JP2003093056A - ｐ５３のＳｅｒ４６をリン酸化する酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ｐ５３のアミノ酸４６番目のセリン残基を
リン酸化する酵素を解明し、更にｐ５３のアポトーシス
誘導能の制御機構を解明した。その結果、全く新規な酵
素を提供する。 【解決手段】 ｐ５３のＳｅｒ４６をリン酸化する酵
素を完全に精製し、何者であるかを解明した。即ち、カ
ゼインキナーゼ２及びｐ５３ＤＩＮＰ１から成る酵素を
提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、癌抑制蛋白質ｐ
５３のアミノ酸４６番目のセリン残基（以下「Ｓｅｒ４
６」ともいう。）をリン酸化する酵素に関する。

【０００２】

【従来の技術】ｐ５３はある場合にはＧ１期停止を誘導
するが、別の場合にはアポトーシスを誘導する。この２
つの異なった経路の選択がどのようになされるかという
ことは重要な問題でありながら、そのメカニズムは不明
であったが、発明者らは、ｐ５３の新規リン酸化部位Ｓ
ｅｒ４６がアポトーシス誘導能を制御するという、つい
最近までは世界中の誰もが予想していなかったことを見
出した（Oda, K. et al., Cell, 102, 849-862, 200
0）。このストーリーは、３年前から発明者が提唱して
いた仮説に始まる。それは「ＤＮＡにあるタイプのダメ
ージが生じたときには、ｐ５３のある部位がリン酸化さ
れ、p21^WaflのようなＧ１期停止関係の遺伝子のプロモ
ーターにｐ５３が結合してその発現を誘導し、Ｇ１停止
が起きる。しかし、ＤＮＡに別のタイプのダメージが生
じたときには、ｐ５３の別の部位がリン酸化され、アポ
トーシス関係の遺伝子のプロモーターにｐ５３が結合し
てその発現を誘導し、アポトーシスが起きる」というも
のであった。さらに発明者は、ｐ５３のどの領域がアポ
トーシス誘導能を制御するかということも推定していた
（実験医学, 18: 2212-2218, 2000）。それは２つのド
メインである。１つはＤＮＡ結合ドメインのすぐＮ末端
側にある、プロリン・リッチ・ドメイン（アミノ酸６４
〜１０１）である。もう１つは、さらにそのＮ末端側に
ある、たった２０個のアミノ酸残基からなっているドメ
イン（アミノ酸４３〜６３）である。

【０００３】この２つのドメインのアミノ酸配列を眺め
ると、これまでの経験からしてin vivoのリン酸化部位
ではないかと推定される部位が３箇所（Ser46、Thr81と
Ser90）見つかった。特にＳｅｒ４６は次がＰｒｏであ
り、サイクリン依存性キナーゼあるいはＭＡＰキナーゼ
のファミリーでリン酸化される可能性が高い。そこで、
これらのリン酸化部位を特異的に認識する抗体を作製し
て実験を始めた。まずわかったことは、ガンマ線、紫外
線やアドリアマイシンなどで細胞のＤＮＡにダメージを
与えて経時的に追ってみると、Ｓｅｒ１５やＳｅｒ２０
にくらべてＳｅｒ４６のリン酸化がいつも遅れて起きる
ことであった。さらに、紫外線量を変える実験を行う
と、やはりＳｅｒ１５やＳｅｒ２０にくらべてＳｅｒ４
６のリン酸化には強い線量が必要とされ、アポトーシス
の時期と一致しているのではないかと感じられた。一昨
年７月に、ｐ５３ＡＩＰ１(p53 regulated apotosis in
ducing protein 1)の発現がｐ２１^Waflの発現にくらべ
ていつも遅れること、と上記Ｓｅｒ４６のリン酸化との
類似性に気付き、新たな研究を始めることになった。こ
の研究は予想以上におもしろい展開をみせた。Ｓｅｒ４
６をＡｌａに変えるとｐ５３のアポトーシス誘導能が大
きく低下することがわかり、さらに、多くのｐ５３標的
遺伝子のうちでｐ５３ＡＩＰ１の発現のみがＳｅｒ４６
の置換で大きく影響された。一方、アポトーシス誘導に
関与することが他のグループによって示唆されていたＢ
ａｘ、ＰＩＧ３やＮＯＸＡなどには影響がなかった。こ
れらの結果を得てから以前の文献を調べ直すと、Ｓｅｒ
４６やＰｒｏ４７が他のアミノ酸に変わった変異がいく
種類かのヒト癌で報告されていることがわかった。論文
を書いた人々はその意味がわからないまま書いたのだ
が、われわれの結果から考えると、これらはＳｅｒ４６
がリン酸化されなくなる変異である。

