JP2006149330A - Non-human mammal inhibitory neuron-specifically expressing reporter gene - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、抑制性ニューロン特異的に蛍光タンパク質遺伝子などのレポーター遺伝子を発現する非ヒト哺乳動物に関する。 The present invention relates to a non-human mammal that expresses a reporter gene such as a fluorescent protein gene in a suppressive neuron specific manner.
脳は、興奮性ニューロンと抑制性ニューロンとで構成される神経ネットワークの集まりからできている。抑制性ニューロンの主要な神経伝達物質（抑制性神経伝達物質）は、γ−アミノ酪酸 (GABA) とグリシンである。GABAを神経伝達物質として放出する神経細胞がGABAニューロンであり、脳および脊髄に広範囲に分布する。一方、グリシンを放出する神経細胞がグリシンニューロンであり、主に脳幹と脊髄に分布する。抑制性伝達物質は神経の電位活動の制御を司り、覚醒、睡眠、概日リズムや学習、運動、感覚情報処理など脳の機能を構築する上で中心的役割を果たしていることが知られている。GABAはてんかん病やアルコール精神病をはじめとする精神神経疾患、不安や抑うつなどの精神症状との関連が報告されている。一方、グリシンはびっくり病（startle disease）との関連が知られている。
従って、(1)GABAやグリシンの作用機序を明らかにすること、(2)GABAやグリシンを伝達物質にもつ抑制性ニューロン（GABAニューロンとグリシンニューロン）の機能を明らかにすることは、脳や神経の機能を理解し、上記疾患の発症機序の解明や治療法の確立に貢献できる。
GABAとグリシンは、小胞型GABAトランスポーター(VGAT)によってシナプス小胞に蓄積された後に、シナプス間隙に放出される。VGATは、抑制性ニューロン（GABAニューロンとグリシンニューロン）に特異的に発現することから、抑制性ニューロンのマーカーとしても使用されている。一方、抑制性ニューロンは一般に中枢神経系に散在し、比較的少数であることから、生体において正確に同定し、電気生理学的特徴などの機能解析は困難であった。
The brain consists of a collection of neural networks composed of excitatory and inhibitory neurons. The major neurotransmitters (inhibitory neurotransmitters) of inhibitory neurons are γ-aminobutyric acid (GABA) and glycine. Nerve cells that release GABA as a neurotransmitter are GABA neurons, which are widely distributed in the brain and spinal cord. On the other hand, nerve cells that release glycine are glycine neurons, which are distributed mainly in the brain stem and spinal cord. Inhibitory transmitters are known to play a central role in the construction of brain functions such as arousal, sleep, circadian rhythm, learning, movement, and sensory information processing. . GABA has been reported to be associated with neuropsychiatric disorders such as epilepsy and alcohol psychosis, and mental symptoms such as anxiety and depression. On the other hand, glycine is known to be associated with startle disease.
Therefore, (1) to clarify the mechanism of action of GABA and glycine, (2) to clarify the function of inhibitory neurons (GABA neurons and glycine neurons) that have GABA or glycine as a transmitter, Understand the function of nerves, contribute to the elucidation of the pathogenesis of the above diseases and the establishment of treatments.
GABA and glycine are accumulated in synaptic vesicles by vesicular GABA transporter (VGAT) and then released into the synaptic cleft. Since VGAT is specifically expressed in inhibitory neurons (GABA neurons and glycine neurons), it is also used as a marker for inhibitory neurons. On the other hand, inhibitory neurons are generally scattered in the central nervous system and are relatively small in number, so that they are accurately identified in the living body and it is difficult to analyze the functions such as electrophysiological characteristics.
抑制性ニューロンを可視化した動物として、グリーン蛍光タンパク質遺伝子がグルタミン酸脱炭酸酵素遺伝子のエクソンと同一の読み取り枠に挿入されているトランスジェニック動物が報告されている（特許文献１）。
また、VGAT遺伝子の発現制御領域の制御下におかれるように連結された蛍光タンパク質をコードする遺伝子を保持する動物も報告されている（特許文献２）。特許文献２においては、VGAT遺伝子の発現制御領域として、５’発現調節領域の約８ｋｂｐの領域が用いられていた。しかしながら、これらの文献に記載された動物における蛍光タンパク質の発現量は十分ではなく、より効率よく抑制性ニューロンを可視化できる動物の開発が望まれていた。
In addition, an animal having a gene encoding a fluorescent protein linked so as to be under the control of the expression control region of the VGAT gene has been reported (Patent Document 2). In Patent Document 2, a region of about 8 kbp of the 5 ′ expression regulatory region was used as the expression control region of the VGAT gene. However, the expression level of the fluorescent protein in the animals described in these documents is not sufficient, and the development of animals that can visualize inhibitory neurons more efficiently has been desired.
本発明は抑制性ニューロンを効率よく観察及び解析することのできる動物を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide an animal capable of efficiently observing and analyzing inhibitory neurons.
