JP2003061663A - 微生物を用いたスフィンゴ糖脂質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規なエキソ型ガングリオシド分解酵素を産
生するエキソ型ガングリオシド分解酵素産生菌Paenibac
illus sp.と、新規なエキソ型ガングリオシド分解酵素
と、新規なエキソ型ガングリオシド分解酵素を生産する
製造方法とを提供すること。 【解決手段】 新規なエキソ型ガングリオシド分解酵素
は、エキソ型ガングリオシド分解酵素を生産するPaenib
acillus sp. TS12 ＦＥＲＭ Ｐ−１８４１６を培養す
ることによって製造することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、微生物を用いた
スフィンゴ糖脂質の製造方法に関するものである。詳細
には、ガングリオシドを分解する新規バクテリア、およ
び新規エキソグリコシダーゼとそれらの遺伝子並びにそ
れらを用いたスフィンゴ糖脂質の製造方法に関するもの
である。

【０００２】

【従来の技術】スフィンゴ糖脂質は、スフィンゴシン塩
基を含むセラミドを脂質部分として持つ糖脂質の総称
で、なかでもガングリオシドはシアル酸を分子内に有す
るスフィンゴ糖脂質の一群につけられた名称である。ガ
ングリオシドという名称は、神経節（ガングリオン）に
由来しているが、実際に脳や神経系に豊富に存在してい
る（Ledeen, R. W. (1989) Biosynthesis, metabolism,
and biological effectsof gangliosides, In Neurobi
ology of Glycoconjugates；Margolis, R. U. andR. K.
Margolis, eds）。ガングリオシドは、成長因子受容体
などの膜貫通型タンパク質の機能（多くはリン酸化）を
調節することで細胞増殖を制御したり、神経系では軸索
の伸長やシナプスの形成にも重要な機能を果たしている
と考えられている。一方、ある種の病原菌や毒素の受容
体としても注目されている。例えば、ある種のガングリ
オシドはインフルエンザウイルスのレセプターとして、
また、GM1ガングリオシドはコレラ毒素の受容体として
知られている。最近になって、ガングリオシドを含むス
フィンゴ糖脂質は、スフィンゴミエリンやコレステロー
ルとともに細胞膜ミクロドメインを形成し、同じくミク
ロドメインに集積するsrc-family キナーゼやGPI型タン
パク質と相互作用することで細胞機能を調節している可
能性が指摘されている。ガングリオシドは、分子内に十
数個のシアル酸を有しており、骨格となる中性糖鎖の構
造に基づいておよそ５つの系統に分類される。なかで
も、Galβ1-3GalNAcβ1-4Galβ1-4Glcβ1-1'Cer (セラ
ミド)という４糖を骨格に持つガングリオテトラオース
系列は、神経系に比較的豊富に存在している。ガングリ
オテトラオース系列のうち、シアル酸を1個有するGM1
（モノシアロガングリオテトラオシルセラミド）はこれ
まで最もよく研究されてきたガングリオシドの１つで、
現在までにアルツハイマー（Svennerholm, L., (1994)
Life Sci. 55, 2125-2134）やパーキンソン病（Schneid
er J. S., Roeltgen, D. P., Rothblat, D.S., Chapas-
Crilly, J., Seraydarian, L., and Rao, J., (1995) N
eurology 45, 1149-1154）、脊髄損傷（Geisler, F.
H., Dorsey, F. C., and Coleman, W. P., (1991) New
England J. Med. 324, 1829-1838）、脳卒中（Argentin
o, C., Sacchetti, M. L., Toni, D., Savoini, G., D'
Arcangelo, E.,Erminio, G. A., Ponari, O., Rebucci,
G., Senin, U., and Fieschi, C., (1989) Stroke 20,
1143-1149）、胎児アルコール障害（Basalingappa, L.
H., Donald, R. C., and Vinayak, G.S. (1994) Alcoh
ol Clin. Exp. Res. 18, 1248-1251）などの様々な神経
疾患への臨床応用が試みられている。スフィンゴ糖脂質
の調製は、それぞれのスフィンゴ脂質が豊富に含まれて
いると思われる動物組織から行われている。例えば、ガ
ングリオテトラオース系ガングリオシドであるGT1a, GD
1a, GD1b, GM1は、ウシ脳から単離される。GM2は、正常
な脳組織には殆ど存在せず、Tay-Sachs病の患者脳から
単離される。GM3は、ヒト赤血球から単離される。ラク
トシルセラミド(LacCer)は、ウシやブタの臓器から単離
される。グルコシルセラミド(GlcCer) は、Gaucher病患
者の脾臓から単離される。セラミドは、ウシ脳から調製
される。これらの天然物由来の標品以外に化学合成法に
よっても調製されているが、非常に高価である。従っ
て、これらの各種ガングリオシドやスフィンゴ糖脂質を
大量にしかも安価に調製する方法の開発が待たれてい
る。動物の生体内でのガングリオシドの分解は、リソソ
ームに存在する種々の糖加水分解酵素よって段階的に進
められる。つまり、糖鎖の非還元末端から順次単糖が外
れ、最終的にはセラミドが生成する。このセラミドは、
リソソームに存在する酸性セラミダーゼによってスフィ
ンゴシン塩基と脂肪酸に代謝される。一方、自然界では
どのようにしてガングリオシドやスフィンゴ糖脂質が分
解されているのは明らかでない。自然界では、これらの
複合脂質の分解に微生物が関与していることは漠然と推
測されているが、ガングリオシドやスフィンゴ糖脂質を
単独で完全に分解できる微生物は知られていない。現在
までに報告のあるガングリオシドあるいはスフィンゴ糖
脂質に作用する微生物起源の酵素としては、非還元末端
のα位のシアル酸に作用するシアリダーゼ（Sugano,K.,
Saito, M., and Nagai,Y.,（1978）FEBS Lett. 89, 32
1-325）、スフィンゴ糖脂質のオリゴ糖鎖とセラミド間
のグリコシド結合を加水分解するエンドグリコセラミダ
ーゼ（EGCase）（Ito, M. and Yamagata, T. (1986) J.
Biol. Chem. 261, 14278-14282）、また、スフィンゴ
糖脂質のセラミド内にあるスフィンゴシン塩基と脂肪酸
との酸アミド結合を加水分解するグリコスフィンゴ脂質
セラミドデアシラーゼ（Hirabayashi, Y., Kimura, Mat
sumoto, M.,Yamamoto, K., Kadowaki, S, Tochikura,
T. (1988) J. Biochem.（Tokyo）103, 1-4）およびスフ
ィンゴ糖脂質のみならずスフィンゴミエリンのセラミド
の酸アミド結合も加水分解するスフィンゴ脂質セラミド
Ｎ−デアシラーゼ (SCDase) (Ito, M., Kurita, T., an
d Kita, K.(1995) J.Biol. Chem. 270, 24370-24374)な
どがある。しかし、シアリダーゼを除いてガングリオシ
ドを含むスフィンゴ糖脂質糖鎖の非還元末端に作用する
微生物起源のエキソグリコシダーゼは未だ報告がない。

【０００３】グリコシダーゼは、その性質によってエキ
ソ型とエンド型に分けられる。エキソ型酵素は、糖鎖の
非還元末端の糖に作用し、単糖を遊離する。一方、エン
ド型酵素は、糖鎖の内部グリコシド結合に作用し、単糖
ではなくオリゴ糖あるいはより大きな糖鎖を遊離する。
一般に、微生物由来のエキソグリコシダーゼは、動物起
源の酵素と比較すると糖鎖部分の構造に対する特異性が
厳密である。この性質を利用して糖タンパク質やオリゴ
糖鎖の構造解析に繁用されてきた。しかし、ガングリオ
シドを含むスフィンゴ糖脂質糖鎖に作用する微生物由来
のエキソ型グリコシダーゼは、シアリダーゼ以外には知
られておらず、植物や動物臓器由来の酵素を使用するこ
とを余儀無くされてきた。安価で大量に調製可能な微生
物起源のエキソ型グリコシダーゼの開発が待たれてい
る。微生物由来のエキソグリコシダーゼは、糖鎖配列自
動決定装置（糖鎖シーケンサー）の開発にも欠かせな
い。また、エキソ型グリコシダーゼを動物や植物の培養
細胞に作用させ、細胞表面の糖鎖をトリミングすること
によって、細胞の増殖、分化、サイトカインや増殖因子
との応答性の変化を調べ、糖鎖の機能を知ることもでき
る。さらに、糖鎖をトリミングすることで積極的に細胞
機能を変化させる細胞工学的な試みも可能であろう。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、ガング
リオシドを分解する微生物について鋭意研究・検討した
結果、ある種の微生物が単独でGD1a, GM1等のガングリ
オシドを完全に分解することを見出した。さらに検討を
続けた結果、本菌は培地中にガングリオシドに作用する
特異性の高いエキソ型グリコシダーゼを産生することを
突き止めた。そこで、発現クローニング法を用いて、幾
つかのエキソ型グリコシダーゼの遺伝子を取得し、この
発明を完成した。

【０００５】今回適用した発現クローニング法は、酵素
生産菌のゲノムDNAを制限酵素で適当な大きさに切断
し、発現ベクターに繋いで大腸菌に導入した後、寒天プ
レート上で大腸菌の酵素活性を判定し、目的の遺伝子を
クローン化する方法である。この方法は、煩雑なタンパ
ク精製を行わずに直接目的遺伝子を得ることができ、今
回のように一つのバクテリアから多数の遺伝子を単離す
る場合に、効力を発揮する。目的酵素の人工発色基質が
手に入るかどうかが鍵であるが、今回は市販の基質が利
用できることが判明した。この方法は、大腸菌で発現す
る遺伝子のみにしか単離できないが、そのことは逆に遺
伝子を取得できれば、大腸菌で必ず発現できることを意
味しているし、大量生産も可能な場合が多い。実際、今
回単離した４つの遺伝子（hex36およびglc4, glc8, glc
28）は全て大腸菌で発現させることができた。

【０００６】この発明の目的は、（１）ガングリオシド
を含むスフィンゴ糖脂質を単独で完全に分解できるバク
テリアを提供すること、（２）微生物起源の特異性の高
いエキソ型グリコシダーゼ遺伝子を提供すること、
（３）糖脂質の糖鎖に作用する新規なエキソ型グリコシ
ダーゼを提供すること、（４）微生物を使用した簡便な
フィンゴ糖脂質の製造方法を提供することを目的として
いる。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、まず、この発明は、ガングリオシドを分解できる微
生物の単離を試み、ガングリオシドを完全分解できる細
菌Paenibacillus sp.TS12 ＦＥＲＭ Ｐ−１８４１６
を提供する。次に、この発明は、Paenibacillus sp. TS
12株のゲノムDNAライブラリーを作製し、蛍光基質４−
メチルウンベリフェリル−グリコシド類（４ＭＵ−glyc
osides）を用いた発現クローニング法によって得られる
各種グリコシダーゼ遺伝子を提供する。さらに、この発
明は、クローン化した遺伝子を大腸菌で大量発現させ、
糖脂質の糖鎖に作用する新規なエキソグリコシダーゼを
提供する。また、この発明は、ガングリオシド分解酵素
生産菌であるPaenibacillus sp.TS12 ＦＥＲＭ Ｐ−１
８４１６を粗ガングリオシドと共培養して、糖鎖トリミ
ングによってスフィンゴ糖脂質を製造する方法を提供す
る。

