JP2003002830A - フラボノイドのエストロゲン活性発現抑制方法およびエストロゲン活性発現抑制用組成物 - Google Patents
フラボノイドのエストロゲン活性発現抑制方法およびエストロゲン活性発現抑制用組成物Info
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- JP2003002830A JP2003002830A JP2001186118A JP2001186118A JP2003002830A JP 2003002830 A JP2003002830 A JP 2003002830A JP 2001186118 A JP2001186118 A JP 2001186118A JP 2001186118 A JP2001186118 A JP 2001186118A JP 2003002830 A JP2003002830 A JP 2003002830A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 フラボノイド類を使用してエストロゲン活性
発現を抑制する方法およびエストロゲン活性発現抑制用
組成物を提供すること。 【解決手段】 一般式[I]： 【化１】 (式中、Ｒは、水素原子またはヒドロキシ基を意味し、
いずれの置換基も複数個存在していてもよい、Ｒ１およ
びＲ２は、いずれも水素原子、ヒドロキシ基、低級アル
キル基、低級アルコキシ基または置換基を有していても
よいフェニル基を意味し、Ｒ１とＲ２とのいずれかは置
換基を有していてもよいフェニル基を意味し、Ｒ１とＲ
２とがいずれも置換基を有していてもよいフェニル基を
意味することはない)で表されるフラボノイドを使用し
てエストロゲン活性発現を抑制する方法。
発現を抑制する方法およびエストロゲン活性発現抑制用
組成物を提供すること。 【解決手段】 一般式[I]： 【化１】 (式中、Ｒは、水素原子またはヒドロキシ基を意味し、
いずれの置換基も複数個存在していてもよい、Ｒ１およ
びＲ２は、いずれも水素原子、ヒドロキシ基、低級アル
キル基、低級アルコキシ基または置換基を有していても
よいフェニル基を意味し、Ｒ１とＲ２とのいずれかは置
換基を有していてもよいフェニル基を意味し、Ｒ１とＲ
２とがいずれも置換基を有していてもよいフェニル基を
意味することはない)で表されるフラボノイドを使用し
てエストロゲン活性発現を抑制する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、フラボノイドの
エストロゲン活性発現抑制方法およびエストロゲン活性
発現抑制用組成物に関するものである。
エストロゲン活性発現抑制方法およびエストロゲン活性
発現抑制用組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】過去５０年間に、環境エストロゲンなど
の環境ホルモンについて多くの報告がなされ、食品およ
び環境中には種々の環境ホルモンが存在していることは
よく知られていて、野生動物のみならずヒトの内分泌系
を撹乱する可能性が示されている（Giulette L (1995):
Endocrine disrupting environmental contaminants a
nd developmental abnormalities in embryos. Human E
col Risk Asses, 1, 25-36）。これらの研究において、
様々なタイプの天然ならびに合成化学薬品が、体内なら
びに体外アッセイ系においてエストロゲン活性を示すこ
とが示された。環境エストロゲンの例としては、ポリ塩
化ビフェニル類、多環芳香族炭化水素類、ポリ塩化ジベ
ンゾダイオキシン類、アルキルフェノ−ル化合物、殺虫
剤、除草剤、植物エストロゲン類、菌エストロゲン類な
どが挙げられる。更に、様々の植物に由来する少なくと
も２０グル−プの植物エストロゲン類があり、それらの
いくつかはエストロゲン活性を示す。動物によって摂取
されると、かかる物質はエストロゲンの合成ならびに代
謝に影響を及ぼし、エストロゲン効果もしくは抗エスト
ロゲン効果を示す。それらの弱いエストロゲン効果もし
くは抗エストロゲン効果に加えて、植物エストロゲン類
は、ほ乳類の細胞において、抗酸化、抗ウィルス、抗菌
活性ばかりではなく、増殖阻止活性や分化誘導活性を示
す。１７β−エストラジオ−ルのような天然エストロゲ
ン類は、女性ならびに割合は少ないけれども男性の生殖
制御ならびにいくつかのタイプのガン発生ならびに発育
に中枢的な役割を果たしている。
の環境ホルモンについて多くの報告がなされ、食品およ
び環境中には種々の環境ホルモンが存在していることは
よく知られていて、野生動物のみならずヒトの内分泌系
を撹乱する可能性が示されている（Giulette L (1995):
Endocrine disrupting environmental contaminants a
nd developmental abnormalities in embryos. Human E
col Risk Asses, 1, 25-36）。これらの研究において、
様々なタイプの天然ならびに合成化学薬品が、体内なら
びに体外アッセイ系においてエストロゲン活性を示すこ
とが示された。環境エストロゲンの例としては、ポリ塩
化ビフェニル類、多環芳香族炭化水素類、ポリ塩化ジベ
ンゾダイオキシン類、アルキルフェノ−ル化合物、殺虫
剤、除草剤、植物エストロゲン類、菌エストロゲン類な
どが挙げられる。更に、様々の植物に由来する少なくと
も２０グル−プの植物エストロゲン類があり、それらの
いくつかはエストロゲン活性を示す。動物によって摂取
されると、かかる物質はエストロゲンの合成ならびに代
謝に影響を及ぼし、エストロゲン効果もしくは抗エスト
ロゲン効果を示す。それらの弱いエストロゲン効果もし
くは抗エストロゲン効果に加えて、植物エストロゲン類
は、ほ乳類の細胞において、抗酸化、抗ウィルス、抗菌
活性ばかりではなく、増殖阻止活性や分化誘導活性を示
す。１７β−エストラジオ−ルのような天然エストロゲ
ン類は、女性ならびに割合は少ないけれども男性の生殖
制御ならびにいくつかのタイプのガン発生ならびに発育
に中枢的な役割を果たしている。
【０００３】また、これらの環境エストロゲン類の大部
分は、天然エストロゲン類とは構造が全く異なってい
る。したがって、現在では、その化学構造式の知識に基
づいてどの化合物がエストロゲン活性を有しているかど
うかの評価をすることはできない。これらの環境エスト
ロゲン類のなかでも、植物エストロゲン類は動物の不妊
に関連している。しかしながら、それらの植物エストロ
ゲン類は月経の症状を緩和することができ、乳がんや前
立腺がんに対する防衛手段となり得るという多くの証拠
がある。更にまた、乳がんならびに前立腺がんの発生率
が低い国々においては、フラボノイド類の摂取量は非常
に多いということが研究によって明らかにされている。
このことはフラボノイド類が化学予防薬として作用して
いることを示唆している。これらの結果から、フラボノ
イド類の生物学的ならびに生理学的活性はがんの予防に
有用であるばかりではなく、エストロゲン活性の修飾に
も有用であることが示唆されている。
分は、天然エストロゲン類とは構造が全く異なってい
る。したがって、現在では、その化学構造式の知識に基
づいてどの化合物がエストロゲン活性を有しているかど
うかの評価をすることはできない。これらの環境エスト
ロゲン類のなかでも、植物エストロゲン類は動物の不妊
に関連している。しかしながら、それらの植物エストロ
ゲン類は月経の症状を緩和することができ、乳がんや前
立腺がんに対する防衛手段となり得るという多くの証拠
がある。更にまた、乳がんならびに前立腺がんの発生率
が低い国々においては、フラボノイド類の摂取量は非常
に多いということが研究によって明らかにされている。
このことはフラボノイド類が化学予防薬として作用して
いることを示唆している。これらの結果から、フラボノ
イド類の生物学的ならびに生理学的活性はがんの予防に
有用であるばかりではなく、エストロゲン活性の修飾に
も有用であることが示唆されている。
【０００４】ところで、大豆中のイソフラボンもエスト
ロゲン活性を有することが報告されている（Cheng E, Y
oder L, Story CD and Burrough W (1954): Estrogenic
activity of some isoflavone derivatives. Science,
120, 575-576；Setchell KDR (1998): Phytoestrogen
s: the biochemistry, physiology, and implicationsf
or human health of soy isoflavones. Am J Clin Nut
r, 68, 1333s-1346s）。しかし、大豆中のイソフラボン
のエストロゲン活性は、他の環境汚染物質と比較すると
格段に摂取量が多いことから、大豆イソフラボンの環境
ホルモン活性の正確な評価が重要視されている。そこ
で、微弱な環境ホルモン活性を評価するために、ヒト乳
癌MCF-7細胞を用いて環境ホルモン活性検定系の最適化
を行い、ダイゼインおよびゲニステインが10-9 Ｍ近辺
で弱いエストロゲン活性を発現することを確認した（山
田耕路・韓達昊・宮崎義之・菅野道廣・立花宏文 (200
0) ヒト乳がんMCF-7細胞の増殖に及ぼすイソフラボンの
作用、 大豆たん白質研究、 3, 54-58）。
ロゲン活性を有することが報告されている（Cheng E, Y
oder L, Story CD and Burrough W (1954): Estrogenic
activity of some isoflavone derivatives. Science,
120, 575-576；Setchell KDR (1998): Phytoestrogen
s: the biochemistry, physiology, and implicationsf
or human health of soy isoflavones. Am J Clin Nut
r, 68, 1333s-1346s）。しかし、大豆中のイソフラボン
のエストロゲン活性は、他の環境汚染物質と比較すると
格段に摂取量が多いことから、大豆イソフラボンの環境
ホルモン活性の正確な評価が重要視されている。そこ
で、微弱な環境ホルモン活性を評価するために、ヒト乳
癌MCF-7細胞を用いて環境ホルモン活性検定系の最適化
を行い、ダイゼインおよびゲニステインが10-9 Ｍ近辺
で弱いエストロゲン活性を発現することを確認した（山
田耕路・韓達昊・宮崎義之・菅野道廣・立花宏文 (200
0) ヒト乳がんMCF-7細胞の増殖に及ぼすイソフラボンの
作用、 大豆たん白質研究、 3, 54-58）。
【０００５】また、大豆イソフラボンは、エストロゲン
との競合を通じて抗乳癌作用を発現する可能性があると
の報告がされている（Barnes S, Grubbs C, Setchell K
