JP2003202329A - リポ多糖吸着体およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新たなリポ多糖吸着体およびその用途を提供
することを目的とする。 【解決手段】 ポリエチレンイミンなどのアミノ基また
はイミノ基を有する化合物をポリエステル布などの担体
に吸着もしくは共有結合により固定化してなる、サルモ
ネラ菌、大腸菌などのグラム陰性菌のリポ多糖を吸着す
るためのリポ多糖吸着体は、検体中のリポ多糖をクロー
スイムノアッセイにより検出する検出方法に効果的に使
用することが出来るものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、リポ多糖吸着体お
よびその用途に関する。更に詳細には、ポリエチレンイ
ミンなどのアミノ基またはイミノ基を有する化合物をポ
リエステル布などの担体に固定化してなる、サルモネラ
菌、大腸菌などのグラム陰性菌のリポ多糖を吸着するた
めのリポ多糖吸着体、かかるリポ多糖吸着体を用いた、
検体中のリポ多糖をイムノアッセイにより検出する検出
方法等に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】酵素免疫法は、近年特に細菌汚染、環境
汚染物質、伝染病原体、細菌毒素等の種々の抗原を検定
する迅速かつ信頼性の高い方法として多用されている。
酵素免疫法は、抗体または抗原を担体（固相）上に固定
化し、それにサンプル中の検出しようとする抗原または
抗体を吸着させ、その抗原または抗体に特異的な酵素標
識抗体を反応させて、サンプル中の抗原または抗体を検
出する方法である。酵素免疫法では一般に、例えばポリ
スチレン、ポリビニールクロライド、ポリメタクリート
等の疎水性プラスチックで出来たマイクロプレート、ビ
ーズまたはチューブ表面上あるいは微粒子担体（磁性粒
子等）などに抗原または抗体を吸着固定化させ、この固
定化した抗原または抗体に検出しようとする抗体または
抗原を抗原抗体反応させて、サンプル中の抗原または抗
体を検出する方法が採用されている。しかしながら、こ
の方法では、マイクロプレート、ビーズなどの担体の表
面積が小さいため、抗原や抗体を固定化するために長時
間を要するという欠点がある。

【０００３】この問題を解決するため、疎水性繊維より
成るマクロ過疎性不織布、例えばポリエステル不織布
（Ｄｕ Ｐｏｎｔ社ＳＯＮＴＡＲＡ８１００^TM）を担体
とし、これにポリミキシンＢを吸着させた吸着体を用
い、この吸着体に検体中のリポ多糖を吸着させ、吸着し
たリポ多糖を酵素標識抗体により検出して検体中のリポ
多糖を検定するクロースエンザイムイムノアッセイ（Cl
oth Enzyme Immunoassay:CEIA）が開発された（Blais a
nd Yamazaki US Pat.5,510,242,1996）。これは、我々
の衛生健康上、食品や畜産等で多く問題になっているグ
ラム陰性菌（サルモネラ菌、大腸菌、カンピロバクター
菌等）のリポ多糖がポリミキシンＢに良く吸着すること
を利用したものである。リポ多糖の本体は、グラム陰性
菌細胞壁外膜の一部を構成しているリポ多糖（ＬＰＳ）
で数種の糖が繰り返し配列する多糖部分と脂質であるリ
ピドＡが２−ケト−３−デオキシオクトン酸（ＫＤＯ）
を介して結合した分子であり、リピドＡに毒性を有し内
毒素（endotoxin）とも言われているものである。これ
に対し外毒素（exotoxin）とは細菌が産生する強力な毒
素で菌外に出す蛋白質を指す。問題の前者のリポ多糖が
持つリン酸基と脂質部分がポリミキシンＢの持つアミノ
基やアルコキシ基部分とお互いに結合しやすいと考えら
れる。

【０００４】ＣＥＩＡは、（１）反応表面が広いため反
応が早くサンプル量も多く使え、従って結果も明確に出
て検出感度も高く再現性に優れている；（２）高価で特
別な器具や設備が必要でなく、操作も簡単なのでどこで
も誰でも行える；（３）アッセイ中の布の洗浄が簡単で
早い；（４）原料である布やポリミキシンＢは安定で長
期間保存が効きむしろ安価でもあるのでアッセイ自体も
安価になる；（５）ポリミキシンＢを吸着させた布の作
成法が簡単である、などの種々の優れた点を有してる。
主な問題点としては、サンプルをポリミキシンＢ吸着布
にあてがう時、この布が適当に濡れていなければドット
ブロット法によるＣＥＩＡでは検定の際に明確なスポッ
トを形成しない場合があり、そのため実施する際には経
験を要し、また布が乾燥している場合はサンプルを吸収
しない、などの問題点が挙げられる。更にはポリミキシ
ンＢは抗生物質であるため高価でその供給源も限られて
いるという問題点もある。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
問題点を解決することにある。即ち、経験を要せず容易
にＣＥＩＡを実施することを可能にするリポ多糖吸着体
を提供することであり、そのＣＥＩＡがポリミキシンＢ
吸着布と同等あるいはそれ以上の測定感度を有し、リポ
多糖吸着体に用いる材料がポリミキシンＢと比べ安価で
あり供給源も広く毒性も非常に低いリポ多糖吸着体を提
供することである。更に本発明の目的は、このようなリ
ポ多糖吸着体を用いたイムノアッセイによるリポ多糖の
検出方法を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】これらの目的を達成する
ため、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、ポリミキシ
ンＢに代わるものとして、例えばポリエチレンイミン
（PEI、polyethylenimin）をポリエステル布に固定化さ
せたＰＥＩ布が、上述のポリミキシンＢ布の全ての優れ
た点に加えて、更に乾燥した布にそのままサンプルをあ
てがってＣＥＩＡを実施することができ、更にポリミキ
シンＢ布と比べて同等またはそれ以上の測定感度が得ら
れることを見出し、本発明を完成した。即ち、本発明
は、アミノ基またはイミノ基を有する化合物を担体に固
定化してなるリポ多糖吸着体に関する。更に本発明は、
リポ多糖の存在が疑われる検体と上記リポ多糖吸着体を
接触させ、次いでリポ多糖吸着体に吸着したリポ多糖に
対する標識抗体を反応させてリポ多糖を検出することか
らなる、イムノアッセイによるリポ多糖の検出方法に関
する。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明で担体に固定するために用
いるアミノ基またはイミノ基を有する化合物としては、
ポリアミン類、アルキレンアミン類、ポリイミン類、ア
ルキレンイミン類などが挙げられる。ポリアミン類とし
ては、ポリエチレンアミン、ポリプロリレンアミンなど
のポリアルキルアミン、ポリビニルアミン等が例示され
る。アルキレンアミン類としては、エチルアミン、プロ
ピルアミン、ブチルアミン、イミノビス（プロピルアミ
ン）などが例示される。ポリイミン類としては、ポリエ
チレンイミン、ポリプロピレンイミンなどのポリアルキ
ルイミン、ポリビニルイミン等が例示される。アルキレ
ンイミン類としては、エチレンイミン、ブチレンイミン
などが例示される。なかでも、ポリアルキルアミン、ポ
リビニルアミン、エチルアミン、イミノビス（プロピル
アミン）、ポリアルキルイミンおよびポリビニルイミン
が好ましく、特にポリエチレンイミンおよびイミノビス
（プロピルアミン）が好ましく、更には分子量２００〜
１００，０００、特に分子量６００〜２，０００のポリ
エチレンイミンが特に好ましい。

