JP2003302404A

JP2003302404A - レセプターの固定化方法、並びにその方法により製造されたレセプター組成物

Info

Publication number: JP2003302404A
Application number: JP2002106890A
Authority: JP
Inventors: Kazuhiro Matsui; 松井　　一裕; Takuya Ishibashi; 石橋　　卓也; Shigeaki Nishii; 重明西井; Masanori Oka; 岡　　正則
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2002-04-09
Filing date: 2002-04-09
Publication date: 2003-10-24

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、不安定なレセプター（抗体を含
む）を固定化する際に、安定化して作製する方法、すな
わち均一な性能を有するレセプター（抗体を含む）組成
物を作製する方法に関する。特に競合法による測定系の
ために低密度で調整された組成物を作製する方法に関す
る。さらにそれらの方法により作製された、組成物・測
定用試薬・キットに関する。【解決手段】レセプターを固定化する際に、固定化す
るレセプター以外の蛋白質を共存させることを特徴とす
る、レセプターおよび抗体の安定的な固定化方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、リガンドとしての
天然の化学物質、合成化学物質、ペプチド・蛋白質を測
定するための、所望の抗体の固定化方法ならびにその方
法によって作製された組成物に関するものである。また
本発明は特にいわゆる競合法によって測定系を構築する
際の、所望の抗体の固定化方法ならびにその方法によっ
て作製された組成物に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】レセプターは生命の発生・成熟・成長・
代謝・維持等に関わる根本的な生体分子であり、研究者
の興味と努力がそれらレセプターの構造・機能・メカニ
ズム・進化機構等に注がれてきた。さらに治療薬・農薬
等のターゲットとしての明確な認識から多くの化学物質
のスクリーニングが実施されてきた。レセプターは機
能、遺伝子・蛋白的構造より、抗体、膜レセプター、核
内レセプター、トランスポーター、コファクター、コア
クチベーターなどに分類されるポリペプチドである。こ
れらのレセプターの種類は近年莫大な数となって増加し
続けている。核内レセプターと呼ばれるレセプターは２
００１年の時点で１００を超す種類が存在する。さらに
生体膜表面・膜中に存在する膜蛋白としてのレセプター
の数も膨大である。コファクター蛋白、コアクチベータ
ー蛋白も多種の蛋白と相互作用をするという意味で、レ
セプターの一種とみなすことができる。薬物の標的とし
てのレセプターの数は膨大であり、また近年問題となっ
ている外因性内分泌撹乱物質の標的である、核内レセプ
ターおよびそれらのコファクター・コアクチベータにお
いても、次々と新種類・新亜型が見出されつつある。こ
れらのレセプターは一般的に非常に不安定なものであ
り、固定化・修飾など種々の加工の際に安定性が障害と
なる。

【０００３】抗体つまり免疫グロブリンについては分析
用ツールとして、それらを用いた種々の測定系が報告さ
れている（酵素免疫測定法：第３版医学書院（１９８
７年）あるいはエンザイムイムノアッセイ（生化学実
験法１１）：東京化学同人（１９８９））。抗体・抗原
に酵素以外の標識も多数用いられ、主として放射性同位
元素（³Ｈ、³²Ｐ、¹²⁵Ｉ等）、発光物質、蛍光物質、金
属原子、金属ゾル、安定なフリーラジカル、ラテック
ス、バクテリオファージなどがある。

【０００４】抗体は種々の動物に抗原を免疫し、抗血清
として得るか、抗体産生細胞とミエローマを融合して作
製したハイブリドーマを培養して、モノクローナル抗体
として得ることができる。また最近では遺伝子組換え技
術を用いて製造された組換え抗体が使用できる。抗体の
クラスとしてはマウス・ラットＩｇＧの各サブクラス、
ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡなどが本発明に関連するもので
ある。各クラス・サブクラスの抗体のフラグメント化
（Ｆａｂ化など）も普遍的に実施されている。場合によ
ってはヒト抗体、ヒト化抗体なども近年使用可能な状況
になってきており、分析材料として現在広汎なものが利
用できる。

【０００５】各種レセプター・抗体を用いた測定系の測
定対象としては、薬物および薬物候補物質、感染症関連
抗原、感染症関連抗体、腫瘍マーカー、ホルモン物質、
各種アレルゲン、生理活性蛋白、バイオマーカー、スト
レスマーカー、微生物、農薬、毒物・毒素、内分泌撹乱
化学物質、環境汚染物質などほとんど全ての物質が対象
となっている。

