JP2003503052A

JP2003503052A - サイクリンｅ遺伝子発現を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび治療でのその使用

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Publication number: JP2003503052A
Application number: JP2001506814A
Authority: JP
Inventors: レベスク，ラック
Original assignee: アンジオジーンインコーポレイテッド
Priority date: 1999-06-23
Filing date: 2000-01-19
Publication date: 2003-01-28
Also published as: WO2001000821A1; AU2088100A; US6339071B1; CA2377273A1; EP1190047A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、サイクリンＥ遺伝子発現阻害用のヒトサイクリンＥ遺伝子に指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび細胞増殖阻害法に関する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、サイクリングＥ遺伝子発現阻害用のサイクリンＥ遺伝子の５’および３’非翻訳領域から設計されている。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、疾患の研究目的、診断、および治療に使用することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用した細胞および組織におけるサイクリンＥ発現の特異的改変法を開示する。サイクリンＥ遺伝子に関する症状の診断、検出、および治療法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】［発明の背景］（ａ）発明の分野本発明は、サイクリンＥ遺伝子発現（細胞周期に関する遺伝子）の変化に応答
する病態についての治療、診断、および研究試薬に関する。より詳細には、本発
明は、サイクリンＥ遺伝子をコードする核酸配列にハイブリダイズするアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドの使用に関する。本発明はまた、再狭窄の予防法または
サイクリンＥ遺伝子に関連する症状（血管増殖疾患または他の増殖障害（乾癬、
癌、および関連する転移など）など）の治療法に関する。

【０００２】（ｂ）従来技術の説明哺乳動物細胞の細胞分裂は、その機能の発現が分裂促進刺激に対して応答する
多数の遺伝子によって調節される(Lanahan A. et al., Mol. Cell. Biol., 12:
3919-3929, 1992)。サイクリンは、細胞周期における細胞の進行を制御する細胞
増殖の主要なレギュレーターである。これは、プロテインキナーゼクラス、すな
わち細胞周期の遷移に必須のサイクリン依存性キナーゼとの複合体の形成によっ
て機能する(Nigg EA., Bioessays, 17(6): 471-80, 1995)。正常な静止期細胞は
、初期Ｇ₀期にある。サイクリンＤはこのＧ１期の間の進行を確実にするための
調節の役割を果たすがゆえに、分裂促進刺激の下で細胞はＧ１期を経て細胞周期
に入る。サイクリンＥは、細胞がＳ期に入るのを調節し、サイクリンＡはＳ期の
間の進行を確実にする。サイクリンＡおよびＢはそれぞれ細胞周期のＧ２期およ
びＭ期の間の進行を確実にする。

【０００３】Ｇ１期サイクリン、より詳細にはサイクリンＥの調節不全は異常な細胞増殖に
関連する。例えば、サイクリンＥの過剰発現は、ラット食道腫瘍形成(Wang Q-S
et al., Carcinogenesis, 17(8): 1583-1588, 1996)、ヒト肝腫瘍形成(Tsuji T.
et al., Biopys. Res. Comm., 242: 317-321, 1998)、卵巣癌(Marone M. et al
., Int. J. Cancer, 75: 34-39)、乳癌(Keyomarsi K et al., Oncogene, 11: 94
1-950)、結腸直腸癌(Leach F. S. et al., Cancer Res., 53: 1986-1989, 1993)
、胃癌(Akama Y. et al., Jpn. J. Cancer Res., 86: 617-621, 1995)、および
急性リンパ芽球性白血病(Scuderi R. et al., Blood, 87: 3360-3367, 1996)で
報告されている。

【０００４】サイクリンＥはまた、経皮経管的血管形成術（ＰＣＴＡ）後の異常な細胞増殖
に関連する(Wei G L. et al., Circ. Res., 80: 418-426, 1997)。ＰＣＴＡは、
冠血管および末梢血管疾患治療で認められた形態である。１９７７年の冠血管疾
患治療へのその導入から、初期成功率は非常に高レベル（９０％〜９５％）に達
し、１％〜５％の合併症率が現在の標準である。しかし、術後３〜６ヶ月以内に
同一の部位で拡大した血管の狭小化が再発することが認められる。バルーン血管
形成後の再狭窄の発生率は、冠状動脈および末梢動脈でそれぞれ５５％および６
５％にもなり得る。再狭窄の発症を予防するための全ての薬理学的アプローチは
失敗に終わっている。

【０００５】バルーン血管形成についての多数の機械的代替法が開発および調査されている
。しかし、これらの代替法では、選定患者中のＰａｌｍｅｚ−Ｓｃｈａｔｚステ
ントで得られた小幅の減少を除いて、経皮血管再生後の再狭窄の発症率の決定的
な減少は未だ認められていない。この効果は、弾性収縮力現象の制限による手術
直後の管腔直径の一貫した増大を達成するためのステントの傾向によって説明さ
れる。再狭窄の危険因子の多くが同定されているが、そのほとんどは支配困難で
ある。

【０００６】ＰＣＴＡでは血管壁損傷は避けられない。内皮および血管壁構造の破壊により
、分子および細胞での事象を引き起こし、患者によっては再狭窄を発症する。い
くつかの成長因子、サイトカイン、および細胞表面レセプターが増殖過程に関与
する。血管損傷の動物モデルでは、弾性収縮力によって説明される管腔直径の直
接的損傷後、この事象の重要なカスケードにより、血管形成術の２４時間後に平
滑筋細胞（ＳＭＣ）増殖が発症する。ＳＭＣ増殖は、動脈のバルーン拡張および
／または表皮剥脱に対する一貫した応答のようである。細胞複製は、血管形成術
後７日以内にピークとなると報告されている。血管形成術から２８日後、中膜な
らびに脈管内膜におけるＳＭＣ増殖は正常化するようである。その後、次の数週
間にわたり基質に蓄積される。

【０００７】非制御細胞増殖の一連の治療法には、放射線治療が含まれる。例えば、癌性腫
瘍を、外部照射または放射能源の内部適用による放射線治療で治療する。別の例
は、ＰＣＴＡ手術を受ける動脈に適用することができる放射性ワイヤ、カテーテ
ル、ステント、またはバルーンの使用である。最近、血管壁への放射能標識オリ
ゴヌクレオチドの浸潤に関する手術が提案された（米国特許第５，８２１，３５
４号）。

【０００８】薬理学的化合物が癌治療に広く使用されており、広範な多数の癌サブタイプで
成功している。しかし、これらの化合物では、再狭窄の減少の成功は証明されて
いない。

