JP2003135053A - 静置液体培地中の細胞の成長速度の増大方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 静置液体培地中での細胞の成長速度の増大お
よびこれらの細胞中での遺伝子の発現の増大。 【解決手段】 静置液体培地へのゲル化剤の添加。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術的分野】本発明は、培地中でゲル化
剤を使用することによる静置液体培地中での細胞の成長
速度の増大方法およびこれらの細胞中の遺伝子の発現の
増大方法、ならびにこうした方法におけるキサンタンの
ようなゲル化剤の使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】人工栄養培地を使用するのに適した成長
条件は、細菌もしくは真菌、例えばビール酵母菌（Ｓ．
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、灰色かび症菌（Ｂ．ｃｉｎｅ
ｒｅａ）、Ｓ．トリティチ（Ｓ．ｔｒｉｔｉｃｉ）、
Ｍ．グリセア（Ｍ．ｇｒｉｓｅａ）、ジャガイモ疫病菌
（Ｐ．ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）もしくは苗立枯病菌（Ｒ．
ｓｏｌａｎｉ）のような多数の微生物について長年記述
された。こうした人工培地はまた、哺乳動物細胞もしく
は昆虫細胞培養物、および植物細胞培養物についても既
知である。これらの培地は例えば細胞培養物の使用に基
づく高スループット法でもまた使用される。従って、例
えばビール酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）はＨＴ
Ｓ実験における細胞に基づくアッセイで成功裏に使用さ
れている。しかしながら、プレート培地上での成長もし
くは発芽は真菌のような多数の異なる細胞型について可
能である一方、液体培地中での培養は可能でないかもし
くは非常に複雑かつ結果として満足できない（例えば錆
病菌、卵菌類）かのいずれかであることが同様に既知で
ある。第三の群の真菌、すなわち絶対的生物栄養性（ｂ
ｉｏｔｒｏｐｈｉｃ）真菌と呼ばれるものは、人工培地
上で維持することができない。これらはそれらの宿主の
生存細胞と長期の栄養関係に進入する真菌である。原則
として、液体培地中の細胞の培養は、細胞に栄養素が供
給されることを確実にするために、培地を継続的に徹底
的に混合すなわち振とうすることを必要とする。この理
由から、大部分の細胞、例えば真菌細胞は、液体培地を
振とうすることができずそして結果として静置であるＨ
ＴＳ法に乏しく適するかもしくは適しない。しかしなが
ら、通常、ＨＴＳ法は細胞の成長もしくは少なくとも生
存を必要とする。これに加えて、レポーター遺伝子が発
現されることが通常必要である。高い細胞密度の使用は
この情況でどうみても問題外である。高すぎる細胞密度
は光学密度もしくは蛍光の測定を不可能にするからであ
る。これらの問題は以下の実施例の助けを借りてさらに
明らかにすることができる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】挙げられた酵母真菌に
加え、固体培地および液体培地双方中で顕著な成長特性
を所有する他の真菌が存在する。この群の代表的なもの
は、植物病原性の担子菌トウモロコシ黒穂病菌（Ｕｓｔ
ｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）である。トウモロコシ黒穂
病菌（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）は二形性真菌であるとして記
述されている。二倍体段階において、それは完全培地中
で約２時間の世代時間を伴う酵母様の成長を表す（担子
胞子）。対照的に、第二の成長の形態すなわち二核糸状
体（ｄｉｋａｒｙｏｔｉｃ ｆｉｌａｍｅｎｔ）は人工
培地上で増殖しない。この理由から、二倍体の担子胞子
が、トウモロコシ黒穂病菌（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）が培養
される主形態である。至適の成長を達成するために、培
養物を振とうしながら成長させることが必要である。

【０００４】他方、トウモロコシ黒穂病菌（Ｕ．ｍａｙ
ｄｉｓ）の培養物を３８４穴ＭＴＰ

【０００５】

【外１】

【０００６】的に混合されない静置溶液に移す場合に
は、光学密度のいかなる増大も観察することが不可能で
あり（図１）；結果として成長は起こらない。従って、
こうした静置液体培地中ではトウモロコシ黒穂病菌
（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）細胞のような真菌細胞を成長させ
かつ使用することが可能でない。これは、とりわけ、使
用される標的、特定の酵素試験もしくは測定方法の特別
の特性により特定の実験配置においてインビトロ試験の
みが可能であるかもしくは望ましい場合に問題となる。
これらの標的は、とりわけ、膜タンパク質もしくはレセ
プターのような標的、および細胞からのその精製が困難
であるかもしくは該ポリペプチドの活性の喪失を伴うポ
リペプチドもまた包含する。

【０００７】さらに、構成的に発現されるレポーター遺
伝子をもつ細胞において、発現のいかなる増大も観察す
ることが不可能であるか、もしくは発現のごくわずかな
増大を観察することのみが可能であるかのいずれかであ
る（図２）。これは、今日まで、静置液体培地中で前述
の真菌細胞を使用することを不可能にしている。

【０００８】前述の問題は、結果として、新たな有効成
分の分類に属しかつ／もしくは新たな作用部位を有する
新規の、前述の例の場合は殺真菌性の有効成分の高スル
ープット探索で負の効果を有する。作用部位、すなわち
通例の様式では細菌宿主中で過剰発現させ、精製しかつ
インビトロＨＴＳアッセイで使用することができない、
標的もしくはポリペプチド、あるいはＤＮＡもしくはＲ
ＮＡは、従って、非常な困難を伴ってのみ到達可能であ
る。結果として、多数の興味深い標的のスクリーニング
は、技術的問題が原因で実施することができない。しか
しながら、問題のポリペプチドを発現しかつそれをイン
ビボで直接試験するのに適するこれらの標的を同定する
ことが可能であった生物体、例えば真菌の使用がまさに
頻繁である。しかしながら、上述された問題は、前述の
真菌のような特定の細胞もしくは生物体が本目的上使用
されることを今まで予防してきた。

【０００９】本発明の目的は、従って、静置液体培地中
での細胞の成長およびポリペプチドの発現を確実にする
もしくは増大させるのに使用することができる方法を利
用可能にすることであった。

【００１０】本発明の情況内で、細胞の不十分な成長
は、それらが受器、例えばマイクロタイタープレートの
底部に沈降して酸素および栄養素の必要な供給がもはや
維持されないことをもたらすという事実に帰されるべき
であることが今や見出された。ウェル中の培地の酸素飽
和は、拡散の速度および空気との交換の表面積に依存
し、それらは上述された静置液体培地中で非常に低いの
みである。別の問題は、細胞成長の接触阻害と呼ばれる
ものである可能性がある（細胞は、それらが相互と接触
するや否や増殖することを停止する（例えば骨芽細
胞））。