【０００８】これらのアミノ基またはイミノ基を有する
化合物を固定化させる担体としては、ポリエステル、レ
ーヨンなどの繊維、ポリスチレン、ポリカーボネート、
ポリメチルメタクリレート、ポリビニルクロライドなど
のプラスチック等が挙げられる。これらの担体は、繊維
の場合には、織布または不織布の形態にあるものが挙げ
られる。具体的には、織布としてはレーヨン／ポリエス
テル布やポリエステル布が挙げられる。不織布としては
レーヨン／ポリエステル布やポリエステル布、最も適し
ている不織布としては、例えばデュポン社製のＳＯＮＴ
ＡＲＡ８４０７ ^TMやＳＯＮＴＡＲＡ８１００^TMなどのポ
リエステル布が例示される。プラスチックの場合には、
マイクロプレート、ビーズ、チューブ、微粒子などの形
態にあるものが挙げられる。

【０００９】本発明のリポ多糖吸着体は、上記したアミ
ノ基またはイミノ基を有する化合物を上記した担体に固
定化することによって得られる。固定化する方法はそれ
自体周知であり、例えば物理的吸着法、共有結合法、イ
オン結合法、包括法などの周知の方法を、用いる担体の
種類、具体的な使用目的に応じて任意に採用すればよ
い。例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）をポリエス
テル布に物理的に吸着させるには、ＰＥＩ水溶液中にポ
リエステル布を３０〜８０℃、望ましくは４０℃の温度
で５分〜１８時間浸漬することによって行うことができ
る。この吸着法によって作製される吸着体は、吸着され
るＰＥＩ量はある程度限定され、吸着したＰＥＩは徐々
に流失する欠点があるが、イムノアッセイ、例えばクロ
ースエンザイムイムノアッセイ（ＣＥＩＡ）に用いるに
は差し支え無い。ポリエステル布以外の担体について
も、周知の方法で同様にアミノ基またはイミノ基を有す
る化合物を物理的吸着により担体に固定化することがで
きる。また、例えば、ポリエステル布の担体に、ＰＥ
Ｉ、アルキルアミンなどを共有結合によって固定化する
ためには、無水のＰＥＩやアルキルアミンなどをポリエ
ステル布に含浸し加温することによってエステルアミド
交換反応が起こり固定化できる。無水ＰＥＩは粘性が非
常に高いので低分子の無水アルコール、例えば無水エタ
ノールなど、あるいはジメチルスルホキシド（ＤＭＳ
Ｏ）などに希釈して用いるのが好ましい。希釈させる際
の濃度としては任意の濃度でよいが、通常１０〜９０
％、特に７０％程度が適当である。これらの溶液にポリ
エステル布を浸漬し加温することによって共有結合によ
り固定化される。浸漬加温する条件、例えば無水ＰＥＩ
の濃度、温度、時間などによって布に導入されるＰＥＩ
の量をコントロール出来る。ＣＥＩＡによって内毒素を
検出するのに用いる布は、分子量８００の無水ＰＥＩを
２〜５分、１１０℃で反応させて得た布が適切である。
アルキルアミンやＰＥＩを共有結合で固定化した布は、
これらの成分が流出することはないので、多量に固定化
することによって、水、生体液やワクチン製造液中に汚
染したリポ多糖や核酸分子（ＤＮＡ）を除く目的に適し
ている。ポリエステル布以外の担体に、アルキルアミン
やＰＥＩあるいは他の化合物を共有結合により固定化す
るには、例えばカルボジイミドのようなカップリング剤
を介する方法などの周知の方法を任意に採用することに
よって実施できる。本発明では、特に、アミノ基または
イミノ基を有する化合物としてポリエチレンイミンを用
い、担体としてポリエステル布またはポリエステル／レ
ーヨン布を用い、ポリエチレンイミンを吸着またはエス
テルアミド交換反応による共有結合でポリエステル布ま
たはポリエステル／レーヨン布に固定化してなるリポ多
糖吸着体が好ましい。

