JP2003204796A - Non-human gene-modified animal and utilization thereof - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、神経伝達物質の輸
送に関連するタンパク質、あるいはペブチド性神経伝達
物質をコードする遺伝子の発現制御領域と、その制御下
におかれるように連結された蛍光タンパク質をコードす
る遺伝子を含むＤＮＡ、それを導入した非ヒト哺乳動
物、およびその利用に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to an expression control region of a protein associated with transport of a neurotransmitter, or a gene encoding a peptide peptide neurotransmitter, and a fluorescent protein linked so as to be placed under the control. The present invention relates to a DNA containing a gene coding for, a non-human mammal introduced with the DNA, and use thereof.
【０００２】[0002]
【従来の技術】脊椎動物の神経系は、神経細胞、及びグ
リア細胞から構成されている。これらはいずれも神経幹
細胞より分化してくるものと考えられている。このう
ち、神経細胞は細胞体並びに樹状突起と軸策の２種の突
起からなる細胞であり、その機能としては、他の神経細
胞や刺激受容細胞からの刺激を受け、この刺激を統合し
た後に軸策に伝達し、軸策末端の神経終末にあるシナプ
スを介して他の神経細胞や筋あるいは腺細胞などのシナ
プス後細胞に伝達することが挙げられる。神経細胞が伝
達する刺激はシナプス後細胞を興奮させるものと、興奮
を抑制するものに分けられる。シナプス後細胞が有する
細胞膜（シナプス後膜）は、ある一定以上の刺激を受け
ると脱分極性のシナプス反応（興奮性シナプス電位（Ｅ
ＰＳＰ：excitatorypostsynaptic potential））を起こ
し、シナプス後細胞に興奮が伝達される。このような刺
激をシナプス後細胞に伝達する神経細胞を興奮性神経細
胞という。また、逆にシナプス後細胞の興奮を抑制する
働きを有するものを抑制性神経細胞といい、抑制性神経
細胞がシナプス後膜に作用して誘導する電位を抑制性シ
ナプス電位（ＩＰＳＰ：inhibitory postsynaptic pote
ntial)という。代表的な興奮性神経細胞としては、大脳
皮質運動野の錐体細胞や脊髄の運動ニューロンなどが知
られており、抑制性神経細胞としては海馬のバスケット
細胞、小脳皮質のプルキンエ細胞や脊髄のレンショウ細
胞などが知られている。BACKGROUND OF THE INVENTION The vertebrate nervous system is composed of nerve cells and glial cells. All of these are considered to be differentiated from neural stem cells. Among them, nerve cells are cells consisting of a cell body and two types of processes of dendrites and axons, and their function is to receive stimulation from other nerve cells and stimulus-receptive cells and integrate these stimuli. It may be later transmitted to axons, and transmitted to post-synaptic cells such as other nerve cells and muscles or glandular cells via synapses at nerve endings at the ends of axons. The stimuli transmitted by nerve cells are classified into those that excite postsynaptic cells and those that suppress excitation. The cell membrane of post-synaptic cells (postsynaptic membrane) receives a definite stimulus, and depolarizes the synaptic reaction (excitatory synaptic potential (E).
PSP: excitatorypostsynaptic potential)) and excitement is transmitted to postsynaptic cells. A nerve cell that transmits such a stimulus to a postsynaptic cell is called an excitatory nerve cell. On the contrary, what has a function of suppressing the excitation of postsynaptic cells is called an inhibitory neuron, and the potential induced by an inhibitory neuron acting on the postsynaptic membrane is called an inhibitory synaptic potential (IPSP).
ntial). Typical examples of excitatory neurons include pyramidal cells in the motor cortex of the cortex and motor neurons of the spinal cord, and examples of inhibitory neurons include basket cells of the hippocampus, Purkinje cells of the cerebellar cortex and Renshaw of the spinal cord. Cells etc. are known.
【０００３】これらの神経細胞による神経伝達はいずれ
もシナプスを介して行われ、そのシナプスは刺激を伝達
する手段によって電気シナプスと化学的なシナプスに分
けられる。このうち大部分は神経伝達物質により刺激を
伝達する化学シナプスである。前終末部シナプスには多
数のシナプス小胞が存在し、神経伝達物質による化学伝
達を可能にするための特殊な装置としての役割を果たし
ている。このうちシナプス小胞から細胞外（シナプス間
隙）へ上記した神経伝達物質と呼ばれる物質を分泌する
ことにより、シブプス後膜に電位変化を誘導している。
抑制性神経細胞が有する抑制性シナプスから放出される
神経伝達物質（以下、これを「抑制性神経伝達物質」と
称することがある。）としては、γ−アミノ酪酸（ＧＡ
ＢＡ)、グリシンなどがあり、また興奮性神経細胞が有
する興奮性シナプスから放出される神経伝達物質（以
下、これを「興奮性神経伝達物質」と称することがあ
る。）としては、グルタミン酸などがある。Neurotransmission by these nerve cells is carried out via synapses, and the synapses are divided into electrical synapses and chemical synapses by means of transmitting stimuli. Most of these are chemical synapses that transmit stimuli by neurotransmitters. A large number of synaptic vesicles are present in the anterior terminal synapse, and they play a role as a special device for enabling chemical transmission by neurotransmitters. Among them, the above-mentioned substance called neurotransmitter is secreted from the synaptic vesicles to the outside of the cell (synaptic space), thereby inducing a potential change in the posterior membrane of the sibbs.
As a neurotransmitter released from an inhibitory synapse of an inhibitory nerve cell (hereinafter, this may be referred to as “inhibitory neurotransmitter”), γ-aminobutyric acid (GA
BA), glycine, etc., and as a neurotransmitter released from excitatory synapses of excitatory nerve cells (hereinafter, this may be referred to as “excitatory neurotransmitter”), glutamic acid, etc. is there.
【０００４】上記した機能の異なる中枢神経系の神経細
胞は、様々な情報を伝達するために複雑に連関して相互
作用しており、その相互作用や動態などを解析すること
は様々な脳機能のメカニズムを明らかにするために必須
である。このような目的を達成するため、これまで中枢
神経系における興奮性及び抑制性神経細胞の分別、同定
方法が試みられてきた。具体的な分別方法としては、例
えば、神経細胞に特異的なマーカーで染色する方法など
が挙げられる。しかし、この方法は抗体などのマーカー
による染色を行うために組織を固定する必要があり、
生体の神経細胞の活動をリアルタイムで解析することは
できなかった。一方、生体内タンパク質をリアルタイム
で観察する方法としては、目的のタンパク質を蛍光タン
パク質との融合タンパク質として生体内で発現させる方
法などが開発されている（以下、これを「蛍光バイオイ
メージング法」と称することがある。）。しかし、神経
伝達物質のうち一部がペブチド性伝達物質であるに過ぎ
ず、また神経伝達物質はシナプス部位に局在しており神
経細胞全体に広く分布するものではないこと等の理由か
ら、現在までに蛍光タンパク質を用いて興奮性、及び抑
制性神経細胞を生体において分離可視化した例はない。The nerve cells of the central nervous system having different functions described above interact in a complex and linked manner to transmit various information, and it is necessary to analyze the interaction and dynamics of various brain functions. Is essential to clarify the mechanism of. In order to achieve such an object, methods for separating and identifying excitatory and inhibitory neurons in the central nervous system have been attempted so far. Specific examples of the sorting method include a method of staining with a nerve cell-specific marker. However, this method requires fixing the tissue in order to perform staining with a marker such as an antibody,
It was not possible to analyze the activity of living nerve cells in real time. On the other hand, as a method for observing a protein in a living body in real time, a method for expressing a target protein in a living body as a fusion protein with a fluorescent protein has been developed (hereinafter, referred to as “fluorescent bioimaging method”). Sometimes.). However, some of the neurotransmitters are only peptidic transmitters, and the neurotransmitters are localized at synaptic sites and not widely distributed in nerve cells. Up to now, there is no example in which excitatory and inhibitory nerve cells are separately visualized in a living body by using a fluorescent protein.
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、神経細胞お
よびシナプスをその機能に応じて分離可視化する方法、
並びにそのための遺伝子改変動物に関する。より詳細に
は、神経伝達物質の輸送に関連するタンパク質、あるい
はペプチド性神経伝達物質をコードする遺伝子の発現制
御領域と、その制御下におかれるように連結された蛍光
タンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡを動物に導
入し、該動物の神経細胞中に発現している蛍光量を指標
として、該神経細胞が抑制性か興奮性かを同定する方法
を提供することを目的としてなされたものである。The present invention provides a method for separating and visualizing nerve cells and synapses according to their functions,
And a genetically modified animal therefor. More specifically, it includes a gene encoding a protein associated with neurotransmitter transport, or an expression control region of a gene encoding a peptide neurotransmitter, and a gene encoding a fluorescent protein linked so as to be under the control. The object of the present invention is to provide a method of introducing DNA into an animal and using the amount of fluorescence expressed in the nerve cells of the animal as an index to identify whether the nerve cell is inhibitory or excitatory. .
【０００６】[0006]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意検討した結果、発現制御領域を含む小
胞性ＧＡＢＡ／グリシントランスポーター遺伝子と、緑
色蛍光タンパク質遺伝子を、両タンパク質が融合タンパ
ク質となるように結合したＤＮＡを導入したトランスジ
ェニックマウスを作製し、該マウスの脳組織、あるいは
未固定の脳組織切片において緑色蛍光タンパク質を発現
している細胞を観察したところ、小胞性ＧＡＢＡ／グリ
シントランスポーター抗体により染色された細胞と一致
し、抑制性神経細胞全体を興奮性神経細胞と区別して可
視化することができることを見出した。本発明はこれら
の知見に基づいて成されたものである。Means for Solving the Problems As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have found that both proteins have a vesicular GABA / glycine transporter gene containing an expression control region and a green fluorescent protein gene. A transgenic mouse into which a DNA bound so as to form a fusion protein was introduced was prepared, and cells expressing green fluorescent protein were observed in the brain tissue of the mouse or an unfixed brain tissue section. It was found that the whole inhibitory neurons can be visualized separately from the excitatory neurons, which is consistent with the cells stained with the / glycine transporter antibody. The present invention was made based on these findings.
