JP2003052394A - 酵素反応解析方法及び解析装置 - Google Patents
酵素反応解析方法及び解析装置Info
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- JP2003052394A JP2003052394A JP2001241534A JP2001241534A JP2003052394A JP 2003052394 A JP2003052394 A JP 2003052394A JP 2001241534 A JP2001241534 A JP 2001241534A JP 2001241534 A JP2001241534 A JP 2001241534A JP 2003052394 A JP2003052394 A JP 2003052394A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 最大反応速度Ｖmax及びミカエリス定数Ｋmを
正確に算出する。 【解決手段】 酵素活性を有する試料溶液について一定
波長での吸光度の時間変化の測定結果に基づいて基質濃
度ｓiとそれに対する酵素反応の反応速度ｖi（但しｉ=
１〜ｎ）とが与えられたとき、下記式を満たすようなＫ
mを算出し、 Σ(ｖi/ｓi)・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)〕/｛Σ(１/ｓi)・
〔１/(１＋Ｋm/ｓi)2〕−Σ(ｖi/ｓi2)・〔１/(１＋Ｋm
/ｓi)2〕/｛Σ(１/ｓi2)・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)3〕＝０ 次いで前記Ｋmを下記式に適用してＶmaxを算出する。 Ｖmax＝Σ(ｖi/ｓi)・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)〕/｛Σ(１/
ｓi)・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)2〕
正確に算出する。 【解決手段】 酵素活性を有する試料溶液について一定
波長での吸光度の時間変化の測定結果に基づいて基質濃
度ｓiとそれに対する酵素反応の反応速度ｖi（但しｉ=
１〜ｎ）とが与えられたとき、下記式を満たすようなＫ
mを算出し、 Σ(ｖi/ｓi)・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)〕/｛Σ(１/ｓi)・
〔１/(１＋Ｋm/ｓi)2〕−Σ(ｖi/ｓi2)・〔１/(１＋Ｋm
/ｓi)2〕/｛Σ(１/ｓi2)・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)3〕＝０ 次いで前記Ｋmを下記式に適用してＶmaxを算出する。 Ｖmax＝Σ(ｖi/ｓi)・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)〕/｛Σ(１/
ｓi)・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)2〕
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、酵素活性を有する
試料について一定波長の光に対する吸光度の時間変化を
分光光度計を用いて測定し、その結果に基づいて酵素反
応の最大反応速度やミカエリス定数といった指標値を算
出するための酵素反応解析方法及び解析装置に関する。
試料について一定波長の光に対する吸光度の時間変化を
分光光度計を用いて測定し、その結果に基づいて酵素反
応の最大反応速度やミカエリス定数といった指標値を算
出するための酵素反応解析方法及び解析装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】各種の酵素による活性反応を調べる方法
として、基質に酵素を添加した後に酵素反応の生じてい
るその溶液の吸光度の時間変化を分光光度計によって測
定し、その時間変化率に基づいて活性値を算出するとい
う方法が従来より用いられている。例えば、酵素活性値
は、吸光度の時間変化（Abs/min）に吸光度−濃度の換
算係数を乗じ、必要に応じて希釈率などを補正するため
の補正係数を乗じることにより求めることができる。
として、基質に酵素を添加した後に酵素反応の生じてい
るその溶液の吸光度の時間変化を分光光度計によって測
定し、その時間変化率に基づいて活性値を算出するとい
う方法が従来より用いられている。例えば、酵素活性値
は、吸光度の時間変化（Abs/min）に吸光度−濃度の換
