JP2002543418A - 流体操作、サーモサイクリング、及び精製を一体化した迅速なｄｎａサンプル処理装置 - Google Patents

流体操作、サーモサイクリング、及び精製を一体化した迅速なｄｎａサンプル処理装置

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JP2002543418A
JP2002543418A JP2000615584A JP2000615584A JP2002543418A JP 2002543418 A JP2002543418 A JP 2002543418A JP 2000615584 A JP2000615584 A JP 2000615584A JP 2000615584 A JP2000615584 A JP 2000615584A JP 2002543418 A JP2002543418 A JP 2002543418A
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ダグラス スミス
ユーリッチ トーマン
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、流体操作、一つ以上の温度制御インキュベーション段階（温度サイクリングを含む）、及び分子サイズ弁別を用いた精製段階を含む、化学的または酵素的反応を用いて、サブミリリットル単位のサンプルの迅速な処理を促進する自動化装置を提供する。例示的アプリケーションには、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、DNAシーケンシングアプリケーション、オリゴヌクレオチド連鎖反応、リガーゼ連鎖反応(LCR)、一塩基伸展、エキソヌクレアーゼ処理、及びオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイが含まれるが限定はされない。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は、生物学的サンプルを扱う高速、少量自動化サンプル操作装置及び方
法に関連し、それらはDNAシーケンシング、遺伝子解析、及び遺伝子発現解析な
ど多様なプロセスのためのゲノミクスの分野に有用である。本発明は、さらに、
薬学的応用のためのハイスループット化合物スクリーニングの検定を設定し行う
ための装置及び方法に関連している。
【０００２】 発明の背景 実験の自動化は、この十年間、ゲノミクス及び薬物発見の発達において重要な
役割を果たしてきた。ゲノミクスの初期の研究は、分注ロボット及び画像収集シ
ステムに適合されたフィンガープリント法及びSTSマッピング法の自動化に集中
していた(Garcia et al., 1995, Kwok et al., 1992, Lamerdin and Carrano, 1 993, MacMurray et al., 1991, Nizetic et al., 1994, Sloan et al., 1993)。
興味ある例は、マサチューセッツ州ケンブリッジ、インテリジェント・オートメ
ーション・システムズ社及びホワイトヘッド・インスティテュート・ゲノムセン
ターが共同開発したSTS/ESTマッピング用「ゲノマトロン」であった(Dietrich e t al. 1995, Hudson et al. 1995)。このシステムは、高速PCR設定、サーモサイ
クリング、反応生成物をナイロン膜へ移動するためのサンプル処理、及びCCD光
シグナル検出用のビオチン化プローブとのハイブリダイゼーションに必要なすべ
ての段階を行った。しかし、この機械は大きく、操作するには高価で、他の作業
を行うために適合させるのが容易ではなかった。1990年以降、数多くの様々な実
験用自動化装置が、増え続ける一連の機器製作会社から販売された。自動化シス
テムは今や、多くの大規模シーケンシングセンターでDNAシーケンシングのため
のハイスループットサンプル調製に用いられている。
【０００３】 シーケンシングセンターで行われている様々な機能の自動化の程度は、手動に
よるシステムから完全一体化処理まで様々である。シーケンシング研究室では、
この両極端のどちらの方法も、その作業の成功に貢献するプラスの特性を示した
。しかし、手動による設定では、配列読み取りの誤同定を引き起こす人為的エラ
ーが重大な問題点となるが、完全一体化処理ではモジュール一つが壊れただけで
システム誤作動に陥りやすい。
【０００４】 自動化を進める人々の間で現在取り組まれているのが、完全一体化システムか
ら、シーケンシングプロセスの個別の独立機能を実行する、より小規模なワーク
ステーションへの移行である。これは、一つのワークステーションが誤作動して
もシステム全体の故障にはならないことを意味する。さらに、このパラダイムは
、時とともにシーケンシングプロセスが変化し改良されても必要に応じた変更が
可能になるという柔軟性も考慮されている。特に、自動化ユニットを作製するた
めに時間がかかるため、柔軟性があれば、改良が可能になった時点で異なる部品
を変更したり改良したりすることができるようになる。ハイスループットシーケ
ンシング装置の場合、煩雑、非効率的でエラーが生じやすいいくつかの機能があ
る。これらの例は、コロニーピッキング、テンプレート調製、シーケンシング反
応設定、クローン回収及びゲル装填である。
【０００５】 最近の研究室ではサンプル操作には部分的に自動化された方法を用いている。
これらの方法では、サーモサイクリングプレートを用いて手動供給用96チャンネ
ルピペッタで試薬とテンプレートを混合する。他の研究室では、同様の作業を行
うために、テカンジェネシス社製（Ahmadi, 1997)などの分注ロボットを使用し
ている。様々な分注ロボット、及びプレート間流体移動、プレート密封、及び磁
気ビーズまたはろ過を用いた精製法を用いたプレートを用いたサーモサイクリン
グを利用する一体化システムが製作されてきた。しかし、これらのシステムは複
雑で製作費が高く、サンプル蒸発や容積の制限などの問題を抱えている。
【０００６】 標準5-10mlシーケンシング反応のもう一つの重大な欠点は、サンプルの少なく
とも50%が無駄になり、ゲル上に装填されることがない。さらに、現在のシーケ
ンサで検出できる蛍光標識DNAの量は一般に生成される量よりもはるかに少量で
ある（サンプルは0.5-1mlで十分である）。
【０００７】 いくつかのグループが、大量のDNAシーケンシングサンプルを扱う際にガラス
キャピラリを使用することを提唱している。例えば、Maxam and Gilbert(1997)
が開発した、最初の化学的シーケンシングプロトコルには、サンプル操作のため
に密封ガラスキャピラリを利用した。ある場合には、キャピラリがベルトコンベ
アのような装置上にあるいくつかの機能的ステーションを通って移動しながら、
それらを個々に充填、混合して操作した。他の開発計画では、96本のキャピラリ
がヒドラディスペンサ（ロビンズ・サイエンティフィック社製）に取り付けられ
、サンプルは上下に動きながら加熱要素を通り過ぎ、PCRを行うことができる（H unicke-Smith, 1997)。この装置の改良版では、銅の加熱要素がサンプルの場所
に対して上下した（スタンフォード・テクノロジー・ラブ社製、1998)。
【０００８】 DNAシーケンシング用のサンプル操作用容器としてキャピラリの使用が試みら
れてきたが、この精製をごく少量（<1ml）で行うことができる簡単で安価な方法
は現在までない。この作業を行うために多くの方法及び技術が開発されてきたが
、従来の技術には欠点が多い。例えば、エタノール沈殿は塩及びヌクレオチドを
除去するには完全に効果的なわけではなく、プライマ除去をすることはできない
。さらに、この技術ではDNAを喪失することが多く、自動化することが困難であ
る。クオンタムプレップTMSEクイーキークリーン96（カリフォルニア州ハーキュ
ールス、バイオラドラボラトリーズ社製、カタログ番号732-6260）及びマルチス
クリーン96（マサチューセッツ州ベッドフォード、ミリポア社製、カタログ番号
MAHVS45）などの市販キットは、エタノール沈殿と同様の作業を行うことができ
るが、プライマを除去することができず、引き続き遠心分離やろ過段階を必要と
する。したがって、DNAサンプルの精製作業には多くの処理段階が用いられる。
完全な塩及びテンプレートの除去のためのスピンカラム及び超ろ過を用いた効率
的な方法も報告されている(Ruiz-Martinez et al. 1998; 及びSalas-Solano et al., 1998)が、原材料が高価で、方法も簡単に自動化するには適していない。
【０００９】 少量DNA精製法で、好ましくは再利用可能な部品を用い、キャピラリを用いた
サンプル操作を容易に一体化することが可能で、遠心分離の必要がない方法が当
業には必要である。また、キャピラリを用いた精製装置及び空気方式サーモサイ
クリングにかわるサンプル操作法や、大きく費用を節約するための各セパレーシ
ョンにちょうど十分な量のサンプルを効率的に操作する方法も必要である。また
、上述の装置及び方法の場合、サンプル劣化や交差混入を最小化する必要性もあ
る。
【００１０】 発明の概要 本発明は、多くのサンプルを並行に処理できる、キャピラリを用いた生物学的
サンプルの吸引、インキュベーション、精製、及び輸送のための、キャピラリを
用いた一体化サンプル操作システムに関する。本発明はさらに、操作が簡便で何
度も再利用することができる、分注、混合、温度処理、及びサンプル精製の一体
化を提供する。
【００１１】 したがって、ある実施態様では、本発明は生物学的サンプルの一体化処理用装
置である。装置は、生物学的サンプルを保持する大きさで、第一端及び第二端を
有する第一キャピラリチューブ；生物学的サンプルを保持する大きさで、これも
また第一端及び第二端を有する第二キャピラリチューブ；及び第一キャピラリチ
ューブの第二端と第二キャピラリチューブの第一端に連結し、第一及び第二キャ
ピラリチューブを機械的及び流動的に連結する連結器を含む。
【００１２】 別の実施態様では、その装置は生物学的サンプルを保持する大きさで、第一端
及び第二端を有する第一キャピラリチューブ；第一キャピラリチューブの第一端
に連結して流体シールを選択的に提供する第一調節要素；生物学的サンプルを保
持する大きさで、第一端及び第二端を有する第二キャピラリチューブ；及び第一
キャピラリチューブの第二端と第二キャピラリチューブの第一端の間に配置され
第一及び第二キャピラリチューブの間に流体シールを選択的に提供する第二流体
調節要素を含む。さらに別の実施態様では、その装置は生物学的サンプルを保持
する大きさでサンプルの熱処理に適合された第一キャピラリチューブで第一端及
び第二端を有するその第一キャピラリチューブ；生物学的サンプルを保持する大
きさの第二キャピラリチューブで第一端及び第二端を有するその第二キャピラリ
チューブ；及び第一キャピラリチューブの第二端及び第二キャピラリチューブの
第一端に連結し第一及び第二キャピラリを機械的及び流動的に連結する流体調節
要素を含む。
【００１３】 さらに別の実施態様では、本発明は生物学的マイクロサンプルの一体化処理用
装置である。その装置は、生物学的マイクロサンプルを保持する大きさでサンプ
ルのサーモサイクリングに適合された第一キャピラリチューブで第一端及び第二
端を有するその第一キャピラリチューブ；生物学的サンプルを保持する大きさで
サンプルの平衡透析に適合された第二キャピラリチューブで第一端及び第二端を
有する第二キャピラリチューブ及び、第一キャピラリチューブの第二端及び第二
キャピラリチューブの第一端に連結し第一及び第二キャピラリチューブを機械的
及び流動的に連結する連結器を含む。
【００１４】 本発明の別の実施態様は、生物学的マイクロサンプルの透析用装置である。そ
の装置はマイクロサンプルを保持する大きさで、分子サイズ弁別 によりマイク