【０００４】以上のような結果から、発明者らは以下の
ようなモデルを考えた（実験医学,18: 2338-9, 200
0）。ＤＮＡに傷がついたとき、まずＳｅｒ１５やＳｅ
ｒ２０のリン酸化が起きてｐ５３は安定化・活性化さ
れ、ｐ２１^WaflのようなＧ１期停止関係の遺伝子、ある
いはｐ５３Ｒ２のようなＤＮＡ修復関係の遺伝子のプロ
モーターに結合してそれらの発現を引き起こす。しか
し、ＤＮＡの傷が深くて、Ｇ１期停止やＤＮＡ修復が不
可能になるとＳｅｒ４６キナーゼが活性化されて、ｐ５
３のＳｅｒ４６がリン酸化され、ｐ５３ＡＩＰ１遺伝子
のプロモーターへのアフィニティーが高まり、ｐ５３Ａ
ＩＰ１が発現して細胞はアポトーシスで死ぬのである。
また、最近ｐ５３ＤＩＮＰ１(p53 damage inducible nu
clear protein 1)遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌ
クレオチドで細胞を処理すると、ｐ５３ＤＩＮＰ１の発
現が抑えられ、かつＳｅｒ４６のリン酸化も抑えられる
ことが明らかにされ、ｐ５３ＤＩＮＰ１がｐ５３のＳｅ
ｒ４６をリン酸化する酵素（即ち、Ｓｅｒ４６キナー
ゼ）の構成要素であることが示唆されていた（Molecula
r Cell, 8,85-94, 2001）。従来の放射線療法やシスプ
ラチン、アドリアマイシンなどの癌治療法はいずれもＤ
ＮＡに傷をつけて、わざわざこの経路を活性化して癌細
胞にアポトーシスを起こさせていたと推定される。その
為に、正常細胞のＤＮＡにも傷がついて副作用が生じ
る。しかし、発明者らが解明したメカニズムは、ＤＮＡ
に傷を付けないで癌細胞にのみアポトーシスを起こさせ
て死滅させる方法の開発などに応用できると期待され
る。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ｐ５３のア
ミノ酸４６番目のセリン残基をリン酸化する酵素を解明
し、更にｐ５３のアポトーシス誘導能の制御機構を解明
することを目的として行われた研究の途上で生まれたも
のであり、その結果全く新規な酵素を提供するものであ
る。

【０００６】

【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】本
発明者らは、Ｓｅｒ４６をリン酸化する酵素を精製する
ことに初めて成功し、それが何者であるかを解明した。
即ち、この酵素がカゼインキナーゼ２（casein kinase
2、以下「ＣＫ２」ともいう。）を含むことを初めて明
らかにし、更に、この酵素がカゼインキナーゼ２とｐ５
３ＤＩＮＰ１（Molecular Cell, 8, 85-94, 2001）の複
合体であることを初めて明らかにした。即ち、本発明
は、カゼインキナーゼ２及びｐ５３ＤＩＮＰ１から成る
酵素である。カゼインキナーゼ２は、公知のキナーゼで
あって、真核細胞においてユビキタスに認められるセリ
ン／スレオニンキナーゼである。α又はα’サブユニッ
ト及びβサブユニットから構成された四量体（即ち、α
αββ又はαα’ββ）であり、オンコプロテインや転
写因子、ＤＮＡメタボリズムに関わる酵素などを基質に
し、細胞周期制御や種々のシグナル伝達に関与すること
が知られている(Litchfield, D.W., et al. Mol. Cell.
Biochem. 1993 Vol127,:p187-199, Allende, J.E. et
al., FASEB J. 1995, Vol9:p313-323)。一方、ｐ５３Ｄ
ＩＮＰ１は、2001年に同定された公知のｐ５３標的遺伝
子であり、ＤＮＡ傷害に応じて誘導される核蛋白（ａと
ｂの２種類がある。）である。ｐ５３ＤＩＮＰ１は、ｐ
５３依存性アポトーシスの誘導に重要な役割を果たして
いるが、その作用分子メカニズムは明らかにされていな
い(S. Okamura, et al. Molecular Cell 2001 Vol8: p8
5-94)。この酵素は、ＣＫ２とｐ５３ＤＩＮＰ１の複合
体であり、ｐ５３のＳｅｒ４６をリン酸化する。

【０００７】後述の実施例から、この酵素の大きさは約
２５０〜３５０ｋＤａである。一方、ＣＫ２の大きさは
約１３０〜１４４ｋＤａ（αサブユニット 約４４ｋＤ
ａ、α’サブユニット 約３７ｋＤａ、βサブユニット
約２８ｋＤａ）であり、ｐ５３ＤＩＮＰ１ａ及びｂは
それぞれ約４２ｋＤａ及び約３８ｋＤａである。従っ
て、この酵素はＣＫ２とｐ５３ＤＩＮＰ１の複合体では
あるが、これら以外も含まれている。また、本発明は、
配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列を有するそれ
ぞれのタンパク質から成る群から選択される少なくとも
一種を含み、かつ、配列番号４又は５のアミノ酸配列を
有するそれぞれのタンパク質から成る群から選択される
少なくとも一種を含む酵素である。この配列番号１〜５
のアミノ酸配列を有するタンパク質は、それぞれカゼイ
ンキナーゼ２のαサブユニット、同α’サブユニット、
同βサブユニット並びにｐ５３ＤＩＮＰ１ａ及びｂに相
当する。

【０００８】別の観点から見ると、本発明は、ｐ５３を
活性化させた細胞から精製された核分画物であり、該核
分画物にｐ５３を加えて反応させると、ｐ５３のアミノ
酸４６番目のセリン残基を含むペプチド断片であって該
セリン残基がリン酸化されたペプチド断片を含む抗原に
対する抗体と反応する核分画物であって、カゼインキナ
ーゼ２に対する抗体に反応する酵素である。本発明は、
更に、ｐ５３ＤＩＮＰ１に対する抗体に反応するこの酵
素である。核分画物は目的の細胞から適宜公知の方法で
回収する。核分画物に加えるｐ５３としては、大腸菌で
精製したｐ５３リコンビナントタンパクが好ましい。カ
ゼインキナーゼ２に対する抗体やｐ５３ＤＩＮＰ１に対
する抗体は、公知の方法で作製してもよいし、また市販
されているものを購入してもよい。核分画物が活性化さ
れたｐ５３を含むか否かは、ｐ５３のアミノ酸４６番目
のセリン残基を含むペプチド断片であって該セリン残基
がリン酸化されたペプチド断片に対する抗体に反応する
か否かによって判断する。このペプチド断片はｐ５３の
４６番目のセリン残基を含む少なくとも４〜５のアミノ
酸配列から成り、このセリン残基がリン酸化されている
ものであればよく、通常はこのセリン残基からアミノ酸
５個程度離れたＫＬＨ等のキャリアータンパクと結合さ
せて用いる。

