JP2003042953A - サンプル分析器を較正するための方法 - Google Patents
サンプル分析器を較正するための方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は定量顕微分光学の分野に関し、詳細
にはより正確なＨＣＴ値を得るためのサンプル分析器の
較正方法に関する。詳細にはプラスチック製使い捨てキ
ュベットからの蛍光に影響されない、あるいは不完全ダ
イクロイックフィルタユニットによる励起／発光クロス
トークに影響されることのない方法を提供する。 【解決手段】 生物学的液体のサンプル、好ましくは全
血を、例えば、厚さが異なる少なくとも２つの領域を有
する光学キュベットなどのチャンバ内に沈着させ、それ
により好ましい実施形態では、血漿が赤血球中には拡散
しない蛍光染料を含有することによって達成される。サ
ンプルは励起光を用いて照射され、それにより血漿が蛍
光放射を放出する。蛍光染料は、励起光および放出され
る蛍光がいずれも赤血球に吸収されないように選択され
る。
にはより正確なＨＣＴ値を得るためのサンプル分析器の
較正方法に関する。詳細にはプラスチック製使い捨てキ
ュベットからの蛍光に影響されない、あるいは不完全ダ
イクロイックフィルタユニットによる励起／発光クロス
トークに影響されることのない方法を提供する。 【解決手段】 生物学的液体のサンプル、好ましくは全
血を、例えば、厚さが異なる少なくとも２つの領域を有
する光学キュベットなどのチャンバ内に沈着させ、それ
により好ましい実施形態では、血漿が赤血球中には拡散
しない蛍光染料を含有することによって達成される。サ
ンプルは励起光を用いて照射され、それにより血漿が蛍
光放射を放出する。蛍光染料は、励起光および放出され
る蛍光がいずれも赤血球に吸収されないように選択され
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は定量顕微分光法(qua
ntitative microspecrtoscopy)の分野に関し、さらに詳
細には、サンプル分析器(sample analyzer)を較正する
(calibrate)ための方法に関する。
ntitative microspecrtoscopy)の分野に関し、さらに詳
細には、サンプル分析器(sample analyzer)を較正する
(calibrate)ための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヘマトクリット値（「ＨＣＴ」: Hemato
crit）、単一赤血球の体積（「ＲＣＶ」: Volume of si
ngle Red Blood Cells）、平均細胞体積（「ＭＣＶ」:
Mean Cell Volume）、および赤血球分布幅（「ＲＤ
Ｗ」: Red Cell Distribution Width）などの血液パラ
メータ(blood parameter)の決定は、際立った臨床上の
関心事であり、通常、電気インピーダンス測定に基づく
システム（クールタ計数器:Coulter Counter）あるいは
光散乱に基づくシステム（流動血球計算器，フローサイ
トメータ: Flow Cytometer）が使用されている（例え
ば、Ｊ．Ｂ．Ｈｅｎｒｙ著「Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｉａ
ｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｂｙ
ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍｅｔｈｏｄｓ」（ｐｐ．５４
８ｆｆ、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ、
Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９６年、あるいはＤ．
Ｈ．Ｔｙｃｋｏ、Ｍ．Ｈ．Ｍｅｔｚ、Ｅ．Ａ．Ｅｐｓｔ
ｅｉｎ、Ａ．Ｇｒｉｎｂａｕｍ著「Ｆｌｏｗ−ｃｙｔｏ
ｍｅｔｒｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｍ
ｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃ
ｅｌｌｖｏｌｕｍｅ ａｎｄ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ」（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｏｐ
ｔｉｃｓ ２４（１９８５年）、１３５５〜１３６５）
を参照されたい）。インピーダンスカウンタは複雑かつ
高価な機器であり、機器およびサンプルパラメータの極
めて慎重な調整および制御を必要とする。フローサイト
メータの大きな欠点は、光を散乱させるパラメータが、
細胞の体積ばかりではなく、細胞の形状にも依存してい
ることである。
crit）、単一赤血球の体積（「ＲＣＶ」: Volume of si
ngle Red Blood Cells）、平均細胞体積（「ＭＣＶ」:
Mean Cell Volume）、および赤血球分布幅（「ＲＤ
Ｗ」: Red Cell Distribution Width）などの血液パラ
メータ(blood parameter)の決定は、際立った臨床上の
関心事であり、通常、電気インピーダンス測定に基づく
システム（クールタ計数器:Coulter Counter）あるいは
光散乱に基づくシステム（流動血球計算器，フローサイ
トメータ: Flow Cytometer）が使用されている（例え
ば、Ｊ．Ｂ．Ｈｅｎｒｙ著「Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｉａ
ｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｂｙ
ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍｅｔｈｏｄｓ」（ｐｐ．５４
８ｆｆ、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ、
Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９６年、あるいはＤ．
Ｈ．Ｔｙｃｋｏ、Ｍ．Ｈ．Ｍｅｔｚ、Ｅ．Ａ．Ｅｐｓｔ
ｅｉｎ、Ａ．Ｇｒｉｎｂａｕｍ著「Ｆｌｏｗ−ｃｙｔｏ
ｍｅｔｒｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｍ
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ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ」（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｏｐ
ｔｉｃｓ ２４（１９８５年）、１３５５〜１３６５）
を参照されたい）。インピーダンスカウンタは複雑かつ
高価な機器であり、機器およびサンプルパラメータの極
めて慎重な調整および制御を必要とする。フローサイト
メータの大きな欠点は、光を散乱させるパラメータが、
細胞の体積ばかりではなく、細胞の形状にも依存してい
ることである。
【０００３】１９８３年に、Ｇｒａｙ、Ｈｏｆｆｍａ
ｎ、およびＨａｎｓｅｎによって、フローサイトメータ
中の細胞の体積を決定するための新しい光学式の方法が
提案された（Ｍ．Ｌ．Ｇｒａｙ、Ｒ．Ａ．Ｈｏｆｆｍａ
ｎ、Ｗ．Ｐ．Ｈａｎｓｅｎ著「Ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏ
ｄ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｖｏｌｕｍｅ ｍｅａｓｕｒｅ
ｍｅｎｔ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｖｏｌｕｍｅ ｅｘｃｌ
ｕｓｉｏｎ ｏｆ ａｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅ
ｓ」（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ３（１９８３年）、４２８
〜４３２））。この方法では、細胞膜を貫通することが
できない蛍光染料(fluorescent dye)中で細胞が懸濁(su
spend)する。集束レーザビーム(focusedlaser beam)に
よって細胞懸濁(cell suspension)の細長い流れが励起
されることによって生じる蛍光のレベル(level of fluo
rescence)は、細胞が照射領域(illuminated region)に
到達し、蛍光強度(fluorescence intensity)が細胞の体
積に正比例して減少するまで一定のレベルを維持する。
フローサイトメータの場合、単一細胞は、約１０μｓ以
内でレーザ照射スポットを通過する。このようにデータ
