JP2003189870A - 病原微生物又は毒素の検出セット - Google Patents
病原微生物又は毒素の検出セットInfo
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- JP2003189870A JP2003189870A JP2001397191A JP2001397191A JP2003189870A JP 2003189870 A JP2003189870 A JP 2003189870A JP 2001397191 A JP2001397191 A JP 2001397191A JP 2001397191 A JP2001397191 A JP 2001397191A JP 2003189870 A JP2003189870 A JP 2003189870A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】環境中の汚泥や生物学的試料等から、より多く
の病原微生物又は生物由来毒素を同一の条件下で簡易且
つ迅速に検出可能なプライマー及びプローブのセットを
提供すること。 【解決手段】 １８種類の病原微生物と５種類の生物由
来の毒素について、同一の反応条件下で害遺伝子の増幅
と検出が可能な特定配列で示されるプライマーとプロー
ブの組み合わせを見出すことに成功し、斯かるプライマ
ーとプローブのセットを用いることにより複数の病原性
遺伝子を迅速に検出することが出来た。
の病原微生物又は生物由来毒素を同一の条件下で簡易且
つ迅速に検出可能なプライマー及びプローブのセットを
提供すること。 【解決手段】 １８種類の病原微生物と５種類の生物由
来の毒素について、同一の反応条件下で害遺伝子の増幅
と検出が可能な特定配列で示されるプライマーとプロー
ブの組み合わせを見出すことに成功し、斯かるプライマ
ーとプローブのセットを用いることにより複数の病原性
遺伝子を迅速に検出することが出来た。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、病原微生物又は生
物由来毒素の検出に用いるプローブ及びプライマーセッ
ト及びこれを用いた病原微生物又は生物由来毒素の検出
方法に関する。
物由来毒素の検出に用いるプローブ及びプライマーセッ
ト及びこれを用いた病原微生物又は生物由来毒素の検出
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】病原微生物や生物由来毒素は、人体に重
大な影響を及ぼし、時として重篤な病態を招くことにも
なる。特に最近では、これらが人為的に製造され犯罪に
利用されるケースもあり、このような場合には多大な被
害が引き起こされると考えられる。従って、病原微生物
や毒素の存在を迅速且つ正確に検出して、汚染の拡大を
未然に防止すると共に、早期に適切な治療を受けられる
ようにすることが重要である。
大な影響を及ぼし、時として重篤な病態を招くことにも
なる。特に最近では、これらが人為的に製造され犯罪に
利用されるケースもあり、このような場合には多大な被
害が引き起こされると考えられる。従って、病原微生物
や毒素の存在を迅速且つ正確に検出して、汚染の拡大を
未然に防止すると共に、早期に適切な治療を受けられる
ようにすることが重要である。
【０００３】一方、従来から、環境中の汚泥や生物学的
試料から目的の遺伝子を検出する方法として、ポリメラ
ーゼチェインリアクション（polymerase chain reactio
n：以下「ＰＣＲ」という）法等の核酸増幅法により予
め目的核酸部分を増幅した後（欧州特許第０２００３６
２号明細書、欧州特許第０２０１１８４号明細書）、核
酸プローブ等を用いて対象の微生物遺伝子を検出する遺
伝子検査法が用いられている。
試料から目的の遺伝子を検出する方法として、ポリメラ
ーゼチェインリアクション（polymerase chain reactio
n：以下「ＰＣＲ」という）法等の核酸増幅法により予
め目的核酸部分を増幅した後（欧州特許第０２００３６
２号明細書、欧州特許第０２０１１８４号明細書）、核
酸プローブ等を用いて対象の微生物遺伝子を検出する遺
伝子検査法が用いられている。
【０００４】病原微生物や生物由来毒素の遺伝子につい
ても、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅手法を利用した検出法が
これまでに幾つか報告されているが（G.Brightwel（Mol
ecula and CellularProbes,(1998)12,367-377）、Hirok
o Tsukano（Microbiol.Immunol.,(1996)40(10),773-77
5）、Conchi Romero（Journal of Clinical Microbiolo
gy,(1995)Mar.,615-617)）、いずれも検査対象毎に、個
々のＰＣＲ反応条件で遺伝子の増幅を行い、個々の条件
でハイブリダーゼーションを行うことにより当該遺伝子
を検出するものであった。
ても、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅手法を利用した検出法が
これまでに幾つか報告されているが（G.Brightwel（Mol
ecula and CellularProbes,(1998)12,367-377）、Hirok
o Tsukano（Microbiol.Immunol.,(1996)40(10),773-77
5）、Conchi Romero（Journal of Clinical Microbiolo
gy,(1995)Mar.,615-617)）、いずれも検査対象毎に、個
々のＰＣＲ反応条件で遺伝子の増幅を行い、個々の条件
でハイブリダーゼーションを行うことにより当該遺伝子
を検出するものであった。
【０００５】しかしながら、犯罪に使用される可能性の
ある病原微生物や生物由来毒素は多岐に渡っており、可
能性のある病原微生物や生物由来毒素に対し、ターゲッ
ト毎にその都度反応条件を変えて検出することは検出時
間の大幅な増大に繋がり、汚染の拡大防止、犯罪の迅速
な解決等を図る上で大きな問題であった。
ある病原微生物や生物由来毒素は多岐に渡っており、可
能性のある病原微生物や生物由来毒素に対し、ターゲッ
ト毎にその都度反応条件を変えて検出することは検出時
間の大幅な増大に繋がり、汚染の拡大防止、犯罪の迅速
な解決等を図る上で大きな問題であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、環境中の汚
泥や生物学的試料等からより多くの病原微生物又は生物
由来毒素を、同一の条件下で簡易迅速に検出可能なプラ
イマー及びプローブのセットを提供することを目的とす
る。
泥や生物学的試料等からより多くの病原微生物又は生物
由来毒素を、同一の条件下で簡易迅速に検出可能なプラ
イマー及びプローブのセットを提供することを目的とす
る。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、斯かる実
情の下、人体に重大な影響を及ぼす病原微生物の遺伝子
又は生物由来の毒素遺伝子を特異的に検出可能なプライ
マー及びプローブについて鋭意検討した結果、１８種類
の病原微生物と５種類の生物由来毒素について、同一の
反応条件下で該遺伝子の増幅・検出が可能なプライマー
及びプローブの組み合わせを見出すことに成功し、斯か
るプライマー及びプローブセットを用いることにより、
複数の病原性遺伝子を簡単且つ迅速に検出できることを
見出し、本発明を完成した。
情の下、人体に重大な影響を及ぼす病原微生物の遺伝子
又は生物由来の毒素遺伝子を特異的に検出可能なプライ
マー及びプローブについて鋭意検討した結果、１８種類
の病原微生物と５種類の生物由来毒素について、同一の
反応条件下で該遺伝子の増幅・検出が可能なプライマー
及びプローブの組み合わせを見出すことに成功し、斯か
るプライマー及びプローブセットを用いることにより、
複数の病原性遺伝子を簡単且つ迅速に検出できることを
見出し、本発明を完成した。
【０００８】すなわち本発明は、病原微生物又は生物由
来毒素を検出するためのプライマー及びプローブからな
るセットであって、下記の（１）〜（３０）よりなる群
から選ばれる１又は２以上の検出セット：（１）配列番
号１で示されるプライマー、配列番号２で示されるプラ
イマー及び配列番号３で示されるプローブからなるセッ
ト、（２）配列番号４で示されるプライマー、配列番号
５で示されるプライマー及び配列番号６で示されるプロ
ーブからなるセット、（３）配列番号７で示されるプラ
イマー、配列番号８で示されるプライマー及び配列番号
９で示されるプローブからなるセット、（４）配列番号
１０で示されるプライマー、配列番号１１で示されるプ
ライマー及び配列番号１２で示されるプローブからなる
セット、（５）配列番号１３で示されるプライマー、配
列番号１４で示されるプライマー及び配列番号１５で示
されるプローブからなるセット、（６）配列番号１６で
示されるプライマー、配列番号１７で示されるプライマ
ー及び配列番号１８で示されるプローブからなるセッ
ト、（７）配列番号１９で示されるプライマー、配列番
号２０で示されるプライマー及び配列番号２１で示され
るプローブからなるセット、（８）配列番号２２で示さ
れるプライマー、配列番号２３で示されるプライマー及
び配列番号２４で示されるプローブからなるセット、
（９）配列番号２５で示されるプライマー、配列番号２
６で示されるプライマー及び配列番号２７で示されるプ
ローブからなるセット、（１０）配列番号２８で示され
るプライマー、配列番号２９で示されるプライマー及び
配列番号３０で示されるプローブからなるセット、（１
１）配列番号３１で示されるプライマー、配列番号３２
で示されるプライマー及び配列番号３３で示されるプロ
ーブからなるセット、（１２）配列番号３４で示される
プライマー、配列番号３５で示されるプライマー及び配
列番号３６で示されるプローブからなるセット、（１
３）配列番号３７で示されるプライマー、配列番号３８
で示されるプライマー及び配列番号３９で示されるプロ
ーブからなるセット、（１４）配列番号４０で示される
プライマー、配列番号４１で示されるプライマー及び配
列番号４２で示されるプローブからなるセット、（１
５）配列番号４３で示されるプライマー、配列番号４４
で示されるプライマー及び配列番号４５で示されるプロ
ーブからなるセット、（１６）配列番号４６で示される
プライマー、配列番号４７で示されるプライマー及び配
列番号４８で示されるプローブからなるセット、（１
７）配列番号４９で示されるプライマー、配列番号５０
で示されるプライマー及び配列番号５１で示されるプロ
ーブからなるセット、（１８）配列番号５２で示される
プライマー、配列番号５３で示されるプライマー及び配
列番号５４で示されるプローブからなるセット、（１
９）配列番号５５で示されるプライマー、配列番号５６
で示されるプライマー及び配列番号５７で示されるプロ
ーブからなるセット、（２０）配列番号５８で示される
プライマー、配列番号５９で示されるプライマー及び配
列番号６０で示されるプローブからなるセット、（２
１）配列番号６１で示されるプライマー、配列番号６２
で示されるプライマー及び配列番号６３で示されるプロ
ーブからなるセット、（２２）配列番号６４で示される
プライマー、配列番号６５で示されるプライマー及び配
列番号６６で示されるプローブからなるセット、（２
３）配列番号６７で示されるプライマー、配列番号６８
で示されるプライマー及び配列番号６９で示されるプロ
ーブからなるセット、（２４）配列番号７０で示される
プライマー、配列番号７１で示されるプライマー及び配
列番号７２で示されるプローブからなるセット、（２
５）配列番号７３で示されるプライマー、配列番号７４
で示されるプライマー及び配列番号７５で示されるプロ
ーブからなるセット、（２６）配列番号７６で示される
プライマー、配列番号７７で示されるプライマー及び配
列番号７８で示されるプローブからなるセット、（２
７）配列番号７９で示されるプライマー、配列番号８０
で示されるプライマー及び配列番号８１で示されるプロ
ーブからなるセット、（２８）配列番号８２で示される
プライマー、配列番号８３で示されるプライマー及び配
列番号８４で示されるプローブからなるセット、（２
９）配列番号８５で示されるプライマー、配列番号８６
で示されるプライマー及び配列番号８７で示されるプロ
ーブからなるセット、（３０）配列番号８８で示される
プライマー、配列番号８９で示されるプライマー及び配
列番号９０で示されるプローブからなるセット、を提供
するものである。
来毒素を検出するためのプライマー及びプローブからな
るセットであって、下記の（１）〜（３０）よりなる群
から選ばれる１又は２以上の検出セット：（１）配列番