【０００８】この発明を実施例によって更に詳細に説明
する。

【実施例】この発明を実施例により更に詳細に説明す
る。 実施例１：ガングリオシド分解菌TS12株の単離と同定お
よび分解機序の検討 （ガングリオシド分解菌TS12株の単離）福岡県福岡市東
区箱崎の土壌から採集したサンプルを、モノシアロガン
グリオテトラオシルセラミド (GM1) を含む合成培地
（0.05% GM1, 0.05% NH₄Cl, 0.05%K₂HPO₄, 0.5% NaCl,
0.05% タウロデオキシコール酸ナトリウム, pH 7.2-7.
4）100μｌ中に加え、30℃で2日間培養した。その後、
培養上清を20μｌ乾燥させ、クロロホルム/ メタノール
( 2 / 1 、v/v) 5μｌに溶解してTLCに負荷した。薄層
クロマトグラフィー (TLC) はクロロホルム/ メタノー
ル/ 0.02% CaCl₂（ 5 /4 / 1, v/v） で展開し、糖脂質
はオルシノール硫酸で発色させた。その結果、12番のサ
ンプルに活性が見られた（図１（Ａ））。TS12株による
GM1の分解の時間変化をTLCを用いて調べた結果、GM1
は、時間経過とともにアシアロGM1、アシアロGM2、ラク
トシルセラミド(LacCer)、グルコシルセラミド(GlcCer)
の順に分解された。この結果は、本菌がGM1に作用する
エキソ型のシアリダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−
ヘキソサミニダーゼを生産していることを示している
（図１（Ｂ））。次に、セラミドの脂肪酸のω位に蛍光
でラベルされたNBD−GM1を用いてGlcCerから先に分解が
進むかを調べた。その結果、TS12株はGlcCerに作用して
グルコースを遊離し、セラミドを生成するβ−グルコシ
ダーゼも生産していることが分かった。また、TS12株
は、GM1だけでなくGD1a, GD1b, GT1a等の複数のシアル
酸を持つガングリオシド、GM2、GM3等の短鎖のガングリ
オシド、LacCerのような中性スフィンゴ糖脂質を分解し
てGlcCerを生成した。しかし、スルファチドやグロボシ
ドは分解しなかった。

【０００９】（ガングリオシド分解菌TS12株の同定）単
離した菌株TS12株の同定は、基本的にはBergey's Manua
l（第8版）（Bergey's manual of determinative bacte
riology, 8th ed., (1974)）に基づいて行った。培養温
度は30℃で行った。運動性、グラム染色の判定は光学顕
微鏡観察で行った。オキシダーゼテストはKovacsらの方
法（Kovacs, N. (1956) Nature , 178, 703）を用い、
グルコースの利用（O-Fテスト）はHughとLeifsonの方法
（Hugh,R., and Leifson, E. (1953) J. Bacteriol. 6
6, 24-26）を用いた。16S rDNA解析は平石の方法（Bull
etin of Japanese Society of Microbial Ecology Vol.
10, No. 2, 81-102, (1995)）に従った。その結果、TS1
2株は、運動性のある短桿菌で、電子顕微鏡観察の結
果、周毛を有していた。また、TS12株は、グラム染色陰
性、カタラーゼ陰性、オキシダーゼ陽性、GC含量49%で
あった（表１）。さらに、16S rDNAによる解析を行った
結果、本菌は、Paenibacillus属の一種であると同定さ
れた。本菌はＦＥＲＭに Ｐ−１８４１６として寄託し
ている。

【００１０】表１：各種生理生化学的試験 形態 短桿菌 運動性 ＋ グラム染色 − カタラーゼ ＋ オキシダーゼ − ０％ＮａＣｌ中での生育 ＋ ０．５％ＮａＣｌ中での生育 ＋ ３％ＮａＣｌ中での生育 ＋ ５％ＮａＣｌ中での生育 − ７％ＮａＣｌ中での生育 − コロニーの色 乳白色 ＯＦテスト − ＧＣ含量 ４９％

【００１１】（TS12株によるGM1の分解）TS12株を、前
述のGM1合成培地250μｌに植菌し、30℃で54時間培養
し、6時間ごとに培地中のGM1の分解をTLCにて確認した
ところ、分解は時間経過とともに進行し、最終的にＧＭ
１はGlcCerに変換された。なお、TLCは、クロロホルム
／メタノール／ 0.02% CaCl₂（ 5 / 4 / 1, v / v ）で
展開し、糖脂質はオルシノール硫酸で発色させた。発色
させた糖脂質の吸光度（540 nm）をデンシトメータ（SH
IMADZU CS-9300 PC）で定量した結果、時間経過ととも
に培地中のGM1は減少してアシアロGM1（AsGM1）が増加
し、さらにLacCerに変換され、最終的にＧＭ１はGlcCer
に変換された（図２）。以上の結果から、TS12株は、GM
1に作用するエキソ型のシアリダーゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼを生産していることが
明らかとなった。

【００１２】（TS12株によるNBD−GM1の分解）オルシノ
ール硫酸法は、糖鎖の検出試薬であるため、糖脂質は検
出できるが、セラミドは検出できない。そこで、セラミ
ドの脂肪酸部位が蛍光標識されているNBD−GM1を用いて
GlcCerからさらにセラミドにまで分解が進むかどうかを
調べた。TS12株をNBD−GM1を250 pmol含む合成培地50
μlに植菌し、30℃で3日間培養した上清を20 μl回収
し、TLCに負荷した。TLCはクロロホルム／メタノール／
0.02% CaCl₂（ 5 / 4 / 1, v / v ）で展開し、トラン
スイルミネーターで紫外線照射し、NBD-GM1の分解を調
べた。その結果、NBD−GM1はセラミドにまで分解される
ことが判明した（図３）。以上の結果から、TS12株はGl
cCerに作用するβ-グルコシダーゼも生産していること
が分かった。また、NBD-GM1の分解の様子から、本菌
は、ガングリオシド糖鎖の非還元末端の糖を順に遊離
し、資化していることが推測された。

【００１３】（TS12株による各種スフィンゴ糖脂質の分
解）TS12株を、ガングリオシドを含む各種スフィンゴ糖
脂質（GQ1b, GT1b, GD1a,GD1b, GM1, GM2, GM3, LacCe
r, グロボシド, スルファチド）1 μgを含む合成培地20
μｌに植菌し、30℃で3日間培養し、全量を乾燥し、TLC
に負荷した。TLCはクロロホルム／メタノール／ 0.02%
CaCl₂（ 5 / 4 / 1, v / v ）で展開し、糖脂質はオル
シノール硫酸で発色させた。上述のようにして、TS12株
を各種スフィンゴ糖脂質とともに培養してそれぞれの分
解をしらべた。その結果、TS12株は各種ガングリオシド
およびLacCerを分解してGlcCerに変換したが、グロボシ
ド、スルファチドは分解しなかった。また、LacCerの分
解速度はガングリオシドに比べて遅いことが判明した。
以上の結果から、Paenibacillus属の細菌であると同定
されたTS12株は、単独で各種ガングリオシドを分解する
ことが明らかになった。また、本菌が自然界においてガ
ングリオシドを分解・資化していることが示唆された。

【００１４】実施例２：TS12株の各種エキソグリコシダ
ーゼ遺伝子の発現クローニング 微生物起源の特異性の高いエキソ型グリコシダーゼは、
糖鎖構造を決定する糖鎖自動シーケンサーの開発、特定
のガングリオシドや糖脂質の大量調製、および動・植物
細胞表面糖脂質糖鎖のトリミング等、糖鎖生物学、糖鎖
工学における大きな貢献が期待される。ここでは、Paen
ibacillus sp. TS12株が生産する各種グリコシダーゼ遺
伝子の発現クローニング法について記載する。

【００１５】（蛍光基質の検討）発現クローニングを行
う前に、TS12株の生産する各種グリコシダーゼが蛍光基
質である４−メチルウンベリフェリル−グリコシド類
（4MU−glycosides）に作用するか調べた。その結果、T
S12株のコロニーは4MU−グリコシド類と反応して蛍光を
発することが確認された。これは、基質である4MU−グ
リコシド類がコロニー（細胞）中に取り込まれ、分解を
受けて4MUの蛍光を発しているものと考えられる。具体
的には、TS12株をLB平板培地にスプレッダーで播き、30
℃で2日間培養した。生えてきたコロニーを2 cm四方の
バイオダインAに写し取り、20μｌの4MU−シアル酸 (4M
U-NeuAc) 溶液（0.3 mM 4MU-シアル酸, 10 mM 酢酸バッ
ファー, pH4.0）、4−MU−β−D−ガラクトシド（4MU−
Gal）溶液（0.3 mM 4MU−Gal, 10mM 酢酸バッファー, p
H 4.0）、4−MU−β−D−N−アセチルガラクトサミン
（4MU−GalNAc）溶液（0.3 mM 4MU−GalNAc, 10 mM 酢
酸バッファー, pH 4.0）、4−MU−β−D−グルコシド
（4MU−Glc）溶液（0.3 mM 4MU-Glc, 10 mM 酢酸バッフ
ァー, pH 4.0）のそれぞれに浸した。これを37℃で30分
間反応させ、紫外線照射により活性を確認した。