DR and Carlson J (1990): Soybean inhibits mammary
tumors in models of breastcancer. Prog Clin Biol R
es, 347, 239-253；Messina M and Barnes (1991):The
role of soy products in reducing risk of cancer. J
Natl Cancer Inst,83, 541-546；Hawrylewicz EJ, Zap
ata JJ and Blair WH (1995): Soy and experimental c
ancer: animal studies. J Nutr, 125, 698s-708s）。
との競合を通じて抗乳癌作用を発現する可能性があると
の報告がされている（Barnes S, Grubbs C, Setchell K
DR and Carlson J (1990): Soybean inhibits mammary
tumors in models of breastcancer. Prog Clin Biol R
es, 347, 239-253；Messina M and Barnes (1991):The
role of soy products in reducing risk of cancer. J
Natl Cancer Inst,83, 541-546；Hawrylewicz EJ, Zap
ata JJ and Blair WH (1995): Soy and experimental c
ancer: animal studies. J Nutr, 125, 698s-708s）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明者は、環境ホル
モンのエストロゲン活性が、標的細胞に存在するエスト
ロゲン受容体との相互作用を通じて発現することに着目
して、種々の環境ホルモンのヒトエストロゲン受容体へ
の結合性とエストロゲン活性の関係について検討した。
また、本発明者は、大豆イソフラボンが、エストロゲン
との競合を通じて抗乳癌作用を発現する可能性があるこ
とに着目して、フラボノイドと環境ホルモンの相互作用
について検討した。これらの検討の結果、本発明者は、
フラボノイドがエストロゲン活性発現を抑制することを
見出して、この発明を完成した。したがって、この発明
は、フラボノイドのエストロゲン活性発現抑制方法およ
びエストロゲン活性発現抑制用組成物を提供することを
目的としている。更に、この発明は、フラボノイドのエ
ストロゲン活性発現抑制方法およびエストロゲン活性発
現抑制用組成物を提供することを目的としている。
モンのエストロゲン活性が、標的細胞に存在するエスト
ロゲン受容体との相互作用を通じて発現することに着目
して、種々の環境ホルモンのヒトエストロゲン受容体へ
の結合性とエストロゲン活性の関係について検討した。
また、本発明者は、大豆イソフラボンが、エストロゲン
との競合を通じて抗乳癌作用を発現する可能性があるこ
とに着目して、フラボノイドと環境ホルモンの相互作用
について検討した。これらの検討の結果、本発明者は、
フラボノイドがエストロゲン活性発現を抑制することを
見出して、この発明を完成した。したがって、この発明
は、フラボノイドのエストロゲン活性発現抑制方法およ
びエストロゲン活性発現抑制用組成物を提供することを
目的としている。更に、この発明は、フラボノイドのエ
ストロゲン活性発現抑制方法およびエストロゲン活性発
現抑制用組成物を提供することを目的としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、この発明は、下記一般式[I]：
に、この発明は、下記一般式[I]：
【０００８】
【化３】
【０００９】（式中、Ｒは、水素原子またはヒドロキシ
基を意味し、いずれの置換基も複数個存在していてもよ
い、Ｒ１およびＲ２は、いずれも水素原子、ヒドロキシ
基、低級アルキル基、低級アルコキシ基または置換基を
有していてもよいフェニル基を意味し、Ｒ１とＲ２との
いずれかは置換基を有していてもよいフェニル基を意味
し、Ｒ１とＲ２とがいずれも置換基を有していてもよい
フェニル基を意味することはない)で表されるフラボノ
イドを使用してエストロゲン活性発現を抑制することを
特徴とするエストロゲン活性発現抑制方法を提供する。
基を意味し、いずれの置換基も複数個存在していてもよ
い、Ｒ１およびＲ２は、いずれも水素原子、ヒドロキシ
基、低級アルキル基、低級アルコキシ基または置換基を
有していてもよいフェニル基を意味し、Ｒ１とＲ２との
いずれかは置換基を有していてもよいフェニル基を意味
し、Ｒ１とＲ２とがいずれも置換基を有していてもよい
フェニル基を意味することはない)で表されるフラボノ
イドを使用してエストロゲン活性発現を抑制することを
特徴とするエストロゲン活性発現抑制方法を提供する。
【００１０】さらに、この発明は、一般式[I]で表され
るフラボノイドを、エストロゲン活性発現を抑制するた
めに使用することを特徴とするエストロゲン活性発現抑
制用組成物を提供する。この発明の好ましい態様として
は、一般式[I]で表されるフラボノイドが、イソフラボ
ン類[II]と、フラボン類[III]とを包含していることで
ある。
るフラボノイドを、エストロゲン活性発現を抑制するた
めに使用することを特徴とするエストロゲン活性発現抑
制用組成物を提供する。この発明の好ましい態様として
は、一般式[I]で表されるフラボノイドが、イソフラボ
ン類[II]と、フラボン類[III]とを包含していることで
ある。
【００１１】
【発明の実施の態様】この発明に係る一般式[I]で表さ
れるフラボノイドにおいて、置換基Ｒは水素原子または
ヒドロキシ基を意味し、いずれの置換基も複数個存在し
ていてもよい。換言すると、置換基Ｒは総計で４個存在
する。つまり、例えば、置換基Ｒとしてヒドロキシ基が
存在しない場合には、置換基Ｒ全ては水素原子であり、
その総計は４個である。また、置換基Ｒとしてヒドロキ
シ基が１個存在する場合には、残り３個の置換基Ｒは水
素原子である。同様に、置換基Ｒとしてヒドロキシ基が
２個存在する場合には、残り２個の置換基Ｒは水素原子
である。
れるフラボノイドにおいて、置換基Ｒは水素原子または
ヒドロキシ基を意味し、いずれの置換基も複数個存在し
ていてもよい。換言すると、置換基Ｒは総計で４個存在
する。つまり、例えば、置換基Ｒとしてヒドロキシ基が
存在しない場合には、置換基Ｒ全ては水素原子であり、
その総計は４個である。また、置換基Ｒとしてヒドロキ
シ基が１個存在する場合には、残り３個の置換基Ｒは水
素原子である。同様に、置換基Ｒとしてヒドロキシ基が
２個存在する場合には、残り２個の置換基Ｒは水素原子
である。
【００１２】また、上記一般式[I]において、Ｒ２で表
される低級アルキル基および低級アルコキシ基のアルキ
ル基は、炭素原子数が１個ないし４個の直鎖状もしくは
分岐鎖状の１価脂肪族炭化水素基を意味し、たとえは、
メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブ
チル基、イソブチル基、tert−ブチル基などが挙げられ
る。更に、上記一般式[I]において、Ｒ１またはＲ２で
表されるフェニル基の置換基としては、水素原子、ヒド
ロキシ基、低級アルキル基または低級アルコキシ基が挙
げられる。また、フェニル基の置換基の数は、１個に限
定されることはなく、複数個であってもよく、また、複
数個の置換基が存在する場合は、それらの置換基はいず
れも同じであっても、または異なっていてもよい。
される低級アルキル基および低級アルコキシ基のアルキ
ル基は、炭素原子数が１個ないし４個の直鎖状もしくは
分岐鎖状の１価脂肪族炭化水素基を意味し、たとえは、
メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブ
チル基、イソブチル基、tert−ブチル基などが挙げられ
る。更に、上記一般式[I]において、Ｒ１またはＲ２で
表されるフェニル基の置換基としては、水素原子、ヒド
ロキシ基、低級アルキル基または低級アルコキシ基が挙
げられる。また、フェニル基の置換基の数は、１個に限
定されることはなく、複数個であってもよく、また、複
数個の置換基が存在する場合は、それらの置換基はいず
れも同じであっても、または異なっていてもよい。
【００１３】また、この発明に使用される一般式[I]で
表されるフラボノイドには、イソフラボン類[II]と、フ
ラボン類[III]とが包含されている。イソフラボン類[I
I]は、一般式[I]において、Ｒ１が水素原子、ヒドロキ
シ基、低級アルキル基または低級アルコキシ基を意味
し、Ｒ２が置換基を有していてもよいフェニル基を意味
する場合のフラボノイドを指称し、また、フラボン類[I
II]は、一般式[I]において、Ｒ１は置換基を有していて
もよいフェニル基を意味し、Ｒ２は水素原子、ヒドロキ
シ基、低級アルキル基または低級アルコキシ基を意味す
る場合のフラボノイドを指称する。
表されるフラボノイドには、イソフラボン類[II]と、フ
ラボン類[III]とが包含されている。イソフラボン類[I
I]は、一般式[I]において、Ｒ１が水素原子、ヒドロキ
シ基、低級アルキル基または低級アルコキシ基を意味
し、Ｒ２が置換基を有していてもよいフェニル基を意味
する場合のフラボノイドを指称し、また、フラボン類[I
II]は、一般式[I]において、Ｒ１は置換基を有していて
もよいフェニル基を意味し、Ｒ２は水素原子、ヒドロキ
シ基、低級アルキル基または低級アルコキシ基を意味す
る場合のフラボノイドを指称する。
【００１４】この発明に使用される一般式[II]で表され
るイソフラボン類の代表的な例としては、例えば、ダイ
ゼインおよびゲニステインが挙げられる。また、フラボ
ン類の代表的な例としては、例えば、フラボン、ルテオ
リンおよびケルセチンが挙げられる。
るイソフラボン類の代表的な例としては、例えば、ダイ
ゼインおよびゲニステインが挙げられる。また、フラボ
ン類の代表的な例としては、例えば、フラボン、ルテオ
リンおよびケルセチンが挙げられる。
【００１５】この発明に係るフラボノイドについて、種
々の環境ホルモンのエストロゲン受容体への結合能とエ
ストロゲン活性とを検討した。種々の環境ホルモンのヒ
エストロゲン受容体への結合能の測定は、Garrett eta
l.の方法(同上)に従い，inhibition ELISA法を用いて行
った。また、環境ホルモンのエストロゲン受容体との結
合能は、各種環境ホルモンが１７β-エストラジオ−ル
とヒトエストロゲンβ受容体の結合を50%阻害する濃度
（IC50）を求めることにより比較検討して求めた。
々の環境ホルモンのエストロゲン受容体への結合能とエ
ストロゲン活性とを検討した。種々の環境ホルモンのヒ
エストロゲン受容体への結合能の測定は、Garrett eta
l.の方法(同上)に従い，inhibition ELISA法を用いて行