【００１０】かくして得られる、アミノ基またはイミノ
基を有する化合物を担体に固定化してなる本発明のリポ
多糖吸着体は、サルモネラ菌、大腸菌、カンピロバクタ
ー菌等のグラム陰性菌のリポ多糖、即ち、グラム陰性菌
細胞壁外膜の一部を構成しているリポ多糖（ＬＰＳ）を
効率良く吸着することができる。従って、本発明のリポ
多糖吸着体は、検体中のリポ多糖ひいてはそれを産生す
る微生物をイムノアッセイにより検出する検出方法に用
いることができる。このようなイムノアッセイとして
は、例えば、リポ多糖の存在が疑われる検体と本発明の
リポ多糖吸着体とを接触させて検体中のリポ多糖をリポ
多糖吸着体に吸着させて捕獲し、次いで吸着したリポ多
糖に対してリポ多糖に対する標識抗体を反応させ、リポ
多糖に結合した標識抗体を測定することによって、検体
中のリポ多糖を検出する方法が挙げられる。ここで用い
る標識抗体として、酵素で標識した抗体を用いる場合に
は、エンザイムイムノアッセイであり、同位元素で標識
した抗体を用いる場合には、ラジオイムノアッセイとな
る。より具体的には、リポ多糖吸着体として、例えばポ
リエステル布などにアミノ基またはイミノ基を有する化
合物を固定化したものを用い、標識抗体として、パーオ
キシダーゼなどの酵素で標識したリポ多糖に対する抗体
を用いる場合には、クロースエンザイムイムノアッセイ
（Cloth Enzyme Immunoassay:CEIA）となる。ＣＥＩＡ
については、Ｂｌａｉｓ ａｎｄ Ｙａｍａｚａｋｉ
ＵＳ Ｐａｔ．５，５１０，２４２，１９９６に記載さ
れた方法が参考となる。本発明のリポ多糖吸着体をＣＥ
ＩＡに採用した場合には、従来の抗生物質であるポリミ
キシンＢを吸着固定化した担体を用いる方法と比べ、検
出感度が同等もしくは１０倍程度高くグラム陰性菌のリ
ポ多糖ひいてはグラム陰性菌そのものを検出でき、また
安価で安全で操作が容易な検出を可能とする。

【００１１】ＣＥＩＡにより検体中のリポ多糖の検出を
行う場合には、アミノ基またはイミノ基を有する化合物
を固定化した織布または不織布を、フィルターに固定
し、固定された織布または不織布に、リポ多糖の存在が
疑われる検体液を一回もしくは数回通過させて、ＣＥＩ
Ａを行うのが好ましい。このように織布または不織布を
フィルターに固定して検体液を一回もしくは複数回通過
させることにより、短時間で検体液中のリポ多糖を織布
または不織布に吸着させることができるため、検出時間
が短縮でき、また極めて低濃度のリポ多糖を含む検体液
でもその存在の有無を検出することができる。このよう
なＣＥＩＡは、フィルターおよび検体液を通過させるた
めの注射用シリンジ入れ口を備えたカートリッジを用い
て行うのが好ましい。このようなカートリッジの例を図
７に示した。図７には、使い捨てカートリッジ（上側）
と再使用カートリッジ（下側）を示した。使い捨てカー
トリッジは、フィルターと、ＰＥＩなどのアミノ基また
はイミノ基を有する化合物を固定化した織布または不織
布を備え、更に注射用シリンジ入れ口を備えたものであ
る。再使用カートリッジは、カートリッジの上側半分は
ねじによって開閉可能になっており、織布または不織布
が取替え可能になっているものである。図７に示されて
いるように、カートリッジの上側と下側には注射用シリ
ンジ入れ口を備えており、検体液を入れた注射器をこの
入口にセットして、検体液を繰り返し交互にフィルター
に固定された織布または不織布を通過させることによっ
て、検体液中のリポ多糖をより高濃度に吸着させること
ができ、極めて低濃度のリポ多糖を含む検体液でもその
存在の有無を検出することができる。また、注射用シリ
ンジ入れ口の上側と下側は、図７に示したように、ずれ
ていてもよく、この場合には、Ｄｏｔ ｂｌｏｔ法によ
りＣＥＩＡを行う時に上側から直接結果を観察できる利
点を有する。注射器を使用する方法に代えて、カートリ
ッジにぺリスタポンプを備えて検体液を相当時間通過さ
せることもできる。以上のようにして検体液を織布また
は不織布に通過させた後、そのままＤｏｔｂｌｏｔ分析
に付してもよく、また織布または不織不を取り出して、
通常の方法により、標識抗体等を用いてリポ多糖の検出
を行うこともできる。

【００１２】以上に説明した本発明のリポ多糖吸着体、
特にＰＥＩなどを固定化したリポ多糖吸着体は重金属類
とキレート複合体を作るので、水、海水、工場廃水等よ
り重金属類を回収除去するのにも用いられる。また、水
や生体水より核酸分子（ＤＮＡ）を除く目的にも使用す
ることができる。

