JP2003210192A - オーファンｇｐｃｒに対するリガンドのスクリーニング方法 - Google Patents
オーファンｇｐｃｒに対するリガンドのスクリーニング方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 オーファンＧＰＣＲ作動薬のスクリーニング
方法およびスクリーニング系の提供。 【解決手段】 (i) 目的のＧＰＣＲとＧα16との融合蛋
白質を含む膜系、(ii)該ＧＰＣＲとＧαi2との融合蛋白
質を含む膜系および(iii) 該ＧＰＣＲとＧαS2との融合
蛋白質を含む膜系を構成要素として包含する、ＧＰＣＲ
に対するリガンドのスクリーニング系、該スクリーニン
グ系を用いたＧＰＣＲと共役するＧα蛋白質の同定方
法、並びにＧＰＣＲと共役Ｇα蛋白質との融合蛋白質を
含む膜系を用いた該ＧＰＣＲに対するリガンドのスクリ
ーニング方法。
方法およびスクリーニング系の提供。 【解決手段】 (i) 目的のＧＰＣＲとＧα16との融合蛋
白質を含む膜系、(ii)該ＧＰＣＲとＧαi2との融合蛋白
質を含む膜系および(iii) 該ＧＰＣＲとＧαS2との融合
蛋白質を含む膜系を構成要素として包含する、ＧＰＣＲ
に対するリガンドのスクリーニング系、該スクリーニン
グ系を用いたＧＰＣＲと共役するＧα蛋白質の同定方
法、並びにＧＰＣＲと共役Ｇα蛋白質との融合蛋白質を
含む膜系を用いた該ＧＰＣＲに対するリガンドのスクリ
ーニング方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、オーファンＧＰＣ
Ｒ作動薬のスクリーニング方法およびスクリーニング系
に関する。
Ｒ作動薬のスクリーニング方法およびスクリーニング系
に関する。
【０００２】
【従来の技術】ゲノム創薬の中で、最も注目されている
創薬ターゲットにＧ蛋白質共役７回膜貫通型レセプター
（ＧＰＣＲ）がある。ＧＰＣＲと生理的リガンドの相互
認識は、細胞外の刺激に応答して細胞内に情報伝達する
ことにより、生体の恒常性の維持や生体機能の調節など
において重要な役割を担っている場合が多い。実際、既
存医薬品の作用点の多くがＧＰＣＲであることから、ゲ
ノム解析情報から得られている少なくとも約５００個以
上存在するＧＰＣＲは、格好の新規創薬ターゲットとな
る。
創薬ターゲットにＧ蛋白質共役７回膜貫通型レセプター
（ＧＰＣＲ）がある。ＧＰＣＲと生理的リガンドの相互
認識は、細胞外の刺激に応答して細胞内に情報伝達する
ことにより、生体の恒常性の維持や生体機能の調節など
において重要な役割を担っている場合が多い。実際、既
存医薬品の作用点の多くがＧＰＣＲであることから、ゲ
ノム解析情報から得られている少なくとも約５００個以
上存在するＧＰＣＲは、格好の新規創薬ターゲットとな
る。
【０００３】一般的に、ＧＰＣＲに対する阻害剤のスク
リーニングとは、ＧＰＣＲを活性化する生理的リガンド
の結合を阻害する化合物を探索することである。しかし
ながら、ゲノム創薬で見出された多くのＧＰＣＲは生理
的リガンドが未知のオーファンであり、その阻害剤をス
クリーニングするためには、予め生理的リガンドを同定
する必要がある。多くのオーファンＧＰＣＲについてリ
ガンド探索を行うことは、多大な時間やコストが必要で
あり、しかも必ずしも同定に成功するとは限らない。さ
らに、例えば数多くのレセプターサブタイプが存在する
ＧＰＣＲ、セロトニンレセプターのように、生理的リガ
ンドであるセロトニンが判明していても、サブタイプ特
異的なアンタゴニスト、インバースアゴニスト、アゴニ
ストがなければ、レセプター機能が特定できない場合が
ある。従って、生理的リガンドの同定が、創薬ターゲッ
トバリデーションに必須でないことは明らかである。
リーニングとは、ＧＰＣＲを活性化する生理的リガンド
の結合を阻害する化合物を探索することである。しかし
ながら、ゲノム創薬で見出された多くのＧＰＣＲは生理
的リガンドが未知のオーファンであり、その阻害剤をス
クリーニングするためには、予め生理的リガンドを同定
する必要がある。多くのオーファンＧＰＣＲについてリ
ガンド探索を行うことは、多大な時間やコストが必要で
あり、しかも必ずしも同定に成功するとは限らない。さ
らに、例えば数多くのレセプターサブタイプが存在する
ＧＰＣＲ、セロトニンレセプターのように、生理的リガ
ンドであるセロトニンが判明していても、サブタイプ特
異的なアンタゴニスト、インバースアゴニスト、アゴニ
ストがなければ、レセプター機能が特定できない場合が
ある。従って、生理的リガンドの同定が、創薬ターゲッ
トバリデーションに必須でないことは明らかである。
【０００４】以上のように、数多く存在するオーファン
ＧＰＣＲの中から、リガンド探索を行うＧＰＣＲを限定
して絞り込むには、情報が不足している。したがって、
多検体のオーファンＧＰＣＲに対して、リガンドを必要
としない、新規かつ迅速で汎用性のある作動薬のスクリ
ーニング方法の開発が強く求められている。スクリーニ
ングによって標的ＧＰＣＲと相互作用する化合物が見出
されれば、それを用いて創薬ターゲットバリデーション
ができると同時に、既にリード化合物を得たことにな
る。
ＧＰＣＲの中から、リガンド探索を行うＧＰＣＲを限定
して絞り込むには、情報が不足している。したがって、
多検体のオーファンＧＰＣＲに対して、リガンドを必要
としない、新規かつ迅速で汎用性のある作動薬のスクリ
ーニング方法の開発が強く求められている。スクリーニ
ングによって標的ＧＰＣＲと相互作用する化合物が見出
されれば、それを用いて創薬ターゲットバリデーション
ができると同時に、既にリード化合物を得たことにな
る。
【０００５】７回膜貫通型蛋白質であるＧＰＣＲは、Ｇ
ＰＣＲ間で相同性を有する７個の疎水性の高い膜貫通ド
メインを介して、細胞外にＮ末端領域と３個のループ、
細胞内に３個のループとＣ末領域を配している。一方、
共役Ｇ蛋白質はα、βおよびγの３個のサブユニットか
ら構成されるヘテロ三量体であり、活性化することによ
りαサブユニットとβγの二量体に解離し、それぞれが
セカンドメッセンジャーなどの活性化を介して、その下
流因子群を賦活化する。即ち、ＧＰＣＲへのアゴニスト
の結合は、ＧＰＣＲの細胞内第三ループに結合している
Ｇ蛋白質のαサブユニットをＧＤＰ結合型からＧＴＰ結
合型にする一連のコンフォメーション変化をもたらす。
ＧＴＰ結合型となったαサブユニットは、βγの二量体
サブユニットと解離し、アデニル酸シクラーゼ（Ａ
Ｃ）、フォスフォリパーゼβ（ＰＬＣβ）などの標的エ
フェクターと相互作用し、シグナリングが開始する。Ａ
ＣやＰＬＣβの活性化により、細胞内のｃＡＭＰやＣａ
イオンなどのセカンドメッセンジャーのレベルを正ある
いは負に調節することにより、細胞外情報を細胞内に伝
達する。αサブユニット自身のＧＴＰ加水分解作用によ
りＧＴＰがＧＤＰに分解されることで、βγサブユニッ
トと再び結合しシグナリングは終結する。このシグナル
経路は、αサブユニットの非常に豊富なサブタイプによ
り特徴付けられる。αサブユニットは、４種のクラス
（αS、αi/0、αq、α12）に分類され、合計１７遺伝
子でコードされる２３種のαサブユニットが既知であ
る。このサブユニットの多様性が刺激の多様性に対応し
ていることは言うまでもない。
ＰＣＲ間で相同性を有する７個の疎水性の高い膜貫通ド
メインを介して、細胞外にＮ末端領域と３個のループ、
細胞内に３個のループとＣ末領域を配している。一方、
共役Ｇ蛋白質はα、βおよびγの３個のサブユニットか
ら構成されるヘテロ三量体であり、活性化することによ
りαサブユニットとβγの二量体に解離し、それぞれが
セカンドメッセンジャーなどの活性化を介して、その下
流因子群を賦活化する。即ち、ＧＰＣＲへのアゴニスト
の結合は、ＧＰＣＲの細胞内第三ループに結合している
Ｇ蛋白質のαサブユニットをＧＤＰ結合型からＧＴＰ結
合型にする一連のコンフォメーション変化をもたらす。
ＧＴＰ結合型となったαサブユニットは、βγの二量体
サブユニットと解離し、アデニル酸シクラーゼ（Ａ
Ｃ）、フォスフォリパーゼβ（ＰＬＣβ）などの標的エ
フェクターと相互作用し、シグナリングが開始する。Ａ
ＣやＰＬＣβの活性化により、細胞内のｃＡＭＰやＣａ
イオンなどのセカンドメッセンジャーのレベルを正ある
いは負に調節することにより、細胞外情報を細胞内に伝
達する。αサブユニット自身のＧＴＰ加水分解作用によ
りＧＴＰがＧＤＰに分解されることで、βγサブユニッ
トと再び結合しシグナリングは終結する。このシグナル
経路は、αサブユニットの非常に豊富なサブタイプによ
り特徴付けられる。αサブユニットは、４種のクラス
（αS、αi/0、αq、α12）に分類され、合計１７遺伝
子でコードされる２３種のαサブユニットが既知であ
る。このサブユニットの多様性が刺激の多様性に対応し
ていることは言うまでもない。
【０００６】既知のＧＰＣＲについて、ＧＰＣＲと共役
するＧα蛋白質を融合蛋白質として発現させることによ
り、ＧＰＣＲからのシグナルをリガンド非依存的に、部
分的かつ恒常的に活性化する現象が知られている（Bert
in, B. et al., PNAS, 91, 8827-8831 (1994)）。本
来、不活性型のヘテロ三量体Ｇ蛋白質はＧＰＣＲの第三
ループに結合した状態をとるが、その結合はＧＰＣＲお
よび各Ｇ蛋白質サブユニットの細胞内濃度に大きく依存
している。即ち、各蛋白質の濃度が十分高い場合はＧＰ
ＣＲには不活性型のヘテロ三量体が結合している確率が
高くなり、ＧＰＣＲに入ったシグナルは直ちにＧ蛋白質
に伝達されるが、各蛋白質の濃度が不十分な場合は必ず
しもそうはならない。ここで、ＧＰＣＲのＣ末端部分に
Ｇα蛋白質のＮ末端部分を融合することにより、不活性
型のＧＤＰ結合型−Ｇα蛋白質は、常に１：１の関係で
ＧＰＣＲのすぐ近傍に配置されることになり、ＧＰＣＲ
近傍でのＧα蛋白質の局所濃度は極めて高い状態とな
る。また、通常ＧＰＣＲは、不活性なコンフォメーショ
ンと活性化されたコンフォメーションの平衡状態にあ
る。リガンド非結合状態ではその平衡は大きく不活性状
態に傾いているものの、偶然的にＧＰＣＲが活性化され
たコンフォメーションをとった瞬間に、融合させたこと
によりすぐ近傍に配置されたＧα蛋白質にシグナルを伝
達することが可能となり、ＧＴＰ結合型に変換し、Ｇα
蛋白質を活性化すると推定される。
するＧα蛋白質を融合蛋白質として発現させることによ
り、ＧＰＣＲからのシグナルをリガンド非依存的に、部
分的かつ恒常的に活性化する現象が知られている（Bert
in, B. et al., PNAS, 91, 8827-8831 (1994)）。本
来、不活性型のヘテロ三量体Ｇ蛋白質はＧＰＣＲの第三
ループに結合した状態をとるが、その結合はＧＰＣＲお
よび各Ｇ蛋白質サブユニットの細胞内濃度に大きく依存
している。即ち、各蛋白質の濃度が十分高い場合はＧＰ
ＣＲには不活性型のヘテロ三量体が結合している確率が
高くなり、ＧＰＣＲに入ったシグナルは直ちにＧ蛋白質
に伝達されるが、各蛋白質の濃度が不十分な場合は必ず
しもそうはならない。ここで、ＧＰＣＲのＣ末端部分に
Ｇα蛋白質のＮ末端部分を融合することにより、不活性
型のＧＤＰ結合型−Ｇα蛋白質は、常に１：１の関係で
ＧＰＣＲのすぐ近傍に配置されることになり、ＧＰＣＲ
近傍でのＧα蛋白質の局所濃度は極めて高い状態とな
る。また、通常ＧＰＣＲは、不活性なコンフォメーショ
ンと活性化されたコンフォメーションの平衡状態にあ
る。リガンド非結合状態ではその平衡は大きく不活性状
態に傾いているものの、偶然的にＧＰＣＲが活性化され
たコンフォメーションをとった瞬間に、融合させたこと
によりすぐ近傍に配置されたＧα蛋白質にシグナルを伝
達することが可能となり、ＧＴＰ結合型に変換し、Ｇα
蛋白質を活性化すると推定される。
【０００７】同様にして、オーファンＧＰＣＲについて
も、リガンド非依存的に恒常的活性化が出来れば、その
現象を利用してオーファンＧＰＣＲ作動薬のスクリーニ
ング系を構築することが出来ると考えられる。この場
合、オーファンＧＰＣＲは活性化しているため、対する
インバースアゴニストをリガンド非依存的にスクリーニ
ングすることが可能となる。また、その活性化が部分的
であるので、アゴニストも同時にスクリーニングするこ
とが可能であり、本法はオーファンＧＰＣＲ作動薬の画
期的なスクリーニング方法となりうる。しかしながら、
その構築のためには、そのオーファンＧＰＣＲがどのＧ
α蛋白質と共役するのか現時点では予想できないという
問題を解決する必要がある。上述の通り、Ｇα蛋白質は
既知のものだけで２３種存在し、そのすべてについてス
クリーニング系を構築することは、時間的、コスト的に
みて非現実的である。
も、リガンド非依存的に恒常的活性化が出来れば、その
現象を利用してオーファンＧＰＣＲ作動薬のスクリーニ
ング系を構築することが出来ると考えられる。この場
合、オーファンＧＰＣＲは活性化しているため、対する
インバースアゴニストをリガンド非依存的にスクリーニ
ングすることが可能となる。また、その活性化が部分的
であるので、アゴニストも同時にスクリーニングするこ
とが可能であり、本法はオーファンＧＰＣＲ作動薬の画
期的なスクリーニング方法となりうる。しかしながら、
その構築のためには、そのオーファンＧＰＣＲがどのＧ
α蛋白質と共役するのか現時点では予想できないという
問題を解決する必要がある。上述の通り、Ｇα蛋白質は
既知のものだけで２３種存在し、そのすべてについてス
クリーニング系を構築することは、時間的、コスト的に
みて非現実的である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
の問題点を解決して、ＧＰＣＲ−Ｇα融合蛋白質発現系
を用いた、迅速かつ汎用性の高い新規なＧＰＣＲ作動薬
スクリーニング手段を提供することである。
の問題点を解決して、ＧＰＣＲ−Ｇα融合蛋白質発現系
を用いた、迅速かつ汎用性の高い新規なＧＰＣＲ作動薬
スクリーニング手段を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】αサブユニットには非常
に豊富なサブタイプが存在するが、個々のシグナリング
の選択性については、その機序は依然として未解明であ
る。しかしながら、種々のαサブユニットは同じ標的エ
フェクターと相互作用でき、個々のαサブユニットは種
々の標的エフェクターと相互作用でき、さらに個々のＧ
ＰＣＲは種々のαサブユニットと相互作用できることが
知られている。即ち、ＧＰＣＲとαサブユニットの関係
は非常に厳密というわけではないのである。本発明者ら
は、かかる知見に基づいて、種々のαサブユニットサブ
タイプのうちから数個を巧妙に選択することにより、す
べてのαサブユニットを準備することなく、ほぼすべて
のＧＰＣＲのシグナリングを網羅できるのではないかと
発想した。そこで、本発明者らは、それら多くのαサブ
ユニットの中から、その発現の組織普遍性、活性の強さ
などを考慮して、ＧqファミリーからＧα16、Ｇiファミ
リーからＧαi2、ＧSファミリーからＧαS2を選択し、
共役するＧα蛋白質およびリガンドが公知の各種ＧＰＣ
Ｒとこれら３種のＧα蛋白質をそれぞれ融合蛋白質とし
て細胞に一過的に発現させ、リガンドの存在下および非
存在下でのＧＰＣＲの活性を比較した。その結果、調べ
たすべてのＧＰＣＲについて、それらが本来共役するＧ
α蛋白質と同じファミリーに属するＧα蛋白質（サブタ
イプが異なるにも関わらず）との融合蛋白質を発現する
細胞においてのみ、リガンドの非存在下においてもＧＰ
ＣＲが恒常的に活性化された。また、インバースアゴニ
ストの存在下では、リガンドフリーの場合に比べて活性
が低下することが示された。さらに、ＧＰＣＲの活性化
は部分的であるため、アゴニストの存在下においてはリ
ガンドフリーの場合に比べて活性が増大することが確認
された。このように、本発明者らは、Ｇα16、Ｇαi2お
よびＧαS2を用いた本スクリーニング系が、アゴニスト
およびインバースアゴニストを含めたオーファンＧＰＣ
Ｒのリガンドスクリーニング系として、あらゆるＧＰＣ
Ｒに普遍的に利用できることを実証して、本発明を完成
するに至った。
に豊富なサブタイプが存在するが、個々のシグナリング
の選択性については、その機序は依然として未解明であ
る。しかしながら、種々のαサブユニットは同じ標的エ
フェクターと相互作用でき、個々のαサブユニットは種
々の標的エフェクターと相互作用でき、さらに個々のＧ
ＰＣＲは種々のαサブユニットと相互作用できることが
知られている。即ち、ＧＰＣＲとαサブユニットの関係
は非常に厳密というわけではないのである。本発明者ら
は、かかる知見に基づいて、種々のαサブユニットサブ
タイプのうちから数個を巧妙に選択することにより、す
べてのαサブユニットを準備することなく、ほぼすべて
のＧＰＣＲのシグナリングを網羅できるのではないかと
発想した。そこで、本発明者らは、それら多くのαサブ
ユニットの中から、その発現の組織普遍性、活性の強さ
などを考慮して、ＧqファミリーからＧα16、Ｇiファミ
リーからＧαi2、ＧSファミリーからＧαS2を選択し、
共役するＧα蛋白質およびリガンドが公知の各種ＧＰＣ
Ｒとこれら３種のＧα蛋白質をそれぞれ融合蛋白質とし
て細胞に一過的に発現させ、リガンドの存在下および非
存在下でのＧＰＣＲの活性を比較した。その結果、調べ
たすべてのＧＰＣＲについて、それらが本来共役するＧ
α蛋白質と同じファミリーに属するＧα蛋白質（サブタ
イプが異なるにも関わらず）との融合蛋白質を発現する
細胞においてのみ、リガンドの非存在下においてもＧＰ
ＣＲが恒常的に活性化された。また、インバースアゴニ
ストの存在下では、リガンドフリーの場合に比べて活性
が低下することが示された。さらに、ＧＰＣＲの活性化
は部分的であるため、アゴニストの存在下においてはリ
ガンドフリーの場合に比べて活性が増大することが確認
された。このように、本発明者らは、Ｇα16、Ｇαi2お
よびＧαS2を用いた本スクリーニング系が、アゴニスト
およびインバースアゴニストを含めたオーファンＧＰＣ
Ｒのリガンドスクリーニング系として、あらゆるＧＰＣ
Ｒに普遍的に利用できることを実証して、本発明を完成
するに至った。
【００１０】すなわち、本発明は、(i) 目的のＧＰＣＲ
とＧα16との融合蛋白質が包埋された脂質二重層を含む
膜系、(ii) 該ＧＰＣＲとＧαi2との融合蛋白質が包埋
された脂質二重層を含む膜系および(iii) 該ＧＰＣＲと
ＧαS2との融合蛋白質が包埋された脂質二重層を含む膜
系を構成要素とする、ＧＰＣＲに対するリガンドのスク
リーニング系、並びにこれらの各膜系に包埋されたＧα
サブユニット蛋白質のＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応、又は該
Ｇαサブユニット蛋白質と相互作用するエフェクターの
活性を、被験物質の存在下と非存在下で比較することに
よる、ＧＰＣＲに対するリガンドのスクリーニング方法
を提供する。
とＧα16との融合蛋白質が包埋された脂質二重層を含む
膜系、(ii) 該ＧＰＣＲとＧαi2との融合蛋白質が包埋
された脂質二重層を含む膜系および(iii) 該ＧＰＣＲと
ＧαS2との融合蛋白質が包埋された脂質二重層を含む膜
系を構成要素とする、ＧＰＣＲに対するリガンドのスク
リーニング系、並びにこれらの各膜系に包埋されたＧα
サブユニット蛋白質のＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応、又は該