算係数を乗じ、必要に応じて希釈率などを補正するため
の補正係数を乗じることにより求めることができる。
【０００３】また、こうした酵素反応はミカエリス−メ
ンテンの式に従うことがよく知られている。すなわち、
酵素反応の速度をｖ、基質の濃度をｓとしたとき、 ｖ＝Ｖmax・ｓ/(Ｋm＋ｓ) …(1) となる関係である。ここで、Ｖmaxは最大反応速度、Ｋm
はミカエリス定数と呼ばれる定数である。この式の意味
するところは、酵素反応の反応速度ｖは基質濃度ｓが増
加するに伴って増大し、その最大値、つまり最大反応速
度Ｖmaxに漸近するということであり、反応速度ｖが最
大反応速度Ｖmaxの１/２となるような基質濃度をミカエ
リス定数Ｋmとして定義している。
ンテンの式に従うことがよく知られている。すなわち、
酵素反応の速度をｖ、基質の濃度をｓとしたとき、 ｖ＝Ｖmax・ｓ/(Ｋm＋ｓ) …(1) となる関係である。ここで、Ｖmaxは最大反応速度、Ｋm
はミカエリス定数と呼ばれる定数である。この式の意味
するところは、酵素反応の反応速度ｖは基質濃度ｓが増
加するに伴って増大し、その最大値、つまり最大反応速
度Ｖmaxに漸近するということであり、反応速度ｖが最
大反応速度Ｖmaxの１/２となるような基質濃度をミカエ
リス定数Ｋmとして定義している。
【０００４】したがって、酵素反応の特性を知るには、
最大反応速度Ｖmax及びミカエリス定数Ｋmが重要な指標
値である。従来、最大反応速度Ｖmax及びミカエリス定
数Ｋmを求めるために最もよく用いられている方法は、
ラインウェーバー・バーク（Lineweaver-Burk）プロッ
トによる方法である。すなわち、上記(1)式は次式に書
き換えることができる。 １/ｖ＝(１/Ｖmax)＋(Ｋm/Ｖmax)・(１/ｓ) …(2) この式がラインウェーバー・バークの式であり、基質濃
度ｓの相違する複数の試料に関して１/ｖと１/ｓとの関
係をプロットしたグラフがラインウェーバー・バークプ
ロットである。
最大反応速度Ｖmax及びミカエリス定数Ｋmが重要な指標
値である。従来、最大反応速度Ｖmax及びミカエリス定
数Ｋmを求めるために最もよく用いられている方法は、
ラインウェーバー・バーク（Lineweaver-Burk）プロッ
トによる方法である。すなわち、上記(1)式は次式に書
き換えることができる。 １/ｖ＝(１/Ｖmax)＋(Ｋm/Ｖmax)・(１/ｓ) …(2) この式がラインウェーバー・バークの式であり、基質濃
度ｓの相違する複数の試料に関して１/ｖと１/ｓとの関
係をプロットしたグラフがラインウェーバー・バークプ
ロットである。
【０００５】(1)式から(2)式への変換はｓ→１/ｓ，ｖ
→１/ｖという軸変換操作であり、１/ｓ−１/ｖのグラ
フ上では各プロット点より回帰直線を引くことができ
る。そこで、各プロット点の最小二乗誤差を最小にする
ように直線を引き、その直線の傾きと縦軸（つまり１/
ｖ）との交点の値からＶmaxとＫmとを求める。
→１/ｖという軸変換操作であり、１/ｓ−１/ｖのグラ
フ上では各プロット点より回帰直線を引くことができ
る。そこで、各プロット点の最小二乗誤差を最小にする
ように直線を引き、その直線の傾きと縦軸（つまり１/
ｖ）との交点の値からＶmaxとＫmとを求める。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】上述した算出方法は簡
便であって計算の手間も小さくてすむ。しかしながら、
軸変換操作を行った上で回帰直線を引いているため、グ
ラフ上の各プロット点の誤差の影響を均一にすることが
できない。そのため、Ｖmax、Ｋmともに真値からずれる
傾向にある。また、このことは、(1)式のミカエリス−
メンテンの式に従ったグラフを描出したときに、ｓ，ｖ
の関係を示す曲線がＶmaxに漸近していると捉えにくい
グラフになることを意味する。
便であって計算の手間も小さくてすむ。しかしながら、
軸変換操作を行った上で回帰直線を引いているため、グ
ラフ上の各プロット点の誤差の影響を均一にすることが
できない。そのため、Ｖmax、Ｋmともに真値からずれる
傾向にある。また、このことは、(1)式のミカエリス−
メンテンの式に従ったグラフを描出したときに、ｓ，ｖ
の関係を示す曲線がＶmaxに漸近していると捉えにくい
グラフになることを意味する。
【０００７】本発明はこのような課題を解決するために
成されたものであり、その目的とするところは、分光光
度計により測定した吸光度の時間変化を基に最大反応速
度Ｖmax及びミカエリス定数Ｋmを算出する酵素活性解析
方法及び解析装置において、最大反応速度Ｖmax及びミ
カエリス定数Ｋmを従来よりも精度よく求めることがで