【０００７】すなわち本発明によれば、次の１〜１５が
提供される。
１．神経伝達物質の輸送に関連するタンパク質、又はペ
プチド性神経伝達物質をコードする遺伝子の発現制御領
域と、その制御下におかれるように連結された蛍光タン
パク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ。
２．蛍光タンパク質をコードする遺伝子が、神経伝達物
質の輸送に関連するタンパク質、又はペブチド性神経伝
達物質と融合タンパク質となるように連結されているも
のである前記１に記載のＤＮＡ。
３．神経伝達物質が、抑制性神経細胞特異的なものであ
る前記１または２に記載のＤＮＡ。
４．神経伝達物質が、興奮性神経細胞特異的なものであ
る前記１または２に記載のＤＮＡ。
５．神経伝達物質が、ＧＡＢＡ又はグリシンであり、該
物質の輸送に関連するタンパク質が、小胞性ＧＡＢＡ／
グリシントランスポーター、ＧＡＢＡトランスポータ
ー、又はグリシントランスポーターである前記３に記載
のＤＮＡ。
６．神経伝達物質が、グルタミン酸であり、該物質の輸
送に関連するタンパク質が、グルタミン酸トランスポー
ターである前記４に記載のＤＮＡ。
７．前記１〜６のいずれかに記載のＤＮＡを導入した非
ヒト遺伝子改変動物。
８．前記１〜６のいずれかに記載のＤＮＡが、宿主細胞
の染色体上の同じ神経伝達物質あるいはその輸送に関連
するタンパク質をコードする遺伝子と相同組換えによっ
て置換されることにより導入されている前記７に記載の
動物。
９．動物が、げつ歯類に属するものである前記７または
８に記載の動物。
１０．動物が、マウスである前記９に記載の動物。
１１．前記７〜１０のいずれかに記載の動物、あるいは
該動物から得られる神経組織について、その神経細胞、
あるいはシナプス中に発現している蛍光タンパク質量を
指標とし、該神経細胞又はシナプスが抑制性又は興奮性
のいずれであるかを同定することを特徴とする神経機能
解析法。
１２．前記７〜１０のいずれかに記載の動物、あるいは
該動物から得られる神経組織に被検物質を添加し、その
神経細胞、あるいはシナプスに発現している蛍光タンパ
ク質量を指標とし、抑制性又は興奮性神経細胞からの神
経伝達を制御する活性を有する物質を選抜することを特
徴とする神経伝達調節薬のスクリーニング方法。
１３．前記７〜１０のいずれかに記載の動物、あるいは
該動物から得られる生体試料に被検物質を添加し、その
神経細胞、あるいはシナプスに現れる変化を解析し、抑
制性又は興奮性神経細胞からの神経伝達を制御する活性
を有する物質を選抜することを特徴とする神経伝達調節
薬のスクリーニング法。
１４．前記１２または１３に記載の方法により選抜され
た物質を有効成分とする神経伝達調節薬。
１５．前記１２または１３に記載の方法により選抜され
た物質を製剤化することを特徴とする神経伝達調節剤の
製造方法。That is, according to the present invention, the following 1 to 15 are provided. 1. A DNA comprising a protein associated with transport of a neurotransmitter or an expression control region of a gene encoding a peptide neurotransmitter, and a gene encoding a fluorescent protein linked so as to be placed under the control. 2. The DNA according to 1 above, wherein the gene encoding the fluorescent protein is linked so as to be a protein associated with transport of a neurotransmitter, or a fusion protein with a peptide neurotransmitter. 3. 3. The DNA according to 1 or 2 above, wherein the neurotransmitter is specific to inhibitory nerve cells. 4. 3. The DNA according to 1 or 2 above, wherein the neurotransmitter is excitatory neuron-specific. 5. The neurotransmitter is GABA or glycine, and the protein involved in the transport of the substance is vesicular GABA /
The DNA according to 3 above, which is a glycine transporter, a GABA transporter, or a glycine transporter. 6. 5. The DNA according to 4 above, wherein the neurotransmitter is glutamic acid, and the protein involved in the transport of the substance is a glutamate transporter. 7. A non-human genetically modified animal into which the DNA according to any one of 1 to 6 above is introduced. 8. 7. The DNA according to any one of 1 to 6 above, which is introduced by substitution by homologous recombination with a gene encoding the same neurotransmitter on the chromosome of the host cell or a protein related to its transport. The animal described in. 9. 9. The animal according to 7 or 8 above, wherein the animal belongs to rodents. 10. 10. The animal according to 9 above, wherein the animal is a mouse. 11. The animal according to any one of 7 to 10 above, or a nerve cell obtained from the nerve tissue obtained from the animal,
Alternatively, a method for analyzing a neural function, characterized by identifying whether the nerve cell or synapse is inhibitory or excitatory using the amount of fluorescent protein expressed in the synapse as an index. 12. A test substance is added to the animal according to any one of 7 to 10 above or a nerve tissue obtained from the animal, and the amount of fluorescent protein expressed in the nerve cell or synapse is used as an index, and the inhibitory or excitatory property is obtained. A method for screening a neurotransmission regulator, which comprises selecting a substance having an activity of controlling neurotransmission from a sex nerve cell. 13. The test substance is added to the animal according to any one of 7 to 10 above, or a biological sample obtained from the animal, and the change appearing in the nerve cell or synapse is analyzed to determine whether the inhibitory or excitatory nerve cell is used. A screening method for a neurotransmission regulator, which comprises selecting a substance having an activity of controlling neurotransmission. 14. A neurotransmission regulator comprising a substance selected by the method according to 12 or 13 as an active ingredient. 15. 14. A method for producing a neurotransmission regulator, which comprises formulating a substance selected by the method described in 12 or 13 above.
【０００８】（１）神経伝達物質の輸送に関連するタン
パク質、あるいはペプチド性神経伝達物質をコードする
遺伝子の発現制御領城
本発明に用いられる神経伝達物質の輸送に関連するタン
パク質とは、興奮性、あるいは抑制性神経細胞に特異的
に存在する神経伝達物質と挙動を共にするものであれば
如何なるものであってもよいが、具体的には、該物質の
細胞内外での輸送を担うタンパク質（以下、これを「ト
ランスポーター」と称することがある。）が好ましく用
いられる。トランスポーターはそれが輸送する神経伝達
物質に対して特異的に作用するものであるので、興奮
性、あるいは抑制性神経細胞に特異的な神経伝達物質の
トランスポーターは上記神経細胞、およびシナプスに特
異的に存在している。また、トランスポーターは神経伝
達物質の合成、あるいは分解酵素などに比べて神経細
胞、およびシナプス全体に広く分布しているため、神経
細胞などのイメージングを行うための標識のターゲット
としては好適である。本発明のトランスポーターは、神
経伝達物質の神経細胞、およびシナプス内での輸送を行
っているもの（以下、これを「小胞性神経伝達物質トラ
ンスポーター」と称することがある。）、神経伝達物質
のシナプス内への再取り込みを行っているもののいずれ
も含むものである。抑制性神経伝達物質トランスポータ
ーとして具体的には、例えば、小胞性ＧＡＢＡ／グリシ
ントランスポーター（Vesicular GABA/glycine transpo
rter：以下、これを「ＶＧＡＴ」と称することがあ
る。）、ＧＡＢＡトランスポーター、およびグリシント
ランスポーターなどが挙げられる。また、興奮性神経伝
達物質トランスポーターとしては、グルタミン酸トラン
スポーター、脳特異的ナトリウム依存性無機リン酸コト
ランスポーター Ｉ（Brain-specific Na＋-dependent
inorganic phosphate co-transporter I（ＢＮＰ
Ｉ））などが挙げられる。(1) Proteins related to transport of neurotransmitters or expression control of genes encoding peptide neurotransmitters Proteins related to transport of neurotransmitters used in the present invention are excitability. Alternatively, any compound may be used as long as it behaves together with a neurotransmitter specifically present in inhibitory nerve cells, and specifically, a protein responsible for transporting the substance inside and outside the cell ( Hereinafter, this may be referred to as "transporter".) Is preferably used. Since the transporter acts specifically on the neurotransmitter that it transports, the neurotransmitter transporter specific to excitatory or inhibitory nerve cells is specific to the nerve cells and synapses. Exist in the world. In addition, since the transporter is widely distributed in nerve cells and the whole synapse as compared with neurotransmitter synthesis or degrading enzymes, it is suitable as a target for labeling for imaging nerve cells and the like. The transporter of the present invention transports neurotransmitters in nerve cells and synapses (hereinafter, this may be referred to as “vesicular neurotransmitter transporter”), neurotransmitters. It includes any of those that are re-uptake into the synapse. Specific examples of the inhibitory neurotransmitter transporter include, for example, vesicular GABA / glycine transporter (Vesicular GABA / glycine transporter).
rter: Hereinafter, this may be referred to as “VGAT”. ), GABA transporters, and glycine transporters. Excitatory neurotransmitter transporters include glutamate transporter, brain-specific sodium-dependent inorganic phosphate cotransporter I (Brain-specific Na + -dependent).
inorganic phosphate co-transporter I (BNP
I)) and the like.
【０００９】本発明においては、ペブチド性神経伝達物
質も抑制性、あるいは興奮性神経細胞またはシナプスに
特異的なものを用いることができる。ここで、ベプチド
性とは、該ボリペプチドをコードするＤＮＡにより生合
成されているものを意味する。興奮性神経細胞特異的に
存在するものとして、具体的には、サプスタンスＰ等の
タキキニン類等が挙げられ、また抑制性神経細胞特異的
に存在するものとしては、オピオイドペプチドやソマト
スタチン等が挙げられる。本発明の導入ＤＮＡにおける
このようなトランスポーター、あるいはペブチド性神経
伝達物質をコードする遺伝子の発現制御領域（以下、こ
れを単に「発現制御領域」と称することがある。）と
は、これを宿主細胞に導入した場合、その遺伝子の形質
発現に影響を及ぼす領域を意味する。具体的には、プロ
モーター、エンハンサー領域等が挙げられる。本発明の
発現制御領域は、該遺伝子のプロモーター等発現制御領
域のみのＤＮＡ断片を用いることも可能であるが、生体
内のトランスポーターやペプチド性神経伝達物質の発現
や動態を該発現制御領域を導入するインピトロ系におい
て再現するために、該発現制御領域を含むゲノムＤＮＡ
を用いることが好ましい。このような領域のＤＮＡ（以
下、これを「発現制御領域ＤＮＡ」と称することがあ
る。）を取得するには、ＢＡＣ、ＹＡＣ等のゲノムライ
ブラリー等からそれ自体既知の通常用いられる方法によ
り該遺伝子を有するクローンを選抜し、該遺伝子の翻訳
領域（以下、これを「ＯＲＦ」と称することがある。）
の上流２〜２０ｋｂ程度を、制限酵素等により切断して
得るか、あるいはポリメラーゼチェインリアクション
（ＰＣＲ）等により取得する方法等が挙げられる。この
ようなＤＮＡの由来は、これを導入する宿主と同種のも
のが好ましいが、宿主細胞内で導入されたＤＮＡが機能
できるものであればこれに限られるものではない。ま
た、発現制御領域を含むゲノムＤＮＡ断片の長さは、遺
伝子によりそれぞれ異なるものであるので、適当な長さ
のＤＮＡを取得して、これの発現制御活性を後述の方法
により解析することにより決定することができる。取得
したＤＮＡ断片がこれを導入する宿主体内で発現制御領
域として活性を有するか否かは、取得したＤＮＡ断片の
３’下流側にルシフェラーゼ等のリポータ遺伝子ＤＮＡ
を結合し、これを導入する細胞、またはこれと近似の適
当な細胞等に導入した後に、該細胞内で発現しているリ
ポーター遺伝子ＤＮＡがコードするタンパク質の量を解
析することにより確認することができる。In the present invention, peptidic neurotransmitters may also be those which are inhibitory or excitatory nerve cells or synapses specific. Here, the peptide property means that it is biosynthesized by the DNA encoding the polypeptide. Specific examples of excitatory nerve cell-specific ones include tachykinins such as Supstance P, and examples of inhibitory nerve cell-specific ones include opioid peptides and somatostatin. . The expression control region of a gene encoding such a transporter or a peptidic neurotransmitter in the introduced DNA of the present invention (hereinafter, may be simply referred to as “expression control region”) is a host. When introduced into a cell, it means a region that affects the expression of the gene. Specific examples include promoters and enhancer regions. As the expression control region of the present invention, a DNA fragment having only the expression control region such as the promoter of the gene can be used, but the expression and kinetics of in vivo transporters and peptide neurotransmitters can be controlled by the expression control region. Genomic DNA containing the expression control region for reproduction in the introduced in vitro system
Is preferably used. In order to obtain the DNA of such a region (hereinafter, this may be referred to as “expression control region DNA”), it can be obtained by a commonly used method known per se from genomic libraries such as BAC and YAC. A clone having a gene is selected and the translation region of the gene (hereinafter, this may be referred to as "ORF").