Ｇαサブユニット蛋白質と相互作用するエフェクターの
活性を、被験物質の存在下と非存在下で比較することに
よる、ＧＰＣＲに対するリガンドのスクリーニング方法
を提供する。
【００１１】本発明はまた、上記スクリーニング系の各
膜系に包埋されたＧαサブユニット蛋白質のＧＤＰ・Ｇ
ＴＰ交換反応、又は該Ｇαサブユニット蛋白質と相互作
用するエフェクターの活性を相互に比較することによ
る、ＧＰＣＲと相互作用し得るＧαサブユニット蛋白質
の同定方法を提供する。Ｇα蛋白質との組み合わせが決
定されれば、当該Ｇα蛋白質との融合蛋白質が包埋され
た膜系についてのみ上記のスクリーニング法を実施する
ことにより、生理的リガンド、アゴニスト、インバース
アゴニストなどのリガンドの探索が可能となる。
膜系に包埋されたＧαサブユニット蛋白質のＧＤＰ・Ｇ
ＴＰ交換反応、又は該Ｇαサブユニット蛋白質と相互作
用するエフェクターの活性を相互に比較することによ
る、ＧＰＣＲと相互作用し得るＧαサブユニット蛋白質
の同定方法を提供する。Ｇα蛋白質との組み合わせが決
定されれば、当該Ｇα蛋白質との融合蛋白質が包埋され
た膜系についてのみ上記のスクリーニング法を実施する
ことにより、生理的リガンド、アゴニスト、インバース
アゴニストなどのリガンドの探索が可能となる。
【００１２】本発明のこれらのおよび他の目的および利
点、並びに本発明のさらなる特徴について、以下の「発
明の実施の形態」においてより詳細に説明する。
点、並びに本発明のさらなる特徴について、以下の「発
明の実施の形態」においてより詳細に説明する。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明は、任意のＧＰＣＲに対す
るリガンドのスクリーニング系及びそれを用いた当該リ
ガンドのスクリーニング方法を提供する。本明細書にお
いて「リガンド」とは、特にことわらない限り、生理的
（即ち、「ネイティブ（＝native）」）リガンドだけで
なく、アゴニスト（即ち、受容体の生理的リガンド結合
部位に結合して、リガンド様の活性を示す物質）やイン
バースアゴニスト（受容体の任意の部位に結合してその
コンフォメーションを変化させ、受容体を不活性化する
物質）をも包含するものとする。
るリガンドのスクリーニング系及びそれを用いた当該リ
ガンドのスクリーニング方法を提供する。本明細書にお
いて「リガンド」とは、特にことわらない限り、生理的
（即ち、「ネイティブ（＝native）」）リガンドだけで
なく、アゴニスト（即ち、受容体の生理的リガンド結合
部位に結合して、リガンド様の活性を示す物質）やイン
バースアゴニスト（受容体の任意の部位に結合してその
コンフォメーションを変化させ、受容体を不活性化する
物質）をも包含するものとする。
【００１４】本発明のスクリーニング系は、(i) 目的の
ＧＰＣＲとＧα16との融合蛋白質が包埋された脂質二重
層を含む膜系、(ii) 該ＧＰＣＲとＧαi2との融合蛋白
質が包埋された脂質二重層を含む膜系および(iii) 該Ｇ
ＰＣＲとＧαS2との融合蛋白質が包埋された脂質二重層
を含む膜系を構成要素として包含する。分析の対象とな
るＧＰＣＲは、いずれかのＧα蛋白質と相互作用して細
胞内情報伝達に関与する膜受容体であればいかなるもの
であってもよい。本発明のスクリーニング系は生理的リ
ガンドおよび目的のＧＰＣＲが本来細胞内で相互作用す
るＧαサブタイプを必要としないので、実質的にすべて
のオーファンＧＰＣＲのリガンド探索に適用することが
できる。ＧＰＣＲの由来も特に制限されず、任意の哺乳
動物、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、サル、ウマ、ヒツ
ジ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット等由来のＧＰＣＲを
分析対象とすることができる。
ＧＰＣＲとＧα16との融合蛋白質が包埋された脂質二重
層を含む膜系、(ii) 該ＧＰＣＲとＧαi2との融合蛋白
質が包埋された脂質二重層を含む膜系および(iii) 該Ｇ
ＰＣＲとＧαS2との融合蛋白質が包埋された脂質二重層
を含む膜系を構成要素として包含する。分析の対象とな
るＧＰＣＲは、いずれかのＧα蛋白質と相互作用して細
胞内情報伝達に関与する膜受容体であればいかなるもの
であってもよい。本発明のスクリーニング系は生理的リ
ガンドおよび目的のＧＰＣＲが本来細胞内で相互作用す
るＧαサブタイプを必要としないので、実質的にすべて
のオーファンＧＰＣＲのリガンド探索に適用することが
できる。ＧＰＣＲの由来も特に制限されず、任意の哺乳
動物、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、サル、ウマ、ヒツ
ジ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット等由来のＧＰＣＲを
分析対象とすることができる。
【００１５】Ｇα16、Ｇαi2およびＧαS2の由来も特に
制限はなく、各種哺乳動物、例えば、ヒト、ウシ、ブ
タ、サル、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラッ
ト等由来のものを使用することができるが、目的のＧＰ
ＣＲと同種由来のものがより好ましい。これらのＧα蛋
白質はそれぞれ、自身のＧＰＣＲとの結合に関与する領
域（以下、ＲＢ領域ともいう）と任意のＧα蛋白質のグ
アニンヌクレオチドとの結合に関与する領域（以下、Ｇ
Ｂ領域ともいう）とを少なくとも有することが必要であ
る。言い換えれば、これらの領域が保存されている限
り、これらのＧα蛋白質はその一部が変異するか、もし
くは人為的に改変されたものであってもよい。ＧαのＸ
線結晶構造解析の結果から、ＲＢ領域はＣ末端近傍にあ
り、一方、ＧＢ領域は、ｒａｓ蛋白質のヌクレオチド結
合部位と相同な領域（Ｎ末端側から、Ｐボックス、Ｇ’
ボックス、Ｇボックス、Ｇ”ボックスと呼ばれるアミノ
酸モチーフ、並びに高度にヘリックス化したドメイン内
のαＥヘリックスの先頭及びαＦヘリックスなど）であ
ることが明らかになっている。
制限はなく、各種哺乳動物、例えば、ヒト、ウシ、ブ
タ、サル、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラッ
ト等由来のものを使用することができるが、目的のＧＰ
ＣＲと同種由来のものがより好ましい。これらのＧα蛋
白質はそれぞれ、自身のＧＰＣＲとの結合に関与する領
域（以下、ＲＢ領域ともいう）と任意のＧα蛋白質のグ
アニンヌクレオチドとの結合に関与する領域（以下、Ｇ
Ｂ領域ともいう）とを少なくとも有することが必要であ
る。言い換えれば、これらの領域が保存されている限
り、これらのＧα蛋白質はその一部が変異するか、もし
くは人為的に改変されたものであってもよい。ＧαのＸ
線結晶構造解析の結果から、ＲＢ領域はＣ末端近傍にあ
り、一方、ＧＢ領域は、ｒａｓ蛋白質のヌクレオチド結
合部位と相同な領域（Ｎ末端側から、Ｐボックス、Ｇ’
ボックス、Ｇボックス、Ｇ”ボックスと呼ばれるアミノ
酸モチーフ、並びに高度にヘリックス化したドメイン内
のαＥヘリックスの先頭及びαＦヘリックスなど）であ
ることが明らかになっている。
【００１６】目的のＧＰＣＲと各Ｇα蛋白質との融合蛋
白質は、それぞれをコードするＤＮＡを取得した後、公
知の遺伝子工学的手法を適宜組み合わせることにより、
該融合蛋白質をコードするＤＮＡを構築し、これを適当
な発現ベクター中に組み込んで適当な宿主細胞に導入・
発現させることにより取得することができる。
白質は、それぞれをコードするＤＮＡを取得した後、公
知の遺伝子工学的手法を適宜組み合わせることにより、
該融合蛋白質をコードするＤＮＡを構築し、これを適当
な発現ベクター中に組み込んで適当な宿主細胞に導入・
発現させることにより取得することができる。
【００１７】目的のＧＰＣＲを取得する方法は特に制限
はないが、例えば、ゲノム解析の結果、７回膜貫通ドメ
インのコンセンサス配列をコードする推定のオーファン
ＧＰＣＲ遺伝子配列が見出された場合、該遺伝子配列を
基に適当なプライマーもしくはプローブを作製してＲＴ
−ＰＣＲやノーザンハイブリダイゼーション等により種
々の組織での該遺伝子の発現を調べ、該遺伝子を発現す
る組織由来のｃＤＮＡライブラリーからコロニーもしく
はプラークハイブリダイゼーション法、あるいはＰＣＲ
法により、該ＧＰＣＲをコードするｃＤＮＡを単離する
ことができる。
はないが、例えば、ゲノム解析の結果、７回膜貫通ドメ
インのコンセンサス配列をコードする推定のオーファン
ＧＰＣＲ遺伝子配列が見出された場合、該遺伝子配列を
基に適当なプライマーもしくはプローブを作製してＲＴ
−ＰＣＲやノーザンハイブリダイゼーション等により種
々の組織での該遺伝子の発現を調べ、該遺伝子を発現す
る組織由来のｃＤＮＡライブラリーからコロニーもしく
はプラークハイブリダイゼーション法、あるいはＰＣＲ
法により、該ＧＰＣＲをコードするｃＤＮＡを単離する
ことができる。
【００１８】Ｇα16、Ｇαi2およびＧαS2をコードする
ＤＮＡも、公知の遺伝子配列を基に、同様の方法により
それぞれクローニングすることができる。
ＤＮＡも、公知の遺伝子配列を基に、同様の方法により
それぞれクローニングすることができる。
【００１９】ＧＰＣＲをコードするＤＮＡとＧα蛋白質
をコードするＤＮＡから、両者の融合蛋白質をコードす
るＤＮＡを作製する手段としては、例えば、ＰＣＲ等を
用いてＧＰＣＲをコードするＤＮＡの終始コドンを除去
したものに、Ｇα蛋白質をコードするＤＮＡを読み枠が
合うように、ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションす
る等の方法が挙げられる。この際、ＧＰＣＲのＣ末端の
一部を欠失させたり、ＧＰＣＲとＧα蛋白質との間にHi
s-tag等のリンカー配列を挿入したりすることもでき
る。
をコードするＤＮＡから、両者の融合蛋白質をコードす
るＤＮＡを作製する手段としては、例えば、ＰＣＲ等を
用いてＧＰＣＲをコードするＤＮＡの終始コドンを除去
したものに、Ｇα蛋白質をコードするＤＮＡを読み枠が
合うように、ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションす
る等の方法が挙げられる。この際、ＧＰＣＲのＣ末端の
一部を欠失させたり、ＧＰＣＲとＧα蛋白質との間にHi
s-tag等のリンカー配列を挿入したりすることもでき
る。
【００２０】融合蛋白質をコードするＤＮＡは、宿主真
核生物由来細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロ
モーターに機能的に連結されていなければならない。使
用されるプロモーターは、真核生物由来細胞内で機能し
得るものであれば特に制限はないが、例えば、ＳＶ４０
由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、
ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、
アデノウイルス由来初期プロモーター、バキュロウイル
ス由来ポリヘドリンプロモーター等のウイルスプロモー
ター、並びにβ−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ
遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモー
ター等の真核生物由来細胞の構成蛋白質遺伝子のプロモ
ーターなどが挙げられる。使用される発現ベクターは、
上記プロモーターに加えて、その下流に転写終結シグナ
ル、すなわちターミネーター領域を含有することが好ま
しく、プロモーター領域とターミネーター領域の間にコ
ーディングＤＮＡを挿入し得るように、適当な制限酵素
認識部位、好ましくは該ベクターを１箇所のみで切断す
るユニークな制限酵素認識部位を有することが望まし
い。さらに、該発現ベクターは、選択マーカー遺伝子
（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハ
イグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤抵抗性遺
伝子、栄養要求性変異相補遺伝子等）をさらに含有して
いてもよい。
核生物由来細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロ
モーターに機能的に連結されていなければならない。使
用されるプロモーターは、真核生物由来細胞内で機能し
得るものであれば特に制限はないが、例えば、ＳＶ４０
由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、
ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、
アデノウイルス由来初期プロモーター、バキュロウイル
ス由来ポリヘドリンプロモーター等のウイルスプロモー
ター、並びにβ−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ
遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモー
ター等の真核生物由来細胞の構成蛋白質遺伝子のプロモ
ーターなどが挙げられる。使用される発現ベクターは、
上記プロモーターに加えて、その下流に転写終結シグナ
ル、すなわちターミネーター領域を含有することが好ま
しく、プロモーター領域とターミネーター領域の間にコ
ーディングＤＮＡを挿入し得るように、適当な制限酵素
認識部位、好ましくは該ベクターを１箇所のみで切断す
るユニークな制限酵素認識部位を有することが望まし
い。さらに、該発現ベクターは、選択マーカー遺伝子
（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハ
イグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤抵抗性遺
伝子、栄養要求性変異相補遺伝子等）をさらに含有して
いてもよい。
【００２１】本発明のスクリーニング系に使用されるベ
クターとしては、上記の融合蛋白質の発現に必要とされ
る機能を満たしたプラスミドベクターが挙げられる。ま
た、ヒト等の哺乳動物での使用に好適なレトロウイル
ス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウ
イルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリ
オウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス等
のウイルスベクターや、昆虫細胞での使用に好適なバキ
ュロウイルスベクター等も挙げられる。
クターとしては、上記の融合蛋白質の発現に必要とされ
る機能を満たしたプラスミドベクターが挙げられる。ま
た、ヒト等の哺乳動物での使用に好適なレトロウイル
ス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウ
イルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリ
オウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス等
のウイルスベクターや、昆虫細胞での使用に好適なバキ
ュロウイルスベクター等も挙げられる。
【００２２】宿主細胞は、ヒト、サル、マウス、ラッ
ト、ハムスター、昆虫等の真核生物由来細胞であれば特
に制限はない。具体的には、COP、L、C127、Sp2/0、NS-
1、NIH3T3、ST2等のマウス由来細胞、ラット由来細胞、
BHK、CHO等のハムスター由来細胞、COS1、COS3、COS7、
CV1、Vero等のサル由来細胞、およびHeLa、293等のヒト
由来細胞、Sf9、Sf21、High Five等の昆虫由来細胞など
が例示される。
ト、ハムスター、昆虫等の真核生物由来細胞であれば特
に制限はない。具体的には、COP、L、C127、Sp2/0、NS-
1、NIH3T3、ST2等のマウス由来細胞、ラット由来細胞、
BHK、CHO等のハムスター由来細胞、COS1、COS3、COS7、
CV1、Vero等のサル由来細胞、およびHeLa、293等のヒト
由来細胞、Sf9、Sf21、High Five等の昆虫由来細胞など
が例示される。
【００２３】宿主細胞への遺伝子導入は、真核生物由来
細胞の遺伝子導入に使用できる公知のいかなる方法を用
いて行ってもよく、例えば、リン酸カルシウム共沈殿
法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、マイク
ロインジェクション法等が挙げられる。
細胞の遺伝子導入に使用できる公知のいかなる方法を用
いて行ってもよく、例えば、リン酸カルシウム共沈殿
法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、マイク
ロインジェクション法等が挙げられる。
【００２４】遺伝子を導入された宿主細胞は、例えば、
約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ME
M）、ダルベッコ改変最少必須培地（DMEM）、Ham's F-1
2培地、RPMI1640培地、199培地、Grace's昆虫細胞培養
用培地等を用いて培養することができる。培地のｐＨは
約６〜約８であるのが好ましく、培養温度は、通常約２
７〜約４０℃である。
約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ME
M）、ダルベッコ改変最少必須培地（DMEM）、Ham's F-1
2培地、RPMI1640培地、199培地、Grace's昆虫細胞培養
用培地等を用いて培養することができる。培地のｐＨは
約６〜約８であるのが好ましく、培養温度は、通常約２
７〜約４０℃である。
【００２５】本発明の各融合蛋白質を保持する脂質二重
層の由来は、融合蛋白質を構成するＧＰＣＲが該膜上で
本来の立体構造をとることができる限り特に制限されな
いが、好ましくはヒト、ウシ、ブタ、サル、マウス、ラ
ット等の哺乳動物細胞や昆虫細胞等の真核生物由来細胞
の細胞膜を含有する画分、例えば、無傷細胞、細胞ホモ
ジネート、あるいは該ホモジネートから遠心分離等によ
り分画される細胞膜画分が挙げられる。したがって、上
記のようにして得られる、ＧＰＣＲとＧα蛋白質との融
合蛋白質をコードするＤＮＡを導入された真核生物由来
細胞は、使用するスクリーニング法に応じてそのまま無
傷細胞として使用してもよいし、あるいは適当な緩衝液
中で該細胞を破砕して得られる細胞ホモジネートや、該
ホモジネートを適当な条件で遠心分離するなどして（例
えば、約１，０００×ｇ程度で遠心して上清を回収した
後、約１００，０００×ｇ程度で遠心して沈渣を回収す
る）単離される膜画分の形態であってもよい。
層の由来は、融合蛋白質を構成するＧＰＣＲが該膜上で
本来の立体構造をとることができる限り特に制限されな
いが、好ましくはヒト、ウシ、ブタ、サル、マウス、ラ
ット等の哺乳動物細胞や昆虫細胞等の真核生物由来細胞
の細胞膜を含有する画分、例えば、無傷細胞、細胞ホモ
ジネート、あるいは該ホモジネートから遠心分離等によ
り分画される細胞膜画分が挙げられる。したがって、上