号１で示されるプライマー、配列番号２で示されるプラ
イマー及び配列番号３で示されるプローブからなるセッ
ト、（２）配列番号４で示されるプライマー、配列番号
５で示されるプライマー及び配列番号６で示されるプロ
ーブからなるセット、（３）配列番号７で示されるプラ
イマー、配列番号８で示されるプライマー及び配列番号
９で示されるプローブからなるセット、（４）配列番号
１０で示されるプライマー、配列番号１１で示されるプ
ライマー及び配列番号１２で示されるプローブからなる
セット、（５）配列番号１３で示されるプライマー、配
列番号１４で示されるプライマー及び配列番号１５で示
されるプローブからなるセット、（６）配列番号１６で
示されるプライマー、配列番号１７で示されるプライマ
ー及び配列番号１８で示されるプローブからなるセッ
ト、（７）配列番号１９で示されるプライマー、配列番
号２０で示されるプライマー及び配列番号２１で示され
るプローブからなるセット、（８）配列番号２２で示さ
れるプライマー、配列番号２３で示されるプライマー及
び配列番号２４で示されるプローブからなるセット、
（９）配列番号２５で示されるプライマー、配列番号２
６で示されるプライマー及び配列番号２７で示されるプ
ローブからなるセット、（１０）配列番号２８で示され
るプライマー、配列番号２９で示されるプライマー及び
配列番号３０で示されるプローブからなるセット、（１
１）配列番号３１で示されるプライマー、配列番号３２
で示されるプライマー及び配列番号３３で示されるプロ
ーブからなるセット、（１２）配列番号３４で示される
プライマー、配列番号３５で示されるプライマー及び配
列番号３６で示されるプローブからなるセット、（１
３）配列番号３７で示されるプライマー、配列番号３８
で示されるプライマー及び配列番号３９で示されるプロ
ーブからなるセット、（１４）配列番号４０で示される
プライマー、配列番号４１で示されるプライマー及び配
列番号４２で示されるプローブからなるセット、（１
５）配列番号４３で示されるプライマー、配列番号４４
で示されるプライマー及び配列番号４５で示されるプロ
ーブからなるセット、（１６）配列番号４６で示される
プライマー、配列番号４７で示されるプライマー及び配
列番号４８で示されるプローブからなるセット、（１
７）配列番号４９で示されるプライマー、配列番号５０
で示されるプライマー及び配列番号５１で示されるプロ
ーブからなるセット、（１８）配列番号５２で示される
プライマー、配列番号５３で示されるプライマー及び配
列番号５４で示されるプローブからなるセット、（１
９）配列番号５５で示されるプライマー、配列番号５６
で示されるプライマー及び配列番号５７で示されるプロ
ーブからなるセット、（２０）配列番号５８で示される
プライマー、配列番号５９で示されるプライマー及び配
列番号６０で示されるプローブからなるセット、（２
１）配列番号６１で示されるプライマー、配列番号６２
で示されるプライマー及び配列番号６３で示されるプロ
ーブからなるセット、（２２）配列番号６４で示される
プライマー、配列番号６５で示されるプライマー及び配
列番号６６で示されるプローブからなるセット、（２
３）配列番号６７で示されるプライマー、配列番号６８
で示されるプライマー及び配列番号６９で示されるプロ
ーブからなるセット、（２４）配列番号７０で示される
プライマー、配列番号７１で示されるプライマー及び配
列番号７２で示されるプローブからなるセット、（２
５）配列番号７３で示されるプライマー、配列番号７４
で示されるプライマー及び配列番号７５で示されるプロ
ーブからなるセット、（２６）配列番号７６で示される
プライマー、配列番号７７で示されるプライマー及び配
列番号７８で示されるプローブからなるセット、（２
７）配列番号７９で示されるプライマー、配列番号８０
で示されるプライマー及び配列番号８１で示されるプロ
ーブからなるセット、（２８）配列番号８２で示される
プライマー、配列番号８３で示されるプライマー及び配
列番号８４で示されるプローブからなるセット、（２
９）配列番号８５で示されるプライマー、配列番号８６
で示されるプライマー及び配列番号８７で示されるプロ
ーブからなるセット、（３０）配列番号８８で示される
プライマー、配列番号８９で示されるプライマー及び配
列番号９０で示されるプローブからなるセット、を提供
するものである。
【０００９】また本発明は、当該検出セットから選ばれ
る２種以上を用いることにより、複数の病原微生物又は
生物由来毒素を同一の条件で検出する方法を提供するも
のである。
る２種以上を用いることにより、複数の病原微生物又は
生物由来毒素を同一の条件で検出する方法を提供するも
のである。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明の検出セットは、上記
（１）〜（３０）のプライマー及びプローブのセットよ
りなる群から選ばれるものであり、これにより検出可能
な病原微生物及び毒素は、（ａ）バクテリア：Bacillus
anthracis、Brucella melitensis、Brucella suis、Bu
rkholderia mallei、Burkholderia pseudomallei、Fran
cisella tularensis tularensis、Yersinia pestis、
（ｂ）ウイルス：Sin Nombre virus、Rift Valley viru
s、Tick-borne encephalitis virus、Venezuelan equin
e encephalitis virus、Western equine encephalitis
virus、Eastern equine encephalitis virus、（ｃ）リ
ケッチア：Coxiella burnetii、Rickettsia prowazeki
i、Rickettsia rickettsii、（ｄ）アメーバ：Naegleri
a fowleri、Naegleria au straliensis、（ｅ）生物由来
毒素：Botulinum toxins (Clostridium botulinum) 、C
lostridium perfringens toxins、Staphylococcal ente
rotoxins (Staphylococcus aureus) 、Ricin、Shigatox
in (Shigella dysenteriae)である。
（１）〜（３０）のプライマー及びプローブのセットよ
りなる群から選ばれるものであり、これにより検出可能
な病原微生物及び毒素は、（ａ）バクテリア：Bacillus
anthracis、Brucella melitensis、Brucella suis、Bu
rkholderia mallei、Burkholderia pseudomallei、Fran
cisella tularensis tularensis、Yersinia pestis、
（ｂ）ウイルス：Sin Nombre virus、Rift Valley viru
s、Tick-borne encephalitis virus、Venezuelan equin
e encephalitis virus、Western equine encephalitis
virus、Eastern equine encephalitis virus、（ｃ）リ
ケッチア：Coxiella burnetii、Rickettsia prowazeki
i、Rickettsia rickettsii、（ｄ）アメーバ：Naegleri
a fowleri、Naegleria au straliensis、（ｅ）生物由来
毒素：Botulinum toxins (Clostridium botulinum) 、C
lostridium perfringens toxins、Staphylococcal ente
rotoxins (Staphylococcus aureus) 、Ricin、Shigatox
in (Shigella dysenteriae)である。
【００１１】具体的には、セット（１）によりBacillus
anthracis遺伝子、セット（２）によりBrucella melit
ensis遺伝子、セット（３）によりBrucella suis遺伝
子、セット（４）によりBurkholderia mallei遺伝子、
セット（５）によりFrancisellatularensis遺伝子、セ
ット（６）によりYersinia pestis遺伝子、セット
（７）によりRift Valley Fever Virus遺伝子、セット
（８）によりCoxiella burnetii遺伝子、セット（９）
によりRickettsia prowazekii遺伝子、セット（１０）
によりRickettsia rickettsii遺伝子、セット（１１）
によりNaegleria fowleri遺伝子、セット（１２）によ
りBotulinum neurotoxin type A遺伝子、セット（１
３）によりBotulinum neurotoxin type B遺伝子、セッ
ト（１４）によりBotulinum neurotoxin type E遺伝
子、セット（１５）によりBotulinum neurotoxin type
F遺伝子、セット（１６）によりClostridium perfringe
ns α-toxin遺伝子、セット（１７）によりClostridium
perfringens β-toxin遺伝子、セット（１８）によりS
taphylococcal enterotoxin A遺伝子、セット（１９）
によりStaphylococcal enterotoxin B遺伝子、セット
（２０）によりStaphylococcal enterotoxin C遺伝子、
セット（２１）によりStaphylococcal enterotoxin D遺
伝子、セット（２２）によりStaphylococcal enterotox
in E遺伝子、セット（２３）によりShigatoxin遺伝子、
セット（２４）によりRicinus toxin遺伝子、セット
（２５）によりSin Nombre virus遺伝子、セット（２
６）によりTick-borne encephalitis virus遺伝子、セ
ット（２７）によりVenezuelan equine encephalitis v
irus遺伝子、セット（２８）によりWestern equine enc
ephalitis virus遺伝子、セット（２９）によりEastern
equine encephalitis virus遺伝子、セット（３０）に
よりNaegleria australiensis遺伝子、及びこれらの遺
伝子に人為的な操作或いは突然変異等により遺伝子組み
替えが生じた変異遺伝子を検出することができる。
anthracis遺伝子、セット（２）によりBrucella melit
ensis遺伝子、セット（３）によりBrucella suis遺伝
子、セット（４）によりBurkholderia mallei遺伝子、
セット（５）によりFrancisellatularensis遺伝子、セ
ット（６）によりYersinia pestis遺伝子、セット
（７）によりRift Valley Fever Virus遺伝子、セット
（８）によりCoxiella burnetii遺伝子、セット（９）
によりRickettsia prowazekii遺伝子、セット（１０）
によりRickettsia rickettsii遺伝子、セット（１１）
によりNaegleria fowleri遺伝子、セット（１２）によ
りBotulinum neurotoxin type A遺伝子、セット（１
３）によりBotulinum neurotoxin type B遺伝子、セッ
ト（１４）によりBotulinum neurotoxin type E遺伝
子、セット（１５）によりBotulinum neurotoxin type
F遺伝子、セット（１６）によりClostridium perfringe
ns α-toxin遺伝子、セット（１７）によりClostridium
perfringens β-toxin遺伝子、セット（１８）によりS
taphylococcal enterotoxin A遺伝子、セット（１９）
によりStaphylococcal enterotoxin B遺伝子、セット
（２０）によりStaphylococcal enterotoxin C遺伝子、
セット（２１）によりStaphylococcal enterotoxin D遺
伝子、セット（２２）によりStaphylococcal enterotox
in E遺伝子、セット（２３）によりShigatoxin遺伝子、
セット（２４）によりRicinus toxin遺伝子、セット
（２５）によりSin Nombre virus遺伝子、セット（２
６）によりTick-borne encephalitis virus遺伝子、セ