きる酵素反応解析方法及び解析装置を提供することにあ
る。
成されたものであり、その目的とするところは、分光光
度計により測定した吸光度の時間変化を基に最大反応速
度Ｖmax及びミカエリス定数Ｋmを算出する酵素活性解析
方法及び解析装置において、最大反応速度Ｖmax及びミ
カエリス定数Ｋmを従来よりも精度よく求めることがで
きる酵素反応解析方法及び解析装置を提供することにあ
る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明者は、基質濃度ｓと反応速度ｖとの組（ｓ，
ｖ）から最大反応速度Ｖmax及びミカエリス定数Ｋmを算
出する際に、軸変換を行うことなく最小二乗近似法によ
り誤差解析を実行することに想到した。
に、本発明者は、基質濃度ｓと反応速度ｖとの組（ｓ，
ｖ）から最大反応速度Ｖmax及びミカエリス定数Ｋmを算
出する際に、軸変換を行うことなく最小二乗近似法によ
り誤差解析を実行することに想到した。
【０００９】すなわち、本発明に係る酵素反応解析方法
は、酵素活性を有する試料溶液について一定波長での吸
光度の時間変化の測定結果に基づいて、酵素反応に関す
る指標値である最大反応速度Ｖmaxとミカエリス定数Ｋm
とを算出する酵素反応解析方法であって、前記測定の結
果として基質濃度ｓiとそれに対する酵素反応の反応速
度ｖi（但しｉ=１〜ｎ）とが与えられたとき、 a)下記式又はその変形式を満たすようなＫmを算出する
ステップと、 Σｗi・ｖi・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)〕/｛Σｗi・〔１/(１
＋Ｋm/ｓi)2〕＝Σｗi2・ｖi・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)2〕/
｛Σｗi2・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)3〕 （ただし、ｗiは（ｓi，ｖi）に対する重み付け係数で
あり、重み付けをしない場合にｉ=１〜ｎにおけるｗiは
等しい） b) 前記Ｋmを下記式に適用してＶmaxを算出するステッ
プと、 Ｖmax＝Σｗi・ｖi・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)〕/｛Σｗi・
〔１/(１＋Ｋm/ｓi)2〕 を含むことを特徴としている。
は、酵素活性を有する試料溶液について一定波長での吸
光度の時間変化の測定結果に基づいて、酵素反応に関す
る指標値である最大反応速度Ｖmaxとミカエリス定数Ｋm
とを算出する酵素反応解析方法であって、前記測定の結
果として基質濃度ｓiとそれに対する酵素反応の反応速
度ｖi（但しｉ=１〜ｎ）とが与えられたとき、 a)下記式又はその変形式を満たすようなＫmを算出する
ステップと、 Σｗi・ｖi・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)〕/｛Σｗi・〔１/(１
＋Ｋm/ｓi)2〕＝Σｗi2・ｖi・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)2〕/
｛Σｗi2・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)3〕 （ただし、ｗiは（ｓi，ｖi）に対する重み付け係数で
あり、重み付けをしない場合にｉ=１〜ｎにおけるｗiは
等しい） b) 前記Ｋmを下記式に適用してＶmaxを算出するステッ
プと、 Ｖmax＝Σｗi・ｖi・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)〕/｛Σｗi・
〔１/(１＋Ｋm/ｓi)2〕 を含むことを特徴としている。
【００１０】この発明に係る酵素反応解析方法では、基
質濃度ｓiが低い領域では高い領域よりも前記両式にお
ける寄与度が高くなるような重み付けを行うことが好ま
しい。
質濃度ｓiが低い領域では高い領域よりも前記両式にお
ける寄与度が高くなるような重み付けを行うことが好ま
しい。
【００１１】また、本発明に係る酵素反応解析装置は、
a)基質濃度の相違する複数種類の酵素活性を有する試料
について、一定波長での吸光度の時間変化を測定する分
光測定手段と、 b)前記吸光度の時間変化より各試料における酵素反応の
反応速度を求める第１の演算処理手段と、 c)前記各試料に対応して算出された、基質濃度ｓiとそ
れに対する酵素反応の反応速度ｖi（但しｉ=１〜ｎ）の
データを受け、 c1)下記式又はその変形式を満たすようなミカエリス定
数Ｋmを算出し、 Σｗi・ｖi・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)〕/｛Σｗi・〔１/(１
