JP2002542784A - Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｓｕｂｏｘｙｄａｎｓソルビトールデヒドロゲナーゼ、その遺伝子および使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、分子生物学、細菌学および産業的発酵の分野に関する。より詳細には、本発明は、本発明の膜に結合した新規なＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）の３つのサブユニットをコードする単離された核酸分子ならびにこの単離された核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明はさらに、本発明のＳＤＨ酵素の３つのサブユニットについての単離されたポリペプチド、ならびにＬ−ソルボースおよび２−ケト−Ｌ−グロン酸の産生のためのプロセスを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） （発明の分野） 本発明は、分子生物学、細菌学および産業的発酵の分野に関する。より詳細に
は、本発明は、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓにおける膜
に結合した新規なソルビトールデヒドロゲナーゼのサブユニットについての核酸
配列およびタンパク質の同定および単離に関する。本発明はさらに、Ｄ−ソルビ
トールからのＬ−ソルボースの発酵的産生および２−ケト−Ｌ−グロン酸のその
後の産生に関する。

【０００２】 （関連技術） ソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）は、ビタミンＣ合成についての重要
な前駆体である２−ケト−Ｌ−グロン酸（２−ＫＬＧ）の製造プロセスにおいて
、ソルボース発酵の間のＬ−ソルボースへのＤ−ソルビトールの効率的な変換を
担う酵素である。Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒは、いくつかのＳＤＨを保有し、
これらのＳＤＨは、その補因子要求性に従って分類され得る：（１）ＮＡＤ依存
型、（２）ＮＡＤＰ依存型および（３）ＮＡＤ（Ｐ）非依存型。これらの中では
、ＮＡＤ（Ｐ）非依存性酵素は、産業的ソルボース発酵の間のソルボースの効率
的産生に直接関与すると考えられる（Ｃｕｍｍｉｎｓ，Ｊ．Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．、２２４、３２３；２２６、３０１（１９５７））。

【０００３】 Ｄ−ソルビトールからのＬ−ソルボースの製造プロセスは代表的に、酢酸細菌
（例えば、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓおよびＡｃｅｔ
ｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）を用いた発酵によって行われる。室温にて、
９６％〜９９％の変換が２４時間未満で行われる（Ｌｉｅｂｓｔｅｒ，Ｊ．ら、
Ｃｈｅｍ．Ｌｉｓｔ．、５０：３９５（１９５６））。

【０００４】 ＳＤＨの作用によって産生されたＬ−ソルボースは、２−ケト−Ｌ−グロン酸
（２−ＫＬＧ）の産生における基質である。２ＫＬＧの産生のための種々のプロ
セスが公知である。例えば、ソルボソン（ｓｏｒｂｏｓｏｎｅ）中間体を介した
２−ＫＬＧへのＬ−ソルボースの酸化を介した２−ＫＬＧの発酵的産生は、広範
な種々の細菌を利用するプロセスについて記載されている：Ｇｌｕｃｏｎｏｂａ
ｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ（米国特許第４，９３５，３５９号；同第４，９６０
，６９５号；同第５，３１２，７４１号；および同第５，５４１，１０８号）；
Ｐｓｅｕｄｏｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓａｃｃｈａｒｏｋｅｔｏｇｅｎｅ
ｓ（米国特許第４，８７７，７３５号；欧州特許第２２１ ７０７号）；Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｏｒｂｏｓｏｘｉｄａｎｓ（米国特許第４，９３３，２８
９号および同第４，８９２，８２３号）；これらおよび他の属由来の微生物（例
えば、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｍｙｃ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（米国特許第３，９１２
，５９２号；同第３，９０７，６３９号；および同第３，２３４，１０５号）の
混合物；ならびに新規な細菌株（米国特許第５，８３４，２３１号）。

【０００５】 ソルビトール、ソルボースおよびソルボソンの発酵的酸化に関与する多数の酵
素は、文献において同定されている。米国特許第５，８８，７８６号；同第５，
８６１，２９２号；同第５，８３４，２６３号および同第５，７５３，４８１号
は、Ｌ−ソルボースデヒドロゲナーゼおよびＬ−ソルボソンデヒドロゲナーゼを
コードする核酸分子ならびに／またはＬ−ソルボースデヒドロゲナーゼおよびＬ
−ソルボソンデヒドロゲナーゼについての単離されたタンパク質を開示し；そし
て米国特許第５，７４７，３０１号は、ソルビトールデヒドロゲナーゼについて
の特異性を有する酵素を開示する。

【０００６】 Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ＳＤＨを補因子要求性に基づいて区別すること
に加えて、これらの異なる酵素を区別する他の物理的特徴が、文献に見出され得
る。例えば、米国特許第５，７４７，３０１号において同定されたソルビトール
デヒドロゲナーゼは、細胞内位置（膜に結合した）および８００±５０ｋＤａと
いうハロ酵素分子量（７９±５ｋＤａの１０個の相同なサブユニット）に基づい
て区別される。Ｓｈｉｎａｇａｗａら（Ｅ．Ｓｈｉｎａｇａｗａ、Ｋ．Ｍａｔｓ
ｕｓｈｉｔａ、Ｏ．ＡｄａｃｈｉおよびＭ．Ａｍｅｙａｍａ（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．、４６、１３５−１４１、１９８２））によって単離された膜
に結合したＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼは、６３，０００、５１，０００
および１７，０００の分子量を有する３種のサブユニットからなっていた。

【０００７】 ２ ＫＬＧの産生における商業的発酵の生産性を改善する努力において、本発
明者らは、文献に記載される他の株とは異なるＧ．ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ株にお
いて膜に結合した新規なソルビトール（ｓｏｒｂｉｔａｌ）デヒドロゲナーゼを
同定した（Ｃｈｏｉ，Ｅ．Ｓ．ら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．
、１２５：４５（１９９５））。

【０００８】 （発明の要旨） 本発明は、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓの膜に結合し
た新規なソルビトールデヒドロゲナーゼに関する。単離されたソルビトールデヒ
ドロゲナーゼ酵素は、３つのサブユニットを含む：ピロロキノリンキノン（ｐｙ
ｒｒｏｌｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ ｑｕｉｎｏｎｅ；ＰＱＱ）を補因子として含む
７５ｋＤａの第１のサブユニット；シトクロムｃである５０ｋＤａの第２のサブ
ユニット；およびこの酵素の安定性および触媒活性において非常に重要な役割を
果たす２９ｋＤａの第３のサブユニット。

【０００９】 本発明は、本明細書中に記載されるＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒソルビトール
デヒドロゲナーゼの３つのタンパク質サブユニットについての核酸分子を提供す
る。第１の特定の実施形態では、本発明は、配列番号１によって同定される第１
のＳＤＨサブユニット（７５ｋＤＡ）に関する単離された核酸分子を提供する。
第２の特定の実施形態では、本発明は、配列番号２によって同定される第２のＳ
ＤＨサブユニット（５０ｋＤＡ）に関する単離された核酸分子を提供する。第３
の特定の実施形態では、本発明は、配列番号３によって同定された第３のＳＤＨ
サブユニット（２９ｋＤＡ）に関する単離された核酸分子を提供する。他の関連
する実施形態は、ベクター、これを産生するためのプロセスおよびこのベクター
を保有する宿主細胞に関する。

【００１０】 本発明はまた、本発明のＳＤＨの３つのサブユニットをコードする単離された
核酸分子を提供する。１つの特定の実施形態では、本発明は、７５ｋＤａサブユ
ニットおよび５０ｋＤａサブユニットをコードするクローン化された核酸分子を
提供する。ソルビトールデヒドロゲナーゼの第１のサブユニットおよび第２のサ
ブユニットについての構造遺伝子は、それぞれ大きさが２，２６５ｂｐおよび１
，４３７ｂｐであり、そしてオペロンを規定する５．７ｋｂ Ｐｓｔ１ ＤＮＡ
フラグメントであるクローン化された核酸分子中でクラスターを形成している。
別の特定の実施形態では、本発明は、第３の２９ｋＤａのＳＤＨサブユニットタ
ンパク質をコードするクローン化された核酸分子を提供する。第３のサブユニッ
トをコードする構造遺伝子は大きさが９２１ｂｐであり、そして４．５ｋｂ Ｃ
ｌａＩ ＤＮＡフラグメント中に見出される。他の関連する実施形態は、ベクタ
ー、これを作製するためのプロセスおよびこのベクターを含む宿主細胞に関する
。

【００１１】 本発明はまた、本明細書中に記載されたＳＤＨの３つのサブユニットについて
の単離されたポリペプチドに関する。

【００１２】 本発明はまた、Ｄ−ソルボースの産生のための方法を提供し、この方法は：（
ａ） 配列番号１のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；配列番号２
のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；および配列番号３のポリヌク
レオチド配列を含むポリヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１つ
の単離されたヌクレオチド配列で宿主細胞を形質転換する工程；ならびに（ｂ）
この形質転換された宿主細胞を選択および増殖させる工程を包含する。

【００１３】 本発明の別の局面は、２−ＫＬＧの産生のための方法に関し、この方法は：（
ａ）配列番号１のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；配列番号２の
ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；および配列番号３のポリヌクレ
オチド配列を含むポリヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１つの
単離されたヌクレオチド配列で宿主細胞を形質転換する工程；ならびに（ｂ）こ
の形質転換された宿主細胞を選択および増殖させる工程を包含する。

【００１４】 （好ましい実施形態の詳細な説明） （１．定義） クローニングベクター：宿主細胞において自律複製し得るプラスミドもしくは
ファージのＤＮＡまたは他のＤＮＡ配列であって、そしてこのようなＤＮＡ配列
が、ベクターの必須の生物学的機能を失うことなく、決定可能な様式で切断され
得、かつそこにＤＮＡフラグメントがスプライシングされてその複製およびクロ
ーニングをもたらし得る、１つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位に
よって特徴付けられる、プラスミドもしくはファージのＤＮＡまたは他のＤＮＡ
配列。クローニングベクターはさらに、クローニングベクターで形質転換した細
胞の同定において使用するのに適したマーカーを含み得る。例えば、マーカーは
、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を提供する。

【００１５】 発現：発現は、ポリペプチドが構造遺伝子から産生されるプロセスである。こ
のプロセスは、ｍＲＮＡへの遺伝子の転写およびポリペプチドへのこのようなｍ
ＲＮＡの翻訳を含む。

【００１６】 発現ベクター：クローニングベクターに類似しているが、ベクター中にクロー
ン化された遺伝子の発現を宿主への形質転換後に増強し得る、ベクター。クロー
ン化された遺伝子は通常、特定の制御配列（例えば、プロモーター配列）の制御
下に置かれる（すなわち、作動可能に連結される）。プロモーター配列は、構成
性または誘導性のいずれかであり得る。

【００１７】 遺伝子：ポリペプチドまたはタンパク質を発現するために必要な情報を含むＤ
ＮＡ配列。

【００１８】 宿主：複製可能な発現ベクターまたはクローニングベクターのレシピエントで
ある、任意の原核生物細胞または真核生物細胞。この用語が本明細書中で使用さ
れる場合、「宿主」はまた、所望の遺伝子をその染色体またはゲノムに含むよう
に周知の技術によって遺伝子操作され得る、原核生物細胞または真核生物細胞を
含む。このような宿主の例については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照のこと。

【００１９】 相同／非相同：２つの核酸分子のヌクレオチド配列がＨＡＳＨコードアルゴリ
ズム（Ｗｉｌｂｅｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：７２６−７３０（１９８３））によって決定し
た場合に５０％を超える類似性を共有する場合、この２つの核酸分子は「相同」
であるとみなされる。２つの核酸分子のヌクレオチド配列が５０％未満の類似性
を共有する場合、この２つの核酸分子は、「非相同」であるとみなされる。

【００２０】 変異：本明細書中で用いられる場合、この用語は、目的のヌクレオチド配列に
おける単一塩基対の変化、挿入または欠失をいう。

【００２１】 変異誘発：本明細書中で用いられる場合、この用語は、ＤＮＡ中に変異を生成
するプロセスをいう。「ランダム」変異誘発を用いたとき、正確な変異部位は予
測不能であり、その微生物の染色体のどこでも生じ、そして因子（例えば、放射
線または化学処理）によって引き起こされる物理的損傷の結果として変異がもた
らされる。

【００２２】 オペロン：本明細書中で用いられる場合、この用語は、ＤＮＡにおける構造遺
伝子および調節エレメントを含む、細菌遺伝子発現および調節の単位をいう。

【００２３】 親株：本明細書中で用いられる場合、この用語は、本発明の微生物を生じるよ
うにいくつかの形態の変異誘発に供される微生物株をいう。

【００２４】 表現型：本明細書中で用いられる場合、この用語は、微生物の遺伝的構成に依
存した観察可能な物理的特徴をいう。

【００２５】 プロモーター：遺伝子の５’領域として一般的に記載される、開始コドンに近
接して位置する、ＤＮＡ配列。隣接した遺伝子の転写は、プロモーター領域で開
始される。プロモーターが誘導性プロモーターであるならば、転写速度は、誘導
因子に応答して上昇する。対照的に、プロモーターが構成性プロモーターである
場合、転写速度は、誘導因子によっては調節されない。

【００２６】 組換え宿主：本発明に従って、組換え宿主は、所望のクローン化遺伝子を発現
ベクターまたはクローニングベクター上に含む、任意の原核生物細胞または真核
生物細胞であり得る。この用語はまた、その生物の染色体またはゲノムに所望の
遺伝子を含むように遺伝子操作された、原核生物細胞または真核生物細胞を含む
ことを意味する。