記のようにして得られる、ＧＰＣＲとＧα蛋白質との融
合蛋白質をコードするＤＮＡを導入された真核生物由来
細胞は、使用するスクリーニング法に応じてそのまま無
傷細胞として使用してもよいし、あるいは適当な緩衝液
中で該細胞を破砕して得られる細胞ホモジネートや、該
ホモジネートを適当な条件で遠心分離するなどして（例
えば、約１，０００×ｇ程度で遠心して上清を回収した
後、約１００，０００×ｇ程度で遠心して沈渣を回収す
る）単離される膜画分の形態であってもよい。
【００２６】あるいは、本発明の各融合蛋白質を保持す
る脂質二重層は、各種の脂質を適当な比率、好ましくは
真核生物由来細胞の細胞膜におけるそれに近い比率で混
合した溶液から常法により調製される人工脂質二重層で
あってもよい。この場合、精製した融合蛋白質を人工脂
質二重層の膜上に再構成させたものを、本発明のスクリ
ーニング系として使用することができる。各融合蛋白質
は、それをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを導入
された組換え細胞から、抗ＧＰＣＲ抗体や、His-tag、G
ST-tag等を用いたアフィニティークロマトグラフィー等
により精製することができる。
る脂質二重層は、各種の脂質を適当な比率、好ましくは
真核生物由来細胞の細胞膜におけるそれに近い比率で混
合した溶液から常法により調製される人工脂質二重層で
あってもよい。この場合、精製した融合蛋白質を人工脂
質二重層の膜上に再構成させたものを、本発明のスクリ
ーニング系として使用することができる。各融合蛋白質
は、それをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを導入
された組換え細胞から、抗ＧＰＣＲ抗体や、His-tag、G
ST-tag等を用いたアフィニティークロマトグラフィー等
により精製することができる。
【００２７】人工脂質二重層を構成する脂質としては、
ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン
（ＰＳ）、コレステロール（Ｃｈ）、ホスファチジルイ
ノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルエタノールアミン
（ＰＥ）等が挙げられ、これら１種または２種以上を適
当な比率で混合したものが好ましく使用される。
ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン
（ＰＳ）、コレステロール（Ｃｈ）、ホスファチジルイ
ノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルエタノールアミン
（ＰＥ）等が挙げられ、これら１種または２種以上を適
当な比率で混合したものが好ましく使用される。
【００２８】例えば、融合蛋白質を組み込んだ人工脂質
二重層（プロテオリポソーム）は、以下の方法により調
製することができる。即ち、まず、ＰＣ：ＰＩ：Ｃｈ＝
１２：１２：１の混合脂質クロロホルム溶液を適当量ガ
ラスチューブに分取し、窒素ガス蒸気でクロロホルムを
蒸発させて脂質をフィルム状に乾燥させた後、適当な緩
衝液を加えて懸濁、次いで超音波処理により均一に分散
させ、コール酸ナトリウム等の界面活性剤を含む緩衝液
をさらに加えて脂質を完全に懸濁する。ここに、精製し
た融合蛋白質を適量添加し、氷中で時々攪拌しながら２
０〜３０分間程度インキュベートした後、適当な緩衝液
に対して透析する。約１００，０００×ｇで３０〜６０
分間遠心して沈渣を回収することにより、所望のプロテ
オリポソームを得ることができる。
二重層（プロテオリポソーム）は、以下の方法により調
製することができる。即ち、まず、ＰＣ：ＰＩ：Ｃｈ＝
１２：１２：１の混合脂質クロロホルム溶液を適当量ガ
ラスチューブに分取し、窒素ガス蒸気でクロロホルムを
蒸発させて脂質をフィルム状に乾燥させた後、適当な緩
衝液を加えて懸濁、次いで超音波処理により均一に分散
させ、コール酸ナトリウム等の界面活性剤を含む緩衝液
をさらに加えて脂質を完全に懸濁する。ここに、精製し
た融合蛋白質を適量添加し、氷中で時々攪拌しながら２
０〜３０分間程度インキュベートした後、適当な緩衝液
に対して透析する。約１００，０００×ｇで３０〜６０
分間遠心して沈渣を回収することにより、所望のプロテ
オリポソームを得ることができる。
【００２９】しかしながら、本発明のより好ましい実施
態様においては、目的のＧＰＣＲとＧα16、Ｇαi2また
はＧαS2との融合蛋白質が包埋された脂質二重層を含む
膜系は、該融合蛋白質をコードするＤＮＡを含む発現ベ
クターでトランスフェクトされた宿主真核生物由来細
胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分で
ある。
態様においては、目的のＧＰＣＲとＧα16、Ｇαi2また
はＧαS2との融合蛋白質が包埋された脂質二重層を含む
膜系は、該融合蛋白質をコードするＤＮＡを含む発現ベ
クターでトランスフェクトされた宿主真核生物由来細
胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分で
ある。
【００３０】例えば、後述のＧＴＰγＳ結合アッセイや
エフェクター活性の直接測定により被験物質のリガンド
特性を評価する場合には、使用するスクリーニング系
は、好ましくは、上記のような組換え真核生物由来細胞
から調製される膜画分である。一方、細胞内ｃＡＭＰ量
（もしくはｃＡＭＰ応答性リポーターの発現量）や細胞
内Ｃａ2+量（もしくはＣａ2+応答性リポーターの発現
量）を測定することにより被験物質のリガンド特性を評
価する場合には、使用するスクリーニング系は無傷真核
生物由来細胞である。
エフェクター活性の直接測定により被験物質のリガンド
特性を評価する場合には、使用するスクリーニング系
は、好ましくは、上記のような組換え真核生物由来細胞
から調製される膜画分である。一方、細胞内ｃＡＭＰ量
（もしくはｃＡＭＰ応答性リポーターの発現量）や細胞
内Ｃａ2+量（もしくはＣａ2+応答性リポーターの発現
量）を測定することにより被験物質のリガンド特性を評
価する場合には、使用するスクリーニング系は無傷真核
生物由来細胞である。
【００３１】融合蛋白質を構成するＧＰＣＲとＧα蛋白
質が相互作用し得る場合、ＧＰＣＲの細胞内第３ループ
上のＧα活性化ドメインとＧα蛋白質のＲＢ領域とは、
ＧＰＣＲに対する生理的リガンドの非存在下に相互作用
して、Ｇα蛋白質におけるＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促
進し得る。すなわち、ＧＰＣＲは恒常的に活性化された
状態となる。一方、目的のＧＰＣＲと相互作用しないＧ
α蛋白質との融合蛋白質ではＧＰＣＲは活性化されず、
Ｇα−ＧＴＰレベルは増大しない。ここで、ＧＴＰの代
わりに、例えば、35Ｓ標識したＧＴＰγＳ等のＧα蛋白
質のＧＴＰａｓｅ活性によって加水分解を受けないＧＴ
Ｐアナログを系に添加しておけば、３種の融合蛋白質を
それぞれ含む膜系において、膜に結合した放射活性を測
定し、相互に比較することによって、ＧＰＣＲの活性化
の有無を評価することができ、ＧＰＣＲと相互作用し得
るＧα蛋白質を同定することができる。
質が相互作用し得る場合、ＧＰＣＲの細胞内第３ループ
上のＧα活性化ドメインとＧα蛋白質のＲＢ領域とは、
ＧＰＣＲに対する生理的リガンドの非存在下に相互作用
して、Ｇα蛋白質におけるＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促
進し得る。すなわち、ＧＰＣＲは恒常的に活性化された
状態となる。一方、目的のＧＰＣＲと相互作用しないＧ
α蛋白質との融合蛋白質ではＧＰＣＲは活性化されず、
Ｇα−ＧＴＰレベルは増大しない。ここで、ＧＴＰの代
わりに、例えば、35Ｓ標識したＧＴＰγＳ等のＧα蛋白
質のＧＴＰａｓｅ活性によって加水分解を受けないＧＴ
Ｐアナログを系に添加しておけば、３種の融合蛋白質を
それぞれ含む膜系において、膜に結合した放射活性を測
定し、相互に比較することによって、ＧＰＣＲの活性化
の有無を評価することができ、ＧＰＣＲと相互作用し得
るＧα蛋白質を同定することができる。
【００３２】いったんＧＰＣＲと相互作用し得るＧα蛋
白質が同定されれば、以後のスクリーニングは、当該Ｇ
α蛋白質との融合蛋白質を含む膜系のみを用いて行うこ
とができる。すなわち、上記の共役Ｇα蛋白質の同定に
用いたのと同様に、Ｇα蛋白質のＧＴＰａｓｅ活性によ
って加水分解を受けないＧＴＰアナログを系に添加し、
被験物質の存在下と非存在下での膜に結合した放射活性
を測定・比較することにより、Ｇα蛋白質におけるＧＤ
Ｐ・ＧＴＰ交換反応に及ぼす被験物質の効果を評価する
ことができ、ＧＰＣＲに対するリガンド活性を有する物
質をスクリーニングすることができる。被験物質の存在
下で放射活性が増加すれば、該被験物質はＧＰＣＲに対
するアゴニスト活性を有し、放射活性が減少すれば、該
被験物質はＧＰＣＲに対するインバースアゴニスト活性
を有する。上述したように、融合蛋白質によるＧＰＣＲ
の活性化は部分的であるので、ＧＰＣＲに対する生理的
リガンド又はアゴニストが結合すると、ＧＰＣＲの活性
型−不活性型の平衡状態はさらに活性状態側にシフト
し、Ｇα−ＧＴＰレベルはさらに増大するので、本スク
リーニング系はアゴニストのスクリーニングも可能であ
る。
白質が同定されれば、以後のスクリーニングは、当該Ｇ
α蛋白質との融合蛋白質を含む膜系のみを用いて行うこ
とができる。すなわち、上記の共役Ｇα蛋白質の同定に
用いたのと同様に、Ｇα蛋白質のＧＴＰａｓｅ活性によ
って加水分解を受けないＧＴＰアナログを系に添加し、
被験物質の存在下と非存在下での膜に結合した放射活性
を測定・比較することにより、Ｇα蛋白質におけるＧＤ
Ｐ・ＧＴＰ交換反応に及ぼす被験物質の効果を評価する
ことができ、ＧＰＣＲに対するリガンド活性を有する物
質をスクリーニングすることができる。被験物質の存在
下で放射活性が増加すれば、該被験物質はＧＰＣＲに対
するアゴニスト活性を有し、放射活性が減少すれば、該
被験物質はＧＰＣＲに対するインバースアゴニスト活性
を有する。上述したように、融合蛋白質によるＧＰＣＲ
の活性化は部分的であるので、ＧＰＣＲに対する生理的
リガンド又はアゴニストが結合すると、ＧＰＣＲの活性
型−不活性型の平衡状態はさらに活性状態側にシフト
し、Ｇα−ＧＴＰレベルはさらに増大するので、本スク
リーニング系はアゴニストのスクリーニングも可能であ
る。
【００３３】融合蛋白質におけるＧＰＣＲの活性化は、
Ｇα蛋白質のエフェクターへの作用を指標として評価す
ることもできる。この場合、本発明のスクリーニング系
は、各融合蛋白質に加えて、各Ｇα蛋白質が相互作用す
るエフェクターをさらに含む脂質二重層を包含する膜系
である必要がある。すなわち、Ｇα16との融合蛋白質を
含む膜系はフォスフォリパーゼβ（ＰＬＣβ）をさらに
含有し、Ｇαi2およびＧαS2との融合蛋白質を含む膜系
はアデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）をさらに含有する。こ
の場合、ＧＰＣＲの活性化の有無は、各Ｇα蛋白質につ
いて、ＧＰＣＲとＧα蛋白質とを別個に（即ち、融合蛋
白質としてではなく）含有する膜系を調製し、それぞれ
についてエフェクター活性を測定・比較することにより
評価することもできるが（即ち、目的のＧＰＣＲと相互
作用し得るＧα蛋白質との融合蛋白質を含む膜系では、
両者を非融合蛋白質として含む膜系よりもエフェクター
活性が有意に高く（Ｇαi2の場合は低い）、相互作用し
ないものでは両系間でエフェクター活性に有意差はな
い）、コントロール膜系を個々に調製する必要があるな
ど操作が煩雑なため、ＧＰＣＲと相互作用し得るＧα蛋
白質の同定には、上述のＧＴＰアナログを用いた結合ア
ッセイを使用することが好ましい。
Ｇα蛋白質のエフェクターへの作用を指標として評価す
ることもできる。この場合、本発明のスクリーニング系
は、各融合蛋白質に加えて、各Ｇα蛋白質が相互作用す
るエフェクターをさらに含む脂質二重層を包含する膜系
である必要がある。すなわち、Ｇα16との融合蛋白質を
含む膜系はフォスフォリパーゼβ（ＰＬＣβ）をさらに
含有し、Ｇαi2およびＧαS2との融合蛋白質を含む膜系
はアデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）をさらに含有する。こ
の場合、ＧＰＣＲの活性化の有無は、各Ｇα蛋白質につ
いて、ＧＰＣＲとＧα蛋白質とを別個に（即ち、融合蛋
白質としてではなく）含有する膜系を調製し、それぞれ
についてエフェクター活性を測定・比較することにより
評価することもできるが（即ち、目的のＧＰＣＲと相互
作用し得るＧα蛋白質との融合蛋白質を含む膜系では、
両者を非融合蛋白質として含む膜系よりもエフェクター
活性が有意に高く（Ｇαi2の場合は低い）、相互作用し
ないものでは両系間でエフェクター活性に有意差はな
い）、コントロール膜系を個々に調製する必要があるな
ど操作が煩雑なため、ＧＰＣＲと相互作用し得るＧα蛋
白質の同定には、上述のＧＴＰアナログを用いた結合ア
ッセイを使用することが好ましい。
【００３４】いったん目的のＧＰＣＲと相互作用し得る
Ｇα蛋白質が同定されれば、以後のスクリーニングは、
該Ｇα蛋白質との融合蛋白質を含む膜系のみを用いて、
該Ｇα蛋白質が相互作用し得るエフェクターの活性を、
被験物質の存在下および非存在下で、以下に詳述するよ
うにして直接的もしくは間接的に測定し、比較すること
により行うことができる。
Ｇα蛋白質が同定されれば、以後のスクリーニングは、
該Ｇα蛋白質との融合蛋白質を含む膜系のみを用いて、
該Ｇα蛋白質が相互作用し得るエフェクターの活性を、
被験物質の存在下および非存在下で、以下に詳述するよ
うにして直接的もしくは間接的に測定し、比較すること
により行うことができる。
【００３５】共役Ｇα蛋白質がＧα16である場合には、
目的のＧＰＣＲとＧα16との融合蛋白質およびＰＬＣβ
を含有する膜系におけるＰＬＣβ活性を、被験物質の存
在下および非存在下で測定・比較する。ＰＬＣβ活性
は、例えば、3Ｈ標識したホスファチジルイノシトール
−４，５−二リン酸をＰＬＣβ含有膜画分に添加し、生
成するイノシトールリン酸量を、公知の手法を用いて測
定することにより、評価することができる。
目的のＧＰＣＲとＧα16との融合蛋白質およびＰＬＣβ
を含有する膜系におけるＰＬＣβ活性を、被験物質の存
在下および非存在下で測定・比較する。ＰＬＣβ活性
は、例えば、3Ｈ標識したホスファチジルイノシトール
−４，５−二リン酸をＰＬＣβ含有膜画分に添加し、生
成するイノシトールリン酸量を、公知の手法を用いて測
定することにより、評価することができる。
【００３６】膜系として無傷真核生物由来細胞を用いる
場合は、ＰＬＣβ活性は、細胞に［ 3Ｈ］イノシトール
を添加し、生成した［3Ｈ］イノシトールリン酸の放射
活性を測定したり、細胞内のＣａ2+量を測定することに
よっても評価することができる。細胞内Ｃａ2+量は、被
験物質の存在下および非存在下で細胞を適当な時間イン
キュベートした後、蛍光プローブ（fura-2、indo-1、fl
uo-3、Calcium-Green I等）を用いて分光学的に測定す
るか、カルシウム感受性発光蛋白質であるエクオリン等
を用いて測定することができるが、公知の他のいかなる
方法を使用してもよい。蛍光プローブを用いた分光学的
測定に適した装置として、FLIPR（Molecular Devices
社）システムが挙げられる。
場合は、ＰＬＣβ活性は、細胞に［ 3Ｈ］イノシトール
を添加し、生成した［3Ｈ］イノシトールリン酸の放射
活性を測定したり、細胞内のＣａ2+量を測定することに
よっても評価することができる。細胞内Ｃａ2+量は、被
験物質の存在下および非存在下で細胞を適当な時間イン
キュベートした後、蛍光プローブ（fura-2、indo-1、fl
uo-3、Calcium-Green I等）を用いて分光学的に測定す
るか、カルシウム感受性発光蛋白質であるエクオリン等
を用いて測定することができるが、公知の他のいかなる
方法を使用してもよい。蛍光プローブを用いた分光学的
測定に適した装置として、FLIPR（Molecular Devices
社）システムが挙げられる。
【００３７】被験物質の存在下にＰＬＣβ活性が増加す
れば、該被験物質はＧＰＣＲに対するアゴニスト活性を
有し、ＰＬＣβ活性が減少すれば、該被験物質はＧＰＣ
Ｒに対するインバースアゴニスト活性を有する。
れば、該被験物質はＧＰＣＲに対するアゴニスト活性を
有し、ＰＬＣβ活性が減少すれば、該被験物質はＧＰＣ
Ｒに対するインバースアゴニスト活性を有する。
【００３８】別の態様として、ＴＰＡ（12−Ｏ−テトラ
デカノイルホルボール−13−アセテート）応答エレメン
ト（ＴＲＥ）の制御下にあるリポーター遺伝子の発現量
を測定することにより、Ｃａ2+量を評価する方法もあ
る。ＴＲＥはＣａ2+の存在下に遺伝子の転写を活性化す
るシスエレメントであり、コンセンサス配列としてTGAC
TCAを含む配列が挙げられるが、Ｃａ2+応答性を保持す
る限り当該配列の一部に欠失、置換、挿入または付加を
含む配列であってもよい。ＴＲＥを含むプロモーター配
列としては、上述したようなウイルスプロモーターや真
核生物由来細胞の構成蛋白質遺伝子プロモーターが同様
に使用可能であり、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用い
て、あるいはＰＣＲ等を利用して、該プロモーター配列
の下流にＴＲＥ配列を挿入することができる。ＴＲＥの
制御下におかれるリポーター遺伝子としては、迅速且つ
簡便に遺伝子発現を検出・定量できる公知のいかなる遺
伝子を使用してもよく、例えば、ルシフェラーゼ、β−
ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、アルカリホ
スファターゼ、ペルオキシダーゼ等のリポーター蛋白質
をコードするＤＮＡが挙げられるが、これらに限定され
ない。リポーター遺伝子の下流にはターミネーター配列
が配置されることがより好ましい。このようなＴＲＥ−
リポーター発現カセットを担持するベクターとしては、
公知のプラスミドベクター又はウイルスベクターを使用
することができる。
デカノイルホルボール−13−アセテート）応答エレメン
ト（ＴＲＥ）の制御下にあるリポーター遺伝子の発現量
を測定することにより、Ｃａ2+量を評価する方法もあ
る。ＴＲＥはＣａ2+の存在下に遺伝子の転写を活性化す
るシスエレメントであり、コンセンサス配列としてTGAC
TCAを含む配列が挙げられるが、Ｃａ2+応答性を保持す
る限り当該配列の一部に欠失、置換、挿入または付加を
含む配列であってもよい。ＴＲＥを含むプロモーター配
列としては、上述したようなウイルスプロモーターや真
核生物由来細胞の構成蛋白質遺伝子プロモーターが同様
に使用可能であり、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用い
て、あるいはＰＣＲ等を利用して、該プロモーター配列
の下流にＴＲＥ配列を挿入することができる。ＴＲＥの
制御下におかれるリポーター遺伝子としては、迅速且つ
簡便に遺伝子発現を検出・定量できる公知のいかなる遺
伝子を使用してもよく、例えば、ルシフェラーゼ、β−
ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、アルカリホ
スファターゼ、ペルオキシダーゼ等のリポーター蛋白質
をコードするＤＮＡが挙げられるが、これらに限定され
ない。リポーター遺伝子の下流にはターミネーター配列
が配置されることがより好ましい。このようなＴＲＥ−
リポーター発現カセットを担持するベクターとしては、
公知のプラスミドベクター又はウイルスベクターを使用
することができる。
【００３９】ＴＲＥ−リポーター発現カセットを担持す
るベクターを導入された真核生物由来細胞を、被験物質
の存在下および非存在下で適当な時間培養した後、細胞
を破砕して得られた抽出液におけるリポーター遺伝子の
発現を公知の手法を用いて測定することにより、細胞内
Ｃａ2+量を評価することができる。被験物質の存在下に
リポーター遺伝子の発現量が増加すれば、該被験物質は
ＧＰＣＲに対するアゴニスト活性を有し、発現量が減少
すれば、該被験物質はＧＰＣＲに対するインバースアゴ
ニスト活性を有する。
るベクターを導入された真核生物由来細胞を、被験物質
の存在下および非存在下で適当な時間培養した後、細胞
を破砕して得られた抽出液におけるリポーター遺伝子の
発現を公知の手法を用いて測定することにより、細胞内
Ｃａ2+量を評価することができる。被験物質の存在下に
リポーター遺伝子の発現量が増加すれば、該被験物質は
ＧＰＣＲに対するアゴニスト活性を有し、発現量が減少
すれば、該被験物質はＧＰＣＲに対するインバースアゴ
ニスト活性を有する。
【００４０】一方、共役Ｇα蛋白質がＧαi2もしくはＧ
αS2である場合には、目的のＧＰＣＲとＧαi2もしくは
ＧαS2との融合蛋白質およびＡＣを含有する膜系におけ
るＡＣ活性を、被験物質の存在下および非存在下で測定
・比較する。ＡＣ活性は、例えば、ＡＣを含む膜画分に
ＡＴＰを添加し、生成するｃＡＭＰ量を、抗ｃＡＭＰ抗
体を用いてＲＩ（例えば、125Ｉ）、酵素（例えば、ア
ルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ等）、蛍光物
質（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン等）等で標識したｃ
ＡＭＰとの競合イムノアッセイにより測定する方法や、
ＡＣを含む膜画分に［α-32Ｐ］ＡＴＰを添加し、生成
する［32Ｐ］ｃＡＭＰをアルミナカラム等で分離後、そ
の放射活性を測定する方法等により測定することができ
るが、これらに限定されない。
αS2である場合には、目的のＧＰＣＲとＧαi2もしくは
ＧαS2との融合蛋白質およびＡＣを含有する膜系におけ
るＡＣ活性を、被験物質の存在下および非存在下で測定
・比較する。ＡＣ活性は、例えば、ＡＣを含む膜画分に
ＡＴＰを添加し、生成するｃＡＭＰ量を、抗ｃＡＭＰ抗
体を用いてＲＩ（例えば、125Ｉ）、酵素（例えば、ア
ルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ等）、蛍光物
質（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン等）等で標識したｃ
ＡＭＰとの競合イムノアッセイにより測定する方法や、
ＡＣを含む膜画分に［α-32Ｐ］ＡＴＰを添加し、生成
する［32Ｐ］ｃＡＭＰをアルミナカラム等で分離後、そ
の放射活性を測定する方法等により測定することができ
るが、これらに限定されない。
【００４１】膜系として無傷真核生物由来細胞を用いる
場合は、ＡＣ活性は、細胞内のｃＡＭＰ量を測定する
か、あるいは細胞を［3Ｈ］アデニンで標識し、生成し
た［3Ｈ］ｃＡＭＰの放射活性を測定することによって
も評価することができる。細胞内ｃＡＭＰ量は、被験物
質の存在下および非存在下で細胞を適当な時間インキュ
ベートした後、細胞を破砕して得られる抽出液につい
て、上記の競合イムノアッセイを実施することにより測
定することができるが、公知の他のいかなる方法も使用
することができる。
場合は、ＡＣ活性は、細胞内のｃＡＭＰ量を測定する
か、あるいは細胞を［3Ｈ］アデニンで標識し、生成し
た［3Ｈ］ｃＡＭＰの放射活性を測定することによって
も評価することができる。細胞内ｃＡＭＰ量は、被験物
質の存在下および非存在下で細胞を適当な時間インキュ
ベートした後、細胞を破砕して得られる抽出液につい
て、上記の競合イムノアッセイを実施することにより測
定することができるが、公知の他のいかなる方法も使用
することができる。
【００４２】共役Ｇα蛋白質がＧαi2の場合、被験物質
の存在下にＡＣ活性が増加すれば、該被験物質はＧＰＣ
Ｒに対するインバースアゴニスト活性を有し、ＡＣ活性
が減少すれば、該被験物質はＧＰＣＲに対するアゴニス
ト活性を有する。一方、共役Ｇα蛋白質がＧαS2の場
合、被験物質の存在下にＡＣ活性が増加すれば、該被験
物質はＧＰＣＲに対するアゴニスト活性を有し、ＡＣ活
性が減少すれば、該被験物質はＧＰＣＲに対するインバ
ースアゴニスト活性を有する。
の存在下にＡＣ活性が増加すれば、該被験物質はＧＰＣ
Ｒに対するインバースアゴニスト活性を有し、ＡＣ活性
が減少すれば、該被験物質はＧＰＣＲに対するアゴニス
ト活性を有する。一方、共役Ｇα蛋白質がＧαS2の場
合、被験物質の存在下にＡＣ活性が増加すれば、該被験
物質はＧＰＣＲに対するアゴニスト活性を有し、ＡＣ活
性が減少すれば、該被験物質はＧＰＣＲに対するインバ
ースアゴニスト活性を有する。
【００４３】別の態様として、ｃＡＭＰ量をｃＡＭＰ応
答エレメント（ＣＲＥ）の制御下にあるリポーター遺伝
子の発現量を測定することにより評価する方法もある。
ＣＲＥはｃＡＭＰの存在下に遺伝子の転写を活性化する
シスエレメントであり、コンセンサス配列としてTGACGT
CAを含む配列が挙げられるが、ｃＡＭＰ応答性を保持す
る限り当該配列の一部に欠失、置換、挿入または付加を
含む配列であってもよい。ＣＲＥを含むプロモーター配
列としては、上述したようなウイルスプロモーターや真
核生物由来細胞の構成蛋白質遺伝子プロモーターが同様
に使用可能であり、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用い
て、あるいはＰＣＲ等を利用して、該プロモーター配列
の下流にＣＲＥ配列を挿入することができる。ＣＲＥの
制御下におかれるリポーター遺伝子としては、迅速且つ
簡便に遺伝子発現を検出・定量できる公知のいかなる遺
伝子を使用してもよく、例えば、ルシフェラーゼ、β−
ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、アルカリホ
スファターゼ、ペルオキシダーゼ等のリポーター蛋白質
をコードするＤＮＡが挙げられるが、これらに限定され
ない。リポーター遺伝子の下流にはターミネーター配列
が配置されることがより好ましい。このようなＣＲＥ−
リポーター発現カセットを担持するベクターとしては、
公知のプラスミドベクター又はウイルスベクターを使用
することができる。
答エレメント（ＣＲＥ）の制御下にあるリポーター遺伝
子の発現量を測定することにより評価する方法もある。
ＣＲＥはｃＡＭＰの存在下に遺伝子の転写を活性化する
シスエレメントであり、コンセンサス配列としてTGACGT
CAを含む配列が挙げられるが、ｃＡＭＰ応答性を保持す
る限り当該配列の一部に欠失、置換、挿入または付加を
含む配列であってもよい。ＣＲＥを含むプロモーター配
列としては、上述したようなウイルスプロモーターや真
核生物由来細胞の構成蛋白質遺伝子プロモーターが同様
に使用可能であり、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用い
て、あるいはＰＣＲ等を利用して、該プロモーター配列
の下流にＣＲＥ配列を挿入することができる。ＣＲＥの
制御下におかれるリポーター遺伝子としては、迅速且つ
簡便に遺伝子発現を検出・定量できる公知のいかなる遺
伝子を使用してもよく、例えば、ルシフェラーゼ、β−
ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、アルカリホ
スファターゼ、ペルオキシダーゼ等のリポーター蛋白質
をコードするＤＮＡが挙げられるが、これらに限定され
ない。リポーター遺伝子の下流にはターミネーター配列
が配置されることがより好ましい。このようなＣＲＥ−
リポーター発現カセットを担持するベクターとしては、
公知のプラスミドベクター又はウイルスベクターを使用
することができる。
【００４４】ＣＲＥ−リポーター発現カセットを担持す
るベクターを導入された真核生物由来細胞を、被験物質
の存在下および非存在下で適当な時間培養した後、細胞
を破砕して得られた抽出液におけるリポーター遺伝子の
発現を公知の手法を用いて測定・比較することにより、
細胞内ｃＡＭＰ量を評価することができる。共役Ｇα蛋
白質がＧαi2の場合、被験物質の存在下にリポーター遺
伝子の発現量が増加すれば、該被験物質はＧＰＣＲに対
するインバースアゴニスト活性を有し、発現量が減少す
れば、該被験物質はＧＰＣＲに対するアゴニスト活性を
有する。一方、共役Ｇα蛋白質がＧαS2の場合、被験物
質の存在下にリポーター遺伝子の発現量が増加すれば、
該被験物質はＧＰＣＲに対するアゴニスト活性を有し、
発現量が減少すれば、該被験物質はＧＰＣＲに対するイ
ンバースアゴニスト活性を有する。
るベクターを導入された真核生物由来細胞を、被験物質
の存在下および非存在下で適当な時間培養した後、細胞
を破砕して得られた抽出液におけるリポーター遺伝子の
発現を公知の手法を用いて測定・比較することにより、
細胞内ｃＡＭＰ量を評価することができる。共役Ｇα蛋
白質がＧαi2の場合、被験物質の存在下にリポーター遺
伝子の発現量が増加すれば、該被験物質はＧＰＣＲに対
するインバースアゴニスト活性を有し、発現量が減少す
れば、該被験物質はＧＰＣＲに対するアゴニスト活性を
有する。一方、共役Ｇα蛋白質がＧαS2の場合、被験物
質の存在下にリポーター遺伝子の発現量が増加すれば、
該被験物質はＧＰＣＲに対するアゴニスト活性を有し、
発現量が減少すれば、該被験物質はＧＰＣＲに対するイ
ンバースアゴニスト活性を有する。
【００４５】Ｇαi2およびＧαS2のエフェクターと相互
作用するための領域を、Ｇα16由来のＰＬＣβと相互作
用し得る配列に置換することにより、すべての融合蛋白
質のエフェクターをＰＬＣβに収斂させることができ
る。したがって、このような系においては、全ての膜系
がエフェクターとしてＰＬＣβをさらに含有する。同様
に、Ｇα16およびＧαS2のエフェクターと相互作用する
ための領域を、Ｇαi2由来のＡＣと相互作用し得る配列
に置換するか、あるいはＧα16およびＧαi2のエフェク
ターと相互作用するための領域を、ＧαS2由来のＡＣと
相互作用し得る配列に置換することにより、すべての融
合蛋白質のエフェクターをＡＣに収斂させることができ
る。したがって、このような系においては、全ての膜系
がエフェクターとしてＡＣをさらに含有する。このよう
に、全ての融合蛋白質が相互作用し得るエフェクターを
同一にすることにより、当該エフェクター活性を各膜系
間で相互に比較することによる目的のＧＰＣＲと相互作
用し得るＧα蛋白質の同定が可能となる。Ｇα蛋白質の
ＲＢ領域はＣ末端の約５アミノ酸程度であることが知ら
れているので、例えば、Ｇα16、Ｇαi2およびＧαS2の
うちのいずれかのＣ末端アミノ酸配列コード領域を、他
の２つのＣ末端アミノ酸配列をコードするヌクレオチド
配列でそれぞれ置換したキメラＤＮＡを、ＰＣＲ等を用
いて作製することにより、ＧＰＣＲと各Ｇα蛋白質との
相互作用性を保持したまま、エフェクターの種類および
作用の方向性（アップレギュレーションまたはダウンレ
ギュレーション）を一致させることができる。
作用するための領域を、Ｇα16由来のＰＬＣβと相互作
用し得る配列に置換することにより、すべての融合蛋白
質のエフェクターをＰＬＣβに収斂させることができ
る。したがって、このような系においては、全ての膜系
がエフェクターとしてＰＬＣβをさらに含有する。同様
に、Ｇα16およびＧαS2のエフェクターと相互作用する
ための領域を、Ｇαi2由来のＡＣと相互作用し得る配列
に置換するか、あるいはＧα16およびＧαi2のエフェク
ターと相互作用するための領域を、ＧαS2由来のＡＣと
相互作用し得る配列に置換することにより、すべての融
合蛋白質のエフェクターをＡＣに収斂させることができ
る。したがって、このような系においては、全ての膜系
がエフェクターとしてＡＣをさらに含有する。このよう
に、全ての融合蛋白質が相互作用し得るエフェクターを
同一にすることにより、当該エフェクター活性を各膜系
間で相互に比較することによる目的のＧＰＣＲと相互作
用し得るＧα蛋白質の同定が可能となる。Ｇα蛋白質の
ＲＢ領域はＣ末端の約５アミノ酸程度であることが知ら
れているので、例えば、Ｇα16、Ｇαi2およびＧαS2の
うちのいずれかのＣ末端アミノ酸配列コード領域を、他
の２つのＣ末端アミノ酸配列をコードするヌクレオチド
配列でそれぞれ置換したキメラＤＮＡを、ＰＣＲ等を用
いて作製することにより、ＧＰＣＲと各Ｇα蛋白質との
相互作用性を保持したまま、エフェクターの種類および
作用の方向性（アップレギュレーションまたはダウンレ
ギュレーション）を一致させることができる。
【００４６】この場合も、いったん目的のＧＰＣＲと相
互作用し得るＧα蛋白質が同定されれば、該Ｇα蛋白質
との融合蛋白質を含む膜系のみを用いて、被験物質の存
在下および非存在下で、該（キメラ）Ｇα蛋白質が相互
作用し得るエフェクターの活性を測定・比較することに
より、ＧＰＣＲに対するリガンドのスクリーニングを行
うことができる。すなわち、Ｇαi2およびＧαS2のエフ
ェクターと相互作用するための領域を、Ｇα16由来のＰ
ＬＣβと相互作用し得る配列に置換した場合は、共役Ｇ
α蛋白質との融合蛋白質を含む膜系におけるＰＬＣβ活
性もしくはＴＲＥの制御下にあるリポーター遺伝子の発
現を、被験物質の存在下および非存在下で比較する。被
験物質の存在下にＰＬＣβ活性もしくはリポーター遺伝
子の発現量が増加すれば、該被験物質はＧＰＣＲに対す
るアゴニスト活性を有し、ＰＬＣβ活性もしくは発現量
が減少すれば、該被験物質はＧＰＣＲに対するインバー
スアゴニスト活性を有する。
互作用し得るＧα蛋白質が同定されれば、該Ｇα蛋白質
との融合蛋白質を含む膜系のみを用いて、被験物質の存
在下および非存在下で、該（キメラ）Ｇα蛋白質が相互
作用し得るエフェクターの活性を測定・比較することに
より、ＧＰＣＲに対するリガンドのスクリーニングを行
うことができる。すなわち、Ｇαi2およびＧαS2のエフ
ェクターと相互作用するための領域を、Ｇα16由来のＰ
ＬＣβと相互作用し得る配列に置換した場合は、共役Ｇ
α蛋白質との融合蛋白質を含む膜系におけるＰＬＣβ活
性もしくはＴＲＥの制御下にあるリポーター遺伝子の発
現を、被験物質の存在下および非存在下で比較する。被
験物質の存在下にＰＬＣβ活性もしくはリポーター遺伝
子の発現量が増加すれば、該被験物質はＧＰＣＲに対す
るアゴニスト活性を有し、ＰＬＣβ活性もしくは発現量
が減少すれば、該被験物質はＧＰＣＲに対するインバー
スアゴニスト活性を有する。
【００４７】Ｇα16およびＧαS2のエフェクターと相互
作用するための領域を、Ｇαi2由来のＡＣと相互作用し
得る配列に置換した場合は、共役Ｇα蛋白質との融合蛋
白質を含む膜系におけるＡＣ活性もしくはＣＲＥの制御
下にあるリポーター遺伝子の発現を、被験物質の存在下
および非存在下で比較する。被験物質の存在下にＡＣ活
性もしくはリポーター遺伝子の発現量が増加すれば、該
被験物質はＧＰＣＲに対するインバースアゴニスト活性
を有し、ＰＬＣβ活性もしくは発現量が減少すれば、該
被験物質はＧＰＣＲに対するアゴニスト活性を有する。
一方、Ｇα16およびＧαi2のエフェクターと相互作用す
るための領域を、ＧαS2由来のＡＣと相互作用し得る配
列に置換した場合も、同様に共役Ｇα蛋白質との融合蛋
白質を含む膜系におけるＡＣ活性もしくはＣＲＥの制御
下にあるリポーター遺伝子の発現を、被験物質の存在下
および非存在下で比較すればよいが、この場合、被験物
質の存在下にＡＣ活性もしくはリポーター遺伝子の発現
量が増加すれば、該被験物質はＧＰＣＲに対するアゴニ
スト活性を有し、ＰＬＣβ活性もしくは発現量が減少す
れば、該被験物質はＧＰＣＲに対するインバースアゴニ
スト活性を有する。
作用するための領域を、Ｇαi2由来のＡＣと相互作用し
得る配列に置換した場合は、共役Ｇα蛋白質との融合蛋
白質を含む膜系におけるＡＣ活性もしくはＣＲＥの制御
下にあるリポーター遺伝子の発現を、被験物質の存在下
および非存在下で比較する。被験物質の存在下にＡＣ活
性もしくはリポーター遺伝子の発現量が増加すれば、該
被験物質はＧＰＣＲに対するインバースアゴニスト活性
を有し、ＰＬＣβ活性もしくは発現量が減少すれば、該
被験物質はＧＰＣＲに対するアゴニスト活性を有する。
一方、Ｇα16およびＧαi2のエフェクターと相互作用す
るための領域を、ＧαS2由来のＡＣと相互作用し得る配
列に置換した場合も、同様に共役Ｇα蛋白質との融合蛋
白質を含む膜系におけるＡＣ活性もしくはＣＲＥの制御
下にあるリポーター遺伝子の発現を、被験物質の存在下
および非存在下で比較すればよいが、この場合、被験物
質の存在下にＡＣ活性もしくはリポーター遺伝子の発現
量が増加すれば、該被験物質はＧＰＣＲに対するアゴニ
スト活性を有し、ＰＬＣβ活性もしくは発現量が減少す
れば、該被験物質はＧＰＣＲに対するインバースアゴニ
スト活性を有する。
【００４８】本発明のスクリーニング法に供される被験
物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であっても
よく、例えば、コンビナトリアルケミストリー技術を用
いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファー
ジディスプレイ法により作製されたランダムペプチドラ
イブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来
の天然成分等が挙げられる。本発明のスクリーニング法
は、two-hybrid法のような蛋白質−蛋白質相互作用解析
系を利用しないので、非ペプチド性の低分子リガンドの
スクリーニングにおいて特に有用性を発揮する。
物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であっても
よく、例えば、コンビナトリアルケミストリー技術を用
いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファー
ジディスプレイ法により作製されたランダムペプチドラ
イブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来
の天然成分等が挙げられる。本発明のスクリーニング法
は、two-hybrid法のような蛋白質−蛋白質相互作用解析
系を利用しないので、非ペプチド性の低分子リガンドの
スクリーニングにおいて特に有用性を発揮する。
【００４９】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、これらは単なる例示であって、本発明はこれ
らの実施例によりなんら限定されるものではない。な
お、特に明記しない限り、以下の実施例は、Sambrook,