ット（２７）によりVenezuelan equine encephalitis v
irus遺伝子、セット（２８）によりWestern equine enc
ephalitis virus遺伝子、セット（２９）によりEastern
equine encephalitis virus遺伝子、セット（３０）に
よりNaegleria australiensis遺伝子、及びこれらの遺
伝子に人為的な操作或いは突然変異等により遺伝子組み
替えが生じた変異遺伝子を検出することができる。
【００１２】本発明の（１）〜（３０）の検出セットに
おけるプライマー及びプローブは、以下の方法により選
定できる。 １）対象となる遺伝子の塩基配列情報を、既知の論文報
告G.Brightwel（Molecula and CellularProbes,(1998)1
2,367-377）、Hiroko Tsukano（Microbiol.Immunol.,(1
996)40(10),773-775）、Conchi Romero（Journal of Cl
inical Microbiology,(1995)Mar.,615-617)などを参考
にして、GenomeNetに登録されている遺伝子配列情報の
中から、それぞれの病原微生物遺伝子又は生物由来の毒
素遺伝子ごとに検索して、それぞれの目的とする遺伝子
配列情報を収集する。
おけるプライマー及びプローブは、以下の方法により選
定できる。 １）対象となる遺伝子の塩基配列情報を、既知の論文報
告G.Brightwel（Molecula and CellularProbes,(1998)1
2,367-377）、Hiroko Tsukano（Microbiol.Immunol.,(1
996)40(10),773-775）、Conchi Romero（Journal of Cl
inical Microbiology,(1995)Mar.,615-617)などを参考
にして、GenomeNetに登録されている遺伝子配列情報の
中から、それぞれの病原微生物遺伝子又は生物由来の毒
素遺伝子ごとに検索して、それぞれの目的とする遺伝子
配列情報を収集する。
【００１３】２）得られた遺伝子配列情報を基に、検出
・測定用のプローブ及びプライマーを設計するために、
遺伝子配列解析ソフト「ＤＮＡＳＩＳ」（日立ソフトエ
ンジニアリング社）を用い、それぞれの病原微生物遺伝
子又は生物由来毒素遺伝子の中で、各菌種又は各毒素遺
伝子間において、それぞれに特異的な配列を持つような
遺伝子領域であり且つその各菌種又は各毒素遺伝子間内
では保存されている特異的ないくつかの遺伝子配列領域
を選定する。
・測定用のプローブ及びプライマーを設計するために、
遺伝子配列解析ソフト「ＤＮＡＳＩＳ」（日立ソフトエ
ンジニアリング社）を用い、それぞれの病原微生物遺伝
子又は生物由来毒素遺伝子の中で、各菌種又は各毒素遺
伝子間において、それぞれに特異的な配列を持つような
遺伝子領域であり且つその各菌種又は各毒素遺伝子間内
では保存されている特異的ないくつかの遺伝子配列領域
を選定する。
【００１４】３）選定したいくつかの特異的な遺伝子配
列領域から、更に２０塩基程度の長さからなる最も高度
に保存されている領域を幾つか選定してプライマー及び
プローブを設計し、それらのプローブ及びプライマーの
組み合わせを実験、検討し、病原微生物遺伝子又は生物
由来の毒素遺伝子を同一条件下で特異的に検出可能なプ
ローブ及びプライマーを決定する。
列領域から、更に２０塩基程度の長さからなる最も高度
に保存されている領域を幾つか選定してプライマー及び
プローブを設計し、それらのプローブ及びプライマーの
組み合わせを実験、検討し、病原微生物遺伝子又は生物
由来の毒素遺伝子を同一条件下で特異的に検出可能なプ
ローブ及びプライマーを決定する。
【００１５】本発明のプローブ及びプライマーには、該
ＤＮＡを標識物で標識されたものも含まれる。標識物と
しては、例えば、ビオチン（Biotin）、アビジン（Avid
in）、ストレプトアビジン（Streptoavidin）、ディゴ
キシゲニン（Digoxigenin）等の化学物質、アルカリフ
ォスファターゼ（Alkaline phosphatase）、ルシフェラ
ーゼ（Luciferase）、ペルオキシダーゼ（Peroxidas
e）、β−ガラクトシダーゼ（β-galactosidase）等の
酵素、フルオレセイン（Fluorescine）等の蛍光物質が
挙げられる。ここで、プローブにビオチンを付加させる
には、一般公知の方法が用いられ、例えば、ターミナル
トランスフェラーゼ（Terminal transferase）存在下
で、プローブにビオチン化されたデオキシウリジン−
５′−三リン酸（deoxyuridine 5′-triphosphate）を
添加することにより得られる。ターミナルトランスフェ
ラーゼやビオチン化されたデオキシウリジン−５′−三
リン酸はキットとしてベーリンガーマンハイム(Boehrin
ger Mannheim)社から購入できる。また、ビオチン以外
の標識物を付加する場合も市販のキットを使用すること
ができ、このようなキットは宝酒造(株)や東洋紡(株)か
ら購入でき、また、“モレキュラー・クローニング”
（J.Sambrook,1989,Cold Spring Harbor Laboratory）
に記載の方法に従って標識物を付加させてもよい。
ＤＮＡを標識物で標識されたものも含まれる。標識物と
しては、例えば、ビオチン（Biotin）、アビジン（Avid
in）、ストレプトアビジン（Streptoavidin）、ディゴ
キシゲニン（Digoxigenin）等の化学物質、アルカリフ
ォスファターゼ（Alkaline phosphatase）、ルシフェラ
ーゼ（Luciferase）、ペルオキシダーゼ（Peroxidas
e）、β−ガラクトシダーゼ（β-galactosidase）等の
酵素、フルオレセイン（Fluorescine）等の蛍光物質が
挙げられる。ここで、プローブにビオチンを付加させる
には、一般公知の方法が用いられ、例えば、ターミナル
トランスフェラーゼ（Terminal transferase）存在下
で、プローブにビオチン化されたデオキシウリジン−
５′−三リン酸（deoxyuridine 5′-triphosphate）を
添加することにより得られる。ターミナルトランスフェ
ラーゼやビオチン化されたデオキシウリジン−５′−三
リン酸はキットとしてベーリンガーマンハイム(Boehrin
ger Mannheim)社から購入できる。また、ビオチン以外
の標識物を付加する場合も市販のキットを使用すること
ができ、このようなキットは宝酒造(株)や東洋紡(株)か
ら購入でき、また、“モレキュラー・クローニング”
（J.Sambrook,1989,Cold Spring Harbor Laboratory）
に記載の方法に従って標識物を付加させてもよい。
【００１６】また、標識物としては放射性同位元素を利
用することもでき、その場合は例えば、Ｔ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ（T4 polynucleotide kinase）存在下、
これに（γ−32Ｐ）ｄＡＴＰ（（γ−32Ｐ）デオキシア
デノシン−５′−三リン酸）を添加する。放射性同位元
素で標識する一般的手法は、“モレキュラー・クローニ
ング”に記載されている。Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼは東洋紡(株)から、（γ−32Ｐ）ｄＡＴＰは(株)アマ
シャムから購入できる。
用することもでき、その場合は例えば、Ｔ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ（T4 polynucleotide kinase）存在下、
これに（γ−32Ｐ）ｄＡＴＰ（（γ−32Ｐ）デオキシア
デノシン−５′−三リン酸）を添加する。放射性同位元
素で標識する一般的手法は、“モレキュラー・クローニ
ング”に記載されている。Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼは東洋紡(株)から、（γ−32Ｐ）ｄＡＴＰは(株)アマ
シャムから購入できる。
【００１７】本発明の検出セットにおけるプローブ及び
プライマーは、配列番号１〜９０で示されるＤＮＡのみ
ならず、当該塩基配列に対応するＲＮＡ、すなわち塩基
としてチミンがウラシルに置換され、糖としてデオキシ
リボースがリボースに置換された核酸もまた本発明のプ
ローブやプライマーとして使用できる。尚、斯かるプロ
ーブ及びプライマーは、市販の核酸合成装置を使用する
ことにより容易に合成することができる。
プライマーは、配列番号１〜９０で示されるＤＮＡのみ
ならず、当該塩基配列に対応するＲＮＡ、すなわち塩基
としてチミンがウラシルに置換され、糖としてデオキシ
リボースがリボースに置換された核酸もまた本発明のプ
ローブやプライマーとして使用できる。尚、斯かるプロ
ーブ及びプライマーは、市販の核酸合成装置を使用する
ことにより容易に合成することができる。
【００１８】本発明の（１）〜（３０）の検出セットを
用いた遺伝子の検出は、病原微生物遺伝子又は生物由来
毒素遺伝子を、通常の遺伝子検査に用いられるＰＣＲ等
の核酸増幅反応を用いて増幅し、生成した増幅産物を核
酸プローブとハイブリダイゼーションすることにより行
なうことができる。
用いた遺伝子の検出は、病原微生物遺伝子又は生物由来
毒素遺伝子を、通常の遺伝子検査に用いられるＰＣＲ等
の核酸増幅反応を用いて増幅し、生成した増幅産物を核
酸プローブとハイブリダイゼーションすることにより行
なうことができる。
【００１９】ここでいう核酸の増幅とは、核酸又はこれ
ら核酸の一部の領域を増幅することをいい、例えば適切
なプライマー配列を選択し、ＰＣＲを用いることによ
り、１００〜４００塩基長の一部の核酸を増幅できるこ
とが好ましい。また、増幅には、ＲＮＡからＤＮＡへの
転写も含まれる。
ら核酸の一部の領域を増幅することをいい、例えば適切
なプライマー配列を選択し、ＰＣＲを用いることによ
り、１００〜４００塩基長の一部の核酸を増幅できるこ
とが好ましい。また、増幅には、ＲＮＡからＤＮＡへの
転写も含まれる。
【００２０】増幅された核酸の検出は、既知のハイブリ
ダーゼーション法、例えば、検体中のＤＮＡを電気泳動
して分子量で分離し、そのＤＮＡをニトロセルロースフ
ィルターやナイロンメンブレン等に移して固定し、標識
化された本発明のプローブを添加し、標識を検出するサ
ザンブロット法（“モレキュラー・クローニング”）を
始め、プローブ法（DNA PROBE,George H.Keller,1993,S
tockton）等を用いればよく、或いは検出可能な標識を
導入したプライマーを用いて遺伝子増幅反応を行い、予
め膜に固定しておいた所望のプローブとハイブリダイゼ
ーション反応を行うリバースドットハイブリダイゼーシ
ョン法(Saiki,R.K.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6230-62
34,1989)を利用することでもよい。
ダーゼーション法、例えば、検体中のＤＮＡを電気泳動
して分子量で分離し、そのＤＮＡをニトロセルロースフ
ィルターやナイロンメンブレン等に移して固定し、標識
化された本発明のプローブを添加し、標識を検出するサ
ザンブロット法（“モレキュラー・クローニング”）を
始め、プローブ法（DNA PROBE,George H.Keller,1993,S
tockton）等を用いればよく、或いは検出可能な標識を
導入したプライマーを用いて遺伝子増幅反応を行い、予
め膜に固定しておいた所望のプローブとハイブリダイゼ
ーション反応を行うリバースドットハイブリダイゼーシ
ョン法(Saiki,R.K.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6230-62
34,1989)を利用することでもよい。
【００２１】また、多検体を同時に検出するような大規
模な診断においては、マイクロタイターウェルやＤＮＡ
チップ等を利用する自動化可能な方法が好ましく、例え
ば、双方がビオチン標識されたプライマーを用いて遺伝
子増幅反応を行い、増幅生成物を所望のプローブを固定
したマイクロタイターウェル中に加えてハイブリダイゼ
ーション反応を行い、プレートと結合した遺伝子増幅生
成物の標識を検出するのが好ましい。
模な診断においては、マイクロタイターウェルやＤＮＡ
チップ等を利用する自動化可能な方法が好ましく、例え
ば、双方がビオチン標識されたプライマーを用いて遺伝
子増幅反応を行い、増幅生成物を所望のプローブを固定
したマイクロタイターウェル中に加えてハイブリダイゼ
ーション反応を行い、プレートと結合した遺伝子増幅生