【００１１】上述されたものに類似である問題は、液体
培養物中で沈降しかつ培地が例えば振とう機中で徹底的
に定常的に混合されてそれにより細胞に栄養素および酸
素が供給されることを確実にする場合にのみ有意の量で
成長することができる全部の細胞の場合に生じる。これ
は植物細胞、哺乳動物細胞もしくは昆虫細胞に影響を及
ぼす可能性がある。嫌気性条件下でもまた成長すること
が可能であるビール酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）細胞でさえ、酸素が供給される場合に顕著に向上さ
れた繁殖速度を表す。本明細書で使用されるところの
「細胞」という用語は、従って、ここで挙げられる全部
の細胞型および細胞培養型、すなわち、例えば、真菌細
胞、植物細胞、哺乳動物細胞および昆虫細胞を包含す
る。

【００１２】本発明の目的は、静止液体培地中での細胞
の成長を確実にした方法を利用可能にすることであり、
その方法は前記静置培地中で細胞を使用することを定常
的に可能にする。

【００１３】

【課題を解決するための手段】ゲル化剤の添加は３８４
穴ＭＴＰ中でトウモロコシ黒穂病菌（Ｕ．ｍａｙｄｉ
ｓ）が成長することを可能にする 驚くべきことに、液体培地への適する濃度のゲル化剤の
添加が、真菌細胞のような細胞が成長することを可能に
する（光学密度の増大およびレポーター遺伝子の上昇さ
れた発現に基づき立証することができる知見）ことが今
や見出された。

【００１４】この点について、本明細書で使用されると
ころの「ゲル化剤」という組織は、液体中でゲルの形成
あるいは構造（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）もしくは組織（ｔ
ｅｘｔｕｒｅ）および／または粘性の形成もしくは増大
をもたらす全部の物質、化合物もしくは物質の混合物を
包含する。代替の一定義において、培地中で細胞を懸濁
物に維持するのに適する物質を「ゲル化剤」と称する。

【００１５】本発明の助けを借りて、例えば細胞への酸
素および栄養素の供給は、今や、細胞を懸濁物に維持す
るゲル化剤を液体培地に添加することにより向上され
る。

【００１６】この点について、本発明は特定の培地に制
限されないが、但し、関する培地は使用される細胞培養
物および該細胞培養物が使用されるべきである目的に適
する。すなわち、培地は、例えば細胞の成長もしくは特
定の遺伝子産物の活性を測定するための測定方法（選択
された細胞培養物もしくは選択されたレポーター遺伝子
に関して使用されるべきである）に適していなければな
らない。従って、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を細胞
培養物中のレポーター遺伝子として使用する場合、培地
がそれ自身のいかなる蛍光も有しないことを確実にする
よう注意をはらわなくてはならない。従って、例えばジ
ャガイモブドウ糖培地（Ｔｓｕｋａｄａら、１９８８）
と呼ばれるものは、この培地がｅＧＦＰの波長範囲での
測定を妨害するため、ｅＧＦＰに基づく蛍光測定に適し
ないとみられる。細胞の成長の測定、通常光学密度の測
定もまた、ＯＤ測定に対するいかなる影響も有しない培
地を要求する（例えば血液を含有する培地はこの情況で
とりわけ適してはいない）。

【００１７】こうしたゲル化剤の一例はケルザン［Ｋｅ
ｌｚａｎ］（商標）（キサンタン多糖（キサンタンガ
ム））と呼ばれるものである。キサンタンが存在するこ
との結果として、細胞、例えば真菌細胞はウェル中に均
一に分布されたまま留まり、そしてこうして十分な酸素
および栄養素を供給され、そして接触阻害により影響を
及ぼされない。しかしながら、下により詳細に記述され
る他のゲル化剤を使用することもまた同様に可能であ
る。

【００１８】例えばトウモロコシ黒穂病菌（Ｕ．ｍａｙ
ｄｉｓ）細胞の場合、振とうフラスコ中での至適の倍加
時間はわずか２．５時間である。例として使用したトウ
モロコシ黒穂病菌（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）株Ｕｍ５１８の
場合、キサンタンを欠く静置液体培地中で６５時間の間
以内にいかなる倍加も観察することが可能でなかった。
検討された期間中に光学密度は約７５％だけのみ増大し
た。しかしながら、キサンタンを含有する培地中で、細
胞数は約２１時間後に既に倍加していた。キサンタンを
培地に添加する場合、トウモロコシ黒穂病菌（Ｕ．ｍａ
ｙｄｉｓ）の光学密度は６５時間以内に三倍になる。結
果として、真菌細胞の成長および増殖条件が顕著に改良
され、それによりそうでなければ静置培養の使用のみを
可能にする方法で該細胞を使用することを可能にする。

【００１９】

【発明の実施の形態】３８４穴ＭＴＰ中でのトウモロコ
シ黒穂病菌（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）レポーター株における
ＧＦＰの発現により例示されるところの遺伝子産物の発
現に対するゲル化剤の影響 成長試験が、既に、トウモロコシ黒穂病菌（Ｕ．ｍａｙ
ｄｉｓ）細胞の成長速度に対するキサンタンのようなゲ
ル化剤の正の影響を示している。成長を別にして、ポリ
ペプチドの発現は、以前に記述されたとおりこれまでは
同時に予防されており、それにより真菌細胞を例えばイ
ンビトロ試験系、例えばＨＴＳアッセイで使用すること
を不可能にしていた。頻繁に、試験されるべきである目
的のポリペプチドは、最初に、十分なシグナルを与える
活性試験を可能にするために増大された量で産生（過剰
産生）されなければならない。しかしながら、インビボ
法の場合は、ポリペプチドもしくはポリペプチド複合体
の活性もしくは活性の喪失をモニターするためにレポー
ターを使用することもまた頻繁に必要である。レポータ
ーの典型的な一例は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）であ
り、その発現はその特徴的な蛍光特性に基づいて測定す
ることができる。

【００２０】本発明の情況内で、従って、上述されたと
ころの増強された成長が遺伝子産物の発現に対する影響
もまた有するかどうか、および／または増強された成長
が活性試験もしくはＨＴＳに十分な発現を確実にするの
に十分であるかどうかを決定するために検討を実施し
た。本発明は、例として、レポーター遺伝子の発現に基
づきこれを検討することになっていた。トウモロコシ黒
穂病菌（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）の場合、前述のＧＦＰはこ
の目的上とりわけ適する。それはその活性のためにいか
なるさらなる外因性もしくは内在性の因子も必要としな
いためである。

【００２１】ＧＦＰ蛍光を測定するために、構成的ｏｔ
ｅｆプロモーター（実施例３を参照されたい）の制御下
にｅＧＦＰ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）：「増
強（ｅｎｈａｎｃｅｄ）緑色蛍光タンパク質」）を発現
するトウモロコシ黒穂病菌（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）株ＵＭ
Ａ３を利用する。バックグラウンドの蛍光を測定するた
めに、ＧＦＰ蛍光を野性型株Ｕｍ５１８における蛍光と
比較した。該株における蛍光は、各場合で、培地（最小
培地）中にキサンタンを含みおよび含まずに測定した。
さらなる対照として、使用された培地を、各場合でキサ
ンタンを含みおよび含まずにそれ自体で（細胞を含ま
ず）検討に包含した。ＧＦＰに基づく蛍光は、４８５ｎ
ｍ（１０ｎｍバンド幅）の励起波長および５１０ｎｍ
（１０ｎｍバンド幅）の測定波長で、最低３６個のウェ
ルで測定した（実施例４、図２）。