った。また、環境ホルモンのエストロゲン受容体との結
合能は、各種環境ホルモンが１７β-エストラジオ−ル
とヒトエストロゲンβ受容体の結合を50%阻害する濃度
（IC50）を求めることにより比較検討して求めた。
【００１６】この発明に係るフラボノイドについて、種
々の環境ホルモンのエストロゲン受容体結合能とエスト
ロゲン活性について比較検討した。エストロゲン受容体
への結合能は、エストロゲン活性は、最高の増殖促進活
性が認められた濃度（IC50）とその濃度における増殖促
進活性で示した。この発明に係るフラボノイドについ
て、フラボノイドと環境ホルモンの相互作用について検
討した。大豆イソフラボンなどのフラボノイドが抗環境
ホルモン活性を発現するか否かについて検討するため、
フラボノイドと環境ホルモンの複合作用について検討を
行った。
々の環境ホルモンのエストロゲン受容体結合能とエスト
ロゲン活性について比較検討した。エストロゲン受容体
への結合能は、エストロゲン活性は、最高の増殖促進活
性が認められた濃度（IC50）とその濃度における増殖促
進活性で示した。この発明に係るフラボノイドについ
て、フラボノイドと環境ホルモンの相互作用について検
討した。大豆イソフラボンなどのフラボノイドが抗環境
ホルモン活性を発現するか否かについて検討するため、
フラボノイドと環境ホルモンの複合作用について検討を
行った。
【００１７】
【実施例】実施例１：17β-エストラジオ−ルのヒトエ
ストロゲン受容体への結合に及ぼすフラボノイド共存の
影響を調べた。まず、２００μｌのエストロゲン標識ウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液をＥＬＩＳＡ用マイク
ロプレ−トの各ウェルに入れ、室温に２０時間放置して
結合させた。つぎに、０．０５％のツイ−ン(Tween) 20
を含む生理リン酸緩衝液（ｐＨ７．４、ＰＢＳ）で3回
洗浄し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液３００μｌを加え
て３７℃で１時間放置することによりブロッキングを行
った。Tween 20 含有ＰＢＳ（ＴＰＢＳ）で洗浄した
後、１０ｐＭのリコンビナントヒトエストロゲン受容体
βと種々の濃度の環境ホルモンを含む混合物を加えて室
温に2時間放置し、遊離のヒトエストロゲン受容体βを
エストロゲン標識ＢＳＡに結合させた。ＴＰＢＳ洗浄
後、５０μｌのウサギ抗エストロゲン抗体溶液を加えて
室温に2時間放置した。再びＴＰＢＳ洗浄を行い、１０
０μｌのホ−スラディッシュ・パ−オキシダ−ゼ (hors
eradish peroxidase) 標識抗ウサギIgG抗体を加えて室
温に2時間放置し、ＴＰＢＳ洗浄を行った。最後に１０
０μｌの基質溶液（0.006% H2O2 in 0.2 Ｍ くエン酸バ
ッファ (pH 4.0)、Ｈ2Ｏ、6mg/ml2，2'-アジノ-ビス（3
−エチル）ベンズチアゾリンスルホン酸の１０：９：１
混合物）を加えて室温で10分間反応させ、１．５％シュ
ウ酸溶液５０μｌを加えて発色反応を停止させた。各ウ
ェルの４１５ｎｍにおける吸光度をＥＬＩＳＡ用分光光
度計を用いて測定することにより、エストロゲン標識Ｂ
ＳＡに結合したヒトエストロゲン受容体β量を測定し
た。各種化合物のエストロゲン受容体への結合活性はこ
の結合反応を５０％阻害する濃度（IC50）で表した。実
験で得られた結果を表１に示す。
ストロゲン受容体への結合に及ぼすフラボノイド共存の
影響を調べた。まず、２００μｌのエストロゲン標識ウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液をＥＬＩＳＡ用マイク
ロプレ−トの各ウェルに入れ、室温に２０時間放置して
結合させた。つぎに、０．０５％のツイ−ン(Tween) 20
を含む生理リン酸緩衝液（ｐＨ７．４、ＰＢＳ）で3回
洗浄し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液３００μｌを加え
て３７℃で１時間放置することによりブロッキングを行
った。Tween 20 含有ＰＢＳ（ＴＰＢＳ）で洗浄した
後、１０ｐＭのリコンビナントヒトエストロゲン受容体
βと種々の濃度の環境ホルモンを含む混合物を加えて室
温に2時間放置し、遊離のヒトエストロゲン受容体βを
エストロゲン標識ＢＳＡに結合させた。ＴＰＢＳ洗浄
後、５０μｌのウサギ抗エストロゲン抗体溶液を加えて
室温に2時間放置した。再びＴＰＢＳ洗浄を行い、１０
０μｌのホ−スラディッシュ・パ−オキシダ−ゼ (hors
eradish peroxidase) 標識抗ウサギIgG抗体を加えて室
温に2時間放置し、ＴＰＢＳ洗浄を行った。最後に１０
０μｌの基質溶液（0.006% H2O2 in 0.2 Ｍ くエン酸バ
ッファ (pH 4.0)、Ｈ2Ｏ、6mg/ml2，2'-アジノ-ビス（3
−エチル）ベンズチアゾリンスルホン酸の１０：９：１
混合物）を加えて室温で10分間反応させ、１．５％シュ
ウ酸溶液５０μｌを加えて発色反応を停止させた。各ウ
ェルの４１５ｎｍにおける吸光度をＥＬＩＳＡ用分光光
度計を用いて測定することにより、エストロゲン標識Ｂ
ＳＡに結合したヒトエストロゲン受容体β量を測定し
た。各種化合物のエストロゲン受容体への結合活性はこ
の結合反応を５０％阻害する濃度（IC50）で表した。実
験で得られた結果を表１に示す。
【００１８】
【表１】
【００１９】表１の結果から、大豆中に見いだされる２
種のイソフラボンであるダイゼインおよびゲニステイン
は、いずれも10-9 Ｍ以上の濃度で17β-エストラジオ−
ルのエストロゲン受容体への結合を濃度依存的に阻害
し，10-7 Ｍ付近の濃度領域で結合量を50%に低下させる
ことが判明した。フラボノ−ルの一種であるケルセチン
は、イソフラボンと同様に10-9 Ｍ以上の濃度で17β-エ
ストラジオ−ルのエストロゲン受容体への結合を濃度依
存的に阻害し，10-7 Ｍ付近の濃度領域で結合量を50%に
低下させた。一方，フラボンの一種であるルテオリン
は、10-8 Ｍ以上の濃度で結合阻害活性を示し，50%阻害
濃度（IC50）は10-6 Ｍ前後であった。この結果は，ケ
ルセチンもイソフラボンと同等のエストロゲン受容体結
合能と有するが、ルテオリンの結合能は3種のフラボノ
イドの10分の1程度であることを示唆している。
種のイソフラボンであるダイゼインおよびゲニステイン
は、いずれも10-9 Ｍ以上の濃度で17β-エストラジオ−
ルのエストロゲン受容体への結合を濃度依存的に阻害
し，10-7 Ｍ付近の濃度領域で結合量を50%に低下させる
ことが判明した。フラボノ−ルの一種であるケルセチン
は、イソフラボンと同様に10-9 Ｍ以上の濃度で17β-エ
ストラジオ−ルのエストロゲン受容体への結合を濃度依
存的に阻害し，10-7 Ｍ付近の濃度領域で結合量を50%に
低下させた。一方，フラボンの一種であるルテオリン
は、10-8 Ｍ以上の濃度で結合阻害活性を示し，50%阻害
濃度（IC50）は10-6 Ｍ前後であった。この結果は，ケ
ルセチンもイソフラボンと同等のエストロゲン受容体結
合能と有するが、ルテオリンの結合能は3種のフラボノ
イドの10分の1程度であることを示唆している。
【００２０】実施例２：４種のフラボノイドのエストロ
ゲン活性を次のようにして調べた。まず、内在エストロ
ゲンを除去するために、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）１００
ｍｌを活性炭５ｇを用いて５６℃で３０分間２度処理し
た。次いで、活性炭を４５０ｘｇで４℃、２０分間遠心
分離して除去した。この操作を２度繰り返して、得られ
た上清液を０．２２μｍ酢酸セルロ−スフィルタ−でろ
取した。次いで、活性炭処理ＦＢＳ（ｃＦＢＳ）を使用
するまで−２０℃で保存した。ヒトMCF-7細胞はＦＢＳ
を１０％含むフェノ−ルレッド含有ＤＭＥＭ培地を用い
て増殖させ、同じ培地を用いて２４ウェル培養プレ−ト
に104個／ウェルでまきこみ、２４時間培養した。つぎ
に、１０％ｃＦＢＳを含むフェノ−ルレッド除去ＤＭＥ
Ｍ培地に交換し、各種濃度の環境ホルモンを添加して６
日間培養を行った。培地を除去した後、冷１０％トリク
ロロ酢酸２００μｌを加えて４℃に３０分放置して細胞
を固定し、５００μｌの精製水で５回洗浄後室温にて乾
燥させた。つぎに、１％酢酸に溶解した０．４％スルホ
ロ−ダミン B（ＳＲＢ）溶液を５００μｌ加え、室温に
10分放置してタンパク質を染色後、５００μｌの１％酢
酸溶液で１回洗浄した。エア−ドライア−の冷風を用い
て乾燥した後、２００μｌの１０ｍＭＴｒｉｓ溶液（ｐ
Ｈ１０．４）を加えて結合したＳＲＢを抽出し、抽出液
を９６ウェルＥＬＩＳＡプレ−トに移し、４９２ｎｍの
吸光度を測定することにより細胞数の推定を行った。本
法を用いることにより、細胞数測定法に比べてより少な
い細胞数で増殖調節活性を評価することが可能となり、
各種環境ホルモンのMCF-7細胞増殖促進活性を鋭敏に検
出することが可能となった。また、測定結果のばらつき
も細胞数測定法より小さく、実験精度の向上をもたらし
た。実験で得られた結果を表２に示す。
ゲン活性を次のようにして調べた。まず、内在エストロ
ゲンを除去するために、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）１００
ｍｌを活性炭５ｇを用いて５６℃で３０分間２度処理し
た。次いで、活性炭を４５０ｘｇで４℃、２０分間遠心
分離して除去した。この操作を２度繰り返して、得られ
た上清液を０．２２μｍ酢酸セルロ−スフィルタ−でろ
取した。次いで、活性炭処理ＦＢＳ（ｃＦＢＳ）を使用
するまで−２０℃で保存した。ヒトMCF-7細胞はＦＢＳ
を１０％含むフェノ−ルレッド含有ＤＭＥＭ培地を用い
て増殖させ、同じ培地を用いて２４ウェル培養プレ−ト
に104個／ウェルでまきこみ、２４時間培養した。つぎ
に、１０％ｃＦＢＳを含むフェノ−ルレッド除去ＤＭＥ
Ｍ培地に交換し、各種濃度の環境ホルモンを添加して６
日間培養を行った。培地を除去した後、冷１０％トリク
ロロ酢酸２００μｌを加えて４℃に３０分放置して細胞
を固定し、５００μｌの精製水で５回洗浄後室温にて乾
燥させた。つぎに、１％酢酸に溶解した０．４％スルホ
ロ−ダミン B（ＳＲＢ）溶液を５００μｌ加え、室温に
10分放置してタンパク質を染色後、５００μｌの１％酢
酸溶液で１回洗浄した。エア−ドライア−の冷風を用い
て乾燥した後、２００μｌの１０ｍＭＴｒｉｓ溶液（ｐ
Ｈ１０．４）を加えて結合したＳＲＢを抽出し、抽出液
を９６ウェルＥＬＩＳＡプレ−トに移し、４９２ｎｍの
吸光度を測定することにより細胞数の推定を行った。本
法を用いることにより、細胞数測定法に比べてより少な
い細胞数で増殖調節活性を評価することが可能となり、
各種環境ホルモンのMCF-7細胞増殖促進活性を鋭敏に検
出することが可能となった。また、測定結果のばらつき
も細胞数測定法より小さく、実験精度の向上をもたらし
た。実験で得られた結果を表２に示す。
【００２１】
【表２】
【００２２】表２の結果から、ダイゼインは、10-10か
