JP2003189890A - タンパク質のｉｎｖｉｔｒｏ発現用の線状ＤＮＡ断片の作製方法 - Google Patents
タンパク質のｉｎｖｉｔｒｏ発現用の線状ＤＮＡ断片の作製方法Info
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 タンパク質のin vitro発現用の線状DNA断片
の作製方法を提供する。 【解決手段】 発現ベクターを線状化することによって
得られる発現に必要な制御エレメントを含む線状DNA断
片、および該線状DNA断片の両末端に相補的な領域を両
末端に有するタンパク質コード遺伝子を、該線状DNA断
片上の発現制御領域の上流および下流に結合するプライ
マー対を用いて共に増幅する。
の作製方法を提供する。 【解決手段】 発現ベクターを線状化することによって
得られる発現に必要な制御エレメントを含む線状DNA断
片、および該線状DNA断片の両末端に相補的な領域を両
末端に有するタンパク質コード遺伝子を、該線状DNA断
片上の発現制御領域の上流および下流に結合するプライ
マー対を用いて共に増幅する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、タンパク質のin v
itro発現用の線状DNA断片の作製方法に関する。この方
法は、発現ベクターを線状化することによって得られる
発現に必要な制御エレメントを含む線状DNA断片、およ
び該線状DNA断片の両末端に相補的な領域を両末端に有
するタンパク質コード遺伝子を、該線状DNA断片上の発
現制御領域の上流および下流に結合するプライマー対を
用いて共に増幅することを特徴とする。さらに、線状DN
A断片とオーバーラップする領域を両末端に有するタン
パク質コード遺伝子の調製に関する方法を開示する。ま
た本発明は、タンパク質のin vitro発現用の本発明に係
る線状DNA断片、これらのDNA断片の使用、タンパク質の
in vitro発現用の本発明に係る線状DNA断片を含むキッ
ト、および本発明に係る線状DNA断片から開始するタン
パク質のin vitro発現方法を包含する。
itro発現用の線状DNA断片の作製方法に関する。この方
法は、発現ベクターを線状化することによって得られる
発現に必要な制御エレメントを含む線状DNA断片、およ
び該線状DNA断片の両末端に相補的な領域を両末端に有
するタンパク質コード遺伝子を、該線状DNA断片上の発
現制御領域の上流および下流に結合するプライマー対を
用いて共に増幅することを特徴とする。さらに、線状DN
A断片とオーバーラップする領域を両末端に有するタン
パク質コード遺伝子の調製に関する方法を開示する。ま
た本発明は、タンパク質のin vitro発現用の本発明に係
る線状DNA断片、これらのDNA断片の使用、タンパク質の
in vitro発現用の本発明に係る線状DNA断片を含むキッ
ト、および本発明に係る線状DNA断片から開始するタン
パク質のin vitro発現方法を包含する。
【０００２】
【従来の技術】大腸菌溶解物に基づく無細胞DNA依存的i
n vitro転写/翻訳は、環状二重らせんDNAの発現との関
連において、また、長い線状DNAの発現との関連におい
て事実上十分に機能する。短い線状DNA断片を発現させ
る試みは、非常に限られた成功しか収めなかった。用い
るDNAが小さければ小さいほど、認めうる量の遺伝子産
物を得ることはより困難となる。こうした困難さは部分
的にはエキソヌクレアーゼの存在に起因することが示さ
れた。従って、エキソヌクレアーゼVが、大腸菌のS30溶
解物を用いたin vitro転写および翻訳の間に、3'末端か
ら開始する線状DNAの分解に関与することが示された。
n vitro転写/翻訳は、環状二重らせんDNAの発現との関
連において、また、長い線状DNAの発現との関連におい
て事実上十分に機能する。短い線状DNA断片を発現させ
る試みは、非常に限られた成功しか収めなかった。用い
るDNAが小さければ小さいほど、認めうる量の遺伝子産
物を得ることはより困難となる。こうした困難さは部分
的にはエキソヌクレアーゼの存在に起因することが示さ
れた。従って、エキソヌクレアーゼVが、大腸菌のS30溶
解物を用いたin vitro転写および翻訳の間に、3'末端か
ら開始する線状DNAの分解に関与することが示された。
【０００３】多くの場合、mRNA分解はほとんど全ての生
物における遺伝子発現を調節するための制御点である(R
ossら, 1995)。エンドリボヌクレアーゼEは、大腸菌の
デグラダソーム(degradasome)における主要な酵素とし
て同定された(Grunberg-Managoら, 1999)。Invitrogen
社は、RNaseコード遺伝子に突然変異を有し、かつmRNA
安定性の向上とタンパク質収量の増加が認められるBL21
株を提供する。また原核生物のmRNAは、3'末端の二次構
造によってエキソヌクレアーゼ分解から保護されている
(Klugら, 1987；Mackie, 1987)。
物における遺伝子発現を調節するための制御点である(R
ossら, 1995)。エンドリボヌクレアーゼEは、大腸菌の
デグラダソーム(degradasome)における主要な酵素とし
て同定された(Grunberg-Managoら, 1999)。Invitrogen
社は、RNaseコード遺伝子に突然変異を有し、かつmRNA
安定性の向上とタンパク質収量の増加が認められるBL21
株を提供する。また原核生物のmRNAは、3'末端の二次構
造によってエキソヌクレアーゼ分解から保護されている
(Klugら, 1987；Mackie, 1987)。
【０００４】線状DNAのin vitro発現において、長いDNA
断片は、付加的配列の導入によってエキソヌクレアーゼ
からのDNAの保護が増大し、かつmRNAの安定性が向上す
るという利点を付与する。
断片は、付加的配列の導入によってエキソヌクレアーゼ
からのDNAの保護が増大し、かつmRNAの安定性が向上す
るという利点を付与する。
【０００５】クローニングを行わずPCRにより作製され
るDNAから開始する遺伝子発現方法は、いわゆる発現PCR
として1991年に初めて記載された(Kainら, 1991)。発現
PCRは、真核生物in vitro発現系(Kain & Lanar, 1994；
Switzer & Heneine, 1995；Henkel & Beuerle, 1993；R
estoら, 1992)ならびに原核生物in vitro発現系(Lesley
ら, 1991；Martemyanovら, 1997；Burksら, 1997；Ohuc
hiら, Nakanoら, 1999)において用いられた。
るDNAから開始する遺伝子発現方法は、いわゆる発現PCR
として1991年に初めて記載された(Kainら, 1991)。発現
PCRは、真核生物in vitro発現系(Kain & Lanar, 1994；
Switzer & Heneine, 1995；Henkel & Beuerle, 1993；R
estoら, 1992)ならびに原核生物in vitro発現系(Lesley
ら, 1991；Martemyanovら, 1997；Burksら, 1997；Ohuc
hiら, Nakanoら, 1999)において用いられた。
【０００６】線状DNAを作製するために以下のPCR技術が
使用されていた：Hechtは、米国特許第5,571,690号にお
いて、ワンステップPCR反応により作製した鋳型から開
始する、タンパク質の無細胞合成方法を記載する。この
方法においては、ファージプロモーター領域を含む全遺
伝子配列が1つの遺伝子から増幅される(またRestoら, 1
992を参照されたい)。
使用されていた：Hechtは、米国特許第5,571,690号にお
いて、ワンステップPCR反応により作製した鋳型から開
始する、タンパク質の無細胞合成方法を記載する。この
方法においては、ファージプロモーター領域を含む全遺
伝子配列が1つの遺伝子から増幅される(またRestoら, 1
992を参照されたい)。
【０００７】Martemyatovら(1997)は、2ステップPCR反
応により作製した鋳型から開始する、大腸菌S30抽出物
に基づく無細胞系におけるタンパク質合成を示す。この
方法においては、標的遺伝子は2つの遺伝子特異的プラ
イマーを用いて増幅された。続いて、T7プロモーターお
よびリボソーム結合部位が、いわゆるメガプライマー(m
egaprimer)(長さ163ヌクレオチド)を用いた2回目のPCR
反応において融合された。また、PCRプライマーによる
プロモーターおよびリボソーム結合部位の組込みがPCR
方法に関する最新の書物(PCR Newton & Graham編, 199
4, Spectrum publisher, Heidelberg；PCR McPhersonお
よびMoller, 2000, BIOS Scientific Publishers, Oxfo
rd)に記載されている。
応により作製した鋳型から開始する、大腸菌S30抽出物
に基づく無細胞系におけるタンパク質合成を示す。この
方法においては、標的遺伝子は2つの遺伝子特異的プラ
イマーを用いて増幅された。続いて、T7プロモーターお
よびリボソーム結合部位が、いわゆるメガプライマー(m
egaprimer)(長さ163ヌクレオチド)を用いた2回目のPCR
反応において融合された。また、PCRプライマーによる
プロモーターおよびリボソーム結合部位の組込みがPCR
方法に関する最新の書物(PCR Newton & Graham編, 199
4, Spectrum publisher, Heidelberg；PCR McPhersonお
よびMoller, 2000, BIOS Scientific Publishers, Oxfo
rd)に記載されている。
【０００８】Ohuchiら(1998)は、Kainら(1991)によって
も用いられた、線状DNA鋳型を作製するためのオーバー
ラップ伸長PCR方法を使用する。このPCR方法は、制限酵
素を用いることなく、オーバーラップするPCR断片によ
って遺伝子を融合するためのオーバーラップ伸長による
遺伝子スプライシング(splicing by overlap extentio
n：SOE)として、Hortonら(1989)によって初めて記載さ
れた。それぞれ融合されるDNAセグメントに対して相同
な領域を5'末端に有するプライマー対を、SOEによる発
現PCRのための1回目のPCR反応に用いる。次いで融合さ
せるDNA断片を、2回目のPCR反応において存在させる(Ka
inら, 1991,図３を参照されたい)。
も用いられた、線状DNA鋳型を作製するためのオーバー
ラップ伸長PCR方法を使用する。このPCR方法は、制限酵
素を用いることなく、オーバーラップするPCR断片によ
って遺伝子を融合するためのオーバーラップ伸長による
遺伝子スプライシング(splicing by overlap extentio
n：SOE)として、Hortonら(1989)によって初めて記載さ
れた。それぞれ融合されるDNAセグメントに対して相同
な領域を5'末端に有するプライマー対を、SOEによる発
現PCRのための1回目のPCR反応に用いる。次いで融合さ
せるDNA断片を、2回目のPCR反応において存在させる(Ka
inら, 1991,図３を参照されたい)。
【０００９】特許出願WO 00/56914において、Liangおよ
びFelgnerは、SOE-PCRに基づいて転写活性のあるDNA分
子を作製する方法を記載する。この方法はプロモーター
を有するDNA断片、ターミネーターを有するDNA断片、こ
れらのDNA断片の5'末端に相同的なプライマー対、およ
びこれらのDNA断片の3'末端および発現される遺伝子配
列の5'末端に相同的なプライマー対を一緒に増幅するこ
とを特徴とする。
びFelgnerは、SOE-PCRに基づいて転写活性のあるDNA分
子を作製する方法を記載する。この方法はプロモーター
を有するDNA断片、ターミネーターを有するDNA断片、こ
れらのDNA断片の5'末端に相同的なプライマー対、およ
びこれらのDNA断片の3'末端および発現される遺伝子配
列の5'末端に相同的なプライマー対を一緒に増幅するこ
とを特徴とする。
【００１０】ワンステップPCRによる無細胞タンパク質
合成のためのDNA鋳型の作製は、増幅される全ての遺伝
子が対応する発現プラスミドに前もって存在しなければ
ならず、全く利点を付与しない。2ステップPCRの難点
は、極端に長い外部プライマーの合成である。この合成
は、効率的でなく、費用がかかる。長い外部プライマー
を用いた2ステップPCRのタンパク質発現の収量は、PCR
産物およびそれらから転写されたmRNAの安定性の低さに
起因して非常に低い。さらに、PCR反応それ自体も、プ
ライマーが長ければ長いほどダイマー形成の可能性が増
大するので、問題を生じやすい。SOEによる発現PCRにお
いては、融合されるDNA分子を最初に調製して、手間を
かけてゲルから抽出しなければならない(Ohuchiら, 199
8を参照されたい)。
合成のためのDNA鋳型の作製は、増幅される全ての遺伝
子が対応する発現プラスミドに前もって存在しなければ
ならず、全く利点を付与しない。2ステップPCRの難点
は、極端に長い外部プライマーの合成である。この合成
は、効率的でなく、費用がかかる。長い外部プライマー
を用いた2ステップPCRのタンパク質発現の収量は、PCR
産物およびそれらから転写されたmRNAの安定性の低さに
起因して非常に低い。さらに、PCR反応それ自体も、プ
ライマーが長ければ長いほどダイマー形成の可能性が増
大するので、問題を生じやすい。SOEによる発現PCRにお
いては、融合されるDNA分子を最初に調製して、手間を
かけてゲルから抽出しなければならない(Ohuchiら, 199
8を参照されたい)。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、タンパク質のin vitro発現用の線状DNA断片を作製
するための簡便な方法を提供することである。
は、タンパク質のin vitro発現用の線状DNA断片を作製
するための簡便な方法を提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】上記課題は、本発明に従
って、タンパク質のin vitro発現用の線状DNA断片の作
製方法により達成される。本発明に係る方法は、発現ベ
クターを線状化することによって得られる発現に必要な
制御エレメントを含む線状DNA断片を、該線状DNA断片の
両末端に相補的な領域を両末端に有するタンパク質コー
ド遺伝子と共に、該線状DNA断片上の発現制御領域の上
流および下流に結合するプライマー対を用いて増幅する
ことを特徴とする。
って、タンパク質のin vitro発現用の線状DNA断片の作
製方法により達成される。本発明に係る方法は、発現ベ
クターを線状化することによって得られる発現に必要な
制御エレメントを含む線状DNA断片を、該線状DNA断片の
両末端に相補的な領域を両末端に有するタンパク質コー
ド遺伝子と共に、該線状DNA断片上の発現制御領域の上
流および下流に結合するプライマー対を用いて増幅する
ことを特徴とする。
【００１３】
【発明の実施の形態】発現ベクターは、マルチクローニ
ングサイトにおける単純な制限酵素消化によって、マル
チクローニングサイトにおける二重制限酵素消化によっ
て、または発現ベクターにクローニングされた遺伝子を
切り離すことによって線状化することができる。別のベ
クター断片の作製方法は、インバースPCRによる増幅で
ある。
ングサイトにおける単純な制限酵素消化によって、マル
チクローニングサイトにおける二重制限酵素消化によっ
て、または発現ベクターにクローニングされた遺伝子を
切り離すことによって線状化することができる。別のベ
クター断片の作製方法は、インバースPCRによる増幅で
ある。
【００１４】好適な発現ベクターは、対応する発現系が
必要とする全ての調節エレメントを提供するものであ
る。大腸菌由来の溶解物およびT7系に基づく原核生物in
vitro発現系の場合には、T7プロモーター、リボソーム
結合部位およびT7ターミネーターをコードする発現ベク
ターは全てが好適であり、例えば、pIVEXベクター、pET
ファミリーの全てのT7発現ベクター、pCRT7-TOPOベクタ
ー、pDESTベクター、pCALベクターなどが挙げられる。T
7ポリメラーゼを含まない天然の大腸菌発現系において
は、内因性大腸菌プロモーター、リボソーム結合部位お
よびターミネーターをコードする全てのベクターが好適
であり、例えばpHB6、pVB6、pXB、pBH、pBV、pBX、pASK
IBAベクター、pBADおよびpTrxFusが挙げられる。真核生
物発現系においては、対応するin vivo系において機能
的な全ての発現ベクターが好適である。好ましい発現ベ
クターは、調節エレメントの配列と距離がタンパク質発
現のために最適化されているものであり、例えば大腸菌
の溶解物およびT7系に基づく原核生物in vitro発現系用
のpIVEXベクターが挙げられる。
必要とする全ての調節エレメントを提供するものであ
る。大腸菌由来の溶解物およびT7系に基づく原核生物in
vitro発現系の場合には、T7プロモーター、リボソーム
結合部位およびT7ターミネーターをコードする発現ベク
ターは全てが好適であり、例えば、pIVEXベクター、pET
ファミリーの全てのT7発現ベクター、pCRT7-TOPOベクタ
ー、pDESTベクター、pCALベクターなどが挙げられる。T
7ポリメラーゼを含まない天然の大腸菌発現系において
は、内因性大腸菌プロモーター、リボソーム結合部位お
よびターミネーターをコードする全てのベクターが好適
であり、例えばpHB6、pVB6、pXB、pBH、pBV、pBX、pASK
IBAベクター、pBADおよびpTrxFusが挙げられる。真核生
物発現系においては、対応するin vivo系において機能
的な全ての発現ベクターが好適である。好ましい発現ベ
クターは、調節エレメントの配列と距離がタンパク質発
現のために最適化されているものであり、例えば大腸菌
の溶解物およびT7系に基づく原核生物in vitro発現系用
のpIVEXベクターが挙げられる。
【００１５】タンパク質発現に必要とされる制御エレメ
ントを含む線状DNA断片を、発現ベクターを線状化する
ことによって、調製するという本発明の解決手段のため
に、線状DNA断片は、前もってタンパク質のin vitro発
現に必要とされる全ての制御エレメントを含む必要があ
る。さらに、制御エレメントそれら自体の間、および制
御エレメントと発現される遺伝子との間には理想的な間
隔があるべきである。例えば、大腸菌系における終止コ
ドンとターミネーターとの距離は、発現率に関して決定
的な役割を果たす。この方法の別の利点は、制御エレメ
ントに加えて、また種々のタグおよび長い融合パートナ
ー、プロテアーゼ認識配列および/または真核生物リボ
ソームのためのCAP構造を増幅によって容易に融合させ
ることができることである。また本発明は、線状化ベク
ターがさらに切断されている系、または複数の線状化ベ
クターを用いる系も包含する。また発現に必要とされる
制御エレメントを2つのベクターに分配し、次いでそれ
らのベクターを線状化することができる。しかしなが
ら、タンパク質のin vitro発現のために断片化した線状
ベクターを使用することもできる。本発明のこの変法に
おいては、発現に必要な制御エレメントを含む線状DNA
断片を断片化、すなわち切断する。次いで得られる切断
した断片を、本発明に従って、制御エレメントを含む2
つのDNA断片に相補的な領域を両末端に含むタンパク質
コード遺伝子と共に、上流および下流に結合するプライ
マー対を用いて増幅する。以下の例は、本発明のこの変
法をより詳細に説明することを意図したものである。線
状化ベクター「V」は、切断前にはT7プロモーター、リ
ボソーム結合部位およびT7ターミネーターを有する。次
いで断片「V1」および「V2」を調製するが、「V1」はT7
プロモーターをもたず、「V2」はT7ターミネーターをも
はやもたない。ここで、本発明の方法は、「V」の代わ
りに「V1」および「V2」を用いて上記のように実施され
る；すなわち、「V1」および「V2」を、「V1」に相補的
な領域を一方の末端に有しかつ「V2」に相補的な領域を
他方の末端に有するタンパク質コード遺伝子と共に増幅
する。これに対応して、プライマー対は「V1」および
「V2」の上流および下流に結合する。
ントを含む線状DNA断片を、発現ベクターを線状化する
ことによって、調製するという本発明の解決手段のため
に、線状DNA断片は、前もってタンパク質のin vitro発
現に必要とされる全ての制御エレメントを含む必要があ