収集時間間隔が短いため、電子検出帯域幅(electronic
detection bandwidth)を相対的に広くしなければなら
ず、そのために信号対雑音比が不十分となり、体積決定
(volume determination)の精度が低くなる。
ｎ、およびＨａｎｓｅｎによって、フローサイトメータ
中の細胞の体積を決定するための新しい光学式の方法が
提案された（Ｍ．Ｌ．Ｇｒａｙ、Ｒ．Ａ．Ｈｏｆｆｍａ
ｎ、Ｗ．Ｐ．Ｈａｎｓｅｎ著「Ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏ
ｄ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｖｏｌｕｍｅ ｍｅａｓｕｒｅ
ｍｅｎｔ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｖｏｌｕｍｅ ｅｘｃｌ
ｕｓｉｏｎ ｏｆ ａｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅ
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〜４３２））。この方法では、細胞膜を貫通することが
できない蛍光染料(fluorescent dye)中で細胞が懸濁(su
spend)する。集束レーザビーム(focusedlaser beam)に
よって細胞懸濁(cell suspension)の細長い流れが励起
されることによって生じる蛍光のレベル(level of fluo
rescence)は、細胞が照射領域(illuminated region)に
到達し、蛍光強度(fluorescence intensity)が細胞の体
積に正比例して減少するまで一定のレベルを維持する。
フローサイトメータの場合、単一細胞は、約１０μｓ以
内でレーザ照射スポットを通過する。このようにデータ
収集時間間隔が短いため、電子検出帯域幅(electronic
detection bandwidth)を相対的に広くしなければなら
ず、そのために信号対雑音比が不十分となり、体積決定
(volume determination)の精度が低くなる。
【０００４】利用可能なデータ収集時間は、細胞を静止
サンプル(stationary sample)中で懸濁(suspend)させ、
ディジタル影像蛍光顕微鏡検査法を適用することによ
り、著しく増大させることができる（Ｐ．Ｌ．Ｂｅｃｋ
ｅｒ、Ｆ．Ｓ．Ｆａｙ著「Ｃｅｌｌ−ｖｏｌｕｍｅ ｍ
ｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｄｉｇｉ
ｔａｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ」（Ｂｉｏｓｈｙｓｉｃａｌ Ｊ
ｏｕｒｎａｌ４９（１９８６年）、Ａ４６５）を参照さ
れたい）。このディジタル蛍光顕微鏡検査手法では、細
胞の体積を決定する(determine the cell volume)ため
の較正手順(calibration procedure)が必要である。Ｒ
ｅｃｋｔｅｎｗａｌｄおよび協働者によって、細胞と共
に懸濁される、光学的に透明でかつ非蛍光性の微小球体
によって較正する方法が導入された（Ｄ．Ｒｅｃｋｔｅ
ｎｗａｌｄ、Ｊ．Ｐｈｉ−Ｗｉｌｓｏｎ、Ｂ．Ｖｅｒｗ
ｅｒ著「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｉｔａ
ｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｄｉｇｉｔａｌ ｍｉｃｒｏｓ
ｃｏｐｙ」（Ｊｏｕｒｎａｌ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ ９７（１９９３年）、２８６８〜２８
７０））。顕微鏡下の投影面積を測定し、理想球形と仮
定してその数字を体積に変換することにより、個々の球
体の体積が決定される。蛍光発光ができない球体の体積
の結果としての蛍光強度の減少が、必要な較正パラメー
タとして使用される。この手法の利点は、較正粒子がサ
ンプル自体の内部に位置することである。つまり、まさ
に同じサンプル容器に対して較正され、特別な較正サン
プル(extra calibration sample)を必要としないことで
ある。
サンプル(stationary sample)中で懸濁(suspend)させ、
ディジタル影像蛍光顕微鏡検査法を適用することによ
り、著しく増大させることができる（Ｐ．Ｌ．Ｂｅｃｋ
ｅｒ、Ｆ．Ｓ．Ｆａｙ著「Ｃｅｌｌ−ｖｏｌｕｍｅ ｍ
ｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｄｉｇｉ
ｔａｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ」（Ｂｉｏｓｈｙｓｉｃａｌ Ｊ
ｏｕｒｎａｌ４９（１９８６年）、Ａ４６５）を参照さ
れたい）。このディジタル蛍光顕微鏡検査手法では、細
胞の体積を決定する(determine the cell volume)ため
の較正手順(calibration procedure)が必要である。Ｒ
ｅｃｋｔｅｎｗａｌｄおよび協働者によって、細胞と共
に懸濁される、光学的に透明でかつ非蛍光性の微小球体
によって較正する方法が導入された（Ｄ．Ｒｅｃｋｔｅ
ｎｗａｌｄ、Ｊ．Ｐｈｉ−Ｗｉｌｓｏｎ、Ｂ．Ｖｅｒｗ
ｅｒ著「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｉｔａ
ｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｄｉｇｉｔａｌ ｍｉｃｒｏｓ
ｃｏｐｙ」（Ｊｏｕｒｎａｌ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ ９７（１９９３年）、２８６８〜２８
７０））。顕微鏡下の投影面積を測定し、理想球形と仮
定してその数字を体積に変換することにより、個々の球
体の体積が決定される。蛍光発光ができない球体の体積
の結果としての蛍光強度の減少が、必要な較正パラメー
タとして使用される。この手法の利点は、較正粒子がサ
ンプル自体の内部に位置することである。つまり、まさ
に同じサンプル容器に対して較正され、特別な較正サン
プル(extra calibration sample)を必要としないことで
ある。
【０００５】較正球体(calibration sphere)を細胞懸濁
(cell suspension)内で使用することには問題がある。
第１に、球体を導入することにより、ワークフローのス
テップが追加される。高スループット用に設計されたシ
ステムでは、このステップの追加は有利ではない。第２
は、Ｒｅｃｋｔｅｎｗａｌｄおよび協働者には、蛍光染
料分子(fluorescent dye molecule)が球体の表面に定着
する傾向があり、誤差の原因になることが分かっていた
ことである。第３に、球体の光屈折率が液体の屈折率と
十分に整合していない場合、測定される蛍光強度に、屈
折に基づくアーティファクト(refraction-based artifa
ct)が球体の縁に発生する。また、最後に、例えば数マ
イクロメートル程度以下の薄いサンプル厚さを必要とす
る場合、微小球体を使用することには問題がある。
(cell suspension)内で使用することには問題がある。
第１に、球体を導入することにより、ワークフローのス
テップが追加される。高スループット用に設計されたシ
ステムでは、このステップの追加は有利ではない。第２
は、Ｒｅｃｋｔｅｎｗａｌｄおよび協働者には、蛍光染
料分子(fluorescent dye molecule)が球体の表面に定着
する傾向があり、誤差の原因になることが分かっていた
ことである。第３に、球体の光屈折率が液体の屈折率と
十分に整合していない場合、測定される蛍光強度に、屈
折に基づくアーティファクト(refraction-based artifa
ct)が球体の縁に発生する。また、最後に、例えば数マ
イクロメートル程度以下の薄いサンプル厚さを必要とす
る場合、微小球体を使用することには問題がある。
【０００６】従来技術の問題を解決するために、異なる
領域に異なる光路長を有する、細胞懸濁(cell suspensi
on)のためのキュベット状光学サンプル容器(cuvette-li
ke optical sample container)の設計が提案されている
（Ｗａｒｄｌａｗへの米国特許第６，１２７，１８４
号）。少なくとも１つの領域では、希薄化されていない
血液の液体層の厚さが非常に薄い（２から７ミクロン）
ため、隔離ＲＢＣの単一層が形成される。他の領域では
液体層はもっと厚く（７から４０ミクロン）、ＲＢＣの
典型的な鎖状集合体（「Ｒｏｌｅａｕｘ」）を形成して
いる。厚い領域(thick area)はＨＣＴ決定用であり、ま
た、薄い領域(thin area)は、単一赤血球の体積（ＲＣ
Ｖ）決定用である。従来技術の場合、血漿(blood plasm