【０００６】測定法の種類としては、レセプター（抗体
を含む）と標識された抗原を用いた競合法、測定対象物
をレセプター（抗体を含む）と標識されたレセプター
（抗体を含む）を用いて測定対象物を挟みこんで測定す
る方法、測定対象物とレセプター（抗体を含む）と測定
対象物が相互作用した際の物理化学量（電位変化・熱量
変化・エバネッセント波の変化など）を測定し、定量す
る方法などがある。検出系は多様であり、測定系が使用
するそれぞれの標識に応じて、吸光度測定器、発光度測
定器、蛍光度測定器、液体シンチレーションカウンター
などが使用される。

【０００７】本発明は特に抗体を固相化した測定法（抗
体を担体に固定化し不溶化させたもの）を対象としてい
る。つまり不溶化レセプター（抗体を含む）固相による
非競合アッセイ、不溶化レセプター（抗体を含む）固相
による競合アッセイのいずれかである。

【０００８】レセプター反応（あるいは抗体反応）に関
わる分子を直接標識する場合も、それらの分子を認識す
る他の分子（プロテインＡやプロテインＧ）などに間接
的に標識することも良く行なわれている。あるいは抗体
分子にビオチンや、ジニトロフェノールを導入し、標識
されたストレプトアビジン、標識された抗ジニトロフェ
ノール抗体などで複合体を形成させることなどもよく行
なわれる。また蛍光色素分子を内包した固相担体上にお
いて、標識された別種の蛍光色素の存在を、蛍光エネル
ギー転移により検出することも実施されている。さらに
固相担体上の標識体の検出ではなく、結合しなかった遊
離の標識体を検出することも実施される。

【０００９】レセプター・抗体の固定化方法としては、
プラスチック・ガラスなどの不溶性担体への物理的吸着
により固定化する方法（非共有結合）と、共有結合によ
りカップリングさせて固定化する方法がある。プラスチ
ックとしては、ポリスチレン・ナイロン・ポリカーボネ
ートなどが頻用されている。他の固相担体材料として
は、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、デ
キストラン、セファロース、ニトロセルロース膜、ガラ
ス、濾紙などが使用される。ヒドラジド基、アルキルア
ミノ基などが導入された修飾ポリスチレン上のアミノ
基、ヒドロキシル基、カルボキシル基などを利用し、共
有結合でカップリングすることも実施される。カップリ
ング試薬としては、グルタルアルデヒド、カルボジイミ
ドなどが用いられる。物理吸着による作製方法は、至適
化された緩衝液にレセプター（あるいは抗体）を希釈
し、固相に浸漬させた後、液から分離し、牛血清アルブ
ミンやカゼイン・ゼラチンなどでブロッキングし、その
ままもしくは乾燥させて完成させるものである。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】物理吸着法による固相
作製法あるいは、共有結合による固相作製法の問題点
は、吸着もしくはカップリング時のレセプター（抗体を
含む）が希釈された場合の不安定性である。数ｍｇ/ｍ
ｌの濃度でも不安定なレセプター（抗体を含む）は希釈
されてμｇ/ｍｌの濃度となった場合、極めて不安定で
あり、作製した固相は実用に適さないかあるいは、失活
分を見込むため、固相化に必要な目的レセプターを多量
に必要とする。固相作製後の安定性も問題であるが、作
製時の不安定性は、同一性能の固相の作製の障害とな
り、ロット間差あるいは、同一ロット内においても作製
固相数が多くなると、作製の順序により大きな差が生じ
る。これらのため測定時の、一定範囲内の性能の維持が
困難となる。

【００１１】競合法に基づく測定系を構築する場合、上
記の問題はより深刻となる。競合法に基づく測定系をよ
り高感度にするためには、固相上のレセプター（抗体を
含む）濃度は一般的に非競合法に比べてより低い濃度に
する必要があり、通常条件では安定な抗体でさえ、不安
定な状況となるまで、固相作製時にレセプター（抗体を
含む）の希釈が必要となるからである。不安定な材料の
場合、状況は一層深刻となるのは自明であろう。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本願発明者らは、固定化
の際に、極めて低い濃度に曝されるレセプター（あるい
は抗体）をより安定化し、高感度など優れた性能を示し
かつ、複数の固相が均一な性能を示すことのできる固定
化法につき、鋭意努力検討した。その結果、目的対象の
レセプター（抗体を含む）の吸着あるいはカップリング
を妨害することのない状態で、目的の測定系とは関連の
ない他種のレセプター・抗体などの蛋白等を目的成分と
同時に共存させて組成物を作製することで、意外にも上
記の問題点を解決できることを見出し、本発明を完成さ
せるに至った。