ら10-6 Ｍの濃度領域でMCF-7細胞の増殖を促進し，10-8
Ｍで最も高い増殖促進活性を示した。また，10-5 Ｍ以
上では細胞毒性が認められた。ゲニステインの増殖促進
効果は、同様に10-10 Ｍ以上で認められたが，最高の増
殖促進効果は、10-6 Ｍで認められ，細胞毒性は10-4Ｍ
以上で認められた。ケルセチンおよびルテオリンは、10
-9 Ｍで最も高い増殖促進活性を示したが，細胞毒性が
イソフラボンより低濃度から認められ，ケルセチンは10
-8 Ｍ以上で，ルテオリンは10-7 Ｍ以上でMCF-7細胞に
対して増殖抑制もしくは致死作用を示した。以上の結果
は，ケルセチンおよびルテオリンが大豆イソフラボンよ
り低濃度でエストロゲン活性を発現するが，MCF-7細胞
毒性もより低濃度から発現することを示している。
ら10-6 Ｍの濃度領域でMCF-7細胞の増殖を促進し，10-8
Ｍで最も高い増殖促進活性を示した。また，10-5 Ｍ以
上では細胞毒性が認められた。ゲニステインの増殖促進
効果は、同様に10-10 Ｍ以上で認められたが，最高の増
殖促進効果は、10-6 Ｍで認められ，細胞毒性は10-4Ｍ
以上で認められた。ケルセチンおよびルテオリンは、10
-9 Ｍで最も高い増殖促進活性を示したが，細胞毒性が
イソフラボンより低濃度から認められ，ケルセチンは10
-8 Ｍ以上で，ルテオリンは10-7 Ｍ以上でMCF-7細胞に
対して増殖抑制もしくは致死作用を示した。以上の結果
は，ケルセチンおよびルテオリンが大豆イソフラボンよ
り低濃度でエストロゲン活性を発現するが，MCF-7細胞
毒性もより低濃度から発現することを示している。
【００２３】実施例３：実施例１および２に記載した方
法を用いて、種々の環境ホルモンのエストロゲン受容体
結合能およびエストロゲン活性を比較した。エストロゲ
ン活性については、最高のエストロゲン活性を示した濃
度およびその濃度における無添加群に対する細胞数増加
倍率を示した。実験で得られた結果を表３に示す。
法を用いて、種々の環境ホルモンのエストロゲン受容体
結合能およびエストロゲン活性を比較した。エストロゲ
ン活性については、最高のエストロゲン活性を示した濃
度およびその濃度における無添加群に対する細胞数増加
倍率を示した。実験で得られた結果を表３に示す。
【００２４】
【表３】
【００２５】エストロゲン受容体への結合能は、エスト
ロゲン活性は最高の増殖促進活性が認められた濃度（IC
50）とその濃度における増殖促進活性で示した。内在性
エストロゲンである17β-エストラジオ−ルは、10-10
ＭでＭＣＦ−７細胞の増殖を２．２倍に促進したが，ジ
エチルスチルベストロ−ル（diethylstilbestrol）は10
-9 Ｍの17β-エストラジオ−ルの受容体への結合を4 x
10-10 Ｍで50%阻害し，17β-エストラジオ−ルと同等も
しくは若干強い結合活性を示した。また，エストロゲン
活性も10-8 Ｍで3.5倍にMCF-7細胞の増殖を促進した。1
7β-エチルエストラジオ−ル、タモキシフェン（tamoxi
fen）、メストラノ−ル（mestranol）およびクロミフェ
ン（clomiphene）も10-7 Ｍ以下のIC50を与え，かなり
強い結合活性を有することが示唆された。しかし，エス
トロゲン活性は17β-エチルエストラジオ−ルが10-8 Ｍ
で2.6倍とかなり強い活性を示したのに対し，他の3種の
エストロゲン活性はより高濃度で発現し，増殖促進倍率
も1.4倍以下の弱いものであった。イソフラボンにおい
ては、ダイゼインおよびゲニステインは、10-7 Ｍ前後
のIC50を与えたが、フォルモノネチン（formononetin）
およびビオチャニン（biochanin） Aは10-5 Ｍ前後の値
を与え、かなり結合能が低いことが示唆された。フォル
モノネチンのエストロゲン活性は、ゲニステインより若
干弱い程度であったが，ビオチャニンAは10-4 Ｍ前後で
1.3倍程度の増殖促進活性しか示さず、エストロゲン活
性は非常に弱いものであった。イソフラボンの生体内代
謝により生じるエクオ−ル（equol）のエストロゲン受
容体への結合能はビオチャニンAより高い傾向が認めら
れたが、エストロゲン活性はビオチャニンAより弱いも
のであった。
ロゲン活性は最高の増殖促進活性が認められた濃度（IC
50）とその濃度における増殖促進活性で示した。内在性
エストロゲンである17β-エストラジオ−ルは、10-10
ＭでＭＣＦ−７細胞の増殖を２．２倍に促進したが，ジ
エチルスチルベストロ−ル（diethylstilbestrol）は10
-9 Ｍの17β-エストラジオ−ルの受容体への結合を4 x
10-10 Ｍで50%阻害し，17β-エストラジオ−ルと同等も
しくは若干強い結合活性を示した。また，エストロゲン
活性も10-8 Ｍで3.5倍にMCF-7細胞の増殖を促進した。1
7β-エチルエストラジオ−ル、タモキシフェン（tamoxi
fen）、メストラノ−ル（mestranol）およびクロミフェ
ン（clomiphene）も10-7 Ｍ以下のIC50を与え，かなり
強い結合活性を有することが示唆された。しかし，エス
トロゲン活性は17β-エチルエストラジオ−ルが10-8 Ｍ
で2.6倍とかなり強い活性を示したのに対し，他の3種の
エストロゲン活性はより高濃度で発現し，増殖促進倍率
も1.4倍以下の弱いものであった。イソフラボンにおい
ては、ダイゼインおよびゲニステインは、10-7 Ｍ前後
のIC50を与えたが、フォルモノネチン（formononetin）
およびビオチャニン（biochanin） Aは10-5 Ｍ前後の値
を与え、かなり結合能が低いことが示唆された。フォル
モノネチンのエストロゲン活性は、ゲニステインより若
干弱い程度であったが，ビオチャニンAは10-4 Ｍ前後で
1.3倍程度の増殖促進活性しか示さず、エストロゲン活
性は非常に弱いものであった。イソフラボンの生体内代
謝により生じるエクオ−ル（equol）のエストロゲン受
容体への結合能はビオチャニンAより高い傾向が認めら
れたが、エストロゲン活性はビオチャニンAより弱いも
のであった。
【００２６】フラボン類では、クリシン（chrisin）が
最も低いIC50値を与え，アピゲニン（apigenin）が最も
高いIC50値を与えたが，これらの化合物のエストロゲン
活性とは必ずしも一致せず，ルテオリンが最も低濃度で
MCF-7細胞の増殖を促進した。アピゲニンのエストロゲ
ン活性は10-6 Ｍ前後の高濃度領域においてのみ認めら
れたが，促進倍率は2.6倍とかなり高い促進活性が得ら
れた。フラボノ−ルのIC50は5 x 10-5 Ｍのかなり高い
濃度領域に認められたが，エストロゲン活性が認められ
たのはケルセチンの10-9 Ｍに対し、ケンフェロ−ル（k
aempferol）では10-5 Ｍと大きな違いが認められた。し
かしながら、促進倍率はケルセチンで2.0倍、ケンフェ
ロ−ルで2.3倍であり、同等のエストロゲン活性を与え
た。その他の環境ホルモンでは、4-ジヒドロキシフェノ
−ルが10-9 Ｍ、4-ノニルフェノ−ルおよびビスフェノ
−ル Aが10-8 Ｍの低濃度でエストロゲン活性を発現し
た。細胞増殖促進活性が2倍以上の化合物はナリンゲニ
ン（naringenin）（2.6倍）、サイアナジン（cyanazin
e）（2.6倍）、4-tert- オクチルフェノ−ル（2.6
倍）、ビス（2- エチルヘキシル）アジペ−ト （2.3
倍）、4- ジヒドロキシビフェノ−ル（2.3倍）、4- ノ
ニルフェノ−ル（2.1倍）、ビスフェノ−ル A（2.1倍）
などであった。多くの環境ホルモンでは、IC50で評価し
たエストロゲン受容体結合能とエストロゲン活性発現濃
度との間に相関関係が認められたが、かならずしも一致
しない場合もあり、これらの化合物におけるMCF-7細胞
増殖促進効果の発現にはエストロゲン受容体への結合以
外の因子も関与していることが示唆された。
最も低いIC50値を与え，アピゲニン（apigenin）が最も
高いIC50値を与えたが，これらの化合物のエストロゲン
活性とは必ずしも一致せず，ルテオリンが最も低濃度で
MCF-7細胞の増殖を促進した。アピゲニンのエストロゲ
ン活性は10-6 Ｍ前後の高濃度領域においてのみ認めら
れたが，促進倍率は2.6倍とかなり高い促進活性が得ら
れた。フラボノ−ルのIC50は5 x 10-5 Ｍのかなり高い
濃度領域に認められたが，エストロゲン活性が認められ
たのはケルセチンの10-9 Ｍに対し、ケンフェロ−ル（k
aempferol）では10-5 Ｍと大きな違いが認められた。し
かしながら、促進倍率はケルセチンで2.0倍、ケンフェ
ロ−ルで2.3倍であり、同等のエストロゲン活性を与え
た。その他の環境ホルモンでは、4-ジヒドロキシフェノ
−ルが10-9 Ｍ、4-ノニルフェノ−ルおよびビスフェノ
−ル Aが10-8 Ｍの低濃度でエストロゲン活性を発現し
た。細胞増殖促進活性が2倍以上の化合物はナリンゲニ
ン（naringenin）（2.6倍）、サイアナジン（cyanazin
e）（2.6倍）、4-tert- オクチルフェノ−ル（2.6
倍）、ビス（2- エチルヘキシル）アジペ−ト （2.3
倍）、4- ジヒドロキシビフェノ−ル（2.3倍）、4- ノ
ニルフェノ−ル（2.1倍）、ビスフェノ−ル A（2.1倍）
などであった。多くの環境ホルモンでは、IC50で評価し
たエストロゲン受容体結合能とエストロゲン活性発現濃
度との間に相関関係が認められたが、かならずしも一致
しない場合もあり、これらの化合物におけるMCF-7細胞
増殖促進効果の発現にはエストロゲン受容体への結合以
外の因子も関与していることが示唆された。
【００２７】実施例４：フラボノイドと環境ホルモンの
相互作用 大豆イソフラボンなどのフラボノイドが抗環境ホルモン
活性を発現するか否かについて検討するため，フラボノ
イドと環境ホルモンの複合作用について検討を行った。
これらの化合物の添加濃度はそれぞれの化合物が最高の
エストロゲン活性を示した濃度とし、実施例２に示した
方法により細胞増殖に及ぼすエストロゲン活性物質とフ
ラボノイドの共存効果について検討した。実験で得られ
た結果を表４に示す。
相互作用 大豆イソフラボンなどのフラボノイドが抗環境ホルモン
活性を発現するか否かについて検討するため，フラボノ
イドと環境ホルモンの複合作用について検討を行った。
これらの化合物の添加濃度はそれぞれの化合物が最高の
エストロゲン活性を示した濃度とし、実施例２に示した
方法により細胞増殖に及ぼすエストロゲン活性物質とフ
ラボノイドの共存効果について検討した。実験で得られ
た結果を表４に示す。
【００２８】
【表４】
【００２９】フラボノイドにおいて、ダイゼインおよび
ゲニステインは、最高もしくはそれに準じる増殖促進効
果が得られた10-8 Ｍを，ケルセチンおよびルテオリン
は最高の増殖促進効果が得られた10-9 Ｍを添加した。
他の環境ホルモン類も同様に最高もしくはそれに準じる
増殖促進効果が得られた濃度で添加した。ジエチルスチ
ルベストロ−ル、10-8 ＭでMCF-7細胞の細胞の増殖を3.