ロサンプルを精製する分離手段を含むキャピラリチューブを含む。好ましい実施
態様では、本発明は生物学的サンプルの平衡透析用装置である。別の好ましい実
施態様では、本発明は生物学的サンプルのフロー透析用装置である。さらに別の
好ましい実施態様では、本発明は生物学的サンプルの交換透析用装置である。
【００１５】 別の態様では、本発明は生物学的サンプルの一体化操作用のモジュラー装置で
ある。ある実施態様では、そのモジュラー装置は、生物学的サンプルを保持する
ためのキャピラリチューブの第一モジュラーアレイで、第一アレイ端及び第二ア
レイ端を有する第一モジュラーアレイ；生物学的サンプルを保持するためのキャ
ピラリチューブの第二モジュラーアレイで、第一モジュラーアレイの第二アレイ
端と連結する第二モジュラーアレイで、第一モジュラーアレイに脱着可能で交換
可能に連結することができるその第二モジュラーアレイ；及び第一モジュラーア
レイの第二アレイ端及び第二モジュラーアレイの第一端に連結して、キャピラリ
チューブの第一及び第二モジュラーアレイ間に流体シールを選択的に提供する流
体調節要素のアレイを含む。
【００１６】 別の実施態様は、本発明は生物学的マイクロサンプルの一体化処理用のモジュ
ラー装置である。その装置は、生物学的マイクロサンプルを保持する大きさでサ
ンプルのサーモサイクリングに適合されたキャピラリチューブの第一モジュラー
アレイで、第一アレイ端及び第二アレイ端を有するその第一モジュラーアレイ；
生物学的マイクロサンプルを保持する大きさでサンプルの透析に適合されたキャ
ピラリチューブの第二モジュラーアレイで、これもまた第一アレイ端及び第二ア
レイ端を有し、その第二モジュラーアレイは第一モジュラーアレイの第二アレイ
端に連結し、またその第二モジュラーアレイは第一モジュラーアレイに着脱可能
かつ交換可能に連結するその第二モジュラーアレイ；及び第一モジュラーアレイ
の第二アレイ端及び第二モジュラーアレイの第一アレイ端に連結し、キャピラリ
チューブの第一及び第二端の間に流体シールを選択的に提供する連結器のアレイ
を含む。
【００１７】 本発明の別の実施態様は、生物学的マイクロサンプルの透析用モジュラー装置
である。その装置は、マイクロサンプルを保持する大きさで、それぞれのチュー
ブが分子サイズ弁別によりマイクロサンプルを精製するための分離手段を含むキ
ャピラリチューブのモジュラーアレイを含む。
【００１８】 さらに別の態様では、本発明は生物学的サンプルの自動化及び一体化処理用の
システムである。ある実施態様では、そのシステムは生物学的サンプルを保持す
るための第一キャピラリチューブで、第一端及び第二端を有するその第一キャピ
ラリチューブ；キャピラリチューブをその第一端で支持するための支持アセンブ
リ；生物学的サンプルを保持するための第二キャピラリチューブで、これもまた
第一端及び第二端を有する第二キャピラリチューブ；第一キャピラリチューブの
第二端及び第二キャピラリチューブの第一端との間に、配置され、第一及び第二
キャピラリチューブ間の流体シールを選択的に提供するための第一流体調節要素
；及び、操作中に第二キャピラリチューブの下に流体貯蔵容器を選択的に置くた
めに配置されたプレート操作アセンブリを含む。
【００１９】 別の実施態様では、そのシステムは生物学的サンプルを保持する第一キャピラ
リチューブで、第一端及び第二端を有するその第一キャピラリチューブ；キャピ
ラリチューブをその第一端で支持する支持アセンブリ；支持要素と第一キャピラ
リチューブ間の流体シールを選択的に提供するための、支持要素と第一キャピラ
リチューブの第一端の間に配置された第一流体調節要素；生物学的サンプルを保
持する第二キャピラリチューブで、第一端及び第二端を有するその第二キャピラ
リチューブ；第一及び第二キャピラリチューブ間に流体シールを選択的に提供す
るための第一キャピラリチューブの第二端及び第二キャピラリチューブの第一端
の間に置かれた第二流体調節要素；及び操作中に第二キャピラリの下に流体貯蔵
容器を選択的に置くために配置されたプレート操作アセンブリを含む。
【００２０】 本発明の別の態様は、生物学的サンプルを自動処理するためのモジュール式シ
ステムである。そのシステムは生物学的サンプルを保持するためのキャピラリチ
ューブの第一モジュラーアレイで、第一アレイ端及び第二アレイ端を有するその
第一モジュラーアレイ；第一モジュラーアレイの第一アレイ端に連結してそのア
レイの第一端で支持するための支持アセンブリ；生物学的サンプルを保持するた
めのキャピラリチューブの第二モジュラーアレイで、第一モジュラーアレイの第
二アレイ端に連結し、その第二モジュラーアレイは第一モジュラーアレイに着脱
可能かつ交換可能に連結されている第二モジュラーアレイ；及び、操作中にキャ
ピラリチューブの第二モジュラーアレイの下に流体貯蔵容器を選択的に置くため
に配置されたプレート操作アセンブリを含む。
【００２１】 別の態様では、本発明は生物学的サンプル処理法である。ある実施態様では、
その方法は、生物学的サンプルを保持する大きさの第一キャピラリチューブの提
供、生物学的サンプルを保持する大きさの第二キャピラリチューブの提供、第一
キャピラリチューブの第二端と第二キャピラリチューブの第一端の機械的及び流
動的連結；及び操作中の第二キャピラリチューブの下への流体貯蔵容器の配置を
含む。
【００２２】 別の実施態様では、本発明は生物学的マイクロサンプルの一体化処理法である
。その方法は、マイクロサンプルの温度処理、及びマイクロサンプルの精製を含
み、温度処理及び精製段階は、マイクロサンプルの一体化処理が達成されるよう
な、これらの段階を一体化した上述の装置で行われる。
【００２３】 さらに別の実施態様では、本発明は生物学的マイクロサンプルの精製法である
。その方法は、分子サイズ弁別によりサンプルを精製する分離手段を含むキャピ
ラリチューブへのマイクロサンプルの導入、及びマイクロサンプルの精製が達成
されるのに十分な時間キャピラリチューブ中にマイクロサンプルを滞留させるこ
とができることを含む。ある実施態様では、マイクロサンプルの精製段階には透
析も含む。別の実施態様では、マイクロサンプルの精製段階にはフロー透析も含
む。ある実施態様では、マイクロサンプルの精製段階には交換透析も含む。
【００２４】 さらなる実施態様では、本発明はDNA反応混合物から迅速かつ効率的に不純物
を除去する精製及び洗浄方法に関する。特に好ましい実施態様では、DNA反応混
合物は宿主細胞中に産生されたDNAテンプレートを含む。
【００２５】 本発明の別の実施態様では、キャピラリは、例えばシーリングなどにより漏出
を防ぐが、同時に、例えばシリンジなどにより浸透も許容するように設計する。
この仕組みでは、プラス及びマイナスの圧力を加えることが可能となる。例えば
、この仕組みでは、マイクロタイタープレートからキャピラリへサンプルを吸入
し、さらに処理を進めるために引き続きプレートに分配し戻すことが可能になる
。
【００２６】 本発明のさらなる実施態様では、複数のサンプルを一本のキャピラリ中で同時
にサーモサイクリングする。
【００２７】 本発明の別の実施態様では、DNA及びシーケンシング試薬を一本のキャピラリ
中で測定し混合する。
【００２８】 さらに別の実施態様では、本発明は各キャピラリチューブの上下にあるシール
上に配置されたガイドキャップを提供する。この仕組みはシリンジ針をキャピラ
リの開口部へ誘導するように働く。
【００２９】 好ましい実施態様では、キャピラリチューブはガラス製、溶融シリカ製、また
はテフロン(R)製である。
【００３０】 発明の詳細な説明 定義 本発明のさらなる説明の前に、明細書、例及び特許請求の範囲で使用される特
定の術語を、便宜上、ここにまとめる。
【００３１】 「生物学的サンプル」という術語は、生物学的有機体の一つ以上の細胞または
細胞外成分を含むサンプルを意味する。このような成分には、ヌクレオチド（例
えば、DNA、RNA、それらの断片、及びプラスミド）、ペプチド（例えば、構造的
たんぱく質及びその断片、酵素など）、糖などを含むが、限定はしない。ここに
記載される生物学的サンプルは、輸送培地、生物学的バッファ、及び上述したプ
ロセスを行うための当業に公知のその他試薬なども含んでよい。本発明の方法は
、いかなる容積の生物学的サンプルでも行うことができるが、本発明に記載の生
物学的サンプルは典型的にはマイクロリットル(mL)単位の容積を有し、したがっ
て、例えば生物学的マイクロサンプルのようにマイクロサンプルと呼んでもよい
。本発明の方法は、10mLから0.05mL、好ましくは0.1mLから3mLの範囲の容積を有
する生物学的サンプルを用いて有利に行われる。
【００３２】 「カセット」という術語は、例えば96個以上のサンプルなどの複数のサンプル
を操作するキャピラリチューブアレイを収容することができる構造体、または「
モジュール」のことを意味する。
【００３３】 「透析」という術語は、当業に知られており、膜を介した不等拡散を利用して
流体中の物質を分離することを意味すると理解されている。ここに記載の「平衡
透析」は透析物の交換またはフローを用いないで生じる透析を意味する。「フロ
ー透析」は、透析のフロー（またはカウンターフロー）を用いて生じる透析を意
味する。「交換透析」は、膜周辺の透析物の少なくとも一つの変化を含む透析で
ある。
【００３４】 「一体化処理」という術語は、一つの操作で複数の段階が行われるという意味
で「一体化」される、少なくとも二つの別個の段階を含むプロセスを意味する。
このようなプロセスには、テンプレート精製、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) 、DN Aシーケンシング、ポリヌクレオチド連鎖反応、クローニング、リガーゼ連鎖反
応(LCR)、一塩基伸展反応、エキソヌクレアーゼ処理、及びオリゴヌクレオチド
ハイブリダイゼーション反応などを含むが、限定はされない。これらのプロセス
に関連するプロセス段階は、例えば、吸入、混合、インキュベーション、精製、
加熱または冷却などの温度処理、及び生物学的サンプルのみの輸送、またはそれ
を生物学的適合性の担体液に入れたある選択された方法による輸送などが含まれ
る。ここに記載される本発明はこれら別個の段階を一体化し、すなわち、本発明
は、複数の別々の操作により行われていたこれらの段階を一つの操作で行うこと
を可能にする。
【００３５】 「膜要素」という術語は、例えばサイズ除去法などによる、不等拡散を用いて
流体中の物質を分離するために用いられてもよい物質を意味する。例示的な膜要
素は半透性であり、すなわち膜要素で透析を行うことが可能である。
【００３６】 「精製」（原語：purification）という術語は、望ましくない要素を望ましい
要素から分離するいかなる操作の、様々な文法形及び類義語（例えば精製（原語
："purification", "clean up"）、精製する（原語：purifying）など）の形も
包含することを意図する。このような操作は、ろ過、超ろ過、透析／平衡透析、
クロマトグラフィなどを含むが、限定はされない。ある実施態様では、精製は生
物学的サンプルの要素を分子サイズ弁別することにより行われる。分子サイズ弁
別による精製は、当業に公知の有孔性を変化させた多くの素材を用いて行うこと
ができ、その素材はフィルタ、膜、及び半透性超ろ過ファイバ素材などを含むが
限定はされない。
【００３７】 「温度処理」（原語："temperature processing", "temperature treating")
、及び「熱処理」という術語はすべて、進行中の特定のプロセスにより様々な温
度条件をサンプルに適用することを同等に意味し、その中には例えば熱変性、ア
ニーリング、インキュベーション、沈殿など、連続的及び不連続的加熱措置が含
まれるが限定はされない。例えば、この術語はPCR及び同様のプロセスに伴うサ