A method of obtaining about 2 to 20 kb upstream of the enzyme by cutting with a restriction enzyme or the like, or obtaining by polymerase chain reaction (PCR) or the like can be mentioned. The origin of such DNA is preferably the same as that of the host into which it is introduced, but is not limited to this as long as the introduced DNA can function in the host cell. The length of the genomic DNA fragment containing the expression control region varies depending on the gene, so it is determined by obtaining a DNA of an appropriate length and analyzing the expression control activity of this by the method described below. can do. Whether the obtained DNA fragment has activity as an expression control region in the host body into which it is introduced depends on whether the reporter gene DNA such as luciferase is located 3 ′ downstream of the obtained DNA fragment.
Can be confirmed by analyzing the amount of the protein encoded by the reporter gene DNA expressed in the cells after binding to the cells, introducing into cells into which the cells are to be introduced, or into an appropriate cell similar thereto. it can.
【００１０】（２）導入ＤＮＡの作製
本発明の発現制御領域ＤＮＡ断片に蛍光タンパク質をコ
ードする遺伝子（以下、これを「蛍光タンパク質遺伝子
｜と称することがある。）が、該発現制御領域の制御下
におかれるように結合したＤＮＡ（本明細書中では、こ
れを「導入ＤＮＡ」と称することがある。）は、これを
適当な宿主に導入することにより、該宿主内で該発現制
御領域の活性化により発現したタンパク質の存在を生体
において観察することができるようなモデル系を作製す
ることができる。蛍光タンパク質としては、観察可能な
蛍光を発するものであれば如何なるものであってもよい
が、生体において特に基質等を加えなくても自家発光を
呈するものがより好ましい。具体的には、緑色蛍光タン
パク質（以下、これを「ＧＦＰ」と称することがある。
例えば、オワンクラゲのＧＦＰについては、Prasher,D.
C.,et al., Gene, 111, 229-233 (1992) 参照）等が挙
げられる。これらの蛍光タンパク質遺伝子を含むＤＮＡ
断片は、ＰＣＲ等で増幅して取得することもできるし、
市販のものを用いることもできる。本発明の蛍光タンパ
ク質遺伝子は上記（１）に記載した神経伝達物質の輸送
に関連するタンパク質、あるいはペプチド性神経伝達物
質をコードする遺伝子の発現制御領域を含むＤＮＡの
３’下流側に通常の方法を用いて結合する。このとき、
上記発現制御領域ＤＮＡと蛍光タンパク質遺伝子ＤＮＡ
との間には、発現制御領域の固有の遺伝子ＤＮＡが挿入
されてもよい。この場合、固有の遺伝子ＤＮＡと蛍光タ
ンパク質遺伝子ＤＮＡは、お互いの読みとり枠（トリプ
レットコドン）がずれないように結合する。ここで、固
有の遺伝子を含むＤＮＡは、ｃＤＮＡライブラリー等か
らＰＣＲ等の方法により取得したｃＤＮＡでもよいし、
ゲノムライプラリー等から取得したゲノムＤＮＡでもよ
い。また、蛍光グンパク質遺伝子の３’下流側にはター
ミネーター等、転写、翻訳に必要な領域を連結させるこ
とが好ましい。転写、翻訳に必要な領域を全て有してい
る断片としては、目的とする発現制御領域、固有のＯＲ
Ｆ、ターミネーター等を含むゲノムＤＮＡが最も好まし
い。このゲノムＤＮＡを用いた本発明の導入ＤＮＡの作
製方法としては、該ゲノムＤＮＡを適当なゲノムＤＮＡ
ライブラリーから取得し、このＤＮＡの適当な位置に蛍
光タンパク質遺伝子ＤＮＡを挿入する方法が挙げられ
る。蛍光タンパク質ＤＮＡを挿入する位置としては、発
現制御領域の３’下流側で、固有のＯＲＦのスタートコ
ドンの５’上流側か、または固有のＯＲＦの途中の読み
取り枠がずれない位置等が挙げられる。このような導入
ＤＮＡとしては、例えば図１に示すものが挙げられる。(2) Preparation of introduced DNA A gene encoding a fluorescent protein in the expression control region DNA fragment of the present invention (hereinafter, this may be referred to as "fluorescent protein gene |") controls the expression control region. The DNA bound as described below (which may be referred to as “introduced DNA” in the present specification) may be obtained by introducing the DNA into an appropriate host to express the expression control region in the host. It is possible to prepare a model system in which the presence of the protein expressed by the activation of can be observed in the living body. Any fluorescent protein may be used as long as it emits observable fluorescence, but it is more preferable that it emits autoluminescence in the living body without adding a substrate or the like. Specifically, green fluorescent protein (hereinafter, this may be referred to as “GFP”).
For example, regarding the GFP of Owan jellyfish, Prasher, D.
C., et al., Gene, 111, 229-233 (1992)) and the like. DNA containing these fluorescent protein genes
The fragment can be obtained by amplification by PCR or the like,
A commercially available product can also be used. The fluorescent protein gene of the present invention can be obtained by the usual method on the 3'downstream side of the DNA containing the expression control region of the protein related to the neurotransmitter transport described in (1) above or the gene encoding the peptide neurotransmitter. To bind. At this time,
Expression control region DNA and fluorescent protein gene DNA
A gene DNA unique to the expression control region may be inserted between and. In this case, the unique gene DNA and the fluorescent protein gene DNA are bound so that their reading frames (triplet codons) do not shift. Here, the DNA containing the unique gene may be cDNA obtained by a method such as PCR from a cDNA library or the like,
It may be a genomic DNA obtained from genomic library. Further, it is preferable to connect a region necessary for transcription and translation, such as a terminator, to the 3'downstream side of the fluorescent cancer protein gene. As a fragment having all the regions necessary for transcription and translation, a target expression control region and a unique OR
Genomic DNA containing F, terminator and the like is most preferable. The method for producing the introduced DNA of the present invention using this genomic DNA is as follows:
Examples include a method of obtaining a fluorescent protein gene DNA from a library and inserting the fluorescent protein gene DNA into an appropriate position of this DNA. Examples of the position for inserting the fluorescent protein DNA include a position 3 ′ downstream of the expression control region, 5 ′ upstream of the start codon of the unique ORF, or a position where the reading frame in the middle of the unique ORF is not displaced. . Examples of such introduced DNA include those shown in FIG.
【００１１】（３）非ヒト遺伝子改変動物の作製
かくして調製される導入ＤＮＡを、ヒト以外の動物生殖
細胞に導入して遺伝子改変動物細胞を作製し、さらにこ
れを発生させることによりヒト以外の遺伝子改変動物を
作製することができる。上記（２）に記載した導入ＤＮ
Ａの宿主への導入方法としては、該導入ＤＮＡが宿主が
有するゲノムＤＮＡの不特定の位置に複数コピー挿入さ
れる方法（以下、これを「トランスジーン法」と称する
ことがある。）と、宿主のゲノム中に存在する導入ＤＮ
Ａに含まれる遺伝子の相同体と入れ替わるように導入す
る方法（以下これを、「ノックイン法」と称することが
ある。）が挙げられる。以下に各々の方法についてその
導入方法を詳細に説明する。(3) Preparation of non-human gene-modified animal The introduced DNA thus prepared is introduced into a non-human germ cell to prepare a genetically-modified animal cell, and the gene is transformed into a non-human gene. Modified animals can be produced. Introduction DN described in (2) above
As a method of introducing A into the host, a method in which a plurality of copies of the introduced DNA are inserted at an unspecified position in the genomic DNA of the host (hereinafter, this may be referred to as "transgene method"), Introduced DN present in the genome of the host
Examples thereof include a method of introducing so as to replace the homologue of the gene contained in A (hereinafter, this may be referred to as “knock-in method”). The introduction method of each method will be described in detail below.
