CN105474014B - S1p1受体激动剂的评价方法和筛选方法 - Google Patents

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Abstract

发现了：S1P1受体激动剂的主作用(免疫抑制活性)与对表达S1P1受体与Gαi2或Gαi3的组合的细胞的选择性相关，S1P1受体激动剂的副作用(心脏毒性)与对表达S1P1受体与Gαi1的组合的细胞的选择性相关。

Description

S1P1受体激动剂的评价方法和筛选方法
技术领域
本发明涉及评价鞘氨醇-1-磷酸1(以下称为“S1P1”)受体激动剂的免疫抑制活性和心脏毒性的方法，以及筛选具有强的免疫抑制活性且心脏毒性低的S1P1受体激动剂的方法。
背景技术
众多的自身免疫疾病的结果是，由于异常的免疫应答，错误地识别自身的淋巴细胞增殖并活化，全身性地攻击自身或者攻击自身特定的组织而呈现症状，但是其原因多种多样且并未明确。迄今为止，以抑制淋巴细胞的增殖、活化的药剂为目标，各种免疫抑制剂逐渐被开发且进入临床应用，但是由非特异性的细胞增殖抑制活性、细胞毒性作用引起的副作用也不少，成为问题。
近年来，作为针对复发缓解型多发性硬化症的药剂而被认可的芬戈莫德(别名FTY-720)由于不是通过使淋巴细胞因细胞死亡而枯竭，而是通过控制其定位来调节免疫，因此作为具有新机制的药剂而受到瞩目。然而另一方面，对于芬戈莫德确认了包括心动过缓、房室传导阻滞(AV传导阻滞)等心律不齐在内的以心血管系统为中心的严重副作用，因而成为问题。(非专利文献1、非专利文献2)。
鞘氨醇-1-磷酸(以下称为“S1P”)的受体是存在于细胞膜上的G蛋白偶联型受体(GPCR)，被鉴定出有5种亚型受体(S1P1、S1P2、S1P3、S1P4、S1P5；别名为内皮分化基因EDG-1、EDG-5、EDG-3、EDG-6、EDG-8)。已知在生物体内磷酸化的芬戈莫德(FTY-p)与S1P1受体、S1P3受体、S1P4受体以及S1P5受体结合，作为激动剂发挥功能。
已知淋巴细胞经常消耗一定的时间在循环血液与淋巴组织中巡游，当从淋巴组织移动至循环血液中时，淋巴细胞膜上的S1P1受体发挥极其重要的作用。以FTY-p为代表的S1P1受体激动剂主要通过与淋巴细胞上的S1P1受体结合，将S1P1受体摄入细胞内而使淋巴细胞上的S1P1受体缺损。然后，由此将淋巴细胞隔离在二级淋巴组织而使循环淋巴细胞数目下降。其结果是S1P1受体激动剂发挥优异的免疫抑制活性(非专利文献2)。另一方面，从啮齿类的研究来看，考虑是通过刺激S1P3受体来显示心动过缓等心血管系统副作用(非专利文献3、4)，因此，正在研究减弱了对S1P3受体的作用的S1P1受体激动剂。
在这样的状况中，近年来报告了作为对S1P1受体和S1P5受体具有选择性的激动剂的BAF312(别名辛波莫德，Siponimod)的临床试验结果(非专利文献5)，其中作为副作用的心率降低作用和作为有效性的循环淋巴细胞数下降效果在相同用量下表现出来。因此，显示了仅仅通过分离对S1P3受体的作用不能在临床上分离心脏毒性，由芬戈莫德表现的心脏毒性作用的至少一部分是由对S1P1受体的激动剂刺激引起的毒性。
S1P1受体与抑制性Gα蛋白质(以下称为“Gαi”)偶联，在心脏中通过对受体的激动剂刺激而活化的Gαi与Gβγ一起使G蛋白偶联型内向整流型钾通道(以下称为“GIRK通道”)活化。由于在心脏中，GIRK1与GIRK4的复合体表达，因此考虑因为该激动剂刺激而产生AV传导阻滞、心率下降等心脏毒性(非专利文献5、6)。
