JP2003501036A - 植物の細胞及び器官の形状を変更するための方法及び遺伝子産物 - Google Patents

植物の細胞及び器官の形状を変更するための方法及び遺伝子産物

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、細胞成長の方向及び大きさの制御が可能なＧＥＧ様遺伝子及びその遺伝子産物に関する。これら遺伝子及び遺伝子産物は、植物の細胞及び／あるいは器官の大きさ、形状を変更するのに使用され得る。植物細胞の半径方向の成長か縦方向の成長かのいずれかにおける伸長が望ましい。当該遺伝子及び遺伝子産物は、園芸、農業及び林業において個々の用途に対してより都合よく、有利で適した再生可能な植物由来原料の構造物を生産するのに有益である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、植物細胞及び植物器官の形状を調整する方法に関する。本発明はま
た、ＧＥＧｃＤＮＡ又はＧＥＧ様の核酸配列、及び個々の用途に対してより都合
よく、有利で、適した構造を有する再生可能な植物由来原料を生産するために、
園芸、農業、及び林業において有益な物質に関する。
【０００２】 （背景技術） 植物の器官に係る極めて不変の形状及び大きさは、その形状が厳しい発育制御
下にあることを示唆する。花の発育期において、花の器官の最終的な形状は、典
型的には分裂運動が基本的に停止した後に発生し、このことは、細胞伸長が器官
形状の決定に重要な役割を果たしていることを示している（Pyke K. A.他、J. E
xp. Bot.、42、1407〜1416頁、1991年；Tsuge T.他、Development、122、1589〜
1600頁、1996年）。葉の発育期間の変異（Tsuge T.他、Development、122、1589
〜1600頁、1996年）、及びアラビドプシス（Arabidopsis）における根の発育期
間のいくつかの細胞伸長変異（Aeschbacher R. A.他、Genes & Development、9
、330〜340頁、1991年；Hauser M. T.他、Development、121、1237〜1252頁、19
92年）は、細胞の縦方向の大きさと半径方向の大きさとの間の相互関係を指摘し
ている。変異により、葉の幅の方向における伸長を制限し、葉の厚さにおいて伸
長を増進することが示されている。植物の中には、形態構造が一方向においての
み影響されるものもあれば、いくつかの方向において影響されるものもある。
【０００３】 植物は自然界における最も重要な再生可能な資源の１つであるので、植物にお
ける細胞成長の方向と大きさ及び器官の形状が制御可能であれば有益であろう。
細胞成長の方向と大きさとを制御、調節し得る機能は、農業、園芸、及び林業に
おけるどんな所望の用途に対しても最も好都合で有益な形状又は構造を提供する
のに役立ち得るであろう。縦方向に増加した、例えば長くなった細胞又は線維の
いずれかは、パルプや紙の産業における用途に有益となるし、一方、半径方向の
細胞成長は、他の多くの用途において所望され得るであろう。現時点では細胞伸
長に係る分子的及び遺伝的制御は、十分には理解されておらず、特には花の発育
期の器官形状の分子的制御はいまだにほとんど分かっていない。
【０００４】 本発明の目的は、縦方向と半径方向との両方向のみならず、細胞成長度を制御
し、及び／あるいは調節することにより、植物の細胞及び器官の形状を変更した
り調整したりする新しい方法を提供することである。
【０００５】 本発明に係る別の目的は、当該方法を実施する手段を提供することである。該
手段は、ＧＥＧｃＤＮＡ又はＧＥＧ様核酸配列であり、所望の方向に外来遺伝子
、あるいは非相同性の核酸配列を方向付けることが可能な当該ＧＥＧ又はＧＥＧ
様の遺伝子もしくは核酸配列を包含する。当該核酸配列からなるＧＥＧ様遺伝子
産物は、個々の用途に対してより好都合で、有利で、実現可能な構造を有する再
現可能な植物由来原料を生産するのに、農業、園芸、及び林業において有益であ
る。
【０００６】 特には林業において本発明に係る好ましい目的は、例えば森から入手可能な繊
維の長さ、及び／あるいは厚みの改変を可能とすることである。農業及び園芸に
おいて所望の目的の１つは、より安定で雨などにより作物が倒されにくい、より
短くて太い茎を提供することである。 園芸において目的は、より装飾的な形状あるいはより長い花をつける茎のみな
らず当該植物における他の所望の特徴を提供するために花及び／または葉の形状
を改変し得ることであるだろう。
【０００７】 （本発明の概要） 本発明は、植物における細胞成長の方向及び器官形成を制御する新しい方法を
提供することにより前述の問題に対する解決法を提供する。当該方法において利
用される方法及び物質及び手段は、本発明に係る請求の範囲に定義される通りで
ある。
【０００８】 （図面の簡単な説明） 図１は、ＧＥＧ発現に係る組織特異性を示すＲＮＡゲルブロットハイブリダイゼ
ーション分析を示す。 図２は、花冠及び心皮の発育期のＧＥＧ発現に係る分析である。 図３は、in situハイブリダイゼーションによる花冠及び心皮におけるＧＥＧ発
現に係る分析である。 図４は、花冠及び心皮の長さと幅の発育に係る生物測定分析である。 図５は、舌状花の花冠の開花直前及びその後（それぞれステージ７＋及び８）の
先端及び中央領域における細胞の長さ及び幅である。 図６は、舌状花の開花前（ステージ７）、開花期（ステージ７.５）、及び開花
後（ステージ９）で、形質転換していない系統（ｗｔ）の構成的にＧＥＧを発現
しているｍ３植物の舌状花冠との比較である。 図７は、構成的にＧＥＧを発現している４系統及びコントロール系統についての
花冠の長さ及び幅に係る分析である。 図８は、花冠の表皮細胞上での構成的なＧＥＧ発現の効果に係る分析である。 図９は、構成的にＧＥＧを発現しているｍ１及びｍ３系統及びコントロール系統
（ｗｔ）の図８に記載と同じ領域における細胞の長さ及び幅である。構成的にＧ
ＥＧを発現している植物では、細胞長さは減少したが、細胞の幅における相違は
測定できなかった。 図１０は、柱頭から３００ｍ下の心皮の花柱部分の表皮に係る走査型電子顕微鏡
写真を示す。構成的にＧＥＧを発現しているｍ１系統では、コントロール系統に
対して細胞長さは減少し、細胞幅は増加した。 図１１は、心皮の柱頭部の表皮細胞上での構成的なＧＥＧ発現の効果に係る分析
である。 図１２は、外生のジベレリン酸の使用が舌状花の花冠におけるＧＥＧ発現をアッ
プレギュレートする。 図１３は、ＧＥＧ遺伝子産物のプロモーター配列、ｃＤＮＡ配列、及びアミノ酸
配列のみならず、本発明に関連する配列の開始点及び終末点が示されている。
【０００９】 （本発明の詳細な説明） 定義 本発明において使用される用語は、組換えＤＮＡ技術のみならず農業、園芸、
林業を包含する従来からの植物栽培、植物生物化学、及びを含む形質転換植物の
分野において一般的に有する意味を有する。しかしながら、本明細書中において
幾分逸脱した、あるいはより広範な意味をもって使用される用語もある。従って
、不明瞭な意味をもつ用語により起こる不確実性を回避するために、明細書及び
請求項中で使用される用語のいくつかは、以下でより詳細に定義される。
【００１０】 「Gerbera ＧＡＳＴ１様遺伝子」に当たる「ＧＥＧ」なる用語は、ガーベラ（
Gerbera hybrida）における花冠成長の最終ステージを示すライブラリーから採
取可能な、単離され、本質的に精製されたｃＤＮＡ配列（トマト由来のジベレリ
ン酸刺激転写産物１[ＧＡＳＴ１]のガーベラホモログ）を意味する。 「ＧＥＧ様核酸配列」なる用語は、当該ＧＥＧ遺伝子又はｃＤＮＡと相同性の
核酸配列を意味する。当該「ＧＥＧ様核酸配列」は、ＧＥＧの遺伝子産物（配列
番号２）のＣ末端ドメイン（配列番号１）とほぼ相同性のアミノ酸配列を有する
「ＧＥＧ様遺伝子産物」をエンコードする核酸配列によって特徴付けられる。当
該「ＧＥＧ様核酸配列」は、更にＧＥＧｃＤＮＡ（配列番号３）と核酸レベルで
ほぼ同等である。最も広範な態様において、ＧＥＧ様核酸配列は、ＧＥＧプロモ
ーター配列番号４とほぼ相同性のプロモーターを包含し、これらプロモーターは
、ＧＥＧが花冠及び花柱において本来存在するプロモーターによって方向付けら
れるのと同様に、外来遺伝子あるいは非相同性の核酸配列を方向付けることが可
能である。
【００１１】 当該「ＧＥＧ様核酸配列」は、代替として様々な方向に細胞成長を増進させた
り及び／あるいは後退させたりする、あるいは当該機能を方向付けることにより