【００２２】この点について、株ＵＭＡ３の場合、ゲル
化剤としてキサンタンを培地中に含有したウェル中の蛍
光の顕著な増大が存在したことを観察することが可能で
あった。対照的に、培地中にいかなるキサンタンも含ま
ずにインキュベートしたＵＭＡ３株において、ＧＦＰ蛍
光のいかなる増大も観察することが可能でなかった。蛍
光のわずかな減少さえ観察された。同一のことがいかな
るＧＦＰレポーター遺伝子ももたない株Ｕｍ５１８に当
てはまる。ＧＦＰ蛍光の減少は、従って、ＧＦＰレポー
ター遺伝子に依存しないが、しかし他の原因によるはず
である。培地対照は同様に蛍光のいかなる有意の変化も
表さなかった（示されない）。

【００２３】本発明の情況内で、培地へのキサンタンの
ようなゲル化剤の添加が細胞中のタンパク質発現の有意
の増大につながることを立証することが結果的にさらに
可能であった。これはおそらく、これらのゲル化剤を添
加することにより達成される成長速度の上で立証された
向上を反映する。ゲル化剤は、結果として、細胞分裂の
速度の有意の増大をもたらすトウモロコシ黒穂病菌
（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）のような真菌細胞のような細胞の
培養における条件を創製する。これは、同様に有意によ
り高いタンパク質発現のレベルにより付随される。

【００２４】結果として、本発明は、以前はこれらの方
法に制限された程度までのみ到達可能であった、ＨＴＳ
もしくはＵＨＴＳのような方法で細胞に基づくインビボ
試験を実施することを可能にする。

【００２５】本発明は、結果として、培地がゲル化剤
（キサンタンもしくはポリアクリルアミドがとりわけ好
ましい）を含有することを特徴とする、静置液体培地中
での細胞、好ましくは真菌細胞の成長速度の増大方法に
関する。本発明の方法はトウモロコシ黒穂病菌（Ｕ．ｍ
ａｙｄｉｓ）の細胞培養物における使用にとりわけ好ま
しく適する。

【００２６】本発明は、同様に、培地がゲル化剤（キサ
ンタンもしくはポリアクリルアミドがとりわけ好まし
い）を含有することを特徴とする、静置液体培地中での
細胞培養物、好ましくは真菌細胞培養物中の遺伝子の発
現の増大方法に関する。本発明の方法はトウモロコシ黒
穂病菌（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）の細胞培養物における使用
にとりわけ好ましく適する。

【００２７】本発明は同様に、細胞培養物、好ましくは
真菌細胞培養物の成長速度を増大させるため、および細
胞、好ましくは真菌細胞中の遺伝子の発現を増大させる
ための静置液体培地中でのゲル化剤（キサンタンおよび
ポリアクリルアミドがとりわけ好ましい）の使用に関す
る。本発明により、トウモロコシ黒穂病菌（Ｕ．ｍａｙ
ｄｉｓ）の細胞培養物中でキサンタンを使用することが
可能であることがとりわけ好ましい。

【００２８】本発明は、同様に、真菌細胞培養物を使用
するインビボのＨＴＳもしくはＵＨＴＳアッセイにおけ
る静置液体培地中でのゲル化剤の使用に関し、キサンタ
ンがとりわけ好ましい。本発明により、トウモロコシ黒
穂病菌（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）の細胞培養物を使用するＨ
ＴＳもしくはＵＨＴＳアッセイにおいてキサンタンを使
用することが可能であることがとりわけ好ましい。 細胞培養物の成長速度の向上 上で説明されたとおり、例えばこれらの真菌／真菌細胞
をＨＴＳアッセイもしくは静置液体培地中で使用するこ
とを可能にする、ある種の真菌もしくは真菌細胞のため
の方法が既に開発されている。記述される方法におい
て、ある範囲の真菌細胞はいかなる成長の問題も有さ
ず、これらの細胞の使用に与えられたおよび与えられて
いる好みをもたらす。

【００２９】前述の問題が生じる真菌は、例えば静置液
体培地中で沈降および／もしくは集合する傾向がありそ
して従って一方で通例の測定方法にもはや利用可能でな
くかつ他方で酸素および栄養素の不十分な供給の結果と
してもはや成長しないかもしくは死ぬ真菌である。これ
らの真菌の一例は植物の病原体である担子菌、トウモロ
コシ黒穂病菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）であ
る。この真菌はこれまでかなりの時間の間検討されてお
り、そして従って重要な標的の研究、すなわち新規殺真
菌剤の攻撃点の探索の情況内でとりわけ重要でもまたあ
る。しかしながら、トウモロコシ黒穂病菌（Ｕ．ｍａｙ
ｄｉｓ）のこれらの成長特性のため、本生物体中で同定
かつ検討することが可能でありそして将来見出され続け
ることができるがしかし精製もしくはそれらの特別の活
性の問題により（膜タンパク質、レセプターなど）新規
活性成分について探索するためのインビトロアッセイに
これまでのところ到達可能でない、標的と呼ばれるもの
を使用することが、限られた程度までかつかなりの努力
を伴ってのみ可能であった。むしろ、研究者らは、他の
より適する生物体中の相同な遺伝子を同定しかつ／もし
くは発現させ、そして適切な場合は精製することを余儀
なくされている。

【００３０】しかしながら、これらの問題はトウモロコ
シ黒穂病菌（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）に制限されない。他の
細胞および他の真菌を、従って、この情況で好ましく使
用されるゲル化剤であるキサンタンのようなゲル化剤を
使用することにより、静置液体培地および結果としてＨ
ＴＳもしくはＵＨＴＳアッセイでの使用に類似の様式で
利用可能にすることができる。これらの他の細胞および
真菌は真菌、ビール酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）もまた包含し；嫌気的に生存するその能力のためこ
の真菌を静置液体培地中で使用することは既に可能にな
っている一方、本発明の方法はその成長およびポリペプ
チドを発現するその能力をさらに向上させることができ
る。 ゲル化剤 ゲルもしくは水性ゲルを形成することが可能でありかつ
安定剤、乳化剤もしくは増粘剤として、または親水コロ
イドを形成するもしくは多様な培地の特定の構造を作る
（ｔｅｘｔｕｒｅ）ために使用することができる、多数
の化合物、頻繁には生体高分子、しかしまた合成高分子
もしくはそれらの混合物が存在する。それらが本用語の
上の定義に従って本事例で示されるべきであるところの
これらの「ゲル化剤」は、食品加工においておよびまた
工業的目的上、例えば石油のため鑿井する（ｄｒｉｌｌ
ｉｎｇ）場合にも使用する。例えば、多様なポリマーが
真菌、アルテルナリア カシエ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ
ｃａｓｓｉａｅ）のような生物殺虫剤の発芽を促進す
る水性ゲルを形成する種子処理における処方のためにそ
れらを使用することもまた既知である（Ｓｈａｂａｎａ
ら、１９９７）。