ーモサイクリングも広く包含する。「超ろ過」とは、透析のどのような方法も意
味し、サンプルが透析物と比較して加圧力下にある場合を意味する。
【００３８】 ここに記載した本発明は、本発明のキャピラリを用いた自動化処理のためのキ
ャピラリを用いた一体化サンプル操作システムを含む。システムは、望ましくは
標準マイクロタイタープレートを試薬源として用いて、多くのサンプルを並行に
処理することができる。本発明に関連したキャピラリチューブを使用すると、流
体容積のほんの小さな部分しか大気にさらされていないために、蒸発が最小化さ
れる利点がある。このことがサンプル処理を促進しながら、同時にサンプル喪失
を防ぐのである。本システムのキャピラリチューブは、圧電要素子、可動ピスト
ンまたはシリンジ型プランジャなどの気体または流体充填容積測定装置の一体化
により、流体を回収、混合及び分配するために用いることができる。
【００３９】 図１は本発明の教示によるキャピラリを用いたサンプル操作システム10の模式
図である。図示したシステム10は、キャピラリを用いた処理アセンブリ14を支持
及び／または装着するために構成された支持アセンブリ12を用いている。支持ア
センブリ12は、キャピラリを用いた処理アセンブリ14を、貯蔵プレート32を支持
する大きさに作製した圧盤表面30上に配置する。制御装置36を、支持アセンブリ
及び処理アセンブリ14の各部分などのサンプル操作システム10の特定要素、及び
温度調節源40に連結する。支持アセンブリ12、圧盤30、及び制御装置36で、米国
ロビンスサイエンティフィック社製ヒドラディスペンサのような従来の流体分配
ユニットの一部を形成することができ、ここに教示されたことを考慮して当業者
に明らかな適切な方法で改良することにより、キャピラリを用いた処理アセンブ
リ14を有効に装着することができる。当業者は、現在実践的に用いられているそ
の他の分配ユニット及びサンプル操作ユニットを、モジュラーまたは単体のいず
れの形にせよ、本発明のキャピラリを用いた処理アセンブリ14に装着するのに適
合されていれば、ここに記載した特徴及び機能を実現するために用いることがで
きるということも認識するであろう。
【００４０】 図示した処理アセンブリ14には、生物学的サンプルに多くの処理段階を行うよ
うに、特定の方法で機能的または効果的に連結された、多数の単体要素が含まれ
る。キャピラリを用いた処理アセンブリ10は、単一の垂直一体化ユニット中の多
くの処理段階を行うために特定の方法で連結した、多数の効果的に連結したキャ
ピラリチューブを含む。図示したアセンブリ14は、一端で支持アセンブリ12に連
結され、反対側の端で流体調節器48に連結した流体連結器44を含む。流体連結器
44は制御装置36及び支持アセンブリ12に連結して処理アセンブリ14中の流体の動
きを調節するように機能する。例えば、流体連結器44は支持アセンブリ12の一部
を形成するポンプ装置に連結し、処理アセンブリ14の近位端に流体を導入するか
、または流体を排出する。通常の当業者は、流体連結器44は、プランジャ型また
はシリンジ型機械的連結器などのいずれの適切な独立型流体作動装置も含むこと
ができ、流体の運動またはポンプ装置を含んでもよい支持アセンブリ12と処理ア
センブリ14の残りの部分の間を連結する流体及び機械的連結器として働くその他
のいかなる適切な流体導管でもよいことも容易に認識するであろう。流体連結器
は必要に応じて、キャピラリチューブ50の上部または下部にシリンジ／シリンジ
針のためのガイドを含んでもよい。
【００４１】 さらに図１に関して、図示した流体調節器48は、選択的な流体連結器44の配置
や、キャピラリチューブ50のように処理システムの残りの部分との特定の流体連
絡に適合されている流体バルブまたは締め付け可能なシリコーン連結器バルブ型
構造でもよい。流体調節器48は、手動で操作するか、本発明の自動化サンプル操
作システム10のように、図示される制御装置36との適切な連絡経路を経た連結に
より、完全自動化サンプル操作システムの一部とすることもできる。キャピラリ
チューブ50は、生物学的流体をマイクロリットル単位で流動的に保持するための
大きさに作製された、市販標準キャピラリ要素であってもよい。好ましい実施に
よると、図示したキャピラリチューブ50は、生物学的に適合された担体媒体中の
生物学的サンプルを保持するのに適合されている。適切な生物学的サンプルの例
には、DNA、たんぱく質及びその他の類似生物学的成分が含まれ、生物学的に適
合された担体媒体は、既知のバッファ、または生物学的処理技術に一般的に採用
された処理流体でもよい。
【００４２】 図示したキャピラリチューブ50は近位端50Aにおいて第二流体調節器48にさら
に連結する。流体調節器48は好ましくはキャピラリチューブ50の遠位端50Bに連
結した流体調節器と類似している。二つの流体調節器48を組み合わせる（48がチ
ューブ50のいずれかの端に連結している ことで、キャピラリチューブ50の空洞
を処理システム14の残りの部分から流動的に隔離することができる）。この構造
は、制御装置または手動で行われる特定の処理措置を、処理アセンブリ14の他の
どの区域で行われている他のどの作用からも独立したキャピラリチューブの領域
内で行うことができる。例えば、加熱要素または冷却源を含んでもよい温度調節
源40は、処理アセンブリ14が特定の位置に配置されたときに、キャピラリチュー
ブ50と温度が連結している。温度調節源40は、好ましくはキャピラリチューブ50 を加熱する加熱源である。このように、キャピラリチューブ50の空洞内に収容さ
れた生物学的サンプル及び必要であれば関連担体流体は、使用者が選択した措置
に従ってサーモサイクリング処理にかけることができる。通常の当業者は、温度
調節源40が直列の抵抗性熱要素を含んでもよく、またはキャピラリチューブ50の
外側表面全体に加熱された空気を通過させるような熱源でもよいということを容
易に理解するであろう。
【００４３】 図示したキャピラリチューブ50はガラス製でもよく、またはポリイミドコート
された溶融シリカでコーティングされている。本発明の教示に記載の用途に適切
なキャピラリチューブは、特定の温度範囲、キャピラリサイズ、熱耐性、及び生
物学的サンプル及び担体流体の各内容物及び量を考慮すると、通常技術の一つの
範囲内である。これらのパラメータに関する通常の当業者は、適切なキャピラリ
チューブの大きさ及び長さを決定することができるものである。さらに、キャピ
ラリチューブ内で行われることが望ましい特定の種類の処理、並びに生物学的サ
ンプル及び担体流体の種類及び量を考慮すると、キャピラリチューブの内容物を
加熱するための特定の温度も、通常技術の一つの範囲内である。
【００４４】 再び図１に関して、第二キャピラリチューブ52は、遠位端52Aで中間流体調節
器48 と連結し、近位端52Bで第三流体調節器48 と連結する。上述のように、キ
ャピラリチューブ52の近位端52A及び遠位端52Bに連結した流体調節器48は、キャ
ピラリチューブ52を流動的に隔離するようにも働く。従って、キャピラリチュー
ブ52内の第二または追加の処理措置を、別のキャピラリチューブ50内で生じてい
るどの特定の処理措置とも独立に、同時発生的に、また同時に生じさせることが
できる。
【００４５】 中央に内腔を有する流体チップ56は、公知の技術に従って第三流体調節器48と
連結する。流体チップ56は、サンプル操作システム10の圧盤30上に配置された貯
蔵容器32へ流体を移すか、またはそこから流体を受け取るように働く。図示した
貯蔵容器32は標準96穴マイクロタイタープレートであってよく、したがって、図
示したシステム10に連結して生物学的サンプルの多重並行処理を行うために用い
ることができる。流体チップは好ましくは、操作の一方式にしたがって、流体貯
蔵容器などの外部流体源と処理アセンブリを流動的に連結する、適切な機械的連
結器のいずれかである。チップは好ましくはテフロン(R)加工されており、プラ
スチック製またはステンレス鋼製であってよい。通常の当業者に明らかなその他
の種類のチップも使用することができる。
【００４６】 図示した処理アセンブリ14は、一つまたは多数の生物学的サンプルをアセンブ
リの軸長全体で吸入することができる単一、スタック状、または一体化された処
理サブアセンブリ14を提供し、流体調節器に連結して、並行に異なる処理措置を
行うアセンブリの特定の部分を分離することができる。
【００４７】 図示した制御装置36は、使用者が選択した情報に従って、流体調節部品48がキ
ャピラリチューブ50及び52を相互に相対的に選択的に連結または取り外すように
制御するようプログラムされている。例えば、制御装置36は、開位置の場合、図
示した流体調節器48をアセンブリ14の軸長ほぼ全体、すなわち指示アセンブリか
ら流体チップ56の流出口までが一つの軸方向流体内腔を形成するように配置する
ことができる。また、制御装置36は、処理アセンブリの一つ以上の領域を残りの
領域から流動的に分離または隔離するように、一つ以上の流体調節器48を作動さ
せることができる。図示した制御装置36は、支持アセンブリ12を制御することも
できる。好ましい実施によると、制御装置は支持アセンブリ12を、貯蔵容器32へ
流体を戻す、またはそこから流体を導入するための選択された位置に配置するよ
うに支持する特定の制御データを提供する。支持アセンブリ12により処理アセン
ブリ14に付与される軸方向の動きを、矢印58で示す。図示した制御装置36は、さ
らに制御信号を温度調節源40に提供し、処理アセンブリ14の特定領域の加熱また
は冷却の提供源を選択的に作動させる。温度調節源40は第一キャピラリチューブ
50の温度を調節するために配置されるが、通常の当業者は、支持アセンブリ12が
、第二キャピラリチューブ52などの処理アセンブリ14の他の一部分を、温度調節
源40により加熱または冷却される位置に配置することができるということも容易
に理解するであろう。また、温度調節源40は複数使用してもよい。さらに、図示
した支持アセンブリ12及び／または制御装置は、処理アセンブリ14を矢印58Aで
示した水平方向に動かすこともできる。
【００４８】 図示したサンプル操作システム10の重要な利点は、一般に大量のサンプルを必
要とする遠心分離の必要のない、少量の生物学的サンプルを自動化フォーマット
で処理することができる自動化された高速サンプル操作システムを提供すること
である。さらに、システム10の図示した処理アセンブリは、好ましくは再利用可
能な部品を使用し、これにより、主要なシステム部品の有効寿命を顕著に延ばす
。一体化処理アセンブリ14は、一つ以上の処理措置を並行に、必要ならば相互に
独立に行うために、効率的、小型で比較的簡便な処理アセンブリも提供する。
【００４９】 複数のキャピラリチューブを処理アセンブリ14に使用する重要な利点は、各キ
ャピラリチューブのサンプル容積は、ごく少量のサンプルを処理することを可能
にすることであるが、それは蒸発の影響を受けるのが、キャピラリチューブ内に
配置された担体流体全体の比較的小さな容積だからである。このサンプル保存法
の利点により、選択されたサンプル処理を行うのに必要なサンプル容積が著しく
減少し、同時に、改良された信号強度及び分解能を有するシーケンシングラダー
を有するサンプル産出を可能にする。
【００５０】 好ましい実施によると、キャピラリチューブは、好ましくは、約１マイクロリ
ットル未満の流体容量を収容する内部容積を有する。
【００５１】 新規サブマイクロリットルキャピラリチューブを並行に使用する利点は、図１
に図示したように、自動化サンプル操作フォーマットにおいて、最少量の高価な
シーケンシング試薬と比較的少量の生物学的サンプルの使用を可能にすることで
ある。図示した処理アセンブリ14は、シーケンシングラダーの調製、及びシーケ
ンシングラダーの適切なマイクロタイタープレートへの注入といったポリメラー
ゼ連鎖反応（PCR）生成物の精製手順、または処理アセンブリ14の特定の区域へ