【００１２】（３−１） トランスジーン法による遺伝
子改変動物の作製
本発明で用いるヒト以外の動物生殖細胞は、これらに前
記した導入ＤＮＡを導入して発生・成育させることによ
り、発現制御領域の活性により蛍光タンパク質遣伝子を
発現するヒト以外の遺伝子改変動物を作製できるもので
あれば、如何なるものでもよい。ここで、ヒト以外の動
物としては哺乳動物が好ましく、例えば、マウス、ラッ
ト、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ブタ、イ
ヌ、ネコ等が挙げられる。これらの中で、マウス、ラッ
ト、モルモット等のげっ歯類が好ましく、マウスがより
好ましい。動物生殖細胞としては、卵割前の受精卵が好
ましく用いられる。このような受精卵は、ヒト以外の動
物の雄と雌を交配させることによって得られる。受精卵
は、自然交配によっても得られるが、動物の雌の性周期
を人工的に調節した後、雄と交配させる方法が好まし
い。動物の雌の性周期を人工的に調節する方法として
は、例えば、初めに卵胞刺激ホルモン（妊馬血清性性腺
刺激ホルモン；ＰＭＳＧ）、次いで黄体形成ホルモン
（ヒト繊毛性性腺刺激ホルモン；ｈＣＧ）を、例えば腹
腔注射等により投与する方法が挙げられる。これらのホ
ルモンの投与量、投与間隔等は、該動物の種類により適
宜決定すればよい。上記の通り動物の雌にホルモン投与
を行って過剰排卵させ、交配後１日目の卵管から摘出す
ること等によって受精卵を得ることができる。得られた
受精卵は、上記（２）に記載した導入ＤＮＡをマイクロ
インジェクション法等により注入して、動物の雌の輸卵
管に人工的に移植、着床させて出産させることにより、
遺伝子改変動物（トランスジェニック動物）を得ること
ができる。また、動物の雌に黄体形成ホルモン放出ホル
モン（ＬＨＲＨ）あるいはその類縁体を投与した後に、
動物の雄と交配させて、受精能を誘起させた偽妊娠雌動
物を作製し、得られた偽妊娠雌動物に受精卵を人工的に
移植、着床する方法も好ましい。ＬＨＲＨあるいはその
類縁体の投与量等は、ヒト以外の動物の種類によりそれ
ぞれ異なる。さらに、上記のヒト以外の動物の雌の性周
期を人工的に調節して受精卵を取得する方法と、受精能
を誘起させた偽妊娠雌動物にこの受精卵を人工的に移植
・着床させる方法とを、組み合わせて用いるのが好まし
い。上記（２）に記載の導入ＤＮＡが導入されたヒト以
外の動物生殖細胞を用いて本発明のヒト以外の遺伝子改
変動物を作製する方法を、マウス受精卵を用いてトラン
スジェニックマウス（以下、これを単に「トランスジェ
ニックマウス」と称することがある。）を作製する場合
を例に挙げてより具体的に説明する。まず、採卵用の雌
マウスに卵胞刺激ホルモン（妊馬血清性性腺刺激ホルモ
ン；ＰＭＳＧ）及び黄体形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺
刺激ホルモン；ｈＣＧ）を投与して過剰排卵させ、雄マ
ウスと交配して、膣栓確認後に卵管から受精卵を採取す
る。得られた受精卵の雄性前核に前記導入ＤＮＡをマイ
クロインジェクション法等により導入して、得られる卵
細胞をWhitten'sの培地等で培養した後、偽妊娠させた
雌マウスの輸卵管に移植して被移植動物を飼育し、出産
させる。生まれた仔マウスから蛍光タンパク質遺伝子を
発現した仔マウスを選択することにより、本発明のトラ
ンスジェニックマウスを得ることができる。上記マウス
の受精卵としては、例えば、Ｃ５７ＢＬ／６、１２９／
ｓｖ、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ３Ｈ、ＳＪＬ／Ｗｔ等に由来す
るマウスの交配により得られるものを用いることができ
るが、前核段階で細胞質内において雄性前核と雌性前核
が独立したときに識別が可能であること、受精卵を多く
採取できること、また、マイクロインジェクション操作
に好適で産仔の発生率が高いことなどから、Ｃ５７ＢＬ
／６（Ｂ６）系マウス同士の交配によって得られるマウ
スの受精卵を用いるのが好ましい。また、導入ＤＮＡの
量は１００〜３，０００コピーが適当であり、導入ＤＮ
Ａの導入方法としては、マイクロインジェクション法や
エレクトロポレーション法等の通常用いられる方法を挙
げることができる。ここで、上記導入ＤＮＡが導入され
た仔マウスの選択は、マウスの尾の先を切り取って、高
分子ＤＮＡ抽出法（発生工学実験マニュアル、野村達次
監修・勝木元也編、講談社（１９８７））又はDNAeasy
Tissue Kit（QIAGEN社製）等の市販のキットを用いるこ
とによりゲノムＤＮＡを抽出し、サザンブロット法やＰ
ＣＲ法等の通常用いられる方法により該ＤＮＡ中の蛍光
タンパク質遺伝子、発現制御領域ＤＮＡ、あるいは発現
制御領域の固有の遺伝子の存在を確認することによって
行うことができる。また、実際にその個体内で導入され
た蛍光タンパク質遺伝子が発現され、蛍光タンパク質が
生成されていることは、ノーザンブロット法やウェスタ
ンブロット法等の通常用いられる方法により確認するこ
とができるが、本発明においては蛍光の発光量の測定
や、蛍光顕微鏡等による観察によっても行うことができ
る。(3-1) Preparation of Gene-Modified Animal by Transgene Method Germ cells other than humans used in the present invention are transformed into expression control regions by introducing the above-mentioned introduced DNA into them to allow them to develop and grow. Any animal can be used as long as it can produce a genetically modified animal other than human that expresses a fluorescent protein gene by activity. Here, mammals are preferable as animals other than humans, and examples thereof include mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, goats, pigs, dogs and cats. Among these, rodents such as mouse, rat and guinea pig are preferable, and mouse is more preferable. As the animal germ cells, fertilized eggs before cleavage are preferably used. Such fertilized eggs are obtained by mating male and female non-human animals. Fertilized eggs can be obtained by natural mating, but a method in which the female sexual cycle of an animal is artificially adjusted and then mated with a male is preferable. As a method of artificially controlling the female female sexual cycle, for example, first follicle-stimulating hormone (pregnant horse serum gonadotropin; PMSG) and then luteinizing hormone (human ciliary gonadotropin; hCG) are used. For example, a method of administering by intraperitoneal injection and the like can be mentioned. The doses and intervals of administration of these hormones may be appropriately determined depending on the type of the animal. As described above, a fertilized egg can be obtained by administering a hormone to a female animal to cause superovulation, and removing from the oviduct on the first day after mating. The obtained fertilized egg is injected with the introduced DNA described in (2) above by the microinjection method or the like, artificially transplanted into the oviduct of a female animal, and implanted to give birth.
A genetically modified animal (transgenic animal) can be obtained. In addition, after administering luteinizing hormone-releasing hormone (LHRH) or its analogs to female animals,
A method is also preferred in which a pseudopregnant female animal in which fertility has been induced is produced by mating with a male animal, and a fertilized egg is artificially transplanted and implanted into the obtained pseudopregnant female animal. The dose and the like of LHRH or its analogs differ depending on the type of animal other than human. Furthermore, a method for artificially controlling the female sexual cycle of the above-mentioned non-human animal to obtain a fertilized egg, and artificially transplanting / implanting this fertilized egg into a pseudopregnant female animal that has induced fertility. It is preferable to use the above method in combination. The method for producing a nonhuman genetically modified animal of the present invention using a nonhuman animal germ cell into which the introduced DNA described in (2) above is used, a transgenic mouse (hereinafter referred to as May be simply referred to as "transgenic mouse".) Will be described more specifically taking as an example the case of producing. First, follicle-stimulating hormone (pregnant horse serum gonadotropin; PMSG) and luteinizing hormone (human chorionic gonadotropin; hCG) were administered to female mice for egg collection to cause superovulation, and then mated with male mice. , After checking the vaginal plug, collect the fertilized egg from the oviduct. The introduced DNA is introduced into the male pronucleus of the obtained fertilized egg by the microinjection method or the like, and the obtained egg cells are cultured in Whitten's medium or the like, and then transplanted into the oviduct of a pseudopregnant female mouse to be transplanted. Raise the animal and give birth. The transgenic mouse of the present invention can be obtained by selecting an offspring mouse expressing the fluorescent protein gene from the newborn offspring mouse. Examples of the fertilized egg of the mouse include C57BL / 6,129 /
Those obtained by mating mice derived from sv, BALB / c, C3H, SJL / Wt and the like can be used, but when the pronucleus is independent of the male pronucleus and the female pronucleus in the cytoplasm at the pronuclear stage, C57BL is possible, it is possible to collect a lot of fertilized eggs, and it is suitable for microinjection operation and the incidence of offspring is high.
It is preferable to use fertilized eggs of mice obtained by mating / 6 (B6) mice. The amount of the introduced DNA is preferably 100 to 3,000 copies, and
Examples of the method of introducing A include commonly used methods such as a microinjection method and an electroporation method. Here, the selection of the mouse pups into which the introduced DNA has been introduced is performed by cutting off the tip of the mouse tail and extracting a high molecular weight DNA (Experimental Engineering Experiment Manual, edited by Tatsuji Nomura and Motoya Katsuki, Kodansha (1987). ) Or DNAeasy
Genomic DNA is extracted by using a commercially available kit such as Tissue Kit (manufactured by QIAGEN), and Southern blotting or P
This can be performed by confirming the presence of the fluorescent protein gene, the expression control region DNA, or the gene unique to the expression control region in the DNA by a commonly used method such as CR method. In addition, the fact that the fluorescent protein gene introduced in the individual is actually expressed and the fluorescent protein is produced can be confirmed by a commonly used method such as Northern blotting or Western blotting. In the present invention, it can be carried out by measuring the amount of fluorescence emitted or observing with a fluorescence microscope or the like.
【００１３】（３−２）ノックイン法による遺伝子改変
動物の作製
ノックイン法により本発明の導入ＤＮＡを導入するため
には、上記（２）に記載のＤＮＡに、さらに相同組み換
えのための相同領域を結合することが必要である。相同
領域とは、該導入ＤＮＡを導入する動物の発現制御領域
の５’末端のＤＮＡ配列と相同の塩基配列を有するＤＮ
Ａ（以下、これを「５’側相同領域ＤＮＡ」と称す
る。）と、その３’下流に存在するＤＮＡ配列と相同の
塩基配列を有するＤＮＡ（以下、これを「３’側相同領
域ＤＮＡ」と称することがある。）を意味する。５’側
相同領域ＤＮＡは、（２）に記載のＤＮＡの５’末端が
相同組換えを起こし得る程度に相同性を有していればこ
れに値するので、特に結合する必要はない。３’側相同
領域ＤＮＡは、発現制御領域の３’下流側の塩基配列と
相同な塩基配列を有するＤＮＡか、発現制御領域固有の
ＯＲＦを挿入したコンストラクトを行った場合には、こ
のＯＲＦの３’下流側の塩基配列と相同な塩基配列を有
するＤＮＡを用いる。また、マーカー遺伝子として、ネ
オマイシン耐性（neo）遺伝子やハイグロマイシン耐性
遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、あるいは、ｌａｃＺ（β−
ガラクトシダーゼ遺伝子）やｃａｔ（クロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）等のレポータ
ー遺伝子等を、相同組換えのマーカーとして適当なプロ
モーターとともに連結することもできる。ここで、相同
領域は、相同組み換えが誘導されるに充分な長さであれ
ばいかなるものであってもよいが、具体的には例えば
０．５ｋｂ以上のものが好ましく用いられる。また、そ
れらのＤＮＡ配列はこれを導入する宿主が有する塩基配
列と完全に一致する必要はなく、好ましくは８０％以上
の相同性を有するものが用いられる。このようなＤＮＡ
断片は、適当なゲノムＤＮＡライブラリー等からＰＣＲ
等を用いて取得することができる。導入ＤＮＡはこれを
適当なクローニングベクター中で構築して用いることも
できる。ここで、クローニングベクターとしては、ｐＢ
Ｓ（ストラタジーン社製）、pBluescriptII（ストラタ
ジーン社製）、ｐＢＲ３２２（TAKARA社製）、ｐＵＣ１
８及びｐＵＣ１９（TAKARA社製）等が挙げられる。ま
た、λフアージ等のバクテリオファージ、モロニー白血
病ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイルス
またはアデノウイルスベクター、バキュロウイルス、ウ
シ乳頭腫ウイルス、へルペスウイルス群のウイルス、ま
たはエプスタイン・バー・ウイルス等の動物ウイルス等
が用いられる。次に、上記の通り構築された導入ＤＮＡ
を非ヒトＥＳ細胞に導入するが、クローニングベクター
を用いて構築した場合には、効率を良くするためにこれ
を直鎖状にしてから導入することが好ましい。直鎖状に
するための切断箇所は転写、翻訳に必要な領域の外部で
あればいずれの場所でもよい。導入の方法としては、例
えば、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、マイ
クロインジェクション法等が挙げられ、中でも電気穿孔
法で行うのが好ましい。非ヒトＥＳ細胞としては、既に
樹立され保存されたものを用いてもよく、それ自体公知
の通常用いられる作製方法に準じて新たに樹立して用い
てもよい。非ヒトＥＳ細胞を樹立するために用いる非ヒ
ト動物としては、前記した（３−１）に記載したものと
同様の動物を用いることができる。例えば、マウスの場
合には、１２９系等のＥＳ細胞が好ましく用いられ、こ
のうち、Ｅ１４ＴＧ２ａ株（Hooper M., et al., Natur
e, 326,292-295 (1987)）等が好ましく用いられる。か
くして得られるＤＮＡが導入された非ヒトＥＳ細胞は、
相同組換えが生じた細胞のみが選択的に培養され得るよ
うな条件下で培養する。このような培養条件は、用いた
非ヒトＥＳ細胞に応じて適宜選択すればよく、例えば、
薬剤耐性遺伝子を導入する場合には、選択に用いる薬剤
を種々の濃度で培地に添加して、該遺伝子が導入される
前のＥＳ細胞が増殖できなくなるような濃度を検討して
決定すればよい。次いで、上記のように培養された非ヒ
トＥＳ細胞から、十分な数のコロニーをピックアップし
て播種しなおし、これらにプロテイナーゼＫ（Proteina
se K）処理や加熱処理等を行ってＤＮＡを抽出して、遺
伝子型の解析を行い、目的の発現制御領域に相同組換え
が生じた非ヒトＥＳ細胞（以下、これを「相同組換え
体」と称することがある。）をさらに確実に選択するこ
とができる。遺伝子型の解析方法としては、導入ＤＮＡ
の塩基配列からなるプライマーと相同組換えにより削除
されない領域の塩基配列からなるプライマーを用いたＰ
ＣＲや、導入ＤＮＡ上もしくは相同組換えにより削除さ
れない領域の塩基配列からなるプローブを用いたサザン
ハイブリダイゼーション法等が挙げられる。ここで用い
られるブライマーあるいはプローブとしては、該ＥＳ細