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、VGAT遺伝子の約１００ｋｂｐの５’発現調節領域を含むDNA断片に発現可能に連結されたレポーター遺伝
子を染色体上に保持させた非ヒト哺乳動物を用いることにより、抑制性ニューロンを効率よく観察及び解析することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
The present inventors have intensively studied to solve the above problems. As a result, inhibitory neurons can be efficiently observed by using a non-human mammal in which a reporter gene operably linked to a DNA fragment containing a 5 'expression regulatory region of about 100 kbp of the VGAT gene is retained on the chromosome. As a result, the present invention has been completed.
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）小胞性ＧＡＢＡトランスポーター遺伝子の約１００ｋｂｐの５’発現調節領域を含むDNA断片に発現可能に連結されたレポーター遺伝子を染色体上に保持する、非ヒト哺乳動物。
（２）前記レポーター遺伝子が、さらに、その３’側に小胞性ＧＡＢＡトランスポーター遺伝子の３'発現調節領域が連結された遺伝子である、（１）の非ヒト哺乳動物。
（３）約１００ｋｂｐの５’発現調節領域を含む小胞性ＧＡＢＡトランスポーター遺伝子、及び該遺伝子の翻訳開始コドンの位置に挿入されたレポーター遺伝子を含む遺伝子コンストラクトを染色体上に保持する、（１）の非ヒト哺乳動物。
（４）レポーター遺伝子がヴィーナス遺伝子である、（１）〜（３）のいずれかの非ヒト哺乳動物。
（５）ラットである、（１）〜（４）のいずれかの非ヒト哺乳動物。
（６）（１）〜（５）のいずれかの非ヒト哺乳動物、あるいは該動物から得られる神経組織に被検物質を添加し、抑制性ニューロンにおけるレポーター遺伝子の発現量を指標として抑制性ニューロンからの神経伝達を制御する活性を有する物質を選抜することを特徴とする、神経伝達調節薬のスクリーニング方法。
That is, the present invention is as follows.
(1) A non-human mammal that retains on a chromosome a reporter gene operably linked to a DNA fragment containing a 5 'expression regulatory region of about 100 kbp of a vesicular GABA transporter gene.
(2) The non-human mammal according to (1), wherein the reporter gene is a gene further linked to the 3 ′ side of the 3 ′ expression regulatory region of the vesicular GABA transporter gene.
(3) A gene construct comprising a vesicular GABA transporter gene comprising a 5 ′ expression regulatory region of about 100 kbp and a reporter gene inserted at the position of the translation initiation codon of the gene is retained on the chromosome of (1) Non-human mammals.
(4) The non-human mammal according to any one of (1) to (3), wherein the reporter gene is a Venus gene.
(5) The non-human mammal according to any one of (1) to (4), which is a rat.
(6) A suppressive neuron using a test substance added to the non-human mammal of any one of (1) to (5) or a nerve tissue obtained from the animal, and using the expression level of the reporter gene in the suppressor neuron as an index A method for screening a neurotransmission modulating agent, comprising selecting a substance having an activity of controlling neurotransmission from a neurotransmitter.
本発明の非ヒト哺乳動物は抑制性ニューロンにレポーター遺伝子を効率よく発現するものである。したがって、本発明の非ヒト哺乳動物を用いることにより、生きた条件下に抑制性ニューロンを明瞭に同定し、可視化することができる。さらに、情報伝達の分子機構を解析するための電気生理学的実験や、抑制性ニューロンに作用する各種の薬物の活性およびその作用機構を調べるための薬理学的実験を従来に比べて格段に容易に行うことができる。本発明の非ヒト哺乳動物の神経細胞、またはシナプスを用いることにより、不安、抑鬱、てんかん、神経細胞死などの脳神経疾患の治療薬のスクリーニングを効率よく行うことができる。
The non-human mammal of the present invention efficiently expresses a reporter gene in inhibitory neurons. Therefore, by using the non-human mammal of the present invention, inhibitory neurons can be clearly identified and visualized under living conditions. In addition, electrophysiological experiments for analyzing the molecular mechanism of information transmission and pharmacological experiments for investigating the activity and mechanism of various drugs that act on inhibitory neurons are much easier than before. It can be carried out. By using the nerve cells or synapses of the non-human mammal of the present invention, screening for therapeutic agents for cranial nerve diseases such as anxiety, depression, epilepsy, and nerve cell death can be performed efficiently.
本発明の非ヒト哺乳動物は、小胞性ＧＡＢＡトランスポーター（VGAT）遺伝子の約１００ｋｂｐの５’発現調節領域を含むDNA断片に発現可能に連結されたレポーター遺伝子を染色体上に保持する、非ヒト哺乳動物である。 The non-human mammal of the present invention is a non-human mammal that retains on its chromosome a reporter gene operably linked to a DNA fragment containing an approximately 100 kbp 5 ′ expression regulatory region of the vesicular GABA transporter (VGAT) gene. Is an animal.