の生物学的生成物の吸入を行うために用いられてもよい。処理アセンブリ14の特
定区域内に収容することができる、またはそこで行うことができる特定の処理措
置の詳細を後述する。
【００５２】 ある実施によると、図示した処理アセンブリ14は、処理アセンブリの一つ以上
の領域内に配置された生物学的サンプルを精製するために用いることができる。
例えば、図２に図示されるように、流体調節器48のいずれかの末端に連結したキ
ャピラリチューブ52は、半透性マイクロファイバなどの分離要素をDNAなどの生
物学的サンプルを処理するために収容することができる。 ある技術によると、
キャピラリ52及び図示したマイクロファイバ60は、キャピラリ電気泳動システム
の範囲内で平衡透析を行うために用いることができる。一般に、DNAシーケンシ
ング生成物を精製するのは、過剰な塩、ヌクレオチド、プライマ及びテンプレー
トを生物学的サンプルから除去するためである。図示したマイクロファイバ16は
、処理アセンブリが近位端で加圧または真空条件にさらされる時、必要な生成物
を排除し、同時に不必要な成分を通過させるためのDNAのろ過処理を行うために
用いることができる。DNAサンプルは、システム内を加圧することによりマイク
ロファイバを通って循環し、これにより比較的小さな成分が中空のファイバ外に
ろ過され、それゆえサンプルがろ過される結果となる。キャピラリチューブをそ
こに配置した一つ以上のマイクロファイバと共に使用することにより、約10から
0.05マイクロリットルの間のごく少量に平衡透析を行う能力を提供する。
【００５３】 図３に示したように、本発明のさらなる重要な利点は、例えばキャピラリチュ
ーブのカセットなど、キャピラリチューブ50及び52がキャピラリチューブアレイ
70の一部を形成することもできることである。図示したキャピラリチューブアレ
イにより、図示したサンプル操作システム10が、処理アセンブリ14の巨大なアレ
イ中で多数の並行処理を行うことができる。特に、システム10はキャピラリチュ
ーブ50及び52の多数のアレイの使用を収容することができる。例えば、キャピラ
リチューブ50はアレイの一部を含んでもよく、キャピラリチューブ52もキャピラ
リチューブの第二アレイの一部を形成してもよい。図示した流体調節器48をモジ
ュラーキャピラリチューブアレイの間に挿入し、処理チューブのモジュラー及び
スタック可能なアセンブリを形成して、図示したシステム10に連結して使用して
もよい。図示した制御装置36は、分注ロボットなどの適切なロボットアセンブリ
に指示データを提供し、図示したシステム10の処理アセンブリ14から選択した一
つ以上のキャピラリチューブ50及び52のモジュラーアレイをスタックするかまた
は取り除いてもよい。 図示したシステム10のこのモジュラー態様は、生物学的
サンプルを標準96穴マイクロタイタープレートに吸入または導入するための、キ
ャピラリチューブのモジュラーアレイの着脱可能かつ交換可能な使用法を考慮に
入れている。さらに、キャピラリチューブのモジュラーアレイのスタック可能な
態様は、多数の特定の処理を一つ以上のキャピラリチューブ内で行うことを可能
にする。処理措置が完了したら、その後の処理または保存のために、システムか
ら分注ロボットを有する一つ以上のモジュラーアレイを取り外すことができる。
【００５４】 図６に図示された本発明の別の実施態様によると、サンプル操作システム10'
は生物学的サンプルを処理するために、一本のキャピラリチューブ51を使用する
ことができる。サンプル操作システム10'は、一つの処理措置が生物学的にサン
プルに作用することが望ましいと考えられる応用例において使用することができ
る。このような処理措置には、サンプル精製、サーモサイクリング、及びここに
説明されたその他のサンプル処理段階が含まれてよい。サンプル精製の場合、図
２に示されたマイクロファイバ60などの膜要素はキャピラリチューブ51内に提供
されてもよい。
【００５５】 本発明によると、サンプルの精製は、透析、ろ過、超ろ過及びクロマトグラフ
ィなど様々な方法により行われてよい。本発明はさらに、選択された精製法によ
っては、精製を行うための様々な構成を提供する。例えば、平衡透析が精製の方
法である場合、本発明の機器は、透析物と有効に作用する接触物（例えば水）中
の膜要素を含む少なくとも一つのキャピラリを提供する。ある実施態様では、透
析物はカセットに収容される。交換透析が精製方法である場合、透析物を有する
少なくとも二つのカセットにキャピラリをうまく挿入してもよい。
【００５６】 ここに述べたように、本発明には透析技術も含まれ、この技術はポリメラーゼ
連鎖反応（PCR)及びサイクルシーケンシング反応を効率的に「精製」（原語：cl ean up）するために用いられることがある。今まで、従来の透析技術に関わる問
題の一つが規模であった。一般に、透析は、1mL以上という比較的大量のサンプ
ルで行われる。一方で、一般的なPCRまたはシーケンシング反応は、一般に約10m L以下のサンプル量を使用し、その量は従来の透析技術で用いられるサンプル量
よりも格段に少ない。
【００５７】 本発明は、キャピラリチューブのうちの一つの中に挿入した一つ以上のマイク
ロファイバなどの膜要素を用いることでこの格差に対処する。マイクロファイバ
は、それよりもはるかに大きな透析作業と同じくらいの分離機能を果たすが、サ
ンプル量ははるかに少なく、遠心分離も使用しない。マイクロファイバは、市販
のろ過カートリッジから取り出した一つ以上の中空ファイバにより生成または製
造することができる。カートリッジは、大量のサンプル（例えば1mL以上）の透
析を行うためだけに設計されているため、一般に数百本のファイバを有する。多
くの種類及びサイズの中空ファイバろ過カートリッジはミリポア社（マサチュー
セッツ州ベッドフォード）またはスペクトラム・ラブズ社（カリフォルニア州ラ
グナヒルズ）などの供給業者から入手できる。一般に、これらのカートリッジは
超ろ過装置として用いられ、透析膜がフィルタとして働き、システムに圧力をか
けるか真空にしたときに必要な生成物を排除し不必要な成分を通過させる。本発
明は、生物学的サンプル一つにつき一本のファイバを使用して、少量の生物学的
サンプルから成分を適切にろ過または分離する。このように、サンプル量が10か
ら0.05mLの透析が達成される。
【００５８】 ある様式の操作によると、本発明は、最初に標準ビッグダイターミネータサイ
クルシーケンシングレディリアクションキット（部品番号4303154、カリフォル
ニア州フォスターシティ、PEアプライドバイオシステムズ社製）を行い、反応サ
ンプルサイズが0.05-10mLのサンプルの適切な精製を行う。サンプルは、ハミル
トン社（ネバダ州レノ）製10mLシリンジを用いて、スペクトラムカートリッジカ
タログ番号132229（カリフォルニア州ラグナヒルズ、スペクトラムラブズ社製）
から切り出した中空ファイバフィルタに吸い上げた。精製は、その後、ここに説
明された様々な方法のいずれかに従って行われた。
【００５９】 本発明のある利点は、操作が簡単でかなりの回数再利用することができる、簡
便な、一つに一体化されたフロースルーシステム10（または処理アセンブリ14）
中で、分注、混合、温度制御／サーモサイクリング、及びサンプル精製を一体化
することである。サンプル成分を、テフロン(R)加工チップ、テフロン(R)チュー
ブその他のプラスチック製チューブ、ステンレス鋼、またはテフロン(R)加工ス
テンレスなどの流体チップ導管56に吸入し、混合する。サーモサイクリングは例
えばガラス製またはさらに好ましくはポリイミドコート溶融シリカ製キャピラリ
チューブ50に異なる温度の空気を吹きつけて行うが、流体媒体を熱伝導体として
用いてもよい。キャピラリ超ろ過素材により、必要なDNA生成物と比較して小さ
い分子サイズの不必要反応生成物を、適切なチャンバ内で水に対して透析するこ
とにより除去することができる。
【００６０】 透析技術は十分に確立されているが、サンプルを喪失しないように少量のサン
プルで行うことは、従来は困難であった。半透性マイクロファイバ超ろ過素材は
、様々な多孔性のものが入手でき、大きな成分が選択的に保持されている間に、
小さい成分が自由に通過することができる。これらは、たんぱく質の超ろ過に一
般に用いられているわけではないが、いくつかの素材だけがキャピラリを用いた
透析に適している。PCR及びDNAシーケンシング反応から除去される反応成分はす
べて、必要な生成物よりもはるかに小さいので、本発明のプロセスはこれらの反
応物を「精製」（原語：clean up)するのに最適な方法である。
【００６１】 本発明のある実施態様によると、サンプル操作装置の各区域、またはそれによ
り行われる処理措置（例えば混合、洗浄、サーモサイクリング、及び流体操作）
は、サンプルが操作の各段階中に「さまよう」ことを防ぐために、図示したバル
ブ48によって他から隔離することができる。このような装置の直線型または長方
形のアレイは、システム圧盤30上のマイクロタイタープレート32にうまく接続す
る。アレイの透析及びサーモサイクリング部分は、別々の密閉容器に密封され、
装置全体に制御された流体または空気の流れを提供する。
【００６２】 この配置により、サブマイクロリットル量の流体を、システムに負の圧力をか
けて吸入することが可能になる。特に、サンプルは、制御された圧力変化により
システムの様々な部分に移動する。なお、キャピラリは、直径250mM、容積0.5ml で、高さが約1 cmである。本発明の教示に従った、キャピラリサンプルホルダを
使用した少量吸入および輸送に適合していると考えられる市販の装置は、数多く
ある。これらには、ロビンズサイエンティフィック社製９６または３８４チャン
ネルサンプル流体分配器(ヒドラ）、プレシジョンサイエンティフィック社製「
ナノムーバー」、及びその他いくつかの可能なデザインなど、いくつかの製造業
者のシリンジポンプが含まれる。ヒドラシステムは、並行チャンネルから特定の
量を、同時に正確に首尾一貫して吸入及び輸送する能力があることから、便利で
ある。これらのシステムにより、物理的なプレート処理システムとPCベースのプ
ログラミングシステムをRS232ポートを介して容易に一体化させることができる
。
【００６３】 温度制御及びサーモサイクリングには、広範囲の空気温度に素早く調節するこ
とができるように、適切な位置にバルブを取り付けた二温度空気循環システムを
使用してもよい。例えば、キャピラリチューブ50に配置して、二つの流体調節器
48により処理アセンブリのその他の部分から隔離したサンプルを加熱するために
、熱源40を使用してもよい。
【００６４】 したがって、ある実施態様では、サーモサイクラはサンプル温度を変化させる
ために熱気及び冷気の組み合わせを用いてもよい。温度を変化させるために、単
純な空気送風機、を使用してもよく、または周囲の空気及び抵抗ヒータで熱した
空気をキャピラリに吹き付けてもよい。温度は標準PID制御装置により測定及び
制御される。例えば加熱サイクルの最初に過熱空気を使用し、その後キャピラリ
の温度が過剰に高くなりすぎることをさけるために冷気を使用して、必要に応じ
て加熱速度を高めればよい。
【００６５】 サンプル操作システム10の支持体12に装着された直列型処理アセンブリ14は、
サンプル吸入、混合、サーモサイクリング、透析及び分配を一つの装置に一体化
する。これは、サンプルの統合性（蒸発なし）、単純性及びスループットに関し
て明確な利点である。システム10の一箇所以上で流体レベルを検出し、オープン
ループまたはフィードバックコントロールを制御装置36に設けて必要な時に処理
アセンブリの一つ以上の部分のサンプルまたは流体レベル量を調節するために、
光センサを図示したシステム10に連結して用いてもよい。本発明のシステム10は
、従来のシステムより操作や維持がはるかに簡単で正確な容積測定システムを提