【０００９】この細胞は、紫外線照射、γ線照射、酸化
的ストレス、又は種々の抗癌剤(シスプラチン、エトポ
シド、アドリアマイシンなど)の投与等を受けることに
よりＤＮＡに傷害を受け、その結果ｐ５３は活性化され
るが、浸透圧刺激ではこの誘導はされない。また、前記
精製は如何なる公知の方法で行ってもよいが、特に、ハ
イドロキシアパタイトカラムによる精製分離、ゲルろ過
カラムによる精製分離、及び陰イオン交換カラムによる
精製分離の少なくとも一つの工程で行われ、更に任意に
陽イオン交換カラムによる精製及びハイドロフォービッ
クカラムによる精製のいずれかの工程で行われてもよ
い。通常、これらの工程のうち少なくとも２〜３段階の
異なる生成過程を組み合わせて行うことが好ましい。

【００１０】本発明の酵素を何らかの方法で癌細胞に注
入すれば、癌細胞にアポトーシスを誘導して死滅させる
ことができる。また、この酵素のキナーゼ活性を特異的
に活性化するような薬剤をスクリーニングすれば、この
ような薬剤は抗癌剤として働く。更に、この酵素の活性
を特異的に阻害するような薬剤をスクリーニングすれ
ば、このような薬剤は抗癌剤治療時の副作用軽減剤とし
て働く。即ち、本発明はまた、これらいずれかの酵素を
有効成分とする含む癌の治療薬、これらのいずれかの酵
素を有効成分とする、ｐ５３を特異的に活性化させる薬
剤のスクリーニング剤、及びこれらのいずれかの酵素を
有効成分とする、該酵素の活性を阻害させる薬剤のスク
リーニング剤を提供するものである。本発明の酵素を公
知の方法により処方して、これら薬剤を構成すればよ
い。また、本発明は、これらいずれかの酵素の癌の治療
薬としての使用、これらいずれかの酵素の、ｐ５３を特
異的に活性化させる薬剤のスクリーニング剤としての使
用、及びこれらいずれかの酵素の、該酵素の活性を阻害
させる薬剤のスクリーニング剤としての使用である。

【００１１】

【実施例】以下、実施例にて本発明を例証するが、本発
明を限定することを意図するものではない。 （１）まず、ＤＮＡ傷害後に誘導される酵素のリン酸化
活性を調べた。ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７細胞(ATCC製)
（以下「ＭＣＦ−７細胞」という。）を、10% Fetal bo
vine serum(GIBCO BRL社製)含有のDMEM培地(SIGMA社
製)中で、15cm²ディッシュ(Corning社製)にほぼ90%コン
フルエントの状態まで培養した。そこに、ドキソルビシ
ン（Doxorubicin、SIGMA社製、アドリアマイシン(ADD)
と同義)水溶液を終濃度が3μMになるように培養液中に
添加した。インキュベーターに静置し、各時間後に細胞
を回収した。氷冷中で、1ディッシュの細胞につき500μ
lの細胞質抽出バッファー(10mM HEPES pH7.9, 2mM MgCl
₂, 0.1mM EDTA, 0.1mM EGTA, 1% Nonidet NP-40, DTT 1
mM,Na₃VO₄ 1mM, NaF 5mM, PMSF 0.5mM, KCl 10mM, leup
eptin 5μg/ml, antipain 5μg/ml, chymostatin 5μg/
ml, pepstatinA 2μg/ml)に懸濁して可溶化した。遠心
分離(15000rpm×15分)後の沈殿物に、100μlの核抽出バ
ッファー(10mM HEPES pH7.9, 2mM MgCl₂, 0.1mM EDTA,
0.1mM EGTA, 1% Nonidet NP-40, DTT 1mM, Na₃VO₄ 1mM,
NaF 5mM, PMSF 0.5mM, KCl 10mM, NaCl 500mM, leupep
tin 5μg/ml,antipain 5μg/ml, chymostatin 5μg/ml,
pepstatinA 2μg/ml)を加えてよく懸濁し、遠心分離
(15000rpm×15分)後の上清を終濃度10mg/mlに調製した
ものを核抽出液とした。

【００１２】一方、リン酸化部位としてヒトｐ５３のア
ミノ酸４６番目のセリン残基を含む下記配列のペプチド
をペプチド合成機を用いて作製した。 ＭＤＤＬＭＳ（ＰＯ_３Ｈ_２）ＰＤＤＩＥＱＣ（配列番号
６） ここで、Ｓ（ＰＯ_３Ｈ_２）はリン酸化セリン残基を表
す。このリン酸化ペプチドをキャリアータンパク質であ
るＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin）と共有結合さ
せて、免疫源とした。この免疫源とアジュバントのエマ
ルジョンをウサギの背後部皮下に注射し免疫した。５週
間後にこのウサギの耳朶静脈より採血した。この抗血清
をさらに２段階のアフィニティークロマトグラフィーで
精製し、これを「P53-Ser46のリン酸化抗体」とした（O
da, K. et al., Cell, 102, 849-862, 2000）。次に、
これらを用いて核抽出液の酵素活性を測定した。ヒトｐ
５３のアミノ酸全長とグルタチオン-ｓ-トランスフェラ
ーゼ(GST)との融合タンパク質（以下「GST-p53」とい
う。）を、活性測定用の基質として使用した。核抽出液
10μgとGST-p53 1μgをキナーゼ反応バッファー（25mM
Tris-HCl(pH 7.5), 5 mMβ-glycerophosphate, 2mM DT
T, 0.1 mM Na₃VO₄, 10mMMgCl₂, 5mMATP）、40μl中に添
加し、30℃、30分保温した。反応液をSDSサンプルバッ
ファー（125mM Tris-HCl(pH 6.5), 45% Glycerol, 5 %S
DS, 5% B-mercaptoethanol, 0.125% BPB）を加えて5分
間100℃で加熱処理した。それを、10%SDS-PAGEゲル上で
分離し、P53-Ser46のリン酸化抗体を用いてWestern blo
t法により、GST-p53におけるリン酸化活性を検出した。
この結果を図１に示す。図中、ＡＤＲ−６ｈは、ドキソ
ルビシン添加６時間後の核抽出液とGST-p53基質とを反
応させたもの、ＡＤＲ−１２ｈは、ドキソルビシン添加
１２時間後の核抽出液とGST-p53基質とを反応させたも
の、Substrate(-)は、ドキソルビシン添加１２時間後の
核抽出液のみ、Lysate(-)は、上記基質のみを表す。図
１から、ドキソルビシン添加後の核抽出液とGST-p53基
質とを反応させたもののみが、Ｓｅｒ４６をリン酸化す
る酵素活性を示すことがわかる。