a)が、ＲＢＣの内部に浸透しない蛍光染料で着色されて
いる。
領域に異なる光路長を有する、細胞懸濁(cell suspensi
on)のためのキュベット状光学サンプル容器(cuvette-li
ke optical sample container)の設計が提案されている
（Ｗａｒｄｌａｗへの米国特許第６，１２７，１８４
号）。少なくとも１つの領域では、希薄化されていない
血液の液体層の厚さが非常に薄い（２から７ミクロン）
ため、隔離ＲＢＣの単一層が形成される。他の領域では
液体層はもっと厚く（７から４０ミクロン）、ＲＢＣの
典型的な鎖状集合体（「Ｒｏｌｅａｕｘ」）を形成して
いる。厚い領域(thick area)はＨＣＴ決定用であり、ま
た、薄い領域(thin area)は、単一赤血球の体積（ＲＣ
Ｖ）決定用である。従来技術の場合、血漿(blood plasm
a)が、ＲＢＣの内部に浸透しない蛍光染料で着色されて
いる。
【０００７】Ｗａｒｄｌａｗによる方法および装置で
は、全血液サンプルのＨＣＴは、次の式
は、全血液サンプルのＨＣＴは、次の式
【０００８】
【数６】
【０００９】に従って決定されている。式（１）におい
て、Ｂｔは、無細胞(cell-free)血漿領域内の既知のサ
イズの領域に出現する蛍光強度(fluorescence intensit
y)である。Ｂａは、他の同一サイズの、連銭形成構造中
のＲＢＣからなる領域に出現する蛍光強度である。実際
にはＢｔは、ある無細胞領域(cell-free region)におけ
る蛍光強度を測定し、より大きいサイズまで外挿するこ
とによって決定される。興味深いことには、ＨＣＴを決
定するためにキュベットの高さを測定する必要がない。
て、Ｂｔは、無細胞(cell-free)血漿領域内の既知のサ
イズの領域に出現する蛍光強度(fluorescence intensit
y)である。Ｂａは、他の同一サイズの、連銭形成構造中
のＲＢＣからなる領域に出現する蛍光強度である。実際
にはＢｔは、ある無細胞領域(cell-free region)におけ
る蛍光強度を測定し、より大きいサイズまで外挿するこ
とによって決定される。興味深いことには、ＨＣＴを決
定するためにキュベットの高さを測定する必要がない。
【００１０】式（１）では、キュベットに再び現れる光
子(photon)は、すべて血漿中の蛍光光子(fluorescence
photon)によるものであると仮定しなければならない
が、実際にはすべての場合がそうとは限らない。少なく
とも２つのメカニズムにより、血漿内では生成されない
追加光子(additional photon)がキュベットに出現す
る。第１は、プラスチック製のキュベットを使用する場
合、プラスチック材自体が蛍光光子を放出することであ
る。第２は、蛍光顕微鏡に使用されるすべての実用ダイ
クロイックフィルタユニットが、ある程度の「励起／発
光クロストーク(excitation/emission cross-talk)」を
示すことである。つまり、少数の励起光子(excitation
photon)がダイクロイックフィルタユニット(dichroic f
ilter unit)を通過し、光検出器に到達することにな
る。
子(photon)は、すべて血漿中の蛍光光子(fluorescence
photon)によるものであると仮定しなければならない
が、実際にはすべての場合がそうとは限らない。少なく
とも２つのメカニズムにより、血漿内では生成されない
追加光子(additional photon)がキュベットに出現す
る。第１は、プラスチック製のキュベットを使用する場
合、プラスチック材自体が蛍光光子を放出することであ
る。第２は、蛍光顕微鏡に使用されるすべての実用ダイ
クロイックフィルタユニットが、ある程度の「励起／発
光クロストーク(excitation/emission cross-talk)」を
示すことである。つまり、少数の励起光子(excitation
photon)がダイクロイックフィルタユニット(dichroic f
ilter unit)を通過し、光検出器に到達することにな
る。
【００１１】このような非蛍光光子(non-fluorescence
photon)の数が多すぎると、ＨＣＴの決定に誤差が生じ
ることになり、したがってプラスチック製使い捨てキュ
ベット(plastic disposable cuvette)からの蛍光に影響
されない、あるいは不完全ダイクロイックダイクロイッ
クフィルタユニット(imperfect dichroic filter unit)
による励起−発光クロストーク(excitation/emission c
ross-talk)に影響されないＨＣＴ決定方法が必要であ
る。
photon)の数が多すぎると、ＨＣＴの決定に誤差が生じ
ることになり、したがってプラスチック製使い捨てキュ
ベット(plastic disposable cuvette)からの蛍光に影響
されない、あるいは不完全ダイクロイックダイクロイッ
クフィルタユニット(imperfect dichroic filter unit)
による励起−発光クロストーク(excitation/emission c
ross-talk)に影響されないＨＣＴ決定方法が必要であ
る。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、サン
プル分析器を較正するための方法、詳細にはプラスチッ
ク製使い捨てキュベットからの蛍光に影響されない、あ
るいは不完全ダイクロイックフィルタユニットによる励
起／発光クロストークに影響されることのない、したが
って低コストプラスチック製使い捨て用品、および不完
全低コストダイクロイックフィルタユニットの利用を可
能にする、ＨＣＴを決定するための較正方法を提供する
ことである。
プル分析器を較正するための方法、詳細にはプラスチッ
ク製使い捨てキュベットからの蛍光に影響されない、あ
るいは不完全ダイクロイックフィルタユニットによる励
起／発光クロストークに影響されることのない、したが
って低コストプラスチック製使い捨て用品、および不完
全低コストダイクロイックフィルタユニットの利用を可
能にする、ＨＣＴを決定するための較正方法を提供する
ことである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、上記の
目的は、生物学的液体のサンプル(sample of biologica
l fluid)、好ましくは全血(whole blood)を、例えば、
厚さが異なる少なくとも２つの領域(area)を有する光学
キュベットなどのチャンバ内に沈着(deposit)させ、そ
れにより好ましい実施形態では、血漿が赤血球中には拡
散(diffuse)しない蛍光染料(fluorescent dye)を含有す
ることによって達成される。サンプルは励起光(excitat
ion light)を用いて照射され、それにより血漿(plasma)
が蛍光放射(fluorescence radiation)を放出する。蛍光
染料は、励起光および放出される蛍光(emitted fluores
cence light)がいずれも赤血球(red blood cell)に吸収
されないように選択される。
目的は、生物学的液体のサンプル(sample of biologica
l fluid)、好ましくは全血(whole blood)を、例えば、
厚さが異なる少なくとも２つの領域(area)を有する光学
キュベットなどのチャンバ内に沈着(deposit)させ、そ
れにより好ましい実施形態では、血漿が赤血球中には拡
散(diffuse)しない蛍光染料(fluorescent dye)を含有す
ることによって達成される。サンプルは励起光(excitat
ion light)を用いて照射され、それにより血漿(plasma)
が蛍光放射(fluorescence radiation)を放出する。蛍光
染料は、励起光および放出される蛍光(emitted fluores
cence light)がいずれも赤血球(red blood cell)に吸収
されないように選択される。
【００１４】ＨＣＴ値は、以下によって決定される。
（ａ）サイズＡおよび第１の厚さを有する第１の対象領
域内の無細胞位置における蛍光強度値を測定する。 （ｂ）無細胞条件下であることが期待される第１の対象
領域から、積分蛍光強度Ｉまで外挿する。 （ｃ）液体サンプル高さを決定するための任意の知られ
ている方法を利用し、第１の対象領域内における厚さｄ
を決定する。 （ｄ）前記第１の対象領域内における、この領域内のす
べての細胞を含む積分蛍光強度Ｉcellを測定する。 （ｅ）サイズＡcal＝Ａ、および第２の厚さを有する第
２の対象領域内の無細胞位置における蛍光強度値を測定
する。 （ｆ）無細胞条件下であることが期待される第２の対象
領域から、積分蛍光強度Ｉcalまで外挿する。 （ｇ）液体サンプル高さを決定するための任意の知られ
ている方法を利用し、第２の対象領域内における厚さｄ
calを決定する。 （ｈ）これらの量Ｉ、Ｉcal、ｄ、ｄcal、およびＡを用
いて、次の式