＋Ｋm/ｓi)2〕＝Σｗi2・ｖi・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)2〕/
｛Σｗi2・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)3〕 （ただし、ｗiは（ｓi，ｖi）に対する重み付け係数で
あり、重み付けをしない場合にｉ=１〜ｎにおけるｗiは
等しい） c2)次いで、前記Ｋmを下記式に適用して最大反応速度Ｖ
maxを算出する第２の演算処理手段と、 Ｖmax＝Σｗi・ｖi・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)〕/｛Σｗi・
〔１/(１＋Ｋm/ｓi)2〕 を備えることを特徴としている。
について、一定波長での吸光度の時間変化を測定する分
光測定手段と、 b)前記吸光度の時間変化より各試料における酵素反応の
反応速度を求める第１の演算処理手段と、 c)前記各試料に対応して算出された、基質濃度ｓiとそ
れに対する酵素反応の反応速度ｖi（但しｉ=１〜ｎ）の
データを受け、 c1)下記式又はその変形式を満たすようなミカエリス定
数Ｋmを算出し、 Σｗi・ｖi・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)〕/｛Σｗi・〔１/(１
＋Ｋm/ｓi)2〕＝Σｗi2・ｖi・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)2〕/
｛Σｗi2・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)3〕 （ただし、ｗiは（ｓi，ｖi）に対する重み付け係数で
あり、重み付けをしない場合にｉ=１〜ｎにおけるｗiは
等しい） c2)次いで、前記Ｋmを下記式に適用して最大反応速度Ｖ
maxを算出する第２の演算処理手段と、 Ｖmax＝Σｗi・ｖi・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)〕/｛Σｗi・
〔１/(１＋Ｋm/ｓi)2〕 を備えることを特徴としている。
【００１２】この発明に係る酵素反応解析装置では、前
記第２の演算処理手段は、基質濃度ｓiが低い領域では
高い領域よりも前記両式における寄与度が高くなるよう
な重み付けを行うことが好ましい。
記第２の演算処理手段は、基質濃度ｓiが低い領域では
高い領域よりも前記両式における寄与度が高くなるよう
な重み付けを行うことが好ましい。
【００１３】
【発明の実施の形態】まず、本発明に係る酵素反応解析
方法において最大反応速度Ｖmax及びミカエリス定数Ｋm
を算出する原理について説明する。
方法において最大反応速度Ｖmax及びミカエリス定数Ｋm
を算出する原理について説明する。
【００１４】上記(1)式は次のように書き換えることが
できる。 ｖ＝Ｖmax・ｓ/(Ｋm＋ｓ) ＝Ｖmax・〔１/(１＋Ｋm/ｓ)〕 …(3) したがって、Ｖmax，Ｋmを未知として、最小二乗法の意
味で最適な値を与えるＶmax，Ｋmを求めればよい。
できる。 ｖ＝Ｖmax・ｓ/(Ｋm＋ｓ) ＝Ｖmax・〔１/(１＋Ｋm/ｓ)〕 …(3) したがって、Ｖmax，Ｋmを未知として、最小二乗法の意
味で最適な値を与えるＶmax，Ｋmを求めればよい。
【００１５】いま、測定点として、
（ｓi，ｖi） 但し１≦i≦ｎ
が与えられている。ここで、求めようとする曲線は、低
濃度の領域でより効率よく一致してほしいので、１/ｓi
（上記ｗi）を重み付け係数として与えることとする。
すなわち、上記命題は次の(4)式を最小にするＶmax，Ｋ
mを求めることになる。 Δ2＝Σ(１/ｓi)・｛ｖi−Ｖmax・〔１/(１＋Ｋm/ｓ)〕｝2 …(4)
濃度の領域でより効率よく一致してほしいので、１/ｓi
（上記ｗi）を重み付け係数として与えることとする。
すなわち、上記命題は次の(4)式を最小にするＶmax，Ｋ
mを求めることになる。 Δ2＝Σ(１/ｓi)・｛ｖi−Ｖmax・〔１/(１＋Ｋm/ｓ)〕｝2 …(4)
【００１６】(4)式で誤差が最小になるときには局値を
とるから、Ｖmax，Ｋmによる偏微分は０でなければなら
ない。まず、(4)式に対するＶmaxによる偏微分により
(5)式が得られる。 ∂Δ2/∂Ｖmax＝−２Σ〔１/ｓi(１＋Ｋm/ｓi)〕・｛ｖi−Ｖmax・〔１/(１ ＋Ｋm/ｓi)〕｝＝０ …(5) これより、ＶmaxとＫmとの関係として次の(6)式が得られる。 Ｖmax＝Σ(ｖi/ｓi)・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)〕/｛Σ(１/ｓi)・〔１/(１＋Ｋm /ｓi)2〕 …(6)