植物の細胞成長の時空的な制御機能によって更に特徴付けられる。 そのようなＧＥＧ様の核酸配列の典型的な例としては、例えばガーベラ由来の
ＧＥＧｃＤＮＡと類似性の高い植物遺伝子の集団からのディファレンシャルハイ
ブリダイゼーションにより得られる、単離され、本質的には精製された核酸配列
を包含する。
【００１２】 「植物細胞あるいは植物器官の大きさ及び形状を変更するためのＤＮＡ構築」
なる用語は、挿入したり、ターゲッティングしたり、あるいは植物細胞及び植物
器官の大きさ及び形状を制御するための、任意のプロモーター、エンハンサー、
又はシグナル配列と組合わされた少なくとも１つの核酸配列を含む適切なベクタ
ー及び／あるいはＤＮＡ構築を意味する。
【００１３】 「ＧＥＧ遺伝子産物」なる用語は、ＧＥＧ様の核酸配列によりエンコードされ
た、先に特徴付けられた推定の細胞壁タンパクと類似性の高い推定されたアミノ
酸配列（配列番号２）をもつアミノ酸配列を意味する。当該「ＧＥＧ遺伝子産物
」は、配列番号２とほぼ相同性のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有すること
により特徴付けられたポリペプチドであり、該配列は、１つあるいはそれ以上の
不変のシステイン残基をもつ非常に良く保存されたＣ末端ドメインを有すること
により更に特徴付けられる。当該「ＧＥＧ様遺伝子産物」は細胞成長の時空的な
制御能力により特徴付けられ、その制御は本発明の実施例において開示される方
法により決定され得る。
【００１４】 「ＧＥＧ様遺伝子産物」なる用語は、当該ＧＥＧ遺伝子産物に加えて、ジベレ
リン酸誘導性遺伝子、すなわちトマト由来のＧＡＳＴ１、ペチュニア由来の（ジ
ベレリン誘導性遺伝子に対する）ＧＩＰ、及びシロイヌナズナ（Arabidopsis）
の（シロイヌナズナ中でのＧＡ誘導に対する）ＧＡＳＡ遺伝子ファミリーの構成
的発現あるいは誘導発現により得られる物質を包含する。発現が外因性のジベレ
リン酸（ＧＡ３）の使用によりまた誘導され得るＧＥＧ及びＧＥＧ様遺伝子は、
植物ホルモンを媒介した細胞伸長に関与する。細胞成長の方向及び大きさを制御
し、そして植物細胞及び／あるいは植物器官の形状を変更する機能を有する植物
を製作するためにＧＥＧ様遺伝子産物を使用した。
【００１５】 「時空的な制御(spatiotemporal control)」なる用語は、当該ＧＥＧ様核酸配
列及びその発現産物が、調整可能で有利な時間間隔をもって縦方向、及び／ある
いは半径方向を包含する様々な方向への細胞成長を増進、及び／あるいは後退さ
せたり、阻害したりすることにより細胞成長を制御する、すなわち、調節し、及
び／あるいは調整することが可能であることを意味する。 「ほぼ相同性の(substantially homologous)」なる用語は、ＧＥＧ遺伝子産物
がアミノ酸レベルで少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、最も好ま
しくは少なくとも５５％の相同性を有することを意味する。
【００１６】 「定義されたハイブリダイゼーション条件」なる用語は、５８℃、２ｘＳＳＣ
と、５８℃、０.２ｘＳＳＣとの条件の間で変動するハイブリダイザーション条
件を意味する。上限であればガーベラと密接に関連する遺伝子が獲得できるし、
少なくとも５８℃、０.２ｘＳＳＣの下限であれば、特には相同性Ｃ末端ドメイ
ンをエンコードする核酸配列の一部分が排除されたような時にＧＥＧ遺伝子が獲
得できる。
【００１７】 「植物細胞系統」なる用語は、ＧＥＧ様遺伝子がそれ自体既知の方法で中に挿
入される細胞系統、あるいは特には半径方向の細胞成長を増進し、縦方向の細胞
成長を阻害する、細胞成長の方向及び大きさを制御し得る機能を有するＧＥＧ様
遺伝子産物を発現することが可能な細胞系統を意味する。 「形質転換植物」なる用語は、細胞中に少なくとも１つＧＥＧ様の遺伝子が導
入あるいは統合されていて、細胞が特には半径方向の細胞成長を増進し、縦方向
の細胞成長を阻害する、あるいはその逆の、細胞成長の方向及び大きさを制御し
得る機能を有するＧＥＧ様遺伝子産物を発現することが可能な植物を意味する。 「ＧＥＧ様遺伝子産物及びその誘導体」なる用語は、当該ＧＥＧ産物の切断型
、複合型も誘導型も含む、ＧＥＧ産物の可能なスプライス変異で、植物における
細胞成長を時空的制御し得る機能を依然として有する変異をすべて包含する。
【００１８】 結論として、本発明における最も広範な態様での「ＧＥＧ様遺伝子産物」は、
別個の存在として、あるいは如何なる組合せでも、異なる起源からのアイソフォ
ームを含む正常なＧＥＧ様分子のみを包含するのではない。該用語は、活性型で
及び前述の型の如何なる組合せのみならず、そのフラグメント型、切断型、誘導
型、及び／あるいは複合型で、挙げられる遺伝子産物をすべて包含し、これら遺
伝子産物は、前段落で定義される前提条件を満たしている。
【００１９】 「アイソフォーム」なる用語は、例えば植物の異なる種のような異なる起源に
由来する同じタンパクの異なる形態をいう。本発明においては、該用語は、フラ
グメント、複合体、及び誘導体を包含する。例としては、ＧＥＧ様遺伝子産物は
、例えば切断により作成される。様々な酵素反応及び非酵素反応、タンパク分解
性の及び非タンパク分解性の反応を包含する様々な反応が、当該ＧＥＧ遺伝子産
物の切断型、誘導型、複合型を作成可能である。それらは、植物の細胞成長に係
る時空的な制御能力の前提条件を満たす限り、本発明に組み込まれる。 「変更」なる用語は、植物の細胞成長の時空的な制御機能すなわち、細胞成長
の方向及び大きさ、そして植物における、特には花の発育期の器官形状を分子的
な調節によって調整することを意味する。
【００２０】 「細胞成長の時空的な制御を有する植物の製作」なる用語は、植物が本発明に
係る１つあるいはそれ以上の核酸配列を保有するＤＮＡ構成物又はベクターを植
物細胞中に組み込む（挿入する）ことにより作成された形質転換植物であり、ジ
ベレリン酸（ＧＡ３）あるいはオーキシンの投与により誘導されて当該挿入断片
を発現し得る、あるいは当該挿入断片を構成的に発現している植物を意味する。
当該植物細胞は、植物において器官を再形成させるために様々な方向へ時空的に
細胞成長を方向付けることが可能である。
【００２１】 本発明に係るＧＥＧ様の核酸配列により発現されたＧＥＧ様遺伝子産物は、従
って個々の用途に対して植物細胞又は植物器官の大きさ及び形状を変更したり調
整したりするのに有益である。 ＧＥＧ様核酸配列のみならずその発現産物は、農業、園芸、及び／あるいは林
業における個々の用途に最も適した植物細胞または植物器官の大きさ及び形状を
獲得するよう、様々な方向、あるいは、縦方向及び／あるいは半径方向へ植物の
細胞成長を方向付けることにより改変可能な大きさ及び／あるいは形状を有する
植物細胞又は植物を製造するために利用され得る。
【００２２】 もし植物の縦方向の成長が増進して、パルプや紙産業での用途に対してより長
い線維が作成されるようになったり、あるいは園芸でより長い花茎が作成される
ようになったり、もしくは植物細胞の縦方向の成長が後退して、より短い茎の作
物が作成されるようになり、抵抗性が増し、それにより農業及び園芸の用途に対
して作物が倒されないようにできれば、特には望ましい。
【００２３】 （発明の一般的な説明） 近年、植物における細胞成長の制御についての知識が加速度的に蓄積されてい
るが、花の発育期における器官の形状の分子的な制御はいまだにほとんど知られ
ていない。ＧＥＧ様遺伝子／タンパクファミリーが、細胞伸長を調節する際のＧ
ＥＧの役割を示唆し得るいくつかの特徴を共有している。「ＧＥＧ様遺伝子とそ
の遺伝子産物」とは、新規のものも従来から既知のものも両方含み、細胞成長の
方向及び大きさを制御し、植物細胞及び／あるいは植物器官の形状を変更し得る
機能を有する植物の製作に有益である。
【００２４】 ディファレンシャルハイブリダイゼーション技術を用いることにより、本願発
明者らは、ガーベラにおける花冠成長の最終ステージを示すライブラリーからＧ
ＥＧが指定されたｃＤＮＡ（トマト由来のジベレリン酸刺激転写産物１[ＧＡＳ
Ｔ１]に対するガーベラホモログ）を単離した。花冠及び心皮におけるＧＥＧ発
現は、時間的には花の開花と同時におこることが十分に示された。花冠及び花柱
において、ＧＥＧ発現は、時間的には縦方向の細胞伸長の停止と相関する。構成
的にＧＥＧを発現している植物において、花冠や花茎の器官の細胞伸長の後退に
付随して花冠の長さが減少及び短くなって半径方向に伸長された花柱部分を有す