る。さらに、制御エレメントそれら自体の間、および制
御エレメントと発現される遺伝子との間には理想的な間
隔があるべきである。例えば、大腸菌系における終止コ
ドンとターミネーターとの距離は、発現率に関して決定
的な役割を果たす。この方法の別の利点は、制御エレメ
ントに加えて、また種々のタグおよび長い融合パートナ
ー、プロテアーゼ認識配列および/または真核生物リボ
ソームのためのCAP構造を増幅によって容易に融合させ
ることができることである。また本発明は、線状化ベク
ターがさらに切断されている系、または複数の線状化ベ
クターを用いる系も包含する。また発現に必要とされる
制御エレメントを2つのベクターに分配し、次いでそれ
らのベクターを線状化することができる。しかしなが
ら、タンパク質のin vitro発現のために断片化した線状
ベクターを使用することもできる。本発明のこの変法に
おいては、発現に必要な制御エレメントを含む線状DNA
断片を断片化、すなわち切断する。次いで得られる切断
した断片を、本発明に従って、制御エレメントを含む2
つのDNA断片に相補的な領域を両末端に含むタンパク質
コード遺伝子と共に、上流および下流に結合するプライ
マー対を用いて増幅する。以下の例は、本発明のこの変
法をより詳細に説明することを意図したものである。線
状化ベクター「V」は、切断前にはT7プロモーター、リ
ボソーム結合部位およびT7ターミネーターを有する。次
いで断片「V1」および「V2」を調製するが、「V1」はT7
プロモーターをもたず、「V2」はT7ターミネーターをも
はやもたない。ここで、本発明の方法は、「V」の代わ
りに「V1」および「V2」を用いて上記のように実施され
る；すなわち、「V1」および「V2」を、「V1」に相補的
な領域を一方の末端に有しかつ「V2」に相補的な領域を
他方の末端に有するタンパク質コード遺伝子と共に増幅
する。これに対応して、プライマー対は「V1」および
「V2」の上流および下流に結合する。
【００１６】本発明に係る方法の別の利点は、発現され
る遺伝子配列が、耐性遺伝子をコードする線状ベクター
を含む最初のPCRサイクルにおいて該ベクターに融合さ
れることである。ベクターのアームは、最初のサイクル
でプライマーとして機能するので、完全なプラスミドが
ある程度、同時合成される。このことは、無細胞系にお
ける発現にだけでなく、好適な細菌株における形質転換
にも最終産物を直接用いることができるという利点を有
する。従って、PCR産物は細菌クローンとしてプラスミ
ド中に確保される。
る遺伝子配列が、耐性遺伝子をコードする線状ベクター
を含む最初のPCRサイクルにおいて該ベクターに融合さ
れることである。ベクターのアームは、最初のサイクル
でプライマーとして機能するので、完全なプラスミドが
ある程度、同時合成される。このことは、無細胞系にお
ける発現にだけでなく、好適な細菌株における形質転換
にも最終産物を直接用いることができるという利点を有
する。従って、PCR産物は細菌クローンとしてプラスミ
ド中に確保される。
【００１７】線状DNA断片の両末端に相補的な領域を両
末端に有するタンパク質コード遺伝子は、本発明に従っ
てPCR反応により得られる。PCR反応において、該タンパ
ク質コード遺伝子は線状DNA断片の両末端とオーバーラ
ップする領域を5'末端に有する遺伝子特異的プライマー
を用いて増幅される。従って増幅された遺伝子は該プラ
イマーのオーバーラップする領域により伸長される。こ
の目的のために、遺伝子特異的センスプライマーは、そ
の5'末端に少なくとも5個の付加的ヌクレオチドを有
し、これらのヌクレオチドは線状DNA断片の上部鎖の3'
末端に同一である。また遺伝子特異的アンチセンスプラ
イマーは、その5'末端に少なくとも5個の付加的ヌクレ
オチドを有し、これらのヌクレオチドは線状DNA断片の
下部鎖の3'末端に同一である。
末端に有するタンパク質コード遺伝子は、本発明に従っ
てPCR反応により得られる。PCR反応において、該タンパ
ク質コード遺伝子は線状DNA断片の両末端とオーバーラ
ップする領域を5'末端に有する遺伝子特異的プライマー
を用いて増幅される。従って増幅された遺伝子は該プラ
イマーのオーバーラップする領域により伸長される。こ
の目的のために、遺伝子特異的センスプライマーは、そ
の5'末端に少なくとも5個の付加的ヌクレオチドを有
し、これらのヌクレオチドは線状DNA断片の上部鎖の3'
末端に同一である。また遺伝子特異的アンチセンスプラ
イマーは、その5'末端に少なくとも5個の付加的ヌクレ
オチドを有し、これらのヌクレオチドは線状DNA断片の
下部鎖の3'末端に同一である。
【００１８】タンパク質コード遺伝子を伸長するステッ
プ、およびこの遺伝子とタンパク質発現に必要とされる
制御エレメント(例えば、プロモーターおよびターミネ
ーター領域)を含む線状DNA断片とを共に増幅するステッ
プは、共通の反応で実施しても、連続的な反応で実施し
てもよい。
プ、およびこの遺伝子とタンパク質発現に必要とされる
制御エレメント(例えば、プロモーターおよびターミネ
ーター領域)を含む線状DNA断片とを共に増幅するステッ
プは、共通の反応で実施しても、連続的な反応で実施し
てもよい。
【００１９】大腸菌の溶解物を用いるタンパク質のin v
itro発現においては、線状ベクターはT7プロモーター、
リボソーム結合部位およびT7ターミネーターを含むこと
が好ましい。
itro発現においては、線状ベクターはT7プロモーター、
リボソーム結合部位およびT7ターミネーターを含むこと
が好ましい。
【００２０】さらに、本発明によれば、線状化ベクター
は、発現に必要とされる制御エレメントと同時に自動的
に導入されるC末端もしくはN末端タグ配列または融合タ
ンパク質配列をコードすることが好ましい。
は、発現に必要とされる制御エレメントと同時に自動的
に導入されるC末端もしくはN末端タグ配列または融合タ
ンパク質配列をコードすることが好ましい。
【００２１】増幅は、当業者に公知のPCRプロトコール
(PCR Newton & Graham編, 1994, publisher Spektrum,
Heidelberg；PCR McPhersonおよびMoller編, 2000, BIO
S Scientific Publishers Oxford)によって実施するこ
とができる。
(PCR Newton & Graham編, 1994, publisher Spektrum,
Heidelberg；PCR McPhersonおよびMoller編, 2000, BIO
S Scientific Publishers Oxford)によって実施するこ
とができる。
【００２２】本発明は、特にタンパク質のin vitro発現
用の線状DNA断片を作製するためのキットであって、1ま
たは複数の容器に、発現ベクターを線状化することによ
って得られるタンパク質発現に必要とされる全ての制御
エレメントを含む線状DNA断片、および線状DNA断片上の
発現制御領域の上流および下流に結合するか、またはプ
ロモーターおよびターミネーター領域の5'末端に直接的
に結合する外部プライマー対、が収容されていることを
特徴とする、前記キットに関する。
用の線状DNA断片を作製するためのキットであって、1ま
たは複数の容器に、発現ベクターを線状化することによ
って得られるタンパク質発現に必要とされる全ての制御
エレメントを含む線状DNA断片、および線状DNA断片上の
発現制御領域の上流および下流に結合するか、またはプ
ロモーターおよびターミネーター領域の5'末端に直接的
に結合する外部プライマー対、が収容されていることを
特徴とする、前記キットに関する。
【００２３】さらに本発明に係るキットは、同じまたは
別々の容器中に、線状DNA断片の両末端とオーバーラッ
プする領域を5'末端に有する遺伝子特異的プライマーを
含むことができる。この目的のために、遺伝子特異的セ
ンスプライマーは、その5'末端に少なくとも5個の付加
的ヌクレオチドを有し、これらのヌクレオチドは線状DN
A断片の上部鎖の3'末端に同一である。また遺伝子特異
的アンチセンスプライマーは、その5'末端に少なくとも
5個の付加的ヌクレオチドを有し、これらのヌクレオチ
ドは線状DNA断片の下部鎖の3'末端に同一である。
別々の容器中に、線状DNA断片の両末端とオーバーラッ
プする領域を5'末端に有する遺伝子特異的プライマーを
含むことができる。この目的のために、遺伝子特異的セ
ンスプライマーは、その5'末端に少なくとも5個の付加
的ヌクレオチドを有し、これらのヌクレオチドは線状DN
A断片の上部鎖の3'末端に同一である。また遺伝子特異
的アンチセンスプライマーは、その5'末端に少なくとも
5個の付加的ヌクレオチドを有し、これらのヌクレオチ
ドは線状DNA断片の下部鎖の3'末端に同一である。
【００２４】さらに本発明に係るキットは、校正活性を
示すかもしくは示さないDNAポリメラーゼまたはそれら2
種のDNAポリメラーゼの混合物、ならびに必要とされる
バッファー、塩化マグネシウム溶液、デオキシヌクレオ
シド三リン酸、およびPCR反応を最適化するための試薬
(例えば、DMSO、グリセロール、ホルムアミド、ベタイ
ン、7-デアザGTPなど)を含むことができる。キットの別
の好ましい実施形態において、線状DNA断片は、Hisタ
グ、HAタグおよびGFP配列などのC末端もしくはN末端タ
グ配列または融合タンパク質配列を含む。
示すかもしくは示さないDNAポリメラーゼまたはそれら2
種のDNAポリメラーゼの混合物、ならびに必要とされる
バッファー、塩化マグネシウム溶液、デオキシヌクレオ
シド三リン酸、およびPCR反応を最適化するための試薬
(例えば、DMSO、グリセロール、ホルムアミド、ベタイ
ン、7-デアザGTPなど)を含むことができる。キットの別
の好ましい実施形態において、線状DNA断片は、Hisタ
グ、HAタグおよびGFP配列などのC末端もしくはN末端タ
グ配列または融合タンパク質配列を含む。
【００２５】本発明は、タンパク質のin vitro発現用の
線状DNA断片を作製するための本発明に係るキットの使
用に関する。
線状DNA断片を作製するための本発明に係るキットの使
用に関する。
【００２６】さらなる本発明の主題は、PCR断片がタン
パク質コード遺伝子およびタンパク質発現に必要とされ
る制御エレメント(例えば、プロモーターおよびターミ
ネーター領域)を含む、上記の本発明の方法によって得
ることができる線状DNA断片である。
パク質コード遺伝子およびタンパク質発現に必要とされ
る制御エレメント(例えば、プロモーターおよびターミ
ネーター領域)を含む、上記の本発明の方法によって得
ることができる線状DNA断片である。
【００２７】大腸菌由来の溶解物を用いたタンパク質の
in vitro発現においては、線状DNA断片はT7プロモータ
ー、リボソーム結合部位およびT7ターミネーターを含む
ことが好ましい。
in vitro発現においては、線状DNA断片はT7プロモータ
ー、リボソーム結合部位およびT7ターミネーターを含む
ことが好ましい。
【００２８】別の好ましい実施形態において、線状DNA
断片は、Hisタグ、HAタグおよびGFP配列などのC末端も
しくはN末端タグ配列または融合タンパク質配列を含
む。
断片は、Hisタグ、HAタグおよびGFP配列などのC末端も
しくはN末端タグ配列または融合タンパク質配列を含
む。
【００２９】また本発明は、無細胞発現系においてタン
パク質をin vitroで発現させるための、本発明に係る線
状DNA断片の使用に関する。特に本発明は、細菌株また
は真核細胞由来の溶解物を用いてタンパク質をin vitro
で発現させるための、本発明に係る線状DNA断片の使用
に関する。
パク質をin vitroで発現させるための、本発明に係る線
状DNA断片の使用に関する。特に本発明は、細菌株また
は真核細胞由来の溶解物を用いてタンパク質をin vitro
で発現させるための、本発明に係る線状DNA断片の使用
に関する。
【００３０】本発明の別の主題は、以下のステップ：上
記の本発明の方法による線状DNA断片の作製、in vitro
転写および/または翻訳、を含むタンパク質の発現方法
である。
記の本発明の方法による線状DNA断片の作製、in vitro
転写および/または翻訳、を含むタンパク質の発現方法
である。
【００３１】タンパク質のin vitro発現は無細胞発現系
で実施されることが好ましい。このようなin vitro翻訳
方法が種々の原核細胞および真核細胞系について記載さ
れている(NirenbergおよびMatthaei, 1961；Zubay 197
3；JacksonおよびHunt, 1983； EricksonおよびBlobel,
1983；MatthewsおよびColman 1991)。
で実施されることが好ましい。このようなin vitro翻訳
方法が種々の原核細胞および真核細胞系について記載さ
れている(NirenbergおよびMatthaei, 1961；Zubay 197
3；JacksonおよびHunt, 1983； EricksonおよびBlobel,
1983；MatthewsおよびColman 1991)。
【００３２】タンパク質のin vitro発現は細菌株または
真核細胞由来の溶解物を用いた共役系(coupled system)
において実施されることが特に好ましい(Zubay 1973；B
aranovら, 1989；KigawaおよびYokoyama, 1991；Kudlic
kiら, 1992；Spirin, 1992；BaranovおよびSpirin, 199
3)。またタンパク質のin vitro発現は、CFCFまたはCECF
反応器中で実施することができる(Spirinら, 1988)。
真核細胞由来の溶解物を用いた共役系(coupled system)
において実施されることが特に好ましい(Zubay 1973；B
aranovら, 1989；KigawaおよびYokoyama, 1991；Kudlic
kiら, 1992；Spirin, 1992；BaranovおよびSpirin, 199
3)。またタンパク質のin vitro発現は、CFCFまたはCECF
反応器中で実施することができる(Spirinら, 1988)。
【００３３】特に、タンパク質のin vitro発現は大腸菌
由来の溶解物を用いて実施されることが好ましい。さら
に、タンパク質をin vitroで発現させるための本発明に
係る方法は、タンパク質コード遺伝子が遺伝子バンクま
たはRNA画分からPCRまたはRT-PCRによって直接的に増幅
されることを特徴とすることが好ましい。
由来の溶解物を用いて実施されることが好ましい。さら
に、タンパク質をin vitroで発現させるための本発明に
係る方法は、タンパク質コード遺伝子が遺伝子バンクま
たはRNA画分からPCRまたはRT-PCRによって直接的に増幅
されることを特徴とすることが好ましい。
【００３４】図面の説明 図１ タンパク質のin vitro発現用の線状DNA断片の作製方法
1回目の遺伝子特異的PCR反応において、発現される遺伝
子の5'末端に相補的な領域をプライマーによって付与す
る。2回目のPCRにおいて、付与された相補的な末端によ
って1回目のPCR産物と末端でハイブリダイズすることが
できる線状化発現ベクターを存在させる。複数の中間ス
テップにおいて、2本のベクター鎖の3'末端はプライマ
ーとして機能し、1回目のPCR産物とのハイブリダイゼー
ション後に伸長される。また1回目のPCR産物の3'末端
は、ベクター末端とのハイブリダイゼーション後に伸長
される。続いて、発現されるPCR産物は、プロモーター
およびターミネーターの上流および下流に結合する第2
のプライマー対を用いた複数回の増幅サイクルによって
得られる(この例ではT7系)。
子の5'末端に相補的な領域をプライマーによって付与す
る。2回目のPCRにおいて、付与された相補的な末端によ
って1回目のPCR産物と末端でハイブリダイズすることが
できる線状化発現ベクターを存在させる。複数の中間ス
テップにおいて、2本のベクター鎖の3'末端はプライマ
ーとして機能し、1回目のPCR産物とのハイブリダイゼー
ション後に伸長される。また1回目のPCR産物の3'末端
は、ベクター末端とのハイブリダイゼーション後に伸長
される。続いて、発現されるPCR産物は、プロモーター
およびターミネーターの上流および下流に結合する第2
のプライマー対を用いた複数回の増幅サイクルによって
得られる(この例ではT7系)。
【００３５】図２a
各レーンは以下のものを示す：
レーンM DNA分子量マーカー
レーン1 1回目の遺伝子特異的PCRからのGFP PCR産物5μl
レーン2 1回目の遺伝子産物を含まないオーバーラップ伸長PCRの陰性対照
レーン3 オーバーラップ伸長PCRからの産物(GFP-His)5μl
【００３６】図２b
活性GFP量を、RTS100大腸菌HYキットにおける発現後に
蛍光計で測定した。プラスミドpIVEX2.1GFP、長い外部
プライマーを用いて得られたPCR産物(2ステップPCR GF
P)およびオーバーラップ伸長PCRによって得られた産物
の2つの異なる量の間で比較を行った。
蛍光計で測定した。プラスミドpIVEX2.1GFP、長い外部
プライマーを用いて得られたPCR産物(2ステップPCR GF
P)およびオーバーラップ伸長PCRによって得られた産物
の2つの異なる量の間で比較を行った。
【００３７】図３a
各レーンは以下のものを示す：
レーンX DNA分子量マーカー
レーン- 鋳型を含まない遺伝子特異的PCRの陰性対照
レーン+ 1回目の遺伝子特異的PCRからの産物(GFP)5μl
レーンVIII DNA分子量マーカー
レーン9/10 プライマーの組合せ9/10(配列番号７および８)を用いたオーバー
ラップ伸長PCRからのGFP PCR産物(GFP Strepタグ)3μl
レーン26/28 プライマーの組合せ26/28(配列番号９および１０)を用いたオーバ
ーラップ伸長PCRからのGFP PCR産物(GFP Strepタグ)3μl
レーン50/49 プライマーの組合せ50/49(配列番号１１および１２)を用いたオー
バーラップ伸長PCRからのGFP PCR産物(GFP Strepタグ)3μl
【００３８】図３b
活性GFP量を、RTS100大腸菌HYキットにおける発現後に
蛍光計で測定した。プラスミドpIVEX2.1GFP、長い外部
プライマーを用いて得られたGFP-PCR産物(2ステップPC
R)および外部プライマー対を用いて調製した3つの異な
るオーバーラップ伸長PCR産物の間で比較を行った。
蛍光計で測定した。プラスミドpIVEX2.1GFP、長い外部
プライマーを用いて得られたGFP-PCR産物(2ステップPC
R)および外部プライマー対を用いて調製した3つの異な
るオーバーラップ伸長PCR産物の間で比較を行った。
【００３９】図４a
各レーンは以下のものを示す：
レーンM DNA分子量マーカー
レーン- 鋳型を含まない遺伝子特異的PCRの陰性対照
レーン+ 1回目の遺伝子特異的PCRからの産物(Epo)5μl
レーン2.2 オーバーラップ伸長PCRからのEpo PCR産物(Epo Strepタグ)5μl
レーン2.4 オーバーラップ伸長PCRからのEpo PCR産物(Epo Hisタグ)5μl
【００４０】図４b
RTS100大腸菌HYキットにおける発現後にStrepタグおよ
びHisタグを有するEpoの量をウエスタンブロットによっ
て分析した。図４a(レーン2.2および2.4)に示す各線状E
po発現構築物2μlをRTS100において発現させた。これら
の発現溶液5μlおよび10μlを4〜12％のNu PAGEゲルに
おいて分離し、続いてメンブレン上にブロットした。検
出を抗Epoモノクローナル抗体によって行った。M = タ
ンパク質分子量マーカー；ctrl = RTS100における発現
後のオーバーラップ伸長PCRの陰性対照。
びHisタグを有するEpoの量をウエスタンブロットによっ
て分析した。図４a(レーン2.2および2.4)に示す各線状E
po発現構築物2μlをRTS100において発現させた。これら
の発現溶液5μlおよび10μlを4〜12％のNu PAGEゲルに
おいて分離し、続いてメンブレン上にブロットした。検
出を抗Epoモノクローナル抗体によって行った。M = タ
ンパク質分子量マーカー；ctrl = RTS100における発現
後のオーバーラップ伸長PCRの陰性対照。
【００４１】
【実施例】実施例１ 線状化pIVEX2.3プラスミドを用いたオーバーラップ伸長
PCRおよびGFP発現データ 1回目のPCR反応(レーン1に適用した5μl、図２a)を、以
下の混合物50μl中で以下の条件下に実施した：1.5mM M
gCl2(最終濃度)を含む10 x PCRバッファー5μl、0.5μM
プライマーA、0.5μMプライマーB、250μM dNTP's(Roch