域内の無細胞位置における蛍光強度値を測定する。 （ｂ）無細胞条件下であることが期待される第１の対象
領域から、積分蛍光強度Ｉまで外挿する。 （ｃ）液体サンプル高さを決定するための任意の知られ
ている方法を利用し、第１の対象領域内における厚さｄ
を決定する。 （ｄ）前記第１の対象領域内における、この領域内のす
べての細胞を含む積分蛍光強度Ｉcellを測定する。 （ｅ）サイズＡcal＝Ａ、および第２の厚さを有する第
２の対象領域内の無細胞位置における蛍光強度値を測定
する。 （ｆ）無細胞条件下であることが期待される第２の対象
領域から、積分蛍光強度Ｉcalまで外挿する。 （ｇ）液体サンプル高さを決定するための任意の知られ
ている方法を利用し、第２の対象領域内における厚さｄ
calを決定する。 （ｈ）これらの量Ｉ、Ｉcal、ｄ、ｄcal、およびＡを用
いて、次の式
【００１５】
【数７】
【００１６】に従って較正定数(calibration constant)
Ｃを計算する。 （ｉ）これらの量Ｉ、Ｉcell、ｄ、Ｃ、およびＡを用い
て、次の式
Ｃを計算する。 （ｉ）これらの量Ｉ、Ｉcell、ｄ、Ｃ、およびＡを用い
て、次の式
【００１７】
【数８】
【００１８】に従ってサンプルのＨＣＴ値を計算する。
【００１９】
【発明の実施の形態】本発明を適用した方法によれば、
好ましくは血液、より好ましくは懸濁赤血球（ＲＢＣs:
suspended red blood cells）を含有する希薄化されて
いない血液(undiluted blood)などの生物学的液体(biol
ogical fluid)のサンプルが、例えば、厚さが異なる少
なくとも２つの領域を有する光学キュベットなどのチャ
ンバ内に沈着される。キュベットは比較的薄く、かつ、
蛍光顕微鏡のサンプルステージ上への位置付けに適した
ものであることが好ましい。蛍光染料が添加され、液体
サンプル中に均等に分布される。染料は、染料が漏れて
ＲＢＣ中に浸入しないものが選択される。つまり、血漿
のみが蛍光染料で着色される。染料は、ＲＢＣ中での吸
収が少ないスペクトル領域内の励起光を吸収する。ま
た、染料は、ＲＢＣ中での吸収がほとんどない蛍光を放
出する。ヘモグロビンは、ＲＢＣ中における優性な吸収
体であるため、励起波長は、６００ｎｍより長いことが
好ましい。良好な染料の候補の１つに、６４０ｎｍ近辺
の波長範囲で励起することができるＴＯ−ＰＲＯ−３
（例えば、Ｏｒｅｇｏｎ州ＥｕｇｅｎｅのＭｏｌｅｃｕ
ｌａｒＰｒｏｂｅｓ社が販売している）がある。他の可
能な染料としては、やはりＲＢＣ中に浸入することのな
い、かつ、７５０ｎｍ近辺の波長で励起することができ
るＴＯ−ＰＲＯ−５（同じくＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒ
ｏｂｅｓ社が販売している）がある。
好ましくは血液、より好ましくは懸濁赤血球（ＲＢＣs:
suspended red blood cells）を含有する希薄化されて
いない血液(undiluted blood)などの生物学的液体(biol
ogical fluid)のサンプルが、例えば、厚さが異なる少
なくとも２つの領域を有する光学キュベットなどのチャ
ンバ内に沈着される。キュベットは比較的薄く、かつ、
蛍光顕微鏡のサンプルステージ上への位置付けに適した
ものであることが好ましい。蛍光染料が添加され、液体
サンプル中に均等に分布される。染料は、染料が漏れて
ＲＢＣ中に浸入しないものが選択される。つまり、血漿
のみが蛍光染料で着色される。染料は、ＲＢＣ中での吸
収が少ないスペクトル領域内の励起光を吸収する。ま
た、染料は、ＲＢＣ中での吸収がほとんどない蛍光を放
出する。ヘモグロビンは、ＲＢＣ中における優性な吸収
体であるため、励起波長は、６００ｎｍより長いことが
好ましい。良好な染料の候補の１つに、６４０ｎｍ近辺
の波長範囲で励起することができるＴＯ−ＰＲＯ−３
（例えば、Ｏｒｅｇｏｎ州ＥｕｇｅｎｅのＭｏｌｅｃｕ
ｌａｒＰｒｏｂｅｓ社が販売している）がある。他の可
能な染料としては、やはりＲＢＣ中に浸入することのな
い、かつ、７５０ｎｍ近辺の波長で励起することができ
るＴＯ−ＰＲＯ−５（同じくＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒ
ｏｂｅｓ社が販売している）がある。
【００２０】図１は、本発明の実践に適した、顕微鏡分
析のための光学キュベットの本質的な部分を示したもの
である。キュベットは、第１の窓（１）および第２の窓
（２）を有し、窓（１）および（２）の少なくとも１つ
は透明である。図１では、窓（２）を透明と仮定してい
る。キュベットには、連銭形成集合体(Roleaux aggrega
tes)を形成するＲＢＣs（４）を含む全血（３）が充填
されている。実際のサンプルでは、ＲＢＣは、全有効血
液体積中に分布している。より明確に数学モデル化する
ために、図１に示すＲＢＣS（４）は、厚さｄｃの明瞭
な部分体積中に集合している。本発明による方法を、結
果は同じであるが、赤血球を分布させた、より複雑なや
り方でモデル化することもできることを強調しておかな
ければならない。
析のための光学キュベットの本質的な部分を示したもの
である。キュベットは、第１の窓（１）および第２の窓
（２）を有し、窓（１）および（２）の少なくとも１つ
は透明である。図１では、窓（２）を透明と仮定してい
る。キュベットには、連銭形成集合体(Roleaux aggrega
tes)を形成するＲＢＣs（４）を含む全血（３）が充填
されている。実際のサンプルでは、ＲＢＣは、全有効血
液体積中に分布している。より明確に数学モデル化する
ために、図１に示すＲＢＣS（４）は、厚さｄｃの明瞭
な部分体積中に集合している。本発明による方法を、結
果は同じであるが、赤血球を分布させた、より複雑なや
り方でモデル化することもできることを強調しておかな
ければならない。
【００２１】図１では、サイズＡの第１の対象領域
（Ｕ）は、ＲＢＣsを有する位置およびＲＢＣsのない位
置を含んでいる。第１の対象領域（Ｕ）の厚さすなわち
光路長は、記号ｄで示されている。また、サイズＡcal
＝Ａの第２の対象領域（Ｖ）も、ＲＢＣsのない位置お
よびＲＢＣs（５）を有する位置を含んでいる。第２の
対象領域（Ｖ）の厚さすなわち光路長は、記号ｄcalで
示されている。本発明によれば、厚さｄおよびｄcal
は、異なっていなければならない。血液サンプルは、上
で考察した波長の励起光で均一に照射される。図１の蛍
光強度Ｉは、ＲＢＣsが存在しない場合に測定されるで
あろう、領域全体（Ｕ）の外挿積分強度(extrapolated
integrated intensity)を表している。Ｉは、（Ｕ）内
の無細胞位置における蛍光強度値を測定し、領域全体
（Ｕ）まで外挿することによって決定される。図１の蛍
光強度Ｉcellは、ＲＢＣsが存在する場合に測定される
領域全体（Ｕ）の積分強度を表している。図１の蛍光強
度Ｉcalは、ＲＢＣsが存在しない場合に測定されるであ
ろう、領域全体（Ｖ）の外挿積分強度を表している。
（Ｕ）は、ＲＢＣsを有する位置およびＲＢＣsのない位
置を含んでいる。第１の対象領域（Ｕ）の厚さすなわち
光路長は、記号ｄで示されている。また、サイズＡcal
＝Ａの第２の対象領域（Ｖ）も、ＲＢＣsのない位置お
よびＲＢＣs（５）を有する位置を含んでいる。第２の
対象領域（Ｖ）の厚さすなわち光路長は、記号ｄcalで
示されている。本発明によれば、厚さｄおよびｄcal
は、異なっていなければならない。血液サンプルは、上
で考察した波長の励起光で均一に照射される。図１の蛍
光強度Ｉは、ＲＢＣsが存在しない場合に測定されるで
あろう、領域全体（Ｕ）の外挿積分強度(extrapolated
integrated intensity)を表している。Ｉは、（Ｕ）内
の無細胞位置における蛍光強度値を測定し、領域全体
（Ｕ）まで外挿することによって決定される。図１の蛍
光強度Ｉcellは、ＲＢＣsが存在する場合に測定される
領域全体（Ｕ）の積分強度を表している。図１の蛍光強
度Ｉcalは、ＲＢＣsが存在しない場合に測定されるであ
ろう、領域全体（Ｖ）の外挿積分強度を表している。
【００２２】厚さが異なる少なくとも２つの対象領域(a
rea of interest)を使用した顕微鏡分析のための光学キ
ュベットは、例えば、参照により本明細書に組み込ま
れ、また、図２（Ａ）〜（Ｃ）に示す、Ｂｅｒｎｄｔに
対する米国特許第６，１８０，３１４号に開示されてい
る方法を適用することにより、容易に製作することがで
きる。キュベットは、フレキシブルカバースリップ（１
０２）を保持するためのスペーサ（１０３）を支える、
普通の顕微鏡スライド（１０１）を使用して製作され
る。一滴の蛍光着色された全血（１０４）が、顕微鏡ス
ライド（１０１）上に沈着される。フレキシブルカバー
スリップ（１０２）を滴下血液に達するまで下向きに押
しつけることにより、毛管力が発生する。血液サンプル
（１０４）が広がり、カバースリップ（１０２）が下方
に保持され、カバーする領域の両端に渡って厚さが変化
する薄い血液膜（１０５）が形成される。血液膜上に適
切な対象領域を容易に見出すことができる。