关于作为对S1P受体的内源性激动剂的S1P的激动剂活性，报告了虽然根据评价法不同而会有一些不同，但是通常显示约10nM左右的50％活化浓度(EC50值)。另一方面，虽然S1P的一般健常人的血中浓度以数百nM这样EC50值的数十倍的高浓度存在，但是在一般健常人中并不诱发心脏毒性。进而，存在下述矛盾：显示同程度的EC50值的BAF312尽管与FTY-p同样地有效血中浓度为数十nM这样低的浓度，但是表现心脏毒性。
这样，S1P受体激动剂发挥作为其主作用的免疫抑制活性、作为其副作用的心脏毒性的机制目前尚未充分地阐明。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2013/094761
非专利文献
非专利文献1：Science,296,346-349(2002)
非专利文献2：Journal of the American Society of Nephrology,13(4),1073-1083(2002)
非专利文献3：Journal of Biological Chemistry,279(14),13839-13848(2004)
非专利文献4：Molecular Pharmacology,58,449-454(2000)
非专利文献5：British Journal of Pharmacology,167,1035-1047(2012)
非专利文献6：Journal of Biological Chemistry,276(8),5505-5510(2001)
非专利文献7：Nature Chemical Biology,8,622-630(2012)
发明内容
发明所要解决的课题
本发明是鉴于这样的状况而做出的，其目的在于，阐明S1P受体激动剂发挥主作用和副作用的机制，基于该机制的信息，提供评价S1P受体激动剂的主作用和副作用的方法。进而，本发明的目的在于，基于该机制的信息，提供筛选具有强的主作用且副作用少的S1P受体激动剂的方法。
用于解决课题的方法
存在众多与S1P1受体的信号转导相关的分子，在这些分子中，即使着眼于与S1P1受体偶联的Gα蛋白，也存在众多的亚型。在这样的状况下，本发明者为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现，S1P1受体激动剂的免疫抑制活性与对表达S1P1受体与Gαi2或Gαi3的组合的细胞的选择性相关，S1P1受体激动剂的心脏毒性与对表达S1P1受体与Gαi1的组合的细胞的选择性相关。即，本发明者最终证明了，与S1P1受体偶联的Gαi1、Gαi2和Gαi3，与S1P受体激动剂的免疫抑制活性、心脏毒性相关。
并且，基于该见解，本发明者发现，通过检测偶联的Gα亚基(Gαi1、Gαi2、Gαi3)特异性的激动剂活性，能够评价S1P1受体激动剂的免疫抑制活性的强度、心脏毒性的高低，进而能够筛选免疫抑制活性强且心脏毒性低的S1P1受体激动剂，从而完成了本发明。
因此，本发明涉及S1P1受体激动剂的评价方法和筛选方法，其特征在于，检测偶联的Gα亚基特异性的对S1P1受体的激动剂活性，更详细地说，提供以下(1)～(9)。
(1)评价S1P1受体激动剂的免疫抑制活性的强度的方法，
该方法以S1P1受体激动剂对与Gαi2偶联的S1P1受体和与Gαi3偶联的S1P1受体中的至少一者的激动剂活性作为指标。