e社)、3U Pwo(Roche社)。GFP(緑色蛍光タンパク質)の配
列とC末端Hisタグ配列とを有し、調節発現エレメントを
含まないプラスミドpCRIITOPO-GFP 100ngをDNA鋳型とし
て使用した。以下のオリゴヌクレオチドをセンスプライ
マーAとして使用した： A GFP 15/15 配列番号１：5'-AGA AGG AGA TAT ACC ATG
ACT AGC AAA GGA-3' 以下のオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマーB
として使用した： B GFPmw 配列番号２：5'-ATT CGC CTT TTA TTA ATG ATG
ATG ATG ATG-3' プログラム94℃ 4分-20回(94℃ 1分-50℃ 1分-72℃ 1
分)-4℃を、Perkin Elmer社製のGene Amp 9600 PCR機器
で実行した。
PCRおよびGFP発現データ 1回目のPCR反応(レーン1に適用した5μl、図２a)を、以
下の混合物50μl中で以下の条件下に実施した：1.5mM M
gCl2(最終濃度)を含む10 x PCRバッファー5μl、0.5μM
プライマーA、0.5μMプライマーB、250μM dNTP's(Roch
e社)、3U Pwo(Roche社)。GFP(緑色蛍光タンパク質)の配
列とC末端Hisタグ配列とを有し、調節発現エレメントを
含まないプラスミドpCRIITOPO-GFP 100ngをDNA鋳型とし
て使用した。以下のオリゴヌクレオチドをセンスプライ
マーAとして使用した： A GFP 15/15 配列番号１：5'-AGA AGG AGA TAT ACC ATG
ACT AGC AAA GGA-3' 以下のオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマーB
として使用した： B GFPmw 配列番号２：5'-ATT CGC CTT TTA TTA ATG ATG
ATG ATG ATG-3' プログラム94℃ 4分-20回(94℃ 1分-50℃ 1分-72℃ 1
分)-4℃を、Perkin Elmer社製のGene Amp 9600 PCR機器
で実行した。
【００４２】2回目のPCR反応(レーン3に適用した5μl、
図２a；図２aにおけるレーン2は、1回目のPCR産物を含
まない2回目のPCR対照反応を示す)を、以下の混合物50
μl中で以下の条件下に実施した：1.5mM MgCl2(最終濃
度)を含む10 x PCRバッファー5μl、0.5μMセンスプラ
イマー、0.5μMアンチセンスプライマー、250μM dNTP'
s(Roche社)、3U Pwo (Roche社)。1回目のPCR産物2μlを
鋳型として添加した。さらに、NcoI/SmaIで線状化し、
続いてアガロースゲルから抽出したプラスミドpIVEX2.3
10ngを存在させた。以下のプライマーを用いた： センスプライマーMd0 SS： 配列番号３： 5'-GAA ATT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ACC ACA ACG
GTT TC-3' およびアンチセンスプライマーMd14 Ter AS 配列番号４: 5'-CAA AAA ACC CCT CAA GAC CCG TTT AGA GGC CCC AAG
G-3' プログラム94℃ 4分-30回(94℃ 1分-60℃ 1分-72℃ 1分
30秒)-4℃を、PerkinElmer社製のGene Amp 9600 PCR機
器で実行した。
図２a；図２aにおけるレーン2は、1回目のPCR産物を含
まない2回目のPCR対照反応を示す)を、以下の混合物50
μl中で以下の条件下に実施した：1.5mM MgCl2(最終濃
度)を含む10 x PCRバッファー5μl、0.5μMセンスプラ
イマー、0.5μMアンチセンスプライマー、250μM dNTP'
s(Roche社)、3U Pwo (Roche社)。1回目のPCR産物2μlを
鋳型として添加した。さらに、NcoI/SmaIで線状化し、
続いてアガロースゲルから抽出したプラスミドpIVEX2.3
10ngを存在させた。以下のプライマーを用いた： センスプライマーMd0 SS： 配列番号３： 5'-GAA ATT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ACC ACA ACG
GTT TC-3' およびアンチセンスプライマーMd14 Ter AS 配列番号４: 5'-CAA AAA ACC CCT CAA GAC CCG TTT AGA GGC CCC AAG
G-3' プログラム94℃ 4分-30回(94℃ 1分-60℃ 1分-72℃ 1分
30秒)-4℃を、PerkinElmer社製のGene Amp 9600 PCR機
器で実行した。
【００４３】線状化pIVEX2.3プラスミドを用いたオーバ
ーラップ伸長PCR方法によって調製したGFP発現構築物
(図２a、レーン3)を、迅速な翻訳系(Rapid Translation
System)RTS 100大腸菌HYキットの使用説明書に従っ
て、混合物50μlにおいて30℃および650rpmで16時間イ
ンキュベートした。図２a、レーン3に示す産物2.2μlお
よび4.4μl、ならびにプラスミドDNA pIVEX2.1-GFP 0.5
μgを使用して、線状化pIVEXプラスミドを用いたオーバ
ーラップ伸長PCRを行わず、長いプライマーを用いた2ス
テップPCR反応によって調製したGFP PCR産物の同一量と
比較した。
ーラップ伸長PCR方法によって調製したGFP発現構築物
(図２a、レーン3)を、迅速な翻訳系(Rapid Translation
System)RTS 100大腸菌HYキットの使用説明書に従っ
て、混合物50μlにおいて30℃および650rpmで16時間イ
ンキュベートした。図２a、レーン3に示す産物2.2μlお
よび4.4μl、ならびにプラスミドDNA pIVEX2.1-GFP 0.5
μgを使用して、線状化pIVEXプラスミドを用いたオーバ
ーラップ伸長PCRを行わず、長いプライマーを用いた2ス
テップPCR反応によって調製したGFP PCR産物の同一量と
比較した。
【００４４】長いPCRプライマーによるプロモーターお
よびリボソーム結合部位の組込みは、PCR方法に関する
最新の書物(PCR Newton & Graham編, 1994, Publisher
Spektrum, Heidelberg; PCR McPhersonおよびMoller, 2
000, BIOS Scientific Publishers, Oxford)に記載され
ている。全ての産物を蛍光計で測定した。
よびリボソーム結合部位の組込みは、PCR方法に関する
最新の書物(PCR Newton & Graham編, 1994, Publisher
Spektrum, Heidelberg; PCR McPhersonおよびMoller, 2
000, BIOS Scientific Publishers, Oxford)に記載され
ている。全ての産物を蛍光計で測定した。
【００４５】長いプライマーを用いた2ステップPCR反応
においては、付加的非翻訳配列をほんの少量しか導入す
ることができず(長いプライマーの合成およびPCR反応に
おいて問題が生じる)、従ってDNA産物および転写された
mRNAは不安定であり、少量のタンパク質しか得られな
い。2倍を超えるほど高いタンパク質収量が、より大き
な安定したDNA断片を生じる線状化プラスミドを用いた
オーバーラップ伸長PCR方法によって達成された(図２a/
b)。
においては、付加的非翻訳配列をほんの少量しか導入す
ることができず(長いプライマーの合成およびPCR反応に
おいて問題が生じる)、従ってDNA産物および転写された
mRNAは不安定であり、少量のタンパク質しか得られな
い。2倍を超えるほど高いタンパク質収量が、より大き
な安定したDNA断片を生じる線状化プラスミドを用いた
オーバーラップ伸長PCR方法によって達成された(図２a/
b)。
【００４６】実施例２ 線状化pIVEX2.1プラスミドおよび種々の第2のプライマ
ー対を使用して得られたオーバーラップ伸長PCR産物を
用いたGFP発現データ 1回目のPCR反応(Rct 1 +; 5μlを適用；図３a)を、以下
の混合物50μl中で以下の条件下に実施した：MgSO4を含
まない10 x Pwoバッファー5μl、25mM MgSO46μl(最終
濃度3mM)、1.5mM MgCl2(最終濃度)、0.5μMプライマー
A、0.5μMプライマーB、250μM dNTP's(Roche社)、3U P
wo (Roche社)。GFP(緑色蛍光タンパク質)の配列とC末端
Hisタグ配列とを含み、調節発現エレメントを含まない
プラスミドpCRIITOPO-2.3 GFP 500ngをDNA鋳型として使
用した。以下のオリゴヌクレオチドをセンスプライマー
(A)として使用した： A GFP 21/15 配列番号５： 5'-ACT TTA AGA AGG AGA TAT ACC ATG ACT AGC AAA GGA
-3' 以下のオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマー
(B)として用いた： B GFP 22/18 2.1 over 配列番号６： 5'-GCG GGT GGC TCC AAG CGC TCC CGG GTT TGT ATA GTT
CAT CC-3' プログラム94℃ 4分-20回(94℃ 1分-50℃ 1分-72℃ 1
分)-4℃を、Perkin Elmer社製のGene Amp 9600 PCR機器
で実行した。
ー対を使用して得られたオーバーラップ伸長PCR産物を
用いたGFP発現データ 1回目のPCR反応(Rct 1 +; 5μlを適用；図３a)を、以下
の混合物50μl中で以下の条件下に実施した：MgSO4を含
まない10 x Pwoバッファー5μl、25mM MgSO46μl(最終
濃度3mM)、1.5mM MgCl2(最終濃度)、0.5μMプライマー
A、0.5μMプライマーB、250μM dNTP's(Roche社)、3U P
wo (Roche社)。GFP(緑色蛍光タンパク質)の配列とC末端
Hisタグ配列とを含み、調節発現エレメントを含まない
プラスミドpCRIITOPO-2.3 GFP 500ngをDNA鋳型として使
用した。以下のオリゴヌクレオチドをセンスプライマー
(A)として使用した： A GFP 21/15 配列番号５： 5'-ACT TTA AGA AGG AGA TAT ACC ATG ACT AGC AAA GGA
-3' 以下のオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマー
(B)として用いた： B GFP 22/18 2.1 over 配列番号６： 5'-GCG GGT GGC TCC AAG CGC TCC CGG GTT TGT ATA GTT
CAT CC-3' プログラム94℃ 4分-20回(94℃ 1分-50℃ 1分-72℃ 1
分)-4℃を、Perkin Elmer社製のGene Amp 9600 PCR機器
で実行した。
【００４７】添加された線状化pIVEX2.1プラスミド上の
T7プロモーターおよびT7ターミネーターの上流および下
流に異なる距離で結合する4種の異なる外部プライマー
対を2回目のPCR反応に用いた。2回目のPCR反応(Rct 2;
各回に3μlを適用した, 図３a)を、以下の混合物50μl
中で以下の条件下に実施した：MgSO4を含まない10 x Pw
oバッファー5μl、25mM MgSO4 6μl(最終濃度3mM)、0.5
μMセンスプライマー、0.5μMアンチセンスプライマ
ー、250μM dNTP's(Roche社)、3U Pwo (Roche社)。1回
目のPCR産物2μlを鋳型として添加した。さらにNcoI/Sm
aIで線状化し、続いてアガロースゲルから抽出したプラ
スミドpIVEX2.1 10ngを存在させた。
T7プロモーターおよびT7ターミネーターの上流および下
流に異なる距離で結合する4種の異なる外部プライマー
対を2回目のPCR反応に用いた。2回目のPCR反応(Rct 2;
各回に3μlを適用した, 図３a)を、以下の混合物50μl
中で以下の条件下に実施した：MgSO4を含まない10 x Pw
oバッファー5μl、25mM MgSO4 6μl(最終濃度3mM)、0.5
μMセンスプライマー、0.5μMアンチセンスプライマ
ー、250μM dNTP's(Roche社)、3U Pwo (Roche社)。1回
目のPCR産物2μlを鋳型として添加した。さらにNcoI/Sm
aIで線状化し、続いてアガロースゲルから抽出したプラ
スミドpIVEX2.1 10ngを存在させた。
【００４８】以下のプライマー対を用いた：
対9/10 センスプライマーM + 9 SS
配列番号７：
5'-CGA TCC CGC GAA ATT AAT ACG ACT CAC TAT AG-3'
およびアンチセンスプライマーM + 10 AS
配列番号８：
5'-CTC CTT TCA GCA AAA AAC CCC TCA AGA CCC G-3'
このプライマー対は、T7プロモーターの9ヌクレオチド
上流およびT7ターミネーターの10ヌクレオチド下流にハ
イブリダイズする。
上流およびT7ターミネーターの10ヌクレオチド下流にハ
イブリダイズする。
【００４９】対26/28 センスプライマーM + 26 SS
配列番号９：
5'-GTA GAG GAT CGA GAT CTC GAT CCC GCG-3'
およびアンチセンスプライマーM + 28 AS
配列番号１０：
5'-GAT ATC CGG ATA TAG TTC CTC CTT TCA GC-3'
このプライマー対は、T7プロモーターの26ヌクレオチド
上流およびT7ターミネーターの28ヌクレオチド下流にハ
イブリダイズする。
上流およびT7ターミネーターの28ヌクレオチド下流にハ
イブリダイズする。
【００５０】対50/49 センスプライマーM + 50 SS
配列番号１１：
5'-GAT GCC GGC CAC GAT GCG TCC GGC GTA GAG G-3'
およびアンチセンスプライマーM + 49 AS
配列番号１２：
5'-GGC GAC CAC ACC CGT CCT GTG GAT ATC CGG-3'
このプライマー対は、T7プロモーターの50ヌクレオチド
上流およびT7ターミネーターの49ヌクレオチド下流にハ
イブリダイズする。
上流およびT7ターミネーターの49ヌクレオチド下流にハ
イブリダイズする。
【００５１】プログラム94℃ 4分-30回(94℃ 1分-60℃
1分-72℃ 1分30秒)-4℃を、PerkinElmer社製のGene Amp
9600 PCR機器で実行した。
1分-72℃ 1分30秒)-4℃を、PerkinElmer社製のGene Amp
9600 PCR機器で実行した。
【００５２】線状化pIVEX2.1プラスミドを用いてオーバ
ーラップ伸長PCR方法によって調製した種々の長さのGFP
発現構築物(図３a、Rct 2)を、迅速な翻訳系RTS 100大
腸菌HYキットの使用説明書に従って、混合物50μlにお
いて30℃および650rpmで4時間インキュベートした。混
合物50μlあたり、それぞれの2回目のPCR産物200ngおよ
びpIVEX2.1-GFP 500ngを使用して、線状化pIVEXプラス
ミドを用いたオーバーラップ伸長PCRを行うことなく、
長いプライマーを用いた2ステップPCR反応によって調製
したGFP PCR産物の同一量と比較した(2ステップPCR)。
全ての産物を蛍光計で測定した。
ーラップ伸長PCR方法によって調製した種々の長さのGFP
発現構築物(図３a、Rct 2)を、迅速な翻訳系RTS 100大
腸菌HYキットの使用説明書に従って、混合物50μlにお
いて30℃および650rpmで4時間インキュベートした。混
合物50μlあたり、それぞれの2回目のPCR産物200ngおよ
びpIVEX2.1-GFP 500ngを使用して、線状化pIVEXプラス
ミドを用いたオーバーラップ伸長PCRを行うことなく、
長いプライマーを用いた2ステップPCR反応によって調製
したGFP PCR産物の同一量と比較した(2ステップPCR)。
全ての産物を蛍光計で測定した。
【００５３】線状化pIVEX2.1プラスミドを用いたオーバ
ーラップ伸長PCRによって得られた種々の長さのGFP発現
構築物は、2ステップGFP-PCR産物と比較して発現率の著
しい増大を示した。実施例１と対照的に、この場合、線
状化ベクターとオーバーラップする領域は、21および22
ヌクレオチドの長さにすぎなかった。このオーバーラッ
プする領域は、陽性のオーバーラップ伸長PCR反応にと
って十分であった。2回目のPCR産物の伸長は、T7プロモ
ーターおよびT7ターミネーター配列の上流および下流に
異なる距離でハイブリダイズする第2のプライマー対を
用いて、明らかに示された。試験遺伝子としてGFPを用
いると、T7調節エレメントのもう一方の側に対して約30
bpの距離が理想的であるとわかった。
ーラップ伸長PCRによって得られた種々の長さのGFP発現
構築物は、2ステップGFP-PCR産物と比較して発現率の著
しい増大を示した。実施例１と対照的に、この場合、線
状化ベクターとオーバーラップする領域は、21および22
ヌクレオチドの長さにすぎなかった。このオーバーラッ
プする領域は、陽性のオーバーラップ伸長PCR反応にと
って十分であった。2回目のPCR産物の伸長は、T7プロモ
ーターおよびT7ターミネーター配列の上流および下流に
異なる距離でハイブリダイズする第2のプライマー対を
用いて、明らかに示された。試験遺伝子としてGFPを用
いると、T7調節エレメントのもう一方の側に対して約30
bpの距離が理想的であるとわかった。
【００５４】実施例３ オーバーラップ伸長PCRによるヒトエリスロポエチン配
列へのStrepおよびHisタグ配列ならびにプロテアーゼ認
識配列の付加 1回目のエリスロポエチン(Epo)特異的PCR反応(Rct 1
+；5μlを適用,図４a)を、以下の混合物50μl中で以下
の条件下に実施した：MgSO4を含まない10 x Pwoバッフ
ァー5μl、25mM MgSO4 6μl(最終濃度3mM)、0.5μM Epo
特異的センスプライマー、0.5μM Epo特異的アンチセン
スプライマー、250μM dNTP's(Roche社)、3UPwo (Roche
社)。Johannes Auer博士から供与されたヒトエリスロポ
エチンの配列を有し、タグ配列を含まないプラスミドpc
DNA3-Epo 300ngをDNA鋳型として使用した。以下のオリ
ゴヌクレオチドをセンスプライマーとして使用した： 2X Xa Epo 配列番号１３： 5'-GGC CGC TTA ATT AAA CAT ATG ACC ATC GAA GGC CGC
GCC CCA CCA CGC CTC ATC-3' 以下のオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマーと
して使用した： 3'EPO/Vec correct 配列番号１４： 5'-CGG ATC TTA CCG GAT CCC GGG TTA TCA TCT GTC CCC
TGT CCT GC-3' プログラム94℃ 4分-20回(94℃ 1分-50℃ 1分-72℃ 1
分)-4℃を、Perkin Elmer社製のGene Amp 9600 PCR機器
で実行した。
列へのStrepおよびHisタグ配列ならびにプロテアーゼ認
識配列の付加 1回目のエリスロポエチン(Epo)特異的PCR反応(Rct 1
+；5μlを適用,図４a)を、以下の混合物50μl中で以下
の条件下に実施した：MgSO4を含まない10 x Pwoバッフ
ァー5μl、25mM MgSO4 6μl(最終濃度3mM)、0.5μM Epo
特異的センスプライマー、0.5μM Epo特異的アンチセン
スプライマー、250μM dNTP's(Roche社)、3UPwo (Roche
社)。Johannes Auer博士から供与されたヒトエリスロポ
エチンの配列を有し、タグ配列を含まないプラスミドpc
DNA3-Epo 300ngをDNA鋳型として使用した。以下のオリ
ゴヌクレオチドをセンスプライマーとして使用した： 2X Xa Epo 配列番号１３： 5'-GGC CGC TTA ATT AAA CAT ATG ACC ATC GAA GGC CGC
GCC CCA CCA CGC CTC ATC-3' 以下のオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマーと
して使用した： 3'EPO/Vec correct 配列番号１４： 5'-CGG ATC TTA CCG GAT CCC GGG TTA TCA TCT GTC CCC
TGT CCT GC-3' プログラム94℃ 4分-20回(94℃ 1分-50℃ 1分-72℃ 1
分)-4℃を、Perkin Elmer社製のGene Amp 9600 PCR機器
で実行した。
【００５５】2回目のPCR反応(各5μl)(図４a)を、以下
の混合物50μl中で以下の条件下に実施した：MgSO4を含
まない10 x Pwoバッファー5μl、25mM MgSO4 6μl(最終
濃度3mM)、0.5μMセンスプライマー、0.5μMアンチセン
スプライマー、250μM dNTP's(Roche社)、3U Pwo (Roch
e社)。1回目のPCR産物2μlを鋳型として添加した。さら
にNdeI/SalIで線状化し、続いてアガロースゲルから抽
出したStrepタグをコードするプラスミドpIVEX2.2 10n
g、またはNdeI/SalIで線状化し、続いてアガロースゲル
から抽出したHisタグをコードするプラスミドpIVEX2.4
10ngを存在させた。
の混合物50μl中で以下の条件下に実施した：MgSO4を含
まない10 x Pwoバッファー5μl、25mM MgSO4 6μl(最終
濃度3mM)、0.5μMセンスプライマー、0.5μMアンチセン
スプライマー、250μM dNTP's(Roche社)、3U Pwo (Roch
e社)。1回目のPCR産物2μlを鋳型として添加した。さら
にNdeI/SalIで線状化し、続いてアガロースゲルから抽
出したStrepタグをコードするプラスミドpIVEX2.2 10n
g、またはNdeI/SalIで線状化し、続いてアガロースゲル
から抽出したHisタグをコードするプラスミドpIVEX2.4
10ngを存在させた。
【００５６】以下のプライマーを使用した：
センスプライマーMd0 SS
配列番号１５：
5'-GAA ATT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ACC ACA ACG
GTT TC-3' およびアンチセンスプライマーMd14 Ter AS 配列番号１６： 5'-CAA AAA ACC CCT CAA GAC CCG TTT AGA GGC CCC AAG
G-3' プログラム94℃ 4分-30回(94℃ 1分-60℃ 1分-72℃ 2
分)-4℃を、Perkin Elmer社製のGene Amp 9600 PCR機器
で実行した。
GTT TC-3' およびアンチセンスプライマーMd14 Ter AS 配列番号１６： 5'-CAA AAA ACC CCT CAA GAC CCG TTT AGA GGC CCC AAG
G-3' プログラム94℃ 4分-30回(94℃ 1分-60℃ 1分-72℃ 2
分)-4℃を、Perkin Elmer社製のGene Amp 9600 PCR機器
で実行した。
【００５７】線状化pIVEX2.2またはpIVEX2.4プラスミド
を用いたオーバーラップ伸長PCR方法によって調製したE
po発現構築物(図４a)を、迅速な翻訳系RTS 100大腸菌HY
キットの使用説明書に従って、混合物50μlにおいて30
℃および650rpmで4時間インキュベートした。2回目のPC
R反応からの産物5μlおよび10μlアリコートを発現に用
いた。それぞれの発現混合物2μlを、サンプルバッファ
ー(Novex)と混合し、95℃まで5分間加熱し、氷上で冷却
し、1 x MESバッファーを含む4〜12％のNuPAGEゲル(Nov
ex)上で200Vで分離した。タンパク質をニトロセルロー
スメンブレン(Protan, Schleicher & Schuell)上に30V
で30分間エレクトロブロッテイングすることによって転
写した。該メンブレンを1倍濃度TBS-Tバッファーに溶解
した3％のBSA溶液で1時間ブロッキングし、1倍濃度TBS-
Tバッファーで洗浄し、MAB抗Epo-POD結合抗体(Roche社)
を含む1倍濃度TBS-Tとともに1時間インキュベートし
た。1倍濃度TBS-Tを用いて3回洗浄した後、タンパク質
を製造業者の使用説明書に従い、Lumi Light plusウエ
スタンブロッティング基質(Roche社)によって検出し
た。
を用いたオーバーラップ伸長PCR方法によって調製したE
po発現構築物(図４a)を、迅速な翻訳系RTS 100大腸菌HY
キットの使用説明書に従って、混合物50μlにおいて30
℃および650rpmで4時間インキュベートした。2回目のPC
R反応からの産物5μlおよび10μlアリコートを発現に用
いた。それぞれの発現混合物2μlを、サンプルバッファ
ー(Novex)と混合し、95℃まで5分間加熱し、氷上で冷却
し、1 x MESバッファーを含む4〜12％のNuPAGEゲル(Nov
ex)上で200Vで分離した。タンパク質をニトロセルロー
スメンブレン(Protan, Schleicher & Schuell)上に30V
で30分間エレクトロブロッテイングすることによって転
写した。該メンブレンを1倍濃度TBS-Tバッファーに溶解
した3％のBSA溶液で1時間ブロッキングし、1倍濃度TBS-
Tバッファーで洗浄し、MAB抗Epo-POD結合抗体(Roche社)
を含む1倍濃度TBS-Tとともに1時間インキュベートし
た。1倍濃度TBS-Tを用いて3回洗浄した後、タンパク質
を製造業者の使用説明書に従い、Lumi Light plusウエ
スタンブロッティング基質(Roche社)によって検出し
た。
【００５８】最初の構築物pcDNA Epoは、2種のタグのい
ずれもコードせず、また真核生物発現プラスミドであっ
たので原核生物in vitro系で発現することができなかっ
た。従って、このことにより、プロテアーゼ認識配列
(この場合、第Xa因子プロテアーゼに対する配列)を含む
StrepタグおよびHisタグならびに発現に必要とされる調
節エレメントを、オーバーラップ伸長PCRによって導入
することができ、またEpoをうまく発現させることがで
きることが示された。
ずれもコードせず、また真核生物発現プラスミドであっ
たので原核生物in vitro系で発現することができなかっ
た。従って、このことにより、プロテアーゼ認識配列
(この場合、第Xa因子プロテアーゼに対する配列)を含む
StrepタグおよびHisタグならびに発現に必要とされる調
節エレメントを、オーバーラップ伸長PCRによって導入
することができ、またEpoをうまく発現させることがで
きることが示された。
【００５９】
【発明の効果】本発明により、複雑なクローニングステ
ップが回避される。さらに本発明により作製された線状
DNA断片は、エキソヌクレアーゼからの保護が増大し、
かつそのmRNAの安定性が向上する。結果として、該線状
DNA断片により、無細胞in vitro転写/翻訳系において高
いタンパク質収量が可能となる。
ップが回避される。さらに本発明により作製された線状
DNA断片は、エキソヌクレアーゼからの保護が増大し、
かつそのmRNAの安定性が向上する。結果として、該線状
DNA断片により、無細胞in vitro転写/翻訳系において高
いタンパク質収量が可能となる。
【００６０】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Roche Diagnostics GmbH
<120> Method for producing linear DNA fragments for the in vitro expres
sion of proteins
<130> 5711/00/
<160> 16
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Primer
<400> 1
agaaggagat ataccatgac tagcaaagga 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> Primer
<400> 2
attcgccttt tattaatgat gatgatgatg 30
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> Primer
<400> 3
gaaattaata cgactcacta tagggagacc acaacggttt c 41
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> Primer
<400> 4
caaaaaaccc ctcaagaccc gtttagaggc cccaagg 37
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> Primer
<400> 5
actttaagaa ggagatatac catgactagc aaagga 36
<210> 6
<211> 41
<212> DNA
<213> Primer
<400> 6
gcgggtggct ccaagcgctc ccgggtttgt atagttcatc c 41
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> Primer
<400> 7
cgatcccgcg aaattaatac gactcactat ag 32
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> Primer
<400> 8
ctcctttcag caaaaaaccc ctcaagaccc g 31
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> Primer
<400> 9
gtagaggatc gagatctcga tcccgcg 27
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> Primer
<400> 10
gatatccgga tatagttcct cctttcagc 29
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> Primer
<400> 11
gatgccggcc acgatgcgtc cggcgtagag g 31
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Primer
<400> 12
ggcgaccaca cccgtcctgt ggatatccgg 30
<210> 13
<211> 54
<212> DNA
<213> Primer
<400> 13
ggccgcttaa ttaaacatat gaccatcgaa ggccgcgccc caccacgcct catc 54
<210> 14
<211> 44
<212> DNA
<213> Primer
<400> 14
cggatcttac cggatcccgg gttatcatct gtcccctgtc ctgc 44
<210> 15
<211> 41
<212> DNA
<213> Primer
<400> 15
gaaattaata cgactcacta tagggagacc acaacggttt c 41
<210> 16
<211> 37
<212> DNA
<213> Primer
<400> 16
caaaaaaccc ctcaagaccc gtttagaggc cccaagg 37
【図１】図１は、タンパク質のin vitro発現用の線状DN
A断片の作製方法を示す。
A断片の作製方法を示す。
【図２】図２aは、線状化pIVEX2.3プラスミドを用いた
オーバーラップ伸長PCRによって得られた産物の電気泳
動写真を示す。図２bは、線状化pIVEX2.3プラスミドを
用いたオーバーラップ伸長PCRによって得られた産物か
ら発現されたタンパク質の活性GFP量を示す。
オーバーラップ伸長PCRによって得られた産物の電気泳
動写真を示す。図２bは、線状化pIVEX2.3プラスミドを
用いたオーバーラップ伸長PCRによって得られた産物か
ら発現されたタンパク質の活性GFP量を示す。
【図３】図３aは、線状化pIVEX2.1プラスミドおよび種
々の第2のプライマー対を使用して得られたオーバーラ
ップ伸長PCR産物の電気泳動写真を示す。図３bは、線状
化pIVEX2.1プラスミドおよび種々の第2プライマー対を
使用して得られたオーバーラップ伸長PCR産物から発現
されたタンパク質の活性GFP量を示す。
々の第2のプライマー対を使用して得られたオーバーラ
ップ伸長PCR産物の電気泳動写真を示す。図３bは、線状
化pIVEX2.1プラスミドおよび種々の第2プライマー対を
使用して得られたオーバーラップ伸長PCR産物から発現
されたタンパク質の活性GFP量を示す。
【図４】図４aは、線状化pIVEX2.2またはpIVEX2.4プラ
スミドを用いてオーバーラップ伸長PCR方法によって得
られたEpo PCR産物の電気泳動写真を示す。図４bは、線
状化pIVEX2.2またはpIVEX2.4プラスミドを用いてオーバ
ーラップ伸長PCR方法によって調製したEpo PCR産物から
発現されたタンパク質のウエスタンブロット分析の結果
を示す。
スミドを用いてオーバーラップ伸長PCR方法によって得
られたEpo PCR産物の電気泳動写真を示す。図４bは、線
状化pIVEX2.2またはpIVEX2.4プラスミドを用いてオーバ
ーラップ伸長PCR方法によって調製したEpo PCR産物から
発現されたタンパク質のウエスタンブロット分析の結果
を示す。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年１１月２９日（２００２．１１．
２９）
２９）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【請求項８】 以下のステップ：請求項１または２に記
載の方法による線状DNA断片の作製、 in vitro転写および翻訳、を含むタンパク質の発現方
法。 ─────────────────────────────────────────────────────
載の方法による線状DNA断片の作製、 in vitro転写および翻訳、を含むタンパク質の発現方
法。 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１５年１月２７日（２００３．１．２
７）
７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、タンパク質のin v
itro発現用の線状DNA断片の作製方法に関する。この方
法は、発現ベクターを線状化することによって得られる
発現に必要な制御エレメントを含む線状DNA断片、およ
び該線状DNA断片の両末端に相補的な領域を両末端に有
するタンパク質コード遺伝子を、該線状DNA断片上の発
現制御領域の上流および下流に結合するプライマー対を
用いて共に増幅することを特徴とする。さらに、線状DN
A断片とオーバーラップする領域を両末端に有するタン
パク質コード遺伝子の調製に関する方法を開示する。ま
た本発明は、タンパク質のin vitro発現用の本発明に係
る線状DNA断片、これらのDNA断片の使用、タンパク質の
in vitro発現用の本発明に係る線状DNA断片を含むキッ
ト、および本発明に係る線状DNA断片から開始するタン
パク質のin vitro発現方法を包含する。
itro発現用の線状DNA断片の作製方法に関する。この方
法は、発現ベクターを線状化することによって得られる
発現に必要な制御エレメントを含む線状DNA断片、およ
び該線状DNA断片の両末端に相補的な領域を両末端に有
するタンパク質コード遺伝子を、該線状DNA断片上の発
現制御領域の上流および下流に結合するプライマー対を
用いて共に増幅することを特徴とする。さらに、線状DN
A断片とオーバーラップする領域を両末端に有するタン
パク質コード遺伝子の調製に関する方法を開示する。ま
た本発明は、タンパク質のin vitro発現用の本発明に係
る線状DNA断片、これらのDNA断片の使用、タンパク質の
in vitro発現用の本発明に係る線状DNA断片を含むキッ
ト、および本発明に係る線状DNA断片から開始するタン
パク質のin vitro発現方法を包含する。
【０００２】
【従来の技術】大腸菌溶解物に基づく無細胞DNA依存的i
n vitro転写/翻訳は、環状二重らせんDNAの発現との関
連において、また、長い線状DNAの発現との関連におい
て事実上十分に機能する。短い線状DNA断片を発現させ
る試みは、非常に限られた成功しか収めなかった。用い
るDNAが小さければ小さいほど、認めうる量の遺伝子産
物を得ることはより困難となる。こうした困難さは部分
的にはエキソヌクレアーゼの存在に起因することが示さ
れた。従って、エキソヌクレアーゼVが、大腸菌のS30溶
解物を用いたin vitro転写および翻訳の間に、3'末端か
ら開始する線状DNAの分解に関与することが示された。
n vitro転写/翻訳は、環状二重らせんDNAの発現との関
連において、また、長い線状DNAの発現との関連におい
て事実上十分に機能する。短い線状DNA断片を発現させ
る試みは、非常に限られた成功しか収めなかった。用い
るDNAが小さければ小さいほど、認めうる量の遺伝子産
物を得ることはより困難となる。こうした困難さは部分
的にはエキソヌクレアーゼの存在に起因することが示さ
れた。従って、エキソヌクレアーゼVが、大腸菌のS30溶
解物を用いたin vitro転写および翻訳の間に、3'末端か
ら開始する線状DNAの分解に関与することが示された。
【０００３】多くの場合、mRNA分解はほとんど全ての生
物における遺伝子発現を調節するための制御点である(R
ossら, 1995)。エンドリボヌクレアーゼEは、大腸菌の
デグラダソーム(degradasome)における主要な酵素とし
て同定された(Grunberg-Managoら, 1999)。Invitrogen
社は、RNaseコード遺伝子に突然変異を有し、かつmRNA
安定性の向上とタンパク質収量の増加が認められるBL21
株を提供する。また原核生物のmRNAは、3'末端の二次構
造によってエキソヌクレアーゼ分解から保護されている
(Klugら, 1987；Mackie, 1987)。
物における遺伝子発現を調節するための制御点である(R
ossら, 1995)。エンドリボヌクレアーゼEは、大腸菌の
デグラダソーム(degradasome)における主要な酵素とし
て同定された(Grunberg-Managoら, 1999)。Invitrogen
社は、RNaseコード遺伝子に突然変異を有し、かつmRNA
安定性の向上とタンパク質収量の増加が認められるBL21
株を提供する。また原核生物のmRNAは、3'末端の二次構
造によってエキソヌクレアーゼ分解から保護されている
(Klugら, 1987；Mackie, 1987)。
【０００４】線状DNAのin vitro発現において、長いDNA
断片は、付加的配列の導入によってエキソヌクレアーゼ
からのDNAの保護が増大し、かつmRNAの安定性が向上す
るという利点を付与する。
断片は、付加的配列の導入によってエキソヌクレアーゼ
からのDNAの保護が増大し、かつmRNAの安定性が向上す
るという利点を付与する。
【０００５】クローニングを行わずPCRにより作製され
るDNAから開始する遺伝子発現方法は、いわゆる発現PCR
として1991年に初めて記載された(Kainら, 1991)。発現
PCRは、真核生物in vitro発現系(Kain & Lanar, 1994；
Switzer & Heneine, 1995；Henkel & Beuerle, 1993；R
estoら, 1992)ならびに原核生物in vitro発現系(Lesley
ら, 1991；Martemyanovら, 1997；Burksら, 1997；Ohuc
hiら, Nakanoら, 1999)において用いられた。
るDNAから開始する遺伝子発現方法は、いわゆる発現PCR
として1991年に初めて記載された(Kainら, 1991)。発現
PCRは、真核生物in vitro発現系(Kain & Lanar, 1994；
Switzer & Heneine, 1995；Henkel & Beuerle, 1993；R
estoら, 1992)ならびに原核生物in vitro発現系(Lesley
ら, 1991；Martemyanovら, 1997；Burksら, 1997；Ohuc
hiら, Nakanoら, 1999)において用いられた。
【０００６】線状DNAを作製するために以下のPCR技術が
使用されていた：Hechtは、米国特許第5,571,690号にお
いて、ワンステップPCR反応により作製した鋳型から開
