JP2003306693A

JP2003306693A - 共役脂肪酸の製造法及び該方法により得られた飲食品

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Publication number: JP2003306693A
Application number: JP2002110773A
Authority: JP
Inventors: Naomi Mizusawa; 直美水澤; Satoshi Kudo; 聰工藤; Masashi Sakai; 正士酒井
Original assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Current assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Priority date: 2002-04-12
Filing date: 2002-04-12
Publication date: 2003-10-31
Anticipated expiration: 2022-04-12
Also published as: JP4213906B2

Abstract

(57)【要約】【課題】生理活性が高いとされているcis-9,trans-11
型共役リノール酸に代表される共役脂肪酸を選択的かつ
高効率で製造する製造法を得る。【解決手段】 Lactobacillus oris、Lactobacillus po
ntis及びLactobacilluspanis から選ばれる１種又は２
種以上の乳酸菌を用いて二重結合を少なくとも二つ以上
有する不飽和脂肪酸を共役化するもの。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Lactobacillus or
is、Lactobacillus pontis及びLactobacillus panis か
ら選ばれる１種又は２種以上の乳酸菌を利用して特定の
共役脂肪酸を効率よく製造する方法及びこの方法により
得られた共役脂肪酸を含有する飲食品に関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】共役脂肪酸は隣り合う炭素が単結合を挟
んで二重結合を持つ脂肪酸であるが、とりわけ炭素数１
８の脂肪酸分子内に共役ジエンを１個持つ共役リノール
酸は、様々な生理活性を持つことが明らかにされてい
る。

【０００３】共役リノール酸を工業的に製造する方法と
しては、例えばリノール酸を含む油脂、あるいは遊離型
のリノール酸をエチレングリコールなどの有機溶媒下で
共役化するアルカリ共役化法が知られている。

【０００４】アルカリ共役化法では、通常、不飽和脂肪
酸と過剰のアルカリとを有機溶媒中で１５０℃以上に加
熱する。この時、得られる共役脂肪酸は、二重結合の結
合位置や配置が異なる混合物の形であり、例えば原料に
リノール酸を用いた場合には、cis-9, trans-11型ある
いはtrans-9, cis-11型、trans-10, cis-12型の共役リ
ノール酸が得られ、この他にも幾つかの位置あるいは幾
何異性体を含んでいる。

【０００５】従って、上記共役脂肪酸の生理作用は、共
役脂肪酸の混合物としての作用であり、特定の共役脂肪
酸が製造できれば学術的にも産業的にも応用価値は高
い。また、アルカリ共役化法では、環化およびその他の
副反応も起こり、共役脂肪酸の収率が低下すること、精
製が困難になることなどの問題点も指摘されている。

【０００６】一方、微生物あるいはその酵素が共役脂肪
酸を作ることが報告されている。例えば、ルーメン細菌
が多価不飽和脂肪酸から共役脂肪酸を産生すること（Sh
orland F.B., et al., Nature , vol.175, p.1129, 195
5）をはじめとして、Treponema（Yokoyama, et al., J.
Bacteriology , vol.107,p519-527,1971）、Butyrivib
rio fibrisolvens （Kepler C.R., et al., J. Biol. C
hem., vol.242, p5686-92, 1967）、Propionibacterium
freudenreichii（Jiang J., Doctoral thesis, Swedis
h Uni. Uppsala, 1998 ）、種々の肺の病原菌の一割強
（Jack C.I.A.,et al., Clinica Chlimica Acts., vol
224, p139-4, 1994 ）などがリノール酸異性化活性を持
ち、また、これらの微生物によって産生される共役リノ
ール酸はcis-9、trans-11型異性体が主体であることも
報告されている。

【０００７】一方、反芻動物は自らの体内でcis-9,tran
s-11型共役リノール酸を産生していることから、乳製品
や畜肉にはcis-9,trans-11型共役リノール酸が多く含有
されており、従って、cis-9,trans-11型共役リノール酸
は通常の食生活でヒトが摂取する機会の多い共役リノー
ル酸であると考えられる。それゆえ、本異性体の生理効
果については多くの研究が行われ、種々の癌に対する防
御作用があることが明らかとなってきた（Ha, Y.L., et
al., Cancer Research vol.50, p1097-1101,1990, Ip
C., et al., Cancer Research vol.51, p6118-6124
）。

