JP2002543825A - 造血細胞内分子相互作用 - Google Patents

造血細胞内分子相互作用

Info

Publication number
JP2002543825A
JP2002543825A JP2000618312A JP2000618312A JP2002543825A JP 2002543825 A JP2002543825 A JP 2002543825A JP 2000618312 A JP2000618312 A JP 2000618312A JP 2000618312 A JP2000618312 A JP 2000618312A JP 2002543825 A JP2002543825 A JP 2002543825A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
protein
pdz
cells
peptide
binding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2000618312A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2002543825A5 (ja
Inventor
エス． ルー，ピーター
Original Assignee
アーバー ビータ コーポレイション
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by アーバー ビータ コーポレイション filed Critical アーバー ビータ コーポレイション
Publication of JP2002543825A publication Critical patent/JP2002543825A/ja
Publication of JP2002543825A5 publication Critical patent/JP2002543825A5/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Abstract

(57)【要約】 本発明は、免疫応答の仲介に関係する造血細胞その他の細胞内でのタンパク質間の相互作用を阻害又は高めるための試薬及び方法を提供する。上記提供させる試薬及び方法は、免疫系細胞により仲介されるさまざまな免疫及び症状の治療のために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 関連出願の参照 本出願は米国特許出願第60/196,460号、第60/196,528号及び第60/196,527号（
全て2000年４月11日提出）、出願第 号（2000年、４月11日提出）（代理人事
件整理番号20054-000300）；出願第09/547,276号（2000年、４月11日提出）；出
願第60/182,296号（2000年２月14日提出）；出願第60/176,195号（2000年１月14
日提出）；出願第60/170,153号（1999年12月13日提出）；出願第60/162,498号（
1999年10月29日提出）；出願第60/160,860（1999年10月21日提出）；及び出願第
60/134,118号；第60/134,117号及び第60/134,114号（全て1999年５月14日出願）
；各開示はその全体がここに取り込まれている。 １．発明の分野 本発明はペプチド及びペプチド類似体、ならびに造血系細胞の活性を制御する
ためのそれら組成体の利用に適した方法に関する。一面において本発明はPDZド
メイン含有蛋白質とPDZドメインに結合する蛋白質間の相互作用を拮抗すること
で造血細胞の代謝を変調する（例えば活性化）方法を提供する。一面において本
発明は造血細胞により発現される表面受容体のカルボキシル末端に対応するアミ
ノ酸配列及び膜貫通トランスポーター配列を含む融合蛋白質に関する；この様な
融合ペプチドは細胞活性化を阻害することによる造血細胞の制御に有用である。
２．発明の背景 蛋白質のPDZドメインは３種類の原型蛋白質：PSD95、ショウジョウバエ大ディ
スク蛋白質及びZonula Occludin I蛋白質（Gopmertsら、1996、Cell 84: 659-66
2)と命名されている。PDZドメイン含有蛋白質は細胞内相互作用を通じ、膜貫通
神経伝達受容体を組織化することでシナプス形成に関係している。PDZドメイン
はサイン配列GLGFを含む。神経系では典型的PDZドメイン含有蛋白質は３カ所のP
DZドメイン、１カ所のSH3ドメイン及び１カ所のグアニレートキナーゼドメイン
を含む。細胞内PDZドメイン含有蛋白質の例にはシナプスに於けるLIN-2、LIN-7
及びLIN-10、及び後シナプスに於けるPSD95が含まれる。
【０００２】 PDZドメインは神経細胞の膜貫通蛋白質のカルボキシル末端に結合することが
示されている。SongyangらはPDZドメインに結合できる蛋白質はE-S/T-X-V/Iのカ
ルボキシル末端モチーフを含むとを報告した（Songyangら、1997、Science275:7
3）。X-線結晶学研究はモチーフ配列及びPDZドメイン間の接触点を明らかにした
（Doyleら、1996、Cell 88:1067-1076)。神経単位内のPDZドメイン及びイオンチ
ャンネル間の相互作用は詳しく研究されているのに対し、その他生物学的システ
ム、特に造血系でのこれら相互作用に関する研究は限定的である。
【０００３】 造血系は様々な機能を持つ各種細胞から構成されている。その多様な機能の多
くは、イオンチャンネルを含む細胞表面受容体、細胞-細胞相互作用を統合する
ための接着表面分子及びサイトカイン受容体の統合的な運動を必要とする。それ
らの持つ多様な機能的活性にも関わらず、全ての造血細胞は多分化能型骨髄造血
幹細胞から発生すると信じられている。分化する間に、幹細胞は複数の特異的造
血細胞系統それぞれの始原細胞を生ずる。その後始原細胞は一連の形態学的及び
機能的変化を受け、成熟した機能的委任造血細胞を生ずる。
【０００４】 造血細胞により遂行される機能の中、免疫には特定の細胞型のみが関与してい
る。例えばT細胞、B細胞及びナチュラルキラー（NK)細胞を含むリンパ球は免疫
反応のエフェクターである。単球及び顆粒球（即ち好中球、好塩基球及び好酸球
）は非特異的防御に役割を持っている。リンパ球、単球及び顆粒球は白血球と総
称される。一方、その他造血細胞は免疫系とは無関係な機能を果たす。例えば赤
血球はガス輸送に関与しており、血小板は血液凝固に関係している。
【０００５】 T細胞及びB細胞は抗原を認識し、免疫応答を生起する。T細胞はT細胞受容体（
TCR)と呼ばれるヘテロダイマー型表面受容体により抗原を認識する。TCRはCD3複
合体と総称される一連のポリペプチドと結合する。B細胞は分泌性分子でもある
表面免疫グロブリン（Ig)により抗原を認識する。更に、大数の共刺激性表面受
容体がT細胞及びB細胞に同定されており、これらは抗原誘導活性化に於いて細胞
活性化を増大させる。
【０００６】 T細胞抗原受容体/CD3複合体（TCR/CD3)に加え、T細胞により発現され、活性化
シグナルと伝達するその他分子にはCD2、CD4、CD5、CD6、CD8、CD18、CD27、CD2
8、CD43、CD45、CD152（CTLA-4)、CD154、MHCクラスI、MHCクラスII、CDw137（4
-1BB)、CDw150等が含まれる（Barelayら、The Leucocyte Antigen Facts Book,
1997, 第二版, Academic Press; Leucocyte Typing, 1984, Bernardら、(編集）
, Springer-Verlag; Leukocyte Typing II, 1986, Reinherzら、（編集）, Spri
nger-Verlag; Leukocyte Typing III, 1987, McMichael （編集）, Oxford Univ
ersity Press; Leukocyte Typing IV, 1989, Knappら（編集）, Oxford Univers
ity Press; CD Antigens, 1996, VI Internat. Workshop and Conference on Hu
man Leukocyte Differentiation Antigens, http://www.ncbi.nih.gov/prow)が
、これらに限定されない。TCR/CD3と共に働く細胞表面抗原は当分野ではしばし
ば共受容体と呼ばれる。
【０００７】 上記T細胞表面抗原の全てに対し特異抗体が作製されている。上記T細胞表面受
容体に結合するその他分子には、可変域の様な抗原結合抗体誘導体、ペプチド、
スーパー抗原、及びCD2に対するCD58、CD4に対するHIVgp、CD27に対するCD27L、
CD28又はCD152に対するCD80又はCD86、CD11a/CD18に対するICM1、ICAM2及びICAM
3、CDw137に対する4-1BBLの様なそれらの天然リガンドが含まれる。
【０００８】 B細胞により発現される活性化分子には表面Ig、CD18、CD19、CD20、CD21、CD2
2、CD23、CD40、CD45、CD80、CD86及びICAM1が含まれるが、これらに限定されな
い。同様にこれら分子の天然リガンド及びそれらに対する抗体及び抗体誘導体も
B細胞への活性シグナル付与に利用できるだろう。
【０００９】 しかし、本発明の以前には白血球受容体刺激後のシグナル伝達がPDZドメイン
含有蛋白質との受容体相互作用により伝達されることは知られていなかった。従
って、白血球受容体/PDZドメイン相互作用の干渉が白血球活性化を制御できるこ
とは、当分野では予想すらされていなかった。 ３．発明の要約 一面においては、本発明は細胞、例えば内皮細胞又は造血細胞（例えばT細胞
又はB相棒の様な白血球）内に、これら細胞内のPDZ蛋白質及びPL蛋白質の結合を
阻害するアンタゴニスト又は細胞内のPDZ蛋白質及びPL蛋白質の結合を促進する
アゴニストを導入することによりこれら細胞の生物学的機能を変調する方法を提
供する。各種実施態様ではPL蛋白質は接着蛋白質、アダプター蛋白質又は細胞内
蛋白質である。実施態様ではそれはCD6、CD49E、CD49F、CD138、Clasp-1、Clasp
-4、VCAM1、Clasp-2、CD95、DNAM-1、CD83、CD44、CD4、CD97、CD3n、DOCK2、CD
34、FceRIb又はFasリガンドである。ある実施態様では、PL蛋白質はX-S-X-A、X-
A-D/E-V、X-V/I/L-X*-V又はX-S/T-X-F（ここでのXは何れかのアミノ酸を、X*は
いずれかの非芳香族アミノ酸である）であるカルボキシ末端アミノ酸モチーフを
特徴とする。実施態様では、PL蛋白質はTリンパ細胞又はＢリンパ細胞により発
現される。本発明の幾つかの実施態様ではPDZ蛋白質はCASK、MPP1、DLG1、PSD95
、NeDLG、SYN1a、TAX43、LDP、LIM、LIMK、AF6、PTN-4、prIL16、41.8、RGS12、
DVL1、TAX40、TIAM1、MINT1、K303、TAX2又はKIAA561である。
【００１０】 幾つかの実施態様では、細胞は白血球であり生物学的機能は細胞活性化、細胞
増殖、細胞構造の維持、細胞代謝活性、又はサイトカイン産生である。いくつか
の実施態様では、方法はさらに白血球活性化の変化を検出することも含む。
【００１１】 好適実施態様ではアゴニストは“A”アッセイ中、“G”アッセイ中又はAアッ
セイ及びGアッセイ両方に於けるPDZドメインポリペプチドへのPLペプチドの結合
を阻害する作用物質である。アゴニストはPL蛋白質のカルボキシ末端２残基と同
一である少なくとも２残基をカルボキシ末端に持つポリペプチドの様なポリペプ
チドであり、前記PL蛋白質は造血又は内皮細胞内に発現される接着他泊質、アダ
プター蛋白質又は細胞内蛋白質である。実施態様の一つでは少なくともポリペプ
チドのカルボキシ末端４残基はPL蛋白質のカルボキシ末端４残基に同一である。
実施態様の一つでは、PL蛋白質はX-S-X-A、X-A-D/E-V、X-V/I/L-X*-V又はX-S/T-
X-Fから選択されるカルボキシ末端アミノ酸モチーフにあって、前記Xがいずれか
のアミノ酸でありX*がいずれかの非芳香族アミノ酸であるモチーフを有する。実
施態様ではPL蛋白質はCD6、CD49E、CD49F、CD138、Clasp-1、Clasp-4、VCAM1、C
lasp-2、CD95、DNAM-1、CD83、CD44、CD97、CD3n、DOCK2、CD34、FceRIb又はFas
リガンドである。
【００１２】 関連面の一つでは、アンタゴニストはPL阻害剤配列ペプチドの模擬ペプチドで
ある。別の関連面では、アンタゴニストPL配列及び膜貫通トランスポーターアミ
ノ酸配列（HIV tat、ショウジョウバエ触覚肢、単純ヘルペスウイルスVP22また
は高DNA CDR2及び3の様な）を有する融合ポリペプチドである。
【００１３】 別の面では発明は、PDZ蛋白質由来の配列を有するPDZドメインポリペプチドを
PLペプチドとそれらが複合体を形成する条件下に、試験化合物有り無しにて接触
せしめること、及び試験化合物有無に於ける複合体形成を検出することで試験化
合物がPDZ蛋白質とPL蛋白質間の結合の阻害剤であるかを決定する方法にあって
、試験化合物非存在下に比べ試験化合物存在下での複合体形成が少ないことが試
験化合物がPDZ蛋白質-PL蛋白質結合の阻害剤であることを示す方法を提供する。
PLペプチドはCD6、CD49E、CD49F、CD138、Clasp-1、Clasp-4、VCAM1、Clasp-2、
CD95、DNAM-1、CD83、CD44、CD97、CD3n、DOCK2、CD34、FceRIb又はFasリガンド
の様なPL蛋白質のC-末端配列を含む配列を有している。幾つかの実施態様では、
PDZドメインポリペプチドは融合ポリペプチドである。
【００１４】 関連する面では、発明はPDZドメインポリペプチドをPLペプチドと、それらが
複合体を形成する条件下に試験化合物有り無しにて接触せしめること、及び試験
化合物の有り無しでの複合体形成を検出することで試験化合物がPDZ蛋白質及びP
L蛋白質間の結合のアゴニストであるか決定する方法にあって、試験化合物無し
の状態に比べ試験化合物有りの状態での複合体形成がより多いことが、試験化合
物がPDZ蛋白質-PL蛋白質結合のアゴニストであることを示す方法を提供する。
【００１５】 発明は更にPDZ蛋白質及びPL蛋白質の結合の阻害剤を提供する。実施態様の一
つでは、阻害剤はCD6、CD49E、CD49F、CD138、Clasp-1、Clasp-4、VCAM1、Clasp
-2、CD95、DNAM-1、CD83、CD44、CD97、CD3n、DOCK2、CD34、FceRIb及びFasリガ
ンドから成るグループから選択されるPLペプチド及びPDZドメインポリペプチド
から成るグループより選択されるペプチドの結合を低下することを特徴とする。
様々な実施態様で阻害剤はCD6、CD49E、CD49F、CD138、Clasp-1、Clasp-4、VCAM
1、Clasp-2、CD95、DNAM-1、CD83、CD44、CD97、CD3n、DOCK2、CD34、FceRIb又
はFasリガンドから選択されるPL蛋白質のC-末端配列の３ないし約20残基である
配列を含むペプチド；モチーフX-S-X-A、X-A-D/E-V、X-V/I/L-X*-V、又はX-S/T-
X-F（ここでのXはいずれかのアミノ酸であり、X*はいずれかの非芳香族アミノ酸
である）を含むペプチド；模擬ペプチド；又は小有機分子である。発明は更にこ
の阻害剤を含む医薬組成体も提供する。
【００１６】 発明はまたPL-PDZ相互作用阻害剤の治療有効量を投与することによる、白血球
活性化を特徴とする疾患の治療に関する方法も提供する。実施態様では、疾患は
炎症性又は液性免疫反応を特徴とするか、又は自己免疫疾患である。発明は更に
PDZ蛋白質及びPL蛋白質の結合を阻害する作用物質を投与することによる被験体
内の炎症を減じる方法にあって、前記ＰＬ蛋白質が接着蛋白質、アダプター蛋白
質、又は細胞内蛋白質である方法を提供する。
【００１７】 発明はまた白血球活性化を阻害し、又は炎症性あるいは体液性免疫反応を特徴
とする造血細胞介在疾患を治療することを目的とした、PDZ蛋白質及びPL蛋白質
結合の阻害剤の利用を提供する。発明はまた造血細胞介在疾患の治療に適した医
薬品調整へのPDZ蛋白質とPL蛋白質結合の阻害剤の利用も提供する。
【００１８】 発明はさらに、表２に示す如くに細胞内のPDZ蛋白質とPL蛋白質の結合を阻害
するアンタゴニストを細胞内に導入することを含む造血細胞の生物学的機能を変
調する方法にあって、前記PL蛋白質がDNAM-1でありPDZ蛋白質がMPP1、MPP2、DLG
1、NcDLG、PSD95、LIM、AF6、41.8又はRGS12であるもの、PL蛋白質がLPAPであり
PDZ蛋白質がDLG1又はMINT1であるもの、又はPL蛋白質がDNAM-1でありPDZ蛋白質
がPSD95又はMPP2である方法も提供する。
【００１９】 本発明はまた造血細胞のPDZドメインに結合するペプチド及びペプチド類似体
にも関する。具体的には、それは造血細胞表面受容体カルボキシル末端配列及び
標的細胞内へのペプチド浸入を促進する膜貫通トランスポート配列を含む融合ペ
プチド及びペプチド類似体に関する。発明はまたサイトカイン産生、細胞増殖、
アポトーシス及び細胞毒性により測定される白血球活性化を阻害する組成体を仕
様する方法にも関する。
【００２０】 発明の目的の一つは、望ましくない白血球介在事象を阻害することを目的とし
、被検体に医薬組成体として上記融合ペプチド又はペプチド類似体の治療有効量
を投与することである。
【００２１】 自己免疫疾患の治療または固形臓器移植の移植拒絶を防止することを目的とし
、被検体に上記融合ペプチド又はペプチド類似体の治療有効量を投与することも
発明の目的の一つである。表 表１ アミノ酸分類 表２ 蛋白質-リガンドペア 表３ PDZドメイン 表3A 表３の注意事項 表４ PLペプチド 表５A及びB 例示PLモチーフ 定義 5.1 ここに用いる“融合蛋白質”又は“融合ポリペプチド”は複合蛋白質、
即ち通常は単一のアミノ酸配列に一つに融合していない２つ（またそれ以上の）
の別個の異種ポリペプチドから作られた単一の連続的アミノ酸配列を意味する。
即ち、融合蛋白質は２個の全く別個のアミノ酸配列または２個の類似あるいは同
一ポリペプチド配列を含む単一アミノ酸配列を含むことができ、これら配列は天
然に見いだされる単一アミノ酸配列中の同一配置中に一緒に見いだされることは
ない。融合蛋白質は一般に当分野で良く知られている組換え体核酸法、即ち組換
え体遺伝子融合産物の転写及び翻訳の結果として融合体が発明のポリペプチドを
コードする断片と異種蛋白質をコードする断片を含む方法、または化学合成法の
いずれかを使用し調整できる。
【００２２】 5.2 ここで用いる“融合蛋白質構築体”は、融合蛋白質をコードするポリヌ
クレオチドである。
【００２３】 5.3 ここで用いる用語“PDZドメイン”は、脳シナプス蛋白質PSD-95、ショウ
ジョウバエ隔壁結合蛋白質Discs-Large(DLG)及び上皮タイト結合蛋白質ZO1（ZO1
）に対する相同性を特徴とする約90アミノ酸の蛋白質配列（即ちモジュラー蛋白
質ドメイン）を表す。PDZドメインはDiscs-Large相同性リピート（“DHRs”）及
びGLGFリピートとしても知られる）。PDZドメインは一般にはコアコンセンサス
配列を維持すると思われている（Doyle、D.A.,1996, Cell 85; 1067-1076）。
【００２４】 PDZドメインはグアニレートキナーゼ相同体のMAGUKファミリーのメンバー、複
数の蛋白質フォスファターゼ及びキナーゼ、神経一酸化窒素合成酵素及びシント
ロフィンと総称される複数のジストロフィン付随蛋白質を含む、多様な膜関連蛋
白質に見いだされている。
【００２５】 例示的PDZドメイン含有蛋白質及びPDZドメイン配列は表３に示されている。用
語“PDZドメイン”はまた表３（例えば多形変異体、保存的置換を持つ変異体等
）の配列の変異体（例えば自然発生変異体）も包含する。典型的には、PDZドメ
インは表３に示すドメインと実質同一であり、例えば最大一致を得る様に配列し
比較した場合に少なくとも約70%、少なくとも約80%、又は少なくとも約90%のア
ミノ酸残基同一性を持つ。
【００２６】 5.4 ここで用いる場合、用語“PDZ蛋白質”はPDZドメインを含んでいる天然
発生蛋白質、例えばヒト蛋白質を表す。例示のPDZ蛋白質にはCASK、MPP1、DLG1,
PSD95、NcDLG、TAX33、SYN1a、TAX43、LDP、LIM、LIMK1、LIMK2、MPP2、NOS1、A
F6、PTN-4、prIL16、41.8kD、KIAA0559、RGS12、KIAA0316、DVL1、TAX40、TIAM1
、MINT1、KIAA0303、CBP、MINT3、TAX2、KIAA0561が含まれる。例示PDZ蛋白質は
ひょう２及び表３に一覧されている。
【００２７】 5.5 ここで用いる場合、用語“PDZ-ドメインポリペプチド”はPDZドメイン配
列、天然発生PDZドメイン又は単離PDZドメインペプチドを含む融合蛋白質の様な
PDZドメインを含んでいるポリペプチドを表す。
【００２８】 5.6 ここで用いる場合、“PL蛋白質”又は“PDZリガンド蛋白質”はPDZドメ
インと分子複合体を形成する天然発生蛋白質又は完全長蛋白質から分離して発現
された場合に（例えば4-25残基、例えば16残基ペプチド断片の様な）そのカルボ
キシ末端がそのような分子複合体を形成する蛋白質を表す。分子複合体はインビ
トロでは下記“Ａアッセイ”又は“Ｇアッセイ”を使用し、又はインビボにて観
察できる。表２掲載の例示PL蛋白質は、特異的PDZ蛋白質を結合することが示さ
れている。この定義は抗PDZ抗体等を包含することを意図しない。
【００２９】 5.7 ここで用いる“PL配列”はPL蛋白のC-末端アミノ酸配列（例えばC-末端
２、３、４、５、６，７，８，９、10、12、14、16、20又は25残基）（“C-末端
PL配列”）又はPDZドメインに結合することが既知である内部配列（“内部PL配
列”）を表す。
【００３０】 5.8 ここで用いる“PLペプチド”はPL蛋白質のC-末端の配列に由来する、ま
たは基づく配列を有するペプチドである。例示PLペプチド（ビオチン化）は表４
に掲載されている。
【００３１】 5.9 ここで用いる“PL融合蛋白質”は、融合蛋白質の１ドメインとして、典
型的にはC-末端ドメインとしてPL配列を有する融合蛋白質である。例示のPL融合
蛋白質はtat-PL配列融合体である。
【００３２】 5.10 ここで使用する場合、用語“PL阻害剤ペプチド配列”は、PDZドメイン
ポリペプチドとPLペプチド間の相互作用を阻害する（例えばAアッセイまたはGア
ッセイにて）PLペプチドのアミノ酸配列（ペプチド又はPL融合蛋白質の形をした
）を表す。
【００３３】 5.11 ここで用いる“PDZ-ドメインコーディング配列”は、PDZドメインをコ
ードしているポリヌクレオチドの断片を意味する。各種実施態様では、ポリヌク
レオチドはDNA、RNA、単鎖又は二本鎖である。
【００３４】 5.12 ここで使用する場合、用語“アンタゴニスト（拮抗剤）”及び“阻害剤
”は、結合相互作用（PDZドメイン配列のPL配列への結合の様な）を変調する流
れで使用される場合には互換的に使用され、例えばPL配列（例えばPLペプチド）
と例えばPDZドメイン（例えばPDZ蛋白質、PDZドメインペプチド）の結合を低下
する作用物質を表す。
【００３５】 5.13 ここで使用する場合、用語“アゴニスト”及び“エンハンサー”は、結
合相互作用（PDZドメイン配列のPL配列への結合の様な）を変調する流れで使用
される場合には互換的に使用され、例えばPL配列（例えばPLペプチド）と例えば
PDZドメイン（例えばPDZ蛋白質、PDZドメインペプチド）の結合を増加する作用
物質を表す。
【００３６】 5.14 ここで使用される場合、用語“模擬ペプチド、”“ペプチドミメティッ
ク、”及び“ペプチド類似体”は互換的に使用され、発明のPL阻害性またはPL結
合性ペプチドと本質的に同一である構造的及び／又は機能的特性を有する合成化
合物を表す。模擬体は合成の、非天然型アミノ酸類似体から全体が成るか、又は
一部天然ペプチドアミノ酸と一部アミノ酸の非天然類似体から成るキメラ分子の
いずれかである。模擬体はまた、それら置換体が模擬体の構造及び／又は阻害的
あるいは結合活性を実質変えない範囲の量にて天然アミノ酸の保存的置換を含む
こともできる。保存的変異体である発明のポリペプチドを使用する場合、通常の
実験が模擬体が発明の範囲内にあるか、即ちその構造及び／又は機能が実質変化
していないか決定するだろう。即ち、模擬組成体がPDZドメインに結合でき、及
び／又はPL-PDZ相互作用を阻害できれば、それは発明の範囲内である。
【００３７】 ペプチドミメティック組成体は典型的には３構造グループ：ａ）天然アミド結
合（“ペプチド結合”）連結以外の残基連結グループ；ｂ）天然発生アミノ酸残
基の代りの非天然残基；又はｃ）模擬的二次構造を誘導する、即ち二次構造、例
えばβターン、γターン、α螺旋立体構造等を誘導または安定化する残基、に由
来する非天然構造成分の組合せを含むことができる。
【００３８】 ポリペプチドはその残基の全て又は一部が天然のペプチド結合以外の化学的手
段により結合されている場合には、模擬体として特徴付けることができる。個々
のペプチドミメティック残基はペプチド結合、その他化学的結合又は例えばグル
タールアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、２官能型マレイミド
、N,N=-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）又はN,N=-ジイソプロピルカル
ボジイミド（DIC)の様なカップリング手段により結合させることができる。従来
のアミド結合（“ペプチド結合”）連結に替わることができる連結グループには
、例えばケトメチレン（例えば-C(=O）-NH-に替わり-C(=O)-CH2）、アミノメチ
レン（CH2-NH）、エチレン、オレフィン（CH=CH）、エーテル（CH2-O）、チオエ
ーテル（CH2-S）、テトラゾール（CH4-）、チアゾール、レトロアミド、チオア
ミド又はエステル（例えばChemistry and Biochemistry of Amino Acids, Pepti
des and Proteins, Vol.7, pp267-357, A Peptide Backbone Modifications, Ma
rcell Dekker, NY中のSpatola（1983）参照）が含まれる。
【００３９】 ポリペプチドはまた、天然発生アミノ酸残基に代わる全て、又は幾つかの非天
然残基を含むことにより模擬体として特徴付けることができる。非天然残基は科
学及び特許文献中によく記述されている：天然アミノ酸残基模擬体として有用で
ある幾つかの例示的非天然組成体及び指針が以下に記載されている。
【００４０】 芳香族アミノ酸の模擬体は例えばD-又はL-ナフチルアミン；D-又はL-フェニル
グリシン；D-又はL-2チエニルアラニン；D-又はL-1、-2、3-又は4-ピレニルアラ
ニン；D-又はL-3チエニルアラニン；D-又はL-（2-ピリジニル）-アラニン；D-又
はL-(3-ピリジニル）-アラニン；D-又はL-（2-ピラジニル）-アラニン；D-又はL
-（4-イソプロピル）-フェニルグリシン；D-（トリフルオロメチル）-フェニル
グリシン；D-（トリフルオロメチル）-フェニルアラニン；D-p-フルオロフェニ
ルアラニン；D-又はL-p-ビフェニルフェニルアラニン；D-（トリフルオロメチル
）-フェニルアラニン；D-p-フルオロフェニルアラニン；D-又はL-p-ビフェニル
フェニルアラニン；K-又はL-p-メトキシビフェニルフェニルアラニン；D-又はL-
2-インドール（アルキル）アラニン；及びD-又はL-アルキルアラニンにあって、
前記アルキルはメチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソ
プロピル、イソ-ブチル、sec-イソチル、イソ-ペンチル又は非酸性アミノ酸によ
り置換されても置換されなくとも良いものであるもので置換することで作ること
ができる。非天然アミノ酸の芳香環には例えばチアゾリル、チオフェニル、ピラ
ゾリル、ベンズイミダゾール、ナフチル、フラニル、ピロリル及びピリジル芳香
環が含まれる。
【００４１】 酸性アミノ酸模擬体は、例えば負電荷を維持している非カルボン酸塩アミノ酸
；（ホスホの）アラニン；硫酸化スレオニンによる置換により生成することがで
きる。カルボキシル側基（例えばアスパラチル又はグルタミル）は例えば1-シク
ロヘキシル-3(2-モルホリニル-(4-エチル）カルボジイミド又は1-エチル-3（4-
アゾニア-4,4-ジメトールペンチル）カルボジイミドの様なカルボジイミド（R=-
N-C-N-R=）との反応により選択的に修飾できる。アスパラチルまたはグルタミル
はアンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニル及びグルタミニル残基に変
換することもできる。
【００４２】 塩基性アミノ酸の模擬体は例えば（リジン及びアルギニンに加え）アミノ酸オ
ルニチン、シトルリン又は（グアニジノ）-酢酸又は（グアニジノ）アルキル-酢
酸にあって、アルキルが上記に同じであるものにより置換することで生成できる
。ニトリル誘導体（例えばCOOHの代わりにCN-成分を含む）はアスパラギン又は
グルタミンの代用になる。アスパラギニル及びグルタミニル残基は対応するアス
パルチル又はグルタミル残基に脱アミン化することができる。
【００４３】 アルギニン残基模擬体は、アルギニルを例えばフェニル具リオｋさる、2,3-ブ
タンジオン、1,2-シクロヘキサンジオン、又はニンヒドリンを含む例えば１又は
それ以上の通常の試薬と、好ましくはアルカリ条件下に反応させることで生成で
きる。
【００４４】 チロシン残基模擬体は、チロシルを例えば芳香族ジアゾニウム化合物又はテト
ラニトロメタンと反応させることで生成できる。N-アセチルイミダゾル及びテト
ラニトロメタンを使用し、それぞれO-アセチルチロシル種及び3-ニトロ誘導体を
形成することができる。
【００４５】 システイン残基模擬体はシステニル残基を例えば2-クロロ酢酸又はクロロアセ
トアミドの様なアルファ-ハロ酢酸エステル及び対応するアミンと反応させるこ
とで生成でき、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を得る。シ
ステイン残基模擬体もまたシステニル残基を例えばブロモトリフルオロアセトン
、アルファ-ブロモ-ベータ-(5-イミダゾイル）プロピオン酸；クロロアセチルリ
ン酸、N-アルキルマレイミド、3-ニトロ-2-ピリジルジスルフィド；メチル2-ピ
リジルジスルフィド；p-クロロ安息香酸水銀；2-クロロ水銀-4-ニトロフェノー
ル；又はクロロ-7-ニトロベンゾ-オキサ-1,3-ジアゾールと反応させることで生
成できる。
【００４６】 リジン模擬体はリジニルを例えばスクシン又はその他無水カルボン酸と反応さ
せることで生成（及びアミノ末端残基を変化させることが）できる。リジン及び
その他アルファ-アミノ-含有残基模擬体はメチルピコルイミデートの様なイミド
エステル、リン酸ピリドキサール、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリ
ニトロベンゼンスルホン酸、O-メチルイソ尿素、2,4,ペンタンジオンとの反応、
及びグリオキシレートによるトランスアミダーゼ-触媒反応により生成できる。
【００４７】 メチオニンの模擬体は例えばメチオニンスルホキシドとの反応により生成でき
る。プロリンの模擬体には例えばピペコリック酸、チアゾリジンカルボン酸、3-
又は4-ヒドロキシプロリン、デヒドロプロリン、3-又は4-メチルプロリン、又は
3,3-ジメチルプロリンとの反応により生成できる。ヒスチジン残基模擬体はヒス
チジルと例えばジエチルプロカルボン酸エステル又はパラブロモフェンアシルブ
ロマイドとの反応により生成できる。
【００４８】 その他模擬体には例えばプロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル又はス
レノニル残基のヒドロキシル基のリン酸化；リジン、アルギニン及び辞すチジン
のアルファ-アミノ基のメチル化；N-末端アミンのアセチル化；主鎖アミド残基
のメチル化又はN-メチルアミノ酸による置換；又はC-末端カルボキシル基のアミ
ド化により生成された模擬体が含まれる。
【００４９】 天然ポリペプチド（例えばPLポリペプチド又はPDZポリペプチド）の成分は、
逆キラリティーを持つアミノ酸（又はペプチドミメティクス残基）により置換で
きる。即ち、L-型の天然発生アミノ酸は（化学物質の構造によりR又はSとも称す
ることができる）同一化学構造を持つアミノ酸又はペプチドミメティクスにより
置換できるが、逆キラリティー、一般にはD-アミノ酸と呼ばれるがR-又はS-型と
呼ばれることもあるものでは置換できない。
【００５０】 発明の模擬体は構造的模擬残基、具体的にはベータターン、ベータシート、ア
ルファ螺旋構造、ガンマターン等の二次構造を誘導または模擬する残基を含む組
成体も含むことができる。例えばペプチド内での天然アミノ酸残基のD-アミノ酸
；N-アルファ-メチルアミノ酸；C-アルファ-メチルアミノ酸；又はデヒドロアミ
ノ酸による置換はベータターン、ガンマターン、ベータシート又はアルファ螺旋
立体構造を誘導又は安定化できる。ベータターン模擬構造体は例えばNagai（198
5）Tet. Lett, 26:647-650; Feigl (1986) J. Amer. Chem. Soc. 108:181-182;
Kahn(1988) J. Amer. Chem. Soc. 110: 1638-1639; Kemp(1988) Tet.Lett. 29:5
057-5060; Kahn(1988) J. Molec. Recognition 1:75-79に記載されている。ベー
タシート模擬構造体は例えばSmith(1992) J. Amer. Chem. Soc. 114:10672-1067
4に記載されている。例えばシスアミド代用体、1,5-ジ置換型テトラゾールによ
り誘導されたVI型ベータターンはBeusen（1995) Biopolymers 36:181-200に記載
されている。アキラル性オメガ-アミノ酸残基の取り込みによるアミド結合に関
する置換体としてのポリメチレン単位の生成はBanerjee(1996) Biopolymers 39:
769-777に記載されている。ポリペプチドの二次構造は例えば高電界型1H NMRま
たは2D NMR分光分析により解析でき、例えばHiggins(1997) J. Pept. Res. 50:4
21-435を参照せよ。またHruby(1997) Biopolymers 43:219-266, Balajiら、米国
特許第5,612,895号を参照。
【００５１】 5.15 ここで使用する場合、“ペプチド変異体”及び“保存的アミノ酸置換体
”は同様の特性（大きさ、極性、疎水性等）を有するアミノ酸残基の置換により
参照ペプチド（例えば特定されたPL蛋白質のカルボキシ末端の配列を有するペプ
チド）とは異なるペプチドを表す。即ち、発明の範囲に包含される化合物がアミ
ノ酸残基に関し指定された分類で部分的に規定される場合、アミノ酸は一般にア
ミノ酸側鎖の特性に一次的に依存し、３主要分類；親水性アミノ酸、疎水性アミ
ノ酸及びしステイン-様アミノ酸に類別される。これら主要分類はさらに亜分類
に分けられるだろう。親水性網の差は酸性、塩基性又は極性側さを有するアミノ
酸を含み、そして疎水性アミノ酸は芳香性又は非極性側鎖を有するアミノ酸を含
む。非極性アミノ酸はさらに脂肪族アミノ酸等を含む様に分けられるだろう。こ
こに使用されるアミノ酸の分類の定義は以下の通りである： “疎水性アミノ酸”は生理学的pHで非荷電であり、水溶液により反発される
側鎖を有するアミノ酸を表す。遺伝的にコードされた疎水性アミノ酸の例にはIl
e、Leu及びValが含まれる。非遺伝的にコードされたアミノ酸例はt-BuAを含む。
【００５２】 “芳香族アミノ酸”は共役π-電子系を有する環を少なくとも一つ含む側鎖（
芳香族基）を持つ疎水性アミノ酸を表す。芳香族基は更にアルキル、アルケニル
、アルキニル、ヒドロキシル、スルファニル、ニトロ及びアミノ基等の様な基と
置換してもよい。遺伝的にコードされた芳香族アミノ酸の例には、フェニルグリ
シン、2-ナフチルアラニン、β-2-チエニルアラニン、1,2,3,4-テトラヒドロイ
ソキノリン-3-カルボン酸、4-クロロ-フェニルアラニン、2-フルオロフェニルア
ラニン、3-フルオロフェニルアラニン及び4-フルオロフェニルアラニンが含まれ
る。
【００５３】 “非極性アミノ酸”は生理学的pHで一般に非荷電状態にあり、非極性である側
鎖を有する疎水性アミノ酸を表す。遺伝的にコードされた非極性アミノ酸の例に
はGly、Pro及びMetが含まれる。非コード型非極性アミノ酸の例にはChaが含まれ
る。
【００５４】 “脂肪族アミノ酸”は飽和又は不飽和の直鎖型、分岐型又は環式炭化水素側鎖
を有する非極性アミノ酸を表す。遺伝的にコードされた脂肪族アミノ酸の例には
Ala、Leu、Val及びIleが含まれる。非コード型脂肪族アミノ酸の例にはNleが含
まれる。
【００５５】 “親水性アミノ酸”は水溶液により誘引される側鎖を有するアミノ酸を表す。
遺伝的にコードされた親水性アミノ酸の例にはSer及びLysが含まれる。非コード
型親水性アミノ酸の例にはCit及びhCysが含まれる。
【００５６】 “酸性アミノ酸”は７未満の側鎖pK値を有する親水性アミノ酸を表す。酸性ア
ミノ酸は典型的には、水素イオンの消失により生理学的pHにて負に荷電した側鎖
を有している。遺伝的にコードされた酸性アミノ酸の例にはAsp及びGluが含まれ
る。
【００５７】 “塩基性アミノ酸”は７より大きい側鎖pKを有する親水性アミノ酸を表す。塩
基性アミノ酸は典型的には水素イオンとの結合により、生理学的pHに於いて正に
荷電した側鎖を有している。遺伝的にコードされた塩基性アミノ酸の例にはArg
、Lys及びHisが含まれる。遺伝的にコードされていない塩基性アミノ酸の例には
、非環式アミノ酸オルニチン、2,3-ジアミノプロピオン酸、2,4-ジアミノブチリ
ル酸及びホモアルギニンが含まれる。
【００５８】 “極性アミノ酸”は生理学的pHにて非荷電であるが、２個の原子により共有さ
れている１組の電子が一方の原子により近く保持されている結合を有する親水性
アミノ酸を表す。遺伝的にコードされた極性アミノ酸の例にはAsx及びGlxが含ま
れる。遺伝的にコードされない極性アミノ酸の例にはシトルリン、N-アセチルリ
ジン及び硫酸メチオニンが含まれる。
【００５９】 “システイン様アミノ酸”は他アミノ酸残基の側鎖とジスルフィド結合の様な
供給結合を形成できる側鎖を持つアミノ酸を表す。典型的にはシステイン様アミ
ノ酸は一般には少なくとも１個のチオール（SH）基を含む側鎖を有している。遺
伝的にコードされたシステイン様アミノ酸の例にはCysが含まれる。遺伝的にコ
ードされていないシステイン様アミノ酸の例にはホモシステイン及びペニシリン
が含まれる。
【００６０】 当業者により理解される如く上記分類は絶対ではなく−複数のアミノ酸は１以
上の特性を有しており、そのために１以上の分類に含めることができる。例えば
チロシンは芳香環及び極性ヒドロキシル基の両方を有している。即ちチロシンは
二重に特性を有しており、芳香族及び極性分類の両方に含めることができる。同
様に、システインはジスルフィド結合を形成できることに加え非極性の特性も有
する。即ち疎水性又は非極性アミノ酸として厳格には分類されていないものの、
システインは多くの例でペプチドに疎水性を付与するために使用できる。
【００６１】 発明のペプチド及びペプチド類似体に含まれる遺伝的にコードされない特に一
般的に見られるアミノ酸にはβ-アラニン（b-Ala）及び3-アミノプロピオン酸（
Dap）、2,3-ジアミノプロピオン酸（Dpr）、4-アミノブチリル酸等の様なその他
のオメガ-アミノ酸；α-アミノイソブチリル酸（Aib）；ε-アミノヘキサノン酸
（Aha）；δ-アミノ吉草酸（Ava）；N-メチルグリシン又はサルコシン（MeGly）
；オルニチン（Orn）；シトルリン（Cit）；t-ブチルアラニン（t-ButA）t-ブチ
ルグリシン（t-BuG）；N-メチルイソロイシン（MeIle）；フェニルグリシン（Ph
g）；シクロヘキシルアラニン（Cha）；ノルロイシン（Nle）；2-ナフチルアラ
ニン（2-Nal）；4-クロロフェニルアラニン（Phe(4-Cl)）；2-フルオロフェニル
アラニン（Phe(2-F)）；3-フルオロフェニルアラニン（Phe(3-F)）；4-フルオロ
フェニルアラニン（Phe(4-F)）；ペニシラミン（Pen）；1,2,3,4-テトラヒドロ
イソキノリン-3-カルボン酸（Tic）；β-2-チエニルアラニン（Thi）；硫酸メチ
オニン(MSO)；ホモアルギニン（hArg）；N-アセチルリジン（AcLys）；2,3-ジア
ミノブチリル酸（Dab）；2,3-ジアミノブチリル酸(Dbu)；p-アミノフェニルアラ
ニン(Phe(pNH2))；N-メチルバリン（MeVal）；ホモシステイン（hCys）及びホモ
セリン（hSer）が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらアミノ
酸も随意上記規定の分類に含まれる。
【００６２】 上記の遺伝的にコードされた、及び遺伝的にコードされていないアミノ酸の分
類は下表１にまとめられている。表１は例示のみを目的としたものであり、ここ
に記載のペプチド及びペプチド類似体を含むアミノ酸残基の網羅的一覧表を意味
するものではない。ここに記載のペプチド及びペプチド類似体を作製する上で有
用な他アミノ酸残基は、例えばFasman、1989、CRC Practical Handbook of Bioc
hemistry and Molecular Biology. CRC Press, Inc.,及びここに引用された参考
文献中に見いだすことができる。ここに記載されていないアミノ酸は、具体的に
特定されたアミノ酸と比較した場合の既知挙動、及び／又はそれらの特徴的な化
学上及び／又は物理上の特性に基づき上記分類に随意分類することができる。
【００６３】
【表１】
【００６４】 5.16 ここで用いる“検出可能な標識体”は当分野通常の意味であり、検出に
利用され、又は利用できる（例えば物理的あるいは化学的特性に基づき）原子（
例えば放射性核種）、分子（例えばフルオロセイン）又は複合体を表し、分子の
存在またはそれと共有結合又はその他結合する他分子と結合できることを示す。
用語“標識体”はまた基質に作用し検出可能な原子、分子又は複合体を産生する
共有結合またはその他結合した分子（例えば酵素の様な生物分子）を表す。本発
明での利用に好適な検出可能な標識体には分光光学的、光化学的、生物化学的、
免疫化学的、電気的、光学的又は化学的手段により検出可能な組成体を含む。本
発明に有用な標識体は、標識化ストレプトアビジン共役体で染色する場合のビオ
チン、磁性ビーズ（例えばDnyabeadsTM）、蛍光色素（例えばフルオロセイン、
テキサスレッド、ローダミン、グリーン蛍光蛋白質、エンハンスドグリーン蛍光
蛋白質等）、放射性核種（例えば3H、125I、35S、14C又は32P）、酵素（例えば
ヒドラーゼ、特にアルカリホスファターゼの様なホスファターゼ、エステラーゼ
又はグリコシダーゼ、あるいは特に西洋ワサビペルオキシダーゼの様なペルオキ
シダーゼ、及びその他ELISAsに一般的に使用されているもの）、基質、補助因子
、阻害剤、化学発光基、発色剤及び金コロイド又は着色ガラスあるいはプラスチ
ック製（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）ビーズの様な着
色標識体が含まれる。これら標識体の使用を教示する特許には米国特許第3,817,
837号；第3,850,752号；第3,939,350号；第3,996,345号；第4,277,437号；第4,2
75,149号；及び第4,366,241号が含まれる。これら標識体を検出する手段は当業
者に良く知られている。即ち、例えば放射線核種及び化学発光標識体は写真フィ
ルム又はシンチレーションカウンターを使用し検出され、蛍光マーカーは放射光
線を検出するための光検出器（例えば蛍光活性化細胞ソーティング）を使用し検
出されるだろう。酵素標識体は典型的には酵素に基質を供与し、基質に対する酵
素の作用により生じた反応産物を検出することで検出され、着色標識体は着色さ
れた標識体を単純に目で見ることで検出される。即ち、標識体は分光光学的、光
化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的又は化学的手段により検出可能
ないずれかの組成体である。標識体は当分野公知の方法に従い所望成分に直接、
又は間接的に結合される。非放射活性標識体は間接的手段により結合されること
が多い。一般にリガンド分子（例えばビオチン）は分子に供給結合される。次に
リガンドは、元来検出可能であるか又は検出可能酵素、蛍光化合物あるいは化学
発光化合物の様なシグナル生成システムに共有結合されている抗リガンド（例え
ばストレプトアビジン）分子に結合する。複数のリガンド及び抗リガンドが利用
できる。リガンドが天然抗リガンド、例えばビオチン、チロキシン及びコルチゾ
ールを有する場合、それらは標識化天然発生抗リガンドと共に使用することがで
きる。あるいは、ハプテン性又は抗原性化合物を抗体と共に利用することができ
る。分子はまた例えば酵素又は発蛍光団を結合させることでシグナル生成化合物
に直接結合することできる。標識体の検出手段は当業者に良く知られている。即
ち、例えば標識体が放射性標識体の場合、検出手段にはシンチレーションカウン
ター、オートラジオグラフィーの様な写真フィルム、又はストレージ蛍光団イメ
ージングが含まれる。標識体が蛍光標識体の場合には、それは適当な波長光によ
り発蛍光団を励起し、生じた蛍光を検出することで検出されるだろう。蛍光は肉
眼、写真フィルムによる手段、電荷結合素子（CCDs）の様な電子的検出装置又は
光電子倍増管の使用により検出される。同様に酵素標識体は、酵素に対し適当な
基質を供与し、生じた反応産物を検出することで検出されるだろう。また単純着
色標識体は標識体に付随する色彩を観察することで検出されるだろう。発蛍光団
の対をアッセイに使用する場合には、多くの場合それらが異なる発光パターンを
持ち、それによりそれらを容易に区別できるものが好ましい。
【００６５】 5.17 ここで使用する用語“本質的に同一”は、アミノ酸を比較する場合に於
いては、最大一致例に関し比較し整列させた場合に、配列が少なくとも約70%、
少なくとも約80%、又は少なくとも90%のアミノ酸同一性を有することを意味する
。パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに好適なアルゴニズムはFA
STAアルゴリズムであり、Pearson、W.R. & Lipman, D.J., 1998, Proc. Natl. A
cad. Sci. U.S.A. 85:2444に記載されている。またW.R.Pearson, 1996, Methods
Enzymol. 266:227-258参照。パーセント同一性を計算するためにDNA列のFASTA
アラインメント中に使用される好適パラメータは最適化され、BL-50マトリック
ス15；-5k-tuple=2；ペナルティー=40、最適化=28；ギャップペナルティー-12、
ギャプ長ペナルティー＝-2及び幅=-16である。
【００６６】 5.18 ここで使用する“造血細胞”にはリンパ球（T細胞、B細胞及びNK細胞）
、単球及び顆粒球を含む白血球（即ち好中球、好塩基球、好酸球）、マクロファ
ージ、樹状細胞、巨大核細胞、網状赤血球、赤血球及びCD34+幹細胞が含まれる
。
【００６７】 6. 発明の詳細な説明 本発明者はPDZ棚泊質及びPL蛋白質間の相互作用が造血細胞及び免疫反応に関
わるその他細胞の生物学的機能に重要かつ広範な役割を果たすことを見いだした
。PDZ-PL相互作用は神経系（即ち神経単位）では既知であったが、造血細胞機能
、特にT細胞及びB細胞の機能に於ける普遍的重要性及び免疫反応の変調に於ける
それらの機能的役割は知られていなかった。特に驚くべきことに本発明者は、造
血系での細胞-細胞相互作用を伝達する細胞接着分子がPDZ-結合蛋白質（PL蛋白
質）であり、PDZ蛋白質に結合することを見いだした。発明者は免疫系細胞に存
在するPDZ蛋白質とPL蛋白質間の多数の相互作用を特定し、発明はこれら相互作
用を阻害することで免疫系内の生物学的機能に影響する作用物質及び方法を提供
する。ここで使用する場合、細胞の文脈中での用語“生物学的機能”は細胞によ
り通常実施される検出可能な生物学的滑動、例えば増殖、細胞活性化（例えばT
細胞活性化、B細胞活性化、T-B細胞共役形成）、サイトカイン放出、脱顆粒、チ
ロシンリン酸化、イオン（例えばカルシウム）流入、代謝活性、アポトーシス、
遺伝子発現の変化、細胞構造の維持、細胞移動、基質への接着、シグナル伝達、
細胞-細胞相互作用及びここに記したあるいは当分野既知のその他事象の様な表
現形の変化を表す。
【００６８】 一面において本発明は免疫機能に必要な造血細胞、例えばT細胞及びB細胞、又
はその他細胞（例えば内皮細胞）の生物学的活性を制御するためのペプチド、ペ
プチド類似体又は模擬体、医薬組成体及びそれら組成体を利用する方法に関する
。発明は更に、造血細胞活性及び免疫機能を変調することを目的とした組成体の
使用方法、並びにそれら阻害剤に関するアッセイに関する。
【００６９】 表２はT細胞及びB細胞での蛋白質相互作用の広範な分析をまとめている。その
大部分について免疫系細胞での発現は従来知られていなかったPDZ蛋白質は表２
の上列に記載されている。表の第１縦列にはPL蛋白質が記載されている。“A”
又は“G”の文字が印されたマトリックス位置は、PDZ蛋白質とPL間の相互作用が
新規結合アッセイ（例えば下記6.2に詳細記載）にて検出されたことを示してい
る。空欄は相互作用が発明のアッセイを使用しても検出されなかったことを意味
している。星印（*）はPL-PDZ相互作用が既に科学文献中に報告されていること
を示している。
【００７０】
【表２】
【００７１】
【表３】
【００７２】 ここに記した様に表２掲載のPDZ蛋白質はPDZドメインを含む天然発生蛋白質で
ある。本発明は特に造血細胞に於けるPDZ蛋白質とPL蛋白質間相互作用の検出及
び変調を目的としている。例示のPL蛋白質は表２に記載されている。特に下記論
ずる様に、これらPL蛋白質の多くは、いずれの細胞系でもその様には従来認めら
れていなかった。多様なPL蛋白質分類が知られており、ここに記したPL蛋白質は
(1)“PL接着蛋白質”(2)“PLイオンチャンネル蛋白質”(3)“PLアダプター蛋白
質”(4)“PL細胞内蛋白質”及び(5)“PLサイトカイン受容体蛋白質”として特徴
付けることができる。
【００７３】 ここで使用される接着蛋白質は、別個の細胞上にある細胞表面分子（例えば膜
貫通蛋白質又は表面蛋白質）と直接接触することで細胞-細胞相互作用に関係す
る細胞表面蛋白質である。即ち、PL接着蛋白質を発現している細胞が適当な別細
胞に接触すると、PL接着蛋白質は２細胞の境界面に局在し、第２細胞上の細胞表
面分子と直接接する。細胞-細胞境界面は２種類の細胞の原形質膜が閉鎖する（
一般に＜10nm、多くは約1nm）領域である。典型的には、直接分子接触はヴァン
デルワールス力が有意である距離、一般には約1nm未満の距離の分子相互作用を
意味する。PL接着蛋白質例にはCD6；CD49E（アルファ-4）、CD49F（ａ型、アル
ファ6）；CD138（シンデカン）；CLASP-1；CLASP-4；VCAM1；CLASP-2；DNAM-1；
CD83；CD44（長型）；CD97；（CD55L)；CD3n；DOCK2；CD34及びFceRIbが含まれ
る。即ち実施態様の一つでは、発明のPL蛋白質はPL接着蛋白質である。ある実施
態様では、発明はここに詳細記す様に、PL接着蛋白質とPDZ蛋白質間の相互作用
を阻害し、免疫反応を変調する方法及び作用物質を提供する。ある実施態様では
、阻害又は変調は造血細胞内で起こる。関連実施態様では、阻害又は変調は内皮
細胞内で起こる。関連実施態様では、阻害又は変調は上皮細胞、ケラチノ細胞、
肝細胞、心筋細胞内に起こる。
【００７４】 ここで使用する場合、イオンチャンネル蛋白質はそれ自体が脂質二重膜の一方
にある水溶液からもう一方にある水溶液へのイオンの通過を触媒する膜貫通蛋白
質を意味する（例えば膜内に小孔を形成することによる）。PLイオンチャンネル
蛋白質の１例はKv1.3である。即ち実施態様の一つでは、発明のPL蛋白質はPLイ
オンチャンネル蛋白質である。ある実施態様では、発明はここに詳細記す様に、
PLイオンチャンネル蛋白質とPDZ蛋白質間の相互作用を阻害し、免疫反応を変調
する方法及び作用物質を提供する。ある実施態様では、阻害又は変調は造血細胞
内に起こる。関連実施態様では、阻害又は変調は内皮細胞内で起こる。
【００７５】 ここで使用する場合、細胞内（即ち細胞質）蛋白質は当分野一般的な意味を有
しており、膜に結合しない蛋白質、例えば膜貫通ドメインを持たない蛋白質を表
す。即ち、実施態様の一つでは、発明のPL蛋白質はPL細胞内蛋白質である。PL細
胞内蛋白質の例にはグリコフォリンC及びLPAPが含まれる。ある実施態様では、
発明はここに詳細記す様にPL細胞質蛋白質とPDZ蛋白質間相互作用を阻害し、免
疫反応を変調する方法及び作用物質を提供する。ある実施態様では、阻害又は変
調は造血細胞内に起こる。関連実施態様では、阻害又は変調は内皮細胞内で起こ
る。
【００７６】 ここで使用する場合、サイトカイン受容体は当分野一般的な意味を有しており
、サイトカインに特異的に結合する細胞外ドメインを持つ膜蛋白質を表す。PLサ
イトカイン受容体蛋白質の例にはCDW125（IL5R）、CDW128A(IL8RA）及びBRL-1が
含まれる。即ち実施態様の一つでは、発明のPL蛋白質はPLサイトカイン蛋白質で
ある。ある実施態様では、発明はここに詳細記す様にPLサイトカイン蛋白質とPD
Z蛋白質間相互作用を阻害し、免疫反応を変調する方法及び作用物質を提供する
。ある実施態様では、阻害又は変調は造血細胞内に起こる。関連実施態様では、
阻害又は変調は内皮細胞内で起こる。
【００７７】 ここで使用する場合、アダプター蛋白質は２又はそれ以上のその他生物分子を
結合することで多分子複合体の形成に寄与する分子（例えば蛋白質）を意味する
。アダプター分子／蛋白質による２又はそれ以上の分子の結合は一般にアダプタ
ー蛋白質と２又はそれ以上の分子のそれぞれとの間の直接の分子接触を含む。PL
アダプター蛋白質の一例はLPAPである。即ち実施態様の一つでは、発明のPL蛋白
質はPLアダプター蛋白質である。ある実施態様では、発明はここに詳細記す様に
PLアダプター蛋白質とPDZ蛋白質間相互作用を阻害し、免疫反応を変調する方法
及び作用物質を提供する。ある実施態様では、阻害又は変調は造血細胞内に起こ
る。関連実施態様では、阻害又は変調は内皮細胞内で起こる。
【００７８】 各種実施態様では、発明のPL蛋白質は本開示の他所に記載の様に特異的C-末端
（即ちPLドメイン）アミノ酸配列又はアミノ酸モチーフを特徴とする。
【００７９】 発明の各種実施態様では、発明のPL蛋白質はTリンパ細胞、Bリンパ細胞、又は
T及びBリンパ細胞の両方に発現されるPDZ蛋白質に結合する。ある実施態様では
、PL蛋白質は内皮細胞中に発現されたPDZ蛋白質に結合する。各種実施態様では
、それが結合するPL蛋白質及び／又はPDZ蛋白質は神経系（例えば神経単位）に
は発現されない。
【００８０】 発明の各種実施態様では、発明のPL蛋白質は表２掲載のPDZ蛋白質の一つにの
み結合する。別実施態様では、PL蛋白質は表２掲載の１ないし３、３ないし５、
または５より多い異なるPDZ蛋白質に結合する。
【００８１】 発明の各種実施態様では、PL蛋白質は細胞活性化（例えば活性化Bリンパ細胞
、Tリンパ細胞）又は有糸分裂に入る（例えば迅速増幅細胞集団でのアップレギ
ュレーション）ことで発現され、又はアップレギュレーションされる。
【００８２】 発明の各種実施態様では、PL蛋白質は(i)細胞（例えば造血細胞）活性化又は
移動を伝達する蛋白質、(ii)あるタイプの細胞でのアポトーシスを伝達しない蛋
白質(iii)G-蛋白質にカップリングした７膜貫通螺旋受容体以外の蛋白質、(iv)G
-蛋白質カップリング７膜貫通螺旋受容体であるがサイトカイン受容体でない蛋
白質、又は(v)G-蛋白質カップリング７膜貫通螺旋受容体でなく、サイトカイン
受容体である蛋白質。
【００８３】 6.1 造血細胞に発現されたPDZドメイン含有蛋白質の検出 上記の如く、本発明者は驚くべきことに複数のPDZ蛋白質が免疫系細胞に発現
されており、免疫反応の変調にて基本的な生物学的役割を果たしていることを見
いだした。PDZ蛋白質DLG1及びTIAM-1は従来T細胞内に報告されている。本発明者