【００１３】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説
明する。本発明は実施例により、なんら限定されるもの
ではない。 実施例１ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）をポリエステル布に吸着
させることによるＰＥＩ吸着布の作成 ５．５ｘ８ｃｍのポリエステル布（ＣＥＩＡを行う際に
サンプルをピペットする場所をすでにプリントしてある
布を用いた）を７０％アルコール中で約２−５分浸した
後ステンレス網上で蒸溜水をかけてアルコールを除き更
に熱湯蒸溜水をかけて洗い、プリントインクの油や布製
造中に起こる汚染を除いて、水を良く切った後ブロット
した布を十分浸す量（一枚当り５ｍｌ）の５％ ＰＥＩ
水溶液中に入れ、布に含まれる空泡を除いた後シールし
て４０℃で２時間放置した。布を吸引フィルター上で蒸
溜水で良く洗った後風乾してＰＥＩ吸着布を作成した。
プリントしていない白地のポリエステル布の場合は２０
％アルコールで洗うのみで、熱湯蒸溜水で洗う段階は必
要無かった。

【００１４】実施例２ＰＥＩ水溶液中でのポリエステル布の処理時間の検討 ＰＥＩ（Ｍ_W２５０００）がポリエステル布に如何に早
く布に吸着して飽和に達するかを検討した。６ｘ６ｍｍ
のポリエステル布を７０％エチルアルコール中で約２−
５分浸した後、ステンレス網上で蒸溜水をかけてアルコ
ールを除き更に熱湯蒸溜水をかけて洗い水を良く切った
後ブロットした。布を十分浸す量の５％ＰＥＩ（Ｍ_W２
５０００）水溶液中に入れ、布に含まれる空気泡を除い
た後シールして４０℃で５分〜１８時間の種々の時間放
置（インキュベーション）した。布を吸引フィルター上
蒸溜水で良く洗った後風乾した。得られたＰＥＩ吸着布
について、フェノールレッドが定量的にＰＥＩと結合す
ることを利用したフェノールレッド法により吸着したＰ
ＥＩ量を定量した。即ち、ＰＥＩ吸着布を乾燥後重量を
測定した後、１％フェノールレッド水溶液中に室温で３
０分放置後蒸溜水で良く洗いブロットし、次いで１ｍｌ
の０．１Ｎ ＮａＯＨ中にフェノールレッドを抽出し、
５５９ｎｍ（Ａ５５９）の吸光度を測った。１ｍｌの
０．１Ｎ ＮａＯＨ中の各種濃度のフェノールレッドを
用いて作成した検量線より吸着ＰＥＩを定量した。定量
結果は図１グラフに示した通りである。本実験に用いた
ポリエステル布のようにマクロ過疎性不織布は大きな表
面積を持ち吸着速度も早く、図１から明らかなように、
ＰＥＩのポリエステル布への吸着は２時間で飽和に達し
た。

【００１５】実施例３種々の分子量のＰＥＩのポリエステル布への吸着量の測
定 種々の分子量のＰＥＩをポリエステル布へ吸着させその
飽和点を調べた。即ち、ＰＥＩは多くの分子量のものが
市販で得られるが、分子量が８００、２０００、２５０
００、７００００のそれぞれのＰＥＩの５％水溶液を用
い、４０℃で２時間ポリエステル布を浸漬し、吸着した
ＰＥＩ量をフェノールレッド法で調べた。得られた結果
を図２のグラフに示した。図２のグラフから分かるよう
に、分子量が２０００、２５０００および７００００の
ＰＥＩはほぼ同量の吸着を示したが、分子量８００のＰ
ＥＩは約その半分の量であった。どの布もＣＥＩＡ用と
して適していた。特に分子量８００のＰＥＩを吸着させ
た布が最も適していた。

【００１６】実施例４種々の分子量のＰＥＩをポリエステル布へ吸着させたＰ
ＥＩ吸着布を用いたＣＥＩＡによリポ多糖の検出性能の
検討 分子量が８００、２０００、２５０００、７００００の
ＰＥＩを用い、実施例１と同様にして、ＰＥＩ吸着ポリ
エステル布を調製し、ＣＥＩＡのドットブロット法によ
ってリポ多糖の検出性能を調べた。対照にポリミキシン
をポリエステル布に吸着させたポリミキシン吸着布を同
様の方法で調製しその検出性能を調べた。即ち、１ｃｍ
おきに５μｌのサルモネラＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）サン
プルを５．５×８ｃｍＰＥＩ吸着布およびポリミキシン
吸着布にあてがった。室温で１５分放置後、粗粒子フィ
ルター上で吸引しながらＰＢＳＴ（リン酸サリンバッフ
ァーに０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む）で洗浄し
た。ＰＥＩ吸着布およびポリミキシン吸着布の水分を吸
収紙で軽く除き、サルモネラＬＰＳに対する抗体ＣＳＡ
−１とパーオキシダーゼが連結したＣＳＡ−１コンジュ
ゲートの希釈液（５０％グリセロール溶液中に該コンジ
ュゲートを０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で含むストック液
を、０．１％ Ｂｌｏｃｋｅｒ Ｃａｓｅｉｎを含んだ
ＰＢＳで２０００倍に希釈した）の４ｍｌを加え、１５
分放置後、同様にしてＰＢＳＴで洗浄した。これらの布
を各４ｍｌのＴＭＢ試薬溶液（３５ｍｇの不溶性ＴＭＢ
パウダー試薬を１ｍｌの水に加えたもの）に５〜１０分
浸漬した。ＰＥＩあるいはポリミキシンによって固定化
されたサルモネラＬＰＳは、サルモネラＬＰＳに対する
抗体とパーオキシダーゼが連結したＣＳＡ−１コンジュ
ゲートを結合固定し、パーオキシダーゼが基質であるＴ
ＭＢに作用して、結局ＬＰＳが存在している布上の部位
に青いスポットが白地に浮かび上がって観察される。又
この布は、記録として長期保管できる。この方法によっ
て、ＰＥＩ（Ｍ_W８００）布はＬＰＳが１０ｎｇ／ｍｌ
まで検出出来たが、ポリミキシン布も含めて１００ｎｇ
／ｍｌが限度であった。従ってどの分子量であってもＰ
ＥＩを吸着させたＰＥＩ布はどれもＣＥＩＡに適してい
たが、ＰＥＩ（Ｍ_W８００）布が他に比べて感度が良く
最も好ましかった。