胞のゲノム上の目的とした位置で相同組み換えが生じ、
目的のＤＮＡ断片に置換されたことを確認できるような
組み合わせであれば如何なるものであってもよい。この
ようにして得られた相同組換え体は、通常その増殖性は
良好であるが、個体発生できる能力を失いやすいので、
注意深く継代培養することが必要である。培養は、それ
自体公知の通常用いられる方法により行うことができる
が、例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダ
ー細胞上でＬＩＦ（１〜１０，０００Ｕ／ｍｌ）存在下
に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５
％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で
約３７℃で培養する等の方法で培養することができる。
また、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液
（通常０．００１〜０．５％トリプシン／０．１〜５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、好ましくは、約０．１％トリプシン／１
ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を用いる。）処理により単細胞化
し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法等
が用いられる。得られた相同組換え体が個体発生できる
能力を安定的に維持できる方法であれば、用いたＥＳ細
胞に適した方法や条件を選択すればよい。継代は、通常
１〜３日毎に行なうのが好ましいが、その都度細胞の観
察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合は、
その培養細胞は放棄することが望ましい。かくして得ら
れる相同組換え体をクローニングし、その細胞を胚形成
の初期の適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト動物胚
または胚細胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させ
た該非ヒト動物の子宮に移植する。または、初期胚と共
培養する凝集法を用いてキメラ胚を作製し、これを移植
してもよい。作出された動物は、正常な目的の発現制御
領域をもつ細胞と蛍光タンパク質遺伝子が挿入された細
胞との両者から構成されるキメラ個体（以下、これを
「キメラ動物」と称することがある。）である。このよ
うなキメラ個体と正常個体とを交配することにより得ら
れた個体群（以下、これを「Ｆ１」と称することがあ
る。）より、相同染色体上のいずれか１つの目的の発現
制御領域により制御される遺伝子座において蛍光タンパ
ク質が存在する遺伝子型（以下、これを「へテロ型」と
称することがある。）を有する個体を選択し、ヘテロ型
動物を得ることができる。このようにして得られたヘテ
ロ型動物は、通常、該個体同士を交配し、それらの産仔
から、相同染色体上の２つの上記遺伝子座において蛍光
タンパク質遺伝子が存在する遺伝子型（以下、これを
「ホモ型」と称することがある。）を有するホモ型動物
を得ることができる。へテロ型またはホモ型動物の選択
は、例えば、該動物の尾等から抽出したＤＮＡを鋳型と
したサザンブロット法やＰＣＲ法によって遺伝子型を解
析することにより行うことができる。ＰＣＲ法で解析を
行う場合に用いるプライマーとしては、遺伝子型が野生
型、ヘテロ型、及びホモ型の区別を行うことができるよ
うな組み合わせのものであればいかなるものでもよい。
例えば、導入ＤＮＡの部分塩基配列またはその相同配列
からなるプライマー、相同組換えによって削除される領
域の部分塩基配列またはその相同配列からなるプライマ
ー、及び相同組換えによって削除されない領域の部分塩
基配列またはその相同配列からなるプライマーを同時に
用いる方法等が挙げられる。(3-2) Preparation of genetically modified animal by knock-in method In order to introduce the introduced DNA of the present invention by the knock-in method, a homologous region for homologous recombination is further added to the DNA described in (2) above. Need to be combined. The homologous region is a DN having a nucleotide sequence homologous to the DNA sequence at the 5'end of the expression control region of the animal into which the introduced DNA is introduced.
A (hereinafter, referred to as "5'-side homologous region DNA") and DNA having a base sequence homologous to the DNA sequence existing 3'downstream thereof (hereinafter, referred to as "3'-side homologous region DNA"). Sometimes referred to as). The 5'-side homologous region DNA is worthy of the homology to the extent that the 5'-end of the DNA described in (2) can cause homologous recombination, and thus it is not particularly necessary to bind. The 3'-side homologous region DNA is a DNA having a base sequence homologous to the base sequence on the 3'downstream side of the expression control region or, when a construct into which an ORF specific to the expression control region is inserted is used, 'A DNA having a base sequence homologous to the downstream base sequence is used. As a marker gene, drug resistance genes such as neomycin resistance (neo) gene and hygromycin resistance gene, or lacZ (β-
A reporter gene such as a galactosidase gene) or cat (chloramphenicol acetyltransferase gene) can also be ligated together with a suitable promoter as a marker for homologous recombination. Here, the homologous region may be any region as long as it is long enough to induce homologous recombination, and specifically, a region having a length of, for example, 0.5 kb or more is preferably used. Moreover, those DNA sequences do not have to completely match the nucleotide sequences of the host into which they are introduced, and those having 80% or more homology are preferably used. Such DNA
The fragment is PCR-processed from an appropriate genomic DNA library or the like.
And the like. The introduced DNA can also be used by constructing it in an appropriate cloning vector. Here, pB is used as the cloning vector.
S (Stratagene), pBluescriptII (Stratagene), pBR322 (TAKARA), pUC1
8 and pUC19 (manufactured by TAKARA) and the like. In addition, bacteriophages such as λ-farge, retroviruses such as Moloney leukemia virus, vaccinia virus or adenovirus vector, baculovirus, bovine papilloma virus, viruses of the herpesvirus group, or animal viruses such as Epstein-Barr virus. Is used. Next, the introduced DNA constructed as described above
Is introduced into a non-human ES cell, and when constructed using a cloning vector, it is preferable to introduce this into a linear form in order to improve efficiency. The cleavage site for linearization may be anywhere outside the region required for transcription and translation. Examples of the introduction method include an electroporation method (electroporation method) and a microinjection method. Among them, the electroporation method is preferable. As the non-human ES cells, those that have already been established and preserved may be used, or they may be newly established and used according to a commonly used production method known per se. As the non-human animal used for establishing non-human ES cells, the same animals as those described in (3-1) above can be used. For example, in the case of mouse, ES cells such as 129 line are preferably used, and among them, E14TG2a strain (Hooper M., et al., Natur
e, 326,292-295 (1987)) and the like are preferably used. The thus obtained DNA-introduced non-human ES cell is
The cells are cultured under conditions such that only cells in which homologous recombination has occurred can be selectively cultured. Such culture conditions may be appropriately selected according to the non-human ES cells used, and for example,
When a drug resistance gene is introduced, the drug used for selection may be added to the medium at various concentrations, and the concentration may be determined by examining the concentration at which ES cells before the gene is unable to grow. . Then, a sufficient number of colonies were picked up from the non-human ES cells cultured as described above and reseeded, and proteinase K (Proteina
non-human ES cells in which homologous recombination has occurred in the target expression control region (hereinafter referred to as "homologous recombinant"). It may be referred to as ".") Can be selected more reliably. As a genotype analysis method, introduced DNA
P using the primer consisting of the nucleotide sequence of the nucleotide sequence of
The Southern hybridization method and the like using CR and a probe having a nucleotide sequence of a region that is not deleted on the introduced DNA or by homologous recombination can be mentioned. As the brimer or probe used here, homologous recombination occurs at a target position on the genome of the ES cell,
Any combination may be used as long as it can be confirmed that the target DNA fragment has been replaced. The homologous recombinant thus obtained is usually good in its proliferative ability, but it is easy to lose the ability of ontogeny,
Careful subculture is required. Culturing can be carried out by a commonly used method known per se, for example, a CO 2 incubator in the presence of LIF (1 to 10,000 U / ml) on an appropriate feeder cell such as STO fibroblast. In (preferably 5% carbon dioxide gas, 95
% Air or 5% oxygen, 5% carbon dioxide gas, 90% air) and the like at about 37 ° C.
At the time of subculture, for example, trypsin / EDTA solution (usually 0.001 to 0.5% trypsin / 0.1 to 5 m
M EDTA, preferably about 0.1% trypsin / 1
Use mM EDTA solution. ) A method in which single cells are obtained by treatment and seeded on newly prepared feeder cells is used. As long as the obtained homologous recombinant can stably maintain the ability of ontogeny generation, a method and conditions suitable for the ES cell used may be selected. Passaging is usually preferably performed every 1 to 3 days, but the cells are observed each time, and if morphologically abnormal cells are found,
It is desirable to discard the cultured cells. The homologous recombinant thus obtained is cloned, and the cells are injected into a non-human animal embryo or an embryo cell at an appropriate stage in the early stage of embryogenesis, for example, the 8-cell stage, and the chimeric embryo produced is pseudopregnant. Transplant into human animal uterus. Alternatively, a chimeric embryo may be produced using an agglutination method in which it is co-cultured with an early embryo, and this may be transplanted. The produced animal is a chimeric individual composed of both cells having a normal target expression control region and cells into which a fluorescent protein gene has been inserted (hereinafter, this may be referred to as “chimeric animal”). Is. From an individual group obtained by mating such a chimeric individual with a normal individual (hereinafter, this may be referred to as "F1"), one of the expression control regions of interest on the homologous chromosome A heterozygous animal can be obtained by selecting an individual having a genotype in which a fluorescent protein is present at a controlled locus (hereinafter, this may be referred to as “heterotype”). The heterozygous animal thus obtained is usually a genotype in which the fluorescent protein gene is present at the two loci on the homologous chromosome from the offspring of the individuals crossed with each other (hereinafter, A homozygous animal having a “homotype” may be obtained. The heterozygous or homozygous animal can be selected by, for example, analyzing the genotype by Southern blotting or PCR using DNA extracted from the tail of the animal as a template. Any primer may be used as a primer used in the analysis by the PCR method as long as the genotype can be distinguished from the wild type, the hetero type, and the homo type.
For example, a primer consisting of a partial base sequence of introduced DNA or a homologous sequence thereof, a partial base sequence of a region deleted by homologous recombination or a primer consisting of a homologous sequence thereof, and a partial base sequence of a region not deleted by homologous recombination or a part thereof Examples include a method of simultaneously using a primer having a homologous sequence.