【０００８】以上のように、微生物を用いれば、前述の
アルカリ異性化法に比べ副産物が少なく、抗癌作用の期
待されるcis-9,trans-11型共役リノール酸含量の高い生
成物が得られることから、微生物、中でも食品への利用
価値が高い乳酸菌を用いた共役リノール酸製造に関して
は、精力的に研究が進められており、いくつかの乳酸菌
がリノール酸から共役リノール酸への変換能力を持つこ
と（京大院農・松村賢司ら、1999年度日本農芸化学会、
福岡）や、また発酵乳中で乳酸菌を用いて共役リノール
酸を製造できること（Tung Y. Lin, et al., Food Chem
istry vol.67,p1-5, 1999、Tung Y. Lin, et al., Food
Chemistry vol.69, p27-31, 2000）などが報告されて
いる。

【０００９】しかしながら、上述した種々の微生物によ
る共役化反応ではcis-9,trans-11型共役リノール酸以外
に all trans型共役リノール酸もまた同時に副産してし
まうことがわかってきた。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】前述の通り、アルカリ
共役化法は、高温における反応のため副反応が起こりや
すく特定の共役脂肪酸を得ることが困難であり、その後
の精製工程が煩雑であるなどの問題点があった。更に、
微生物による変換反応によって得られる共役リノール酸
では、all trans型共役リノール酸もまた同時に副産し
てしまい、cis-9,trans-11型共役リノール酸のみを選択
的に得る方法については現在のところまだ報告されてい
ない。

【００１１】本発明は、生理活性が高いとされているci
s-9,trans-11型共役リノール酸に代表される共役脂肪酸
を選択的かつ高効率で製造する製造法を得ることを目的
とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明に係る共役脂肪酸
の製造法では、Lactobacillus oris、Lactobacilluspon
tis及びLactobacillus panis から選ばれる１種又は２
種以上の乳酸菌を用いて二重結合を少なくとも二つ以上
有する不飽和脂肪酸を共役化することにより、上述の課
題を解決するものである。

【００１３】二重結合を少なくとも二つ以上有する不飽
和脂肪酸としては、リノール酸を用いることが好まし
い。

【００１４】本発明においては、二重結合を少なくとも
二つ以上有する不飽和脂肪酸を含有する培地に、Lactob
acillus oris、Lactobacillus pontis及びLactobacillu
s panis から選ばれる１種又は２種以上の乳酸菌を接種
して培養することが好ましい。このための培地として、
乳培地を用いることが好適である。

【００１５】本発明は更に、上述の本発明による方法に
よって得られた共役脂肪酸を含有する飲食品も提供す
る。

【００１６】

【発明の実施の形態】本発明による方法においては、La
ctobacillus oris、Lactobacillus pontis及びLactobac
illus panis から選ばれる１種又は２種以上の乳酸菌を
用いて二重結合を少なくとも二つ以上有する不飽和脂肪
酸を共役化するものであるため、生理活性が高いとされ
ているcis-9,trans-11型共役リノール酸に代表される共
役脂肪酸を選択的かつ高効率で製造することができる。

【００１７】本発明による共役脂肪酸の製造方法で用い
られるラクトバチルス・オリス（La ctobacillus oris）
は人の唾液から分離された乳酸菌である（Farrow J.A.
E. etal., Int. J. Syst. Bacteriol.vol.38, p116, 19
88）。菌株としては、例えば、Lactobacillus oris NCD
02160(ATCC49062), NCD02161, NCD02162, NCD02163,NCD
02164等が挙げられ、特に、NCD02160(ATCC49062)が好ま
しい。

【００１８】また、ラクトバチルス・ポンティス（Lact
obacillus pontis）は、ライ麦パン種から分離された乳
酸菌であり（Vogel,R.F., et al., Int. J. Syst. Bact
eriol., vol.44, p223-229, 1994）、菌株としては、例
えば、Lactobacillus pontisATCC51518, ATCC51519等が
挙げられ、特にATCC51519を用いることが好ましい。