【００１７】実施例５種々の濃度のＰＥＩで吸着させたＰＥＩ吸着布を用いた
ＣＥＩＡによるリポ多糖の検出性能の検討 種々の濃度のＰＥＩ（Ｍ_W８００）で吸着させた布でＣ
ＥＩＡのシグナルが最高になるＰＥＩ濃度を調べた。実
施例２と同様にしてＰＥＩ吸着ポリエステル布６ｘ６ｍ
ｍを調製した。但し、種々の濃度（１〜１０ｍｇ／ｍ
ｌ）のＰＥＩ（Ｍ _W８００）水溶液５０μｌ中４０℃で
１６時間の処理を行ってＰＥＩを吸着させた。次いでＣ
ＥＩＡによりアッセイをおこなった。即ち、各吸着布に
サルモネラＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）５μｌサンプルをあ
てがい室温で１５分放置した。以下、実施例４と同様
に、ＰＢＳＴで洗浄後、５０μｌのＣＳＡ−１コンジュ
ゲート希釈溶液に１５分浸漬し、再びＰＢＳＴで洗浄し
た。これらの布を各１ｍｌのＴＭＢ試薬（３５ｍｇの水
溶性ＴＭＢパウダー試薬を１ｍｌの水に加えたもの）と
１６ｘ１００−ｍｍ試験管中で３０分間３０℃の温水振
盪器で振盪した。２５０μｌの２Ｎ硫酸を加えて反応を
止め４５０ｎｍの吸光度を測った。調製した各布に対し
サルモネラＬＰＳをあてがわないでＣＥＩＡを行った場
合を対照とした。得られた結果を図３に示した。図３に
示した結果から明らかな通り、ポリエステル布にＰＥＩ
を吸着させるのに４−６ｍｇ／ｍｌのＰＥＩ溶液で十分
であることが判明した。サルモネラＬＰＳをあてがわな
いでＣＥＩＡを行った対照実験の場合には、どの濃度の
ＰＥＩ吸着布に於ても非常に低いシグナルを示したこと
はＬＰＳがＰＥＩと互いに密接に強い相互作用していて
ＰＥＩ吸着布がＣＥＩＡに適している事を示している。

【００１８】実施例６ＰＥＩをポリエステル布に反応させることによるＰＥＩ
反応布の作成 市販の分子量８００と２５０００の無水ＰＥＩを用いて
ポリエステル布にＰＥＩを反応させてＰＥＩ反応布を作
製した。分子量８００と２５０００の無水ＰＥＩは粘性
が非常に高いので無水アルコール（一般に低分子アルコ
ールやＤＭＳＯでも可。安全面より無水エタノールが良
い）で７０％に（どの％でも良いが１０〜９０％でもア
ルコールはポリエステルを少しずつ溶かすので〜７０％
が適当である）に希釈し、実施例２と同様に洗浄した後
よく乾燥した５．５ｘ８ｃｍのポリエステル布全体に布
一枚当り４ｍｌをガラス板上において満遍に塗布し、約
３０分室温で放置後そのまま１１０℃のドライバス上に
移して２分から５０分にわたりＰＥＩの必要導入量に応
じて加熱し反応させた。加熱後布を水中に２時間〜一晩
室温で放置し、水を数回交換後吸引フィルター上蒸溜水
で良く洗った後風乾した。同様の方法条件で調製した６
ｘ６ｍｍの各布を実施例１のフェノールレッド法でＰＥ
Ｉの導入程度を調べた。得られた結果を図４に示した。
図４から分かるように、反応時間が長くなるに従って、
導入されたＰＥＩの量も上昇した。また、ＰＥＩ反応布
を用いてドットブロット法によるＣＥＩＡにもっとも適
している布を吟味した結果、分子量８００のＰＥＩを２
〜５分間１１０℃で反応させて得られる布であった。他
の布もＣＥＩＡに用いることができるがＢｌｏｃｋｅｒ
の濃度を０．２％以上用いる必要があり又それでもスポ
ットの下地が完全に白にならない為弱いシグナルを読み
取り難い問題があった。

【００１９】実施例７３，３’−イミノビス（プロピアミン） （ＩＢＰＡ）
布をポリエステル布に反応させることＩＢＰＡ反応布の
作成 アルキルアミンであるＩＢＰＡをドラフト中、実施例６
と同様に洗浄乾燥した５．５ｘ８ｃｍのポリエステル布
に一枚当り４ｍｌを満遍に塗布し８０℃（室温〜１００
℃でも可）のドライバス上で２分から４０分（８０℃
で、これ以上長くすると布が分解した）にわたりＩＢＰ
Ａの必要導入量に応じて加熱した。反応後、布を水中に
２時間室温で放置し水を数回交換後、吸引フィルター上
蒸溜水で良く洗った後風乾した。３，３’−イミノビス
（Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピルアミン）反応布も同じ条件
下で作成できた。どちらの布を用いてもドットブロット
法でＬＰＳが１００ｎｇ／ｍｌまで検出出来た。