はヒトESTデータベースのBLAST検索及び下記実験より、更にT細胞のMPP1、P-DLG
、VELI-1、PSD95、シンテニン及びB細胞でのCASK、DLG1、DLG2、ZIPキナーゼ、
シントロフィン２、P-dlg、PSD95及びシンテニンを含む７種類のPDZ蛋白質が造
血細胞内に存在していることを見いだした。
【００８４】 造血機能に於けるPDZ蛋白質の関与の全範囲を決定するために、発明者はT及び
B細胞におけるPDZ蛋白質の体系的な研究に着手した。PDZドメイン含有蛋白質の
包括的リストはキーワード検索によりSanger Centre データベース（Pfam）から
取り出された。対応するcDNA配列はNCBI”entrez”データベースを使ったGeneBa
nk（以後“GenBankPDZ蛋白質ｃDNA配列”）から取り出された。PDZドメインをコ
ードするDNA部分は、cDNA及び蛋白質配列を、CLUSTALWを使い並列させることで
特定された。DNA/蛋白質アラインメント情報に基づき、PDZ度面を包含するプラ
イマーが設計された。免疫細胞での特定PDZ-含有蛋白質の発現は、免疫細胞由来
RNAを逆転写（“RT”）して得たcDNAをポリメラーゼチェインリアクション（“P
CR”）すること（即ち“RT-PCR”）で検出された。PCR、RT-PCR及びその他核酸
の分析及び取り扱い方法は良く知られており、Sambrookら、(1989）MOLECULAR C
LONING: A LABORATORY MANUAL, 第２版、1-3巻、Cold-Spring Harbor Laborator
y、以後“Sambrook”）；及び1999年１月より増補のAusubelら、CURRENT PROTOC
OLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New
York（1997）（以後“Auisubel”）に一般的に記載されている。
【００８５】 表２にまとめられた実験では、T-細胞（Jurkat E6細胞株）及びB-細胞（MV 4-
11細胞株）は、RT-PCRにより特異的PDZドメイン含有遺伝子の発現について試験
された。RNAは“trizol”RNA調整キット（GIBCO-BRL；カタログ番号15596-018）
をメーカーの推奨法に従い使用して調整された。簡単に述べると、1-5×107リン
パ芽球を200×g、10分間、20℃の遠心分離により集めた。細胞を100μlのPBS緩
衝液に再懸濁し、5×106細胞当たり1mlのTRIZOL試薬を加えた。細胞懸濁液を混
合し、5分間室温（RT）でインキュベーションした後1mlのTRIZOL当たりクロロホ
ルムを0.2ml加えた。懸濁液を強くかきまぜ、更に３分間RTにてインキュベーシ
ョンした。次にサンプルを12000×ｇ,15分間、４℃で遠心分離し、水相を回収、
RNAを2-プロパノールで沈殿させた。沈殿をさらに12000×ｇ、15分間、４℃にて
遠心分離し再回収し、風乾させてから適当な容積のDEPC処理水に再懸濁した。
【００８６】 RNA濃度及び純度は、核酸の260/280nm光吸収の測定から決定された。cDNA合成
に関しては、SUPERSCRIPT II逆転写酵素cDNAキット（Gibco-brl；カタログ番号1
8064-014）を使用した、200μlのcDNA反応サンプル当たりのRNA持ち込み量は10
μgであった。cDNAを合成する前に、RNAは1単位/μlのDNAseI水溶液110μlにて
、37℃、20分間処理された。次にDNaseIは10分間70℃インキュベーションにより
不活性化された。cDNAプライミングにはランダムプライマーが使用された；ラン
ダムヘキサマープライマー10μl（100ng/μl）を加え、サンプルを70℃に５分間
加熱してから氷上にて冷却された。続いて40μlのSUPERSCRIPT II“第１鎖”緩
衝液、20μlの0.1M DDT,10μlの10mMのデオキシヌクレオチド３リン酸混合液（d
ATP、dCTP、dGTP、dUTP）及び10μlのSUPERSCRIPT II逆転写酵素が加えられ、45
分間、42℃にてcDNA合成が行われた。反応は95℃、５分間のインキュベーション
により停止され、一般にはPCRにこれらcDNAサンプル2-4μlが使用された。
【００８７】 ｃDNAの一部（典型的には20μl反応液の1/5）がPCRに使用された。PCRは目的
とするPDZ蛋白質のPDZドメイン含有領域を特異的に増幅するよう設計されたプラ
イマーを使い実施された。目的の各種PDZドメインをコードするDNA配列は調査（
即ちGeneBankより得たPDZ蛋白質ｃDNAを理論的に翻訳した後、PDZドメインアミ
ノ酸配列と並列させること）により特定された。表３はPCRプライマー、増幅さ
れたPDZ-コードドメイン及びPDZドメイン含有蛋白質のGenBank登録番号を示す。
PDZドメインのその後のクローニングを容易にするために、PCRプライマーはその
末端にエンドヌクレアーゼ制限配列を含んでおり、グルタチオン-Sトランスフェ
ラーゼ（GST）とフレーム内にてpGEX-3Xクローニングベクター（Pharmacia、Gen
Bank XXI13852）と連結することができる。
【００８８】 表３は上記アッセイにて検出された蛋白質を一覧している。結果はPDZ蛋白質
がT及びB細胞に於いて、細胞株特異的様式及び細胞株独立的様式の両方にて広く
利用されていることを示している。INADL2/3（PDZ dom.）、KIAA0316及び26sサ
ブユニットp27はT細胞には検出されたが、B細胞には検出されなかった。mCASK、
KIAA0559、PTN-4及びX11ベータはB細胞には検出されたがT細胞には検出されなか
った。AF6、BAII関連Prot.、Cytohesin bind. Prot.、DLG1、DLG5(pdlg）、DLV1
、DVL3、GTPase、hypoth. 41.8kd、KIAA147、KIAA0300、KIAA0303、KIAA0380、K
IAA0440、KIAA0545、KIAA0561、LIMK1、LIMK2、LIMドメインprot、LIM蛋白質、M
INT1、MINT3、MPP1、MPP2、NE-DLG、NOS1、新規セリンプロテアーゼ、PTN-3、pr
IL16、PSD95、RGS12、セリンプロテアーゼ、SYNTENIN、SYNTR 1アルファ、TAX1
、TAX2、TAX33、TAX40、Tax43(SYN、ベータ1）、TIAMwwp3及びX11prot.はT細胞
及びB細胞両方に検出された。
【００８９】
【表４】
【００９０】
【表５】
【００９１】
【表６】
【００９２】
【表７】
【００９３】
【表８】
【００９４】
【表９】
【００９５】
【表１０】
【００９６】
【表１１】
【００９７】
【表１２】
【００９８】
【表１３】
【００９９】
【表１４】
【０１００】
【表１５】
【０１０１】
【表１６】
【０１０２】
【表１７】
【０１０３】
【表１８】
【０１０４】
【表１９】
【０１０５】
【表２０】
【０１０６】 6.2 PDZ-ドメインポリペプチド及びPDZ候補リガンド蛋白質（PL蛋白質）間相 互作用検出に関するアッセイ ２種類の”A”及び”G”と命名された相補的アッセイを開発し、PDZ-ドメイン
ポリペプチドとPDZリガンド候補間の結合を検出した。２種類のアッセイそれぞ
れでは、結合は１またはそれ以上のPDZドメイン（即ち候補PLペプチド）と結合
すると予想される蛋白質のC末端に対応する配列を有するペプチドとPDZ-ドメイ
ンポリペプチド（典型的にはPDZドメインを含む融合蛋白質）間に検出される。
“A”アッセイでは、候補PLペプチドが固定され、可溶化PDZ-度面ポリペプチド
の固定化ペプチドへの結合が検出される（“A”アッセイは、実施態様の一つに
於いてペプチドの固定化にアビジン表面が利用されることから命名された）“G
”アッセイでは、PDZ-ドメインポリペプチドが固定され、可溶性PLペプチドの結
合が検出される（“G”アッセイは、実施態様の一つに於いてPDZ-ドメインポリ
ペプチドの固定にGST-結合表面が利用されていることから命名された）。これら
アッセイの好適実施態様は下記に詳細記載されている。しかしこれらアッセイは
、本発明の目的への有用性を維持したまま様々に変更できることが当業者により
理解されるだろう。
【０１０７】 6.2.1 PDZ-ドメイン含有融合蛋白質の産生 発明のアッセイでの使用を目的としGST-PDZドメイン融合蛋白質が調整された
。PDZコーディンドメインを含むPCR産物（§6.1上記）を、PDZドメイン及び異質
ドメイン（即ちグルタミン-Sトランスフェラーゼ配列、“GST”）を含む融合蛋
白質の発現を可能にするため発現ベクター内にサブクローニングされた。DNAを
コードするPDZドメインを表すPCR産物（即ちDNA断片）は、メーカーの提案に従
い“セファグラス”ゲル抽出システム（Pharmacia）を使用し、アガロースゲル
より抽出された。
【０１０８】 上記の如くPCRプライマーは、PCR断片とGST遺伝子融合ベクター（ｐGEX-3X；P
harmacia、GenBank登録番号XXU13852）インフレーム内でのグルタチオン-Sトラ
ンスフェラーゼ配列との連結を容易にするためのエンドヌクレアーゼ制限部位を
含む様に設計されている。このベクターはIPTG誘導lacZプロモーターを含む。pG
EX-3Xベクターは表３に示す様にBamH1及びEcoRI、又は幾つかの例ではEcoRI又は
SmaI、を使用し直鎖状にされ、脱リン酸化された。多くのクローニング法ではBa
mHI及びEcoRIによる二重消化が実施され、クローンに対するPRC断片の末端はBam
HI及びEcoRIとなった。幾つかの例では、使用した制限エンドヌクレアーゼの組
合せはBglII及びEcoRI、BamHI及びMfeI、又はEcoRIのみ、SmaIのみ、又はBamHI
のみ（表３参照）であった。１個以上のPDZドメインをクローニングする場合に
は、クローン化されるDNA部分はPDZドメイン及び個々のドメイン間に位置するｃ
DNA部分を表す。アッセイに使用されたクローン化断片の正確な位置を表３に示
す。GST部分及びPDZドメイン含有DNA部分間のDNAリンカー配列は極僅かであり、
上記のクローニング部位及び使用した方法に依存する。共配列であるGST-PDZ融
合蛋白質のアミノ酸配列は、GSTとPDZドメイン間のリンカー領域において異なっ
ている。各種クローニング部位／方法に対応する蛋白質リンカー配列を以下に示
す。リンカー配列（ベクターDNAがコードする）は太字であり、遺伝子由来配列
を含むPDZドメインはイタリックである。 １） GST-BamHI/BamHI-PDZドメインインサート Glu-Ile-PDZドメインインサート ２） GST-BamHI/BglII-PDZドメインインサート Glu-Ile-PDZドメインインサート ３） GST-EcoRI/EcoI-PDZドメインインサート Glu-IleーPro-Gly-Asn-PDZドメインインサート ４） GST-SmaI/SmaI-PDZドメインインサート Glu-Ile-Pro-PDZドメインインサート PDZコーディングPCR断片及び直鎖化pGEX-3Xベクターはエタノール沈殿され、1
0ulの標準的ライゲーション緩衝液に再懸濁された。ライゲーションはT4DNAリガ
ーゼを使用し、4-10時間、７℃で実施された。得られた構築体の幾つかは非常に
短いリンカー配列を含むこと、及び複数のPDZドメインをクローニングした場合
には構築体は個々のPDZドメイン間に位置する幾つかのDNAを含むことが理解され
るだろう。
【０１０９】 ライゲーション産物DH5α又はBL-21E.coli細菌株中に形質導入された。クロー
ンは、PCR及び配列分析によりクローン化PDZドメインを含むDNAの存在及びその
同一性に関し、及びグルタチオンS-トランスフェラーゼコーディングDNA部分と
の正確な融合についてスクリーニングされた。陽性クローンは小規模アッセイに
てGST/PDZドメイン融合蛋白質に関し試験され、そして発現されている場合には
引き続きそれらクローンをGST/PDZ融合蛋白質の大規模調整に備え増殖した。
【０１１０】 GST-PDZドメイン融合蛋白質は培地中へのIPTG添加により過剰発現され、精製
された。小規模及び大規模融合蛋白質発現法、ならびに精製法の詳細は“GST Ge
ne Fusion System”（第二版、校訂２；Pharmaciaより出版）に記載されている
。簡単に述べると、融合蛋白質構築体を有する細菌株（DH5α、BL21又はJM109）
を含む少培養体（3-5mls）をLB-培地中、37℃、適当な抗生物質選択を行いなが
ら（100ug/mlアンピシリン；a.k.a.LB-amp）一晩増殖した。一晩培養したものを
新しく調整されたLB-amp（典型的には250-500mls）に注ぎ込み培養体の光学密度
（OD）が0.5ないし0.9になるまで増殖した（約2.5時間）。IPTG（イソプロピル
ベータ-D-チオガラクトピラノシド）を最終濃度1.0mMまで加えGST融合蛋白質の
産生を誘導し、その後培養体を更に1.5-2.5時間培養した。細菌は遠心分離（450
0g）により集められ、緩衝液A-（50mM Tris, pH 8.0, 50mMデキストロース、1mM
EDTA、200uMフェニルメチルスルホニルフルオリド）に懸濁された。等量の緩衝
液A+（緩衝液A-、4mg/mlライソゾーム）が加えられ、氷上にて３分間インキュベ
ーションされ細菌を溶解した。等量の緩衝液B（10mM Tris, pH8.0, 50mM KCl, 1
mM EDTA, 0.5% Tween-20, 0.5% NP40(a.k.a.IGEPAL CA-630)、200uMフェニルメ
チルスルホニルフルオリド）が加えられ、更に20分間インキュベーションされた
。細菌細胞溶解体は遠心分離され（x20,000g）、上清は事前に1Xリン酸緩衝化食
塩水（PBS）に膨潤させておいた（再水和）グルタチオンセファロース4B（Pharm
acia、カタログ番号17-0765-01）に加えられた。上清-セファロースのスラーリ
はカラムに注ぎ込まれ、少なくともベッド容積の20倍の1×PBSで洗浄された。GS
T融合蛋白質は0.5-1.0mlの5mMグルタチオンを加えることでグルタチオンセファ
ロースより溶出され、別分画として集められた。分画の濃度はBioRad Protein A
ssay（カタログ番号500-0006）をメーカー指示書通りに用い決定された。最高濃
度の融合蛋白質を含むこれら分画をプールし、１×PBS/35%グリセロールに対し
透析された。融合蛋白質は“Sambrook”記載の通りのSDSゲル電気泳動（PAGE）
により、その大きさ及び質に関しアッセイされた。融合蛋白質の一部はマイナス
80℃及びマイナス20℃に保存された。
【０１１１】 6.2.2 候補PL蛋白質の同定及びペプチドの合成 幾つかの非造血細胞（例えば神経単位、上皮細胞）では、特定のPDZドメイン
がPDZ-結合蛋白質のC-末端残基により結合されていることが知られている。造血
及び上皮細胞で機能しているPL蛋白質を同定するため、細胞表面受容体蛋白質が
同定され、各蛋白質のc-末端に相当する配列を有するペプチドが合成された。表
４にこれら蛋白質が掲載されており、対応するC-末端配列及びGeneBank受付番号
が提供されている。“Clasp1”はWO00/20434号（2000年４月13日公開）に記載さ
れている。“Clasp2”及び“Clasp4”は共に2000年４月11日に提出の同時係属出
願USSN09/547276号（代理人整理番号20054-000200）及び60/196527号（代理人整
理番号20054-000400）に記載されている。
【０１１２】 規定配列（例えば指示蛋白質のカルボキシル末端に対応する）の合成ペプチド
は標準的な樹脂ベース法（米国特許第4,108,846号参照、及びCaruthersら、1980
、Nucleic Acids Res. Symp. Ser., 215-223; Hornら、1980、Nucelic Acids Re
s. Symp. Ser., 225-232; Robergeら、1995、Science 269; 202も参照）。ここ
に記載のアッセイに使用されたペプチドはFMOC（Guy及びFields、1997、Meth.En
z.289.67-83；Wellings及びAtherton、1997、Meth.Enz.289.44-67参照）により
調整された。幾つかの例では（例えば発明のA及びGアッセイでの使用に関し）、
ペプチドは触媒量の塩基と共に４倍過剰量のビオチンメチルエステルのジメチル
スルホオキシド液との反応によりアミノ末端にビオチンが標識される。ペプチド
は適当な酸化防止剤（例えばエタンジチオール）及び過剰の凍結乾燥溶媒存在下
にハロゲン化物含有酸（例えばトリフルオロ酢酸）を使用して樹脂から切り出さ
れる。
【０１１３】 凍結乾燥後、ペプチドは再溶解され逆相高性能液体クロマトグラフィー（HPLC
)により精製された。適当なHPLC溶媒系の一つは、水＋0.1%トリフルオロ酢酸の
ベース溶媒中のアセトニトリル＋0.1%トリフルオロ酢酸量を増加させながら5mL/
分でランニングするBydac C-18半調整的カラムを含む。HPLC精製後、ペプチドの
特性はMALDIカチオン-モードマススペクトロメトリーにより確認された。上記の
如く、例示のビオチン化ペプチドが表４に示されている。
【０１１４】 6.2.3 PDZ-PL相互作用の検出 免疫系細胞が多くのPDZ蛋白質及び同様の多くの候補PL蛋白質を含むという決
定より、これら蛋白質間の特異的PDZ-PL相互作用の特徴付けにはこれら相互作用
に関する信頼できる迅速アッセイが必要であることが発明者に明らかになった。
当分野既知の各種アッセイ様式を使用し、特定蛋白質と特異的に反応するリガン
ドを選択することができる。例えば固相ELISA免疫アッセイ、免疫沈降、Biacore
及びウエスタンブロットアッセイを利用し、PDZ-ドメインポリペプチドに特異的
に結合するペプチドを特定することができる。上記の如く、PDZ-PL相互作用を検
出するために相補完する２種類のアッセイが開発された。それぞれではPDZ-PL対
の一方の結合相手が固定化され、そして第２結合相手の結合能力が決定された。
上記これらアッセイを使用することで数時間に数百から数千の潜在的PDZ-リガン
ド相互作用をスクリーニングすることができる。即ち、これらアッセイを利用し
て造血細胞内の未だ新規であるPDZ-PL相互作用を特定することができる。更に、
それらを利用しPDZ-PL相互作用のアゴニストを特定することができる（下記参照
）。
【０１１５】 6.2.3.1“Aアッセイ”固定化PLペプチドを利用したPDZ-リガンド結合の検出 一面において発明は、アビジンコーティング表面にビオチン化候補PLペプチド
が固定化されているアッセイを提供する。そしてこの表面へのPDZ-ドメイン融合
蛋白質の結合が測定される。好適実施態様ではPDZ-ドメイン融合蛋白質はGST/PD
Zドメイン融合蛋白質であり、アッセイは次の様に実施される： （１）アビジンが表面、例えば蛋白質結合表面に結合される。実施態様の一つで
は、ウエル当たり20ng/mLのアビジン（Pierce)のカルシウム及びマグネシウムを
含まないリン酸緩衝化食塩水溶液、pH7.4（“PBS”、GibcoBRL)100uLを４℃、１
２時間添加することで、アビジンはポリスチレン製96ウエルプレート（例えばNu
cn Polysorb(カタログ番号475094）に結合される。次に100mL当たり2gの無プロ
テアーゼウシ血清アルブミン（“PBS/BSA）を含むPBSをウエル当たり200uL、４
℃、２時間加えてプレートを処理し非特異的反応をブロックする。次にプレート
を各ウエル当たり200uLのPBSを加え、プレート内容物を廃棄容器に廃棄し、プレ
ートを乾燥表面に軽く打ち付けることを繰り返し、３回洗浄する。 （２）ビオチン化PLペプチド（又は候補PLペプチド、例えば表４参照）は、ウエ
ル当たり40uLの0.4uMペプチドのPBS/BSA液を30分間、４℃にて加えることでプレ
ートのウエル表面に固定化される。通常各種ペプチドは、複数回の測定（例えば
二重測定、及び更に異なる3ST/PDZ-ドメイン融合蛋白質及びGST単独の陰性コン
トロールを用いた測定）が可能となるよう、少なくとも８個のウエルに加えられ
、更にペプチド固定されない追加の陰性コントロールウエルも調整される。表面
上へPLペプチドを固定化した後、プレートはPBSにて３回洗浄される。 （３）GST/PDZドメイン融合蛋白質（上記の如くに調整された）は、５ug/mLのGS
T/PDZドメイン融合蛋白質を含むPBS/BSA溶液を２時間、４℃にて各ウエル当たり
50uL加えることで表面と反応させられる。陰性コントロールとして、各固定化ペ
プチドについてGSTのみ（即ち融合蛋白質ではない）が特定ウエル、一般には少
なくとも２ウエル（即ち二重測定）に加えられる。２時間の反応後、プレートは
PBSにて３回洗浄され未結合の融合蛋白質が除かれる。 （４）アビジンビオチン化ペプチド表面へのGST/PDZドメイン融合蛋白質の結合
は、当分野既知の各種方法及び検出装置を使い検出できる。実施態様の一つでは
、ウエル当たり50uLの抗GST抗体のPBS/BSA液（例えば2.5ug/mLのポリクローナル
ヤギ抗GST抗体、Pierce）がプレートに加えられ、20分間、４℃にて反応させる
。プレートはPBSにて３回洗浄され、次に二次検出可能標識化抗体が加えられる
。実施態様の一つでは、ウエル当たり50uLの2.5ug/mLの西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ（HRP)-標識化ポリクローナルウサギ抗ヤギ免疫グロブリン抗体がプレート
に加えられ、20分間、４℃にて反応させる。プレートを0.2%のTween20を含む50m
M Tris、pH8.0にて３回洗浄し、ウエル当たり100uLのHRP-基質液（TMP、Dako)を
20分間、室温（RT)にて加え、発色さる。HRPとその基質との反応はウエル当たり
100uLの1M硫酸を加えることで停止され、プレートの各ウエルの光学密度（O.D)
を450nmにて測定した。 （５）PLペプチド及びPDZドメインポリペプチドの特異的結合は、PLペプチド及
びPDZドメインポリペプチドが組合わさったウエルからのシグナルとバックグラ
ンドシグナルとを比較することで検出される。バックグランドシグナルは陰性コ
ントロールに見いだされるシグナルである。典型的には特異的又は選択的反応は
バックグランドシグナルの少なくとも２倍、より典型的にはバックグランドの５
倍より高く、最も典型的にはバックグランドシグナルの10又はそれ以上の倍数で
ある。更に、統計有意の反応は少なくとも２標準誤差、より典型的には４標準誤
差、最も典型的には６又はそれ以上の標準誤差によりシグナルとバックグランド
シグナルとが区別される反応の多重測定を含む。従って、シグナルの反復測定と
バックグラントの反復測定とを比較する統計試験（例えばT-試験）のｐ-値は0.0
5未満、より典型的にはp-値は0.01未満、最も典型的にはp-値は0.001未満であろ
う。
【０１１６】 上記の如く、“A”アッセイの実施態様の一つでは、GST/PDZ-ドメイン融合蛋
白質のPLペプチドに暴露されていないアビジン表面への結合からのシグナルは好
適な陰性コントロール（時に“B“と称される）。PLペプチドに暴露され（即ち
被覆された）、アビジンにてコーティングされた表面へのGSTポリペプチド単独
の結合に由来するシグナルは第２の好適陰性コントロール（時に”B“と称され
る）である。全ての測定は複数回実施されるため（即ち最低２回）、結合の決定
には複数回測定の算術的平均（または平均値とも言う）が使用され、結合測定の
誤差確率の決定には平均の標準誤差が使用される。N回測定の平均の標準誤差は
以下の平方根に等しい：各測定値とその平均値との差の平方の合計を(N)と(N-1)
の積で除する。即ち実施態様の一つでは、PDZ蛋白質のプレート結合PLペプチド
への特異的結合は、特定のPL-PDZの組合せに関する平均シグナル（”平均S“）
及びシグナルの標準誤差（”SE“）と、平均B1及び／又は平均B2とを比較するこ
とで決定される。表２では、結合は（１）平均Sが平均B1の少なくとも２倍であ
り、B2の少なくとも２倍であり、そして（２）平均Sが平均B1及び平均B2の両方
に比べ少なくとも６標準誤差（６SE）である場合に、特異的であるとされる（マ
トリックスでは”A“と記載される）。更に表２にまとめた実験では追加の判断
基準を加えることで、上記特異的とされた相互作用が試験対象のPDZ融合蛋白質
とPLペプチドとを組み合わせることで各通常バックグランドより高いシグナルを
生じる傾向が生まれた結果では無いこと確認した。この判断基準は、（３）平均
Sは平均B1と平均B2の積の少なくとも20倍であるというものである。20倍という
因数は、B１及びB2の少なくとも一方が0.1O.D単位より小さいことを意味してお
り、従って平均B1及び平均B2の積の20倍は一般に平均１の２倍と平均B2の２倍よ
り小さくなり、判断基準（３）の厳密性を判断基準（１）より低くしている。平
均B1及び平均B2が共に0.1O.D単位（即ち試験した特定PDZ融合蛋白質及びPLペプ
チドが通常のバックグランドより高い値を示す傾向がある）より大きい極僅かな
例でのみ、判断基準（３）は判断基準（１）に比べより厳密となる。
【０１１７】
【表２１】
【０１１８】 6.2.3.2 “Gアッセイ”−固定化PDZ-ドメイン融合蛋白質を用いたPDZ-リガン ド結合の検出 一面では発明はGST/PDZドメイン融合蛋白質が表面に固定されているアッセイ
（“G”アッセイ）を提供する。ここではこの表面への標識化PLペプチド（表４
に掲載）の結合が測定される。好適実施態様では、アッセイは次の様に実施され
る： （１）PDZ-ドメインポリペプチドは表面、例えば蛋白質結合表面に結合される。
好適実施態様では、１又はそれ以上のPDZドメインを含むGST/PDZドメイン融合蛋
白質がポリスチレン製96ウエルプレートに結合される。GST/PDZドメイン融合蛋
白質は当業者既知の各種標準的方法によりプレートに結合させることができるが
、プレートへの融合蛋白質の結合の工程がPDZドメインのリガンド結合特性を買
えない様に注意しなければならない。実施態様の一つでは、GST/PDZドメイン融
合蛋白質は96ウエルプレート上にコーティングされた抗-GST抗体を介して結合さ
れる。プレートへの適当な結合は次の様にして達成することができる： ａ．ウエル当たり100uLの5ug/mLヤギ抗-GSTポリクローナル抗体（Pierce)PB
S溶液を、ポリスチレン製96ウエルプレート（例えばNunc Polysorb)に４℃で12
時間加える。
【０１１９】 ｂ．ウエル当たり200uLのPBS/BSAを２時間、４℃で加えプレートをブロック
する。
【０１２０】 ｃ．プレートを３回、PBSにて洗浄する。
【０１２１】 ｄ．ウエル当たり50uLの5ug/mLのGST/PDZドメイン融合蛋白質）又は陰性コ
ントロールとしてGSTポリペプチドのみ（即ち融合蛋白質でない）のPBS/BSA溶液
を２時間、４℃にてプレートに加える。
【０１２２】 ｅ．プレートを再度PBSで３回洗浄する。
【０１２３】 （２） （２）ウエル当たり50uLの20uMのビオチン化ペプチドPBS/BSA液を10分間、４℃
にて加え、更に25℃にて20分間インキュベーションすることでビオチン化PLペプ
チド（又は候補PLペプチド、例えば表４に示される様な）を表面と反応させる。
プレートはPBSにて３回洗浄される。 （３）GST/PDZ融合蛋白質表面へのビオチン化ペプチドの結合は、当分野既知の
各種方法及び検出装置を使い検出できる。実施態様の一つでは、ウエル当たり10
0uLのBSA/PBSに溶解された0.5ug/mLのストレプトアビジン-西洋ワサビ（HRP)標
識PSA/PBS抗GST抗体が加えられ、４℃、20分間反応させる。続いてプレートは0.
2%のTween20を含む50mM Tris、pH8.0にて５回洗浄され、ウエル当たり100uLのHR
P-基質液（TMP、Dako)が20分間、室温（RT)にて加えられ発色する。HRPとその基
質との反応はウエル当たり100uLの1M硫酸を加えることで停止され、プレートの
各ウエルの光学密度（O.D)を450nmにて測定する。 （４）PLペプチド及びPDZドメインポリペプチドの特異的結合は、PLペプチド及
びPDZドメインポリペプチドが組合わされたウエルからのシグナルとバックグラ
ンドシグナルとを比較することで検出される。バックグランドシグナルは陰性コ
ントロールに見いだされるシグナルである。典型的には特異的又は選択的反応は
バックグランドシグナルの少なくとも２倍、より典型的にはバックグランドの５
倍より高く、最も典型的にはバックグランドシグナルの10又はそれ以上である。
更に、統計有意の反応は少なくとも２標準誤差、より典型的には４標準誤差、最
も典型的には６又はそれ以上の標準誤差によりシグナルとバックグランドシグナ
ルとが区別される反応の多重測定を含む。従って、シグナルの反復測定とバック
グラントの反復測定とを比較する統計試験（例えばT-試験）のｐ-値は0.05未満
、より典型的にはp-値は0.01未満、最も典型的にはp-値は0.001未満であろう。
上記の如く“G”アッセイの実施態様の一つでは、固定化（表面結合）された単
独GSTポリペプチドに対する上記PLペプチドの結合からのシグナルが好適な陰性
コントロール（時に“B1“と称される）である。全ての測定は複数回実施される
ため（即ち最低２回）、結合の決定には複数回測定の算術平均（または平均値と
も言う）が使用され、結合測定の誤差確率の決定には平均の標準誤差が使用され
る。N快速艇の平均の標準誤差は以下の平方根に等しい：各測定値とその平均値
との差の平方の合計を(N)と(N-1)の積で除する。即ち実施態様の一つでは、PDZ
蛋白質のプレート結合ペプチドへの特異的結合は、特定のPL-PDZの組合せの平均
シグナル（”平均S“）及びシグナルの標準誤差（”SE“）と、平均B1とを比較
することで決定される。表２にまとめられた実験では、結合は（１）平均Sが平
均B1の少なくとも２倍であり、そして（２）平均Sが平均B1に比べ少なくとも６
標準誤差（６SE）である場合に、特異的であるとされる。例示の”G“アッセイ
の結果は図1A-1Dに示されている。
【０１２４】 6.2.4 アッセイの変型 上記の如く、上記アッセイ中の多くの段階を変えることができること、例えば
PL及びPDZ-含有蛋白質に各種基質を使用することができること；融合蛋白質を含
む異なる型のPDZを使用できること；PDZ/PL相互作用検出に異なる標識体を使用
できること；及び異なる検出法が利用できることが理解されるだろう。
【０１２５】 PDZ-PL検出アッセイはPL及びPDZ-含有蛋白質を結合する各種表面を利用できる
。例えば表面は、それへの“PL蛋白質又はPDZ-含有蛋白質の接着を最適化する素
材（例えばポリスチレン）より形成された”アッセイプレート“でよい。一般に
アッセイプレートの個々のウエルは高い面積対容積比を有しており、従って好適
形状は平底ウエル（アッセイの蛋白質が接着される場所）である。その他表面に
は、ポリスチレン製又はガラス製ビーズ、ポリスチレン製又はガラス製スライド
等がふくまれるが、これらに限定されない。
【０１２６】 例えばアッセイプレートは“マイクロタイター”プレートである。用語“マイ
クロタイター”プレートはここで使用する場合には、複数ウエル型アッセイプレ
ート、例えば約30ないし200個の個別ウエル、通常は96個のウエルを有するアッ
セイプレートを意味する。あるいは、高密度アレーもよく使用され、マイクロタ
イタープレートの個別ウエルは最大約250ulの容積を保持するだろう。好都合に
は、アッセイプレートは96ウエル型ポリスチレンプレート（Becton Dickinson L
abware, Lincoln Park, N.J.より発売されている様な）であり、自動化及び大量
スクリーニングが可能である。その他表面にはNuncMatrisorp、Inter Med, Denm
arkより販売されている様なポリスチレン製マイクロタイターELISAプレートが含
まれる。多くはその中に懸濁された水性サンプルを含む緩衝液約50ulないし300u
l、より好ましくは100ulないし200ulがアッセイプレートの各ウエルに加えられ
るだろう。
【０１２７】 発明の検出可能標識体は分子（上記の様な）に直接又は間接に標識される検出
可能な化合物又は組成体であろう。標識体はそれ自体により（例えば放射性同位
元素標識体又は蛍光標識体）検出可能であるか、又は検出可能な酵素標識体の例
では基質化合物又は組成体の化学変化を触媒することができる。好適標識体は非
放射性の色試薬の色変化を触媒する酵素標識体である。時に標識体は抗体に間接
的に標識される。
【０１２８】 当業者は間接標識に関する様々な技術を知っている。例えば抗体はビオチンと
標識でき、上記標識体のいずれかの分類をアビジンに標識する、またはその逆を
行うことができる（上記“Ａ”及び“G”アッセイ参照）。ビオチンはアビジン
に選択的に結合し、従って標識体は抗体と間接的に結合できる。ビオチン-アビ
ジン結合及び同様アッセイを含む技術の概要についてはAusubel、上記を参照。
あるいは、標識体と抗体との間接的結合を達成するために、抗体は小ハプテン（
例えばジゴキシン）で標識され、そして上記標識体とは異なるタイプの標識体が
抗ハプテン抗体で標識される（例えば抗ジゴキシン抗体）。こうして抗体による
標識体の間接的標識が達成できる。
【０１２９】 変化型アッセイには各種洗浄段階も含むことができる。“洗浄”とは、固相か
ら非結合物質（例えば非接着細胞、非接着捕捉体、非結合リガンド、受容体、受
容体構築物、細胞溶解物、又はHRP抗体）を除く様に固相を水性液（通常は緩衝
液又は細胞培地）にさらすことを意味する。バックグランドノイズを下げるため
、洗浄液中に界面活性剤（例えばTritonX）を含めると好都合である。一般には
、水性洗浄液は洗浄後アッセイプレートのウエルよりデカンテーションされる。
好都合には、洗浄は自動洗浄装置を使用し実施できる。時に複数洗浄段階（例え
ば約１ないし10洗浄段階）が必要とされることがある。
【０１３０】 各種緩衝液もPDZ-PLアッセイに使用できる。例えば各種ブロッキング緩衝液を
利用してアッセイバックグランドを下げることができる。用語“ブロッキング緩
衝液”は、基質露出面に結合でき、PL又はPDZ-含有蛋白質では被覆されないブロ
ッキング化合物を少なくとも１種類含む水性のｐH緩衝化液を表す。ブロッキン
グ化合物は通常ウシ血清アルブミン（BSA)、ゼラチン、カゼイン、又は粉乳の様
な蛋白質であり、アッセイ中のいずれの試薬とも交叉反応しない。ブロック緩衝
液は通常約７ないし7.5の間のpHを備えており、好適緩衝作用物質にはリン酸及
びTRISが含まれる。
【０１３１】 各種酵素-基質の組合せもPDZ-PL相互作用の検出に利用できる。酵素-基質の組
合せの例には、例えば： （ｉ）基質として過酸化水素を利用し、過酸化水素が色素前駆体（例えばオルト
フェニレンジアミン［OPD］又は3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン塩酸塩［T
MB］）を酸化する西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRPO）（上記の様な）、 （ｉｉ）パラ-ニトロフェニルリン酸塩を発色基質として利用するアルカリホス
ファターゼ（AP）、 （ｉｉｉ）発色基質（例えばp-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシダーゼ）又は蛍
光原基質4-メチルウンベリフェリル-β-D-ガラクトシダーゼを利用するβ-D-ガ
ラクトシダーゼ（βD-Gal）を含む。
【０１３２】 その他多くの酵素-基質組合せが当業者に利用可能である。これらの一般的レ
ビューについては、共に参照されここに取り込まれている米国特許第4,275,149
号及び第4,318,980号を参照。
【０１３３】 更に、便宜上ではあるが本発明は１次的にはPDZ-PL相互作用のアンタゴニスト
を表しているが、PDZ-PL相互作用のアゴニストもここに開示の方法、又はその容
易に明らかになる変型により同定することができることが理解されるだろう。
【０１３４】 6.2.5 PDL-PL相互作用アッセイの結果 上記の表２はここに記載の“A”及び“G”アッセイを利用し特異的結合が検出
されたアッセイの結果を示している。表の上２行はGST-PDZ融合蛋白質（表３参
照）に使用したPDZドメインの源を表している。第１縦列にはC-末端ペプチド配
列が由来した細胞表面蛋白質が表示されており、第２縦列（“コード”）にはア
ッセイに使用されたペプチドが表示されている（表４参照）。第３縦列“Seq”
には、細胞表面蛋白質及びペプチドの４個C末端残基配列が示されている。マト
リックス中では、“A”は“A”アッセイ中に検出された特異的結合を示している
。“G”は“G”アッセイ中に検出された特異的結合を示している。星印（*）はP
DZ蛋白質及び細胞表面蛋白質（またはそれぞれのサブドメイン）間の対相互作用
が他者により記載されていることを示している。
【０１３５】 6.2.5.1 新規PLモチーフ 上記の如く、表２はPDZ蛋白質及び候補PLペプチド間の結合を検出するアッセ
イ（“PRISM MATRIX”と称する）の結果を示している。特異的PDZ-PL相互作用の
数はMATRIX及び主要アミノ酸より特定され、PDZ結合に重要位置（“PLモチーフ
”）はこれら結果より演繹される。MATRIXはPDZ-PL結合の組合せを包括的に分類
するのに役立つばかりでなく、アッセイは更に新規PL蛋白質の迅速発見及び特徴
付けを支援し、PLモチーフはPL-PDZ相互作用阻害剤の合理的な薬剤設計及び合成
にも役立つ。
【０１３６】 他研究者らは特定のPLモチーフがPDZ結合に重要であること、例えばC末端モチ
ーフS/T-X-V/I/L（DLG1に関し）及びMPP1に関するY/F-Y/F-I/L/Fを報告している
（Doyleら、1996、Cell 85, 1067；Songyangら、1997、Science 275, 73参照）
。しかし報告されたモチーフは十分に特異的でなく（即ち数多くの蛋白質がこれ
ら判断基準に合致するものの実際のPDZリガンドではない）、少数のPDZ蛋白質の
みをカバーするに過ぎなかった（約10種類）。PRISM MATRIXは、それが特異的PD
Z結合をもたらす、又はもたらさないアミノ酸配列を正確に決定できることから
、リガンド特異性の決定及びPDZ蛋白質のリガンド結合モチーフの演繹に利用で
きる。更に、アッセイは新規PDZドメイン結合モチーフ（即ちPLモチーフ）：CD6
のC-末端配列、ISAA；CD49EのC-末端配列、TSDA；CD49FのC-末端配列；TSDA；Cl
asp-1のC-末端配列、TSDA；CLASP-4のC-末端配列、YAEV；CD44のC-末端配列、KI
GV；IL5RのC-末端配列、DSVF；BLR-1のC-末端配列LTTFの重要性を表している。
これら新規PL配列を特定することで新規PLモチーフを定義できる（下表5A参照）
。これら新規モチーフが規定される特異性は、MATRIXが陽性結果（即ち特異的結
合相互作用を生じるPDZ-PLの組合せ）及び陰性結果（即ち特異的結合を生じない
PDZ-PLの組合せ）の両方を報告するという事実によって高められている。例えば
、CD6のC-末端配列SAA及びCD49EのC-末端配列SDAはPDZ-ドメインポリペプチド41
.8に結合するが、CD166の関連C-末端配列TEA及びCD148のC-末端配列YIAは結合し
ない。このことから-2位置にセリンを持ちアラニンで終止するポリペプチドの新
規PLモチーフ（下記モチーフ１）が特定され、-2位置がスレオニン及びチロシン
であるポリペプチドが排除された。従ってものモチーフは従来特定された多くの
モチーフよりより特異的である。その他の新規モチーフは表5Aに記載されている
。
【０１３７】
【表２２】
【０１３８】 6.2.5.2 結合クラスター 表２はPDZ/GST融合蛋白質及びPLペプチドリガンドが共に相互に構造的類似分
子になるような順番に配置されている。表２の作製及び本表を作成するために行
った実験に於いて、各GST-PDZ融合蛋白質のPDZドメインについてCLUSTAL複数配
列アラインメントソフトウエアーパッケージを利用してアミノ酸配列類似性に関
し等級付けした。最大配列類似性を持つ蛋白質はマトリックス無いにて相互に最
も近く配置された。PLペプチドリガンドについてはさらにアミノ酸類似性に基き
順番付けしたが、PDZ結合に関し重要であると報告された残基に加重した（Doyle
ら、1996、Cell 85, 1067）。具体的には、ペプチドはまず最C-末端残基（０位
置）に基づき以下のアミノ酸の順番に並べた：G、A、C、S、T、N、Q、D、E、H、
K、R、V、I、L、M、P、F、Y、W。同一C-末端を持つペプチドの場合には、ペプチ
ド結合に関し２番目に重要な残基、-2位置の残基について上記に同一の順序付け
方法を適用し、更に-3位置、-1位置と続ける。（別方法では蛋白質を並べる場合
に、リガンド結合にとって重要であることが既知である残基に追加加重する様に
GST-PDZ融合体も並べることができる）。
【０１３９】 表１のある領域に重要な結合相互作用が高密度に集まることは、特定のリガン
ド構造が特定のPDZドメインファミリーに結合する傾向にあることを示している
。結果は、マトリックス中の幾つかのクラスターに多くの有意な結合相互作用が
集まり、その他の領域には殆ど有意な結合相互作用がないことから、類似構造を
持つPDZドメインが類似結合相互作用により類似構造リガンドと結合することを
示している。これらの結果は、異なるPDZ蛋白質とそれらリガンド間に幾つかの
構造相関性があることを示している。これら構造相関性を理解することは、特異
的PDZ蛋白質にとって有望なリガンドのデータベースをスキャンし、これら新規
相互作用の阻害剤設計の迅速化及びそれら阻害剤の副作用プロフィールの推測に
利用できる。
【０１４０】 クラスターの最も顕著な例はマトリックスの縦列1-5に見られる（CASK、MPP1
、DLG1、PSD95及びNeDLG由来のPDZドメイン）。我々のアッセイでは、CASKは試
験したリガンドのうちの１種類、ニューレクシンとのみ有意に結合した（この相
互作用は従来神経細胞に同定されていた）。使用した順番付けシステムではCASK
に最も近いMPP1はニューレクシンを含む５種類のリガンドのセットに結合した。
特定されたMPP1リガンドは全て構造的に類似しており、バリン（V）で終止し、
電荷アミノ酸（E又はK〜をC-末端から-3の位置に有していた（C-末端モチーフ；
E/K-X-X-V）。
【０１４１】 特定された５種類のMPP1リガンドの内４種類は、CASK及びMPP1に次に最も類似
している蛋白質DLG1とも結合できる。DLG1はその他２種類の蛋白質、PSD95及びN
eDLGとも良く相関している。これら３種類の蛋白質はそれぞれ従来報告のモチー
フS/T/Y-X-V/I/Lで終止している（Songyangら、1997、Science 275, 73）。興味
深いことに、末端リガンド残基がバリンの場合には、従来未特定の-2位置の他残
基は結合に関し互換的であり、C-末端配列AEV及びELVと共に有意な結合を生じる
。これは従来未確認であったPDZリガンド結合に於ける柔軟性を反映する一方で
、我々のアッセイにて検出された相互作用の特異性は重要でない結合事象を含む
縦列1-5の上部及び下部の広い領域に反映されている。これらの領域は、V/I/L以
外の残基で終止する潜在的リガンドはCASK、MPP1、DLG1、PSD95又はNeDLGに有意
に結合しないことを表している。
【０１４２】 （MPP1に関しては、MPP1の既知リガンドである糖蛋白質C、Marfatiaら、1997
、J.Biol.Chem, 272, 24191は我々の試験ではMPPIに有意に結合しなかったが、
バリンによく似たイソロイシンで終止し、C-末端の-3位置に電荷残基を有してい
る）マトリックス上にあるより小さなクラスターもまた特定PDZドメインのリガ
ンド特異性に関する有益な情報を提供する。例えば５種類のリガンドは、従来研
究されていないPDZドメイン含有蛋白質である41.8kD蛋白質似たいし、“G”及び
“A”アッセイの両方で有意に結合する。
【０１４３】 これらリガンドは全てA、V、I又はLで終止しており、５種類の内４種類が-2位
置にセリンを持ち、このPDZドメインに関するC-末端リガンドモチーフはS-XA/V/
I/Lである。どうようにKIAA0561に特異的に結合する３種類のリガンドの内２種
類が式中のX*が非芳香族アミノ酸であるC-末端モチーフX*-S/T-D/E-V/I/Lに合致
する。興味深いことに、これらリガンドの一つはKIAA0561*に最も関連するTAX2
にも結合する。同様にprIL16と結合する２種類のリガンドは-3位置に電荷アミノ
酸を、-2位置には疎水性アミノ酸を、そして末端位置にはバリンを有している。
PDZドメインのリガンド特異性を規定する最後の興味深い例はPTN-4である。PTN-
4に有意に結合する２種類のリガンドはそれらのC-末端２残基に関しては密に相
関していないが、共にC-末端モチーフD/E-S-X-V/I/L/F/Yに合致する。特定のPDZ
蛋白質のリガンド特異性を特徴付けるこれらモチーフは表5Bにまとめられている
。これらモチーフにより、これら特定PDZ蛋白質に結合する新規リガンド（PL蛋
白質）に関するデータベース検索が可能になる。これらPDZ蛋白質に結合するPL
蛋白質に関する知識により、下記ここに開示の方法を利用し、これら相互作用の
阻害剤を設計することができる。更に、特定PDZ蛋白質に結合するPL蛋白質のセ
ットに関する知識を利用することで、このPDZを標的とする化合物の有用性及び
副作用を推測することができる。
【０１４４】
【表２３】
【０１４５】 6.3 PDZおよびリガンドの結合親和性 本発明の「Ａ」および「Ｇ」検定を用いてPDZリガンドペプチドとPDZドメイン
ポリペプチドの結合の「見掛けの親和性」を決めることができる。見掛けの親和
性は、第二の分子の結合（例えば、リガンドと受容体の結合）を飽和するのに必
要なある分子の濃度に基づいて決められる。PDZ−リガンド結合の見掛けの親和
性の定量化のために特に有用な二つのアプローチを下記に提供する。 アプローチ１： （1）GST／PDZ融合タンパク質ならびにネガティブ対照としてのGST単独を、「
Ｇ」検定のために上記の記載と同様に、表面（例えば、96ウェルプレート）と結
合させ、その表面をブロックし、洗浄する。
【０１４６】 （2）ビオチニル化したPLペプチドの溶液（例えば、表４に示すような）を、
ＰＢＳ／ＢＳＡ中の濃度を増加させて（例えば、0.1 uM、0.33 uM、1 uM、3.3 u
M、10 uM、33 uM、および100 uM）表面に1ウェル当たり50 uL加える。一実施形
態においては、PLペプチドを結合したGST／PDZ融合タンパク質（ならびにGST単
独のネガティブ対照）と４℃で１０分間、続いて２５℃で２０分間反応させる。
プレートを氷で冷やしたＰＢＳで３回洗浄して結合していない標識されたペプチ
ドを除去する。
【０１４７】 （3）PLペプチドと固定化したPDZドメインのポリペプチドの結合を、「Ｇ」検
定のために上記の記載と同様に検出する。
【０１４８】 （4）ペプチドの各濃度に対する正味の結合信号は、ペプチドのGST／PDZ融合
タンパク質との結合からペプチドのGST単独との結合を差し引くことによって決
められる。次いで正味の結合信号を、リガンド濃度の関数としてプロットし、そ
のプロットを下記の式に当てはめる（例えば、Kaleidagraphのソフトウェアパッ
ケージの曲線当てはめ用アルゴリズムを用いて）。下式で、「信号〔リガンド〕 」はPLペプチド濃度「〔リガンド〕」における結合信号であり、「Kd」は結合事
象の見掛けの親和性であり、また「飽和結合度」は実験データに対する適合の最
適化のための曲線当てはめ用アルゴリズムによって決まる定数である。
【０１４９】
【数１】
【０１５０】 上式を高い信頼性で適用するためには、実験的にうまく試験された最高ペプチ
ドリガンド濃度が、計算上のKdよりも大きいかまたは少なくともほぼ同じである
ことが必要である（すなわち、最大測定結合度は計算上の飽和結合度とほぼ同じ
であるべきである）。上記の基準を満たすことが困難であることが判明した場合
には別のアプローチ（下記）を用いることができる。
【０１５１】 アプローチ１を用いた場合に得られる結果を図２Ａおよび図２Ｂに例示する。
図２は、ビオチニル化したCLASP-2（図２Ａ）またはFas（図２Ｂ）の様々な濃度
を示す。Ｃ末端のペプチドを、固定化した（プレートと結合した）GSTポリペプ
チドまたはGDT／PDZ融合タンパク質（GST／DLG1、GST／NeDLG、およびGDT／PSD9
5）と複製中に反応させた。信号を正規化し、プロットし、飽和結合曲線に当て
はめた結果、DLG1−CLASP-2相互作用に対しては見掛けの親和性21uM、NeDLG−CL
ASP-2相互作用に対しては見掛けの親和性7.5uM、PSD95−CLASP-2相互作用に対し
ては見掛けの親和性45uM、またDLG1−Fas相互作用に対しては見掛けの親和性54u
M、NeDLG−Fas相互作用に対しては見掛けの親和性54uM、PSD95−Fas相互作用に
対しては見掛けの親和性85uMが得られた。 アプローチ２： （1）PDZドメインのポリペプチド濃度を固定し、標識したPLペプチド（例えば
、ビオチンまたはフルオレセインで標識する。代表的なペプチドのアミノ酸配列
については表４を参照されたい）の濃度を増加して混合し、溶液にして反応させ
た。一実施形態において好ましいペプチド濃度は0.1uM、1uM、10uM、100uM、お
よび1mMである。様々な実施形態における適切な反応時間は、温度４℃から３７
℃の範囲で１０分から２日の範囲にある。幾つかの実施形態においてはその同一
の反応を、対照として非PDZドメイン含有タンパク質を用いて行なうこともでき
る（例えば、PDZドメインのポリペプチドが融合タンパク質の場合、その融合の
相手を用いることができる）。
【０１５２】 （2）PDZ−リガンド複合体は、当業界で周知の様々な方法を用いて結合してい
ない標識されたペプチドから分離することができる。例えば複合体は、高性能サ
イズ排除クロマトグラフィ（ＨＰＳＥＣ、ゲル濾過）（Rabinowitz等のImmunity
9:699 (1998)）、アフィニティクロマトグラフィ（例えば、グルタチオンセフ
ァロースビーズを用いて）、および親和吸収（例えば、上記に記載のように抗GS
T被覆プレートと結合させることにより）を用いて分離することができる。
【０１５３】 （3）PDZ−リガンド複合体は、当業者には周知の様々な方法および検出器を用
いてペプチドリガンド上の標識の存在に基づいて検出される。例えば、標識がフ
レオレセインであり、分離がＨＰＳＥＣを用いて達成される場合、インライン型
フレオレセイン検出器を用いることができる。結合はまた、Ｇ検定用の上記の記
載と同様に検出することもできる。
【０１５４】 （4）PTZ−リガンド結合信号をリガンドの濃度の関数としてプロットし、その
プロットを下記の式に当てはめる（例えば、Kaleidagraphのソフトウェアパッケ
ージの曲線当てはめ用アルゴリズムを用いて）。下式で、「信号〔リガンド〕」
はPLペプチド濃度「〔リガンド〕」における結合信号であり、「Kd」は結合事象
の見掛けの親和性であり、また「飽和結合度」は実験データに対する適合の最適
化のための曲線当てはめ用アルゴリズムによって決まる定数である。
【０１５５】
【数２】
【０１５６】 PTZドメインポリペプチドに対する標識されたペプチドリガンドの結合親和性
の測定は、この相互作用の親和性（すなわち見掛けの親和性）の知識が、よく知
られている効力を有する相互作用インヒビターの合理的設計を可能にするので役
に立つ（実施例２を参照されたい）。阻害におけるインヒビターの効力は、PDZ
ドメインに対する標識されたペプチドリガンドの結合の見掛けの親和性に類似し
ている（すなわち、その１桁の大きさ以内にある）はずである。
【０１５７】 6.4 新規なPDZドメイン結合部分を同定するための、またPDZタンパク質−PL
タンパク質結合のインヒビターを同定するための検定 主にPDZドメインのポリペプチドとPLタンパク質の間の相互作用の同定という
観点から上記に記述したが、上記記載の検定法およびその他の検定法もまた、そ
の他の分子（例えば、ペプチド模倣物、小分子など）とPDZドメインの配列の結
合を同定するために用いることができる。例えば、本明細書に開示した検定法を
用いて化合物の組合せまたは別のライブラリーをスクリーニングすることができ
る。ライブラリーのスクリーニングは、様々な一般に知られている方法のいずれ
かによって達成することができる。例えば、ペプチドのライブラリーについて開
示されている下記の参考資料、すなわちParmleyおよびSmithの論文Adv. Exp. Me
d. Biol. 251:215~218 (1989)、ScottおよびSmithの論文Science 249:386~390 (
1990)、Fowlkes等の論文BioTechniques 13:422~427 (1992)、Oldenburg等の論文
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5393~5397 (1992)、Yu等の論文Cell 76:933~94
5 (1994)、Staudt等の論文Science 241:577~580 (1988)、Bock等の論文Nature 3
55:564~566 (1992)、Tuerk等の論文Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6988~6992
(1992)、Ellington等の論文Nature 355:850~852 (1992)、ladner他の米国特許第
5,096,815号、第5,223,409号、および第5,198,346号、RebarおよびPaboの論文Sc
ience 263:671~673 (1993)、ならびに国際特許公開第94/18318号を参照されたい
。
【０１５８】 ある特殊な実施形態においてスクリーニングは、ライブラリーのメンバーを固
形の支持体上に固定した造血細胞のPDZドメインのポリペプチドと接触させ、タ
ンパク質と結合するこれらライブラリーメンバーを収集することによって行なう
ことができる（例えば、上記で「Ｇ」検定において記述したように）。「パンニ
ング」技法と呼ばれるこのようなスクリーニング法の例は、ParmleyおよびSmith
の論文Gene 73:305~318 (1988)、Fowlkes等の論文BioTechniques 13:422~427 (1
992)、国際特許公開第94/18318号、および本明細書で先に引用した参考資料中に
例として記載されている。
【０１５９】 別の実施形態においては、酵母中で相互作用するタンパク質を選別するために
二つのハイブリッドシステム（FieldsおよびSongの論文Nature 340:245~246 (19
89)、Chien等の論文Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9578~9582 (1991)）を用い
てPDZドメインを含有するタンパク質と特異的に結合する分子を同定することが
できる。その上、同定された分子はさらにトランスメンブレン受容体のPDZドメ
インとの相互作用を阻害する能力が試験される。
【０１６０】 本発明の一態様においては、PDZタンパク質とPLタンパク質の間の相互作用の
アンタゴニストが同定される。一実施形態において、上記に記載した「Ａ」検定
の修正形態を用いてアンタゴニストを同定する。一実施形態において、上記に記
載した「Ｇ」検定の修正形態を用いてアンタゴニストを同定する。
【０１６１】 一実施形態においては、スクリーニング検定を用いて造血細胞中のPDZドメイ
ンと特異的に結合する分子を検出する。このような分子はPDZタンパク質が仲介
する細胞機能（例えば、細胞の活性化、例えばＴ細胞の活性化；小胞輸送；サイ
トカインの放出；細胞増殖因子；転写変化；サイトスケレチン配列；細胞運動；
化学走性など）のアゴニストまたはアンタゴニストとして有用である。一実施形
態においてこのような検定は、薬物開発用の白血球活性化インヒビターをスクリ
ーニングするために行なわれる。こうして本発明は、造血細胞中のPDZドメイン
含有タンパク質と特異的に結合する分子を検出ための検定法を提供する。例えば
、PDZドメインをコード化する核酸を発現する組換え細胞を用いてこれら検定でP
DZドメインを産生し、そのドメインと結合する分子をスクリーニングすることが
できる。分子を結合に導く条件下でPDZドメイン（またはその断片）と接触させ
、次いでそのようなドメインと特異的に結合する分子を同定する。前記を実施す
るために用いることができる方法は、当業界では一般に知られている。
【０１６２】 例として、ランダムもしくは組合せペプチドまたは非ペプチドライブラリーな
どの多様なライブラリーを、造血細胞中でPDZドメインと特異的に結合する分子
を得るためにスクリーニングすることができる。使用することができる多くのラ