【００２７】 組換えベクター：所望のクローン化遺伝子を含む、任意のクローニングベクタ
ーまたは発現ベクター。

【００２８】 （２．ソルビトールデヒドロゲナーゼの単離および精製） 本発明は、一連のカラムクロマトグラフィー工程を用いてＧ．ｓｕｂｏｘｙｄ
ａｎｓ ＫＣＴＣ（Ｋｏｒｅａ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｔｙｐｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎ（遺伝子銀行））２１１１（ＡＴＣＣ ６２１に等価である）の細胞質膜か
らＳＤＨを単離および精製する。精製された酵素の生化学的特性が提供され、な
らびに各サブユニットの単離およびアミノ酸配列分析機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ、４７７Ａ）を用いた各サブユニットのＮ末端アミノ酸配列の
決定が提供される。

【００２９】 新たに特徴付けられた酵素は、Ｇ．ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ ＩＦＯ ３２５４
株（Ｓｈｉｎａｇａｗａ，Ｅ．ら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、４６：
１３５（１９８２））由来の報告されたＦＡＤ依存性ＳＤＨとは異なり、ピロロ
キノリンキノン（ＰＱＱ）を補因子として含み、そして３つのサブユニットを含
む（Ｃｈｏｉ、Ｅ．Ｓ．ら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１２
５：４５（１９９５））。

【００３０】 本発明のＳＤＨは、標準的なタンパク質技術を用いて単離され得る。手短に述
べると、Ｇ．ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ ＫＣＴＣ ２１１１は、ＳＹＰ培地（５％
Ｄ−ソルビトール、１％ Ｂａｃｔｏ−Ｐｅｐｔｏｎｅ、０．５％酵母抽出物
）中で培養物され、そしてこの細胞は１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ５
．０）中で溶解される。１２，０００ｇで遠心分離して細胞破片を除去した後、
上清を超遠心分離器において遠心分離して、細胞質膜画分が回収される。精製は
、細胞質膜画分を１．５％ ｎ−オクチルグルコシド（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて可溶化し、そして一連のクロマトグラフィーカラム
（ＣＭ−ＴＳＫ ６５０（Ｓ）（Ｍｅｒｃｋ）、ＤＥＡＥ−ＴＳＫ ６５０（Ｓ
）（Ｍｅｒｃｋ）、Ｍｏｎｏ−Ｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）およびＳｕｐｅｒｏｓ
ｅ １２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含む）に通すことによって完了する。

【００３１】 精製された酵素は、ポリオール（例えば、Ｄ−ソルビトール（１００％）、Ｄ
−マンニトール（６８％）およびＤ−リビトール（７０％））に対して活性であ
る。この酵素の活性は、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を添加した場合、９倍
まで上昇する。このことは、ＰＱＱがこの酵素についての補因子であることを示
唆する；蛍光スペクトル分析によって、精製された酵素がピロロキノリンキノン
（ＰＱＱ）を含むことが確認された。精製された酵素の吸収スペクトル分析は、
この酵素がシトクロムｃを含むことを実証する。精製された酵素をポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）にｐＨ４．３で供した場合（Ｒｅｉｓｆｅｌｄ
，Ｒ．Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、１９５：２８１（１９６２））、精製された酵素
は、このゲルについての活性染色後に一本の活性バンドを形成する。

【００３２】 精製された酵素の最初のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、この酵素が７５ｋＤａ、５
０ｋＤａおよび１４ｋＤａの３つのサブユニットから構成されることを示した。
これらのサブユニットはそれぞれ、第１のサブユニット、第２のサブユニットお
よび第３のサブユニットと命名された（Ｃｈｏｉ、Ｅ．Ｓ．ら、ＦＥＭＳ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１２５：４５（１９９５））。しかし、この酵素
のさらなる研究では、２９ｋＤａの別のサブユニットが、ＳＤＨの安定性および
触媒活性において非常に重要な役割を果たすことが見出された。すなわち、ＤＥ
ＡＥ−ＴＳＫカラムでの精製の間のタンパク質分離能力を上昇させるための努力
において種々のｐＨ条件を調査する間に、ｐＨ５．０で溶出する、部分的に分離
された活性ピークが、ｐＨ６．０で溶出した場合に２つの別々の活性ピークへと
完全に分離されることが見出された。最初に溶出する活性ピークは迅速に酵素活
性を失い、そして後に溶出する活性ピークは安定なままであった。これらの２つ
のピークのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、安定な酵素活性を有するピークが、
７５ｋＤａサブユニットおよび５０ｋＤａサブユニットに加えて２９ｋＤａのさ
らなるサブユニットを含み、一方、迅速に酵素活性を失うピークは７５ｋＤａサ
ブユニットおよび５０ｋＤａサブユニットのみを含むことが見出された。この２
９ｋＤａのさらなるサブユニットを、第３のサブユニットと改名した：第３のサ
ブユニットを以前に割り当てられた１４ｋＤａサブユニットがこの酵素の真のサ
ブユニットであるか否かは、相対量をアクリルアミドゲルで他のサブユニットと
比較した場合、疑わしい。ｐＨ６．５への溶出緩衝液のｐＨのさらなる上昇は、
個々のサブユニットへの３つのサブユニットの完全な分離をもたらすこともまた
見出された。

【００３３】 ２または３のサブユニットの異なる組み合わせを、Ｆｅｒｒｉｃ−Ｄｕｐａｎ
ｏｌアッセイ法（Ｗｏｏｄ，Ｗ．Ａ．ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ、５：２８
７（１９６２））によって酵素活性の回復について試験した場合、酵素活性は、
２９ｋＤａの第３のサブユニットの存在下でのみ充分に回復されることが見出さ
れた。それゆえ、２９ｋＤａの第３のサブユニットが、ＳＤＨの安定性および触
媒活性において重要な役割を果たすことが結論付けられた。

【００３４】 Ｄ−ソルビトールを基質として用いた場合、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅ
ｎ定数は、Ｋｍ＝１２０ｍＭおよびＶｍａｘ＝３．９×１０^-5Ｍ／分であると決
定された。ジクロロフェノールヨードフェノール（ＤＣＩＰ）またはフェリシア
ニドは、この酵素の電子受容体として効果的に作用した。フェナジンメトスルフ
ェート（ＰＭＳ）を電子伝達物質として添加した場合、酵素活性は上昇した。カ
ルシウムイオンまたはマグネシウムイオンの添加は、精製された酵素の活性を顕
著に上昇させ、一方、銅イオンの添加は活性をひどく阻害した。

【００３５】 本発明のＳＤＨ酵素の精製および特徴付けのさらなる詳細は、実施例１に提供
される。

【００３６】 （３．本発明の核酸分子） 本発明は、本明細書中に記載されるＳＤＨ酵素の３つのサブユニットのうちの
１以上をコードする単離された核酸分子を提供する。単離された核酸分子の操作
のために設計された方法および技術は、当該分野で周知である。例えば、核酸分
子の単離、精製およびクローニングのための方法、ならびに真核生物宿主細胞お
よび原核生物宿主細胞の使用ならびにその中での核酸およびタンパク質の発現を
記載する方法および技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９、およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃ
ｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．
、１９８７（これらの開示は、本明細書中に参考として援用される）によって記
載される。

【００３７】 より詳細には、本発明は、本発明のＳＤＨ酵素の７５ｋＤａサブユニットタン
パク質、５０ｋＤａサブユニットタンパク質および２９ｋＤａサブユニットタン
パク質の個々をコードするいくつかの単離された核酸分子を提供する。さらに、
本発明は、本発明のＳＤＨ酵素のサブユニットタンパク質の１以上をコードする
いくつかの単離された核酸分子を提供する。明確にする目的で、本発明の特定の
単離された核分子が記載される。その後、これらの単離された核酸分子の特定の
特性および特徴がより詳細に記載される。

【００３８】 そうでないと示さない限り、本明細書中のＤＮＡ分子を配列決定することによ
って決定される全てのヌクレオチド配列を、自動化ＤＮＡ配列決定機（例えば、
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．製のＭｏｄｅｌ ３７３Ａ）
を用いて決定し、そして本明細書中で決定したＤＮＡ分子によってコードされる
ポリペプチドの全てのアミノ酸配列を上記で決定されたＤＮＡ配列の翻訳によっ
て推定した。それゆえ、この自動化アプローチによって決定される任意のＤＮＡ
配列について当該分野で公知であるように、本明細書中で決定された任意のヌク
レオチド配列は、いくつかの誤りを含み得る。自動化によって決定したヌクレオ
チド配列は代表的に、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対
して少なくとも約９０％同一、より代表的には少なくとも約９５％から少なくと
も約９９．９％同一である。実際の配列は、当該分野で周知の手動のＤＮＡ配列
決定方法を含む他のアプローチによって、より正確に決定され得る。また当該分
野で公知であるように、実際の配列と比較しての、決定されたヌクレオチド配列
における単一の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳物においてフレーム
シフトを引き起こし、その結果、決定されたヌクレオチド配列によってコードさ
れる推定アミノ酸配列は、配列決定されたＤＮＡ分子によって実際にコードされ
るアミノ酸配列とは、このような挿入または欠失の点から始まって、完全に異な
る。

【００３９】 １つの実施形態では、本発明は、以下を含む、本発明のＳＤＨ酵素の第１の（
７５ｋＤａ）サブユニットについての単離された核酸分子を提供する：（ａ）配
列番号１のポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号１のポリヌクレオチドの少なくと
も約２０ヌクレオチド長のポリヌクレオチドフラグメント；（ｃ）配列番号４の
アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；および（ｄ）配列番号４のアミノ
酸配列の少なくとも約１０アミノ酸長のフラグメントをコードするポリヌクレオ
チドからなる群より選択されるポリヌクレオチド配列。

【００４０】 別の実施形態では、本発明は、上記に記載される本発明のＳＤＨ酵素の第１の
（７５ｋＤａ）サブユニットについての単離された核酸配列に対して少なくとも
約９５％同一なポリヌクレオチドを含む、本発明のＳＤＨ酵素の第１の（７５ｋ
Ｄａ）サブユニットについての単離された核酸分子を提供する。

【００４１】 本発明の別の実施形態は、以下からなる群より選択されるポリヌクレオチド配
列を含む、本発明のＳＤＨ酵素の第２の（５０ｋＤａ）サブユニットについての
単離された核酸分子を提供する：（ａ）配列番号２のポリヌクレオチドまたはそ
のフラグメント；（ｂ）配列番号２のポリヌクレオチドの少なくとも約２０ヌク
レオチド長のポリヌクレオチドフラグメント；（ｃ）配列番号５のアミノ酸配列
をコードするポリヌクレオチド；および（ｄ）配列番号５のアミノ酸配列の少な
くとも約１０アミノ酸長のフラグメントをコードするポリヌクレオチド。

【００４２】 別の実施形態では、本発明は、上記に記載される本発明のＳＤＨ酵素の第２の
（５０ｋＤａ）サブユニットについての単離された核酸配列に対して少なくとも
約９５％同一なポリヌクレオチドを含む、本発明のＳＤＨ酵素についての第２の
（５０ｋＤａ）サブユニットについての単離された核酸分子を提供する。

【００４３】 本発明の別の実施形態は、以下からなる群より選択されるポリヌクレオチド配
列を含む、本発明のＳＤＨ酵素の第３の（２９ｋＤａ）サブユニットについての
単離された核酸分子を提供する：（ａ）配列番号３のポリヌクレオチド；（ｂ）
配列番号３のポリヌクレオチドの少なくとも約２０ヌクレオチド長のポリヌクレ
オチドフラグメント；（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列をコードするポリヌクレ
オチド；および（ｄ）配列番号６のアミノ酸配列の少なくとも約１０アミノ酸長
のフラグメントをコードするポリヌクレオチド。

【００４４】 別の実施形態では、本発明は、上記に記載される本発明のＳＤＨ酵素の第３の
（２９ｋＤａ）サブユニットについての単離された核酸配列に対して少なくとも
約９５％同一なポリヌクレオチドを含む、本発明のＳＤＨ酵素についての第３の
（２９ｋＤａ）サブユニットについての単離された核酸分子を提供する。

【００４５】 本発明の別の実施形態は、以下からなる群より選択されるポリヌクレオチド配
列を含む、本発明のＳＤＨ酵素の第１の（７５ｋＤａ）サブユニットタンパク質
および第２の（５０ｋＤａ）サブユニットタンパク質の両方をコードする単離さ
れた核酸分子を提供する：（ａ）配列番号７のポリヌクレオチド；および（ｂ）
配列番号７のポリヌクレオチドの少なくとも約２０ヌクレオチド長のポリヌクレ
オチドフラグメント。

【００４６】 別の実施形態では、本発明は、本発明のＳＤＨ酵素の第１の（７５ｋＤａ）サ
ブユニットタンパク質および第２の（５０ｋＤａ）サブユニットタンパク質につ
いての単離された核酸分子に対して少なくとも約９５％同一なポリヌクレオチド
を含む、本発明のＳＤＨ酵素の第１の（７５ｋＤａ）サブユニットタンパク質お
よび第２の（５０ｋＤａ）サブユニットタンパク質についての単離された核酸分
子を提供する。