【００２０】実施例８ＰＥＩ反応布のポリミキシン捕獲能の検定 分子量８００のＰＥＩを１１０℃で５分間反応させて得
られるＰＥＩ反応布のサルモネラＬＰＳ捕獲能をポリミ
キシン吸着布と比較した。即ち、実施例６と同様にして
分子量８００のＰＥＩを１１０℃で５分間反応させて調
製した６ｘ６ｍｍ四方のＰＥＩ反応布と、実施例４の方
法で調製した６ｘ６ｍｍのポリミキシン吸着布に、サル
モネラＬＰＳ ５μｌ（１０μｇ／ｍｌ）をスポットし
て、実施例５と同様にＣＥＩＡを行った。ＣＥＩＡにお
いてはサンプルを布にあてがい室温で５〜２５分間の各
種時間でサンプルと布を接触させた後、ＰＢＳＴで洗浄
後に検出を行った。また、各サンプル小片布をＴＭＢ試
薬１ｍｌ中３０℃で５分間振盪を行った。得られた結果
を図５に示した。図５から分かるように、ＰＥＩ反応布
は２分以内にＬＰＳを完全に捕獲するのに比べてポリミ
キシン吸着布は約１５分でほぼ完全捕獲に達する。従っ
てＰＥＩ吸着布はポリミキシン吸着布より強い吸着性を
示し、そのため捕獲をきわめて早く完全に行うことがで
きる。これによりアッセイ時間を短縮する事を可能にす
る。

【００２１】実施例９ＰＥＩ反応布のサルモネラＬＰＳの検出感度の検定 ＰＥＩ反応布とポリミキシン吸着布に対して種々の濃度
のサルモネラＬＰＳを接触させて両者のサルモネラＬＰ
Ｓの捕獲能、即ち検出感度を比較した。即ち、６ｘ６ｍ
ｍ四方のＰＥＩ吸着布およびポリミキシン吸着布に各種
濃度のサルモネラＬＰＳサンプル５μｌをスポットし
た。以後、各サンプルは実施例５と同様にアッセイを行
った。得られた結果を図６に示した。図６のグラフから
分かるように、ＰＥＩ反応布とポリミキシン吸着布のサ
ルモネラＬＰＳ捕獲能、即ち検出感度は同じ（ほぼ１０
０ｎｇ／ｍｌが限度）であったが、ドットブロット法で
はＰＥＩ反応布は更に１０倍捕獲能、即ち検出感度が上
で１０ｎｇ／ｍｌのスポットまで確認された。

【００２２】実施例１０ＰＥＩ反応布を用いた大腸菌ＬＰＳの検出 ＰＥＩ反応布を用いて他のグラム陰性菌である大腸菌の
ＬＰＳもＣＥＩＡにより検出できるか否かを調べた。実
施例９と同様にＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１１１ ＬＰＳを抽出
バッファーで各段階に希釈したサンプル５μｌずつをＰ
ＥＩ反応布にあてがった。これにムリン抗Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｏ１１１ ＩｇＭを反応させ更にこのＩｇＭに抗ムリ
ンＩｇＭ−ＨＲＰコンジュゲートを反応させたのちドッ
トブロット法で発色させた。サルモネラＬＰＳの場合と
同じくスポットも明快で１０ｎｇ／ｍｌまで検出が可能
であった。

【００２３】実施例１１カートリッジを利用したＣＥＩによるＬＰＳの検出 ａ） ＰＥＩ吸着布の作成 ５．５ｘ８ｃｍのポリエステル布を１０−１００％アル
コール中で約２−５分浸した後、ステンレス網上で蒸溜
水をかけてアルコールを除き、更に熱湯蒸溜水をかけて
洗い水を良く切った後、ブロットした布を十分浸す量、
即ち、一枚当り５ｍｌの５％ ＰＥＩ８００水溶液中に
入れ布に含まれる空泡を除いた後、シールして４０℃で
２から６時間放置した。布を吸引フィルター上蒸溜水で
良く洗った後風乾した。プリントしていない白地のポリ
エステル布の場合は熱湯蒸溜水で洗う段階は必要無かっ
た。 ｂ） ＰＥＩ反応布の作成 上記と同様に洗浄した後良く乾燥した布を、ガラス板上
で５．５ｘ８ｃｍのポリエステル布一枚当り４ｍｌの７
０％無水ＰＥＩ無水アルコール溶液を、布全体に満遍に
塗布し約３０分室温で放置後、ドラフト中１１０℃のド
ライバス上で２分から数時間にわたりＰＥＩの必要挿入
量に応じて加熱した。加熱後布を水中に２時間から一晩
室温で放置し水を数回交換後、吸引フィルター上蒸溜水
で良く洗った後風乾した。

【００２４】ｃ） ポリミキシン布の作成 Ｂｌａｉｓ ａｎｄ Ｙａｍａｚａｋｉ法により改良作
成した。ポリミキシンＢスルフェート５ｍｇ／ｍｌ液中
で作成したポリミキシン布に水溶性ポリマー例えばポリ
エチレングリコール１０，０００をコートすることによ
り乾燥状態でサンプルを付けやすく改良した。 ｄ） ＬＰＳサンプルの作法 精製されたサルモネラＬＰＳ液もしくはサルモネラＬＰ
Ｓを含む鶏肉スープに０．５％コール酸ナトリウムを含
ませ、それを１００℃で１０分加熱してサンプルとし
た。 ｅ） ＰＥＩ−布をセットしたＬＰＳ濃縮吸着用カート
リッジ 図７に示すように、使い捨て用のカートリッジは６ｍｍ
直径の円形ＰＥＩ−布をセットしたもので上下に注射用
シリンジ（例えば１０ｍｌ容量）が差し込めるようにし
てあり、上方は中心より外れて位置していることにより
酵素抗体反応による色素の検定が出来る様になってい
る。他方、ＰＥＩ−布が交換出来る再使用カートリッジ
はほぼ同様のデザインであるが、図７に示すごとくネジ
で上下の部分に分けられる様になっているため布が交換
できる。シリンジ容量以上ではぺリスタ チュウブポン
プを用いてサンプルを回転させる。