始する、タンパク質の無細胞合成方法を記載する。この
方法においては、ファージプロモーター領域を含む全遺
伝子配列が1つの遺伝子から増幅される(またRestoら, 1
992を参照されたい)。
使用されていた：Hechtは、米国特許第5,571,690号にお
いて、ワンステップPCR反応により作製した鋳型から開
始する、タンパク質の無細胞合成方法を記載する。この
方法においては、ファージプロモーター領域を含む全遺
伝子配列が1つの遺伝子から増幅される(またRestoら, 1
992を参照されたい)。
【０００７】Martemyatovら(1997)は、2ステップPCR反
応により作製した鋳型から開始する、大腸菌S30抽出物
に基づく無細胞系におけるタンパク質合成を示す。この
方法においては、標的遺伝子は2つの遺伝子特異的プラ
イマーを用いて増幅された。続いて、T7プロモーターお
よびリボソーム結合部位が、いわゆるメガプライマー(m
egaprimer)(長さ163ヌクレオチド)を用いた2回目のPCR
反応において融合された。また、PCRプライマーによる
プロモーターおよびリボソーム結合部位の組込みがPCR
方法に関する最新の書物(PCR Newton & Graham編, 199
4, Spectrum publisher, Heidelberg；PCR McPhersonお
よびMoller, 2000, BIOS Scientific Publishers, Oxfo
rd)に記載されている。
応により作製した鋳型から開始する、大腸菌S30抽出物
に基づく無細胞系におけるタンパク質合成を示す。この
方法においては、標的遺伝子は2つの遺伝子特異的プラ
イマーを用いて増幅された。続いて、T7プロモーターお
よびリボソーム結合部位が、いわゆるメガプライマー(m
egaprimer)(長さ163ヌクレオチド)を用いた2回目のPCR
反応において融合された。また、PCRプライマーによる
プロモーターおよびリボソーム結合部位の組込みがPCR
方法に関する最新の書物(PCR Newton & Graham編, 199
4, Spectrum publisher, Heidelberg；PCR McPhersonお
よびMoller, 2000, BIOS Scientific Publishers, Oxfo
rd)に記載されている。
【０００８】Ohuchiら(1998)は、Kainら(1991)によって
も用いられた、線状DNA鋳型を作製するためのオーバー
ラップ伸長PCR方法を使用する。このPCR方法は、制限酵
素を用いることなく、オーバーラップするPCR断片によ
って遺伝子を融合するためのオーバーラップ伸長による
遺伝子スプライシング(splicing by overlap extentio
n：SOE)として、Hortonら(1989)によって初めて記載さ
れた。それぞれ融合されるDNAセグメントに対して相同
な領域を5'末端に有するプライマー対を、SOEによる発
現PCRのための1回目のPCR反応に用いる。次いで融合さ
せるDNA断片を、2回目のPCR反応において存在させる(Ka
inら, 1991,図３を参照されたい)。
も用いられた、線状DNA鋳型を作製するためのオーバー
ラップ伸長PCR方法を使用する。このPCR方法は、制限酵
素を用いることなく、オーバーラップするPCR断片によ
って遺伝子を融合するためのオーバーラップ伸長による
遺伝子スプライシング(splicing by overlap extentio
n：SOE)として、Hortonら(1989)によって初めて記載さ
れた。それぞれ融合されるDNAセグメントに対して相同
な領域を5'末端に有するプライマー対を、SOEによる発
現PCRのための1回目のPCR反応に用いる。次いで融合さ
せるDNA断片を、2回目のPCR反応において存在させる(Ka
inら, 1991,図３を参照されたい)。
【０００９】特許出願WO 00/56914において、Liangおよ
びFelgnerは、SOE-PCRに基づいて転写活性のあるDNA分
子を作製する方法を記載する。この方法はプロモーター
を有するDNA断片、ターミネーターを有するDNA断片、こ
れらのDNA断片の5'末端に相同的なプライマー対、およ
びこれらのDNA断片の3'末端および発現される遺伝子配
列の5'末端に相同的なプライマー対を一緒に増幅するこ
とを特徴とする。
びFelgnerは、SOE-PCRに基づいて転写活性のあるDNA分
子を作製する方法を記載する。この方法はプロモーター
を有するDNA断片、ターミネーターを有するDNA断片、こ
れらのDNA断片の5'末端に相同的なプライマー対、およ
びこれらのDNA断片の3'末端および発現される遺伝子配
列の5'末端に相同的なプライマー対を一緒に増幅するこ
とを特徴とする。
【００１０】ワンステップPCRによる無細胞タンパク質
合成のためのDNA鋳型の作製は、増幅される全ての遺伝
子が対応する発現プラスミドに前もって存在しなければ
ならず、全く利点を付与しない。2ステップPCRの難点
は、極端に長い外部プライマーの合成である。この合成
は、効率的でなく、費用がかかる。長い外部プライマー
を用いた2ステップPCRのタンパク質発現の収量は、PCR
産物およびそれらから転写されたmRNAの安定性の低さに
起因して非常に低い。さらに、PCR反応それ自体も、プ
ライマーが長ければ長いほどダイマー形成の可能性が増
大するので、問題を生じやすい。SOEによる発現PCRにお
いては、融合されるDNA分子を最初に調製して、手間を
かけてゲルから抽出しなければならない(Ohuchiら, 199
8を参照されたい)。
合成のためのDNA鋳型の作製は、増幅される全ての遺伝
子が対応する発現プラスミドに前もって存在しなければ
ならず、全く利点を付与しない。2ステップPCRの難点
は、極端に長い外部プライマーの合成である。この合成
は、効率的でなく、費用がかかる。長い外部プライマー
を用いた2ステップPCRのタンパク質発現の収量は、PCR
産物およびそれらから転写されたmRNAの安定性の低さに
起因して非常に低い。さらに、PCR反応それ自体も、プ
ライマーが長ければ長いほどダイマー形成の可能性が増
大するので、問題を生じやすい。SOEによる発現PCRにお
いては、融合されるDNA分子を最初に調製して、手間を
かけてゲルから抽出しなければならない(Ohuchiら, 199
8を参照されたい)。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、タンパク質のin vitro発現用の線状DNA断片を作製
するための簡便な方法を提供することである。
は、タンパク質のin vitro発現用の線状DNA断片を作製
するための簡便な方法を提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】上記課題は、本発明に従
って、タンパク質のin vitro発現用の線状DNA断片の作
製方法により達成される。本発明に係る方法は、発現ベ
クターを線状化することによって得られる発現に必要な
制御エレメントを含む線状DNA断片を、該線状DNA断片の
両末端に相補的な領域を両末端に有するタンパク質コー
ド遺伝子と共に、該線状DNA断片上の発現制御領域の上
流および下流に結合するプライマー対を用いて増幅する
ことを特徴とする。
って、タンパク質のin vitro発現用の線状DNA断片の作
製方法により達成される。本発明に係る方法は、発現ベ
クターを線状化することによって得られる発現に必要な
制御エレメントを含む線状DNA断片を、該線状DNA断片の
両末端に相補的な領域を両末端に有するタンパク質コー
ド遺伝子と共に、該線状DNA断片上の発現制御領域の上
流および下流に結合するプライマー対を用いて増幅する
ことを特徴とする。
【００１３】
【発明の実施の形態】発現ベクターは、マルチクローニ
ングサイトにおける単純な制限酵素消化によって、マル
チクローニングサイトにおける二重制限酵素消化によっ
て、または発現ベクターにクローニングされた遺伝子を
切り離すことによって線状化することができる。別のベ
クター断片の作製方法は、インバースPCRによる増幅で
ある。
ングサイトにおける単純な制限酵素消化によって、マル
チクローニングサイトにおける二重制限酵素消化によっ
て、または発現ベクターにクローニングされた遺伝子を
切り離すことによって線状化することができる。別のベ
クター断片の作製方法は、インバースPCRによる増幅で
ある。
【００１４】好適な発現ベクターは、対応する発現系が
必要とする全ての調節エレメントを提供するものであ
る。大腸菌由来の溶解物およびT7系に基づく原核生物in
vitro発現系の場合には、T7プロモーター、リボソーム
結合部位およびT7ターミネーターをコードする発現ベク
ターは全てが好適であり、例えば、pIVEXベクター、pET
ファミリーの全てのT7発現ベクター、pCRT7-TOPOベクタ
ー、pDESTベクター、pCALベクターなどが挙げられる。T
7ポリメラーゼを含まない天然の大腸菌発現系において
は、内因性大腸菌プロモーター、リボソーム結合部位お
よびターミネーターをコードする全てのベクターが好適
であり、例えばpHB6、pVB6、pXB、pBH、pBV、pBX、pASK
IBAベクター、pBADおよびpTrxFusが挙げられる。真核生
物発現系においては、対応するin vivo系において機能
的な全ての発現ベクターが好適である。好ましい発現ベ
クターは、調節エレメントの配列と距離がタンパク質発
現のために最適化されているものであり、例えば大腸菌
の溶解物およびT7系に基づく原核生物in vitro発現系用
のpIVEXベクターが挙げられる。
必要とする全ての調節エレメントを提供するものであ
る。大腸菌由来の溶解物およびT7系に基づく原核生物in
vitro発現系の場合には、T7プロモーター、リボソーム
結合部位およびT7ターミネーターをコードする発現ベク
ターは全てが好適であり、例えば、pIVEXベクター、pET
ファミリーの全てのT7発現ベクター、pCRT7-TOPOベクタ
ー、pDESTベクター、pCALベクターなどが挙げられる。T
7ポリメラーゼを含まない天然の大腸菌発現系において
は、内因性大腸菌プロモーター、リボソーム結合部位お
よびターミネーターをコードする全てのベクターが好適
であり、例えばpHB6、pVB6、pXB、pBH、pBV、pBX、pASK
IBAベクター、pBADおよびpTrxFusが挙げられる。真核生
物発現系においては、対応するin vivo系において機能
的な全ての発現ベクターが好適である。好ましい発現ベ
クターは、調節エレメントの配列と距離がタンパク質発
現のために最適化されているものであり、例えば大腸菌
の溶解物およびT7系に基づく原核生物in vitro発現系用
のpIVEXベクターが挙げられる。
【００１５】タンパク質発現に必要とされる制御エレメ
ントを含む線状DNA断片を、発現ベクターを線状化する
ことによって、調製するという本発明の解決手段のため
に、線状DNA断片は、前もってタンパク質のin vitro発
現に必要とされる全ての制御エレメントを含む必要があ
る。さらに、制御エレメントそれら自体の間、および制
御エレメントと発現される遺伝子との間には理想的な間
隔があるべきである。例えば、大腸菌系における終止コ
ドンとターミネーターとの距離は、発現率に関して決定
的な役割を果たす。この方法の別の利点は、制御エレメ
ントに加えて、また種々のタグおよび長い融合パートナ
ー、プロテアーゼ認識配列および/または真核生物リボ
ソームのためのCAP構造を増幅によって容易に融合させ
ることができることである。また本発明は、線状化ベク
ターがさらに切断されている系、または複数の線状化ベ
クターを用いる系も包含する。また発現に必要とされる
制御エレメントを2つのベクターに分配し、次いでそれ
らのベクターを線状化することができる。しかしなが
ら、タンパク質のin vitro発現のために断片化した線状
ベクターを使用することもできる。本発明のこの変法に
おいては、発現に必要な制御エレメントを含む線状DNA
断片を断片化、すなわち切断する。次いで得られる切断
した断片を、本発明に従って、制御エレメントを含む2
つのDNA断片に相補的な領域を両末端に含むタンパク質
コード遺伝子と共に、上流および下流に結合するプライ
マー対を用いて増幅する。以下の例は、本発明のこの変
法をより詳細に説明することを意図したものである。線
状化ベクター「V」は、切断前にはT7プロモーター、リ
ボソーム結合部位およびT7ターミネーターを有する。次
いで断片「V1」および「V2」を調製するが、「V1」はT7
プロモーターをもたず、「V2」はT7ターミネーターをも
はやもたない。ここで、本発明の方法は、「V」の代わ
りに「V1」および「V2」を用いて上記のように実施され
る；すなわち、「V1」および「V2」を、「V1」に相補的
な領域を一方の末端に有しかつ「V2」に相補的な領域を
他方の末端に有するタンパク質コード遺伝子と共に増幅
する。これに対応して、プライマー対は「V1」および
「V2」の上流および下流に結合する。
ントを含む線状DNA断片を、発現ベクターを線状化する
ことによって、調製するという本発明の解決手段のため
に、線状DNA断片は、前もってタンパク質のin vitro発
現に必要とされる全ての制御エレメントを含む必要があ
る。さらに、制御エレメントそれら自体の間、および制
御エレメントと発現される遺伝子との間には理想的な間
隔があるべきである。例えば、大腸菌系における終止コ
ドンとターミネーターとの距離は、発現率に関して決定
的な役割を果たす。この方法の別の利点は、制御エレメ
ントに加えて、また種々のタグおよび長い融合パートナ
ー、プロテアーゼ認識配列および/または真核生物リボ
ソームのためのCAP構造を増幅によって容易に融合させ
ることができることである。また本発明は、線状化ベク
ターがさらに切断されている系、または複数の線状化ベ
クターを用いる系も包含する。また発現に必要とされる
制御エレメントを2つのベクターに分配し、次いでそれ
らのベクターを線状化することができる。しかしなが
ら、タンパク質のin vitro発現のために断片化した線状
ベクターを使用することもできる。本発明のこの変法に
おいては、発現に必要な制御エレメントを含む線状DNA
断片を断片化、すなわち切断する。次いで得られる切断
した断片を、本発明に従って、制御エレメントを含む2
つのDNA断片に相補的な領域を両末端に含むタンパク質
コード遺伝子と共に、上流および下流に結合するプライ
マー対を用いて増幅する。以下の例は、本発明のこの変
法をより詳細に説明することを意図したものである。線
状化ベクター「V」は、切断前にはT7プロモーター、リ
ボソーム結合部位およびT7ターミネーターを有する。次
いで断片「V1」および「V2」を調製するが、「V1」はT7
プロモーターをもたず、「V2」はT7ターミネーターをも
はやもたない。ここで、本発明の方法は、「V」の代わ
りに「V1」および「V2」を用いて上記のように実施され
る；すなわち、「V1」および「V2」を、「V1」に相補的
な領域を一方の末端に有しかつ「V2」に相補的な領域を
他方の末端に有するタンパク質コード遺伝子と共に増幅
する。これに対応して、プライマー対は「V1」および
「V2」の上流および下流に結合する。
【００１６】本発明に係る方法の別の利点は、発現され
る遺伝子配列が、耐性遺伝子をコードする線状ベクター
を含む最初のPCRサイクルにおいて該ベクターに融合さ
れることである。ベクターのアームは、最初のサイクル
でプライマーとして機能するので、完全なプラスミドが
ある程度、同時合成される。このことは、無細胞系にお
ける発現にだけでなく、好適な細菌株における形質転換
にも最終産物を直接用いることができるという利点を有
する。従って、PCR産物は細菌クローンとしてプラスミ
ド中に確保される。
る遺伝子配列が、耐性遺伝子をコードする線状ベクター
を含む最初のPCRサイクルにおいて該ベクターに融合さ
れることである。ベクターのアームは、最初のサイクル
でプライマーとして機能するので、完全なプラスミドが
ある程度、同時合成される。このことは、無細胞系にお
ける発現にだけでなく、好適な細菌株における形質転換
にも最終産物を直接用いることができるという利点を有
する。従って、PCR産物は細菌クローンとしてプラスミ
ド中に確保される。
【００１７】線状DNA断片の両末端に相補的な領域を両
末端に有するタンパク質コード遺伝子は、本発明に従っ
てPCR反応により得られる。PCR反応において、該タンパ
ク質コード遺伝子は線状DNA断片の両末端とオーバーラ
ップする領域を5'末端に有する遺伝子特異的プライマー
を用いて増幅される。従って増幅された遺伝子は該プラ
イマーのオーバーラップする領域により伸長される。こ
の目的のために、遺伝子特異的センスプライマーは、そ
の5'末端に少なくとも5個の付加的ヌクレオチドを有
し、これらのヌクレオチドは線状DNA断片の上部鎖の3'
末端に同一である。また遺伝子特異的アンチセンスプラ
イマーは、その5'末端に少なくとも5個の付加的ヌクレ
オチドを有し、これらのヌクレオチドは線状DNA断片の
下部鎖の3'末端に同一である。
末端に有するタンパク質コード遺伝子は、本発明に従っ
てPCR反応により得られる。PCR反応において、該タンパ
ク質コード遺伝子は線状DNA断片の両末端とオーバーラ
ップする領域を5'末端に有する遺伝子特異的プライマー
を用いて増幅される。従って増幅された遺伝子は該プラ
イマーのオーバーラップする領域により伸長される。こ
の目的のために、遺伝子特異的センスプライマーは、そ
の5'末端に少なくとも5個の付加的ヌクレオチドを有
し、これらのヌクレオチドは線状DNA断片の上部鎖の3'
末端に同一である。また遺伝子特異的アンチセンスプラ
イマーは、その5'末端に少なくとも5個の付加的ヌクレ
オチドを有し、これらのヌクレオチドは線状DNA断片の
下部鎖の3'末端に同一である。
【００１８】タンパク質コード遺伝子を伸長するステッ
プ、およびこの遺伝子とタンパク質発現に必要とされる
制御エレメント(例えば、プロモーターおよびターミネ
ーター領域)を含む線状DNA断片とを共に増幅するステッ
プは、共通の反応で実施しても、連続的な反応で実施し
てもよい。
プ、およびこの遺伝子とタンパク質発現に必要とされる
制御エレメント(例えば、プロモーターおよびターミネ
ーター領域)を含む線状DNA断片とを共に増幅するステッ
プは、共通の反応で実施しても、連続的な反応で実施し
てもよい。
【００１９】大腸菌の溶解物を用いるタンパク質のin v
itro発現においては、線状ベクターはT7プロモーター、
リボソーム結合部位およびT7ターミネーターを含むこと
が好ましい。
itro発現においては、線状ベクターはT7プロモーター、
リボソーム結合部位およびT7ターミネーターを含むこと
が好ましい。
【００２０】さらに、本発明によれば、線状化ベクター
は、発現に必要とされる制御エレメントと同時に自動的
に導入されるC末端もしくはN末端タグ配列または融合タ
ンパク質配列をコードすることが好ましい。
は、発現に必要とされる制御エレメントと同時に自動的
に導入されるC末端もしくはN末端タグ配列または融合タ
ンパク質配列をコードすることが好ましい。
【００２１】増幅は、当業者に公知のPCRプロトコール
(PCR Newton & Graham編, 1994, publisher Spektrum,
Heidelberg；PCR McPhersonおよびMoller編, 2000, BIO
S Scientific Publishers Oxford)によって実施するこ
とができる。
(PCR Newton & Graham編, 1994, publisher Spektrum,
Heidelberg；PCR McPhersonおよびMoller編, 2000, BIO
S Scientific Publishers Oxford)によって実施するこ
とができる。
【００２２】本発明は、特にタンパク質のin vitro発現
用の線状DNA断片を作製するためのキットであって、1ま
たは複数の容器に、発現ベクターを線状化することによ
って得られるタンパク質発現に必要とされる全ての制御
エレメントを含む線状DNA断片、および線状DNA断片上の
発現制御領域の上流および下流に結合するか、またはプ
ロモーターおよびターミネーター領域の5'末端に直接的
に結合する外部プライマー対、が収容されていることを
特徴とする、前記キットに関する。
用の線状DNA断片を作製するためのキットであって、1ま
たは複数の容器に、発現ベクターを線状化することによ
って得られるタンパク質発現に必要とされる全ての制御
エレメントを含む線状DNA断片、および線状DNA断片上の
発現制御領域の上流および下流に結合するか、またはプ