【００１６】（発現クローンニングの方法）TS12株のゲ
ノムDNAをSau3AIで限定分解し、pBluscriptII SKベクタ
ーのBamHIサイトに組み込んでゲノムライブラリーを作
製した。続いて、作製したゲノムライブラリーを大腸菌
DH5αにトランスフェクトし、各種4MU−glycosidesと反
応させ、宿主にはないグリコシダーゼを新たに生産する
コロニーをスクリーニングした。具体的には、TS12株を
300 mlのPY培地で30℃、3日間振とう培養し、8,000 rpm
で5分間遠心し、菌体を回収した。集めた菌体を4 mlのT
E buffer（10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA）に懸
濁し、4 mgのリゾチームを加え37℃で10分間インキュベ
ートした。さらに1 mlの10% SDS（ラウリル硫酸ナトリ
ウム）を加え、菌体を溶菌させた後に750μｌの5 M NaC
lを加えた。5 mlの平衡化フェノールを加え、よく転倒
飽和した後に5,000 rpmで10 分間遠心して水層とフェノ
ール層に分離し、水層を回収した。タンパク質の中間層
がなくなるまでこの操作を繰り返し行った。次に等量の
クロロホルムを加え転倒混和し、5,000 rpmで10 分間遠
心して、水層とクロロホルム層に分離し、水層を回収し
た。得られた水層に等量のイソプロピルアルコールを加
えてDNAを沈澱させ、このDNAを70%エタノールで洗浄し
た後にTE buffer 4 mlに溶解した。このDNA溶液にRNase
（20 mg / ml）を10μl加え、50℃で1時間インキュベー
トしてRNAを分解した。さらに5 M NaClを100μｌ、10%
SDSを200μｌ、Proteinase K（20 mg / ml）を25μｌを
加えて37℃で1時間インキュベートし、残りのタンパク
質を分解した。続いて、上記と同様の方法でフェノール
処理、クロロホルム処理、イソプロピルアルコール沈澱
を行い、70%エタノールで洗浄したものを2 mlのTE buff
erに溶かし、分光光度計（Ultrospec 3000, Amersham P
harmacia Biotech）にて定量した。５０μｇのゲノムDN
AをSau3AIで限定分解し、約2k-8 kbpの部分を4フラクシ
ョンに切り出し、それぞれをSephaglas BandPrep Kit
（Amersham Pharmacia Biotech）を用いてゲルより抽出
した。これをpBluscriptII SKベクターのBamHIサイトに
Ligation Pack（日本ジーン）を用いて組み込んだ。反
応溶液をエタノール沈澱し、10μｌの滅菌水に溶かし、
ゲノムDNAライブラリーとした。

【００１７】（β−N−アセチルヘキソサミニダーゼ遺
伝子の単離）4MU−β−N−アセチルガラクトサミンを基
質とした時に、本基質を分解するコロニーを１つ得た。
形質転換した大腸菌の細胞抽出液を用いて基質特異性を
検討したところ、本酵素は、AsGM2には作用したがGM2に
は作用しなかった。また、4MU-β−N−アセチルガラク
トサミンのみならず、4MU−β−N−アセチルグルコサミ
ンにも作用することが判明し、本酵素は、β−N−アセ
チルヘキソサミニダーゼと同定された。2,934 bpからな
るβ−N−アセチルヘキソサミニダーゼ遺伝子（hex36）
（配列番号７、８）は、978アミノ酸をコードし、その
推定分子量は105,208、推定等電点は5.00であった。ま
た、アミノ酸レベルでStreptomyces coelicolor, Vibri
o cholerae, Homo sapiens, Mus musculusのβ−ヘキソ
サミニダーゼとそれぞれ41％, 26％, 26％, 25％一致し
た。TS12株のヘキソサミニダーゼは他のヘキソサミニダ
ーゼと比べて、C末が長く、分子量が大きいことが特徴
としてあげられる。

【００１８】以下、方法を具体的に記載する。4MU−Gal
NAc と反応して蛍光を発する1クローン（Hex36）からプ
ラスミド（pHex36）を抽出し、インサートを解析した結
果、このプラスミドにはβ−ヘキソサミニダーゼ遺伝子
が含まれているものの、その全長は含まれておらず、C
末部分が欠如していることが分かった。そこで、下線部
をプローブとして、ヘキソサミニダーゼのC末断片をサ
ザンブロッティング、コロニーハイブリダイゼーション
で取得し、Hex36の3'部分と入れ替えて全長の入ったク
ローンHex36Tを取得した。Hex36Tの取得は、次のような
方法で行った。TS12株のゲノムDNA 500 ngを各種制限酵
素で消化し、0.7%のアガロースゲルで泳動した。DNAを
アガロースゲルからナイロンメンブレン（Hybond-N^＋、
Amarsham Pharmacia Biotech）に写し取った。このメン
ブレンを80℃で2時間乾燥させ、三方をシールしたハイ
ブリバックにいれた。ここにハイブリダイゼーション溶
液（1 mM EDTAと7% SDSを含む0.5 M チャーチリン酸バ
ッファー（pH 7.0））を加え、ポリシーラーで閉じ、１
時間プレハイを行った。プローブはReady-To-Go DNA la
beling kit（Amersham Pharmacia Biotech）を使用して
［α−^３２P］dCTPでラベルし、ハイブリダイゼーショ
ンに使用した。ハイブリダイゼーションはハイブリダイ
ゼーション溶液中で65℃、16時間行った。ハイブリダイ
ゼーションさせた後、メンブレンは 1% SDSを含む40 mM
チャーチリン酸バッファー（pH 7.0）で3回洗浄し、ima
ging plateに曝した。20分後にBAS1500 imaging analyz
er（FujiFilm）にて解析した。サザンブロッティングを
行った結果、HindIIIで消化した約1.5 kbpのフラグメン
トにβ−ヘキソサミニダーゼのC末部分が含まれている
と予想されたので、このフラグメントを取得するため
に、TS12株のゲノムDNA 5μｇをHindIIIで消化して、0.
7%のアガロースゲルで泳動した。約1.5 kbpのフラグメ
ントを切り出し、ゲルから抽出した。これをpBluscript
II SKベクターのHindIIIサイトにLigation Packを用い
て組み込んだ。反応溶液をエタノール沈澱し、DH5αに
導入し、ヘキソサミニダーゼのC末断片の遺伝子を含む
ゲノムライブラリーを作製して、^３２Pでラベルしたプ
ローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションを行っ
た（参考文献：実験医学 17(2), 172-174, 17(3), 517-
514 1999）。

【００１９】（TS12株のβ−ヘキソサミニダーゼの基質
特異性）GM2（1μｇGM2, 0.1% TDC）10μｌとHex36Tの
ライセート10μｌを37℃で16時間反応させた。反応溶液
には終濃度0.05%のTDCを加えた。反応させたサンプルを
乾燥させ、クロロホルム／メタノール（ 2 / 1 ）5μｌ
に溶解してTLCに負荷した。TLCはクロロホルム／メタノ
ール/ 0.02% CaCl₂（ 5 / 4 / 1, v / v ）で展開し、
糖脂質はオルシノール硫酸で発色させた。TS12株のβ−
N-アセチルヘキソサミニダーゼ３６（Hex36）は、AsGM2
には作用したが、GM2には作用しなかった。Bacillus属
のAT173-1株もβ−N−アセチルガラクトサミニダーゼを
生産することが報告されているが（Tanaka, A and Ozak
i, S. (1997) J. Biochem. , 122,330-336）、AT173-1
株の生産するβ−N−アセチルガラクトサミニダーゼ
は、オリゴ糖末端のGalNAcには作用するが、糖脂質の末
端GalNAcには作用しない。よって、この発明に係るβ−
ヘキソサミニダーゼは、糖脂質に作用することが示され
たので、新規のβ−ヘキソサミニダーゼであるといえ
る。

【００２０】（β-グルコシダーゼの発現クローニン
グ）さらに、4MU−β−Glcを用いて、β−N−アセチル
ヘキソサミニダーゼと同様な方法で発現クローニングを
行った結果、約3,000個のコロニーから、3個の4MUの蛍
光を発するコロニーが得られた。これら3個のpositive
クローン（クローンGlc8, クローンGlc4, クローンGlc2
8）の細胞抽出液を4MU−β−Glcとエッペンチューブ中
で反応させたところ、分解が確認されたので、これら3
クローンはβ-グルコシダーゼを生産していることが分
かった。それぞれのクローンが持っていたプラスミドpG
lc8, pGlc4, pGlc28のインサートを解析した結果、glc8
(配列番号３、４)は4,098 bpからなり、1,366アミノ酸
をコードし、推定分子量145,254、推定pIは4.64だっ
た。glc4(配列番号１、２)は、2,493 bpからなり、831
アミノ酸をコードし、推定分子量90,706、推定pIは5.34
だった。glc28(配列番号５、６)は、1,713 bpからな
り、571アミノ酸をコードし、推定分子量63,628、推定p
Iは5.09だった。得られた３クローンの配列は、相互に
一致しなかったため、それぞれ異なるβ-グルコシダー
ゼをコードしていることが明らかとなった。

【００２１】（β-グルコシダーゼの基質特異性）NBD−
GlcCer溶液（100 pmol NBD-GlcCer, 0.1% TDC）10μｌ
とβ−グルコシダーゼ遺伝子で形質転換した大腸菌の細
胞抽出液10μｌを37℃で16時間反応させた。反応させた
サンプルを乾燥させ、クロロホルム／メタノール（ 2 /
1 、v/v）5μｌに溶解してTLCに負荷した。TLCはクロ
ロホルム／メタノール/ 0.02% CaCl₂（ 5 / 4 / 1, v /
v ）で展開し、分解の様子を紫外線照射で確認した。
その結果、グルコシダーゼ4(Glc4)はNBD−GlcCerに作用
してグルコースを遊離し、Cerを生成したが、グルコシ
ダーゼ8(Glc8), グルコシダーゼ28(Glc28)はNBD−GlcCe
rには作用しないことが判明した。

【００２２】（DNAシーケンスとその解析）発現クロー
ニングで取得したpositiveコロニーをLB培地で16時間培
養し、アルカリミニプレップ法でプラスミドを抽出し、
得られたプラスミドのインサートの塩基配列をBigdye T
erminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit（App
liedBiosystems）を用いDNAシーケンサー（Applied Bio
system 377型）にてチェインターミネーター法で解析し
た。DNAの配列の分析はDNASIS（Hitachi SoftwareEngin
eering）にて行った。

【００２３】

【発明の効果】この発明で以下のような効果が期待され
る。 微生物起源の特異性の厳格なエキソ型グリコシダーゼを
用いることによって糖鎖シーケンサーの開発。 TS12株を用いたGlcCerの製造。 シアリダーゼ阻害剤等を併用して、GM2, GM3 等の短鎖
ガングリオシドの製造 セラミドの製造。 高度に精製した酵素を用いて細胞表面糖鎖のトリミング
法の開発。 TS12株には、グルコシダーゼおよびヘキソサミニダーゼ
以外に、ガングリオシドに作用するガラクトシダーゼ及
びシアリダーゼが存在する。それゆえ、TS12株は、これ
ら新規遺伝子の取得の材料を提供する。