【００３１】本発明の方法における使用にとりわけ良好
に適する合成ポリマーの一例はポリアクリルアミドであ
る。ポリアクリルアミドはアクリルアミド単量体を重合
することにより形成される。Ｎ，Ｎ’−メチレンビスア
クリルアミドのような二官能性化合物と架橋させること
によりゲルが形成される。これらのゲル中の孔径はゲル
の組成に依存して大きく変動する可能性があり、そして
本発明の方法においては所定の要件に調節することがで
きる。重合の開始剤として（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テト
ラメチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）と組み合わせで）頻
繁に使用される過硫酸アンモニウムを、頻繁に妨害する
過硫酸塩を回避するためにリボフラビンで置き換えるこ
ともまたできる。必要なフリーラジカルがリボフラビン
の光分解により形成される。

【００３２】その使用がとりわけ食品の実務で通例であ
る天然に存在する多糖化合物もとりわけ興味深い。キサ
ンタンおよび／もしくはケルザンの例を使用して下でよ
り詳細に説明されるそれらの特別の特性のため、これら
のポリマーは本発明の上述された方法に十分に適する。
下により詳細に記述する物質はこれらの多糖ゲル化剤の
例である。

【００３３】アラビノガラクタンはカラマツ種の芯材中
に５から３５％までの含量で天然に存在する。該多糖は
（１，３）結合によって連結されるβ−Ｄ−ガラクトピ
ラノシル残基の鎖よりなる。個々の基礎単位で、主鎖は
ガラクトースおよびアラビノース残基より構成される側
鎖を担持する。分枝の程度は高い。分子量は５０と７０
０００ダルトンとの間である。水性溶液中でのその球状
構造のため、溶液はニュートン液体として挙動する。粘
性は非常に低い。事実上、ｐＨに対する依存性は存在し
ない。６０％以上の濃度でのみ溶液の粘度が濃厚なペー
ストのものに変化する。その非常に良好な溶解性のた
め、アラビノガラクタンは低粘度でエーテル油、香料製
剤および甘味料中の乳化剤、安定剤および担体物質とし
て使用される。

【００３４】アミロース、デンプンを参照されたい。寒
天は、多様な紅藻（紅藻綱（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｃｅａ
ｅ）：ゲリジウム（Ｇｅｌｉｄｉｕｍ）スピーシーズ、
プテロクラディア（Ｐｔｅｒｏｃｌａｄｉａ）スピーシ
ーズおよびグラシラリア（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ）スピ
ーシーズ）からの熱水抽出により得られる。寒天および
カラギーナンを産生することに加え、これらの藻はガラ
クタンもまた産生する。寒天は厳密に定義された物質で
はない。それは１，４結合および１，３結合によって交
互に連結されるβ−Ｄ−ガラクトピラノースおよび３，
６−アンヒドロ−α−Ｌ−ガラクトピラノースよりな
る。鎖のいくつかは硫酸でエステル化される。寒天は、
硫酸含量により、アガロース（およそ１０個ごとのガラ
クトース残基がエステル化される）およびアガロペクチ
ン（より高程度のエステル化およびピルビン酸の使用）
に識別される。寒天は冷水に不溶性である。それは沸騰
される際にコロイド状に可溶性になる。寒天が冷却され
る場合、典型的なゲル形成を約４５℃で観察することが
できる。この点について、寒天を再度加熱する場合にゲ
ル化温度および融解温度が異なることは注目すべきであ
る。例えば、１．５％溶液は３２から３９℃までの温度
でゲル化し、そして６０から９７℃までで再度融解する
のみである。形成されたゲルの特性および安定性は濃度
および分子量に依存する。寒天は微生物学において固体
栄養培地として、および食品工業で増粘剤として既に使
用されている。

【００３５】アミロペクチン、デンプンを参照された
い。

【００３６】アルギネートは全部の褐藻の細胞壁に見出
される。アルギネートはアルカリを使用して褐藻（褐藻
綱（Ｐｈａｅｏｐｈｙｃｅａｅ）：ジャイアントケルプ
（Ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ｐｙｒｉｆｅｒａ）、ラミ
ナリア（Ｌａｍｉｎａｒｉａ）スピーシーズ、アスコフ
ィルム（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）スピーシーズおよび
サルガッスム（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ）スピーシーズ）か
ら抽出されることにより得られる。多糖はその場合、生
じる抽出物からカルシウム塩（Ｅ４０４）もしくはアル
ギン酸（Ｅ４００）として沈殿させる。アルギネート
は、１，４結合によって連結されるβ−Ｄ−マンヌロン
酸およびα−Ｌ−グルロン酸よりなる。分子量は３２０
００から２０００００ダルトンまでの範囲にあり、１８
０単位の重合度に対応する。アルカリ金属、マグネシウ
ム、アンモニアおよびアミンと形成される塩は水溶性で
ありかつ増粘剤として使用される。アルギネート溶液の
粘性はとりわけ分子量および与えられる対イオンに依存
する。とりわけ、多価陽イオン（例えばカルシウム）の
存在下では、それはこれらのイオンの濃度とともに増大
しそして従って所望の値に容易に調節することができ
る。ゲル、繊維および薄膜は、カルシウムイオンを選択
的に添加することもしくはアルギン酸ナトリウム溶液を
酸性化することにより製造することができる。アルギネ
ートは非常に効果的な増粘剤、安定剤およびゲル化剤で
ある。０．２５から０．５％までの濃度で、それらは例
えばケーキおよびペストリーの詰め物の安定性を向上さ
せ、そしてサラダドレッシング、チョコレートミルクお
よびアイスクリームを安定化する。

【００３７】カラギーナンは紅藻から抽出することがで
きるκ−カラギーナンのような硫酸を含有するガラクタ
ンである。カラギーナンは、１，３および１，４位で交
互にグリコシド的に（ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃａｌｌｙ）
連結されるＤ−ガラクトース−４−硫酸および３，６−
アンヒドロ−α−Ｄ−ガラクトースよりなり、水に容易
に可溶性であり、そして冷却される際に揺変性ゲルを形
成し、液状化はＮａ⁺イオンの存在下および比較的低い
ｐＨ値で開始する。

【００３８】セルロースは植物細胞壁の主構成要素であ
る。それはヘミセルロース、ペクチンおよびリグニンと
一緒に見出される。セルロースは１，４結合によって連
結されるβ−グルコピラノース残基よりなる。結晶構造
は鎖の構造により形成される。天然のセルロースでは、
結晶セグメントの比率は約６０％である。セルロース鎖
はまた、いくぶん折り畳まれてもおり、その結果分子内
水素結合を形成することができ、これらの結合は規則正
しい構造を付加的に増大させる（Ｏ（４）とＯ（６）、
およびまたＯ（３）とＯ（５）との間のＨ結合）。セル
ロースは高分子量を有する。起源に依存して、１０００
から１４０００までの重合度が見積もられる。その高度
に規則正しい構造およびその高分子量のため、セルロー
スは水に可溶性でない。セルロースの膨潤する能力はセ
ルロースの起源に依存して変動する一方、この能力は基
本的に低い。不十分な水和可能性および分散可能性は、
少量のカルボキシメチルセルロースを添加することによ
り顕著に向上される。安定であるセルロースはアルキル
化により多数の誘導体に転化することができ、それらは
その後修飾に依存して容易に膨潤可能かつ可溶性であ
る。これらの化合物はセルロース誘導体と称され、これ
らはそれらの多くかつ多様な特性のため、多くの応用を
有する。