る心皮が見られ、花柱においては半径方向の細胞伸長の増加が認められた。
【００２５】 花の器官形状のもつ規則性が高度であるため、本願発明者らは、分子的及び遺
伝的なアプローチを用いて植物における器官形成の基盤を研究することが有益で
あろうと想定した。ガーベラ（Gerbera hybrida：キク科）において、花冠に係
る最も顕著な部分は舌状花冠の様の葉身であり、これは３つの花弁列片の合併に
よるものである（Bremer K.、Asteraceae、Cladistics & Classification、Port
land、Timber Press、1994年；Helariutta Y.他、Plant Mol. Biol.、22、183〜
193頁、1993年）。
【００２６】 心皮の花柱部分は、微細で細長い非光合成的な構造である。花冠のｃＤＮＡラ
イブラリーに係るディファレンシャルハイブリダイゼーション用いることにより
、ｃＤＮＡであるＧＥＧ（gerbera ＧＡＳＴ１様遺伝子に当たる）が単離され、
ＧＥＧが、ガーベラにおける花冠及び花茎の発育期の細胞形状の調節に関与する
ことが示された。ＧＥＧ発現は、空間的にも時間的にも花冠の開花及び花冠伸長
の停止と相関する。心皮において、ＧＥＧ発現の誘導は花柱伸長の停止と同時に
おこる。構成的にＧＥＧを発現している形質転換植物において、花冠は形質転換
していない株の花冠と比較すると短い。花冠と同様に、構成的なＧＥＧ発現によ
り心皮は短くなるが、また付随する花柱が半径方向への伸長する。本発明におい
て、花冠の舌状部分と花柱の両表皮細胞は、器官の軸に沿った長さが減少するこ
とが示されている。花柱における表皮細胞の半径方向の伸長がまた認められた。
この結果は、前述の植物ホルモンを媒介した細胞伸長はまた、所望の方向の植物
成長を制御する新しい方法及び手段を提供するために、農業及び林業において適
用され得ることを示唆している。
【００２７】 データベース調査において、ＧＥＧは、システインリッチなドメインを有する
推定の小さな細胞壁タンパクと推定のペプチド配列をエンコードする遺伝子ファ
ミリー（トマト由来のＧＡＳＴ１、シロイヌナズナ由来のＧＡＳＡ１〜４とペチ
ュニア由来のＧＩＰ、及びトマト由来のＲＳＩ−１）に属することが示された（
Shi L.他、Plant J.、2、153〜159頁、1992年；Taylor B. H.他、Mol. Gen. Gen
et.、243、148〜157頁、1994年；Herzog M.他、Plant Mol. Biol.、27、743〜75
2頁、1995年；Ben-Nissan G.他、Plant Mol. Biol.、32、1067〜1074頁、1996年
）。ＧＥＧ発現は、実験的にはジベレリン酸（ＧＡ３）処置により誘導され、こ
れは、当該遺伝子がジベレリン酸又はオーキシンにより調節されやすいことを示
している先行文献と同様である。得られた結果は、ＧＥＧが花冠及び心皮の発育
期において機能する植物ホルモンを介した細胞伸長メカニズムに重要であり、そ
のメカニズムは農業及び林業の用途に対してより望ましくて有利な構造をもつ植
物原料を使用するための新しい方法及び手段を発展させるのに有益となり得るこ
とを示している。
【００２８】 ＧＥＧの発現パターンは、花冠と心皮との両方における器官及び細胞伸長の完
了と相関する。更には形質転換植物において、構成的なＧＥＧ発現は、過剰のＧ
ＥＧ産生が花冠及び心皮の発育期の器官及び細胞の形状を変更可能であることを
実証する。このことは、ＧＥＧが、花冠及び心皮の形態形成期において細胞の形
状を決定するのに関与し、従って植物におけるＧＥＧ様遺伝子の役割についての
機能的な情報を提供していることを示唆する。
【００２９】 心皮において、構成的なＧＥＧ発現は、縦方向の成長と半径方向の成長との負
の相関関係を示す。上述のように、このことはまた、表皮細胞においては明らか
である。しかしながら、花冠では構成的なＧＥＧ発現のために表皮細胞の半径方
向の伸長は見られない。更には、心皮では内生のＧＥＧ発現ステージ期に、花柱
幅の増加は見られなかった（図４Ｄ）。このことは、ＧＥＧの主な役割が細胞伸
長を阻害することであることを示唆するだろう。この仮説によると、構成的なＧ
ＥＧ発現は、縦方向の細胞伸長を時期尚早に阻害する。これにより花柱の表皮細
胞において見られるように、半径方向に受動的に方向付けられる細胞の成長ポテ
ンシャルがもたらされるであろう。ＧＥＧが半径方向の伸長を促進し、縦方向の
伸長を阻害するという別の仮説もまたあり得る。本発明においては、走査型電子
顕微鏡写真より表皮細胞の大きさを測定し、ＧＥＧ発現を内在する実質細胞中で
観察した。この所見は、細胞形状における相似的な変化が、他の植物細胞におい
てもまた起こりうることを示している。細胞伸長に加えて細胞分裂もまた、分析
されるステージで最終的な形状の決定の一因となり得ることは可能であるけれど
も、細胞伸長と器官伸長とが並行しておこることは明らかである。
【００３０】 ＧＥＧとオルソロガスな遺伝子が、従来から様々な植物において述べられてき
た（例えばＧＡＳＴ１（トマト）、ＧＡＳＡ１〜５（シロイヌナズナ）、ＧＩＰ
（ペチュニア）、及びＲＳＩ−１（トマト））（Shi L.他、Plant J.、2、153〜
159頁、1992年；Taylor B. H.他、Mol. Gen. Genet.、243、148〜157頁、1994年
；Herzog M.他、Plant Mol. Biol.、27、743〜752頁、1995年；Ben-Nissan G.他
、Plant Mol. Biol.、32、1067〜1074頁、1996年）。
【００３１】 ＧＥＧ様遺伝子／タンパクファミリーは、細胞伸長を調節する際のＧＥＧの役
割を示唆し得るいくつかの特徴を共有する。ＧＥＧ発現に係る本願発明者らの研
究、及びいくつかの構成要素（ＧＥＧ、ＧＡＳＴ１、及びＲＳＩ−１）がディフ
ァレンシャルスクリーニング法に基づいて単離されているという事実に基づいて
、本願発明者らは、そのｍＲＮＡは、比較的豊富で、遺伝子産物に対する構造上
の役割に特徴的であると結論づけることが可能である。更には、推定のシグナル
配列及び他のターゲットシグナルの欠如は、該遺伝子産物がおそらく細胞壁に分
泌されることを示唆する（Shi L.他、Plant J.、2、153〜159頁、1992年）。他
の特性は、植物ホルモンによる遺伝子発現の調節である。効果的なホルモンの多
様性は、該遺伝子の役割がシグナルの切断後、様々なシグナル伝達通路の下流と
なり得ることを示している。
【００３２】 ＧＥＧの主な役割が軸方向の細胞伸長を阻害し得ることであることを示唆して
いる形質転換植物のデータをふまえて考慮すると、ＧＥＧ様の機能は、一般的に
は植物における器官形成期の細胞壁特性の確立に関わっていることが考えられ得
る。 本発明は、方法と結果が詳細に記載される以下の部分において更に記載される
。これら方法のみならず得られた結果は、本発明の保護範囲を制限するものとし
て解釈すべきではない。前述の記載に基づいて当業者は、等しく十分機能する農
業及び林業に対して望ましくて有利な他の用途が発生することを容易に考え得る
。
【００３３】 実施例１ 植物材料 本発明の調査で使用されるGerera hybrida van terra Regina（ガーベラ）は
、Terra Nigra BV、オランダから入手した。該ガーベラのコントロール植物及び
形質転換植物は特定の条件下（並行して）同時に育てられ、植物の年齢は同じで
あった。花序の発育ステージは、Helariutta Y.他、Plant Mol. Biol.、22、183
〜193頁、1993年中に記載されている。すべての分析について、サンプルは、開
花の最も外側の舌状花から採取し、それぞれ形質転換及びコントロールの植物サ
ンプルは、同時に採取し処置する。
【００３４】 実施例２ 植物形質転換 ガーベラの形質転換は、従来から述べられているようにAgrobacterium tumefa
ciensを介する遺伝子転写を用いて実施した（Elomaa P.他、Bio/Technology、11
、508〜511頁、1993年）。形質転換は、葉におけるＧＥＧ発現を示すＲＮＡブロ
ット分析及びＤＮＡブロット分析により検証した。これらの分析は、オリジナル
の形質転換植物（Ｔ０）のクローン上で実施した。
【００３５】 実施例３ 植物ＤＮＡ及びＲＮＡの単離 植物ＤＮＡは、Dellaporta S. L.、Plant Mol. Biol. Rep.1、19〜21頁、1983
年による方法を用いて単離した。全てのＲＮＡは、Jones J. D. G.他、EMBO J.