VGAT遺伝子は、VGATをコードする限り特に制限されないが、マウスまたはラット由来の遺伝子が好ましく、マウス由来の遺伝子がより好ましい。マウス由来のVGAT遺伝子としては、 データベースEnsemblに登録番号ENSMUSG00000037771で登録されている遺伝子（http://www.ensembl.org/Mus_musculus/geneview?gene=ENSMUSG00000037771&db=core）が挙げられ、具体的配列はhttp://www.ensembl.org/Mus_musculus/geneview?gene=ENSMUSG00000037771&db=core&_gene_sequence=1で参照できる。
VGAT遺伝子の約１００ｋｂｐの５’発現調節領域としては、VGAT遺伝子のエクソン１に含まれる開始コドンATGより５’側の約１００ｋｂｐの領域が挙げられる。なお、上記領域は、レポーター遺伝子の抑制性ニューロンにおける特異的発現を誘導するものである限り、１又は複数の塩基が置換、欠失、挿入等されたものであってもよい。ここで複数とは、例えば、２〜100個、好ましくは2〜50個、より好ましくは2〜20個である。また、約１００ｋｂｐとは、例えば、９０〜１１０ｋｂｐ、好ましくは９５〜１０５ｋｂｐ、特に好ましくは９９〜１０１ｋｂｐである。
また、約１００ｋｂｐの領域を含む限り、さらに５’側の領域を含んでいてもよい。
The VGAT gene is not particularly limited as long as it encodes VGAT, but a mouse or rat-derived gene is preferable, and a mouse-derived gene is more preferable. Examples of the mouse-derived VGAT gene include a gene (http://www.ensembl.org/Mus_musculus/geneview?gene=ENSMUSG00000037771&db=core) registered in the database Ensembl under the registration number ENSMUSG00000037771. You can refer to it at: //www.ensembl.org/Mus_musculus/geneview? gene = ENSMUSG00000037771 & db = core & _gene_sequence = 1.
Examples of the about 100 kbp 5 ′ expression regulatory region of the VGAT gene include a region of about 100 kbp 5 ′ to the start codon ATG contained in
Further, as long as the region of about 100 kbp is included, a region on the 5 ′ side may be further included.
本発明の非ヒト哺乳動物は、レポーター遺伝子がVGAT遺伝子の約１００ｋｂｐの５’発現調節領域を含むDNA断片に発現可能に連結された遺伝子コンストラクトを保持する。該遺伝子コンストラクトは、VGAT遺伝子の５’発現調節領域の下流にレポーター遺伝子のオープンリーディングフレームが連結されていれば良く、５’発現調節領域に直接連結されていても良いし、５’発現調節領域の下流にレポーター遺伝子の発現を阻害しない任意の配列を介して連結されていても良い。VGAT遺伝子の５’発現調節領域の直後の翻訳開始コドンの位置にレポーター遺伝子のオープンリーディングフレーム、好ましくはオープンリーディングフレーム及びポリＡ配列が挿入された遺伝子コンストラクトが望ましい。
なお、遺伝子コンストラクト上には、VGAT遺伝子の翻訳開始コドン以降の配列（エクソンや３’発現調節領域）が含まれていてもよい。３’発現調節領域としては、VGAT遺伝子の終止コドンの下流の約２０ｋｂｐの領域が挙げられる。
The non-human mammal of the present invention holds a gene construct in which a reporter gene is operably linked to a DNA fragment containing a 5 ′ expression regulatory region of about 100 kbp of the VGAT gene. The gene construct may be connected to the 5 ′ expression regulatory region of the VGAT gene downstream of the 5 ′ expression regulatory region, and may be directly linked to the 5 ′ expression regulatory region. It may be linked to any downstream via any sequence that does not inhibit the expression of the reporter gene. A gene construct in which an open reading frame of a reporter gene, preferably an open reading frame and a poly A sequence is inserted at the position of the translation initiation codon immediately after the 5 ′ expression regulatory region of the VGAT gene is desirable.
The gene construct may contain a sequence (exon or 3 ′ expression regulatory region) after the translation start codon of the VGAT gene. Examples of the 3 ′ expression regulatory region include a region of about 20 kbp downstream of the stop codon of the VGAT gene.