とるから、Ｖmax，Ｋmによる偏微分は０でなければなら
ない。まず、(4)式に対するＶmaxによる偏微分により
(5)式が得られる。 ∂Δ2/∂Ｖmax＝−２Σ〔１/ｓi(１＋Ｋm/ｓi)〕・｛ｖi−Ｖmax・〔１/(１ ＋Ｋm/ｓi)〕｝＝０ …(5) これより、ＶmaxとＫmとの関係として次の(6)式が得られる。 Ｖmax＝Σ(ｖi/ｓi)・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)〕/｛Σ(１/ｓi)・〔１/(１＋Ｋm /ｓi)2〕 …(6)
【００１７】一方、(4)式に対するＫmによる偏微分によ
り(7)式が得られる。 ∂Δ2/∂Ｋm＝−２Σ(Ｖmax/ｓi2)・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)2〕・｛ｖi−Ｖmax ・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)〕｝＝０ …(7) Ｖmaxは非ゼロであると仮定してよいので、ＶmaxとＫm
との関係として次の(8)式が得られる。 Ｖmax＝Σ(ｖi/ｓi2)・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)2〕/｛Σ(１/ｓi2)・〔１/(１＋ Ｋm/ｓi)3〕 …(8)
り(7)式が得られる。 ∂Δ2/∂Ｋm＝−２Σ(Ｖmax/ｓi2)・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)2〕・｛ｖi−Ｖmax ・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)〕｝＝０ …(7) Ｖmaxは非ゼロであると仮定してよいので、ＶmaxとＫm
との関係として次の(8)式が得られる。 Ｖmax＝Σ(ｖi/ｓi2)・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)2〕/｛Σ(１/ｓi2)・〔１/(１＋ Ｋm/ｓi)3〕 …(8)
【００１８】上記(6)，(8)式より次の(9)式が得られ
る。 Ｆ(Ｋm)＝Σ(ｖi/ｓi)・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)〕/｛Σ(１/ｓi)・〔１/(１＋ Ｋm/ｓi)2〕−Σ(ｖi/ｓi2)・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)2〕/｛Σ(１/ｓi2)・〔１/(１ ＋Ｋm/ｓi)3〕＝０ …(9) この(9)式を満たすＫmが求めようとしている値である。
このＫmが求まれば、上記(6)式よりＶmaxも同様に求め
ることができる。
る。 Ｆ(Ｋm)＝Σ(ｖi/ｓi)・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)〕/｛Σ(１/ｓi)・〔１/(１＋ Ｋm/ｓi)2〕−Σ(ｖi/ｓi2)・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)2〕/｛Σ(１/ｓi2)・〔１/(１ ＋Ｋm/ｓi)3〕＝０ …(9) この(9)式を満たすＫmが求めようとしている値である。
このＫmが求まれば、上記(6)式よりＶmaxも同様に求め
ることができる。
【００１９】なお、重み付け係数は必須ではないもの
の、ミカエリス−メンテンの式の性質上、低濃度領域で
の値の寄与度を高くしたほうが、より確からしい近似を
行うことができる。もちろん、重み付け係数を与える場
合でも、１/ｓiでなく、他の値としてもよい。
の、ミカエリス−メンテンの式の性質上、低濃度領域で
の値の寄与度を高くしたほうが、より確からしい近似を
行うことができる。もちろん、重み付け係数を与える場
合でも、１/ｓiでなく、他の値としてもよい。
【００２０】上記本発明による演算方法と従来方法とで
計算を行った場合の結果の相違について具体例を挙げて
説明する。
計算を行った場合の結果の相違について具体例を挙げて
説明する。
【００２１】いま、(ｓi，ｖi)として、(5.71，0.156
6)，(6.67，0.1737)，(8，0.2176)，(10，0.2615)，(1
3.3，0.3188)，(20，0.4)という６個の測定データが得
られたものとする。このとき従来のラインウェーバー・
バークの方法による計算では、Ｖmax＝1.3215，Ｋm＝4
2.3869と求まる。また、この解析結果に基づいてミカエ