、4、2411〜2418頁、1995年に記載されるように、あるいはRNeasy 植物総ＲＮＡ
キット（Qiagen、Chatsworth、カナダ）によって単離した。Poly(Ａ)+ＲＮＡは
、オリゴ(dT)セルロースアフィニティークロマトグラフィーを用いて単離した（
Sambrook J.他、Molecular Cloning：A Laboratory Manual.、Cold Spring Harb
or NY：Cold Spring Harbor Laboratory、1989年）。
【００３６】 実施例４ 花冠ｃＤＮＡライブラリーの構築及びディファレンシャルスクリーニング 発育ステージ５〜９（Helariutta Y.他、Plant Mol. Biol.、22、183〜193頁
、1993年）での舌状花の基部から抽出されたポリアデニル化ＲＮＡ（５μｇ）は
、ＺＡＰIIベクター（ＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キット；Stratagene、La Jolla、カ
ナダ）中でｃＤＮＡライブラリーを構築するために使用された。増幅されていな
いｃＤＮＡライブラリーから、約５０,０００プラークをプレートに蒔き、レプ
リカのナイロン膜上に転写し、そしてその後、舌状花冠の基部及び先端部に係る
舌状花の筒領域から放射標識された１本鎖ｃＤＮＡプールを用いてディファレン
シャルにスクリーニングした（１本鎖ｃＤＮＡ合成キット；Amersham）。
【００３７】 ＧＥＧｃＤＮＡは、舌状花冠の先端部よりも基部において強く発現されるクロ
ーンとして単離された。２つの別個であるが、同じｃＤＮＡクローンを単離し、
ｐＵＣ１８誘導体中にサブクローニングし、そしてAutoaRead キット（Pharmaci
a、Uppsala、スウェーデン）を用いて配列決定した。ＧＥＧプロモーターの一部
を含む８１３塩基対の遺伝子フラグメントは、ゲノムＤＮＡ上でのＰＣＲ増幅の
ような５'ＲＡＣＥ用いることにより得た。ＧＥＧｃＤＮＡ配列及びＧＥＧ遺伝
子の５'フランキング領域の配列は、ＥＭＢＬデータベースに寄託され目録番号
は、それぞれAJ005206及びAJ006273である。
【００３８】 実施例５ ＲＮＡロボット分析及びin situハイブリダイゼーション レーン当たり総ＲＮＡ量で１５μｇを充填した。充填されるＲＮＡ量は、分光
光度計により測定し、当量充填したことは、ｒＲＮＡバンドのエチレンブロミド
染色により確認した。電気泳動及びハイブリダイゼーションは、Sambrook他、19
89年に記載の通りに実施した。２５９塩基対の３'フラグメント（そのうちの２
３４塩基対は、非コード領域）がプローブの役割をした。０.２ＳＳＣの洗浄条
件（１ＳＳＣは、０.１５Ｍ ＮａＣｌ及び０.０１５Ｍ クエン酸ナトリウム）で
０.１％ＳＤＳ、５８℃をすべてのＲＮＡブロットにおいて適用した。In situハ
イブリダイゼーションは、３５Ｓ−ＣＴＰ標識アンチセンス及びセンス(コント
ロール)ＲＮＡプローブを用いるKotilainen M.他、Plant Mol. Biol,、26、971
〜978頁、1994年に従来記載の通りに実施した。該プローブは、ｐＳ７３ベクタ
ー中のＴ７プロモーターのもとでのゲルプロット試験で使用されるのと同じフラ
グメントから転写した（ＳＰ６/Ｔ７転写キット；Roche Diagnostics、Mannheim
、ドイツ）。
【００３９】 実施例６ 走査型電子顕微鏡分析 コントロール植物及び形質転換植物の花冠及び心皮サンプルを、同時並行で更
に処置した。それらは、ＦＡＡ緩衝液（５０％エタノール、５％酢酸、及び２％
ホルムアルデヒド）中で一晩固定し、その後１００％エタノールまでのエタノー
ルノ−ル系列を移動させて臨界点乾燥し（Balzers CPD 030 Critical Point Dry
er、Bal-Tec、リヒテンシュタイン）、白金／パラジウムでコーティングした（A
gar Sputter Coater、Agar Scientific Ltd、イギリス）。試料を、グラファイ
ト性接着剤又はテープを用いてアルミニウムスタブに載せ、the Electron Micro
scopy Laboratory、バイオテクノロジー研究所、ヘルシンキ大学で走査型電子顕
微鏡（Zeiss Digital Scanning Microscope DSM 962、Karl Zeiss、ドイツ）を
用いて検定した。
【００４０】 実施例７ 器官と細胞の測定及び統計解析 器官の長さと幅の測定は、心皮幅を除いては、in vivoで副尺付きカリパスを
用いて実施され、心皮幅は、柱頭から２００μｍ下の走査型電子顕微鏡写真から
測定した。細胞の長さと幅は走査型電子顕微鏡写真を用いて測定した。 構成的なＧＥＧ発現により引き起こされる器官と細胞の伸長の差が統計的に有
意であるのかどうかを検討するために、Student t test及び／あるいはRank sum
testを実施した。もし、サンプルの正規性及び等分散性が確認されたなら（棄
却すべきＰ値は＜０.０５０）パラメトリックなt testを用いた。いずれかが確
認されなければ、ノンパラメトリックなRank sum testがを用いた。本検定で記
載される全ての統計的な有意差において、信頼水準はＰ＜０.００１である。
【００４１】 実施例８ ディファレンシャルスクリーニングによるＧＥＧｃＤＮＡの単離 両方とも空間的に制限されたアントシアニン色素形成パターンである、推定の
シグナル配列と他の標的シグナルの欠損とは、他の特性が植物ホルモンによる遺
伝子発現調節をすることを示唆する。有効なホルモンの可変性は、該遺伝子の役
割が、収束後、様々なシグナル伝達路の下流となり得ることを示し（Helariutta Y.他、Plant Mol. Biol.、22、183〜193頁、1993年）、ガーベラ舌状花の花冠
のさまざまな領域における遺伝子産物の集積パターン（Helariutta Y.他、未発
表）は、花冠の縦軸に沿った遺伝子発現に係る領域特異的な制御を示している。
本願発明者らは、花冠内部の発現差を有する遺伝子を単離するために花冠の形態
形成の最終ステージ期に縦方向の軸に沿っていくつかのディファレンシャルスク
リーニングスキームを実施した。本明細書において本願発明者らは、先端部より
も花冠の基部において発現が強いクローンとしてｃＤＮＡを単離した。ＧＡＳＴ
１様遺伝子と相同性が高いことから、本願発明者らは、このｃＤＮＡをＧＥＧと
名づけた。
【００４２】 配列比較により、ＧＥＧが様々な植物において植物ホルモンにより転写的に調
節される遺伝子ファミリーに属することを示す。予測されたＧＥＧタンパクは、
ジベレリン酸（トマト由来のＧＡＳＴ１、シロイヌナズナ由来のＧＡＳＡ１〜４
、及びペチュニア由来のＧＩＰ）、又はオーキシン（トマト由来のＲＳＩ−１）
により発現が誘導される遺伝子によりエンコードされるタンパクと高い配列相同
性を有する（Shi L.他、Plant J.、2、153〜159頁、1992年；Taylor B. H.他、M
ol. Gen. Genet.、243、148〜157頁、1994年；Herzog M.他、Plant Mol. Biol.