成物の標識を検出するのが好ましい。
【００２２】本発明の病原微生物又は生物由来毒素の検
出法においては、上記のＰＣＲ等の核酸増幅反応及びハ
イブリダイゼーションでの検出条件は、（１）〜（３
０）の何れのセットを用いる場合でも、同一であり個々
に変える必要はない。すなわち、例えばＰＣＲではプラ
イマーのアニーリング温度及び反応液のｐＨが、ハイブ
リダイゼーションではプローブの反応温度、反応液のｐ
Ｈ及び塩濃度が共通である。従って、複数の微生物及び
毒素由来の遺伝子を同時に検出することも可能である。
出法においては、上記のＰＣＲ等の核酸増幅反応及びハ
イブリダイゼーションでの検出条件は、（１）〜（３
０）の何れのセットを用いる場合でも、同一であり個々
に変える必要はない。すなわち、例えばＰＣＲではプラ
イマーのアニーリング温度及び反応液のｐＨが、ハイブ
リダイゼーションではプローブの反応温度、反応液のｐ
Ｈ及び塩濃度が共通である。従って、複数の微生物及び
毒素由来の遺伝子を同時に検出することも可能である。
【００２３】ＰＣＲ条件としては、プライマーのアニー
リング温度が４０〜７２℃、好ましくは４５〜６５℃、
反応液のｐＨが６．０〜１１．０、好ましくは７．０〜
１０．０である。
リング温度が４０〜７２℃、好ましくは４５〜６５℃、
反応液のｐＨが６．０〜１１．０、好ましくは７．０〜
１０．０である。
【００２４】ハイブリダイゼーション条件としては、プ
ローブの反応温度が１０〜８０℃、好ましくは２０〜７
０℃、反応液のｐＨが５．０〜９．０、好ましくは６．
０〜８．０、塩濃度が０．００１〜２０．０Ｍ、好まし
くは０．０１ 〜 １０．０Ｍである。またハイブリダイ
ゼーションにおいて用いられる塩としては、ＬｉＣｌ
（塩化リチウム）ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）、ＫＣｌ
（塩化カリウム）、ＭｇＣｌ2（塩化マグネシウム）、
ＣａＣｌ2（塩化カルシウム）等が挙げられるが、好ま
しくはＮａＣｌであり、その濃度は０．０１ 〜 １０．
０Ｍである。
ローブの反応温度が１０〜８０℃、好ましくは２０〜７
０℃、反応液のｐＨが５．０〜９．０、好ましくは６．
０〜８．０、塩濃度が０．００１〜２０．０Ｍ、好まし
くは０．０１ 〜 １０．０Ｍである。またハイブリダイ
ゼーションにおいて用いられる塩としては、ＬｉＣｌ
（塩化リチウム）ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）、ＫＣｌ
（塩化カリウム）、ＭｇＣｌ2（塩化マグネシウム）、
ＣａＣｌ2（塩化カルシウム）等が挙げられるが、好ま
しくはＮａＣｌであり、その濃度は０．０１ 〜 １０．
０Ｍである。
【００２５】本発明の検出セットを用い、ＰＣＲ法を利
用して病原微生物遺伝子又は生物由来毒素遺伝子を検出
する場合の具体的な工程を以下に示す。 （ア）ＤＮＡを含む検体に、本発明のプライマー、ＤＮ
Ａポリメラーゼ、ｄＡＴＰ（デオキシアデノシン−５′
−三リン酸）、ｄＣＴＰ（デオキシシチジン−５′−三
リン酸）、ｄＧＴＰ（デオキシグアノシン−５′−三リ
ン酸）及びｄＴＴＰ（デオキシチミン−５′−三リン
酸）を含む緩衝液を添加し、加熱する。 （イ）冷却し、保温し、加熱する。 （ウ）（イ）の操作を繰返す。 （エ）反応液に含まれるＤＮＡを検出する。
用して病原微生物遺伝子又は生物由来毒素遺伝子を検出
する場合の具体的な工程を以下に示す。 （ア）ＤＮＡを含む検体に、本発明のプライマー、ＤＮ
Ａポリメラーゼ、ｄＡＴＰ（デオキシアデノシン−５′
−三リン酸）、ｄＣＴＰ（デオキシシチジン−５′−三
リン酸）、ｄＧＴＰ（デオキシグアノシン−５′−三リ
ン酸）及びｄＴＴＰ（デオキシチミン−５′−三リン
酸）を含む緩衝液を添加し、加熱する。 （イ）冷却し、保温し、加熱する。 （ウ）（イ）の操作を繰返す。 （エ）反応液に含まれるＤＮＡを検出する。
【００２６】工程（ア）のＤＮＡを含む検体としては、
例えば環境中の汚泥等から核酸を抽出したものが挙げら
れ、工程（ア）のＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば
タック（Ｔａｑ）ポリメラーゼを使用することができ
る。タックポリメラーゼはアプライドバイオシステムズ
(株)から購入できる。工程（ア）の加熱は例えば９０℃
〜１００℃で１秒〜５分間静置する。工程（イ）の冷却
は例えば４５℃〜６５℃で１秒〜５分間静置し、保温は
例えば７０℃〜８０℃で１秒〜５分間静置し、加熱は例
えば９０℃〜１００℃で１秒〜５分間静置すればよい。
工程（ア）の加熱操作や工程（イ）の冷却、保温及び加
熱の操作は、ＤＮＡサーマルサイクラー (（登録商標；
Perkin-elmer Cetus社製）を使用して行うことができ
る。工程（ウ）の繰返し回数は特に限定されないが、１
０回以上繰り返すことが望ましい。工程（エ）の反応液
に含まれるＤＮＡの検出は、例えば、反応液を臭化エチ
ジウム含有アガロースゲルを用いて電気泳動して反応液
に含まれているＤＮＡを分子量で分離し、紫外線を照射
すればよく、使用した本発明のプライマーが標識物で標
識されている場合はその標識を利用してＤＮＡを検出す
ればよい。
例えば環境中の汚泥等から核酸を抽出したものが挙げら
れ、工程（ア）のＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば
タック（Ｔａｑ）ポリメラーゼを使用することができ
る。タックポリメラーゼはアプライドバイオシステムズ
(株)から購入できる。工程（ア）の加熱は例えば９０℃
〜１００℃で１秒〜５分間静置する。工程（イ）の冷却
は例えば４５℃〜６５℃で１秒〜５分間静置し、保温は
例えば７０℃〜８０℃で１秒〜５分間静置し、加熱は例
えば９０℃〜１００℃で１秒〜５分間静置すればよい。
工程（ア）の加熱操作や工程（イ）の冷却、保温及び加
熱の操作は、ＤＮＡサーマルサイクラー (（登録商標；
Perkin-elmer Cetus社製）を使用して行うことができ
る。工程（ウ）の繰返し回数は特に限定されないが、１
０回以上繰り返すことが望ましい。工程（エ）の反応液
に含まれるＤＮＡの検出は、例えば、反応液を臭化エチ
ジウム含有アガロースゲルを用いて電気泳動して反応液
に含まれているＤＮＡを分子量で分離し、紫外線を照射
すればよく、使用した本発明のプライマーが標識物で標
識されている場合はその標識を利用してＤＮＡを検出す
ればよい。
【００２７】
【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。 実施例１ Yersinia pestis遺伝子の検出 （１）テンプレートＤＮＡ溶液の調製Yersinia pestisのゲノムＤＮＡが入手困難であった
為、その目的配列であるｃａｆ１遺伝子の一部のＤＮＡ
を合成し、プラスミドにクローニングして、以下の実験
のテンプレートＤＮＡとして用いることにした。目的配
列を含む配列番号９１、９２、９３、９４の塩基配列か
らなるＤＮＡをそれぞれ、Ｂ７ＴＳ１、Ｂ７ＴＳ２、Ｂ
７ＴＡ１、Ｂ７ＴＡ２と名付けた。Ｂ７ＴＳ１はＢ７Ｔ
Ａ１の相補鎖で、Ｂ７ＴＳ２はＢ７ＴＡ２の相補鎖であ
り、Ｂ７ＴＳ１の３’末端とＢ７ＴＳ２の５’末端、ま
た、Ｂ７ＴＡ１の５’末端とＢ７ＴＡ２の３’末端が連
結できるような設計とした。まず、相補鎖どうしのＢ７
ＴＳ１とＢ７ＴＡ１、Ｂ７ＴＳ２とＢ７ＴＡ２を反応チ
ューブに加え９５℃で１分の加熱後、ゆっくり室温に戻
して２本鎖ＤＮＡを形成させた。それぞれの５’末端を
Ｔ４ポリヌクレオチドリン酸化酵素とＡＴＰを用いてリ
ン酸化した後、混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結
合させた。それを制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消
化し枝末端とし、同様に制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲ
Ｉで消化し枝末端としたプラスミドｐＵＣ１１９と混合
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ、大腸菌ＤＨ
５に形質転換した。これを用いて常法に従って、目的配
列を含むプラスミドＤＮＡを精製し、これをテンプレー
トＤＮＡ溶液として以下の実験に使用した。
が、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。 実施例１ Yersinia pestis遺伝子の検出 （１）テンプレートＤＮＡ溶液の調製Yersinia pestisのゲノムＤＮＡが入手困難であった
為、その目的配列であるｃａｆ１遺伝子の一部のＤＮＡ
を合成し、プラスミドにクローニングして、以下の実験
のテンプレートＤＮＡとして用いることにした。目的配
列を含む配列番号９１、９２、９３、９４の塩基配列か
らなるＤＮＡをそれぞれ、Ｂ７ＴＳ１、Ｂ７ＴＳ２、Ｂ
７ＴＡ１、Ｂ７ＴＡ２と名付けた。Ｂ７ＴＳ１はＢ７Ｔ
Ａ１の相補鎖で、Ｂ７ＴＳ２はＢ７ＴＡ２の相補鎖であ
り、Ｂ７ＴＳ１の３’末端とＢ７ＴＳ２の５’末端、ま
た、Ｂ７ＴＡ１の５’末端とＢ７ＴＡ２の３’末端が連
結できるような設計とした。まず、相補鎖どうしのＢ７
ＴＳ１とＢ７ＴＡ１、Ｂ７ＴＳ２とＢ７ＴＡ２を反応チ
ューブに加え９５℃で１分の加熱後、ゆっくり室温に戻
して２本鎖ＤＮＡを形成させた。それぞれの５’末端を
Ｔ４ポリヌクレオチドリン酸化酵素とＡＴＰを用いてリ
ン酸化した後、混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結
合させた。それを制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消
化し枝末端とし、同様に制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲ
Ｉで消化し枝末端としたプラスミドｐＵＣ１１９と混合
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ、大腸菌ＤＨ
５に形質転換した。これを用いて常法に従って、目的配
列を含むプラスミドＤＮＡを精製し、これをテンプレー
トＤＮＡ溶液として以下の実験に使用した。
【００２８】（２）ＰＣＲ条件の検討
Ｈｉｒｏｋｏ Ｔｓｕｋａｎｏらの論文（Microbiol.Im
munol.,40(10),773-775,1996）を参考にして、プライマ
ーの設計を行った。論文に記載されてあるプライマー配
列番号９５、９６の塩基配列からなるＤＮＡの合成は日
本バイオサービス社に外注し、それぞれプライマーＢ７
Ｆ１、プライマーＢ７Ｒ１と名付けた。プライマーの
５’末端をビオチンで標識し以下の実験に使用した。そ
れぞれのプライマー０．２μＭを加え、ｄＡＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰそれぞれ２００μＭ、１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ ＫＣ
ｌ、３．６ｍＭ ＭｇＣｌ2、４％ グリセロール、Ｔ
ａｑＤＮＡポリメラーゼ（アプライドバイオシステムズ
社）０．００１２５ユニットを含む総量４０μＬを反応
液とした。そこに陽性コントロールとしてテンプレート
ＤＮＡ溶液を１０μＬ加した。陰性コントロールにはＨ
2Ｏを１０μＬ添加した。それぞれ２検体ずつＰＣＲ反
応液の調製を行った。ＰＣＲ反応は９４℃・５分間加熱
したのち、つづいて、９４℃・３０秒、５５℃・３０
秒、７２℃・３０秒を１サイクルとし、４０サイクルの
反応を行った。
munol.,40(10),773-775,1996）を参考にして、プライマ
ーの設計を行った。論文に記載されてあるプライマー配
列番号９５、９６の塩基配列からなるＤＮＡの合成は日
本バイオサービス社に外注し、それぞれプライマーＢ７
Ｆ１、プライマーＢ７Ｒ１と名付けた。プライマーの
５’末端をビオチンで標識し以下の実験に使用した。そ
れぞれのプライマー０．２μＭを加え、ｄＡＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰそれぞれ２００μＭ、１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ ＫＣ
ｌ、３．６ｍＭ ＭｇＣｌ2、４％ グリセロール、Ｔ
ａｑＤＮＡポリメラーゼ（アプライドバイオシステムズ
社）０．００１２５ユニットを含む総量４０μＬを反応
液とした。そこに陽性コントロールとしてテンプレート
ＤＮＡ溶液を１０μＬ加した。陰性コントロールにはＨ
2Ｏを１０μＬ添加した。それぞれ２検体ずつＰＣＲ反
応液の調製を行った。ＰＣＲ反応は９４℃・５分間加熱
したのち、つづいて、９４℃・３０秒、５５℃・３０
秒、７２℃・３０秒を１サイクルとし、４０サイクルの
反応を行った。