rea of interest)を使用した顕微鏡分析のための光学キ
ュベットは、例えば、参照により本明細書に組み込ま
れ、また、図２（Ａ）〜（Ｃ）に示す、Ｂｅｒｎｄｔに
対する米国特許第６，１８０，３１４号に開示されてい
る方法を適用することにより、容易に製作することがで
きる。キュベットは、フレキシブルカバースリップ（１
０２）を保持するためのスペーサ（１０３）を支える、
普通の顕微鏡スライド（１０１）を使用して製作され
る。一滴の蛍光着色された全血（１０４）が、顕微鏡ス
ライド（１０１）上に沈着される。フレキシブルカバー
スリップ（１０２）を滴下血液に達するまで下向きに押
しつけることにより、毛管力が発生する。血液サンプル
（１０４）が広がり、カバースリップ（１０２）が下方
に保持され、カバーする領域の両端に渡って厚さが変化
する薄い血液膜（１０５）が形成される。血液膜上に適
切な対象領域を容易に見出すことができる。
【００２３】本発明によるサンプル分析器を較正するた
めの方法については、以下の９ステップに要約すること
ができる。 １．サイズＡおよび第１の厚さを有する第１の対象領域
内の無細胞位置における蛍光強度値を測定するステッ
プ。 ２．無細胞条件下であることが期待される第１の対象領
域から、積分蛍光強度Ｉまで外挿するステップ。 ３．液体サンプル高さを決定するための任意の知られて
いる方法を利用し、第１の対象領域内の厚さｄを決定す
るステップ。 ４．前記第１の対象領域内における、この領域内のすべ
ての細胞を含む積分蛍光強度Ｉcellを測定するステッ
プ。 ５．サイズＡcal＝Ａ、および第２の厚さを有する第２
の対象領域内の無細胞位置における蛍光強度値を測定す
るステップ。 ６．無細胞条件下であることが期待される第２の対象領
域から、積分蛍光強度Ｉcalまで外挿するステップ。 ７．液体サンプル高さを決定するための任意の知られて
いる方法を利用し、前記第２の対象領域内の厚さｄcal
を決定するステップ。 ８．量Ｉ、Ｉcal、ｄ、ｄcal、およびＡ＝Ａcalを用い
て、次の式
めの方法については、以下の９ステップに要約すること
ができる。 １．サイズＡおよび第１の厚さを有する第１の対象領域
内の無細胞位置における蛍光強度値を測定するステッ
プ。 ２．無細胞条件下であることが期待される第１の対象領
域から、積分蛍光強度Ｉまで外挿するステップ。 ３．液体サンプル高さを決定するための任意の知られて
いる方法を利用し、第１の対象領域内の厚さｄを決定す
るステップ。 ４．前記第１の対象領域内における、この領域内のすべ
ての細胞を含む積分蛍光強度Ｉcellを測定するステッ
プ。 ５．サイズＡcal＝Ａ、および第２の厚さを有する第２
の対象領域内の無細胞位置における蛍光強度値を測定す
るステップ。 ６．無細胞条件下であることが期待される第２の対象領
域から、積分蛍光強度Ｉcalまで外挿するステップ。 ７．液体サンプル高さを決定するための任意の知られて
いる方法を利用し、前記第２の対象領域内の厚さｄcal
を決定するステップ。 ８．量Ｉ、Ｉcal、ｄ、ｄcal、およびＡ＝Ａcalを用い
て、次の式
【００２４】
【数９】
【００２５】に従って較正定数Ｃを計算するステップ。
９．量Ｉ、Ｉcell、ｄ、Ｃ、およびＡを用いて、次の式
【００２６】
【数１０】
【００２７】に従ってサンプルのＨＣＴ値を計算するス
テップ。
テップ。
【００２８】ステップ１
本明細書では顕微鏡サンプルを取り扱い、また、顕微鏡
下におけるあらゆる所与の「視野(field of view)」の
面積は、極めて狭い絶対面積であるため、第１の対象領
域（Ｕ）内の厚さｄは一定であると見なすことができ
る。典型的な顕微鏡の場合、対物レンズを２０倍と仮定
すると、視野の直径は優に１ｍｍ未満であり、Ｕの典型
的な直径は約１００ミクロンである。図２（Ａ）〜
（Ｃ）に示すサンプルの場合、膜の直径は２０ｍｍ以上
に及び、膜の最小厚さは約１ミクロン、また、膜の最大
厚さは約３０ミクロンである。ＨＣＴを測定する場合、
図１に従って、膜領域中に厚さ約２０ミクロン以上の第
１の対象領域を選択することになる。
下におけるあらゆる所与の「視野(field of view)」の
面積は、極めて狭い絶対面積であるため、第１の対象領
域（Ｕ）内の厚さｄは一定であると見なすことができ
る。典型的な顕微鏡の場合、対物レンズを２０倍と仮定
すると、視野の直径は優に１ｍｍ未満であり、Ｕの典型
的な直径は約１００ミクロンである。図２（Ａ）〜
（Ｃ）に示すサンプルの場合、膜の直径は２０ｍｍ以上
に及び、膜の最小厚さは約１ミクロン、また、膜の最大
厚さは約３０ミクロンである。ＨＣＴを測定する場合、
図１に従って、膜領域中に厚さ約２０ミクロン以上の第
１の対象領域を選択することになる。
【００２９】このことは、Ｕ内における厚さの変化がわ
ずかに±０．７％でしかないことを意味している。厚さ
の変化は、平均値に対して反対称的に分布するため、追
加相殺され、したがって総合的な影響が極めて小さくな
り、その影響を無視することができる。
ずかに±０．７％でしかないことを意味している。厚さ
の変化は、平均値に対して反対称的に分布するため、追
加相殺され、したがって総合的な影響が極めて小さくな
り、その影響を無視することができる。
【００３０】ステップ２
特定の位置における測値から、積分強度まで外挿する方
法は、画像処理の分野では良く知られているため、ステ
ップ２については詳細に考察する必要はない。第１の対
象領域（Ｕ）からの「積分蛍光強度Ｉ」には、プラスチ
ック蛍光の寄与の可能性、および／または励起／発光ク
ロストークの寄与の可能性が含まれていることを述べて
おくべきである。
法は、画像処理の分野では良く知られているため、ステ
ップ２については詳細に考察する必要はない。第１の対
象領域（Ｕ）からの「積分蛍光強度Ｉ」には、プラスチ
ック蛍光の寄与の可能性、および／または励起／発光ク
ロストークの寄与の可能性が含まれていることを述べて
おくべきである。
【００３１】積分蛍光強度Ｉは、次の式
Ｉ＝Ｉ０・Ｆ・ｄ・Ａ＋ＩＣＴ （２）
を用いて計算することができる。
【００３２】ここで、Ｉ０は均一励起強度(homogeneous
excitation intensity)である。Ｆは、放出光子(emitt
ed photon)の何パーセントが光検出器(photodetector)
に向けて導かれ、かつ、検出されたかを考慮した蛍光量
子収量(fluorescence quantum yield)および幾何学係数
(geometrical factor)を含む定システム伝達関数係数(c
onstant system transfer function factor)を表してい
る。式（２）の量Ａは、第１の対象領域のサイズを表し
ている。式（２）における未知量ＩＣＴは、励起／発光
クロストークおよび／またはプラスチック蛍光の寄与を
表している。また、未知量ＩＣＴには、このような影響
の元となる他の寄与、例えば漏れて機器内に入り込む昼
光などの迷明による寄与が含まれている。
excitation intensity)である。Ｆは、放出光子(emitt
ed photon)の何パーセントが光検出器(photodetector)
に向けて導かれ、かつ、検出されたかを考慮した蛍光量
子収量(fluorescence quantum yield)および幾何学係数
(geometrical factor)を含む定システム伝達関数係数(c
onstant system transfer function factor)を表してい
る。式（２）の量Ａは、第１の対象領域のサイズを表し
ている。式（２）における未知量ＩＣＴは、励起／発光
クロストークおよび／またはプラスチック蛍光の寄与を
表している。また、未知量ＩＣＴには、このような影響
の元となる他の寄与、例えば漏れて機器内に入り込む昼
光などの迷明による寄与が含まれている。
【００３３】ステップ３
知られている一連の方法の任意の方法を用いて、第１の
対象領域（Ｕ）内の液体層の厚さｄを決定することがで
きる。キュベット製造中に正確な厚さを確立することが
できる場合は、その数字を使用することができる。しか
し、上で記述したように、厳格な製造公差により、プラ
スチック製キュベットのコストが高くなり、また、不正
確なキュベットを用いて正確なＨＣＴの決定を可能にす
ることが本発明の目的である。つまり、高いコストで何
百万個もの極端に正確な使い捨てキュベットを製造する
代りに、よりインテリジェントな機器に、より安価なキ
ュベットを使用することができる。
対象領域（Ｕ）内の液体層の厚さｄを決定することがで
きる。キュベット製造中に正確な厚さを確立することが
できる場合は、その数字を使用することができる。しか
し、上で記述したように、厳格な製造公差により、プラ
スチック製キュベットのコストが高くなり、また、不正
確なキュベットを用いて正確なＨＣＴの決定を可能にす
ることが本発明の目的である。つまり、高いコストで何
百万個もの極端に正確な使い捨てキュベットを製造する
代りに、よりインテリジェントな機器に、より安価なキ
ュベットを使用することができる。