供する。少量の流体を正確に吸入するために、空隙を最小限に維持し（システム
のほぼ全体を水で満たす）、液滴やキャリーオーバが付着するのをさけるために
キャピラリの外側表面をテフロン(R)などの疎水性素材でコートしたほうが有利
である。したがって、容積は、チップ56で正確に吸入及び分配することができ、
システム内の正確な位置に移動させることができる。異なる流体（すなわちDNA
及びビッグダイターミネータサイクルシーケンシングレディリアクションミック
ス（DT-ミックス））を、小さな空隙を間に挟んで（交差混入を最小にして）、
別々の「スラグ」に吸入することもできる。サンプルをチップに分配し戻す場合
、液滴（チップの大きさと比較して大きすぎなければ）がチップに付着し、サン
プルが混ざる原因となる。そのときは、液滴を吸入してシステムに戻すことがで
きる。シリカキャピラリは、2ミクロン以内の大きさにばらつきのないものを入
手することができる。
【００６６】 本発明は、DNA反応混合物から夾雑物を迅速かつ効率的に除去する精製及び洗
浄方法にも関連する。現在のシーケンシング装置は、ゲルを通した電気泳動を使
用しており、適切に標識された異なる長さのDNAを分離、検出する。これらの装
置をより迅速で正確な結果を出すものにするために、ゲル分離媒体の形状を厚い
ゲルから細いキャピラリで捕捉したゲルに変更した。大きな欠点は、シーケンシ
ングしているDNA中の夾雑物がキャピラリを物理的に塞ぎ、異なる長さのDNAの正
確な検出を妨げるということである。DNAサンプル中の主要な夾雑物源は、DNAサ
ンプルを精製するサーモサイクリング反応の副生成物の所産である。反応中にDN A鎖に組み込まれなかった通常及び染色標識ヌクレオチドの両者が、DNAシーケン
サを劣化させる夾雑物となる。さらに、反応中に残された反応試薬のイオン成分
（例えば塩など）も装置を劣化させる。
【００６７】 ある実施態様では、本発明はサーモサイクリング反応からの夾雑物の効率的な
除去を提供する。反応混合物をサーモサイクリングにかけたら、精製は、低濃度
のイオン成分を有する溶液と接触している中空膜要素に混合物を配置して行って
よい。膜全体にかかる浸透圧の差により、生成物の夾雑物は膜の向こうの水溶液
へ強制移動させられ、効率的に生成物から夾雑物を除去する。
【００６８】 別の実施態様では、本発明は宿主細胞中に生成されたDNA分子の精製機器及び
方法を提供する。例IVにさらに記載されているように、本発明は宿主細胞中にお
けるテンプレートDNAの生成、宿主細胞の溶解、テンプレートDNAの精製及びシー
ケンシングを提供する。
【００６９】 実施例 例I：DNAシーケンシング 図１に関して、システム14をまず水で洗浄し、それからシリンジを約5mL残し
て水で満たす。次に、1cm(0.5mL)の空隙を吸い上げから、0.5mlのDNA、及び0.5m Lのビッグダイターミネーターサイクルシーケンシングレディリアクションミッ
クス(DT)(部品番号4303154、カリフォルニア州フォスターシティPEアプライドバ
イオシステムズ社製）を吸い上げる。その後DTおよびDNAを混合のために排出す
る。1mlの反応混合物を吸入してサーモサイクリング区域50に上げて（1-2cm空隙
を維持しながら）、その後サーモサイクリングを行う。サンプルを透析区域52に
下ろし、20分間透析する。最後にサンプルをマイクロタイタープレートに排出し
て水で洗浄する。
【００７０】 この処理中、下にあるプレートハンドラがプレートを交換し（DNA源から、DT
混合物へ、アウトプットプレートへ）、それらを上下に動かす（空隙を作るため
に）。分注、フロースルー精製、及びサーモサイクリングは迅速で、スループッ
トは非常に高く、例えば384チャンネルシステムでは一時間に約384サンプルくら
いの速度である。ゲルを3時間ごとに96サンプルの速度（提唱される最高スピー
ド）で稼動させることができれば、全速で稼動する１台のサンプルロボットが８
つのゲルシステムに供給することができる。
【００７１】 サンプル操作装置は、スタックすることのできる、または流体処理段階に作用
する流体処理装置に独立に一時的に取り付けることのできる直列の独立モジュー
ルも構築することができる。この方法の利点は、システムの中で作製するのに最
も高価な部分である一つの流体処理装置を、多数の透析及びサーモサイクリング
モジュール中でサンプル処理するためにさらに最適に利用することができるとい
うことである。プレートを、典型的な一体化自動化システム上で操作する方法と
同様に、後者のモジュールを操作することができ、独立したユニットが流体処理
装置から離されたときに有利に自動的に密閉され、またプレート間移動がキャピ
ラリ間移動に置換される（大気との接触をさけるため）。透析モジュールの例を
図３に示す。
【００７２】 例II：透析 本例は、シーケンシング及びPCR反応精製法としてごく少量のサンプルを中空
ファイバ透析に使用することの実現性をさらに説明する。作業のほとんどは、標
準1/4Xビッグ大ターミネータヒドラシーケンシング反応プロトコルに従い、PEア
プライドバイオシステム社製標準ビッグダイターミネータサイクルシーケンシン
グレディリアクションキット部品番号4303154を用いて準備されたシーケンシン
グ反応を用いて行われた。結果はABI377自動化DNAシーケンサー（カリフォルニ
ア州フォスターシティ、PEアプライドバイオシステム社製）またはメガベース10 00自動化DNAシーケンサ（カリフォルニア州サニーベイル、モレキュラーダイナ
ミクス社製）を用いて得た。生データはフレッドソフトウェア(Brent Ewing, La Deana Hillier, Michael C. Wendl and Phil Green Base-Calling of Automated Sequencer Traces Using Phred I. Accuracy Assessment Genome Research 8, pg 175-185; Brent Ewing, Phil Green Base-Calling of Automated Sequencer Traces Using Phred II. Error Probabilities Genome Research 8, pg 186-19 4)により解析した。
【００７３】 個々の中空ファイバ透析チューブはアミコン社製（マサチューセッツ州ベバリ
ー）ファイバろ過カートリッジを切り開いてファイバを取り出して得た。ファイ
バは使用するまで滅菌蒸留水中に保存した。異なるポアサイズを有するファイバ
をこれらの研究に使用したが、大半の実験は平均ポアサイズ100Kdalのフィルタ
を使用して行った。
【００７４】 標準1/4Xビッグダイターミネータヒドラシーケンシング反応は、ハミルトンシ
リンジ（ネバダ州レノ、ハミルトン社製）を用いて中空ファイバ透析チューブに
移された。中空ファイバの末端はピンセットでつまんで封鎖した。透析ファイバ
に封入された反応物は、その後、滅菌蒸留水のビーカに浮遊させて、３０分間平
衡化した。３０分後、ファイバをビーカから取り出し、封鎖した末端を切断し、
中空ファイバの内容物をハミルトンシリンジで取り出した。その後サンプルをAB I377またはメガベース1000自動化DNAシーケンサにかけた。
【００７５】 「精製」（原語："clean up")と呼ばれるシーケンシング反応の副産物の一般
的な除去法は、エタノール沈殿（EtOH prec.)である。本発明の方法をEtOH prec .と比較した。図４から明らかなように、本発明の透析法と標準EtOH prec.とか
ら得られた結果を比較する377ゲルを目視で検査すると、透析技法はシーケンシ
ング反応の副産物である組み込まれなかったダイターミネータを除去し、EtOH p rep.よりもよい分解能になることを示している。データを表１にまとめる。第１
列は、その特定のシーケンシング反応で精製された確実な塩基の合計数である読
み長を示す。第２列及び３列は、それぞれフレッドスコア30及び20以上の量スコ
アを有する塩基の合計数を示す。透析の読み長の塩基数と、高い量フレッドスコ
アを有する塩基数の増加が連動していおり、透析方法による結果の方が優れてい
ることを示唆している。
【００７６】
【表１】
【００７７】 例III：透析動力学 以下の実験は透析反応の動力学を実証する。サンプルとして、BDターミネータ
ミックスまたはETプライマミックスのいずれかを有する流体10マイクロリットル
を用いた。BDターミネータミックスは、標準シーケンシング反応中にみられる過
剰の蛍光標識ジデオキシターミネータ生成物を刺激し、一方、ETプライマミック
スはPCR反応中にみられる組み込まれなかったプライマを刺激する。各サンプル
は、100Kdalの平均ポアサイズを有するファイバを使用した上述の方法を用いて
、以下に上げる時点、0,5,10,15,30,60,120分及び最終が１２時間経過時点で、
または一晩(o/n)、透析した。図５に示したように、結果は、シーケンシング反
応（すなわちBDターミネータミックス）透析は非常に素早く生じ、５から１０分
で平衡を生じることを明らかに示唆している。はるかに大きなプライマ（すなわ
ちETプライマミックス）は、除去にかなりの時間がかかり、この実験では平衡に
達するまでに少なくとも６０分かかった。特記すべきことは、プライマ除去を利
用するには、大きめのポアサイズの中空ファイバ（例えば500Kdal)を用いること
が有利であることある。
【００７８】 例IV：プラスミド精製 プラスミドテンプレート精製は、ポアサイズ100Kdalを有する1.1mm ID直径チ
ューブを使用して行った。ヒトBAC挿入断片を有するプラスミドサブクローンを
、96穴型で増殖させ、遠心分離し、リゾチームを加えたSTETバッファ(73uL)中、
95℃を超える温度で２分間加熱し、ろ過して処理した。 透明ろ過液（〜３０ｍ
Ｌ）を、
その後３０分間、1mMEDTAに対して透析した。得られた４マイクロリットルのサ
ンプルをその後、直接ビッグダイターミネータシーケンシングミックスに加え、
サンプルをABI 377 自動化DNAシーケンサ（カリフォルニア州フォスターシティ
、PEアプライドバイオシステムズ社製）で分離した。このように処理された286
個のサンプルから得た生成物は、平均短縮読み長が703nt、及び合格配列の場合
のフレッド20スコア571（全体の合格率が85％）であった。これらの結果は、改
良プラスミドミニプレパレーションプロトコル（マサチューセッツ州ベッドフォ
ード、ミリポア社製）にしたがって定量化及び再設定された標準自動化プラスミ
ド調整法を用いて得られた結果と本質的な違いはなかった。
【００７９】 例V：キャピラリを用いた精製及びサンプル操作 ラピッドサイクラ1605（アイダホ州アイダホフォールズ、アイダホテクノロジ
ー社製）を、ガラス製、シリカ製、テフロン(R)製、及びステンレス鋼製キャピ
ラリを用いた少量サーモサイクリングについて検査した。低熱容量媒体（空気）
を通して熱伝導が生じ、温度が急速に変化することがあるため、本システムでは
PCR増幅は３０分以内で終了することができる。ビッグダイターミネータケミス
トリ、及びpGEM-3Zf(+)を用いたシーケンシング実験は、標準20ml反応の試薬量
の1/40（ガラス、シリカまたはテフロン(R)キャピラリに1ml量で行われる）で、
まずまずの質と読み長の配列を生成することができることを示した。1/20量(2ml )において行われた反応も全く正常で、質の高い読みを生成した（フレッド30ス
コアを添付表２に示す）。
【００８０】
【表２】
【００８１】 例VI：キャピラリの密封 キャピラリ内で加熱した100ナノリットルのサンプルを目視で（顕微鏡を用い
て）検査したところ、キャピラリの両端を密封しないとサンプルが急速に分散す
ることが明らかになった（おそらく急速な除気または局部的な沸騰のため）。サ
ンプル量を多くしてシリンジによりチューブの一端だけを効率的に密封した実験