【００２９】（３）検出用マイクロタイターウェルの調
製 配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号
１００、配列番号１８、配列番号１０１で示される塩基
配列からなるＤＮＡをＤＮＡ合成機（アプライドバイオ
システムズ社製）で化学合成し、それぞれプローブＢ７
Ｓ５、プローブＢ７Ｓ６、プローブＢ７Ｓ７、プローブ
Ｂ７Ａ５、プローブＢ７Ａ６、プローブＢ７Ａ７と名付
けた。増幅産物をハイブリダイゼーション法により検出
するために、それぞれのプローブＤＮＡをマイクロタイ
ターウェルへ固定した。プローブＤＮＡを、１０ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液で
１μｇ／５０μＬの濃度とし、等量の固定化バッファー
（１．５ＭＮａＣｌ、０．３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０）、０．３Ｍ ＭｇＣｌ2）を加えて混和し、
マイクロタイターウェル（住友ベークライト、セパプレ
ート８Ｆ Ｈタイプ）に１ウェルあたり１００μＬずつ
加えた。ウェルはふたをして３７℃１６時間放置した。
その後、液を除き、３７℃３０分間乾燥後、ストラタリ
ンカー２４００（ストラタジーン社製）を用い、５０
０，０００μＪの光照射を行った。光照射後、洗浄バッ
ファー（１Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．３、０．１％ Ｔｗｅ
ｅｎ２０：２００μＬ）で３回洗浄した。プローブＢ７
Ｓ５の配列を含むプローブＤＮＡを固定したものをＢ７
Ｓ５ウェル、プローブＢ７Ｓ６の配列を含むプローブＤ
ＮＡを固定したものをＢ７Ｓ６ウェル、プローブＢ７Ｓ
７の配列を含むプローブＤＮＡを固定したものをＢ７Ｓ
７ウェル、プローブＢ７Ａ５の配列を含むプローブＤＮ
Ａを固定したものをＢ７Ａ５ウェル、プローブＢ７Ａ６
の配列を含むプローブＤＮＡを固定したものをＢ７Ａ６
ウェル、プローブＢ７Ａ７の配列を含むプローブＤＮＡ
を固定したものをＢ７Ａ７ウェルとした。マイクロタイ
ターウェルをビニールパックに入れシールして４℃で保
存した。
製 配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号
１００、配列番号１８、配列番号１０１で示される塩基
配列からなるＤＮＡをＤＮＡ合成機（アプライドバイオ
システムズ社製）で化学合成し、それぞれプローブＢ７
Ｓ５、プローブＢ７Ｓ６、プローブＢ７Ｓ７、プローブ
Ｂ７Ａ５、プローブＢ７Ａ６、プローブＢ７Ａ７と名付
けた。増幅産物をハイブリダイゼーション法により検出
するために、それぞれのプローブＤＮＡをマイクロタイ
ターウェルへ固定した。プローブＤＮＡを、１０ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液で
１μｇ／５０μＬの濃度とし、等量の固定化バッファー
（１．５ＭＮａＣｌ、０．３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０）、０．３Ｍ ＭｇＣｌ2）を加えて混和し、
マイクロタイターウェル（住友ベークライト、セパプレ
ート８Ｆ Ｈタイプ）に１ウェルあたり１００μＬずつ
加えた。ウェルはふたをして３７℃１６時間放置した。
その後、液を除き、３７℃３０分間乾燥後、ストラタリ
ンカー２４００（ストラタジーン社製）を用い、５０
０，０００μＪの光照射を行った。光照射後、洗浄バッ
ファー（１Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．３、０．１％ Ｔｗｅ
ｅｎ２０：２００μＬ）で３回洗浄した。プローブＢ７
Ｓ５の配列を含むプローブＤＮＡを固定したものをＢ７
Ｓ５ウェル、プローブＢ７Ｓ６の配列を含むプローブＤ
ＮＡを固定したものをＢ７Ｓ６ウェル、プローブＢ７Ｓ
７の配列を含むプローブＤＮＡを固定したものをＢ７Ｓ
７ウェル、プローブＢ７Ａ５の配列を含むプローブＤＮ
Ａを固定したものをＢ７Ａ５ウェル、プローブＢ７Ａ６
の配列を含むプローブＤＮＡを固定したものをＢ７Ａ６
ウェル、プローブＢ７Ａ７の配列を含むプローブＤＮＡ
を固定したものをＢ７Ａ７ウェルとした。マイクロタイ
ターウェルをビニールパックに入れシールして４℃で保
存した。
【００３０】（４）マイクロタイターウェルを用いたハ
イブリダイゼーション法による検出 それぞれの増幅産物を９４℃で１０分間、熱変性後、氷
中で１０分間冷却した。その増幅産物を、あらかじめハ
イブリダイゼーション溶液（１×ＳＳＣ）１００μＬを
加えておいた各マイクロタイターウェルに５μＬ加え３
７℃で１時間ハイブリダイゼーションした。ハイブリダ
イゼーション溶液を除き、溶液１（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．３Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ
ＭｇＣｌ2、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ
−１００）で４回洗浄した。これに、アビジン−ＨＲＰ
溶液（ベクター社）を溶液１で１／１００に希釈したも
のを１００μＬ／ウェル加え、３７℃で１５分間放置し
た。反応液を除き、溶液１（３５０μＬ／ウェル）で４
回洗浄した。洗浄後、ＡＢＴＳ（和光純薬製）１００μ
Ｌ／ウェルを加えて３７℃で１５分反応し、４１５ｎｍ
で吸光度を測定した。その結果は表１に示されるとおり
である。なお、吸光度による測定（Ｏ．Ｄ．４１５ｎ
ｍ）で０．２以上の値を示したものが陽性である。
イブリダイゼーション法による検出 それぞれの増幅産物を９４℃で１０分間、熱変性後、氷
中で１０分間冷却した。その増幅産物を、あらかじめハ
イブリダイゼーション溶液（１×ＳＳＣ）１００μＬを
加えておいた各マイクロタイターウェルに５μＬ加え３
７℃で１時間ハイブリダイゼーションした。ハイブリダ
イゼーション溶液を除き、溶液１（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．３Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ
ＭｇＣｌ2、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ
−１００）で４回洗浄した。これに、アビジン−ＨＲＰ
溶液（ベクター社）を溶液１で１／１００に希釈したも
のを１００μＬ／ウェル加え、３７℃で１５分間放置し
た。反応液を除き、溶液１（３５０μＬ／ウェル）で４
回洗浄した。洗浄後、ＡＢＴＳ（和光純薬製）１００μ
Ｌ／ウェルを加えて３７℃で１５分反応し、４１５ｎｍ
で吸光度を測定した。その結果は表１に示されるとおり
である。なお、吸光度による測定（Ｏ．Ｄ．４１５ｎ
ｍ）で０．２以上の値を示したものが陽性である。
【００３１】
【表１】
【００３２】陽性コントロール検体で、プローブＢ７Ｓ
６、Ｂ７Ｓ７、Ｂ７Ａ６、Ｂ７Ａ７のウェルで十分な発
色がみられたが、Ｂ７Ｓ５、Ｂ７Ａ５では発色がみられ
なかった。また、陰性コントロール検体で、Ｂ７Ｓ６、
Ｂ７Ｓ７、Ｂ７Ａ７のウェルに僅かながら発色がみられ
た。そこで、Yersinia pestisの目的遺伝子の検出に用
いるプローブはＢ７Ａ６プローブを使用することにし
た。さらに、Ｂ７Ａ６プローブを用いて、再度プライマ
ーの検討を行った。配列番号１６、１７の塩基配列から
なるＤＮＡをアプライドバイオシステムズ社製のＤＮＡ
合成機で化学合成し、それぞれプライマーＢ７Ｆ２、プ
ライマーＢ７Ｒ２と名付けた。プライマーの５’末端を
ビオチンで標識したものを以下の実験に使用した。表２
に記載したプライマーの組み合わせで、前記載のＰＣＲ
反応液と同様な試薬組成で４種類のＰＣＲ反応液を調製
した。それぞれの増幅試薬に、陽性コントトロールとし
てテンプレートＤＮＡ溶液を１０μＬ添加した。陰性コ
ントロールはＨ2Ｏを１０μＬ添加した。前記載同様の
ＰＣＲ反応条件でＰＣＲ反応を行った。
６、Ｂ７Ｓ７、Ｂ７Ａ６、Ｂ７Ａ７のウェルで十分な発
色がみられたが、Ｂ７Ｓ５、Ｂ７Ａ５では発色がみられ
なかった。また、陰性コントロール検体で、Ｂ７Ｓ６、
Ｂ７Ｓ７、Ｂ７Ａ７のウェルに僅かながら発色がみられ
た。そこで、Yersinia pestisの目的遺伝子の検出に用
いるプローブはＢ７Ａ６プローブを使用することにし
た。さらに、Ｂ７Ａ６プローブを用いて、再度プライマ
ーの検討を行った。配列番号１６、１７の塩基配列から
なるＤＮＡをアプライドバイオシステムズ社製のＤＮＡ
合成機で化学合成し、それぞれプライマーＢ７Ｆ２、プ
ライマーＢ７Ｒ２と名付けた。プライマーの５’末端を
ビオチンで標識したものを以下の実験に使用した。表２
に記載したプライマーの組み合わせで、前記載のＰＣＲ
反応液と同様な試薬組成で４種類のＰＣＲ反応液を調製
した。それぞれの増幅試薬に、陽性コントトロールとし
てテンプレートＤＮＡ溶液を１０μＬ添加した。陰性コ
ントロールはＨ2Ｏを１０μＬ添加した。前記載同様の
ＰＣＲ反応条件でＰＣＲ反応を行った。
【００３３】
【表２】
【００３４】Ｂ７Ａ６プローブを固定したウェルを用い
て、前記載同様の方法でプレートによる検出を行った。
その結果は表３に示されるとおりである。なお、吸光度
による測定（Ｏ．Ｄ．４１５ｎｍ）で０．２以上の値を
示したものが陽性である。
て、前記載同様の方法でプレートによる検出を行った。
その結果は表３に示されるとおりである。なお、吸光度
による測定（Ｏ．Ｄ．４１５ｎｍ）で０．２以上の値を
示したものが陽性である。
【００３５】
【表３】
【００３６】ＰＣＲ反応液１、２を用いた時、陰性コン
トロールに発色がみられた。増幅試薬３、４を用いると
陽性コントロールの発色も強く、また、陰性コントロー
ルでは発色がみられず結果が良好であった。本法によ
り、Ｂ７Ｆ２、Ｂ７Ｒ２プライマーを用いたＰＣＲ反応
液、さらに、その増幅物の検出にＢ７Ａ６プローブを用
いること、すなわち本発明の検出セット（６）を用いる
ことで、Yersinia pestisを短時間で正確に検出が可能
であった。
トロールに発色がみられた。増幅試薬３、４を用いると
陽性コントロールの発色も強く、また、陰性コントロー
ルでは発色がみられず結果が良好であった。本法によ
り、Ｂ７Ｆ２、Ｂ７Ｒ２プライマーを用いたＰＣＲ反応
液、さらに、その増幅物の検出にＢ７Ａ６プローブを用
いること、すなわち本発明の検出セット（６）を用いる
ことで、Yersinia pestisを短時間で正確に検出が可能
であった。
【００３７】実施例２ Naegleria fowleri遺伝子の検
出 （１）テンプレートＤＮＡ溶液の調製Naegleria fowleriの ゲノムＤＮＡが入手困難であっ
た為、その目的配列であるmitochondrial ATPase 6 sub
unit遺伝子の一部のＤＮＡを合成し、プラスミドにクロ
ーニングして、以下の実験のテンプレートＤＮＡとして
用いることにした。目的配列を含む配列番号１０２、１
０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０
９の塩基配列からなるＤＮＡをそれぞれ、Ｐ１ＴＳ１、
Ｐ１ＴＳ２、Ｐ１ＴＳ３、Ｐ１ＴＳ４、Ｐ１ＴＡ１Ａ、
Ｐ１ＴＡ２Ａ、Ｐ１ＴＡ３Ａ、Ｐ１ＴＡ４Ａと名付け
た。Ｐ１ＴＳ１はＰ１ＴＡ１Ａの相補鎖で、Ｐ１ＴＳ２
はＰ１ＴＡ２Ａの相補鎖で、Ｐ１ＴＳ３はＰ１ＴＡ３Ａ
の相補鎖で、Ｐ１ＴＳ４はＰ１ＴＡ４Ａの相補鎖であ
り、Ｐ１ＴＳ１の３’末端とＰ１ＴＳ２の５’末端、Ｐ
１ＴＳ２の３’末端とＰ１ＴＳ３の５’末端、Ｐ１ＴＳ
３の３’末端とＰ１ＴＳ４の５’末端、さらに、Ｐ１Ｔ
Ａ１Ａの５’末端とＰ１ＴＡ２Ａの３’末端、Ｐ１ＴＡ
２Ａの５’末端とＰ１ＴＡ３Ａの３’末端、Ｐ１ＴＡ３
Ａの５’末端とＰ１ＴＡ４Ａの３’末端が連結できるよ
うな設計とした。まず、相補鎖どうしのＰ１ＴＳ１とＰ
１ＴＡ１Ａ、Ｐ１ＴＳ２とＰ１ＴＡ２Ａ、Ｐ１ＴＳ３と
Ｐ１ＴＡ３Ａ、Ｐ１ＴＳ４とＰ１ＴＡ４Ａを反応チュー
ブに加え９５℃で１分の加熱後、ゆっくり室温に戻して
２本鎖ＤＮＡを形成させた。それぞれの５’末端をＴ４
ポリヌクレオチドリン酸化酵素とＡＴＰを用いてリン酸
化した後、混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合さ
せた。それを制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化し
枝末端とし、同様に制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで
消化し枝末端としたプラスミドｐＵＣ１１９と混合し、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ、大腸菌ＤＨ５に