【００３４】第１の対象領域内の厚さｄを決定するため
の知られている手法の１つは、共焦点顕微鏡(confocal
microscope)を使用することである。複雑なキュベット
から反射して戻された光子の数を、Ｚ軸に沿った焦点面
位置の関数としてプロットすることにより、隣接する２
つの屈折率の異なる媒体間の界面毎の最大量が得られ
る。Ｚ軸に沿った半値全幅（ＦＷＨＭ: full-width-at-
half-maximum）は、約２から３ミクロンであり、サブミ
クロンの精度でベル形界面反射位置(position ofthe be
ll-shaped interface reflex)を決定することができ
る。したがって、適切な最大量間のＺ位置の差から、キ
ュベット内のサンプル層の厚さｄを決定することができ
る。一例として、対象の２つの界面の位置付け精度を
０．２ミクロンと仮定すると、３０ミクロンのキュベッ
ト厚さを、わずか１．３％の誤差で決定することができ
る。知られている他の方法を使用することもできる。そ
れらの１つについて、段落「ステップ８」で説明する。
の知られている手法の１つは、共焦点顕微鏡(confocal
microscope)を使用することである。複雑なキュベット
から反射して戻された光子の数を、Ｚ軸に沿った焦点面
位置の関数としてプロットすることにより、隣接する２
つの屈折率の異なる媒体間の界面毎の最大量が得られ
る。Ｚ軸に沿った半値全幅（ＦＷＨＭ: full-width-at-
half-maximum）は、約２から３ミクロンであり、サブミ
クロンの精度でベル形界面反射位置(position ofthe be
ll-shaped interface reflex)を決定することができ
る。したがって、適切な最大量間のＺ位置の差から、キ
ュベット内のサンプル層の厚さｄを決定することができ
る。一例として、対象の２つの界面の位置付け精度を
０．２ミクロンと仮定すると、３０ミクロンのキュベッ
ト厚さを、わずか１．３％の誤差で決定することができ
る。知られている他の方法を使用することもできる。そ
れらの１つについて、段落「ステップ８」で説明する。
【００３５】ステップ４
ステップ２に関して記述した内容は、ステップ４では非
蛍光赤血球(non-fluorescent red cell)以外の透過によ
る蛍光排除効果(fluorescence exclusion effect)を含
む実際の積分強度(actual integrated intensity)が測
定されることを除き、すべてステップ４にも適用され
る。積分強度Ｉcellは、次の式 Ｉcell＝Ｉ０・Ｆ・（ｄ−ｄｃ）・Ａ＋ＩＣＴ （３） で与えられる。図１によれば、上式においｔ、ｄｃは、
「パックされた(packed)」ＲＢＣsの実効厚さ(effectiv
e thickness)を表している。既に記述したように、パッ
クされたＲＢＣsを仮定することにより、簡略化が可能
になっている。重要なことは、強度Ｉcellに、式（２）
の外挿強度(extrapolated intensity)Ｉと同じクロスト
ーク寄与(cross-talk contribution)ＩＣＴが含まれて
いることに留意することである。これは、条件Ａcal＝
Ａの結果によるものであり、また、均一な照射強度(hom
ogeneous illumination intensity)Ｉ０を仮定している
ことによるものである。
蛍光赤血球(non-fluorescent red cell)以外の透過によ
る蛍光排除効果(fluorescence exclusion effect)を含
む実際の積分強度(actual integrated intensity)が測
定されることを除き、すべてステップ４にも適用され
る。積分強度Ｉcellは、次の式 Ｉcell＝Ｉ０・Ｆ・（ｄ−ｄｃ）・Ａ＋ＩＣＴ （３） で与えられる。図１によれば、上式においｔ、ｄｃは、
「パックされた(packed)」ＲＢＣsの実効厚さ(effectiv
e thickness)を表している。既に記述したように、パッ
クされたＲＢＣsを仮定することにより、簡略化が可能
になっている。重要なことは、強度Ｉcellに、式（２）
の外挿強度(extrapolated intensity)Ｉと同じクロスト
ーク寄与(cross-talk contribution)ＩＣＴが含まれて
いることに留意することである。これは、条件Ａcal＝
Ａの結果によるものであり、また、均一な照射強度(hom
ogeneous illumination intensity)Ｉ０を仮定している
ことによるものである。
【００３６】ステップ５
ステップ５はステップ１に対応しているが、サイズＡca
l＝Ａは同じであるが厚さが異なる第２の対象領域
（Ｖ）で実行される。
l＝Ａは同じであるが厚さが異なる第２の対象領域
（Ｖ）で実行される。
【００３７】ステップ６
ステップ６はステップ２に対応しているが、サイズＡca
l＝Ａの前記第２の対象領域（Ｖ）で実行される。積分
強度Ｉcalは、次の式 Ｉｃａｌ＝Ｉ０・Ｆ・ｄｃａｌ・Ａ＋ＩＣＴ （４） によって与えられる。
l＝Ａの前記第２の対象領域（Ｖ）で実行される。積分
強度Ｉcalは、次の式 Ｉｃａｌ＝Ｉ０・Ｆ・ｄｃａｌ・Ａ＋ＩＣＴ （４） によって与えられる。
【００３８】上式において、ｄcalはこの領域の厚さを
表している。この場合においても重要なことは、強度Ｉ
cellに、式（２）の外挿強度Ｉと同じクロストーク寄与
ＩＣ Ｔが含まれていることに留意することである。これ
は、条件Ａcal＝Ａ、および均一な照射強度Ｉ０の結果
によるものである。本発明による方法を高精度にするた
めには、厚さｄおよびｄcalを可能な限り異なる厚さに
することが有利である。
表している。この場合においても重要なことは、強度Ｉ
cellに、式（２）の外挿強度Ｉと同じクロストーク寄与
ＩＣ Ｔが含まれていることに留意することである。これ
は、条件Ａcal＝Ａ、および均一な照射強度Ｉ０の結果
によるものである。本発明による方法を高精度にするた
めには、厚さｄおよびｄcalを可能な限り異なる厚さに
することが有利である。
【００３９】ステップ７
ステップ７は、ステップ３で説明した手順に対応してい
るが、前記第２の対象領域（Ｖ）で実行される。
るが、前記第２の対象領域（Ｖ）で実行される。
【００４０】ステップ８
式（２）から式（４）を引くことにより、較正定数Ｃの
表現式が得られ、次の式
表現式が得られ、次の式
【００４１】
【数１１】
【００４２】で与えられる。
【００４３】較正定数Ｃは、厚さの変化によるサイズＡ
の特定領域の積分強度の変化に関する情報を提供する。
重要なことは、Ｃが比率「強度／体積(intensity/volum
e)」を表しているのではなく、微分量(differential qu
antity)を表していることに留意することである。プラ
スチック蛍光の寄与および／または励起／発光クロスト
ークの寄与から独立しているのは微分量だけである。特
定の体積（例えば、サイズおよび厚さが既知の１つの領
域）に出現する積分強度として測定される比率「強度／
体積」は、上で記述した寄与(contribution)に依然とし
て影響されている。
の特定領域の積分強度の変化に関する情報を提供する。
重要なことは、Ｃが比率「強度／体積(intensity/volum
e)」を表しているのではなく、微分量(differential qu
antity)を表していることに留意することである。プラ
スチック蛍光の寄与および／または励起／発光クロスト
ークの寄与から独立しているのは微分量だけである。特
定の体積（例えば、サイズおよび厚さが既知の１つの領
域）に出現する積分強度として測定される比率「強度／
体積」は、上で記述した寄与(contribution)に依然とし
て影響されている。
【００４４】ステップ９
較正定数Ｃが決定すると、式（２）から式（３）を引
き、かつ、ステップ８で式（５）に従って決定されたＣ
の値を用いてＨＣＴ値を計算することができる。したが
ってＨＣＴを表す式は、
き、かつ、ステップ８で式（５）に従って決定されたＣ
の値を用いてＨＣＴ値を計算することができる。したが
ってＨＣＴを表す式は、
【００４５】
【数１２】
【００４６】で与えられる。式（５）および式（６）を
組み合わせることも当然可能であり、
組み合わせることも当然可能であり、
【００４７】
【数１３】
【００４８】が得られる。
【００４９】式（７）では、２つの対象領域のサイズで
あるＡは全く含まれていないが、本発明による測定は、
プラスチック蛍光の寄与および／または励起／発光クロ
ストークの寄与を相殺するために、Ａ＝Ａcalの条件下
で実施しなければならない。
あるＡは全く含まれていないが、本発明による測定は、
プラスチック蛍光の寄与および／または励起／発光クロ
ストークの寄与を相殺するために、Ａ＝Ａcalの条件下
で実施しなければならない。
【００５０】図３は、予備結果(preliminary result)を
示したものである。図１に示す状況に類似した人工(art
ificial)「ＲＢＣs」が、図２に従って、領域の厚さの
差が１ミクロンと１００ミクロンの間である薄い光学キ