【００２５】ｆ） ＰＥＩ−布カートリッジを用いた多
量のサンプル中の微量ＬＰＳの濃縮 上記のカートリッジの両側に１０ｍｌ容量の注射用シリ
ンジを差し込み、その上方の入れ口からサンプル液を１
ｍｌ当り４５秒かけて通過させ液を合計７回まで布を通
した。布をカートリッジ中から取りだしてＰＢＳＴでよ
く洗浄した。以下ＣＥＩＡ法に従ってアッセイを行っ
た。 ｇ） ＣＥＩＡによる検出 Ｂｌａｉｓ ａｎｄ Ｙａｍａｚａｋｉが確立した方法
によった。上記により作成したＰＥＩ布又はポリミキシ
ン布は６ｍｍ四方に切り、５μｌのＬＰＳサンプルを布
にあてがった。６ｍｍ直径円ＰＥＩ−布交換可能カート
リッジに吸着させた場合は、カートリッジより取りだし
た。室温で１５分放置後、粗粒子フィルター上吸引でＰ
ＢＳＴ（リン酸サリンバッファーに０．０５％のＴｗｅ
ｅｎ２０を含む）で洗浄した。布の水分を吸収紙で軽く
除き、サルモネラＬＰＳの場合、５０μｌのＣＳＡ−１
コンジュゲート（５０％グリセロール溶液中０．１ｍｇ
／ｍｌのストック液を２０００倍に０．１％ブロッカー
カゼインを含んだＰＢＳで希釈した）を加え、１５分放
置後、同様にしてＰＢＳＴで洗浄した。これらの布を各
１ｍｌの水溶性ＴＭＢ試薬（３５ｍｇ水溶性ＴＭＢ粉末
を１ｍｌの水に溶解）と１６ｘ１００ｍｍ試験管中で５
から６０分間、３０℃の温水振盪器で振盪した。２５０
μｌの２Ｎ硫酸を加えて反応を止め４５０ｎｍ
（Ａ₄₅₀）の吸光度を測った。 ｇ） Ｄｏｔ ｂｌｏｔアッセイによる検出 ６ｍｍ直径円ＰＥＩ−布交換可能カートリッジに吸着さ
せたＰＥＩ布を取りだした。以後上記と同じ条件で布を
処理し最後の段階では水不溶性ＴＭＢ試薬（３５ｍｇ水
不溶性ＴＭＢ粉末を１ｍｌの水に溶解）を用いて布上で
発色を５から１０分間させ、粗粒子フィルター上吸引で
水で洗浄した。ＬＰＳが存在している所に吸着したＨＲ
Ｐのパーオキシダーゼ活性で生じた青いスポットが白地
に浮かび上がって観察される。この布は長期レコードと
して保存出来る。使い捨てカートリッジを用いた場合は
上記と同様にシリンジを用いて反応過程を行い最終の色
素判定もカートリッジの上部より観察を行うことができ
る。

【００２６】ｈ） 結果と考察 １）６ｘ６ｍｍのＰＥＩ−布またはポリミキシン布に５
μｌのサルモネラＬＰＳ１０μｇ／ｍｌをスポットして
１秒から１５分間以内にＰＢＳＴで洗浄した。このシリ
ーズの布をＣＥＩＡすることにより２種の布のＬＰＳ吸
着の違いを計測し比較した。ＰＥＩ−布は１秒で６７
％、５秒で８５％、５分で１００％ＬＰＳを吸着した。
一方ポリミキシン布は１秒で２７％、１００％吸着する
のにほぼ１５分かかった。この結果よりＰＥＩ−布はポ
リミキシン布より２倍以上速くＬＰＳを吸着することが
判明した。 ２）のＬＰＳが入っている１０ｍｌサンプルを１０ｍｌ
シリンジに入れ上記の濃縮法によりＰＥＩ−布カートリ
ッジを一度だけ３秒から２０分かけて通すことによりＰ
ＥＩ−布に吸着したＬＰＳをＣＥＩＡで計測すると、最
低１ｍｌ当り４５秒かけて通過させれば１００％吸着す
ることが判明した。 ３）１ｍｌもしくは１０ｍｌ当り１ｐｇより１μｇのＬ
ＰＳが入っているサンプルを上記の濃縮法によりＰＥＩ
−布カートリッジを通しｄｏｔ ｂｌｏｔ法ＣＥＩＡを
行った。これにより１ｍｌのサンプルよりは１ｐｇま
で、１０ｍｌのサンプルよりは１０ｐｇまで検出出来
た。サンプル量が多いほど感度は下がる傾向にあるが１
ｍｌのサンプルでは１ｐｇのＬＰＳつまり約１６菌体ま
で検出可能であった。 ４）実状のサンプルに近い状態中に含まれているＬＰＳ
をこの濃縮法で検出可能かを調べるため，１μｇのＬＰ
Ｓを１ｍｌもしくは１０ｍｌの鶏肉スープ（リプトン鶏
スープ、蛋白脂肪炭水化物としての固形分８４ｍｇ／ｍ
ｌを含む）中に含ませ上記の３）と同様に実験を行い吸
着したＬＰＳをＣＥＩＡで比較した。１ｍｌのサンプル
よりは８４％、１０ｍｌのサンプルよりは３７％のＬＰ
Ｓが布に吸着されていた。一方同様にしてＰＢＳ緩衝液
中では１ｍｌは９７％、１０ｍｌでは８４％が吸着し
た。１０ｍｌの鶏肉スープ中低い吸着率は微細不溶固形
成分が布に吸着したためＬＰＳ吸着が阻害されたためと
思われるが検出は充分可能であった。