【００１９】また、ラクトバチルス・パニス（Lactobac
illus panis ）は、ライ麦パン種から分離された乳酸菌
であり（Strohmar,W., Diekmann,H., Z.Lebensm. Unter
s. Forsch, vol.194, p536-540, 1992）、菌株として
は、例えば、Lactobacillus panis JCM11053等が挙げら
れ、特にJCM11053を用いることが好ましい。

【００２０】本発明において共役脂肪酸を製造するため
にLactobacillus oris、Lactobacillus pontis及びLact
obacillus panis から選ばれる１種又は２種以上の乳酸
菌を用いて不飽和脂肪酸を共役化する処理としては、原
料の不飽和脂肪酸を含有する増殖培地中で乳酸菌を培養
して直接共役脂肪酸を生成させる方法、或いは何らかの
方法で乳酸菌を培養して集菌し洗浄した菌体（洗浄菌
体）を原料の不飽和脂肪酸を含有する溶液に加えて反応
させることにより共役脂肪酸を生成させる方法等何れの
方法を用いることも可能である。更に、不飽和脂肪酸を
含有する溶液中では、乳酸菌の生菌のみならず、死菌
体、菌体抽出液などを利用して反応を行うことも可能で
ある。

【００２１】Lactobacillus oris、Lactobacillus pont
is及びLactobacillus panis から選ばれる１種又は２種
以上の乳酸菌を培養するための培地としては、乳酸菌の
増殖用に通常用いられる培地や乳を含む培地を用いるこ
とが出来るが、特に乳を用いた発酵乳中で不飽和脂肪酸
を処理することが好ましく、これにより乳中に含まれる
蛋白成分などの影響によって原料油類の均質化が比較的
容易となる。なお、本明細書中において乳とは、牛乳・
山羊乳などの獣乳の生乳、脱脂粉乳、全脂粉乳、生クリ
ーム、あるいは豆乳・アーモンド乳・ココナッツミルク
等の植物乳の各種乳蛋白質含有物を指す。

【００２２】また、不飽和脂肪酸を含有する溶液中でLa
ctobacillus oris、Lactobacilluspontis及びLactobaci
llus panis から選ばれる１種又は２種以上の乳酸菌の
洗浄菌体或いは菌体末、死菌体、菌体抽出液などを利用
して反応を行う場合、洗浄菌体や菌体末、死菌体、菌体
抽出液の調製は常法に従えば良い。例えば、洗浄菌体
は、生理食塩水やバッファーなどで培養菌体を洗浄して
得ることができ、菌体末は凍結乾燥や噴霧乾燥などの乾
燥技術により得ることができる。

【００２３】死菌体を得る方法としては、細胞壁溶解酵
素を作用させる方法の他に、低浸透圧で処理する方法、
凍結融解する方法、高圧処理する方法、破砕処理する方
法、加熱処理する方法等がある。中でも、菌体を加熱処
理し自己融解させる方法は、コストをかけずに大量の菌
体を処理できる点で好ましい。菌体抽出液は、上記のよ
うにして得た洗浄菌体、菌体末、死菌体などに適切な溶
媒を添加した後、遠心分離上清として得ることができ
る。

【００２４】本発明において、原料として用いられる、
二重結合を少なくとも二つ以上有する不飽和脂肪酸は特
に限定されず、例えばリノレン酸、アラキドン酸、エイ
コサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などいずれも好
適に使用し得る。特に、リノール酸を原料として共役リ
ノール酸を生成させた場合、生理活性の報告されている
特定の異性体が特異的かつ効率よく生成し、他の異性体
（副産物）の量は極微量となるため好ましい。

【００２５】また、上記不飽和脂肪酸は、塩またはエス
テルなどを形成していても良く、塩としては、ナトリウ
ム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム
塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アンモ
ニンム塩等が挙げられ、エステルとしてはメチルエステ
ル、エチルエステルのほか上記脂肪酸を含むその他の脂
質類（リン脂質、糖脂質等）、モノグリセライド、ジグ
リセライド、トリグリセライドなども用いることも可能
である。また、天然油脂も原料として用いることがで
き、例えばリノール酸を分子内に多く含むものとしては
サフラワー油、綿実油、大豆油、ヒマワリ種子油、トウ
モロコシ油、落花生油、米ヌカ油、アマニ油、カカオ脂
などの植物由来の天然油脂などが、リノレン酸を分子内
に多く含むものとしてはアマニ油、ナタネ油などが、多
価不飽和脂肪酸を多く含むものとしてはイワシ油、ニシ
ン油、タラ肝油などの動物由来の天然油脂などが挙げら
れ、さらにこれらのリパーゼ分解物なども原料として用
いることが可能である。