イブラリー、例えば化学的に合成されたライブラリー、組換え型（例えばファー
ジ表示ライブラリー）、およびインビトロ翻訳ベースのライブラリーが当業界で
知られている。
【０１６３】 化学的に合成したライブラリーの例は、Fodor等の論文Science 251:767-773 (
1991)、Houghten等の論文Nature 354:84-86 (1991)、Lam等の論文Nature 354:82
-84 (1991)、Medynskiの論文Bio/Technology 12:709-710 (1994)、Gallop等の論
文J. Medicinal Chemistry 37(9):1233-1251 (1994)、Ohlmeyer等の論文Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926 (1993)、Erb等の論文Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 91:11422-11426 (1994)、Houghten等の論文Biotechniques 13:412 (19
92)、Jayawickreme等の論文Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1614-1618 (1994)
、Salmon等の論文Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11708-11712 (1993)、国際特
許公開第93/20242号、ならびにBrennerおよびLernerの論文Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 89:5381-5383 (1992) に記載されている。
【０１６４】 ファージ表示ライブラリーの例は、ScottおよびSmithの論文Science 249:386~
390 (1990)、Devlin等の論文Science 249:404-406 (1990)、Christian,R.B.等の
論文J.Mol.Biol. 227:711-718 (1992)、Lenstraの論文J. Immunol. Meth. 152:1
49~157 (1992)、Kay等の論文Gene 128:59-65 (1993)、および国際特許公開第94/
18318号（1994年8月18日）に記載されている。
【０１６５】 インビトロ翻訳ベースのライブラリーには、国際特許公開第91/05058号（1991
年4月18日）およびMattheakis等の論文Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022-90
26 (1994) に記載のものがあるがこれには限定されない。
【０１６６】 非ペプチドライブラリーの例としては、ベンゾジアゼピンのライブラリー（例
えば、Bunin等の論文Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4708-4712 (1994) を参照
されたい）を使用に適するようにすることができる。またペプチドライブラリー
（Simon等の論文Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-9371 (1992)）を使用す
ることもできる。化学的に形質転換された組合せライブラリーを生成するように
ペプチド中のアミド官能基が完全メチル化されている使用可能なライブラリーの
別の例がOstresh等の論文（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11138-11142 (1994
)）に記載されている。一実施形態において、周知のまたは候補のアンタゴニス
トの存在または不在下でＡまたはＧ検定を行なうことによってアンタゴニストが
同定されることは普通の当業者ならば理解するはずである。ある化合物の存在下
で結合の減少が観察される場合、その化合物はアンタゴニストとして同定される
。ある化合物の存在下における結合の増加は、その化合物がアゴニストであるこ
とを意味している。
【０１６７】 例えばある検定において試験化合物は、試験化合物の存在および不在下におい
て、（試験化合物が存在しなかったら）複合体を形成するはずの条件下でPDZド
メインのポリペプチドとPLペプチドを接触させ、試験化合物の存在および不在下
における複合体の形成を検出することにより、PDZタンパク質とPLタンパク質の
間の結合のインヒビター（アンタゴニスト）として同定することができる。試験
化合物の存在下における複合体の形成が化合物の不在下における複合体の形成よ
りも少ないことは、試験化合物がPDZタンパク質−PLタンパク質結合のインヒビ
ターであることを示すことが理解されよう。様々な実施形態においてPLペプチド
は、PLタンパク質のＣ末端配列とほぼ等しいアミノ酸配列を含む（例えば、CD6
、CD49E、CD49F、CD138、Clasp-1、Clasp-4、VCAM-1、Clasp-2、CD95、DNAM-1、
CD83、CD44、CD4、CD97、Neurexin、CD3n、DOCK2、CD34、FceRIb、またはFasLig
and）。
【０１６８】 ある実施形態においては「Ｇ検定」が候補インヒビターの存在または不在下に
おいて用いられる。ある実施形態においては「Ａ検定」が候補インヒビターの存
在または不在下において用いられる。
【０１６９】 ある実施形態（Ｇ検定を用いる）においては、１または複数のPDZドメイン含
有GST融合タンパク質を上記に記載のように（非融合GSTタンパク質を含む適切に
制御された状態で）９６ウェルプレートのウェル表面と結合させる。適切な制御
および統計的分析を行なうことができるように全ての融合タンパク質を複数ウェ
ル中で結合させる。ＢＳＡ／ＰＢＳに溶かした試験化合物（一般に複数の異なる
濃度で）をウェルに加える。その後直ちに関連するPDZドメイン（例えば、表２
参照）と結合させるために検出可能に標識した（例えばビオチニル化した）既知
のペプチド30 ulをウェルそれぞれに、例えば約2 uMと約40 uMの間、一般には約
5 uM、約15 uM、または約25 uMの最終濃度で加える。次いでこの混合物を、表面
に結合しているPDZ融合タンパク質と４℃で１０分間、続いて２５℃で２０分間
反応させる。表面を氷で冷やしたＰＢＳで３回洗浄して結合していないペプチド
を除去し、試験化合物の存在および不在下におけるペプチドの結合量を決める。
通常、結合レベルは、レプリカウェル（例えば複製）の各組についてこれらウェ
ル中のペプチド結合の生の測定値の平均からGSTのみの背景の平均を差し引くこ
とによって測定される。
【０１７０】 別の実施形態においては、PL−PDZ相互作用のインヒビターを同定するために
Ａ検定を試験候補の存在および不在下で行なう。
【０１７１】 ある実施形態においては、1 mM以下（例えば、500 uM、100 uM、10 uM、1 uM
、100 nM、または1 nM以下）の試験化合物濃度において、試験化合物の存在下に
おけるPDZドメイン（Ｐ）とPL（Ｌ）の結合が、試験化合物の不在下における結
合の約５０％未満（様々な実施形態においては約２５％未満、約１０％未満、ま
たは約１％未満）の場合、ＰとＬ配列の結合の特異的インヒビターであると判定
される。試験化合物の存在下におけるＰとＬの結合の正味信号プラス試験化合物
の存在下における信号の標準誤差の６倍が、試験化合物の不在下における結合信
号より小さいことが好ましい。
【０１７２】 ある実施形態においてインヒビターの検定は、単一のPDZタンパク質−PLタン
パク質ペア（例えばPDZドメイン融合タンパク質とPLペプチド）を用いて行なわ
れる。関連する実施形態において検定は、表２に列挙した複数の異なるペアなど
複数のペアを用いて行なわれる。
【０１７３】 幾つかの実施形態では、ある決まった濃度において、あるPL−PDZペアの結合
を阻害するが、特定の第二のPL−PDZペアの結合を阻害しない（または阻害の程
度が小さい）化合物を同定することが望まれる。これらのアンタゴニストは、候
補のインヒビターと様々なPL−PDZペア（例えば表２のマトリックス中に示した
ような）を用いて一連の検定を行ない、検定の結果を比較することによって同定
することができる。全てのこのようなペア様式の組合せが本発明によって検討さ
れている（例えば試験化合物は、PL1とPDZ1の結合を、PL1とPDZ2またはPL2とPDZ 2 の結合を阻害するよりも高度に阻害する）。重要なことは、表２に提供され、
本明細書に開示されたデータ（および本明細書に記載の方法を用いて生み出すこ
とができる付加的なデータ）に基づいて様々な特異性を有するインヒビターを容
易に設計することができる点にあるということを理解されよう。
【０１７４】 PDZ結合部分および本発明のPDZタンパク質−PLタンパク質結合アンタゴニスト
を用いて細胞（例えば、Ｔ細胞およびＢ細胞などの造血細胞）、内皮細胞、およ
び本明細書に記載したその他の免疫系細胞の生理学的活性または機能を調節し、
またヒトおよび非ヒト動物（例えば実験モデル）の病および状態を治療する。生
理学的活性の例は上記に列挙する。
【０１７５】 患者に投与される場合、本発明の化合物（例えばPL−PDZ相互作用のインヒビ
ター）は、炎症性および液素性免疫応答を特徴とする病、例えば炎症、アレルギ
ー（例えば全身アナフィラキシー、過敏性反応、薬剤アレルギー、昆虫刺傷アレ
ルギー）；炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、回腸炎、および腸炎；乾癬および炎症
性皮膚病；強皮症；喘息、アレルギー性鼻炎、過敏性肺疾患などの呼吸アレルギ
ー性疾患；脈管炎；鼻腔適合性；輸血反応；薬剤敏感性；ＰＩＨ；アトピー性皮
膚炎；湿疹；鼻炎；関節炎（リウマチ様および乾癬性）、多発性硬化症、全身性
エリテマトーデス、インスリン依存性糖尿病、糸球体腎炎、強皮症、ＭＣＴＤ、
ＩＤＤＭ、橋本病、グッドパスチャー症候群、乾癬などの自己免疫性疾患；骨関
節症；多発関節炎；移植片拒絶（例えば同種移植片拒絶反応、例えば腎同種移植
片拒絶反応、移植片対宿主病、移植拒絶反応（心臓、腎臓、肺、肝臓、小腸、角
膜、膵臓、死体または自己骨髄、異種移植））；アテローマ性動脈硬化症；脈管
形成依存性疾患；癌（例えば、黒色腫および乳癌、衰弱性癌、白血病、リンパ腫
、転移性疾患）；感染性疾患（例えば、ＨＩＶ、麻疹、パラインフルエンザ、ウ
ィルス性細胞融合などのウィルス感染）；虚血（例えば、心筋梗塞後の合併症、
関節の外傷、腎臓、強皮症）を含む様々な病および状態の治療（症状の軽減）に
とって有用である。
【０１７６】 表２に列挙したPLタンパク質およびPDZタンパク質は十分に特徴が調べられて
おり、この開示（本明細書に記載のPLタンパク質とPDZタンパク質の間の相互作
用の発見を含む）によって手引きされた当業者は、表２に記載のものなどPDZ−P
L相互作用の活性調節因子（例えば、エンハンサーまたはインヒビター）の多く
の使い方について理解するはずである。さらに読者を支援するため、選ばれたPL
タンパク質（およびその機能）の特徴に関する考察を下記に提供する。この考察
は包括的なものではなく、決して本発明を限定することを意図するものではない
ことを理解されたい。さらに、この項のいずれも本発明者等の意図を特定の行動
手順に限定するものと解釈されるべきではない。 A．CD6 上記で示したように、CD6はPDZタンパク質41.8を結び付ける。CD6は、慢性リ
ンパ球性白血病の胸腺細胞、Ｔ細胞、およびＢ細胞上に発現する。CD6は、Ｔ細
胞の副刺激において役割を演じ、CD6ネガティブＴ細胞はCD6ポジティブＴ細胞よ
りも自己反応性が低い。CD6とCD6／41.8の相互作用の阻害は、移植片対宿主病（
ＧＶＨＤ）または乾癬の症状を軽減すると予想される。したがって本発明の一実
施形態において、ドナーの骨髄細胞を受ける患者のＧＶＨＤは、細胞を有効量の
アンタゴニストで前処理することにより低減される。CD6−PDZ相互作用のインヒ
ビターは、FK506、Cellcept、またはサイクロスポリンなどの移植後免疫抑制治
療と組み合わせると移植患者（例えば白血病患者）全体の生存を改善することに
なる。 B．CD49e（αA-4） 本明細書で報告した実験によって示されるようにCD49eのＣ末端は、PDZドメイ
ン含有タンパク質41.8kDと結合する。CD49eは、インテグリンαファミリー（イ
ンテグリンα５）の110kDトランスメンブレンの膜タンパク質である。これは、
インテグリンβ１サブユニットと対でVLA-5を形成する。VLA-5は、主に単核細胞
、塩基性染色細胞、Ｔ細胞、およびＢ細胞を含む造血細胞およびリンパ様系統細
胞上に発現する。VLA-5は、いたるところに発現した接着分子フィブロネクチン
に対する受容体である。心筋梗塞などの組織の損傷はフィブロネクチンの可溶性
断片を放出する。これら可溶性断片とVLA-5の結合は、単核細胞を含む免疫細胞
のフィブロネクチン発生源への化学走性、およびこれら細胞上におけるVLA-5発
現のダウンモジュレーションをもたらす。このようなリガンドが誘発するダウン
モジュレーションは、化学走性受容体の普通かつ必要な特徴である。いったん免
疫細胞がフィブロネクチンの発生源へ完全に移動すると、フィブロネクチン表面
との接着はフィブロネクチン−VLA-5相互作用によって高められる。特別の機構
によって結合することを意味するものではないが、41.8／CD49eの相互作用は、
それが中断されるとフィブロネクチンを含有する表面への移動および付着も同様
に中断され、その結果免疫系細胞のフィブロネクチン発生源への有効な移動と、
フィブロネクチンを含有する表面への付着が不能になるため、それはCD49eの適
正な膜分布および／またはCD49eの再循環にとって必要であると考えられる。し
たがってこのような中断は、心筋梗塞後の炎症の低減を含む炎症性反応の望まし
い低減をもたらすはずである。治療可能なその他の疾患には関節炎、乾癬、接触
アレルギー、クローン病、炎症性腸疾患、湿疹、アトピー性皮膚炎があるがこれ
には限定されない。 C．CD49F（VLA-6αサブユニット） 上記で示したように、CD49FはPDZタンパク質41.8を結び付ける。CD49fは、VLA
-6を形成するβ１インテグリンサブユニット（CD29）、またはCD104（β４イン
テグリンサブユニット）のいずれかと対になるインテグリンサブユニットとして
知られている。インテグリン超遺伝子ファミリーは、胚形成、血栓症、創傷の治
癒、腫瘍発生、、および免疫応答を含む多くの異なる生理学的過程にとって重要
な多数の細胞表面αβ異種二量体からなる。各β鎖は、様々なα鎖と対になるこ
とができる。VLA-6およびCD49f／CD104の両者は、非リンパ様組織において上皮
上に広く発現する。VLA-6はまた、血小板、単核細胞、胸腺細胞、およびＴリン
パ細胞上で発現し、活性また休止記憶Ｔ細胞上では発現が増加する。
【０１７７】 VLA-6と41.8の間の相互作用の阻害は、転移性癌の予防および治療、ならびに
過剰能動免疫の治療など多数の治療機能を有する。例えば、VLA-6は衰弱性癌の
侵襲と関連しており、乳癌の転移において役割を演じる。衰弱性癌の通常の治療
と組み合わせたVLA-6機能の阻止は、転移性疾患を予防することによって、より
有効な治療となるはずである（Cress等の著書Cancer Metastasis R (1995) 参照
）。PDZの相互作用を介するCD49fの阻止はまた、記憶応答を鈍感にすることによ
りＲｈ不適合を治療することができ、あるいはケロイドの治療に用いることがで
きる。 D．CD138（シンデカン−１） CD138は、様々な細胞外間質成分に対してリガンド結合ドメインとして機能す
る細胞外ドメインと、細胞骨格を変え細胞内信号を変換するように機能する細胞
内部分とを有するトランスメンブレンのプロテオグリカン受容体である。また、
CD138はFGF2を結び付け、FGF2受容体に対するコレセプターである可能性がある
（Yayon等の記述 (1991)）。
【０１７８】 上記に示したようにCD138は、41.8kDタンパク質およびTIAM1と相互作用する。
CD138のＣ末端はまた、シンテニンおよびヒトＣＡＳＫのPDZドメインを結び付け
ることが報告されている（Cohen等の論文J. Cell. Biol. 142:129-138 (1998)、
Grootjans等の論文PNAS 94: 13683~13688 (1997)、Hsueh等の論文J. Cell. Biol
. 142:139-151 (1998)）。CD138は、プレＢ細胞、未熟Ｂ細胞、形質細胞、神経
細胞、上皮細胞の基底面、胎児性の間充繊細胞、血管平滑筋細胞、内皮細胞、お
よび神経細胞だが成熟循環性Ｂ細胞でないものの中において発現する。CD138と
、41.8kDタンパク質およびTIAM1タンパク質のPDZドメインとの間の相互作用は、
細胞表面のCD138の適正な分布にとって必要であると考えられる。有効量のアン
タゴニストの投与による相互作用の中断は、細胞の細胞外間質への移動および付
着を妨ぎ、その結果炎症性および体液性の免疫応答を低減させることが期待され
る。CD138の阻害は、これには限定されないが心筋梗塞後の炎症性損傷、関節の
負傷、慢性関節リウマチ、脈管炎、薬物反応、強皮症、ＳＬＥ、橋本病、グッド
パスチャー症候群、若年性インスリン依存性糖尿病、乾癬などの疾患を治療する
ために用いることができる。 E．CD98 上記に示したように、CD98はMPP 2と相互作用する。CD98は、単核細胞上に高
レベルで発現し、またＴ細胞、Ｂ細胞、脾細胞、ＮＫ細胞、および顆粒球上に低
レベル発現する。CD98は、接着および融合において役割を演じ、Ｌ型アミノ酸輸
送体である。CD98はまた、ウィルスが仲介する細胞融合（例えば、パラミクソウ
ィルス、すなわちパラインフルエンザウィルス２型、ニューキャッスル病ウィル
ス、およびルブラウィルス）と関わっており、CD98機能の拮抗作用はウィルス性
感染を治療し、ウィルスの拡散を制限することが期待される。CD98インヒビター
は、これには限定されないがパラミクソウィルス、パラインフルエンザ、ニュー
キャッスル病、およびルブラに対する抗ウィルス性剤である可能性がある。その
他の役割には急性白血病の治療がある。 F．CLASP-1 上記に示したようにCLASP-1は、DLG 1、PSD 95、およびNeDLGと相互作用する
。CLASP-1は、同様の主題をもつ免疫細胞関連タンパク質の超ファミリーのメン
バーである（国際特許公開第00/20434号として公開された国際出願米国特許第PC
T/US99/2299号を参照）。CLASP-1は、免疫シナプスの維持機能をもつ。CLASP-1
転写物は、リンパ系器官および神経組織中に存在し、そのタンパク質は、Ｔおよ
びＢリンパ球、ならびに脾臓の周辺帯のＭＯＭＡ−１サブ領域、すなわちＴおよ
びＢ細胞の相互作用において重要であることが知られている領域中のマクロファ
ージによって発現する。個々のＴおよびＢ細胞のCLASP-1の染色は、Ｂ細胞中の
「ボール」または「キャップ」構造として組織化され、またＴ細胞中の「リング
」、「ボール」、または「キャップ」構造を形成する活性化前の構造極性を示す
。これら構造の配置は、微小管形成中心（「ＭＴＯＣ」）に隣接している。CLAS
P-1抗体の染色は、CLASP-1が、分化と完全に関わっているＴ−Ｂ細胞抱合体の境
界面にあることを示している。CLASP-1の細胞外ドメインに対する抗体もまた、
Ｔ−Ｂ細胞抱合体の形成およびＴ細胞の活性化を妨げる。
【０１７９】 CLASP-1機能の拮抗作用は、免疫応答（例えば、ＴおよびＢ細胞活性化）、信
号の変換、細胞と細胞の相互作用、および膜の組織化を妨げることが期待される
。CLASP-1アゴニスト／アンタゴニストによって治療することが可能な疾患には
、これには限定されないが慢性関節リウマチ、若年性糖尿病、器官拒絶反応、移
植片対宿主病、強皮症、多発性硬化症がある。 G．CLASP-4 上記に示したようにCLASP-4は、DLG 1、PSD 95、NeDLG、LDP、AF 6、41.8、お
よびMINT1と相互作用する。CLASP-4は、同様の主題をもつ免疫細胞関連タンパク
質の超ファミリーのメンバーである（同時係属中の出願日2000年4月11日の米国
特許出願第60/196,527号を参照されたい）。CLASP-4タンパク質は、主に末梢血
液のリンパ球中で発現する。CLASP-4とPDZドメインの相互作用の阻害は、免疫応
答（例えば、ＴおよびＢ細胞活性化）、信号の変換、細胞と細胞の相互作用、お
よび膜の組織化を妨げるはずである。CLASP-4アゴニスト／アンタゴニストによ
って治療することが可能な疾患には、これには限定されないが慢性関節リウマチ
、若年性糖尿病、器官拒絶反応、移植片対宿主病、強皮症、多発性硬化症、急性
白血病、白血病芽細胞発症、梗塞後の炎症（心臓など）、アテローマ性動脈硬化
症がある。 H．VCAM1 血管細胞接着分子１（VCAM-1、CD106）は主に血管の内皮（すなわち内皮細胞
）によって発現するが、マクロファージ、樹枝状細胞、骨髄誘発性細胞、、繊維
芽細胞、皮質性胸腺上皮細胞、血管平滑筋細胞、筋原細胞、および筋管中に検出
されている。VCAM-1は、インテグリンリガンドすなわちVLA-4との相互作用を介
して接着を仲介し、それはリンパ球、単核細胞、および好酸球によって発現する
。VCAM-1とVLA-4の間の相互作用は、内皮自体が炎症または外傷により活性化す
るようになったとき、VLA-4発現細胞の活性化、横ばい化、および血液溢出にと
って重要である（Salomon等の論文Blood 89:2461-2471 (1997)、St-Pierre等の
論文Eur. J. Immunol. 26:2050~2055 (1996)、Bell等の論文Int.Immunol. 7:186
1-1871 (1995)）。
【０１８０】 上記に示したようにVCAM-1のＣ末端領域は、MPP 1、DLG 1、NeDLG1、LDP、41.
8タンパク質、TIAM1、およびK303のPDZドメインに対するリガンドである。これ
らの相互作用は、内皮細胞とインテグリン発現リンパ球の相互作用の機能を仲介
すると考えられる。PDZ - PL相互作用が中断されるとリンパ球の内皮への付着も
同様に中断され、結果として例えば炎症の軽減をもたらす。したがってVCAM-1の
PDZタンパク質との結合の阻害は、腎同種移植拒絶反応、インスリン依存性糖尿
病、慢性関節リウマチ、心筋梗塞後の合併症、および全身性慢性エリテマトーデ
スなど（これらには限定されないが）の異常なVCAM-1の炎症応答および関連する
病状を低減するのに役立つ（Pasloske等の論文Ann. Rev. Med. 45:283 (1994)、
Ockenhouse等の論文J. Exp. Med. 176:1183 (1992)、Solezk等の論文Kidney Int
. 51:1476 (1997)、Tedla等の論文Clin. Exp. Immunol. 117:92-99 (1999)、Kus
terer等の論文Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes 107:S102-107 (1999)、Bonomi
ni等の論文Nephron. 79:399 (1998)、Suassuna等の論文Kidney Int. 46:443 (19
94)、Ferri等の論文Hypertension 34:568 (1999)）。 I．CLASP-2 上記に示したようにCLASP-2は、PSD95、NeDLG、およびDLG1と相互作用する。C
LASP-2は、同様の主題をもつ免疫細胞関連タンパク質の超ファミリーのメンバー
である（同時係属中の出願日2000年4月11日の米国特許出願第09/547,276号、出
願日2000年4月11日の国際特許公開第00/10158号、出願日2000年4月11日の国際特
許公開第00/10156号を参照されたい）。CLASP-2の転写物は胎盤中に最も強く、
次いで肺、腎臓、および心臓中に存在し、そのタンパク質はＴおよびＢ細胞、な
らびに腎臓の上皮細胞中で発現する。
【０１８１】 CLASP-2とPDZドメインの相互作用の阻害はCLASP-2の機能を妨げ、その結果Ｔ
およびＢ細胞の機能（例えば、ＴおよびＢ細胞活性化）、信号の変換、細胞と細
胞の相互作用、および膜の組織化を妨げることになる。加えてCLASP-2は心臓中
に存在するので、CLASP-2の機能または発現を阻止することにより心臓中の免疫
応答を選択的に阻止する（例えば、どこか別の場所で免疫を損なうことなく心臓
移植拒絶反応またはＭＩ後の炎症に続く、例えば心臓の区画中の免疫応答を選択
的に停止する）ことができる。CLASP-1アゴニスト／アンタゴニストによって治
療することが可能なその他の疾患には、慢性関節リウマチ、若年性糖尿病、器官
拒絶反応、移植片対宿主病、強皮症、多発性硬化症があるがこれには限定されな
い。 J．CD 95（Apo-1／Fas） CD 95（Fas／Apo-1）とFasリガンド（FasL）は、リンパ球の恒常性および末梢
性と関係する受容体リガンドのペアである。そのリガンドによるFasの結合は、
アポトーシスによる細胞死、すなわち急性炎症反応の分解中に不要の細胞を安全
に取り片付けるための重要で主要な仕組みをもたらす。上記に示したようにPSD
95は、PDZドメイン、すなわちDLG 1、PSD95、NeDLG、および41.8を結び付ける。
CD 95とPDZドメインの相互作用の阻害が用いられる。 K．Kv1.3（Shaker型Kv1.3カリウムチャンネル） 上記に示したようにKv1.3は、DLG1、PSD95、NeDLG、LIMK、41.8、RGS12、DVL1
、およびMINT1を結び付ける。Kv1.3は、Ｔリンパ球の膜電位の調節に関わるShak
erに関連したチャンネルタンパク質である（LewisおよびCahalanの論文Ann. Rev
. Immunol. 13:623 (1995)）。Kv1.3チャンネルの阻害は、Ｔ細胞膜を長期にわ
たり脱分極し、細胞膜中でカルシウムにより活性化される放出カルシウムチャン
ネルを介するカルシウムの侵入を低減し、その結果リンパ球の活性化にとって不
可欠なカルシウムの信号伝達経路を阻害する。Hanada等は、Kv1.3がジャーカッ
トＴ細胞中のDLG1およびPSD95と対合していることを報告している（J. Biol. Ch
em. 272:26899 (1997)）。Kv1.3 - PDZタンパク質のアゴニスト／アンタゴニス
トの投与は、Ｔ細胞の信号伝達を中断することになり、これらには限定されない
が器官の移植、移植片対宿主病、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、慢
性関節リウマチ、骨関節症、多発性硬化症、強皮症、混合性の結合組織疾患の治
療のために有用な治療薬となる可能性がある。 L. DNAM-1 上記に示したようにDNAM-1は、MPP2、DLG1、PSD95、NeDLG、LIM、AF6、41.8、
およびRGS12を含む幾つかのPDZタンパク質を結び付ける。DNAM-1は、本質的にFy
nと対合するが、過バナジン酸塩（チロシンホスファターゼインヒビター）の存
在を必要とする（Shibuya等の論文Immnity.11:615-623 (1999) を参照されたい
）。抗CD3（またはDNAM-1）で刺激すると、DNAM-1はセリン329においてリン酸化
され（Shibuya等の論文J. Immn.16:1671-1676 (1998)）、LFA-1と対合する。さ
らにFynは、過バナジン酸塩とは無関係にDNAM-1と対合するようになる。FynはY3
22においてDNAM-1をリン酸化するが、DNAM-1との結合を続けるのにY322を必要と
しない。
【０１８２】 DNAM-1自体はSH3結合ドメインを持たず、Y322にSrcリン酸化部位を持つのみな
ので、DNAM-1とFynを架橋するにはアダプター分子が存在しなければならない。P
LG1はＴ細胞中に存在することが文献に記載されている（Hanada等の論文J. Biol
. Chem. 272:26899 (1997)）が、Fynを結び付けない。PSD95はSH3結合部位を持
たない。しかしながら別の幾つかのPDZタンパク質は、これには限定されないがN
eDLG、RGS12、MPP2を含むSH3結合ドメインを持ち、この機能を満たすことができ
る。上記で列挙されたこれらのアダプターPDZは、そのPDZドメインを介してDNAM
-1と結合し、同時にPDZドメインの丁度Ｎ末端のそのプロリンを多く含む配列を
介してFynのSH3ドメインと結合する。Y139は、FynとDNAM-1の対合およびアダプ
ターPDZの制御のためのリン酸化部位の候補である。
【０１８３】 この分析に基づいて、本発明の試薬を用いたPDZ とDNAM-1の対合の阻害は、Fy
n とDNAM-1の対合と、それに続くY322のリン酸化および細胞障害Ｔ細胞の活性化
を阻害する。治療することが可能な疾患には、クローン病、多発性硬化症、潰瘍
性大腸炎、炎症性腸疾患、移植片対宿主病、若年性糖尿病、橋本病があるがこれ
らには限定されない。 M. CD83 (HB15) CD83は、主に活性化した樹枝状細胞（DCs）、すなわち皮膚中のランゲルハン
ス細胞上で発現し、また活性化した末梢リンパ球上で若干の弱い発現が検出され
るトランスメンブレンの糖タンパク質であり、リンパ様器官のＴ細胞内の細網細
胞を互いに入り込ませる（ZhouおよびTedderの論文J. Immunol. 154:3821~3835
(1995)、Zhou等の論文J. Immunol. 149:735-742 (1992)）。CD83は、未成熟のDC
sを活性化させると新たに上向き調節され、主要な識別用標識であって活性化さ
れた成熟したDCsに特徴的である（Czemiecki等の論文J. Immunol. 159:3823~383
7 (1997)）。DCsは、抗原提示細胞（APCs）として機能する。したがってCD83の
アップレギュレーションおよび発現は、DCsが成熟しAPCsとして機能するために
必要であるらしい。
【０１８４】 上記に記載した実験によって示されるようにCD83は、DLG1、PSD95、およびNeD
LGのPDZドメインと結合する。CD83とPDZドメインの間、 ならびにCD83とDLG1、P
SD95、およびNeDLGの間のこれら相互作用は、CD83の適正な分布および再循環に
とって重要であると考えられる。アゴニストおよびアンタゴニストによるCD83お
よびPDZタンパク質の中断は、これには限定されないが乾癬、癌、アレルギー、
多発性硬化症、全身性慢性エリテマトーデスなどの自己免疫性疾患の治療に用い
ることができる。 N. CD44（食細胞糖タンパク質１、リンパ球ホーミング受容体、p85、およびHCA
M） CD44は、代替のスプライシングによる幾つかの異なるイソ型タンパク質を有す
る一回貫通トランスメンブレンタンパク質である。それは、上皮細胞、内皮細胞
、間充繊細胞、および神経細胞を含む造血細胞型および非造血細胞型の両者の上
に検出される発現の広範なパターンを有する。CD44Hは、リンパ様細胞、骨髄細
胞、および赤芽球細胞中で発現する主要なイソ型タンパク質である（Barclay等
の著書The Leukocyte Antigen Facts Book, 2nd ed. Academic Press (1997) 中
に総覧されている）。CD44は、細胞外間質（ＥＣＭ）の構成要素であるヒアルロ
ン酸塩（ＨＡ）の受容体である。免疫系においてCD44は、ＥＣＭ中でＨＡを結び
付ける白血球および赤血球表面の接着分子として機能し、それはまたＨＡが炎症
反応または組織の損傷の間に可溶性になったとき信号を伝える受容体として働く
可能性がある。CD44の細胞質領域は、スペクトリンおよびＥＲＭ（エズリン、ラ
ジキシン、およびメオシン）ファミリーのメンバーとの相互作用を介してアクチ
ン細胞骨格を結び付け、またはそれと対合することをが示された（Lesley等の著
書 (1993)、Bajorathの記述Proteins 39:103-111 (2000)で総覧されている）。
加えてCD44は、非受容体チロシンキナーゼp56Lckと対合する（Taher等の論文J.
Biol. Chem. 271:2863-2867 (1996)）。CD44は、Ｔ細胞を活性化させるようにCD
3／TCRを連動させる共刺激性分子である（Aruffoの記述J. Clin. Invest. 98:21
91-2192 (1996) で総覧されている）。
【０１８５】 本明細書で報告された実験による上記記述のように、CD44のＣ末端は、MPP1、
prIL-16、およびMINT1中に含有されたPDZドメインのリガンドである。CD44とPDZ
ドメインの相互作用、またCD44とMPP1、prIL-16、およびMINT1との間の相互作用
は、リンパ球構造の維持およびリンパ球の信号伝達において機能すると考えられ
る。したがってCD44−PDZの相互作用が中断されると、CD44は適正な細胞内信号
の変換、およびその表面のCD44の適正な分布の維持に失敗することになり、それ
は炎症および組織の損傷中のリンパ球と内皮の接着を妨げることになる。したが
って、この相互作用のアゴニスト／アンタゴニストの投与は、これには限定され
ないが組織の虚血および細胞の溶解（例えば横紋筋溶解）、血管不全症（例えば
凍傷）、乾癬、湿疹、移植片対宿主病、環状肉芽腫、強皮症の間、炎症応答の低
下をもたらす。 O. CD97 (CD55) 上記で論じたようにCD97は、DLG1 および41.8のPDZドメインを結び付ける。CD
97は、顆粒細胞および単核細胞上に発現し、また休止Ｔ細胞およびＢ細胞上に低
レベルで発現する79.7kDの７スパントランスメンブレンタンパク質である。Ｔま
たはＢ細胞が活性化すると、Ｔ細胞およびＢ細胞中のCD97の発現レベルは急激に
増加する（Eichler等の論文Scand. J. Immunol. 39:111-115 (1994)、Pickl等の
論文Leukocyte Typing V:1151~1153 (1995)）。COS細胞上で発現すると、CD97は
リンパ球に、また赤血球に接着性を与える。
【０１８６】 本発明によればCD97とDLG1 および41.8kDタンパク質との相互作用を、CD97の
適正な膜分布および／またはCD97の再循環を妨げるように変えることができる。
このような変調は、治療上利益をもたらす細胞のCD97依存性の密着に影響する。
CD97−PDZタンパク質相互作用のアゴニストおよびアンタゴニストは、これらに
は限定されないが慢性関節リウマチ、骨関節症、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾
癬の治療に用いることができる。 P. 糖タンパク質Ｃ（GC） 上記に示したように糖タンパク質Ｃ（GC）のＣ末端は、ヒトのDLG、PSD95、Ne
DLG、MMP2、AF6、41.8、およびMINT1のPDZドメインと（先に記載のMint-1と）相
互作用する。糖タンパク質Ｃは、赤芽球細胞、胸腺、胃、胸、成人および胎児の
肝臓、単核細胞、ならびにＴおよびＢ細胞中に発現する膜内在性タンパク質であ
り（Le Van Kim等の論文J. Biol. Chem. 264:20407-20414 (1989)）、ヒトの赤
血球中のその役割についてはよく知られている。それは、MPP1およびタンパク質
4.1と相互作用して赤血球の形状、完全性、および機械的安定性を調節する（Mar
fatia等の論文J. Biol. Chem. 272:24191-24197 (1997)、Reid等の論文Blood 69
:1068-1072 (1987)）。
【０１８７】 糖タンパク質ＣとPDZタンパク質DLG、PSD95、NeDLG、MMP2、AF6、41.8、およ
びMINT1との間の相互作用は、それらが発現する細胞の物理的完全性の維持にと
って必要であると考えられる。GC−PDZ相互作用の変調はこれらの機能により変
わるはずであり、これには限定されないが真性赤血球増加症、球状赤血球症の治
療に利用することができる。 Q. CDw128A（IL8RA） 上記に記載したようにCDW128Aは、DLG1およびNeDLGのPDZドメインと結合する
。IL8受容体には二つの形態、すなわちIL8RA(CDw128A)およびIL8RB(CDw128B) が
あり、その両者はＧタンパク質結合型受容体の超ファミリーのメンバーでしかも
ロドプシンファミリーのケモカイン受容体ブランチである。CDw128AおよびCDw12
8Bの両者は、同一の親和性を有する（ただしCDw128Bのみは除く）IL8を結び付け
る。CDw128Bは３つの他のIL8関連のCXCケモカイン、すなわち黒色腫増殖刺激活
性（GRO／MGSA）、好中球活性化ペプチド２（NAP-2）およびENA-78を結び付ける
。例えば、Ahuja, SKおよびMuphy, PMの論文J. Biol. Chem. 271:20545-50 (199
6) を参照されたい。
【０１８８】 CDw128Aは、あらゆる顆粒細胞、Ｔ細胞の構成部分、単核細胞、内皮細胞、角
化細胞、赤血球、および黒色腫細胞上で発現する。IL8は、好中球、好塩基球、
およびＴリンパ球の化学走性を誘発し、好中球および単核細胞の内皮細胞との接
着を向上させる。IL-8とIL8RAの結合は、細胞内のカルシウム濃度、ホスホリパ
ーゼＤの活性化、好中球の呼吸性バースト、および化学走性の一過性の増加を誘
発する。この早期炎症応答は、正常な免疫応答において実効的である。CDw128A
のインヒビターは、乾癬、慢性関節リウマチ、多発関節炎の治療にとって、また
黒色腫および乳癌などの脈管形成依存性疾患の制御にとって有用である。 R. CD3-η CD3-ηは、CD3-ζのスプライス変異型で、かつCD 3／TCR複合体の成分であり
、それは抗原の認識、信号の変換、およびＴ細胞の活性化にとって必要である（
WeissおよびLittmanの論文Cell 76:263-274 (1994)）。Barclay等の著書The Leu
cocyte antigen facts books, 2nd ed. Academic Press (1997) を参照されたい
。本明細書に報告された実験によって示されるように、CD3-ηのＣ末端領域は、
MINT1、41.8タンパク質、DLG1、およびPSZ95のPDZドメインのリガンドである。C
D3-ηとPDZドメインの相互作用、ならびにCD3-ηとMINT1、41.8タンパク質、DLG
1、およびPSZ95の相互作用は、あらゆる細胞の免疫応答に必要なＴ細胞の活性化
にとって重要であると考えられる。アゴニストおよびアンタゴニストによるこの
相互作用の変調は、これに限定されないが急性および慢性の同種移植片拒絶反応
、多発関節炎、移植片対宿主病、慢性関節リウマチの治療に用いることができる
。 S. LPAP（CD45-AP、LSM-1） LPAPは、休止および活性化したＴおよびＢ細胞上に発現するトランスメンブレ
ンタンパク質である。LPAPはCD45、すなわちＴ細胞受容体の複合体の一部である
タンパク質と結合することが示されており、CD4、CD2、およびThy-1と同じ場所
に局在化することが分かっている。LPAPはまた、p56（lck）およびZAP-70と一緒
に免疫沈降する。LPAPの実際の機能は知られていないが、この事実はそれがCD45
複合体の構築分子であることを示唆している。
【０１８９】 上記に示したようにLPAPは、DLG-1およびMINT-1と結合する。特にDLG-1および
MINT-1はＴ細胞中でともに発現する。またDLG-1はＴ細胞中でp56（lck）と一緒
に免疫沈降することが示されている。本明細書に記載の検定はまた、DLG-1がCD9
5およびKV1.3と結合し、MINT-1がKV1.3と結合することを実証した。これらの分
子はすべてTCRによる信号伝達と関わっている。LPAPは、Ｔ細胞が活性化してい
るときCD45による、多分CD45用の基質としてp56（lck）を補充することによる信
号伝達の組織化において機能すると考えられる。CD45の機能を妨げるとＴ細胞の
応答を激しく損なうことが示された。LPAPとPDZタンパク質の間の相互作用を阻
害することにより、残りの免疫応答由来のCD45が仲介する経路を変えることが期
待される。PL−PDZ結合のアゴニストおよびアンタゴニストは、これに限定され
ないが慢性関節リウマチ、移植拒絶反応、多発関節炎、強皮症、移植片対宿主病
の治療に用いることができる。 T. CD46（補体膜共同因子タンパク質（MCP）） CD46は、赤血球上ではなく、あらゆる核をもつ細胞上で発現される膜タンパク
質である。CD46は、補体活性化タンパク質ファミリーのレギュレーターのメンバ
ーである。その主要な機能は、膜に付着したC3b／C4bの補体を不活性化すること
による補体の攻撃から細胞を保護することである（Liszewski等の論文Adv. Immu
nol. 61:201-283 (1999)）。CD46は、45から70kDの範囲の、ディファレンシャル
スプライシングにより生じた８種類を超すイソ型タンパク質中に存在する。また
上記の機能に加えてCD46は麻疹ウィルスに対する、またその他の病原性微生物（
例えばStreptococcus pyogenes）に対する受容体として働く（Manchester等の論
文Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2161 (1994)、Okada等の論文Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 92:2489~2493 (1995)）。CD46はまた、ある種の腫瘍に過剰に発現
するらしく（Jurianz等の論文Mol.Immunol. 36:929-939 (1999)）、こうして腫
瘍細胞を補体の作用に対して鈍感にする。Barcley等の著The Leucocyte antigen
facts book, 2nd ed.,Academic Press (1997) を参照されたい。
【０１９０】 上記に示したようにCD46は、DLG1、PSD95、およびNe-DLGを結合する。この相
互作用は、CD46の適正な膜分布および／またはCD46の再循環にとって必要である
と考えられる。CD46−PDZ相互作用の変化は、麻疹ウィルスおよびその他の病原
体の細胞侵入能を低下させる可能性があり、CD46発現性腫瘍の補体による攻撃を
受けやすくする。CD46−PDZ相互作用のアゴニストおよびアンタゴニストの投与
は、これに限定されないが癌およびウィルス感染性疾患の治療に役立つ。 （Ｕ） ＣＤｗ１２８Ｂ 上述するように、ＣＤｗ１２８Ｂは、上述のアッセイにおいてＤＬＧＩ、Ｎｅ
ＤＬＧ、ＰＳＤ９５、及び４１．８のＰＤＺドメインに結合する。ＩＬ−８受容
体には２つの型、ＩＬ−８ＲＡ（ＣＤｗ１２８Ａ）とＩＬ−８ＲＢ（ＣＤｗ１２
８Ｂ）があり、双方共、Ｇタンパク質結合受容体スーパーファミリー及びロドプ
シン・ファミリーのケモカイン受容体分枝群の一員である。ＣＤｗ１２８Ａ及び
ＣＤｗ１２８Ｂは共に同等の親和性でＩＬ−８に結合するが、ＣＤｗ１２８Ｂの
みが他の３つのＩＬ−８関連ＣＸＣケモカインである、メラノーマ増殖刺激活性
（ＧＲＯ／ＭＧＳＡ）、好中球活性化ペプチド（ＮＡＰ−２）及びＥＮＡ−７８
にも結合する。例えば、Ａｈｕｊａ，ＳＫ及びＭｕｒｐｈｙ，ＰＭ（１９９６年
）のＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２７１：２０５４５〜５０を参照のこと。
【０１９１】 ＣＤｗ１２８Ｂは、顆粒球のすべて、Ｔ細胞のあるサブセット、単球、内皮細
胞、角化細胞、赤血球、及びメラノーマ細胞に発現している。ＩＬ−８は好中球
、好塩基球、及びＴリンパ球の走化性を誘導するが、ＩＬ−８ＲＡに対しては相
対的に低く、好中球及び単球の内皮細胞への接着を高める。ＩＬ−８Ａのその受
容体への結合は、細胞内カルシウムレベルの一過性の上昇及び顆粒の放出を誘導
するが、ホスホリパーゼＤの活性化又は好中球における呼吸バーストは誘導しな
い。この炎症誘発性反応は、通常の免疫反応において効果的である。ＣＤｗ１２
８Ｂの阻害は、乾癬、慢性関節リウマチ、多発性関節炎の治療に、及びメラノー
マや乳癌のような血管形成依存性疾患の制御に有用である。 （Ｖ）ＤＯＣＫ２ ＤＯＣＫファミリーは、細胞骨格と相互作用して形態変化に影響を及ぼす形態
形成膜貫通タンパク質の一群である。この新しいファミリーの一員には、ショウ
ジョウバエ筋芽細胞シティ（ｍｂｃ）、ＤＯＣＫ１８０、ＤＯＣＫ２、ＤＯＣＫ
３、ＤＥＤ５、ＫＩＡＡ０２０９、及びＣＬＡＳＰが挙げられる。原型的分子で
ある、ＤＯＣＫ１又はＤＯＣＫ１８０は、Ｃ．エレガンス（線虫）の遺伝子、Ｃ
ＥＤ５のヒト相同体であり、ＣＥＤ５はアポトーシス細胞のマクロファージによ
る飲込み及び貪食に関与している。ＤＯＣＫ２は末梢血リンパ球で見い出され、
形質移入によって平坦な細胞を丸い細胞に変換することができる（Nagase, et a
l., DNA Res 3:321-329、1996; Nishihara, H. Hokkaido Igaku Zasshi 74:157
）。
【０１９２】 上で示されるように、ＤＯＣＫ２はＰＬであり、ＰＤＺタンパク質に結合する
。アダプタとしてＰＤＺタンパク質を用いて、ＤＯＣＫ２はＡ、Ｂ、Ｃと複合体
を形成し、血管循環へのリンパ球の転送に備えて細胞の形状を制御する。急性白
血病、急性転化、心筋梗塞後の炎症、傷害後の炎症を治療するのに、ＰＤＺタン
パク質相互作用の作動薬及び拮抗剤によるＤＯＣＫ２の調節を用いることができ
るが、これに限定されない。 Ｗ． ＣＤ３４ 上で示されるように、ＣＤ３４はＤＬＧ１、ＰＳＤ９５及びＮｅＤＬＧに結合
する。ＣＤ３４は、造血系幹細胞を含む骨髄細胞の小さな亜集団に発現されてい
る。ＣＤ３４はまた、骨髄間質細胞及び内皮細胞上にも発現されている。セレク
チンである、ＣＤ６２Ｌ（Ｌ−セレクチン）及びＣＤ６２Ｅ（Ｅ−セレクチン）
はＣＤ３４に結合する。ＣＤ３４は白血球の接着及びローリングに介在する。Ｃ
Ｄ３４の造血系幹細胞における特性には幹細胞の骨髄分化が挙げられる。作動薬
及び／又は拮抗剤によるＣＤ３４−ＰＤＺ相互作用の調節を、骨髄異形成症、白
血病、傷害後の炎症、心筋梗塞後の炎症を治療するのに用いることができるが、
これに限定されない。 Ｘ． Ｆｃイプシロン受容体ベータＩ（ＦｃεＲβＩ） ヒトのＩｇＥに対する高親和性受容体である、ＦｃεＲＩはα、β及びジスル
フィド結合したγヘテロダイマーで構成される。α鎖は、ＩｇＥのＦｃ部に結合
するが、β鎖は、γ鎖ヘテロダイマーを介して伝達されるシグナルを増幅するよ
うに作用する。αβγ２四量体及びαγ２三量体の両方が存在するが、β鎖は、
Ｓｙｋの活性化及びカルシウム動員で測定すると５〜７倍、シグナルを増幅する
。さらに、ＦｃεＲβＩは、ＰＤＺのリガンドであり、ＣＤ２０／ＦｃεＲβＩ
受容体ファミリーの一員である。上で示されるようにＦｃεＲβＩは、ＭＩＮＴ
１に結合する。
【０１９３】 ＩｇＥの高親和性受容体として、好塩基球及び肥満細胞上のＦｃεＲβＩはア
レルギー反応の開始において中心的な役割を担っている。ＩｇＥに結合した多価
アレルゲンの架橋によってＦｃεＲβＩを介したシグナル伝達が始まる。 結果
は、 小胞の脱顆粒、ヒスタミンロイコトリエン及び炎症誘発性サイトカイン（
ＩＬ−６及びＴＮＦα）即時型過敏症の症状に関与する因子の放出である。喘息
、アトピー性皮膚炎、湿疹、薬物反応、肥満細胞症、蕁麻疹、好酸球増加・筋痛
症候群を治療するために、作動薬及び拮抗剤によるＰＬ／ＰＤＺ相互作用を標的
としたシグナル伝達の改変を用いることができるが、これに限定されない（Turn
er, H., Nature 402:Supp:B24, 1999）。 Ｙ． Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ） ＣＤ９５（Ｆａｓ／Ａｐｏ−１）及びＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）は、リンパ
球の恒常性と末梢寛容に決定的に関与する受容体−リガンド対である。リガンド
によるＦａｓへの結合は、アポトーシス細胞死を招き、それは急性炎症反応を解
消する間、不要な細胞を安全に片付ける重要で主要なメカニズムである。Ｆａｓ
Ｌは主として活性化Ｔ細胞に拘束されており、迅速に誘導される。ＦａｓＬは、
正常な胸部内皮細胞及び良性胸部疾患に比べて乳癌で亢進していることが多い。
上で示されるように、ＦａｓＬは、ＫＩＡＡ０５６１ＰＤＺドメインに結合する
。ＰＤＺ−ＰＬ調節因子は、腫瘍、例えば、従来の化学療法に不応性の腫瘍の治
療に有用であるが、これに限定されない。 Ｚ． ＣＤＷ１２５（ＩＬ−５Ｒ） 上で示されるように、ＣＤＷ１２５はＰＴＮ−４及びＲＧＳ１２と結合する。
ＣＤＷ１２５は、好酸球及び好塩基球上に発現されているＩＬ−５受容体である
。ＩＬ−５は、好酸球前駆細胞の増殖と分化を促進し、成熟好酸球を活性化する
（Takatsu et al., Adv. Immunol., 57:145-190）。ＣＤｗ１２５の分泌型は、
拮抗的な特性を有し、ＩＬ−５が誘導する好酸球の増殖及び分化を阻害すること
ができる。喘息、アトピー性皮膚炎、湿疹、薬物反応、蕁麻疹、肥満細胞症、好
酸球増加症を治療するために、ＰＤＺドメインに結合するＣＤＷ１２５の調節を
用いることができるが、これに限定されない。 ＡＡ． バーキットリンパ腫受容体−１（ＢＬＲ−１；ＣＸＣＲ５） ＢＬＲ−１は、最初にＢ細胞で検出され、刺激されたＴ細胞で上方制御される
ことが示された膜貫通受容体である（Dobner et al., Eur. J. Immunol., 22:27
95-2799, 1992; Flynn et al., J. Exp. Med., 188:297-304, 1998）。 ＢＬＲ
−１は、抗原に対する適正な発生と選択のための、二次リンパ器官の濾胞（例え
ば、脾臓）へのＢ及びＴ細胞の走化性において機能する（Forster et al., Cell
87:1037-1047, 1996）。そのリガンドは、Ｂリンパ球の化学誘引物質（ＢＬＣ
）であり、パイエル板、脾臓及びリンパ節の濾胞に強く発現されている（Gunn e
t al., Nature 391:799-803, 1998）。その走化性の役割に一致して、成熟した
、活性化されたＢ細胞（形質細胞）ではＢＬＲ−１の発現は下方制御され、それ
らが濾胞に留まるのを妨げ（Forster et al., Cell Mol. Biol., 40:381-387, 1
994）、Ｂｌｒ−／−Ｂ細胞はＢ細胞濾胞に移動できないことが示されている（F
orster et al., 1996）。
【０１９４】 本明細書で報告される実験で示されるように、ＢＬＲ−１のＣ末端は、タンパ
ク質ＭＩＮＴ１を含有するＰＤＺドメインに結合する。特定のメカニズムに束縛
されることを意図せずに、ＢＬＲ−１とＭＩＮＴ１及びＢＬＲ−１とＰＤＺドメ
インの間の相互作用は、細胞表面上におけるＢＬＲ−１の適正な分布及びシグナ
ル伝達に必要である。この相互作用が破綻すると、ＢＬＲ−１を発現するリンパ
系細胞の走化性能も同様に破綻する。そのような破綻の結果、免疫応答が低下し
、適正に循環し、抗原への応答を進展させるリンパ球の能力の妨害を生じる。全
身性エリテマトーシス、強皮症及びその他の自己免疫疾患を治療するために、こ
の相互作用の作動薬及び拮抗剤を用いることができるが、それに限定されない。
ＢＢ． ＣＤ４ ＣＤ４は、抗原認識に関与するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を伴った共受容体であ
る。ＣＤ４及びＴＣＲは双方共、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する。
エフェクター細胞及び標的細胞に対するＴ細胞の親和力を高めることによってＴ
細胞の活性化は増強される。細胞質ドメインは、シグナル伝達及びチロシンキナ
ーゼｐ５６lckとの会合に関与する。ＣＤ４は、ほとんどの胸腺細胞、２／３の
末梢血Ｔリンパ球、単球及びマクロファージに発現されている。
【０１９５】 ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）は、そのエンベロープの糖タンパク
質が介在する膜融合によって感染し、ＣＤ４とケモカイン共受容体、ＣＣＲ５又
はＣＸＣＲ４との相互作用によって誘発される。ＨＩＶ暴露直後のＨＩＶ感染、
慢性関節リウマチ、多発性硬化症、強皮症、全身性エリテマトーシス、乾癬を治
療するために、作動薬及び拮抗剤によるＣＤ４−ＰＤＺ相互作用の調節を用いる
ことができるが、これに限定されない。 ６．５ ＰＤＺ−ＰＬ相互作用の作動薬及び拮抗剤 本明細書で記載するように、阻害剤又は拮抗剤の投与によって、細胞（例えば
、造血系細胞、例えば、Ｔ細胞及びＢ細胞）においてＰＺＤタンパク質とＰＬタ
ンパク質との相互作用を破壊してもよい。本明細書に記載されるスクリーニング
アッセイを用いて阻害剤を同定することができる。実施態様において、本明細書
に記載されるモチーフを用いて阻害剤を設計する。実施態様の中には、発明の拮
抗剤が表２に一覧されるＰＬドメインタンパク質のＣ末端残基を基にした構造（
例えば、ペプチド配列）を有するものもある。実施例の中には、発明の拮抗剤が
本明細書で開示されたＰＬモチーフを基にした構造（例えば、ペプチド配列）を
有するものもある。
【０１９６】 ＰＤＺ／ＰＬ拮抗剤及び本発明の拮抗剤は、ポリマー（例えば、オリゴペプチ
ド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチド）、小型分子、
抗体、糖、脂肪酸、ヌクレオチド及びヌクレオチド類縁体、天然に生じる構造の
類縁体（例えば、ペプチド模倣体、核酸類縁体など）、及び多数のその他の化合
物を含めて、天然に生じる及び合成の、有機及び無機の多数の化合物のいずれで
あってもよい。便宜上、本議論は主としてＰＤＺ−ＰＬ相互作用の拮抗剤を引用
するが、ＰＤＺ−ＰＬ相互作用の作動薬も本明細書で開示される方法において使
用できることは認識されるだろう。
【０１９７】 １つの態様では、本発明のペプチド及びペプチド模倣体は、Ｔ細胞及びＢ細胞
のような造血系細胞におけるＰＤＺドメインに結合するアミノ酸配列、又は、さ
もなければ、ＰＬタンパク質とＰＤＺタンパク質の会合を阻害するアミノ酸配列
を含有する。１つの実施態様では、拮抗剤は、表２に一覧されたＰＬタンパク質
のカルボキシ末端配列、例えば、表４に一覧されたペプチドに相当する配列を有
するペプチドを含む。典型的には、該ペプチドはＰＬタンパク質の少なくともＣ
末端４残基を含み、阻害性ペプチドは、ＰＬタンパク質Ｃ末端からの４を超える
残基（例えば、少なくとも、５、６、７、８、９、１０、１２又は１５残基）を
含むことが多い。例えば、下の６．５．１の項を参照のこと。その上、造血系細
胞及び内皮細胞によって発現される特異的表面受容体のＣ末端ドメインをそれ自
体、阻害剤として用いてもよく、非ペプチド阻害剤の合理的な設計の基礎として
用いてもよい。下の６．６の項を参照のこと。
【０１９８】 実施態様の中には、拮抗剤がそのような配列を含む融合タンパク質であるもの
もある。膜貫通トランスポータのアミノ酸配列を含有する融合タンパク質は特に
有用である。例えば、下の６．５．２の項を参照のこと。
【０１９９】 実施態様の中には、阻害剤が阻害活性を有するＰＬのＣ末端タンパク質配列の
変換変異体であるものもある。下の６．５．３の項を参照のこと。
【０２００】 実施態様の中には、拮抗剤がＰＬのＣ末端配列のペプチド模倣体であるものも
ある。下の６．５．４の項を参照のこと。
【０２０１】 実施態様の中には、阻害剤が小型分子（すなわち、１ｋＤ未満の分子量を有す
る）であるものもある。下の６．５．５の項を参照のこと。 ６．５．１ ペプチド拮抗剤 １つの実施態様では、拮抗剤は、表２に一覧されたＰＬタンパク質のカルボキ
シ末端の配列を有するペプチドである。ペプチドは少なくともＰＬタンパク質の
Ｃ末端の２つの残基を含み、典型的には、阻害性ペプチドは、ＰＬタンパク質Ｃ
末端からの２より多い残基（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２
又は１５残基）を含む。ＰＬタンパク質とともに阻害性ペプチドを分かち合う残
基はペプチドのＣ末端で見い出されることが最も多い。しかしながら、実施態様
の中には、配列が内部にあるものもある。同様に、阻害性ペプチドが、ＰＬタン
パク質のＣ末端ではないが、近傍であるＰＬ配列からの残基を含むこともある（
Gee et al., J. Biological Chem., 273:1980-87, 1998を参照のこと）。
【０２０２】 例えば、造血系細胞の表面受容体の『コアのＰＤＺモチーフ配列』はそのＣ末
端において最後の４つのアミノ酸を含有し、造血系細胞においてＰＤＺを標的と
するのにこの配列を用いてもよい。ＰＤＺモチーフ配列の４アミノ酸コアは、そ
の結合親和性及び／又は安定性をさらに高めるために、そのアミノ末端に追加の
アミノ酸を含有してもよい。１つの実施態様では、ＰＤＺモチーフ配列のペプチ
ドは４アミノ酸〜１５アミノ酸であってもよい。配列の長さは６〜１０アミノ酸
であることが好ましい。さらに好ましくは、ＰＤＺモチーフ配列は８アミノ酸を
含有する。コア配列のアミノ末端における追加のアミノ酸は、各造血系細胞表面