【００４７】 本発明の別の実施形態は、以下からなる群より選択されるポリヌクレオチド配
列を含む、本発明のＳＤＨ酵素の第３の（２９ｋＤａ）サブユニットについての
単離された核酸分子を提供する：（ａ）配列番号８のポリヌクレオチド；および
（ｂ）配列番号８のポリヌクレオチドの少なくとも約２０ヌクレオチド長のポリ
ヌクレオチドフラグメント。

【００４８】 別の実施形態では、本発明は、上記に記載される本発明のＳＤＨ酵素の第３の
（２９ｋＤａ）サブユニットについての単離された核酸分子に対して少なくとも
約９５％同一な単離された核酸分子を含む、本発明のＳＤＨ酵素についての第３
の（２９ｋＤａ）サブユニットについての単離された核酸分子を提供する。

【００４９】 「単離された」核酸分子によって、そのネイティブな環境から取り出した、核
酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡが意図される。例えば、ベクター中に含まれる組換
えＤＮＡ分子は、本発明の目的のために単離されているとみなされる。単離され
たＤＮＡ分子のさらなる例としては、異種宿主細胞中に維持される組換えＤＮＡ
分子または溶液中の（部分的または実質的に）精製されたＤＮＡ分子が挙げられ
る。単離されたＲＮＡ分子としては、本発明のＤＮＡ分子のインビボまたはイン
ビトロでのＲＮＡ転写物が挙げられる。本発明による単離された核酸分子として
はさらに、合成によって産生されたような分子が挙げられる。

【００５０】 ＲＮＡベクターもまた、本発明に開示されるＳＤＨ核酸分子とともに利用され
得る。これらのベクターは、天然で広範な種々の真核生物細胞において複製する
正鎖または負鎖のＲＮＡウイルスに基づく（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ，Ｐ．Ｊ．お
よびＲｉｃｅ，Ｃ．Ｍ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：２９７−３１０（１９９２）
）。レトロウイルスとは異なり、これらのウイルスは、中間のＤＮＡの生活環相
を欠き、完全にＲＮＡ形態で存在する。例えば、アルファウイルスは、外来タン
パク質についての発現ベクターとして使用される。なぜなら、これらは、広範な
種々の宿主細胞において利用され得、そして高レベルの発現を提供するからであ
る；この型のウイルスの例としては、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林ウ
イルス（Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｓ．、ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１８−２２（
１９９３）；Ｆｒｏｌｏｖ，Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
（ＵＳＡ）９３：１１３７１−１１３７７（１９９６））が挙げられる。Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎのＳｉｎｂｉｓ発現系によって例示されるように、研究者は、組
換え分子をＤＮＡ形態（ｐＳｉｎｒｅｐ５プラスミド）で実験室において便利に
維持し得るが、ＲＮＡ形態での増殖もまた実施可能である。発現のために使用さ
れる宿主細胞では、目的の遺伝子を含むベクターは、ＲＮＡ形態で完全に存在し
、そして所望の場合、その状態で連続して増殖し得る。

【００５１】 別の実施形態では、本発明はさらに、本明細書中に記載される単離された核酸
分子の一部分、アナログまたは誘導体をコードする改変体核酸分子を提供する。
改変体としては、１以上のヌクレオチドを含み得る、ヌクレオチドの置換、欠失
または付加によって産生される改変体が挙げられる。改変体は、コード領域、非
コード領域、または両方が変更され得る。コード領域における変更は、保存的ま
たは非保存的なアミノ酸の置換、欠失または付加を生じ得る。

【００５２】 本発明の単離された核酸分子の改変体は、天然で生じ得る（例えば、天然の対
立遺伝子改変体）。「対立遺伝子改変体」によって、生物の染色体の所定の遺伝
子座を占めるある遺伝子のいくつかの代替形態のうちの１つが意図される。Ｇｅ
ｎｅｓ ＩＩ、Ｌｅｗｉｎ、Ｂ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５）。天然に存在しない改変体は、当該分野で公知の変
異誘発技術を用いて産生され得る。

【００５３】 本発明の単離された核酸分子はまた、本明細書中に記載される単離された核酸
分子に対して９５％、９６％、９７％、９８％および９９％同一であるポリヌク
レオチド配列を含む。コンピュータプログラム（例えば、ＢｅｓｔＦｉｔプログ
ラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａ
ｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ １０ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｐａｒｋ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ ５
３７１１））を用いて、任意の特定の核酸分子が、本明細書中に開示されるヌク
レオチド配列または本明細書中に記載される寄託されたクローンのヌクレオチド
配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であ
るか否かを決定し得る。ＢｅｓｔＦｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ
、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４
８２−４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムを使用して、２つの配列の
間での最良の相同性セグメントを見出す。

【００５４】 例として、コンピューターアラインメントプログラム（例えば、ＢｅｓｔＦｉ
ｔ）を利用して参照ヌクレオチド配列に対する９５％同一性を決定する場合、同
一性パーセンテージは、参照ヌクレオチド配列の全長にわたって算出され、そし
て参照配列中のヌクレオチド総数の５％までの相同性におけるギャップが許容さ
れる。従って、分析される１００塩基対あたり、９５％の同一性は、対象配列に
おける１００ヌクレオチドのうちの５ほどが参照ヌクレオチド配列から変化し得
ることを示す。

【００５５】 本発明はまた、本明細書中に記載されるヌクレオチド配列および単離された核
酸分子のフラグメントを包含する。好ましい実施形態では、本発明は、少なくと
も２０塩基長であるフラグメントを提供する。このようなフラグメントの長さは
、代数的に容易に規定され得る。例えば、配列番号１は、２，２６５塩基長であ
る単離されたヌクレオチド分子を提供する。配列番号１の、少なくとも２０塩基
長のフラグメント（Ｆ１）は、Ｆ１＝２０＋Ｘと規定され得、ここで、Ｘは、０
または１〜２，２４５の整数全体のいずれかであると規定される。同様に、本明
細書中に記載される他の単離された核酸分子についてのフラグメントは、以下の
通りに規定され得る：１，４３７塩基長である配列番号２については、配列番号
２の、少なくとも２０塩基長のフラグメント（Ｆ２）は、Ｆ２＝２０＋Ｘと規定
され得、ここで、Ｘは、０または１〜１，４１７の整数全体のいずれかであると
規定される；９２１塩基長である配列番号３については、配列番号３の、少なく
とも２０塩基長のフラグメント（Ｆ３）は、Ｆ３＝２０＋Ｘと規定され得、ここ
で、Ｘは、０または１〜９０１の整数全体のいずれかであると規定される；４，
８３０塩基長である配列番号７については、配列番号７の、少なくとも２０塩基
長のフラグメント（Ｆ７）は、Ｆ７＝２０＋Ｘと規定され得、ここで、Ｘは、０
または１〜４，８１０の整数全体のいずれかであると規定される；そして、２，
７００塩基長である配列番号８については、配列番号８の、少なくとも２０塩基
長のフラグメント（Ｆ８）は、Ｆ８＝２０＋Ｘと規定され得、ここで、Ｘは、０
または１〜２，６８０の整数全体のいずれかであると規定される。当業者によっ
て理解されるように、本発明の単離された核酸配列フラグメントは、一本鎖分子
または二本鎖分子であり得る。

【００５６】 本発明は、本発明のＳＤＨ酵素の３つのサブユニットタンパク質をコードする
単離された核酸配列を開示する。コンピューター分析は、各サブユニットのオー
プンリーディングフレーム、推定シグナル配列および成熟タンパク質形態に関す
る情報を提供する。第１の（７５ｋＤａ）サブユニットおよび第２の（５０ｋＤ
ａ）サブユニットをコードする遺伝子は、Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＫＣＴＣ）、Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＫＲＩＢＢ）、５２、Ｏｕｎ−Ｄｏｎｇ、Ｙｕｓｏｎｇ−
Ｋｕ、Ｔａｅｊｏｎ ３０５−３３、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａに登
録番号ＫＣＴＣ ０５９３ＢＰで１９９９年３月２５日に細菌内で寄託され、そ
してＤＮＡとして登録番号ＫＣＴＣ ０５９７ＢＰで１９９９年４月２日に寄託
されたλＧＥＭ ５−１クローンの５．７ｋｂのＰｓｔＩフラグメントに完全に
含まれる。第３の（２９ｋＤａ）サブユニットの遺伝子は、ＣｌａＩ−＃６９と
呼ばれ、Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅｓ（ＫＣＴＣ）、Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏ
ｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＫＲＩＢＢ
）、５２、Ｏｕｎ−Ｄｏｎｇ、Ｙｕｓｏｎｇ−Ｋｕ、Ｔａｅｊｏｎ ３０５−３
３、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａに、登録番号ＫＣＴＣ ０５９４ＢＰ
で１９９９年３月２５日に細菌内で寄託され、そしてＤＮＡとして登録番号ＫＣ
ＴＣ ０５９８ＢＰで１９９９年４月２日に寄託された４．５ｋｂ長の配列に含
まれる。

【００５７】 従って、本発明は、新規な株ＫＣＴＣ ０５９３ＢＰ中に保有される単離され
た核酸分子（ＫＣＴＣ ０５９７ＢＰ）を提供し、そして本発明はまた、新規な
株ＫＣＴＣ ０５９４ＢＰ中に保有される単離された核酸分子（ＫＣＴＣ ０５
９８ＢＰ）を提供する。

【００５８】 λＧＥＭ ５−１から得た配列である５．７ｋｂのＰｓｔ Ｉフラグメントを
図８に示し、そして配列番号７を割り当てる。第１のサブユニット遺伝子につい
ての完全なコード配列は、６６５位〜２，９２９位（配列番号１）に位置し、シ
グナル配列は６６５位〜７６６位に位置し、そしてＳＤＨの第１のサブユニット
の成熟タンパク質についてのコード配列は７６７位〜２，９２９位（配列番号２
２）に位置する。第２のサブユニット遺伝子についての完全なコード配列は、２
，９６４位〜４，４００位（配列番号２）に位置し、シグナル配列は２，９６４
位〜３，０７１位に位置し、そしてＳＤＨの第２のサブユニットの成熟タンパク
質についてのコード配列は３，０７２位〜４，４００位（配列番号２３）に位置
する。

【００５９】 従って、本発明の別の実施形態は、図８に示されそして配列番号７として同定
される、λＧＥＭ ５−１の５．７ｋｂ Ｐｓｔ Ｉフラグメントから得られた
配列由来の単離された核酸分子を提供する。このような単離された核酸分子とし
ては、以下が挙げられる：（１）配列番号２８として同定される、配列番号７の
ヌクレオチド１〜６６４；（２）配列番号２９として同定される、配列番号７の
ヌクレオチド５０〜６６４；（３）配列番号３０として同定される、配列番号７
のヌクレオチド１００〜６６４；（４）配列番号３１として同定される、配列番
号７のヌクレオチド１５０〜６６４；（５）配列番号３２として同定される、配
列番号７のヌクレオチド２００〜６６４；（６）配列番号３３として同定される
、配列番号７のヌクレオチド２５０〜６６４；（７）配列番号３４として同定さ
れる、配列番号７のヌクレオチド３００〜６６４；（８）配列番号３５として同
定される、配列番号７のヌクレオチド３５０〜６６４；（９）配列番号３６とし
て同定される、配列番号７のヌクレオチド４００〜６６４；（１０）配列番号３
７として同定される、配列番号７のヌクレオチド４５０〜６６４；（１１）配列
番号３８として同定される、配列番号７のヌクレオチド５００〜６６４；（１２
）配列番号３９として同定される、配列番号７のヌクレオチド５５０〜６６４；
（１３）配列番号４０として同定される、配列番号７のヌクレオチド６００〜６
６４；（１４）配列番号１として同定される、配列番号７のヌクレオチド６６５
〜２，９２９の、本発明のＳＤＨの全長サブユニット１タンパク質をコードする
ヌクレオチド配列；（１５）配列番号２２として同定される、配列番号７のヌク
レオチド７６７〜２，９２９の、本発明のＳＤＨの成熟形態のサブユニット１タ
ンパク質をコードするヌクレオチド配列；（１６）配列番号２として同定される
、配列番号７のヌクレオチド２，９６４〜４，４００の、本発明のＳＤＨの全長
サブユニット２タンパク質をコードするヌクレオチド配列；（１７）配列番号２
３として同定される、配列番号７のヌクレオチド３，０７２〜４，４００の、本
発明のＳＤＨの成熟形態のサブユニット２タンパク質をコードするヌクレオチド
配列；（１８）配列番号４１として同定される、配列番号７のヌクレオチド２，
９３０〜２，９６３；（１９）配列番号４２として同定される、配列番号７のヌ
クレオチド４，４０１〜４，４５１；（２０）配列番号４３として同定される、
配列番号７のヌクレオチド４，４０１〜４，５０１；（２１）配列番号４４とし
て同定される、配列番号７のヌクレオチド４，４０１〜４，５５１；（２２）配
列番号４５として同定される、配列番号７のヌクレオチド４，４０１〜４，６０
１；（２３）配列番号４６として同定される、配列番号７のヌクレオチド４，４
０１〜４，６５１；（２４）配列番号４７として同定される、配列番号７のヌク
レオチド４，４０１〜４，７０１；（２５）配列番号４８として同定される、配
列番号７のヌクレオチド４，４０１〜４，７５１；（２６）配列番号４９として
同定される、配列番号７のヌクレオチド４，４０１〜４，８０１；および（２７
）配列番号５０として同定される、配列番号７のヌクレオチド４，４０１〜４，
８３０。