【００１３】（２）次に、ｐ５３のＳｅｒ４６をリン酸
化する酵素を精製した。（１）で明らかなように、ＭＣ
Ｆ−７細胞にドキソルビシンを添加して12時間後には、
Ｓｅｒ４６のリン酸化酵素の活性化が顕著に誘導されて
いる。その核抽出液を原料に、カラムクロマトグラフィ
ーによりｐ５３のＳｅｒ４６をリン酸化する酵素の精製
を施行した。まず、FPLC精製にはアマシャムファルマシ
ア社のAKTA explorer装置を用いた。Superose 6 HR(ア
マシャムファルマシア社)を接続し、核抽出液5mgを溶出
バッファー(50 mM Tris pH 7.4, 1 mM EDTA, 2.5 mM EG
TA,150 mM NaCl, 0.1 mM Sodium vanadat、5 % Glyecer
ol)を用いて、流速0.2ml/minの速度で1分画につき0.5ml
の容量で溶出した。各分画中のＳｅｒ４６リン酸化する
酵素活性を測定し、活性の分画を次の精製に用いた。次
に、MonoQ HR5/5(アマシャムファルマシア社)を接続
し、開始バッファー(50mM Tris pH 7.4, 1 mM EDTA, 2.
5 mM EGTA, 250 mM NaCl, 0.1 mM Sodium vanadat、5 %
Glyecerol)でカラムを平衡化した後、活性分画500μg
を、溶出バッファー(50 mM Tris pH 7.4, 1 mM EDTA,
2.5 mM EGTA, 500 mM NaCl, 0.1 mM Sodium vanadat、5
% Glyecerol)で0.3ml/minの速度で、1分画につき0.5ml
の容量でグラジエント溶出をした。各分画中の酵素活性
を測定した結果を図２に示す（図２中、ｐ-Ser46 Activ
ity）。この結果、塩濃度約330mMのFr.25に活性のピー
クが認められた。なお、図２中ｐ-Ser15 Activity及び
ｐ-Ser33 Activityは、比較のため、１５番目及び３３
番目のセリン残基をリン酸化したペプチドを抗原として
用いて得られたリン酸化抗体を用いて上記と同様の操作
を行ったものを示す。

【００１４】（３）次に、精製した酵素の同定を行っ
た。まず、In GelアッセイによりＳｅｒ４６リン酸化活
性を示す分子を同定した。（２）（図２）の陰イオン交
換カラムクロマトグラフィー（MonoQ）のいくつかの分
画（１，７，１５及び２５）について、GST-p53及びMye
lin basic proteinを基質として含むSDS-PAGEゲルをそ
れぞれ作製し、各精製分画を電気泳動後に脱SDS処理を
施行し、³²p-ATPの存在下でIn Gelアッセイを行いオー
トラジオグラフィーによりキナーゼ分子を同定した。こ
の結果を図３に示す。図３から、基質としてGST-p53を
用いた場合に、図２でｐ５３のＳｅｒ４６をリン酸化す
る酵素の認められた分画２５において強いｐ５３リン酸
化活性が認められた。しかし、ｐ５３を含まないMyelin
basic protein基質や基質なし（substrate(-)）につい
てはこのような活性は認められず、ＤＮＡ傷害後に誘導
される酵素はｐ５３と出合ったときのみ活性（即ち、リ
ン酸化活性）を示すことがわかる。このゲルろ過クロマ
トグラフィーの結果、精製した酵素は約２５０〜３５０
ｋＤａの大きさであることがわかった。この活性部分を
詳細に見ると更に２つの部分に分かれていることがわか
る。図４には精製分画におけるＳｅｒ４６リン酸化酵素
の銀染色像を示す（図中、ａとｂで示す。）。

【００１５】このSDS-PAGEゲルのａとｂの断片を切り出
して、２５ｍＭ重炭酸ナトリウム／５０％アセトニトリ
ル溶液で洗浄２回行った後、これらにトリプシンを含む
トリスバッファー（ｐＨ８．０）を加えて、３５℃で２
０時間の消化を行った。その後、サンプル溶液の７０％
容量をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に供した。（分析条件：Ｈ
ＰＬＣ装置：MAGIC 2002 (Michrom BioResources, In
c., USA) 、カラム：MAGIC 2002 (Michrom BioResource
s, Inc., USA)；溶媒Ａ：２％アセトニトリル／０．１
％ギ酸；溶媒Ｂ：９０％アセトニトリル／０．１％ギ
酸；流速：４００〜５００ｎｌ／分；グラジェント０
（分）５（Ｂ％）, ２５（分）６５（Ｂ％）, ２６
（分）１００（Ｂ％）, ２７（分）１００（Ｂ％）, ２
８（分）５（Ｂ％）； 質量分析装置：Q-Tof2 (Microm
ass, UK)；イオン化方式：Nanoflow-LC ESI；イオン化
モード：Positive mode；キャピラリー電圧：２ｋＶ；
コリジョンエネルギー：２０〜３５ｅＶ） このLC-MS/MS分析により、Ｓｅｒ４６リン酸化酵素のア
ミノ酸１次配列を決定したところ（ａ部分は、配列番号
１、ｂ部分は配列番号２）、図４のａ及びｂは、それぞ
れＣＫ２のα及びα’サブユニットであることが判明し
た。