【００１４】（４）非ヒト遺伝子改変動物の利用
本発明のヒト以外の遺伝子改変動物は、かくして得られ
る個体を交配し、導入されたＤＮＡが安定に保持される
ことを確認して通常の飼育環境で継代飼育することによ
りその子孫を得ることもできるし、体外受精を繰り返す
ことによりその子孫を得て、系統を維持することもでき
る。本発明の動物には、かくして得られる導入ＤＮＡを
有するその子孫等も含まれる。また、かかる動物から得
られる神経組織も本発明の範囲に含まれる。該動物から
得られる神経組織とは、脳や分泌腺、消化管、心臓等の
神経支配を受けている組織であって、これらは後述する
興奮性、あるいは抑制性神経細胞、およびシナプスの同
定や機能解析、並びに神経伝達調節剤のスクリーニング
に用いることができる。(4) Utilization of Non-Human Gene-Modified Animal The non-human gene-modified animal of the present invention is bred in a normal manner by mating the individuals thus obtained and confirming that the introduced DNA is stably retained. The offspring can be obtained by subculture in the environment, or the offspring can be obtained by repeating in vitro fertilization to maintain the lineage. The animals of the present invention also include their progeny having the introduced DNA thus obtained. Moreover, the nerve tissue obtained from such animals is also included in the scope of the present invention. The nerve tissue obtained from the animal is a tissue that is innervated by the brain, secretory glands, digestive tract, heart, etc., and these are the excitatory or inhibitory nerve cells and synapse identification and It can be used for functional analysis and screening of neurotransmission regulators.
【００１５】（４−１）非ヒト遺伝子改変動物を用いた
神経細胞、およびシナプスの機能解析
かくして取得される非ヒ卜遺伝子改変動物、あるいは該
動物から得られる神経組織は、その神経細胞、あるいは
シナプス中に発現している蛍光タンパク質量を指標とし
て、該神経細胞あるいはシナプスがシナプス後細胞に対
して抑制性の機能を有するものか、または興奮性の機能
を有するものであるかを同定することができる。蛍光タ
ンパク質の発現量は、蛍光量として観察、測定すること
ができる。蛍光量の測定の方法は、蛍光顕微鏡等による
可視化やＦＲＥＴ（F1uorescenceResonance Energy Tra
nsfer）等による定量化、二光子励起法、あるいはフロ
ーサイトメトリー等によることができる。神経細胞ある
いはシナプスの機能の同定方法としては、例えば、発現
制御領域およびそのＯＲＦとして小胞性ＧＡＢＡ／グリ
シントランスポーターを用いた場合には、該トランスポ
ーターは抑制性神経細胞またはシナプスに特異的に存在
するものであるので、ある神経細胞またはシナプスにお
いて蛍光を観察した場合にその神経細胞またはシナプス
は抑制性のものであると同定することができる。逆に、
グルタミン酸トランスポーター等の興奮性神経細胞また
はシナプスに特異的に存在するものを用いた場合には、
蛍光を観察した神経細胞またはシナプスは興奮性のもの
であると同定することができる。また、上記の方法によ
れば、蛍光タンパク質の発現量を定量することも可能で
あるので、本発明の動物に由来するある神経組織に対し
て、電気的、あるいは薬物等の刺激を与え、この刺激に
より抑制性、あるいは興奮性神経細胞またはシナプス中
の蛍光強度の変化を観察することにより、該刺激に対す
る神経細胞あるいはシナプスの機能的あるいは形態的変
化を解析することができる。このような解析によれば、
中枢神経系における興奮性、抑制性神経細胞あるいはシ
ナプスに対する刺激や薬物によって誘発される生理薬理
効果の作用機構や相互作用等が解明される。これらの解
析から得られる知見は、神経伝達や薬理作用のメカニズ
ムの解明につながるものである。(4-1) Functional Analysis of Nerve Cells and Synapses Using Non-Human Gene-Modified Animal The non-human gene-modified animal thus obtained, or the nerve tissue obtained from the animal is the nerve cell, or To identify whether the nerve cell or synapse has an inhibitory function or an excitatory function for postsynaptic cells using the amount of fluorescent protein expressed in the synapse as an index You can The expression level of the fluorescent protein can be observed and measured as the fluorescence level. The fluorescence amount is measured by visualization using a fluorescence microscope or FRET (F1uorescence Resonance Energy Tra
nsfer) and the like, two-photon excitation method, or flow cytometry. As a method for identifying the function of a nerve cell or synapse, for example, when a vesicular GABA / glycine transporter is used as an expression control region and its ORF, the transporter is specifically present in inhibitory nerve cells or synapses. Therefore, when fluorescence is observed in a nerve cell or synapse, the nerve cell or synapse can be identified as an inhibitory one. vice versa,
When an excitatory neuron such as a glutamate transporter or one specifically present in synapses is used,
Neurons or synapses whose fluorescence is observed can be identified as excitable. Further, according to the method described above, since it is also possible to quantify the expression level of the fluorescent protein, a certain nerve tissue derived from the animal of the present invention is stimulated electrically or with a drug, etc. By observing a change in fluorescence intensity in an inhibitory or excitatory nerve cell or synapse upon stimulation, a functional or morphological change in the nerve cell or synapse in response to the stimulation can be analyzed. According to such analysis,
The mechanism of action and interaction of physiological and pharmacological effects induced by excitatory and inhibitory nerve cells or synapses in the central nervous system or by drugs are elucidated. The findings obtained from these analyzes will lead to the elucidation of the mechanisms of neurotransmission and pharmacological actions.
【００１６】(４−２）神経伝達調節薬のスクリーニン
グ法
本発明の非ヒト遺伝子改変動物は、興奮性、あるいは抑
制性神経細胞またはシナプスを生体において可視化する
ことができるので、神経細胞あるいはシナプスにおける
神経伝達調節薬のスクリーニングを行うことができる。
本発明のスクリーニング方法は、本発明の非ヒト遺伝子
改変動物を用いて、該動物を被検物質で処理し、該動物
における神経細胞、あるいはシナプスに現れる変化を解
析し、これを無処理の対照動物と比較することにより行
うことができる。被検物質としては、例えば、ペプチ
ド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵
生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等が
挙げられ、これらの物質は新規な物質であってもよい
し、公知の物質であってもよい。該動物を被検物質で処
理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射等の
通常用いられる公知の方法が挙げられ、試験動物の症
状、被検物質の性質等に合わせて適宜選択すればよい。
また、被検物質の投与量についても、投与方法、被検物
質の性質等に合わせて適宜選択することができる。ま
た、本発明のスクリーニング方法は、本発明の遺伝子改
変動物から得られる神経組織を用いて行うこともでき
る。神経細胞、あるいはシナプスに現れる変化として
は、蛍光タンパク質の発現量や、シナプスの数の変化を
伴う構造的、あるいは形態的な効果等が挙げられる。こ
れらの解析方法は上記の（４−１）に挙げたものと同様
のものを用いることができる。(4-2) Screening Method for Neurotransmission Modulator Since the non-human gene-modified animal of the present invention can visualize excitatory or inhibitory nerve cells or synapses in a living body, it can be used in nerve cells or synapses. Screening for neurotransmitter modulators can be performed.
The screening method of the present invention uses the non-human genetically modified animal of the present invention, treats the animal with a test substance, analyzes changes appearing in nerve cells or synapses in the animal, and treats this as an untreated control. This can be done by comparing with animals. Examples of test substances include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc., and these substances are novel substances. It may be a known substance. Examples of the method for treating the animal with the test substance include known methods commonly used such as oral administration and intravenous injection, and may be appropriately selected depending on the symptoms of the test animal, the properties of the test substance, and the like. Good.
Also, the dose of the test substance can be appropriately selected according to the administration method, the property of the test substance, and the like. In addition, the screening method of the present invention can also be performed using neural tissue obtained from the genetically modified animal of the present invention. Examples of the changes that appear in nerve cells or synapses include the expression level of fluorescent proteins and structural or morphological effects that accompany changes in the number of synapses. For these analysis methods, the same methods as those listed in (4-1) above can be used.
【００１７】（５）神経伝達調節剤の調製方法
上記（４−２）のスクリーニング方法を用いて選択され
た物質は、前記の被検物質から選ばれた物質であって、
神経伝達調節活性を有するため、興奮性、あるいは抑制
性神経細胞またはシナプスの機能異常に起因する種々の
疾患に対する安全で低毒性な予防又は治療薬として用い
ることができる。このような疾患としては、例えば、不
安、抑鬱、てんかん、神経細胞死等の神経疾患等が挙げ
られる。このような予防、または治療薬には、上記スク
リーニング方法により得られた物質から誘導される化合
物も同様に用いることができる。これらの物質を上記疾
患の予防及び／または治療薬として用いる場合には、該
物質を単独で用いることもできるが、薬学的に許容され
得る担体と配合して医薬組成物として用いることもでき
る。このときの有効成分の担体に対する割合は、１〜９
０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は種々
の形態で投与することができ、それらの投与形態として
は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロッ
プ剤等による経口投与、または注射剤、点滴剤、リポソ
ーム剤、坐薬剤等による非経口投与を挙げることができ
る。また、その投与量は、症状、年齢、体重等によって
適宜選択することができる。(5) Method for Preparing Neurotransmission Regulator The substance selected using the screening method in (4-2) above is a substance selected from the above-mentioned test substances,
Since it has a neurotransmission-regulating activity, it can be used as a safe and low-toxicity prophylactic or therapeutic drug for various diseases caused by excitatory or inhibitory nerve cell or synaptic dysfunction. Examples of such diseases include nerve diseases such as anxiety, depression, epilepsy, and death of nerve cells. For such preventive or therapeutic agents, compounds derived from the substances obtained by the above screening method can be used as well. When these substances are used as prophylactic and / or therapeutic agents for the above diseases, the substances can be used alone, or can be used as a pharmaceutical composition by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier. The ratio of the active ingredient to the carrier at this time is 1 to 9
It can be varied between 0% by weight. Further, such a drug can be administered in various forms, and those dosage forms include oral administration by tablets, capsules, granules, powders, syrups, etc., or injections, infusions, liposomes, Parenteral administration such as suppository can be mentioned. Further, the dose can be appropriately selected depending on the symptoms, age, body weight and the like.