【００２６】Lactobacillus oris、Lactobacillus pont
is及びLactobacillus panis から選ばれる１種又は２種
以上の乳酸菌を用いて共役脂肪酸を製造するための共役
化処理法としては例えば以下の(a)〜(e)を挙げることが
できる。 (a) 乳酸菌を増殖培地や発酵乳中で培養して発酵生産の
形で不飽和脂肪酸を共役化する方法 (b) 不飽和脂肪酸を乳酸菌の洗浄菌体で共役化する方法 (c) 乳酸菌菌末を用いて不飽和脂肪酸を共役化する方法 (d) 乳酸菌死菌体を用いて不飽和脂肪酸を共役化する方
法 (e) 乳酸菌菌体抽出液を用いて不飽和脂肪酸を共役化す
る方法

【００２７】以下、処理法(a)〜(e)について詳述する。 (a) 乳酸菌を増殖培地や乳培地中で培養して発酵生産の
形で不飽和脂肪酸を共役化する方法：増殖培地あるいは
発酵乳中で共役化を行う際は、基本操作は一般的に行わ
れている手法で行えば良いが、スターターとしては以下
のものを用いるのが好ましい。

【００２８】まず菌体調製において変換能を効率的に誘
導するため、文献（京都大学大学院農学研究科・大村依
子ら、平成11年度日本生物工学会要旨集、p191）を参考
にしてリノール酸などの不飽和脂肪酸をMRS（LACTOBACI
LLI MRS BROTH、DIFCO社製）培地などの乳酸菌用増殖培
地に添加した。この濃度は０〜0.2%で、特に0.05〜0.1%
が好ましい。この際の培養は、ｐＨ3.5〜5.5で停止する
ことが好ましく、特に、4.5〜5.5で停止することが好ま
しい。ｐＨ3.5 以下まで培養すると菌の過増殖により共
役化能が低下してしまう場合もあり、ｐＨ5.5 以上では
共役化を行うのに充分な菌体量が得られないためであ
る。

【００２９】以上のようにして培養した培養液をスター
ターとして用いるのが好ましく、スターター接種量は発
酵乳調製用培地の 0.5〜８％程度が好ましく、特に１〜
４％程度が好ましい。原料は培地中に0.02〜0.8 ％程度
が好ましく、特に0.1〜0.2％が好ましい。培養温度は２
０〜４０℃程度、好ましくは２８〜３７℃である。

【００３０】より効率良く目的とする共役脂肪酸を得る
ためには培養はｐＨ3.5〜5.5で停止することが好まし
く、特にｐＨ4.5〜5.5で停止することが好ましい。ま
た、中和培養でも同様に目的とする共役脂肪酸を得るこ
とが出来る。

【００３１】(b) 不飽和脂肪酸を乳酸菌の洗浄菌体で共
役化する方法：処理法(a) のスターター調製時と同様の
培養条件によって培養した菌体を生理食塩水にて洗浄し
たものを回収し、緩衝液に懸濁させたものを洗浄菌体と
して用いるのが好ましく、この菌体を懸濁させる緩衝液
および洗浄菌体反応は適度なｐＨを維持できる条件の水
溶液を用いて行う。例えば0.1〜1.0Ｍのリン酸緩衝液が
好ましく、ｐＨは5.0〜7.5であるが、好ましくは6.0〜
7.0である。菌体懸濁液の菌体濃度は、湿重で0.025〜0.
25％であり、好ましくは0.025〜0.1 ％である。

【００３２】原料は、添加時の原料を牛血清アルブミン
等のバッファーとの混合液として用いることが原料を均
一に混ぜるためには、好ましい。おり原料濃度は反応溶
液中に0.1〜4.0％程度添加することが好ましく、特に0.
3〜1.0％が好ましい。また牛血清アルブミンの混合比率
は原料に対して５分の１程度が好ましい。洗浄菌体によ
る変換反応の際の温度は２０〜５２℃だが、好ましくは
３２〜３７℃である。変換生成の適正な時間は０〜９６
時間であり、好ましくは２４〜７２時間である。なお、
ｐＨを中和しながら培養した菌体も同様に用いることが
出来る。