の受容体の天然の配列に由来しても、合成リンカーに由来してもよい。保存的に
追加のアミノ酸を置換してもよい。Ｃ末端から３番目の残基がＳ、Ｔ、又はＹで
ある場合、ペプチドを使用する前にこの残基がリン酸化されてもよい。
【０２０３】 実施態様の中には、ペプチド阻害剤及び非ペプチド阻害剤が小さいもの、例え
ば、ペプチドであれば、１０アミノ酸残基の長さより小さいものもある。さらに
、限られた数のリガンドアミノ酸がＰＤＺドメインと直接接触し（一般に８未満
）（Kozlov et al., Biochemistry 39:2572, 2000; Doyle et al., Cell 85:106
7, 1996）、Ｃ末端の３アミノ酸ほど短いペプチドがさらに長い（＞１５）アミ
ノ酸ペプチドと同様の結合特性を保持することが多い（Yanagisawa et al., J.
Biol. Chem., 272:8539, 1997）ということが報告されている。
【０２０４】 図３Ａ〜Ｈは、上で記載されたＧアッセイを用いてＰＬ−ＰＤＺ相互作用を阻
害するためのペプチドの使用を示す。図３Ａ及びＢでは、ＤＬＧ１又はＰＳＤ９
５（上の表３を参照のこと）からのＰＬドメインを含有するＧＳＴ融合タンパク
質を用いて阻害アッセイが行われた。種々の競合ペプチド（濃度１００μＭにて
）の存在下又は非存在下（１００％の結合と同等）にて、Ｃｌａｓｐ２、ＣＤ４
６、Ｆａｓ、又はＫＶ１．３（表４に一覧されるように）に関するビオチン化Ｐ
Ｌペプチドの結合を測定した。競合ペプチドは、Ｃｌａｓｐ２のＣ末端（ＭＴＳ
ＳＳＳＶＶ）、ＣＤ４６のＣ末端（ＲＥＶＫＦＴＳＬ）又はＦａｓのＣ末端（Ｒ
ＮＥＩＱＳＬＶ）を有する８アミノ酸ペプチド、ＫＶ１．３のＣ末端配列を有す
る非標識１９アミノ酸ペプチド（すなわち、表３に一覧されるような非ビオチン
化ＡＡ３３Ｌ）、又はヘモグロビンの６４〜７６残基の配列を有するペプチド（
Vidal et al., J. Immunol., 163:4811, 1999）、すなわち、無関係な競合物で
あった。ビオチン化ペプチド（ＦａｓとＫＶ１．３については１０μＭ、Ｃｌａ
ｓｐ２とＣＤ４６については２０μＭ）のＧＳＴのみに対する結合を融合タンパ
ク質に対する結合から差し引いて、各実験条件に対する正味のシグナルを得た。
この正味のシグナルを競合ペプチド非存在下のシグナルで割ることにより標準化
し、データをプロットした。エラーバーは２回の測定の標準偏差を示した。Ｃｌ
ａｓｐ２ ＰＬ−ＤＬＧ ＰＤＺ結合の特異的阻害は、ＣＬＡＳＰ２の８アミノ
酸、ＣＤ４６の８アミノ酸、Ｆａｓの８アミノ酸及びＫＶ１．３ペプチドと共に
認められたが、ペプチド非存在下又は無関係なペプチドを用いては認められなか
った。
【０２０５】 図３Ｃ〜Ｆは、阻害するのにさらに短いペプチド（例えば、３アミノ酸及び５
アミノ酸）を用いた同様のアッセイを示す。図３Ｃは、Ｃｌａｓｐ２のＣ末端の
配列(表３）を有する１ｍＭの３アミノ酸ペプチドの非存在下又は存在下におけ
る、Ｃｌａｓｐ２、ＣＤ４６、Ｆａｓ、又はＫＶ１．３に関するビオチン化ＰＬ
ペプチドの、ＮｅＤＬＧ、ＤＬＧ１又はＰＳＤ９５に由来するＰＤＺドメインを
含有するＧＳＴ融合タンパク質への結合を、指示した濃度（表３に一覧するよう
に）にて示す。図３Ｆは、４１．８Ｋｄに由来するＰＤＺドメインを含有するＧ
ＳＴ融合タンパク質への５アミノ酸ＣＤ４９Ｅペプチドの結合に対する影響を示
す。 ６．５．２ ペプチド変異体 ＰＤＺ結合ペプチド及びＰＤＺ−ＰＬ相互作用の阻害性配列を同定して、この
ような配列の変異体を作成し、ＰＤＺドメインの結合又はＰＤＺ−ＰＬ阻害活性
について得られた変異体を調べることができる。実施態様では、変異体は母型ペ
プチドと同一の又は異なった、ＰＤＺドメインへの結合能を有する。典型的には
、かかるアミノ酸置換は保存的であり、すなわち、アミノ酸残基は、それらが置
き換わる残基に似た物理的及び／又は化学的特性を有する他のアミノ酸残基で置
き換えられる。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、１つのアミノ酸が同一の指
定クラス内に包含されるもう１つのアミノ酸に置き換えられるようなものである
。 ６．５．３ ペプチド模倣体 ＰＤＺ結合ペプチド及びＰＤＺ−ＰＬ相互作用の阻害性配列を同定して、日常
の方法を用いてペプチド模倣体を調製することができ、本発明のアッセイを用い
て模倣体の阻害活性を確認することができる。従って、実施態様の中には、拮抗
剤がＰＬのＣ末端のペプチド模倣体であることもある。高度な熟練者は、科学文
献及び特許文献、例えば、有機合成総合編（Organic Syntheses Collective Vol
umes）（Gilman et al., eds., John Wiley & Sons Inc., NY）に十分に記載さ
れている多様な手順及び方法を用いて個々の合成残基及びポリペプチドを組み入
れる模倣体を合成することができることを認識するだろう。例えば、米国特許第
５，４２２，４２６号（Di Marchi et al.）に記載されるような固相合成法を用
いてポリペプチドを組み入れる模倣体を作成することができる。コンビナトリア
ル法を用いても本発明の模倣体を合成することができる。ペプチド及びペプチド
模倣体のライブラリを作成するための種々の方法が周知であり、それには、例え
ば、複数ピン、ティーバッグ、及びスプリット結合ミックス法が挙げられる；例
えば、al-Obeidi(1998) Mol. Biotechnil. 9:205-223; Hruby(1997) Curr. Opin
. Chem. Biol. 1:114-119; Ostergaad (1997) Mol. Divers. 3:17-27; Ostresh
(1996) Methods Enzymol., 267:220-234を参照のこと。 ６．５．４ 小型分子 実施態様の中には、阻害剤が小型分子（すなわち、１ｋＤ未満の分子量を有す
る）であることもある。小型分子をスクリーニングする方法は公知であり、上の
６．４の項に記載されたようなものを含む。 ６．６ 細胞の表面受容体及びＰＤＺドメインの結合配列 以下の項は、造血系及び免疫応答系における様々な型の細胞によって発現され
ている特異的な表面受容体を説明する。このような受容体のＣ末端は阻害剤とし
て使用され、又は、ＰＤＺ−ＰＬ相互作用を阻害するのに使用するためにＰＤＺ
モチーフ配列ペプチド、変異体、融合タンパク質、ペプチド模倣体及び小型分子
を設計するための基礎として役に立つ。好ましい実施態様では、本発明のアッセ
イで阻害活性又は調節活性についてペプチドを調べる（表４及び上の議論を参照
のこと）。 ６．６．１ Ｔ細胞表面受容体のＰＤＺモチーフ配列 Ｔ細胞によって発現される多数の表面受容体がＰＤＺモチーフ配列（ＰＬ配列
）を含有する。このような分子には、ＣＤ３η、ＣＤ４、ＣＤ６、ＣＤ３８、Ｃ
Ｄ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５３、ＣＤ８３、ＣＤ９０、ＣＤ９５、ＣＤ９７、
ＣＤ９８、ＣＤｗ１３７（４１ＢＢ）、ＣＤ１６６、ＣＤｗ１２８（ＩＬ−８Ｒ
）、ＤＮＡＭ−１、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）及びＬＰＡＰ（Barclay et al.
, 1997, The Leucocyte Antigen Facts Book, second eddition, Academic Pres
s）、ＣＬＳＳＰ−１、ＣＬＡＳＰ−２、ＣＬＡＳＰ−４、ＫＶ１．３及びＤＯ
ＣＫ２が挙げられる。
【０２０６】 ＣＤ３のＣ末端コア配列はＳＳＱＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）である。天然
に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含有タン
パク質を標的とするには、ＳＳＳＱＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、ＳＳＳＳＱ
Ｌ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、ＰＳＳＳＳＱＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）及
びＰＰＳＳＳＳＱＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）も用いてもよい。
【０２０７】 ＣＤ４のＣ末端コア配列はＣＳＰＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ９）である。天然に
生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含有タンパ
ク質を標的とするには、ＴＣＳＰＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、ＫＴＣＳＰ
Ｉ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、ＱＫＴＣＳＰＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２
）及びＦＱＫＴＣＳＰＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）も用いてもよい。
【０２０８】 ＣＤ６のＣ末端コア配列は、ＩＳＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）である。
天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含有
タンパク質を標的とするには、ＤＩＳＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）、ＤＤ
ＩＳＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、ＹＤＤＩＳＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１７）及びＤＹＤＤＩＳＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）も用いてもよい。
【０２０９】 ＣＤ３８のＣ末端コア配列はＴＳＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）である。
天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含有
タンパク質を標的とするには、ＣＴＳＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）、ＳＣ
ＴＳＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、ＳＳＣＴＳＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：２２）及びＤＳＳＣＴＳＥＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）も用いてもよい。
【０２１０】 ＣＤ４９ｅのＣ末端コア配列はＴＳＤＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）である
。天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含
有タンパク質を標的とするには、ＡＴＳＤＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）、Ｐ
ＡＴＳＤＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）、ＰＰＡＴＳＤＡ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：２７）及びＫＰＰＡＴＳＤＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）も用いてもよい
。
【０２１１】 ＣＤ４９ｆのＣ末端コア配列はＴＳＤＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）である
。天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含
有タンパク質を標的とするには、ＬＴＳＤＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、Ｒ
ＬＴＳＤＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、ＥＲＬＴＳＤＡ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：３２）及びＫＥＲＬＴＳＤＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）も用いてもよい
。
【０２１２】 ＣＤ５３のＣ末端コア配列はＴＩＧＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）である。
天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含有
タンパク質を標的とするには、ＱＴＩＧＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）、ＳＱ
ＴＩＧＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）、ＴＳＱＴＩＧＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：３７）及びＫＴＳＱＴＩＧＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）も用いてもよい。
【０２１３】 ＣＤ８３のＣ末端コア配列はＴＥＬＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８）である
。天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含
有タンパク質を標的とするには、ＫＴＥＬＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４９）、
ＨＫＴＥＬＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５０）、ＰＨＫＴＥＬＶ（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：２５１）及びＤＴＰＨＫＴＥＬＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５２）も用
いてもよい。
【０２１４】 ＣＤ９０のＣ末端コア配列はＦＭＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）である。
天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含有
タンパク質を標的とするには、ＤＦＭＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、ＴＤ
ＦＭＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、ＡＴＤＦＭＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：４２）及びＱＡＴＤＦＭＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）も用いてもよい。
【０２１５】 ＣＤ９５のＣ末端コア配列はＱＳＬＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）である。
天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含有
タンパク質を標的とするには、ＩＱＳＬＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）、ＥＩ
ＱＳＬＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）、ＮＥＩＱＳＬＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：４７）及びＲＮＥＩＱＳＬＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８）も用いてもよい。
【０２１６】 ＣＤ９７のＣ末端コア配列はＥＳＧＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）である。
天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含有
タンパク質を標的とするには、ＳＥＳＧＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０）、ＡＳ
ＥＳＧＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）、ＲＡＳＥＳＧＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：５２）及びＬＲＡＳＥＳＧＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３）も用いてもよい。
【０２１７】 ＣＤ９８のＣ末端コア配列はＰＹＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４）である。
天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含有
タンパク質を標的とするには、ＦＰＹＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５）、ＲＦ
ＰＹＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）、ＬＲＦＰＹＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：５７）及びＬＬＲＦＰＹＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８）も用いてもよい。
【０２１８】 ＣＤｗ１３７のＣ末端コア配列はＧＣＥＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９）であ
る。天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン
含有タンパク質を標的とするには、ＧＧＣＥＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）、
ＥＧＧＣＥＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１）、ＥＥＧＧＣＥＬ（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：６２）及びＥＥＥＧＧＣＥＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３）も用いてもよ
い。
【０２１９】 ＣＤ１６６のＣ末端コア配列はＫＴＥＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）である
。天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含
有タンパク質を標的とするには、ＨＫＴＥＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５）、Ｎ
ＨＫＴＥＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）、ＮＮＨＫＴＥＡ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：６７）及びＥＮＮＨＫＴＥＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８）も用いてもよい
。
【０２２０】 ＣＤｗ１２８のＣ末端コア配列はＳＳＮＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９）であ
る。天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン
含有タンパク質を標的とするには、ＶＳＳＮＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０）、
ＮＶＳＳＮＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１）、ＶＮＶＳＳＮＬ（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：７２）及びＳＶＮＶＳＳＮＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３）も用いてもよ
い。
【０２２１】 ＤＮＡＭ−１のＣ末端コア配列はＫＴＲＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４）であ
る。天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン
含有タンパク質を標的とするには、ＰＫＴＲＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５）、
ＲＰＫＴＲＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６）、ＲＲＰＫＴＲＶ（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：７７）及びＳＲＲＰＫＴＲＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）も用いてもよ
い。
【０２２２】 ＦａｓＬのＣ末端コア配列はＬＹＫＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９）である。
天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含有
タンパク質を標的とするには、ＧＬＹＫＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０）、ＦＧ
ＬＹＫＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１）、ＦＦＧＬＹＫＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：８２）及びＴＦＦＧＬＹＫＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３）も用いてもよい。
【０２２３】 ＬＰＡＰのＣ末端コア配列はＶＴＡＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４）である。
天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含有
タンパク質を標的とするには、ＨＶＴＡＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５）、ＬＨ
ＶＴＡＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６）、ＧＬＨＶＴＡＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：８７）及びＱＧＬＨＶＴＡＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８）も用いてもよい。
【０２２４】 ＣＬＡＳＰ−１のＣ末端コア配列はＳＡＱＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１８）
である。天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメ
イン含有タンパク質を標的とするには、ＳＳＡＱＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１
９）、ＳＳＳＡＱＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２０）、ＩＳＳＳＡＱＶ（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２２１）及びＳＩＳＳＳＡＱＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２２）
も用いてもよい。
【０２２５】 ＣＬＡＳＰ−２のＣ末端コア配列はＳＳＶＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２３）
である。天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメ
イン含有タンパク質を標的とするには、ＳＳＳＶＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２
４）、ＳＳＳＳＶＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５）、ＴＳＳＳＳＶＶ（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２２６）及びＭＴＳＳＳＳＶＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７）
も用いてもよい。
【０２２６】 ＣＬＡＳＰ−４のＣ末端コア配列はＹＡＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２８）
である。天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメ
イン含有タンパク質を標的とするには、ＲＹＡＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２
９）、ＰＲＹＡＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３０）、ＳＰＲＹＡＥＶ（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２３１）及びＧＳＰＲＹＡＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３２）
も用いてもよい。
【０２２７】 ＫＶ１．３のＣ末端コア配列はＦＴＤＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３８）であ
る。天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン
含有タンパク質を標的とするには、ＩＦＴＤＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３９）
、ＫＩＦＴＤＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４０）、ＫＫＩＦＴＤＶ（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：２４１）及びＩＫＫＩＦＴＤＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４２）も用
いてもよい。
【０２２８】 ＤＯＣＫ２のＣ末端コア配列はＳＴＤＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４３）であ
る。天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン
含有タンパク質を標的とするには、ＬＳＴＤＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４４）
、ＳＬＳＴＤＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４５）、ＤＳＬＳＴＤＬ（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：２４６）及びＰＤＳＬＳＴＤＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４７）も用
いてもよい。 ６．６．２ Ｂ細胞表面受容体のＰＤＺモチーフ配列 Ｂ細胞によって発現される多数の表面受容体はＰＤＺドメインのモチーフ配列
を含有している。このような分子には、ＣＤ３８、ＣＤ５３、ＣＤ９５、ＣＤ９
７、ＣＤ９８、ＣＤｗ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤｗ１２５（ＩＬ−５Ｒ）、ＤＮ
ＡＭ−１、ＬＰＡＰ、シンデカン−２（Barclay et al., 1997, The leucocyte
Antigen Facts Book, second edition, Academic Press）、及びＢＬＲ−１が挙
げられるが、これに限定されない。ＣＤ３８、ＣＤ５３、ＣＤ８３、ＣＤ９５、
ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤｗ１３７、ＤＮＡＭ−１、ＤＯＣＫ２、ＬＰＡＰ、Ｃ
ＬＡＳＰ−１、ＣＬＡＳＰ−２及びＣＬＡＳＰ−４の特異的モチーフ配列は前の
段落に記載した。
【０２２９】 ＣＤ１３８のＣ末端コア配列はＥＦＹＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９）である
。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、Ｂ細胞においてＰＤＺを含有す
るタンパク質を標的とするには、ＥＥＦＹＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０）、Ｑ
ＥＥＦＹＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１）、ＫＱＥＥＦＹＡ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：９２）及びＴＫＱＥＥＦＹＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３）も用いてもよい
。
【０２３０】 ＣＤｗ１２５のＣ末端コア配列はＤＳＶＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４）であ
る。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、Ｂ細胞においてＰＤＺを含有
するタンパク質を標的とするには、ＥＤＳＶＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５）、
ＬＥＤＳＶＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６）、ＴＬＥＤＳＶＦ（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：９７）及びＥＴＬＥＤＳＶＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７）も用いてもよ
い。
【０２３１】 シンデカン−２のＣ末端コア配列はＥＦＹＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５８）
である。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、Ｂ細胞においてＰＤＺを
含有するタンパク質を標的とするには、ＫＥＦＹＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５
９）、ＴＫＥＦＹＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６０）、ＰＴＫＥＦＹＡ（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２６１）及びＡＰＴＫＥＦＹＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６２）
も用いてもよい。
【０２３２】 ＢＬＲ−１のＣ末端コア配列はＬＴＴＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５３）であ
る。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、Ｂ細胞においてＰＤＺを含有
するタンパク質を標的とするには、ＳＬＴＴＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５４）
、ＴＳＬＴＴＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５５）、ＡＴＳＬＴＴＦ（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：２５６）及びＮＡＴＳＬＴＴＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５７）も用
いてもよい。 ６．６．３ ナチュラルキラー細胞の表面受容体のＰＤＺモチーフ配列 ＮＫ細胞によって発現される多数の表面受容体がＰＤＺドメインのモチーフ配
列を含有する。このような分子には、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ９８及びＤＮＡ
Ｍ−１が挙げられるが、これに限定されない。ＣＤ３８、ＣＤ９８及びＤＮＡＭ
−１の特異的モチーフ配列は前の段落に記載した。
【０２３３】 ＣＤ５６のＣ末端コア配列はＥＳＫＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９）である。
天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、ＮＫ細胞においてＰＤＺを含有す
るタンパク質を標的とするには、ＮＥＳＫＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００）、
ＥＮＥＳＫＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１）、ＫＥＮＥＳＫＡ（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１０２）及びＴＫＥＮＥＳＫＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３）も用い
てもよい。 ６．６．４ 単球の表面受容体のＰＤＺモチーフ配列 単球系列（単球及びマクロファージ）の細胞によって発現される多数の表面受
容体が、ＰＤＺドメインのモチーフ配列を含有する。このような分子には、ＣＤ
３８、ＣＤ４４、ＣＤ４６、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５３、ＣＤ６１、Ｃ
Ｄ９５、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ１４８、ＣＤｗ１２８、ＣＤｗ１３７、Ｌｙ
−６、ＤＮＡＭ−１及びＦｃεＲＩβが挙げられるが、これに限定されない。Ｃ
Ｄ３８、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５３、ＣＤ９５、ＣＤ９７、ＣＤ９８、
ＣＤｗ１２８、ＣＤｗ１３７、ＤＮＡＭ−１、ガレクチン３（Ｍａｃ−２）及び
マンノース受容体の特異的モチーフ配列は前の段落に記載した。
【０２３４】 ＣＤ４４のＣ末端コア配列はＫＩＧＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４）である
。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、単球においてＰＤＺを含有する
タンパク質を標的とするには、ＭＫＩＧＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５）、Ｄ
ＭＫＧＩＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６）、ＶＤＭＫＩＧＶ（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１０７）及びＮＶＤＭＫＩＧＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８）も用いて
もよい。
【０２３５】 ＣＤ４６のＣ末端コア配列はＦＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）である
。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、単球においてＰＤＺを含有する
タンパク質を標的とするには、ＫＦＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０）、Ｖ
ＫＦＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１）、ＥＶＫＦＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１１２）及びＲＥＶＫＦＴＳＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３）も用いて
もよい。
【０２３６】 ＣＤ６１のＣ末端コア配列はＫＳＬＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４）である
。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、単球においてＰＤＺを含有する
タンパク質を標的とするには、ＬＫＳＬＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５）、Ｆ
ＬＫＳＬＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６）、ＲＦＬＫＳＬＶ（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１１７）及びＧＲＦＬＫＳＬＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８）も用いて
もよい。
【０２３７】 ＣＤ１４８のＣ末端コア配列はＧＹＩＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９）であ
る。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、単球においてＰＤＺを含有す
るタンパク質を標的とするには、ＮＧＹＩＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０）、
ＴＮＧＹＩＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１）、ＫＴＮＧＹＩＡ（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１２２）及びＧＫＴＮＧＹＩＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３）も用い
てもよい。
【０２３８】 Ｌｙ−６のＣ末端コア配列はＱＴＬＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４）である
。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、単球においてＰＤＺを含有する
タンパク質を標的とするには、ＬＱＴＬＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５）、Ｌ
ＬＱＴＬＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６）、ＶＬＬＱＴＬＬ（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１２７）及びＳＶＬＬＱＴＬＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２８）も用いて
もよい。
【０２３９】 ＦｃεＲＩβのＣ末端コア配列はＰＩＤＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２９）で
ある。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、単球においてＰＤＺを含有
するタンパク質を標的とするには、ＰＰＩＤＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０）
、ＳＰＰＩＤＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１）、ＭＳＰＰＩＤＬ（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：１３２）及びＥＭＳＰＰＩＤＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３３）も用
いてもよい。
【０２４０】 ガレクチン３のＣ末端コア配列はＹＴＭＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３４）で
ある。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、単球においてＰＤＺを含有
するタンパク質を標的とするには、ＳＹＴＭＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３５）
、ＡＳＹＴＭＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６）、ＳＡＳＹＴＭＩ（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：１３７）及びＴＳＡＳＹＴＭＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８）も用
いてもよい。
【０２４１】 マンノース受容体のＣ末端コア配列はＨＳＶＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９
）である。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、単球においてＰＤＺを
含有するタンパク質を標的とするには、ＥＨＳＶＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４
０）、ＮＥＨＳＶＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１）、ＱＮＥＨＳＶＩ（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１４２）及びＥＱＮＥＨＳＶＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３）
も用いてもよい。 ６．６．５ 顆粒球の表面受容体のＰＤＺモチーフ配列 顆粒球によって発現される多数の表面受容体が、ＰＤＺドメインのモチーフ配
列を含有している。このような分子には、ＣＤ５３、ＣＤ９５、ＣＤ９７、ＣＤ
９８、ＣＤ１４８、ＣＤｗ１２５、ＣＤｗ１２８、ＦｃεＲＩβ及びＧ−ＣＳＦ
Ｒが挙げられるが、これに限定されない。このような分子のほとんどは前の段落
に記載した。
【０２４２】 Ｇ−ＣＳＦＲのＣ末端コア配列はＴＳＶＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４４）で
ある。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、単球においてＰＤＺを含有
するタンパク質を標的とするには、ＩＴＳＶＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４５）
、ＰＩＴＳＶＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４６）、ＦＰＩＴＳＶＬ（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：１４７）及びＬＦＰＩＴＳＶＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４８）も用
いてもよい。 ６．６．６ 内皮細胞の表面受容体のＰＤＺモチーフ配列 内皮細胞は造血系細胞ではないが、血管の内層を形成するので造血系と密接に
関わる。そういうものとして、内皮細胞は、造血系の細胞と接触する。従って、
内皮細胞の機能を調節する能力は造血系細胞の間接的な調節を規定する。内皮細
胞によって発現される多数の表面受容体がＰＤＺドメインのモチーフ配列を含有
する。このような分子にはＣＤ３４、ＣＤ４６、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ
１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ６２ｅ（Ｅ−セレクチン）及びＶＣＡＭ−１が挙げら
れるが、これに限定されない。
【０２４３】 ＣＤ３４のＣ末端コア配列はＤＴＥＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９）である
。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、内皮細胞においてＰＤＺを含有
するタンパク質を標的とするには、ＡＤＴＥＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５０）
、ＶＡＤＴＥＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５１）、ＶＶＡＤＴＥＬ（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：１５２）及びＨＶＶＡＤＴＥＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５３）も用
いてもよい。
【０２４４】 ＣＤ６６ｂ及びＣＤ６６ｃのＣ末端コア配列はＶＡＬＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１５４）である。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、内皮細胞にお
いてＰＤＺを含有するタンパク質を標的とするには、ＲＶＡＬＩ（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１５５）、ＡＲＶＡＬＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５６）、ＬＡＲＶＡ
ＬＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５７）及びＶＬＡＲＶＡＬＩ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１５８）も用いてもよい。
【０２４５】 ＣＤ１０５のＣ末端コア配列はＳＳＭＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５９）であ
る。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、内皮細胞においてＰＤＺを含
有するタンパク質を標的とするには、ＴＳＳＭＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６０
）、ＳＴＳＳＭＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６１）、ＣＳＴＳＳＭＡ（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１６２）及びＰＣＳＴＳＳＭＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６２）も
用いてもよい。
【０２４６】 ＣＤ１０６のＣ末端コア配列はＫＳＫＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６３）であ
る。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、内皮細胞においてＰＤＺを含
有するタンパク質を標的とするには、（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６４）、ＡＱＫ
ＳＫＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６５）、ＥＡＱＫＳＫＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１６６）及びＶＥＡＱＫＳＫＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６７）も用いてもよ
い。
【０２４７】 ＣＤ６２ｅのＣ末端コア配列はＳＹＩＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６８）であ
る。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、内皮細胞においてＰＤＺを含
有するタンパク質を標的とするには、ＰＳＹＩＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６９
）、ＫＰＳＹＩＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７０）、ＱＫＰＳＹＩＬ（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１７１）及びＹＱＫＰＳＹＩＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７２）も
用いてもよい。
【０２４８】 ＶＣＡＭ−１のＣ末端コア配列はＫＳＫＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３３）で
ある。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、内皮細胞においてＰＤＺを
含有するタンパク質を標的とするには、ＱＫＳＫＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３
４）、ＡＱＫＳＫＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３５）、ＥＡＱＫＳＫＶ（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２３６）及びＶＥＡＱＫＳＫＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３７）
も用いてもよい。 ６．６．７ 肥満細胞、好塩基球及び好酸球の細胞表面受容体 ＦｃεＲＩβ、ＣＤｗ１２５、ＣＤｗ１２８及びＩＬ−８ＲＢは、肥満細胞、
好塩基球及び好酸球により発現される膜貫通受容体である。このような受容体は
このような細胞の活性において役割を果し、アレルギー反応において脱顆粒及び
ヒスタミンの放出を招く。ＦｃεＲＩβのＣ末端コア配列は、ＰＩＤＬ（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：４）である。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、肥満
細胞においてＰＤＺを含有するタンパク質を標的とするには、ＰＰＩＤＬ（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：５）、ＳＰＰＩＤＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、ＭＳＰＰＩ
ＤＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）及びＥＭＳＰＰＩＤＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
８）も用いてもよい。 さらに、残基ＥをＧで置換してその結合親和性を高めて
もよい。
【０２４９】 ＣＤｗ１２５のＣ末端コア配列は、ＤＳＶＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）であ
る。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、肥満細胞においてＰＤＺを含
有するタンパク質を標的とするには、ＥＤＳＶＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）
、ＬＥＤＳＶＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、ＴＬＥＤＳＶＦ（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１２）及びＥＴＬＥＤＳＶＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）も用いても
よい。
【０２５０】 ＣＤｗ１２８のＣ末端コア配列は、ＳＳＮＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）で
ある。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、肥満細胞においてＰＤＺを
含有するタンパク質を標的とするには、ＶＳＳＮＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５
）、ＮＶＳＳＮＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、ＶＮＶＳＳＮＬ（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：１７）及びＳＶＮＶＳＳＮＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）も用いて
もよい。
【０２５１】 ＩＬ−８ＲＢのＣ末端コア配列は、ＳＴＴＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）で
ある。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、肥満細胞においてＰＤＺを
含有するタンパク質を標的とするには、ＴＳＴＴＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０
）、ＨＴＳＴＴＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、ＧＨＴＳＴＴＬ（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：２２）及びＳＧＨＴＳＴＴＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）も用いて
もよい。 ６．６．８ その他のＰＤＺモチーフ配列 ＮＭＤＡのＣ末端コア配列は、ＥＳＤＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６３）であ
る。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、神経細胞においてＰＤＺを含
有するタンパク質を標的とするには、ＩＥＳＤＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６４