【０００９】ＰＣＴＡを受ける動脈の新規の治療手段は、薬物を局所的に送達させることで
ある。ラットモデルでは、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）に指向するアンチセンス
オリゴヌクレオチド(Simons M. et al., J. Clin. Invest., 93(6): 2351-2356,
1994)は、脈管内膜へのＳＭＣ増殖を阻害する。オリゴヌクレオチドをＰｌｕｒ
ｏｎｉｃゲルと混合し、ＰＣＴＡ手術後の動脈に適用した。他の研究は、アンチ
センスｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、およびＣＤＫ２キナーゼオリゴヌクレオチドの
使用に関する。

【００１０】Ｖｉｌｌａａｎｄｃｏｌｌｅａｇｕｅ(Villa AE et al., Circ. Res., 76
(4): 505-513, 1995)は、ラットモデルにおけるＰＣＴＡ後の再狭窄を阻害する
ためにアンチセンスｃ−ｍｙｂオリゴヌクレオチドの使用を試みたが、失敗して
いる。彼らは、４つの連続するグアニン残基の存在がハイブリダイズ依存性アン
チセンス機構と区別可能なアプタマー効果に関連し得ると報告した。

【００１１】再狭窄の予防におけるｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴヌクレオチドについても
研究されている。ＳｈｉａｎｄＣｏｌｌｅａｇｕｅｓ(Shi Y. et al., Circ
ulation, 90(2): 944-951, 1994)は、ブタ冠状動脈の管腔中の平滑筋増殖および
細胞外基質蓄積の減少に成功したと報告している。しかし、この治療を使用した
臨床試験は不成功であると考えられた（Holt C. M.、「動脈再狭窄治療用のアン
チセンスオリゴヌクレオチド（Antisense Oligonucleotides for the treatment
of coronary restenosis）」、Antisense 98, London, October 8-9, 1998）。
オリゴヌクレオチドまたは輸送送達デバイスのいずれによる失敗かは決定されな
かった。

【００１２】他の研究では、マウス冠状動脈同種移植片の新生内膜肥厚の予防におけるアン
チセンスＣＤＫ２オリゴヌクレオチドの効果を試験した(Sizuki J.-I. et al.,
Nat. Med., 3(8): 900-903, 1997)。アンチセンスＣＤＫ２キナーゼオリゴヌク
レオチド（細胞周期調節遺伝子）の腔内投与により心臓移植後の新生内膜肥厚を
阻害可能であると報告された。

【００１３】しかし、現在、新生内膜増殖の減少における細胞周期を標的するアンチセンス
オリゴヌクレオチドの使用を評価する研究は行われていない。以前の研究で、細
胞周期進行に関与する一定の遺伝子はＰＣＴＡ後に誘導されることが示されてい
る(Wei G L. et al., Circ. Res., 80: 418-426, 1997)。実際、ＰＣＴＡが施さ
れたラット動脈は、数日後にＣＤＫ２、ＰＣＮＡ、ならびにサイクリンＥおよび
Ａ遺伝子産物が発現する。

【００１４】サイクリンＥの役割は、細胞周期のＧ１期からＳ期に細胞を進め、細胞を分裂
させることである。現在、サイクリンＥ遺伝子産物の阻害が報告されているアン
チセンス構築物に関する研究およびオリゴヌクレオチドに関する研究は共に存在
しない。

【００１５】非制御細胞増殖（再狭窄、癌、および乾癬など）予防用のより有効な方法およ
び薬剤組成物を得ることが非常に望ましい。

【００１６】［発明の概要］本発明の目的の１つは、非制御の細胞増殖（再狭窄など）の予防により有効な
方法を提供することにある。

【００１７】本発明の別の目的は、非制御細胞増殖の予防用の薬剤組成物を提供することに
ある。

【００１８】本発明によれば、細胞増殖阻害用のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって
、前記オリゴヌクレオチドはサイクリンＥ遺伝子発現阻害用の、前記サイクリン
Ｅ遺伝子の５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）または３’非翻訳領域（３’−ＵＴ
Ｒ）に相補的であり、それにより細胞増殖を阻害するアンチセンスオリゴヌクレ
オチドが得られる。

【００１９】好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１または配列番号
２由来の核酸配列を有する。

【００２０】細胞増殖は、再狭窄であっても、癌または乾癬によって引き起こされてもよい
。

【００２１】また、本発明によれば、薬学的受容可能な担体と組み合わせた、上記に定義さ
れたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む薬剤組成物が得られる。

【００２２】さらに、本発明によれば、サイクリンＥ遺伝子発現阻害用の前記サイクリンＥ
遺伝子の５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）または３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ
）に相補的であり、それにより細胞増殖を阻害する、アンチセンスオリゴヌクレ
オチドを患者に投与する過程を含む細胞増殖を防ぐ方法が得られる。アンチセン
スオリゴヌクレオチドは、上記のように、配列番号１または配列番号２由来の核
酸配列を有し得る。

【００２３】アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、再狭窄の場合、動脈の拡張
部位に送達される。

【００２４】また、本発明によれば、細胞増殖阻害用のアンチセンスオリゴヌクレオチドが
得られる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記のように、サイクリンＥ遺
伝子発現阻害用の前記サイクリンＥ遺伝子の５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）ま
たは３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）に相補的であり、それにより細胞増殖を阻
害する。

【００２５】［発明の詳細な説明］本発明によれば、サイクリンＥ遺伝子発現阻害に特異的なアンチセンスオリゴ
ヌクレオチド送達による再狭窄などの増殖性疾患の予防法が得られる。本発明の
方法は、血管用の部位特異的薬物送達の最近の開発を用いて実現可能となった(T
eiger E et al., J. Cardiovasc. Pharmacol., 33(5): 726-732, 1999)。さらに
、この化合物の全身送達は、この症状の予防に有効であると証明されている。

【００２６】本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトサイクリンＥ遺伝子由来の
ＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸配列に相補的である。オリゴヌクレオチドは、相
補配列に特異的にハイブリダイズするのに十分な同一性および数のヌクレオチド
単位から構成される。この関係は、一般に「アンチセンス」と呼ばれる。

【００２７】好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、遺伝子の５’非翻訳領域（５
’−ＵＴＲ）または３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）に特異的に相補的であるか
、それらとハイブリダイズする。

【００２８】別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、特定のサイクリンアイソザイム、
またはサイクリンアイソザイムの特定のセットをコードするＤＮＡまたはｍＲＮ
Ａと特異的にハイブリダイズできる。このようなオリゴヌクレオチドは、薬学的
に許容可能な担体を含む組成物中に都合よく且つ望ましく存在し得る。