【００２４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <100> UIP Co., Ltd. <120> Process for the production of gangliosides by using a microorgani sm <130> P0446T <160> 8 <210> 1 <211> 2496 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <400> 1 gtggcgcaac tcacgcttga agaaaaagcc ggcctctgtt cgggggaaag cttttggagg 60 accaaagcaa ttgatcgtct ggggattccg tccatcatga tgacagacgg acctcacggc 120 ttgcgcaagc aagcggggga agcggaccat ctgggactga acgagagcat tccggcaacg 180 tgctttccga ccgccgccgg gcttgcgagc tcctgggacc gcgaactggt gcgaaaggta 240 ggagaagcgc tgggaaagga aagccaggca gagaacgtct ccatcctgct gggacctggc 300 gcgaatatta aacgttcgcc actgtgcggg aggaacttcg agtatttctc ggaagatccg 360 tatctgacgg gcgagttggc cgcggcgcat attgcaggcg ttcaaagcca gggtgtcggc 420 acgtcgctga agcatttcgc tgtcaacaac caggagcatc gccggatgac gacggatgct 480 gtggtggacg aacggacgct gcgcgaaatt tatttgaccg gcttcgagat tgccgtgaag 540 aaatcgcagc catggacggt catgtcggcg tacaaccgga tgaacggaac ctactgctcc 600 gaaaacgaaa cgttgctgac ccgcattctg aaggaggaat ggggccacga gggcatcgtc 660 gtatcggact ggggcgccgt caacgaagcg gctgcgagcg tggcggccgg catggagctg 720 gagatgccgt ccagccatgg catcggccaa aggaaaatcg tggcggcggt ggaaagcgga 780 gaactgtccg tcgaggcgct ggatcgggca gtgacgcggc ttttgactgt gattttcaaa 840 gctgtcgaca gccggaagac ggacgccact tacgacaagg aagcgcatca cttacttgcc 900 cgcgaaatcg cccgcgaatc gatggtgctg ctcaaaaatg aaggcaatct gctcccgctg 960 gcaaagacgg gcaaactggc gatcatcgga gccatggctg agcaggttcg ataccaaggt 1020 ggcggaagct cccacatcaa gccgacaaag ctggatagca tcagggacga gatcgaaaaa 1080 tcggccagaa gtgcggaaat ccgttattcg aaagggtatc ttctcgaaag cgacgagagc 1140 gacgagtctt tgctgaacga ggcgaagcaa gccgcagctg actctgatgt cgcggtgctg 1200 ttcgtcgggc tgccggaccg ttacgaatcg gaaggctacg atcggacgca tctgaatttg 1260 ccggctaacc acatcgaact gatcgagcgg atcgcatccg ttcagccgaa cgtcgttgtg 1320 atcttgagca acggttctcc cgtcgttatg ccgtggctgg gtcatgcgaa ggccgtgctc 1380 gaagcttacc tgggcggtca ggctgcgggc ggagcgatcg ccgacctgtt gttcggcgac 1440 gccaatccga gcggcaagct ggcggagacg ttcccgcata gcctgaagca caatccgtcc 1500 catccttttt atcctggcga gggcgatcgg acggaatacc gggaaggcat ttttgtcggt 1560 tatcgctatt tcgacgcgaa ggatatagag ccgctgtttc cgttcggaca cggcttaagc 1620 tatacggcgt tttcctattc cggattgaag ctggacaaaa gcgagatgac agaccgggac 1680 atcgtgcaag tccgcgtcaa cgtgaagaac acggggggac ggttcggcaa ggaaaccgtt 1740 cagctttacg tccacagtcg gaattccagc gtcattcgtc cggaaaaaga gctgaaaggc 1800 tttgcgaagg tatcgttaaa cccggaggaa gaacagacgg ttacgttcgc gcttgataaa 1860 cgaagctttg cctattacaa cgcggaattg aaagagtggc atgctgaaac gggcgaatat 1920 gaaatattga tcggcagctc ttcgcgcgat atcgcgcttc ggacggcatt gacggtccag 1980 tccacgaccg aaatcgtccc aacatttcat cggaatacga cactcggaga gctgatggaa 2040 aatccggcaa cgctcccgat tcttgcgcac ttgcagagca tggcgccgca acagcaggcg 2100 caatcggact cggtgtcccc agacatgatg atggcgatga tgcgatacat gccgctgcgc 2160 gcgctgcttc cctttaccgg cggcgcgatg acggaagaga cgcttggcat gttgctggag 2220 cagtttaatc aggccgttcg cggcgaaaag aatcaacctc atgcaagcga gggaagttct 2280 gcggctttta acgaatactc gacgctgggc gacctcttgg ctcacgaagc agctgttgct 2340 gtattagaaa agcatctccc cggcatatcg acgaatccga tgatcagcat ggggaaagga 2400 ctcactctca agcaactggc cggcattccg caagcgaata tacccgagga gttaatctct 2460 acaattgtga ccgacttgag tgtagtcaga ggataa 2496 <210> 2 <211> 831 <212> PRT <213> Paenibacillus sp. <400> 2 Val Ala Gln Leu Thr Leu Glu Glu Lys Ala Gly Leu Cys Ser Gly 5 10 15 Glu Ser Phe Trp Arg Thr Lys Ala Ile Asp Arg Leu Gly Ile Pro 20 25 30 Ser Ile Met Met Thr Asp Gly Pro His Gly Leu Arg Lys Gln Ala 35 40 45 Gly Glu Ala Asp His Leu Gly Leu Asn Glu Ser Ile Pro Ala Thr 50 55 60 Cys Phe Pro Thr Ala Ala Gly Leu Ala Ser Ser Trp Asp Arg Glu 65 70 75 Leu Val Arg Lys Val Gly Glu Ala Leu Gly Lys Glu Ser Gln Ala 80 85 90 Glu Asn Val Ser Ile Leu Leu Gly Pro Gly Ala Asn Ile Lys Arg 95 100 105 Ser Pro Leu Cys Gly Arg Asn Phe Glu Tyr Phe Ser Glu Asp Pro 110 115 120 Tyr Leu Thr Gly Glu Leu Ala Ala Ala His Ile Ala Gly Val Gln 125 130 135 Ser Gln Gly Val Gly Thr Ser Leu Lys His Phe Ala Val Asn Asn 140 145 150 Gln Glu His Arg Arg Met Thr Thr Asp Ala Val Val Asp Glu Arg 155 160 165 Thr Leu Arg Glu Ile Tyr Leu Thr Gly Phe Glu Ile Ala Val Lys 170 175 180 Lys Ser Gln Pro Trp Thr Val Met Ser Ala Tyr Asn Arg Met Asn 185 190 195 Gly Thr Tyr Cys Ser Glu Asn Glu Thr Leu Leu Thr Arg Ile Leu 200 205 210 Lys Glu Glu Trp Gly His Glu Gly Ile Val Val Ser Asp Trp Gly 215 220 225 Ala Val Asn Glu Ala Ala Ala Ser Val Ala Ala Gly Met Glu Leu 230 235 240 Glu Met Pro Ser Ser His Gly Ile Gly Gln Arg Lys Ile Val Ala 245 250 255 Ala Val Glu Ser Gly Glu Leu Ser Val Glu Ala Leu Asp Arg Ala 260 265 270 Val Thr Arg Leu Leu Thr Val Ile Phe Lys Ala Val Asp Ser Arg 275 280 285 Lys Thr Asp Ala Thr Tyr Asp Lys Glu Ala His His Leu Leu Ala 290 295 300 Arg Glu Ile Ala Arg Glu Ser Met Val Leu Leu Lys Asn Glu Gly 305 310 315 Asn Leu Leu Pro Leu Ala Lys Thr Gly Lys Leu Ala Ile Ile Gly 320 325 330 Ala Met Ala Glu Gln Val Arg Tyr Gln Gly Gly Gly Ser Ser His 335 340 345 Ile Lys Pro Thr Lys Leu Asp Ser Ile Arg Asp Glu Ile Glu Lys 350 355 360 Ser Ala Arg Ser Ala Glu Ile Arg Tyr Ser Lys Gly Tyr Leu Leu 365 370 375 Glu Ser Asp Glu Ser Asp Glu Ser Leu Leu Asn Glu Ala Lys Gln 380 385 390 Ala Ala Ala Asp Ser Asp Val Ala Val Leu Phe Val Gly Leu Pro 395 400 405 Asp Arg Tyr Glu Ser Glu Gly Tyr Asp Arg Thr His Leu Asn Leu 410 415 420 Pro Ala Asn His Ile Glu Leu Ile Glu Arg Ile Ala Ser Val Gln 425 430 435 Pro Asn Val Val Val Ile Leu Ser Asn Gly Ser Pro Val Val Met 440 445 450 Pro Trp Leu Gly His Ala Lys Ala Val Leu Glu Ala Tyr Leu Gly 455 460 465 Gly Gln Ala Ala Gly Gly Ala Ile Ala Asp Leu Leu Phe Gly Asp 470 475 480 Ala Asn Pro Ser Gly Lys Leu Ala Glu Thr Phe Pro His Ser Leu 485 490 495 Lys His Asn Pro Ser His Pro Phe Tyr Pro Gly Glu Gly Asp Arg 500 505 510 Thr Glu Tyr Arg Glu Gly Ile Phe Val Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp 515 520 525 Ala Lys Asp Ile Glu Pro Leu Phe Pro Phe Gly His Gly Leu Ser 530 535 540 Tyr Thr Ala Phe Ser Tyr Ser Gly Leu Lys Leu Asp Lys Ser Glu 545 550 555 Met Thr Asp Arg Asp Ile Val Gln Val Arg Val Asn Val Lys Asn 560 565 570 Thr Gly Gly Arg Phe Gly Lys Glu Thr Val Gln Leu Tyr Val His 575 580 585 Ser Arg Asn Ser Ser Val Ile Arg Pro Glu Lys Glu Leu Lys Gly 590 695 600 Phe Ala Lys Val Ser Leu Asn Pro Glu Glu Glu Gln Thr Val Thr 605 610 615 Phe Ala Leu Asp Lys Arg Ser Phe Ala Tyr Tyr Asn Ala Glu Leu 620 625 630 Lys Glu Trp His Ala Glu Thr Gly Glu Tyr Glu Ile Leu Ile Gly 635 640 645 Ser Ser Ser Arg Asp Ile Ala Leu Arg Thr Ala Leu Thr Val Gln 650 655 660 Ser Thr Thr Glu Ile Val Pro Thr Phe His Arg Asn Thr Thr Leu 665 670 675 Gly Glu Leu Met Glu Asn Pro Ala Thr Leu Pro Ile Leu Ala His 680 685 690 Leu Gln Ser Met Ala Pro Gln Gln Gln Ala Gln Ser Asp Ser Val 695 700 705 Ser Pro Asp Met Met Met Ala Met Met Arg Tyr Met Pro Leu Arg 710 715 720 Ala Leu Leu Pro Phe Thr Gly Gly Ala Met Thr Glu Glu Thr Leu 725 730 735 Gly Met Leu Leu Glu Gln Phe Asn Gln Ala Val Arg Gly Glu Lys 740 745 750 Asn Gln Pro His Ala Ser Glu Gly Ser Ser Ala Ala Phe Asn Glu 755 760 765 Tyr Ser Thr Leu Gly Asp Leu Leu Ala His Glu Ala Ala Val Ala 770 775 780 Val Leu Glu Lys His Leu Pro Gly Ile Ser Thr Asn Pro Met Ile 785 790 795 Ser Met Gly Lys Gly Leu Thr Leu Lys Gln Leu Ala Gly Ile Pro 800 805 810 Gln Ala Asn Ile Pro Glu Glu Leu Ile Ser Thr Ile Val Thr Asp 815 820 825 Leu Ser Val Val Arg Gly 830 <210> 3 <211> 4101 <212> DNA <213> Paramecium sp. <400> 3 atgaggatag gcctgaatat atcctttcag aaagcgttga gtgcggtatt ggttttaacg 60 gtcgtgctag gactttggag cggttatcgt cctgttgtta gcgctgcggc cgctaatgaa 120 tttacggtaa cctttgattc caatggatgc tcgataacgg caccagcagc ggatacggtt 180 aacgggaagc tagcttcgat tcctcttctt gcaagggaag gttatacatt tgaaggatgg 240 tatgaaagca agaatcctgc cattacagca acagccatta acagcaacac cgtgttcacc 300 aagaacacaa cagtatatgc catttggcaa gcggactatg ccaagctggc aacaaaatat 360 aaggatcagg aagtaacatt atcctacgct ccctcttcgg gagtcaagct gatcaaggaa 420 gacgggaccg cattaaccaa agccgaaatt tcggcctatg accaatcctt tccgatcttt 480 aaagatctga ataaaaacgg taaattggac ccttatgaag attggcggct gccctataaa 540 gagcgtgctc tgaatttggc gtcgctgatg gccggcgcaa gcgataacgt cgaacaaatt 600 gcgggactga