【００３３】(c) 乳酸菌菌末を用いて不飽和脂肪酸を共
役化する方法：乳酸菌菌末は、例えば処理法(a) のスタ
ーター調製時の培養条件と同様の方法にて得た乳酸菌菌
体を乾燥処理により粉末化することにより得ることが出
来る。乾燥処理方法としては凍結乾燥、噴霧乾燥などを
利用することができる。尚、菌末調製後の変換反応は、
処理法(b) の洗浄菌体反応の反応条件と同様に行えば良
い。

【００３４】(d) 乳酸菌死菌体を用いて不飽和脂肪酸を
共役化する方法：乳酸菌死菌体は、例えば処理法(a) ス
ターター調製時の培養条件と同様の方法にて得た乳酸菌
菌体の細胞壁を破壊することにより得ることができる。
細胞壁破壊は、細胞壁破壊酵素で処理する方法や、菌体
を溶媒に懸濁させて低浸透圧で処理する方法、凍結融解
する方法、高圧処理する方法、破砕処理する方法、加熱
処理する方法などを利用することができる。細胞壁破壊
液調製後の変換反応は、処理法(b) の洗浄菌体反応の反
応条件と同様に行えば良い。

【００３５】(e) 乳酸菌菌体抽出液を用いて不飽和脂肪
酸を共役化する方法：乳酸菌菌体抽出液としては、例え
ば処理法(b)〜(d)と同様の方法にて得た乳酸菌洗浄菌
体、菌体末、死菌体などを適切な溶媒で抽出し、遠心分
離など方法により残渣を除去して得ることができる。
尚、菌体抽出液調製後の反応は、処理法(b)の洗浄菌体
反応の反応条件と同様に行えば良い。

【００３６】上記処理法(a)〜(e)等、Lactobacillus or
is、Lactobacillus pontis及びLactobacillus panis か
ら選ばれる１種又は２種以上の乳酸菌の何れかにより得
られる反応液または培養液の脂肪酸組成は、ガスクロマ
トグラフィー分析により内部標準物質と各脂肪酸の面積
値の比率をもとに各脂肪酸量を算出できる。なお、例え
ば、共役リノール酸を対象とする場合には、ガスクロマ
トグラフィーは以下の表１に示す条件で行えばよい。

【００３７】

【表１】

【００３８】本発明により得られる共役脂肪酸は、医薬
品、食品、化粧品等の形態で投与することができる。例
えば共役リノール酸の生理効果を訴求する医薬品や栄養
補助食品等の形態で用いる場合であれば、カプセル剤、
顆粒剤、錠剤、散剤等の固形製剤、或いはシロップ剤等
の液状製剤として経口投与することができる。また、経
口投与剤でなくとも、注射剤、皮膚外用剤、直腸投与剤
等非経口形態で投与することも可能である。

【００３９】各製剤の製造時には、乳糖、澱粉、結晶セ
ルロース、乳酸カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグ
ネシウム、無水ケイ酸等の賦形剤、白糖、ヒドロキシプ
ロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤、
カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロ
ースカルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウ
ム、タルク、モノグリセリド、蔗糖脂肪酸エステル等の
滑沢剤や、その他、医薬・食品等として許容され得る成
分を適宜使用すればよい。

【００４０】また、同様の生理効果を期待して一般食品
形態（「明らか食品」の形態）で用いる場合には、本発
明の方法により得られた共役脂肪酸をそのまま或いは適
宜精製処理したものを油脂、錠菓、発酵乳、飴、調味
料、ふりかけ等の飲食品に添加し、常法を用いて製造す
ればよい。発酵食品として用いる場合には、発酵原料中
の二重結合を二つ以上有する脂肪酸を添加し、発酵菌に
より発酵（培養）させ、製造することができる。特にリ
ノール酸を含む乳を発酵した発酵乳とすれば、前記のと
おりcis-9, trans-11型共役リノール酸を特異的かつ多
量に含有させることが容易であるため好ましい。