【００６０】 Ｃｌａ Ｉ−＃６９クローンから得られた配列を図１０に示し、そして配列番
号８を割り当てる。第３のサブユニット遺伝子についての完全なコード配列は１
，３８４位〜２，３０４位（配列番号３）に位置し、シグナル配列は１，３８４
位〜１，４６１位に位置し、そしてＳＤＨの第３のサブユニットの成熟タンパク
質についてのコード配列は１，４６２位〜２，３０４位（配列番号２４）に存在
する。

【００６１】 従って、本発明の別の実施形態は、図１０に例示されそして配列番号８が割り
当てられた、Ｃｌａ Ｉ−＃６９クローンから得られた配列から誘導された単離
された核酸分子を提供する。このような単離された核酸分子としては、以下が挙
げられる：（１）配列番号５１として同定される、配列番号８のヌクレオチド１
〜１，３８３；（２）配列番号５２として同定される、配列番号８のヌクレオチ
ド５０〜１，３８３；（３）配列番号５３として同定される、配列番号８のヌク
レオチド１００〜１，３８３；（４）配列番号５４として同定される、配列番号
８のヌクレオチド１５０〜１，３８３；（５）配列番号５５として同定される、
配列番号８のヌクレオチド２００〜１，３８３；（６）配列番号５６として同定
される、配列番号８のヌクレオチド２５０〜１，３８３；（７）配列番号５７と
して同定される、配列番号８のヌクレオチド３００〜１，３８３；（８）配列番
号５８として同定される、配列番号８のヌクレオチド３５０〜１，３８３；（９
）配列番号５９として同定される、配列番号８のヌクレオチド４００〜１，３８
３；（１０）配列番号５９として同定される、配列番号８のヌクレオチド４５０
〜１，３８３；（１１）配列番号６１として同定される、配列番号８のヌクレオ
チド５００〜１，３８３；（１２）配列番号６２として同定される、配列番号８
のヌクレオチド５５０〜１，３８３；（１３）配列番号６３として同定される、
配列番号８のヌクレオチド６００〜１，３８３；（１４）配列番号６４として同
定される、配列番号８のヌクレオチド６００〜１，３８３；（１５）配列番号６
５として同定される、配列番号８のヌクレオチド６５０〜１，３８３；（１６）
配列番号６６として同定される、配列番号８のヌクレオチド７００〜１，３８３
；（１７）配列番号６７として同定される、配列番号８のヌクレオチド７５０〜
１，３８３；（１８）配列番号６８として同定される、配列番号８のヌクレオチ
ド８００〜１，３８３；（１９）配列番号６９として同定される、配列番号８の
ヌクレオチド８５０〜１，３８３；（２０）配列番号７０として同定される、配
列番号８のヌクレオチド９００〜１，３８３；（２１）配列番号７１として同定
される、配列番号８のヌクレオチド９５０〜１，３８３；（２２）配列番号７２
として同定される、配列番号８のヌクレオチド１，０００〜１，３８３；（２３
）配列番号７３として同定される、配列番号８のヌクレオチド１，０５０〜１，
３８３；（２４）配列番号７４として同定される、配列番号８のヌクレオチド１
，１００〜１，３８３；（２５）配列番号７５として同定される、配列番号８の
ヌクレオチド１，１５０〜１，３８３；（２６）配列番号７６として同定される
、配列番号８のヌクレオチド１，２００〜１，３８３；（２７）配列番号７７と
して同定される、配列番号８のヌクレオチド１，２５０〜１，３８３；（２８）
配列番号７８として同定される、配列番号８のヌクレオチド１，３００〜１，３
８３；（２９）配列番号７９として同定される、配列番号８のヌクレオチド１，
３５０〜１，３８３；（３０）配列番号３として同定される、配列番号８のヌク
レオチド１，３８４〜１，４６１の、本発明の全長ＳＤＨサブユニット３タンパ
ク質をコードするヌクレオチド配列；（３１）配列番号２４として同定される、
配列番号８のヌクレオチド１，４６２〜２，３０４の、本発明の成熟形態のＳＤ
Ｈサブユニット３タンパク質をコードするヌクレオチド配列；（３２）配列番号
８０として同定される、配列番号８のヌクレオチド２，３０５〜２，３５５；（
３３）配列番号８１として同定される、配列番号８のヌクレオチド２，３０５〜
２，４０５；（３４）配列番号８２として同定される、配列番号８のヌクレオチ
ド２，３０５〜２，４５５；（３５）配列番号８３として同定される、配列番号
８のヌクレオチド２，３０５〜２，５０５；（３２）配列番号８４として同定さ
れる、配列番号８のヌクレオチド２，３０５〜２，５５５；（３２）配列番号８
５として同定される、配列番号８のヌクレオチド２，３０５〜２，６０５；（３
２）配列番号８６として同定される、配列番号８のヌクレオチド２，３０５〜２
，６５５；および（３３）配列番号８７として同定される、配列番号８のヌクレ
オチド２，３０５〜２，７００。

【００６２】 本発明はまた、上記に広範に記載されたような１以上の配列を含む組換え構築
物を含む。この構築物は、その中に本発明の配列が、正方向または逆方向に挿入
されたベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）を含む。この実
施形態の好ましい局面では、この構築物はさらに、この配列に作動可能に連結さ
れた調節配列（例えば、プロモーターを含む）を含む。多数の適切なベクターお
よびプロモーターが当該分野で公知であり、そして市販される。以下のベクター
は、例として提供される：細菌性−ｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＱＥ７０、ｐ
ＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐ
ｓｉＸｌ７４、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢｓＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮ
Ｈ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＴｒｃ９
９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）；および真核生物性−ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ
４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭ
ＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。従って、これらおよび任意の他のプラ
スミドまたはベクターは、これらがその宿主において複製可能でかつ生存可能で
ある限り、使用され得る。

【００６３】 プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベ
クター、または選択マーカーを有する他のベクターを用いて任意の所望の遺伝子
から選択され得る。２つの適切なベクターは、ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７
である。特定の指定された細菌プロモーターとしては、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ
３、Ｔ７、ｇｐｔ、λＰ_R、Ｐ_Lおよびｔｒｐが挙げられる。真核生物プロモータ
ーとしては、ＣＭＶ前初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期のＳＶ４
０、レトロウイルス由来ＬＴＲおよびマウスメタロチオネイン−Ｉが挙げられる
。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当該分野の技術範囲のレ
ベル内である。

【００６４】 別の実施形態では、本発明は、本明細書中に記載されるベクターを産生するた
めのプロセスを提供し、このプロセスは、以下を包含する：（ａ）本発明の単離
された核酸分子をベクターに挿入する工程；および（ｂ）宿主細胞においてこの
ベクターを選択および増殖させる工程。

【００６５】 適切な宿主の代表例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：細
菌性細胞（例えば、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｍ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｓｅｕｄｏｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの細胞）；真菌および酵母生物（Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓおよびＲｈｉｚｏｐｕｓを含む）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌ
ａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９の細胞）；動物細胞（例えば、Ｃ
ＨＯ、ＣＯＳおよびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）；ならびに植物細胞。上記の宿主細
胞について適切な培養培地および条件は当該分野で公知である。

【００６６】 （４．本発明のポリペプチド） 本発明は、本発明のＳＤＨ酵素についての単離されたポリペプチド分子を提供
する。単離されたポリペプチド分子の操作について設計された方法および技術は
、当該分野で周知である。例えば、ポリペプチド分子の単離および精製のための
方法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓ
ｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９７（この開示は、本明細書中に参考として援用される
）に記載される。

【００６７】 より詳細には、本発明は、本発明のＳＤＨ酵素の、７５ｋＤａ、５０ｋＤａお
よび２９ｋＤａの個々のサブユニットタンパク質をコードする、単離されたいく
つかのポリペプチド分子を提供する。明確にする目的のために、本発明の特定の
単離されたポリペプチド分子が記載される。その後に、これらの単離されたポリ
ペプチド分子の特定の特性および特徴がより詳細に記載される。

【００６８】 １つの実施形態では、本発明は、以下からなる群より選択されるポリペプチド
配列を含む単離されたポリペプチドを提供する：（ａ）配列番号１のポリヌクレ
オチド配列中にコードされるポリペプチド配列；（ｂ）配列番号４のポリペプチ
ド配列；および（ｃ）配列番号４のポリペプチド配列由来の、少なくとも約１０
アミノ酸長のポリペプチド。

【００６９】 別の実施形態では、本発明は、以下からなる群より選択されるポリペプチド配
列を含む、単離されたポリペプチドを提供する：（ａ）配列番号２のポリヌクレ
オチド配列中にコードされるポリペプチド配列；（ｂ）配列番号５のポリペプチ
ド配列；および（ｃ）配列番号５のポリペプチド配列由来の、少なくとも約１０
アミノ酸長のポリペプチド。

【００７０】 なお別の実施形態では、本発明は、以下からなる群より選択されるポリペプチ
ド配列を含む、単離されたポリペプチドを提供する：（ａ）配列番号３のポリヌ
クレオチド配列中にコードされるポリペプチド配列；（ｂ）配列番号６のポリペ
プチド配列；および（ｃ）配列番号６のポリペプチド配列由来の、少なくとも約
１０アミノ酸長のポリペプチド。

【００７１】 本発明の他の実施形態としては、単離された核酸配列である配列番号７によっ
てコードされるポリペプチドを含む単離されたポリペプチド配列；単離された核
酸配列である配列番号８によってコードされるポリペプチドを含む単離されたポ
リペプチド配列；ＫＣＴＣ受託番号０５９３ＢＰに含まれるＤＮＡクローンによ
ってコードされるポリペプチドを含む単離されたポリペプチド配列；およびＫＣ
ＴＣ受託番号０５９４ＢＰに含まれるＤＮＡクローンによってコードされるポリ
ペプチドを含む単離されたポリペプチド配列が挙げられる。

【００７２】 用語「単離されたポリペプチド」は、本明細書中で、そのネイティブな環境か
ら取り出されたポリペプチドを意味するように用いられる。従って、組換え宿主
細胞内で産生されるおよび／または含まれるポリペプチドは、本発明の目的では
、単離されているとみなされる。「単離されたポリペプチド」としてはまた、組
換え宿主細胞から部分的または実質的に精製されたポリペプチドが意図される。

【００７３】 本発明のポリペプチドとしては、天然から精製された産物、化学合成手順の産
物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高
等植物細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生
される産物が挙げられる。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、
本発明のポリペプチドは、グリコシル化されてもグリコシル化されなくてもよい
。さらに、本発明のポリペプチドはまた、いくつかの場合には宿主媒介プロセス
の結果として、最初の修飾メチオニン残基を含み得る。

【００７４】 本発明の単離されたポリペプチドとしてはまた、上記のポリペプチドの改変体
が挙げられる。用語「改変体」は、アミノ酸の、保存的または非保存的な、置換
、欠失または挿入を保有する、天然の対立遺伝子改変体ポリペプチド配列を含む
ことを意味する。用語「改変体」はまた、公知の変異誘発技術を通して、または
化学合成方法論を通してヒトの手によって産生された、単離されたポリペプチド
配列を含むことを意味する。このような人工の改変体としては、アミノ酸の、保
存的または非保存的な、置換、欠失または挿入を保有するポリペプチド配列が挙
げられ得る。

【００７５】 特定のアミノ酸が保存的であるかまたは非保存的であるかは、当業者に周知で
ある。保存的アミノ酸置換は、タンパク質の折り畳みまたは活性に顕著な影響を
与えない。例示の目的のために、表１は、保存的アミノ酸置換のリストを示す。

【００７６】

【表１】 本発明のタンパク質における、機能に必須のアミノ酸は、当該分野で公知の方
法（例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャンニング変異誘発（Ｃｕ
ｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０
８５（１９８９））によって同定され得る。

【００７７】 本発明の単離されたポリペプチド分子としてはまた、本明細書中に記載の単離
されたポリペプチド分子に９５％、９６％、９７％、９８％および９９％同一で
あるポリペプチド配列が挙げられる。コンピュータプログラム（例えば、Ｂｅｓ
ｔＦｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉ
ｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ １０ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標）、
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓ
ｏｎ、ＷＩ ５３７１１））を用いて、任意の特定のポリペプチド分子が、本明
細書中に開示されるポリペプチド配列または本明細書中に記載される寄託された
クローンの単離されたＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチド配列に対し
て少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるか否かが
決定され得る。ＢｅｓｔＦｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ
ａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４
８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列の間の最良の
相同性セグメントを見出す。

【００７８】 例として、コンピューターアラインメントプログラム（例えば、ＢｅｓｔＦｉ
ｔ）を利用して参照ポリペプチド配列に対する９５％同一性を決定する場合、同
一性パーセンテージは、参照ポリペプチド配列の全長にわたって算出され、そし
て参照配列中のアミノ酸総数の５％までの相同性におけるギャップが許容される
。 従って、分析される１００アミノ酸あたり、９５％の同一性は、対象配列におけ
る１００アミノ酸のうちの５ほどが参照ポリペプチド配列から変化し得ることを
示す。