【００３９】カードラン（β−（１，３）−Ｄ−グルカ
ンの一般名）は最も濃縮された形態のβ−グルカンであ
り、その元の製造経路はブドウ糖培地をアグロバクテリ
ウムビオバル（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｂ
ａｒ）１で醗酵させることを含んだ。カードランは親水
コロイド形成体かつ良好な構造形成体であり、そのゲル
は広範なｐＨ範囲にわたって安定である。

【００４０】デキストランは基質としてショ糖を使用し
てロイコノストック メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎ
ｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）およびＬ．
デキストラニクム（Ｌ．ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｍ）によ
り産生される。デキストランは、主として主鎖に１，３
によってしかしいくつかの場合には１，４および１，２
結合によってもまた連結される若干のブドウ糖側鎖を所
有するβ−１，６−グルカンである。

【００４１】フルセラランは紅藻フルセラリア ファス
チギアタ（Ｆｕｒｃｅｌｌａｒｉａｆａｓｔｉｇｉａｔ
ａ）から得られる。フルセラランは、Ｄ−ガラクトース
（４６から５３％まで）、３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガ
ラクトース（３３％）および双方の糖の硫酸塩（１６な
いし２０％）よりなる。構造はκ−カラギーナンのもの
に非常に類似である。本質的な差異は、κ−カラギーナ
ンが２個の糖残基ごとについて１個の硫酸残基を含有す
る一方、フルセラランにおいては３ないし４個の糖残基
ごとについて１個の硫酸残基が存在することである。フ
ルセラランは熱可逆ゲルを形成する。ゲル化する能力は
重合度、３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトースの含有
量、および溶液中に存在する陽イオンに依存する。カリ
ウムは固体のゲルを形成する一方、カルシウムはほとん
ど影響を有しない。ナトリウムはいかなるゲル形成も生
じさせない。糖はゲル形成に正の影響を有する。

【００４２】グリコーゲンはその構造がアミロペクチン
に似ている一方、それはなおより大きい分枝度およびよ
り大きい分子量（２５０００から９００００個までのＤ
−ブドウ糖単位）を表す。

【００４３】外層および胚を分離することによりシアモ
プシス テトラゴノルバ（Ｃｙａｍｏｐｓｉｓ ｔｅｔ
ｒａｇｏｎｏｌｂａ）（マメ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａ
ｅ））の種子から得られるグアーは、多糖グアランに加
えて、１０から１５％までの水、５から６％までのタン
パク質、２．５％の粗繊維および０．５から０．８％ま
での灰分を含有し、かつ、１，４結合によって連結され
るβ−Ｄ−マンノピラノシル残基よりなり、２残基ごと
に１，６結合によって側鎖としてα−Ｄ−ガラクトピラ
ノシル残基を所有する。グアランは高度に粘性の溶液を
形成し、その粘度は剪断応力に依存する。

【００４４】多様なアカシア属の種（アカシア（Ａｃａ
ｃｉａ）スピーシーズ）およびミモザ属の種の樹液から
樹脂として得られるアラビアゴムは、起源によって２６
００００から１１６００００ダルトンまでの範囲で変動
する可能性のある平均分子量を有する緊密に関係した多
糖の混合物である。糖残基Ｌ−アラビノース、Ｌ−ラム
ノース、Ｄ−ガラクトースおよびＤ−グルクロン酸が基
礎単位としてはたらき、主鎖は１，３−結合されたβ−
Ｄ−ガラクトピラノシル残基よりなる一方、側鎖は１，
６−結合される。アラビアゴムは極めて水溶性であり、
その結果５０％までの濃度を調製することが可能であ
る。他の多糖と対照的に、その粘性は高濃度でのみ増大
する。

【００４５】イナゴマメ粉（ｃａｒｏｂ ｂｅａｎ ｆ
ｌｏｕｒ）はカロブの樹木（イナゴマメ（Ｃｅｒａｔｏ
ｎｉａ ｓｉｌｉｑｕａ）の長角果（莢）から得られ
る。イナゴマメ粉を得るために、種子を粉砕し、そして
内乳胚を分離する。その場合、粉は約８８％のガラクト
マンノグルカン、５％の他の多糖、６％のタンパク質お
よび１％の無機物質を含有する。グアランの場合（「グ
アー」を参照されたい）と同様、イナゴマメ粉の多糖は
１，４結合によって連結されるβ−Ｄ−マンノピラノシ
ル残基の鎖よりなる。グアランと対照的に、α−Ｄ−ガ
ラクトピラノシル残基は４ないし５個のマンノース残基
ごとに側鎖（１，６結合）としてのみ存在する。分子量
は約３１００００ダルトンである。特性はグアランのも
のに対応する。同一濃度で、溶液の粘性はいくぶんより
低い。イナゴマメ粉は好都合な構造粘性を有する。

【００４６】ペクチンは柑橘類の果実の果皮およびリン
ゴ残滓から得られる。抽出物を濃縮して液体ペクチン調
製物を生じさせるか、もしくは噴霧乾燥およびドラム乾
燥によって粉末に加工するかのいずれかである。その主
構造において、ペクチンは、主に１，４−結合されたα
−Ｄ−ガラクツロン酸（ホモガラクツロナン）、ならび
に、そのバックボーンが１，４−結合されたα−Ｄ−ガ
ラクツロン酸および１，２−結合されたα−Ｌ−ラムノ
ースより交互に構成される分枝状領域（ラムノガラクツ
ロナン）よりなる。側鎖の主な基礎単位はアラビノース
およびガラクトースであり、それらは連結される。比較
的少量の、アピオース、Ｌ−アセル酸（ａｃｅｒｉｃ
ａｃｉｄ）、２−ケト−３−デオキシオクトン酸（ｄｅ
ｏｘｙｏｃｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、３−デオキシ−Ｄ
−キシロ−２−ヘプツロン酸のような単糖、および２種
の異なるメチル化された単糖もまたペクチン中に見出さ
れる。ペクチンの基礎単位は多様な部位でメタノールも
しくは酢酸によりエステル化されている可能性がある。
ペクチンは３から４までのｐＨでその最大の化学的安定
性を達成する。ペクチンは容易に膨潤可能な炭水化物で
ある。これに加え、それはまた約ｐＨ３の範囲およびカ
ルシウムイオンの存在下で熱可逆ゲルも形成する。ゲル
を形成する能力は分子量に正比例し、また、エステル化
の程度に反比例するが、但しそれ以外は同一の条件が支
配する。