VGAT遺伝子の５’発現調節領域を含むＤＮＡは、ＢＡＣ、ＹＡＣ等のゲノムライブラリー等から通常用いられる方法により該ＤＮＡを含むクローンを選抜し、VGAT遺伝子の５’発現調節領域を含む断片を制限酵素等により切断して得るか、あるいはポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）等により取得することができる。このようなＤＮＡの由来は、これを導入する宿主と同種のものが好ましいが、宿主細胞内で導入されたＤＮＡが機能できるものであればこれに限られるものではない。VGAT遺伝子の約１００ｋｂｐの５’発現調節領域を含むBACライブラリーとしては、例えば、Genome system社（St. Louis, MO,U.S.A.）より入手できるクローン#160L22が挙げられる。 For DNA containing the 5 'expression regulatory region of the VGAT gene, clones containing the DNA are selected from genomic libraries such as BAC and YAC by a commonly used method, and fragments containing the 5' expression regulatory region of the VGAT gene are restricted. It can be obtained by cleaving with an enzyme or the like, or can be obtained by polymerase chain reaction (PCR) or the like. The origin of such DNA is preferably the same as that of the host into which it is introduced, but is not limited thereto as long as the DNA introduced into the host cell can function. An example of a BAC library containing a 5 'expression regulatory region of about 100 kbp of the VGAT gene is clone # 160L22 available from Genome system (St. Louis, MO, U.S.A.).
レポーター遺伝子としては、抑制性ニューロンを選択的に可視化するために用いる発光又は発色タンパク質遺伝子や、抑制性ニューロンを選択的に破壊するために用いる毒素遺伝子などが挙げられる。発光タンパク質をコードする遺伝子としては、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質；Prasher,D.C.,et al., Gene, 111, 229-233 (1992)）、紫外線を照射することで緑から赤に変化するカエデをコードする遺伝子（GenBank Accession No. AB085641）、細胞内のカルシウム濃度に依存して発光するカメレオンをコードする遺伝子（GenBank Accession No.AB178711）、ヴィーナス遺伝子（Nat Biotechnol. 2002 Jan;20(1):87-90.）などが挙げられる。発色タンパク質遺伝子としては、β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子などが挙げられる。毒素をコードする遺伝子としては、ジフテリア毒素をコードする遺伝子などが挙げられる。
これらのレポーター遺伝子を含むＤＮＡ断片は、ＰＣＲ等で増幅して取得することもできるし、市販のものを用いることもできる。
Reporter genes include luminescent or chromogenic protein genes used to selectively visualize inhibitory neurons, toxin genes used to selectively destroy inhibitory neurons, and the like. GFP (green fluorescent protein; Prasher, DC, et al., Gene, 111, 229-233 (1992)), which codes for photoprotein, codes for maple that changes from green to red when irradiated with ultraviolet light. Gene (GenBank Accession No. AB085641), a gene encoding chameleon that emits light depending on intracellular calcium concentration (GenBank Accession No. AB178711), Venus gene (Nat Biotechnol. 2002 Jan; 20 (1): 87- 90.). Examples of the chromogenic protein gene include a gene encoding β-galactosidase. Examples of the gene encoding the toxin include a gene encoding diphtheria toxin.
The DNA fragment containing these reporter genes can be obtained by amplification by PCR or the like, or a commercially available product can be used.
レポーター遺伝子は上記VGAT遺伝子の５’発現調節領域を含むＤＮＡの３'側に制限酵素などを用いて連結することができる。VGAT遺伝子の開始コドンの位置にレポーター遺伝子が挿入された遺伝子コンストラクトは、VGAT遺伝子の開始コドンの前後の配列の間にレポーター遺伝子を挿入した遺伝子コンストラクトを用いた相同組換えによって作製することもできる。なお、遺伝子コンストラクトは１００ｋｂｐ以上の長さを有するため、ＢＡＣ（大腸菌人工染色体）などを用いて導入することが好ましい。 The reporter gene can be linked to the 3 ′ side of the DNA containing the 5 ′ expression regulatory region of the VGAT gene using a restriction enzyme or the like. A gene construct in which a reporter gene is inserted at the position of the start codon of the VGAT gene can also be prepared by homologous recombination using a gene construct in which a reporter gene is inserted between sequences before and after the start codon of the VGAT gene. Since the gene construct has a length of 100 kbp or more, it is preferably introduced using BAC (E. coli artificial chromosome) or the like.
非ヒト哺乳動物としては、マウスまたはラットなどのげっ歯類が好ましく、ラットがより好ましい。すなわち、 (1) GAERS欠神発作ラット、Huntington病ラットなど疾患モデルラットが存在すること、(2) モノクローナル抗体の使用はマウスでは困難であるがラットでは可能であり、組織学的解析が容易になること、(3) 生理学実験の多くがラットで行われておりデータを照合しやすいこと、(4) 脳幹部の小さな神経核の解析はマウスよりもラットで容易であること、などによりラットが特に好ましい。 The non-human mammal is preferably a rodent such as a mouse or a rat, and more preferably a rat. (1) There are disease model rats such as GAERS absence seizure rats, Huntington disease rats, etc. (2) Use of monoclonal antibodies is difficult in mice but is possible in rats, and histological analysis is easy. (3) Many physiological experiments are performed in rats and it is easy to collate data. (4) Analysis of small nucleus in the brainstem is easier in rats than in mice. Particularly preferred.