【００２９】代謝分解耐性を増加するためにオリゴヌクレオチドを改変することが好ましい
。ヌクレアーゼ耐性の増加が少なくとも１つの硫黄含有ヌクレオチド、最も好ま
しくはホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートによって送達されること
もまた好ましい。

【００３０】他の好ましい実施形態によれば、オリゴヌクレオチドは、細胞ヌクレアーゼの
存在下での改良された標的親和性、細胞取り込み、組織取り込み、または安定性
などのいくつかの所望の特徴を送達する１つまたは複数の化学修飾を含む。

【００３１】いくつかの好ましいオリゴヌクレオチドの例は、改変された糖内架橋を含むも
のである。ＣＨ₂−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ₂、ＣＨ₂−Ｎ（ＣＨ₃）−Ｏ−ＣＨ₂、ＣＨ₂−
Ｏ−Ｎ（ＣＨ₃）−ＣＨ₂、ＣＨ₂−Ｎ（ＣＨ₃）−Ｎ（ＣＨ₃）−ＣＨ₂、およびＯ
−Ｎ（ＣＨ₃）−ＣＨ₂−ＣＨ₂バックボーン（ホスホジエステルはＯ−Ｐ−Ｏ−
ＣＨ₂）を含むオリゴヌクレオチドが最も好ましい。ホスホロチオエートもまた
、最も好ましい。モルホリノバックボーン構造（Summerton, J. E. and Weller
D. D.、米国特許第５，０３４，５０６号）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）バッ
クボーン(P. E. Nielson, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt, Science, 199
1, 254: 1497)を有するオリゴヌクレオチドもまた好ましい。他の好ましい実施
形態によれば、ホスホジエステル結合を、キラルでエナンチオマー的に特異的な
構造に置換する。

【００３２】改変オリゴヌクレオチドの他の例としては、少なくとも１つの改変核酸塩基を
含む種が挙げられる。したがって、通常天然で見出されるもの以外のプリンおよ
びピリミジンもまた使用することができる。ヌクレオチドサブユニットのペント
フラノシル部分を改変することもできる。本発明で有用な糖部分の２’の位置で
のこのような改変の例は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ₃、ＳＯＣＨ₃、Ｎ₃、Ｎ
Ｏ₂、ＮＨ₂、ＯＨ、ＯＣＮ、ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＯＣＨ₃、ＯＣＨ₃、ＯＣＨ₂ＣＨ₃、Ｏ
ＣＨ₂ＯＣＨ₂ＣＨ₃、Ｏ（ＣＨ₂）_nＮＨ₂（式中、ｎは１〜約２５）、ＳＨ、ＳＣ
Ｈ₃、Ｎ−アルキル、ＳＯ₂ＣＨ₃、ＯＮＯ₂、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシク
ロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮ
Ａ切断基、レポーター基であるが、これらに限定されない。１つまたは複数のペ
ントフラノシル基を、別の糖、糖模倣物（シクロブチルなど）、または糖に代わ
る別の部分に置換することができる。

【００３３】いくつかの好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、相補サイ
クリンＥｍＲＮＡとの結合親和性を増加させるように改変された少なくとも１
つの領域およびＲＮアーゼＨ開裂についての基質領域である領域を含むキメラま
たは「ギャップ」オリゴヌクレチドである。このような一実施形態では、ＲＮア
ーゼＨ基質領域は、サイクリンＥｍＲＮＡ結合親和性が増加した２つの領域に
隣接している。

【００３４】別の好ましい実施形態は、以下の３成分のキメラアンチセンスオリゴヌクレオ
チドである：３’末端が２’改変ホスホジエステルヌクレオチドおよび２’改変
Ｐ−アルキルオキシホスホトリエステルヌクレオチドから構成され、５’末端が
３個〜１５個の連続したホスホロチオエート連結デオキシリボヌクレオチドのＲ
ＮアーゼＨ活性化領域に結合し、オリゴヌクレオチドの３’末端が逆位デオキシ
リボヌクレオチド、１個〜３個のホスホチオエート２’改変リボヌクレオチドの
連続したストレッチ、ビオチン基、およびＰ−アルキルオキシホスホトリエステ
ルヌクレオチドからなる。

【００３５】ヒトにおける非制御細胞増殖の予防法は、本発明の好ましい実施形態によれば
、非制御細胞増殖治療用の治療薬を局所的または全身に送達させる過程を含む。
例えば、非制御細胞増殖が血管形成術後の再狭窄である場合、治療薬を、部位特
異的に送達させるかまたは全身に送達させることができる。しかし、非制御増殖
が癌または悪性腫瘍である場合、治療薬を単独または例えば抗体、カチオニック
リピドまたはペプチド部分と結合させて投与することができる。このようなペプ
チド部分には、形質転換成長因子α（ＴＧＦα）、ＴＧＦβ、サイトカイン、お
よび任意の他の成長因子が挙げられるが、これらに限定されない。アンチセンス
オリゴヌクレオチドを、局所的に、部位特異的様式で、または全身に投与するこ
とができる。

【００３６】本発明の一実施形態によれば、このような治療用アンチセンスオリゴヌクレオ
チドを、その薬物動態学的性質に好ましい影響を与えるために他の部分（コレス
テロール、オレイン酸もしくはリノール酸など）と結合させることができる。そ
の細胞特異性を増大させるために抗体と結合させることもできる。アンチセンス
オリゴヌクレオチドを、ヌクレアーゼまたは標的ｍＲＮＡまたはＤＮＡ鎖の切断
を誘導し得る他の活性部分に結合させることもできる。配列由来の分子ステムの
治療特性は、サイクリンＥ遺伝子産物を標的するために用いられた。

【００３７】オリゴヌクレオチド投与による細胞プロセスに対するサイクリンＥ遺伝子産物
の欠失効果を評価するために、一連のアンチセンスホスホロチオエートを設計お
よび合成した。最も好ましいオリゴヌクレオチドＡＭＧ１０５１を、種々のア
ッセイにおいて試験して、サイクリンＥ遺伝子産物の欠失の生物学的効果を評価
した。