【００１３】すなわち本発明は、（１）レセプターを固定化する際に、固定化するレセプ
ター以外の蛋白質を共存させることを特徴とする、レセ
プターおよび抗体の安定的な固定化方法。（２）固定化するレセプター以外の蛋白質が、当該レセ
プターが認識する結合反応に干渉しないことを特徴とす
る（１）の固定化方法。（３）固定化するレセプター以外の蛋白質が、当該レセ
プターと相互作用しないことを特徴とする（１）、
（２）の固定化方法。（４）固定化するレセプター以外の蛋白質が、抗体・ア
ルブミン・乳蛋白質・ゼラチン類・シャぺロニン・糖結
合性蛋白であることを特徴とする（１）〜（３）の固定
化方法。（５）固定化するレセプター以外の蛋白質が、糖結合性
蛋白質であり、当該レセプターが有する糖鎖と結合する
ことを特徴とする（２）の固定化方法。（６）抗体が、魚類・両性類・爬虫類・哺乳類のイムノ
グロブリンＧ・Ｍ・Ｄ・Ａであることを特徴とする
（４）の固定化方法。（７）抗体が、哺乳類のうちのゲッ歯類由来であること
を特徴とする（３）・（５）の固定化方法。（８）抗体が、イムノグロブリンの定常領域のフラグメ
ントであることを特徴とする（６）、（７）の固定化方
法。（９）アルブミン・乳蛋白質・ゼラチンが鳥類・魚類・
両性類・爬虫類・哺乳類由来であることを特徴とする
（４）の固定化方法。（１０）糖結合性蛋白質が、微生物・植物・鳥類・魚類
・両性類・哺乳類由来であることを特徴とする（４）の
固定化方法。（１１）糖結合性蛋白質が、微生物由来のマルトース結
合蛋白質（ＭＢＰ）・シュークロース結合蛋白質（ＳＢ
Ｐ）、植物性レクチンであることを特徴とする（４）の
固定化方法。（１２）植物性レクチンがコンカナバリンＡ、小麦胚芽
レクチンであることを特徴とする（１１）の固定化方
法。（１３）レセプターが、抗体、核内レセプター、膜貫通
型レセプター、トランスポーター、コファクターあるい
はコアクチベーターであることを特徴とする、（１）〜
（１２）のいずれかに記載の固定化方法。（１４）レセプターが低分子化合物を認識することを特
徴とする（１）〜（１２）のいずれかに記載の固定化方
法。（１５）低分子化合物がホルモン作用あるいは生物学的
作用を有するものであることを特徴とする（１４）の固
定化方法。（１６）低分子化合物が、エストラジオール、テストス
テロン、アンドロステロン、プロゲステロン、ジヒドロ
テストステロン、ミボレロン、Ｒ１８８１、ジエチルス
チルべステロール、サイロキシン、トリヨードサイロニ
ン、エストリオール、ビスフェノールＡ、アルキルフェ
ノール、農薬類、防腐剤、防黴剤、抗生物質、ＰＣＢ
類、ダイオキシン類であることを特徴とする（１５）の
固定化方法。（１７）レセプターが、アンドロジェンレセプター(A
R)、エストロゲンレセプター(ER)、グルココルチコイド
レセプター(GR)、ミネラルコルチコイドレセプター(MC
R)、プロゲステロンレセプター(PR)、ビタミンＤレセプ
ター（VDR)、サイロイドレセプター(TR)、レチノイン酸
レセプター(RAR)、レチノイドレセプター(RXR)、アリル
ハイドロカーボンレセプター(AHR)、プレグナンレセプ
ター、ペルオキシソームプロリファレイターアクチベ
ーテッドレセプター(PPAR)あるいはそれらの変異型で
あることを特徴とする（１４）〜（１７）の固定化方
法。（１８）（１）〜（１７）のいずれかに記載された方法
によって製造された固定化レセプターの組成物。（１９）（１３）〜（１７）のいずれかに記載された方
法によって製造された固定化レセプターの組成物を、競
合法にて使用することを特徴とする物質の測定方法。（２０）（１３）〜（１７）のいずれかに記載された方
法によって製造された固定化レセプターの組成物を、競
合法にて使用することを特徴とする物質測定用キット。
に関するものである。

【発明の実施の形態】本発明で対象とするレセプターの
形態としては、純化され活性のある蛋白以外に、動物組
織・植物組織・微生物から部分精製、粗精製あるいは未
精製抽出物が使用可能である。

【００１４】本発明で対象とするレセプターの給源とし
ては、ヒト・ラット・マウスなどの哺乳類由来のもの、
ニワトリなど鳥類由来のもの、ワニなどの爬虫類由来の
もの、カエルなどの両性類由来のもの、マス・メダカな
ど魚類由来のものを使用することができる。また他の無
脊椎動物・植物・微生物などいかなる生物由来のレセプ
ターも対象とすることができる。