5倍に促進したが，フラボノイド共存下においても同等
の増殖促進効果を発現した。一方，17β-エチルエスト
ラジオ−ルの増殖促進効果は、ゲニステイン，ダイゼイ
ンおよびルテオリンの存在下で低下する傾向が認められ
た。また，これら3種のフラボノイドは、4-ノニルフェ
ノ−ル、4-tert-オクチルフェノ−ル、4-ジヒドロキシ
ビフェノ−ルおよびビスフェノ−ルAの細胞増殖促進効
果の発現を完全に抑制しただけでなく、かえって細胞数
を減少させた。しかしながら、ケルセチンの添加はこれ
らの環境ホルモンの活性発現に大きな効果は与えなかっ
た。これらの結果は、環境ホルモン活性を有する複数の
化合物が同時に作用した場合、互いに抑制的に作用する
だけでなく、逆の作用を発現する場合があることを示唆
している。したがって、環境ホルモンの生体調節機能の
評価およびその生理的意義の検討を行う場合、環境ホル
モンの相互作用に関する検討が不可欠であると思われ
る。
ゲニステインは、最高もしくはそれに準じる増殖促進効
果が得られた10-8 Ｍを，ケルセチンおよびルテオリン
は最高の増殖促進効果が得られた10-9 Ｍを添加した。
他の環境ホルモン類も同様に最高もしくはそれに準じる
増殖促進効果が得られた濃度で添加した。ジエチルスチ
ルベストロ−ル、10-8 ＭでMCF-7細胞の細胞の増殖を3.
5倍に促進したが，フラボノイド共存下においても同等
の増殖促進効果を発現した。一方，17β-エチルエスト
ラジオ−ルの増殖促進効果は、ゲニステイン，ダイゼイ
ンおよびルテオリンの存在下で低下する傾向が認められ
た。また，これら3種のフラボノイドは、4-ノニルフェ
ノ−ル、4-tert-オクチルフェノ−ル、4-ジヒドロキシ
ビフェノ−ルおよびビスフェノ−ルAの細胞増殖促進効
果の発現を完全に抑制しただけでなく、かえって細胞数
を減少させた。しかしながら、ケルセチンの添加はこれ
らの環境ホルモンの活性発現に大きな効果は与えなかっ
た。これらの結果は、環境ホルモン活性を有する複数の
化合物が同時に作用した場合、互いに抑制的に作用する
だけでなく、逆の作用を発現する場合があることを示唆
している。したがって、環境ホルモンの生体調節機能の
評価およびその生理的意義の検討を行う場合、環境ホル
モンの相互作用に関する検討が不可欠であると思われ
る。
【００３０】約７０種類の化学品が潜在的に内分泌系を
破壊するとの疑いを持たれているけれども、これらの化
学品が内分泌系を破壊する能力を有しているかどうかを
明らかにする必要がある。しかしながら、環境エストロ
ゲン類と、食物中の植物由来の天然エストロゲンの代表
であるフラボノイド類との組み合わせによる効果につい
てのデ−タは、これまでは限定的なものである。したが
って、それらが別の環境エストロゲン類と共存している
ときのそれらの効果ならびに組み合わせ効果を評価する
必要がある。それに加えて、ヒト乳がんセルラインは、
エストロゲンレセプタの発現によるエストロゲン応答性
によって特徴づけられている確立した体外系である。し
たがって、天然エストロゲン類の、エストロゲンレセプ
タである標的細胞に対する増殖効果はエストロゲン作用
の顕著な特長として残っている。環境エストロゲン類と
フラボノイド類とのエストロゲン性を決定する一つの方
法として、これらの化合物のＭＣＦ−７細胞に対する増
殖効果を試験した。さらに、フラボノイド類によるＭＣ
Ｆ−４細胞の環境エストロゲン誘導増殖を試験した。
破壊するとの疑いを持たれているけれども、これらの化
学品が内分泌系を破壊する能力を有しているかどうかを
明らかにする必要がある。しかしながら、環境エストロ
ゲン類と、食物中の植物由来の天然エストロゲンの代表
であるフラボノイド類との組み合わせによる効果につい
てのデ−タは、これまでは限定的なものである。したが
って、それらが別の環境エストロゲン類と共存している
ときのそれらの効果ならびに組み合わせ効果を評価する
必要がある。それに加えて、ヒト乳がんセルラインは、
エストロゲンレセプタの発現によるエストロゲン応答性
によって特徴づけられている確立した体外系である。し
たがって、天然エストロゲン類の、エストロゲンレセプ
タである標的細胞に対する増殖効果はエストロゲン作用
の顕著な特長として残っている。環境エストロゲン類と
フラボノイド類とのエストロゲン性を決定する一つの方
法として、これらの化合物のＭＣＦ−７細胞に対する増
殖効果を試験した。さらに、フラボノイド類によるＭＣ
Ｆ−４細胞の環境エストロゲン誘導増殖を試験した。
【００３１】実施例５：ＭＣＦ−７細胞の増殖に対する
環境環境エストロゲンとフラボノイドの薬剤依存効果は
次のようにして検討した。 （細胞および細胞培養）ヒト乳がんＭＣＦ−７細胞を、
Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ‘−２−エタ
ンスルホン酸２．３ｍｇ／ｍｌ、ペニシリンＧ１００Ｕ
／ｍｌ、ストレプトマイシン０．１ｍｇ／ｍｌ、炭酸水
素ナトリウム２．０８ｍｇ／ｍｌ、５％ＦＢＳを添加し
たＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。細胞は、加湿雰囲
気で、５％ＣＯ２を用いて３７℃で１００ｍｍプラスチ
ック組織培養デイッシュを使用して培養した。保存培養
細胞からＭＣＦ−７を、ＰＢＳを用いて２度洗浄した。
次いで、その細胞を、０．２％トリプシン／ＰＢＳで処
理し、４℃で３分間１５０ｘｇで遠心分離することのよ
ってＲＰＭＩ１９４０培地で１度洗浄した。細胞ペレッ
トを、ＲＰＭＩ１９４０培地で再懸濁し、該培地で２度
洗浄した。最後に、細胞ペレットを、ＲＰＭＩ１９４０
培地で再懸濁し、細胞数を計数計で計算した。ヒト乳が
んＭＣＦ−７細胞（１ｘ１０５個／ｍｌ）を、２４ウエ
ルプレ−トに接種し、２４時間接触した。次いで、培地
を、環境エストロゲンとフラボノイドとを有する１％ｃ
ＦＢＳを含むフエノ−ルレツド除去ＲＰＭＩ１６４０で
置換した。細胞数を、計数計で、各ウエル中の細胞数を
計算して５日目または６日目で特定した。
環境環境エストロゲンとフラボノイドの薬剤依存効果は
次のようにして検討した。 （細胞および細胞培養）ヒト乳がんＭＣＦ−７細胞を、
Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ‘−２−エタ
ンスルホン酸２．３ｍｇ／ｍｌ、ペニシリンＧ１００Ｕ
／ｍｌ、ストレプトマイシン０．１ｍｇ／ｍｌ、炭酸水
素ナトリウム２．０８ｍｇ／ｍｌ、５％ＦＢＳを添加し
たＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。細胞は、加湿雰囲
気で、５％ＣＯ２を用いて３７℃で１００ｍｍプラスチ
ック組織培養デイッシュを使用して培養した。保存培養
細胞からＭＣＦ−７を、ＰＢＳを用いて２度洗浄した。
次いで、その細胞を、０．２％トリプシン／ＰＢＳで処
理し、４℃で３分間１５０ｘｇで遠心分離することのよ
ってＲＰＭＩ１９４０培地で１度洗浄した。細胞ペレッ
トを、ＲＰＭＩ１９４０培地で再懸濁し、該培地で２度
洗浄した。最後に、細胞ペレットを、ＲＰＭＩ１９４０
培地で再懸濁し、細胞数を計数計で計算した。ヒト乳が
んＭＣＦ−７細胞（１ｘ１０５個／ｍｌ）を、２４ウエ
ルプレ−トに接種し、２４時間接触した。次いで、培地
を、環境エストロゲンとフラボノイドとを有する１％ｃ
ＦＢＳを含むフエノ−ルレツド除去ＲＰＭＩ１６４０で
置換した。細胞数を、計数計で、各ウエル中の細胞数を
計算して５日目または６日目で特定した。
【００３２】（統計）結果は、３ないし４つの独立した
アッセイを２度行なって平均値±標準偏差として表示し
た。各実験からの平均細胞数は、初期プレ−テイング密
度中の差を補正するために、ホルモンフリ−対照培養細
胞（１００％）に正常化した。異なる化学処理グル−プ
間の差はシグマプロットソフトウエアを使用して、変動
の分析とＳｔｕｄｅｎｔ‘ｓ ｔ−ｔｅｓｔによって決
定した。上記ＭＣＦ−７細胞を、異なる濃度の環境エス
トロゲンとフラボノイド類を有する１％ＦＢＳ含有フェ
ノ−ルレッド除去ＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、細胞
増殖を積分生育相（図１ないし３）間に５日目で決定し
た。対照として、エタノ−ル／ＰＢＳを使用した。この
溶媒は、ＭＣＦ−７細胞の増殖に影響するかを調べた。
この溶媒は、ＭＣＦ−７細胞増殖を促進することはでき
なかった。エタノ−ル／ＰＢＳは、すべての環境エスト
ロゲンに使用される第一義的な溶媒であるので、この溶
媒を活性のネガティブコントロ−ルとして使用した。
アッセイを２度行なって平均値±標準偏差として表示し
た。各実験からの平均細胞数は、初期プレ−テイング密
度中の差を補正するために、ホルモンフリ−対照培養細
胞（１００％）に正常化した。異なる化学処理グル−プ
間の差はシグマプロットソフトウエアを使用して、変動
の分析とＳｔｕｄｅｎｔ‘ｓ ｔ−ｔｅｓｔによって決
定した。上記ＭＣＦ−７細胞を、異なる濃度の環境エス
トロゲンとフラボノイド類を有する１％ＦＢＳ含有フェ
ノ−ルレッド除去ＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、細胞
増殖を積分生育相（図１ないし３）間に５日目で決定し