形質転換した。これを用いて常法に従って、目的配列を
含むプラスミドＤＮＡを精製し、これをテンプレートＤ
ＮＡ溶液として以下に実験に使用した。
出 （１）テンプレートＤＮＡ溶液の調製Naegleria fowleriの ゲノムＤＮＡが入手困難であっ
た為、その目的配列であるmitochondrial ATPase 6 sub
unit遺伝子の一部のＤＮＡを合成し、プラスミドにクロ
ーニングして、以下の実験のテンプレートＤＮＡとして
用いることにした。目的配列を含む配列番号１０２、１
０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０
９の塩基配列からなるＤＮＡをそれぞれ、Ｐ１ＴＳ１、
Ｐ１ＴＳ２、Ｐ１ＴＳ３、Ｐ１ＴＳ４、Ｐ１ＴＡ１Ａ、
Ｐ１ＴＡ２Ａ、Ｐ１ＴＡ３Ａ、Ｐ１ＴＡ４Ａと名付け
た。Ｐ１ＴＳ１はＰ１ＴＡ１Ａの相補鎖で、Ｐ１ＴＳ２
はＰ１ＴＡ２Ａの相補鎖で、Ｐ１ＴＳ３はＰ１ＴＡ３Ａ
の相補鎖で、Ｐ１ＴＳ４はＰ１ＴＡ４Ａの相補鎖であ
り、Ｐ１ＴＳ１の３’末端とＰ１ＴＳ２の５’末端、Ｐ
１ＴＳ２の３’末端とＰ１ＴＳ３の５’末端、Ｐ１ＴＳ
３の３’末端とＰ１ＴＳ４の５’末端、さらに、Ｐ１Ｔ
Ａ１Ａの５’末端とＰ１ＴＡ２Ａの３’末端、Ｐ１ＴＡ
２Ａの５’末端とＰ１ＴＡ３Ａの３’末端、Ｐ１ＴＡ３
Ａの５’末端とＰ１ＴＡ４Ａの３’末端が連結できるよ
うな設計とした。まず、相補鎖どうしのＰ１ＴＳ１とＰ
１ＴＡ１Ａ、Ｐ１ＴＳ２とＰ１ＴＡ２Ａ、Ｐ１ＴＳ３と
Ｐ１ＴＡ３Ａ、Ｐ１ＴＳ４とＰ１ＴＡ４Ａを反応チュー
ブに加え９５℃で１分の加熱後、ゆっくり室温に戻して
２本鎖ＤＮＡを形成させた。それぞれの５’末端をＴ４
ポリヌクレオチドリン酸化酵素とＡＴＰを用いてリン酸
化した後、混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合さ
せた。それを制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化し
枝末端とし、同様に制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで
消化し枝末端としたプラスミドｐＵＣ１１９と混合し、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ、大腸菌ＤＨ５に
形質転換した。これを用いて常法に従って、目的配列を
含むプラスミドＤＮＡを精製し、これをテンプレートＤ
ＮＡ溶液として以下に実験に使用した。
【００３８】（２）ＰＣＲ条件の検討
Ｇ．Ｌ．ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎらの論文（Journal of C
linical Microbiology, Feb. 1991, p.227-230）を参考
にして、プライマーの設計を行った。論文に記載されて
あるプライマー配列番号１１０、１１１の塩基配列から
なるＤＮＡの合成を日本バイオサービス社に外注し、そ
れぞれプライマーＰ１Ｆ１、プライマーＰ１Ｒ１と名付
けた。プライマーの５’末端をビオチンで標識したもの
以下の実験に使用した。
linical Microbiology, Feb. 1991, p.227-230）を参考
にして、プライマーの設計を行った。論文に記載されて
あるプライマー配列番号１１０、１１１の塩基配列から
なるＤＮＡの合成を日本バイオサービス社に外注し、そ
れぞれプライマーＰ１Ｆ１、プライマーＰ１Ｒ１と名付
けた。プライマーの５’末端をビオチンで標識したもの
以下の実験に使用した。
【００３９】それぞれのプライマー０．２μＭを加え、
ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰそれぞれ２０
０μＭ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、
５０ｍＭ ＫＣｌ、３．６ｍＭ ＭｇＣｌ2、４％グリ
セロール、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（アプライドバイ
オシステムズ社）０．００１２５ユニットを含む総量４
０μＬを反応液とした。そこに陽性コントロールとして
テンプレートＤＮＡ溶液を１０μＬ加した。陰性コント
ロールにはＨ2Ｏを１０μＬ添加した。それぞれ２検体
ずつＰＣＲ反応液の調製を行った。ＰＣＲ反応は９４℃
・５分間加熱したのち、つづいて、９４℃・３０秒、５
５℃・３０秒、７２℃・３０秒を１サイクルとし、４０
サイクルの反応を行った。なお、プライマー配列以外の
ＰＣＲ反応液組成、ＰＣＲ反応温度条件は同一な反応条
件である。
ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰそれぞれ２０
０μＭ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、
５０ｍＭ ＫＣｌ、３．６ｍＭ ＭｇＣｌ2、４％グリ
セロール、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（アプライドバイ
オシステムズ社）０．００１２５ユニットを含む総量４
０μＬを反応液とした。そこに陽性コントロールとして
テンプレートＤＮＡ溶液を１０μＬ加した。陰性コント
ロールにはＨ2Ｏを１０μＬ添加した。それぞれ２検体
ずつＰＣＲ反応液の調製を行った。ＰＣＲ反応は９４℃
・５分間加熱したのち、つづいて、９４℃・３０秒、５
５℃・３０秒、７２℃・３０秒を１サイクルとし、４０
サイクルの反応を行った。なお、プライマー配列以外の
ＰＣＲ反応液組成、ＰＣＲ反応温度条件は同一な反応条
件である。
【００４０】（３）検出用マイクロタイターウェルの調
製 配列番号１１２、１１３、１１４、１１５の塩基配列か
らなるＤＮＡをＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステ
ムズ社製）で化学合成し、それぞれプローブＰ１Ｓ１、
プローブＰ１Ｓ２、プローブＰ１Ｓ３、プローブＰ１Ｓ
４と名付けた。
製 配列番号１１２、１１３、１１４、１１５の塩基配列か
らなるＤＮＡをＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステ
ムズ社製）で化学合成し、それぞれプローブＰ１Ｓ１、
プローブＰ１Ｓ２、プローブＰ１Ｓ３、プローブＰ１Ｓ
４と名付けた。
【００４１】（４）マイクロタイターウェルを用いたハ
イブリダイゼーション法による検出 実施例１と同様な方法でプローブをマイクロタイターウ
ェルへ固定し、実施例１と同様な方法で、マイクロタイ
ターウェルを用いたハイブリダイゼーション法による検
出を行なった。その結果は表４に示されるとおりであ
る。なお、吸光度による測定（Ｏ．Ｄ．４１５ｎｍ）で
０．２以上の値を示したものが陽性である。
イブリダイゼーション法による検出 実施例１と同様な方法でプローブをマイクロタイターウ
ェルへ固定し、実施例１と同様な方法で、マイクロタイ
ターウェルを用いたハイブリダイゼーション法による検
出を行なった。その結果は表４に示されるとおりであ
る。なお、吸光度による測定（Ｏ．Ｄ．４１５ｎｍ）で
０．２以上の値を示したものが陽性である。
【００４２】
【表４】
【００４３】陽性コントロール検体では、すべてのプロ
ーブで十分な発色がみられた。しかし、陰性コントロー
ル検体で、Ｐ１Ｓ１、Ｐ１Ｓ２、Ｐ１Ｓ３プローブに僅
かながら発色がみられた。そこで、Naegleria fowleri
の目的遺伝子の検出に用いるプローブはＰ１Ｓ４プロー
ブを使用することにした。
ーブで十分な発色がみられた。しかし、陰性コントロー
ル検体で、Ｐ１Ｓ１、Ｐ１Ｓ２、Ｐ１Ｓ３プローブに僅
かながら発色がみられた。そこで、Naegleria fowleri
の目的遺伝子の検出に用いるプローブはＰ１Ｓ４プロー
ブを使用することにした。
【００４４】陰性コントロールの値は陰性ではあるが、
僅かに発色が強いと思われる。そこでＰ１Ｓ４プローブ
を用いて、プライマーの最適化の検討を行った。配列番
号１１６、１１７の塩基配列からなるＤＮＡをアプライ
ドバイオシステムズ社製のＤＮＡ合成機で化学合成し、
それぞれプライマーＰ１Ｆ２、プライマーＰ１Ｒ２と名
付けた。プライマーの５’末端をビオチンで標識したも
のを以下の実験に使用した。
僅かに発色が強いと思われる。そこでＰ１Ｓ４プローブ
を用いて、プライマーの最適化の検討を行った。配列番
号１１６、１１７の塩基配列からなるＤＮＡをアプライ
ドバイオシステムズ社製のＤＮＡ合成機で化学合成し、
それぞれプライマーＰ１Ｆ２、プライマーＰ１Ｒ２と名
付けた。プライマーの５’末端をビオチンで標識したも
のを以下の実験に使用した。
【００４５】表５に記載したプライマーの組み合わせ
で、前記載のＰＣＲ反応液と同様な試薬組成で３種類の
ＰＣＲ反応液を調製した。それぞれの増幅試薬に、陰性
コントロールとしてＨ2Ｏを１０μＬ添加した。前記載
同様のＰＣＲ反応条件でＰＣＲ反応を行った。
で、前記載のＰＣＲ反応液と同様な試薬組成で３種類の
ＰＣＲ反応液を調製した。それぞれの増幅試薬に、陰性
コントロールとしてＨ2Ｏを１０μＬ添加した。前記載
同様のＰＣＲ反応条件でＰＣＲ反応を行った。
【００４６】
【表５】
【００４７】Ｐ１Ｓ４プローブを固定したウェルを用い
て、前記載同様の方法でプレートによる検出を行った。
その結果は表６に示されるとおりである。なお、吸光度
による測定（Ｏ．Ｄ．４１５ｎｍ）で０．２以上の値を
示したものが陽性である。
て、前記載同様の方法でプレートによる検出を行った。
その結果は表６に示されるとおりである。なお、吸光度
による測定（Ｏ．Ｄ．４１５ｎｍ）で０．２以上の値を
示したものが陽性である。
【００４８】
【表６】
【００４９】ＰＣＲ反応液１、２を用いた時、陰性コン
トロールに発色がみられた。増幅試薬３を用いた時、陰
性コントロールでは発色がみられず結果が良好であっ
た。
トロールに発色がみられた。増幅試薬３を用いた時、陰
性コントロールでは発色がみられず結果が良好であっ
た。
【００５０】実施例１と同一な条件、ＰＣＲのプライマ
ーのアニーリング温度が４５〜６５℃で、増幅反応液の
ｐＨが７．０〜１０．０であり、ハイブリダイゼーショ
ン法におけるプローブの反応温度が２０〜７０℃で、反
応液のｐＨが６．０〜８．０で、塩濃度が０．０１〜１
０．０Ｍである同一な条件で以下の検出を行った。本発
明の検出セット（１１）を用いてNaegleria fowleri遺
伝子の検出を行い、結果を表７に示した。
ーのアニーリング温度が４５〜６５℃で、増幅反応液の
ｐＨが７．０〜１０．０であり、ハイブリダイゼーショ
ン法におけるプローブの反応温度が２０〜７０℃で、反
応液のｐＨが６．０〜８．０で、塩濃度が０．０１〜１
０．０Ｍである同一な条件で以下の検出を行った。本発
明の検出セット（１１）を用いてNaegleria fowleri遺
伝子の検出を行い、結果を表７に示した。
【００５１】
【表７】
【００５２】本発明の検出セット（１１）を用いること
で、Naegleria fowleri遺伝子を同一検出条件において
短時間で正確に検出が可能であった。
で、Naegleria fowleri遺伝子を同一検出条件において
短時間で正確に検出が可能であった。
【００５３】実施例３ Ricinus遺伝子の検出
（１）テンプレートＤＮＡ溶液の調製Ricinus
のゲノムＤＮＡが入手困難であった為、その目
的配列であるRicinus toxinの A chain region遺伝子の
一部のＤＮＡを合成し、テンプレートＤＮＡとして用い
た。目的配列を含む配列番号１１８、１１９の塩基配列
からなるＤＮＡをそれぞれＴ６ＴＳＬ、Ｔ６ＴＡＬと名
付けた。これら合成ＤＮＡをＨ2Ｏで溶解し、テンプレ
ートＤＮＡ溶液として以下の実験に使用した。
的配列であるRicinus toxinの A chain region遺伝子の
一部のＤＮＡを合成し、テンプレートＤＮＡとして用い
た。目的配列を含む配列番号１１８、１１９の塩基配列
からなるＤＮＡをそれぞれＴ６ＴＳＬ、Ｔ６ＴＡＬと名
付けた。これら合成ＤＮＡをＨ2Ｏで溶解し、テンプレ
ートＤＮＡ溶液として以下の実験に使用した。
【００５４】（２）ＰＣＲ条件の検討
ＧｅｎｏｍｅＮｅｔに登録されている遺伝子配列情報の
中から、「Ｒｉｃｉｎｕｓ ｔｏｘｉｎ」をキーワード
に検索を行い遺伝子配列情報を収集した。さらに日立ソ
フトエンジニアリング社から販売されている遺伝子配列
解析ソフト「ＤＮＡＳＩＳ」を用い、保存されている遺
伝子配列を選定しプライマーの設計を行った。プライマ
ー配列番号１２０、１２１の塩基配列からなるＤＮＡの
合成を日本バイオサービス社に外注し、それぞれプライ
マーＴ６Ｆ２、プライマーＴ６Ｒ２と名付けた。プライ
マーの５’末端をビオチンで標識したもの以下の実験に