）、ＳＩＥＳＤＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６５）、ＰＳＩＥＳＤＶ（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２６６）及びＭＰＳＩＥＳＤＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６７）も
用いてもよい。
【０２５２】 ニューレキシンのＣ末端コア配列は、ＥＹＹＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６８
）である。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、神経細胞においてＰＤ
Ｚを含有するタンパク質を標的とするには、ＫＥＹＹＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
２６９）、ＤＫＥＹＹＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７０）、ＫＤＫＥＹＹＶ（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７１）及びＮＫＤＫＥＹＹＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７
２）も用いてもよい。
【０２５３】 グリコフォリンＣのＣ末端コア配列は、ＥＹＦＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７
３）である。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、ＰＤＺを含有するタ
ンパク質を標的とするには、ＫＥＹＦＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７４）、ＲＫ
ＥＹＦＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７５）、ＳＲＫＥＹＦＩ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：２７６）及びＳＳＲＫＥＹＦＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７）も用いても
よい。
【０２５４】 ＣＤ１４８のＣ末端コア配列は、ＫＴＩＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７８）で
ある。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、上皮細胞又は骨髄細胞にお
いてＰＤＺを含有するタンパク質を標的とするには、ＧＫＴＩＡ（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：２７９）、ＦＧＫＴＩＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８０）、ＴＦＧＫＴ
ＩＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８１）及びＴＴＦＧＫＴＩＡ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：２８２）も用いてもよい。 ６．７ ペプチドの調製 ６．７．１ 化学合成 ペプチド及びペプチド類縁体の調製のための事実上公知のいかなる技法を用い
て、本発明のペプチド又はその類縁体を調製してもよい。例えば、従来の液相又
は固相ペプチド合成を用いて線状形態で調製し、樹脂から切断して精製してもよ
い（Creighton, 1983, Protein Structures And Molecular Principles, W.H. F
reeman and Co., N.Y.）。本明細書で記載されるペプチドを合成する方法は公知
である。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析又は配列決定で確認してもよい（
例えば、エドマン分解法及び質量分析計）。
【０２５５】 さらに、ペプチドの類縁体及び誘導体を化学的に合成することができる。本発
明のペプチドの各アミノ酸間の結合は、アミド、置換されたアミド又はアミドの
等配電子体であってもよい。非古典的なアミノ酸又は化学的なアミノ酸類縁体を
置換又は付加として配列に導入づることができる。非古典的なアミノ酸には、通
常のアミノ酸のＤ型異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、アブ、２−
アミノ酪酸、γ−アブ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミ
ノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン
、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグ
リシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β
−アラニン、フルオロアミノ酸、及びβ−メチルアミノ酸、Ｃ−メチルアミノ酸
、Ｎ−メチルアミノ酸のようなデザイナーアミノ酸、及び一般のアミノ酸類縁体
が挙げられるが、これに限定されない。さらに、アミノ酸はＤ（右旋体）又はＬ
（左旋体）であってもよい。 ６．７．２ 組換え合成 ペプチドが全体として遺伝子にコードされたアミノ酸で構成される場合、又は
その一部がそのように構成される場合、従来の組換え遺伝子工学技術を用いて、
ペプチド又は該当する部分を合成してもよい。組換え製造では、線状形態のペプ
チドをコードするポリヌクレオチドを適当な発現媒体、すなわち、挿入したコー
ド配列の転写と翻訳に必要な要素、又はＲＮＡウイルスベクターの場合は複製と
翻訳に必要な要素を含有するベクターに挿入する。次いで発現媒体を好適な標的
細胞に形質移入し、その細胞はペプチドを発現する。使用する発現システムに依
存して、当該技術で確立された手法によって発現されたペプチドを、次いで単離
する。組換えタンパク質及びペプチドの製造方法は公知である（例えば、Maniat
is et al., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual［分子クローニング
：実験室マニュアル］, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.; 及びAusubel e
t al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology［分子生物学の現代プ
ロトコール］, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.
を参照のこと）。
【０２５６】 本明細書で記載されたペプチドを発現するために多様な宿主−発現ベクター系
を利用してもよい。これらには、適当なコード配列を含有する組換えバクテリオ
ファージＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡ発現ベクターによって形質転換された細菌
；適当なコード配列を含有する酵母又は真菌発現ベクターによって形質転換され
た酵母又は糸状菌；適当なコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（
例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞システム；適当なコード配列
を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイル
ス又はタバコモザイクウイルス）を感染させた植物細胞システム、又は組換えプ
ラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）によって形質転換された植物
細胞システム；又は動物細胞システムが挙げられるが、これに限定されない。
【０２５７】 発現システムの発現要素はその強度及び特異性において異なる。利用する宿主
／ベクターシステムによって、構成的プロモータ及び誘導可能なプロモータを含
めて多数の好適な転写及び翻訳要素のいずれを発現ベクターで使用してもよい。
例えば、細菌システムでクローニングする場合は、バクテリオファージλのｐＬ
、ｐｌａｃ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモータ）などのよう
な誘導可能なプロモータを用いてもよく；昆虫細胞システムでクローニングする
場合は、バキュロウイルスの多面体プロモータのようなプロモータを用いてもよ
く；植物細胞システムでクローニングする場合は、植物細胞のゲノムに由来する
プロモータ（例えば、熱ショックプロモータ；ＲＵＢＩＳＣＯの小型サブユニッ
トのためのプロモータ；クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のためのプロモータ
）又は植物ウイルスに由来するプロモータ（例えば、ＣａＭＶの３５ＳＲＮＡプ
ロモータ；ＴＭＶの被膜タンパク質プロモータ）を用いてもよく；哺乳類細胞シ
ステムでクローニングする場合は、哺乳類ゲノムに由来するプロモータ（例えば
、メタロチオネイン・プロモータ）又は哺乳類ウイルスに由来するプロモータ（
例えば、アデノウイルス後期プロモータ；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモー
タ）を用いてもよく；発現産物の複数コピーを含有する細胞株を集める場合は、
適当な選択可能なマーカーと共に、ＳＶ４０−、ＢＰＶ−及びＥＢＶ−を基にし
たベクターを用いてもよい。
【０２５８】 植物の発現ベクターを用いる場合、本発明のペプチドをコードする配列の発現
は、多数のプロモータのいずれに由来してもよい。例えば、ＣａＭＶの３５ＳＲ
ＮＡ及び１９ＳＲＮＡプロモータ（Brisson et al., Nature 310:511-514, 1984
）又はＴＭＶの被膜タンパク質プロモータ（Takamatsu et al., EMBO J., 6:307
-311, 1987）を用いてもよく；別の方法としては、ＲＵＢＩＳＣＯの小型サブユ
ニット（Coruzzi et al., EMBO J., 3:1671-1680, 1984; Broglie et al., Scie
nce 224:838-843, 1984）又は熱ショックプロモータ、例えば大豆ｈｓｐ１７．
５Ｅ若しくはｈｓｐ１７．３Ｂ（Gurley et al., Mol. Cell Biol., 6:559-565,
1986）のような植物プロモータを用いてもよい。このようなコンストラクトを
Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接的ＤＮＡ形質転
換、微量注入法、エレクトロポレーションなどによってplanleucocyteに導入す
ることができる。かかる技法の概説については、Weissbach & Weissbach, 1988,
Methods for Plant Molecular Biology［植物の分子生物学のための方法］, Ac
ademic Press N.Y. のＶＩＩＩ章、４２１〜４６３ページ；及びGrierson & Cor
ey, 1988, Plant Molecular Biology［植物の分子生物学］ 第２版Blackie Lon
don Ch 7-9を参照のこと。
【０２５９】 本発明のペプチドを製造するために使用してもよい昆虫発現システムの１つで
は、外来遺伝子を発現するためのベクターとしてＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌ
ｉｆｏｒｎｉｃａ核ポリヒドローシスウイルス（ＡｃＮＰＶ）を用いる。ウイル
スはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｏｅｒｄａ細胞中で増殖する。ウイルス
の非必須領域（例えば、多面体遺伝子）にコード配列をクローニングし、ＡｃＮ
ＰＶプロモータ（例えば、多面体プロモータ）の制御のもとに置いてもよい。コ
ード配列の挿入が上手く行くと、多面体遺伝子の不活化が生じ、非閉塞組換えウ
イルス（すなわち、多面体遺伝子によってコードされるタンパク質様被膜を欠く
ウイルス）が生産される。次いでこのようなウイルスを用いて、Ｓｐｏｄｏｐｔ
ｅｒａ Ｆｒｕｉｐｅｒｄａ細胞に感染させ、そこで挿入された遺伝子が発現さ
れる（例えば、Smith et al., J. Virol., 46:584; 米国特許第４，２１５，０
５１号[スミス］を参照のこと）。さらに、この発現システムの例は、Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Vo
l.2, Ausubel et al., Greene Publish Assoc. & Wiley Interscience）の中で
見い出されてもよい。
【０２６０】 哺乳類の宿主細胞では、多数のウイルスを基にした発現システムが利用される
。発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合、アデノウイルスの転写／
翻訳制御複合体、例えば、後期プロモータ及び三部分リーダー配列にコード配列
を連結してもよい。次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏの組換えによ
ってこのキメラ遺伝子をアデノウイルスゲノムに挿入してもよい。ウイルスゲノ
ムの非必須領域（例えば、Ｅ１又はＥ３領域）における挿入によって、感染した
宿主の中で生存可能で、且つペプチドを発現することが可能な組換えウイルスを
生じる（例えば、Logan & Dhenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3655-3659,
1984を参照のこと）。別の方法としては、ワクシニア７．５Ｋプロモータを用
いてもよい（例えば、Mackett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7415-7
419, 1982; Mackett et al., J. Virol., 49:857-864, 1984; Panicali et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4927-4931を参照のこと）。
【０２６１】 本発明の線状ペプチドを製造するためのその他の発現システムは当業者には明
らかであろう。 ６．７．３ ペプチド及びペプチド類縁体の精製 例えば、高速液体クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル電気
泳動、アフィニティクロマトグラフィなどのような公知の技法によって本発明の
ペプチド及びペプチド類縁体を精製することができる。特定のペプチド又は類縁
体を精製するのに用いる実際の条件は、部分的には、正味の荷電、疎水性、親水
性などのような要因に依存しており、当業者には明らかであろう。例えば、放射
性標識後のゲル電気泳動、放射性免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ、バイオアッセイな
どを含む、その物理的又は機能的特性に基づいたアッセイによって精製されたペ
プチドを同定することができる。
【０２６２】 アフィニティクロマトグラフィ精製については、ペプチド又はペプチド類縁体
に特異的に結合するいかなる抗体を使用してもよい。抗体の産生については、ペ
プチドと共に注射することによって、ウサギ、マウス、ラットなどを含むが、こ
れに限定されない種々の宿主動物を免疫してもよい。側鎖官能基又は側鎖官能基
に結合したリンカーによって、ＢＳＡ又はＫＬＨのような好適なキャリアにペプ
チドを結合してもよい。宿主の種に依存して、免疫応答を高めるために種々のア
ジュバントを使用してもよく、それには、フロインド（完全及び不完全）、水酸
化アルミニウムのような無機ゲル、リソレシチンのような界面活性物質、プルロ
ニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルション、カサガイの
ヘモシアニン、ジニトロフェノール、及びＢＣＧ（カルメットーゲラン菌）並び
にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍのような潜在的に有用なヒト
アジュバントが挙げられるが、これに限定されない。
【０２６３】 培養中で維持されている細胞株による抗体分子の産生を供するいかなる技法を
用いて、ペプチドに対するモノクローナル抗体を調製してもよい。これらには、
元々ＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（Nature 256:495-497, 1975）によって
記載されたハイブリドーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kosbor et al., I
mmunology Today 4:72, 1983; Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2
026-2030, 1983）及びＥＢＶハイブリドーマ法（Cole et al., Monoclonal anti
bodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc., 77-96pp, 1985）が挙げられ
るが、これに限定されない。さらに、適当な抗原特異性のマウス抗体分子からの
遺伝子を適当な生物活性のヒト抗体分子の遺伝子と共にスプライシングすること
による『キメラ抗体』の産生のために開発された技術を使用することもできる（
Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855, 1984; Neuberge
r et al., Nature 312:604-608, 1984; Takeda et al., Nature 314:452-454, 1
985）。別の方法としては、単鎖抗体（米国特許第４，９４６，７７８号）の産
生に関して記載された技術をペプチド特異的な単鎖抗体を産生するのに当てはめ
ることができる。
【０２６４】 既知の技法によって特異的結合部位の欠失を含有する抗体断片を作成してもよ
い。例えば、かかる断片には、抗体分子のペプシン消化によって産生することが
できるＦ（ａｂ’）2断片、及びＦ（ａｂ’）2断片のジスルフィド結合を還元す
ることによって作成することができるＦａｂ断片が挙げられるが、これに限定さ
れない。別の方法としては、関心のあるペプチドに関する所望の特異性で、モノ
クローナルＦａｂ断片を迅速に且つ容易に同定することができるようにＦａｂ発
現ライブラリを構築してもよい（Huse et al., Science 246:1275-1281）。
【０２６５】 所望のペプチドに特異的な抗体又は抗体断片を、例えば、寒天に結合すること
ができ、抗体−寒天複合体は、本発明のペプチドを精製するための免疫クロマト
グラフィで使用することができる。Scopes, Protein Purification: Principles
and Practice (Springer-Verlag, New York Inc., NY, 1984) 及びLivingstone
, Methods Enzymology: Immunoaffinity Chromatography of Proteins 34:723-7
31, 1974を参照のこと。 ６．８ ＰＤＺドメインに結合し拮抗する化合物の使用 本発明の１つの態様では、本発明のＰＤＺドメイン結合及びＰＤＺ−ＰＬ阻害
性化合物は、造血系細胞（例えば、Ｔ細胞及びＢ細胞）及び免疫応答に関与する
その他の細胞の多様な活性を調節するのに有用である。
【０２６６】 本発明の１つの実施態様では、本発明の化合物は、サイトカインの産生、細胞
接着、細胞数の増加、アポトーシス及び細胞傷害を含むがこれに限定されない測
定可能な事象で示される白血球の活性化を阻害するために使用される。必然的な
結果として、急性並びに慢性の炎症、移植片対宿主病、移植の拒絶、過敏症、及
び多発性硬化症、慢性関節リウマチ、歯周病、全身性エリテマトーシス、若年性
糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、並びにアレルギーのような自己免疫性、及
び本明細書に一覧するその他の状態（例えば、上の６．４の項を参照のこと）を
含むが、これに限定されない望ましくない白血球の活性化に関連する多様な状態
を治療するのに本発明の化合物を用いてもよい。
【０２６７】 従って、本発明はまた、例えば、細胞傷害、サイトカインの産生、細胞増殖及
びアポトーシスによって測定されるような白血球の活性化を調節することにおい
て、かかる組成物を使用する方法にも関する。活性化のためのアッセイは周知で
ある。例えば、ＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤は以下のように評価することがで
きる：（１）放射性標識された標的細胞とともに細胞傷害性Ｔリンパ球をインキ
ュベートし、放射活性の放出によってこのような標的細胞の抗原特異的な細胞融
解を検出することができる、（２）抗原及び抗原提示細胞とともにヘルパーＴリ
ンパ球をインキュベートし、常法によりサイトカインの合成及び分泌を測定する
ことができる（Windhagan, A et al., Immunity 2(4):373-80, 1995）（３）タ
ンパク質抗原全体とともに抗原提示細胞をインキュベートし、Ｔリンパ球の活性
化又は生物学的方法のいずれかによってＭＨＣ上の該抗原の提示を検出すること
ができる（Harding et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:4230-4, 1989）、
(４)Ｆｃイプシロン受容体に架橋する試薬とともに肥満細胞をインキュベートし
、酵素免疫アッセイによってヒスタミンの放出を測定することができる（Siraga
nian et al., TIPS 4:432-437, 1983）。
【０２６８】 同様に、周知の種々の方法によって、白血球活性化の産物に対するＰＤＺ／Ｐ
Ｌ相互作用の拮抗剤の効果をモデル生物（例えば、マウス）又はヒト患者のどち
らかで評価することができる。例えば、（１）例えばＥＬＩＳＡのような現在臨
床検査で使用されている常法によって、ワクチン接種に対する応答における抗体
の産生を容易に検出することができる；（２）皮膚の表面を引っ掻き、無菌容器
に入れて引っ掻き部位の移動細胞を捕捉することによって、炎症部位の免疫細胞
の移動を検出することができる（Peters et al., Blood 72:1310-5, 1988）；（
３）3Ｈ−チミジンを用いることにより、マイトジェンに対する反応又は混合リ
ンパ球反応における末梢血単核細胞の増殖を測定することができる；(４)標識し
た粒子とともにウエルの中にＰＢＭＣを入れることによって、ＰＢＭＣ中の顆粒
球、マクロファージ及びその他の貪食細胞の貪食能を測定することができる。；
及び（５） ＣＤ４及びＣＤ８のようなＣＤ分子に対する抗体でＰＢＭＣを標識
し、このようなマーカーを発現するＰＢＭＣの分画を測定することにより、免疫
系細胞の分化を測定することができる。
【０２６９】 例示としてのアッセイの１つでは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＤＺ／ＰＬ相互作
用の拮抗剤を調べるために、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ)、ヒトＴ細胞株（
例えば、ジャーカットＥ６、ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５２）、ＥＢＶで形質転換さ
れたＢ細胞株（例えば、９Ｄ１０、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−８７５２）、抗原特異的
Ｔ細胞クローン又はその株を使用することができる。このような細胞又は細胞株
の活性化の阻害をＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤の可能性を評価するのに用いる
ことができる。
【０２７０】 それによって造血系細胞が免疫応答に特徴的な活性化を受けるように刺激され
る標準的な方法は、例えば： Ａ） 免疫応答の抗原特異的な刺激。 常法によって、免疫前のマウス又は免
疫経験のないマウスの脾細胞を作成することができる。さらに、抗原特異的なＴ
細胞クローン及びハイブリドーマ（例えば、ＭＢＰ特異的）及び多数のＢ細胞リ
ンパ腫細胞株（例えば、ＣＨ２７）が予め特徴付けられており、以下で議論する
アッセイで利用することができる。抗原特異的な脾細胞又はＢ細胞を抗原の存在
下、抗原特異的なＴ細胞と混合し、免疫応答を生じることができる。ＰＤＺ／Ｐ
Ｌ相互作用の拮抗剤の存在下又は非存在下でこれを行い、ＰＤＺ／ＰＬ相互作用
の拮抗剤が上の免疫応答を調節するかどうかをアッセイすることができる。
【０２７１】 Ｂ） 非特異的なＴ細胞の活性化。抗原の非存在下、Ｔ細胞を活性化するのに
以下の方法を用いることができる：１）共刺激分子に対する抗体、例えば、抗Ｃ
Ｄ２８とともに受容体活性化分子（例えば、ＴＣＲ、ＣＤ３又はＣＤ２）に対す
る抗体を添加することによるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の架橋；２）コンカナバリ
ンＡ（ＣｏｎＡ）及び植物凝集素（ＰＨＡ）のようなレクチンを用いた非特異的
手法における細胞表面受容体の活性化；３）タンパク質キナーゼＣを活性化する
薬剤（例えば、ホルボールエステル）及び細胞質Ｃａ2+を上昇させる薬剤（例え
ば、イオノマイシン）を用いた、表面受容体が介在する活性化の模倣。
【０２７２】 Ｃ） 非特異的なＢ細胞の活性化。１）ＩｇＭ、ＣＤ２０又はＣＤ２１のよう
な細胞表面分子に対する抗体の適用、２）バイパスで受容体刺激を誘発するため
に、リポ多糖類（ＬＰＳ）、ホルボールエステル、カルシウムイオノフォア及び
イオノマイシンを用いることもできる。
【０２７３】 Ｄ） 混合リンパ球反応（ＭＬＲ）。提供者のＰＢＭＣを受入者のＰＢＭＣと
混合し、ミスマッチの組織抗原の提示によってリンパ球を活性化するが、それは
、一卵性双生児以外いずれの場合でも起きる。
【０２７４】 Ｅ） 特定の抗原を認識する特異的Ｔ細胞のクローン又は株の作成。標準的な
アプローチは、最近破傷風毒素の追加注射を受けたことのある提供者から破傷風
毒素特異的Ｔ細胞を作成することである。細胞株又はＴ細胞クローンの特異性を
維持するために、主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）の一致した抗原提示細胞と
破傷風毒素源を用いる（Lanzavecchia A et al., Eur. J. Immunol., 13:733-73
8, 1983）。 アッセイの定量化 種々の周知の定量化法によって上記アッセイを定量化することができる。例え
ば： （Ａ）チロシンのリン酸化 ＨＳ１、ＰＬＣ−γ、ＺＡＰ−７６及びＶａｖのような早期反応性タンパク質
のチロシンのリン酸化は、白血球の活性化に続く早期の生化学的事象である。チ
ロシンがリン酸化されたタンパク質は、リン酸化チロシン残基に対する抗体を用
いたウエスタンブロットによって検出することができる。このような早期反応性
タンパク質のチロシンのリン酸化は、白血球の活性化に関する標準的なアッセイ
として用いることができる（J. Biol. Chem., 272(23):14562-14570, 1997）。
潜在的なＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤の存在下で免疫応答が生じる場合、この
ようなタンパク質又は関連するタンパク質のリン酸化パターンのいかなる変化も
潜在的なＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤を示すものである。
【０２７５】 （Ｂ）細胞内カルシウムの流入 予めカルシウムに感受性の色素を負荷することにより細胞の刺激後、時間を追
って細胞内Ｃａ2+濃度の動態を測定することができる。フローサイトメータ、溶
液フローメータ、及び共焦点顕微鏡を用いて、Ｃａ2+指示薬色素（例えば、フル
オロ−４［分子プローブ］）を結合することによる蛍光レベルの上昇が示される
。ＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤の存在下で免疫応答が生じる場合、カルシウム
流入のレベルや時間におけるいかなる変化もこの反応の阻害を示すものである。
【０２７６】 （Ｃ）早期活性化マーカーの調節 フローサイトメータを用いて、蛍光的に標識した抗体により、ＣＤ６９、ＩＬ
−２Ｒ、ＭＨＣクラスＩＩ、Ｂ７及びＴＣＲのような早期リンパ球活性化マーカ
ーの発現／レベルの調節における増減を一般的に測定する。抗体はすべて市販さ
れている。ＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤の存在下で免疫応答が生じる場合、リ
ンパ球活性化マーカーの発現レベルにおけるいかなる変化もこの反応の阻害を示
すものである。
【０２７７】 （Ｄ）代謝活性／酸放出の増加 最も知られたシグナル伝達経路の引き金の活性化によって、酸性代謝産物が増
加する。この再現可能な生物学的事象は、微量生理機能測定装置（分子装置）を
用いて、酸放出の速度として測定され、潜在的な生物学的療法による細胞の処置
を比較する場合、早期活性化マーカーとして用いられる（McConnell, H. M. et
al., Science 257:1906-1912, 1992 及びMcConnell H. M., Proc. Natl. Acad.
Sci. 92:2750-2754, 1995）。 対照試料（処置なし）と比較した、ＰＤＺ／ＰＬ
相互作用の拮抗剤で処置した試料の酸放出におけるいかなる統計的に有意な増減
も、生物学的な機能におけるＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤の影響を示唆してい
る。
【０２７８】 （Ｅ）細胞増殖／細胞生存性のアッセイ （１）3Ｈチミジンの取り込み ｉｎ ｖｉｔｒｏにて抗原又はマイトジェンにリンパ球を暴露してＤＮＡ合成
及び細胞増殖を誘導する。新しく合成されたＤＮＡへの3Ｈチミジンの取り込み
による分裂活性の測定は、Ｔ細胞活性化を定量するために最も頻繁に用いられる
アッセイの１つである。Ｔ細胞を活性化するのに用いられた細胞集団と刺激の形
態によって、3Ｈチミジンをパルスした後、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて２４〜７２時
間以内に分裂活性を測定することができる（Mishekk, B. B. & Shiigi, S. M.,
Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company, 1980
及びDutton, R.W. & Pearce J.D., Nature 194:93, 1962）。対照試料（処置な
し）と比較した、ＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤で処置した試料のＣＰＭにおけ
るいかなる統計的に有意な増減も、生物学的な機能におけるＰＤＺ／ＰＬ相互作
用の拮抗剤の影響を示唆している。 （２）ＭＴＳ［５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４，５−ジメ
チルチアゾリル）−３−（４−スルホフェニル）テトラゾリウム、分子内塩］は
、リンパ球の活性化後１〜５日間の増殖又は細胞傷害性アッセイにおける生存細
胞の数を測定する比色法である（Barltrop J.A., Bioorg. & Med. Chem. Lett.
1:611）。オーエン試薬である、ＭＴＳテトラゾリウム化合物は、細胞により生
体還元されて、組織培養培地に可溶性の着色したホルマザン産物になる。微量プ
レートリーダーを用いて、４９０ｎｍマイナス６５０ｎｍにて色強度を読み取る
。対照試料（処置なし）と比較した、ＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤で処置した
試料の色強度におけるいかなる統計的に有意な増減も、生物学的な機能における
ＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤の影響を示唆することができる（Mosmann T., J.
Immunol. methods 65:55, 1983及びBarltrop J.A. et al.）。 （３）ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、チミジン類縁体、ＤＮＡ合成を受
けている細胞に容易に組み入れる。酵素を結合した抗ＢｒｄＵ抗体によりＢｒｄ
Ｕでパルスした細胞を標識する（Gratzner, H.G., Science 218:474-475, 1982
）。ＢｒｄＵを取り込んだ、増殖している細胞を視覚化するために比色分析用の
可溶性基質を用いる。硫酸によって反応を止め、微量プレートリーダーを用いて
４５０ｎｍでプレートを読み取る。対照試料（処置なし）と比較した、ＰＤＺ／
ＰＬ相互作用の拮抗剤で処置した試料の色強度におけるいかなる統計的に有意な
増減も、生物学的な機能におけるＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤の影響を示唆し
ている。
【０２７９】 （Ｆ）アネキシンＶによるアポトーシス プログラム細胞死又はアポトーシスは、異化反応が細胞死を招くカスケードに
おける早期の事象である。細胞膜の完全性を喪失することによって蛍光的に共役
したホスファチジルセリンの結合ができるようになる。蛍光顕微鏡又はフローサ
イトメータによって染色された細胞を測定することができる（Vermes, L., J. I
mmunol. Methods 180:39-52, 1995）。１つの実施態様では、対照試料（処置な
し）と比較した、ＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤で処置した試料のアポトーシス
細胞の数におけるいかなる統計的に有意な増減も、生物学的な機能におけるＰＤ
Ｚ／ＰＬ相互作用の拮抗剤の影響を示唆する。 ｉｎ ｓｉｔｕでアポトーシス
を評価するために、ｉｎ ｖｉｖｏ試験において組織試料における細胞死を評価
するためのアッセイを用いることもできる。
【０２８０】 （Ｇ）サイトカイン産生の定量化 １６〜４８時間、細胞を刺激した後で回収された細胞上清を、サイトカイン産
生についてアッセイするまで、又は直接試験するまで、−８０℃にて保存する。
各試料について複数のサイトカインアッセイを行うことができる。マウス、ラッ
ト及びヒトについて、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＦＮ−γ及びその他のサイトカイ
ンのＥＬＩＳＡアッセイが利用できる（エンドゲン［Endogen］社及びバイオソ
ース）。製造元により記載されているような標準的な２抗体サンドイッチＥＬＩ
ＳＡプロトコールを用いてサイトカインの産生を測定する。３，３’５，５’−
テトラメチルベンジリジン（ＴＭＢ）によって西洋ワサビペルオキシダーゼの存
在を検出し、硫酸によって反応を止める。微量プレートリーダーを用いて、４５
０ｎｍにて吸収を測定する。対照試料（処置なし）と比較した、ＰＤＺ／ＰＬ相
互作用の拮抗剤で処置した試料の色強度におけるいかなる統計的に有意な増減も
、生物学的な機能におけるＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤の影響を示唆する。下
の実施例１を参照のこと。抗サイトカイン抗体を用いた細胞内サイトカインの検
出は、混合された細胞集団に関するサイトカインを測定するさらなる利点を提供
する。これによって、浮遊液又は組織におけるサイトカインを産生する細胞型の
頻度を測定する表現型決定を行うことができる。
【０２８１】 （Ｈ）免疫染色によってＮＦ−ＴＡを視覚化することができる。
【０２８２】 Ｔ細胞の活性化は、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦ−ＡＴ）の核への移入を必要
とする。抗ＮＦ−ＡＴ抗体で免疫染色することによってＮＦ−ＴＡのこの転移を
視覚化することができる（Cell 93:851-861, 1998）。従って、Ｔ細胞の活性化
をアッセイするのにＮＦ−ＡＴの核転移が用いられてきた。同様に、ＮＦ−ＡＴ
／ルシフェラーゼ・リポーターアッセイもＴ細胞活性化の標準的な測定法として
用いられてきた（MCB 12:7151-7160, 1996）。対照試料（処置なし）と比較した
、ＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤で処置した試料によってもたらされたＮＦ−Ａ
Ｔの核転移におけるいかなる統計的に有意な増減も、生物学的な機能におけるＰ
ＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤の影響を示唆する。本明細書で開示されたペプチド
及びペプチド類縁体のヒト被験者での使用を最適化するために、臨床パラメータ
を決定するのに種々の動物モデルを用いてもよい。例えば、心臓移植のマウスモ
デルにおいて、様々な投与量、剤形及び投与経路によって本発明の化合物で処置
して、固形臓器移植に対する拒絶反応を阻止する能力を最適化してもよい（Fulm
er et al., Am. J. Anat., 113:273, 1963; Jockusch et al., Exp. Neurol., 8
1:749, 1983）。
【０２８３】 Ｔ細胞応答の阻害が所望であるような状況では、ＰＤＺドメインのＣＤ３、Ｃ
Ｄ４、ＣＤ６及びＣＤｗ１３７との相互作用を阻害するために本発明の化合物を
使用してもよい。さらに、Ｂ細胞においてＰＤＺドメインとＣＤ５３及びＣＤ１
３８との相互作用を阻害するのに本発明の化合物を使用してもよい。ＩｇＥが介
在するアレルギー反応を阻害するために、ＰＤＺドメインとＦｃεＲＩβ、ＣＤ
ｗ１２５及びＣＤｗ１２８との相互作用を阻害するために本発明の化合物を用い
てもよい。さらに、リンパ腫のアポトーシスを誘導するためにＣＤ９５のＰＤＺ
モチーフ配列（ＰＬ配列）を用いてもよい。 （Ｉ）炎症性メディエイター放出分析 ＩｇＥ介在性の脱顆粒（に対する）化合物または治療の効果を入手するための
炎症性メディエイターの検定法は、この技術において周知である。たとえば、双
方とも参考文献として本文に編入されている、Bergerら、1997、Measuring Cell
Degranulation（細胞脱顆粒の測定）の、たとえば第１９．６章 Immunology M
ethod Manual（免疫学方法マニュアル）. アカデミック・プレス社、1436 - 144
0、およびSiraganian、1983 、Histamine Secretion from Mast Cells and Baso
phil（肥満細胞および好塩基球からのヒスタミン分泌）TIPS 4 : 432 - 437、を
参照のこと。 ６．９．製剤および投与経路 ６．９．１．アゴニストまたはアンタゴニスト（たとえばペプチドおよび融合 タンパク質）の細胞への導入 一つの観点においては、本発明のＰＤＺ−ＰＬアンタゴニストは、細胞の生物
機能または活性を調節する（すなわち増大または減少させる）べく、細胞内へ導
入される。多くの有機低分子は容易に細胞膜を横切る（または熟練者により、化
合物が細胞に入る能力を、たとえば電荷を減じるかまたは除去すること、親油性
を増大すること、細胞表面受容体をターゲットとする成分と当該分子を結合させ
、当該受容体と相互作用した後に、増加させるべく、慣例的な方法を用いて改造
されることが可能である）。より大きい分子、たとえばペプチドおよび融合タン
パク質を導入する方法も周知であり、たとえば、注射、リポソーム仲介性融合、
ヒドロゲル、細胞によってエンドサイトーシスされるターゲティング成分結合体
との結合、電気穿孔、およびその他を含む）。
【０２８４】 一つの態様においては、アンタゴニストまたは薬剤は、融合ポリペプチドまた
は誘導されたポリペプチドである。融合または誘導されたタンパク質は、当該ポ
リペプチドが細胞膜を横切る能力を増大させるか、または当該ポリペプチドを特
殊化された細胞型（たとえば、肝細胞または腫瘍細胞）に対して優先的に、ある
いは細胞区画（たとえば、核区画）に対して優先的に送達されるようにするター
ゲティング成分を含んでもよい。ターゲティング成分の実例は、リピドテイル、
アンテナポエディア（antenapoedia）ペプチドまたは核局在化シグナル（ＮＬＳ
；たとえばRobbinsら、1991、Cell 64 : 615、アフリカツメガエル核原形質）と
いったアミノ酸配列を含む。
【０２８５】 本発明の一つの態様においては、ＰＤＺドメイン−ＰＬタンパク質の結合を阻
害するべく決定されたペプチド配列またはペプチド類似体は、本発明の一つの検
定法においては、当該配列を原形質膜を通した輸送を促進するアミノ酸配列（「
膜貫通トランスポーター配列」）に対して結合することにより細胞内へ導入され
る。本発明のペプチドは、直接使用されるか、または細胞内へのそれらの侵入を
促進するべく、膜貫通トランスポーター配列に対して融合されてもよい。かかる
融合ペプチドの場合には、各々のペプチドは異種ペプチドと、そのアミノ末端に
おいて直接に、または１〜３回反復されたペンタマー Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｓ（配
列番号１）などの可撓性のポリリンカーを用いることにより融合されてもよい。
かかるリンカーは、ＶHとＶLとの間に挿入されることにより、単鎖抗体（ｓｃＦ
ｖ）の構築の使用されてきた（Birdら、1988、Science 242 : 423 - 426；Husto
nら、1988、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 : 5979 - 5883）。リンカーは
単鎖抗体の可変領域を形成している二つのβシート間の正しい相互作用を可能に
するべく設計されている。使用されてもよい他のリンカーは、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−
Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−
Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（配列番号２）（Chaudharyら、1990、Proc. Natl. Aca
d. Sci. U.S.A. 87 : 1066 - 1070）およびＬｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−
Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−
Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（配列番号３）(Birdら、1988、Scien
ce 242 : 423 - 426）を含む。
【０２８６】 当該技術においてはいくつかのペプチド配列が、これらの配列に結合されたペ
プチドの原形質膜を通した細胞内への侵入を促進することが可能であるとして記
述されている（Derossiら、1998、Trends in Cell Biol. 8 : 84）。本発明の目
的のためには、かかるペプチドは集合的に膜貫通トランスポーターペプチドと呼
ばれる。このようなペプチドの実例は、ＨＩＶ由来のｔａｔ（Vivesら、1997、J
. Biol. Chem. 272 : 16010；Nagaharaら、1993、Nat. Med. 4 : 1449）、ショ
ウジョウバエ由来のアンテナペディア（Derossiら、1994、J. Biol. Chem. 261
: 10444）、単純ヘルペスウイルス由来のＶＰ２２（ElliotおよびD’Hare、1997
、Cell 88 : 223 - 233）、抗ＤＮＡ抗体の相補正決定領域（ＧＤＲ）２および
３（Avrameasら、1998、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 : 5601 - 5606）、
７０ＫDａの熱ショックタンパク質（Fujihara、1999、EMBO J. 18 : 411 - 419
）、およびトランスポータン（transportan）(Poogaら、1998、FASEB J. 12 : 6
7 - 77）を含むが、これに制限されない。本発明の好ましい態様においては、Ｇ
ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号１７３）の配列を有する切断されたＨＩＶ
ｔａｔペプチドが用いられる。
【０２８７】 膜貫通トランスポーター配列は、そのアミノ末端において造血細胞表面の受容
体のカルボキシル末端に、リンカーを用いるかまたは用いずに融合されている。
一般的に、ＰＤＺモチーフ配列（ＰＬ配列）のC末端は、ＰＤＺドメインと相互
作用するために遊離していなければならない。膜貫通トランスポーター配列は全
体で、またはそれが細胞へのペプチドの侵入を促進することが可能である限り部
分的に使用されてもよい。
【０２８８】 本発明の別の態様においては、造血細胞表面の受容体のC末端配列は、それが
膜貫通トランスポーター配列の不在下に細胞への侵入を可能にする方法で送達さ
れる場合には、単独で用いられてよい。たとえば、当該ペプチドはリポソーム製
剤中においてか、またはＰＤＺモチーフのためのコード配列を単独で、あるいは
融合分子として送達することによる遺伝子治療アプローチを用いて、標的細胞内
に送達されてもよい。
【０２８９】 本発明の化合物は、当該ペプチド組成物の半減期を増す他に、リンパ組織など
の特定の組織に対して当該結合体をターゲットするために役立つか、または感染
細胞に対し選択的にターゲットされる、リポソームを経て投与されてもよい。リ
ポソームはエマルジョン、泡沫、ミセル、不溶性単分子層、液晶、リン脂質分散
、ラメラ層、およびその他を含む。このような標品中では、送達されるべきペプ
チドはリポソームの一部として、単独か、またはたとえばＣＤ４５抗原と結合す
るモノクローナル抗体などの、リンパ細胞の間で優勢な受容体と結合する分子と
、あるいは他の治療用または免疫原性組成物とともに取り込まれる。したがって
、所望のぺプチドまたは本発明の結合体で満たされたリポソームは、リンパ細胞
の部位に向けられることが可能であり、次いでリポソームはそこで、選ばれたイ
ンヒビター組成物を送達する。本発明において使用するためのリポソームは標準
的な小胞形成脂質から形成されるが、それは一般的に中性かつ負に帯電したリン
脂質と、コレステロールなどのステロールとを含む。脂質の選択は一般に、たと
えばリポソームの大きさ、酸不安定性、および血流中でのリポソームの安定性を
考慮することにより進められる。リポソームの調製には、たとえばSzokaら、Ann
. Rev. Biophys. Bioeng. 9 : 467（1980）、米国特許第４，２３５，８７１号
、４，５０１，７２８号および４、８３７、０２８号に記述されたような種々の
方法が利用できる。
【０２９０】 種々のターゲティング薬剤を用いたリポソームのターゲティングは、当該技術
において周知である（たとえば、米国特許第４，９５７，７７３号および第４，
６０３，０４４号を参照のこと）。免疫細胞に対するターゲティング用には、リ
ポソーム内に取り入れられるリガンドは、たとえば所望の免疫系細胞の細胞表面
決定基に特異的な抗体またはそのフラグメントを含むことが可能である。ペプチ
ドまたは結合体を含んでいるリポソーム懸濁物は、静脈内に、局部的に、局所的
、その他に、中でも投与の方式、送達される結合体、および治療される疾病の段
階に依存して、異なる用量で投与されてよい。
【０２９１】 ＰＤＺモチーフ配列（ＰＬ配列）ペプチドを特別の細胞種内へ特異的に送達す
るためには当該ペプチドは、成長因子、ホルモン、およびサイトカインなどの多
様な白血球表面分子のためのリガンド、ならびに抗体またはそれらの抗原結合フ
ラグメントを含むがこれに限定されない細胞特異ターゲティング成分に結合され
てよい。多数の細胞表面受容体が白血球において同定されているため、これらの
受容体に特異的なリガンドまたは抗体は、細胞特異ターゲティング成分として用
いられてよい。たとえば、インターロイキン２、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−
２（ＣＤ８６）、およびＣＤ４０またはそれらのペプチドフラグメントは、活性
化されたＴ細胞を特異的にターゲットするべく用いられてよい（The Leucocyte
Antigen Facts Book、1997 、Barclayら、（共編）、アカデミックプレス）。Ｃ
Ｄ２８、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ４０Ｌまたはそれらのペプチドは、Ｂ細胞を
特異的にターゲットするべく用いられてよい。さらにＦｃドメインは、単球など
のＦｃ受容体を発現しているある種の細胞をターゲットするべく用いられてよい
。
【０２９２】 抗体は、それらがどの細胞表面抗原に対しても生成され得るため、最も多目的
に使用できる細胞特異ターゲティング成分である。モノクローナル抗体は、ある
種のＣＤ抗原などの白血球系統特異マーカーに対して生成されてきた。抗体の可
変領域の遺伝子は、当該技術において周知の方法により、ハイブリドーマ細胞か
ら容易に単離されることが可能である。しかしながら、抗体は二つの重鎖と二つ
の軽鎖との間で構築されるため、本発明においてはｓｃＦｃが細胞特異ターゲテ
ィング成分として用いられることが好ましい。かかるｓｃＦｃは、可撓性のリン
カーペプチドによって一つのポリペプチド鎖に結合されたＶhおよびＶLドメイン
から構成される。
【０２９３】 ＰＤＺモチーフ配列（ＰＬ配列）は、膜貫通トランスポーター配列および細胞
特異ターゲティング成分に結合されて、三重の融合分子を生じてもよい。この分
子は白血球表面分子に結合し、細胞膜を通過し、さらにＰＤＺドメインをターゲ
ットすることが可能である。別法として、ＰＤＺモチーフ配列（ＰＬ配列）は、
当該融合ペプチドをインターナライズする表面分子に結合する、細胞特異ターゲ
ティング成分に対して結合されてもよい。
【０２９４】 他の一つのアプローチにおいては、混合アミノ酸の人工ポリマーから成るミク
ロスフェア（プロテイノイド）が、薬剤を送達するべく用いられてきた。たとえ
ば、米国特許第４，９２５，６７３号は、薬剤を含んでいるプロテイノイドミク
ロスフェア担体、ならびにそれらの調製法および用途について記述している。こ
のようなプロテイノイドミクロスフェアは、いくつかの活性薬剤の送達にとって
有用である。参考文献として本文に編入されている米国特許第５，９０７，０３
０号および第６，０３３，８８４号を参照のこと。
【０２９５】 ６．９．２．ポリヌクレオチドの細胞内への導入 表面受容体Ｃ末端ペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、種々の白血
球活性化に関連した異常状態の治療に有用であってよい。細胞内に遺伝子配列を
導入することにより、白血球が活性化されて有害な結果を生じる状態を治療する
べく、遺伝子療法が用いられることができる。一つの態様においては、本発明の
ＰＬ配列ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、それが発現される細胞内へ
導入される。発現されたペプチドは、次に細胞内におけるＰＤＺタンパク質とＰ
Ｌタンパク質との相互作用を阻害する。
【０２９６】 したがって、一つの態様においては、本発明のポリペプチドは細胞内で、所望
のタンパク質またはペプチドをコードしている核酸（たとえばＤＮＡ発現ベクタ
ーまたはｍＲＮＡ）を当該細胞内に導入することにより発現される。発現はベク
ターおよびプロモーターの選択に依存して、構成性かまたは誘導性のいずれかで
あってよい。核酸の導入ならびに発現のための方法は当該技術において周知であ
り、本文に記述されている。
【０２９７】 一つの特別の態様においては、本文に述べられたペプチドをコードしている配
列を含んでいる核酸が、ヒトの患者に投与される。この態様においては、当該核
酸はそのコード産物を産生し、それが白血球の活性化を阻害することにより治療
効果を取り次ぐ。当該技術において利用可能な遺伝子療法のためのいかなる方法
も、本発明に従って使用されることができる。以下に代表的な方法が述べられて
いる。
【０２９８】 遺伝子療法についての全般的な総説としては、Goldspielら、1993、Clinical
Pharmacy 12 : 488 - 505；WuおよびWu、1991、Biotherapy 3 : 87 - 95；Tolst
oshev、1993、Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32 : 573 - 596；Mulligan、199
3、Science 260 : 926 - 932；およびMorganおよびAnderson、1993、Ann. Rev.
Biochem. 62 : 191 - 217；May、1993、TIBTECH 11（5）:155 - 215参照のこと
。使用可能な組換えＤＮＡ技術において一般的に知られている方法は、Ausubel
ら（共編）、1993、Current Protocols in Molecular Biology、ジョン・ウィリ
ー＆サンズ、ニューヨーク州；およびKriegler、1990、Gene transfer and Expr
ession、 A Laboratory Manual、ストックトン（Stockton）プレス、ニューヨー
ク州、に記述されている。
【０２９９】 本発明の一つの好ましい態様においては、治療用組成物は発現ベクターの部分
であるコーディング配列を含む。とくに、かかる核酸は、当該コーディング配列
に操作可能に結合されたプロモーターを有しており、前記プロモーターは誘導可
能であるかまたは構成性であり、さらに任意で組織特異性である。もう一つの特
別の態様においては、一つの核酸分子が用いられており、その中でコーディング
配列と他の所望の配列とは、ゲノム内の所望の部位において相同組換えを促進す
る領域によってフランクされており、したがって当該核酸の染色体内発現が提供
される（KollerおよびSmithies、1989、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.86 : 89
32 - 8935；Zijlstraら、1989、Nature 342 : 435 - 438）。
【０３００】 当該核酸の患者への送達は直接的でよく、この場合には当該患者は当該核酸ま
たは核酸を運んでいるベクターに直接暴露されるか、あるいは間接的でよく、こ
の場合にはまず細胞が当該核酸によってインヴィトロでトランスフォームされ、
次いで当該患者に移植される。これらの二つのアプローチは、各々インヴィヴォ
またはエクスヴィヴォ（生体外）の遺伝子療法として知られている。
【０３０１】 一つの特別の態様においては、当該核酸はインヴィヴォにおいてコードされた
産物を産生するべく発現される場所に直接投与される。このことは、当該技術に
おいて周知のいかなる方法によっても、たとえばそれを適当な核酸発現ベクター
の部分として構築すること、およびそれを、たとえば欠損または弱毒化されたレ
トロウイルスまたは他のウイルスベクターを用いた感染によるか（米国特許第４
，９８０，２８６号参照のこと）、むきだしのＤＮＡの直接の注射によるか、微
粒子衝撃によるか（たとえば、遺伝子銃；バイオリスティック（Biolistic）、
デュポン）、脂質または、細胞表面の受容体またはトランスフェクト薬剤を用い
たコーティングによるか、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセル内への
封入によるか、核に侵入することが知られているペプチドに対してそれを結合さ
せて投与することによるか、または受容体を発現している細胞種を特異的にター
ゲットするべく用いられることが可能な、受容体仲介エンドサイトーシスを受け
やすいリガンドに対してそれを結合させて投与することにより（たとえばWuおよ
びWu、1987、J. Biol. Chem. 262 : 4429 - 4432参照）、投与してそれが細胞内
となるようにすることにより成就されることが可能である。もう一つの態様にお
いては、核酸ーリガンド複合体が形成されることが可能であり、その中で当該リ
ガンドはエンドソームを破壊するためのフゾジェニック（融合原性、fusogenic
）なウイルスペプチドを含み、当該核酸がリソソームによる分解を回避できるよ