ロモーターおよびターミネーター領域の5'末端に直接的
に結合する外部プライマー対、が収容されていることを
特徴とする、前記キットに関する。
【００２３】さらに本発明に係るキットは、同じまたは
別々の容器中に、線状DNA断片の両末端とオーバーラッ
プする領域を5'末端に有する遺伝子特異的プライマーを
含むことができる。この目的のために、遺伝子特異的セ
ンスプライマーは、その5'末端に少なくとも5個の付加
的ヌクレオチドを有し、これらのヌクレオチドは線状DN
A断片の上部鎖の3'末端に同一である。また遺伝子特異
的アンチセンスプライマーは、その5'末端に少なくとも
5個の付加的ヌクレオチドを有し、これらのヌクレオチ
ドは線状DNA断片の下部鎖の3'末端に同一である。
別々の容器中に、線状DNA断片の両末端とオーバーラッ
プする領域を5'末端に有する遺伝子特異的プライマーを
含むことができる。この目的のために、遺伝子特異的セ
ンスプライマーは、その5'末端に少なくとも5個の付加
的ヌクレオチドを有し、これらのヌクレオチドは線状DN
A断片の上部鎖の3'末端に同一である。また遺伝子特異
的アンチセンスプライマーは、その5'末端に少なくとも
5個の付加的ヌクレオチドを有し、これらのヌクレオチ
ドは線状DNA断片の下部鎖の3'末端に同一である。
【００２４】さらに本発明に係るキットは、校正活性を
示すかもしくは示さないDNAポリメラーゼまたはそれら2
種のDNAポリメラーゼの混合物、ならびに必要とされる
バッファー、塩化マグネシウム溶液、デオキシヌクレオ
シド三リン酸、およびPCR反応を最適化するための試薬
(例えば、DMSO、グリセロール、ホルムアミド、ベタイ
ン、7-デアザGTPなど)を含むことができる。キットの別
の好ましい実施形態において、線状DNA断片は、Hisタ
グ、HAタグおよびGFP配列などのC末端もしくはN末端タ
グ配列または融合タンパク質配列を含む。
示すかもしくは示さないDNAポリメラーゼまたはそれら2
種のDNAポリメラーゼの混合物、ならびに必要とされる
バッファー、塩化マグネシウム溶液、デオキシヌクレオ
シド三リン酸、およびPCR反応を最適化するための試薬
(例えば、DMSO、グリセロール、ホルムアミド、ベタイ
ン、7-デアザGTPなど)を含むことができる。キットの別
の好ましい実施形態において、線状DNA断片は、Hisタ
グ、HAタグおよびGFP配列などのC末端もしくはN末端タ
グ配列または融合タンパク質配列を含む。
【００２５】本発明は、タンパク質のin vitro発現用の
線状DNA断片を作製するための本発明に係るキットの使
用に関する。
線状DNA断片を作製するための本発明に係るキットの使
用に関する。
【００２６】さらなる本発明の主題は、PCR断片がタン
パク質コード遺伝子およびタンパク質発現に必要とされ
る制御エレメント(例えば、プロモーターおよびターミ
ネーター領域)を含む、上記の本発明の方法によって得
ることができる線状DNA断片である。
パク質コード遺伝子およびタンパク質発現に必要とされ
る制御エレメント(例えば、プロモーターおよびターミ
ネーター領域)を含む、上記の本発明の方法によって得
ることができる線状DNA断片である。
【００２７】大腸菌由来の溶解物を用いたタンパク質の
in vitro発現においては、線状DNA断片はT7プロモータ
ー、リボソーム結合部位およびT7ターミネーターを含む
ことが好ましい。
in vitro発現においては、線状DNA断片はT7プロモータ
ー、リボソーム結合部位およびT7ターミネーターを含む
ことが好ましい。
【００２８】別の好ましい実施形態において、線状DNA
断片は、Hisタグ、HAタグおよびGFP配列などのC末端も
しくはN末端タグ配列または融合タンパク質配列を含
む。
断片は、Hisタグ、HAタグおよびGFP配列などのC末端も
しくはN末端タグ配列または融合タンパク質配列を含
む。
【００２９】また本発明は、無細胞発現系においてタン
パク質をin vitroで発現させるための、本発明に係る線
状DNA断片の使用に関する。特に本発明は、細菌株また
は真核細胞由来の溶解物を用いてタンパク質をin vitro
で発現させるための、本発明に係る線状DNA断片の使用
に関する。
パク質をin vitroで発現させるための、本発明に係る線
状DNA断片の使用に関する。特に本発明は、細菌株また
は真核細胞由来の溶解物を用いてタンパク質をin vitro
で発現させるための、本発明に係る線状DNA断片の使用
に関する。
【００３０】本発明の別の主題は、以下のステップ：上
記の本発明の方法による線状DNA断片の作製、in vitro
転写および/または翻訳、を含むタンパク質の発現方法
である。
記の本発明の方法による線状DNA断片の作製、in vitro
転写および/または翻訳、を含むタンパク質の発現方法
である。
【００３１】タンパク質のin vitro発現は無細胞発現系
で実施されることが好ましい。このようなin vitro翻訳
方法が種々の原核細胞および真核細胞系について記載さ
れている(NirenbergおよびMatthaei, 1961；Zubay 197
3；JacksonおよびHunt, 1983； EricksonおよびBlobel,
1983；MatthewsおよびColman 1991)。
で実施されることが好ましい。このようなin vitro翻訳
方法が種々の原核細胞および真核細胞系について記載さ
れている(NirenbergおよびMatthaei, 1961；Zubay 197
3；JacksonおよびHunt, 1983； EricksonおよびBlobel,
1983；MatthewsおよびColman 1991)。
【００３２】タンパク質のin vitro発現は細菌株または
真核細胞由来の溶解物を用いた共役系(coupled system)
において実施されることが特に好ましい(Zubay 1973；B
aranovら, 1989；KigawaおよびYokoyama, 1991；Kudlic
kiら, 1992；Spirin, 1992；BaranovおよびSpirin, 199
3)。またタンパク質のin vitro発現は、CFCFまたはCECF
反応器中で実施することができる(Spirinら, 1988)。
真核細胞由来の溶解物を用いた共役系(coupled system)
において実施されることが特に好ましい(Zubay 1973；B
aranovら, 1989；KigawaおよびYokoyama, 1991；Kudlic
kiら, 1992；Spirin, 1992；BaranovおよびSpirin, 199
3)。またタンパク質のin vitro発現は、CFCFまたはCECF
反応器中で実施することができる(Spirinら, 1988)。
【００３３】特に、タンパク質のin vitro発現は大腸菌
由来の溶解物を用いて実施されることが好ましい。さら
に、タンパク質をin vitroで発現させるための本発明に
係る方法は、タンパク質コード遺伝子が遺伝子バンクま
たはRNA画分からPCRまたはRT-PCRによって直接的に増幅
されることを特徴とすることが好ましい。
由来の溶解物を用いて実施されることが好ましい。さら
に、タンパク質をin vitroで発現させるための本発明に
係る方法は、タンパク質コード遺伝子が遺伝子バンクま
たはRNA画分からPCRまたはRT-PCRによって直接的に増幅
されることを特徴とすることが好ましい。
【００３４】図面の説明 図１ タンパク質のin vitro発現用の線状DNA断片の作製方法
1回目の遺伝子特異的PCR反応において、発現される遺伝
子の5'末端に相補的な領域をプライマーによって付与す
る。2回目のPCRにおいて、付与された相補的な末端によ
って1回目のPCR産物と末端でハイブリダイズすることが
できる線状化発現ベクターを存在させる。複数の中間ス
テップにおいて、2本のベクター鎖の3'末端はプライマ
ーとして機能し、1回目のPCR産物とのハイブリダイゼー
ション後に伸長される。また1回目のPCR産物の3'末端
は、ベクター末端とのハイブリダイゼーション後に伸長
される。続いて、発現されるPCR産物は、プロモーター
およびターミネーターの上流および下流に結合する第2
のプライマー対を用いた複数回の増幅サイクルによって
得られる(この例ではT7系)。
子の5'末端に相補的な領域をプライマーによって付与す
る。2回目のPCRにおいて、付与された相補的な末端によ
って1回目のPCR産物と末端でハイブリダイズすることが
できる線状化発現ベクターを存在させる。複数の中間ス
テップにおいて、2本のベクター鎖の3'末端はプライマ
ーとして機能し、1回目のPCR産物とのハイブリダイゼー
ション後に伸長される。また1回目のPCR産物の3'末端
は、ベクター末端とのハイブリダイゼーション後に伸長
される。続いて、発現されるPCR産物は、プロモーター
およびターミネーターの上流および下流に結合する第2
のプライマー対を用いた複数回の増幅サイクルによって
得られる(この例ではT7系)。
【００３５】図２a
各レーンは以下のものを示す：
レーンM DNA分子量マーカー
レーン1 1回目の遺伝子特異的PCRからのGFP PCR産物5μl
レーン2 1回目の遺伝子産物を含まないオーバーラップ伸長PCRの陰性対照
レーン3 オーバーラップ伸長PCRからの産物(GFP-His)5μl
【００３６】図２b
活性GFP量を、RTS100大腸菌HYキットにおける発現後に
蛍光計で測定した。プラスミドpIVEX2.1GFP、長い外部
プライマーを用いて得られたPCR産物(2ステップPCR GF
P)およびオーバーラップ伸長PCRによって得られた産物
の2つの異なる量の間で比較を行った。
蛍光計で測定した。プラスミドpIVEX2.1GFP、長い外部
プライマーを用いて得られたPCR産物(2ステップPCR GF
P)およびオーバーラップ伸長PCRによって得られた産物
の2つの異なる量の間で比較を行った。
【００３７】図３a
各レーンは以下のものを示す：
レーンX DNA分子量マーカー
レーン- 鋳型を含まない遺伝子特異的PCRの陰性対照
レーン+ 1回目の遺伝子特異的PCRからの産物(GFP)5μl
レーンVIII DNA分子量マーカー
レーン9/10 プライマーの組合せ9/10(配列番号７および８)を用いたオーバー
ラップ伸長PCRからのGFP PCR産物(GFP Strepタグ)3μl
レーン26/28 プライマーの組合せ26/28(配列番号９および１０)を用いたオーバ
ーラップ伸長PCRからのGFP PCR産物(GFP Strepタグ)3μl
レーン50/49 プライマーの組合せ50/49(配列番号１１および１２)を用いたオー
バーラップ伸長PCRからのGFP PCR産物(GFP Strepタグ)3μl
【００３８】図３b
活性GFP量を、RTS100大腸菌HYキットにおける発現後に
蛍光計で測定した。プラスミドpIVEX2.1GFP、長い外部
プライマーを用いて得られたGFP-PCR産物(2ステップPC
R)および外部プライマー対を用いて調製した3つの異な
るオーバーラップ伸長PCR産物の間で比較を行った。
蛍光計で測定した。プラスミドpIVEX2.1GFP、長い外部
プライマーを用いて得られたGFP-PCR産物(2ステップPC
R)および外部プライマー対を用いて調製した3つの異な
るオーバーラップ伸長PCR産物の間で比較を行った。
【００３９】図４a
各レーンは以下のものを示す：
レーンM DNA分子量マーカー
レーン- 鋳型を含まない遺伝子特異的PCRの陰性対照
レーン+ 1回目の遺伝子特異的PCRからの産物(Epo)5μl
レーン2.2 オーバーラップ伸長PCRからのEpo PCR産物(Epo Strepタグ)5μl
レーン2.4 オーバーラップ伸長PCRからのEpo PCR産物(Epo Hisタグ)5μl
【００４０】図４b
RTS100大腸菌HYキットにおける発現後にStrepタグおよ
びHisタグを有するEpoの量をウエスタンブロットによっ
て分析した。図４a(レーン2.2および2.4)に示す各線状E
po発現構築物2μlをRTS100において発現させた。これら
の発現溶液5μlおよび10μlを4〜12％のNu PAGEゲルに
おいて分離し、続いてメンブレン上にブロットした。検
出を抗Epoモノクローナル抗体によって行った。M = タ
ンパク質分子量マーカー；ctrl = RTS100における発現
後のオーバーラップ伸長PCRの陰性対照。
びHisタグを有するEpoの量をウエスタンブロットによっ
て分析した。図４a(レーン2.2および2.4)に示す各線状E
po発現構築物2μlをRTS100において発現させた。これら
の発現溶液5μlおよび10μlを4〜12％のNu PAGEゲルに
おいて分離し、続いてメンブレン上にブロットした。検
出を抗Epoモノクローナル抗体によって行った。M = タ
ンパク質分子量マーカー；ctrl = RTS100における発現
後のオーバーラップ伸長PCRの陰性対照。
【００４１】
【実施例】実施例１ 線状化pIVEX2.3プラスミドを用いたオーバーラップ伸長
PCRおよびGFP発現データ 1回目のPCR反応(レーン1に適用した5μl、図２a)を、以
下の混合物50μl中で以下の条件下に実施した：1.5mM M
gCl2(最終濃度)を含む10 x PCRバッファー5μl、0.5μM
プライマーA、0.5μMプライマーB、250μM dNTP's(Roch
e社)、3U Pwo(Roche社)。GFP(緑色蛍光タンパク質)の配
列とC末端Hisタグ配列とを有し、調節発現エレメントを
含まないプラスミドpCRIITOPO-GFP 100ngをDNA鋳型とし
て使用した。以下のオリゴヌクレオチドをセンスプライ
マーAとして使用した： A GFP 15/15 配列番号１：5'-AGA AGG AGA TAT ACC ATG
ACT AGC AAA GGA-3' 以下のオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマーB
として使用した： B GFPmw 配列番号２：5'-ATT CGC CTT TTA TTA ATG ATG
ATG ATG ATG-3' プログラム94℃ 4分-20回(94℃ 1分-50℃ 1分-72℃ 1
分)-4℃を、Perkin Elmer社製のGene Amp 9600 PCR機器
で実行した。
PCRおよびGFP発現データ 1回目のPCR反応(レーン1に適用した5μl、図２a)を、以
下の混合物50μl中で以下の条件下に実施した：1.5mM M
gCl2(最終濃度)を含む10 x PCRバッファー5μl、0.5μM
プライマーA、0.5μMプライマーB、250μM dNTP's(Roch
e社)、3U Pwo(Roche社)。GFP(緑色蛍光タンパク質)の配
列とC末端Hisタグ配列とを有し、調節発現エレメントを
含まないプラスミドpCRIITOPO-GFP 100ngをDNA鋳型とし
て使用した。以下のオリゴヌクレオチドをセンスプライ
マーAとして使用した： A GFP 15/15 配列番号１：5'-AGA AGG AGA TAT ACC ATG
ACT AGC AAA GGA-3' 以下のオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマーB
として使用した： B GFPmw 配列番号２：5'-ATT CGC CTT TTA TTA ATG ATG
ATG ATG ATG-3' プログラム94℃ 4分-20回(94℃ 1分-50℃ 1分-72℃ 1
分)-4℃を、Perkin Elmer社製のGene Amp 9600 PCR機器
で実行した。
【００４２】2回目のPCR反応(レーン3に適用した5μl、
図２a；図２aにおけるレーン2は、1回目のPCR産物を含
まない2回目のPCR対照反応を示す)を、以下の混合物50
μl中で以下の条件下に実施した：1.5mM MgCl2(最終濃
度)を含む10 x PCRバッファー5μl、0.5μMセンスプラ
イマー、0.5μMアンチセンスプライマー、250μM dNTP'
s(Roche社)、3U Pwo (Roche社)。1回目のPCR産物2μlを
鋳型として添加した。さらに、NcoI/SmaIで線状化し、
続いてアガロースゲルから抽出したプラスミドpIVEX2.3
10ngを存在させた。以下のプライマーを用いた： センスプライマーMd0 SS： 配列番号３： 5'-GAA ATT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ACC ACA ACG
GTT TC-3' およびアンチセンスプライマーMd14 Ter AS 配列番号４: 5'-CAA AAA ACC CCT CAA GAC CCG TTT AGA GGC CCC AAG
G-3' プログラム94℃ 4分-30回(94℃ 1分-60℃ 1分-72℃ 1分
30秒)-4℃を、PerkinElmer社製のGene Amp 9600 PCR機
器で実行した。
図２a；図２aにおけるレーン2は、1回目のPCR産物を含
まない2回目のPCR対照反応を示す)を、以下の混合物50
μl中で以下の条件下に実施した：1.5mM MgCl2(最終濃
度)を含む10 x PCRバッファー5μl、0.5μMセンスプラ
イマー、0.5μMアンチセンスプライマー、250μM dNTP'
s(Roche社)、3U Pwo (Roche社)。1回目のPCR産物2μlを
鋳型として添加した。さらに、NcoI/SmaIで線状化し、
続いてアガロースゲルから抽出したプラスミドpIVEX2.3
10ngを存在させた。以下のプライマーを用いた： センスプライマーMd0 SS： 配列番号３： 5'-GAA ATT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ACC ACA ACG
GTT TC-3' およびアンチセンスプライマーMd14 Ter AS 配列番号４: 5'-CAA AAA ACC CCT CAA GAC CCG TTT AGA GGC CCC AAG
G-3' プログラム94℃ 4分-30回(94℃ 1分-60℃ 1分-72℃ 1分
30秒)-4℃を、PerkinElmer社製のGene Amp 9600 PCR機
器で実行した。
【００４３】線状化pIVEX2.3プラスミドを用いたオーバ
ーラップ伸長PCR方法によって調製したGFP発現構築物
(図２a、レーン3)を、迅速な翻訳系(Rapid Translation
System)RTS 100大腸菌HYキットの使用説明書に従っ
て、混合物50μlにおいて30℃および650rpmで16時間イ
ンキュベートした。図２a、レーン3に示す産物2.2μlお
よび4.4μl、ならびにプラスミドDNA pIVEX2.1-GFP 0.5
μgを使用して、線状化pIVEXプラスミドを用いたオーバ
ーラップ伸長PCRを行わず、長いプライマーを用いた2ス
テップPCR反応によって調製したGFP PCR産物の同一量と
比較した。
ーラップ伸長PCR方法によって調製したGFP発現構築物
(図２a、レーン3)を、迅速な翻訳系(Rapid Translation
System)RTS 100大腸菌HYキットの使用説明書に従っ
て、混合物50μlにおいて30℃および650rpmで16時間イ
ンキュベートした。図２a、レーン3に示す産物2.2μlお
よび4.4μl、ならびにプラスミドDNA pIVEX2.1-GFP 0.5
μgを使用して、線状化pIVEXプラスミドを用いたオーバ
ーラップ伸長PCRを行わず、長いプライマーを用いた2ス
テップPCR反応によって調製したGFP PCR産物の同一量と
比較した。
【００４４】長いPCRプライマーによるプロモーターお
よびリボソーム結合部位の組込みは、PCR方法に関する
最新の書物(PCR Newton & Graham編, 1994, Publisher
Spektrum, Heidelberg; PCR McPhersonおよびMoller, 2
000, BIOS Scientific Publishers, Oxford)に記載され
ている。全ての産物を蛍光計で測定した。
よびリボソーム結合部位の組込みは、PCR方法に関する
最新の書物(PCR Newton & Graham編, 1994, Publisher
Spektrum, Heidelberg; PCR McPhersonおよびMoller, 2
000, BIOS Scientific Publishers, Oxford)に記載され
ている。全ての産物を蛍光計で測定した。
【００４５】長いプライマーを用いた2ステップPCR反応
においては、付加的非翻訳配列をほんの少量しか導入す
ることができず(長いプライマーの合成およびPCR反応に
おいて問題が生じる)、従ってDNA産物および転写された
mRNAは不安定であり、少量のタンパク質しか得られな