【００１５】本発明で対象とするレセプターの種類とし
ては、核内レセプター、膜レセプター、トランスポータ
ー、コファクター、コアクチベーター、抗体その他のポ
リペプチドがあげられる。生体内のポリペプチドのその
ほとんどは、他の蛋白、リガンドと相互作用を行うた
め、主として生物の構造を保持する蛋白質であっても、
相互作用を行うレセプターとして考えることができるこ
とが多い。

【００１６】本発明でいう核内レセプターは、アンドロ
ジェンレセプター(AR)およびその亜型、エストロゲンレ
セプター(ER)およびその亜型、グルココルチコイドレセ
プター(GR)およびその亜型、ミネラルコルチコイドレセ
プター(MCR)およびその亜型、プロゲステロンレセプタ
ー(PR)およびその亜型、ビタミンＤレセプター（VDR)お
よびその亜型、サイロイドレセプター(TR)およびその亜
型、レチノイン酸レセプター(RAR)およびその亜型、レ
チノイドレセプター(RXR)およびその亜型、アリルハイ
ドロカーボンレセプター(AHR)およびその亜型、プレグ
ナンレセプターおよびその亜型、ペルオキシソームプ
ロリファレイターアクチベーテッドレセプター(PPAR)
およびその亜型、ならびにその変異体などの核内レセプ
タースーパーファミリーに属するものをいい、２０００
年の時点で１００種類以上とさらにそれらの亜型が相当
する。

【００１７】本発明でいう膜レセプターは、ペプチドホ
ルモン、神経伝達物質、増殖因子、サイトカイン、カテ
コールアミンなどに対するレセプターを言い、機構的に
は３量体Ｇタンパク共役型レセプター、イオンチャンネ
ル共役型レセプター、プロテインキナーゼ型レセプター
に分類される。具体的にはＥＧＦレセプター、ＰＤＧＦ
レセプター、アデノシンレセプター、ＦＧＦレセプタ
ー、ＴＧＦβレセプター、インシュリンレセプター、Ｉ
ＧＦ−Ｉレセプター、アンジオテンシンレセプター、Ｏ
Ｂレセプター、メラノコルチン、レセプター、アドレナ
リンレセプター、トロンビンレセプター、オキシトシン
レセプター、イノシトール３リン酸レセプター、ＦＳＨ
レセプター、ＴＳＨレセプター、インターフェロンレセ
プター、インターロイキンレセプター、Ｇ−ＣＳＦレセ
プター、ケモカインレセプター、チロシンキナーゼレセ
プターなどとその亜種、変異体をいう。

【００１８】本発明でいうトランスポーターとは、輸送
体、キャリアーとも呼ばれ、トランスチレチン、アルブ
ミン、リポ蛋白質、トランスコルチン、チロキシン結合
グロブリン、レチノール結合グロブリン、セルロプラス
ミン、ビタミンＤ結合蛋白質、トランスフェリン、ハプ
トグロビン、ヘモペチシン、トランスコバラミン、免疫
グロブリン等であり、主として難溶性物質と結合し、可
溶性の複合体を形成するものを言う。

【００１９】本発明でいうその他のレセプターとしての
コアクチベーター、コファクターあるいはポリペプチド
は、上述のレセプターと直接もしくは他の蛋白を介して
相互作用をもたらすものであれば、いかなる種類のもの
であってよく制限はない。

【００２０】本発明でいう抗体とは免疫グロブリンの各
クラス、すなわちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、Ｉ
ｇＤのことを言い、各抗体は魚類・両性類・爬虫類・哺
乳類のものを使用することができる。また抗体はこれら
各種動物の生体液から得られたものであっても、ハイブ
リドーマより産生されたものでも、遺伝子工学的に製造
されたものであってもよい。さらには抗体は全体の分子
であっても、結合部分の活性を保持しえれば、Ｆab、
（Ｆab）₂、Fab'、Fv，scFvあるいはミニボデイなどい
かなる形態のフラグメントであってもよい。

【００２１】本発明で使用するレセプター（抗体を含
む）は目的に応じて蛋白質、糖類、ポリマー、リン酸、
スルフォン酸によって融合または修飾されていてもよ
い。さらに目的によっては、レセプターのアミノ酸配列
の一部に変異があってもよい。

【００２２】本発明で使用されるレセプターが融合され
るとは、遺伝子配列、アミノ酸配列的に糖結合性蛋白
質、グルタチオン結合性蛋白質、カルシウム結合性蛋白
質、ポリヒスチジン配列、ビオチン結合性蛋白質、イム
ノグロブリン結合性蛋白質、イムノグロブリンＧ，Ｍ，
Ａ，Ｅ，Ｄの一部である蛋白質、蛍光性蛋白質と結合し
ていることを言う。