tgctgtacag cgcccattat ggcgtaacat ccgccatgcc gaccgatgcg 660 cagaagcaat acctcgacgc cgaccatttg cgccatgttc tggtcacgac aagctcgtcg 720 ccggaaatga atgcgaaatg gaataataac gtacaagctt ttacggaaag cacctcattc 780 ggcattcctg ccaataactc ttcggatccg cgccattcag ccaacacgac atccggagtg 840 gaatactacg tggagaatgc gggcgtgtct gcatggccga cctcgctggg gctagcggcg 900 acttttaatg tcgatacgat gaagcaattt ggtaaaatcg cctcgattga atatcgctcg 960 cttggcatat cgaccgcgct ttcacctcaa atcgatattg ctacggatcc tcgctggggc 1020 cggtttaacg gcacattcgg agaagacccc aagctcgcat ccgctatggc aagagcttat 1080 gtagacggtt ttcagacgac ctatgcagac gggacgagca atacgccggt cgccggaggc 1140 tggggcatgg acagcgtcaa tgcgatgatg aagcattggc cgggcggcgg cgccggagaa 1200 ggcggacggg atgcgcatta tgattacggc aagtatgccg tgtacccggg agataatttt 1260 gaagcgcatt taattccgtt cgtagacggc tctctgagtc tatccgacgg tacgggaatg 1320 gcaacggcag ttatgcccta ttacaccatt tcgtatatgc aaacgcctgg aagcgaacct 1380 aacagctcca atcttccggg ggcaaagctg aatatggcga atgcctataa tgattacatg 1440 atcaatggcg ttctgcgtga cgcttatcaa tttgaaggcg tcgtaacgac ggattggaac 1500 gttatcggtc caaagactgc acccggcggc ggttttgaca gcgacattcc gggcatgatc 1560 tgggggccgg acgaccatta cggattaacg ggatttacga tggacgatat ggccgtaaga 1620 gcgcgcctgc ttcttgatgc cggtgtcgat caattcgggg gacttaacac gaatgcgcca 1680 atcgtaaccg cttacaacaa cgcaacgggc gaagataagg agaggctgct ggcacagctt 1740 caagttagcg cctatcggct tctgatgaac gtcttcagaa cggggttatt cgaagatccg 1800 tatctggacc cggctgagag caaagccacg gtcggccaag aagcgttcat ggctgccggc 1860 tacaaagcgc agttggaatc gatggtattg ctaaaggata aaaacagcat cttgcctgta 1920 tcgaccaata aaaaggtata tgcgcccgga gcggatgcca ataccgttac tttgctgaag 1980 gcatacttcg gcagtgaaaa cgtaattacg gaagcagcca acgcaaatgc ggccgattat 2040 gcgattgtgt tcatgaactc cgtctctgca ggcggcggtt caaggaatgc ttcgcagcat 2100 atcaacagct atacgccgat taatctggac tttaaagctt ataccgcgac aaacgcgcgc 2160 gaaacgagca ttgccggtta cccgctaaga gaaattccgg atgatttcac ctctgcggtt 2220 ataggaatgg agaatcgttc ctacaggggc cttactacca atatttccgc tgctgccgca 2280 acgatcaaca gcaacatagc cgccgccaag gccagcggaa aaccggtcat tctttccgtt 2340 aatatgtcca accctatggt catgggagag gttgagcctc atgcggatgt aatgctcgtc 2400 aacttcggag ctcaaaaatc cgccatactg gatatgctta cgggctctac tcgctacggc 2460 aagcaaggcg gtccatcctc ggctgtctat cctaccggca tgctgccaat gcaattgcct 2520 aaagatatgg atgaagtcga gctgcaatat gaagatgtcc ctcgcgatat ggtcagctac 2580 acggacagcc agggaaatgt ttacgacttt ggctttggac tgacctggaa ggacggattg 2640 aagaggattg atgcatcggt aaatcccggt tatactcctt tcgttgccgg aaatacggtg 2700 ccgatgactc atcccgttaa tatgggcacc aatgaaaaca gcccttatct gattgccaat 2760 cgggcaaaag tgaaatttga tttcggctat aaggaatcgg cagccgataa ggaaaatgca 2820 aaaatcacca aaatagtaaa taaaggttca accgtaactc ctgccgaacc gccatcccgc 2880 gccggacaag cattcgcggg ctggtataac ggaaccgaca aatttgattt ctccaacccg 2940 attactgaag atatcgttct tacagcaaaa tggggtgaag aaggagcggc tccgacgatc 3000 acggctccag cctccgtcgt ggtcggacag gacttcgatc ttcacattgg cattaaaggc 3060 atcgaggaag ggtttgactc cctggcggta gtcgtgaatt atgatccgga gcaggtcgag 3120 tttgacactg taagcgatgc ggaaggcgca ctgagcttga gtgagcaagc ggtcgcttcg 3180 ctgcgttccg atcttcacgt tctcggaaca ggcgtcaagc ccgacgcggg acaaattctg 3240 attatcctgt caacgacagg tcaactggtc gagctggacg gcgatctgct ggttctccat 3300 ggcaaggcca gagctggcgc tgcagcaggt acgactatta tagctttaag cgattttgaa 3360 gtatcggcta acggctcctc ccaatcgctg aatacggatg gtagttcggt cgccattcaa 3420 attcgtttgg ctgatcatgc ggcgctggca tcggcgatca gcgaagccga gcagctgctt 3480 gcccaggctg tcgagggctc gcagccgggt cagtacccgg ctggcaccaa agcggcgctg 3540 cggcttgccg ttaatcaggc gattgcggtc agggataacg cttcggcgat aaatgaacag 3600 attgctcaag cggcggtgtc gctcaacaat gccattaaac tattcaagag cttggtgaac 3660 ccggatcctt ctccctcggc agacaagatt gcgttgaatg cggcgatcgc ggcggcgcag 3720 acgaagctgg gtcaggcgaa ggaaggcacg aaggtgggtc aatattccgc atcggccatc 3780 gctgcgctga aagcggctgt tcaaacggct aacgcagtga agaatgattc gacggcatcg 3840 caatattccg ttgatcaagc gacggcaaaa ttaaacgagg cggttgccga attcaccgcg 3900 aagatgatta cgcttgttcc cggtcaaacg ggagtgacgc tgagcgactt gtcctatttg 3960 gcgaagtact acggcgtaaa atcgaccgat ccggaatgga gcaatgtcga gaaggcagac 4020 ctcttcgaca gcggtgaaat tacgattcgc gagctggcgg caattgcaag aatgattgtc 4080 gacaactggc tggatcaata a 4101 <210> 4 <211> 1366 <212> PRT <213> Paramecium sp. <400> 4 Met Arg Ile Gly Leu Asn Ile Ser Phe Gln Lys Ala Leu Ser Ala 5 10 15 Val Leu Val Leu Thr Val Val Leu Gly Leu Trp Ser Gly Tyr Arg 20 25 30 Pro Val Val Ser Ala Ala Ala Ala Asn Glu Phe Thr Val Thr Phe 35 40 45 Asp Ser Asn Gly Cys Ser Ile Thr Ala Pro Ala Ala Asp Thr Val 50 55 60 Asn Gly Lys Leu Ala Ser Ile Pro Leu Leu Ala Arg Glu Gly Tyr 65 70 75 Thr Phe Glu Gly Trp Tyr Glu Ser Lys Asn Pro Ala Ile Thr Ala 80 85 90 Thr Ala Ile Asn Ser Asn Thr Val Phe Thr Lys Asn Thr Thr Val 95 100 105 Tyr Ala Ile Trp Gln Ala Asp Tyr Ala Lys Leu Ala Thr Lys Tyr 110 115 120 Lys Asp Gln Glu Val Thr Leu Ser Tyr Ala Pro Ser Ser Gly Val 125 130 135 Lys Leu Ile Lys Glu Asp Gly Thr Ala Leu Thr Lys Ala Glu Ile 140 145 150 Ser Ala Tyr Asp Gln Ser Phe Pro Ile Phe Lys Asp Leu Asn Lys 155 160 165 Asn Gly Lys Leu Asp Pro Tyr Glu Asp Trp Arg Leu Pro Tyr Lys 170 175 180 Glu Arg Ala Leu Asn Leu Ala Ser Leu Met Ala Gly Ala Ser Asp 185 190 195 Asn Val Glu Gln Ile Ala Gly Leu Met Leu Tyr Ser Ala His Tyr 200 205 210 Gly Val Thr Ser Ala Met Pro Thr Asp Ala Gln Lys Gln Tyr Leu 215 220 225 Asp Ala Asp His Leu Arg His Val Leu Val Thr Thr Ser Ser Ser 230 235 240 Pro Glu Met Asn Ala Lys Trp Asn Asn Asn Val Gln Ala Phe Thr 245 250 255 Glu Ser Thr Ser Phe Gly Ile Pro Ala Asn Asn Ser Ser Asp Pro 260 265 270 Arg His Ser Ala Asn Thr Thr Ser Gly Val Glu Tyr Tyr Val Glu 275 280 285 Asn Ala Gly Val Ser Ala Trp Pro Thr Ser Leu Gly Leu Ala Ala 290 295 300 Thr Phe Asn Val Asp Thr Met Lys Gln Phe Gly Lys Ile Ala Ser 305 310 315 Ile Glu Tyr Arg Ser Leu Gly Ile Ser Thr Ala Leu Ser Pro Gln 320 325 330 Ile Asp Ile Ala Thr Asp Pro Arg Trp Gly Arg Phe Asn Gly Thr 335 340 345 Phe Gly Glu Asp Pro Lys Leu Ala Ser Ala Met Ala Arg Ala Tyr 350 355 360 Val Asp Gly Phe Gln Thr Thr Tyr Ala Asp Gly Thr Ser Asn Thr 365 370 375 Pro Val Ala Gly Gly Trp Gly Met Asp Ser Val Asn Ala Met Met 380 385 390 Lys His Trp Pro Gly Gly Gly Ala Gly Glu Gly Gly Arg Asp Ala 395 400 405 His Tyr Asp Tyr Gly Lys Tyr Ala Val Tyr Pro Gly Asp Asn Phe 410 415 420 Glu Ala His Leu Ile Pro Phe Val Asp Gly Ser Leu Ser Leu Ser 425 430 435 Asp Gly Thr Gly Met Ala Thr Ala Val Met Pro Tyr Tyr Thr Ile 440 445 450 Ser Tyr Met Gln Thr Pro Gly Ser Glu Pro Asn Ser Ser Asn Leu 455 460 465 Pro Gly Ala Lys Leu Asn Met Ala Asn Ala Tyr Asn Asp Tyr Met 470 475 480 Ile Asn Gly Val Leu Arg Asp Ala Tyr Gln Phe Glu Gly Val Val 485 490 495 Thr Thr Asp Trp Asn Val Ile Gly Pro Lys Thr Ala Pro Gly Gly 500 505 510 Gly Phe Asp Ser Asp Ile Pro Gly Met Ile Trp Gly Pro Asp Asp 515 520 525 His Tyr Gly Leu Thr Gly Phe Thr Met Asp Asp Met Ala Val Arg 530 535 540 Ala Arg Leu Leu Leu Asp Ala Gly Val Asp Gln Phe Gly Gly Leu 545 550 555 Asn Thr Asn Ala Pro Ile Val Thr Ala Tyr Asn Asn Ala Thr Gly 560 565 570 Glu Asp Lys Glu Arg Leu Leu Ala Gln Leu Gln Val Ser Ala Tyr 575 580 585 Arg Leu Leu Met Asn Val Phe Arg Thr Gly Leu Phe Glu Asp Pro 590 595 600 Tyr Leu Asp Pro Ala Glu Ser Lys Ala Thr Val Gly Gln Glu Ala 605 610 615 Phe Met Ala Ala Gly Tyr Lys Ala Gln Leu Glu Ser Met Val Leu 620 625 630 Leu Lys Asp Lys Asn Ser Ile Leu Pro Val Ser Thr Asn Lys Lys 635 640 645 Val Tyr Ala Pro Gly Ala Asp Ala Asn Thr Val Thr Leu Leu Lys 650 655 660 Ala Tyr Phe Gly Ser Glu Asn Val Ile Thr Glu Ala Ala Asn Ala 665 670 675 Asn Ala Ala Asp Tyr Ala Ile Val Phe Met Asn Ser Val Ser Ala 680 685 690 Gly Gly Gly Ser Arg Asn Ala Ser Gln His Ile Asn Ser Tyr Thr 695 700 705 Pro Ile Asn Leu Asp Phe Lys Ala Tyr Thr Ala Thr Asn Ala Arg 710 715 720 Glu Thr Ser Ile Ala Gly Tyr Pro Leu Arg Glu Ile Pro Asp Asp 725 730 735 Phe Thr Ser Ala Val Ile Gly Met Glu Asn Arg Ser Tyr Arg Gly 740 745 750 Leu Thr Thr Asn Ile Ser Ala Ala Ala Ala Thr Ile Asn Ser Asn 755 760 765 Ile Ala Ala Ala Lys Ala Ser Gly Lys Pro Val Ile Leu Ser Val 770 775 780 Asn Met Ser Asn Pro Met Val Met Gly Glu Val Glu Pro His Ala 785 790 795 Asp Val Met Leu Val Asn