(2)评价S1P1受体激动剂的免疫抑制活性的强度的方法，
该方法包括测定S1P1受体激动剂对与Gαi2偶联的S1P1受体和与Gαi3偶联的S1P1受体的激动剂活性的工序，
在S1P1受体激动剂对与Gαi2偶联的S1P1受体和与Gαi3偶联的S1P1受体的激动剂活性高于对与Gαi1偶联的S1P1受体的激动剂活性的情况下，评价为S1P1受体激动剂能够发挥强的免疫抑制活性。
(3)评价S1P1受体激动剂的免疫抑制活性的强度的方法，
该方法包括测定S1P1受体激动剂对与Gαi2偶联的S1P1受体和与Gαi3偶联的S1P1受体的激动剂活性的工序，
在S1P1受体激动剂对与Gαi2偶联的S1P1受体和与Gαi3偶联的S1P1受体中的至少一者的激动剂活性高于内源性激动剂S1P的情况下，评价为S1P1受体激动剂能够发挥强的免疫抑制活性。
(4)评价S1P1受体激动剂产生心脏毒性的容易程度的方法，
该方法以S1P1受体激动剂对与Gαi1偶联的S1P1受体的激动剂活性作为指标。
(5)评价S1P1受体激动剂产生心脏毒性的容易程度的方法，
该方法包括测定S1P1受体激动剂对与Gαi1偶联的S1P1受体的激动剂活性的工序，
在S1P1受体激动剂对与Gαi1偶联的S1P1受体的激动剂活性低于对与Gαi2偶联的S1P1受体和与Gαi3偶联的S1P1受体的激动剂活性的情况下，评价为S1P1受体激动剂不易产生心脏毒性。
(6)评价S1P1受体激动剂产生心脏毒性的容易程度的方法，
该方法包括测定S1P1受体激动剂对与Gαi1偶联的S1P1受体的激动剂活性的工序，
在S1P1受体激动剂对与Gαi1偶联的S1P1受体的激动剂活性低于内源性激动剂S1P的情况下，评价为S1P1受体激动剂不易产生心脏毒性。
(7)S1P1受体激动剂的筛选方法，
该方法包括：
工序(a)，测定被测化合物对与Gαi1偶联的S1P1受体、与Gαi2偶联的S1P1受体和与Gαi3偶联的S1P1受体的激动剂活性，以及
工序(b)，选择对与Gαi2偶联的S1P1受体和与Gαi3偶联的S1P1受体的激动剂活性高于对与Gαi1偶联的S1P1受体的激动剂活性的化合物。
(8)根据(7)所述的方法，在工序(b)中，选择对与Gαi2偶联的S1P1受体和与Gαi3偶联的S1P1受体的激动剂活性比对与Gαi1偶联的S1P1受体的激动剂活性高30倍以上的化合物。
(9)S1P1受体激动剂的筛选方法，
该方法包括：
工序(a)，测定被测化合物对与Gαi1偶联的S1P1受体、与Gαi2偶联的S1P1受体和与Gαi3偶联的S1P1受体的激动剂活性，以及
工序(b)，选择对与Gαi1偶联的S1P1受体的激动剂活性低于内源性激动剂S1P、且对与Gαi2偶联的S1P1受体和与Gαi3偶联的S1P1受体中的至少一者的激动剂活性高于内源性激动剂S1P的化合物。
另外，关于本发明中的“S1P1受体”，在NCBI数据库上其代表性氨基酸序列作为NP001391.2注册，对应的mRNA的碱基序列作为NM001400.4注册。
此外，关于“Gαi1(基因名是GNAI1)”，在NCBI数据库上其代表的氨基酸序列作为NP_002060.4注册，对应的mRNA的碱基序列作为NM002069.5注册。
此外，关于“Gαi2(基因名是GNAI2)”，在NCBI数据库上其代表的氨基酸序列作为NP_002061.1注册，对应的mRNA的碱基序列作为NM002070.2注册。