【００３８】図１では、オリゴヌクレオチドを、５’→３’方向でサイクリンＥ標的領域に
関して配列している。

【００３９】本発明のオリゴヌクレオチドを、サイクリンＥ遺伝子発現を阻害する５’およ
び３’−ＵＴＲを標的するように設計した。したがって、本発明のオリゴヌクレ
オチドは、５’−ＵＴＲ配列：ｇｔｇｃｔｃａｃｃｃｇｇｃｃｃｇｇｔｇｃ
ｃａｃｃｃｇｇｇｔｃｃａｃａｇｇｇａｔｇｃｇａａｇｇａｇｃｇｇｇａ
ｃａｃｃ（配列番号１）または３’−ＵＴＲ配列：

【表１】

【００４０】より好ましいオリゴヌクレオチドは、以下の配列のうち１つを有するものであ
る。

【表２】

【００４１】これらのオリゴヌクレオチドは、サイクリンＥ発現の発現を調節することが見
出された。しかし、最も好ましいアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレ
オチドＡＮＧ１０５１をさらなる特徴づけに供した。

【００４２】図２は、２つのヒト細胞株（ヒト伏在静脈平滑筋細胞（ＨＳ−ＳＭＣ）および
Ａ５４９細胞）を種々の濃度のＡＮＧ１０５１で４時間処理した用量反応実験
を示す。結果は、ＡＮＧ１０５１は、Ａ５４９細胞で約６０ｎＭ、ＨＳ−ＳＭ
Ｃで４００ｎＭのＩＣ₅₀でサイクリンＥｍＲＮＡ発現を減少させることを示す
。この相違は、両細胞株のオリゴヌクレオチド取り込みの差によって説明するこ
とができる。

【００４３】図３Ａおよび図３Ｂは、活動的に増殖しているＨＳ−ＳＭＣ（図３Ａ）または
Ａ５４９（図３Ｂ）細胞を４００ｎＭの活性オリゴヌクレオチド（ＡＮＧ１０
５１）およびその１２塩基のミスマッチコントロール（ＡＮＧ１０６５）また
は賦形剤で処理したサイクリンＥタンパク質発現を示す。細胞をオリゴヌクレオ
チドで４時間処理してから２４、４８、および７２時間後に、免疫ブロッティン
グ用に細胞を回収した。サイクリンＥ発現は、細胞の賦形剤またはＡＮＧ１０
６５での処理に影響されなかった。しかし、サイクリンＥタンパク質発現は、処
理から数時間ＡＮＧ１０５１によって減少する。サイクリンＥレベルは、７２
時間後に増加する。

【００４４】２４時間後の効果の欠如は、オリゴヌクレオチドでの処理時に存在する構成性
サイクリンＥタンパク質の存在によるものである。ｍＲＮＡ翻訳の停止後、サイ
クリンＥタンパク質が代謝される。したがって、タンパク質含有量は、４８時間
後に減少する。しかしオリゴヌクレオチドの代謝によりサイクリンＥｍＲＮＡ
の翻訳活性が再惹起され、サイクリンＥタンパク質レベルが回復する。

【００４５】図４Ａおよび図４Ｂは、ＨＳ−ＳＭＣ（図４Ａ）およびＡ５４９（図４Ｂ）細
胞をオリゴヌクレオチドで処理した用量反応実験を示す。次いで、細胞増殖を、
トリチウム化チミジン取り込みによって測定した。

【００４６】細胞を、低血清培地に２４時間暴露することによって静止させた。次いで、種
々の濃度のオリゴヌクレオチドを、細胞に４時間適用した。その後、血清レベル
を増殖開始レベルに２４時間回復させた。次いで、トリチウム化チミジンを細胞
に添加し、さらに２４時間取り込ませた。

【００４７】結果は、実験の最初の４時間の細胞のＡＮＧ１０５１処理は、両細胞株の細
胞増殖減少に十分であったことを示す。コントロールオリゴヌクレオチドは、い
かなる細胞増殖効果も示さず、これは、このアンチセンスは配列特異的現象であ
ることを証明している。

【００４８】図５は、ＨＳ−ＳＭＣ細胞をオリゴヌクレオチドに表示の時間暴露し、その後
図４に関して記載したようにトリチウム化チミジン取り込みアッセイによって細
胞増殖を測定する時間経過実験を示す。

【００４９】結果は、最大抗増殖効果を得るために必要なオリゴヌクレオチド暴露時間が１
２０分であることを示す。細胞のオリゴヌクレオチドへの６０分間の暴露により
８５％減少し、一方ＡＮＧ１０５１の抗増殖活性の５０％を減少させるのに３
０分の暴露時間が必要である。ミスマッチコントロールＡＮＧ１０６５は効果
がなかった。

【００５０】図６は、ＨＳ−ＳＭＣ細胞をオリゴヌクレオチドで処理し、その後血球計を使
用した細胞の計数によって細胞増殖を測定する時間経過実験を示す。

【００５１】細胞を、１５０００細胞／ウェルの密度でプレートし、次に低血清培地への２
４時間の暴露によって静止させた。オリゴヌクレオチド（４００ｎＭ）を細胞に
４時間適用し、表示する場合、増幅を開始する血清レベルに回復させた。細胞を
、表示の時間トリパンブルー溶液中で計数した。細胞生存度データを、図７に示
す。

【００５２】細胞増殖の結果は、低血清培地（１％ＦＢＳ）に暴露した細胞は増殖しないこ
とを示す。細胞をＡＮＧ１０５１またはＡＮＧ１０６５で処理し、低血清培
地に暴露した条件では毒性を示さなかった。細胞はウェルにプレートした静止期
のままであった。

【００５３】完全培地（２０％ＦＢＳ）でインキュベートしたＡＮＧ１０６５および賦形
剤で処理した細胞は増殖し、その数は倍になった。しかし、アンチセンスホスホ
ロチオエートＡＮＧ１０５１により、血清に誘導された増殖が妨害された。

【００５４】これらのさらなる結果は、図４および図５に表したトリチウム化チミジン取り
込みの妨害と相関し、オリゴヌクレオチドに誘導されたサイクリンＥ遺伝子産物
の欠乏が強力な抗増殖性を示すことを実証する。

【００５５】図７は、図６に示すアッセイにおけるＨＳ−ＳＭＣ生存度の結果を示す。全て
の条件で、オリゴヌクレオチドは細胞死または毒性を誘導しなかった。細胞生存
度は、処理後２４、４８、７２、および９６時間で試験した全ての条件下で９５
％を超えた。

【００５６】これらの結果は、ＡＮＧ１０５１はＨＳ−ＳＭＣ死滅を誘導しないが、生殖
細胞の死滅を誘導することを示す。

【００５７】図８Ａおよび図８Ｂは、オリゴヌクレオチド処理後のＨＳ−ＳＭＣ細胞（図８
Ａ）およびＡ５４９細胞（図８Ｂ）の細胞周期の進行を示す。細胞周期の進行を
、ヨウ化プロピジウム染色を使用して測定した。