リス−メンテン式に従った関係を示すと図４のグラフに
なる。このグラフでは、最大基質濃度であるｓ＝20で漸
近線Ｖmaxとの乖離は約0.9215となっている。
6)，(6.67，0.1737)，(8，0.2176)，(10，0.2615)，(1
3.3，0.3188)，(20，0.4)という６個の測定データが得
られたものとする。このとき従来のラインウェーバー・
バークの方法による計算では、Ｖmax＝1.3215，Ｋm＝4
2.3869と求まる。また、この解析結果に基づいてミカエ
リス−メンテン式に従った関係を示すと図４のグラフに
なる。このグラフでは、最大基質濃度であるｓ＝20で漸
近線Ｖmaxとの乖離は約0.9215となっている。
【００２２】これに対し、本発明による方法では、(9)
式に従って横軸をＫm、縦軸をｖにとったグラフをＫm＝
０から50の範囲に亘って描くと、図２に示すようにな
る。この図２より、Ｋm＝32.5でゼロラインと交差する
ことがわかる。すなわち、求めたいミカエリス定数Ｋm
は32.5である。更に、(6)式により最大反応速度Ｖmaxを
求めると、Ｖmax＝1.073442と求まる。このようにして
求めたＫm，Ｖmaxを用いてミカエリス−メンテンの関係
を示すと図３のようになる。この図３では、ｓ＝20で漸
近線Ｖmaxとの乖離は約0.67であり、上述した従来方法
と比べて著しく改善されていることがわかる。
式に従って横軸をＫm、縦軸をｖにとったグラフをＫm＝
０から50の範囲に亘って描くと、図２に示すようにな
る。この図２より、Ｋm＝32.5でゼロラインと交差する
ことがわかる。すなわち、求めたいミカエリス定数Ｋm
は32.5である。更に、(6)式により最大反応速度Ｖmaxを
求めると、Ｖmax＝1.073442と求まる。このようにして
求めたＫm，Ｖmaxを用いてミカエリス−メンテンの関係
を示すと図３のようになる。この図３では、ｓ＝20で漸
近線Ｖmaxとの乖離は約0.67であり、上述した従来方法
と比べて著しく改善されていることがわかる。
【００２３】次に、上記酵素反応解析方法を利用した酵
素反応解析装置の一実施例を説明する。図１は本実施例
による酵素反応解析装置の構成図である。この酵素反応
解析装置は大別して分光測定部１と演算処理部６とから
構成されており、分光測定部１は光源部２、分光部３、
試料セル４、光検出部５を含み、演算処理部６は吸光度
演算部７、酵素反応解析演算部８を含む。演算処理部６
の実体は、ハードウエアとしてはＣＰＵを中心に構成さ
れるパーソナルコンピュータであって、吸光度演算部７
や酵素反応解析演算部８はそのコンピュータ上で実行さ
れる所定のソフトウエアによりその動作が達成される。
また、演算処理部６には、入力操作を行うためのキーボ
ードやポインティングデバイスなどの入力部９、解析結
果のグラフなどを表示するためのモニタ１０が接続され
ている。
素反応解析装置の一実施例を説明する。図１は本実施例
による酵素反応解析装置の構成図である。この酵素反応
解析装置は大別して分光測定部１と演算処理部６とから
構成されており、分光測定部１は光源部２、分光部３、
試料セル４、光検出部５を含み、演算処理部６は吸光度
演算部７、酵素反応解析演算部８を含む。演算処理部６
の実体は、ハードウエアとしてはＣＰＵを中心に構成さ
れるパーソナルコンピュータであって、吸光度演算部７
や酵素反応解析演算部８はそのコンピュータ上で実行さ
れる所定のソフトウエアによりその動作が達成される。
また、演算処理部６には、入力操作を行うためのキーボ
ードやポインティングデバイスなどの入力部９、解析結
果のグラフなどを表示するためのモニタ１０が接続され
ている。
【００２４】試料セル４には基質に酵素を添加した試料
溶液が収容される。光源部２から放射された白色光のう
ち、分光部３により特定波長の単色光を取り出して試料
セル４に照射する。この単色光は酵素による活性反応を
生じている試料溶液中を通過し、その過程で光の一部が
吸収され、この透過光の光強度を光検出部５で検出す
る。この検出信号は吸光度演算部７へ送られ、照射光と
透過光との比に基づいて吸光度が計算される。この吸光
度の測定は所定時間間隔毎に、所定の測定時間に達する
まで繰り返し行われる。これにより吸光度の時間変化曲
線が作成される。
溶液が収容される。光源部２から放射された白色光のう
ち、分光部３により特定波長の単色光を取り出して試料
セル４に照射する。この単色光は酵素による活性反応を
生じている試料溶液中を通過し、その過程で光の一部が
吸収され、この透過光の光強度を光検出部５で検出す
る。この検出信号は吸光度演算部７へ送られ、照射光と
透過光との比に基づいて吸光度が計算される。この吸光