此外，关于“Gαi3(基因名是GNAI3)”，在NCBI数据库上其代表的氨基酸序列作为NP_006487.1注册，对应的mRNA的碱基序列作为NM006496.3注册。
发明的效果
在以往的激动剂活性的评价方法中，不能将S1P1受体激动剂的主作用(有效性)和副作用区别开来进行评价。在本发明中，通过分成与S1P1受体偶联的Gα蛋白的亚型(Gαi1、Gαi2、Gαi3)来检测对S1P1受体的激动剂活性，从而能够将S1P1受体激动剂的主作用和副作用区别开来进行评价。此外，由此能够有效地筛选优异的S1P1受体激动剂。
具体实施方式
<评价S1P1受体激动剂的免疫抑制活性的强度的方法>
本发明提供评价S1P1受体激动剂的免疫抑制活性的强度的方法。在本实施例中发现，S1P1受体激动剂的免疫抑制活性的强度与对与Gαi2偶联的S1P1受体或与Gαi3偶联的S1P1受体的激动剂活性相关。因此，本发明的评价方法是以S1P1受体激动剂对与Gαi2偶联的S1P1受体和与Gαi3偶联的S1P1受体中的至少一者的激动剂活性作为指标的方法。
对于本发明中的“免疫抑制活性”，例如，可以以循环淋巴细胞数下降作为指标进行掌控。对于循环淋巴细胞数，例如，可以通过本实施例2中记载的方法测定。
本发明中的Gαi的亚型特异性的激动剂活性的测定可以通过例如，本实施例1(2)中记载的方法(非专利文献7中记载的方法)进行。即，使S1P1受体和特定的Gα亚型与Gγ2和Gβ1一起在细胞中表达，以由S1P1受体激动剂引起的Gα蛋白与Gβγ蛋白的分离率作为指标，可以测定激动剂活性。
此外，已知通常如果激动剂刺激S1P1受体，则细胞内cAMP量被向减少的方向调节。因此，例如，使用共表达S1P1受体和特定的Gαi亚型的细胞，以在通过毛喉素等使细胞内cAMP量上升的条件下、由S1P1受体激动剂引起的cAMP量的减少作为指标，也能够测定Gαi亚型特异性的激动剂活性。
此外，如果细胞变形，则在单层膜上形成的电阻值发生变化。已知利用该现象，在膜上以单层培养表达S1P受体的细胞，测定由于添加S1P1受体激动剂而产生的电阻值的变化的方法(Invest Ophthalmol Vis Sci.2005Jun；46(6):1927-33.)。基于该方法，例如，在膜上培养共表达S1P1受体和特定的Gα亚型的细胞，以由于添加S1P1受体激动剂而产生的电阻值的变化作为指标，也能够测定Gαi亚型特异性的激动剂活性。
此外，通常已知使表达GPCR的细胞膜、化合物和γ-[35S]GTP在缓冲液中进行反应，以结合在膜上的标记体的量作为激动剂的活性值进行定量的方法(Life ScienceVolume 74,Issue 4,12December 2003,Pages 489-508)。因此，例如，使用共表达S1P1受体和特定的Gαi亚型的细胞膜，以由于GTP交换反应γ-[35S]GTP向膜部分的蓄积作为指标，也能够测定Gαi亚型特异性的激动剂活性。
在本发明的一种方式中，测定S1P1受体激动剂对与Gαi2偶联的S1P1受体和与Gαi3偶联的S1P1受体的激动剂活性，在S1P1受体激动剂对与Gαi2偶联的S1P1受体和与Gαi3偶联的S1P1受体的激动剂活性高于对与Gαi1偶联的S1P1受体的激动剂活性的情况下，评价为S1P1受体激动剂能够发挥强的免疫抑制活性。
优选对与Gαi2偶联的S1P1受体和与Gαi3偶联的S1P1受体的激动剂活性，是对与Gαi1偶联的S1P1受体的激动剂活性的10倍以上，更优选是20倍以上，进一步优选是30倍以上。