【００２３】本発明でいう、固定化するレセプター以外
の蛋白質としては、当該レセプターが認識する結合反応
に干渉しない蛋白質を使用することができる。また固定
化するレセプター以外の蛋白質が、当該レセプターと相
互作用しないとは、レセプターの結合部以外の部分に対
して結合するなどの作用をしないことをいう。具体的に
は核内レセプターにおけるヒンジ領域や転写活性領域な
どに対して相互作用する蛋白の使用をしないこと、ある
いは測定系に使用する抗体のFc領域に結合するプロテイ
ンAあるいは抗Fc抗体などを使用しないことを意味す
る。

【００２４】本発明でいう、イムノグロブリンの定常領
域のフラグメントとは、測定対象の物質と結合する領域
（可変領域）以外で各クラス毎に比較的配列が保持され
ている領域のことをいう。

【００２５】本発明でいう、アルブミン・乳蛋白質・ゼ
ラチンは鳥類・魚類・両性類・哺乳類由来のものを使用
することができる。

【００２６】本発明でいう、糖結合性蛋白質としては、
微生物・植物・鳥類・魚類・両性類・爬虫類・哺乳類由
来のものを使用することができ、具体的には微生物由来
のマルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）・シュークロース結
合蛋白質（ＳＢＰ）、植物性レクチンであるコンカナバ
リンＡ、小麦胚芽レクチン等を使用することができる。

【００２７】本発明でいう、低分子化合物はホルモン作
用あるいは生物学的作用を有するのであり、具体的に
は、エストラジオール、テストステロン、アンドロステ
ロン、プロゲステロン、ジヒドロテストステロン、ミボ
レロン、Ｒ１８８１、ジエチルスチルべステロール、サ
イロキシン、トリヨードサイロニン、エストリオール、
ビスフェノールＡ、アルキルフェノール、農薬類、防腐
剤、防黴剤、抗生物質、ＰＣＢ類、ダイオキシン類な
どがある。

【００２８】本発明でいう競合法とは、レセプター（抗
体を含む）の結合対象である物質Ａの標識体（Ａ-Ｌ）
をレセプターの固定化された固相上で、試料中の（Ａ）
と（Ａ−Ｌ）の競合反応を行なわせた後、遊離の（Ａ−
Ｌ）もしくは固相に結合した（Ａ−Ｌ）の標識（Ｌ）の
量を計測する、測定系のことをいう。図５に標識として
酵素（ペルオキシダーゼ）を用いた競合法測定系の例を
示す。

【００２９】本発明における固定化のための不溶性担体
としては、ポリスチレン・ナイロン・ポリカーボネート
などプラスチック、アガロース、セルロース、ポリアク
リルアミド、デキストラン、セファロース、ニトロセル
ロース、ガラス、濾紙などが使用可能である。各担体に
は各種の官能基（ヒドラジド基、アルキルアミノ基、ア
ミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基など）が導入
されていてもよい。担体の形状としては、マイクロタイ
タープレート、膜、シート、チップ、ビーズなど操作性
のよいものを使用することができる。各不溶性担体の吸
着可能力・結合能力はあらかじめ確認できている方が好
ましいが、それらの情報は必ずしも必須ではない。

【００３０】本発明では、固相担体作製時に、共有結合
によるカップリングも実施可能である。カップリング試
薬としては、グルタルアルデヒド、カルボジイミドなど
が用いられる。

【００３１】本発明におけるレセプター（抗体を含む）
固相作製時に使用する吸着液のベース緩衝液としては、
１０ｍＭりん酸緩衝液（１５０ｍＭＮａＣｌ含有：
ｐＨ７.２）、５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９.６）、１
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（１５０ｍＭＮａＣｌ含
有：ｐＨ８．５）など、一般的に用いられているもの
を、目的レセプターの安定性が保持されるｐＨ範囲内
（ｐＨ３.０〜１０.０：好ましくはｐＨ５.０〜９.０）
で使用することができる。塩の種類、緩衝液の濃度は示
した例に限定されるものではなく、適宜変更することが
でき、レセプターの種類によっては、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ
₂、ＭｎＣｌ₂、あるいは微量の重金属塩等を０．０１ｍ
Ｍ〜３００ｍＭの範囲で添加することが可能である。吸
着・結合反応後、牛血清アルブミンやカゼイン・ゼラチ
ンなどを、非特異的反応防止の為にブロッキング剤とし
て０．０１％〜１０％（Ｗ／Ｖ）の範囲で使用すること
ができる。このブロック剤のベース緩衝液としては吸着
液に使用したりん酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液の他に、
マレイン酸、乳酸などの有機酸緩衝液を１０ｍＭ〜３０
０ｍＭの範囲で使用することができる。ｐＨは測定系に
関連するレセプター（抗体を含む）の安定化に最もふさ
わしい範囲を選択できるが、一般的にはｐＨ５.０〜ｐ
Ｈ８．５で使用することが多い。また固定化後の安定化
のためにサッカロース・グルコース・デキストランなど
の糖類を安定化剤として０．０１％〜２０％（Ｗ／Ｖ）
の範囲で適宜添加することができる。