Phe Gly Ala Gln Lys Ser Ala Ile Leu 800 805 810 Asp Met Leu Thr Gly Ser Thr Arg Tyr Gly Lys Gln Gly Gly Pro 815 820 825 Ser Ser Ala Val Tyr Pro Thr Gly Met Leu Pro Met Gln Leu Pro 830 835 840 Lys Asp Met Asp Glu Val Glu Leu Gln Tyr Glu Asp Val Pro Arg 845 850 855 Asp Met Val Ser Tyr Thr Asp Ser Gln Gly Asn Val Tyr Asp Phe 860 865 870 Gly Phe Gly Leu Thr Trp Lys Asp Gly Leu Lys Arg Ile Asp Ala 875 880 885 Ser Val Asn Pro Gly Tyr Thr Pro Phe Val Ala Gly Asn Thr Val 890 895 900 Pro Met Thr His Pro Val Asn Met Gly Thr Asn Glu Asn Ser Pro 905 910 915 Tyr Leu Ile Ala Asn Arg Ala Lys Val Lys Phe Asp Phe Gly Tyr 920 925 930 Lys Glu Ser Ala Ala Asp Lys Glu Asn Ala Lys Ile Thr Lys Ile 935 940 945 Val Asn Lys Gly Ser Thr Val Thr Pro Ala Glu Pro Pro Ser Arg 950 955 960 Ala Gly Gln Ala Phe Ala Gly Trp Tyr Asn Gly Thr Asp Lys Phe 965 970 975 Asp Phe Ser Asn Pro Ile Thr Glu Asp Ile Val Leu Thr Ala Lys 980 985 990 Trp Gly Glu Glu Gly Ala Ala Pro Thr Ile Thr Ala Pro Ala Ser 995 1000 1005 Val Val Val Gly Gln Asp Phe Asp Leu His Ile Gly Ile Lys Gly 1010 1015 1020 Ile Glu Glu Gly Phe Asp Ser Leu Ala Val Val Val Asn Tyr Asp 1025 1030 1035 Pro Glu Gln Val Glu Phe Asp Thr Val Ser Asp Ala Glu Gly Ala 1040 1045 1050 Leu Ser Leu Ser Glu Gln Ala Val Ala Ser Leu Arg Ser Asp Leu 1055 1060 1065 His Val Leu Gly Thr Gly Val Lys Pro Asp Ala Gly Gln Ile Leu 1070 1075 1080 Ile Ile Leu Ser Thr Thr Gly Gln Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp 1085 1090 1095 Leu Leu Val Leu His Gly Lys Ala Arg Ala Gly Ala Ala Ala Gly 1100 1105 1110 Thr Thr Ile Ile Ala Leu Ser Asp Phe Glu Val Ser Ala Asn Gly 1115 1120 1125 Ser Ser Gln Ser Leu Asn Thr Asp Gly Ser Ser Val Ala Ile Gln 1130 1135 1140 Ile Arg Leu Ala Asp His Ala Ala Leu Ala Ser Ala Ile Ser Glu 1145 1150 1155 Ala Glu Gln Leu Leu Ala Gln Ala Val Glu Gly Ser Gln Pro Gly 1160 1165 1170 Gln Tyr Pro Ala Gly Thr Lys Ala Ala Leu Arg Leu Ala Val Asn 1175 1180 1185 Gln Ala Ile Ala Val Arg Asp Asn Ala Ser Ala Ile Asn Glu Gln 1190 1195 1200 Ile Ala Gln Ala Ala Val Ser Leu Asn Asn Ala Ile Lys Leu Phe 1205 1210 1215 Lys Ser Leu Val Asn Pro Asp Pro Ser Pro Ser Ala Asp Lys Ile 1220 1225 1230 Ala Leu Asn Ala Ala Ile Ala Ala Ala Gln Thr Lys Leu Gly Gln 1235 1240 1245 Ala Lys Glu Gly Thr Lys Val Gly Gln Tyr Ser Ala Ser Ala Ile 1250 1255 1260 Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Gln Thr Ala Asn Ala Val Lys Asn 1265 1270 1275 Asp Ser Thr Ala Ser Gln Tyr Ser Val Asp Gln Ala Thr Ala Lys 1280 1285 1290 Leu Asn Glu Ala Val Ala Glu Phe Thr Ala Lys Met Ile Thr Leu 1295 1300 1305 Val Pro Gly Gln Thr Gly Val Thr Leu Ser Asp Leu Ser Tyr Leu 1310 1315 1320 Ala Lys Tyr Tyr Gly Val Lys Ser Thr Asp Pro Glu Trp Ser Asn 1325 1330 1335 Val Glu Lys Ala Asp Leu Phe Asp Ser Gly Glu Ile Thr Ile Arg 1340 1345 1350 Glu Leu Ala Ala Ile Ala Arg Met Ile Val Asp Asn Trp Leu Asp 1355 1360 1365 Gln 1366 <210> 5 <211> 1716 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <400> 5 gtggttaatt tacgagcgaa accattttat ctggatgatg atgccgtgat ttgggtgcaa 60 agcacattag aaaaaatgga tatacgagcc aaggttggcc aattgttttg tgaaattgtg 120 tgggacaagc cgggcatgga catagacagt ctgtttactg atatcgaacc gggcggaatt 180 atgtttcgtc ctgatacagg ggccaacatt caaaaatcgg ccaggtatgt gcagcagaag 240 gctcaaattc cgctgttaat tgccggtaat ctcgaacgtg gcggcagcgg tggaaacggt 300 gggtttaagg acgggaccta ctttggttcg cccatgcaag ttgctgctac cgatgatgaa 360 gagaacggtt ataggcttgg gttaattgca tgcagggaag gggcggctgc aggggtaaac 420 tggacattcg aacccatcat cgatattgac tataattttc ataatccaat tacgaatgtt 480 cggacgttcg gcagtgattt aaatcgtata ctccggatgg ccaaaggtta catgcgaggg 540 gcttatgagt gcggagtggc cgtatcgatc aagcattggc cgggagacgg agttgatttt 600 cgcgatcagc atttgctggc cagtgttaac agtatgtcgg tagaagaatg gaatgcatca 660 tttggttggc tatataaaga aatgatcgat gccggcgcca atacgttgat ggcctcccat 720 attaaattgc cggcgtactc tcggaaattg cgcccgggaa ttaaggatga agagatcatg 780 cctgcctcat tggctcccga attgcatcat caattattgc gtgagcagtt aggatttaac 840 ggcctcatcg tcagcgatgc tacccagatg gctggattta cggtatcgat ggaacgcgaa 900 aaagcggttc ctgccgccat agccgcggga tgcgacatgt ttttgtttac aattaatcac 960 agggaagacg ttcaatacat gttaaggggt gtcgagcaag gtatcattag ccaggaaaga 1020 ttaaatgaag cggttacccg tattctggcg cttaaagcat ctcttgggct gcatagaaag 1080 cagcacgaac ataaccttgt tcctgggact gatgctttgc aactgctgct gtgcgaccaa 1140 catgtgagtt gggccaaaga atgcgcagac caagctatca cgctgattaa ggatagagag 1200 caactattgc ctctttcgac cgaaaggcac aagcgcattc tattgcaaac gattacgaat 1260 gagcctacag atgaacaagg ttttactgcc gaatcattgc agttcaagcg cttgcttgaa 1320 caatcaggat ttgagattac tgacttcaga tctgaagaga tgcctggggg tttacagggg 1380 aaaatatcaa tcagtgaatt gaagcaacaa acggatctta ttgtatatta tgtaaatatg 1420 agagtggcca gcaatcagaa tagtgtacga ttgtcttggg cggacttttt gggcgaagac 1500 tcgcctaagt atgcgaaaga tatccccgtc gtctttattt ccgcatccaa tccttatcat 1560 ctgatagatg taccgatggt atcgacttat attaacgcat acagttcaaa tcaatatgtt 1620 gtagaagctc tggttgataa attgcttgga aagtcggagt ttaaaggaat tagtcctgtc 1680 gatccatttt gcggattgtg ggatgccggg ctctga 1716 <210> 6 <211> 571 <212> PRT <213> Paenibacillus sp. <400> 6 Val Val Asn Leu Arg Ala Lys Pro Phe Tyr Leu Asp Asp Asp Ala 5 10 15 Val Ile Trp Val Gln Ser Thr Leu Glu Lys Met Asp Ile Arg Ala 20 25 30 Lys Val Gly Gln Leu Phe Cys Glu Ile Val Trp Asp Lys Pro Gly 35 40 45 Met Asp Ile Asp Ser Leu Phe Thr Asp Ile Glu Pro Gly Gly Ile 50 55 60 Met Phe Arg Pro Asp Thr Gly Ala Asn Ile Gln Lys Ser Ala Arg 65 70 75 Tyr Val Gln Gln Lys Ala Gln Ile Pro Leu Leu Ile Ala Gly Asn 80 85 90 Leu Glu Arg Gly Gly Ser Gly Gly Asn Gly Gly Phe Lys Asp Gly 95 100 105 Thr Tyr Phe Gly Ser Pro Met Gln Val Ala Ala Thr Asp Asp Glu 110 115 120 Glu Asn Gly Tyr Arg Leu Gly Leu Ile Ala Cys Arg Glu Gly Ala 125 130 135 Ala Ala Gly Val Asn Trp Thr Phe Glu Pro Ile Ile Asp Ile Asp 140 145 150 Tyr Asn Phe His Asn Pro Ile Thr Asn Val Arg Thr Phe Gly Ser 155 160 165 Asp Leu Asn Arg Ile Leu Arg Met Ala Lys Gly Tyr Met Arg Gly 170 175 180 Ala Tyr Glu Cys Gly Val Ala Val Ser Ile Lys His Trp Pro Gly 185 190 195 Asp Gly Val Asp Phe Arg Asp Gln His Leu Leu Ala Ser Val Asn 200 205 210 Ser Met Ser Val Glu Glu Trp Asn Ala Ser Phe Gly Trp Leu Tyr 215 220 225 Lys Glu Met Ile Asp Ala Gly Ala Asn Thr Leu Met Ala Ser His 230 235 240 Ile Lys Leu Pro Ala Tyr Ser Arg Lys Leu Arg Pro Gly Ile Lys 245 250 255 Asp Glu Glu Ile Met Pro Ala Ser Leu Ala Pro Glu Leu His His 260 265 270 Gln Leu Leu Arg Glu Gln Leu Gly Phe Asn Gly Leu Ile Val Ser 275 280 285 Asp Ala Thr Gln Met Ala Gly Phe Thr Val Ser Met Glu Arg Glu 290 295 300 Lys Ala Val Pro Ala Ala Ile Ala Ala Gly Cys Asp Met Phe Leu 305 310 315 Phe Thr Ile Asn His Arg Glu Asp Val Gln Tyr Met Leu Arg Gly 320 325 330 Val Glu Gln Gly Ile Ile Ser Gln Glu Arg Leu Asn Glu Ala Val 335 340 345 Thr Arg Ile Leu Ala Leu Lys Ala Ser Leu Gly Leu His Arg Lys 350 355 360 Gln His Glu His Asn Leu Val Pro Gly Thr Asp Ala Leu Gln Leu 365 370 375 Leu Leu Cys Asp Gln His Val Ser Trp Ala Lys Glu Cys Ala Asp 380 385 390 Gln Ala Ile Thr Leu Ile Lys Asp Arg Glu Gln Leu Leu Pro Leu 395 400 405 Ser Thr Glu Arg His Lys Arg Ile Leu Leu Gln Thr Ile Thr Asn 410 415 420 Glu Pro Thr Asp Glu Gln Gly Phe Thr Ala Glu Ser Leu Gln Phe 425 430 435 Lys Arg Leu Leu Glu Gln Ser Gly Phe Glu Ile Thr Asp Phe Arg 440 445 450 Ser Glu Glu Met Pro Gly Gly Leu Gln Gly Lys Ile Ser Ile Ser 455 460 465 Glu Leu Lys Gln Gln Thr Asp Leu Ile Val Tyr Tyr Val Asn Met 470 475 480 Arg Val Ala Ser Asn Gln Asn Ser Val Arg Leu Ser Trp Ala Asp 485 490 495 Phe Leu Gly Glu Asp Ser Pro Lys Tyr Ala Lys Asp Ile Pro Val 500 505 510 Val Phe Ile Ser Ala Ser Asn Pro Tyr His Leu Ile Asp Val Pro 515 520 525 Met Val Ser Thr Tyr Ile Asn Ala Tyr Ser Ser Asn Gln Tyr Val 530 535 540 Val Glu Ala Leu Val Asp Lys Leu Leu Gly Lys Ser Glu Phe Lys 545 550 555 Gly Ile Ser Pro Val Asp Pro Phe Cys Gly Leu Trp Asp Ala Gly 560 565 570 Leu 571 <210> 7 <211> 2937 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <400> 7 atgatgagct ttattcctga aagtgccagc gcctcaacaa gtcagccttc aattttgcca 60 aagcctgtaa gctatacagt gggatccggg caatttgttt taacaaagaa cgcttccatc 120 tttgtagccg gcaataacgt aggagaaacg gatgagctgt tcaacattgg acaagccctc 180 