【００５８】７２時間の低血清培地への暴露によって細胞を静止させた。ついで、オリゴヌ
クレオチド（４００ｎＭ）を細胞に４時間適用した。血清レベルを、増殖開始レ
ベルに回復させた。血清刺激から２２時間後に細胞を採取した。

【００５９】結果は、ＡＮＧ１０５１での細胞の処理によって細胞のＳ期への進行が阻害
されることを示す。コントロールオリゴヌクレオチドは、細胞周期にいかなる効
果も示さず、これは、配列特異的現象であるためアンチセンス媒介効果であるこ
とが証明された。

【００６０】図９Ａおよび図９Ｂは、ＨＳ−ＳＭＣのアポトーシスに対するＡＮＧ１０５
１およびＡＮＧ１０６５の潜在的効果を示す。２４時間の低血清培地への暴露
によって細胞を静止させた。ついで、オリゴヌクレオチド（４００ｎＭ）を細胞
に４時間適用し、血清レベルを、増殖開始レベルに回復させた。処理から２４お
よび４８時間後（図９Ａ）ならびに７２および９６時間後（図９Ｂ）に細胞を回
収し、ＤＮＡ断片化について評価した。

【００６１】結果は、ＡＮＧ１０５１およびＡＮＧ１０６５はいずれもＨＳ−ＳＭＣ細
胞のアポトーシスを誘導しないことを示す。これは、さらに、ＡＮＧ１０５１
によるサイクリンＥ遺伝子産物の欠乏はＨＳ−ＳＭＣの死滅を誘導しないが、生
殖細胞の死滅を誘導することを実証する。

【００６２】再狭窄予防については、本発明のオリゴヌクレオチドを、冠状動脈ステンティ
ングなどの動脈における有効性が示されている他の治療様式と組み合わせること
ができる。本明細書中に記載の本発明の使用に基づいた局所薬物送達ストラテジ
ーまたは全身送達は、全ての血管増殖障害に適用可能であり得る。これらの障害
には、冠状および末梢性動脈再狭窄等、ならびに動静脈瘻孔、癌および転移治療
および乾癬、ならびにサイクリンＥ遺伝子に関連する他の病態があるが、これら
に限定されない。

【００６３】本発明は、以下の実施例を参照してより容易に理解されるが、これらはその本
発明の範囲を限定するものではなく例示として示す。

【００６４】実施例Ｉオリゴヌクレオチド合成および精製置換および非置換デオキシオリゴヌクレオチドを、高速脱保護ホスホラミダイ
ド化学およびオリゴヌクレオチドの５’末端に残存するＤＭＴ基を使用した自動
ＤＮＡ合成機（ＰｅｒｓｅｐｔｉｖｅＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓモデル８９０９）
によって合成した。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド用に、標準的な酸化
ボトルをホスファイト結合の段階的硫黄化用の０．０２４Ｍの３−エトキシ−１
，２，４−ジアチアゾリン−５−オンのアセトニトリル溶液で置換した。ＣＰＧ
カラムからの開裂および５５℃で最低１５分間の濃水酸化アンモニウムでの脱封
鎖後、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）を有するオリゴヌクレオチドを、第１表の
スキームおよび以下の勾配を使用してＨＰＬＣシステムのＯｌｉｇｏＲ３^TM逆
相カラム(Perseptive BioSystems, MA)によって精製した：溶液Ａ：０．１２Ｍ氷酢酸−０．１６Ｍトリエチルアミン、溶液Ｂ：８０％アセトニトリル−２０％水、溶液Ｃ：３％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、および溶液Ｄ：２回蒸留水。

【００６５】

【表３】

【００６６】オリゴヌクレオチドを、多溶媒段階勾配を使用して精製した。第１過程は、最
終産物からの不成功の配列の排除である。最終産物のみがＤＭＴ（ジメトキシト
リチル）部分を保有し、逆相カラムに残存している。この過程後、洗浄過程を行
ってオリゴヌクレオチドを脱塩した。次の過程は、オリゴヌクレオチドのトリフ
ルオロ酢酸（ＴＦＡ）への短時間の暴露によるＤＭＴ部分の排除を含む。

【００６７】ＴＦＡを洗浄し、次に勾配を適用して約１８〜１９分で精製オリゴヌクレオチ
ドが溶出する。次いで、次の運転用にカラムを洗浄および平衡化した。

【００６８】実施例ＩＩ融解曲線吸光度対温度曲線を、ＩＢＭＰＣコンピュータおよびＧｉｌｆｏｒｄＲｅ
ｓｐｏｎｓｅＩＩ吸光光度計に接続したＧｉｌｆｏｒｄ２６０吸光光度計を
使用して２６０ｎｍで測定した。緩衝液は、１００ｎＭのＮａ⁺、１０ｍＭリン
酸、および０．１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７）を含んでいた。Ｐｕｇｌｉｓｉａ
ｎｄＴｉｎｏｃｃｏ(Methods in Enzymol., 1989, 180, 304-325)に従って計
算された８５℃での吸光度および吸光率から同定した各鎖のオリゴヌクレオチド
濃度は４μＭであった。Ｔｍ値（二重らせん形成の自由エネルギーおよび結合定
数）を、二状態モデルのデータと直線勾配のベースラインとのフィッティングか
ら得た。報告したパラメータは少なくとも３回の実験の平均値である。

【００６９】実施例ＩＩＩＲＮアーゼＨ分析活性アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの相補配列に対応す
る化学合成２’０−塩基オリゴリボヌクレオチドを使用してＲＮアーゼＨアッセ
イを行った。５’末端標識ＲＮＡを２０ｎＭの濃度で使用し、２０ｍＭｔｒｉ
ｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭ
ジチオスレイトール、１０μｇｔＲＮＡ、および４ＵＲＮアーゼ（最終体
積１０μｌ）を含む反応液中で１０倍過剰モルのアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドとインキュベートした。反応成分を、３７℃で１５分間予備アニーリングし、
室温にゆっくり冷却した。Ａ５４９細胞核抽出物を、哺乳動物ＲＮアーゼＨ源と
して使用した。２μｇの核抽出物の添加によって反応を開始し、３７℃で１０分
間反応を進行させた。フェノール／クロロフォルム抽出によって反応を停止し、
ＲＮＡ成分を、エタノールで沈殿させた。等量のＣＰＭを、７Ｍ尿素を含む２０
％ポリアクリルアミドゲルにロードし、ＲＮＡ開裂産物を解析し、電気泳動によ
って視覚化し、続いてオートラジオグラフィーを行った。切断産物の定量を、Ｉ
ｎｓｔａｎｔＩｍａｇｅｒ(Packard, Downers Grove, IL)を使用して行った。