【００３２】固定化する目的のレセプター（抗体を含
む）の状態としては、市販の精製された状態のもの、例
えばアフィニテイ精製されたモノクローナル抗体や抗血
清が使用できる。レセプター（抗体を含む）は部分精製
されたものも使用できる。ここで精製されたあるいは部
分精製されたレセプター（抗体を含む）中の不純物とし
ての蛋白質等は、本発明でいう、意図的に添加する、測
定系に関与するレセプター以外の蛋白に相当しないこと
を明確にしておく。単なる不純物としての蛋白質等は、
本願発明の内容の先行事実でもなければ、示唆する要素
を含まないことは明らかであろう。

【００３３】測定系に関与するレセプター（抗体を含
む）を固定化させる時の濃度としては、０.１ｐｇ（ピ
コグラム）／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの範囲を使用すること
ができる。より好ましくは１０ｐｇ／ｍｌ〜５０μｇ／
ｍｌを、さらに好ましくは０．1μg/mL 〜１０μg/mL
を選択することができる。

【００３４】吸着・結合時に同時に共存させる、測定系
に関与するレセプター以外の蛋白の濃度としては、０．
１ｐｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲を使用することが
できる。より好ましくは１０ｐｇ／ｍｌ〜５００μｇ
／ｍｌを選択することができる。

【００３５】吸着・結合時の必要な時間としては、５分〜
７２時間が選択可能であるが、より好ましくは１時間〜
３６時間が選択できる。インキュベートする温度とし
ては、１℃〜４５℃が選択可能であるが、より好ましく
は２℃〜３７℃が選択できる。

【００３６】本発明で不溶性担体にレセプター（抗体を
含む）を吸着させた後、適宜１０ｍＭりん酸緩衝液
（１５０ｍＭＮａＣｌ含むｐＨ７.２）などの洗浄液
で洗浄することができる。洗浄剤にはツイーン２０やト
リトンＸ−１００など、温和な非イオン界面活性剤等な
どを適宜加えることもできる。

【００３７】本発明でいう測定用キットとは、上記競合
法を可能にする各種の試薬群（固相化された担体を含
む）のことである。具体的にはレセプター固定化プレー
ト、反応用緩衝液、試料希釈液、標準品、標識量を定量
するための測定用試薬などのセットをいう。

【００３８】

【実施例】本発明の実施における望ましい態様を実施例
として以下に述べる。

【００３９】［実施例１］氷冷した、５０ｍＭ炭酸緩衝
液（１５０ｍＭＮａＣｌを含む、ｐＨ９.６）に、ザ
イメット社製抗エストラジオールマウスモノクローナル
抗体を１μｇ／ｍｌ及びダコ社製精製抗ＣＥＡ抗体を５
μｇ／ｍｌとなるように希釈して抗体吸着液を作製し、
９６穴ポリスチレンプレート（コースター社製）に１０
０μＬづつ各ウエルに分注した。分注後２〜６℃におい
て調節された部屋に２４時間静置し物理吸着を実施し
た。その後吸着液を除去し、ツイン２００.０５％(Ｗ／
Ｖ)を含む１０ｍＭりん酸緩衝液（１５０ｍＭＮａＣ
ｌを含む:ｐＨ７.４）２００μｌにて各ウエルを洗浄
した。洗浄は計３回繰り返し実施した。洗浄後１０ｍＭ
りん酸緩衝液（１５０ｍＭＮａＣｌを含む：ｐＨ７.
４）に、１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡ及び１０％（Ｗ／
Ｖ）サッカロースを加えたブロック液２００μｌにて
各ウエルを満たし、２〜６℃において調節された部屋に
２４時間静置した。その後各ウエル中の液を除去し、そ
のまま真空乾燥を実施した。この操作を９６穴プレート
５０枚に対して連続して実施し、５０枚の抗エストラ
ジオール抗体固定化プレート５０枚を得た。乾燥後、
エストラジオール標識ペルオキシダーゼと４℃で１時間
反応させた後、上と同じ洗浄液にて３回洗浄後、テトラ
メチルベンチジン（ＴＭＢ）溶液を１００μｌ添加、３
７℃で２０分間反応させ、１Ｎ硫酸１００μｌにて酵
素反応を停止し、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。そ
の結果を図１に示す。最初に作製したプレート〜最後
（５０枚目）に作製したプレートで殆ど差がないことが
わかる。