上記のようにして調製された遺伝子コンストラクトを、非ヒト哺乳動物の生殖細胞に導入して遺伝子改変動物細胞を作製し、さらにこれを発生させることにより非ヒト哺乳動物を作製することができる。遺伝子コンストラクトの宿主への導入方法としては、該コンストラクトを、宿主が有するゲノムＤＮＡの不特定の位置に複数コピー挿入する方法や、宿主のゲノムの特定の位置に導入する方法などが挙げられる。 A gene construct prepared as described above is introduced into germ cells of a non-human mammal to produce a genetically modified animal cell, and further generated to produce a non-human mammal. Examples of the method for introducing the gene construct into the host include a method of inserting a plurality of copies of the construct into an unspecified position of the genomic DNA of the host, a method of introducing the construct into a specific position of the host genome, and the like.
非ヒト哺乳動物生殖細胞としては、卵割前の受精卵が好ましく用いられる。このような受精卵は、非ヒト哺乳動物の雄と雌を交配させることによって得られる。受精卵は、自然交配によっても得られるが、動物の雌の性周期を人工的に調節した後、雄と交配させる方法が好ましい。動物の雌の性周期を人工的に調節する方法としては、例えば、初めに卵胞刺激ホルモン（妊馬血清性性腺刺激ホルモン；ＰＭＳＧ）、次いで黄体形成ホルモン（ヒト繊毛性性腺刺激ホルモン；ｈＣＧ）を、例えば腹腔注射等により投与する方法が挙げられる。これらのホルモンの投与量、投与間隔等は、該動物の種類により適宜決定すればよい。上記の通り動物の雌にホルモン投与を行って過剰排卵させ、交配後１日目の卵管から摘出すること等によって受精卵を得ることができる。
得られた受精卵に、遺伝子コンストラクトをマイクロインジェクション法等により注入して、動物の雌の輸卵管に人工的に移植、着床させて出産させることにより、遺伝子改変動物（トランスジェニック動物）を得ることができる。また、動物の雌に黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）あるいはその類縁体を投与した後に、動物の雄と交配させて、受精能を誘起させた偽妊娠雌動物を作製し、得られた偽妊娠雌動物に受精卵を人工的に移植、着床する方法を用いてもよい。
As non-human mammal germ cells, fertilized eggs before cleavage are preferably used. Such a fertilized egg is obtained by mating a non-human mammal male and female. Although fertilized eggs can be obtained by natural mating, a method of mating with males after artificially adjusting the female sexual cycle of animals is preferred. As a method of artificially adjusting the female sexual cycle of animals, for example, follicle-stimulating hormone (pregnant horse serum gonadotropin; PMSG) and then luteinizing hormone (human ciliary gonadotropin; hCG) are used. For example, a method of administration by intraperitoneal injection or the like can be mentioned. What is necessary is just to determine suitably the dosage amount, administration interval, etc. of these hormones according to the kind of this animal. As described above, a fertilized egg can be obtained by administering a hormone to an animal female to cause excessive ovulation and removing it from the oviduct on the first day after mating.
A genetically modified animal (transgenic animal) is obtained by injecting a gene construct into the resulting fertilized egg by a microinjection method or the like, and artificially transplanting the animal into a female oviduct, implanting it, and giving birth. Can do. In addition, after administering luteinizing hormone-releasing hormone (LHRH) or an analog thereof to an animal female, a pseudopregnant female animal in which fertility was induced by mating with an animal male was prepared, and the obtained pseudopregnancy was obtained. A method of artificially transplanting and implanting a fertilized egg into a female animal may be used.
上記遺伝子コンストラクトが導入された仔マウスあるいは仔ラットの選択は、マウスあるいはラットの尾の先を切り取って、高分子ＤＮＡ抽出法（発生工学実験マニュアル、野村達次監修・勝木元也編、講談社（１９８７））又はDNAeasy Tissue Kit（QIAGEN社製）等の市販のキットを用いることによりゲノムＤＮＡを抽出し、サザンブロット法やＰＣＲ法等の通常用いられる方法により該ＤＮＡ中のレポーター遺伝子、VGAT発現制御領域ＤＮＡの存在を確認することによって行うことができる。また、レポーター遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合、蛍光の発光量の測定や、蛍光顕微鏡等による観察によっても行うことができる。 The selection of pups or pups introduced with the above gene construct is performed by cutting off the tip of the mouse or rat tail and extracting it from a polymer DNA (manufacturing experiment manual, supervised by Tatsuji Nomura, edited by Motoya Katsuki, Kodansha ( 1987)) or a commercially available kit such as DNAeasy Tissue Kit (manufactured by QIAGEN). Genomic DNA is extracted, and reporter gene and VGAT expression control in the DNA is performed by a commonly used method such as Southern blotting or PCR. This can be done by confirming the presence of the region DNA. In addition, when the reporter gene is a fluorescent protein gene, it can also be performed by measuring the amount of fluorescence emitted or observing with a fluorescence microscope or the like.