【００１８】[0018]
【実施例】次に実施例により本発明をより詳細に説明す
るが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
【００１９】実施例１ ＶＧＡＴ／ＥＧＦＰ融合ＤＮ
Ａ導入マウスの作製
（１）導入ＤＮＡの構築
マウスゲノムのＢＡＣライブラリー（Genome System In
c.,St.Louis, USA）より、マウスＶＧＡＴ遺伝子中のエ
クソン１を含むＤＮＡ断片（Genbank accession number
: AJ001598； FEBS Lett., 417, 177-183 (1997)）を
プローブとしてスクリーニングを行った。このスクリー
ニングによりＶＧＡＴ遺伝子のエクソン領域を含む２つ
のクローンを取得し、これをクローン１、およびクロー
ン２とした。クローン２をＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで
切断し、得られた約５ｋｂのＤＮＡ断片をＮｏｔＩサイ
トをつぶしたｐＢＳＫベクター（STRATAGENE社製）に挿
入した。上記ＤＮＡ断片は図１のｂ（ＢａｍＨＩ）から
ｅ（ＫｐｎＩ）で示されるＥｘｏｎ１、２、および３を
含むものである。このプラスミドをＶＧＡＴＥｘ１−３
／ＳＫとした。ｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（クロンテッ
ク社製）テンプレートとして、末端にＸｈｏＩ認識配列
を有するプライマーを用いたＰＣＲにより、両末端にＸ
ｈｏＩ制限酵素サイトを有する緑色蛍光タンパク質遺伝
子（ＥＧＦＰ）ＤＮＡ断片を得た。これを上記のプラス
ミドＶＧＡＴＥｘ１−３／ＳＫのＸｈｏＩサイト（図１
のｄ）に挿入した。ＸｈｏＩサイトはＥｘｏｎ２中に存
在するのでＶＧＡＴとＥＧＦＰが融合したタンパク質が
発現するような構造となっている。このプラスミドをＶ
ＧＡＴ−ＥＧＦＰ／ＳＫとした。さらにクローン１をＳ
ｐｅＩおよびＮｏｔＩで切断し、得られた約１．１ｋｂ
のＤＮＡ断片を上記ＶＧＡＴ−ＥＧＦＰ／ＳＫのＳｐｅ
Ｉ／ＮｏｔＩサイトに挿入した。ＳｐｅＩおよびＮｏｔ
Ｉで切断して得られたＤＮＡ断片は図１のａ（Ｓｐｅ
Ｉ）からｃ（ＮｏｔＩ）で示されるＶＧＡＴのＯＲＦの
上流約８ｋｂを含むものであるので、作製されたプラス
ミドは、ＥＧＦＰ遺伝子が途中に挿入されたマウスＶＧ
ＡＴのＥｘｏｎ１から３と、その発現制御領域を含むも
のである。ここで得られたブラスミドをＫｐｎＩで切断
し、得られた約１５ｋｂのＤＮＡ断片を導入ＤＮＡとし
た。
（２）トランスジェニックマウスの作製
採卵用のＣ５７ＢＬ／６系統雌マウスに卵胞刺激ホルモ
ン（妊馬血清性性腺刺激ホルモン：ＰＭＳＧ）及び黄体
形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン：ｈＣＧ）
をそれぞれ個体あたり約５単位、４８時間間隔で腹腔内
投与して過剰排卵させ、Ｃ３Ｈ系統雄マウスと交配させ
た。膣栓確認後、交配後１日目の卵管からマウス受精卵
（初期胚）を採取し、上記（１）で得られた導入ＤＮＡ
（１０ｎｇ／ｍｌ）溶液を、該受精卵の雄性前核にマイ
クロインジェクションした。これを２細胞期までWhitte
n'sの培地中にて３７℃で培養し、偽妊娠の雌ＩＣＲ系
マウスの輸卵管に戻して個体を発生させ、帝王切開によ
り仔マウスを取り出した。得られた仔マウスは、すぐに
仮親につけて離乳期まで育てた。
（３）トランスジェニックマウスのスクリーニング
上記（２）で作製したトランスジェニックマウスについ
て、ＰＣＲ法を用いてスクリーニングを行った。上記の
方法で作製されたトランスジェニックマウスは、出生後
１ケ月経過したところで、雌８個体、雄１７個体の尾の
先を切り取って、高分子ＤＮＡ抽出法によりゲノムＤＮ
Ａを抽出し、エタノール沈澱を行って濃縮した。沈澱と
して得られたＤＮＡはＴＥバッファー（１０ｍＭ Tris
-HCl(ｐＨ８)，１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再溶解し、ＰＣＲ
のテンプレートとして用いた。プライマーは、ＥＧＦＰ
の翻訳領域の両末端にあたる配列番号３および配列番号
４に示す塩基配列を有するものを用いた。この結果を図
２に示す。図中、Ｗは野生型マウスのＤＮＡの結果を示
し、ＴはトランスジェニックマウスのＤＮＡの結果を示
す。また、左はじのレーンには分子量マーカーを泳動し
た。ＴのレーンにはＥＧＦＰのＯＲＦを示す約０．７ｋ
ｂのバンドが検出され、ＥＧＦＰを含むＤＮＡが導入さ
れていることが確認された。出生した雌８個体、雄１７
個体のうち１０組交配して６１の産仔を得て、２８個体
がＥＧＦＰ陽性であった。このうち雌２個体、及び雄４
個体の計６系統のFounder を得た。さらにこれらのFoun
der の交配を試みたところＦ１個体が得られた。また、
交配によりＦ１個体を得ることができなかった系統は体
外受精によりその系統を維持することとした。 Example 1 VGAT / EGFP fusion DN
Preparation of A-Introduced Mouse (1) Construction of Introduced DNA BAC library of mouse genome (Genome System In
c., St. Louis, USA), a DNA fragment containing the exon 1 in the mouse VGAT gene (Genbank accession number).
: AJ001598; FEBS Lett., 417, 177-183 (1997)) was used as a probe for screening. By this screening, two clones containing the exon region of the VGAT gene were obtained and designated as clone 1 and clone 2. Clone 2 was digested with BamHI and KpnI, and the obtained DNA fragment of about 5 kb was inserted into a pBSK vector (Stratagene) in which the NotI site was crushed. The above DNA fragment includes Exon 1, 2 and 3 shown by b (BamHI) to e (KpnI) in FIG. This plasmid was designated as VGATEx1-3
/ SK. By using a pEGFP-N1 vector (Clontech) template with a primer having an XhoI recognition sequence at the end, PCR was performed at both ends by X.
A green fluorescent protein gene (EGFP) DNA fragment having a hoI restriction enzyme site was obtained. This is the XhoI site of the above-mentioned plasmid VGATEx1-3 / SK (FIG. 1).
Inserted in d). Since the XhoI site exists in Exon2, the structure is such that a protein in which VGAT and EGFP are fused is expressed. This plasmid is V
It was set to GAT-EGFP / SK. Clone 1 to S
About 1.1 kb obtained by cutting with peI and NotI
DNA fragment of SVG of the above VGAT-EGFP / SK
It was inserted into the I / NotI site. SpeI and Not
The DNA fragment obtained by cleaving with I was a (Spe
I) to c (NotI) contains about 8 kb upstream of the ORF of VGAT, so the prepared plasmid is a mouse VG in which the EGFP gene is inserted in the middle.
It includes Exon 1 to 3 of AT and its expression control region. The plasmid obtained here was digested with KpnI, and the obtained DNA fragment of about 15 kb was used as the introduced DNA. (2) Preparation of Transgenic Mice Egg stimulating hormone (maternal serum gonadotropin: PMSG) and luteinizing hormone (human chorionic gonadotropin: hCG) in C57BL / 6 strain female mice for egg collection
Was intraperitoneally administered at about 5 units per individual at 48-hour intervals for superovulation, and mated with C3H strain male mice. After confirmation of the vaginal plug, a fertilized mouse egg (early embryo) was collected from the oviduct on the first day after mating, and the introduced DNA obtained in (1) above
The (10 ng / ml) solution was microinjected into the male pronucleus of the fertilized egg. Whitte this to the 2-cell stage
The cells were cultured in n's medium at 37 ° C., returned to the oviduct of a pseudopregnant female ICR mouse to develop an individual, and a pup mouse was removed by caesarean section. The obtained offspring mouse was immediately attached to a foster mother and raised until the weaning period. (3) Screening of transgenic mouse The transgenic mouse prepared in (2) above was screened using the PCR method. The transgenic mice produced by the above method were cut off at the tip of the tail of 8 females and 17 males one month after birth and subjected to genomic DNA extraction by high molecular DNA extraction.
A was extracted, precipitated with ethanol and concentrated. The DNA obtained as a precipitate was TE buffer (10 mM Tris
-Redissolve in HCl (pH8), 1mM EDTA) and PCR
Used as a template. The primer is EGFP
Those having the base sequences shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, which correspond to both ends of the translation region, were used. The result is shown in FIG. In the figure, W shows the result of the wild-type mouse DNA, and T shows the result of the transgenic mouse DNA. A molecular weight marker was electrophoresed in the left lane. About 0.7k showing the EGFP ORF in the T lane
The band b was detected, and it was confirmed that the DNA containing EGFP was introduced. 8 females born and 17 males
Among the individuals, 10 pairs were crossed to obtain 61 offspring, and 28 individuals were EGFP-positive. Of these, 2 females and 4 males
We obtained a total of 6 founders of individuals. Furthermore these Foun
When an attempt was made to cross der, F1 individuals were obtained. Also,
It was decided to maintain the line by in vitro fertilization for the line that could not obtain F1 individuals by mating.
【００２０】実施例２ ＶＧＡＴ／ＥＧＦＰ融合ＤＮ
Ａ導入マウスの解析
上記実施例１の（３）で取得されたマウスは、ＧＡＢＡ
／グリシントランスポーターとＥＧＦＰの融合タンパク
質を発現していた。その発現が生体組織のままで観察す
ることが可能であることを確認する目的で、蛍光顕微鏡
による自家蛍光の観察と、固定後の組織標本で抗ＶＧＡ
Ｔ抗体による免疫染色を行い、その結果を比較した。ま
ず、上述したＶＧＡＴ／ＥＧＦＰ融合ＤＮＡ導入マウス
から摘出した脳の切片について蛍光顕微鏡（Axioscop
e；Zeiss社製）にＢ励起フィルター（Ｎｏ．３７；Zeis
s社製）を装着して、自家蛍光を観察した。この結果を
図３のＡに示す。また、同様の脳切片を、Endocrinolog
y, 137，1423-1428（1996)、Mol. BrainRes.，40, 203-
213（1996)等に記載の通常用いられる公知の方法を用い
て調製した。免疫組織染色は、J. Biol. Chem., 273, 2
7051-27054（1998)に記載の方法に従って行うことと
し、まず、調製した脳切片にマウス抗ＶＧＡＴ抗体（Ch
emicon社製）を反応させ、次いでＦＩＴＣ標識抗ウサギ
ＩｇＧ抗体を反応させて、蛍光顕微鏡により検出した。
この結果を図３のＢに示す。その結果、トラペゾイド体
（Trapezoid body：台形体）において両染色が一致し
（図３／Ｃ)、ＶＧＡＴ／ＥＧＦＰ融合ＤＮＡ導入マウ
スにおいてＧＡＢＡ／グリシン神経細胞が生体のまま同
定可能であることがわかった。 Example 2 VGAT / EGFP fusion DN
Analysis of A-Introduced Mouse The mouse obtained in (3) of Example 1 above was GABA.
/ Expressed a fusion protein of glycine transporter and EGFP. In order to confirm that its expression can be observed as it is in living tissue, observation of autofluorescence with a fluorescence microscope and anti-VGA in a tissue sample after fixation
Immunostaining with T antibody was performed and the results were compared. First, a section of a brain excised from the above-mentioned VGAT / EGFP fusion DNA-introduced mouse was subjected to fluorescence microscopy (Axioscop).
e; B excitation filter (No. 37; Zeis)
(manufactured by s company) was attached and the autofluorescence was observed. The result is shown in FIG. In addition, the same brain section was used for Endocrinolog
y, 137, 1423-1428 (1996), Mol. BrainRes., 40, 203-
213 (1996) and the like, which are commonly used and well-known methods. Immunohistological staining is performed by J. Biol. Chem., 273, 2
7051-27054 (1998). First, a mouse anti-VGAT antibody (Ch
(manufactured by emicon), followed by reaction with a FITC-labeled anti-rabbit IgG antibody and detection by a fluorescence microscope.