度の測定は所定時間間隔毎に、所定の測定時間に達する
まで繰り返し行われる。これにより吸光度の時間変化曲
線が作成される。
【００２５】最大反応速度Ｖmaxやミカエリス定数Ｋmを
求めたい場合には、基質濃度の相違する複数の試料溶液
についてそれぞれ吸光度の時間変化を求め、基質濃度ｓ
iと反応速度ｖiとの値の組を酵素反応解析演算部８に与
える。酵素反応解析演算部８は上述したような演算を実
行することにより、最大反応速度Ｖmax及びミカエリス
定数Ｋmを算出し、モニタ１０の画面上にこれを数値と
して表示するとともに、ミカエリス−メンテンの式に従
った図３に示したようなグラフを描出する。
求めたい場合には、基質濃度の相違する複数の試料溶液
についてそれぞれ吸光度の時間変化を求め、基質濃度ｓ
iと反応速度ｖiとの値の組を酵素反応解析演算部８に与
える。酵素反応解析演算部８は上述したような演算を実
行することにより、最大反応速度Ｖmax及びミカエリス
定数Ｋmを算出し、モニタ１０の画面上にこれを数値と
して表示するとともに、ミカエリス−メンテンの式に従
った図３に示したようなグラフを描出する。
【００２６】なお、上記実施例は本発明の一例にすぎ
ず、本発明の趣旨の範囲で適宜変更や修正を行えること
は明らかである。
ず、本発明の趣旨の範囲で適宜変更や修正を行えること
は明らかである。
【００２７】
【発明の効果】以上のように、本発明による酵素反応解
析方法及び解析装置によれば、基質濃度ｓと反応速度ｖ
を組とする複数種類の測定データが与えられたときに、
軸変換を行うことなく最小二乗法により最大反応速度Ｖ
max及びミカエリス定数Ｋmを算出することができる。そ
のため、最大反応速度Ｖmax及びミカエリス定数Ｋmの算
出精度が向上し、より正確性の高い、基質濃度ｓと反応
速度ｖとの関係を示すグラフを描くことができる。
析方法及び解析装置によれば、基質濃度ｓと反応速度ｖ
を組とする複数種類の測定データが与えられたときに、
軸変換を行うことなく最小二乗法により最大反応速度Ｖ
max及びミカエリス定数Ｋmを算出することができる。そ
のため、最大反応速度Ｖmax及びミカエリス定数Ｋmの算
出精度が向上し、より正確性の高い、基質濃度ｓと反応
速度ｖとの関係を示すグラフを描くことができる。
【図１】 本発明の一実施例による酵素反応解析装置の
構成図。
構成図。
【図２】 本発明の酵素反応解析方法を説明するための
グラフ。
グラフ。
【図３】 本発明の酵素反応解析方法により描かれるミ
カエリス−メンテンの式に従ったグラフ。
カエリス−メンテンの式に従ったグラフ。
【図４】 従来のラインウェーバー・バークプロットに
よる方法により描かれるミカエリス−メンテンの式に従
ったグラフ。
よる方法により描かれるミカエリス−メンテンの式に従
ったグラフ。
【符号の説明】
１…分光測定部
２…光源部
３…分光部
４…試料セル
５…光検出部
６…演算処理部
７…吸光度演算部
８…酵素反応解析演算部
９…入力部
１０…モニタ
フロントページの続き
Ｆターム(参考） 2G054 AA10 AB03 EA04 EB01 GA07
GB01
2G059 AA02 AA10 BB04 CC16 EE01
EE12 FF04 HH02 JJ01 KK01
MM01 MM02 MM10
4B029 AA07 BB16 FA10 FA12
4B063 QA01 QQ15 QQ16 QQ18 QQ21
QQ61 QR01 QR41 QR50 QR57
QS24 QS28 QX01
Claims (4)
- 【請求項１】 酵素活性を有する試料溶液について一定
波長での吸光度の時間変化の測定結果に基づいて、酵素
反応に関する指標値である最大反応速度Ｖmaxとミカエ
リス定数Ｋmとを算出する酵素反応解析方法であって、 前記測定の結果として基質濃度ｓiとそれに対する酵素
反応の反応速度ｖi（但しｉ=１〜ｎ）とが与えられたと
き、 a)下記式又はその変形式を満たすようなＫmを算出する
ステップと、 Σｗi・ｖi・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)〕/｛Σｗi・〔１/(１
＋Ｋm/ｓi)2〕＝Σｗi2・ｖi・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)2〕/
｛Σｗi2・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)3〕（ただし、ｗiは（ｓ
i，ｖi）に対する重み付け係数であり、重み付けをしな
い場合にｉ=１〜ｎにおけるｗiは等しい） b) 前記Ｋmを下記式に適用してＶmaxを算出するステッ