【００４７】デンプンは植物における重要な貯蔵多糖で
あり、そして２つの画分に細分することができる。すな
わち、アミロースはα−１，４結合によって直鎖状に連
結されるブドウ糖分子よりなる非分枝状デンプンであ
る。トウモロコシデンプンにおいて、重合度は１０００
と２０００との間である。これらの鎖は、順に、溶液状
態に依存して、多かれ少なかれはっきりしたらせんであ
ると想像されるはずである。アミロースを冷水中に分散
させることは困難である。加熱する際に膨潤が起こり、
そしてデンプン糊が形成される。この糊はデンプン溶液
中の膨潤されたデンプン粒の系である。この点につい
て、グルチン化（ｇｌｕｔｉｎｉｚａｔｉｏｎ）温度に
言及がなされる。この温度はデンプンに依存して異な
る。デンプン糊を急速に冷却する場合、混合物が攪拌さ
れるかもしくはされないかに依存して異なる構造が形成
される。混合物が攪拌される場合、粘性が全般に増大す
る一方、混合物が攪拌されない場合にアミロースゲルが
形成される。アミロペクチンはブドウ糖分子間にα−
１，４およびα−１，６結合を含有する分枝状デンプン
である。この点について、鎖中の分枝はα−１，６結合
によって遂げられる。これらの分枝は約１５〜３０個の
ブドウ糖セグメントごとに不規則に存在する。アミロペ
クチンの分子量は非常に大きく、１０⁷から２×１０⁸ダ
ルトンまでの範囲にある。アミロペクチンはまたある限
界内でらせんを形成するとも想定されている。アミロペ
クチンは熱水に可溶性である。それは粘質もしくは付着
性である澄明な高度に粘性の溶液を生じさせる。アミロ
ースと対照的に、アミロペクチンは老化を受けるいかな
る傾向もほとんど有しない。非常に高濃度でを除き、い
かなる劣化およびゲル形成も観察することが可能でな
い。天然のデンプンはこれら２種のデンプン画分の混合
物であり、それらの比率は起源に依存する。大部分のデ
ンプンは約３０から４０％までのアミロースを含有し、
そして結果として主としてアミロペクチンよりなる。

【００４８】ブドウ糖、硝酸塩および無機塩よりなる栄
養培地を必要とするスギ枝枯菌核病菌種（スクレロティ
ウム グルカニクム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ ｇｌｕｃ
ａｎｉｃｕｍ）から得られるスクレログルカンは、濾過
後アルコールで沈殿される多糖である。スクレログルカ
ンは約３個の糖ごとに側鎖として１個のブドウ糖残基を
所有しかつ約１３００００ダルトンの分子量を有するβ
−１，３−グルカンである。スクレログルカンは水に容
易に可溶性であり、そして高い粘性を生じさせ、これら
の溶液は偽塑性の挙動を表す。

【００４９】植物アストラガルス（Ａｓｔｒａｇａｌｕ
ｓ）スピーシーズの滲出物から得られるトラガカントは
２つの画分よりなる植物ガムである。すなわち、トラガ
カンチンは水に可溶性であるが；対照的に、バソリンは
不溶性であり、可溶性画分は多様な多糖の混合物（Ｄ−
ガラクツロン酸、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−果糖、Ｄ−キ
シロースおよびＬ−アラビノースよりなる）である。ト
ラガカンチン分子はおよそ８４００００ダルトンの分子
量を有しかつ長く延びており、高度に粘性の溶液をもた
らし、その粘度は適用される剪断速度に依存する。

【００５０】キサンタンは例えばカンキツかいよう病菌
（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）お
よびいくつかの関係する微生物種により形成される。該
多糖はＫＣｌの存在下でイソプロパノールを用いてそれ
を沈殿させることにより培地から単離する。キサンタン
はモル比２８：３０：２０：１７：５．１〜６．３でＤ
−ブドウ糖、Ｄ−マンノース、Ｄ−グルクロン酸、酢酸
およびピルビン酸を含有するヘテログリカンである。分
子量は使用された製造条件および株に依存して２×１０
⁶から１２×１０⁶まで変動する。キサンタンは冷水およ
び熱水に容易に可溶性であり、生じるらせんが高い粘性
をもたらす三次元網状構造を生じさせる。従って、キサ
ンタンは高度に粘性の溶液中で偽塑性の挙動を表す。こ
の点について、粘性は大きな程度まで温度に非依存性で
ある。キサンタンの存在下で、溶液、乳剤およびゲルは
高い凍結融解安定性を所有する。キサンタンは飲料中で
の加圧安定化のためおよびエーテル油の乳剤を安定化さ
せるために使用される。その高程度の熱安定性のため、
それはまた缶詰食品中の増粘剤としても使用される。キ
サンタンの添加はデンプンゲル中の凍結融解安定性を向
上させる。高程度の安定性が休止状態で達成される一
方、剪断応力に関係した粘性の下落はわずかな流れ（ｆ
ｌｕｘ）をもたらす。キサンタンは本発明の方法におけ
る使用にとりわけ良好に適する。

【００５１】キサンタンの一例は前述のケルザン［Ｋｅ
ｌｚａｎ］（商標）（ＣＡＳ＃：１１１３８−６６−
２）である。ケルザン［Ｋｅｌｚａｎ］（商標）は１３
０℃の温度まで活性である。該ポリマーはわずかに陰イ
オン性であり、その理由から、陽イオン性である溶液と
混合する過程は注意をはらって実施しなければならな
い。ケルザン［Ｋｅｌｚａｎ］（商標）は本発明の上述
された方法における使用に非常にとりわけ適する。

【００５２】ゲル化剤の濃度および／もしくはそれらの
架橋度は変動させることができ、そして、一方で細胞が
沈降しないかもしくは十分にゆっくりとのみ沈降しかつ
他方で溶液はなおピペットで取ることができかつ行われ
るいかなる測定も妨害されないことを確実にするよう注
意がはらわれる限りは、単純な実験で、存在する培地、
使用される細胞および意図された目的に調節することが
できる。培地を細胞と混合する場合におそらく形成され
るかもしれない気泡が上方に上昇しかつ逃れることが可
能であるような濃度を調節することもまた重要である。
これらの気泡はそうでなければ測定を決定的に妨害する
とみられるからである。キサンタン（例えばケルザン
［Ｋｅｌｚａｎ］（商標））の場合、濃度は比較的広範
な範囲にわたって変動することができる。０．０６から
０．３重量％までの濃度がとりわけ適することが見出さ
れており、０．０８から０．２重量％までの濃度がとり
わけ好ましい。至適の結果は、０．０９と０．１２重量
％との間、とりわけ０．１重量％の濃度で得られた。

【００５３】通常、ゲル化剤を使用することができる温
度範囲は大きく、そして前述の論評もしくは専門家の論
文から推論することができる。細胞培養物について興味
深い１８から３８℃までの温度範囲は、ほとんどいかな
るゲル化剤に対しても問題を構成しない。

【００５４】キサンタン、とりわけケルザン［Ｋｅｌｚ
ａｎ］（商標）の場合、１６から３７℃までの温度、と
りわけ２２から３４℃までの温度で非常に良好な結果が
得られ、良好な結果はとりわけ２８ないし３０℃で得ら
れた。至適の結果は３０℃で得られた。

【００５５】通常、ゲル化剤のゲル形成効果は導入され
る容量に依存しない。例えば、キサンタン（例えばケル
ザン［Ｋｅｌｚａｎ］（商標））を、３８４穴ＭＴＰ中
の細胞培養物（１００μｌ）および三角フラスコ中の細
胞培養物（８００ｍｌ）中に、本発明に従って成功裏に
使用した。