J.ら著、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、 第
2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New Yor
k、 1989年発行、Current Protocols in Protein Scien
ce（ed. Coligan, J.E. et al.）、John Wiley and Son
s, Inc.等に記載の方法で行なった。
明するが、これらは単なる例示であって、本発明はこれ
らの実施例によりなんら限定されるものではない。な
お、特に明記しない限り、以下の実施例は、Sambrook,
J.ら著、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、 第
2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New Yor
k、 1989年発行、Current Protocols in Protein Scien
ce（ed. Coligan, J.E. et al.）、John Wiley and Son
s, Inc.等に記載の方法で行なった。
【００５０】実施例１ ＧＰＣＲ−Ｇα融合蛋白質発現
用プラスミドの構築 オーファンＧＰＣＲと各Ｇα蛋白質の融合蛋白質を発現
させるプラスミドは以下の方法で構築した。先ず、ヒト
Ｇα蛋白質（Ｇα16、Ｇαi2およびＧαS2）の全コーデ
ィング領域を、発現ベクターpcDNA3.1(+)にＰＣＲクロ
ーニングした。さらに、ＰＣＲ反応を利用し、各Ｇαコ
ーディング領域の直前に６×Hisタグを含む配列を付加
したpcHISGα16、pcHISGαi2およびpcHISGαi2を作製し
た。即ち、ヒト脾臓ｃＤＮＡ（Clonthech）を２０倍希
釈し、うち１μｌを増幅の鋳型とした。酵素は、KODplu
s（TOYOBO）を使用した。増幅反応は、２０μｌの反応
液でKODplusに添付の反応バッファーを使用した。ただ
し、Ｍｇ2+濃度は１ｍＭとした。Ｇα16 ｃＤＮＡを増
幅するためにはプライマーGNA15F1（配列番号１）とGNA
15R1（配列番号２）を、Ｇαi2 ｃＤＮＡを増幅するた
めにはプライマーGNAi2F1（配列番号３）とGNAi2R1（配
列番号４）を、またＧαS2 ｃＤＮＡを増幅するために
はプライマーGS2F1（配列番号５）とGS2R1（配列番号
６）をそれぞれ使用した。増幅は、GeneAmp PCR System
9600（Applied Biosystems）を用い、９４℃、２分→
（９４℃、１５秒→６８℃、１２０秒）×４０サイクル
の条件で実施し、目的の大きさのＰＣＲ産物を得た。各
ＰＣＲ産物の末端をリン酸化し、０．８％アガロースゲ
ル電気泳動により分離精製後、制限酵素EcoRVで切断し
ＣＩＡＰ処理したプラスミドpcDNA3.1(+)（Invitroge
n）とライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し
た。形質転換株からプラスミドを精製し、制限酵素消化
パターンおよび挿入塩基配列が目的のものであることを
確認し、得られた各Ｇ蛋白質発現プラスミドをそれぞ
れ、pcGα16 、pcGαi2およびpcGαS2と命名した。これ
ら、各Ｇ蛋白質発現プラスミドの構築の工程を図１に示
す。
用プラスミドの構築 オーファンＧＰＣＲと各Ｇα蛋白質の融合蛋白質を発現
させるプラスミドは以下の方法で構築した。先ず、ヒト
Ｇα蛋白質（Ｇα16、Ｇαi2およびＧαS2）の全コーデ
ィング領域を、発現ベクターpcDNA3.1(+)にＰＣＲクロ
ーニングした。さらに、ＰＣＲ反応を利用し、各Ｇαコ
ーディング領域の直前に６×Hisタグを含む配列を付加
したpcHISGα16、pcHISGαi2およびpcHISGαi2を作製し
た。即ち、ヒト脾臓ｃＤＮＡ（Clonthech）を２０倍希
釈し、うち１μｌを増幅の鋳型とした。酵素は、KODplu
s（TOYOBO）を使用した。増幅反応は、２０μｌの反応
液でKODplusに添付の反応バッファーを使用した。ただ
し、Ｍｇ2+濃度は１ｍＭとした。Ｇα16 ｃＤＮＡを増
幅するためにはプライマーGNA15F1（配列番号１）とGNA
15R1（配列番号２）を、Ｇαi2 ｃＤＮＡを増幅するた
めにはプライマーGNAi2F1（配列番号３）とGNAi2R1（配
列番号４）を、またＧαS2 ｃＤＮＡを増幅するために
はプライマーGS2F1（配列番号５）とGS2R1（配列番号
６）をそれぞれ使用した。増幅は、GeneAmp PCR System
9600（Applied Biosystems）を用い、９４℃、２分→
（９４℃、１５秒→６８℃、１２０秒）×４０サイクル
の条件で実施し、目的の大きさのＰＣＲ産物を得た。各
ＰＣＲ産物の末端をリン酸化し、０．８％アガロースゲ
ル電気泳動により分離精製後、制限酵素EcoRVで切断し
ＣＩＡＰ処理したプラスミドpcDNA3.1(+)（Invitroge
n）とライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し
た。形質転換株からプラスミドを精製し、制限酵素消化
パターンおよび挿入塩基配列が目的のものであることを
確認し、得られた各Ｇ蛋白質発現プラスミドをそれぞ
れ、pcGα16 、pcGαi2およびpcGαS2と命名した。これ
ら、各Ｇ蛋白質発現プラスミドの構築の工程を図１に示
す。
【００５１】次に、各Ｇ蛋白質のＮ末側にHISタグを介
してＧＰＣＲを融合することが出来るように、各Ｇ蛋白
質の開始コドンＡＴＧの直前にHISタグ配列を連結し、
さらに制限酵素EcoRVの認識部位を付加した。即ち、先
ず、pcGα16、pcGαi2およびpcGαS2それぞれ１０ｎｇ
を鋳型として、プライマー（GNA15ATG：配列番号７、GN
Ai2ATG：配列番号８またはGS2ATG：配列番号９）とベク
ター部分のプライマー(pcDNARV：配列番号１０)でＰＣ
Ｒを行った。増幅は、９４℃、２分→（９４℃、１５秒
→５８℃、３０秒→６８℃、６０秒）×２０サイクルの
条件で実施し、目的の大きさのＰＣＲ産物を得た。次
に、HIS2linker（配列番号１１）とHIS2linker(R)（配
列番号１２）をアニーリングし、末端をリン酸化後、各
ＰＣＲ産物とライゲーションした。これらを制限酵素Ec
oRV、XhoIで切断後、目的ＤＮＡ断片を０．８％アガロ
ースゲル電気泳動により分離、精製した。回収したＤＮ
Ａ断片を、EcoRVおよびXhoIで切断した発現プラスミドp
cDNA3.1(+)とライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質
転換した。形質転換株からプラスミドを精製し、制限酵
素消化パターンおよび挿入塩基配列が目的のものである
ことを確認し、得られたプラスミドをそれぞれpcHISGα
16、pcHISGαi2およびpcHISGαS2と命名した。pcHISGα
16、pcHISGαi2およびpcHISGαS2中に含まれる挿入ｃＤ
ＮＡ配列を配列番号１６、配列番号１７および配列番号
１８にそれぞれ示す。また、これらＧＰＣＲ−Ｇα融合
蛋白質発現用プラスミドの構築の工程を図２に示す。
してＧＰＣＲを融合することが出来るように、各Ｇ蛋白
質の開始コドンＡＴＧの直前にHISタグ配列を連結し、
さらに制限酵素EcoRVの認識部位を付加した。即ち、先
ず、pcGα16、pcGαi2およびpcGαS2それぞれ１０ｎｇ
を鋳型として、プライマー（GNA15ATG：配列番号７、GN
Ai2ATG：配列番号８またはGS2ATG：配列番号９）とベク
ター部分のプライマー(pcDNARV：配列番号１０)でＰＣ
Ｒを行った。増幅は、９４℃、２分→（９４℃、１５秒
→５８℃、３０秒→６８℃、６０秒）×２０サイクルの
条件で実施し、目的の大きさのＰＣＲ産物を得た。次
に、HIS2linker（配列番号１１）とHIS2linker(R)（配
列番号１２）をアニーリングし、末端をリン酸化後、各
ＰＣＲ産物とライゲーションした。これらを制限酵素Ec
oRV、XhoIで切断後、目的ＤＮＡ断片を０．８％アガロ
ースゲル電気泳動により分離、精製した。回収したＤＮ
Ａ断片を、EcoRVおよびXhoIで切断した発現プラスミドp
cDNA3.1(+)とライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質
転換した。形質転換株からプラスミドを精製し、制限酵
素消化パターンおよび挿入塩基配列が目的のものである
ことを確認し、得られたプラスミドをそれぞれpcHISGα
16、pcHISGαi2およびpcHISGαS2と命名した。pcHISGα
16、pcHISGαi2およびpcHISGαS2中に含まれる挿入ｃＤ
ＮＡ配列を配列番号１６、配列番号１７および配列番号
１８にそれぞれ示す。また、これらＧＰＣＲ−Ｇα融合
蛋白質発現用プラスミドの構築の工程を図２に示す。
【００５２】実施例２ ５−ＨＴ１ａレセプター−Ｇα
融合蛋白質発現プラスミドの構築 ヒト５−ＨＴ１ａレセプターと各Ｇα蛋白質の融合蛋白
質を発現させるプラスミドは以下の方法で構築した。先
ず、ヒト脾臓ｃＤＮＡ（Clonthech）を２０倍に希釈
し、うち１μｌを増幅の鋳型とした。酵素は、KODplus
を使用した。増幅反応は、２０μｌの反応液でKODplus
に添付の反応バッファーを使用した。ただし、Ｍｇ2+濃
度は１．２ｍＭとした。プライマーは5HT1AF1（配列番
号１３）と5HT1AR1（配列番号１４）を使用した。増幅
は、GeneAmp PCR System 9600を用い、９４℃、２分→
（９４℃、１５秒→６８℃、１２０秒）×４０サイクル
の条件で実施し、目的の大きさのＰＣＲ産物を得た。Ｐ
ＣＲ産物の末端をリン酸化し、０．８％アガロースゲル
電気泳動により分離精製後、制限酵素EcoRVで切断しＣ
ＩＡＰ処理したプラスミドpcDNA3.1(+)とライゲーショ
ンし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。形質転換株から
プラスミドを精製し、制限酵素消化パターンおよび挿入
塩基配列が目的のものであることを確認し、得られた５
−ＨＴ１ａ発現プラスミドをpc5HT1aと命名した。
融合蛋白質発現プラスミドの構築 ヒト５−ＨＴ１ａレセプターと各Ｇα蛋白質の融合蛋白
質を発現させるプラスミドは以下の方法で構築した。先
ず、ヒト脾臓ｃＤＮＡ（Clonthech）を２０倍に希釈
し、うち１μｌを増幅の鋳型とした。酵素は、KODplus
を使用した。増幅反応は、２０μｌの反応液でKODplus
に添付の反応バッファーを使用した。ただし、Ｍｇ2+濃
度は１．２ｍＭとした。プライマーは5HT1AF1（配列番
号１３）と5HT1AR1（配列番号１４）を使用した。増幅
は、GeneAmp PCR System 9600を用い、９４℃、２分→
（９４℃、１５秒→６８℃、１２０秒）×４０サイクル
の条件で実施し、目的の大きさのＰＣＲ産物を得た。Ｐ
ＣＲ産物の末端をリン酸化し、０．８％アガロースゲル
電気泳動により分離精製後、制限酵素EcoRVで切断しＣ
ＩＡＰ処理したプラスミドpcDNA3.1(+)とライゲーショ
ンし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。形質転換株から
プラスミドを精製し、制限酵素消化パターンおよび挿入
塩基配列が目的のものであることを確認し、得られた５
−ＨＴ１ａ発現プラスミドをpc5HT1aと命名した。
【００５３】次に、５−ＨＴ１ａをＧα16、Gαi2ある
いはGαS2との融合蛋白質として発現できるように、実
施例１で構築した各ＧＰＣＲ−Ｇα融合蛋白質発現用プ
ラスミドに５−ＨＴ１ａ遺伝子を挿入することとした。
まず、１０ｎｇのプラスミドpc5HT1aを鋳型として、５
−ＨＴ１ａ遺伝子の５’側のプライマー(5HT1AF1：配列
番号１３)と終始コドンの直前までを増幅するためのプ
ライマー（5HT1ART：配列番号１５）でＰＣＲを行っ
た。増幅は、KODplusを使用し、Ｍｇ2+濃度を１ｍＭと
し、９４℃、２分→（９４℃、１５秒→５８℃、３０秒
→６８℃、６０秒）×２０サイクルの条件で実施し、目
的の大きさのＰＣＲ産物を得た。各ＰＣＲ産物の末端を
リン酸化し、０．８％アガロースゲル電気泳動により分
離精製した。３種のＧＰＣＲ−Ｇα融合蛋白質発現用プ
ラスミドpcHISGα16、pcHISGαi2およびpcHISGαS2をそ
れぞれ制限酵素EcoRVで切断しＣＩＡＰ処理した。これ
らと５−ＨＴ１ａの終始コドン直前までをコードするよ
う増幅させたＰＣＲ産物をそれぞれライゲーションし、
大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。形質転換株からプラス
ミドを精製し、制限酵素消化パターンおよび挿入塩基配
列が目的のものであることを確認し、それぞれpc5HT1aH
ISGα16、pc5HT1aHISGαi2およびpc5HT1aHISGαS2と命
名した。pc5HT1aHISGα16、pc5HT1aHISGαi2およびpc5H
T1aHISGαS2中に含まれる５−ＨＴ１ａ−Ｇα融合蛋白
質コード配列を、配列番号１９、配列番号２０および配
列番号２１にそれぞれ示す。また、これら５−ＨＴ１ａ
−Ｇα融合蛋白質発現プラスミドの構築の工程を図３に
示す。
いはGαS2との融合蛋白質として発現できるように、実
施例１で構築した各ＧＰＣＲ−Ｇα融合蛋白質発現用プ
ラスミドに５−ＨＴ１ａ遺伝子を挿入することとした。
まず、１０ｎｇのプラスミドpc5HT1aを鋳型として、５
−ＨＴ１ａ遺伝子の５’側のプライマー(5HT1AF1：配列
番号１３)と終始コドンの直前までを増幅するためのプ
ライマー（5HT1ART：配列番号１５）でＰＣＲを行っ
た。増幅は、KODplusを使用し、Ｍｇ2+濃度を１ｍＭと
し、９４℃、２分→（９４℃、１５秒→５８℃、３０秒
→６８℃、６０秒）×２０サイクルの条件で実施し、目
的の大きさのＰＣＲ産物を得た。各ＰＣＲ産物の末端を
リン酸化し、０．８％アガロースゲル電気泳動により分
離精製した。３種のＧＰＣＲ−Ｇα融合蛋白質発現用プ
ラスミドpcHISGα16、pcHISGαi2およびpcHISGαS2をそ
れぞれ制限酵素EcoRVで切断しＣＩＡＰ処理した。これ
らと５−ＨＴ１ａの終始コドン直前までをコードするよ
う増幅させたＰＣＲ産物をそれぞれライゲーションし、
大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。形質転換株からプラス
ミドを精製し、制限酵素消化パターンおよび挿入塩基配
列が目的のものであることを確認し、それぞれpc5HT1aH
ISGα16、pc5HT1aHISGαi2およびpc5HT1aHISGαS2と命
名した。pc5HT1aHISGα16、pc5HT1aHISGαi2およびpc5H
T1aHISGαS2中に含まれる５−ＨＴ１ａ−Ｇα融合蛋白
質コード配列を、配列番号１９、配列番号２０および配
列番号２１にそれぞれ示す。また、これら５−ＨＴ１ａ
−Ｇα融合蛋白質発現プラスミドの構築の工程を図３に
示す。
【００５４】実施例３ ５−ＨＴ１ａレセプター−Ｇα
融合蛋白質発現による恒常的活性化の確認 先ず、ＣＨＯ−Ｋ１細胞株へ５−ＨＴ１ａレセプター−
Ｇα融合蛋白質発現プラスミドを一過的に遺伝子導入し
た。即ち、ＣＨＯ−Ｋ１細胞６ｘ１０6個をＴ２２５フ
ラスコにまき、F-12（GIBCO）、１０％ＦＢＳの培養液
により、ＣＯ2インキュベータで２４時間培養した。２
０μｇのプラスミドＤＮＡ（pc5HT1a、 pc5HT1aHISGα1
6およびpc5HT1aHISGαi2）を２ｍｌのOPTI-MEM（GIBC
O）に希釈、また１２０μｌのLipofectAmine（GIBCO）
を２ｍｌのOPTI-MEMに希釈した。両者を混合し室温で３
０分間静置後、１６ｍｌの血清無添加のF-12培地を加
え、血清無添加のF-12培地で１回洗浄した細胞にかけ
た。ＣＯ2インキュベータで４時間培養後、１０％ＦＢ
Ｓ添加F-12培地に置き換え、ＣＯ2インキュベータで２
４時間培養し、以下の膜画分の調製に使用した。
融合蛋白質発現による恒常的活性化の確認 先ず、ＣＨＯ−Ｋ１細胞株へ５−ＨＴ１ａレセプター−
Ｇα融合蛋白質発現プラスミドを一過的に遺伝子導入し
た。即ち、ＣＨＯ−Ｋ１細胞６ｘ１０6個をＴ２２５フ
ラスコにまき、F-12（GIBCO）、１０％ＦＢＳの培養液
により、ＣＯ2インキュベータで２４時間培養した。２
０μｇのプラスミドＤＮＡ（pc5HT1a、 pc5HT1aHISGα1
6およびpc5HT1aHISGαi2）を２ｍｌのOPTI-MEM（GIBC
O）に希釈、また１２０μｌのLipofectAmine（GIBCO）
を２ｍｌのOPTI-MEMに希釈した。両者を混合し室温で３
０分間静置後、１６ｍｌの血清無添加のF-12培地を加
え、血清無添加のF-12培地で１回洗浄した細胞にかけ
た。ＣＯ2インキュベータで４時間培養後、１０％ＦＢ
Ｓ添加F-12培地に置き換え、ＣＯ2インキュベータで２
４時間培養し、以下の膜画分の調製に使用した。
【００５５】次に、一過的に遺伝子導入を行った細胞か
ら膜画分を調製した。細胞を２４時間培養後、Ｔ２２５
フラスコをＰＢＳ（−）で１回洗浄し、１０ｍｌのＰＢ
Ｓ（−）を添加しセルスクレーパーで細胞を回収した。
細胞を１２００ｒｐｍ、３分間遠心し、上清を捨て、２
ｍｌのバッファーＡ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．
５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１μｇ／
ｍｌ ペプスタチンＡ、１μｇ／ｍｌ ロイペプチン、１
０μｇ／ｍｌ アプロチニン）に懸濁した。テフロン
（Ｒ）ホモジナイザーでホモジナイズ（４００ｒｐｍ、
２０回）し、核などの細胞内小器官を除くため、１２０
０ｒｐｍで５分間遠心し、その上清をBeckman L8遠心
機、type50.2Tiローターで２４０００ｒｐｍで３０分間
遠心し、膜などを沈殿させた。沈殿画分を１ｍｌのバッ
ファーＡに懸濁し、再度テフロン（Ｒ）ホモジナイザー
でホモジナイズ（４００ｒｐｍ、１０回）し、膜画分と
した。膜画分の蛋白濃度は、BioRadの蛋白定量キットで
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をスタンダードとして定
量することにより決定した。得られた膜画分を、以下の
［ 35Ｓ］ＧＴＰγＳ結合実験に用いた。
ら膜画分を調製した。細胞を２４時間培養後、Ｔ２２５
フラスコをＰＢＳ（−）で１回洗浄し、１０ｍｌのＰＢ
Ｓ（−）を添加しセルスクレーパーで細胞を回収した。
細胞を１２００ｒｐｍ、３分間遠心し、上清を捨て、２
ｍｌのバッファーＡ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．
５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１μｇ／
ｍｌ ペプスタチンＡ、１μｇ／ｍｌ ロイペプチン、１
０μｇ／ｍｌ アプロチニン）に懸濁した。テフロン
（Ｒ）ホモジナイザーでホモジナイズ（４００ｒｐｍ、
２０回）し、核などの細胞内小器官を除くため、１２０
０ｒｐｍで５分間遠心し、その上清をBeckman L8遠心