た。対照として、エタノ−ル／ＰＢＳを使用した。この
溶媒は、ＭＣＦ−７細胞の増殖に影響するかを調べた。
この溶媒は、ＭＣＦ−７細胞増殖を促進することはでき
なかった。エタノ−ル／ＰＢＳは、すべての環境エスト
ロゲンに使用される第一義的な溶媒であるので、この溶
媒を活性のネガティブコントロ−ルとして使用した。
【００３３】図１ないし３に示すように、Ｅ２は、ホル
モンフリ−の対照細胞と比較して約３倍の強い増殖促進
力を示した。薬品では（図２）、ＤＥＳが、１ｎＭない
し１μＭの全濃度において、ホルモンフリ−の対照細胞
に比べて２倍もしくは３倍以上の増殖促進力を示した。
特に、１０ｎＭＤＥＳは、Ｅ２と同等の強い増殖促進力
を示した。また、１７ＥＳは、１０ｎＭないし１０μＭ
の濃度において増殖促進力を示した。他方、ＴａｍとＣ
ｌｏとは、１０ｎＭないし１μＭの濃度において強力な
細胞増殖促進力を示した。同様に、Ｍｅｓもまた１００
ｎＭないし１０μＭの濃度においてＭＣＦ−７細胞を増
殖した。ＢｉｓＡ、ＯＰ、ＢｉＰなどの工業用化学品
は、濃度を増やすと細胞増殖促進活性が増加する方向に
強い薬剤依存傾向を示した（図２）。その中で、１μＭ
濃度のＢｉｓＡは１０ｎＭＥ２に匹敵する強力な細胞増
殖促進力を示した。さらにまた、ダイゼインおよびゲニ
ステインは、ＭＣＦ−７細胞に対して増殖促進活性を示
したのに対して、ケルセチンとルテオリンは、１ｎＭな
いし１μＭの全濃度において、細胞増殖促進活性を示す
強力な薬剤依存傾向を示した。この結果、１７ＥＳ、Ｂ
ｉｓＡ、ＯＰ、ＮＰ、ダイゼインおよびゲニステイン
は、上に示した濃度でＭＣＦ−７細胞に対する増殖促進
効果を有することが判明した。
モンフリ−の対照細胞と比較して約３倍の強い増殖促進
力を示した。薬品では（図２）、ＤＥＳが、１ｎＭない
し１μＭの全濃度において、ホルモンフリ−の対照細胞
に比べて２倍もしくは３倍以上の増殖促進力を示した。
特に、１０ｎＭＤＥＳは、Ｅ２と同等の強い増殖促進力
を示した。また、１７ＥＳは、１０ｎＭないし１０μＭ
の濃度において増殖促進力を示した。他方、ＴａｍとＣ
ｌｏとは、１０ｎＭないし１μＭの濃度において強力な
細胞増殖促進力を示した。同様に、Ｍｅｓもまた１００
ｎＭないし１０μＭの濃度においてＭＣＦ−７細胞を増
殖した。ＢｉｓＡ、ＯＰ、ＢｉＰなどの工業用化学品
は、濃度を増やすと細胞増殖促進活性が増加する方向に
強い薬剤依存傾向を示した（図２）。その中で、１μＭ
濃度のＢｉｓＡは１０ｎＭＥ２に匹敵する強力な細胞増
殖促進力を示した。さらにまた、ダイゼインおよびゲニ
ステインは、ＭＣＦ−７細胞に対して増殖促進活性を示
したのに対して、ケルセチンとルテオリンは、１ｎＭな
いし１μＭの全濃度において、細胞増殖促進活性を示す
強力な薬剤依存傾向を示した。この結果、１７ＥＳ、Ｂ
ｉｓＡ、ＯＰ、ＮＰ、ダイゼインおよびゲニステイン
は、上に示した濃度でＭＣＦ−７細胞に対する増殖促進
効果を有することが判明した。
【００３４】実施例６： ＭＣＦ−７細胞の増殖に対す
る環境エストロゲンとフラボノイド類の時間依存性効果 ＭＣＦ−７細胞の増殖パタ−ンを調べるために、細胞
を、１％ｃＦＢＳ含有フェノ−ルレッド除去ＲＰＭＩ１
６４０培地中で１μＭ濃度の環境エストロゲンおよび１
０ｎＭ濃度のフラボノイドまたは１０ｎＭ濃度のＥ２と
ともに６日間培養した。ＴａｍおよびＣｌｏを１μＭ添
加した後、ＭＣＦ−７細胞は強力な増殖阻害活性を示し
た（図４）。他方、１μＭ濃度の１７ＥＳは、１０ｎＭ
濃度のＥ２と同等の強力な細胞促進活性を示した。１７
ＥＳの最強増殖活性は３日目に検出でき、４日目に最大
レベルに達した。これに対して、１０ｎＭ濃度のＥ２
は、その最強増殖活性は５日目に検出された。さらにま
た、ＤＥＳは４日目と５日目に弱い増殖促進活性を示
し、またＭｅｓは５日目および６日目に増殖阻害活性を
示した。工業用化学品の場合、ＢｉｓＡ、ＯＰ、ＮＰお
よびＢｉＰは、それぞれ１μＭの濃度で、５日間の処理
によってＭＣＦ−７細胞に対して強力な増殖促進活性を
示した。その中でも、１μＭ濃度のＢｉｓＡは１０ｎＭ
濃度のＥ２と同等の強力な細胞増殖促進活性を示した。
１０ｎＭ濃度のフラボノイド類においては、ダイセイン
およびゲニステインは、５日間の処理で弱い増殖促進活
性を示した。これに対して、ケルセチンおよびルテオリ
ンは活性を示さなかった。
る環境エストロゲンとフラボノイド類の時間依存性効果 ＭＣＦ−７細胞の増殖パタ−ンを調べるために、細胞
を、１％ｃＦＢＳ含有フェノ−ルレッド除去ＲＰＭＩ１
６４０培地中で１μＭ濃度の環境エストロゲンおよび１
０ｎＭ濃度のフラボノイドまたは１０ｎＭ濃度のＥ２と
ともに６日間培養した。ＴａｍおよびＣｌｏを１μＭ添
加した後、ＭＣＦ−７細胞は強力な増殖阻害活性を示し
た（図４）。他方、１μＭ濃度の１７ＥＳは、１０ｎＭ
濃度のＥ２と同等の強力な細胞促進活性を示した。１７
ＥＳの最強増殖活性は３日目に検出でき、４日目に最大
レベルに達した。これに対して、１０ｎＭ濃度のＥ２
は、その最強増殖活性は５日目に検出された。さらにま
た、ＤＥＳは４日目と５日目に弱い増殖促進活性を示
し、またＭｅｓは５日目および６日目に増殖阻害活性を
示した。工業用化学品の場合、ＢｉｓＡ、ＯＰ、ＮＰお
よびＢｉＰは、それぞれ１μＭの濃度で、５日間の処理
によってＭＣＦ−７細胞に対して強力な増殖促進活性を
示した。その中でも、１μＭ濃度のＢｉｓＡは１０ｎＭ
濃度のＥ２と同等の強力な細胞増殖促進活性を示した。
１０ｎＭ濃度のフラボノイド類においては、ダイセイン
およびゲニステインは、５日間の処理で弱い増殖促進活
性を示した。これに対して、ケルセチンおよびルテオリ
ンは活性を示さなかった。
【００３５】実施例７： フラボノイド類によるＭＣＦ
−７細胞に対する環境エストロゲン促進増殖の阻害 ダイセイン、ゲニステイン、ケルセチンおよびルテオリ
ンなどのフラボノイド類によるＭＣＦ−７細胞に対する
環境エストロゲン促進増殖の阻害を調べるために、細胞
を１０ｎＭ濃度のフラボノイド類の存在下もしくは非存
在下において１０ｎＭ濃度の環境エストロゲンと共に５
日間培養した。環境エストロゲンの個々の増殖効果は、
フラボノイド類と組み合わせた効果と比較した。この実
験における初期の結果で、ダイセインおよびゲニステイ
ンは、１０ｎＭの濃度で増殖促進活性を示したので、こ
れらのフラボノイド類が環境エストロゲンによって刺激
されたＭＣＦ−７細胞増殖を阻止することができるかど
うかを調べた。フラボノイド類１０ｎＭを１７ＥＳ、Ｔ
ａＭおよびＣｌｏ（それぞれ１μＭ）と組み合わせた場
合、ＭＣＦ−７細胞の増殖を阻止した。それらのうち、
ＴａＭおよびＣｌｏは、その環境エストロゲン誘導増殖
活性を基準レベルにまで阻止することができた。１１μ
ＭＭｅｓとの組み合わせでは、これらのフラボノイド類
はほとんど効果を示さなかった。さらにフラボノイド類
によるＭＣＦ−７の工業用化学品誘導増殖阻止を調べる
ために、１μＭ濃度の工業用化学品を１０ｎＭ濃度のフ
ラボノイド類と組み合わせて処理した。１０ｎＭ濃度の
フラボノイド類をＢｉｓＡ、ＯＰおよびＢｉＰ（それぞ
れ１μＭ）と組み合わせた場合、フラボノイド類はこれ
らの化学品で刺激されたＭＣＦ−７細胞に対して強力な
阻害活性を示した。他方、ＢｉｓＡと組み合わせたルテ
オリンはほとんど活性を示さなかった。その上、１０ｎ
Ｍ濃度のフラボノイド類を１μＭ濃度のＮＰと組み合わ
せた場合、フラボノイド類は増殖促進に対して弱い阻止
活性を示した。しかしながら、フラボノイド類の阻止レ
ベルはホルモンフリ−のコントロ−ル細胞よりも高かっ
た。
−７細胞に対する環境エストロゲン促進増殖の阻害 ダイセイン、ゲニステイン、ケルセチンおよびルテオリ
ンなどのフラボノイド類によるＭＣＦ−７細胞に対する
環境エストロゲン促進増殖の阻害を調べるために、細胞
を１０ｎＭ濃度のフラボノイド類の存在下もしくは非存
在下において１０ｎＭ濃度の環境エストロゲンと共に５
日間培養した。環境エストロゲンの個々の増殖効果は、
フラボノイド類と組み合わせた効果と比較した。この実
験における初期の結果で、ダイセインおよびゲニステイ
ンは、１０ｎＭの濃度で増殖促進活性を示したので、こ
れらのフラボノイド類が環境エストロゲンによって刺激
されたＭＣＦ−７細胞増殖を阻止することができるかど
うかを調べた。フラボノイド類１０ｎＭを１７ＥＳ、Ｔ
ａＭおよびＣｌｏ（それぞれ１μＭ）と組み合わせた場
合、ＭＣＦ−７細胞の増殖を阻止した。それらのうち、
ＴａＭおよびＣｌｏは、その環境エストロゲン誘導増殖
活性を基準レベルにまで阻止することができた。１１μ
ＭＭｅｓとの組み合わせでは、これらのフラボノイド類
はほとんど効果を示さなかった。さらにフラボノイド類
によるＭＣＦ−７の工業用化学品誘導増殖阻止を調べる
ために、１μＭ濃度の工業用化学品を１０ｎＭ濃度のフ
ラボノイド類と組み合わせて処理した。１０ｎＭ濃度の
フラボノイド類をＢｉｓＡ、ＯＰおよびＢｉＰ（それぞ
れ１μＭ）と組み合わせた場合、フラボノイド類はこれ
らの化学品で刺激されたＭＣＦ−７細胞に対して強力な
阻害活性を示した。他方、ＢｉｓＡと組み合わせたルテ
オリンはほとんど活性を示さなかった。その上、１０ｎ
Ｍ濃度のフラボノイド類を１μＭ濃度のＮＰと組み合わ
せた場合、フラボノイド類は増殖促進に対して弱い阻止