使用した。
中から、「Ｒｉｃｉｎｕｓ ｔｏｘｉｎ」をキーワード
に検索を行い遺伝子配列情報を収集した。さらに日立ソ
フトエンジニアリング社から販売されている遺伝子配列
解析ソフト「ＤＮＡＳＩＳ」を用い、保存されている遺
伝子配列を選定しプライマーの設計を行った。プライマ
ー配列番号１２０、１２１の塩基配列からなるＤＮＡの
合成を日本バイオサービス社に外注し、それぞれプライ
マーＴ６Ｆ２、プライマーＴ６Ｒ２と名付けた。プライ
マーの５’末端をビオチンで標識したもの以下の実験に
使用した。
【００５５】それぞれのプライマー０．２μＭを加え、
ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰそれぞれ２０
０μＭ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、
５０ｍＭ ＫＣｌ、３．６ｍＭ ＭｇＣｌ2、４％ グ
リセロール、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（アプライドバ
イオシステムズ社）０．００１２５ユニットを含む総量
４０μＬを反応液とした。そこに陽性コントロールとし
てテンプレートＤＮＡ溶液を１０μＬ加した。陰性コン
トロールにはＨ2Ｏを１０μＬ添加した。それぞれ２検
体ずつＰＣＲ反応液の調製を行った。ＰＣＲ反応は９４
℃・５分間加熱したのち、つづいて、９４℃・３０秒、
５５℃・３０秒、７２℃・３０秒を１サイクルとし、４
０サイクルの反応を行った。なお、プライマー配列以外
のＰＣＲ反応液組成、ＰＣＲ反応温度条件は（実施例１
記載と）同一な反応条件である。
ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰそれぞれ２０
０μＭ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、
５０ｍＭ ＫＣｌ、３．６ｍＭ ＭｇＣｌ2、４％ グ
リセロール、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（アプライドバ
イオシステムズ社）０．００１２５ユニットを含む総量
４０μＬを反応液とした。そこに陽性コントロールとし
てテンプレートＤＮＡ溶液を１０μＬ加した。陰性コン
トロールにはＨ2Ｏを１０μＬ添加した。それぞれ２検
体ずつＰＣＲ反応液の調製を行った。ＰＣＲ反応は９４
℃・５分間加熱したのち、つづいて、９４℃・３０秒、
５５℃・３０秒、７２℃・３０秒を１サイクルとし、４
０サイクルの反応を行った。なお、プライマー配列以外
のＰＣＲ反応液組成、ＰＣＲ反応温度条件は（実施例１
記載と）同一な反応条件である。
【００５６】（３）検出用マイクロタイターウェルの調
製 配列番号１２２、１２３、１２４、１２５の塩基配列か
らなるＤＮＡをＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステ
ムズ社製）で化学合成し、それぞれプローブＴ６Ｓ２、
プローブＴ６Ｓ４、プローブＴ６Ａ２、プローブＴ６Ａ
４と名付けた。
製 配列番号１２２、１２３、１２４、１２５の塩基配列か
らなるＤＮＡをＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステ
ムズ社製）で化学合成し、それぞれプローブＴ６Ｓ２、
プローブＴ６Ｓ４、プローブＴ６Ａ２、プローブＴ６Ａ
４と名付けた。
【００５７】（４）マイクロタイターウェルを用いたハ
イブリダイゼーション法による検出 実施例１と同様な方法でプローブをマイクロタイターウ
ェルへ固定し、実施例１と同様な方法で、マイクロタイ
ターウェルを用いたハイブリダイゼーション法による検
出を行なった。その結果は表８に示されるとおりであ
る。なお、吸光度による測定（Ｏ．Ｄ．４１５ｎｍ）で
０．２以上の値を示したものが陽性である。
イブリダイゼーション法による検出 実施例１と同様な方法でプローブをマイクロタイターウ
ェルへ固定し、実施例１と同様な方法で、マイクロタイ
ターウェルを用いたハイブリダイゼーション法による検
出を行なった。その結果は表８に示されるとおりであ
る。なお、吸光度による測定（Ｏ．Ｄ．４１５ｎｍ）で
０．２以上の値を示したものが陽性である。
【００５８】
【表８】
【００５９】陽性コントロール検体では、すべてのプロ
ーブで十分な発色がみられた。その中でもＴ６Ｓ４プロ
ーブを用いた時が最も発色が強く、逆に、陰性コントロ
ール検体の発色は最も弱かった。Ｔ６Ｓ４プローブを用
いた時が発色のコントラストが最も明瞭であったのでRi
cinusの目的遺伝子の検出に用いるプローブはＴ６Ｓ４
プローブを使用することにした。
ーブで十分な発色がみられた。その中でもＴ６Ｓ４プロ
ーブを用いた時が最も発色が強く、逆に、陰性コントロ
ール検体の発色は最も弱かった。Ｔ６Ｓ４プローブを用
いた時が発色のコントラストが最も明瞭であったのでRi
cinusの目的遺伝子の検出に用いるプローブはＴ６Ｓ４
プローブを使用することにした。
【００６０】従って本発明の検出セット（２４）を用い
ることで、Ricinus遺伝子を同一検出条件において短時
間で正確に検出が可能であった。
ることで、Ricinus遺伝子を同一検出条件において短時
間で正確に検出が可能であった。
【００６１】実施例４ Bacillus anthracis遺伝子の検
出 （１）テンプレートＤＮＡ溶液の調製Bacillus anthracisのゲノムＤＮＡが入手困難であった
為、その目的配列であるＢＡ８１３遺伝子の一部のＤＮ
Ａを合成し、テンプレートＤＮＡとして用いた。目的配
列を含む配列番号１２６、１２７の塩基配列からなるＤ
ＮＡをそれぞれＢ１ＴＳＬ、Ｂ１ＴＡＬと名付けた。こ
れら合成ＤＮＡをＨ2Ｏで溶解し、テンプレートＤＮＡ
溶液として以下の実験に使用した。
出 （１）テンプレートＤＮＡ溶液の調製Bacillus anthracisのゲノムＤＮＡが入手困難であった
為、その目的配列であるＢＡ８１３遺伝子の一部のＤＮ
Ａを合成し、テンプレートＤＮＡとして用いた。目的配
列を含む配列番号１２６、１２７の塩基配列からなるＤ
ＮＡをそれぞれＢ１ＴＳＬ、Ｂ１ＴＡＬと名付けた。こ
れら合成ＤＮＡをＨ2Ｏで溶解し、テンプレートＤＮＡ
溶液として以下の実験に使用した。
【００６２】（２）ＰＣＲ条件の検討
Ｇ．Ｂｒｉｇｈｔｗｅｌｌらの論文（Molecula and Cel
lularProbes(1998)12,367-377）を参考にして、プライ
マーの設計を行った。プライマー配列番号１２８、１２
９、１３０、１３１の塩基配列からなるＤＮＡの合成を
日本バイオサービス社に外注し、それぞれプライマーＢ
１Ｆ１、プライマーＢ１Ｆ２、プライマーＢ１Ｒ１、プ
ライマーＢ１Ｒ２、と名付けた。プライマーの５’末端
をビオチンで標識したもの以下の実験に使用した。
lularProbes(1998)12,367-377）を参考にして、プライ
マーの設計を行った。プライマー配列番号１２８、１２
９、１３０、１３１の塩基配列からなるＤＮＡの合成を
日本バイオサービス社に外注し、それぞれプライマーＢ
１Ｆ１、プライマーＢ１Ｆ２、プライマーＢ１Ｒ１、プ
ライマーＢ１Ｒ２、と名付けた。プライマーの５’末端
をビオチンで標識したもの以下の実験に使用した。
【００６３】表９に記載したプライマーの組み合わせ
で、前記載のＰＣＲ反応液と同様な試薬組成で４種類の
ＰＣＲ反応液を調製した。それぞれの増幅試薬に、陽性
コントトロールとしてテンプレートＤＮＡ溶液を１０μ
Ｌ添加した。陰性コントロールはＨ2Ｏを１０μＬ添加
した。プライマー配列以外のＰＣＲ反応液組成、ＰＣＲ
反応温度条件は同一な反応条件で行った。
で、前記載のＰＣＲ反応液と同様な試薬組成で４種類の
ＰＣＲ反応液を調製した。それぞれの増幅試薬に、陽性
コントトロールとしてテンプレートＤＮＡ溶液を１０μ
Ｌ添加した。陰性コントロールはＨ2Ｏを１０μＬ添加
した。プライマー配列以外のＰＣＲ反応液組成、ＰＣＲ
反応温度条件は同一な反応条件で行った。
【００６４】
【表９】
【００６５】（３）検出用マイクロタイターウェルの調
製 配列番号１３２、１３３、１３４の塩基配列からなるＤ
ＮＡをＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステムズ社
製）で化学合成し、それぞれプローブＢ１Ａ１、プロー
ブＢ１Ａ２、プローブＢ１Ａ３と名付けた。
製 配列番号１３２、１３３、１３４の塩基配列からなるＤ
ＮＡをＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステムズ社
製）で化学合成し、それぞれプローブＢ１Ａ１、プロー
ブＢ１Ａ２、プローブＢ１Ａ３と名付けた。
【００６６】（４）マイクロタイターウェルを用いたハ
イブリダイゼーション法による検出 実施例１と同様な方法でプローブをマイクロタイターウ
ェルへ固定し、実施例１と同様な方法で、マイクロタイ
ターウェルを用いたハイブリダイゼーション法による検
出を行なった。その結果は表１０に示されるとおりであ
る。なお、吸光度による測定（Ｏ．Ｄ．４１５ｎｍ）で
０．２以上の値を示したものが陽性である。
イブリダイゼーション法による検出 実施例１と同様な方法でプローブをマイクロタイターウ
ェルへ固定し、実施例１と同様な方法で、マイクロタイ
ターウェルを用いたハイブリダイゼーション法による検
出を行なった。その結果は表１０に示されるとおりであ
る。なお、吸光度による測定（Ｏ．Ｄ．４１５ｎｍ）で
０．２以上の値を示したものが陽性である。
【００６７】
【表１０】
【００６８】陽性コントロール検体では、すべてのプロ
ーブで発色がみられたが、Ｂ１Ａ３プローブを用いた
時、最も発色が強かった。特にＰＣＲ反応液１を使用し
た時の陽性コントロールの発色が強く、陰性コントロー
ルの発色が最も低く、そのコントラストが明瞭であっ
た。そこで、Bacillus anthracisの目的遺伝子の検出に
用いるプローブはＢ１Ａ３プローブを使用し、プライマ
ーはＢ１Ｆ１、Ｂ１Ｒ１を使用することにした。
ーブで発色がみられたが、Ｂ１Ａ３プローブを用いた
時、最も発色が強かった。特にＰＣＲ反応液１を使用し
た時の陽性コントロールの発色が強く、陰性コントロー
ルの発色が最も低く、そのコントラストが明瞭であっ
た。そこで、Bacillus anthracisの目的遺伝子の検出に
用いるプローブはＢ１Ａ３プローブを使用し、プライマ
ーはＢ１Ｆ１、Ｂ１Ｒ１を使用することにした。
【００６９】従って本発明の検出セット（１）を用いる
ことで、それぞれBacillus anthracis遺伝子を同一検出
条件において短時間で正確に検出が可能であった。
ことで、それぞれBacillus anthracis遺伝子を同一検出
条件において短時間で正確に検出が可能であった。
【００７０】以上のように、実施例１と同一な条件、Ｐ
ＣＲのプライマーのアニーリング温度が４５〜６５℃
で、増幅反応液のｐＨが７．０〜１０．０であり、ハイ
ブリダイゼーション法におけるプローブの反応温度が２
０〜７０℃で、反応液のｐＨが６．０〜８．０で、塩濃
度が０．０１〜１０．０Ｍである同一な条件で、本発明
の検出セット（１）を用いBacillus anthracis遺伝子の
検出、検出セット（１１）を用いNaegleria fowleri遺
伝子の検出、検出セット（２４）を用いRicinus遺伝子
を短時間で正確に検出が可能であった。
ＣＲのプライマーのアニーリング温度が４５〜６５℃
で、増幅反応液のｐＨが７．０〜１０．０であり、ハイ
ブリダイゼーション法におけるプローブの反応温度が２
０〜７０℃で、反応液のｐＨが６．０〜８．０で、塩濃
度が０．０１〜１０．０Ｍである同一な条件で、本発明
の検出セット（１）を用いBacillus anthracis遺伝子の
検出、検出セット（１１）を用いNaegleria fowleri遺
伝子の検出、検出セット（２４）を用いRicinus遺伝子
を短時間で正確に検出が可能であった。
【００７１】
【発明の効果】本発明の検出セットを用いることによ
り、人体に重大な影響を及ぼす複数の病原微生物又は生
物由来毒素を、短時間で的確に特定することができる。
従って、本発明の検出セットは、病原微生物又は生物由
来毒素による汚染の拡大防止、犯罪の迅速な解決及び当
該病原菌及び毒素に対する適切な治療法の決定に大きく
寄与する。
り、人体に重大な影響を及ぼす複数の病原微生物又は生
物由来毒素を、短時間で的確に特定することができる。
従って、本発明の検出セットは、病原微生物又は生物由
来毒素による汚染の拡大防止、犯罪の迅速な解決及び当
該病原菌及び毒素に対する適切な治療法の決定に大きく
寄与する。
【００７２】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> WAKUNAGA PHARMACEUTICAL CO., LTD.