【００４１】なお、発酵乳とは、乳等省令により定めら
れている発酵乳、乳製品乳酸菌飲料等の生菌含有タイプ
の飲料や殺菌処理の施された発酵乳を含有する乳性飲
料、更には、ケフィア等のことである。発酵に際して
は、その他の菌、例えばラクトバチルス・カゼイ、ラク
トバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ガッセ
リ、ラクトバチルス・ゼアエ、ラクトバチルス・ジョン
ソニー、ラクトバチルス・デルブルッキィサブスピー
シーズブルガリカス、ラクトバチルス・デルブルッキ
ィサブスピーシーズデルブルッキィ等のラクトバチル
ス属細菌やストレプトコッカス・サーモフィルス等のス
トレプトコッカス属細菌、ラクトコッカス・ラクチス
サブスピーシーズ．ラクチス、ラクトコッカス・ラクチ
スサブスピーシーズ．クレモリス、ラクトコッカス・
プランタラム、ラクトコッカス・ラフィノラクチス等の
ラクトコッカス属細菌、ロイコノストック・メセンテロ
イテス、ロイコノストック・ラクチス等のロイコノスト
ック属細菌、エンテロコッカス・フェカーリス、エンテ
ロコッカス・フェシウム等のエンテロコッカス属細菌等
を使用できる。

【００４２】また、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、
ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリ
ウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・アニマーリス
等のビフィドバクテリウム属細菌や酵母その他の微生物
を使用しても良い。これらは、１種または２種以上を組
み合わせて使用することができる。

【００４３】また、これらの食品には、その他の食品素
材、すなわち、各種糖質や乳化剤、増粘剤、甘味料、酸
味料、果汁等を適宜配合してもよい。具体的には、蔗
糖、異性化糖、グルコース、フラクトース、パラチノー
ス、トレハロース、ラクトース、キシロース等の糖類、
ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチ
トール、パラチニット、還元水飴、還元麦芽糖水飴等の
糖アルコール、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪
酸エステル、レシチン等の乳化剤、カラギーナン、グァ
ーガム、キサンタンガム、ペクチン、ローカストビーン
ガム等の増粘（安定）剤、が挙げられる。この他にも、
ビタミンＡ、ビタミンＢ類等の各種ビタミン類やカルシ
ウム、鉄、マンガン、亜鉛等のミネラル類を配合して
も、優れた風味の耐光性発酵乳を得ることができる。

【００４４】これら医薬品、食品等の形態での使用に際
しては、本発明の方法により得られた共役脂肪酸を適宜
配合することができる。また、共役脂肪酸の生理効果を
訴求する場合であれば、その効果を得られかつ過剰摂取
等の問題が生じない程度の量、１０ｍｇ〜１０００ｍｇ
／日程度の摂取が見込まれる量を適宜配合しておけばよ
い。

【００４５】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれら実施例になんら制約されるもので
はない。

【００４６】実施例１：共役脂肪酸を産生する乳酸菌の
スクリーニング１００mMリン酸緩衝液（ｐＨ6.5）１ｍL中にリノール酸
５０mgとBSA １０mgを溶解し、あらかじめリノール酸−
BSA−複合体溶液を調製した。１５ｍLの0.07％リノール
酸含有MRS（LACTOBACILLI MRS BROTH、DIFCO社製）培地
に各菌を接種し、２８℃、１２０ｒｐｍ、２０時間振盪
培養した。得られた培養液はｐＨ 4.7であった。

【００４７】この培養液を遠心分離して菌体を回収し生
理食塩水で２回洗浄して洗浄菌体を得た。この洗浄菌体
にリノール酸−BSA−複合体溶液を100μL、100ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ6.5）を0.9ｍL添加し、酸素吸収・炭酸
ガス発生剤（Anaero Pack、三菱ガス化学(株)社製）に
て嫌気状態に保った酸素不透過性のビニール袋内で３７
℃、１２０ｒｐｍで２４時間反応した。

【００４８】得られた反応液に内部標準物質（HEPTADEC
ANOIC ACID）を1mg添加後Bligh-Dyer 法にて抽出し、メ
チルエステル化（４％塩酸メタノール溶液で３０分間室
温静置）後、ガスクロマトグラフィーの分析に供し脂肪
酸分析を行った。