、27、743〜752頁、1995年；Ben-Nissan G.他、Plant Mol. Biol.、32、1067〜1
074頁、1996年）。該由来ポリペプチドの全ては、von Heijne G.、Nuclear acid
research 14、4683〜4690頁、1986年により予想される切断部位を持つＮ末端部
に推定のシグナル配列を有する。他の標的シグナルは、同定されていないので、
これらの遺伝子産物を細胞外スペース中にあるいは細胞壁中にターゲッティング
することが提起されている。６０のＣ末端アミノ酸のうち、２２の同一残基があ
り、そのうち１２はシステインである。
【００４３】 ＤＮＡゲルブロット分析の間、プローブ（ＧＥＧｃＤＮＡに係る２５９塩基対
の３'フラグメント、９０％非コード）は、ＲＮＡゲルブロッティング用途での
厳密性では１つ又は２つのバンドを認識した。これにより、以下で示される発現
分析結果が１本の遺伝子座の転写産物と一致し、いくつかの分解物中に見られた
２つのバンドは、ヘテロ接合性の栽培品種における制限多型によるものであるこ
とが最も予想される。低厳密性のＤＮＡゲルブロット分析の間、完全な長さのＧ
ＥＧｃＤＮＡプローブはより多くのバンドを認識し、これによりガーベラのゲノ
ム中にＧＥＧ様の遺伝子に係る小さな遺伝子ファミリーがあることことが示唆さ
れる（データなし）。
【００４４】 実施例９ ＧＥＧｍＲＮＡが花冠及び心皮中に豊富にある ＧＥＧの発生上の発現パターンは、ＲＮＡゲルブロット分析を用いて検討した
。ＧＥＧの発現は、花器中で最も高く、加えてかすかなシグナルが、葉身からの
ＲＮＡ中で検出された。強いＧＥＧ発現が花冠組織（筒状領域と舌状領域との両
方）及び心皮で認められ、花茎（floral stem）及び花托（花茎の先端の伸長部
）では幾分弱かった（図１）。植物の成長におけるＧＥＧの役割を理解するため
に本願発明者らは、花冠及び心皮でのＧＥＧ発現に焦点をあてた。
【００４５】 ＧＥＧ発現は、舌状花の花冠の成長の様々なステージで時間的に検討した（図
２Ａ〜２Ｆ、及びHelaruitta Y.他、Plant Mol. Biol.、22、183〜193頁、1993
年）。ＧＥＧ発現は、個々の花と花序全体との両方の開花と時間的に相関し、ス
テージ７（図２Ｇ）で誘導される。ガーベラの舌状花の花冠サイズが大きいため
、本願発明者らは、時間をかけて花冠の様々な部分からＲＮＡを単離し、ＲＮＡ
ゲルプロット分析を用いてＧＥＧ発現の発生的な誘導パターンを検討することが
可能である。そのパターンは、興味深いものである。花の開花−花冠が開く−直
前に、ＧＥＧ発現が花冠の両末端部からほぼ同時に開始する。そのまさに第１の
シグナルは花冠の基部、より正確には筒状及び舌状領域の結合部に見られる（図
２Ｈ：ステージ７）。開花期において基部での発現は両方向：筒状部へと求底的
に、及び舌状部へと求頂的に進展する。基部での発現の開始とほぼ同時に、ＧＥ
Ｇ発現は、花冠の先端部からもまた始まる。この発現は舌状部の中央部に向けて
求底的に進行し、その中央部でちょうど花冠が開いたときに基部と先端部の両発
現ドメインが交わる（図２Ｈ：ステージ８）。ＧＥＧ発現は、老齢化するまで高
レベルで続く（データなし）。ＧＥＧ発現パターンのin situハイブリダイザー
ション分析により、花冠の開花期の葉肉中と表皮中との両方において転写産物が
検出されることが示された（図３）。
【００４６】 心皮において、ＧＥＧ発現を、発育ステージ６及び８で舌状花の前と後のそれ
ぞれから採取されたサンプルからのＲＮＡを用いてゲルブロッティングにより検
討した（図２Ｃ〜２Ｆ、及びHelariutta Y.他、Plant Mol. Biol.、22、183〜19
3頁、1993年）。図２Ｇで見られるように、ＧＥＧ発現の開始は、花の開花と同
時におこる。花柱において、ＧＥＧｍＲＮＡは、外側の表皮及び実質部（皮質）
で検出されたが、透過組織では検出されなかった（図３Ａ）。
【００４７】 実施例１０ ＧＥＧ発現の花冠及び心皮における器官と細胞伸長の停止との時間的な相関 花冠成長に係る生物測定分析（図４）は、開花前に花冠が縦方向にも横方向に
も伸長することを示している。開花後まもなく、両方向の成長が止まる（図４Ａ
及び４Ｂ）。時間的には、ＧＥＧ発現は花冠成長の停止に正確に従い、開花直後
では花冠組織中のあらゆる所で検出される（図２Ｄ〜２Ｆ、及び２Ｈ）。
【００４８】 花冠の先端−基底軸に沿った時間的なＧＥＧ発現パターンは、ＧＥＧ発現が、
細胞伸長の停止と相関するかどうかを分析するのに重要であった。ステージ７直
後（７＋）及びステージ８で、花冠の先端領域及び中央領域での細胞の長さを測
定した（それぞれ図２Ｈ、領域７及び５）。これらのステージでは、ＧＥＧｍＲ
ＮＡは、先端領域には存在するが、ステージ８の直前に中央領域に到達する（図
２Ｈ）。細胞長さの測定により、先端領域の細胞は伸長せず、一方、中央領域に
おいては軸方向の細胞伸長がおこることが明らかになった（図５Ａ）。ステージ
８の中央部の細胞と他の集団との間の細胞長さの差は、統計的には有意である（
Rank sum test、Ｐ＜０.００１）。ステージ７＋と８との間で花冠の先端部及び
基部の両方において細胞幅の成長が認められた（図５Ｂ）。従って、ＧＥＧ発現
は、先端−基底軸に沿った細胞伸長の停止と厳密に相関する。
【００４９】 花冠と同様に、心皮の器官形成を生物測定分析を用いてより詳細に特徴付けた
（図４）。花序発育の様々なステージで、最も外側の舌状花における心皮の長さ
及び幅を測定した。舌状花の花冠及び花序全体の開花は、心皮の縦方向の伸長の
変化と同時におこる。
【００５０】 花の開花前に心皮の伸長がおこり、開花直前で伸長は最も早い。開花後、心皮
の伸長は停止する（図２Ｆ及び４Ｃ）。半径方向においては、伸長期間及びその
後では、花柱は統計的には伸長しない（図４Ｄ）。従って、心皮において伸長の
停止はまた、ＧＥＧ発現と時間的に相関する。
【００５１】 器官においては記載されたパターンで細胞伸長がおこり、花の開花前に花柱の
表皮細胞は伸長するが、その後は伸長しない（図４Ｅ）。それゆえ、細胞伸長は
、少なくとも大部分が、上述で見られた心皮の成長によって引き起こる。花冠及
び心皮の両方において、ＧＥＧ発現は先端−基底軸に沿った細胞伸長の停止と時
間的に相関する。
【００５２】 実施例１１ 過剰発現ＧＥＧがより短い花冠を有する形質転換植物 ＧＥＧの発生の調節に係る詳細な時間分析は、転写産物が花冠及び心皮の両方
での細胞伸長の停止と相関することを示す。この所見に基づいて本願発明者らは
、ＧＥＧポリペプチドの機能的役割が細胞伸長を停止させることであると仮説を
たてた。この仮説を検討するため本願発明者らは、ＧＥＧ発現が構成的に活性プ
ロモーターの制御下にある形質転換植物を作成した。該植物においては、構成的
なＧＥＧ発現は、細胞伸長の時期早尚の阻害し、短い細胞を有する短い器官とな
るはずである。
【００５３】 Agrobacterium tumefaciensが媒介した形質転換を介してカリフラワーモザイ
クウィルス３５Ｓプロモーターの調節の下でＧＥＧｃＤＮＡをガーベラに導入し