【００７０】実施例ＩＶ細胞のオリゴヌクレオチド処理ＨＳ−ＳＭＣまたはＡ５４９細胞を予め加温した３７℃の非補充ＤＭＥＭ溶液
で洗浄した。ついで、オリゴヌクレオチドを、各プレート（５００μｌ／ウェル
）中の５μｇ／ｍｌＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ
，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）を含むＤＭＥＭに投
与した。各プレートを、３７℃で４時間インキュベートした。培地を除去し、完
全ＤＭＥＭ培地と置換した。次いで、細胞を種々の生物学的アッセイに供した。

【００７１】実施例Ｖインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）でのサイクリンＥ発現のノーザンブロット分
析ヒト肺癌Ａ５４９細胞株を、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ(Rockville, MD)から得た。ヒト伏在静脈平滑筋細胞（Ｈ
Ｓ−ＳＭＣ）を、同意した患者由来の伏在静脈移植片から調製した。細胞を、Ａ
５４９およびＨＳ−ＳＭＣそれぞれについて１０％または２０％の熱不活化ウシ
胎児血清、ならびに各５０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよびストレプトマイシンを補
充したＤＭＥＭ中で増殖させた。１００ｍＭプレートに細胞を播種した。細胞が
７０〜８０％密集に達したとき、実施例ＩＶに記載のように細胞をオリゴヌクレ
オチドで処理した。次いで、培地をＤＭＥＭに置換し、細胞を、オリゴヌクレオ
チド処理から２４時間後に採取し、ＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙ^TMキットを使用
して全ＲＮＡを単離した。

【００７２】ノーザンハイブリダイズ各サンプルについて１０μｇのＲＮＡを１．２％アガロース／ホルムアルデヒ
ドゲルで電気泳動し、標準的な方法を使用してナイロンメンブランに一晩かけて
転写した。ＲＮＡをメンブランにＵＶ架橋させた。二本鎖³²Ｐ−プローブを、Ｏ
ｌｉｇｏｌａｂｅｌｌｉｎｇキット(Pharmacia Upjohn, Montreal, Canada)を使
用して合成した。これらの研究で使用したプローブは、サイクリンＥおよびＧ３
ＰＤＨである。ブロットを、ＱｕｉｃｋＨｙｂ^TMハイブリダイズ溶液(Stratagen
e, La Jolla, Calif.)と６８℃で１５分間予備ハイブリダイズさせた。熱変性放
射性プローブを添加し、メンブランを６８℃で９０分間ハイブリダイズさせた。
ブロットを室温の２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで１５分間を２回、５６℃の０．
１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで１５分間を２回洗浄した。ブロットを、オートラ
ジオグラフィーし、ＩｎｓｔａｎｔＩｍａｇｅｒ(Packard, Downers Grove, I
L)を使用してシグナルを定量した。ノーザンブロットを初めにサイクリンＥプロ
ーブとハイブリダイゼーションさせ、次に、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中
で５分間のボイルによって剥ぎ取り、コントロールＧ３ＰＤＨプローブと再ハイ
ブリダイズさせて正確なサンプルローディングをチェックした。

【００７３】実施例ＶＩインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）でのサイクリンＥのウェスタンブロット分析
。ＨＳ−ＳＭＣまたはＡ５４９細胞を、１０％熱非活性化ウシ胎児血清および各
５０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で増
殖させた。細胞を１００ｍＭプレートに播種した。細胞が７０〜８０％密集に達
したとき、実施例ＩＶに記載のように細胞をオリゴヌクレオチドで処理した。次
いで、培地をＤＭＥＭで置換し、細胞をオリゴヌクレオチド処理から２４、４８
、または７２時間後の各々で採取し、全タンパク質を抽出した。細胞を氷冷ＰＢ
Ｓで１回洗浄し、４℃のロイペプチン（２μｇ／ｍｌ）およびアプロチニン（１
μｇ／ｍｌ）を補充した２５０μｌの溶解緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．４）、１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５ｍＭＥＧＴＡ
、２ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭジチオスレイトール、５０ｍＭＮａＦ、１０ｍＭ
Ｎａ₂ＨＰＯ₄）に溶解した。Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ(Bio-Rad,
Hercules, CA)によって同定したサンプルを均一にゲルにロードし、１２％アク
リルアミドゲルで電気泳動し、電気ブロッティングを行った。サイクリンＥおよ
びＧ３ＰＤＨのレベルを、ポリクローナル抗サイクリンＥ（１：２０００、Upst
ate Biotechnology, Lake Placid, NY）およびモノクローナル抗Ｇ３ＰＤＨ（１
：５００００、Advanced ImmunoChemical Inc., Long Beach, CA）抗体の使用に
よって同時に同定した。一次抗体との最低２時間のインキュベーション後、メン
ブランを西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ロバ抗マウス抗体またはＨ
ＲＰ標識ロバ抗ウサギ抗体（Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, E
ngland）と１時間インキュベートした。ハイブリダイズバンドを、ＥＣＬ^TMウェ
スタンブロッティング検出キット（Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamsh
ire, England）を使用して視覚化し、ＩｎｓｔａｎｔＩｍａｇｅｒ(Packard,
Downers Grove, IL)を使用して定量した。

【００７４】実施例ＶＩＩ細胞増殖アッセイＨＳ−ＳＭＣおよびＡ５４９細胞を、血清由来培地で２４時間同調培養した。
細胞を、実施例ＩＶに記載のようにオリゴヌクレオチドで処理し、ＦＢＳで刺激
した。２４時間後、細胞を［メチル−³Ｈ］−チミジン（６．７Ｃｉ／ｍｍｏｌ
、NEN Life Science Products）にさらに２４時間暴露した。次いで、細胞を、
氷冷ＰＢＳで１回洗浄し、エタノール／酢酸溶液（３：１）で４℃で１５分間固
定した。次いで、細胞を水で洗浄し、０．５Ｎ過塩素酸中で１５分間インキュベ
ートした。次いで、細胞を洗浄し、０．５Ｎ過塩素酸溶液中で８０℃で１時間イ
ンキュベートした。得られた溶液を、シンチレーションバイアルに移し、計数し
た。