機、type50.2Tiローターで２４０００ｒｐｍで３０分間
遠心し、膜などを沈殿させた。沈殿画分を１ｍｌのバッ
ファーＡに懸濁し、再度テフロン（Ｒ）ホモジナイザー
でホモジナイズ（４００ｒｐｍ、１０回）し、膜画分と
した。膜画分の蛋白濃度は、BioRadの蛋白定量キットで
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をスタンダードとして定
量することにより決定した。得られた膜画分を、以下の
［ 35Ｓ］ＧＴＰγＳ結合実験に用いた。
【００５６】WGA-PVT SPAビーズ（Amersham）をＨ2Ｏに
懸濁（５００ｍｇビーズ／５．７ｍｌ Ｈ2Ｏ、９０ｍｇ
／ｍｌとなる）し、必要量（１．５ｍｇ／検体）を取出
し、２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てた。こ
のビーズを必要量（５μｇ／検体）の膜画分で懸濁し、
室温で２時間回転攪拌させ、ビーズに膜を結合させた。
２０００ｒｐｍで５分間遠心し、ビーズに吸着しなかっ
た上清を捨てた。ビーズをバッファーＳ（２０ｍＭ Ｈ
ＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０
ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５μＭ ＧＤＰ、１
ｍＭ ＤＴＴ）に８０μｌ／ウェルとなるよう懸濁し
た。あらかじめ、各種濃度（１０-4Ｍから１０-8Ｍ）の
１０μｌのリガンド溶液（８−ＯＨ ＤＰＡＴをアゴニ
スト、ｓｐｉｐｅｒｏｎｅをインバースアゴニストとし
て使用）と、１０μｌの４ｎＭ ［35Ｓ］−ＧＴＰγＳ
（１．６５ｋＢｑ／ウェル）を入れた底が透明な白い９
６穴プレート（Isoplate; Wallac）の各ウェルにビーズ
懸濁液を添加し、結合反応を開始した。室温で１時間反
応後、２０００ｒｐｍで５分間遠心し、ビーズをウェル
の底に張り付け、MicroBeta TRILUXプレートカウンター
システム（Wallac）でビーズに結合したＲＩ量をカウン
トした。ＧＴＰγＳ結合実験の結果を図４にまとめた。
懸濁（５００ｍｇビーズ／５．７ｍｌ Ｈ2Ｏ、９０ｍｇ
／ｍｌとなる）し、必要量（１．５ｍｇ／検体）を取出
し、２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てた。こ
のビーズを必要量（５μｇ／検体）の膜画分で懸濁し、
室温で２時間回転攪拌させ、ビーズに膜を結合させた。
２０００ｒｐｍで５分間遠心し、ビーズに吸着しなかっ
た上清を捨てた。ビーズをバッファーＳ（２０ｍＭ Ｈ
ＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０
ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５μＭ ＧＤＰ、１
ｍＭ ＤＴＴ）に８０μｌ／ウェルとなるよう懸濁し
た。あらかじめ、各種濃度（１０-4Ｍから１０-8Ｍ）の
１０μｌのリガンド溶液（８−ＯＨ ＤＰＡＴをアゴニ
スト、ｓｐｉｐｅｒｏｎｅをインバースアゴニストとし
て使用）と、１０μｌの４ｎＭ ［35Ｓ］−ＧＴＰγＳ
（１．６５ｋＢｑ／ウェル）を入れた底が透明な白い９
６穴プレート（Isoplate; Wallac）の各ウェルにビーズ
懸濁液を添加し、結合反応を開始した。室温で１時間反
応後、２０００ｒｐｍで５分間遠心し、ビーズをウェル
の底に張り付け、MicroBeta TRILUXプレートカウンター
システム（Wallac）でビーズに結合したＲＩ量をカウン
トした。ＧＴＰγＳ結合実験の結果を図４にまとめた。
【００５７】５−ＨＴ１ａレセプターは、Ｇ蛋白質のＧ
αi1と共役することが既知であり、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に
単独で発現させても内在性のＧ蛋白質によるＧＴＰ結合
活性の活性化は測定可能であることが知られている。図
４−Ａに、セロトニンレセプター単独発現プラスミドpc
5HT1aを一過的に導入したＣＨＯ−Ｋ１細胞から調製し
た膜画分を用いてＧＴＰ結合活性を測定した結果を示
す。アゴニストである８−ＯＨ ＤＰＡＴの濃度依存的
添加によりＧＴＰ結合活性が増加し、無刺激の状態で約
２８００ｃｐｍであったカウントが、８−ＯＨ ＤＰＡ
Ｔで刺激することにより最大約４０００ｃｐｍまで高ま
ることを観察し（Δ１２００ｃｐｍ）、実施例２におい
てクローニングした５−ＨＴ１ａが正常に機能しうるこ
とを検証した。インバースアゴニストであるｓｐｉｐｅ
ｒｏｎｅの添加では、ＧＴＰ結合活性は変動しなかっ
た。
αi1と共役することが既知であり、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に
単独で発現させても内在性のＧ蛋白質によるＧＴＰ結合
活性の活性化は測定可能であることが知られている。図
４−Ａに、セロトニンレセプター単独発現プラスミドpc
5HT1aを一過的に導入したＣＨＯ−Ｋ１細胞から調製し
た膜画分を用いてＧＴＰ結合活性を測定した結果を示
す。アゴニストである８−ＯＨ ＤＰＡＴの濃度依存的
添加によりＧＴＰ結合活性が増加し、無刺激の状態で約
２８００ｃｐｍであったカウントが、８−ＯＨ ＤＰＡ
Ｔで刺激することにより最大約４０００ｃｐｍまで高ま
ることを観察し（Δ１２００ｃｐｍ）、実施例２におい
てクローニングした５−ＨＴ１ａが正常に機能しうるこ
とを検証した。インバースアゴニストであるｓｐｉｐｅ
ｒｏｎｅの添加では、ＧＴＰ結合活性は変動しなかっ
た。
【００５８】次に、５−ＨＴ１ａレセプターに対する本
来の共役Ｇ蛋白質ではないが、同じＧiファミリーに属
するＧαi2との融合蛋白質として５−ＨＴ１ａレセプタ
ーを発現させるpc5HT1aHISGαi2を一過的に導入したＣ
ＨＯ−Ｋ１細胞から調製した膜画分を用いてＧＴＰ結合
活性を測定した結果を図４−Ｂに示す。この場合では、
無刺激の状態でのカウントが約３７００ｃｐｍと５−Ｈ
Ｔ１ａレセプター単独発現の場合（図４−Ａ）よりも約
９００ｃｐｍ高くなっていた。さらに、８−ＯＨ ＤＰ
ＡＴで刺激することにより最大約７３００ｃｐｍまで高
まった（Δ３６００ｃｐｍ）。５−ＨＴ１ａレセプター
単独発現の場合と比較して、アゴニスト８−ＯＨ ＤＰ
ＡＴに対する応答性は３倍向上した。一方、インバース
アゴニストｓｐｉｐｅｒｏｎｅによる刺激では結合する
ＧＴＰγＳ量が最大で約２９００ｃｐｍまで低下した
（Δ−８００ｃｐｍ）。この低下した結合レベルは、５
−ＨＴ１ａレセプター単独発現の無刺激状態とほぼ一致
していた。
来の共役Ｇ蛋白質ではないが、同じＧiファミリーに属
するＧαi2との融合蛋白質として５−ＨＴ１ａレセプタ
ーを発現させるpc5HT1aHISGαi2を一過的に導入したＣ
ＨＯ−Ｋ１細胞から調製した膜画分を用いてＧＴＰ結合
活性を測定した結果を図４−Ｂに示す。この場合では、
無刺激の状態でのカウントが約３７００ｃｐｍと５−Ｈ
Ｔ１ａレセプター単独発現の場合（図４−Ａ）よりも約
９００ｃｐｍ高くなっていた。さらに、８−ＯＨ ＤＰ
ＡＴで刺激することにより最大約７３００ｃｐｍまで高
まった（Δ３６００ｃｐｍ）。５−ＨＴ１ａレセプター
単独発現の場合と比較して、アゴニスト８−ＯＨ ＤＰ
ＡＴに対する応答性は３倍向上した。一方、インバース
アゴニストｓｐｉｐｅｒｏｎｅによる刺激では結合する
ＧＴＰγＳ量が最大で約２９００ｃｐｍまで低下した
（Δ−８００ｃｐｍ）。この低下した結合レベルは、５
−ＨＴ１ａレセプター単独発現の無刺激状態とほぼ一致
していた。
【００５９】更に、５−ＨＴ１ａ−Ｇα16融合蛋白質を
発現させるpc5HT1aHISGα16を一過的に導入したＣＨＯ
−Ｋ１細胞から調製した膜画分を用いてＧＴＰ結合活性
を測定した結果を図４−Ｃに示す。５−ＨＴ１ａレセプ
ターがＧα16と共役できないため、アゴニスト、インバ
ースアゴニストによる刺激に対して全く応答しないこと
が示された。また、無刺激でのカウントは約２７００ｃ
ｐｍとセロトニンレセプター単独発現の場合とほぼ一致
していた。
発現させるpc5HT1aHISGα16を一過的に導入したＣＨＯ
−Ｋ１細胞から調製した膜画分を用いてＧＴＰ結合活性
を測定した結果を図４−Ｃに示す。５−ＨＴ１ａレセプ
ターがＧα16と共役できないため、アゴニスト、インバ
ースアゴニストによる刺激に対して全く応答しないこと
が示された。また、無刺激でのカウントは約２７００ｃ
ｐｍとセロトニンレセプター単独発現の場合とほぼ一致
していた。
【００６０】図４に示した３種の膜画分の中で、５−Ｈ
Ｔ１ａ−Ｇαi2融合蛋白質発現膜画分だけが、リガンド
非添加状態でのカウントが高く、インバースアゴニスト
を作用させることにより他の２種と同じレベルまで低下
した。また、アゴニストによる活性化の程度が５−ＨＴ
１ａレセプター単独発現の場合の３倍であった。これら
の結果は、５−ＨＴ１ａレセプターが共役しうるＧα蛋
白質との融合蛋白質として発現させることにより、該レ
セプターが、リガンド非依存的に、部分的且つ恒常的に
活性化され、しかもアゴニストに対する感受性も単独で
発現させる場合よりも高まり、逆にインバースアゴニス
トの結合により部分的な恒常的活性化は打ち消されたこ
とを示す典型的な例であることを示している。
Ｔ１ａ−Ｇαi2融合蛋白質発現膜画分だけが、リガンド
非添加状態でのカウントが高く、インバースアゴニスト
を作用させることにより他の２種と同じレベルまで低下
した。また、アゴニストによる活性化の程度が５−ＨＴ
１ａレセプター単独発現の場合の３倍であった。これら
の結果は、５−ＨＴ１ａレセプターが共役しうるＧα蛋
白質との融合蛋白質として発現させることにより、該レ
セプターが、リガンド非依存的に、部分的且つ恒常的に
活性化され、しかもアゴニストに対する感受性も単独で
発現させる場合よりも高まり、逆にインバースアゴニス
トの結合により部分的な恒常的活性化は打ち消されたこ
とを示す典型的な例であることを示している。
【００６１】また、上記結果から、実施例２で構築した
Ｇαi2のＧＰＣＲとの融合蛋白質発現用プラスミドは、
オーファンＧＰＣＲのリガンド非存在下でのスクリーニ
ングでの使用に十分な性能を有していると言え、全く同
様に作製したＧα16、ＧαS2の融合蛋白質発現用プラス
ミドも、Ｇαi2の融合蛋白質と同様に問題なく機能する
ことが容易に類推できる。
Ｇαi2のＧＰＣＲとの融合蛋白質発現用プラスミドは、
オーファンＧＰＣＲのリガンド非存在下でのスクリーニ
ングでの使用に十分な性能を有していると言え、全く同
様に作製したＧα16、ＧαS2の融合蛋白質発現用プラス
ミドも、Ｇαi2の融合蛋白質と同様に問題なく機能する
ことが容易に類推できる。
【００６２】
【発明の効果】本系をオーファンＧＰＣＲに適用するこ
とにより、リガンド未知のまま、アゴニスト活性やアン
タゴニスト（インバースアゴニスト）活性を有する化合
物のスクリーニングが可能となる。
とにより、リガンド未知のまま、アゴニスト活性やアン
タゴニスト（インバースアゴニスト）活性を有する化合
物のスクリーニングが可能となる。
【００６３】
【配列表フリーテキスト】配列番号１：全長ＯＲＦを含
むヒトＧ蛋白質Ｇα16 ｃＤＮＡフラグメントを増幅す
るためのセンスプライマーとして機能すべくデザインさ
れたオリゴヌクレオチド。 配列番号２：全長ＯＲＦを含むヒトＧ蛋白質Ｇα16 ｃ
ＤＮＡフラグメントを増幅するためのアンチセンスプラ
イマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオ
チド。 配列番号３：全長ＯＲＦを含むヒトＧ蛋白質Ｇαi2 ｃ
ＤＮＡフラグメントを増幅するためのセンスプライマー
として機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。 配列番号４：全長ＯＲＦを含むヒトＧ蛋白質Ｇαi2 ｃ
ＤＮＡフラグメントを増幅するためのアンチセンスプラ
イマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオ
チド。 配列番号５：全長ＯＲＦを含むヒトＧ蛋白質ＧαS2 ｃ
ＤＮＡフラグメントを増幅するためのセンスプライマー
として機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。 配列番号６：全長ＯＲＦを含むヒトＧ蛋白質ＧαS2 ｃ
ＤＮＡフラグメントを増幅するためのアンチセンスプラ
イマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオ
チド。 配列番号７：ヒトＧ蛋白質Ｇα16 ｃＤＮＡフラグメン
トを開始コドンから増幅するためのセンスプライマーと
して機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。 配列番号８：ヒトＧ蛋白質Ｇαi2 ｃＤＮＡフラグメン
トを開始コドンから増幅するためのセンスプライマーと
して機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。 配列番号９：ヒトＧ蛋白質ＧαS2 ｃＤＮＡフラグメン
トを開始コドンから増幅するためのセンスプライマーと
して機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。 配列番号１０：プラスミドpcDNA3.1(+)のマルチクロー
ニング部位を増幅するためのアンチセンスプライマーと
して機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。 配列番号１１：6xHisタグペプチド配列をコードするヌ
クレオチド配列を含むリンカーを構築すべくデザインさ
れたセンス鎖オリゴヌクレオチド。 配列番号１２：6xHisタグペプチド配列をコードするヌ
クレオチド配列を含むリンカーを構築すべくデザインさ
れたアンチセンス鎖オリゴヌクレオチド。 配列番号１３：全長ＯＲＦを含むヒト５−ＨＴ１ａレセ
プターｃＤＮＡフラグメントを増幅するためのセンスプ
ライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレ
オチド。 配列番号１４：全長ＯＲＦを含むヒト５−ＨＴ１ａレセ
プターｃＤＮＡフラグメントを増幅するためのアンチセ
ンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴ
ヌクレオチド。 配列番号１５：ヒト５−ＨＴ１ａレセプターｃＤＮＡフ
ラグメントを終止コドンの直前まで増幅するためのアン
チセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオ
リゴヌクレオチド。 配列番号１６：pcHISGα16に含まれるインサートｃＤＮ
Ａ配列。 配列番号１７：pcHISGαi2に含まれるインサートｃＤＮ
Ａ配列。 配列番号１８：pcHISGαS2に含まれるインサートｃＤＮ
Ａ配列。 配列番号１９：pc5HT1aHISGα16に含まれる融合蛋白質
コード配列。 配列番号２０：pc5HT1aHISGαi2に含まれる融合蛋白質
コード配列。 配列番号２１：pc5HT1aHISGαS2に含まれる融合蛋白質
コード配列。
むヒトＧ蛋白質Ｇα16 ｃＤＮＡフラグメントを増幅す
るためのセンスプライマーとして機能すべくデザインさ
れたオリゴヌクレオチド。 配列番号２：全長ＯＲＦを含むヒトＧ蛋白質Ｇα16 ｃ
ＤＮＡフラグメントを増幅するためのアンチセンスプラ
イマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオ
チド。 配列番号３：全長ＯＲＦを含むヒトＧ蛋白質Ｇαi2 ｃ
ＤＮＡフラグメントを増幅するためのセンスプライマー
として機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。 配列番号４：全長ＯＲＦを含むヒトＧ蛋白質Ｇαi2 ｃ
ＤＮＡフラグメントを増幅するためのアンチセンスプラ
イマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオ
チド。 配列番号５：全長ＯＲＦを含むヒトＧ蛋白質ＧαS2 ｃ
ＤＮＡフラグメントを増幅するためのセンスプライマー
として機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。 配列番号６：全長ＯＲＦを含むヒトＧ蛋白質ＧαS2 ｃ
ＤＮＡフラグメントを増幅するためのアンチセンスプラ
イマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオ
チド。 配列番号７：ヒトＧ蛋白質Ｇα16 ｃＤＮＡフラグメン
トを開始コドンから増幅するためのセンスプライマーと
して機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。 配列番号８：ヒトＧ蛋白質Ｇαi2 ｃＤＮＡフラグメン
トを開始コドンから増幅するためのセンスプライマーと
して機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。 配列番号９：ヒトＧ蛋白質ＧαS2 ｃＤＮＡフラグメン
トを開始コドンから増幅するためのセンスプライマーと
して機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。 配列番号１０：プラスミドpcDNA3.1(+)のマルチクロー
ニング部位を増幅するためのアンチセンスプライマーと
して機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。 配列番号１１：6xHisタグペプチド配列をコードするヌ
クレオチド配列を含むリンカーを構築すべくデザインさ
れたセンス鎖オリゴヌクレオチド。 配列番号１２：6xHisタグペプチド配列をコードするヌ
クレオチド配列を含むリンカーを構築すべくデザインさ
れたアンチセンス鎖オリゴヌクレオチド。 配列番号１３：全長ＯＲＦを含むヒト５−ＨＴ１ａレセ
プターｃＤＮＡフラグメントを増幅するためのセンスプ
ライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレ
オチド。 配列番号１４：全長ＯＲＦを含むヒト５−ＨＴ１ａレセ
プターｃＤＮＡフラグメントを増幅するためのアンチセ
ンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴ
ヌクレオチド。 配列番号１５：ヒト５−ＨＴ１ａレセプターｃＤＮＡフ
ラグメントを終止コドンの直前まで増幅するためのアン
チセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオ
リゴヌクレオチド。 配列番号１６：pcHISGα16に含まれるインサートｃＤＮ
Ａ配列。 配列番号１７：pcHISGαi2に含まれるインサートｃＤＮ
Ａ配列。 配列番号１８：pcHISGαS2に含まれるインサートｃＤＮ
Ａ配列。 配列番号１９：pc5HT1aHISGα16に含まれる融合蛋白質
コード配列。 配列番号２０：pc5HT1aHISGαi2に含まれる融合蛋白質
コード配列。 配列番号２１：pc5HT1aHISGαS2に含まれる融合蛋白質
コード配列。
【００６４】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<120> Method for Screening of Ligand for Ophan GPCR