た。４つの構成的にＧＥＧを発現している系統が作成され、４つの形質転換植物
及びコントロール植物において２０の最も外側の舌状花の花冠の長さと幅とに係
る分析が、花冠成長が停止した発育ステージ９で行われた。構成的にＧＥＧを発
現している４系統（ｍ１、ｍ３、ｍ２、及びｍ５）は全て、形質転換していない
系統及びアンチセンス方向にＧＥＧで形質転換した２つのコントロール系統と比
較すると花冠が短く、ＧＥＧ発現の低下はない、あるいはわずかであるという結
果となった（図６及び図７Ａ；有意にＧＥＧ発現レベルが減少したアンチセンス
系統は得られなかった）。花冠長さの差は統計的には有意であった（t test/Ran
k sum test；Ｐ＜０.００１）。対照的に構成的にＧＥＧ系統を発現している系
統に係る全ての植物における花冠幅は、コントロール系統と比較して変化がなか
った（図７Ｂ）。
【００５４】 実施例１２ ＧＥＧの構成的発現が花冠の細胞長さを減少させる 花冠及び心皮の表現型に係るより詳細な分析を、以下に示されるような形質転
換していないコントロール系統と一緒に２つの形質転換系統ｍ１及びｍ３を用い
て実施した。これらの形質転換におけるＧＥＧの構成的発現は、内因性ＧＥＧ発
現がまだ存在しない発育ステージ６での花冠断面のin situ ハイブリダイゼーシ
ョンにより、及び内因性発現がとても低い葉の組織のＲＮＡゲルブロット分析に
より実証した。In situ 分析は、全ての細胞タイプがＧＥＧを過剰発現している
ことを示している（データなし）。
【００５５】 コントロール系統と一緒にｍ１及びｍ３の両花冠において、表皮細胞の長さ及
び幅を、発育ステージ８で向軸側の舌状花の舌状花冠の基部先端の中央部で測定
した（図８Ａ）。構成的にＧＥＧを発現している植物において、細胞長さは、統
計的に有意に減少した（t test；Ｐ＜０.００１）が、細胞幅の差は測定されな
かった（図８Ｂ、８Ｃ、９Ａ、及び９Ｂ）。結論としては、構成的ＧＥＧ発現の
主な効果は、舌状花冠における表皮細胞の軸方向の細胞伸長の停止である。
【００５６】 実施例１３ 構成的にＧＥＧを発現している系統では、花柱の表皮細胞はより短く幅広い コントロール系統と比較して、構成的にＧＥＧを発現している形質転換系統で
は、心皮の長さは減少し、心皮の直径は増加した（図１０、１１Ａ、及び１１Ｂ
）。構成的にＧＥＧを発現しているｍ１及びｍ３系統と、コントロール系統との
間の花柱表皮細胞の細胞の長さ及び幅の比較により伸長パターンの変化が明らか
になった。内因性の発現の前であるステージ６でさえ、細胞の長さ及び幅の統計
的な有意差が認められた（t test；Ｐ＜０.００１）。構成的にＧＥＧを発現し
ているｍ１及びｍ３系統においては、コントロール系統と比較すると細胞の長さ
は減少し、幅は増加した（図１０、１１Ｃ、及び１１Ｄ）。構成的発現の表現型
は、ＧＥＧ遺伝子産物が心皮の発育期のみならず花冠の発育期の軸方向の細胞伸
長を調節する見解を支持する。しかしながら、心皮においては、花冠とは違って
本願発明者らは、半径方向の大きさにおいて同時におこる逆の効果を認めた。
【００５７】 実施例１４ ジベレリン酸と花冠におけるＧＥＧ発現の調節 相同性遺伝子（導入部参照）のすべては、植物ホルモンによって誘導されるた
め、そして発現は、空間的及び時間的に調節されるため、本願発明者らは、ＧＥ
Ｇ発現がＧＡ３に応答するかどうかを検討した。外生ＧＡ３の使用は、独立した
花序に係る舌状花の花冠でのＧＥＧ発現をアップレギュレートした（図１２）。
ＧＡ３の短いパルスは２時間でＧＥＧを誘導可能であった。しかしながら、ＧＥ
ＧｍＲＮＡの最大レベルは、ＧＡ３使用後２４時間よりも前には見られなかった
ことから、ＧＥＧ発現に係るＧＡ刺激は間接的である、あるいはジベレリン酸濃
度の減少（増加ではなくて）がＧＥＧ発現を誘導することが考えられる。
【００５８】 本願発明者らは、ＧＥＧのゲノムの５'フランキング配列をまた単離した。そ
の配列は、発現がジベレリン酸で調節される米と大麦のαアミラーゼ遺伝子のフ
ランキング領域で見られる２つの配列モチーフを包含する（Huang N.他、Plant
Mol. Biol.、14、655〜668頁、1990年；Skriver K.他、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 88、7266〜7270頁、1991年）。このことは、ＧＥＧ発現がジベレリン酸に
よって発育上調節されているという概念を更に支持する。
【００５９】 図１．ＧＥＧ発現の組織特異性を示すＲＮＡゲルブロットハイブリダイゼーシ
ョン分析 ＲＮＡゲルブロットのオートラジオグラフィーは、ＧＥＧｃＤＮＡ（９０％非
コード）に係る２５９塩基対の３'フラグメントを用いてプローブした。レーン
当たり１５μｇの総ＲＮＡを充填し、等量充填されていることはエチジウムブロ
ミド染色により確認した。いくつかの発育ステージを包含する器官を検定した。
花茎は花の茎部分で；花托は花茎の先端の肥大部である。
【００６０】 図２．花冠及び心皮の発育期のＧＥＧ発現に係る分析 （Ａ）から（Ｆ） Helariutta他（1993年）によるガーベラの花序の様々な発
育ステージである。 （Ａ） 発育ステージが１であり、（Ｂ）は３、（Ｃ）は５、（Ｄ）は７、（
Ｅ）は７.５、そして（Ｆ）は８である。 （Ｇ） 心皮及び花冠におけるＧＥＧ発現は、個々の舌状花と花序全体との両
方の開花と相関する。 舌状花の花冠の空間的区分 領域はゲル上に示されている。発現の開始は、花
冠の両末端から（ステージ７、領域２及び７）でちょうど花冠開花したときにお
こる。両発現ドメインは舌状花冠の中央部で交わる（ステージ８、領域５）。領
域１は。舌状花冠の筒状部（筒）であり；３（基部）から７（先端部）の領域は
花冠の舌状部を示す。ＧＤＦＲ１は、充填のコントロールとして用いられる。発
育ステージは（Ａ）から（Ｆ）で示される通りである。
【００６１】 図３．In situハイブリダイゼーションによる心皮及び花冠でのＧＥＧ発現の分
析 両器官において（ステージ７.５）、ＧＥＧ発現が白銀染色で表皮及び実質細
胞において見られる。In situ分析は、３５Ｓ−ＣＴＰ標識のアンチセンス及び
センス（コントロール、データなし）ＲＮＡプローブを用いて実施される。プロ
ーブは、ＲＮＡゲルブロット分析で使用されるのと同じＧＥＧｃＤＮＡの３'フ
ラグメントから転写した。 （Ａ） 心皮花柱の断面図 （Ｂ） 舌状花冠の基部の辺縁領域の断面図 バー＝（Ａ）及び（Ｂ）とも１００μｍ
【００６２】 図４．花冠と心皮の長さ及び幅の発育に係る生物測定分析 （Ａ）及び（Ｂ） それぞれ花冠の長さ及び幅：時間的なＧＥＧ発現は、縦方向
及び横方向の両方向への花冠の伸長の停止と厳密に従う（図２もまた参照）。 （Ｃ） 心皮長さ：心皮での伸長の停止は、ＧＥＧ発現と時間的に相関する。 （Ｄ） 心皮幅：花冠の花柱は、伸長期又はその後は半径方向には伸長しない。
（Ｅ） 心皮の細胞長さ：心皮において花柱の表皮細胞は、花の開花前は伸長す
るが開花後は伸長せず、従って細胞伸長の抑制がＧＥＧ発現と相関する。 様々な発育ステージのタイミング（Helatuitta Y.他、Plant Mol. Biol.、22