ュベット中に配置されたものである。この特定の実験で
は、低品質のダイクロイックフィルタが使用され、総合
「蛍光強度」に対する励起／発光クロストークの寄与は
２０％であった。従来技術に従って（すなわち式（１）
に従って）実施したＨＣＴ決定で得られたＨＣＴ値は１
７％も小さく、臨床機器としては許容し難い値である。
本発明による（すなわち式（６）および式（７）によ
る）方法を使用することにより、正しいＨＣＴ値が得ら
れた。
示したものである。図１に示す状況に類似した人工(art
ificial)「ＲＢＣs」が、図２に従って、領域の厚さの
差が１ミクロンと１００ミクロンの間である薄い光学キ
ュベット中に配置されたものである。この特定の実験で
は、低品質のダイクロイックフィルタが使用され、総合
「蛍光強度」に対する励起／発光クロストークの寄与は
２０％であった。従来技術に従って（すなわち式（１）
に従って）実施したＨＣＴ決定で得られたＨＣＴ値は１
７％も小さく、臨床機器としては許容し難い値である。
本発明による（すなわち式（６）および式（７）によ
る）方法を使用することにより、正しいＨＣＴ値が得ら
れた。
【００５１】また、本発明による較正方法を使用するこ
とにより、プラスチック蛍光および励起／発光クロスト
ークによるアーチファクトの問題を抱えている従来技術
の較正方法と比較して、より正確にＲＣＶを測定するこ
とができる。ＲＣＶを測定するためには、厚い（７〜４
０ミクロン）領域および薄い（２〜７ミクロン）領域を
有する光学キュベットを使用することができる。本発明
による較正は、厚い領域部分で実施することができる。
薄い領域では、単一隔離ＲＢＣsの単一層の形成が期待
される。ＲＢＣsの近傍領域における積分蛍光強度は、 ＩＰ＝Ｉ０・Ｆ・ｄＭＬ・ａ＋ＩＣＴ′ （８） で与えられる式によって決定される。
とにより、プラスチック蛍光および励起／発光クロスト
ークによるアーチファクトの問題を抱えている従来技術
の較正方法と比較して、より正確にＲＣＶを測定するこ
とができる。ＲＣＶを測定するためには、厚い（７〜４
０ミクロン）領域および薄い（２〜７ミクロン）領域を
有する光学キュベットを使用することができる。本発明
による較正は、厚い領域部分で実施することができる。
薄い領域では、単一隔離ＲＢＣsの単一層の形成が期待
される。ＲＢＣsの近傍領域における積分蛍光強度は、 ＩＰ＝Ｉ０・Ｆ・ｄＭＬ・ａ＋ＩＣＴ′ （８） で与えられる式によって決定される。
【００５２】上式において、ｄＭＬは、単一層領域(mon
olayer region)におけるこの部分の厚さを表している。
量ａは、選択された対象領域のサイズである。量
ＩＣＴ′は、上で記述した通常の寄与を表している。Ｉ
ＣＴ′の大きさはサイズａによって変化するが、その変
化は、以下で説明する追加ステップを適用することによ
って、どのみち相殺されることが期待される。
olayer region)におけるこの部分の厚さを表している。
量ａは、選択された対象領域のサイズである。量
ＩＣＴ′は、上で記述した通常の寄与を表している。Ｉ
ＣＴ′の大きさはサイズａによって変化するが、その変
化は、以下で説明する追加ステップを適用することによ
って、どのみち相殺されることが期待される。
【００５３】次のステップでは、前記ＲＢＣを含む同一
サイズａの領域における積分蛍光強度ＩＲＢＣが、 ＩＲＢＣ＝Ｉ０・Ｆ・（ｄＭＬ−ｄＲＢＣ）・ａ＋ＩＣＴ′ （９） で与えられる式によって決定される。
サイズａの領域における積分蛍光強度ＩＲＢＣが、 ＩＲＢＣ＝Ｉ０・Ｆ・（ｄＭＬ−ｄＲＢＣ）・ａ＋ＩＣＴ′ （９） で与えられる式によって決定される。
【００５４】上式において、ｄＲＢＣは、前記ＲＢＣS
「高さ」を表している。式（８）から式（９）を引き、
かつ、ＲＢＣの面積と同じになるように面積ａを選択す
ることにより、前記単一細胞の体積ＲＣＶが得られる。
その式は、
「高さ」を表している。式（８）から式（９）を引き、
かつ、ＲＢＣの面積と同じになるように面積ａを選択す
ることにより、前記単一細胞の体積ＲＣＶが得られる。
その式は、
【００５５】
【数１４】
【００５６】で与えられる。式（１０）は、２つの蛍光
強度の差が計算されることを示している。したがって、
プラスチック蛍光および励起／発光クロストークによる
あらゆる寄与を相殺することができる。このことは、キ
ュベットの薄い領域からの真の蛍光が、その薄さのため
に極端に弱いため、特に重要である。したがって、測定
強度(measured intensity)に占めるこのような寄与のパ
ーセンテージが大きくても、何ら差し支えることはな
い。場合によっては、このような寄与が測定強度の支配
的部分を占めることも可能である。
強度の差が計算されることを示している。したがって、
プラスチック蛍光および励起／発光クロストークによる
あらゆる寄与を相殺することができる。このことは、キ
ュベットの薄い領域からの真の蛍光が、その薄さのため
に極端に弱いため、特に重要である。したがって、測定
強度(measured intensity)に占めるこのような寄与のパ
ーセンテージが大きくても、何ら差し支えることはな
い。場合によっては、このような寄与が測定強度の支配
的部分を占めることも可能である。
【００５７】これまでは、ＲＢＣが円筒形状であると仮
定してきた。ＲＢＣの形状が不規則であり、また、キュ
ベット内の細胞のＺ位置が細胞体積の計算に影響しない
ことが分かっている。式（９）で与えられる積分強度Ｉ
ＲＢＣは、次の式によって、空間的に変化する細胞高さ
ｈＲＢＣ（ｘ、ｈ）に対して表すこともできる。 ＩＲＢＣ＝Ｉ０・Ｆ・∫［ｄＭＬ−ｈＲＢＣ（ξ，η）］ｄξｄη＋ＩＣＴ （１１） 式（１１）において、量ｘおよびｈは、ＲＢＣ内の独立
Ｘ変数および独立Ｙ変数を表している。実際には、面積
ａ中の画素強度を加えることにより、必要な積分を容易
に実施することができる。上で説明したＨＣＴ決定につ
いても同様である。
定してきた。ＲＢＣの形状が不規則であり、また、キュ
ベット内の細胞のＺ位置が細胞体積の計算に影響しない
ことが分かっている。式（９）で与えられる積分強度Ｉ
ＲＢＣは、次の式によって、空間的に変化する細胞高さ
ｈＲＢＣ（ｘ、ｈ）に対して表すこともできる。 ＩＲＢＣ＝Ｉ０・Ｆ・∫［ｄＭＬ−ｈＲＢＣ（ξ，η）］ｄξｄη＋ＩＣＴ （１１） 式（１１）において、量ｘおよびｈは、ＲＢＣ内の独立
Ｘ変数および独立Ｙ変数を表している。実際には、面積
ａ中の画素強度を加えることにより、必要な積分を容易
に実施することができる。上で説明したＨＣＴ決定につ
いても同様である。
【００５８】最後に、重要なことは、本発明による較正
方法では、第２の対象領域（Ｖ）にＲＢＣsを全く含有
させる必要がないことに留意することである。図５は、
このような状況を示したものである。既に記述したよう
に、第１と第２の対象領域の間の厚さの差を可能な限り
大きくすることにより、本発明による較正精度は著しく
高くなる。第１の対象領域には、連銭形成構造(Roleaux
formation)のＲＢＣsが必要である。したがってこの領
域の厚さは約３０ミクロンであり、それにより第２の対
象領域の厚さが自然に薄くなる。通常、厚さが薄いこと
により、無細胞領域(cell-free area)が増加する。
方法では、第２の対象領域（Ｖ）にＲＢＣsを全く含有
させる必要がないことに留意することである。図５は、
このような状況を示したものである。既に記述したよう
に、第１と第２の対象領域の間の厚さの差を可能な限り
大きくすることにより、本発明による較正精度は著しく
高くなる。第１の対象領域には、連銭形成構造(Roleaux
formation)のＲＢＣsが必要である。したがってこの領
域の厚さは約３０ミクロンであり、それにより第２の対
象領域の厚さが自然に薄くなる。通常、厚さが薄いこと
により、無細胞領域(cell-free area)が増加する。
【００５９】図５は、従来技術を適用した場合に、血漿
蛍光に対するプラスチック蛍光および／または励起／発
光クロストークの寄与の増加が、如何に計算ＨＣＴ値に
影響を及ぼすかを再度示す他のプロットを示したもので
ある。計算ＨＣＴ値が真値に近くなるのは、キュベット
の蛍光が極めて小さい場合、および品質の高いダイクロ
イックフィルタユニットを使用した場合のみである。対
照的に、本発明による方法によれば、蛍光プラスチック
材をキュベットに使用することができ、また、等級の低
いダイクロイックフィルタを使用することができ、か
つ、正確なＨＣＴ値を得ることができる。
蛍光に対するプラスチック蛍光および／または励起／発
光クロストークの寄与の増加が、如何に計算ＨＣＴ値に
影響を及ぼすかを再度示す他のプロットを示したもので
ある。計算ＨＣＴ値が真値に近くなるのは、キュベット
の蛍光が極めて小さい場合、および品質の高いダイクロ
イックフィルタユニットを使用した場合のみである。対
照的に、本発明による方法によれば、蛍光プラスチック
材をキュベットに使用することができ、また、等級の低
いダイクロイックフィルタを使用することができ、か
つ、正確なＨＣＴ値を得ることができる。
【図１】第１の厚さｄを有する第１の対象領域Ｕ、およ