<130> A5333
<140> JP 2002-
<141> 2002-01-18
<160> 21
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc feature
<223> Oligonucleotide designed to act as sense primer for amplifying
human G protein Gα16 cDNA fragment containing full length ORF.
<400> 1
ccatggcccg ctcgctgacc 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc feature
<223> Oligonucleotide designed to act as antisense primer for
amplifying human G protein Gα16 cDNA fragment containing full
length ORF.
<400> 2
ccgaggctgg agagatagac c 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc feature
<223> Oligonucleotide designed to act as sense primer for amplifying
human G protein Gαi2 cDNA fragment containing full length ORF.
<400> 3
gcggcggagc ggcggaacg 19
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc feature
<223> Oligonucleotide designed to act as antisense primer for
amplifying human G protein Gαi2 cDNA fragment containing full
length ORF.
<400> 4
ggagaaaagc ggcgggggaa cagg 24
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc feature
<223> Oligonucleotide designed to act as sense primer for amplifying
human G protein GαS2 cDNA fragment containing full length ORF.
<400> 5
ccatgggctg cctcgggaac a 21
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc feature
<223> Oligonucleotide designed to act as antisense primer for
amplifying human G protein GαS2 cDNA fragment containng full
length ORF.
<400> 6
ggtttcgcaa aatcactcgg ggg 23
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc feature
<223> Oligonucleotide designed to act as sense primer for amplifying
human G protein Gα16 cDNA fragment from initiation codon.
<400> 7
atggcccgct cgctgacctg g 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc feature
<223> Oligonucleotide designed to act as sense primer for amplifying
human G protein Gαi2 cDNA fragment from initiation codon.
<400> 8
atgggctgca ccgtgagcgc c 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc feature
<223> Oligonucleotide designed to act as sense primer for amplifying
human G protein GαS2 cDNA fragment from initiation codon.
<400> 9
atgggctgcc tcgggaacag 20
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc feature
<223> Oligonucleotide designed to act as antisense primer for
amplifying multiple cloning site of plasmid pcDNA3.1(+).
<400> 10
tagaaggcac agtcgagg 18
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc feature
<223> Sense strand oligonucleotide designed to construct linker
containing nucleotide sequence encoding 6xHis-tag peptide
sequence.
<400> 11
gatatccatc atcatcatca ccat 24
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc feature
<223> Antisense strand oligonucleotide desined to construct linker
containing nucleotide sequence encoding 6xHis-tag peptide
sequence.
<400> 12
atggtgatga tgatgatg 18
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc feature
<223> Oligonucleotide designed to act as sense primer for amplifying
human 5-HT1a receptor cDNA fragment containing full length ORF.
<400> 13
aatcttcgcg ctgctttttc ttcc 24
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc feature
<223> Oligonucleotide designed to act as antisense primer for
amplifying human 5-HT1a receptor cDNA fragment containing full
length ORF.
<400> 14
cctcgactgg ccggctactc ct 22
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc feature
<223> Oligonucleotide designed to act as antisense primer for
amplyfying human 5-HT1a receptor cDNA fragment up to immediately
before stop codon.
<400> 15
ctggcggcag aacttacac 19
<210> 16
<211> 1245
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc feature
<223> Insert cDNA sequence contained in pcHISGα16.
<400> 16
atccatcatc atcatcacca tatggcccgc tcgctgacct ggcgctgctg cccctggtgc 60
ctgacggagg atgagaaggc cgccgcccgg gtggaccagg agatcaacag gatcctcttg 120
gagcagaaga agcaggaccg cggggagctg aagctgctgc ttttgggccc aggcgagagc 180
gggaagagca ccttcatcaa gcagatgcgg atcatccacg gcgccggcta ctcggaggag 240
gagcgcaagg gcttccggcc cctggtctac cagaacatct tcgtgtccat gcgggccatg 300
atcgaggcca tggagcggct gcagattcca ttcagcaggc ccgagagcaa gcaccacgct 360
agcctggtca tgagccagga cccctataaa gtgaccacgt ttgagaagcg ctacgctgcg 420
gccatgcagt ggctgtggag ggatgccggc atccgggcct gctatgagcg tcggcgggaa 480
ttccacctgc tcgattcagc cgtgtactac ctgtcccacc tggagcgcat caccgaggag 540
ggctacgtcc ccacagctca ggacgtgctc cgcagccgca tgcccaccac tggcatcaac 600
gagtactgct tctccgtgca gaaaaccaac ctgcggatcg tggacgtcgg gggccagaag 660
tcagagcgta agaaatggat ccattgtttc gagaacgtga tcgccctcat ctacctggcc 720
tcactgagtg aatacgacca gtgcctggag gagaacaacc aggagaaccg catgaaggag 780
agcctcgcat tgtttgggac tatcctggaa ctaccctggt tcaaaagcac atccgtcatc 840
ctctttctca acaaaaccga catcctggag gagaaaatcc ccacctccca cctggctacc 900
tatttcccca gtttccaggg ccctaagcag gatgctgagg cagccaagag gttcatcctg 960
gacatgtaca cgaggatgta caccgggtgc gtggacggcc ccgagggcag caagaagggc 1020
gcacgatccc gacgcctctt cagccactac acatgtgcca cagacacaca gaacatccgc 1080
aaggtcttca aggacgtgcg ggactcggtg ctcgcccgct acctggacga gatcaacctg 1140
ctgtgaccca ggccccacct ggggcaggcg gcaccggcgg gcgggtggga ggtgggagtg 1200
gctgcaggga cccctagtgt ccctggtcta tctctccagc ctcgg 1245
<210> 17
<211> 1203
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc feature
<223> Insert cDNA sequence contained in pcHISGαi2.
<400> 17
atccatcatc atcatcacca tatgggctgc accgtgagcg ccgaggacaa ggcggcggcc 60
gagcgctcta agatgatcga caagaacctg cgggaggacg gagagaaggc ggcgcgggag 120
gtgaagttgc tgctgttggg tgctggggag tcagggaaga gcaccatcgt caagcagatg 180
aagatcatcc acgaggatgg ctactccgag gaggaatgcc ggcagtaccg ggcggttgtc 240
tacagcaaca ccatccagtc catcatggcc attgtcaaag ccatgggcaa cctgcagatc 300
gactttgccg acccctccag agcggacgac gccaggcagc tatttgcact gtcctgcacc 360
gccgaggagc aaggcgtgct ccctgatgac ctgtccggcg tcatccggag gctctgggct 420
gaccatggtg tgcaggcctg ctttggccgc tcaagggaat accagctcaa cgactcagct 480
gcctactacc tgaacgacct ggagcgtatt gcacagagtg actacatccc cacacagcaa 540
gatgtgctac ggacccgcgt aaagaccacg gggatcgtgg agacacactt caccttcaag 600
gacctacact tcaagatgtt tgatgtgggt ggtcagcggt ctgagcggaa gaagtggatc 660
cactgctttg agggcgtcac agccatcatc ttctgcgtag ccttgagcgc ctatgacttg 720
gtgctagctg aggacgagga gatgaaccgc atgcatgaga gcatgaagct attcgatagc 780
atctgcaaca acaagtggtt cacagacacg tccatcatcc tcttcctcaa caagaaggac 840
ctgtttgagg agaagatcac acacagtccc ctgaccatct gcttccctga gtacacaggg 900
gccaacaaat atgatgaggc agccagctac atccagagta agtttgagga cctgaataag 960
cgcaaagaca ccaaggagat ctacacgcac ttcacgtgcg ccaccgacac caagaacgtg 1020
cagttcgtgt ttgacgccgt caccgatgtc atcatcaaga acaacctgaa ggactgcggc 1080
ctcttctgag gggcagcggg gcctggcggg atgggccacc gccgactttg taccccccaa 1140
cccctgagga agatgggggc aagaagatca cgctccccgc ctgttccccc gccgcttttc 1200
tcc 1203
<210> 18
<211> 1350
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc feature
<223> Insert cDNA sequence contained in pcHISGαS2.
<400> 18
atccatcatc atcatcacca tatgggctgc ctcgggaaca gtaagaccga ggaccagcgc 60
aacgaggaga aggcgcagcg tgaggccaac aaaaagatcg agaagcagct gcagaaggac 120
aagcaggtct accgggccac gcaccgcctg ctgctgctgg gtgctggaga atctggtaaa 180
agcaccattg tgaagcagat gaggatcctg catgttaatg ggtttaatgg agagggcggc 240
gaagaggacc cgcaggctgc aaggagcaac agcgatggca gtgagaaggc aaccaaagtg 300
caggacatca aaaacaacct gaaagaggcg attgaaacca ttgtggccgc catgagcaac 360
ctggtgcccc ccgtggagct ggccaacccc gagaaccagt tcagagtgga ctacatcctg 420
agtgtgatga acgtgcctga ctttgacttc cctcccgaat tctatgagca tgccaaggct 480
ctgtgggagg atgaaggagt gcgtgcctgc tacgaacgct ccaacgagta ccagctgatt 540
gactgtgccc agtacttcct ggacaagatc gacgtgatca agcaggctga ctatgtgccg 600
agcgatcagg acctgcttcg ctgccgtgtc ctgacttctg gaatctttga gaccaagttc 660
caggtggaca aagtcaactt ccacatgttt gacgtgggtg gccagcgcga tgaacgccgc 720
aagtggatcc agtgcttcaa cgatgtgact gccatcatct tcgtggtggc cagcagcagc 780
tacaacatgg tcatccggga ggacaaccag accaaccgcc tgcaggaggc tctgaacctc 840
ttcaagagca tctggaacaa cagatggctg cgcaccatct ctgtgatcct gttcctcaac 900
aagcaagatc tgctcgctga gaaagtcctt gctgggaaat cgaagattga ggactacttt 960
ccagaatttg ctcgctacac tactcctgag gatgctactc ccgagcccgg agaggaccca 1020
cgcgtgaccc gggccaagta cttcattcga gatgagtttc tgaggatcag cactgccagt 1080
ggagatgggc gtcactactg ctaccctcat ttcacctgcg ctgtggacac tgagaacatc 1140
cgccgtgtgt tcaacgactg ccgtgacatc attcagcgca tgcaccttcg tcagtacgag 1200
ctgctctaag aagggaaccc ccaaatttaa ttaaagcctt aagcacaatt aattaaaagt 1260
gaaacgtaat tgtacaagca gttaatcacc caccataggg catgattaac aaagcaacct 1320
ttcccttccc ccgagtgatt ttgcgaaacc 1350
<210> 19
<211> 2409
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<221> misc feature
<223> Fusion protein coding sequence contained in pc5HT1aHISGα16.