【００２７】

【発明の効果】本発明により提供される、ポリエチレン
イミンなどのアミノ基またはイミノ基を有する化合物を
ポリエステル布などの担体に吸着もしくは共有結合によ
り固定化してなるリポ多糖吸着体は、グラム陰性菌のリ
ポ多糖を検出するクロースエンザイムイムノアッセイに
用いた場合は、従来の抗生物質であるポリミキシンＢを
吸着固定した担体を用いる方法と比べ、サンプルを乾燥
した例えばポリエチレンイミン布にそのままあてがうこ
とが出来、検出感度が同等もしくは１０倍程度高くグラ
ム陰性菌のリポ多糖、ひいてはグラム陰性菌そのものを
検出でき、また安価で、毒性が非常に低いため安全で操
作が容易な検出を可能とするものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）水溶液
中でのポリエステル布の浸漬（インキュベーション）時
間を変えてＰＥＩ吸着量を調べたグラフである。

【図２】図２は、種々の分子量のＰＥＩ水溶液中にポリ
エステル布を２時間浸漬させた時の飽和ＰＥＩ吸着量を
調べたグラフである。

【図３】図３は、種々の濃度のＰＥＩ水溶液中にポリエ
ステル布を浸漬させて得たＰＥＩ吸着布を用いてクロー
スエンザイムイムノアッセイ（ＣＥＩＡ）によりリポポ
リサッカライド（ＬＰＳ）を検出した結果を示すグラフ
である。

【図４】図４は、１１０℃で加熱する反応時間を変えて
ポリエステル布へのＰＥＩの導入量を調べたグラフであ
る。

【図５】図５は、ＰＥＩ反応布およびポリミキシン吸着
布を用いてＣＥＩＡによるサルモネラＬＰＳの検出を行
う際に、布をＬＰＳとの接触時間を変えて検出を行った
時のＬＰＳの捕獲を比べたグラフである。

【図６】図６は、各種の濃度のサルモネラＬＰＳに対し
てＰＥＩ反応布およびポリミキシン吸着布を用いたＣＥ
ＩＡにより検出を行った時の検出感度を示すグラフであ
る。

【図７】図７は、ＣＥＩＡに用いることができる使い捨
てカートリッジ（上側）と再使用カートリッジ（下側）
を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 國武 雅司 熊本県熊本市渡鹿１丁目16 合同住宅１− 44 (72)発明者 宮崎 雅雄 東京都中央区八重洲２−７−２ 理工協産 株式会社内 (72)発明者 井上 哲秀 東京都中央区八重洲２−７−２ 理工協産 株式会社内 (72)発明者 平山 忠一 熊本県熊本市下南部三丁目11番地63号 Ｆターム(参考） 4G066 AC27B AD06B AD10B BA09 BA16 BA38 CA54 DA07

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アミノ基またはイミノ基を有する化合物
   を担体に固定化してなるリポ多糖吸着体。
2. 【請求項２】 アミノ基またはイミノ基を有する化合物
   がポリアミン類、アルキレンアミン類、ポリイミン類ま
   たはアルキレンイミン類である請求項１のリポ多糖吸着
   体。
3. 【請求項３】 アミノ基またはイミノ基を有する化合物
   がポリアルキルアミン、ポリビニルアミン、エチルアミ
   ン、イミノビス（プロピルアミン）、ポリアルキルイミ
   ンまたはポリビニルイミンである請求項１または２のリ
   ポ多糖吸着体。
4. 【請求項４】 アミノ基またはイミノ基を有する化合物
   が分子量２００〜１００，０００のポリエチレンイミン
   である請求項１から３のいずれかのリポ多糖吸着体。
5. 【請求項５】 担体が繊維またはプラスチックである請
   求項１から４のいずれかのリポ多糖吸着体。
6. 【請求項６】 担体が織布、不織布、マイクロプレー
   ト、ビーズ、チューブまたは微粒子の形態にある請求項
   １から５のいずれかのリポ多糖吸着体。
7. 【請求項７】 ポリエチレンイミンをポリエステル布ま
   たはポリエステル／レーヨン布に吸着またはエステルア
   ミド交換反応による共有結合で固定化してなるリポ多糖
   吸着体である請求項１から６のいずれかのリポ多糖吸着
   体。
8. 【請求項８】 検体中のリポ多糖またはそれを産生する
   微生物をイムノアッセイにより測定するための請求項１
   から７のいずれかのリポ多糖吸着体。
9. 【請求項９】 リポ多糖の存在が疑われる検体と請求項
   １から８のいずれかのリポ多糖吸着体を接触させ、次い
   でリポ多糖吸着体に吸着したリポ多糖に対してリポ多糖
   に対する標識抗体を反応させてリポ多糖を検出すること
   からなる、イムノアッセイによるリポ多糖の検出方法。
10. 【請求項１０】 織布または不織布のリポ多糖吸着体を
    用いてクロースエンザイムイムノアッセイ（Cloth Enzy
    meb Immunoassay）により検出する請求項９の検出方
    法。
11. 【請求項１１】 アミノ基またはイミノ基を有する化合
    物を固定化した織布または不織布を、フィルターに固定
    し、固定された織布または不織布に、リポ多糖の存在が
    疑われる検体液を一回もしくは数回通過させて、クロー
    スエンザイムイムノアッセイを行う請求項１０の検出方
    法。
12. 【請求項１２】 フィルターおよび検体液を通過させる
    ための注射用シリンジ入れ口を備えたカートリッジを用
    いて行う請求項１１の検出方法。