【００４０】［比較例１］実施例１の操作のうち抗ＣＥ
Ａ抗体を除いて同様の操作を実施し、抗エストラジオー
ル抗体固定化プレートを５０枚作製した。実施例１同様
に作製したプレートの性能を確認した。図２にその結果
を示す。最初に作製したプレートと比較して、次第に後
半に作製したプレートの活性シグナルが低下しているこ
とが分かる。

【００４１】［実施例２］実施例１の吸着液のうち、抗
ＣＥＡ抗体の代りに、抗Ｔａｑポリメラーゼ抗体、抗マ
ウスＩｇＧヤギ抗体あるいは抗ヒトＦａｂヤギ抗体、ヒ
ト免疫グロブリンフラグメント(Ｆｃ)をそれぞれ添加し
た抗体吸着液を作製した。コントロールとして抗体を添
加しない抗エストラジオール抗体のみの吸着液を作製し
た。これらの抗体吸着液を２５℃にて１時間保持後、９
６穴プレートに分注し、実施例１と同様に抗体固定化プ
レートを各１枚づつ作製した。比較として各抗体吸着液
を４℃にて１時間保持後、同様に抗体固定化プレートを
各１枚づつ作製した。実施例１と同様に各種の作製プレ
ートの性能を確認し比較した。図３にその結果を示す。
エストラジオール測定に無関連の各種抗体を添加した抗
体吸着液を用いた系では２５℃、１時間の処理で大幅な
シグナルの減少が認められず、種類によらず添加した蛋
白は保護効果を有することが分かる。

【００４２】［実施例３］氷冷した、５０ｍＭ炭酸緩衝
液（１５０ｍＭＮａＣｌを含む、ｐＨ９.６）に、パ
ンベラ社製エストロゲンレセプターαを５ｐｍｏｌｅ
／ｍｌ及びダコ社製精製抗ＣＥＡ抗体あるいはＢＳＡ、
抗Ｔａｑポリメラーゼ抗体、抗マウスＩｇＧヤギ抗体、
抗ヒトＦａｂヤギ抗体を別個に５μｇ／ｍｌとなるよう
に希釈してレセプター吸着液を作製し、９６穴ポリスチ
レンプレート（コースター社製）に１００μＬづつ各ウ
エルに分注した。分注後２〜６℃において調節された部
屋に３時間静置し物理吸着を実施した。その後、吸着液
を除去し、１０ｍＭりん酸緩衝液（１５０ｍＭＮａＣ
ｌを含む:ｐＨ７.４）２００μｌにて各ウエルを洗浄
した。洗浄は計３回繰返し実施した。洗浄後１０ｍＭ
りん酸緩衝液（１５０ｍＭＮａＣｌを含む：ｐＨ７.
４）に、１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡ及び１０％（Ｗ／
Ｖ）サッカロースを加えたブロック液２００μｌにて
各ウエルを満たし、２〜６℃において調節された部屋に
２４時間静置した。コントロールとしてエストロゲンレ
セプターαのみのものを作製した（レセプター固定化プ
レート）。レセプターを加えないこと以外は全く同じ方
法にて同様の固相を作製した（レセプター非固定化プレ
ート）。レセプター固定化プレートあるいはレセプター
非固定化プレートを、トリチウムラベルしたエストラジ
オール溶液１ｎＭ（０．１％ゼラチンを含む５０ｍＭ
ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７.４）をベースとする）、１
２０μＬと４℃で３時間反応させた後、上清１００μｌ
を２ウエル分とり、液体シンチレーションカクテルク
リアゾルII（ナカライテスク社製）２ｍｌを加え、シン
チレーションカウンターにてＣＰＭを測定した。さらに
レセプター固定化プレートのシグナルＣＰＭと非レセプ
ター固定化プレートのシグナルＣＰＭの差（ΔＣＰＭ）
を、各種の条件で算出した。その結果を図４に示す。レ
セプター反応に影響を与えない抗体等を添加しないで作
製した、レセプター固定化プレートには殆どエストラジ
オール結合能がほとんどないことが明瞭であり、添加し
た抗体等が固相作製時に保護効果を有することが分か
る。

【００４３】

【発明の効果】本発明により、より高感度なレセプター
（抗体を含む）固定化組成物を一定の品質で作製するこ
とが可能であり、さらにそれらを用いた高感度な測定用
組成物・試薬を提供することができる。本発明は特に不
安定なレセプター（抗体を含む）に対して、高感度な競
合免疫測定系（一般に固相に固定化するレセプター等の
密度が低い）に対して極めて有効である。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で複数作製した抗体固相の反応性を
示す。