【００７５】実施例ＶＩＩＩ細胞周期の進行ＨＳ−ＳＭＣを、血清由来培地で２４時間同調培養した。細胞を、実施例ＩＶ
に記載のようにオリゴヌクレオチドで処理し、ＦＢＳで刺激した。血清刺激から
２４時間および４８時間後に細胞を採取し、７０％エタノールで固定し、０．１
％クエン酸ナトリウム、０．３％ＮＰ−４０、０．０２ＲＮアーゼ、および０．
０５ｍｇ／ｍｌヨウ化プロピジウムで処理した。染色細胞を、ＧＡＣＳｃａｎモ
デル(Becton Dickinson Immunocytometry Systems)を使用したフローサイトメト
リーによって分析した。

【００７６】実施例ＩＸキナーゼアッセイＨＳ−ＳＭＣを、血清由来培地で２４時間同調培養した。細胞を、実施例ＩＶ
に記載のようにオリゴヌクレオチドで処理し、ＦＢＳで刺激した。次いで、細胞
を５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、２５０ｍＭＮａＣｌ、および０．１％
ＮＰ−４０中に溶解し、１００，０００×ｇで３０分間の超遠心分離で上清をえ
た。サンプルを、ポリクローナル抗サイクリンＥ抗体を含むタンパク質Ａ−Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ^TM(Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY)を使用して免疫沈
降を行った。免疫沈降物を、０．１ｍｇ／ｍｌＢＳＡを補充したキナーゼ緩衝
液（５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＤＴ
Ｔ）で洗浄した。

【００７７】キナーゼアッセイ用に、３０μＭＡＴＰ、５μＣｉの［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ、
および１μｇヒストンＨ１を補充した５０μｌのキナーゼ緩衝液中にビーズを再
懸濁した。この懸濁液を、３７℃で３０分間インキュベートした。産物を、１２
％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用して分析し、続いてオートラジオグラフィーを行
った。

【００７８】実施例Ｘ再狭窄予防におけるオリゴヌクレオチド血管造影法家畜ブタを、ケタミン、アザペロン、およびアトロピンの筋肉内注射で鎮静化
し、チオペンタールナトリウムで麻酔した（ｉｖ）。ブタに挿管し、手術中２％
イソフルランおよび酸素の混合物を補給した。上行大動脈を透視モニタリングし
ながら０．０３５Ｊガイドワイヤを用いて８Ｆｒ．のガイドカテーテルを大腿鞘
に通した。次にガイドワイヤを取り除き、標的血管口にガイドカテーテルを設置
した。血管造影を行う前に、０．３ｍｇ／ｍＬの濃度の１ｍＬニトログリセリン
溶液のボーラスを、冠内注射する。次いで、ブタの右冠動脈（ＲＣＡ）または左
回旋動脈（ＬＣＸ）の標的部位を視覚化する少なくとも２つのほぼ直交した視野
で血管造影を行う。定量的冠動脈造影（ＱＣＡ）法を行って血管サイズを評価し
た。

【００７９】局所薬物送達デバイス薬物送達デバイスのＩｎｆｉｌｔｒａｔｏｒ（商品名）カテーテル(InterVent
ional Technologies, San Diego, CA)を、オリゴヌクレオチドの壁内投与に使用
した。Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｏｒ（商品名）カテーテルを、両ポート上の三方コッ
クを用いて準備した。２０ｃｃのシリンジで注入ポートを空気でフラッシュした
。２０ｃｃシリンジでバルーンポートを吸引し、１０ｃｃシリンジを用いて通常
の様式に維持した。５０：５０造影剤／滅菌水を用いてＩｎｄｅｆｌａｔｏｒ（
商品名）ポンプを準備し、バルーンポートに連結した。中央の管腔をヘパリン処
理生理食塩水でフラッシュし、０．０１４ワイヤをカテーテルの穴に挿入した、
次いで、薬物を注入ポート（緑色）に注意深く充填した。デッドボリュームを薬
物溶液で充填した（０．６ｍｌ）。所定の位置にガイドカテーテルをおいて、冠
動脈入口部に「Ｙ」ハブを介して拡張ワイヤ上にＩｎｆｉｌｔｒａｔｏｒ（商品
名）カテーテルを進めた。薬物送達デバイスの位置を、造影剤を注入して確認お
よび記録した。選択部位での薬物送達デバイスの適切な位置付け後、バルーンを
２〜４気圧に膨張させた。血管壁へのバルーンの付加を、造影剤を用いて確認し
た。０．６ｍｌの全ボーラス薬物を、６０〜９０秒にわたりゆっくりと注入した
。トランスフェクション中、ＥＣＧをモニタリングして、虚血の全サインを評価
した。薬物注入後、バルーンを収縮させ、カテーテルを取り出した。次にコント
ロール血管造影を行って、全ての残留管腔狭窄または血管壁解剖を記録した。痙
攣が記録された場合、０．３ｍｇ／ｍｌの濃度の１ｍｌニトログリセリン溶液を
冠内注射した。

【００８０】実施例ＸＩ腫瘍細胞株増殖に対するオリゴヌクレオチドの効果雌免疫不全ＣＤ１マウスを、ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ(St-Laurent, Canad
a)から入手し、処理開始時に６〜８週齢のものを使用した。各マウスの側腹に０
．１ｍｌの５×１０⁶腫瘍細胞（Ａ５４９、ＭＣＦ−７、およびＯＶＣＡＲ３）
を皮下接種した。１群あたり２０匹のマウスにこの細胞株を接種した。腫瘍サイ
ズを週２回カリパスで二次元で測定し、体積を、式Ｖ＝１／２ａ×ｂ²（式中、
ａおよびｂは腫瘍の長直径および短直径である）を使用してｍｍ³で表した。各
群は、６〜８匹の腫瘍保有マウスを含んでいた。残りの動物をＣＯ₂吸入によっ
て安楽死させた。次いで、腫瘍サイズが７０〜１００ｍｍ³に達したときに治療
を開始した。

【００８１】オリゴヌクレオチド（生理食塩水中に処方）を、尾静脈に毎日ｉ．ｖ．投与し
、コントロールマウスには生理食塩水を投与した。腫瘍体積を週２〜３回、およ
び最後の処理から２４時間後にモニタリングした。次いで、マウスを屠殺し、腫
瘍フラグメントをドライアイス上で保存し、その後ノーザン分析を行った。