【００５６】ケルザン［Ｋｅｌｚａｎ］（商標）に加
え、類似の特性を所有しかつ従って同一の様式で本発明
の方法において使用することができる多数の他のキサン
タンが存在する。特別の特性はまたデンプンやセルロー
スのような前述のゲル化剤でも見出されるはずであり、
これらは網状構造様の構造を形成する能力および結果と
して粘性の溶液の結果として、本発明の方法における使
用に前述のキサンタンもしくはケルザン［Ｋｅｌｚａ
ｎ］（商標）と同一の程度まで適する。しかしながら、
上の一覧は網羅的でない。むしろ、意図は、本発明によ
り使用することができるゲル化剤が、本発明の意味内
で、とりわけ、溶液中で粘性を発生させる能力ならびに
適切な場合は偽塑性かつ安定化する特性を特徴とする可
能性があるという事実に対し読者の注意を引くために、
示された一覧を使用することである。

【００５７】温度耐性、好ましいｐＨ、イオン依存性、
粘性もしくは網状構造の発生などに関しての変動する特
性を、使用される培地、使用される細胞、およびそれら
の要件、ならびにポリペプチドの発現および活性を観察
するために使用される測定方法に依存して各所定の場合
について適切なゲル化剤を見出すのに使用することがで
きる。このために、前述の特性を考慮に入れることがで
きるか、もしくはゲル化剤の適合性および至適の条件
を、明らかな様式で一連の実験で試験することができ
る。

【００５８】この点について、本発明の方法におけるそ
れらの使用のためにゲル化剤に対し置かれた基礎的な要
求は： ａ）培地中の懸濁物中で細胞を維持する能力。各場合に
適するゲル化剤の濃度を決定することが必要である、 ｂ）ゲル化剤は光学的かつ化学的に不活性でなければな
らないが、しかしながら、適切な場合はゲル化剤が栄養
源としてもまたはたらくことが可能である、 ｃ）ゲル化剤は細胞にいかなる浸透圧もはたらかせては
ならない、および ｄ）ゲル化剤は、適切な場合に、培地が（適切な場合は
細胞と一緒に）ピペットで取られることをなお可能にし
なければならない である。

【００５９】

【実施例】実施例１ トウモロコシ黒穂病菌（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）を成長させ
るための条件 トウモロコシ黒穂病菌（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）細胞は０．
６から１．０までのＯＤ₆₀₀までＰＤ培地中２８℃で培
養した。その後、それらを３２００ｒｐｍで１０分間遠
心分離し、最小培地で洗浄し、そしてその後培養物が
０．３のＯＤ₆₀₀を有したように、最小培地もしくは
０．１％ケルザン［Ｋｅｌｚａｎ］（商標）を含有する
最小培地に再懸濁した。これを達成するために以下の計
算を動員することができる： Ｖ（ｘ）＝Ｖ（ｙ）×ＯＤ₆₀₀（ｙ）／ＯＤ₆₀₀（ｘ） Ｖ 容量 ｘ：一夜培養物からのＰＤ培地中の真菌培養物 ｙ：ＭＴＰ試験に使用する、最小培地もしくは０．１％
ケルザン［Ｋｅｌｚａｎ］（商標）を含有する最小培地
中の真菌培養物。

【００６０】成長試験のためには、各場合で５０μｌの
細胞培養物を、マルチドロップ ピペッター（Ｍｕｌｔ
ｉｄｒｏｐ Ｐｉｐｅｔｔｅｒ）を使用して３８４穴Ｍ
ＴＰ（透明、グライナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ）から）にピ
ペットで取った。成長試験のために、吸収を６２０ｎｍ
の波長で測定した。プレートを室温で３日間インキュベ
ートした。光学密度を、時間０およびその後４時間ごと
にティーカン（Ｔｅｃａｎ）プラス読取り器で測定し
た。 使用されたトウモロコシ黒穂病菌（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）
株 トウモロコシ黒穂病菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉ
ｓ）株Ｕｍ５１８（ａ２ｂ２）およびＵＭＡ３（ａ２ｂ
２ ｐＣＡ１２３）を、実施した実験に使用した。 使用された培地 ＰＤ培地 ２．４％（ｗ／ｖ）ジャガイモブドウ糖培地 最小培地（ＭＭ） ０．３％（ｗ／ｖ）ＫＮＯ₃ ６．２５（ｖ／ｖ）のＨｏｌｌｉｄａｙ，１９７４に よる塩溶液 １．０％（ｗ／ｖ）ブドウ糖 塩溶液 （Ｈｏｌｌｉｄａｙ，１９７４による） １６０％（ｗ／ｖ）ＫＨ₂ＰＯ₄ ４．０％（ｗ／ｖ）Ｎａ₂ＳＯ₄ ８．０％（ｗ／ｖ）ＫＣｌ ４．０８％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １．３２％（ｗ／ｖ）ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ ８．０％（ｖ／ｖ）のＨｏｌｌｉｄａｙ，１９７４に よる微量元素 微量元素 （Ｈｏｌｌｉｄａｙ，１９７４による） ０．０６％（ｗ／ｖ）Ｈ₃ＢＯ₃ ０．１４％（ｗ／ｖ）ＭｎＣｌ・４Ｈ₂Ｏ ０．４％（ｗ／ｖ）ＺｎＣｌ₂ ０．４％（ｗ／ｖ）Ｎａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ ０．１％（ｗ／ｖ）ＦｅＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ ０．０４％（ｗ／ｖ）ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ。

【００６１】実施例２ トウモロコシ黒穂病菌（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）細胞および
ケルザン［Ｋｅｌｚａｎ］（商標）を使用する成長試験 トウモロコシ黒穂病菌（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）細胞の成長
速度に対する培地中の０．１％ケルザン［Ｋｅｌｚａ
ｎ］（商標）の存在の影響を、成長試験（Ｍ＆Ｍ）を使
用して検討した。このために、トウモロコシ黒穂病菌
（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）野性型株Ｕｍ５１８を、０．１％
ケルザン［Ｋｅｌｚａｎ］（商標）を含むおよびケルザ
ン［Ｋｅｌｚａｎ］（商標）を含まない最小培地中、Ｍ
Ｔプレート中でインキュベートした。対照のため、最小
培地それ自身および０．１％ケルザン［Ｋｅｌｚａｎ］
（商標）を含有する最小培地の光学密度を、それぞれこ
れとともに同時に測定した。吸収は３６個の独立したウ
ェル中で４時間ごとに６２０ｎｍの波長で測定した。測
定は３日（６５時間）にわたって実施し、測定は４時間
ごとに行った。