、183〜193頁、1993年中に記載）は、本願発明者らの標準的な温室条件のもとで
５０以上の花序の発育に従って測定した。花冠と心皮との両方の長さ及び幅は、
（Ａ）から（Ｄ）で示され、各発育ステージで１５〜３０の最も外側の舌状花冠
を測定した。サンプルは、少なくとも２つの異なる花序から採取した。各時点の
７２の表皮細胞に係る心皮の細胞長さ（Ｅ）を測定した。各心皮の柱頭から２０
０〜４００μｍ下の１８の表皮細胞の細胞長さを測定し、４つの心皮の平均の細
胞長さを測定した。曲線の下の数字は、花序の発育ステージと一致する（図２Ａ
〜２Ｆ参照）。エラーバーは、標準偏差を示す。
【００６３】 図５．開花の直前及び開花後（それぞれステージ７＋及び８）の舌状花の花冠
の基部領域及び中央領域における細胞の長さ及び幅 両ステージでＧＥＧは基部では発現する一方、ＧＥＧ発現は、ステージ８(図
２Ｈ参照）の直前に中央部に到達する。 （Ａ） μｍ単位での花冠の細胞長さ 基部領域の細胞は伸長しない一方、中央
領域の細胞は伸長する。従ってＧＥＧ発現は、厳密には先端−基底の軸に沿った
細胞伸長の停止と相関する。Ｔｉｐは基部領域で；Ｍｉｄは中央領域である。 （Ｂ） 細胞幅（μｍ）の成長は、花冠の基部と中央との両領域で見られた。 細胞の長さ及び幅は、走査型電子顕微鏡写真を用いて副尺付きカリパスで測定
した。３つの別々の舌状花の花冠ににおいて４０の細胞長さを各時点で測定した
。花冠の基部領域では、先端部から１ｍｍのところで測定を実施した。細胞幅は
、５７０μｍの長さの３６の横線上の細胞数をカウントし、各線の平均細胞幅を
カウントすることにより測定した。エラーバーは、標準偏差を示す。
【００６４】 図６．舌状花の開花前（ステージ７）、開花期（ステージ７.５）、及び開花後
（ステージ９）において、形質転換していない系統（ｗｔ）の舌状花の花冠の構
成的にＧＥＧを発現しているｍ３植物の舌状花の花冠との比較
【００６５】 図７．構成的にＧＥＧを発現している系統とコントロール系統についての花冠の
長さ及び幅に係る分析 （Ａ） 花冠長さ（ｍｍ） 野生型、構成的にＧＥＧを発現している系統（ｍ１ 、ｍ３、ｍ２、及びｍ５）、及びＧＥＧ発現の低下していない（ｔ４）又は幾分
低下した（ｔ９、８０％残留）２つのＧＥＧアンチセンス系統の最も外側の舌状
花の花冠の長さである。構成的にＧＥＧを発現している４系統のすべてが、コン
トロール系統と比較して統計的に短い花冠を有する。 （Ｂ）コントロール系統と比較すると不変である構成的にＧＥＧを発現している
すべての系統の花冠幅（ｍｍ）。 ステージ９で各系統に係る２つの花序の４０の最も外側の舌状花の花冠を選択
した。構成的にＧＥＧを発現している４系統（ｍ１、ｍ３、ｍ２、及びｍ５）、
形質転換していない系統、及び２つのアンチセンス系統（ＧＥＧ発現に影響しな
いかあるいは幾分影響のある）の花冠の幅及び長さを測定した。エラーバーは、
標準偏差を示す。
【００６６】 図８．花冠表皮細胞上での構成的ＧＥＧ発現の影響に係る分析 （Ａ） 表皮細胞は、花冠の先端−基底軸に沿って走る縦線中に組織化する。 （Ｂ） 形質転換していないコントロール系統（ステージ８）に係る舌状花の花
冠の基部の向軸（表）側の走査型電子顕微鏡写真。（Ｂ）における区域は（Ａ）
で白四角でマークしている。該表皮細胞のうちの１つを強調している。 （Ｃ） 構成的にＧＥＧを発現しているｍ１系統に係る一致した領域の走査型電
子顕微鏡写真。（Ｃ）のバー＝（Ｂ）及び（Ｃ）とも７５μｍ
【００６７】 図９．構成的にＧＥＧを発現しているｍ１、ｍ３系統、及びコントロール系統（
ｗｔ）の図８に記載と同じ領域での細胞の長さ及び幅。構成的にＧＥＧを発現し
ている植物において、細胞長さは減少するが、細胞幅の差は測定できなかった。
（Ａ） μｍ単位での花冠細胞長さ。構成的にＧＥＧを発現しているこれら２系
統における細胞長さは、コントロール系統と比較すると短く、その差は統計的に
は有意である。 （Ｂ） μｍ単位での花冠細胞幅。構成的にＧＥＧを発現しているこれらの系統
の細胞幅は、コントロール系統の細胞幅と変わらない。 形質転換していないコントロール系統と一緒に形質転換系統ｍ１及びｍ３の３
つの舌状花の花冠を選択し（ステージ８）、そして図８Ａ中の白四角でマークさ
れた領域で細胞長さ及び幅を測定した。花冠において、顕微鏡写真上に横線を引
き、長さ測定用に１ｃｍ間隔で細胞を選択した。Ｍ１、ｍ３、及びコントロール
系統につき約２００細胞の細胞長さを測した。細胞幅は、細胞幅は、５７０μｍ
の長さの３０〜３６の横線上の細胞数をカウントし、各線の平均細胞幅をカウン
トすることにより測定した（線当たりおよそ４０細胞）。
【００６８】 図１０．柱頭から３００ｍ下の心皮の花柱部分の表皮部分の走査型電子顕微鏡写
真。構成的にＧＥＧを発現しているｍ１系統において、コントロール系統と比較
して、細胞長さは減少し、細胞幅は増加した。 （Ａ） ステージ６の形質転換していないコントロール系統（Ｂ） ステージ６
の構成的にＧＥＧを発現しているｍ１系統。バー＝（Ａ）及び（Ｂ）とも１００
μｍ
【００６９】 図１１．心皮花柱の表皮細胞上での構成的ＧＥＧ発現の効果に係る分析 （Ａ） ｍｍ単位での心皮長さ 構成的にＧＥＧを発現している系統の心皮長さ
はコントロール系統と比較して短い。 （Ｂ） μｍ単位での心皮幅 コントロール系統と比較して、心皮半径は構成的
にＧＥＧを発現している系統では増加した。 （Ｃ） μｍ単位での心皮細胞長さ ｍ１及びｍ３系統の形質転換していないコ
ントロール系統との細胞長さの比較により、構成的にＧＥＧを発現している系統
の花柱の表皮細胞はコントロール系統と比較すると短いことが明らかである。 （Ｄ） μｍ単位での心皮細胞幅 構成的にＧＥＧを発現している系統の表皮細
胞は、コントロール系統と比較すると幅広い。 構成的にＧＥＧを発現している２系統（ｍ１及びｍ３）及び形質転換していな
いコントロール系統の１２から２０の心皮を測定した。心皮長さは発育ステージ
９で測定し；心皮の幅、表皮細胞長さ、及び幅はステージ６で測定した。各心皮
の柱頭から２００〜４００μｍ下の１８の別々の表皮細胞の細胞長さ、及び各系
統の１２〜２０の心皮の平均細胞長さを測定した。（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、及
び（Ｅ）で示された差は統計的に有意である。エラーバーは、標準偏差を示す。
【００７０】 図１２．外生のジベレリン酸の使用は、舌状花の花冠におけるＧＥＧ発現をアッ
プレギュレートする ＧＡ３添加後、花序の開花直前（ステージ７＋）のＧＥＧ発現を示しているＲ
ＮＡゲルブロットである。花茎（floral stem）は、花序の５ｃｍ下を切断した
。 （Ａ） コントロールの花序は５０ｍＭスクロース上で成長した。 （Ｂ） ＧＥＧ発現の誘導は、花序が５μＭ ＧＡ３を含む５０ｍＭスクロース
上で成長するときに見られた。 （Ｃ）ＧＥＧ発現の誘導は、花序を５μＭ ＧＡ３を含む５０ｍＭスクロース中
で最初５分間インキュベートし、その後５０ｍＭスクロース培地に移したときに