活性を示した。しかしながら、フラボノイド類の阻止レ
ベルはホルモンフリ−のコントロ−ル細胞よりも高かっ
た。
【００３６】
【発明の効果】環境エストロゲンなどの環境ホルモンが
野生動物および人間において内分泌系ならびに生殖機能
を損なうことは乳がんの発生と関連して幅広く報告され
ている。環境エストロゲンのこれらの作用は、次のよう
な原因に基づくものと考えられている。つまり、（１）
エストロゲンやアンドロ−ゲンなどの内生ホルモンの作
用と類似していること、（２）通常の内生ホルモンの作
用に拮抗していること、（３）天然ホルモンの合成なら
びに代謝パタ−ンを変化させること、（４）ホルモンレ
セプタ−レベルを修飾することなどが挙げられる。内分
泌系の破壊については、多くの種類の環境エストロゲン
のエストロゲン活性について研究されている。各種環境
ホルモンが17β-エストラジオ−ルとヒトエストロゲン
β受容体の結合を50%阻害する濃度（IC50）を求めるこ
とにより，環境ホルモンのエストロゲン受容体との結合
能を比較検討した。また，ヒト乳癌由来MCF-7細胞を用
いてエストロゲン活性の評価を行った。その結果，大豆
イソフラボンであるダイゼインは10-8 Ｍ前後で最高の
エストロゲン活性を示し，17β-エストラジオ−ルとエ
ストロゲン受容体の結合を50%阻害する濃度（IC50）は1
0-7 Ｍ前後であることが明らかとなった。一方，ゲニス
テインは10-8 Ｍでも強い活性を示すが最高のエストロ
ゲン活性は10-6 Ｍで得られ，そのIC50は5 x 10-8 Ｍで
あった。その他の環境ホルモンでは，エストロゲン活性
を示す最高濃度とIC50濃度との間にほぼ正の相関が認め
られたが，若干の例外も認められた。また，ダイゼイ
ン，ゲニステインあるいはルテオリンの添加により、4-
ノニルフェノ−ル、4-tert-オクチルフェノ−ル、4-ジ
ヒドロキシビフェノ−ルおよびビスフェノ−ルAのMCF-7
細胞増殖促進活性の発現が完全に抑制されるだけでな
く、細胞増殖がかえって抑制されることが明らかとなっ
た．これらの結果は環境ホルモン活性を有する化合物に
おいてはその複合作用の解明が重要な意味を有すること
を示唆している。
野生動物および人間において内分泌系ならびに生殖機能
を損なうことは乳がんの発生と関連して幅広く報告され
ている。環境エストロゲンのこれらの作用は、次のよう
な原因に基づくものと考えられている。つまり、（１）
エストロゲンやアンドロ−ゲンなどの内生ホルモンの作
用と類似していること、（２）通常の内生ホルモンの作
用に拮抗していること、（３）天然ホルモンの合成なら
びに代謝パタ−ンを変化させること、（４）ホルモンレ
セプタ−レベルを修飾することなどが挙げられる。内分
泌系の破壊については、多くの種類の環境エストロゲン
のエストロゲン活性について研究されている。各種環境
ホルモンが17β-エストラジオ−ルとヒトエストロゲン
β受容体の結合を50%阻害する濃度（IC50）を求めるこ
とにより，環境ホルモンのエストロゲン受容体との結合
能を比較検討した。また，ヒト乳癌由来MCF-7細胞を用
いてエストロゲン活性の評価を行った。その結果，大豆
イソフラボンであるダイゼインは10-8 Ｍ前後で最高の
エストロゲン活性を示し，17β-エストラジオ−ルとエ
ストロゲン受容体の結合を50%阻害する濃度（IC50）は1
0-7 Ｍ前後であることが明らかとなった。一方，ゲニス
テインは10-8 Ｍでも強い活性を示すが最高のエストロ
ゲン活性は10-6 Ｍで得られ，そのIC50は5 x 10-8 Ｍで
あった。その他の環境ホルモンでは，エストロゲン活性
を示す最高濃度とIC50濃度との間にほぼ正の相関が認め
られたが，若干の例外も認められた。また，ダイゼイ
ン，ゲニステインあるいはルテオリンの添加により、4-
ノニルフェノ−ル、4-tert-オクチルフェノ−ル、4-ジ
ヒドロキシビフェノ−ルおよびビスフェノ−ルAのMCF-7
細胞増殖促進活性の発現が完全に抑制されるだけでな
く、細胞増殖がかえって抑制されることが明らかとなっ
た．これらの結果は環境ホルモン活性を有する化合物に
おいてはその複合作用の解明が重要な意味を有すること
を示唆している。
【００３７】この発明において、ＭＣＦ−７細胞に対す
る増殖調節作用として数種類の環境エストロゲンの発情
原性を評価した。そのうち、ダイセイン、ゲニステイ
ン、ケルセチンおよびルテオリンは、大豆や植物食品の
主要なフラボノイド類である。これらの化合物は歴史的
に受精能力を増進したり、減退させたりするために使用
されてきた。したがって、これらの化合物がエストロゲ
ン性を有することは何ら驚くことではない。また、これ
らの化合物はラットや人において抗エストロゲン性を有
している。抗エストロゲン性および抗酸化活性は抗発が
ん性であるいわれている。またゲニステインはチロシン
キナ−ゼを阻害し、インビトロでの血管形成を阻止し、
またこれらの作用は抗発がん性の機能でもあると提案さ
れている。各化合物の薬剤依存性作用の研究は、ＭＣＦ
−７細胞の増殖を促進するために必要な最少濃度を決定
するために行われている。この実験において、エストロ
ゲン性拮抗作用を有するダイゼインやゲニステインなど
のフラボノイド類は、１０ｎＭ濃度でＭＣＦ−７細胞の
増殖を促進することができることが判明した。これに対
して、エストロゲン拮抗作用を有するケルセチンやルテ
ノ−ルは試験したすべての濃度で増殖阻害活性を示し
た。
る増殖調節作用として数種類の環境エストロゲンの発情
原性を評価した。そのうち、ダイセイン、ゲニステイ
ン、ケルセチンおよびルテオリンは、大豆や植物食品の
主要なフラボノイド類である。これらの化合物は歴史的
に受精能力を増進したり、減退させたりするために使用
されてきた。したがって、これらの化合物がエストロゲ
ン性を有することは何ら驚くことではない。また、これ
らの化合物はラットや人において抗エストロゲン性を有
している。抗エストロゲン性および抗酸化活性は抗発が
ん性であるいわれている。またゲニステインはチロシン
キナ−ゼを阻害し、インビトロでの血管形成を阻止し、
またこれらの作用は抗発がん性の機能でもあると提案さ
れている。各化合物の薬剤依存性作用の研究は、ＭＣＦ
−７細胞の増殖を促進するために必要な最少濃度を決定
するために行われている。この実験において、エストロ
ゲン性拮抗作用を有するダイゼインやゲニステインなど
のフラボノイド類は、１０ｎＭ濃度でＭＣＦ−７細胞の
増殖を促進することができることが判明した。これに対
して、エストロゲン拮抗作用を有するケルセチンやルテ
ノ−ルは試験したすべての濃度で増殖阻害活性を示し
た。
【００３８】非ステロイド系エストロゲン拮抗剤や、Ｔ
ａｍやＣｌｏなどの医薬化学品は、エストロゲン標的組
織において様々な作用を有していると報告されている。
これらの化学薬品は一般的には抗エストロゲンといわれ
ているけれども、ラットや人においてはエストロゲンア
ゴニストとアンタゴニストとの両方の性質を有してい
る。これと対照して、抗エストロゲンは、マウスにおい
てはエストロゲンアゴニストとして、鶏においてはエス
トロゲンアンタゴニストとして、主に作用するものと思
われる。これらの様々な作用にもかかわらず、Ｔａｍは
乳がん患者の管理に有効であることが証明されている。
この実験では、ＴａｍやＣｌｏが１０ｎＭないし１μＭ
範囲の濃度において強力な増殖阻害活性を示した。他
方、Ｍｅｓなどの医薬化学品は、１ｎＭまたは１０ｎＭ
濃度で増殖促進活性を示した。また１７ＥＳは１０ｎＭ
ないし１μＭ範囲の濃度で増殖促進活性を示した。
ａｍやＣｌｏなどの医薬化学品は、エストロゲン標的組
織において様々な作用を有していると報告されている。
これらの化学薬品は一般的には抗エストロゲンといわれ
ているけれども、ラットや人においてはエストロゲンア
ゴニストとアンタゴニストとの両方の性質を有してい
る。これと対照して、抗エストロゲンは、マウスにおい
てはエストロゲンアゴニストとして、鶏においてはエス
トロゲンアンタゴニストとして、主に作用するものと思
われる。これらの様々な作用にもかかわらず、Ｔａｍは
乳がん患者の管理に有効であることが証明されている。
この実験では、ＴａｍやＣｌｏが１０ｎＭないし１μＭ
範囲の濃度において強力な増殖阻害活性を示した。他
方、Ｍｅｓなどの医薬化学品は、１ｎＭまたは１０ｎＭ
濃度で増殖促進活性を示した。また１７ＥＳは１０ｎＭ
ないし１μＭ範囲の濃度で増殖促進活性を示した。
【００３９】さらに、この発明において、１０ｎＭ濃度
のフラボノイド類は、環境エストロゲンで促進されたＭ
ＣＦ−７細胞の増殖を阻害することができた。いくつか
の免疫学的研究において、乳がんまたは前立腺がんの危
険性と、大豆食物の摂取もしくは植物エストロゲンの尿
排泄との間には逆の関係があるとの示唆もある。また、
植物エストロゲンは、強力な抗エストロゲン作用があ
り、それによってホルモン関連がんの発生を阻止してい
ることが示唆されている。この研究では、フラボノイド
類は、ＭＣＦ−７細胞においてエストロゲン活性と、抗
エストロゲン活性とを有していることが示されたけれど
も、この研究に使用した大豆食物中のフラボノイド類を
含むその他のフラボノイド類はすべてエストロゲン活性
だけを有していた。フラボノイド類の提案された化学予