うにする。さらにもう一つの態様においては、特異的な受容体をターゲティング
することにより、当該核酸はインヴィヴォにおいて細胞特異な取り込みおよび発
現のためにターゲティングされることが可能である（たとえば、ＰＣＴ公開、１
９９２年４月１６日付けのＷＯ９２／０６１８０；１９９２年１２月２３日付け
のＷＯ９２／２２６３５；１９９２年１１月２６日付けのＷＯ９２／２０３１６
；１９９３年７月２２日付けのＷＯ９３／１４１８８；１９９３年１０月１４日
付のＷＯ９３／２０２２１を参照のこと）。別法として、当該核酸は相同組換え
により細胞内に導入され、かつ発現のため宿主細胞のＤＮＡ内に取り込まれるこ
とができる（KollerおよびSmithies、1989、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :
8932 - 8935；Zijlstraら、1989、Nature 342 : 435 - 438）。
【０３０２】 本発明の好ましい態様においては、ウイルスベクターとしてアデノウイルスが
遺伝子療法に使用されることが可能である。アデノウイルスは非分裂細胞に感染
することができるという利点を有する（KozarskyおよびWilson、1993、Current
Opinion in Genetics and Development 3 : 499 - 503）。遺伝子療法における
アデノウイルスの使用の他の例は、Rosenfeldら、1991、Science 252 : 431 - 4
34；Rosenfeldら、1992、Cell 68 : 143 - 155；およびMastrangeliら、1993、J
. Clin. Invest. 91 : 225 - 234に見ることができる。さらに、修正された指向
性をもつアデノウイルスベクターが細胞特異ターゲティングに用いられてよい（
ＷＯ９８／４０５０８）。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）もまた遺伝子療法にお
ける使用に向けて提案されている（Walshら、1993、Proc. Soc. Exp. Biol. Med
. 204 : 289 - 300）。
【０３０３】 さらに、レトロウイルスベクター（Millerら、1993、Meth. Enzymol. 217 : 5
81 - 599）は、ウイルスゲノムのパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの組込
みに必要ではないレトロウイルス配列を削除するべく修正されている。遺伝子療
法に用いられるコーディング配列はベクター内にクローン化され、それは当該遺
伝子の患者への送達を促進する。レトロウイルスベクターについてのさらなる詳
細は、Boesenら、1994、Biotherapy 6 : 291 - 302に見ることができるが、それ
は幹細胞を化学療法に対してより抵抗性にする目的で、ｍｄｒＩ遺伝子を造血幹
細胞に送達するためのレトロウイルスベクターの使用について記述している。遺
伝子療法におけるレトロウイルスベクターの使用を説明している他の参考文献は
：Clowesら、1994、J. Clin. Invest. 93 : 644 - 651；Kiemら、1994、Blood 8
3 : 1467- 1473；SalmonsおよびGunzberg、1993、Human Gene Therapy 4 : 129
- 141；およびGrossmanおよびWilson、1993、Genetics and Devel. 3 : 110 - 1
14におけるCurr. Opin. である。
【０３０４】 遺伝子療法へのもう一つのアプローチは、組織培養における細胞へ遺伝子を移
入することを含む。通常、移入の方法は当該細胞への選択可能なマーカーの移入
を含む。次いで当該細胞は移入された遺伝子を取り込みかつ発現している細胞を
単離するための選別下に置かれる。このような細胞は次いで患者に送達される。
【０３０５】 この態様においては、結果として生じる組換え細胞のインヴィヴォの投与に先
立ち、当該核酸が細胞内に導入される。かかる導入は、トランスフェクション、
電気穿孔、リポフェクション、マイクロインジェクション、当該核酸配列を含ん
でいるウイルスまたはバクテリオファージを用いた感染、細胞融合、染色体仲介
遺伝子移入、微小核体仲介遺伝子移入、スフェロプラスト融合、その他を含むが
これに制限されない当該技術において周知のいかなる方法によっても行なわれる
ことができる。当該技術においては、外来遺伝子を細胞内に導入するための数多
くの技術が周知であり（たとえば、LoefflerおよびBehr、1993、Meth. Enzymol.
217 : 599 - 618；Cohenら、1993、Meth. Enzymol. 217 : 618 - 644 ; Cline
、1985、Pharmac. Ther. 29 : 69 - 92を参照のこと）、また受容細胞について
の必要な発生および生理的機能が破壊されてさえいなければ、本発明に従って使
用されてよい。当該技術は細胞への核酸の安定な移入に必要な手段を備えている
べきであり、それにより核酸は細胞による発現が可能であり、かつ好ましくは遺
伝性であって、その子孫細胞による発現が可能であるようにする。好ましい態様
においては、遺伝子療法に用いられる細胞は患者にとって自己由来である。
【０３０６】 一つの特別の態様においては、遺伝子療法を目的として導入される核酸は、コ
ーディング配列に対して操作可能に結合された誘導性のプロモーターを含んでお
り、当該核酸の発現が適当な転写誘導物質の有無を調節することにより制御され
ることができるようにする。
【０３０７】 白血球表面受容体のｍＲＮＡ、特にそのC末端の翻訳を阻害するべく機能する
アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子などのオリゴヌクレオチド、およびリボザ
イムもまた本発明の範囲内にある。アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子は、タ
ーゲットされたｍＲＮＡに結合することおよびタンパク質の翻訳を妨げることに
り、ｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するべく作用する。アンチセンスＤＮＡに関して
は、翻訳開始部位、たとえば−１０と＋１０の間のヌクレオチド配列、に由来す
るオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０３０８】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラ
シル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン
、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５
−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキリメチルア
ミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、
イノシン、Ｎ６−イソペンタニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイ
ノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン
、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグア
ニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオ
ウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５´−メトキシカルボキシメチル
ウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデ
ニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（v）、ワイブトキソジン（wybutoxosine）、
プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウ
ラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル
−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（v）、５−メチ
ル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）
ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含むがこれに制限
されない群より選ばれる、少なくとも一つの修飾された塩基部分を含んでよい。
【０３０９】 リボザイムは、ＲＮＡの特異的な切断を触媒することができる酵素的なＲＮＡ
分子である。リボザイムの作用機構は、相補的なターゲットＲＮＡに対してのリ
ボザイム分子の配列特異なハイブリダイゼーションと、それに続くエンドヌクレ
オリティックな切断を含む。白血球表面受容体のＲＮＡ配列のエンドヌクオリテ
ィックな切断を特異的かつ効率的に触媒する工作されたハンマーヘッドモチーフ
リボザイム分子は、本発明の範囲内にある。
【０３１０】 潜在性のＲＮＡターゲット内の特異的なリボザイム切断部位は、まず当該ター
ゲット分子を以下の配列、ＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣを含むリボザイム切断
部位について走査することにより同定される。一旦同定されれば、当該切断部位
を含んでいる、ターゲット遺伝子の領域に相当する１５と２０の間のリボヌクレ
オチドから成る短いＲＮＡ配列が、オリゴヌクレオチド配列を不適当にしてもよ
い二次構造などの予測された構造上の特徴について査定されてよい。候補ターゲ
ットの適性も、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイを用いて、相補的なオ
リゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションについて、その影響の受けやすさ
を検査することにより査定されてよい。
【０３１１】 本発明のアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子とリボザイムは、当該技術にお
いて核酸分子の合成用として周知のいかなる方法によっても調製されてよい。こ
れらは、たとえば固相ホスホルアミダイト化学合成といった当該技術において周
知の、オリゴデオキシリボヌクレオチドの化学合成用の技術を含む。別法として
、ＲＮＡ分子は、当該ＲＮＡ分子をコードしているＤＮＡ配列のインヴィトロお
よびインヴィヴォにおける転写により生成されてもよい。かかるＤＮＡ配列は、
Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの、適当なプロモーターを含む
種々のベクター内に取り込まれてよい。別法として、用いられたプロモーターに
依存して構成性または誘導性にアンチセンスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤ
ＮＡ構築物が、細胞系内に安定に導入されることができる。
【０３１２】 細胞内での安定性および半減期の増大のための手段として、ＤＮＡ分子に対す
る種々の修飾が導入されてよい。可能な修飾は、オリゴデオキシリボヌクレオチ
ドバックボーン内のホスホジエステラーゼ結合よりもむしろ、当該分子の５´お
よび／または３´末端に対するリボ−またはデオキシ−ヌクレオチドのフランキ
ング配列の付加か、またはホスホロチオエートまたは２´Ｏ−メチルの使用を含
むがこれに制限されない。
【０３１３】 ６．９．３．他の薬剤組成物 本発明の化合物はそれ自体で、または無菌の組成物または薬剤組成物の形状で
患者に投与されてよい。本発明の化合物を含んで成る薬剤組成物は、通常の混合
、溶解、顆粒化、糖衣作成、研和、乳化、カプセル化、閉じ込め（entrapping）
、または凍結乾燥の工程といった手段により製造されてよい。薬剤組成物は、活
性ペプチドまたはペプチド類似体の、薬剤学的に使用可能な製剤への加工を促進
する一つまたはそれより多い生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、また
は佐剤を用いて、通常の方式において製剤されてよい。適切な製剤は、選ばれた
投与経路に依存する。
【０３１４】 局所投与のためには、本発明の化合物は当該技術において周知のような溶液、
ゲル、軟膏、クリーム、懸濁液、その他として製剤されてよい。
【０３１５】 全身用の製剤は、注射、たとえば皮下、静脈内、筋肉内、髄腔内、または腹腔
内注射による投与のために設計されたもの、ならびに経皮、経粘膜、経口、また
は経肺性の投与のために設計されたものを含む。
【０３１６】 注射用には、本発明の化合物は水溶性の溶液、好ましくはハンクス液、リンガ
ー液、または生理食塩水緩衝液といった生理学的に適した緩衝液において製剤さ
れる。当該溶液は、懸濁、安定化および／または分散剤といった製剤用薬剤を含
んでもよい。
【０３１７】 別法として、当該化合物は適当な賦形剤、たとえば、使用の前に発熱性物質な
しの滅菌水を用いて構成するための、粉末の形状であってもよい。
【０３１８】 経粘膜投与のためには、浸透されるべき障壁に適した浸透剤が製剤に使用され
る。かかる浸透剤は、当該技術において一般的に知られている。この投与経路は
、当該化合物を鼻腔へ送達するべく用いられてよい。
【０３１９】 経口投与には、当該化合物は活性ペプチドまたはペプチド類似体を、当該技術
において周知の薬剤学上許容される担体と結びつけることにより、容易に製剤さ
れることが可能である。かかる担体は、本発明の化合物が、治療されるべき患者
による経口摂取のための、錠剤、丸剤、糖衣丸、カプセル、液体、ゲル、シロッ
プ、スラリー、懸濁液、およびその他として製剤されることを可能にする。たと
えば粉末、カプセル、および錠剤といった経口用の固形の製剤のためには、適当
な賦形剤は、ラクトース、スクロース、マンニトール、およびソルビトールなど
の糖類；トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデ
ンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピル
メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポ
リビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース標品；顆粒化剤；および結着剤
などの賦形剤を含む。所望であれば、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、
またはアルギン酸か、またはアルギン酸ナトリウムなどのそれらの塩といった崩
壊剤が添加されてよい。
【０３２０】 所望であれば、固形の剤形は標準的な技術を用いて糖衣または腸溶性であって
よい。
【０３２１】 たとえば懸濁液、エリキシル剤、および溶液などの、経口用の液体標品用には
、適当な担体、賦形剤、または希釈剤は、水、グリコール、油、アルコール、そ
の他を含む。さらに、着香料、保存料、着色剤、およびその他が添加されてよい
。
【０３２２】 バッカル投与用には、当該化合物は通常の方式で製剤された錠剤、トローチ剤
、その他の形状で摂取されてよい。
【０３２３】 吸入による投与のためには、本発明による化合物は、適当な噴射剤、たとえば
、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフル
オロメタン、二酸化炭素、または他の適当なガスの使用とともに、加圧されたパ
ックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレイの形状にて便利に送達される
。加圧されたエアロゾルの場合には、計測された量を送達するためのバルブを備
えることにより、用量単位が決定されてもよい。吸入器および注入器における使
用のための、たとえばゼラチンから成るカプセルおよびカートリッジは、当該化
合物と、ラクトースまたはデンプンなどの適当な粉末基剤との粉末混合物を含ん
で製剤されてよい。
【０３２４】 当該化合物はまた、たとえば、カカオバターまたは他のグリセリドといった通
常の坐剤用基剤を含んでいる、坐剤または停留浣腸などの、直腸用または膣用の
組成物において製剤されてもよい。
【０３２５】 先に述べた製剤に加えて、当該化合物はまたデポ製剤として製剤されてもよい
。かかる長期間作用性の製剤は、移植（たとえば皮下または筋肉内への）による
か、または筋肉内注射により投与されてよい。したがって、たとえば、当該化合
物は適当な高分子または疎水性の物質（たとえば許容される油中のエマルジョン
）またはイオン交換樹脂とともに、あるいはやや溶けにくい誘導体、たとえばや
や溶けにくい塩として製剤されてよい。
【０３２６】 別法として、他の薬剤送達システムが使用されてもよい。リポソームとエマル
ジョンとは、本発明のペプチドおよびペプチド類似体を送達するべく用いられて
よい送達媒体の周知の例である。ジメチルスルホキシドなどの、ある種の有機溶
媒もまた用いられるが、通常はより大きい毒性という代償を払っている。さらに
、当該化合物は治療用薬剤を含んでいる固形ポリマーから成る半透性物質などの
、持続放出システムを用いて送達されてもよい。いくつかの持続放出物質が確立
されており、当業者には周知である。持続放出カプセルは、その化学的性質に依
存して、数週間にわたり、１００日を超えるまで当該化合物を放出する。治療用
薬剤の化学的性質と生物学的安定性とに依存して、タンパク質安定化のための付
加的な戦略が用いられてよい。
【０３２７】 本発明の化合物は荷電のある側鎖または末端を含んでよいため、それらは上記
のいかなる製剤においても、遊離の酸または塩基として、あるいは薬剤学的に許
容される塩として含まれてよい。薬剤学的に許容される塩は、遊離塩基の生物活
性を実質的に保持しており、かつ無機酸との反応によって調製されるような塩で
ある。薬剤学的な塩は、水性および他のプロトン性溶媒中では、対応する遊離塩
基の形状であるよりもさらに可溶性である。 ６．１０．有効量 本発明の化合物は一般的に、意図された目的を遂行するべく有効な量において
使用されるであろう。白血球の活性化に関連した疾患を阻害するための使用には
、本発明の化合物またはそれらの薬剤学的組成物は、治療上有効な量において投
与または適用される。治療上有効な量によって意味されるものは、症状を改善ま
たは予防するか、あるいは治療される患者の生存を引き伸ばす有効量である。治
療上有効な量の決定は、特に本文において提供された詳細な開示に照らせば、充
分に当業者の能力の範囲内にある。ＰＤＺ−ＰＬ結合阻害剤についての「阻害性
の量」または「阻害性の濃度」は結合を、少なくとも約４０％、好ましくは少な
くとも約５０％、しばしば少なくとも約７０％まで、さらに少なくとも約９０％
までも減じる量である。結合は、インヴィトロで（たとえば、Ａ検定またはＧ検
定）、あるいはインシトゥで測定されることができる。
【０３２８】 全身投与用には、治療上の有効量はまずインヴィトロの検定から算定されるこ
とが可能である。たとえば、細胞培養において決定されたようなＩＣ50を含む循
環濃度範囲を成就するべく、ある用量が動物モデルにおいて処方されることが可
能である（すなわち、白血球表面受容体−ＰＤＺドメインを含んでいるタンパク
質の相互作用を５０％阻害する被検化合物の濃度）。かかる情報は、ヒトにおけ
る有用な用量をさらに正確に決定するべく用いられることが可能である。
【０３２９】 最初の用量はまた、インヴィヴォのデータ、たとえば動物モデルから、当該技
術において周知の技術を用いて算定されることもできる。当該技術において普通
の技術を有する者は、動物のデータに基づき、ヒトへの投与を容易に最適化する
ことができるであろう。
【０３３０】 用量および間隔は、治療効果を維持するべく充分な化合物の血漿レベルを提供
するため、個々に調整されてよい。注射による投与のための通常の患者の用量は
、約０．１から５ｍｇ／ｋｇ／日であり、好ましくは約０．５から１ｍｇ／ｋｇ
／日である。治療上有効な血清レベルは、日々複数の用量を投与することにより
成就されてもよい。
【０３３１】 局部投与または選択的な取り込みの場合には、当該化合物の有効な局部濃度は
血漿濃度に関係していなくてもよい。当業者は、過度の実験をすることなく、治
療上有効な局部濃度を最適化することができるであろう。
【０３３２】 投与される化合物の量は、当然、治療される患者に、患者の体重に、病気の厳
しさ、投与の方式、および処方する医師の判断に依存する。
【０３３３】 治療は、症状が検出される間は、あるいはそれらが検出されない時であっても
、間欠性に反復されてよい。治療は単独で、あるいは他の薬剤と組合せて提供さ
れてもよい。移植拒絶および自己免疫病などの、白血球の活性化に関連した状態
の場合には、本発明の化合物と組合せて用いられてよい薬剤は、ステロイドおよ
び非ステロイド性の抗炎症剤を含むがこれに制限されない。
【０３３４】 ６．１０．１．毒性 好ましくは、本文において述べられた化合物の治療上の有効量は、実質的な毒
性を引き起こすことなく治療上の利点を提供するであろう。
【０３３５】 本文において述べられた化合物の毒性は、標準的な方法により、細胞培養また
は実験動物において、たとえば、ＬＤ50（集団の５０％に対して致死である用量
）またはＬＤ100（集団の１００％に対して致死である用量）を測定することに
より決定されてよい。毒性と治療効果の間の用量の比が治療係数である。高い治
療係数を示す化合物が好ましい。このような細胞培養検定法および動物実験から
得られたデータは、ヒトにおける使用のために毒性ではない用量範囲を処方する
上で用いられることが可能である。本文に述べられた化合物の用量は、好ましく
はほとんどまたは全く毒性のない有効量を含む循環濃度の範囲内にある。用量は
、この範囲内で、使用された剤形および利用された投与経路に依存して変動して
よい。正確な処方、投与経路、および用量は、個々の医師により、患者の状態を
考慮して選択されることが可能である（たとえば、Finglら、1975、The Pharmac
ological Basis of Therapeutics、第１章、１頁を参照のこと）。 ６．１１．実施例１：ＴＡＴ−Ｔ細胞の表面受容体のカルボキシル末端融合ペプ チドはＴ細胞活性化を阻害した ６．１１．１．材料および方法 ６．１１．１．１．ペプチド合成 すべてのペプチドは、標準的な方法により化学的に合成された。Ｔａｔ−ＣＤ
３カルボキシル末端融合ペプチド、（ＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＰＰＳＳＳＳ
ＧＬ、配列番号１７４）；Ｔａｔ−ＣＬＡＳＰ１カルボキシル末端融合ペプチド
、（ＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＳＩＳＳＳＡＥＶ、配列番号１７５）；Ｔａｔ
−ＣＬＡＳＰ２カルボキシル末端融合ペプチド、（ＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ
ＭＴＳＳＳＳＶＶ、配列番号１７６）；およびＴａｔペプチド、（ＧＹＧＲＫＫ
ＲＲＱＲＲＲＧ、配列番号 ）；はＰＢＳ、ｐＨ７か、またはｄＨ２Ｏ中に
て１mＭに溶解された。ストックＭＢＰＡｃ−１６ペプチド、（ＡｃＡＳＱＫＲ
ＰＳＱＲＨＧＳＫＹＬＡ）は５mＭに溶解された。すべてのペプチドはアリコー
ト化され、検査まで−８０℃に貯蔵された。
【０３３６】 ６．１１．１．２．細胞培養 細胞は、１０％ウシ胎児血清（ハイクローン（HyClone））、２ｍＭグルタミ
ン、１０ｍＭヘペス、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプト
マイシン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、および５
０μＭβメルカプトエタノールを補足されたＲＰＭＩ１６４０培地において維持
および検査された。
【０３３７】 ６．１１．１．３．Ｔ細胞刺激検定 上清は、Ｔ細胞系の活性化に続くサイトカイン産生について検定された。マウ
スのＴ細胞系は二つの異なる方法、抗原および抗原提示細胞か、または抗マウス
ＣＤ３のいずれかを用いて刺激された。
【０３３８】 抗原特異マウスＴ細胞、ＢＲ４．２は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰＡ
ｃ１−１６）のＮ末端の１６アミノ酸配列および同系マウスの脾細胞を用いて、
９６穴プレートにおいて活性化された。マイトマイシンＣ処理された抗原提示細
胞、２x１０5個のＢ１０．ＢＲは、連続的に希釈された０から２００μＭに及ぶ
ＭＢＰＡｃ−１６の各々の列に添加された。次に、１０μＭのＴａｔ−ペプチド
か、または培地のみが各々の列に添加された。最後に、あらかじめ１０μＭのＴ
ａｔ−ペプチド（上記を参照）を負荷された２x１０4個のＭＢＰＡｃ−１６特異
Ｔ細胞がすべてのウェルに添加された（Rabinowitzら、1992、Proc. Natl. Acad
. Sci. U.S.A. 94 : 8702 - 8707）。細胞は、５％ＣＯ２、３７℃における一晩
のインキュベーションの間に活性化された。細胞上清が集められ、サイトカイン
産生について検査されるまで−８０℃に貯蔵された。最終的な体積は２００μｌ
／ウェルであった。
【０３３９】 マウスＣＤ３に対する抗体（ファ−ミゲン（Pharmigen）＃１４５−２Ｃ１１
）は、９６穴平底Ｅｌｉｓａプレートを用いて、ＰＢＳ中にて希釈され最終濃度
０．５μｇ／ｍｌにおいて、４℃にて一晩コートされた。使用直前に、プレート
は２００μｌ／ウェルのＰＢＳにより３回洗浄され、過剰の抗ＣＤ３が除去され
た。活性化に先立ち、細胞がＴａｔ−ペプチドを形質導入するための充分な時間
が与えられたことを確かめるため、Ｔ細胞（５x１０5細胞／ｍｌ）は１０μＭの
Ｔａｔ−ペプチドを用いるかまたは用いずに、５％ＣＯ２、３７℃において２時
間前処理され、次いで１０μＭのＴａｔ−ペプチドを用いるかまたは用いない培
地中にて、２００μｌの最終体積においてウェルあたり２x１０4細胞の最終濃度
に希釈された。次いで細胞は、前文に述べたように処理された。
【０３４０】 ６．１１．１．４．サイトカインＥＬＩＳＡ ＩＦＮγは、前文に述べた細胞上清から、周囲の温度において、エンドジェン
社（Endogen, Inc.）、ＥＬＩＳＡプロトコール３を用いて測定された。手短に
言えば、９６穴、平底、ハイバインディングＥＬＩＳＡプレートが、コーティン
グ抗体（ＭＭ７００）とともに一晩プレインキュベートされた。プレートは、５
０ｍＭトリス、０．２％ツイーン２０、ｐＨ８を用いて洗浄され、さらにＰＢＳ
プラス２％ＢＳＡを用いて１時間ブロックされた。洗浄されたプレートは次いで
２５μｌの細胞上清および２５μｌのブロッキング緩衝液、または５０μｌのＩ
ＦＮγスタンダードと共に１時間インキュベートされた。ＩＦＮγの存在は、ビ
オチン標識された抗マウスＩＮＦγモノクローナル抗体（ＭＭ７００Ｂ、エンド
ジェン社）を用いて検出された。検出抗体の定量的な量は、西洋ワサビペルオキ
シダーゼを結合されたストレプタビジンを用いて明らかにされる。酵素性の、色
のついた、ＨＲＰの基質である、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）は、３０分
まで発生され、１．０ＭのＨ2ＳＯ4を用いて停止された。４５０ｎｍでの吸収は
マイクロタイタープレートリーダー（サーモ・マックス（Thermo Max）、モレキ
ュラー・デバイシズ（Molecular Devices）を用いて測定され、細胞上清からの
ＩＦＮγの未知の濃度は、Ｓｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏ．ソフトウェア（モレキュラ
ー・デバイシズ）によって作成された標準曲線から算定された。
【０３４１】 ６．１１．２．結果 種々のＰＬのＣ末端配列に結合されたＴａｔトランスポーター配列を含んでい
るペプチドは、Ｔ細胞の活性化を阻害するそれらの能力について検査された。図
４Ａは、Ｔａｔ−ＣＤ３融合ペプチドが、Ｔａｔ−ペプチド単独かまたはペプチ
ドなしの対照と比較して、ペプチド：ＭＨＣによって仲介されるＴ細胞の活性化
を阻害することを示している。図４Ｂは、Ｔａｔ−ＣＬＡＳＰ２カルボキシル末
端融合ペプチドが、Ｔａｔ−ペプチド単独に比較して、モノクローナル抗ＣＤ３
によって仲介されるＴ細胞の活性化を阻害したことを示している。Ｔａｔ−ＣＬ
ＡＳＰ１融合ペプチドは、この実験においてはＴ細胞の活性化を阻害しなかった
。これらの結果は、潜在性の阻害配列を含んでいるペプチドが、Ｔａｔなどのト
ランスポーターペプチドを介し、ＰＤＺタンパク質によって仲介される表面受容
体の構造を破壊するべく、Ｔ細胞内に輸送されることが可能であることを示して
いる。ＰＤＺに仲介される表面受容体の構造は、抗原に反応したＴ細胞の活性化
の阻止に導く。 ６．１２．実施例２：１００Ｕｍより大きい力価をもつＤＬＧ１−リガンド結合 の阻害剤の設計 ＧＳＴ／ＤＬＧ１融合タンパク質（表３参照）、およびＣＬＡＳＰ−２タンパ
ク質のＣ末端の２０アミノ酸に相当するビオチン標識されたペプチド、ＡＡ２Ｌ
（表４参照）は、上に述べたような、当該技術において周知の標準的な技術によ
って合成および生成された。このＰＤＺ−リガンドの組合せは、次いで「Ａ］検
定および「Ｇ」検定（表２参照）の双方を用いて特異的に結合することが示され
た。一度特異的な結合が証明されれば、「ＰＤＺ−リガンド結合親和性の測定」
という表題のつけられた章のアプローチ１を用いて、結合相互作用の見かけの親
和性が測定された（図２Ａ参照）。測定された見かけの親和性は２１ｕＭであっ
た。このことは、２１ｕＭの標識されたＣＬＡＳＰ−２ペプチドＡＡ２Ｌが、Ｄ
ＬＧ１上のＣＬＡＳＰ−２用の結合部位の５０％を満たすことを意味している。
したがって、もし所与のリガンドが（１）ＤＬＧ１上のＱａｓｐ〜２と同じ部位
に対して結合し、かつ（２）ＣＬＡＳＰ−２ペプチドの結合を有意に減じるため
に充分な濃度で添加されていないのであれば（すなわち、ＣＬＡＳＰ−２ペプチ
ドのアウトコンピート不能）、２１ｕＭの未標識のＣＬＡＳＰ−２ペプチドは、
ＤＬＧ１に対する所与のリガンドの結合を約５０％まで阻止することができるは
ずである。
【０３４２】 かかる阻害を検出するためには、（１）同様のＤＬＧ１結合特性を保持してお
り、かつ（２）阻害を測定するべく選ばれた検定においてそれ自身がシグナルを
発生することのない、ＣＬＡＳＰ２ペプチドＡＡ２Ｌの類似体を合成することが
必要であった。ＰＤＺタンパク質とそれらのリガンドとの間のほとんどの分子相
互作用は当該リガンドのＣ末端の６アミノ酸のみに関係することから、ＣＬＡＳ
Ｐ−２ペプチドの８アミノ酸変異体、ＭＴＳＳＳＳＶＶは、２０アミノ酸のＡＡ
２Ｌ ＣＬＡＳＰ−２ペプチドと同様のＤＬＦ１結合特性を保持することが予期
された。それゆえこの８アミノ酸のＣＬＡＳＰ−２ペプチド（機能性の標識を欠
く）が、上に述べた標準的な方法により合成および精製された。１００ｕＭの（
機能性には未標識）８アミノ酸ＣＬＡＳＰ−２ペプチドと、２０ｕＭのビオチン
標識されたＡＡ２Ｌ ＣＬＡＳＰ−２ペプチドとが、「Ｇ」検定の変法（上に述
べた）においてＤＬＧ１に対して同時に添加された場合、標識されたＡＡ２Ｌ
ＣＬＡＳＰ−２ペプチドの結合は、予測されたように５０％よりも多く阻害され
た（図３Ａ）。標識されたＡＡ２Ｌ ＣＬＡＳＰ−２ペプチドがもう一つの標識
されたＤＬＧ１リガンド、標識されたＡＡ１３ＬＦａｓペプチドで置換された類
似の実験は、当該８アミノ酸のＣＬＡＳＰ−２ペプチドによる同様の阻害を証明
した（図３Ａ）。したがって、既知の力価範囲（２１ｕＭ程度の大きさ）をもつ
ＤＬＧ１−リガンド結合の有効な阻害剤（すなわち８アミノ酸ＣＬＡＳＰ−２ペ
プチドＭＴＳＳＳＳＶＶ）が、親和性についての知識、２１ｕＭに基づいて設計
され、それを用いて特定の標識されたリガンド、ＣＬＡＳＰ−２ペプチドＡＡ２
ＬがＤＬＧ１と結合した。
【０３４３】 本発明は、本発明の一つの観点の例証として意図されている代表的な態様によ
って範囲が限定されるものではなく、機能的に同等ないかなる配列も本発明の範
囲内にある。事実、当業者には先の記述および添付の図面から、本文において示
されかつ記述されたものに加えて、本発明についての種々の変更が明らかとなる
であろう。かかる変更は、添付のクレームの範囲内に入ることが意図されている
。
【０３４４】 本文において引用されたすべての出版物は、ことごとく、またすべての目的の
ために参考文献に編入されている。本出願もまた、ともに２０００年５月１２日
出願の、同時継続米国特許出願第 号「Molecular Interactions in T Ce
lls（Ｔ細胞における分子相互作用）」（書類番号０２００５４−００１３００
）、および第 号「Molecular Interactions in Allergy（アレルギ
ーにおける分子相互作用）」（書類番号０２００５４−００１２００）により開
示全体が参考文献として編入されている。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 図1A-1Dは各種白血球蛋白質のカルボキシル末端（“c-末端”）の配列を有す
るビオチン化ペプチドのPDZドメインへの結合（即ちGST-PDZドメイン融合蛋白質
）が下記“G”アッセイを利用し決定されている例示アッセイの結果を示す。PDZ
ドメインは：PSD95（図１A）；NeDLG(図1B）；DLG1（図1C）；及び41.8（図1D）
である。これら及びその他PDZドメイン融合蛋白質は以下に記載される（例えば
表２）。図では、ペプチドI-31はアッセイに使用されたビオチン化PLペプチドを
表し、下記キー内に特定されている。“ペプチドIDs”は表３に規定されている
。 キー：
【表２４】
【図１Ｂ】 図1A-1Dは各種白血球蛋白質のカルボキシル末端（“c-末端”）の配列を有す
るビオチン化ペプチドのPDZドメインへの結合（即ちGST-PDZドメイン融合蛋白質
）が下記“G”アッセイを利用し決定されている例示アッセイの結果を示す。PDZ
ドメインは：PSD95（図１A）；NeDLG(図1B）；DLG1（図1C）；及び41.8（図1D）
である。これら及びその他PDZドメイン融合蛋白質は以下に記載される（例えば
表２）。図では、ペプチドI-31はアッセイに使用されたビオチン化PLペプチドを
表し、下記キー内に特定されている。“ペプチドIDs”は表３に規定されている
。
【図１Ｃ】 図1A-1Dは各種白血球蛋白質のカルボキシル末端（“c-末端”）の配列を有す
るビオチン化ペプチドのPDZドメインへの結合（即ちGST-PDZドメイン融合蛋白質
）が下記“G”アッセイを利用し決定されている例示アッセイの結果を示す。PDZ
ドメインは：PSD95（図１A）；NeDLG(図1B）；DLG1（図1C）；及び41.8（図1D）
である。これら及びその他PDZドメイン融合蛋白質は以下に記載される（例えば
表２）。図では、ペプチドI-31はアッセイに使用されたビオチン化PLペプチドを
表し、下記キー内に特定されている。“ペプチドIDs”は表３に規定されている
。
【図１Ｄ】 図1A-1Dは各種白血球蛋白質のカルボキシル末端（“c-末端”）の配列を有す
るビオチン化ペプチドのPDZドメインへの結合（即ちGST-PDZドメイン融合蛋白質
）が下記“G”アッセイを利用し決定されている例示アッセイの結果を示す。PDZ
ドメインは：PSD95（図１A）；NeDLG(図1B）；DLG1（図1C）；及び41.8（図1D）
である。これら及びその他PDZドメイン融合蛋白質は以下に記載される（例えば
表２）。図では、ペプチドI-31はアッセイに使用されたビオチン化PLペプチドを
表し、下記キー内に特定されている。“ペプチドIDs”は表３に規定されている
。
【図２Ａ】 図2A及び2BはPDZ-リガンド相互作用に関する見かけ上の親和性測定値を示す。
各種濃度のビオチン化CLASP-2（図2A；表４）又はFas（図2B；表４）C-末端ペプ
チドを固定化（プレート結合）GSTポリペプチド又はGST-PDZ融合蛋白質（GST-DL
G1、GST-NeDLG及びGST-PSD95）と反応させた。各ペプチド濃度でのシグナルを得
るために、融合蛋白質への結合からGST単独（＜0.2OD単位）への結合が差し引か
れた。次にこのシグナルは各ペプチド-PDZペアについて観察された最大シグナル
にて各ペプチド濃度のシグナルを除することで正規化された（即ち40uMClasp2ペ
プチド又は100uMFASペプチドについて得られたシグナル；Clasp2の場合で0.4-1.
0OD単位、及びFasの場合で1.2-2.0OD単位）。次に正規化シグナルはプロットさ
れ、飽和結合カーブに適合された結果、DLG1-Clasp2相互作用に関して21uM、NeD
LG-Clasp2相互作用に関し7.5uM、PSD95-Clasp2相互作用に関し45uM、DLG1-Fas相
互作用に関し54uM、NeDLG-Fas相互作用に関し54uMそしてPSD95-Fas相互作用に関
しては85uMの見かけ上の親和性を得た。データは二重データポイントの平均値で
あり、二重データ間の標準誤差は＜20%である。
【図２Ｂ】 図2A及び2BはPDZ-リガンド相互作用に関する見かけ上の親和性測定値を示す。
各種濃度のビオチン化CLASP-2（図2A；表４）又はFas（図2B；表４）C-末端ペプ
チドを固定化（プレート結合）GSTポリペプチド又はGST-PDZ融合蛋白質（GST-DL
G1、GST-NeDLG及びGST-PSD95）と反応させた。各ペプチド濃度でのシグナルを得
るために、融合蛋白質への結合からGST単独（＜0.2OD単位）への結合が差し引か
れた。次にこのシグナルは各ペプチド-PDZペアについて観察された最大シグナル
にて各ペプチド濃度のシグナルを除することで正規化された（即ち40uMClasp2ペ
プチド又は100uMFASペプチドについて得られたシグナル；Clasp2の場合で0.4-1.
0OD単位、及びFasの場合で1.2-2.0OD単位）。次に正規化シグナルはプロットさ
れ、飽和結合カーブに適合された結果、DLG1-Clasp2相互作用に関して21uM、NeD
LG-Clasp2相互作用に関し7.5uM、PSD95-Clasp2相互作用に関し45uM、DLG1-Fas相
互作用に関し54uM、NeDLG-Fas相互作用に関し54uMそしてPSD95-Fas相互作用に関
しては85uMの見かけ上の親和性を得た。データは二重データポイントの平均値で
あり、二重データ間の標準誤差は＜20%である。
【図３Ａ】 図3A-3FはPDZ-PLペプチド相互作用の阻害を示す。固定濃度の細胞表面受容体
蛋白質（Clasp2、CD46、Fas及びKV1.3；表４参照）のC-末端配列に基づく配列を
有するビオチン化C-末端ペプチドを、各フレームの左上に示した固定化GSTポリ
ペプチド又はGST-融合蛋白質に、各フレームの説明に示した競合ペプチド有り無
しの状態で結合させ、阻害レベルを決定した。図3A-DLG1；図3B-PSD95；図3C-Ne
DLG；図3D-DLG1、図3E、PSD95；図F-41.8。図3A-Bでは競合体ペプチドは100uM存
在している；図3C-Fでは競合対は指示濃度存在している。
【図３Ｂ】 図3A-3FはPDZ-PLペプチド相互作用の阻害を示す。固定濃度の細胞表面受容体
蛋白質（Clasp2、CD46、Fas及びKV1.3；表４参照）のC-末端配列に基づく配列を
有するビオチン化C-末端ペプチドを、各フレームの左上に示した固定化GSTポリ
ペプチド又はGST-融合蛋白質に、各フレームの説明に示した競合ペプチド有り無
しの状態で結合させ、阻害レベルを決定した。図3A-DLG1；図3B-PSD95；図3C-Ne
DLG；図3D-DLG1、図3E、PSD95；図F-41.8。図3A-Bでは競合体ペプチドは100uM存
在している；図3C-Fでは競合対は指示濃度存在している。
【図３Ｃ】 図3A-3FはPDZ-PLペプチド相互作用の阻害を示す。固定濃度の細胞表面受容体
蛋白質（Clasp2、CD46、Fas及びKV1.3；表４参照）のC-末端配列に基づく配列を
有するビオチン化C-末端ペプチドを、各フレームの左上に示した固定化GSTポリ
ペプチド又はGST-融合蛋白質に、各フレームの説明に示した競合ペプチド有り無
しの状態で結合させ、阻害レベルを決定した。図3A-DLG1；図3B-PSD95；図3C-Ne
DLG；図3D-DLG1、図3E、PSD95；図F-41.8。図3A-Bでは競合体ペプチドは100uM存
在している；図3C-Fでは競合対は指示濃度存在している。
【図３Ｄ】 図3A-3FはPDZ-PLペプチド相互作用の阻害を示す。固定濃度の細胞表面受容体
蛋白質（Clasp2、CD46、Fas及びKV1.3；表４参照）のC-末端配列に基づく配列を
有するビオチン化C-末端ペプチドを、各フレームの左上に示した固定化GSTポリ
ペプチド又はGST-融合蛋白質に、各フレームの説明に示した競合ペプチド有り無
しの状態で結合させ、阻害レベルを決定した。図3A-DLG1；図3B-PSD95；図3C-Ne
DLG；図3D-DLG1、図3E、PSD95；図F-41.8。図3A-Bでは競合体ペプチドは100uM存
在している；図3C-Fでは競合対は指示濃度存在している。
【図３Ｅ】 図3A-3FはPDZ-PLペプチド相互作用の阻害を示す。固定濃度の細胞表面受容体
蛋白質（Clasp2、CD46、Fas及びKV1.3；表４参照）のC-末端配列に基づく配列を
有するビオチン化C-末端ペプチドを、各フレームの左上に示した固定化GSTポリ
ペプチド又はGST-融合蛋白質に、各フレームの説明に示した競合ペプチド有り無
しの状態で結合させ、阻害レベルを決定した。図3A-DLG1；図3B-PSD95；図3C-Ne
DLG；図3D-DLG1、図3E、PSD95；図F-41.8。図3A-Bでは競合体ペプチドは100uM存
在している；図3C-Fでは競合対は指示濃度存在している。
【図３Ｆ】 図3A-3FはPDZ-PLペプチド相互作用の阻害を示す。固定濃度の細胞表面受容体
蛋白質（Clasp2、CD46、Fas及びKV1.3；表４参照）のC-末端配列に基づく配列を
有するビオチン化C-末端ペプチドを、各フレームの左上に示した固定化GSTポリ
ペプチド又はGST-融合蛋白質に、各フレームの説明に示した競合ペプチド有り無
しの状態で結合させ、阻害レベルを決定した。図3A-DLG1；図3B-PSD95；図3C-Ne
DLG；図3D-DLG1、図3E、PSD95；図F-41.8。図3A-Bでは競合体ペプチドは100uM存
在している；図3C-Fでは競合対は指示濃度存在している。
【図４Ａ】 図4A及び4BはT細胞活性化へのTat-CD3融合ペプチドの導入結果を示している。
抗原特異的T細胞活性化はサイトカイン産生より測定された。tat及びT細胞表面
分子カルボキシル末端を含む融合ペプチドは、ミエリン塩基性蛋白質（MBP)刺激
に対する反応に於けるT細胞株によるγ-インターフェロン（IFN)産生を阻害する
。阻害レベルはまず融合蛋白質に対する結合からGST単独に対する標識ペプチド
の結合を差し引き、次に阻害体ペプチド無しに於けるシグナルで除して決定され
た。
【図４Ｂ】 図4A及び4BはT細胞活性化へのTat-CD3融合ペプチドの導入結果を示している。
抗原特異的T細胞活性化はサイトカイン産生より測定された。tat及びT細胞表面
分子カルボキシル末端を含む融合ペプチドは、ミエリン塩基性蛋白質（MBP)刺激
に対する反応に於けるT細胞株によるγ-インターフェロン（IFN)産生を阻害する
。阻害レベルはまず融合蛋白質に対する結合からGST単独に対する標識ペプチド
の結合を差し引き、次に阻害体ペプチド無しに於けるシグナルで除して決定され
た。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年１１月２７日（２００１．１１．２７）
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ Ｃ１２Ｎ 5/00 ＺＮＡＥ (31)優先権主張番号 ６０／１３４，１１８ (32)優先日 平成11年５月14日(1999．5．14) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１６０，８６０ (32)優先日 平成11年10月21日(1999．10．21) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１６２，４９８ (32)優先日 平成11年10月29日(1999．10．29) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１７０，４５３ (32)優先日 平成11年12月13日(1999．12．13) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１７６，１９５ (32)優先日 平成12年１月14日(2000．1．14) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１８２，２９６ (32)優先日 平成12年２月14日(2000．2．14) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／５４７，２７６ (32)優先日 平成12年４月11日(2000．4．11) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１９６，４６０ (32)優先日 平成12年４月11日(2000．4．11) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１９６，５２８ (32)優先日 平成12年４月11日(2000．4．11) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１９６，５２７ (32)優先日 平成12年４月11日(2000．4．11) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１９６２６７ (32)優先日 平成12年４月11日(2000．4．11) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims (36)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 細胞におけるＰＤＺタンパク質とＰＬタンパク質の結合を阻
    害する拮抗剤を細胞に導入し、それによって生物機能を調節することを含む、内
    皮細胞又は造血系細胞の生物機能を調節する方法。
  2. 【請求項２】 ＰＬタンパク質が （ａ）接着タンパク質； （ｂ）アダプタタンパク質；又は （ｃ）細胞内タンパク質 である請求項１の方法。
  3. 【請求項３】 ＰＬタンパク質がＴリンパ球又はＢリンパ球によって発現さ
    れる請求項１の方法。
  4. 【請求項４】 ＰＬタンパク質が、ＣＤ６、ＣＤ４９Ｅ、ＣＤ４９Ｆ、ＣＤ
    １３８、Ｃｌａｓｐ−１、Ｃｌａｓｐ−４、ＶＣＡＭ−１、Ｃｌａｓｐ−２、Ｃ
    Ｄ９５、ＤＮＡＭ−１、ＣＤ８３、ＣＤ４４、ＣＤ９７、ＣＤ３、ＣＤ４、ＤＯ
    ＣＫ２、ＣＤ３４、ＦｃｅＲＩｂ及びＦａｓリガンドから成る群から選択される
    請求項１の方法。
  5. 【請求項５】 ＰＬタンパク質が、Ｘ−Ｓ−Ｘ−Ａ、Ｘ−Ａ−Ｄ／Ｅ−Ｖ、
    Ｘ−Ｖ／Ｉ／Ｌ−Ｘ＊−Ｖ、又はＸ−Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｆから選択されるカルボキシ
    末端アミノ酸モチーフを有し、その際、Ｘはアミノ酸であり、Ｘ＊は非芳香族ア
    ミノ酸である請求項１の方法。
  6. 【請求項６】 拮抗剤がＡアッセイ又はＧアッセイにおいてＰＤＺドメイン
    のポリペプチドへのＰＬペプチドの結合を阻害する物質である請求項１の方法。
  7. 【請求項７】 拮抗剤がＡアッセイ又及びＧアッセイの両方においてＰＤＺ
    ドメインのポリペプチドへのＰＬペプチドの結合を阻害する物質である請求項６
    の方法。
  8. 【請求項８】 該物質がポリペプチドである請求項１の方法。
  9. 【請求項９】 ポリペプチドのカルボキシ末端の少なくとも２つの残基がＰ
    Ｌタンパク質のカルボキシ末端の２つの残基と同一であり、その際、ＰＬタンパ
    ク質は造血系細胞又は内皮細胞に発現され、 （ａ）接着タンパク質； （ｂ）アダプタタンパク質；又は （ｃ）細胞内タンパク質である 請求項８の方法。
  10. 【請求項１０】 ポリペプチドのカルボキシ末端の少なくとも４つの残基が
    ＰＬタンパク質のカルボキシ末端の４つの残基と同一である請求項９の方法。
  11. 【請求項１１】 ＰＬタンパク質が、Ｘ−Ｓ−Ｘ−Ａ、Ｘ−Ａ−Ｄ／Ｅ−Ｖ
    、Ｘ−Ｖ／Ｉ／Ｌ−Ｘ＊−Ｖ、又はＸ−Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｆから選択されるカルボキ
    シ末端アミノ酸モチーフを有し、その際、Ｘはアミノ酸であり、Ｘ＊は非芳香族
    アミノ酸である請求項１０の方法。
  12. 【請求項１２】 ＰＬタンパク質が、ＣＤ６、ＣＤ４、ＣＤ４９Ｅ、ＣＤ４
    ９Ｆ、ＣＤ１３８、Ｃｌａｓｐ−１、Ｃｌａｓｐ−４、ＶＣＡＭ−１、Ｃｌａｓ
    ｐ−２、ＣＤ９５、ＤＮＡＭ−１、ＣＤ８３、ＣＤ４４、ＣＤ９７、ＣＤ３ｎ、
    ＤＯＣＫ２、ＣＤ３４、ＦｃｅＲＩｂ及びＦａｓリガンドから成る群から選択さ
    れる請求項９の方法。
  13. 【請求項１３】 拮抗剤がＰＬ阻害剤配列ペプチドのペプチド模倣体である
    請求項８の方法。
  14. 【請求項１４】 該物質が、膜貫通トランスポータアミノ酸配列及びＰＬ配
    列を含む融合ポリペプチドである請求項８の方法。
  15. 【請求項１５】 膜貫通トランスポータアミノ酸配列が、ＨＩＶのｔａｔ、
    ショウジョウバエのアンテナペディア、単純ヘルペスウイルスのＶＰ２２及び抗
    ＤＮＡのＣＤＲ２並びに３から成る群から選択される請求項１４の方法。
  16. 【請求項１６】 細胞が白血球である請求項１の方法。
  17. 【請求項１７】 白血球がＴ細胞又はＢ細胞である請求項１６の方法。
  18. 【請求項１８】 生物機能が、細胞の活性化、細胞の増殖、細胞構造の維持
    、細胞の代謝活性、又はサイトカインの産生である請求項１の方法。
  19. 【請求項１９】 白血球の活性化における変化を検出する工程をさらに含む
    請求項１８の方法。
  20. 【請求項２０】 試験化合物がＰＤＺタンパク質とＰＬタンパク質との間の
    結合の阻害剤であるかどうかを決定する方法であって： ａ）それらが複合体を形成する条件下で、ｉ）ＰＤＺタンパク質由来の配列を
    有するＰＤＺドメインポリペプチドとｉｉ）ＰＬペプチドを接触させること、こ
    こで、ＰＬペプチドは、ＣＤ６、ＣＤ４９Ｅ、ＣＤ４９Ｆ、ＣＤ１３８、Ｃｌａ
    ｓｐ−１、Ｃｌａｓｐ−４、ＣＤ４、ＶＣＡＭ−１、Ｃｌａｓｐ−２、ＣＤ９５
    、ＤＮＡＭ−１、ＣＤ８３、ＣＤ４４、ＣＤ９７、ＣＤ３ｎ、ＤＯＣＫ２、ＣＤ
    ３４、ＦｃｅＲＩｂ及びＦａｓリガンドから成る群から選択されるＰＬタンパク
    質のＣ末端配列を含み、ここで、前記接触は試験化合物の存在下及び非存在下で
    行われる；及び ｂ）試験化合物の存在下及び非存在下にて複合体の形成を検出することを含む
    ここで、試験化合物非存在下に比べて試験化合物存在下での複合体形成が少ない
    ことは、試験化合物がＰＤＺタンパク質−ＰＬタンパク質の結合の阻害剤である
    ことを示す、前記方法。
  21. 【請求項２１】 ＰＤＺドメインポリペプチドが融合ポリペプチドである請
    求項２０の方法。
  22. 【請求項２２】 阻害剤が、ＣＤ６、ＣＤ４９Ｅ、ＣＤ４９Ｆ、ＣＤ１３８
    、Ｃｌａｓｐ−１、Ｃｌａｓｐ−４、ＶＣＡＭ−１、Ｃｌａｓｐ−２、ＣＤ９５
    、ＤＮＡＭ−１、ＣＤ８３、ＣＤ４４、ＣＤ４、ＣＤ９７、ＣＤ３ｎ、ＤＯＣＫ
    ２、ＣＤ３４、ＦｃｅＲＩｂ及びＦａｓリガンドから成る群から選択されるＰＬ
    ペプチドから成る群から選択されるペプチドとＰＤＺドメインのポリペプチドと
    の結合を低下させることを特徴とするＰＤＺタンパク質とＰＬタンパク質の結合
    の前記阻害剤。
  23. 【請求項２３】 ａ）ＣＤ６、ＣＤ４９Ｅ、ＣＤ４９Ｆ、ＣＤ１３８、Ｃｌ
    ａｓｐ−１、Ｃｌａｓｐ−４、ＶＣＡＭ−１、Ｃｌａｓｐ−２、ＣＤ９５、ＤＮ
    ＡＭ−１、ＣＤ８３、ＣＤ４４、ＣＤ９７、ＣＤ３ｎ、ＣＤ４、ＤＯＣＫ２、Ｃ
    Ｄ３４、ＦｃｅＲＩｂ及びＦａｓリガンドから選択されるＰＬタンパク質のＣ末
    端配列の３〜約２０の残基である配列を含むペプチドであり； ｂ）Ｘがアミノ酸であり、Ｘ＊が非芳香族アミノ酸である、モチーフ、Ｘ−Ｓ−
    Ｘ−Ａ、Ｘ−Ａ−Ｄ／Ｅ−Ｖ、Ｘ−Ｖ／Ｉ／Ｌ−Ｘ＊−Ｖ、又はＸ−Ｓ／Ｔ−Ｘ
    −Ｆを有するペプチドであり； ｃ）（ａ）又は（ｂ）項のペプチドのペプチド模倣体であり；又は ｄ）分子量１ｋＤ未満の小型有機分子である 請求項２１の阻害剤。
  24. 【請求項２４】 請求項２１の阻害剤を含む医薬組成物。
  25. 【請求項２５】 請求項２１の阻害剤の治療上有効な量を投与することを含
    む、白血球の活性化を特徴とする疾患の治療方法。
  26. 【請求項２６】 疾患が、炎症又は液性免疫応答を特徴とする請求項２５の
    方法。
  27. 【請求項２７】 疾患が自己免疫疾患である請求項２５の方法。
  28. 【請求項２８】 白血球の活性化を阻害するためのＰＤＺタンパク質とＰＬ
    タンパク質の結合阻害剤の使用。
  29. 【請求項２９】 造血系細胞が介在する疾患を治療するためのＰＤＺタンパ
    ク質とＰＬタンパク質の結合阻害剤の使用。
  30. 【請求項３０】 疾患が炎症又は液性免疫応答を特徴とする請求項２９の使
    用。
  31. 【請求項３１】 造血系細胞が介在する疾患の治療のための薬剤の調製にお
    けるＰＤＺタンパク質とＰＬタンパク質の結合阻害剤の使用。
  32. 【請求項３２】 ＰＬタンパク質が （ａ）接着タンパク質； （ｂ）アダプタタンパク質；又は （ｃ）細胞内タンパク質を である、ＰＤＺタンパク質とＰＬタンパク質の結合を阻害する物質を投与するこ
    とを含む被験者において炎症を軽減する方法。
  33. 【請求項３３】 細胞においてＰＤＺタンパク質とＰＬタンパク質の結合を
    阻害する拮抗剤を細胞に導入することを含む、造血系細胞の生物機能を調節する
    方法であって、ここで、 （ａ）ＰＬタンパク質は、ＤＮＡＭ−１であり、且つＰＤＺタンパク質はＭＰＰ
    １、ＭＰＰ２、ＤＬＧ１、ＮｅＤＬＧ、ＰＳＤ９５、ＬＩＭ、ＡＦ６、４１．８
    若しくはＲＧＳ１２であり；又は （ｂ）ＰＬタンパク質はＬＰＡＰであり、且つＰＤＺタンパク質はＤＬＧ１若し
    くはＭＩＮＴ１である、前記方法。
  34. 【請求項３４】 ＰＬタンパク質がＤＮＡＭ−１であり、且つＰＤＺタンパ
    ク質がＰＳＤ９５又はＭＰＰ２である請求項３３の方法。
  35. 【請求項３５】 ＰＤＺタンパク質が、ＣＡＳＫ、ＭＰＰ１、ＤＬＧ１、Ｐ
    ＳＤ９５、ＮｅＤＬＧ、ＳＹＮ１ａ、ＴＡＸ４３、ＬＤＰ、ＬＩＭ、ＬＩＭＫ、
    ＡＦ６、ＰＴＮ−４、ｐｒＩＬ１６、４１．８、ＲＧＳ１２、ＤＶＬ１、ＴＡＸ
    ４０、ＴＬＡＭ１、ＭＩＮＴ１、ＫＩＡＡ０３０３、ＴＡＸ２、及びＫＩＡＡ０
    ５６１から成る群から選択される請求項１の方法。
  36. 【請求項３６】 試験化合物がＰＤＺタンパク質とＰＬタンパク質との間の
    結合の作動薬であるかどうかを決定する方法であって： ａ）それらが複合体を形成する条件下で、ｉ）ＰＤＺドメインポリペプチドと
    ｉｉ）ＰＬペプチドを接触させること、ここで、ＰＬペプチドは、ＣＤ６、ＣＤ
    ４９Ｅ、ＣＤ４９Ｆ、ＣＤ１３８、Ｃｌａｓｐ−１、Ｃｌａｓｐ−４、ＣＤ４、
    ＶＣＡＭ−１、Ｃｌａｓｐ−２、ＣＤ９５、ＤＮＡＭ−１、ＣＤ８３、ＣＤ４４
    、ＣＤ９７、ＣＤ３ｎ、ＤＯＣＫ２、ＣＤ３４、ＦｃｅＲＩｂ及びＦａｓリガン
    ドから成る群から選択されるＰＬタンパク質のＣ末端配列を含み、ここで、前記
    接触は試験化合物の存在下及び非存在下で行われる；及び ｂ）試験化合物の存在下及び非存在下にて複合体の形成を検出することを含む
    、ここで、試験化合物非存在下に比べて試験化合物存在下での複合体形成が増加
    することは、試験化合物がＰＤＺタンパク質−ＰＬタンパク質の結合の作動薬で
    あることを示す、前記方法。
JP2000618312A 1999-05-14 2000-05-12 造血細胞内分子相互作用 Withdrawn JP2002543825A (ja)