【００７９】 本発明はまた、本明細書中に記載されるポリペプチド配列および単離されたポ
リペプチド分子のフラグメントを包含する。好ましい実施形態では、本発明は、
少なくとも１０アミノ酸長であるフラグメントを提供する。このようなフラグメ
ントの長さは、代数的に容易に規定され得る。例えば、配列番号４は、７５４ア
ミノ酸長である単離されたポリペプチド分子を提供する。配列番号４の、少なく
とも１０アミノ酸長のフラグメント（Ｆ４）は、Ｆ４＝１０＋Ｘと規定され得、
ここで、Ｘは、０または１〜７４４の整数全体のいずれかであると規定される。
同様に、本明細書中に記載される他の単離されたポリペプチド分子についてのフ
ラグメントは、以下の通りに規定され得る：４７８アミノ酸長である配列番号５
については、配列番号５の、少なくとも１０アミノ酸長のフラグメント（Ｆ５）
は、Ｆ５＝１０＋Ｘと規定され得、ここで、Ｘは、０または１〜４６８の整数全
体のいずれかであると規定される；そして３０６アミノ酸長である配列番号６に
ついては、配列番号６の、少なくとも１０アミノ酸長のフラグメント（Ｆ６）は
、Ｆ６＝１０＋Ｘと規定され得、ここで、Ｘは、０または１〜２９６の整数全体
のいずれかであると規定される。

【００８０】 本発明の特に好ましい実施形態は、以下のような単離されたポリペプチドを提
供する：（１）配列番号１の単離された核酸分子によってコードされ、そして配
列番号４によって同定される、本発明のＳＤＨサブユニット１の全長ポリペプチ
ド；（２）配列番号２の単離された核酸分子によってコードされ、そして配列番
号５によって同定される、本発明のＳＤＨサブユニット２の全長ポリペプチド；
（３）配列番号３の単離された核酸分子によってコードされ、そして配列番号６
によって同定される、本発明のＳＤＨサブユニット３の全長ポリペプチド；（４
）配列番号２２の単離された核酸分子によってコードされ、そして配列番号２５
によって同定される、本発明のＳＤＨサブユニット１ポリペプチドの成熟形態；
（５）配列番号２４の単離された核酸分子によってコードされ、そして配列番号
２６と同定される、本発明のＳＤＨサブユニット２ポリペプチドの成熟形態；な
らびに配列番号２３の単離された核酸分子によってコードされ、そして配列番号
２７と同定される、本発明のＳＤＨサブユニット３ポリペプチドの成熟形態。

【００８１】 本発明はまた、ポリペプチドを産生するためのプロセスを提供し、このプロセ
スは、以下の工程を包含する：（ａ）配列番号１の単離された核酸分子またはそ
の改変体を含む宿主細胞を増殖させる工程；（ｂ）この単離された核酸分子によ
ってコードされるポリペプチドを発現させる工程；および（ｃ）このポリペプチ
ドを単離する工程。

【００８２】 別の実施形態では、本発明は、ポリペプチドを産生するためのプロセスを提供
し、このプロセスは、以下の工程を包含する：（ａ）配列番号２の単離された核
酸分子またはその改変体を含む宿主細胞を増殖させる工程；（ｂ）この単離され
た核酸分子によってコードされるポリペプチドを発現させる工程；および（ｃ）
このポリペプチドを単離する工程。

【００８３】 本発明によって提供される別のプロセスは、ポリペプチドを産生するためのプ
ロセスであり、このプロセスは、以下の工程を包含する：（ａ）配列番号３の単
離された核酸分子またはその改変体を含む宿主細胞を増殖させる工程；（ｂ）こ
の単離された核酸分子によってコードされるポリペプチドを発現させる工程；お
よび（ｃ）このポリペプチドを単離する工程。

【００８４】 適切な宿主の代表例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：細
菌性細胞（例えば、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｍ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｓｅｕｄｏｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの細胞）；真菌および酵母生物（Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓおよびＲｈｉｚｏｐｕｓを含む）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌ
ａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９の細胞）；動物細胞（例えば、Ｃ
ＨＯ、ＣＯＳおよびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）；ならびに植物細胞。上記の宿主細
胞について適切な培養培地および条件は当該分野で公知である。

【００８５】 このポリペプチドは、改変された形態で（例えば、融合タンパク質として）発
現され得、そして分泌シグナルだけでなく、さらなる異種機能領域をも含み得る
。例えば、さらなるアミノ酸（特に、荷電したアミノ酸）の領域は、このポリペ
プチドのＮ末端に対して付加されて、宿主細胞内での、精製の間の、またはその
後の取り扱いおよび保存の間での安定性および持続性を改善し得る。また、ペプ
チド部分をこのポリペプチドに付加して、精製を容易にし得る。このような領域
は、このポリペプチドの最終的な調製の前に除去され得る。とりわけ、分泌また
は排出を生じ、安定性を改善し、そして精製を容易にする、ポリペプチドに対す
るペプチド部分の付加は、当該分野で周知であり、そして慣用技術である。

【００８６】 本発明のポリペプチドは、以下を含む周知の方法によって組換え細胞培養物か
ら回収および精製され得る：硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール沈澱、酸抽
出、陰イオン交換クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、
ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ア
フィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー
およびレクチンクロマトグラフィー。最も好ましくは、高性能液体クロマトグラ
フィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。

【００８７】 （５．Ｌ−ソルボースおよび２−ケト−Ｌ−グロン酸の産生） 本発明は、Ｌ−ソルボースおよび２−ケト−Ｌ−グロン酸の産生のためのプロ
セスを提供し、これらは、ビタミンＣの産生のために有用である。

【００８８】 １つの実施形態では、本発明は、Ｄ−ソルビトールからのＬ−ソルボースの産
生のためのプロセスを提供し、このプロセスは、以下の工程を包含する：（ａ）
（ｉ）配列番号１のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；（ｉｉ）配
列番号２のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；および（ｉｉｉ）配
列番号３のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドからなる群より選択さ
れる少なくとも１つの単離されたヌクレオチド配列で宿主細胞を形質転換する工
程；ならびに（ｂ）この形質転換された宿主細胞を選択および増殖させる工程。

【００８９】 別の実施形態では、本発明は、２−ケト−Ｌ−グロン酸の産生のためのプロセ
スを提供し、このプロセスは、以下の工程を包含する：（ａ）（ｉ）配列番号１
のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；（ｉｉ）配列番号２のポリヌ
クレオチド配列を含むポリヌクレオチド；および（ｉｉｉ）配列番号３のポリヌ
クレオチド配列を含むポリヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１
つの単離されたヌクレオチド配列で宿主細胞を形質転換する工程；ならびに（ｂ
）この形質転換された宿主細胞を選択および増殖させる工程。

【００９０】 Ｌ−ソルボースおよび２−ケト−Ｌ−グロン酸の産生のために本明細書中に適
用されるプロセスにおいて宿主細胞として用いるために適切な細菌は、当業者に
公知である。このような細菌としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂ
ｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎ
ｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＰｓ
ｅｕｄｏｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒが挙げられるがこれらに限定されない。

【００９１】 本発明のＳＤＨ酵素の発現のための他の宿主細胞としては、以下が挙げられる
：米国特許第５，８３４，２３１号において同定される株；Ｇｌｕｃａｎｏｂａ
ｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ ＤＳＭ ４０２５（米国特許第４，９６０，６９５
号）；Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｏｒ ｏｘｙｄａｎｓ ＴＩＯＯ（Ａｐｐｌ．Ｅ
ｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４５４−４６０（１９９７））；Ｐ
ｓｅｕｄｏｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓａｃｃｈａｒｏｋｅｔｏｇｅｎｅｓ
ＩＦＯ １４４６４（欧州特許第２２１ ７０７号）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ ｓｏｒｂｏｓｏｘｉｄａｎｓ（米国特許第４，９３３，２８９号）；および
Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＩＦＯ １２２５８（Ａ
ｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１：４１３−４２０（１９９
５））。

【００９２】 本発明の他の実施形態では、当該分野で公知の種々の発酵技術が、Ｌ−ソルボ
ースおよび２−ケト−Ｌ−グロン酸の産生に関する本発明のプロセスにおいて用
いられ得る。一般的に、Ｌ−ソルボースおよび２−ケト−Ｌ−グロン酸は、（例
えば、バッチ型または供給バッチ型の）発酵プロセスによって産生され得る。バ
ッチ型の発酵では、全ての栄養分が、発酵開始時に添加される。供給バッチ型ま
たは長期供給バッチ型の発酵では、発酵開始からすぐにもしくは培養物が特定の
齢に到達した後に、または供給された栄養分が培養液から使い果たされた場合に
、１以上の栄養分が培養物に連続的に供給される。供給バッチ型発酵の長期バッ
チ変法は、反復供給バッチまたは充填−取り出し発酵（ｆｉｌｌ−ａｎｄ−ｄｒ
ａｗ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）であり、ここで、発酵槽の内容物の一部があ
る時点で（例えば、発酵槽が充填された時点で）取り出され、その間、栄養分の
供給が続けられる。このようにして、発酵が長期にわたって延長され得る。

【００９３】 別の型の発酵である連続発酵またはケモスタット培養は、発酵槽中のブロスの
容量がほぼ一定のままであるように培養液を連続的にはまたは半連続的に取り出
しながら、完全培地の連続供給を使用する。連続発酵は原則的に、無限の時間に
わたって維持され得る。

【００９４】 バッチ発酵において、生物は、培地中の必須栄養分のうちの１つが使い果たさ
れるまで、または発酵条件が不都合になるまで（例えば、ｐＨが、微生物の増殖
に対して阻害的な値まで低下するまで）増殖する。供給−バッチ発酵では、例え
ば、ｐＨコントロールを用いることによって、好都合な増殖条件を維持するため
に通常、測定が行われ、そして１以上の必須栄養分の消耗は、これらの栄養分を
培養物に供給することによって防止される。この微生物は、栄養分の供給速度に
よって指示される増殖速度で増殖し続ける。一般的に、単一の栄養分（非常にし
ばしば、炭素源）は、増殖の制限要因（ｌｉｍｉｔｉｎｇ）となる。同じ原理が
連続発酵にも適用され、通常、培地供給物中の１つの栄養分が制限要因であり、
他の全ての栄養分は過剰である。制限的な栄養分は、培養液中に非常に低濃度で
存在し、しばしば、測定できないほど低い。異なる型の栄養分の制限が用いられ
得る。炭素源の制限が最もしばしば用いられる。他の例は、窒素源による制限、
酸素による制限、特定の栄養分（例えば、ビタミンまたはアミノ酸（微生物がこ
のような化合物について栄養要求性である場合）による制限、硫黄による制限お
よびリンによる制限である。

【００９５】 適切な補充炭素源の例証となる例としては以下が挙げられるがこれらに限定さ
れない：他の炭水化物（例えば、グルコース、フルクトース、マンニトール、デ
ンプンまたはデンプン加水分解産物、セルロース加水分解産物および糖蜜）；有
機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、乳酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸およびフ
マル酸）；ならびにアルコール（例えば、グリセロール）。

【００９６】 適切な窒素源の例証となる例としては以下が挙げられるがこれらに限定されな
い：アンモニア（アンモニアガスおよび水性アンモニアを含む）；無機酸または
有機酸のアンモニウム塩（例えば、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン
酸アンモニウム、硫酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウム）；尿素；硝酸塩ま
たは亜硝酸塩、および他の窒素含有材料（純粋な調製物または粗調製物のいずれ
かとしてのアミノ酸、肉抽出物、ペプトン、魚粉、魚加水分解産物、コーンステ
ィープリカー（ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒ）、カゼイン加水分解産物
、ダイズ絞り粕（ｓｏｙｂｅａｎ ｃａｋｅ）加水分解産物、酵母抽出物、乾燥
酵母、エタノール−酵母留出物、ダイズ粉末、綿実粉などを含む）。

【００９７】 適切な無機塩の例証となる例としては以下が挙げられるがこれらに限定されな
い：カリウム、カルシウム、ナトリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、コバル
ト、亜鉛、銅および他の微量元素、ならびにリン酸の塩。

【００９８】 適切な微量栄養分、増殖因子などの例証となる例としては以下が挙げられるが
これらに限定されない：純粋なもしくは部分精製した化学的化合物としてか、ま
たは天然材料中に存在する通りとしてかのいずれかの、補酵素Ａ、パントテン酸
、ビオチン、チアミン、リボフラビン、フラビンモノヌクレオチド、フラビンア
デニンジヌクレオチド、他のビタミン、アミノ酸（例えば、システイン）、チオ
硫酸ナトリウム、ｐ−アミノ安息香酸、ナイアシンアミドなど。本発明の微生物
株の培養は、当業者に公知の液内発酵技術（例えば、気泡、伝統的な散布攪拌設
計または振盪培養）のいずれかを用いて達成され得る。

【００９９】 用いられる培養条件（温度、ｐＨ、空気混和速度、攪拌速度、培養持続時間な
どを含む）は、Ｌ−ソルボースおよび２−ケト−Ｌ−グロン酸の産生を最大にす
るように当業者によって経験的に決定され得る。特定の培養条件の選択は、用い
られる本発明の特定の微生物株、培地組成および型、培養技術、ならびに同様の
考慮すべき事柄のような因子に依存する。

【０１００】 ２−ＫＬＧを回収するための適切な方法の例証となる例は、米国特許第５，４
７４，９２４号；同第５，３１２，７４１号；同第４，９６０，６９５号；同第
４，９３５，３５９号；同第４，８７７，７３５号；同第４，９３３，２８９号
；同第４，８９２，８２３号；同第３，０４３，７４９号；同第３，９１２，５
９２号；同第３，９０７，６３９号および同第３，２３４，１０５号に記載され
ている。