では、サーモサイクリング中、サンプルスラグがチューブ内を急速にあちこちに
移動することが認められた。これは、キャピラリチューブ内の閉鎖空間内で蒸気
圧が変化するために生じていると推測される。 チューブの開口端に加圧すると
その動きがなくなり、長いテフロン(R)キャピラリチューブ中でサーモサイクリ
ングを成功させることができた。したがって、密封手段、バルブ、または圧力制
御システムは、強固なフロースルーキャピラリサーモサイクリングシステムの望
ましい部分である。
【００８２】 例VII：一本のキャピラリ内におけるサンプル数個のサーモサイクリング 数サンプルを同時に一本のキャピラリ内でサーモサイクリングした。サンプル
はキャピラリ内の空隙を用いて分離した。キャピラリの末端が密封されていれば
、サンプルは分散せず、相互に分離した状態を維持した。ある実験では、キャピ
ラリに１マイクロリットルサンプルを４つ装填し、異なる染色プライマ試薬混合
物をそれぞれに加えた。これらをサーモサイクリングし、保存し、ABI 377自動
化DNAシーケンサ（カリフォルニア州フォスターシティ、PEアプライドバイオシ
ステムズ社製）にかけた。その結果、４個のプライマ反応に成功し、サーモサイ
クリング中に混ざり合うことがなかったことが示された。
【００８３】 例VIII：試薬の混合 本発明のある実施例では、反応設定プロトコルによるサーモサイクリングの前
に、シーケンシング試薬をDNAを加えることが有利である。従来は、色素をマイ
クロタイタープレートに計量注入し、その後DNAをサンプルプレートに計量注入
する。その後プレートを混合してサーモサイクリングにかける。本発明によると
、マイクロリットル量をキャピラリ内でサーモサイクリングする。しかし、この
量をマイクロタイタープレートから吸入することは困難で、そのキャピラリ内に
色素混合物及びDNAを計量注入して混合する能力が含まれることが望ましい。検
査の結果、DNA及びシーケンシング試薬の計量注入及び混合は、試薬をまず小さ
いキャピラリに吸い上げ、末端を拭き取るかまたは洗浄してキャピラリの外側に
付着した余分な混合物の量を減少させることで、行うことができることを示した
。次に、キャピラリをDNAに浸し、DNAの一部をキャピラリに吸入した。こうする
ことで、DNA源プレートへ逃してしまう混合物の量をごく少量に抑えた。DNA及び
試薬がキャピラリにさらに吸い上げられると、完全な混合が行われ、サンプルの
サーモサイクルをうまく行うことができた。代替法が検査され、その方法とは、
小空包により分離されたDNA及び試薬混合物の別々のスラグを持ち上げ、ピペッ
トチップの先端を拭き取ることなくそこへこれらを押し出した。適切なチップ設
計（例えば、0.5mm IDテフロン(R)キャピラリチューブなど）及び流体量（2マイ
クロリットル）を用いると、微小液滴がチップに付着し、融合及び再吸入のプロ
セスでよく混合した。
【００８４】 例IX：感度検査 全体の感度及び少量のDNAを透析チューブから回収する能力を以下のように検
査した。標準1/4倍ビッグダイターミネータ反応を行い、同等物を1/32倍、1/64
倍、及び1/128倍に希釈した。１１個の希釈サンプル複製物を例IIに記載したよ
うに透析し、メガベース100自動化DNAシーケンサ（カリフォルニア州サニーベイ
ル、モレキュラーダイナミクス社製）で分離した。結果は、これらのサンプル中
に存在する少量のシーケンシング反応生成物は、サンプルの約90％が効率的に回
収されたことを示唆した。読み長及び質の統計を表３に示す（すべてのサンプル
の平均）。
【００８５】
【表３】
【００８６】 参考文献 Maxam AM, et al. (1977) A new method for sequencing DNA. Proc Natl Aca d Sci U S A. 74: 560-4. Bashkin, J., Roach, D., Leong, J., Bartosiewicz, M., Barker, D., Johnsto n, R.G. J. (1996) Capillary Electrophor. 3: 61-68. Boddy, AV; Idle, JR. (1993) Cancer Surv., 17 (Pharmacokinetics and Cance r Chemotherapy), 79-104. Boffa L.C., Carpaneto E.M. & Allfrey V.G., (1995).Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 1901 Caporaso, N.; Landi, M.T. (1995) Med. Lav., 86, 199-206. Carrilho, E; Ruiz-Martinez, M., Berka, J., Smirnov, L., Goetzinger, W., Miller, A.w., Brady, D., Karger, B.L. (1996) Anal. Chem. 68: 3305-3313. Dubiley S., Kirillov E., Lysov Y. & Mirzabekov A., (1997).Nucleic Acid R es. 25, 2259 Carrilho, E., Miller, A., Ruiz Martinez, M.C., Kotler, L., Keisilman, j. , Karger, B.L. (1997) B. L. Proc. SPIE 2985A, 4-18. Egholm M., Buchard O., Christensen L., Behrens C., Freier S.M., Driver D .A., Berg R., Kim S.K., Norden B., & Nielsen P.E., (1993). Nature 365, 5 66 Evensen, H. T.; Meldrum, D. R.; Cunningham, D. L. (1998) Rev. Sci. Instr um, 519-526. Figeys D., Ahmadzedeh H., Arriaga E. & Dovichi N.J., (1996) J. Chromato gr. A 698, 375. Gingeras, TA.; Mack, D; Chee, MS.; Berno, AJ.; Stryer, L; Ghandour, G; W ang, C. PCT Int. Appl., 132 pp. WO 9729212 A1 970814. Haff L., Atwood J.G., . DiCesareJ, Katz E., Picozza E., Williams J.F. & Woudenberg T., BioTechniques 10, 102 (1991). Meldrum D., et al., (1998) http://isdl.ee.washington.edu/GNL/acapella/
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【００８７】 言及による編入 ここに引用したすべての特許、公告済み特許出願、及びその他の文献は、言及
により明確にここにその全体を編入する。
【００８８】 等価物 当業者であれば、ごく通常の実験を用いるのみで、ここに説明された特定の実
施例の等価物を数多く認識され、又は確認できることであろう。このような等価
物は、以下の請求の範囲の包含するところである。
【図面の簡単な説明】
本発明の前述またはその他の目的、特徴及び利点は、以下の説明から明らかで
あり、かつ添付図面からも明らかであり、図面中の同様の参照記号は異なる視点
から見た同一の部分を参照している。図面は本発明の原理を描写しており、変倍
はしていないが、相対的な寸法を示している。
【図１】本発明の教示に記載のキャピラリを用いたサンプル操作システムの模
式化透視図。
【図２】本発明の教示に記載の図１のシステムの生物学的サンプル精製用の、
一つのキャピラリ台の模式化透視図。
【図３】本発明の教示に記載の図１のサンプル操作システムの使用に適したキ
ャピラリチューブのモジュラーアレイの模式化透視図。
【図４】本発明の実施態様及び方法（透析）を用いて得られたシーケンシング
反応精製生成物と、例Iにさらに記載のエタノール沈殿を用いて得られた生成物
とを比較した電気泳動ゲルを表している。
【図５】本発明のある実施態様及び方法と例IIにさらに記載のETプライマミッ
クスまたはビッグダイターミネーターミックスをサンプルとして用いて得られた
生成物を比較した電気泳動ゲルを表している。
【図６】本発明の教示に記載の、一本のキャピラリを用いた、キャピラリを用
いたサンプル操作システムの模式化透視図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 カヒル パトリック アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02160 ネイティック エリオット スト リート 42 (72)発明者 スミス ダグラス アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01930 グロウスター メイフラワー レ ーン ２ (72)発明者 トーマン ユーリッチ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02421 レキシントン シェード ストリ ート 110 (72)発明者 エンゲルステイン マーシー アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02192 ニーダム ファーラー ブルック アベニュー 48 Ｆターム(参考） 2G045 BB01 BB04 BB14 CB01 DA13 2G058 AA09 BA08 DA07 GA11 4B029 AA07 AA23 FA12

Claims (92)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 生物学的サンプルを保持する大きさの第一キャピラリチュー
    ブであって、第一端及び第二端を有する、第一キャピラリチューブと、 生物学的サンプルを保持する大きさの第二キャピラリチューブであって、第一
    端及び第二端を有する、第二キャピラリチューブと、 前記第一キャピラリチューブの前記第二端と前記第二キャピラリチューブの前
    記第一端に連結し、前記第一及び第二チューブを機械的かつ流動的に相互に連結
    する連結器と、 を含む、生物学的サンプルの一体化処理用装置。
  2. 【請求項２】 前記連結器が、前記第一及び第二キャピラリチューブ間の流
    体シールを選択的に提供する流体調節要素である、請求項１の装置。
  3. 【請求項３】 前記流体調節要素が、バルブまたは締め付け可能なシリコー
    ン連結器を含む、請求項２の装置。
  4. 【請求項４】 前記第二キャピラリチューブが、前記連結器により前記第一
    キャピラリチューブに着脱可能かつ交換可能に連結するよう適合されている、請
    求項１の装置。
  5. 【請求項５】 前記第二キャピラリチューブが前記連結器に着脱可能かつ交
    換可能に連結するよう適合されており、前記連結器が、前記第一及び第二キャピ
    ラリチューブを選択的に相互に流体連絡させるよう適合されている、請求項１の
    装置。
  6. 【請求項６】 前記第一端で前記第一キャピラリチューブを支持する支持ア
    センブリをさらに含む、請求項１の装置。
  7. 【請求項７】 前記支持アセンブリが、 前記第一キャピラリチューブの前記第一端に流動的に連結した流体操作要素と
    、 流体処理要素に流体を強制送入する、及び前記流体処理要素から強制排出する
    ポンプと、 を含む、請求項６の装置。