防作用に対するその他のいくつかの機構としては、がん
細胞分化の誘導、タンパクチロシンキナ−ゼの阻害、血
管形成の抑制、直接的抗酸化作用などが挙げられる。
のフラボノイド類は、環境エストロゲンで促進されたＭ
ＣＦ−７細胞の増殖を阻害することができた。いくつか
の免疫学的研究において、乳がんまたは前立腺がんの危
険性と、大豆食物の摂取もしくは植物エストロゲンの尿
排泄との間には逆の関係があるとの示唆もある。また、
植物エストロゲンは、強力な抗エストロゲン作用があ
り、それによってホルモン関連がんの発生を阻止してい
ることが示唆されている。この研究では、フラボノイド
類は、ＭＣＦ−７細胞においてエストロゲン活性と、抗
エストロゲン活性とを有していることが示されたけれど
も、この研究に使用した大豆食物中のフラボノイド類を
含むその他のフラボノイド類はすべてエストロゲン活性
だけを有していた。フラボノイド類の提案された化学予
防作用に対するその他のいくつかの機構としては、がん
細胞分化の誘導、タンパクチロシンキナ−ゼの阻害、血
管形成の抑制、直接的抗酸化作用などが挙げられる。
【図１】ＭＣＦ−７細胞増殖に対するフラボノイド類の
時間依存的効果。
時間依存的効果。
【図２】ＭＣＦ−７細胞増殖に対する医薬化学品の時間
依存的効果。
依存的効果。
【図３】ＭＣＦ−７細胞増殖に対する工業化学品の時間
依存的効果。
依存的効果。
【図４】ＭＣＦ−７細胞増殖に対するフラボノイド類と
医薬化学品との併合による効果。
医薬化学品との併合による効果。
【図５】ＭＣＦ−７細胞増殖に対するフラボノイド類と
工業化学品との併合による効果。
工業化学品との併合による効果。
Claims (10)
- 【請求項１】 一般式[I]： 【化１】 (式中、Ｒは、水素原子またはヒドロキシ基を意味し、
いずれの置換基も複数個存在していてもよい、 Ｒ１およびＲ２は、いずれも水素原子、ヒドロキシ基、
低級アルキル基、低級アルコキシ基または置換基を有し
ていてもよいフェニル基を意味し、Ｒ１とＲ２とのいず
れかは置換基を有していてもよいフェニル基を意味し、
Ｒ１とＲ２とがいずれも置換基を有していてもよいフェ
ニル基を意味することはない)で表されるフラボノイド
を使用してエストロゲン活性発現を抑制することを特徴
とするフラボノイドのエストロゲン活性発現抑制方法。 - 【請求項２】 上記一般式[I]で表されるフラボノイド
が、一般式[I]において、Ｒは水素原子またはヒドロキ
シ基を意味し、Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ基、低級ア
ルキル基または低級アルコキシ基を意味し、Ｒ２は置換
基を有していてもよいフェニル基を意味する）で表され
るイソフラボン類[II]であることを特徴とする請求項１
に記載するフラボノイドのエストロゲン活性発現抑制方
法。 - 【請求項３】 上記一般式[I]で表されるフラボノイド
が、一般式[I]において、Ｒは水素原子またはヒドロキ
シ基を意味し、Ｒ１は置換基を有していてもよいフェニ
ル基を意味し、Ｒ２は水素原子、ヒドロキシ基、低級ア
ルキル基または低級アルコキシ基を意味する）で表され
るフラボン類[III]であることを特徴とする請求項１に
記載するフラボノイドのエストロゲン活性発現抑制方
法。 - 【請求項４】 上記イソフラボン類[II]がダイゼインま
たはゲニステインであることを特徴とする請求項１また
は２に記載するフラボノイドのエストロゲン活性発現抑
制方法。 - 【請求項５】 上記フラボン類[III]がフラボン、ルテ
オリンまたはケルセチンであることを特徴とする請求項
１または３に記載するフラボノイドのエストロゲン活性
発現抑制方法。 - 【請求項６】 一般式[I]： 【化２】 （式中、Ｒは、水素原子またはヒドロキシ基を意味し、
いずれの置換基も複数個存在していてもよい、 Ｒ１およびＲ２は、いずれも水素原子、ヒドロキシ基、
低級アルキル基、低級アルコキシ基または置換基を有し
ていてもよいフェニル基を意味し、Ｒ１とＲ２とのいず
れかは置換基を有していてもよいフェニル基を意味し、
Ｒ１とＲ２とがいずれも置換基を有していてもよいフェ
ニル基を意味することはない)で表されるフラボノイド
をエストロゲン活性発現を抑制するために使用すること
を特徴とするフラボノイドのエストロゲン活性発現抑制
用組成物。 - 【請求項７】 上記一般式[I]で表されるフラボノイド
が、一般式[I]において、Ｒは水素原子またはヒドロキ
シ基を意味し、Ｒ１は、水素原子、ヒドロキシ基、低級
アルキル基または低級アルコキシ基を意味し、Ｒ２は置
換基を有していてもよいフェニル基を意味する）で表さ
れるイソフラボン類[II]であることを特徴とする請求項
６に記載するフラボノイドのエストロゲン活性発現抑制
用組成物。 - 【請求項８】 上記一般式[I]で表されるフラボノイド
が、一般式[I]において、Ｒは水素原子またはヒドロキ
シ基を意味し、Ｒ１は置換基を有していてもよいフェニ
ル基を意味し、Ｒ２は水素原子、ヒドロキシ基、低級ア
ルキル基または低級アルコキシ基を意味する）で表され
るフラボン類[III]であることを特徴とする請求項６に
記載するフラボノイドのエストロゲン活性発現抑制用組
成物。 - 【請求項９】 上記一般式[II]で表されるイソフラボン
類がダイゼインまたはゲニステインであることを特徴と
する請求項６または７に記載するフラボノイドのエスト
ロゲン活性発現抑制用組成物。 - 【請求項１０】 上記一般式[III]で表されるフラボン
類がフラボン、ルテオリンまたはケルセチンであること
を特徴とする請求項６または８に記載するフラボノイド
のエストロゲン活性発現抑制用組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001186118A JP2003002830A (ja) | 2001-06-20 | 2001-06-20 | フラボノイドのエストロゲン活性発現抑制方法およびエストロゲン活性発現抑制用組成物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001186118A JP2003002830A (ja) | 2001-06-20 | 2001-06-20 | フラボノイドのエストロゲン活性発現抑制方法およびエストロゲン活性発現抑制用組成物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003002830A true JP2003002830A (ja) | 2003-01-08 |
Family
ID=19025595
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001186118A Pending JP2003002830A (ja) | 2001-06-20 | 2001-06-20 | フラボノイドのエストロゲン活性発現抑制方法およびエストロゲン活性発現抑制用組成物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003002830A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004345982A (ja) * | 2003-05-20 | 2004-12-09 | Maruzen Pharmaceut Co Ltd | 抗アレルギー剤、抗老化剤及び抗老化用皮膚外用剤 |
| JP2005220100A (ja) * | 2004-02-06 | 2005-08-18 | Maruzen Pharmaceut Co Ltd | 抗老化剤、血小板凝集抑制剤、抗酸化剤、抗アレルギー剤、皮膚化粧料及び飲食品 |
| WO2006112330A1 (ja) * | 2005-04-15 | 2006-10-26 | Genomembrane Co., Ltd. | エストロン３硫酸トランスポーター活性阻害剤 |
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2001
- 2001-06-20 JP JP2001186118A patent/JP2003002830A/ja active Pending
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|---|---|---|---|---|
| JP2004345982A (ja) * | 2003-05-20 | 2004-12-09 | Maruzen Pharmaceut Co Ltd | 抗アレルギー剤、抗老化剤及び抗老化用皮膚外用剤 |
| JP4703948B2 (ja) * | 2003-05-20 | 2011-06-15 | 丸善製薬株式会社 | 抗アレルギー剤、抗老化剤及び抗老化用皮膚外用剤 |
| JP2005220100A (ja) * | 2004-02-06 | 2005-08-18 | Maruzen Pharmaceut Co Ltd | 抗老化剤、血小板凝集抑制剤、抗酸化剤、抗アレルギー剤、皮膚化粧料及び飲食品 |
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