【０１０１】 このような方法の１つによれば、この微生物は、第１に、培養ブロスから公知
の方法（例えば、遠心分離または濾過）により除去され、そして得られた溶液は
、減圧下で濃縮される。次いで、結晶性２−ＫＧＬは、濾過により回収され、そ
して、所望であれば、再結晶により精製される。同様に、２−ＫＧＬは、イオン
交換樹脂、溶媒抽出、沈澱、塩析などの使用などのような公知の方法を用いて回
収され得る。

【０１０２】 ２−ＫＧＬが遊離酸として回収される場合、その遊離酸は、所望であれば、従
来の方法を用いて、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウムもしくは
類似のカチオンにより塩に変換され得る。あるいは、２−ＫＧＬが塩として回収
される場合、その塩は、従来の方法を用いて、その遊離形態もしくは異なる塩に
変換され得る。

【０１０３】 本明細書中で言及されるすべての特許および刊行物は、明らかに参考として援
用される。ここまでは本発明を一般的に記載してきたが、本発明は、以下の実施
例を参照することにより、より容易に理解される。なお、以下の実施例は、例示
のために提供され、かつ特に示されていない限り本発明を限定することを意図さ
れていない。

【０１０４】 （実施例） （実施例１：Ｇ．ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ ＫＣＴＣ ２１１１からのＳＤＨの
単離および特徴付け） Ｇ．ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ ＫＣＴＣ ２１１１からの本発明のピロロキノリ
ンキノン（ＰＱＱ）依存性ＳＤＨの改良された精製方法が示される。当初の精製
スキーム（Ｃｈｏｉ，Ｅ．Ｓ．ら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ
．、１２５：４５（１９９５））に対する改良点は、より大きいサブユニット分
離能および酵素活性の改良された安定性に関する。

【０１０５】 （工程１：Ｇ．ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ ＫＣＴＣ ２１１１の培養） Ｇ．ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ ＫＣＴＣ ２１１１を、５ｍｌのＳＹＰ培地（５
％ Ｄ−ソルビトール、１％ ＢａｃｔｏＰｅｐｔｏｎｅおよび０．５％酵母抽
出物）に接種し、そして３０℃で２０時間インキュベートした。１ミリリットル
（ｍｌ）のこの培養物を、５００ｍｌフラスコ中の５０ｍｌの同じ培地に移し、
そして３０℃で２０時間、回転振盪機（１８０ｒｐｍ）で培養した。このように
して調製された培養物を、同じ培地を３Ｌ含む５Ｌジャーファメンター（ｊａｒ
ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ）のための接種材料として使用し、そして３Ｌ培養物を、
定常期初期まで増殖させた。

【０１０６】 （工程２：膜画分の調製） １２，０００ｇにて１０分間の遠心分離により細胞を収集し、１０ｍＭ酢酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で１回洗浄し、そしてビーズビーター（ｂｅａｄ
ｂｅａｔｅｒ）（Ｅｄｍｕｎｄ Ｂｕｈｌｅｒ、Ｖｉ ４）中で、４℃で９０
秒間、ガラスビーズ（直径０．１ｍｍ）を用いて破壊した。このようにして調製
されたホモジネートを、１２，０００ｇにて５分間遠心分離して、細胞破片およ
びガラスビーズを除去した。得られた上清を１００，０００ｇにて６０分間遠心
分離し、そして粗膜画分を沈殿物として得た。

【０１０７】 （工程３：膜画分由来のＳＤＨの可溶化） この粗膜画分を１ｍｌあたり４０ｍｇのタンパク質で再懸濁し、そして４℃に
て２時間攪拌することによって１．５％ ｎ−オクチルグルコシドで可溶化した
。得られた懸濁物を１２，０００ｇにて１０分間遠心分離して上清を得、この上
清を可溶化ＳＤＨ画分と称した。精製手順において用いた全ての溶液は、０．７
５％ ｎ−オクチルグルコシドを含んでいた。

【０１０８】 （工程４：酵素活性アッセイ） 酵素活性を、２，６−ジクロロフェノールヨードフェノール（ＤＣＩＰ）を人
工電子受容体として用い、そしてフェナジンメトスルフェート（ｐｈｅｎａｚｉ
ｎｅ ｍｅｔｈｏｓｕｌｐｈａｔｅ；ＰＭＳ）を電子伝達物質として用いて分光
光度法によってアッセイした。この反応混合物は、１．０ｍｌの総容量中に５０
ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５ｍＭ Ｃ
ａＣｌ₂、５ｍＭ ＫＣＮ、０．１ｍＭ ＰＭＳ、０．１２ｍＭ ＤＣＩＰ、２
５０ｍＭ Ｄ−ソルビトール、０．７５％ ｎ−オクチルグルコシドおよび酵素
溶液を含んでいた。ｐＨ５．０でのＤＣＩＰについてε＝５，６００ｃｍ^-1Ｍ^-1 のモル吸光係数を用いた。１単位の酵素活性を、１分間あたり１μｍｏｌのＤＣ
ＩＰの還元を触媒する酵素量と定義した。

【０１０９】 酵素活性を、実施例１の工程６に記載される再構成されたサブユニットについ
て、Ｆｅｒｒｉｃ−Ｄｕｐａｎｏｌ法（Ｗｏｏｄ，Ｗ．Ａ．ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ．５：２８７（１９６２））によっても決定した。サブユニットタン
パク質を、単独で、または異なる組み合わせでのいずれかで２５℃にて５分間プ
レインキュベートした。この反応を、１０ｍＭ（最終濃度）のフェリシアン化カ
リウムおよび２５０ｍＭ（最終濃度）のＤ−ソルビトールの添加によって開始し
た。適切な時間の後、この反応を、硫酸鉄（ＩＩＩ）−Ｄｕｐａｎｏｌ溶液（Ｆ
ｅ₂（ＳＯ₄）₃・ｎＨ₂Ｏ ５ｇ／Ｌ、Ｄｕｐａｎｏｌ（ラウリル硫酸ナトリウム
）３ｇ／Ｌおよび８５％リン酸９５ｍｌ／Ｌ）を添加することによって停止し、
そしてプルシアン色の吸光度を、分光光度計において６６０ｎｍで決定した。

【０１１０】 （工程５：イオン交換クロマトグラフィー） この可溶化した画分を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で平衡化した
ＣＭ−ＴＳＫ ６５０（Ｓ）（Ｍｅｒｃｋ）カラム（２．５×２０ｃｍ）にかけ
た。このＣＭ−ＴＳＫカラムを、線形勾配（１０ｍＭから５００ｍＭまで）の酢
酸ナトリウムで溶出させた。活性画分をプールし、そしてメンブレンフィルター
（Ａｍｉｃｏｎ、ＹＭ １０）を用いた限外濾過によって濃縮し、そしてＤＥＡ
Ｅ−ＴＳＫ ６５０（Ｓ）（Ｍｅｒｃｋ）カラム（２．５×２０ｃｍ）にかけた
。このＤＥＡＥ−ＴＳＫカラムを、ｐＨ５．０またはｐＨ６．０のいずれかの１
０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液でアイソクラティックに（ｉｓｏｃｒａｔｉｃａｌ
ｌｙ）溶出させた。

【０１１１】 図１に示すように、ｐＨ６．０で溶出した場合（図１−Ｂ）、活性ピークの分
解能は、ｐＨ５．０での溶出（図１−Ａ）よりもずっと高く、そして酵素活性の
ピークＩとピークＩＩとは完全に分離した。画分の酵素活性を溶出直後および溶
出の１時間後に測定した場合、ｐＨ５．０で一緒に溶出するピークＩおよびＩＩ
における画分の酵素活性が時間によって顕著には異ならないことが見出された。
しかし、ｐＨ６．０で別々に溶出するピークＩおよびＩＩにおける画分の場合、
ピークＩにおける酵素活性は、溶出１時間以内にもともとの値の１０分の１未満
に減少し、一方、ピークＩＩにおける酵素活性は変化しないままであった。

【０１１２】 ＤＥＡＥ−ＴＳＫカラムで、ｐＨ６．０で溶出されたピークＩおよびＩＩを含
む画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｕ．Ｋ．、Ｎａｔｕｒｅ、２２
７、６８０（１９７０））により分析した（図２）。図２−Ａは、ピークＩの画
分を示す。カラムＭは、標準的な分子量マーカーを示す。カラム１から４におい
て示すように、７５ｋＤａの第１のサブユニットバンドおよび５０ｋＤａの第２
のサブユニットバンドが観察され得るが、２９ｋＤａの第３のサブユニットバン
ドは観察されなかった。この場合、溶出１時間後、酵素活性は、１０倍を超えて
減少した。図２−Ｂは、ピークＩＩの画分を示す。カラムＭは、標準的な分子量
マーカーを示す。カラム５からカラム８に示すように、ピークＩＩの画分は、７
５ｋＤａのサブユニットおよび５０ｋＤａのサブユニットに加えて２９ｋＤａの
第３のサブユニットバンドを含んでいることが観察された。この観察は、２９ｋ
Ｄａの第３のサブユニットがＳＤＨの安定性において重要な役割を果たし得るこ
とを示した。

【０１１３】 （工程６：異なるサブユニットとのＳＤＨ再構成） ＤＥＡＥカラムクロマトグラフィーの間の５．０から６．０への溶出緩衝液の
ｐＨの上昇が、クロマトグラフィーピークの分解能を増加させたので、溶出緩衝
液のｐＨをｐＨ６．５にさらに上昇させた。実施例１の工程５において記載され
るように、ＣＭ−ＴＳＫ ６５０（Ｓ）カラムクロマトグラフィーによって提供
される部分精製ＳＤＨを、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で予
め平衡化したＤＥＡＥ−ＴＳＫ ６５０（Ｓ）カラム（２．５×１６．５ｃｍ）
にかけ、そしてこのカラムを１８０ｍｌの同じ緩衝液でアイソクラティックに溶
出し、続いて各々１６０ｍｌの２０ｍＭおよび５００ｍＭのリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ６．５）で勾配溶出した。カラム画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分
析した。

【０１１４】 図３に示すように、７５ｋＤａの第１のサブユニットは最初に溶出し（ピーク
Ｉ）、続いて２９ｋＤａの第３のサブユニットがアイソクラティック溶出の間に
溶出し（ピークＩＩ）、そして５０ｋＤａの第２のサブユニットが勾配溶出の間
に後で溶出した（ピークＩＩＩ）。図４に示すように、この３つのピークのＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ分析は、この３つのサブユニットが本質的に純粋であり、そして互
いに完全に分離されたことを示した。

【０１１５】 ３つのサブユニットは非変性条件下で精製され得、そして個々の種に分離され
得るので、再構成実験を行って、ＳＤＨ酵素の触媒活性について各サブユニット
の役割を決定した。ｐＨ６．５での溶出によってＤＥＡＥカラムから得られた約
１００ｐｍｏｌｅの各サブユニットを、単独でまたは異なる組み合わせでプレイ
ンキュベートし、そして実施例１の工程４に記載されるように、Ｆｅｒｒｉｃ−
Ｄｕｐａｎｏｌ法によって酵素活性についてアッセイした（表２）。各サブユニ
ットは単独では、非常に低いレベルの活性を示した。第１のサブユニットおよび
第２のサブユニットを再構成した場合、酵素活性は、第１のサブユニット単独と
比較して２倍上昇した。第３のサブユニットを第１のサブユニットに対して添加
した場合、および第１のサブユニットと第２のサブユニットとの混合物に対して
添加した場合、酵素活性はそれぞれ、約３０倍および約２０倍上昇した。これら
の結果は、第３のサブユニットがＳＤＨの触媒活性ならびにこの酵素の安定性に
対して重要な役割を果たすことを示した。

【０１１６】

【表２】 （実施例２：ＳＨＤサブユニットのＮ末端アミノ酸配列の決定） 実施例１において調製された精製されたＳＤＨをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５
％ゲル）に供し、そして分離されたタンパク質をポリビニリデンジフルオリド（
ＰＶＤＦ）メンブレン（Ｂｏｌｌａｇ、Ｄ．ＭおよびＥｄｅｌｓｔｅｉｎ、Ｓ．
Ｊ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．，８
（１９９１））にエレクトロブロッティングした。ポンソーＳ染料での可視化後
、各ＳＤＨサブユニットを含むメンブレンの部分を小片にして切り取り、そして
各サブユニットについてのこのメンブレンの小片を、アミノ酸配列分析機（Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｏｄｅｌ ４７７Ａ）にＮ末端アミノ酸
配列分析のために直接適用した。

【０１１７】 第１のサブユニットおよび第３のサブユニットについて得られたデータを表３
に示す（配列番号９および配列番号１１）。第２のサブユニットのＮ末端アミノ
酸配列は得られ得なかった。これは、Ｎ末端がブロックされていることによる可
能性が最も高い。ブロックされたＮ末端の同様の知見は、別の酢酸細菌Ａｃｅｔ
ｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓのアルコールデヒドロゲナーゼ複合
体のシトクロムｃサブユニットについて報告されており（Ｔａｋｅｍｕｒａ、Ｈ
．ら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５、２１、６８５７（１９９３））、ここ
で、Ｎ末端の遮断は、Ｎ末端でのグルタミン酸残基の、ピログルタミン酸残基へ
の修飾に起因した。この修飾は、Ｎ末端アミノ酸配列決定の間のエドマン分解に
抵抗する。