Applications Claiming Priority (27)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13411899P 1999-05-14 1999-05-14
US13411799P 1999-05-14 1999-05-14
US13411499P 1999-05-14 1999-05-14
US16086099P 1999-10-21 1999-10-21
US16249899P 1999-10-29 1999-10-29
US17045399P 1999-12-13 1999-12-13
US60/170,453 1999-12-13
US17619500P 2000-01-14 2000-01-14
US60/176,195 2000-01-14
US18229600P 2000-02-14 2000-02-14
US60/182,296 2000-02-14
US19652700P 2000-04-11 2000-04-11
US19626700P 2000-04-11 2000-04-11
US54727600A 2000-04-11 2000-04-11
US19646000P 2000-04-11 2000-04-11
US19652800P 2000-04-11 2000-04-11
US60/134,117 2000-04-11
US60/196,527 2000-04-11
US60/196,528 2000-04-11
US60/160,860 2000-04-11
US60/134,118 2000-04-11
US60/134,114 2000-04-11
US09/547,276 2000-04-11
US60/162,498 2000-04-11
US60/196267 2000-04-11
US60/196,460 2000-04-11
PCT/US2000/013161 WO2000069896A2 (en) 1999-05-14 2000-05-12 Molecular interactions in haematopoietic cells

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2011029100A Division JP2011102326A (ja) 1999-05-14 2011-02-14 造血細胞内分子相互作用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2002543825A true JP2002543825A (ja) 2002-12-24
JP2002543825A5 JP2002543825A5 (ja) 2007-07-05