び第２の厚さｄcalを有する第２の対象領域Ｖを備えた
光学キュベットの略図である。
び第２の厚さｄcalを有する第２の対象領域Ｖを備えた
光学キュベットの略図である。
【図２】顕微鏡分析のための、厚さが異なる少なくとも
２つの対象領域を備えた光学キュベットを示す図であ
る。
２つの対象領域を備えた光学キュベットを示す図であ
る。
【図３】人工サンプルに対して実施した、本実施の形態
によるＨＣＴ測定の結果を示す図であって、第２のプロ
ットは、プラスチック製使い捨て蛍光および／または励
起／発光クロストークによる光子の寄与が、従来技術装
置による全血のＨＣＴ決定に如何に影響しているかを示
している図である。
によるＨＣＴ測定の結果を示す図であって、第２のプロ
ットは、プラスチック製使い捨て蛍光および／または励
起／発光クロストークによる光子の寄与が、従来技術装
置による全血のＨＣＴ決定に如何に影響しているかを示
している図である。
【図４】第１の厚さｄを有する第１の対象領域Ｕ、およ
び第２の厚さｄcalを有する第２の無細胞対象領域Ｖを
備えた光学キュベットの略図である。
び第２の厚さｄcalを有する第２の無細胞対象領域Ｖを
備えた光学キュベットの略図である。
【図５】血漿蛍光に対するプラスチック蛍光および／ま
たは励起／発光クロストークの寄与の増加が、計算され
たＨＣＴ値に如何に影響するかを示すプロットである。
たは励起／発光クロストークの寄与の増加が、計算され
たＨＣＴ値に如何に影響するかを示すプロットである。
１、２ 窓
３、１０４ 全血
４、５ 赤血球
１０１ 顕微鏡スライド
１０２ フレキシブルカバースリップ
１０３ スペーサ
フロントページの続き
(71)出願人 595117091
１ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲＡ
ＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥ
ＲＳＥＹ 07417−1880， ＵＮＩＴＥＤ
ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ
(72)発明者 クラウス ダブリュ．バーント
アメリカ合衆国 21093 メリーランド州
ティモニウム ロックビュー テラス
305
Ｆターム(参考） 2G043 AA01 BA16 CA03 EA01 FA02
GA07 GB02 GB05 GB16 JA02
KA02 KA05 NA01 NA13
2G045 AA06 CA25 FA16 FB16 GC14
HA16 JA01 JA02
2G057 AA04 AB01 AC01 BA01 BB06
BC01 BC07 BD02 DA20 DC01
Claims (10)
- 【請求項１】 血液サンプルのヘマトクリット（ＨＣ
Ｔ）値を測定するために、光学的走査機器内に保持され
る血液分析器の較正方法であって、 ａ）サンプルを受け入れるためのチャンバを前記サンプ
ル分析器内に提供するステップと、 ｂ）蛍光染料を含有する前記サンプルを前記チャンバ内
に置くステップと、 ｃ）前記サンプルを励起光で照射するステップと、 ｄ）前記サンプルからの蛍光を検出するために、前記機
器を使用して前記サンプルを走査するステップと、 ｅ）サイズＡおよび第１の厚さを有する第１の対象領域
内の無細胞位置における蛍光強度値を測定するステップ
と、 ｆ）無細胞条件下であることが期待される前記第１の対
象領域から、積分蛍光強度Ｉまで外挿するステップと、 ｇ）液体サンプル高さを決定するための知られている方
法を利用して、前記第１の対象領域内の厚さｄを決定す
るステップと、 ｈ）前記第１の対象領域内における、この領域内のすべ
ての細胞を含む積分蛍光強度Ｉcellを測定するステップ
と、 ｉ）サイズＡcal＝Ａ、および第２の厚さを有する第２
の対象領域内の無細胞位置における蛍光強度値を測定す
るステップと、 ｊ）無細胞条件下であることが期待される前記第２の対
象領域から、積分蛍光強度Ｉcalまで外挿するステップ
と、 ｋ）液体サンプル高さを決定するための知られている方
法を利用して、前記第２の対象領域内の厚さｄcalを決
定するステップと、 ｌ）積分蛍光強度差の対を含む式によってサンプルのＨ
ＣＴ値を計算するために、量Ｉ、Ｉcell、Ｉcal、ｄ、
ｄcalを用いるステップと、 ｍ）較正済みサンプル分析器を使用して前記ＨＣＴ値を
得るステップとを含むことを特徴とする方法。 - 【請求項２】 前記サンプルのＨＣＴ値は、式 【数１】 に従って計算されることを特徴とする請求項１に記載の
方法。 - 【請求項３】 ａ）第１の較正定数Ｃは、式 【数２】 に従って決定され、 ｂ）前記サンプルの前記ＨＣＴ値は、式 【数３】 に従って計算されることを特徴とする請求項１に記載の
方法。 - 【請求項４】 前記サンプルは全血であり、前記チャン
バは光学キュベットであることを特徴とする請求項１に
記載の方法。 - 【請求項５】 前記蛍光染料は、６００ｎｍより長い波
長を有する励起光で照射されることを特徴とする請求項
１に記載の方法。 - 【請求項６】 血液サンプルの単一赤血球の体積（ＲＣ
Ｖ）を決定するために、光学的走査機器内に保持される
血液分析器の較正方法であって、 ａ）サンプルを受け入れるためのチャンバを前記サンプ
ル分析器内に提供するステップと、 ｂ）蛍光染料を含有する前記サンプルを前記チャンバ内
に置くステップと、 ｃ）前記サンプルを励起光で照射するステップと、 ｄ）前記サンプルからの蛍光を検出するために、前記機
器を使用して前記サンプルを走査するステップと、 ｅ）サイズＡおよび第１の厚さを有する第１の対象領域
内の無細胞位置における蛍光強度値を測定するステップ
と、 ｆ）無細胞条件下であることが期待される前記第１の対
象領域から、積分蛍光強度Ｉまで外挿するステップと、 ｇ）液体サンプル高さを決定するための知られている方
法を利用して、前記第１の対象領域内の厚さｄを決定す
るステップと、 ｈ）サイズＡcal＝Ａ、および第２の厚さを有する第２
の対象領域内の無細胞位置における蛍光強度値を測定す
るステップと、 ｉ）無細胞条件下であることが期待される前記第２の対
象領域から、積分蛍光強度Ｉcalまで外挿するステップ
と、 ｊ）液体サンプル高さを決定するための知られている方
法を利用して、前記第２の対象領域内の厚さｄcalを決
定するステップと、 ｋ）較正定数Ｃを計算するために、量Ｉ、Ｉcal、ｄ、
およびｄcalを用いるステップと、 ｌ）単一赤血球領域ａで全面的に占有されている単一層
領域内の第３の対象領域における積分蛍光強度ＩＲＢＣ
を測定するステップと、 ｍ）前記単一赤血球に近接し、かつ、サイズａを有する
第４の対象領域内の無細胞位置における蛍光強度値を測
定するステップと、 ｎ）無細胞条件下であることが期待される第４の対象領
域から、積分蛍光強度ＩＰまで外挿するステップと、 ｏ）積分蛍光強度差の対を含む式によって前記単一赤血
球の前記ＲＣＶ値を計算するために、前記の値Ｃ、
ＩＰ、およびＩＲＢＣを使用するステップと、 ｐ）較正済みサンプル分析器を使用して前記単一赤血球
の前記ＲＣＶ値を得るステップとを含むことを特徴とす
る方法。 - 【請求項７】 前記較正値Ｃは、式 【数４】 に従って計算されることを特徴とする請求項６に記載の
方法。 - 【請求項８】 前記単一赤血球の前記ＲＣＶ値は、式 【数５】 に従って計算されることを特徴とする請求項６に記載の
方法。 - 【請求項９】 前記サンプルは全血であり、前記チャン
バは光学キュベットであることを特徴とする請求項６に
記載の方法。 - 【請求項１０】 前記蛍光染料は、６００ｎｍより長い
波長を有する励起光で照射されることを特徴とする請求
項６に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/845,071 | 2001-04-27 | ||
| US09/845,071 US6544793B2 (en) | 2001-04-27 | 2001-04-27 | Method for calibrating a sample analyzer |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003042953A true JP2003042953A (ja) | 2003-02-13 |
Family
ID=25294325
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002129352A Pending JP2003042953A (ja) | 2001-04-27 | 2002-04-30 | サンプル分析器を較正するための方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6544793B2 (ja) |
| EP (1) | EP1253420A3 (ja) |
| JP (1) | JP2003042953A (ja) |
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