gccaaaaaac tgaatgcatc gaccgggtat accatcagtg tcgtcaaatc aaaccagccg 240 acggctggaa gtatttattt gactacagtt ggcggaaatg ccgccctggg caatgaaggg 300 tatgatttaa tcacgacttc caatcaggtt acgcttactg caaataaacc ggaaggagtc 360 tttagaggca atcaaacctt attgcagctc ttgccggcgg gtattgaaaa gaacaccgtt 420 gtttccggcg tgcaatgggt aatcccccat tccaatatta gcgacaagcc cgaatatgaa 480 tatcgcggac ttatgcttga tgtggctcga cacttcttta ccgtggatga agttaaacgt 540 cagattgatc tggcctcgca gtataagatc aacaaatttc atatgcattt gtctgacgat 600 cagggctggc gtattgaaat taaatcatgg cctgatctca tagagatcgg aagcaaggga 660 caggtaggcg gcggtcccgg cggatattat acgcaggagc agttcaaaga tattgtcagc 720 tatgcggctg aacgatacat tgaagttatt ccggaaatcg atatgcccgg tcatacgaat 780 gccgctttag cttcttatgg tgaacttaat cctgatggaa aaagaaaagc tatgcgcacc 840 gatacggctg tagggtacag cacgctcatg cctcgcgccg agattacgta tcaatttgtt 900 gaagatgtca tcagcgagct tgccgcaata tcgccttcgc cttatattca tctgggtggc 960 gatgaatcta acgcaacgtc ggctgccgac tatgattatt tttttggcag agttacggct 1020 attgctaaca gttacggcaa gaaagtcgtt ggctgggacc cgtccgatac gtcaagcgga 1080 gcaactagcg attctgttct gcagaactgg acttgcagcg cctcaaccgg aactgcggca 1140 aaagcaaaag ggatgaaggt catcgtatct cctgcaaatg cttatcttga catgaaatac 1200 tacagtgatt cgccaattgg tttacaatgg agaggatttg tcaatacaaa cagagcttat 1260 aattgggatc cgaccgattg catcaaggga gcgaatattt acggagttga aagtacatta 1320 tggacagaaa cctttgtaac acaagatcat ttggattata tgctctatcc gaaattatta 1380 tcaaatgctg aagtcggctg gactgcccgg ggagatcgaa actgggatga ttttaaagaa 1440 aggctgatcg aacatacgcc aagattgcaa aataaaggaa ttaaattttt tgccgaccct 1500 attgtgtggg agcttccgat tgtccagatt aattcagaat ggaagatgga tgaaggaacc 1560 ggcaccgtcg tgaaggacac ttccggttat ttaaacggaa ctttagttgg cggcgcaaag 1620 tggacagcgg gcaaacaagg aaatggggta agctttgatg gaagctcggg ctacataaat 1680 ttaggcggtc aggatataac agggaactgg accgcagcag tatgggttta cggccagcca 1740 aatacaacga ataatgaaac gctgctgagc ggcacaactt cagcaatcaa gatcaaccag 1800 tataataaaa caggtaaagt cgggattacc atttacggta cgaaagacta tacgtacaat 1860 tatagcattc catccaataa atggactcat ctgacgttcg taggcacaag cacggggact 1920 gcgctttatg aaaacggcgt gctgaaagaa acaatcgccg caaaaatgaa tggtccaatg 1980 gctttggtgg gagcggaaaa aacgggagga tccggagatt taacctctta tttcagagga 2040 agtctggatg aattgaaaat attcaacaga gcgctaagcg caagcgaggt tgttgaattg 2100 gcaaaatcgc cggcgccgaa ggcgtcgctc acaggtcctc aatcggcgaa tcccggtcaa 2160 tccttcgatg taaaaatggg gttgagcgac gtttccccaa gcgaattcgg acaaatgtat 2220 gctcaagact ggacgattaa ctatgattcg gcgaagttgc agttagattc gattacatcg 2280 ctgcaagata agtttcaagt gatcgaccaa aaggagttgg cgccgggaca aatccggatt 2340 gtggctgcga atgcagctgc gaaccaagga gtgactccgc aaggcgattt gttcgcattc 2400 aaatttacag ttaaagcggg aaccgatgtc aagacgacaa tttcggcaga ccatattgtt 2460 attggcaacg cacaggggaa agaattggag atcgcggggg ccactcacga gatccaggtc 2520 agcatcccag tagacaaatc gcaattgaat gtactgattg cgaacgctca agccaagcat 2580 gatgcggcgg tggaaggaaa tgaagacggg ttgtacgccg caggttccaa agcgcaattg 2640 caaacggcta ttcatacagc caaagcggta gcagacaatt cgaatgcatc tcaacaacag 2700 gtggatagtg cgaaatccgc attggaagag gccgttcaag tatttgaaag caagaaaata 2760 tctgcagacg taaacggaga tggtcaggtc tctattggag atttggcaat cattgcgggt 2820 gcttacggca aagaggaagg tcaggctggc tggaataaaa aagcggatgt gaatcacgac 2880 ggcaaggttg acattataga ccttacaatc gtagccaaag cgatcttgca gatataa 2937 <210> 8 <211> 978 <212> PRT <213> Paenibacillus sp. <400> 8 Met Met Ser Phe Ile Pro Glu Ser Ala Ser Ala Ser Thr Ser Gln 5 10 15 Pro Ser Ile Leu Pro Lys Pro Val Ser Tyr Thr Val Gly Ser Gly 20 25 30 Gln Phe Val Leu Thr Lys Asn Ala Ser Ile Phe Val Ala Gly Asn 35 40 45 Asn Val Gly Glu Thr Asp Glu Leu Phe Asn Ile Gly Gln Ala Leu 50 55 60 Ala Lys Lys Leu Asn Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ile Ser Val Val 65 70 75 Lys Ser Asn Gln Pro Thr Ala Gly Ser Ile Tyr Leu Thr Thr Val 80 85 90 Gly Gly Asn Ala Ala Leu Gly Asn Glu Gly Tyr Asp Leu Ile Thr 95 100 105 Thr Ser Asn Gln Val Thr Leu Thr Ala Asn Lys Pro Glu Gly Val 110 115 120 Phe Arg Gly Asn Gln Thr Leu Leu Gln Leu Leu Pro Ala Gly Ile 125 130 135 Glu Lys Asn Thr Val Val Ser Gly Val Gln Trp Val Ile Pro His 140 145 150 Ser Asn Ile Ser Asp Lys Pro Glu Tyr Glu Tyr Arg Gly Leu Met 155 160 165 Leu Asp Val Ala Arg His Phe Phe Thr Val Asp Glu Val Lys Arg 170 175 180 Gln Ile Asp Leu Ala Ser Gln Tyr Lys Ile Asn Lys Phe His Met 185 190 195 His Leu Ser Asp Asp Gln Gly Trp Arg Ile Glu Ile Lys Ser Trp 200 205 210 Pro Asp Leu Ile Glu Ile Gly Ser Lys Gly Gln Val Gly Gly Gly 215 220 225 Pro Gly Gly Tyr Tyr Thr Gln Glu Gln Phe Lys Asp Ile Val Ser 230 235 240 Tyr Ala Ala Glu Arg Tyr Ile Glu Val Ile Pro Glu Ile Asp Met 240 245 255 Pro Gly His Thr Asn Ala Ala Leu Ala Ser Tyr Gly Glu Leu Asn 260 265 270 Pro Asp Gly Lys Arg Lys Ala Met Arg Thr Asp Thr Ala Val Gly 275 280 285 Tyr Ser Thr Leu Met Pro Arg Ala Glu Ile Thr Tyr Gln Phe Val 290 295 300 Glu Asp Val Ile Ser Glu Leu Ala Ala Ile Ser Pro Ser Pro Tyr 305 310 315 Ile His Leu Gly Gly Asp Glu Ser Asn Ala Thr Ser Ala Ala Asp 320 325 330 Tyr Asp Tyr Phe Phe Gly Arg Val Thr Ala Ile Ala Asn Ser Tyr 335 340 345 Gly Lys Lys Val Val Gly Trp Asp Pro Ser Asp Thr Ser Ser Gly 350 355 360 Ala Thr Ser Asp Ser Val Leu Gln Asn Trp Thr Cys Ser Ala Ser 365 370 375 Thr Gly Thr Ala Ala Lys Ala Lys Gly Met Lys Val Ile Val Ser 380 385 390 Pro Ala Asn Ala Tyr Leu Asp Met Lys Tyr Tyr Ser Asp Ser Pro 395 400 405 Ile Gly Leu Gln Trp Arg Gly Phe Val Asn Thr Asn Arg Ala Tyr 410 415 420 Asn Trp Asp Pro Thr Asp Cys Ile Lys Gly Ala Asn Ile Tyr Gly 425 430 435 Val Glu Ser Thr Leu Trp Thr Glu Thr Phe Val Thr Gln Asp His 440 445 450 Leu Asp Tyr Met Leu Tyr Pro Lys Leu Leu Ser Asn Ala Glu Val 455 460 465 Gly Trp Thr Ala Arg Gly Asp Arg Asn Trp Asp Asp Phe Lys Glu 470 475 480 Arg Leu Ile Glu His Thr Pro Arg Leu Gln Asn Lys Gly Ile Lys 485 490 495 Phe Phe Ala Asp Pro Ile Val Trp Glu Leu Pro Ile Val Gln Ile 500 505 510 Asn Ser Glu Trp Lys Met Asp Glu Gly Thr Gly Thr Val Val Lys 525 520 525 Asp Thr Ser Gly Tyr Leu Asn Gly Thr Leu Val Gly Gly Ala Lys 530 535 540 Trp Thr Ala Gly Lys Gln Gly Asn Gly Val Ser Phe Asp Gly Ser 545 550 555 Ser Gly Tyr Ile Asn Leu Gly Gly Gln Asp Ile Thr Gly Asn Trp 560 565 570 Thr Ala Ala Val Trp Val Tyr Gly Gln Pro Asn Thr Thr Asn Asn 575 580 585 Glu Thr Leu Leu Ser Gly Thr Thr Ser Ala Ile Lys Ile Asn Gln 590 595 600 Tyr Asn Lys Thr Gly Lys Val Gly Ile Thr Ile Tyr Gly Thr Lys 605 610 615 Asp Tyr Thr Tyr Asn Tyr Ser Ile Pro Ser Asn Lys Trp Thr His 620 625 630 Leu Thr Phe Val Gly Thr Ser Thr Gly Thr Ala Leu Tyr Glu Asn 635 640 645 Gly Val Leu Lys Glu Thr Ile Ala Ala Lys Met Asn Gly Pro Met 650 655 660 Ala Leu Val Gly Ala Glu Lys Thr Gly Gly Ser Gly Asp Leu Thr 665 670 675 Ser Tyr Phe Arg Gly Ser Leu Asp Glu Leu Lys Ile Phe Asn Arg 680 685 690 Ala Leu Ser Ala Ser Glu Val Val Glu Leu Ala Lys Ser Pro Ala 695 700 705 Pro Lys Ala Ser Leu Thr Gly Pro Gln Ser Ala Asn Pro Gly Gln 710 715 720 Ser Phe Asp Val Lys Met Gly Leu Ser Asp Val Ser Pro Ser Glu 725 730 735 Phe Gly Gln Met Tyr Ala Gln Asp Trp Thr Ile Asn Tyr Asp Ser 740 745 750 Ala Lys Leu Gln Leu Asp Ser Ile Thr Ser Leu Gln Asp Lys Phe 755 760 765 Gln Val Ile Asp Gln Lys Glu Leu Ala Pro Gly Gln Ile Arg Ile 770 775 780 Val Ala Ala Asn Ala Ala Ala Asn Gln Gly Val Thr Pro Gln Gly 785 790 795 Asp Leu Phe Ala Phe Lys Phe Thr Val Lys Ala Gly Thr Asp Val 800 805 810 Lys Thr Thr Ile Ser Ala Asp His Ile Val Ile Gly Asn Ala Gln 815 820 825 Gly Lys Glu Leu Glu Ile Ala Gly Ala Thr His Glu Ile Gln Val 830 835 840 Ser Ile Pro Val Asp Lys Ser Gln Leu Asn Val Leu Ile Ala Asn 845 850 855 Ala Gln Ala Lys His Asp Ala Ala Val Glu Gly Asn Glu Asp Gly 860 865 870 Leu Tyr Ala Ala Gly Ser Lys Ala Gln Leu Gln Thr Ala Ile His 875 880 885 Thr Ala Lys Ala Val Ala Asp Asn Ser Asn Ala Ser Gln Gln Gln 890 895 900 Val Asp Ser Ala Lys Ser Ala Leu Glu Glu Ala Val Gln Val Phe 905 910 915 Glu Ser Lys Lys Ile Ser Ala Asp Val Asn Gly Asp Gly Gln Val 920 925 930 Ser Ile Gly Asp Leu Ala Ile Ile Ala Gly Ala Tyr Gly Lys Glu 935 940 945 Glu Gly Gln Ala Gly Trp Asn Lys Lys Ala Asp Val Asn His Asp 950 955 960 Gly Lys Val Asp Ile Ile Asp Leu Thr Ile Val Ala Lys Ala Ile 965 970 975 Leu Gln Ile 978