  8. 【請求項８】 前記第一キャピラリチューブの第一端に連結し、流体操作要
    素とキャピラリチューブの間に配置された第二連結器をさらに含む、請求項７の
    装置。
  9. 【請求項９】 前記流体操作要素がシリンジ型流体ハウジングを含む、請求
    項７の装置。
  10. 【請求項１０】 前記流体操作要素が少なくともシリンジの一部分を含む、
    請求項７の装置。
  11. 【請求項１１】 前記第二連結器が流体調節要素を含む、請求項８の装置。
  12. 【請求項１２】 前記第二キャピラリチューブへ流体を導入する、または前
    記第二キャピラリチューブから流体を分配するために前記第二キャピラリチュー
    ブの前記第二端に連結した流体チップをさらに含む、請求項１の装置。
  13. 【請求項１３】 前記第二キャピラリチューブの第二端に連結した第二連結
    器と、 前記第二連結器に連結して、前記第二キャピラリチューブに流体を導入する
    、または前記第二キャピラリチューブから流体を分配するために前記装置の入口
    または出口を形成する流体チップであって、前記第二連結器が前記流体チップと
    前記第二キャピラリチューブとの間に流体シールを選択的に形成する、流体チッ
    プと、 をさらに含む請求項１の装置。
  14. 【請求項１４】 前記第一キャピラリチューブがガラスキャピラリチューブ
    を含む、請求項１の装置。
  15. 【請求項１５】 前記第一キャピラリチューブがシリカキャピラリチューブ
    を含む、請求項１の装置。
  16. 【請求項１６】 前記第一キャピラリチューブがポリイミド素材でコートさ
    れている、請求項１の装置。
  17. 【請求項１７】 生物学的サンプルが前記第一キャピラリチューブ内に滞留
    する時にその温度処理を促進するために、前記第一キャピラリチューブがポリイ
    ミド素材でコートされている、請求項１の装置。
  18. 【請求項１８】 前記連結器が、開位置では前記第一キャピラリ及び前記第
    二キャピラリチューブを相互に流体連絡させ、閉位置では前記第一キャピラリチ
    ューブを前記第二キャピラリチューブから流体シールするように開閉可能なバル
    ブを含む、請求項１の装置。
  19. 【請求項１９】 前記第二キャピラリチューブが、前記第二キャピラリチュ
    ーブ内に滞留する時の前記生物学的サンプル中の成分を分離するための一つ以上
    の膜要素を含む、請求項１の装置。
  20. 【請求項２０】 前記膜要素が、半透性マイクロファイバを含む、請求項１
    ９の装置。
  21. 【請求項２１】 前記第一及び第二キャピラリチューブが、容積10mlから0. 05mlの範囲の前記生物学的サンプルを保持する大きさ及び構造である、請求項１
    の装置。
  22. 【請求項２２】 生物学的サンプルを保持する大きさの第一キャピラリチュ
    ーブであって、第一端及び第二端を有する、第一キャピラリチューブと、 前記第一キャピラリチューブの前記第一端に連結して、流体シールを選択的に
    提供する第一調節要素と、 生物学的サンプルを保持する大きさの第二キャピラリチューブであって、第一
    端及び第二端を有する、第二キャピラリチューブと、 前記第一キャピラリチューブの前記第二端と前記第二キャピラリチューブの前
    記第一端との間に配置され、前記第一及び第二キャピラリチューブの間に流体シ
    ールを選択的に提供する第二流体調節要素と、 を含む、生物学的サンプルの一体化処理用装置。
  23. 【請求項２３】 前記第二キャピラリチューブが、前記第二流体調節要素に
    着脱可能かつ交換可能に連結するよう適合されている、請求項２２の装置。
  24. 【請求項２４】 前記第二キャピラリチューブが前記第二流体調節要素に着
    脱可能かつ交換可能に連結するよう適合されており、前記第二流体調節要素が前
    記第一及び第二キャピラリチューブを選択的に相互に流体連絡させるよう適合さ
    れている、請求項２２の装置。
  25. 【請求項２５】 前記第一キャピラリチューブを前記第一端において支持す
    るための支持アセンブリをさらに含む、請求項２２の装置。
  26. 【請求項２６】 前記支持アセンブリが、 前記第一キャピラリチューブの前記第一端に流動的に連結した流体操作要素と
    、 前記流体操作要素に流体を強制送入し、及び強制排出するポンプと、 を含む、請求項２５の装置。
  27. 【請求項２７】 前記流体操作要素がシリンジ型流体ハウジングを含む、請
    求項２６の装置。
  28. 【請求項２８】 前記流体操作要素が、シリンジの少なくとも一部分を含む
    、請求項２６の装置。
  29. 【請求項２９】 前記第二キャピラリチューブへ流体を導入する、または前
    記第二キャピラリチューブから流体を分配するために、前記第二キャピラリチュ
    ーブの前記第二端に連結した流体チップをさらに含む、請求項２２の装置。
  30. 【請求項３０】 前記第二キャピラリチューブの第二端に連結した第三連結
    器と、 前記第三流体調節要素に流動的に連結して、前記第二キャピラリチューブに流
    体を導入する、または前記第二キャピラリチューブから流体を分配するための入
    口または出口を前記装置に形成する流体チップであって、前記第三流体調節要素
    が前記流体チップと前記第二キャピラリチューブとの間に流体シールを選択的に
    形成する、流体チップと、 をさらに含む、請求項２２の装置。
  31. 【請求項３１】 前記第一キャピラリチューブがガラス及びシリカキャピラ
    リチューブの一つを含む、請求項２２の装置。
  32. 【請求項３２】 前記第一キャピラリチューブがポリイミド素材でコートさ
    れている、請求項２２の装置。
  33. 【請求項３３】 前記第一キャピラリチューブ内に滞留するときの生物学的
    サンプルの熱処理を促進するために、前記第一キャピラリチューブをポリイミド
    素材でコートした、請求項２２の装置。
  34. 【請求項３４】 前記第一流体調節要素が、開位置では前記第一キャピラリ
    と前記第二キャピラリチューブを相互に流体連絡させ、閉位置では前記第一キャ
    ピラリチューブを前記第二キャピラリチューブから流体シールするように開閉可
    能なバルブを含む、請求項２２の装置。
  35. 【請求項３５】 前記第一又は第二流体調節要素が締め付け可能なシリコー
    ン連結器を含む、請求項２２の装置。
  36. 【請求項３６】 前記第二キャピラリチューブが、前記第二キャピラリチュ
    ーブ内に滞留するときの前記生物学的サンプル中の成分を分離するための一つ以
    上の膜要素を含む、請求項２２の装置。
  37. 【請求項３７】 前記膜要素が半透性マイクロファイバを含む、請求項３６
    の装置。
  38. 【請求項３８】 前記第一及び第二キャピラリチューブが、マイクロリット
    ル単位の所定の流体を保持する大きさ及び構造である、請求項２２の装置。
  39. 【請求項３９】 生物学的サンプルを保持する大きさであり、前記サンプル
    を熱処理することに適合された第一キャピラリチューブであって、第一端及び第
    二端を有する、第一キャピラリチューブと、 生物学的サンプルを保持する大きさの第二キャピラリチューブであって、第
    一端及び第二端を有する、第二キャピラリチューブと、 前記第一及び第二キャピラリチューブを機械的及び流動的に相互に連結するた
    めに、前記第一キャピラリチューブの前記第二端と前記第二キャピラリチューブ
    の前記第一端に連結した流体調節要素と、 を含む、生物学的サンプルの一体化処理用装置。
  40. 【請求項４０】 生物学的サンプルを保持するキャピラリチューブの第一モ
    ジュラーアレイであって、第一アレイ端及び第二アレイ端を有する、第一モジュ
    ラーアレイと、 前記生物学的サンプルを保持するキャピラリチューブの第二モジュラーアレイ
    であって、前記第一モジュラーアレイの前記第二アレイ端に連結し、着脱可能か
    つ交換可能に前記第一モジュラーアレイに連結した、第二モジュラーアレイと、 前記第一モジュラーアレイの前記第二アレイ端と第二モジュラーアレイの第一
    端に連結して、前記キャピラリチューブの第一及び第二モジュラーアレイの間に
    流体シールを選択的に提供する流体調節要素アレイと、 を含む、生物学的サンプルの一体化処理用モジュラー装置。
  41. 【請求項４１】 第一モジュラーアレイ前記第一アレイ端に連結して、前記
    アレイを前記第一端で支持する支持アセンブリをさらに含む、請求項４０の装置
    。
  42. 【請求項４２】 生物学的サンプルを保持する第一キャピラリチューブであ
    って、第一端及び第二端を有する、第一キャピラリチューブと、 前記第一端で前記キャピラリチューブを支持する支持アセンブリと、 前記生物学的サンプルを保持する第二キャピラリチューブであって、第一端及
    び第二端を有する、第二キャピラリチューブと、 前記第一キャピラリチューブの前記第二端と前記第二キャピラリチューブの前
    記第一端との間に配置されて、前記第一及び第二キャピラリチューブの間に流体
    シールを選択的に提供する第一流体調節要素と、 操作中に第二キャピラリチューブの下方に選択的に流体貯蔵容器を置くために
    配置されるプレート操作アセンブリと、 を含む、生物学的サンプルの自動化一体化処理用システム。
  43. 【請求項４３】 前記支持要素と前記第一キャピラリチューブの前記第一端
    との間に配置されて、前記支持要素と前記第一キャピラリチューブの間に流体シ
    ールを選択的に提供する第二流体調節要素をさらに含む、請求項４２のシステム
    。
  44. 【請求項４４】 生物学的サンプルを保持する第一キャピラリチューブであ
    って、第一端及び第二端を有する、第一キャピラリチューブと、 前記第一端で前記キャピラリチューブを支持する支持アセンブリと、 前記支持要素と前記第一キャピラリチューブの前記第一端との間に配置され、
    前記支持要素と第一キャピラリチューブとの間に流体シールを選択的に提供する
    第一流体調節要素と、 前記生物学的サンプルを保持する第二キャピラリチューブであって、第一端及
    び第二端を有する、第二キャピラリチューブと、 前記第一キャピラリチューブの前記第二端と前記第二キャピラリチューブの前
    記第一端との間に配置され、前記第一及び第二キャピラリチューブの間に流体シ
    ールを選択的に提供する第二流体調節要素と、 操作中に第二キャピラリチューブの下方に選択的に流体貯蔵容器を置くために
    配置されるプレート操作アセンブリと、 を含む、生物学的サンプルの自動化一体化処理用システム。
  45. 【請求項４５】 前記プレート操作アセンブリが、流体貯蔵容器を支持する
    ための支持面と、 流体貯蔵容器を所定の位置へ移動させる手段と、 を含む、請求項４４のシステム。
  46. 【請求項４６】 前記第一キャピラリ及び前記第二キャピラリチューブを相
    互に流体連絡させる開位置と、前記第一キャピラリチューブを前記第二キャピラ
    リチューブから流体シールする閉位置との間に前記調節要素を自動的に配置する
    ために前記流体調節要素の一つと連結する制御装置をさらに含む、請求項４４の
    システム。
  47. 【請求項４７】 前記第二キャピラリチューブが着脱可能かつ交換可能に第
    二流体調節要素に連結するよう適合されており、前記第二流体調節要素が前記第
    一及び第二キャピラリチューブを選択的に相互に流体連絡させるよう適合されて
    いる、請求項４５のシステム。
  48. 【請求項４８】 前記第二キャピラリチューブの前記第二端に連結した第三