【００１６】（４）次に、免疫沈降法を用いてＣＫ２が
精製した酵素に含まれていることを確認した。（２）の
分画２５から、ＣＫ２α特異抗体（サンタクルーズ社）
を用いて免疫沈降を施行し、上清及び免疫複合体のＳｅ
ｒ４６リン酸化活性を測定した。その結果を図５Ａに示
す。ＣＫ２α特異抗体を用いたときには、上清(Sup)中
の活性は完全に消失し、沈降分画(Pellet)に移行し、Ｃ
Ｋ２が沈殿物に含まれていることを示している。ＣＫ２
α特異抗体以外の抗体(IgG)を用いたときには沈殿物に
Ｓｅｒ４６リン酸化活性を示すものはない。

【００１７】（５）次に、免疫沈降法を用いてｐ５３Ｄ
ＩＮＰ１がＳｅｒ４６リン酸化酵素に含まれていること
を確認した。ＭＣＦ−７細胞にγ線３０Ｇｙ照射後、各
時間で回収し、細胞のライセートを調整した。各サンプ
ルをｐ５３ＤＩＮＰ１抗体で免疫沈降し、得られた免疫
沈降物を酵素源、ＧＳＴ−ｐ５３を基質としてキナーゼ
アッセイを行った。免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥし、
P53-Ser46のリン酸化抗体を用いてWestern blot法をお
こなった。その結果を図６に示す。リン酸化を起こす酵
素の中にｐ５３ＤＩＮＰ１が含まれていることがわか
る。ここで用いたｐ５３ＤＩＮＰ１抗体は以下のように
して調製した。Ｎ末端部にＨｉｓ残基を付加したｐ５３
ＤＩＮＰ１ａリコンビナントタンパクを大腸菌で発現さ
せ、Ｎｉ−キレーティングセロファースカラム（アマジ
ャムファルマシア社）で精製を行った。そのタンパクを
抗原としてウサギにアジュバントと共に免疫してポリク
ローナル抗体（ｐ５３ＤＩＮＰ１抗体）を作成した。こ
の抗体はｐ５３ＤＩＮＰ１ａとｐ５３ＤＩＮＰ１ｂの両
方を認識する。

【００１８】（６）ここでは、in vivoにおいてＣＫ２
とｐ５３ＤＩＮＰ１が複合体を形成していることを確認
した。ＭＣＦ−７細胞にアドリアマイシン処理を行い、
１２時間で細胞を回収した。氷冷中で、１ディッシュの
細胞につき５００μｌの免疫沈降バッファー（５０ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ Ｎａｃｌ、１
ｍＭ ＥＤＴＡ、２．５ｍＭ ＥＧＴＡ、０．１％ Ｔ
ｗｅｅｎ ２０、１０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１ｍＭ
ＮａＦ、０．１ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｖａｎａｄａｔ
ｅ、ＰＭＳＦ ０．５ｍＭ、ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ ５μ
ｇ／ｍｌ、ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ ５μｇ／ｍl、ｐｅ
ｐｓｔａｔｉｎＡ ２μｇ／ｍ１）を加えてよく懸濁し
てから超音波破砕した。遠心分離後の上清を終濃度１０
ｍｇ／ｍｌに調製したものを細胞抽出液とした。細胞紬
出液１ｍｇずつとり、各々１次抗体（抗ｐ５３ＤＩＮＰ
１抗体、抗ＣＫ２α抗体、非特異的抗体（ＩｇＧ））を
５μｇずつ加える。４℃で、１時間ゆっくりとローテー
トしたのち、プロテインＧ−セロファース４Ｂ（アマシ
ャムファルマシア社）を２０μｇずつ加えて再度４℃
で、１時間ゆっくりとローテートして遠心沈殿させた沈
殿物を１ｍｌの免疫沈降バッファーで４回洗浄する。サ
ンプルバッファー（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（Ｐ
Ｈ６．５）、４５％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、５％ＳＤＳ、５
％β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、０．１２５％
ＢＰＢ）で沈殿物を１００℃、５分加熱して溶出した。
得られた免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗Ｃ
Ｋ２α抗体、抗ＣＫ２β及び抗ｐ５３ＤＩＮＰ１抗体並
びに比較のため非特異的抗体（ＩｇＧ）を用いてｗｅｓ
ｔｅｒｎ ｂｌｏｔを行った。その結果を図７に示す。
この図から、抗ｐ５３ＤＩＮＰ１抗体と抗ＣＫ２α抗体
を用いて免疫沈降したものは、抗ＣＫ２α抗体（図７
Ａ）、抗ＣＫ２β（図７Ｂ）及び抗ｐ５３ＤＩＮＰ１抗
体（図７Ｃ）を用いたｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔのいず
れにおいても両者とも反応性を示した。このことはＣＫ
２、ＣＫ２β及びｐ５３ＤＩＮＰ１が複合体を形成して
いることを示している。以上の実施例から、ｐ５３のＳ
ｅｒ４６をリン酸化する酵素が、ＣＫ２及びｐ５３ＤＩ
ＮＰ１から成る複合体であることが解明された。