【００６２】実施例３ 液体培地中でのＧＦＰの発現を測定するためのプラスミ
ドｐＣＡ１２３の構築 ｏｔｅｆプロモーターを、８９０ｂｐのＰｖｕＩＩ／Ｎ
ｃｏＩフラグメントとしてプラスミドｐｏｔｅｆ−ＳＧ
（Ｓｐｅｌｌｉｎｇら、１９９６）から単離し、そし
て、ＰｖｕＩＩ／ＮｃｏＩで切断していたベクターｐＴ
ＥＦ−ＳＧ（Ｓｐｅｌｌｉｇら、１９９６）に連結し
た。ＳＧＦＰ遺伝子を、ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩで制限する
ことにより生じるプラスミドから切り出し、そしてｐＥ
ＧＦＰ−Ｎ１（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）か
ら）からのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩで切断されたＥＧＦＰ対
立遺伝子で置き換えた。生じるプラスミドをｐＣＡ１２
３と命名する。

【００６３】実施例４ レポーター遺伝子ＧＦＰの発現の測定 各場合において、試験されるべき株からの５０μｌの細
胞懸濁物を上述されたとおり３８４穴ＭＴＰ（黒色、グ
ライナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ）から）に移した。発現され
たＧＦＰによる相対的蛍光を、ティーカン（Ｔｅｃａ
ｎ）プラス読取り器中、４８５ｎｍ（バンド幅１０ｎ
ｍ）の励起波長および５１０ｎｍ（バンド幅１０ｎｍ）
の測定波長、ならびに７０の利得係数で、測定あたり３
回のフラッシュで蛍光測定的に測定した。測定は時間０
およびその後４時間ごとに行った（図２）。

【００６４】

【表１】

【図面の簡単な説明】

【図１】３８４穴ＭＴＰ中のトウモロコシ黒穂病菌
（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）細胞のケルザン［Ｋｅｌｚａｎ］
（商標）依存性の成長。成長は、時間に依存する６２０
ｎｍの波長での光学密度の増大として示す。黒丸により
印を付けられた曲線はケルザン［Ｋｅｌｚａｎ］（商
標）の存在下でのＯＤ₆₂₀の平均の増大を描く一方、白
三角により印を付けられた曲線はケルザン［Ｋｅｌｚａ
ｎ］（商標）を含まないＯＤ₆₂₀の変化を描く。それぞ
れケルザン［Ｋｅｌｚａｎ］（商標）を含むおよび含ま
ない、細胞を含まない培地対照のＯＤ₆₂₀の変化を描く
曲線は、それぞれ白四角および白菱形により描く。黒棒
は各場合の測定値の標準誤差を示す。

【図２】８３４穴ＭＴＰ中でのＧＦＰ蛍光のレポーター
株特異的およびケルザン［Ｋｅｌｚａｎ］（商標）依存
性の増大。該図は、３８４穴ＭＴＰ中のレポーター遺伝
子産物ＧＦＰの発現による相対的蛍光の時間依存性の変
化を示す。囲みおよび黒三角により印を付けられた曲線
はそれぞれケルザン［Ｋｅｌｚａｎ］（商標）を含むお
よび含まない株ＵＭＡ３における相対的蛍光を示す。菱
形および黒丸により印を付けられた曲線はそれぞれケル
ザン［Ｋｅｌｚａｎ］（商標）を含むおよび含まない株
Ｕｍ５２１における相対的蛍光を描く。測定の連続の標
準誤差もまた各場合で示す。

【図３】３８４穴ＭＴＰ中でのトウモロコシ黒穂病菌
（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）株の成長アッセイ。Ａ：トウモロ
コシ黒穂病菌（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）野性型株のＯＤ₆₂₀
での吸光度の動力学を、ティーカン（Ｔｅｃａｎ）ウル
トラ読取り器（菱形）を使用して３８４穴ＭＴＰ中で測
定した。対照として１種の株がはたらき、それにヒグロ
マイシンＢを２００μｇ／ｍｌの濃度で添加した
（×）。双方の株の初期ＯＤ₆₂₀は０．１８であった。
ヒグロマイシンを含まない株は開始後２０時間までＯＤ
の増大を示した一方、ヒグロマイシンＢの存在下で、同
一の株は光学密度の継続的減少を示した。Ｂ：３８４穴
ＭＴＰ中でのトランスジェニックトウモロコシ黒穂病菌
（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）株中でのＧＦＰ発現の動力学。Ｇ
ＦＰ発現が強力な構成的ＯＭＡプロモーターにより制御
されているトウモロコシ黒穂病菌（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）
株のＧＦＰ蛍光（四角）をティーカン（Ｔｅｃａｎ）プ
ラス読取り器で測定した。励起波長は４８５ｎｍであ
り、測定波長は５３５ｎｍであった。対照として、ＧＦ
Ｐを発現しないトウモロコシ黒穂病菌（Ｕ．ｍａｙｄｉ
ｓ）野性型株がはたらいた（三角）。時間が経つと、ト
ランスジェニック株は５０時間後に最大を伴いＧＦＰ蛍
光の増大を示した一方、野性型株は蛍光を示さない。よ
り低温と比較すると、ＯＤ₆₂₀の増大および蛍光の増大
はより速かった。実験手順：トウモロコシ黒穂病菌
（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）株は実施例で前に記述されたとお
り処理した。溶液は１×最小培地、０．１％ケルザン
（Ｋｅｌｚａｎ）を含有し、そしてアッセイは３０℃で
実施した。全部の実験は独立の二重物で反復した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ペーター・シユライアー ドイツ50674ケルン・ダツセルシユトラー セ16 (72)発明者 ダナ・シエネベルク ドイツ42327ブツペルタール・ドウイスベ ルクシユトラーセ44 Ｆターム(参考） 4B065 AA58X AA87X BB01 BB18 BC50 CA46

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 液体培地が細胞が沈降するのを防ぐのに
   適する濃度でゲル化剤を含有することを特徴とする、静
   置液体培養物中での細胞の成長速度の増大方法。
2. 【請求項２】 液体培養物が細胞が沈降するのを防ぐの
   に適する濃度でゲル化剤を含有することを特徴とする、
   静置液体培養物中での細胞中の遺伝子の発現の増大方
   法。
3. 【請求項３】 ゲル化剤がキサンタンであることを特徴
   とする、請求項１もしくは２記載の方法。
4. 【請求項４】 キサンタンが０．０８から０．３重量％
   までの濃度で存在することを特徴とする、請求項３記載
   の方法。
5. 【請求項５】 細胞が植物細胞、哺乳動物細胞もしくは
   昆虫細胞であることを特徴とする、請求項１ないし４の
   いずれか１つ記載の方法。
6. 【請求項６】 細胞が真菌細胞であることを特徴とす
   る、請求項１ないし４のいずれか１つ記載の方法。
7. 【請求項７】 真菌細胞がトウモロコシ黒穂病菌（Ｕｓ
   ｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）細胞であることを特徴と
   する、請求項６記載の方法。
8. 【請求項８】 その中に懸濁される細胞の成長速度を増
   大させるための、静置液体培地中でのゲル化剤の使用。
9. 【請求項９】 細胞中の遺伝子の発現を増大させるため
   の静置液体培地中でのゲル化剤の使用。
10. 【請求項１０】 ゲル化剤がキサンタンであることを特
    徴とする、請求項８もしくは９記載の使用。
11. 【請求項１１】 静置液体培養物中での細胞の成長速度
    の増大方法におけるゲル化剤の使用。