【図面の簡単な説明】

【図１】ガングリオシド分解酵素生産菌の１次スクリー
ニングを示す薄層クロマトグラフ。

【図２】ＴＳ１２株によるＧＭ１の分解様式を示す薄層
クロマトグラフ。

【図３】ＴＳ１２株のＮＢＤ−ＧＭ１の分解様式を示す
示すグラフ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA12 CA04 DA05 DA06 EA04 FA02 GA11 HA03 4B050 CC01 CC03 DD02 LL05 4B064 AF21 CA02 CA19 CC24 DA01 4B065 AA01Y AA26X AB01 BA01 CA16 CA19 CA44

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１で示す塩基配列ならびに配列
   番号２で示すアミノ酸配列を有することを特徴とするβ
   −グルコシダーゼ遺伝子 (glc4)。
2. 【請求項２】 配列番号３で示す塩基配列ならびに配列
   番号４で示すアミノ酸配列を有することを特徴とするβ
   −グルコシダーゼ遺伝子 (glc8)。
3. 【請求項３】 配列番号５で示す塩基配列ならびに配列
   番号６で示すアミノ酸配列を有することを特徴とするβ
   −グルコシダーゼ遺伝子 (glc28)。
4. 【請求項４】 配列番号７で示す塩基配列ならびに配列
   番号８で示すアミノ酸配列を有することを特徴とするβ
   −ヘキソサミニダーゼ遺伝子 (hex36)。
5. 【請求項５】 エキソ型ガングリオシド分解酵素（β−
   グルコシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼ、シアリダー
   ゼおよびβ−ガラクトシダーゼ）を生産するPaenibacil
   lus sp. TS12 ＦＥＲＭ Ｐ−１８４１６。
6. 【請求項６】 Paenibacillus sp. TS12 ＦＥＲＭ Ｐ
   −１８４１６由来のβ−ヘキソサミニダーゼ遺伝子およ
   びβ−グルコシダーゼ遺伝子の大腸菌による組み換え体
   ポリペプチド。
7. 【請求項７】 エキソ型ガングリオシド分解酵素産生菌
   Paenibacillus sp.TS12 ＦＥＲＭ Ｐ−１８４１６を
   粗ガングリオシドと共培養して各種スフィンゴ糖脂質を
   得ることを特徴とするスフィンゴ糖脂質の製造方法。