【００４９】

【表２】

【００５０】共役リノール酸のピークは標準品（リノー
ル油脂製 CLA８０）のリテンションタイムを基準に判断
し、基質として添加したリノール酸を１００とした時の
相対値を算出した。その結果、表２に示したようにLact
obacillus orisで共役リノール酸の産生が認められた。
このLactobacillus oris NCD02160は、ATCC49062として
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴ
ＣＣ）に登録されている。

【００５１】実施例２：共役脂肪酸の異性体の同定実施例１でLactobacillus orisによって産生された共役
リノール酸の異性体を調べた。図１はLactobacillus or
isによって産生された共役リノール酸の異性体のガスク
ロマトグラムのチャートである。図１に示したようにLa
ctobacillus orisによって産生された共役リノール酸の
全てがcis-9,trans-11型共役リノール酸であった。以上
の結果から、数ある乳酸菌の中でLactobacillus orisが
選択的、且つ効率的にcis-9,trans-11型共役リノール酸
を産生することが明らかとなった。

【００５２】実施例３：発酵乳中での共役脂肪酸の産生１００mMリン酸緩衝液（ｐＨ6.5）１ｍL中にリノール酸
５０mgとBSA １０mgを溶解し、あらかじめリノール酸−
BSA −複合体溶液を調製した。このリノール酸−BSA−
複合体溶液２００μLをMRS（LACTOBACILLI MRS BROTH、
DIFCO社製）培地１５ｍL に添加後、Lactobacillus ori
sを接種し２８℃、１２０ｒｐｍ、２０時間振盪培養
し、ｐＨ４．７の培養液を調製した。

【００５３】１５ｍL 容試験管（キャップ付き）に５ｍ
L 分注した１０％スキムミルク（グルコース１％、大豆
ペプチド0.1％添加）培地に、リノール酸−BSA−複合体
溶液を１００μL、先に調製した各菌株の培養液を２０
０μL添加し、キャップを閉めた。この培地を２８℃、
１２０ｒｐｍで４８時間培養しｐＨ4.6 の発酵乳を調製
し、実施例１と同様に脂肪酸分析を行った。

【００５４】その結果、添加したリノール酸の２．０％
が共役リノール酸に変換されていた。産生された共役リ
ノール酸の全てがcis-9、trans-11型共役リノール酸で
あり、実施例２と同様の結果が得られた。以上の結果か
ら、発酵乳中でもLactobacillus orisが選択的、且つ効
率的にcis-9,trans-11型共役リノール酸を産生すること
が明らかとなった。

【００５５】実施例４：Lactobacillus oris 死菌体に
よる共役脂肪酸の産生１００mMリン酸緩衝液（ｐＨ6.5）１ｍL中にリノール酸
５０mgと BSA１０mgを溶解し、あらかじめリノール酸−
BSA −複合体溶液を調製した。このリノール酸−BSA−
複合体溶液２００μLをMRS（LACTOBACILLI MRS BROTH、
DIFCO社製）培地１５ｍL に添加後、Lactobacillus ori
sを接種し２８℃、１２０ｒｐｍ、２０時間振盪培養
し、ｐＨ4.7 の培養液を調製した。

【００５６】この培養液0.5ｍLを、0.3%glc加ＩＬＳ培
地15mLに接種し、３７℃、１２０rpmで１８時間（ｐＨ
5.6まで）培養し、遠心分離して菌体を回収し0.2Ｍグリ
シン緩衝液（ｐＨ10.6）で２回洗浄し、洗浄後菌体を
6.7％蔗糖−５０mMトリスアミノメタン−１mＭ EDTA溶
液２ｍLに溶解した。この液に lysozyme溶液(10mg/mL i
n25mＭトリスアミノメタン ,ｐＨ8.0、生化学工業(株)
社製)0.8ｍLおよびN-Acetylmuramidase水溶液（1mg/mL
、生化学工業(株)社製）0.15ｍLを添加し、３７℃、１
２０ｒｐｍで３０分反応した。反応液をセントリプレッ
プ１０（amicon社製）に移し濃縮操作を行うことにより
Lactobacillus oris死菌体懸濁液を約0.6ｍL得た。