【００１９】

【発明の効果】本発明は、ｐ５３のアミノ酸４６番目の
セリン残基をリン酸化する酵素が、ＣＫ２及びｐ５３Ｄ
ＩＮＰ１から成る酵素であることを初めて解明し、ｐ５
３のアポトーシス誘導能の制御機構を解明することに成
功した研究の成果であり、全く新規な酵素を提供するも
のである。この新規な酵素は困難な精製過程を経て単離
され、その構造が明らかにされたものである。本発明の
酵素は癌細胞にのみ選択的にアポトーシスを誘導して死
滅させる新しい癌治療法の開発などに応用することがで
きる。更に、この酵素はそのキナーゼ活性を特異的に活
性化するような薬剤のスクリーニングに利用できる。そ
のような薬剤は新しい抗癌剤になるはずである。更に、
この酵素は、この酵素の活性を特異的に阻害するような
薬剤のスクリーニングに利用できる。そのような薬剤は
抗癌剤治療時の副作用軽減剤になるはずである。

【００２０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Science and Technology Corporation <120> ｐ５３のＳｅｒ４６をリン酸化する酵素 <130> PS01-1057 <160> 5 <210> 1 <211> 391 <212> PRT <213> casein kinase 2α <400> 1 Met Ser Gly Pro Val Pro Ser Arg Ala Arg Val Tyr Thr Asp Val Asn 1 5 10 15 Thr His Arg Pro Arg Glu Tyr Trp Asp Tyr Glu Ser His Val Val Glu 20 25 30 Trp Gly Asn Gln Asp Asp Tyr Gln Leu Val Arg Lys Leu Gly Arg Gly 35 40 45 Lys Tyr Ser Glu Val Phe Glu Ala Ile Asn Ile Thr Asn Asn Glu Lys 50 55 60 Val Val Val Lys Ile Leu Lys Pro Val Lys Lys Lys Lys Ile Lys Arg 65 70 75 80 Glu Ile Lys Ile Leu Glu Asn Leu Arg Gly Gly Pro Asn Ile Ile Thr 85 90 95 Leu Ala Asp Ile Val Lys Asp Pro Val Ser Arg Thr Pro Ala Leu Val 100 105 110 Phe Glu His Val Asn Asn Thr Asp Phe Lys Gln Leu Tyr Gln Thr Leu 115 120 125 Thr Asp Tyr Asp Ile Arg Phe Tyr Met Tyr Glu Ile Leu Lys Ala Leu 130 135 140 Asp Tyr Cys His Ser Met Gly Ile Met His Arg Asp Val Lys Pro His 145 150 155 160 Asn Val Met Ile Asp His Glu His Arg Lys Leu Arg Leu Ile Asp Trp 165 170 175 Gly Leu Ala Glu Phe Tyr His Pro Gly Gln Glu Tyr Asn Val Arg Val 180 185 190 Ala Ser Arg Tyr Phe Lys Gly Pro Glu Leu Leu Val Asp Tyr Gln Met 195 200 205 Tyr Asp Tyr Ser Leu Asp Met Trp Ser Leu Gly Cys Met Leu Ala Ser 210 215 220 Met Ile Phe Arg Lys Glu Pro Phe Phe His Gly His Asp Asn Tyr Asp 225 230 235 240 Gln Leu Val Arg Ile Ala Lys Val Leu Gly Thr Glu Asp Leu Tyr Asp 245 250 255 Tyr Ile Asp Lys Tyr Asn Ile Glu Leu Asp Pro Arg Phe Asn Asp Ile 260 265 270 Leu Gly Arg His Ser Arg Lys Arg Trp Glu Arg Phe Val His Ser Glu 275 280 285 Asn Gln His Leu Val Ser Pro Glu Ala Leu Asp Phe Leu Asp Lys Leu 290 295 300 Leu Arg Tyr Asp His Gln Ser Arg Leu Thr Ala Arg Glu Ala Met Glu 305 310 315 320 His Pro Tyr Phe Tyr Thr Val Val Lys Asp Gln Ala Arg Met Gly Ser 325 330 335 Ser Ser Met Pro Gly Gly Ser Thr Pro Val Ser Ser Ala Asn Met Met 340 345 350 Ser Gly Ile Ser Ser Val Pro Thr Pro Ser Pro Leu Gly Pro Leu Ala 355 360 365 Gly Ser Pro Val Ile Ala Ala Ala Asn Pro Leu Gly Met Pro Val Pro 370 375 380 Ala Ala Ala Gly Ala Gln Gln 385 390 <210> 2 <211> 350 <212> PRT <213> casein kinase 2α’ <400> 2 Met Pro Gly Pro Ala Ala Gly Ser Arg Ala Arg Val Tyr Ala Glu Val 1 5 10 15 Asn Ser Leu Arg Ser Arg Glu Tyr Trp Asp Tyr Glu Ala His Val Pro 20 25 30 Ser Trp Gly Asn Gln Asp Asp Tyr Gln Leu Val Arg Lys Leu Gly Arg 35 40 45 Gly Lys Tyr Ser Glu Val Phe Glu Ala Ile Asn Ile Thr Asn Asn Glu 50 55 60 Arg Val Val Val Lys Ile Leu Lys Pro Val Lys Lys Lys Lys Ile Lys 65 70 75 80 Arg Glu Val Lys Ile Leu Glu Asn Leu Arg Gly Gly Thr Asn Ile Ile 85 90 95 Lys Leu Ile Asp Thr Val Lys Asp Pro Val Ser Lys Thr Pro Ala Leu 100 105 110 Val Phe Glu Tyr Ile Asn Asn Thr Asp Phe Lys Gln Leu Tyr Gln Ile 115 120 125 Leu Thr Asp Phe Asp Ile Arg Phe Tyr Met Tyr Glu Leu Leu Lys Ala 130 135 140 Leu Asp Tyr Cys His Ser Lys Gly Ile Met His Arg Asp Val Lys Pro 145 150 155 160 His Asn Val Met Ile Asp His Gln Gln Lys Lys Leu Arg Leu Ile Asp 165 170 175 Trp Gly Leu Ala Glu Phe Tyr His Pro Ala Gln Glu Tyr Asn Val Arg 180 185 190 Val Ala Ser Arg Tyr Phe Lys Gly Pro Glu Leu Leu Val Asp Tyr Gln 195 200 205 Met Tyr Asp Tyr Ser Leu Asp Met Trp Ser Leu Gly Cys Met Leu Ala 210 215 220 Ser Met Ile Phe Arg Arg Glu Pro Phe Phe His Gly Gln Asp Asn