The result is shown in B of FIG. As a result, both stainings were identical in the trapezoid body (trapezoid) (Fig. 3 / C), and it was found that GABA / glycine nerve cells could be identified as they were in the VGAT / EGFP fusion DNA-transfected mouse. .
【００２１】[0021]
【発明の効果】本発明は興奮性、あるいは抑制性神経細
胞、およびシナプスを蛍光バイオイメ−ジングできる方
法を提供するものである。本発明の方法により、生きた
条件下に上記の神経細胞、あるいはシナプスを明瞭に同
定し、可視化することによって、これまでの実験系では
達成できなかった、興奮性、あるいは抑制性シナプスを
高い精度で同定することが可能となる。これによって、
情報伝達の分子機構を解析するための電気生理学的実験
や、興奮性、あるいは抑制性シナプスに作用する各種の
薬物の活性およびその作用機構を調べるための薬理学的
実験が従来に比べて格段に容易に行えるようになり、こ
れらの解析の精度も著しく高まるものである。さらに、
これらの神経細胞、およびシナプスを用いたスクリーニ
ングによれば、不安、抑鬱、てんかん、神経細胞死など
の脳神経疾患の治療薬が提供されるものである。INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention provides a method capable of fluorescent bioimaging excitatory or inhibitory nerve cells and synapses. By the method of the present invention, by clearly identifying and visualizing the above nerve cells or synapses under a living condition, visualization of excitatory or inhibitory synapses with high accuracy, which could not be achieved by conventional experimental systems, was performed. It is possible to identify with. by this,
Electrophysiological experiments to analyze the molecular mechanism of signal transduction and pharmacological experiments to investigate the activity of various drugs acting on excitatory or inhibitory synapses and the mechanism of their action are much more remarkable than before. It can be easily performed, and the accuracy of these analyzes is significantly improved. further,
Screening using these nerve cells and synapses provides therapeutic agents for cranial nerve diseases such as anxiety, depression, epilepsy, and nerve cell death.
【００２２】[0022]
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Science and Tecchnology Corporation, and Mitsubishi Chemical Corporation <120> The geneticaly modified animal and the use thereof <130> PC909866 <140> <141> 2002-05-24 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : Synthetic <400> 1 ggtgaagttc tacatcgacg tcaag 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : Synthetic <400> 2 gtgtccagtt catcatgcag tggaa 25 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : Synthetic <400> 3 ccgctcgaga tggtgagcaa gggcga 26 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : Synthetic <400> 4 ccgctcgagt tacttgtaca gctcgtcca 29[Sequence list] SEQUENCE LISTING <110> Japan Science and Tecchnology Corporation, and Mitsubishi Chemical Corporation <120> The geneticaly modified animal and the use thereof <130> PC909866 <140> <141> 2002-05-24 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 1 ggtgaagttc tacatcgacg tcaag 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 2 gtgtccagtt catcatgcag tggaa 25 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 3 ccgctcgaga tggtgagcaa gggcga 26 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 4 ccgctcgagt tacttgtaca gctcgtcca 29
【図１】ＶＧＡＴ遺伝子発現制御領域、ＯＲＦ、ＥＧＦ
Ｐ遺伝子を含む導入ＤＮＡの構造を示す図である。FIG. 1 VGAT gene expression control region, ORF, EGF
It is a figure which shows the structure of the introduced DNA containing P gene.
【図２】遺伝子改変マウスの遺伝子型をＰＣＲにより解
析した結果を示す電気泳動写真である。FIG. 2 is an electrophoretic photograph showing the results of PCR analysis of the genotype of genetically modified mice.
【図３】遺伝子改変マウスの脳切片の、自家蛍光を示す
図（Ａ）、抗マウスＶＧＡＴ抗体による免疫染色を示す
図（Ｂ）、および両方を重ねた図（Ｃ）である。FIG. 3 is a diagram showing autofluorescence of a brain section of a genetically modified mouse (A), a diagram showing immunostaining with an anti-mouse VGAT antibody (B), and a diagram in which both are overlapped (C).
─────────────────────────────────────────────────────
─────────────────────────────────────────────────── ───
【手続補正書】[Procedure amendment]
【提出日】平成１４年５月２４日（２００２．５．２
４）[Submission date] May 24, 2002 (2002.5.2)
4)
【手続補正１】[Procedure Amendment 1]
【補正対象書類名】図面[Document name to be corrected] Drawing
【補正対象項目名】図２[Name of item to be corrected] Figure 2
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction content]
【図２】 [Fig. 2]
【手続補正２】[Procedure Amendment 2]
【補正対象書類名】図面[Document name to be corrected] Drawing
【補正対象項目名】図３[Name of item to be corrected] Figure 3
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction content]
【図３】 [Figure 3]
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/22 Ａ６１Ｐ 25/24 25/24 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 鈴木 秀典 東京都文京区小日向１−８−12 (72)発明者 柳川 右千夫 愛知県岡崎市竜美東１丁目８−14 Ｆターム(参考） 2G045 AA29 AA40 BA13 BB20 CB17 DA12 DA13 DA14 DA36 FA16 FB07 FB12 GC15 4B024 AA11 BA80 CA04 CA07 DA02 EA04 GA11 GA18 HA01 HA11 4B063 QA01 QA18 QQ20 QQ79 QR77 QS28 QX02 4C084 AA17 MA52 MA55 NA14 ZA011 ZA051 ZA061 ZA121 ZC781─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI theme code (reference) A61P 25/22 A61P 25/24 25/24 C12Q 1/02 C12Q 1/02 G01N 33/15 Z G01N 33 / 15 33/50 Z 33/50 C12N 15/00 ZNAA (72) Inventor Hidenori Suzuki 1-8-12 Kohinata, Bunkyo-ku, Tokyo (72) Inventor Right Chio Yanagawa 1-8-14, Ryumihigashi, Okazaki-shi, Aichi Prefecture Term (reference) 2G045 AA29 AA40 BA13 BB20 CB17 DA12 DA13 DA14 DA36 FA16 FB07 FB12 GC15 4B024 AA11 BA80 CA04 CA07 DA02 EA04 GA11 GA18 HA01 HA11 4B063 QA01 QA18 QQ20 QQ79 QR77 QS28 QX02 4C081 NA147A52BA1 ZA1
Claims (15)
質、又はペプチド性神経伝達物質をコードする遺伝子の
発現制御領域と、その制御下におかれるように連結され
た蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ。1. An expression control region of a protein encoding a neurotransmitter transport or a gene encoding a peptide neurotransmitter, and a gene encoding a fluorescent protein linked so as to be under the control DNA.
神経伝達物質の輸送に関連するタンパク質、又はペブチ
ド性神経伝達物質と融合タンパク質となるように連結さ
れているものである請求項１に記載のＤＮＡ。2. A gene encoding a fluorescent protein,
The DNA according to claim 1, which is linked to a protein related to transport of a neurotransmitter or a peptide peptide and a fusion protein so as to be a fusion protein.
なものである請求項１または２に記載のＤＮＡ。3. The DNA according to claim 1 or 2, wherein the neurotransmitter is specific to inhibitory nerve cells.
なものである請求項１または２に記載のＤＮＡ。4. The DNA according to claim 1 or 2, wherein the neurotransmitter is excitatory neuron-specific.
であり、該物質の輸送に関連するタンパク質が、小胞性
ＧＡＢＡ／グリシントランスポーター、ＧＡＢＡトラン
スポーター、又はグリシントランスポーターである請求
項３に記載のＤＮＡ。5. The neurotransmitter is GABA or glycine, and the protein involved in transport of the substance is vesicular GABA / glycine transporter, GABA transporter, or glycine transporter. DNA.
該物質の輸送に関連するタンパク質が、グルタミン酸ト
ランスポーターである請求項４に記載のＤＮＡ。6. The neurotransmitter is glutamic acid,
The DNA according to claim 4, wherein the protein involved in the transport of the substance is a glutamate transporter.
を導入した非ヒト遺伝子改変動物。7. The DNA according to any one of claims 1 to 6.
A non-human genetically modified animal into which is introduced.
が、宿主細胞の染色体上の同じ神経伝達物質あるいはそ
の輸送に関連するタンパク質をコードする遺伝子と相同
組換えによって置換されることにより導入されている請
求項７に記載の動物。8. The DNA according to any one of claims 1 to 6.
9. The animal according to claim 7, wherein the animal is introduced by substituting by homologous recombination with a gene encoding the same neurotransmitter on the chromosome of the host cell or a protein related to its transport.
求項７または８に記載の動物。9. The animal according to claim 7, wherein the animal belongs to rodents.
の動物。10. The animal according to claim 9, wherein the animal is a mouse.
物、あるいは該動物から得られる神経組織について、そ
の神経細胞、あるいはシナプス中に発現している蛍光タ
ンパク質量を指標とし、該神経細胞又はシナプスが抑制
性又は興奮性のいずれであるかを同定することを特徴と
する神経機能解析法。11. The animal according to claim 7, or a nerve tissue obtained from the animal, wherein the nerve cell or the amount of fluorescent protein expressed in the synapse is used as an index, and the nerve cell is used. Alternatively, a method for analyzing neural function, which comprises identifying whether the synapse is inhibitory or excitatory.
物、あるいは該動物から得られる神経組織に被検物質を
添加し、その神経細胞、あるいはシナプスに発現してい
る蛍光タンパク質量を指標とし、抑制性又は興奮性神経
細胞からの神経伝達を制御する活性を有する物質を選抜
することを特徴とする神経伝達調節薬のスクリーニング
方法。12. A test substance is added to the animal according to claim 7, or a nerve tissue obtained from the animal, and the amount of the fluorescent protein expressed in the nerve cell or synapse is used as an index. And a method for screening a neurotransmission regulator, which comprises selecting a substance having an activity of controlling neurotransmission from an inhibitory or excitatory nerve cell.
物、あるいは該動物から得られる生体試料に被検物質を
添加し、その神経細胞、あるいはシナプスに現れる変化
を解析し、抑制性又は興奮性神経細胞からの神経伝達を
制御する活性を有する物質を選抜することを特徴とする
神経伝達調節薬のスクリーニング法。13. A test substance is added to the animal according to any one of claims 7 to 10 or a biological sample obtained from the animal, and changes appearing in the nerve cells or synapses are analyzed, and the inhibitory or A screening method for a neurotransmission regulator, which comprises selecting a substance having an activity of controlling neurotransmission from excitatory nerve cells.
より選抜された物質を有効成分とする神経伝達調節薬。14. A neurotransmission regulator, which comprises a substance selected by the method according to claim 12 or 13 as an active ingredient.
より選抜された物質を製剤化することを特徴とする神経
伝達調節剤の製造方法。15. A method for producing a neurotransmission regulator, which comprises formulating a substance selected by the method according to claim 12 or 13.
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- 2002-05-24 JP JP2002151457A patent/JP2003204796A/en active Pending
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