【００５７】この死菌体懸濁液にリノール酸−BSA−複
合体溶液を１００μL、１００mMリン酸緩衝液（ｐＨ6.
5）を0.9ｍL添加し、酸素吸収・炭酸ガス発生剤（Anaer
o Pack、三菱ガス化学(株)(株)社製）にて嫌気状態に保
った酸素不透過性のビニール袋内で３７℃、１２０ｒｐ
ｍで２４時間反応した。

【００５８】得られた反応液について実施例１と同様に
脂肪酸分析を行った結果、添加したリノール酸の１．６
％が共役リノール酸に変換されていた。産生された共役
リノール酸の全てがcis-9,trans-11型共役リノール酸で
あり、洗浄菌体および発酵乳中と同様の結果が得られ
た。以上の結果から、細胞壁を破壊した死菌体でもLact
obacillus orisが選択的、且つ効率的にcis-9,trans-11
型共役リノール酸を産生することが明らかとなった。

【００５９】実施例５：Lactobacillus pontisによる共
役脂肪酸の産生１００mMリン酸緩衝液（ｐＨ6.5）１ｍL中にリノール酸
５０mgと BSA１０mgを溶解し、あらかじめリノール酸−
BSA −複合体溶液を調製した。このリノール酸−BSA−
複合体溶液２００μLをMRS（LACTOBACILLI MRS BROTH、
DIFCO社製）培地１５ｍL に添加後、Lactobacillus pon
tis （ATCC51518）を接種し２８℃、１２０ｒｐｍ、４
８時間振盪培養し、ｐＨ4.9 の培養液を調製した。

【００６０】１５ｍL 容試験管（キャップ付き）に５ｍ
L 分注した１０％スキムミルク生地に、リノール酸−BS
A −複合体溶液を１００μL 、先きに調整した各菌株の
培養液を４００μL 添加し、キャップを閉めた。この培
地を２８℃、１２０ｒｐｍで４８時間培養し、ｐＨ5.5
の発酵乳を調整し、実施例１と同様に脂肪酸分析を行っ
た。

【００６１】その結果、添加したリノール酸の０．５％
が拒約リノール酸に返還されていた。産生された共役リ
ノール酸の全てがcis-9,trans-11型共役リノール酸であ
った。以上の結果から、Lactobacillus pontisが選択
的、且つ効率的にcis-9,trans-11型共役リノール酸を産
生することが明らかとなった。

【００６２】

【発明の効果】以上説明した通り、本発明の共役不飽和
脂肪酸の製造方法によればcis-9, trans-11型共役不飽
和脂肪酸を選択的に高効率で製造できるという効果があ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】Lactobacillus orisによって産生された共役リ
ノール酸の異性体のガスクロマトグラムのチャートであ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:225） (72)発明者酒井正士東京都港区東新橋１丁目１番19号株式会社ヤクルト本社内Ｆターム(参考） 4B001 AC06 AC31 EC05 4B018 LB07 MD10 MD86 ME08 MF13 4B064 AD88 CA02 CC03 CD25 DA10 4H059 BA26 BB04 BC48 CA99 EA40

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 Lactobacillus oris、Lactobacillus po
ntis及びLactobacillus panis から選ばれる１種又は２
種以上の乳酸菌を用いて二重結合を少なくとも二つ以上
有する不飽和脂肪酸を共役化する工程を含むことを特徴
とする共役脂肪酸の製造法。
【請求項２】二重結合を少なくとも二つ以上有する不
飽和脂肪酸として、リノール酸を用いることを特徴とす
る請求項１に記載の共役脂肪酸の製造法。
【請求項３】前記共役化する工程が、二重結合を少な
くとも二つ以上有する不飽和脂肪酸を含有する培地に、
Lactobacillus oris、Lactobacillus pontis及びLactob
acillus panis から選ばれる１種又は２種以上の乳酸菌
を接種して培養する工程を含むことを特徴とする請求項
１又は２に記載の共役脂肪酸の製造法。
【請求項４】培地として、乳培地を用いることを特徴
とする請求項３に記載の共役脂肪酸の製造法。
【請求項５】請求項１〜４の何れか１項に記載の方法
により得られた共役脂肪酸を含有する飲食品。