此外，在本发明的另一方式中，测定S1P1受体激动剂对与Gαi2偶联的S1P1受体和与Gαi3偶联的S1P1受体的激动剂活性，在S1P1受体激动剂对与Gαi2偶联的S1P1受体和与Gαi3偶联的S1P1受体中的至少一者的激动剂活性高于内源性激动剂S1P的情况下，评价为S1P1受体激动剂能够发挥强的免疫抑制活性。
成为对照的内源性激动剂S1P的激动剂活性可以在测定S1P1受体激动剂的激动剂活性时测定，也可以使用预先测定的值。例如，在利用本实施例1(2)中记载的方法(非专利文献7中记载的方法)进行测定时，在对与Gαi2偶联的S1P1受体的激动剂活性的EC50值(nM)为14以下的情况、或者对与Gαi3偶联的S1P1受体的激动剂活性的EC50值(nM)为8以下的情况下，评价为S1P1受体激动剂能够发挥强的免疫抑制活性。
<评价S1P1受体激动剂产生心脏毒性的容易程度的方法>
本发明提供评价S1P1受体激动剂产生心脏毒性的容易程度的方法。在本实施例中发现，S1P1受体激动剂的心脏毒性产生的容易程度与对与Gαi1偶联的S1P1受体的激动剂活性相关。因此，本发明的评价方法以S1P1受体激动剂对与Gαi1偶联的S1P1受体的激动剂活性作为指标。
本发明中的“心脏毒性”可以将例如，AV传导阻滞、心率下降作为指标进行掌控。AV传导阻滞可以通过例如，本实施例3中记载的方法进行测定。此外，本发明中的Gαi的亚型特异性的激动剂活性的测定的方法如上所述。
在本发明的一种方式中，测定S1P1受体激动剂对与Gαi1偶联的S1P1受体的激动剂活性，在S1P1受体激动剂对与Gαi1偶联的S1P1受体的激动剂活性低于对与Gαi2偶联的S1P1受体和与Gαi3偶联的S1P1受体的激动剂活性的情况下，评价为S1P1受体激动剂不易产生心脏毒性。
优选对与Gαi1偶联的S1P1受体的激动剂活性是对与Gαi2偶联的S1P1受体和与Gαi3偶联的S1P1受体的激动剂活性的10分之1以下，更优选为20分之1以下，进一步优选为30分之1以下。
此外，在本发明的另一方式中，测定S1P1受体激动剂对与Gαi1偶联的S1P1受体的激动剂活性，在S1P1受体激动剂对与Gαi1偶联的S1P1受体的激动剂活性低于内源性激动剂S1P的情况下，评价为S1P1受体激动剂不易产生心脏毒性。
作为对照的内源性激动剂S1P的激动剂活性可以在测定S1P1受体激动剂的激动剂活性时测定，也可以使用预先测定的值。例如，在利用本实施例1(2)中记载的方法(非专利文献7中记载的方法)进行测定时，在对与Gαi1偶联的S1P1受体的激动剂活性的EC50值(nM)高于261的情况下，评价为S1P1受体激动剂不易产生心脏毒性。
<S1P1受体激动剂的筛选方法>
本发明提供S1P1受体激动剂的筛选方法。在本实施例中，明确了S1P1受体激动剂的免疫抑制活性与对表达S1P1受体与Gαi2或Gαi3的组合的细胞的选择性相关，S1P1受体激动剂的心脏毒性与对表达S1P1受体与Gαi1的组合的细胞的选择性相关。本发明的筛选方法是利用这样的相关的方法。
对用于筛选的被测化合物无特别限制，例如，可以使用合成低分子化合物文库、基因文库的表达产物、肽文库、抗体、细菌释放物质、细胞(微生物、植物细胞、动物细胞)的提取液和培养上清、纯化或部分纯化多肽、海洋生物、源自植物或动物的提取物、噬菌体展示随机肽文库。此外，检测Gαi的亚型特异性的激动剂活性的方法如上所述。