プと、 Ｖmax＝Σｗi・ｖi・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)〕/｛Σｗi・
〔１/(１＋Ｋm/ｓi)2〕 を含むことを特徴とする酵素反応解析方法。 - 【請求項２】 基質濃度ｓiが低い領域では高い領域よ
りも前記両式における寄与度が高くなるような重み付け
を行うことを特徴とする請求項１に記載の酵素反応解析
方法。 - 【請求項３】 a)基質濃度の相違する複数種類の酵素活
性を有する試料について、一定波長での吸光度の時間変
化を測定する分光測定手段と、 b)前記吸光度の時間変化より各試料における酵素反応の
反応速度を求める第１の演算処理手段と、 c)前記各試料に対応して算出された、基質濃度ｓiとそ
れに対する酵素反応の反応速度ｖi（但しｉ=１〜ｎ）の
データを受け、 c1)下記式又はその変形式を満たすようなミカエリス定
数Ｋmを算出し、 Σｗi・ｖi・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)〕/｛Σｗi・〔１/(１
＋Ｋm/ｓi)2〕＝Σｗi2・ｖi・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)2〕/
｛Σｗi2・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)3〕 （ただし、ｗiは（ｓi，ｖi）に対する重み付け係数で
あり、重み付けをしない場合にｉ=１〜ｎにおけるｗiは
等しい） c2)次いで、前記Ｋmを下記式に適用して最大反応速度Ｖ
maxを算出する第２の演算処理手段と、 Ｖmax＝Σｗi・ｖi・〔１/(１＋Ｋm/ｓi)〕/｛Σｗi・
〔１/(１＋Ｋm/ｓi)2〕 を備えることを特徴とする酵素反応解析装置。 - 【請求項４】 前記第２の演算処理手段は、基質濃度ｓ
iが低い領域では高い領域よりも前記両式における寄与
度が高くなるような重み付けを行うことを特徴とする請
求項３に記載の酵素反応解析装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001241534A JP2003052394A (ja) | 2001-08-09 | 2001-08-09 | 酵素反応解析方法及び解析装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001241534A JP2003052394A (ja) | 2001-08-09 | 2001-08-09 | 酵素反応解析方法及び解析装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003052394A true JP2003052394A (ja) | 2003-02-25 |
Family
ID=19071956
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001241534A Pending JP2003052394A (ja) | 2001-08-09 | 2001-08-09 | 酵素反応解析方法及び解析装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003052394A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101788462A (zh) * | 2010-03-09 | 2010-07-28 | 清华大学 | 一种单通道酶活自动检测装置 |
| CN107014928A (zh) * | 2017-05-03 | 2017-08-04 | 杭州帕匹德科技有限公司 | 一种蛋白质酶解反应动力学参数的测定方法 |
-
2001
- 2001-08-09 JP JP2001241534A patent/JP2003052394A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101788462A (zh) * | 2010-03-09 | 2010-07-28 | 清华大学 | 一种单通道酶活自动检测装置 |
| CN107014928A (zh) * | 2017-05-03 | 2017-08-04 | 杭州帕匹德科技有限公司 | 一种蛋白质酶解反应动力学参数的测定方法 |
| CN107014928B (zh) * | 2017-05-03 | 2019-08-20 | 杭州帕匹德科技有限公司 | 一种蛋白质酶解反应动力学参数的测定方法 |
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