い。2倍を超えるほど高いタンパク質収量が、より大き
な安定したDNA断片を生じる線状化プラスミドを用いた
オーバーラップ伸長PCR方法によって達成された(図２a/
b)。
においては、付加的非翻訳配列をほんの少量しか導入す
ることができず(長いプライマーの合成およびPCR反応に
おいて問題が生じる)、従ってDNA産物および転写された
mRNAは不安定であり、少量のタンパク質しか得られな
い。2倍を超えるほど高いタンパク質収量が、より大き
な安定したDNA断片を生じる線状化プラスミドを用いた
オーバーラップ伸長PCR方法によって達成された(図２a/
b)。
【００４６】実施例２ 線状化pIVEX2.1プラスミドおよび種々の第2のプライマ
ー対を使用して得られたオーバーラップ伸長PCR産物を
用いたGFP発現データ 1回目のPCR反応(Rct 1 +; 5μlを適用；図３a)を、以下
の混合物50μl中で以下の条件下に実施した：MgSO4を含
まない10 x Pwoバッファー5μl、25mM MgSO46μl(最終
濃度3mM)、1.5mM MgCl2(最終濃度)、0.5μMプライマー
A、0.5μMプライマーB、250μM dNTP's(Roche社)、3U P
wo (Roche社)。GFP(緑色蛍光タンパク質)の配列とC末端
Hisタグ配列とを含み、調節発現エレメントを含まない
プラスミドpCRIITOPO-2.3 GFP 500ngをDNA鋳型として使
用した。以下のオリゴヌクレオチドをセンスプライマー
(A)として使用した： A GFP 21/15 配列番号５： 5'-ACT TTA AGA AGG AGA TAT ACC ATG ACT AGC AAA GGA
-3' 以下のオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマー
(B)として用いた： B GFP 22/18 2.1 over 配列番号６： 5'-GCG GGT GGC TCC AAG CGC TCC CGG GTT TGT ATA GTT
CAT CC-3' プログラム94℃ 4分-20回(94℃ 1分-50℃ 1分-72℃ 1
分)-4℃を、Perkin Elmer社製のGene Amp 9600 PCR機器
で実行した。
ー対を使用して得られたオーバーラップ伸長PCR産物を
用いたGFP発現データ 1回目のPCR反応(Rct 1 +; 5μlを適用；図３a)を、以下
の混合物50μl中で以下の条件下に実施した：MgSO4を含
まない10 x Pwoバッファー5μl、25mM MgSO46μl(最終
濃度3mM)、1.5mM MgCl2(最終濃度)、0.5μMプライマー
A、0.5μMプライマーB、250μM dNTP's(Roche社)、3U P
wo (Roche社)。GFP(緑色蛍光タンパク質)の配列とC末端
Hisタグ配列とを含み、調節発現エレメントを含まない
プラスミドpCRIITOPO-2.3 GFP 500ngをDNA鋳型として使
用した。以下のオリゴヌクレオチドをセンスプライマー
(A)として使用した： A GFP 21/15 配列番号５： 5'-ACT TTA AGA AGG AGA TAT ACC ATG ACT AGC AAA GGA
-3' 以下のオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマー
(B)として用いた： B GFP 22/18 2.1 over 配列番号６： 5'-GCG GGT GGC TCC AAG CGC TCC CGG GTT TGT ATA GTT
CAT CC-3' プログラム94℃ 4分-20回(94℃ 1分-50℃ 1分-72℃ 1
分)-4℃を、Perkin Elmer社製のGene Amp 9600 PCR機器
で実行した。
【００４７】添加された線状化pIVEX2.1プラスミド上の
T7プロモーターおよびT7ターミネーターの上流および下
流に異なる距離で結合する4種の異なる外部プライマー
対を2回目のPCR反応に用いた。2回目のPCR反応(Rct 2;
各回に3μlを適用した, 図３a)を、以下の混合物50μl
中で以下の条件下に実施した：MgSO4を含まない10 x Pw
oバッファー5μl、25mM MgSO4 6μl(最終濃度3mM)、0.5
μMセンスプライマー、0.5μMアンチセンスプライマ
ー、250μM dNTP's(Roche社)、3U Pwo (Roche社)。1回
目のPCR産物2μlを鋳型として添加した。さらにNcoI/Sm
aIで線状化し、続いてアガロースゲルから抽出したプラ
スミドpIVEX2.1 10ngを存在させた。
T7プロモーターおよびT7ターミネーターの上流および下
流に異なる距離で結合する4種の異なる外部プライマー
対を2回目のPCR反応に用いた。2回目のPCR反応(Rct 2;
各回に3μlを適用した, 図３a)を、以下の混合物50μl
中で以下の条件下に実施した：MgSO4を含まない10 x Pw
oバッファー5μl、25mM MgSO4 6μl(最終濃度3mM)、0.5
μMセンスプライマー、0.5μMアンチセンスプライマ
ー、250μM dNTP's(Roche社)、3U Pwo (Roche社)。1回
目のPCR産物2μlを鋳型として添加した。さらにNcoI/Sm
aIで線状化し、続いてアガロースゲルから抽出したプラ
スミドpIVEX2.1 10ngを存在させた。
【００４８】以下のプライマー対を用いた：
対9/10 センスプライマーM + 9 SS
配列番号７：
5'-CGA TCC CGC GAA ATT AAT ACG ACT CAC TAT AG-3'
およびアンチセンスプライマーM + 10 AS
配列番号８：
5'-CTC CTT TCA GCA AAA AAC CCC TCA AGA CCC G-3'
このプライマー対は、T7プロモーターの9ヌクレオチド
上流およびT7ターミネーターの10ヌクレオチド下流にハ
イブリダイズする。
上流およびT7ターミネーターの10ヌクレオチド下流にハ
イブリダイズする。
【００４９】対26/28 センスプライマーM + 26 SS
配列番号９：
5'-GTA GAG GAT CGA GAT CTC GAT CCC GCG-3'
およびアンチセンスプライマーM + 28 AS
配列番号１０：
5'-GAT ATC CGG ATA TAG TTC CTC CTT TCA GC-3'
このプライマー対は、T7プロモーターの26ヌクレオチド
上流およびT7ターミネーターの28ヌクレオチド下流にハ
イブリダイズする。
上流およびT7ターミネーターの28ヌクレオチド下流にハ
イブリダイズする。
【００５０】対50/49 センスプライマーM + 50 SS
配列番号１１：
5'-GAT GCC GGC CAC GAT GCG TCC GGC GTA GAG G-3'
およびアンチセンスプライマーM + 49 AS
配列番号１２：
5'-GGC GAC CAC ACC CGT CCT GTG GAT ATC CGG-3'
このプライマー対は、T7プロモーターの50ヌクレオチド
上流およびT7ターミネーターの49ヌクレオチド下流にハ
イブリダイズする。
上流およびT7ターミネーターの49ヌクレオチド下流にハ
イブリダイズする。
【００５１】プログラム94℃ 4分-30回(94℃ 1分-60℃
1分-72℃ 1分30秒)-4℃を、PerkinElmer社製のGene Amp
9600 PCR機器で実行した。
1分-72℃ 1分30秒)-4℃を、PerkinElmer社製のGene Amp
9600 PCR機器で実行した。
【００５２】線状化pIVEX2.1プラスミドを用いてオーバ
ーラップ伸長PCR方法によって調製した種々の長さのGFP
発現構築物(図３a、Rct 2)を、迅速な翻訳系RTS 100大
腸菌HYキットの使用説明書に従って、混合物50μlにお
いて30℃および650rpmで4時間インキュベートした。混
合物50μlあたり、それぞれの2回目のPCR産物200ngおよ
びpIVEX2.1-GFP 500ngを使用して、線状化pIVEXプラス
ミドを用いたオーバーラップ伸長PCRを行うことなく、
長いプライマーを用いた2ステップPCR反応によって調製
したGFP PCR産物の同一量と比較した(2ステップPCR)。
全ての産物を蛍光計で測定した。
ーラップ伸長PCR方法によって調製した種々の長さのGFP
発現構築物(図３a、Rct 2)を、迅速な翻訳系RTS 100大
腸菌HYキットの使用説明書に従って、混合物50μlにお
いて30℃および650rpmで4時間インキュベートした。混
合物50μlあたり、それぞれの2回目のPCR産物200ngおよ
びpIVEX2.1-GFP 500ngを使用して、線状化pIVEXプラス
ミドを用いたオーバーラップ伸長PCRを行うことなく、
長いプライマーを用いた2ステップPCR反応によって調製
したGFP PCR産物の同一量と比較した(2ステップPCR)。
全ての産物を蛍光計で測定した。
【００５３】線状化pIVEX2.1プラスミドを用いたオーバ
ーラップ伸長PCRによって得られた種々の長さのGFP発現
構築物は、2ステップGFP-PCR産物と比較して発現率の著
しい増大を示した。実施例１と対照的に、この場合、線
状化ベクターとオーバーラップする領域は、21および22
ヌクレオチドの長さにすぎなかった。このオーバーラッ
プする領域は、陽性のオーバーラップ伸長PCR反応にと
って十分であった。2回目のPCR産物の伸長は、T7プロモ
ーターおよびT7ターミネーター配列の上流および下流に
異なる距離でハイブリダイズする第2のプライマー対を
用いて、明らかに示された。試験遺伝子としてGFPを用
いると、T7調節エレメントのもう一方の側に対して約30
bpの距離が理想的であるとわかった。
ーラップ伸長PCRによって得られた種々の長さのGFP発現
構築物は、2ステップGFP-PCR産物と比較して発現率の著
しい増大を示した。実施例１と対照的に、この場合、線
状化ベクターとオーバーラップする領域は、21および22
ヌクレオチドの長さにすぎなかった。このオーバーラッ
プする領域は、陽性のオーバーラップ伸長PCR反応にと
って十分であった。2回目のPCR産物の伸長は、T7プロモ
ーターおよびT7ターミネーター配列の上流および下流に
異なる距離でハイブリダイズする第2のプライマー対を
用いて、明らかに示された。試験遺伝子としてGFPを用
いると、T7調節エレメントのもう一方の側に対して約30
bpの距離が理想的であるとわかった。
【００５４】実施例３ オーバーラップ伸長PCRによるヒトエリスロポエチン配
列へのStrepおよびHisタグ配列ならびにプロテアーゼ認
識配列の付加 1回目のエリスロポエチン(Epo)特異的PCR反応(Rct 1
+；5μlを適用,図４a)を、以下の混合物50μl中で以下
の条件下に実施した：MgSO4を含まない10 x Pwoバッフ
ァー5μl、25mM MgSO4 6μl(最終濃度3mM)、0.5μM Epo
特異的センスプライマー、0.5μM Epo特異的アンチセン
スプライマー、250μM dNTP's(Roche社)、3UPwo (Roche
社)。Johannes Auer博士から供与されたヒトエリスロポ
エチンの配列を有し、タグ配列を含まないプラスミドpc
DNA3-Epo 300ngをDNA鋳型として使用した。以下のオリ
ゴヌクレオチドをセンスプライマーとして使用した： 2X Xa Epo 配列番号１３： 5'-GGC CGC TTA ATT AAA CAT ATG ACC ATC GAA GGC CGC
GCC CCA CCA CGC CTC ATC-3' 以下のオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマーと
して使用した： 3'EPO/Vec correct 配列番号１４： 5'-CGG ATC TTA CCG GAT CCC GGG TTA TCA TCT GTC CCC
TGT CCT GC-3' プログラム94℃ 4分-20回(94℃ 1分-50℃ 1分-72℃ 1
分)-4℃を、Perkin Elmer社製のGene Amp 9600 PCR機器
で実行した。
列へのStrepおよびHisタグ配列ならびにプロテアーゼ認
識配列の付加 1回目のエリスロポエチン(Epo)特異的PCR反応(Rct 1
+；5μlを適用,図４a)を、以下の混合物50μl中で以下
の条件下に実施した：MgSO4を含まない10 x Pwoバッフ
ァー5μl、25mM MgSO4 6μl(最終濃度3mM)、0.5μM Epo
特異的センスプライマー、0.5μM Epo特異的アンチセン
スプライマー、250μM dNTP's(Roche社)、3UPwo (Roche
社)。Johannes Auer博士から供与されたヒトエリスロポ
エチンの配列を有し、タグ配列を含まないプラスミドpc
DNA3-Epo 300ngをDNA鋳型として使用した。以下のオリ
ゴヌクレオチドをセンスプライマーとして使用した： 2X Xa Epo 配列番号１３： 5'-GGC CGC TTA ATT AAA CAT ATG ACC ATC GAA GGC CGC
GCC CCA CCA CGC CTC ATC-3' 以下のオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマーと
して使用した： 3'EPO/Vec correct 配列番号１４： 5'-CGG ATC TTA CCG GAT CCC GGG TTA TCA TCT GTC CCC
TGT CCT GC-3' プログラム94℃ 4分-20回(94℃ 1分-50℃ 1分-72℃ 1
分)-4℃を、Perkin Elmer社製のGene Amp 9600 PCR機器
で実行した。
【００５５】2回目のPCR反応(各5μl)(図４a)を、以下
の混合物50μl中で以下の条件下に実施した：MgSO4を含
まない10 x Pwoバッファー5μl、25mM MgSO4 6μl(最終
濃度3mM)、0.5μMセンスプライマー、0.5μMアンチセン
スプライマー、250μM dNTP's(Roche社)、3U Pwo (Roch
e社)。1回目のPCR産物2μlを鋳型として添加した。さら
にNdeI/SalIで線状化し、続いてアガロースゲルから抽
出したStrepタグをコードするプラスミドpIVEX2.2 10n
g、またはNdeI/SalIで線状化し、続いてアガロースゲル
から抽出したHisタグをコードするプラスミドpIVEX2.4
10ngを存在させた。
の混合物50μl中で以下の条件下に実施した：MgSO4を含
まない10 x Pwoバッファー5μl、25mM MgSO4 6μl(最終
濃度3mM)、0.5μMセンスプライマー、0.5μMアンチセン
スプライマー、250μM dNTP's(Roche社)、3U Pwo (Roch
e社)。1回目のPCR産物2μlを鋳型として添加した。さら
にNdeI/SalIで線状化し、続いてアガロースゲルから抽
出したStrepタグをコードするプラスミドpIVEX2.2 10n
g、またはNdeI/SalIで線状化し、続いてアガロースゲル
から抽出したHisタグをコードするプラスミドpIVEX2.4
10ngを存在させた。
【００５６】以下のプライマーを使用した：
センスプライマーMd0 SS
配列番号１５：
5'-GAA ATT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ACC ACA ACG
GTT TC-3' およびアンチセンスプライマーMd14 Ter AS 配列番号１６： 5'-CAA AAA ACC CCT CAA GAC CCG TTT AGA GGC CCC AAG
G-3' プログラム94℃ 4分-30回(94℃ 1分-60℃ 1分-72℃ 2
分)-4℃を、Perkin Elmer社製のGene Amp 9600 PCR機器
で実行した。
GTT TC-3' およびアンチセンスプライマーMd14 Ter AS 配列番号１６： 5'-CAA AAA ACC CCT CAA GAC CCG TTT AGA GGC CCC AAG
G-3' プログラム94℃ 4分-30回(94℃ 1分-60℃ 1分-72℃ 2
分)-4℃を、Perkin Elmer社製のGene Amp 9600 PCR機器
で実行した。
【００５７】線状化pIVEX2.2またはpIVEX2.4プラスミド
を用いたオーバーラップ伸長PCR方法によって調製したE
po発現構築物(図４a)を、迅速な翻訳系RTS 100大腸菌HY
キットの使用説明書に従って、混合物50μlにおいて30
℃および650rpmで4時間インキュベートした。2回目のPC
R反応からの産物5μlおよび10μlアリコートを発現に用
いた。それぞれの発現混合物2μlを、サンプルバッファ
ー(Novex)と混合し、95℃まで5分間加熱し、氷上で冷却
し、1 x MESバッファーを含む4〜12％のNuPAGEゲル(Nov
ex)上で200Vで分離した。タンパク質をニトロセルロー
スメンブレン(Protan, Schleicher & Schuell)上に30V
で30分間エレクトロブロッテイングすることによって転
写した。該メンブレンを1倍濃度TBS-Tバッファーに溶解
した3％のBSA溶液で1時間ブロッキングし、1倍濃度TBS-
Tバッファーで洗浄し、MAB抗Epo-POD結合抗体(Roche社)
を含む1倍濃度TBS-Tとともに1時間インキュベートし
た。1倍濃度TBS-Tを用いて3回洗浄した後、タンパク質
を製造業者の使用説明書に従い、Lumi Light plusウエ
スタンブロッティング基質(Roche社)によって検出し
た。
を用いたオーバーラップ伸長PCR方法によって調製したE
po発現構築物(図４a)を、迅速な翻訳系RTS 100大腸菌HY
キットの使用説明書に従って、混合物50μlにおいて30
℃および650rpmで4時間インキュベートした。2回目のPC
R反応からの産物5μlおよび10μlアリコートを発現に用
いた。それぞれの発現混合物2μlを、サンプルバッファ
ー(Novex)と混合し、95℃まで5分間加熱し、氷上で冷却
し、1 x MESバッファーを含む4〜12％のNuPAGEゲル(Nov
ex)上で200Vで分離した。タンパク質をニトロセルロー
スメンブレン(Protan, Schleicher & Schuell)上に30V
で30分間エレクトロブロッテイングすることによって転
写した。該メンブレンを1倍濃度TBS-Tバッファーに溶解
した3％のBSA溶液で1時間ブロッキングし、1倍濃度TBS-
Tバッファーで洗浄し、MAB抗Epo-POD結合抗体(Roche社)
を含む1倍濃度TBS-Tとともに1時間インキュベートし
た。1倍濃度TBS-Tを用いて3回洗浄した後、タンパク質
を製造業者の使用説明書に従い、Lumi Light plusウエ
スタンブロッティング基質(Roche社)によって検出し
た。
【００５８】最初の構築物pcDNA Epoは、2種のタグのい
ずれもコードせず、また真核生物発現プラスミドであっ
たので原核生物in vitro系で発現することができなかっ
た。従って、このことにより、プロテアーゼ認識配列
(この場合、第Xa因子プロテアーゼに対する配列)を含む
StrepタグおよびHisタグならびに発現に必要とされる調
節エレメントを、オーバーラップ伸長PCRによって導入
することができ、またEpoをうまく発現させることがで
きることが示された。
ずれもコードせず、また真核生物発現プラスミドであっ
たので原核生物in vitro系で発現することができなかっ
た。従って、このことにより、プロテアーゼ認識配列
(この場合、第Xa因子プロテアーゼに対する配列)を含む
StrepタグおよびHisタグならびに発現に必要とされる調
節エレメントを、オーバーラップ伸長PCRによって導入
することができ、またEpoをうまく発現させることがで
きることが示された。
【００５９】
【発明の効果】本発明により、複雑なクローニングステ
ップが回避される。さらに本発明により作製された線状
DNA断片は、エキソヌクレアーゼからの保護が増大し、
かつそのmRNAの安定性が向上する。結果として、該線状
DNA断片により、無細胞in vitro転写/翻訳系において高
いタンパク質収量が可能となる。
ップが回避される。さらに本発明により作製された線状
DNA断片は、エキソヌクレアーゼからの保護が増大し、
かつそのmRNAの安定性が向上する。結果として、該線状
DNA断片により、無細胞in vitro転写/翻訳系において高
いタンパク質収量が可能となる。
【００６０】
【００６１】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Roche Diagnostics GmbH