在本发明的一种方式中，测定被测化合物对与Gαi1偶联的S1P1受体、与Gαi2偶联的S1P1受体和与Gαi3偶联的S1P1受体的激动剂活性，选择对与Gαi2偶联的S1P1受体和与Gαi3偶联的S1P1受体的激动剂活性高于对与Gαi1偶联的S1P1受体的激动剂活性的化合物。
优选选择对与Gαi2偶联的S1P1受体和与Gαi3偶联的S1P1受体的激动剂活性高于对与Gαi1偶联的S1P1受体的激动剂活性10倍以上的化合物，更优选选择高20倍以上的化合物，进一步优选选择高30倍以上的化合物。
此外，在本发明另一方式中，测定被测化合物对与Gαi1偶联的S1P1受体、与Gαi2偶联的S1P1受体和与Gαi3偶联的S1P1受体的激动剂活性，选择对与Gαi1偶联的S1P1受体的激动剂活性低于内源性激动剂S1P、且对与Gαi2偶联的S1P1受体和与Gαi3偶联的S1P1受体中的至少一者的激动剂活性高于内源性激动剂S1P的化合物。
作为对照的内源性激动剂S1P的激动剂活性可以在测定S1P1受体激动剂的激动剂活性时测定，也可以使用预先测定的值。例如，在利用本实施例1(2)中记载的方法(非专利文献7中记载的方法)进行测定的情况下，可以选择对与Gαi1偶联的S1P1受体的激动剂活性的EC50值(nM)高于261且对与Gαi2偶联的S1P1受体的激动剂活性的EC50值(nM)为14以下、或者对与Gαi3偶联的S1P1受体的激动剂活性的EC50值(nM)为8以下的化合物。考虑这样选择的化合物显示强的免疫抑制活性，而且心脏毒性低。
实施例
以下基于实施例对本发明进行更具体的说明，但是本发明不受以下的实施例限定。
[实施例1]S1P1受体激动剂免疫抑制活性评价
(1)普通的S1P1受体激动剂活性的评价
作为普通的评价S1P1受体激动剂活性的方法，已知使用表达S1P1受体的CHO细胞等，以对受体的结合、由结合产生的信号转导活性作为指标来测定激动剂活性的方法(专利文献1)。根据专利文献1的试验例1中记载的方法，测定了S1P、FTY-p、BAF312、欧洲专利第1826197号的example48(实施例48)中记载的化合物(以下称为“compound A(化合物A)”)和专利文献1-实施例2中记载的化合物(以下称为“compound B(化合物B)”)的S1P1受体激动剂活性。结果S1P1受体激动剂活性分别是6.4nM、0.08nM、3.0nM、0.3nM、9.2nM。
(2)Gα蛋白的亚型特异性的S1P1受体激动剂活性的评价
接着，根据非专利文献7中记载的方法，进行了Gα蛋白的亚型特异性的S1P1受体激动剂活性的评价。另外，表达条件依照非专利文献7的“Supplementary Methods(补充方法)”项，测定条件依照“Bioluminescence resonance energy transfer measurement(生物发光共振能量转移测定)”项。
首先，使HEK293T细胞共表达S1P1受体、特定的Gα亚型(Gαi1、Gαi2或Gαi3)、Gγ2和Gβ1，以由内源性激动剂S1P引起的Gα蛋白与Gβγ蛋白的分离率作为指标，测定了激动剂活性。其结果是，S1P的50％活化浓度(EC50值)在Gαi1表达条件下是261nM，在Gαi2表达条件下是14.6nM，在Gαi3表达条件下是8.4nM。
接着，在同一试验条件下，FTY-p、BAF312、compound A和compound B的EC50值在Gαi1表达条件下分别是17.6nM、122nM、98nM、640nM；在Gαi2表达条件下分别是约100nM、81nM、11nM、6nM；在Gαi3表达条件下分别是0.94nM、27nM、85nM、19nM(表1)。