<120> Detection kits of pathogenic microbacterium and toxins
<130> P05771312
<140>
<141>
<160> 134
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
aacgatagct cctacatttg gag 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ttaattcact tgcaactgat ggg 23
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
cggtatagaa cctggcat 18
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
tcgagcgccc cgcaagggg 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
aaatctttcc cccgaagggc 20
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
gtagcaaatg gtacgtt 17
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
tcgagcgccc cgcaagggg 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
aaatctttcc cccgaagggc 20
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
gtagcaaatg gtacgtt 17
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
atccagcaat gccgcgtgtg 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
tagccggtgc ttattcttcc 20
<210> 12
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
gccagaatga tttct 15
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
atggcgagtg atactgcttg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
gcatcatcag agccacctaa 20
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
tcgtaatgtt agctgtatca tcatt 25
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
ggaaccacta gcacatctg 19
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
cccacaaggt tctcaccg 18
<210> 18
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
tccatccctg agaag 15
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
tgtgtagggt atgagagagt 20
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
ccatgaggct cacatttggt ta 22
<210> 21
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
ccatccagag ag 12
<210> 22
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
gttgtaaagc actttcg 17
<210> 23
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
tgtgggtaac gtcaacg 17
<210> 24
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
aggggttctc aag 13
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
taccaaccct tgacatggtg 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 26
catgcaacac ctgtgtgtgg 20
<210> 27
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 27
ttacggattg ca 12
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 28
taccaaccct tgacatggtg 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 29
catgcaacac ctgtgtgtgg 20
<210> 30
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 30
ttgcggatcg cag 13
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 31
cgtatctagt agatagaac 19
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 32
cgtaacgaca aacctacag 19
<210> 33
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 33
atggtgggct acttg 15
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 34
caggtatttt aaaagacttt tgggg 25
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 35
tatatacacg atcattattt ctaac 25
<210> 36
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 36
ttacgctacc tctaggcc 18
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 37
gcgaatactt aaaagatttt tgggg 25
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 38
gatatatata atcttctttt ctaac 25
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 39
ttttgattat atttgctacg tg 22
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 40
caaatatttt gaaggatttt tgggg 25
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 41
tatatacctg atcattcttt ctaac 25
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 42
tatattatta atgcttaaag tag 23
<210> 43
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 43
caagtatctt aaaagacttt tgggg 25
<210> 44
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 44
tatatgccag atcatttttt ctaac 25
<210> 45
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 45
ctataggacc attttttctt ataa 24
<210> 46
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 46
gttgatagcg caggacatgt taag 24
<210> 47
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 47
catgtagtca tctgttccag catc 24
<210> 48
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 48
cctcattagt tttgc 15
<210> 49
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 49
actatacaga cagatcattc aacc 24
<210> 50
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 50
ttaggagcag ttagaactac agac 24
<210> 51
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 51
ccacgagtag tttct 15
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 52
actgttcacg agttggatct 20
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 53
ggttctgtag aagtatgaaa c 21
<210> 54
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 54
gatgggaagg ttcaga 16
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 55
tactgttcgg gtatttgaag 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 56
tcccgtttca taaggcgagt 20
<210> 57
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 57
aatagtgacg agttag 16
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 58
taggtaaagt tacaggtggc 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 59
tagttcttga gctgttacac 20
<210> 60
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 60
taatgggaac ttacaa 16
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 61
acaagaatta gatgcacaag 20
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 62
cataagagac tttagaccca 20
<210> 63
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 63
taatgatact ctcgga 16
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 64
taacttgtgg atagacggaa 20
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 65
ctgtctgagt tatataaacc 20
<210> 66
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 66
aactttatct ataggt 16
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 67
tttaccttag acttctcgac 20
<210> 68
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 68
cacatataaa ttatttcgtt c 21
<210> 69
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 69
ctgatgattg atagtg 16
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 70
taggtacaac cggagatctg 20
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 71
aaggctcctt ggttagactc 20
<210> 72
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 72
atagttgggg gagact 16
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 73
gcagctcaga aattggcttc 20
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 74
atggtcatca ggttcaatcc 20
<210> 75
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 75
cctgttgatc caaca 15
<210> 76
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 76
agtcgtgaac gtgttgag 18
<210> 77
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 77
cctttcagaa tggccttc 18
<210> 78
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 78
acagcttagg agaac 15
<210> 79
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 79
ttttagtcct agccggcg 18
<210> 80
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 80
tcggcatcgt tgttgcgtg 19
<210> 81
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 81
tcgtaggcgc cgac 14
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 82
tacttcctgt tagctcaatg 20
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 83
gtgcatgaat tctcagatgc 20
<210> 84
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 84
cgtgatactg acggtta 17
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 85
ctctagttga gcacaaacac 20
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 86
atttgcatca cttccaagtg 20
<210> 87
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 87
ggaccatccg accttgc 17
<210> 88
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 88
ttacgcccta gccggtgg 18
<210> 89
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 89
taataaaagt gattgaccc 19
<210> 90
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 90
tcaaagacca ggaac 15
<210> 91
<211> 92
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 91
gatgaattcc aggaaccact agcacatctg ttaactttac agatgccgcg ggtgatccca 60
tgtacttaac atttacttct caggatggaa at 92
<210> 92
<211> 97
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 92
aaccaccaat tcactacaaa agtgattggc aaggattcta gagattttga tatctctcct 60
aaggtaaacg gtgagaacct tgtgggggaa gcttagc 97
<210> 93
<211> 96
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 93
ggttatttcc atcctgagaa gtaaatgtta agtacatggg atcacccgcg gcatctgtaa 60
agttaacaga tgtgctagtg gttcctggaa ttcatc 96
<210> 94
<211> 93
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 94
gctaagcttc ccccacaagg ttctcaccgt ttaccttagg agagatatca aaatctctag 60
aatccttgcc aatcactttt gtagtgaatt ggt 93
<210> 95
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 95
caggaaccac tagcacatc 19
<210> 96
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 96
cccccacaag gttctcac 18
<210> 97
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 97
atgtacttaa ca 12
<210> 98
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 98
cttctcagga tgga 14
<210> 99
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 99
attggcaagg attcta 16
<210> 100
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 100
tgttaagtac at 12
<210> 101
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 101
tagaatcctt gccaat 16
<210> 102
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 102
gatgaattcc gtatctagta gatagaacaa aaatgttttt tccttttttt ttttatttat 60
tcttatttat ctgttta 77
<210> 103
<211> 87
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 103
agtaatttag tcggtatagt tccatttagt ttcacaataa caagccattt aaatataaca 60
tttagtctat cttttttggt atggtgg 87
<210> 104
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 104
gctacttgtt tattaggttt ttatgaaagt ggtcttgctt ttattgctat attttatgta 60
aaaggtattc ctttt 75
<210> 105
<211> 80
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 105
gtattagttc cattttgggc attaatagaa gttataagtt ttatttttag atctgtaggt 60
ttgtcgttac gaagcttagc 80
<210> 106
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 106
tacttaaaca gataaataag aataaataaa aaaaaaaagg aaaaaacatt tttgttctat 60
ctactagata cggaattcat c 81
<210> 107
<211> 87
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 107
tagcccacca taccaaaaaa gatagactaa atgttatatt taaatggctt gttattgtga 60
aactaaatgg aactataccg actaaat 87
<210> 108
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 108
atacaaaagg aatacctttt acataaaata tagcaataaa agcaagacca ctttcataaa 60
aacctaataa acaag 75
<210> 109
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 109
gctaagcttc gtaacgacaa acctacagat ctaaaaataa aacttataac ttctattaat 60
gcccaaaatg gaacta 76
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 110
cgtatctagt agatagaaca 20
<210> 111
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 111
cgtaacgaca aacctacag 19
<210> 112
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 112
gtatggtggg ctacttgtt 19
<210> 113
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 113
tatggtgggc tacttg 16
<210> 114
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 114
atggtgggct acttg 15
<210> 115
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 115
tatggtgggc tacttgt 17
<210> 116
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 116
cgtatctagt agatagaac 19
<210> 117
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 117
cgtaacgaca aacctacaga 20
<210> 118
<211> 110
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 118
gaattaggta caaccggaga tctgcaccag atcctagcgt aattacactt gagaatagtt 60
gggggagact ttccactgca attcaagagt ctaaccaagg agcctttgct 110
<210> 119
<211> 110
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 119
agcaaaggct ccttggttag actcttgaat tgcagtggaa agtctccccc aactattctc 60
aagtgtaatt acgctaggat ctggtgcaga tctccggttg tacctaattc 110
<210> 120
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 120
taggtacaac cggagatctg 20
<210> 121
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 121
aaggctcctt ggttagactc 20
<210> 122
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 122
gtaattacac ttgaga 16
<210> 123
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 123
atagttgggg gagact 16
<210> 124
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 124
tctcaagtgt aattac 16
<210> 125
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 125
agtctccccc aactat 16
<210> 126
<211> 158
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 126
aattcaacga tagctcctac atttggaggg aatacagcaa acacagaatt tgaagcatta 60
acgagttact caatgagtct tttaatgcca ggttctatac cgtatcagca agctattcca 120
agtcagaaag aaatcccatc agttgcaagt gaattaaa 158
<210> 127
<211> 158
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 127
agcttttaat tcacttgcaa ctgatgggat ttctttctga cttggaatag cttgctgata 60
cggtatagaa cctggcatta aaagactcat tgagtaactc gttaatgctt caaattctgt 120
gtttgctgta ttccctccaa atgtaggagc tatcgttg 158
<210> 128
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 128
aacgatagct cctacatttg gag 23
<210> 129
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 129
atagctccta catttggagg 20
<210> 130
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 130
ttaattcact tgcaactgat ggg 23
<210> 131
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 131
ttaattcact tgcaactgat gg 22
<210> 132
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 132
ctcattgagt aactcgtt 18
<210> 133
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 133
actcattgag taactcgtta 20
<210> 134
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 134
cggtatagaa cctggcat 18
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 松永 裕也
広島県高田郡甲田町下甲立1624 湧永製薬
株式会社内
(72)発明者 新田 明広
広島県高田郡甲田町下甲立1624 湧永製薬
株式会社内
(72)発明者 前川尻 真司
広島県高田郡甲田町下甲立1624 湧永製薬
株式会社内
(72)発明者 藤本 康弘
広島県高田郡甲田町下甲立1624 湧永製薬
株式会社内
(72)発明者 永田 のぞみ
広島県高田郡甲田町下甲立1624 湧永製薬
株式会社内
(72)発明者 保科 定頼
東京都世田谷区北沢１−30−16
Ｆターム(参考） 4B024 AA13 AA14 BA38 CA03 CA04
CA09 FA02 HA14
4B063 QA01 QA18 QQ05 QQ42 QQ60
QR32 QR55 QR62 QS25 QS34
Claims (5)
- 【請求項１】 病原微生物又は生物由来毒素を検出する
ためのプライマー及びプローブからなるセットであっ
て、下記の（１）〜（３０）よりなる群から選ばれる１
又は２以上の検出セット：（１）配列番号１で示される
プライマー、配列番号２で示されるプライマー及び配列
番号３で示されるプローブからなるセット、（２）配列
番号４で示されるプライマー、配列番号５で示されるプ
ライマー及び配列番号６で示されるプローブからなるセ
ット、（３）配列番号７で示されるプライマー、配列番
号８で示されるプライマー及び配列番号９で示されるプ
ローブからなるセット、（４）配列番号１０で示される
プライマー、配列番号１１で示されるプライマー及び配
列番号１２で示されるプローブからなるセット、（５）
配列番号１３で示されるプライマー、配列番号１４で示
されるプライマー及び配列番号１５で示されるプローブ
からなるセット、（６）配列番号１６で示されるプライ
マー、配列番号１７で示されるプライマー及び配列番号
１８で示されるプローブからなるセット、（７）配列番
号１９で示されるプライマー、配列番号２０で示される
プライマー及び配列番号２１で示されるプローブからな
るセット、（８）配列番号２２で示されるプライマー、
配列番号２３で示されるプライマー及び配列番号２４で
示されるプローブからなるセット、（９）配列番号２５
で示されるプライマー、配列番号２６で示されるプライ
マー及び配列番号２７で示されるプローブからなるセッ
ト、（１０）配列番号２８で示されるプライマー、配列
番号２９で示されるプライマー及び配列番号３０で示さ
れるプローブからなるセット、（１１）配列番号３１で
示されるプライマー、配列番号３２で示されるプライマ
ー及び配列番号３３で示されるプローブからなるセッ
ト、（１２）配列番号３４で示されるプライマー、配列
番号３５で示されるプライマー及び配列番号３６で示さ
れるプローブからなるセット、（１３）配列番号３７で
示されるプライマー、配列番号３８で示されるプライマ
ー及び配列番号３９で示されるプローブからなるセッ
ト、（１４）配列番号４０で示されるプライマー、配列
番号４１で示されるプライマー及び配列番号４２で示さ
れるプローブからなるセット、（１５）配列番号４３で
示されるプライマー、配列番号４４で示されるプライマ
ー及び配列番号４５で示されるプローブからなるセッ
ト、（１６）配列番号４６で示されるプライマー、配列
番号４７で示されるプライマー及び配列番号４８で示さ
れるプローブからなるセット、（１７）配列番号４９で
示されるプライマー、配列番号５０で示されるプライマ
ー及び配列番号５１で示されるプローブからなるセッ
ト、（１８）配列番号５２で示されるプライマー、配列
番号５３で示されるプライマー及び配列番号５４で示さ
れるプローブからなるセット、（１９）配列番号５５で
示されるプライマー、配列番号５６で示されるプライマ
ー及び配列番号５７で示されるプローブからなるセッ
ト、（２０）配列番号５８で示されるプライマー、配列
番号５９で示されるプライマー及び配列番号６０で示さ
れるプローブからなるセット、（２１）配列番号６１で
示されるプライマー、配列番号６２で示されるプライマ
ー及び配列番号６３で示されるプローブからなるセッ
ト、（２２）配列番号６４で示されるプライマー、配列
番号６５で示されるプライマー及び配列番号６６で示さ
れるプローブからなるセット、（２３）配列番号６７で
示されるプライマー、配列番号６８で示されるプライマ
ー及び配列番号６９で示されるプローブからなるセッ
ト、（２４）配列番号７０で示されるプライマー、配列
番号７１で示されるプライマー及び配列番号７２で示さ
れるプローブからなるセット、（２５）配列番号７３で
示されるプライマー、配列番号７４で示されるプライマ
ー及び配列番号７５で示されるプローブからなるセッ
ト、（２６）配列番号７６で示されるプライマー、配列
番号７７で示されるプライマー及び配列番号７８で示さ
れるプローブからなるセット、（２７）配列番号７９で
示されるプライマー、配列番号８０で示されるプライマ
ー及び配列番号８１で示されるプローブからなるセッ
ト、（２８）配列番号８２で示されるプライマー、配列
番号８３で示されるプライマー及び配列番号８４で示さ
れるプローブからなるセット、（２９）配列番号８５で
示されるプライマー、配列番号８６で示されるプライマ
ー及び配列番号８７で示されるプローブからなるセッ
ト、（３０）配列番号８８で示されるプライマー、配列
番号８９で示されるプライマー及び配列番号９０で示さ
れるプローブからなるセット。 - 【請求項２】 同一の反応条件下で検出可能な請求項１
記載の検出セット。 - 【請求項３】 同一の反応条件が、核酸増幅反応におけ
るプライマーのアニーリング温度：４５〜６５℃、反応
液のｐＨ：７．０〜１０．０である請求項２記載の検出
セット。 - 【請求項４】 同一の反応条件が、ハイブリダイゼーシ
ョン反応におけるプローブの反応温度：２０〜７０℃、
反応液のｐＨ：６．０〜８．０及び塩濃度：０．０１
〜 １０．０Ｍである請求項２又は３記載の検出セッ
ト。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか１項記載の検出
セットから選ばれる２種以上を用いることにより、複数
の病原微生物又は生物由来毒素を同一の条件で検出する
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001397191A JP2003189870A (ja) | 2001-12-27 | 2001-12-27 | 病原微生物又は毒素の検出セット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001397191A JP2003189870A (ja) | 2001-12-27 | 2001-12-27 | 病原微生物又は毒素の検出セット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003189870A true JP2003189870A (ja) | 2003-07-08 |
Family
ID=27603065
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001397191A Pending JP2003189870A (ja) | 2001-12-27 | 2001-12-27 | 病原微生物又は毒素の検出セット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003189870A (ja) |
-
2001
- 2001-12-27 JP JP2001397191A patent/JP2003189870A/ja active Pending
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