Family

ID=27584529

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000618312A Withdrawn JP2002543825A (ja) 1999-05-14 2000-05-12 造血細胞内分子相互作用
JP2011029100A Pending JP2011102326A (ja) 1999-05-14 2011-02-14 造血細胞内分子相互作用

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2011029100A Pending JP2011102326A (ja) 1999-05-14 2011-02-14 造血細胞内分子相互作用

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP1178817A2 (ja)
JP (2) JP2002543825A (ja)
ES (1) ES2436624T3 (ja)
WO (2) WO2000069897A2 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007116945A1 (ja) * 2006-04-07 2007-10-18 University Of Tsukuba 移植片対宿主病予知マーカーおよびその利用
JP2008537478A (ja) * 2005-02-24 2008-09-18 ザ・スクリプス・リサーチ・インステイチユート 単離骨髄球様骨髄細胞集団及びそれを用いた治療方法
JP2009503439A (ja) * 2005-07-01 2009-01-29 アルボー ビータ コーポレーション ウイルス感染および細菌感染の診断および処置のための方法および組成物

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002522029A (ja) 1998-07-27 2002-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド コートタンパク質の改変によるファージ提示における改良した形質転換効率
US6942981B1 (en) 1999-05-14 2005-09-13 Arbor Vita Corporation Method of determining interactions with PDZ-domain polypeptides
US7510824B2 (en) 1999-06-02 2009-03-31 Nono Inc. Method of screening peptides useful in treating traumatic injury to the brain or spinal cord
US7595297B2 (en) * 1999-06-02 2009-09-29 Michael Tymianski Method of reducing injury to mammalian cells
AU2002215354A1 (en) * 2000-10-13 2002-04-22 Arbor Vita Corporation Molecular interactions in hematopoietic cells
AU2002252015A1 (en) * 2001-02-16 2002-09-04 Arbor Vita Corporation Pdz domain interactions and lipid rafts
CA2445309A1 (en) * 2001-04-24 2002-11-07 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Crohn's disease antibody-binding peptide and method of examining crohn's disease
AU2011211347B2 (en) * 2001-05-07 2015-02-19 Agriculture Victoria Services Pty Ltd Modification of plant and seed development and plant responses to stresses and stimuli (3)
DE10124342A1 (de) * 2001-05-18 2002-11-28 Biotecon Diagnostics Gmbh Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen der Spezies Yersinia pestis/Yersinia pseudotuberculosis und/oder zur Differzierung zwischen Yersinia pestis und Yersinia pseudotuberculosis
US20030148264A1 (en) * 2001-07-06 2003-08-07 Genentech, Inc. Phage displayed PDZ domain ligands
AU2003291558B2 (en) * 2001-08-03 2009-08-13 Arbor Vita Corporation Molecular interactions in neurons
AU2002321903A1 (en) * 2001-08-03 2003-02-24 Arbor Vita Corporation Molecular interactions in cells
JP2003199459A (ja) 2002-01-07 2003-07-15 Japan Science & Technology Corp リンパ球遊走制御機能欠失モデル非ヒト動物
US9408381B2 (en) 2004-12-21 2016-08-09 Musc Foundation For Research Development Alpha Connexin c-Terminal (ACT) peptides for use in transplant
AU2012202117B2 (en) * 2004-12-21 2014-06-26 Musc Foundation For Research Development Compositions and methods for promoting wound healing and tissue regeneration
AU2005319155B2 (en) 2004-12-21 2013-01-31 Musc Foundation For Research Development Compositions and methods for promoting wound healing and tissue regeneration
WO2007071448A2 (en) * 2005-12-23 2007-06-28 Partnership & Corp. Technology Transfer Synthetic peptides for use as inhibitors of neurotransmitter secretion and as inducers of muscle relaxation
DK2819682T3 (en) 2012-03-01 2017-08-21 Firststring Res Inc TOPICAL GELLS CONTAINING ALPHA-CONNEXIN C-TERMINAL (ACT) PEPTIDES
CA2958879A1 (en) 2014-08-22 2016-02-25 Auckland Uniservices Limited Channel modulators
EP3619299A1 (en) * 2017-05-03 2020-03-11 BioMarin Pharmaceutical Inc. Improved lentiviruses for transduction of hematopoietic stem cells.
EP3897669A4 (en) * 2018-12-20 2022-08-24 The University of Chicago METHODS AND COMPOSITIONS RELATING TO THERAPEUTIC PEPTIDES FOR CANCER THERAPY
CN114457005B (zh) * 2022-01-12 2024-03-26 佛山市妇幼保健院 一种小儿尿道平滑肌细胞的分离纯化方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998005347A1 (en) * 1996-07-22 1998-02-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Compounds that inhibit interaction between signal-transducing proteins and the glgf (pdz/dhr) domain and uses thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998005347A1 (en) * 1996-07-22 1998-02-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Compounds that inhibit interaction between signal-transducing proteins and the glgf (pdz/dhr) domain and uses thereof

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008537478A (ja) * 2005-02-24 2008-09-18 ザ・スクリプス・リサーチ・インステイチユート 単離骨髄球様骨髄細胞集団及びそれを用いた治療方法
JP2009503439A (ja) * 2005-07-01 2009-01-29 アルボー ビータ コーポレーション ウイルス感染および細菌感染の診断および処置のための方法および組成物
WO2007116945A1 (ja) * 2006-04-07 2007-10-18 University Of Tsukuba 移植片対宿主病予知マーカーおよびその利用
JP5296530B2 (ja) * 2006-04-07 2013-09-25 国立大学法人 筑波大学 移植片対宿主病予知マーカーおよびその利用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2000069896A9 (en) 2002-10-03
WO2000069896A2 (en) 2000-11-23
ES2436624T3 (es) 2014-01-03
WO2000069897A9 (en) 2002-07-04
EP1178817A2 (en) 2002-02-13
JP2011102326A (ja) 2011-05-26
WO2000069897A2 (en) 2000-11-23
WO2000069896A3 (en) 2001-07-05
WO2000069897A3 (en) 2001-11-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7514224B2 (en) Arrays of PDZ domain polypeptides
JP2011102326A (ja) 造血細胞内分子相互作用
US20120093873A1 (en) Molecular Interactions in Hematopoietic Cells
US7858322B2 (en) Method of determining inhibition of binding to TRPM7 protein
US20090075377A1 (en) Molecular interactions in cells
US20110039758A1 (en) Molecular Interactions in Neurons
EP1443951A2 (en) Molecular interactions in cells
EP1387692A2 (en) Molecular interactions in hematopoietic cells
US20050019841A1 (en) Modulation of signaling pathways
WO2004045535A2 (en) Molecular interactions in neurons
US20050282743A1 (en) Molecular interactions in cells
US20020169283A1 (en) Clasp-7 transmembrane protein
JP2001523455A (ja) Ｃｄｋ２タンパク質およびｃｄｋ２タンパク質複合体
WO2002031512A2 (en) Molecular interactions in hematopoietic cells
EP2385124B1 (en) Peptides or peptide analogues for modulating the binding of a PDZ protein and a PL protein
US7919584B1 (en) Methods and compositions for diagnosis and treatment of asthma
EP1191096A1 (en) Novel protein and dna thereof
US20020086382A1 (en) Clasp-3 transmembrane protein
US20060264610A1 (en) Protein complexes of the tip60 transcriptional activator protein
US20030103992A1 (en) Clasp membrane proteins
WO2001042297A9 (en) Clasp-3 transmembrane protein
WO2001085908A2 (en) Clasp-1 transmembrane protein

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20070511

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20070511

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20100202

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20100506

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20100513

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20101012

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20110214

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20110418

A761 Written withdrawal of application

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761

Effective date: 20110422