【００８２】本発明はその特定の実施形態に関して記載しているが、さらなる修正形態が可
能であり、本出願は一般に本発明の原理にしたがって本発明の任意の変形形態、
使用、または適用を対象とすることが意図されることが理解され、これには、本
発明に関連する分野の範囲内の公知または習慣的な実施に近いか、上記の必須の
特徴に適用可能であるか、添付の特許請求の範囲内に従うような本開示からの逸
脱が含まれる。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】サイクリンＥ遺伝子とハイブリダイズ可能なアンチセンスオリゴヌクレオチド
での処理後のＡ５４９細胞におけるサイクリンＥｍＲＮＡ発現の棒グラフであ
る。

【図２】２つのヒト細胞型（Ａ５４９細胞および伏在静脈平滑筋細胞）におけるサイク
リンＥ遺伝子のサイクリンＥｍＲＮＡ発現の減少に対する種々の濃度のＡＮＧ１０５１の効果の棒グラフである。

【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、２つのヒト細胞型（伏在静脈平滑筋細胞（図３Ａ）お
よびＡ５４９細胞（図３Ｂ））における時間の関数としてのサイクリンＥ遺伝子
のサイクリンＥタンパク質発現の減少に対する４００ｎＭのＡＮＧ１０５１お
よびその１２塩基のミスマッチコントロールＡＮＧ１０６５の効果の棒グラフ
である。

【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、伏在静脈平滑筋細胞（図４Ａ）およびＡ５４９細胞（
図４Ｂ）のトリチウム化チミジン取り込みに対する種々の濃度のＡＮＧ１０５
１およびその１２塩基のミスマッチコントロールＡＮＧ１０６５の効果の線グ
ラフである。

【図５】抗増殖効果を達成するためのオリゴヌクレオチドの暴露時間の関数としての伏
在静脈平滑筋細胞の細胞数に対する４００ｎＭのＡＮＧ１０５１およびその１
２塩基のミスマッチコントロールＡＮＧ１０６５の効果の線グラフである。

【図６】血球計を使用した細胞の計数によって評価された細胞増殖に対する４００ｎＭ
のＡＮＧ１０５１およびその１２塩基のミスマッチコントロールＡＮＧ１０
６５の効果の線グラフである。

【図７】時間の関数としての伏在静脈平滑筋細胞の細胞生存度に対する４００ｎＭのＡ
ＮＧ１０５１およびその１２塩基のミスマッチコントロールＡＮＧ１０６５
の効果の棒グラフである。

【図８】図８Ａおよび図８Ｂは、伏在静脈平滑筋細胞（図８Ａ）およびＡ５４９細胞（
図８Ｂ）の細胞周期に対するＡＮＧ１０５１およびその１２塩基のミスマッチ
コントロールＡＮＧ１０６５の効果を示す図である。

【図９】図９Ａおよび図９Ｂは、４００ｎＭのオリゴヌクレオチドでの細胞の処理から
２４時間および４８時間後（図９Ａ）ならびに７２時間および９６時間後（図９
Ｂ）のＤＮＡ断片化を示すゲルの図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA01 HA17 4C084 AA13 ZA362 ZA892 ZB212 ZB262 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 ZA36 ZA89 ZB21 ZB26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞増殖阻害用のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって
、前記オリゴヌクレオチドはサイクリンＥ遺伝子発現を阻害するために、前記サ
イクリンＥ遺伝子の５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）または３’非翻訳領域（３
’−ＵＴＲ）に相補的であり、それにより細胞増殖を阻害する、アンチセンスオ
リゴヌクレオチド。
【請求項２】配列番号１または配列番号２由来の核酸配列を有する、請求
項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番
号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、
配列番号１３、および配列番号１４からなる群から選択される、請求項２記載の
アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】薬学的に許容可能な担体と組み合わせた、請求項１、請求項
２、または請求項３記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む薬剤組成物。
【請求項５】細胞増殖阻害のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使
用であって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは前記サイクリンＥ遺伝子発
現を阻害するために、サイクリンＥ遺伝子の５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）ま
たは３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）に相補的であり、それにより細胞増殖を阻
害する、アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項６】前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号１または配
列番号２由来の核酸配列を有する、請求項５記載の使用。
【請求項７】前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号３、配列
番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列
番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４か
らなる群から選択される核酸配列を有する、請求項５記載の使用。
【請求項８】再狭窄によって引き起こされる細胞増殖を阻害するための請
求項１、請求項２、または請求項３記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使
用。
【請求項９】癌によって引き起こされる細胞増殖を阻害するための請求項
１、請求項２、または請求項３記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１０】乾癬によって引き起こされる細胞増殖を阻害するための請
求項１、請求項２、または請求項３記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使
用。
【請求項１１】再狭窄によって引き起こされる細胞増殖を阻害するための
請求項４記載の薬剤組成物の使用。
【請求項１２】癌によって引き起こされる細胞増殖を阻害するための請求
項４記載の薬剤組成物の使用。
【請求項１３】乾癬によって引き起こされる細胞増殖を阻害するための請
求項４記載の薬剤組成物の使用。
【請求項１４】細胞増殖阻害用の薬物製造のための、請求項１、請求項２
、または請求項３記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１５】再狭窄によって引き起こされる細胞増殖阻害用の薬物製造
のための、請求項１、請求項２、または請求項３記載のアンチセンスオリゴヌク
レオチドの使用。
【請求項１６】癌によって引き起こされる細胞増殖阻害用の薬物製造のた
めの、請求項１、請求項２、または請求項３記載のアンチセンスオリゴヌクレオ
チドの使用。
【請求項１７】乾癬によって引き起こされる細胞増殖阻害用の薬物製造の
ための、請求項１、請求項２、または請求項３記載のアンチセンスオリゴヌクレ
オチドの使用。
【請求項１８】サイクリンＥ遺伝子発現を阻害するために、前記サイクリ
ンＥ遺伝子の５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）または３’非翻訳領域（３’−Ｕ
ＴＲ）に相補的であり、それにより細胞増殖を阻害するアンチセンスオリゴヌク
レオチドを患者に投与する過程を含む、細胞増殖予防法。
【請求項１９】前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号１または
配列番号２由来の核酸配列を有する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号３、配
列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配
列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４
からなる群から選択される核酸配列を有する、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】前記細胞増殖は再狭窄である、請求項１８記載の方法。
【請求項２２】前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを動脈拡張部位に送
達する、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】前記細胞増殖は癌によって引き起こされる、請求項１８記
載の方法。
【請求項２４】前記細胞増殖は乾癬によって引き起こされる、請求項１８
記載の方法。