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2409)
<400> 19
atg gat gtg ctc agc cct ggt cag ggc aac aac acc aca tca cca ccg 48
Met Asp Val Leu Ser Pro Gly Gln Gly Asn Asn Thr Thr Ser Pro Pro
1 5 10 15
gct ccc ttt gag acc ggc ggc aac act act ggt atc tcc gac gtg acc 96
Ala Pro Phe Glu Thr Gly Gly Asn Thr Thr Gly Ile Ser Asp Val Thr
20 25 30
gtc agc tac caa gtg atc acc tct ctg ctg ctg ggc acg ctc atc ttc 144
Val Ser Tyr Gln Val Ile Thr Ser Leu Leu Leu Gly Thr Leu Ile Phe
35 40 45
tgc gcg gtg ctg ggc aat gcg tgc gtg gtg gct gcc atc gcc ttg gag 192
Cys Ala Val Leu Gly Asn Ala Cys Val Val Ala Ala Ile Ala Leu Glu
50 55 60
cgc tcc ctg cag aac gtg gcc aat tat ctt att ggc tct ttg gcg gtc 240
Arg Ser Leu Gln Asn Val Ala Asn Tyr Leu Ile Gly Ser Leu Ala Val
65 70 75 80
acc gac ctc atg gtg tcg gtg ttg gtg ctg ccc atg gcc gcg ctg tat 288
Thr Asp Leu Met Val Ser Val Leu Val Leu Pro Met Ala Ala Leu Tyr
85 90 95
cag gtg ctc aac aag tgg aca ctg ggc cag gta acc tgc gac ctg ttc 336
Gln Val Leu Asn Lys Trp Thr Leu Gly Gln Val Thr Cys Asp Leu Phe
100 105 110
atc gcc ctc gac gtg ctg tgc tgc acc tca tcc atc ttg cac ctg tgc 384
Ile Ala Leu Asp Val Leu Cys Cys Thr Ser Ser Ile Leu His Leu Cys
115 120 125
gcc atc gcg ctg gac agg tac tgg gcc atc acg gac ccc atc gac tac 432
Ala Ile Ala Leu Asp Arg Tyr Trp Ala Ile Thr Asp Pro Ile Asp Tyr
130 135 140
gtg aac aag agg acg ccc cgg cgc gcc gct gcg ctc atc tcg ctc act 480
Val Asn Lys Arg Thr Pro Arg Arg Ala Ala Ala Leu Ile Ser Leu Thr
145 150 155 160
tgg ctt att ggc ttc ctc atc tct atc ccg ccc atg ctg ggc tgg cgc 528
Trp Leu Ile Gly Phe Leu Ile Ser Ile Pro Pro Met Leu Gly Trp Arg
165 170 175
acc ccg gaa gac cgc tcg gac ccc gac gca tgc acc att agc aag gat 576
Thr Pro Glu Asp Arg Ser Asp Pro Asp Ala Cys Thr Ile Ser Lys Asp
180 185 190
cat ggc tac act atc tat tcc acc ttt gga gct ttc tac atc ccg ctg 624
His Gly Tyr Thr Ile Tyr Ser Thr Phe Gly Ala Phe Tyr Ile Pro Leu
195 200 205
ctg ctc atg ctg gtt ctc tat ggg cgc ata ttc cga gct gcg cgc ttc 672
Leu Leu Met Leu Val Leu Tyr Gly Arg Ile Phe Arg Ala Ala Arg Phe
210 215 220
cgc atc cgc aag acg gtc aaa aag gtg gag aag acc gga gcg gac acc 720
Arg Ile Arg Lys Thr Val Lys Lys Val Glu Lys Thr Gly Ala Asp Thr
225 230 235 240
cgc cat gga gca tct ccc gcc ccg cag ccc aag aag agt gtg aat gga 768
Arg His Gly Ala Ser Pro Ala Pro Gln Pro Lys Lys Ser Val Asn Gly
245 250 255
gag tcg ggg agc agg aac tgg agg ctg ggc gtg gag agc aag gct ggg 816
Glu Ser Gly Ser Arg Asn Trp Arg Leu Gly Val Glu Ser Lys Ala Gly
260 265 270
ggt gct ctg tgc gcc aat ggc gcg gtg agg caa ggt gac gat ggc gcc 864
Gly Ala Leu Cys Ala Asn Gly Ala Val Arg Gln Gly Asp Asp Gly Ala
275 280 285
gcc ctg gag gtg atc gag gtg cac cga gtg ggc aac tcc aaa gag cac 912
Ala Leu Glu Val Ile Glu Val His Arg Val Gly Asn Ser Lys Glu His
290 295 300
ttg cct ctg ccc agc gag gct ggt cct acc cct tgt gcc ccc gcc tct 960
Leu Pro Leu Pro Ser Glu Ala Gly Pro Thr Pro Cys Ala Pro Ala Ser
305 310 315 320
ttc gag agg aaa aat gag cgc aac gcc gag gcg aag cgc aag atg gcc 1008
Phe Glu Arg Lys Asn Glu Arg Asn Ala Glu Ala Lys Arg Lys Met Ala
325 330 335
ctg gcc cga gag agg aag aca gtg aag acg ctg ggc atc atc atg ggc 1056
Leu Ala Arg Glu Arg Lys Thr Val Lys Thr Leu Gly Ile Ile Met Gly
340 345 350
acc ttc atc ctc tgc tgg ctg ccc ttc ttc atc gtg gct ctt gtt ctg 1104
Thr Phe Ile Leu Cys Trp Leu Pro Phe Phe Ile Val Ala Leu Val Leu
355 360 365
ccc ttc tgc gag agc agc tgc cac atg ccc acc ctg ttg ggc gcc ata 1152
Pro Phe Cys Glu Ser Ser Cys His Met Pro Thr Leu Leu Gly Ala Ile
370 375 380
atc aat tgg ctg ggc tac tcc aac tct ctg ctt aac ccc gtc att tac 1200
Ile Asn Trp Leu Gly Tyr Ser Asn Ser Leu Leu Asn Pro Val Ile Tyr
385 390 395 400
gca tac ttc aac aag gac ttt caa aac gcg ttt aag aag atc att aag 1248
Ala Tyr Phe Asn Lys Asp Phe Gln Asn Ala Phe Lys Lys Ile Ile Lys
405 410 415
tgt aag ttc tgc cgc cag atc cat cat cat cat cac cat atg gcc cgc 1296
Cys Lys Phe Cys Arg Gln Ile His His His His His His Met Ala Arg
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<223> Fusion protein coding sequence contained in pc5HT1aHISGαS2.
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Asp Ala Thr Pro Glu Pro Gly Glu Asp Pro Arg Val Thr Arg Ala Lys
755 760 765
tac ttc att cga gat gag ttt ctg agg atc agc act gcc agt gga gat 2352
Tyr Phe Ile Arg Asp Glu Phe Leu Arg Ile Ser Thr Ala Ser Gly Asp
770 775 780
ggg cgt cac tac tgc tac cct cat ttc acc tgc gct gtg gac act gag 2400
Gly Arg His Tyr Cys Tyr Pro His Phe Thr Cys Ala Val Asp Thr Glu
785 790 795 800
aac atc cgc cgt gtg ttc aac gac tgc cgt gac atc att cag cgc atg 2448
Asn Ile Arg Arg Val Phe Asn Asp Cys Arg Asp Ile Ile Gln Arg Met
805 810 815
cac ctt cgt cag tac gag ctg ctc 2472
His Leu Arg Gln Tyr Glu Leu Leu
820
【図１】ヒトＧα16、Ｇαi2およびＧαS2遺伝子のＰＣ
Ｒによるクローニングと、動物細胞での各発現用プラス
ミドの構築工程を示すフローである。
Ｒによるクローニングと、動物細胞での各発現用プラス
ミドの構築工程を示すフローである。
【図２】ＧＰＣＲとＧα16、Ｇαi2およびＧαS2の各Ｇ
α蛋白質との融合蛋白質発現プラスミド構築用のプラス
ミドの構築工程を示すフローである。
α蛋白質との融合蛋白質発現プラスミド構築用のプラス
ミドの構築工程を示すフローである。
【図３】ヒト５−ＨＴ１ａレセプター遺伝子のＰＣＲに
よるクローニングと、Ｇα16、Ｇαi2およびＧαS2の各
Ｇαとの融合蛋白質発現プラスミドの構築工程を示すフ
ローである。
よるクローニングと、Ｇα16、Ｇαi2およびＧαS2の各
Ｇαとの融合蛋白質発現プラスミドの構築工程を示すフ
ローである。
【図４】５−ＨＴ１ａレセプター蛋白質単独（Ａ）、５
−ＨＴ１ａレセプター−Ｇαi2融合蛋白質（Ｂ）および
５−ＨＴ１ａレセプター−Ｇα16融合蛋白質（Ｃ）の発
現プラスミドをそれぞれＣＨＯ−Ｋ１細胞に一過的に発
現させ、膜画分を調製し、ＧＴＰγＳ結合実験を行った
結果をプロットしたグラフである。８−ＯＨ ＤＰＡＴ
またはｓｐｉｐｅｒｏｎｅ（１０-5〜１０-9Ｍ）で刺激
し、各蛋白質発現細胞膜の応答性を調べた。
−ＨＴ１ａレセプター−Ｇαi2融合蛋白質（Ｂ）および
５−ＨＴ１ａレセプター−Ｇα16融合蛋白質（Ｃ）の発
現プラスミドをそれぞれＣＨＯ−Ｋ１細胞に一過的に発
現させ、膜画分を調製し、ＧＴＰγＳ結合実験を行った
結果をプロットしたグラフである。８−ＯＨ ＤＰＡＴ
またはｓｐｉｐｅｒｏｎｅ（１０-5〜１０-9Ｍ）で刺激
し、各蛋白質発現細胞膜の応答性を調べた。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ
33/566 33/566
// Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 AA40 BA11 BB50
DA12 DA13 DA14 DA36 FB02
4B024 AA01 BA07 BA11 BA63 CA04
CA07 DA02 EA04 GA11 HA08
4B063 QA18 QQ07 QQ08 QQ09 QQ13
QQ30 QQ38 QQ53 QQ79 QR42
QR45 QR50 QR77
4B065 AA57X AA87X AA93Y AB01
BA02 CA24 CA44
Claims (26)
- 【請求項１】 Ｇ蛋白質共役型受容体に対するリガンド
のスクリーニング系であって、(i) 目的のＧ蛋白質共役
型受容体とＧα16との融合蛋白質が包埋された脂質二重
層を含む膜系、(ii) 該受容体とＧαi2との融合蛋白質
が包埋された脂質二重層を含む膜系および(iii) 該受容
体とＧαS2との融合蛋白質が包埋された脂質二重層を含
む膜系を構成要素として含むことを特徴とするスクリー
ニング系。 - 【請求項２】 Ｇ蛋白質共役型受容体と各Ｇαサブユニ
ット蛋白質との融合蛋白質が包埋された膜系が、該融合
蛋白質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトラン
スフェクトされた宿主真核生物由来細胞、該細胞のホモ
ジネートまたは該細胞由来の膜画分である、請求項１記
載のスクリーニング系。 - 【請求項３】 前記(i)の膜系がフォスフォリパーゼβ
をさらに含み、前記(ii)および(iii)の膜系がアデニル
酸シクラーゼをさらに含むものである、請求項１または
２記載のスクリーニング系。 - 【請求項４】 前記(i)の膜系が、ＴＰＡ応答エレメン
トを含むプロモーター領域の制御下にあるリポーター遺
伝子を含む発現ベクターでさらにトランスフェクトされ
た宿主真核生物由来細胞であり、前記(ii)および(iii)
の膜系が、ｃＡＭＰ応答エレメントを含むプロモーター
領域の制御下にあるリポーター遺伝子を含む発現ベクタ
ーでさらにトランスフェクトされた宿主真核生物由来細
胞である、請求項３記載のスクリーニング系。 - 【請求項５】 Ｇαi2およびＧαS2のエフェクターと相
互作用するための領域が、Ｇα16由来のフォスフォリパ
ーゼβと相互作用し得る配列で置換されている、請求項
１または２記載のスクリーニング系。 - 【請求項６】 前記(i)〜(iii)の膜系がフォスフォリパ
ーゼβをさらに含むものである、請求項５記載のスクリ
ーニング系。 - 【請求項７】 前記(i)〜(iii)の膜系が、ＴＰＡ応答エ
レメントを含むプロモーター領域の制御下にあるリポー
ター遺伝子を含む発現ベクターでさらにトランスフェク
トされた宿主真核生物由来細胞である、請求項６記載の
スクリーニング系。 - 【請求項８】 Ｇα16およびＧαS2の少なくともエフェ
クターと相互作用するための領域が、Ｇαi2由来のアデ
ニル酸シクラーゼと相互作用し得る配列で置換されてい
る、請求項１または２記載のスクリーニング系。 - 【請求項９】 Ｇα16およびＧαi2の少なくともエフェ
クターと相互作用するための領域が、ＧαS2由来のアデ
ニル酸シクラーゼと相互作用し得る配列で置換されてい
る、請求項１または２記載のスクリーニング系。 - 【請求項１０】 前記(i)〜(iii)の膜系がアデニル酸シ
クラーゼをさらに含むものである、請求項８または９記
載のスクリーニング系。 - 【請求項１１】 前記(i)〜(iii)の膜系が、ｃＡＭＰ応
答エレメントを含むプロモーター領域の制御下にあるリ
ポーター遺伝子を含む発現ベクターでさらにトランスフ
ェクトされた宿主真核生物由来細胞である、請求項１０
記載のスクリーニング系。 - 【請求項１２】 請求項１〜１１のいずれかに記載のス
クリーニング系の各膜系に包埋されたＧαサブユニット
蛋白質のＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応、又は該Ｇαサブユニ
ット蛋白質と相互作用するエフェクターの活性を、被験
物質の存在下と非存在下で比較することを特徴とする、
Ｇ蛋白質共役型受容体に対するリガンドのスクリーニン
グ方法。 - 【請求項１３】 請求項１〜３のいずれかに記載のスク
リーニング系の各膜系に、被験物質の存在下及び非存在
下で標識したＧＴＰアナログを添加し、Ｇαサブユニッ
ト蛋白質に結合した標識量を両条件下で比較することを
特徴とする、請求項１２記載の方法。 - 【請求項１４】 請求項３記載のスクリーニング系にお
いて、前記(i)の膜系には、被験物質の存在下及び非存
在下でホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸
を添加して、フォスフォリパーゼβ活性を両条件下で比
較し、前記(ii)および(iii)の膜系には、被験物質の存
在下及び非存在下でＡＴＰを添加して、アデニル酸シク
ラーゼ活性を両条件下でそれぞれ比較することを特徴と
する、請求項１２記載の方法。 - 【請求項１５】 各膜系が真核生物由来細胞である請求
項３記載のスクリーニング系において、前記(i)の膜系
については細胞内カルシウムイオンの量を、被験物質の
存在下と非存在下で比較し、前記(ii)および(iii)の膜
系については細胞内ｃＡＭＰ量を、被験物質の存在下と
非存在下でそれぞれ比較することを特徴とする、請求項
１２記載の方法。 - 【請求項１６】 請求項４記載のスクリーニング系にお
ける各真核生物由来細胞でのリポーター遺伝子の発現量
を、被験物質の存在下と非存在下でそれぞれ比較するこ
とを特徴とする、請求項１２記載の方法。 - 【請求項１７】 請求項６記載のスクリーニング系の各
膜系に、被験物質の存在下及び非存在下でホスファチジ
ルイノシトール−４，５−二リン酸を添加して、フォス
フォリパーゼβ活性を両条件下でそれぞれ比較すること
を特徴とする、請求項１２記載の方法。 - 【請求項１８】 各膜系が真核生物由来細胞である請求
項６記載のスクリーニング系において、各真核生物由来
細胞内のカルシウムイオン量を、被験物質の存在下と非
存在下でそれぞれ比較することを特徴とする、請求項１
２記載の方法。 - 【請求項１９】 請求項７記載のスクリーニング系にお
ける各真核生物由来細胞でのリポーター遺伝子の発現量
を、被験物質の存在下と非存在下でそれぞれ比較するこ
とを特徴とする、請求項１２記載の方法。 - 【請求項２０】 請求項１０記載のスクリーニング系の
各膜系に、被験物質の存在下及び非存在下でＡＴＰを添
加して、アデニル酸シクラーゼ活性を両条件下でそれぞ
れ比較することを特徴とする、請求項１２記載の方法。 - 【請求項２１】 各膜系が真核生物由来細胞である請求
項１０記載のスクリーニング系において、各真核生物由
来細胞内のｃＡＭＰ量を、被験物質の存在下と非存在下
でそれぞれ比較することを特徴とする、請求項１２記載
の方法。 - 【請求項２２】 請求項１１記載のスクリーニング系に
おける各真核生物由来細胞でのリポーター遺伝子の発現
量を、被験物質の存在下と非存在下でそれぞれ比較する
ことを特徴とする、請求項１２記載の方法。 - 【請求項２３】 請求項１〜１１のいずれかに記載のス
クリーニング系の各膜系に包埋されたＧαサブユニット
蛋白質のＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を相互に比較すること
を特徴とする、Ｇ蛋白質共役型受容体と相互作用し得る
Ｇαサブユニット蛋白質の同定方法。 - 【請求項２４】 請求項６または１０記載のスクリーニ
ング系の各膜系に包埋されたＧαサブユニット蛋白質が
相互作用し得るエフェクターの活性を相互に比較するこ
とを特徴とする、Ｇ蛋白質共役型受容体と相互作用し得
るＧαサブユニット蛋白質の同定方法。 - 【請求項２５】 請求項７または１１記載のスクリーニ
ング系における各真核生物由来細胞でのリポーター遺伝
子の発現を相互に比較することを特徴とする、Ｇ蛋白質
共役型受容体と相互作用し得るＧαサブユニット蛋白質
の同定方法。 - 【請求項２６】 請求項１２〜２２のいずれかに記載の
方法を、請求項２３〜２５のいずれかに記載の方法によ
り同定されたＧαサブユニット蛋白質と目的のＧ蛋白質
共役型受容体との融合蛋白質が包埋された膜系について
のみ実施することを特徴とする、該Ｇ蛋白質共役型受容
体に対するリガンドのスクリーニング方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002010871A JP2003210192A (ja) | 2002-01-18 | 2002-01-18 | オーファンｇｐｃｒに対するリガンドのスクリーニング方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002010871A JP2003210192A (ja) | 2002-01-18 | 2002-01-18 | オーファンｇｐｃｒに対するリガンドのスクリーニング方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003210192A true JP2003210192A (ja) | 2003-07-29 |
Family
ID=27648490
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002010871A Pending JP2003210192A (ja) | 2002-01-18 | 2002-01-18 | オーファンｇｐｃｒに対するリガンドのスクリーニング方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003210192A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105474014A (zh) * | 2013-08-20 | 2016-04-06 | 明治制果药业株式会社 | S1p1受体激动剂的评价方法和筛选方法 |
| JP2017163984A (ja) * | 2016-03-14 | 2017-09-21 | サントリーホールディングス株式会社 | 苦味評価のための融合タンパク質および苦味評価方法 |
-
2002
- 2002-01-18 JP JP2002010871A patent/JP2003210192A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105474014A (zh) * | 2013-08-20 | 2016-04-06 | 明治制果药业株式会社 | S1p1受体激动剂的评价方法和筛选方法 |
| CN105474014B (zh) * | 2013-08-20 | 2017-04-05 | 明治制果药业株式会社 | S1p1受体激动剂的评价方法和筛选方法 |
| JP2017163984A (ja) * | 2016-03-14 | 2017-09-21 | サントリーホールディングス株式会社 | 苦味評価のための融合タンパク質および苦味評価方法 |
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