【０１１８】 それゆえ、精製されたＳＤＨの第２のサブユニットについてＮ末端配列を得る
ためには、単離されたＳＤＨタンパク質をピログルタミン酸アミノペプチダーゼ
で最初に処理して、潜在的にブロックされたＮ末端を遊離させた。手短に述べる
と、実施例１からの約５０ｐｇの精製されたＳＤＨを、消化緩衝液（１００ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭジチオスレイトールおよ
び５％（ｖ／ｖ）グリセロール、ｐＨ８．０）に溶解し、そして３．７５μｇの
ピログルタミン酸アミノペプチダーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ）と共に４℃にて１８時間インキュベートし、続いて２５℃にて４時間さらに
インキュベートした。インキュベーション後、反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに
供し、ＰＶＤＦメンブレンにエレクトロブロットし、そしてこのメンブレン上の
第２のサブユニットバンドを切り出し、そしてＮ末端アミノ酸配列について上記
のように分析した。１０残基のＮ末端アミノ酸配列を配列番号１０として表３に
示す。

【０１１９】

【表３】 （実施例３：第３のサブユニットについての内部アミノ酸配列の決定） 第３のサブユニットについて、対応する遺伝子の促進されたクローニングのた
めに、Ｎ末端アミノ酸配列に加えて内部アミノ酸配列もまた決定した。実施例１
の工程６に記載のように単離された約７μｇの第３のサブユニットタンパク質を
、以前に記載された（Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ，Ｐ．Ｔ．、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａ
ｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｐｅｐｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｍｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ ３７頁（１９８９））のようにトリプシン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ）で消化した。トリプシン処理消化物を、Ｂｒｏｗｎｌｅｅ ＳＰ
ＨＥＲＩ−５ ＲＰ １８カラム（０．２×２２ｃｍ）を用いたＨＰＬＣによっ
て分離し、そしてこのカラムを１５〜７０％のアセトニトリルの線形勾配で２１
０マイクロリットル／分間で６０分間にわたって溶出させた。溶出を２１４ｎｍ
でモニターし、そして充分に分離した３つのペプチドピークを回収し（図５にお
いて１、５および７と称した）、そして（実施例２）に記載されるようにそれら
のアミノ酸配列について分析した。ピーク１、５および７についての内部アミノ
酸配列をそれぞれ、以下の表４に示す（それぞれ、配列番号１２、配列番号１３
および配列番号１４）。

【０１２０】

【表４】 （実施例４：プライマー設計、およびＳＤＨ遺伝子の一部を含む１．５３ｋｂ
のＤＮＡフラグメントの単離） 第１のサブユニット（配列番号９）のＮ末端アミノ酸配列に基づいて、２つの
縮重プライマーであるプライマー１（５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣ ＧＡＡ（Ｇ）
ＧＡＴ（Ｃ）ＡＣＩ ＧＧＩ ＡＣＩ ＧＣ−３’）（配列番号１５）およびプ
ライマー２（５’−ＡＴＴ（Ｃ，Ａ）ＡＣＩ ＡＡＴ（Ｃ）ＧＣＩ ＧＡＴ（Ｃ
） ＣＡＡＧ） ＣＡＴ（Ｃ） ＣＣ−３’）（配列番号１６）を合成した。

【０１２１】 ＴａｋｅｄａおよびＳｈｉｍｉｚｕ（ＴａｋｅｄａおよびＳｈｉｍｉｚｕ、Ｊ
．Ｆｅｒｍ．Ｂｉｏｅｎｇ．、７２：１（１９９１））の方法を用いてＧ．ｓｕ
ｂｏｘｙｄａｎｓ ＫＣＴＣ ２１１１から単離されたゲノムＤＮＡを、Ｂａｍ
ＨＩで部分的に消化した。プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ）を、ＮａｅＩおよびＢａｍＨＩで制限処理し、そしてゲノムＤＮ
ＡのＢａｍＨＩ部分消化物をこのプラスミドのＢａｍＨＩ部位に連結した。

【０１２２】 ３０サイクルのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、単一特異性プライマーＰ
ＣＲ（ＳＳＰ−ＰＣＲ）方法（Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．、ＳＳＰ−ＰＣＲ ａｎｄ ｇ
ｅｎｏｍｅ ｗａｌｋｉｎｇ、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、ＰＣ
Ｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、１５：３３９（１９９３）
）に従って行って１．５３ｋｂの大きさのクローン（＃ＳＤＨ２−１）を単離し
た。

【０１２３】 上記で調製された連結反応混合物を、遺伝子特異的プライマーであるプライマ
ー１、およびこのベクターのＴ７プライマーで増幅した。一般的Ｔ７プライマー
は全ての連結されたフラグメントの末端にアニーリングするが、得られる産物は
線形でしか増加しない。しかし、特異的産物への遺伝子特異的プライマー１およ
びＴ７プライマーの同時アニーリングは、特異的一次産物の指数増幅をもたらす
。ネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーである、遺伝子特異的プライマー２
およびＴ７プライマーで行われた２回目のＰＣＲは、第２の特異的産物を生成し
、このことは、一次ＰＣＲの特異性を確認した。

【０１２４】 ＰＣＲ産物をプラスミドｐＴ７ Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に連結し、そし
てＳＥＭプロトコル（Ｉｎｏｕｅ，Ｈ．ら、Ｇｅｎｅ、９６：２３（１９９０）
）によってＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５ａに形質転換した。形質
転換体を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充したＬＢ培地（１％ Ｂａｃ
ｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％酵母抽出物および１％ ＮａＣｌ）中で培養
した。続いて、プラスミドをアルカリ溶解法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．ら、Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ、１２５頁（１９８８）
）によって抽出した。

【０１２５】 このプラスミドをテンプレートとして用い、プライマー１またはプライマー２
をＴ７プライマーと共に用いたＰＣＲによって、ポジティブな反応が得られた。
＃ＳＤＨ２−１フラグメントの部分的ヌクレオチド配列決定によって、プライマ
ー１結合部位の下流の誘導されたアミノ酸配列が、実験的に決定されたＮ末端ア
ミノ酸配列と一致することがさらに確認された。しかし、＃ＳＤＨ２−１は、第
１のサブユニット遺伝子の一部しか含んでいなかった。

【０１２６】 （実施例５：１．５３ｋｂのＤＮＡフラグメントをプローブとして用いた、Ｓ
ＤＨサブユニット遺伝子を含むλＧＥＭ５−１クローンの単離） 実施例４において単離された＃ＳＤＨ２−１を、ＤＩＧ Ｌａｂｅｌｉｎｇ
ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅ ＤＩＧ Ｓｙｓｔｅｍ Ｕｓｅ
ｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．６
−９頁、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（１９９３））で標識した。

【０１２７】 Ｇ．ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ ＫＣＴＣ ２１１１のゲノムＤＮＡライブラリー
を構築するために、実施例４に記載される方法を用いてＧ．ｓｕｂｏｘｙｄａｎ
ｓ ＫＣＴＣ ２１１１から単離されたゲノムＤＮＡを、Ｓａｕ３ＡＩで部分的
に消化した。部分的に消化されたＤＮＡを０．８％アガロースゲルにおいて電気
泳動し、そして１５〜２３ｋｂの大きさのＤＮＡを、ＱＬＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ
Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて溶出させた。次いで
、溶出したＤＮＡをλＧＥＭ−１１ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＢａｍＨＩ部
位に連結した。連結混合物を、ファージλ粒子中にＰａｃｋａｇｅｎｅ Ｉｎ
Ｖｉｔｒｏ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を指示マニ
ュアルに従って用いてパッケージングした。Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２細胞を、
０．２％マルトースおよび１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄を補充したＴＢ培地（１％ Ｂ
ａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅおよび０．５％ ＮａＣｌ）中で３０℃にて増殖さ
せ、そしてＯＤ₆₀₀が０．６に達した時点で４℃で保存した。パッケージング混
合物を細胞懸濁物に添加し、そしてこの混合物を３７℃にて３０分間インキュベ
ートして、感染させた。この混合物に対して、３ｍｌの溶解した（４５℃の）Ｔ
Ｂトップ寒天（１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄を含むＴ１３培地中の０．８％ Ｂａｃｔ
ｏ−Ａｇａｒ）を添加し、穏やかにボルテックスし、そして直ちにＬＢプレート
に注いだ。このプレートを倒置して３７℃にて一晩インキュベートした。

【０１２８】 λファージプラークをナイロンメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上に固定し、
そしてこのメンブレンを、プレハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＣ、１％
（ｗ／ｖ）ブロッキング試薬、０．１％ Ｎ−ラウロイルサルコシン（ｌａｕｒ
ｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ）、０．０２％ ＳＤＳおよび５０％（ｖ／ｖ）ホル
ムアミド）を４２℃にて３時間用いてハイブリダイゼーションオーブン（Ｈｙｂ
ａｉｄ）中でプレハイブリダイズした。次いで、このメンブレンを、ハイブリダ
イゼーション溶液（プレハイブリダイゼーション溶液中で希釈した、ＤＩＧ標識
した＃ＳＤＨ２−１プローブ）を４２℃にて１６時間用いてハイブリダイズした
。λファージの約２０，０００プラークのうちの１１個のプラークが、ＤＩＧ標
識した＃ＳＤＨ２−１プローブでのプラークハイブリダイゼーション（Ｔｈｅ
ＤＩＧ Ｓｙｓｔｅｍ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｆｉｌｔｅｒ Ｈ
ｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（１９９
３））によってポジティブなシグナルを与えた。

【０１２９】 λＤＮＡをポジティブなλクローンから単離し、そしてＬａｍｂｄａ ＤＮＡ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で精製した。単
離されたλＤＮＡをＢａｍＨ１で消化し、そして０．７％アガロースゲル電気泳
動に供した。このゲルで分離されたＤＮＡフラグメントをナイロンメンブレンに
転写し、そして上記と同じ条件下でプローブとして＃ＳＤＨ２−１を用いたサザ
ンハイブリダイゼーションによって再度分析した。ポジティブなシグナルを与え
たクローンを選択し、そして１５ｋｂの挿入片ＤＮＡをこのクローンからＸｈｏ
Ｉで切り出し、続いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫのＸｈｏＩ部位にクローン
化して、λＧＥＭ ５−１を得た。λＧＥＭ ５−１クローンを、いくつかの異
なる制限酵素での消化によってマッピングした。図６は、λＧＥＭ ５−１の制
限酵素地図を表す。

【０１３０】 （実施例６：λＧＥＭ ５−１クローンにおける５．７ｋｂのＰｓｔｌＩフラ
グメントのヌクレオチド配列の決定） 実施例５において得られたポジティブなクローンλＧＥＭ ５−１を、いくつ
かの異なる制限酵素でマッピングし、そして実施例５において記載されるように
サザンハイブリダイゼーションによって分析した。＃ＳＤＨ２−１とハイブリダ
イズする５．７ｋｂのＰｓｔＩフラグメントをサブクローン化し、そしてヌクレ
オチド配列を決定した。ＤＮＡ配列決定をより単純にするために、３つの重複す
るサブクローンＳ１、Ｓ２およびＳ３をそれぞれ、図７に示すように制限酵素セ
ットＫｐｎＩ−ＰｓｔＩ、ＮｏｔＩ−ＳａｃＩＩおよびＰｓｔＩ−ＳａｃＩを用
いて構築した。欠失クローンのセットを、Ｅｘｏ ＩＩＩ−Ｍｕｎｇｂｅａｎ
Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて各サブクローンに
ついて調製した。ヌクレオチド配列決定反応を、Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ
Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ
（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって行い、そして配列を自動Ｄ
ＮＡ配列決定機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｏｄｅｌ ３７３
Ａ）において決定した。

【０１３１】 図８は、５．７ｋｂのＰｓｔＩフラグメント（配列番号７）における４，８３
０ｂｐのヌクレオチド配列を示す。配列決定したＤＮＡは、２，２６５ヌクレオ
チドおよび１，４３７ヌクレオチドという２つのオープンリーディングフレーム
（ＯＲＦ）を含む。第１のＯＲＦは第１のサブユニットをコードする。第１のサ
ブユニット遺伝子の前には、６５１ｂｐ〜６５４ｂｐに位置するＳｈｉｎｅ−Ｄ
ａｌｇａｒｎｏ配列「ＡＧＧＡ」がある。第１のサブユニットの３４アミノ酸の
シグナル配列は、配列番号７の６６５ｂｐ〜７６６ｂｐに位置する。第１のサブ
ユニットタンパク質の成熟部分のコード配列は、７２０アミノ酸ポリペプチドを
コードする、配列番号７の７６７ｂｐ〜２，９２９ｂｐに位置する。その誘導さ
れるＮ末端アミノ酸配列は、Ｎ末端アミノ配列分析によって得られた１５アミノ
酸残基と完全一致する。

【０１３２】 第１のＯＲＦには、第２のＯＲＦが続いており、この２つのＯＲＦは、短い遺
伝子間領域によって隔てられていた。第２のＯＲＦは、第２のサブユニットをコ
ードする。第２のサブユニット遺伝子のＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（Ａ
ＧＧＡ）は配列番号８の２，９５０ｂｐ〜２，９５３ｂｐに見出され、この構造
遺伝子は配列番号８の２，９６４ｂｐ〜４，４００ｂｐに位置する。第２のサブ
ユニット遺伝子は、３６アミノ酸のシグナル配列を含めて４７８アミノ酸ポリペ
プチドをコードする。成熟ポリペプチドの誘導されたアミノ酸配列は、ピログル
タミン酸アミノペプチダーゼで処理したサンプルについて実験的に得られた配列
との完全一致を示した。第２のサブユニット遺伝子の停止コドンの下流には、逆
方向反復配列が見られる。