    流体調節要素と、 前記第三流体調節要素に連結して、前記第二キャピラリチューブに流体を導入
    する、または前記第二キャピラリチューブから流体を分配する入口または出口を
    前記装置に形成する流体チップであって、前記第三流体調節要素が前記流体チッ
    プと前記第二キャピラリチューブとの間に流体シールを選択的に形成する、流体
    チップと、 をさらに含む請求項４４のシステム。
  49. 【請求項４９】 前記支持アセンブリが、前記第一キャピラリチューブの前
    記第一端に流動的に連結した流体操作要素と、前記流体操作要素に流体を強制送
    入し、及び前記流体操作要素から強制排出させるポンプを含む、請求項４４のシ
    ステム。
  50. 【請求項５０】 前記第一キャピラリチューブがガラス及びシリカキャピラ
    リチューブの一つを含む請求項４４のシステム。
  51. 【請求項５１】 前記第一キャピラリチューブがポリイミド素材でコートさ
    れている請求項４４のシステム。
  52. 【請求項５２】 前記第一キャピラリチューブが、前記第一キャピラリチュ
    ーブ内に滞留する時の生物学的サンプルの温度処理を促進するためにポリイミド
    素材でコートされた、請求項４４のシステム。
  53. 【請求項５３】 前記第一流体調節要素が、開位置では前記第一キャピラリ
    及び前記第二キャピラリチューブを相互に流体連絡させ、閉位置では前記第一キ
    ャピラリチューブを前記第二キャピラリチューブから流体シールするように開閉
    可能なバルブを含む、請求項４４のシステム。
  54. 【請求項５４】 前記第一または第二流体調節要素が締め付け可能なシリコ
    ーン連結器を含む、請求項４４のシステム。
  55. 【請求項５５】 前記第二キャピラリチューブが、第二キャピラリチューブ
    内に滞留時の生物学的サンプルの成分を分離するための一つ以上の膜要素を含む
    、請求項４４のシステム。
  56. 【請求項５６】前記膜要素が半透性のマイクロファイバを含む、請求項５５
    のシステム。
  57. 【請求項５７】 前記第一及び第二キャピラリチューブが所定の流体をマイ
    クロリットル単位で保持する大きさ及び構成である、請求項４４のシステム。
  58. 【請求項５８】 生物学的サンプルを保持するキャピラリチューブの第一モ
    ジュラーアレイであって、第一アレイ端及び第二アレイ端を有する、第一モジュ
    ラーアレイと、 前記第一端で前記アレイを支持するために第一モジュラーアレイの第一アレイ
    端に連結した支持アセンブリと、 前記生物学的サンプルを保持するキャピラリチューブの第二モジュラーアレイ
    であって、前記第一モジュラーアレイの前記第二アレイ端に連結すると共に、着
    脱可能かつ交換可能に前記第一モジュラーアレイに連結した、前記第二モジュラ
    ーアレイと、 操作中にキャピラリチューブの第二モジュラーアレイの下方に選択的に流体貯
    蔵容器を置くために配置されたプレート操作アセンブリと、 を含む、生物学的サンプルの自動処理用モジュラーシステム。
  59. 【請求項５９】 前記第一モジュラーアレイの第二アレイ端と前記第二モジ
    ュラーアレイの第一端とに連結して、キャピラリチューブの前記第一及び第二モ
    ジュラーアレイの間に流体シールを選択的に提供する流体調節要素の第一アレイ
    、をさらに含む請求項５８のモジュラーシステム。
  60. 【請求項６０】 第一モジュラーアレイの第一アレイ端と前記支持アセン
    ブリとに連結して、前記支持要素と前記第一キャピラリチューブとの間に流体シ
    ールを選択的に提供する流体調節要素の第二アレイ、をさらに含む請求項５９の
    モジュラーシステム。
  61. 【請求項６１】 前記第一キャピラリチューブが前記サンプルの温度処理に
    適合されている、請求項１の装置。
  62. 【請求項６２】 前記第一キャピラリチューブが前記サンプルのサーモサイ
    クリングに適合されている、請求項１の装置。
  63. 【請求項６３】 前記第二キャピラリチューブが分子サイズ弁別により前記
    サンプルを精製する分離手段を含む、請求項１の装置。
  64. 【請求項６４】 前記分離手段が、前記サンプルの透析用の半透膜マイクロ
    ファイバを含む、請求項６３の装置。
  65. 【請求項６５】 前記第一キャピラリチューブに流体を通過させる手段をさ
    らに含む、請求項１の装置。
  66. 【請求項６６】 前記第一キャピラリチューブが前記サンプルのサーモサイ
    クリングに適合されており、前記第二キャピラリチューブが前記サンプルの透析
    のための分離手段を含む、請求項１の装置。
  67. 【請求項６７】 前記生物学的サンプルがポリヌクレオチド、ポリペプチド
    、糖、またはそれらの混合物を含む、請求項６６の装置。
  68. 【請求項６８】 前記ポリヌクレオチドがDNAを含む、請求項６７の装置。
  69. 【請求項６９】 生物学的マイクロサンプルの透析用の装置であって、前記
    マイクロサンプルを保持する大きさのキャピラリチューブを含み、分子サイズ弁
    別により前記マイクロサンプルを精製する分離手段を含む、装置。
  70. 【請求項７０】 生物学的マイクロサンプルの透析用のモジュラー装置であ
    って、前記マイクロサンプルを保持する大きさのキャピラリチューブのモジュラ
    ーアレイを含み、各前記チューブは分子サイズ弁別により前記マイクロサンプル
    を精製する分離手段を含む、装置。
  71. 【請求項７１】 生物学的マイクロサンプルの一体化処理用装置であって、 前記生物学的マイクロサンプルを保持する大きさであり、前記サンプルのサー
    モサイクリングに適合された第一キャピラリチューブであって、第一端及び第二
    端を有する、第一キャピラリチューブと、 前記生物学的サンプルを保持する大きさであり、前記サンプルの透析に適合さ
    れた第二キャピラリチューブであって、第一端及び第二端を有する、第二キャピ
    ラリチューブと、 前記第一キャピラリチューブの前記第二端と前記第二キャピラリチューブの前
    記第一端に連結し、機械的または流動的に前記第一及び第二キャピラリチューブ
    を相互に連結する連結器と、 を含む、装置。
  72. 【請求項７２】 前記第二キャピラリチューブが分子サイズ弁別により前記
    サンプルを精製する分離手段を含む、請求項７１の装置。
  73. 【請求項７３】 前記分離手段が半透膜マイクロファイバを含む、請求項７
    ２の装置。
  74. 【請求項７４】 生物学的マイクロサンプルの一体化処理用モジュラー装置
    であって、 前記生物学的マイクロサンプルを保持する大きさであり、前記サンプルのサー
    モサイクリングに適合されたキャピラリチューブの第一モジュラーアレイであっ
    て、第一アレイ端及び第二アレイ端を有する、第一モジュラーアレイと、 前記生物学的マイクロサンプルを保持する大きさであり、前記サンプルの透
    析に適合されたキャピラリチューブの第二モジュラーアレイであって、第一アレ
    イ端及び第二アレイ端を有し、前記第二モジュラーアレイが前記第一モジュラー
    アレイの前記第二アレイ端に連結し、前記第二モジュラーアレイが着脱可能かつ
    交換可能に前記第一モジュラーアレイに連結された、第二モジュラーアレイと、 前記第一モジュラーアレイの前記第二アレイ端と前記第二モジュラーアレイの
    前記第一端とに連結して、前記キャピラリチューブの第一及び第二モジュラーア
    レイ間に流体シールを選択的に提供する連結器のアレイと、 を含む、装置。
  75. 【請求項７５】 生物学的サンプルを処理する方法であって、 前記生物学的サンプルを保持する大きさの第一キャピラリチューブを提供する
    ステップと、 前記生物学的サンプルを保持する大きさの第二キャピラリチューブを提供する
    ステップと、 前記第一キャピラリチューブの第二端と前記第二キャピラリチューブの第一端
    を機械的かつ流動的に相互に連結するステップと、 第一キャピラリチューブを第一端で支持するステップと、 操作中に前記第二キャピラリチューブの下方に流体貯蔵容器を配置するステッ
    プと、 を含む、方法。
  76. 【請求項７６】 生物学的マイクロサンプルの一体化処理法であって、 前記マイクロサンプルを温度処理するステップと、 前記マイクロサンプルを精製するステップと、 を含み、 前記温度処理ステップ及び精製ステップは、前記二ステップを一体化した装置
    で行われ、前記マイクロサンプルの一体化処理が達成される、方法。
  77. 【請求項７７】 前記装置が請求項７１に記載された装置である、請求項７
    ６の方法。
  78. 【請求項７８】 前記装置が請求項７４に記載された装置である、請求項７
    ６の方法。
  79. 【請求項７９】 前記温度処理ステップがサーモサイクリングを 含み、前記精製ステップが透析を含む、請求項７６の方法。
  80. 【請求項８０】 前記マイクロサンプルが、ポリヌクレオチド、ポリペプチ
    ド、糖、またはそれらの混合物を含む、請求項７９の方法。
  81. 【請求項８１】 前記ポリヌクレオチドがDNAを含む、請求項８０の方法。
  82. 【請求項８２】 ポリメラーゼ連鎖反応、DNAシーケンシング反応、オリゴ
    ヌクレオチド伸長反応、エキソヌクレアーゼ反応、OLA反応、ハイブリダイゼー
    ション反応、及び対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応からなる群のうちから
    選択された反応の、不必要な成分を除去するために、前記マイクロサンプルを透
    析する、請求項８１の方法。
  83. 【請求項８３】 前記マイクロサンプルが10mlから0.05mlの範囲の容量を占
    める、請求項８０の方法。
  84. 【請求項８４】 マイクロサンプルを、分子サイズ弁別により前記サンプル
    を精製するための分離手段を含むキャピラリチューブに導入するステップと、前
    記サンプルの透析を達成させるように前記マイクロサンプルを前記キャピラリチ
    ューブに十分な時間滞留させるステップとを含む、生物学的マイクロサンプルに
    透析を行う方法。
  85. 【請求項８５】 ポリメラーゼ連鎖反応、DNAシーケンシング反応、オリゴ
    ヌクレオチド伸長反応、エキソヌクレアーゼ反応、OLA反応、ハイブリダイゼー
    ション反応、及び対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応からなる群のうちから
    選択された反応の、不必要な成分を除去するために、前記透析を行う、請求項８
    ４の方法。
  86. 【請求項８６】 前記マイクロサンプルが、ポリヌクレオチド、ポリペプチ
    ド、糖、またはそれらの混合物を含む、請求項８４の方法。
  87. 【請求項８７】 前記ポリヌクレオチドがDNAを含む、請求項８６の方法。
  88. 【請求項８８】 前記マイクロサンプルが10mlから0.05mlの範囲の容量を占
    める、請求項８４の方法。
  89. 【請求項８９】 前記分離手段が一つ以上の膜要素を含む、請求項８４の方
    法。
  90. 【請求項９０】 前記膜要素が半透性マイクロファイバを含む、請求項８９
    の方法。
  91. 【請求項９１】 前記マイクロファイバが中空ファイバ透析チューブである
    、請求項９０の方法。
  92. 【請求項９２】 前記透析チューブが、約100Kdalの分子量カットオフ値を
    有する、請求項９１の方法。
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