<120> Method for producing linear DNA fragments for the in vitro expres
sion of proteins
<130> 5711/00/
<160> 16
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Primer
<400> 1
agaaggagat ataccatgac tagcaaagga 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> Primer
<400> 2
attcgccttt tattaatgat gatgatgatg 30
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> Primer
<400> 3
gaaattaata cgactcacta tagggagacc acaacggttt c 41
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> Primer
<400> 4
caaaaaaccc ctcaagaccc gtttagaggc cccaagg 37
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> Primer
<400> 5
actttaagaa ggagatatac catgactagc aaagga 36
<210> 6
<211> 41
<212> DNA
<213> Primer
<400> 6
gcgggtggct ccaagcgctc ccgggtttgt atagttcatc c 41
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> Primer
<400> 7
cgatcccgcg aaattaatac gactcactat ag 32
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> Primer
<400> 8
ctcctttcag caaaaaaccc ctcaagaccc g 31
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> Primer
<400> 9
gtagaggatc gagatctcga tcccgcg 27
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> Primer
<400> 10
gatatccgga tatagttcct cctttcagc 29
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> Primer
<400> 11
gatgccggcc acgatgcgtc cggcgtagag g 31
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Primer
<400> 12
ggcgaccaca cccgtcctgt ggatatccgg 30
<210> 13
<211> 54
<212> DNA
<213> Primer
<400> 13
ggccgcttaa ttaaacatat gaccatcgaa ggccgcgccc caccacgcct catc 54
<210> 14
<211> 44
<212> DNA
<213> Primer
<400> 14
cggatcttac cggatcccgg gttatcatct gtcccctgtc ctgc 44
<210> 15
<211> 41
<212> DNA
<213> Primer
<400> 15
gaaattaata cgactcacta tagggagacc acaacggttt c 41
<210> 16
<211> 37
<212> DNA
<213> Primer
<400> 16
caaaaaaccc ctcaagaccc gtttagaggc cccaagg 37
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 ベルンド ブックベルガー
ドイツ連邦共和国 82380 パイッセンベ
ルク，フェンター シュトラーセ ６
(72)発明者 マンフレッド ヴァッツェル
ドイツ連邦共和国 82362 ヴァイルハイ
ム，リンクシュトラーセ ２
(72)発明者 ウォルフガンク マッター
ドイツ連邦共和国 82347 ベルンリード,
アム ノイランド １
(72)発明者 アルベルト レーダー
ドイツ連邦共和国 82541 ミュエンジン
ク，ネールドリッヒェ ゼーシュトラーセ
12
(72)発明者 ステファニー ヴェスナー
ドイツ連邦共和国 82467 ガーミッシュ
−パルテンキルヒェン，フエルステンシュ
トラーセ 18
Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA21 CA04 CA05 EA04
FA02 FA07 HA01
4B064 AG01 CA21 CC24 DA16
Claims (25)
- 【請求項１】 タンパク質のin vitro発現用の線状DNA
断片の作製方法であって、発現ベクターを線状化するこ
とによって得られる制御エレメントを含む線状DNA断片
を、該線状DNA断片の両末端に相補的な領域を両末端に
有するタンパク質コード遺伝子と共に、該線状DNA断片
上の発現制御領域の上流および下流に結合するプライマ
ー対を用いて増幅することを特徴とする、前記作製方
法。 - 【請求項２】 前記線状DNA断片の両末端に相補的な領
域を両末端に有するタンパク質コード遺伝子がPCR反応
により得られ、該PCR反応において該タンパク質コード
遺伝子は該線状DNA断片とオーバーラップする領域を5'
末端に有する遺伝子特異的プライマーを用いて増幅さ
れ、このようにして増幅された遺伝子は該プライマーの
オーバーラップする領域により伸長される、請求項１に
記載の方法。 - 【請求項３】 遺伝子特異的プライマーが、その5'末端
に少なくとも5個の付加的ヌクレオチドを有し、これら
のヌクレオチドが線状DNA断片の上部鎖または下部鎖の
3'末端に同一である、請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 タンパク質コード遺伝子を伸長するステ
ップおよびこの遺伝子と制御エレメントを含む線状DNA
断片との接合増幅を行うステップが共通の反応で実施さ
れる、請求項２または３に記載の方法。 - 【請求項５】 タンパク質コード遺伝子を伸長するステ
ップおよびこの遺伝子と制御エレメントを含む線状DNA
断片との接合増幅を行うステップが連続的な反応で実施
される、請求項２または３に記載の方法。 - 【請求項６】 線状化ベクターが制御エレメントとして
プロモーターおよびターミネーター領域を含む、請求項
１〜５のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】 線状ベクターがT7プロモーター、リボソ
ーム結合部位およびT7ターミネーターを含み、in vitro
発現が大腸菌由来の溶解物を用いて実施される、請求項
１〜６のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項８】 線状化ベクターがC末端もしくはN末端Hi
sタグまたは融合タンパク質配列を含む、請求項１〜７
のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項９】 タンパク質のin vitro発現用の線状DNA
断片を作製するためのキットであって、1または複数の
容器に、 発現ベクターを線状化することによって得られる制御エ
レメントを含む線状DNA断片、および線状DNA断片上の発
現制御領域の上流もしくは下流にまたは直接的に該制御
領域の5'末端に結合する外部プライマー、が収容されて
いることを特徴とする、前記キット。 - 【請求項１０】 線状DNA断片の両末端とオーバーラッ
プする領域を5'末端に有する遺伝子特異的プライマーを
含む、請求項９に記載のキット。 - 【請求項１１】 ポリメラーゼおよびバッファーを含
む、請求項９または１０に記載のキット。 - 【請求項１２】 線状DNA断片がT7プロモーター、リボ
ソーム結合部位およびT7ターミネーターを含む、請求項
９〜１１のいずれか１項に記載のキット。 - 【請求項１３】 線状DNA断片がC末端もしくはN末端タ
グ配列または融合タンパク質配列を含む、請求項９〜１
２のいずれか１項に記載のキット。 - 【請求項１４】 タンパク質のin vitro発現用の線状DN
A断片を作製するための請求項９〜１３のいずれか１項
に記載のキットの使用。 - 【請求項１５】 PCR断片がタンパク質コード遺伝子お
よび制御エレメントを含む、請求項１〜８のいずれか１
項に記載の方法によって得ることができる線状DNA断
片。 - 【請求項１６】 DNA断片がT7プロモーター、リボソー
ム結合部位およびT7ターミネーターを含む、請求項１５
に記載の線状DNA断片。 - 【請求項１７】 DNA断片がC末端もしくはN末端タグ配
列または融合タンパク質配列を含む、請求項１５または
１６に記載の線状DNA断片。 - 【請求項１８】 無細胞発現系においてタンパク質をin
vitroで発現させるための、請求項１５〜１７のいずれ
か１項に記載の線状DNA断片の使用。 - 【請求項１９】 細菌株または真核細胞由来の溶解物を
用いてタンパク質をin vitroで発現させるための、請求
項１５〜１７のいずれか１項に記載の線状DNA断片の使
用。 - 【請求項２０】 以下のステップ：請求項１〜８のいず
れか１項に記載の方法による線状DNA断片の作製、 in vitro転写および翻訳、を含むタンパク質の発現方
法。 - 【請求項２１】 タンパク質のin vitro発現が無細胞発
現系で実施される、請求項２０に記載の方法。 - 【請求項２２】 タンパク質のin vitro発現が細菌株ま
たは真核細胞由来の溶解物を用いて実施される、請求項
２０または２１に記載の方法。 - 【請求項２３】 タンパク質のin vitro発現が大腸菌由
来の溶解物を用いて実施される、請求項２０〜２２のい
ずれか１項に記載の方法。 - 【請求項２４】 タンパク質コード遺伝子が遺伝子バン
クまたはRNA画分からPCRまたはRT-PCRによって直接的に
増幅される、請求項２０〜２３のいずれか１項にタンパ
ク質の発現方法。 - 【請求項２５】 タンパク質がCFCFまたはCECF反応器中
で発現される、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載
の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10158904.2 | 2001-11-30 | ||
| DE10158904A DE10158904A1 (de) | 2001-11-30 | 2001-11-30 | Verfahren zur Herstellung von linearen DNA Fragmenten für die in vitro Expression von Proteinen |
| US10/314,007 US20040110135A1 (en) | 2001-11-30 | 2002-12-06 | Method for producing linear DNA fragments for the in vitro expression of proteins |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003189890A true JP2003189890A (ja) | 2003-07-08 |
Family
ID=32963502
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002348959A Pending JP2003189890A (ja) | 2001-11-30 | 2002-11-29 | タンパク質のｉｎｖｉｔｒｏ発現用の線状ＤＮＡ断片の作製方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20040110135A1 (ja) |
| EP (1) | EP1316616B1 (ja) |
| JP (1) | JP2003189890A (ja) |
| DE (1) | DE10158904A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012147370A1 (ja) | 2011-04-28 | 2012-11-01 | 国立大学法人山口大学 | ターミネータ配列を含む高発現用リバースプライマー及びリニアｄｎａ |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE60045879D1 (de) * | 1999-08-25 | 2011-06-01 | Ambergen Inc | Methoden zur Detektion, Analyse und Isolation von entstehenden Proteinen |
| JP4768155B2 (ja) | 2001-07-02 | 2011-09-07 | 独立行政法人理化学研究所 | 鋳型ｄｎａの製造方法及びそれを用いた無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の製造方法 |
| JP4441170B2 (ja) | 2002-11-28 | 2010-03-31 | 独立行政法人理化学研究所 | Ｓ１２リボソームタンパク質に変異を有する大腸菌細胞抽出液及びそれを用いる無細胞系によるタンパク質の製造方法 |
| JP4868731B2 (ja) | 2004-11-17 | 2012-02-01 | 独立行政法人理化学研究所 | 哺乳動物培養細胞由来の無細胞タンパク質合成システム |
| JP4787488B2 (ja) | 2004-11-19 | 2011-10-05 | 独立行政法人理化学研究所 | 直鎖状鋳型ｄｎａを用いた無細胞タンパク質合成方法及びそのための細胞抽出液 |
| US20070117179A1 (en) * | 2005-09-27 | 2007-05-24 | Invitrogen Corporation | In vitro protein synthesis systems for membrane proteins that include adolipoproteins and phospholipid-adolipoprotein particles |
| EP2118129A4 (en) * | 2007-03-01 | 2010-04-28 | Life Technologies Corp | ISOLATED PHOSPHOLIPID PROTEIN PARTICLES |
| EP2188386A2 (en) * | 2007-09-17 | 2010-05-26 | Universite De Strasbourg | Method for detecting or quantifying a truncating mutation |
| EP2213747B1 (en) | 2007-11-05 | 2021-06-30 | Riken | Method for producing membrane protein |
| WO2017022696A1 (ja) | 2015-07-31 | 2017-02-09 | 国立研究開発法人理化学研究所 | 膜タンパク質の製造方法およびその利用 |
| CN109370999A (zh) * | 2018-11-23 | 2019-02-22 | 浙江善测禾骑士生物科技有限公司 | 一种Klenow（exo-）突变蛋白的表达纯化方法 |
| AU2020329166A1 (en) | 2019-08-09 | 2022-03-03 | Nutcracker Therapeutics, Inc. | Microfluidic apparatus and methods of use thereof |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5571690A (en) * | 1991-05-08 | 1996-11-05 | The University Of Virginia Patents Foundation | Method for the cell-free synthesis of proteins |
| KR100561788B1 (ko) * | 1996-03-12 | 2006-09-20 | 피지-티엑스엘 컴파니,엘.피. | 수용성파클리탁셀전구약물을포함하는조성물및이러한조성물을포함하는이식가능한의료장치 |
| WO1998011249A1 (en) * | 1996-09-13 | 1998-03-19 | Garvin Alex M | Mutation detection using peptide tagged in vitro synthesized proteins |
| US6207378B1 (en) * | 1997-08-19 | 2001-03-27 | Nippon Flour Mills Co., Ltd. | Method for amplifying nucleic acid molecules and method for synthesizing proteins |
| EP1064360B1 (en) * | 1998-03-27 | 2008-03-05 | Prolume, Ltd. | Luciferases, gfp fluorescent proteins, their nucleic acids and the use thereof in diagnostics |
| FR2786788B1 (fr) * | 1998-12-08 | 2002-04-19 | Proteus | Procede de criblage de substances capables de modifier l'activite d'une ou plusieurs proteines cibles ou d'un ensemble cible de proteines exprimees in vitro |
| AU4032300A (en) * | 1999-03-24 | 2000-10-09 | Gene Therapy Systems, Inc. | Method for generating transcriptionally active dna fragments |
-
2001
- 2001-11-30 DE DE10158904A patent/DE10158904A1/de not_active Withdrawn
-
2002
- 2002-11-26 EP EP02026225.9A patent/EP1316616B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-29 JP JP2002348959A patent/JP2003189890A/ja active Pending
- 2002-12-06 US US10/314,007 patent/US20040110135A1/en not_active Abandoned
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012147370A1 (ja) | 2011-04-28 | 2012-11-01 | 国立大学法人山口大学 | ターミネータ配列を含む高発現用リバースプライマー及びリニアｄｎａ |
| US9796973B2 (en) | 2011-04-28 | 2017-10-24 | Yamaguchi University | Terminator sequence-containing reverse primer for overexpression and linear DNA |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1316616A1 (en) | 2003-06-04 |
| US20040110135A1 (en) | 2004-06-10 |
| EP1316616B1 (en) | 2015-01-28 |
| DE10158904A1 (de) | 2003-06-12 |
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