Tyr 225 230 235 240 Asp Gln Leu Val Arg Ile Ala Lys Val Leu Gly Thr Glu Glu Leu Tyr 245 250 255 Gly Tyr Leu Lys Lys Tyr His Ile Asp Leu Asp Pro His Phe Asn Asp 260 265 270 Ile Leu Gly Gln His Ser Arg Lys Arg Trp Glu Asn Phe Ile His Ser 275 280 285 Glu Asn Arg His Leu Val Ser Pro Glu Ala Leu Asp Leu Leu Asp Lys 290 295 300 Leu Leu Arg Tyr Asp His Gln Gln Arg Leu Thr Ala Lys Glu Ala Met 305 310 315 320 Glu His Pro Tyr Phe Tyr Pro Val Val Lys Glu Gln Ser Gln Pro Cys 325 330 335 Ala Asp Asn Ala Val Leu Ser Ser Gly Leu Thr Ala Ala Arg 340 345 350 <210> 3 <211> 215 <212> PRT <213> casein kinase 2β <400> 3 Met Ser Ser Ser Glu Glu Val Ser Trp Ile Ser Trp Phe Cys Gly Leu 1 5 10 15 Arg Gly Asn Glu Phe Phe Cys Glu Val Asp Glu Asp Tyr Ile Gln Asp 20 25 30 Lys Phe Asn Leu Thr Gly Leu Asn Glu Gln Val Pro His Tyr Arg Gln 35 40 45 Ala Leu Asp Met Ile Leu Asp Leu Glu Pro Asp Glu Glu Leu Glu Asp 50 55 60 Asn Pro Asn Gln Ser Asp Leu Ile Glu Gln Ala Ala Glu Met Leu Tyr 65 70 75 80 Gly Leu Ile His Ala Arg Tyr Ile Leu Thr Asn Arg Gly Ile Ala Gln 85 90 95 Met Leu Glu Lys Tyr Gln Gln Gly Asp Phe Gly Tyr Cys Pro Arg Val 100 105 110 Tyr Cys Glu Asn Gln Pro Met Leu Pro Ile Gly Leu Ser Asp Ile Pro 115 120 125 Gly Glu Ala Met Val Lys Leu Tyr Cys Pro Lys Cys Met Asp Val Tyr 130 135 140 Thr Pro Lys Ser Ser Arg His His His Thr Asp Gly Ala Tyr Phe Gly 145 150 155 160 Thr Gly Phe Pro His Met Leu Phe Met Val His Pro Glu Tyr Arg Pro 165 170 175 Lys Arg Pro Ala Asn Gln Phe Val Pro Arg Leu Tyr Gly Phe Lys Ile 180 185 190 His Pro Met Ala Tyr Gln Leu Gln Leu Gln Ala Ala Ser Asn Phe Lys 195 200 205 Ser Pro Val Lys Thr Ile Arg 210 215 <210> 4 <211> 240 <212> PRT <213> p53Dinp1a <400> 4 Met Phe Gln Arg Leu Asn Lys Met Phe Val Gly Glu Val Ser Ser Ser 1 5 10 15 Ser Asn Gln Glu Pro Glu Phe Asn Glu Lys Glu Asp Asp Glu Trp Ile 20 25 30 Leu Val Asp Phe Ile Asp Thr Cys Thr Gly Phe Ser Ala Glu Glu Glu 35 40 45 Glu Glu Glu Glu Asp Ile Ser Glu Glu Ser Pro Thr Glu His Pro Ser 50 55 60 Val Phe Ser Cys Leu Pro Ala Ser Leu Glu Cys Leu Ala Asp Thr Ser 65 70 75 80 Asp Ser Cys Phe Leu Gln Phe Glu Ser Cys Pro Met Glu Glu Ser Trp 85 90 95 Phe Ile Thr Pro Pro Pro Cys Phe Thr Ala Gly Gly Leu Thr Thr Ile 100 105 110 Lys Val Glu Thr Ser Pro Met Glu Asn Leu Leu Ile Glu His Pro Ser 115 120 125 Met Ser Val Tyr Ala Val His Asn Ser Cys Pro Gly Leu Ser Glu Ala 130 135 140 Thr Arg Gly Thr Asp Glu Leu His Ser Pro Ser Ser Pro Arg Val Glu 145 150 155 160 Ala Gln Asn Glu Met Gly Gln His Ile His Cys Tyr Val Ala Ala Leu 165 170 175 Ala Ala His Thr Thr Phe Leu Glu Gln Pro Lys Ser Phe Arg Pro Ser 180 185 190 Gln Trp Ile Lys Glu His Ser Glu Arg Gln Pro Leu Asn Arg Asn Ser 195 200 205 Leu Arg Arg Gln Asn Leu Thr Arg Asp Cys His Pro Arg Gln Val Lys 210 215 220 His Asn Gly Trp Val Val His Gln Pro Cys Pro Arg Gln Tyr Asn Tyr 225 230 235 240 <210> 5 <211> 164 <212> PRT <213> p53Dinp1b <400> 5 Met Phe Gln Arg Leu Asn Lys Met Phe Val Gly Glu Val Ser Ser Ser 1 5 10 15 Ser Asn Gln Glu Pro Glu Phe Asn Glu Lys Glu Asp Asp Glu Trp Ile 20 25 30 Leu Val Asp Phe Ile Asp Thr Cys Thr Gly Phe Ser Ala Glu Glu Glu 35 40 45 Glu Glu Glu Glu Asp Ile Ser Glu Glu Ser Pro Thr Glu His Pro Ser 50 55 60 Val Phe Ser Cys Leu Pro Ala Ser Leu Glu Cys Leu Ala Asp Thr Ser 65 70 75 80 Asp Ser Cys Phe Leu Gln Phe Glu Ser Cys Pro Met Glu Glu Ser Trp 85 90 95 Phe Ile Thr Pro Pro Pro Cys Phe Thr Ala Gly Gly Leu Thr Thr Ile 100 105 110 Lys Val Glu Thr Ser Pro Met Glu Asn Leu Leu Ile Glu His Pro Ser 115 120 125 Met Ser Val Tyr Ala Val His Asn Ser Cys Pro Gly Leu Ser Glu Ala 130 135 140 Thr Arg Gly Thr Asp Glu Leu His Ser Pro Ser Ser Pro Arg Ala Arg 145 150 155 160 Lys Ser Cys Leu