本発明の非ヒト哺乳動物は、上記のようにして得られる個体を交配し、導入されたＤＮＡが安定に保持されることを確認して通常の飼育環境で継代飼育することによりその子孫を得ることもできるし、体外受精を繰り返すことによりその子孫を得て、系統を維持することもできる。
本発明の非ヒト哺乳動物は染色体上に上記遺伝子コンストラクトを保持する限り、他の動物との掛け合わせによって得られる動物であってもよい。
例えば、てんかんでは抑制性ニューロンが関与していることが示唆されているため、本発明のラットをＳＨＲラットなどのてんかんモデル動物と掛け合わせることによって、てんかんにおける抑制性ニューロンの動態の観察や、てんかんの病因解析や治療薬のスクリーニングに有用な動物を得ることができる。
また、VGATは膵ランゲルハンス島にも発現していることが知られているため、本発明のラットをＧＫラットなどの糖尿病モデル動物と掛け合わせることによって、糖尿病における膵ランゲルハンス島の観察や、糖尿病の病因解析や治療薬のスクリーニングに有用な動物を得ることができる。
The non-human mammal of the present invention crosses the individuals obtained as described above, confirms that the introduced DNA is stably retained, and subcultures it in a normal breeding environment. The progeny can be obtained by repeating in vitro fertilization, and the strain can be maintained.
The non-human mammal of the present invention may be an animal obtained by crossing with other animals as long as it retains the gene construct on the chromosome.
For example, it is suggested that inhibitory neurons are involved in epilepsy. Therefore, by crossing the rat of the present invention with an epilepsy model animal such as an SHR rat, observation of the dynamics of inhibitory neurons in epilepsy, epilepsy, etc. It is possible to obtain animals useful for pathogenesis analysis and screening of therapeutic agents.
In addition, since VGAT is known to be expressed on pancreatic islets of Langerhans, crossing the rat of the present invention with diabetes model animals such as GK rats, observation of pancreatic islets of Langerhans in diabetes, Animals useful for pathogenesis analysis and therapeutic drug screening can be obtained.
本発明の非ヒ卜遺伝子改変動物、あるいは該動物から得られる神経組織は、レポーター遺伝子により翻訳されるタンパク質の量を指標として、GABAニューロンなどの抑制性ニューロンの電気生理学的解析や形態学的解析に用いることができる。また、GABAニューロンの発生学的解析、GABAニューロンに固有の分子生物学的解析、VGAT遺伝子のin vivoにおける発現動態の解析などにも用いることができる。
なお、レポーター遺伝子に蛍光タンパク質遺伝子を用いる場合、蛍光タンパク質の発現量は、蛍光量として観察、測定することができる。蛍光量の測定の方法は、蛍光顕微鏡等による可視化やＦＲＥＴ（F1uorescenceResonance Energy Transfer）等による定量化、二光子励起法、あるいはフローサイトメトリー等によることができる。
具体的には、本発明の動物に由来する抑制性ニューロンに対して、電気的、あるいは薬物等の刺激を与え、この刺激により抑制性神経細胞またはシナプス中の蛍光強度の変化を観察することにより、該刺激に対する神経細胞あるいはシナプスの機能的あるいは形態的変化を解析することができる。このような解析によれば、中枢神経系における抑制性神経細胞あるいはシナプスに対する刺激や薬物によって誘発される生理薬理効果の作用機構や相互作用等が解明される。これらの解析から得られる知見は、神経伝達や薬理作用のメカニズムの解明につながるものである。
また、VGAT遺伝子はグリシンニューロンにも発現することから、グリシンニューロンを生体で可視化することもでき、グリシンニューロンの機能解析やグリシン神経伝達が関与する疾患の発症機構を解明することにも利用可能である。
The non-human gene-modified animal of the present invention or the neural tissue obtained from the animal is electrophysiological and morphologically analyzed for inhibitory neurons such as GABA neurons, using the amount of protein translated by the reporter gene as an index. Can be used. It can also be used for developmental analysis of GABA neurons, molecular biological analysis unique to GABA neurons, and in vivo expression dynamics of VGAT genes.
When a fluorescent protein gene is used as the reporter gene, the expression level of the fluorescent protein can be observed and measured as the fluorescence amount. The method for measuring the amount of fluorescence can be performed by visualization with a fluorescence microscope or the like, quantification by FRET (F1uorescence Resonance Energy Transfer), two-photon excitation method, flow cytometry, or the like.
Specifically, by applying electrical or drug stimuli to the inhibitory neurons derived from the animals of the present invention, and by observing changes in fluorescence intensity in the inhibitory neurons or synapses by this stimulus The functional or morphological changes of nerve cells or synapses in response to the stimulation can be analyzed. Such an analysis elucidates the mechanism of action and interaction of physiological pharmacological effects induced by drugs or stimuli on inhibitory neurons or synapses in the central nervous system. The knowledge obtained from these analyzes will lead to the elucidation of the mechanisms of neurotransmission and pharmacological action.