表1
S1P1-Gαi1 S1P1-Gαi2 S1P1-Gαi3
S1P 261 14.6 8.4
FTY-p 17.6 100 0.94
BAF312 122 81 27
Compound A 98 11 85
Compound B 640 6 19
从该结果判明，FTY-p、BAF312和compound A对Gαi1的活性强，且对Gαi2、Gαi3的选择性低。另一方面判明，compound B对Gαi1的活性弱、对Gαi2和Gαi3的选择性高。可以说compound B是使在S1P显示的活性的偏向更加偏移的强的偏向激动剂(biased agonist)。
[实施例2]S1P1受体激动剂有效性评价
以不同的用量对雄性SD大鼠经口给予BAF312或compound B，利用血细胞测定装置测定3、6小时后和24小时后的血中淋巴细胞数。结果均是给予6小时后最强地抑制淋巴细胞数，直到24小时仍观察到其效果。
关于6小时后和24小时后的50％淋巴细胞数抑制用量(ED50)，BAF312分别是0.1mg/kg、>1mg/kg，compound B分别是0.17mg/kg、0.65mg/kg。计算出24小时后的有效血中浓度，结果BAF312是>208nM，compound B是176nM。
[实施例3]S1P1受体激动剂心脏毒性评价
使用显示与BAF312几乎同等的有效血中浓度的compound B，研究麻醉下豚鼠心脏毒性评价模型中的心脏毒性表达强度。本模型使用对S1P1受体的应答性高的豚鼠，并且是能够通过在麻醉下进行而强力地检测出S1P1受体依赖的心脏毒性的模型。对在麻醉下进行了人工呼吸管理的雄性豚鼠安装心电图测定用仪器和起搏用仪器，进行药剂给予。
其结果是，在10分钟输注给予0.01mg/kg的BAF312的情况下，4例中4例表达完全性AV传导阻滞，直到1小时后所有案例均持续完全性AV传导阻滞。
另一方面，在同样的条件下给予compound B的情况下，4例中1例都没有表达完全性AV传导阻滞。
此外，BAF312和compound B给药结束时的血中浓度分别是17nM、91nM，1小时后的血中浓度分别是<4nM、27nM。该事实表明，偏向活性更强的compound B虽然血中浓度更高，但是是更弱的心脏毒性化合物。
产业上的可利用性
根据本发明，能够将S1P1受体激动剂的主作用(有效性)和副作用区别开来进行评价，能够有效地筛选优异的S1P1受体激动剂。因此，本发明在药品的开发和评价领域能够作出大贡献。

Claims (9)

1.评价鞘氨醇-1-磷酸1受体激动剂的免疫抑制活性的强度的方法，
该方法以鞘氨醇-1-磷酸1受体激动剂对与抑制性Gα蛋白质2偶联的鞘氨醇-1-磷酸1受体和与抑制性Gα蛋白质3偶联的鞘氨醇-1-磷酸1受体中的至少一者的激动剂活性作为指标。
2.评价鞘氨醇-1-磷酸1受体激动剂的免疫抑制活性的强度的方法，
该方法包括测定鞘氨醇-1-磷酸1受体激动剂对与抑制性Gα蛋白质2偶联的鞘氨醇-1-磷酸1受体和与抑制性Gα蛋白质3偶联的鞘氨醇-1-磷酸1受体的激动剂活性的工序，
在鞘氨醇-1-磷酸1受体激动剂对与抑制性Gα蛋白质2偶联的鞘氨醇-1-磷酸1受体和与抑制性Gα蛋白质3偶联的鞘氨醇-1-磷酸1受体的激动剂活性高于对与抑制性Gα蛋白质1偶联的鞘氨醇-1-磷酸1受体的激动剂活性的情况下，评价为鞘氨醇-1-磷酸1受体激动剂能够发挥强的免疫抑制活性。