見られた。 ＧＡ３添加後の各時点（時間）で、約１０の舌状花の花冠をＲＮＡ単離用に採
取した。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＧＥＧ発現に係る組織特異性を示すＲＮＡゲルブロットハイブリ
ダイゼーション分析を示す。
【図２】 花冠及び心皮の発育期のＧＥＧ発現に係る分析を示す。
【図３Ａ】 In situハイブリダイゼーションによる心皮におけるＧＥＧ発
現の分析を示す。
【図３Ｂ】 In situハイブリダイゼーションによる花冠におけるＧＥＧ発
現の分析を示す。
【図４Ａ】 花冠長さの発育に係る生物測定分析を示す。
【図４Ｂ】 花冠幅の発育に係る生物測定分析を示す。
【図４Ｃ】 心皮長さの発育に係る生物測定分析を示す。
【図４Ｄ】 心皮幅の発育に係る生物測定分析を示す。
【図４Ｅ】 心皮細胞長さの発育に係る生物測定分析を示す。
【図５Ａ】 舌状花の花冠の開花直前及びその後（それぞれステージ７＋及
び８）の先端及び中央領域における細胞長さを示す。
【図５Ｂ】 舌状花の花冠の開花直前及びその後（それぞれステージ７＋及
び８）の先端及び中央領域における細胞幅を示す。
【図６】 舌状花の開花前（ステージ７）、開花期（ステージ７.５）、及
び開花後（ステージ９）で、形質転換していない系統（ｗｔ）の構成的にＧＥＧ
を発現しているｍ３植物の舌状花冠との比較を示す。
【図７Ａ】 構成的にＧＥＧを発現している４系統及びコントロール系統に
ついて花冠長さに係る分析を示す。
【図７Ｂ】 構成的にＧＥＧを発現している４系統及びコントロール系統に
ついて花冠幅に係る分析を示す。
【図８】 花冠の表皮細胞上での構成的なＧＥＧ発現の効果に係る分析を示
す。
【図９Ａ】 構成的にＧＥＧを発現しているｍ１及びｍ３系統及びコントロ
ール系統（ｗｔ）の図８に記載と同じ領域における細胞長さを示す。
【図９Ｂ】 構成的にＧＥＧを発現しているｍ１及びｍ３系統及びコントロ
ール系統（ｗｔ）の図８に記載と同じ領域における細胞幅を示す。
【図１０】 柱頭から３００μｍ下の心皮の花柱部分の表皮の走査型電子顕
微鏡写真を示す。
【図１１】 心皮の柱頭部の表皮細胞上での構成的なＧＥＧ発現の効果に係
る分析である。
【図１２】 外生のジベレリン酸の使用が舌状花の花冠におけるＧＥＧ発現
をアップレギュレートすることを示す。
【図１３】 ＧＥＧ遺伝子産物のプロモーター配列、ｃＤＮＡ配列、及びア
ミノ酸配列のみならず、本発明に関連する配列の開始点及び終末点を示す。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年１１月２８日（２００１．１１．２８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ユルイョ・ヘラリウッタ フィンランド、エフイーエン−00320ヘル シンキ、オスケランティエ８番、アー５ (72)発明者 メルヤ・メヒト フィンランド、エフイーエン−01600ヴァ ンター、ルークンテキイェンティエ４番、 セー29 (72)発明者 エイヤ・ペッレネン フィンランド、エフイーエン−01800クラ ウッカラ、ヤリンティエ18アー番 (72)発明者 パウラ・エロマー フィンランド、エフイーエン−01640ヴァ ンター、アイサティエ16アー番 Ｆターム(参考） 4B024 AA08 BA80 CA04 DA01 EA01 FA02 GA11 HA01 4H045 AA10 BA10 CA30 EA05 FA74

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＧＥＧ様核酸配列は、好ましくはＣ末端ドメインが１つある
    いはそれ以上のシステイン残基を含むガーベラＧＡＳＴ−１様ｃＤＮＡとほぼ相
    同的なＧＥＧ様遺伝子産物をエンコードすることが可能であり、当該ＧＥＧ様核
    酸配列は植物細胞の成長の時空的な制御機能、あるいは当該機能を方向付ける機
    能を有することを特徴とする、植物細胞又は植物器官の大きさ及び形状を変更す
    るために単離され、本質的に精製された核酸配列。
  2. 【請求項２】 該ＧＥＧ様核酸配列が、ＧＥＧ（配列番号２）の遺伝子産物
    に係るＣ末端部とほぼ相同性のＣ末端ドメイン（配列番号１）を有するＧＥＧ様
    遺伝子産物をエンコードすることを特徴とする、請求項１に記載の核酸配列。
  3. 【請求項３】 該ＧＥＧ様核酸配列が定義された条件下で配列番号３を用い
    てハイブリダイズすることが可能であることを特徴とする、請求項１〜２に記載
    の核酸配列。
  4. 【請求項４】 ＧＥＧ様核酸配列が、少なくとも４つ、好ましくは少なくと
    も８つ、最も好ましくは少なくとも１２のシステイン残基を含むＣ末端ドメイン
    を有するＧＥＧ様遺伝子産物をエンコードすることを特徴とする、請求項１〜３
    に記載の核酸配列。
  5. 【請求項５】 該エンコードされたＣ末端ドメインが１２のシステイン残基
    を含む、請求項４に記載の核酸配列。
  6. 【請求項６】 配列番号３を用いてガーベラから従来法により得られる核酸
    配列、トマトから得られるＧＡＳＴ１、シロイヌナズナから得られるＧＡＳＡ１
    〜４、ペチュニアから得られるＧＩＰ、及びトマトから得られるＲＳＩ−１又は
    その一部分の改良により得られる核酸配列を含むことを特徴とする、請求項１〜
    ５に記載の核酸配列。
  7. 【請求項７】 ガーベラから得られる配列番号３（ＧＥＧｃＤＮＡ）を含む
    ことを特徴とする、請求項１〜６に記載の核酸配列。
  8. 【請求項８】 ＧＥＧプロモーター配列（配列番号４）を含むことを特徴と
    する、核酸配列。
  9. 【請求項９】 ＧＥＧ様遺伝子産物が、１つあるいはそれ以上可能なシステ
    イン残基を含む配列番号１とほぼ相同性のＣ末端ドメインを有するポリペプチド
    であり、当該ＧＥＧ様遺伝子産物が細胞成長の時空的な制御能力を有することを
    特徴とする、植物細胞又は植物器官の大きさ及び形状を変更するために請求項１
    〜８の記載の核酸配列により発現されたＧＥＧ様遺伝子産物。
  10. 【請求項１０】 Ｃ末端ドメインが少なくとも４つ、好ましくは少なくとも
    ８つ、最も好ましくは少なくとも１２のシステイン残基を含むことを特徴とする
    、請求項９に記載のＧＥＧ様遺伝子産物。
  11. 【請求項１１】 １２のシステイン残基を含むＣ末端ドメインを有するＧＥ
    Ｇ様遺伝子産物をエンコードすることを特徴とする、請求項１０に記載のＧＥＧ
    様遺伝子産物。
  12. 【請求項１２】 アミノ酸配列配列番号２を除いて、配列番号１とほぼ相同
    性のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むことを特徴とする請求項９〜１１
    に記載のＧＥＧ様遺伝子産物。
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