【図面の簡単な説明】

【図１】ＤＮＡを傷害した核抽出液を用いた酵素反応液
のP53-Ser46リン酸化抗体によるウエスタンブロットを
示す図である。

【図２】ＤＮＡを傷害した核抽出液をSuperose 6で精製
した後、Mono Qカラムで精製したものを用いた酵素反応
液のP53-Ser46リン酸化抗体によるウエスタンブロット
を示す図である。

【図３】ＤＮＡを傷害した核抽出液の精製物のIn Gelア
ッセイを示す図である。

【図４】ＤＮＡを傷害した核抽出液の精製物のSDS-PAGE
ゲルの銀染色像を示す図である。

【図５】核抽出液の精製物（Ｓｅｒ４６リン酸化活性分
画）をＣＫ２α特異抗体を用いて免疫沈降したものを用
いた酵素反応液のP53-Ser46リン酸化抗体によるウエス
タンブロットを示す図である。

【図６】核抽出液をｐ５３ＤＩＮＰ１抗体を用いて免疫
沈降したものを用いた酵素反応液のP53-Ser46リン酸化
抗体によるウエスタンブロットを示す図である。

【図７】核抽出液を抗ｐ５３ＤＩＮＰ１抗体、抗ＣＫ２
α抗体、非特異的抗体（ＩｇＧ））を用いて免疫沈降し
たものの抗ＣＫ２α抗体（Ａ）、抗ＣＫ２β（Ｂ）及び
抗ｐ５３ＤＩＮＰ１抗体（Ｃ）によるウエスタンブロッ
トを示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/53 Ｍ 33/566 33/566 Ａ６１Ｋ 37/52 (72)発明者 田中 知明 千葉県印旛郡富里町根木名1049−１ (72)発明者 中村 祐輔 神奈川県横浜市青葉区あざみ野１−17−33 (72)発明者 荒川 博文 東京都杉並区善福寺１−21−29 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 BA11 BB50 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 4B050 CC01 DD07 LL01 LL03 4B063 QA18 QQ27 QR07 4C084 AA02 AA07 BA01 BA08 BA22 BA23 BA44 CA18 CA27 CA56 DC25 NA14 ZB262

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 カゼインキナーゼ２及びｐ５３ＤＩＮＰ
   １から成る酵素。
2. 【請求項２】 配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配
   列を有するそれぞれのタンパク質から成る群から選択さ
   れる少なくとも一種を含み、かつ、配列番号４又は５の
   アミノ酸配列を有するそれぞれのタンパク質から成る群
   から選択される少なくとも一種を含む酵素。
3. 【請求項３】 前記配列番号１〜５のいずれかのアミノ
   酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換
   又は付加された請求項２に記載の酵素。
4. 【請求項４】 ｐ５３を活性化させた細胞から精製され
   た核分画物であり、該核分画物にｐ５３を加えて反応さ
   せると、ｐ５３のアミノ酸４６番目のセリン残基を含む
   ペプチド断片であって該セリン残基がリン酸化されたペ
   プチド断片を含む抗原に対する抗体と反応する核分画物
   であって、カゼインキナーゼ２に対する抗体に反応する
   酵素。
5. 【請求項５】 更に、ｐ５３ＤＩＮＰ１に対する抗体に
   反応する請求項４に記載の酵素。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵
   素を有効成分とする癌の治療薬。
7. 【請求項７】 請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵
   素を有効成分とする、ｐ５３を特異的に活性化させる薬
   剤のスクリーニング剤。
8. 【請求項８】 請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵
   素を有効成分とする、該酵素の活性を阻害させる薬剤の
   スクリーニング剤。
9. 【請求項９】 請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵
   素の癌の治療薬としての使用。
10. 【請求項１０】 請求項１〜５のいずれか一項に記載の
    酵素の、ｐ５３を特異的に活性化させる薬剤のスクリー
    ニング剤としての使用。
11. 【請求項１１】 請求項１〜５のいずれか一項に記載の
    酵素の、該酵素の活性を阻害させる薬剤のスクリーニン
    グ剤としての使用。