3.评价鞘氨醇-1-磷酸1受体激动剂的免疫抑制活性的强度的方法，
该方法包括测定鞘氨醇-1-磷酸1受体激动剂对与抑制性Gα蛋白质2偶联的鞘氨醇-1-磷酸1受体和与抑制性Gα蛋白质3偶联的鞘氨醇-1-磷酸1受体的激动剂活性的工序，
在鞘氨醇-1-磷酸1受体激动剂对与抑制性Gα蛋白质2偶联的鞘氨醇-1-磷酸1受体和与抑制性Gα蛋白质3偶联的鞘氨醇-1-磷酸1受体中的至少一者的激动剂活性高于内源性激动剂鞘氨醇-1-磷酸的情况下，评价为鞘氨醇-1-磷酸1受体激动剂能够发挥强的免疫抑制活性。
4.评价鞘氨醇-1-磷酸1受体激动剂产生心脏毒性的容易程度的方法，
该方法以鞘氨醇-1-磷酸1受体激动剂对与抑制性Gα蛋白质1偶联的鞘氨醇-1-磷酸1受体的激动剂活性作为指标。
5.评价鞘氨醇-1-磷酸1受体激动剂产生心脏毒性的容易程度的方法，
该方法包括测定鞘氨醇-1-磷酸1受体激动剂对与抑制性Gα蛋白质1偶联的鞘氨醇-1-磷酸1受体的激动剂活性的工序，
在鞘氨醇-1-磷酸1受体激动剂对与抑制性Gα蛋白质1偶联的鞘氨醇-1-磷酸1受体的激动剂活性低于对与抑制性Gα蛋白质2偶联的鞘氨醇-1-磷酸1受体和与抑制性Gα蛋白质3偶联的鞘氨醇-1-磷酸1受体的激动剂活性的情况下，评价为鞘氨醇-1-磷酸1受体激动剂不易产生心脏毒性。
6.评价鞘氨醇-1-磷酸1受体激动剂产生心脏毒性的容易程度的方法，
该方法包括测定鞘氨醇-1-磷酸1受体激动剂对与抑制性Gα蛋白质1偶联的鞘氨醇-1-磷酸1受体的激动剂活性的工序，
在鞘氨醇-1-磷酸1受体激动剂对与抑制性Gα蛋白质1偶联的鞘氨醇-1-磷酸1受体的激动剂活性低于内源性激动剂鞘氨醇-1-磷酸的情况下，评价为鞘氨醇-1-磷酸1受体激动剂不易产生心脏毒性。
7.鞘氨醇-1-磷酸1受体激动剂的筛选方法，
该方法包括：
工序(a)，测定被测化合物对与抑制性Gα蛋白质1偶联的鞘氨醇-1-磷酸1受体、与抑制性Gα蛋白质2偶联的鞘氨醇-1-磷酸1受体和与抑制性Gα蛋白质3偶联的鞘氨醇-1-磷酸1受体的激动剂活性，以及
工序(b)，选择对与抑制性Gα蛋白质2偶联的鞘氨醇-1-磷酸1受体和与抑制性Gα蛋白质3偶联的鞘氨醇-1-磷酸1受体的激动剂活性高于对与抑制性Gα蛋白质1偶联的鞘氨醇-1-磷酸1受体的激动剂活性的化合物。
8.根据权利要求7所述的方法，在工序(b)中，选择对与抑制性Gα蛋白质2偶联的鞘氨醇-1-磷酸1受体和与抑制性Gα蛋白质3偶联的鞘氨醇-1-磷酸1受体的激动剂活性比对与抑制性Gα蛋白质1偶联的鞘氨醇-1-磷酸1受体的激动剂活性高30倍以上的化合物。
9.鞘氨醇-1-磷酸1受体激动剂的筛选方法，
该方法包括：
工序(a)，测定被测化合物对与抑制性Gα蛋白质1偶联的鞘氨醇-1-磷酸1受体、与抑制性Gα蛋白质2偶联的鞘氨醇-1-磷酸1受体和与抑制性Gα蛋白质3偶联的鞘氨醇-1-磷酸1受体的激动剂活性，以及
工序(b)，选择对与抑制性Gα蛋白质1偶联的鞘氨醇-1-磷酸1受体的激动剂活性低于内源性激动剂鞘氨醇-1-磷酸、且对与抑制性Gα蛋白质2偶联的鞘氨醇-1-磷酸1受体和与抑制性Gα蛋白质3偶联的鞘氨醇-1-磷酸1受体中的至少一者的激动剂活性高于内源性激动剂鞘氨醇-1-磷酸的化合物。
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