In addition, since the VGAT gene is also expressed in glycine neurons, glycine neurons can be visualized in vivo, and can be used to analyze the function of glycine neurons and to elucidate the pathogenesis of diseases involving glycine neurotransmission. is there.
本発明の非ヒト遺伝子改変動物は、抑制性神経細胞またはシナプスを生体において可視化することができるので、神経細胞あるいはシナプスにおける神経伝達調節薬のスクリーニングや評価に用いることができる。本発明のスクリーニング方法は、本発明の非ヒト哺乳動物を用いて、該動物を被検物質で処理し、該動物における神経細胞、あるいはシナプスに現れる変化を解析し、これを無処理の対照動物と比較することにより行うことができる。
被検物質としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等が挙げられ、これらの物質は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。該動物を被検物質で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射等の通常用いられる公知の方法が挙げられ、試験動物の症状、被検物質の性質等に合わせて適宜選択すればよい。
また、本発明のスクリーニング方法は、本発明の遺伝子改変動物から得られる神経組織を用いて行うこともできる。
神経細胞、あるいはシナプスに現れる変化としては、蛍光タンパク質の発現量や、シナプスの数の変化を伴う構造的、あるいは形態的な効果等が挙げられる。
Since the non-human gene-modified animal of the present invention can visualize inhibitory neurons or synapses in a living body, it can be used for screening and evaluation of neurotransmission regulators in neurons or synapses. In the screening method of the present invention, the non-human mammal of the present invention is used to treat the animal with a test substance, analyze changes in nerve cells or synapses in the animal, and treat this with an untreated control animal. It can be done by comparing with.
Examples of the test substance include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc., and these substances are novel substances. It may be a known substance. Examples of the method of treating the animal with a test substance include known methods commonly used such as oral administration and intravenous injection, and can be appropriately selected according to the symptom of the test animal, the nature of the test substance, and the like. Good.
In addition, the screening method of the present invention can also be performed using neural tissue obtained from the genetically modified animal of the present invention.
Examples of changes that appear in nerve cells or synapses include structural or morphological effects that accompany changes in the expression level of fluorescent proteins and the number of synapses.
遺伝子コンストラクトの作製
（１）VGAT遺伝子を含む大腸菌人工染色体（BAC）クローンの選択
VGAT遺伝子を含む大腸菌人工染色体（BAC）クローンをマウス大腸菌人工染色体（BAC）ライブラリー（Genome system社、St. Louis, MO, U.S.A.）からPCR法により、3クローン同定した。これらの3クローン（#44G06, #160L22, #184J1）をGenome system社より購入して、各クローンの挿入部位の塩基配列を決定することにより、各クローンの挿入部位の中のVGAT遺伝子の位置を決定した。その結果、#160L22クローンでは、VGAT遺伝子の5'側に約100 kb、3'側に約25 kbあり、VGAT遺伝子（約5 kb）を含めて、全長約130 kbのインサートがあることが判明した。
Gene construction (1) Selection of E. coli artificial chromosome (BAC) clones containing VGAT gene
Three clones of E. coli artificial chromosome (BAC) clones containing the VGAT gene were identified by PCR from a mouse E. coli artificial chromosome (BAC) library (Genome system, St. Louis, MO, USA). By purchasing these 3 clones (# 44G06, # 160L22, # 184J1) from the Genome system and determining the nucleotide sequence of the insertion site of each clone, the position of the VGAT gene in the insertion site of each clone is determined. Were determined. As a result, it was found that the # 160L22 clone has an insert of about 100 kb on the 5 'side of the VGAT gene and about 25 kb on the 3' side, and an insert of about 130 kb in total, including the VGAT gene (about 5 kb). did.