【図２】比較例１で複数作製した抗体固相の反応性を
示す。

【図３】実施例２で作製した各種抗体固相の反応性を
比較して示す。

【図４】実施例３で作製した各種レセプター固相の反
応性を比較して示す。

【図５】酵素免疫競合法の測定原理を模式的に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者岡正則福井県敦賀市東洋町10番24号東洋紡績株式会社敦賀バイオ研究所内Ｆターム(参考） 4H045 AA10 BA62 CA40 CA52 CA53 DA50 DA75 EA50 FA82

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】レセプターを固定化する際に、固定化す
るレセプター以外の蛋白質を共存させることを特徴とす
る、レセプターおよび抗体の安定的な固定化方法。
【請求項２】固定化するレセプター以外の蛋白質が、
当該レセプターが認識する結合反応に干渉しないことを
特徴とする請求項１の固定化方法。
【請求項３】固定化するレセプター以外の蛋白質が、
当該レセプターと相互作用しないことを特徴とする請求
項１、２の固定化方法。
【請求項４】固定化するレセプター以外の蛋白質が、
抗体・アルブミン・乳蛋白質・ゼラチン類・シャぺロニ
ン・糖結合性蛋白であることを特徴とする請求項１−３
の固定化方法。
【請求項５】固定化するレセプター以外の蛋白質が、
糖結合性蛋白質であり、当該レセプターが有する糖鎖と
結合することを特徴とする請求項２の固定化方法。
【請求項６】抗体が、魚類・両性類・爬虫類・哺乳類
のイムノグロブリンＧ・Ｍ・Ｄ・Ａであることを特徴と
する請求項４の固定化方法。
【請求項７】抗体が、哺乳類のうちのゲッ歯類由来で
あることを特徴とする請求項３、５の固定化方法。
【請求項８】抗体が、イムノグロブリンの定常領域の
フラグメントであることを特徴とする請求項６、７の固
定化方法。
【請求項９】アルブミン・乳蛋白質・ゼラチンが鳥類
・魚類・両性類・爬虫類・哺乳類由来であることを特徴
とする請求項４の固定化方法。
【請求項１０】糖結合性蛋白質が、微生物・植物・鳥
類・魚類・両性類・哺乳類由来であることを特徴とする
請求項４の固定化方法。
【請求項１１】糖結合性蛋白質が、微生物由来のマルト
ース結合蛋白質（ＭＢＰ）・シュークロース結合蛋白質
（ＳＢＰ）、植物性レクチンであることを特徴とする請
求項４の固定化方法。
【請求項１２】植物性レクチンがコンカナバリンＡ、小
麦胚芽レクチンであることを特徴とする請求項１１の固
定化方法。
【請求項１３】レセプターが、抗体、核内レセプター、
膜貫通型レセプター、トランスポーター、コファクター
あるいはコアクチベーターであることを特徴とする、請
求項１〜１２のいずれかに記載の固定化方法。
【請求項１４】レセプターが低分子化合物を認識するこ
とを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の固定
化方法。
【請求項１５】低分子化合物がホルモン作用あるいは生
物学的作用を有するものであることを特徴とする請求項
１４の固定化方法。
【請求項１６】低分子化合物が、エストラジオール、テ
ストステロン、アンドロステロン、プロゲステロン、ジ
ヒドロテストステロン、ミボレロン、Ｒ１８８１、ジエ
チルスチルべステロール、サイロキシン、トリヨードサ
イロニン、エストリオール、ビスフェノールＡ、アルキ
ルフェノール、農薬類、防腐剤、防黴剤、抗生物質、Ｐ
ＣＢ類、ダイオキシン類であることを特徴とする請求項
１５の固定化方法。
【請求項１７】レセプターが、アンドロジェンレセプタ
ー(AR)、エストロゲンレセプター(ER)、グルココルチコ
イドレセプター(GR)、ミネラルコルチコイドレセプター
(MCR)、プロゲステロンレセプター(PR)、ビタミンＤレ
セプター（VDR)、サイロイドレセプター(TR)、レチノイ
ン酸レセプター(RAR)、レチノイドレセプター(RXR)、ア
リルハイドロカーボンレセプター(AHR)、プレグナンレ
セプター、ペルオキシソームプロリファレイターアク
チベーテッドレセプター(PPAR)あるいはそれらの変異
型であることを特徴とする請求項１４〜１７の固定化方
法。
【請求項１８】請求項１〜１７のいずれかに記載された
方法によって製造された固定化レセプターの組成物。
【請求項１９】請求項１３〜１７のいずれかに記載され
た方法によって製造された固定化レセプターの組成物
を、競合法にて使用することを特徴とする物質の測定方
法。
【請求項２０】請求項１３〜１７のいずれかに記載され
た方法によって製造された固定化レセプターの組成物
を、競合法にて使用することを特徴とする物質測定用キ
ット。