（２）VGAT遺伝子へvenus遺伝子を挿入・改変したBACクローンの作製
VGAT遺伝子のエクソン１の翻訳開始コドン（ATG）にframeを一致させるようにVenus遺伝子（Nat Biotechnol. 2002 Jan;20(1):87-90.）を挿入した。すなわち、Venus遺伝子とそれに続くSV40poly(A)配列を含み、その5'-端にVGAT遺伝子の5'-相同領域（0.94 kbの5'-発現調節領域）、3'-端にVGAT遺伝子の3'-相同領域（1.39 kbのエクソン１とその下流を含む領域）を配置したDNAを作製し、これを相同組み換え用シャトルベクター(pKOV-Kan；Lalioti and Heath, Nucleic Acids Res. 29(3):E14. 2001)に挿入して、ターゲティングコンストラクト、VGAT-venus/KOV (Fig. 1)を作製した。#160L22クローンにVGAT-venus/KOVを導入し、相同組換えにより、#160L22クローン上にあるVGAT遺伝子のATGの位置にvenus遺伝子およびポリA配列を挿入したVGAT-venus BACクローンをLalioti and Heath (2001)の方法に従って作製した。
(2) Preparation of BAC clone by inserting and modifying venus gene into VGAT gene
The Venus gene (Nat Biotechnol. 2002 Jan; 20 (1): 87-90.) Was inserted so that the frame coincided with the translation start codon (ATG) of
（３）VGAT-venusラットの作製
上記のようにして作製したVGAT-venus BACクローンからBAC DNAを精製し、そのDNAをラット受精卵に注入した後、偽妊娠マウスに移植し、21匹の仔 (Founder) を得た。VGAT-venus遺伝子が導入されているかどうかをPCR法で決定した。用いたprimerはvenus遺伝子内に設計し、sequenceは以下のとおりである。
venus-F: 5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT-3'（配列番号１）
venus-R: 5'-TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGA-3' （配列番号２）。
その結果、２１匹の仔のうち、２匹がVGAT-venus遺伝子が導入されたトランスジェニックラット（VGAT-venusラット）であることが判明した。２匹とも野生型ラットと交配した結果、次世代に導入遺伝子が継代され、ラインとして樹立された。
(3) Preparation of VGAT-venus rat BAC DNA was purified from the VGAT-venus BAC clone prepared as described above, and the DNA was injected into a rat fertilized egg, then transplanted into a pseudopregnant mouse, and 21 pups Got (Founder). Whether or not the VGAT-venus gene was introduced was determined by PCR. The primer used was designed in the venus gene, and the sequence is as follows.
venus-F: 5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT-3 '(SEQ ID NO: 1)
venus-R: 5'-TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGA-3 '(SEQ ID NO: 2).
As a result, it was found that 2 out of 21 offspring were transgenic rats (VGAT-venus rats) into which the VGAT-venus gene was introduced. As a result of mating both with wild-type rats, the transgene was passaged to the next generation and established as a line.
（４）VGAT-venusラットの解析
生後１日〜3日のVGAT-venusラットについて蛍光顕微鏡で観察した結果、頭部に自家蛍光を観察した。さらに、パラホルムアルデヒド固定した組織を蛍光顕微鏡で観察した結果、脳に強いに自家蛍光を観察した（図２）。
自家蛍光をもつ細胞が抑制性ニューロンであるかどうか生後3週齢のVGAT-venusラットの脳組織標本を作成し、GFPの自家蛍光の観察、抗GFP抗体と抗GABA抗体を用いた免疫組織化学の検討を行った。図３に大脳皮質標本を用いた結果を示す。抗GFP抗体陽性の細胞は、小型〜中型の大きさで、多様な形態を示し、散在性に分布するGABAニューロンの特徴をもつ。さらに、GFPの自家蛍光と抗GABA抗体を用いた２重染色で、GFPの自家蛍光をもつ細胞が抗GABA抗体陽性細胞であることが、判明した。また、図４に小脳皮質標本を用いた結果を示す。GFPの蛍光が観察される細胞は、分子層では多数の小型の細胞、プルキンエ細胞層では大型の細胞、顆粒層では散在性に少数の細胞が認められた。このGFPの蛍光が観察された細胞は、これまで多数報告されているGABAニューロンの分布と一致する。また、抗GFP抗体陽性の細胞もGABAニューロンの分布と一致する。以上の結果は、大脳皮質、小脳皮質のGFPの自家蛍光をもつ細胞が主な抑制性ニューロンである、GABAニューロンであることを示唆する。従って、VGAT-venusラットがGABAニューロンの機能解析に有用であることがわかった。
(4) Analysis of VGAT-venus rat As a result of observing the VGAT-
Whether or not the cells with autofluorescence are inhibitory neurons Prepare a brain tissue sample of VGAT-venus rat 3 weeks old, observe autofluorescence of GFP, immunohistochemistry using anti-GFP antibody and anti-GABA antibody Was examined. FIG. 3 shows the results using a cerebral cortex specimen. Anti-GFP antibody-positive cells are small to medium in size, have various morphologies, and are characterized by scattered GABA neurons. Furthermore, double staining using GFP autofluorescence and anti-GABA antibody revealed that cells with GFP autofluorescence were anti-GABA antibody positive cells. FIG. 4 shows the results using a cerebellar cortex specimen. The cells in which GFP fluorescence was observed were many small cells in the molecular layer, large cells in the Purkinje cell layer, and few cells scattered in the granular layer. The cells in which the fluorescence of GFP is observed are consistent with the distribution of GABA neurons reported so far. Anti-GFP antibody-positive cells are also consistent with the distribution of GABA neurons. These results suggest that cells with GFP autofluorescence in the cerebral cortex and cerebellar cortex are GABA neurons, which are the main inhibitory neurons. Therefore, VGAT-venus rats were found to be useful for functional analysis of GABA neurons.
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