【０１３３】 第１のサブユニットおよび第２のサブユニットの成熟タンパク質の算出された
分子量はそれぞれ、７９ｋＤａおよび４８ｋＤａであり、これらの分子量は、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した場合のそれぞれ７５ｋＤａおよび５０ｋＤａと
いう実験値と良く一致する。

【０１３４】 さらに、特徴的ＰＱＱ結合配列（ＰＱＱ依存性デヒドロゲナーゼのアミノ末端
およびカルボキシ末端に特徴的に現れるコンセンサス配列）は、第１のサブユニ
ット遺伝子中に存在することもまた見いだされた。表５では、アミノ末端部分に
おける特徴的ＰＱＱ結合配列を配列番号１７として示し、そしてカルボキシ末端
部分に存在する特徴的配列を配列番号１８として示す（ここで、Ｘは任意のアミ
ノ酸を表す）。アミノ末端の特徴的な配列は、位置８１２ｂｐ〜８９８ｂｐで生
じ、そしてカルボキシ末端の特徴的な配列は位置１，４９０ｂｐ〜１，５５５ｂ
ｐで生じる。これらのデータは、第１のサブユニットがピロロキノリンキノン（
ＰＱＱ）を補因子として含むというさらなる証拠を提供する。

【０１３５】

【表５】 さらに、単一のヘム結合配列が第１のサブユニット遺伝子において位置２，６
１２ｂｐ〜２，６２６ｂｐで生じ（以下の表６における配列番号１９）、そして
３つのヘム結合配列が以下の位置で生じることもまた見い出された：第２のサブ
ユニット遺伝子における３，１２９ｂｐ〜３，１４３ｂｐ；３，５７３ｂｐ〜３
，５８７ｂｐおよび３，９８１ｂｐ〜３，９９５ｂｐ（ここで、Ｘ_Aは、任意の
アミノ酸を表す。Ｘ_BはＸ_Aとは異なる任意のアミノ酸である）。

【０１３６】

【表６】 相同配列についてのデータベース検索は、第１のサブユニット遺伝子のＤＮＡ
配列が、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補因子として含む多くのデヒドロゲ
ナーゼに対して大きな程度の類似性を示すことを決定した。特に、Ａｃｅｔｏｂ
ａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｏｘｏｇｅｎｅｓのアルコールデヒドロゲナーゼ（Ｔａｍ
ａｋｉ、Ｔ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１０８８、２９
２（１９９１））およびＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉのアルコールデヒ
ドロゲナーゼ（Ｉｎｏｕｅ、Ｔ．ら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７１、３１１
５（１９８９））はそれぞれ、第１のサブユニット遺伝子に対して７７％および
７０％同一である。第２のサブユニット遺伝子とのデータベースの検索は、最大
の程度の類似性を提供し、Ｇ．ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ ＩＦＯ １２５２８のシ
トクロムｃ（ＴａｋｅｄａおよびＳｈｉｍｉｚｕ、Ｊ Ｆｅｒｍ．Ｂｉｏｅｎｇ
．、７２：１（１９９１））と８３％のヌクレオチド配列同一性および８８％の
アミノ酸配列同一性で一致した。

【０１３７】 （実施例７：プライマーの設計、および第３のサブユニット遺伝子の一部を含
む３２０ｂｐのＤＮＡフラグメントのＰＣＲクローン化） 実施例６に記載される第１のサブユニット遺伝子および第２のサブユニット遺
伝子のヌクレオチド配列分析は、単離されたオペロンクローンが、第３のサブユ
ニット遺伝子を含まないことを示した。５’隣接領域および３’隣接領域のさら
なる配列決定はまた、第３のサブユニットの存在を示すことができなかった。そ
れゆえ、第３のサブユニットをコードする遺伝子を単離するために、プローブと
して使用される第３のサブユニット遺伝子の一部を含む短いＤＮＡフラグメント
をＰＣＲによって作製するための縮重プライマーを、アミノ酸配列情報に基づい
て合成した。

【０１３８】 実施例２において得られた成熟した第３のサブユニットタンパク質のＮ末端ア
ミノ酸配列（配列番号１１）、および実施例３において得られたトリプシン処理
ペプチドの内部アミノ酸配列のうちの１つ（配列番号１３）に基づいて、２つの
縮重プライマーであるプライマー３（５’−ＧＧＧＡＡＴＴＣ ＴＴＴ（Ｃ）
ＣＡＡ（Ｇ） ＧＡＡ（Ｇ） ＡＴＧ ＡＡＴ（Ｃ） ＡＡ−３’）（配列番号
２０）およびプライマー４（５’−ＧＧＧＡＡＴＴＣ ＴＴ ＧＡＡ Ａ（Ｇ）
ＣＣ ＮＧＣ Ａ（Ｇ）ＴＣ Ａ（Ｇ）ＴＡ−３’）（配列番号２１）をそれぞ
れ合成した。

【０１３９】 ＰＣＲ反応を、ＴａｋｅｄａおよびＳｈｉｍｉｚｕ（ＴａｋｅｄａおよびＳｈ
ｉｍｉｚｕ、Ｊ．Ｆｅｒｍ．Ｂｉｏｅｎｇ．、７２ １（１９９１））の方法に
よって調製されたＧ．ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ ＫＣＴＣ ２１１１のゲノムＤＮ
Ａをテンプレートとして用い、プライマー３および４を用いて行った。この反応
は、３２０ｂｐのＤＮＡフラグメントを生成した。この３２０ｂｐのＰＣＲ産物
をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に連結し、そしてＳ
ＥＭプロトコル（Ｉｎｏｕｅ，Ｈ．ら、Ｇｅｎｅ，９６、２３（１９９０））に
よってＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換した。形質転換体を、１００μｇ／ｍ
ｌのアンピシリンを補充したＬＢ培地中で培養した。続いて、このプラスミドを
、アルカリ溶解法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ、ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ、（１９８８））によって抽出した。サブクローン
化を、プライマー３およびプライマー４と共にこのプラスミドＤＮＡをテンプレ
ートとして用いるＰＣＲ反応を行うことによって確認した。３２０ｂｐのフラグ
メントの部分的ヌクレオチド配列決定はさらに、プライマー３結合部位の下流の
誘導されたアミノ酸配列が実験的に決定されたＮ末端アミノ酸配列と一致するこ
とを確認した。しかし、３２０ｂｐのフラグメントは、第３のサブユニット遺伝
子のＮ末端部分しか含まなかった。

【０１４０】 （実施例８：３２０ｂｐのＤＮＡフラグメントをプローブとして用いた、第３
のサブユニット遺伝子の単離） （実施例７）において単離された３２０ｂｐのＤＮＡフラグメントをＤＩＧ
Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅ ＤＩＧ Ｓ
ｙｓｔｅｍ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄ
ｚａｔｉｏｎ．６−９頁、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（１９９３
））で標識した。ＴａｋｅｄａおよびＳｈｉｍｉｚｕ（ＴａｋｅｄａおよびＳｈ
ｉｍｉｚｕ、Ｊ．Ｆｅｒｍ．Ｂｉｏｅｎｇ．、７２、（（１９９１））の方法を
用いてＧ．ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ ＫＣＴＣ ２１１１から単離されたゲノムＤ
ＮＡを、ＢａｍＨＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩまたは
ＸｈｏＩで消化し、０．８％アガロースゲルで電気泳動し、そしてナイロンメン
ブレン（ＮＹＴＲＡＮ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）に記載さ
れる（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｅ．Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８，５０３（１
９７５））通りに転写した。このメンブレンを、ハイブリダイゼーションオーブ
ン（Ｈｙｂａｉｄ）中でプレハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＣ、１％（
ｗ／ｖ）ブロッキング試薬、０．１％ Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．２％
ＳＤＳおよび５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド）を用いて４２℃にて２時間プレハ
イブリダイズした。次いで、このメンブレンを、ハイブリダイゼーション溶液（
プレハイブリダイゼーション溶液中で希釈したＤＩＧ標識したプローブ）を用い
て４２℃にて１２時間ハイブリダイズした。サザンハイブリダイゼーションは、
用いた各酵素について強度の別個のシグナルを与えた。４．５ｋｂ ＣｌａＩで
のポジティブシグナルに対応するＤＮＡを溶出させ、そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔ ＳＫ中にクローン化して、ミニライブラリーを構築した。このミニライブ
ラリーを、上記のようにサザンハイブリダイゼーションを繰り返すことによって
ポジティブクローンについてスクリーニングした。ポジティブシグナルを与える
クローンを選択し、そしてＣｌａＩ−＃６９と称した。図９は、ＣｌａＩ−＃６
９の制限酵素地図を表す。

【０１４１】 （実施例９：第３のサブユニットを含む４．５ｋｂのＣｌａＩフラグメントの
ヌクレオチド配列分析） ４．５ｋｂのＣｌａＩ−＃６９クローンにおける第３のサブユニット遺伝子の
ヌクレオチド配列を決定し、そして分析した。ＤＮＡ配列決定を容易にするため
に、いくつかの重複する制限フラグメントをサブクローン化し、そして各クロー
ンのヌクレオチド配列を決定した。ヌクレオチド配列決定反応をＤｙｅ Ｔｅｒ
ｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔ
ｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって行い、そし
てこの配列を自動ＤＮＡ配列決定機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、
Ｍｏｄｅｌ ３７３Ａ）において決定した。

【０１４２】 図１０は、４．５ｋｂのＣｌａＩフラグメント（配列番号８）の２７００ｂｐ
のヌクレオチド配列を示す。配列決定されたＤＮＡは、９２１ヌクレオチドのオ
ープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、このＯＲＦは、第３のサブユニ
ットポリペプチドをコードする。第３のサブユニット遺伝子の前には、１，３７
５ｂｐ〜１，３７７ｂｐに位置する潜在的なＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列
（ＡＧＧ）が存在する。第３のサブユニットポリペプチドのアミノ酸シグナル配
列は、１，３８４ｂｐ〜１，４６１ｂｐに位置する。第３のサブユニットタンパ
ク質の成熟部分のコード配列は１，４６２ｂｐ〜２，３０４ｂｐに位置し、２８
０アミノ酸ポリペプチドをコードする。この誘導されたＮ末端アミノ酸配列は、
Ｎ末端アミノ配列分析によって得られた２５アミノ酸残基と完全に一致した。第
３のサブユニットの成熟タンパク質の算出された分子量は２９，５５２Ｄａであ
り、この分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定された２９ｋＤａという実験
値と良好に一致した。

【０１４３】

【表７】

【０１４４】

【表８】

【０１４５】

【表９】

【０１４６】

【表１０】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ｐＨ５．０（Ａ）およびｐＨ６．０（Ｂ）の酢酸ナトリウム緩衝液を
用いたＤＥＡＥ−ＴＳＫカラムクロマトグラフィーを表す。

【図２】 図２は、ＤＥＡＥ−ＴＳＫカラムクロマトグラフィーによって分離されたピー
クＩ画分（Ａ）およびピークＩＩ画分（Ｂ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を表す。

【図３】 図３は、ｐＨ６．５のリン酸ナトリウム緩衝液を用いたＤＥＡＥ−ＴＳＫカラ
ムクロマトグラフィーを表す。

【図４】 図４は、ｐＨ６．５でＤＥＡＥ−ＴＳＫカラムクロマトグラフィーによって分
離したピークＩ（レーン１）、ピークＩＩ（レーン３）およびピークＩＩＩ（レ
ーン２）のカラム画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を表す。レーンＭは、分子量標準
マーカーを示す。

【図５】 図５は、ｐＨ６．５でのＤＥＡＥ−ＴＳＫカラムクロマトグラフィー由来のピ
ークＩＩタンパク質のトリプシン消化物のＨＰＬＣクロマトグラムを表す。点線
は、移動相におけるアセトニトリルの濃度勾配を示す。

【図６】 図６は、λＧＥＭ ５−１の制限酵素地図を表す。プローブとして用いた１．
５３ｋｂのＤＮＡフラグメント（＃ＳＤＨ ２−１）を黒棒として示す。

【図７】 図７は、λＧＥＭ ５−１の５．７ｋｂのＰｓｔＩフラグメントからの、異な
るセットの制限酵素を用いて作成した、Ｓ１ ＤＮＡフラグメント、Ｓ２ ＤＮ
ＡフラグメントおよびＳ３ ＤＮＡフラグメントの位置を表す。

【図８】 図８は、５．７ｋｂ ＰｓｔＩフラグメントの４，８３０塩基（配列番号７）
のヌクレオチド配列を表す。第１のサブユニットおよび第２のサブユニットにつ
いての推定アミノ酸配列を、ヌクレオチド配列の下に示す。精製したソルビトー
ルデヒドロゲナーゼのＮ末端アミノ酸配列決定によって得られたＮ末端アミノ酸
配列に下線を付す。シグナル配列切断部位を三角として示す。ヘム結合配列に、
点線で下線を付す。潜在的なリボソーム結合配列（ＳＤ）を、四角で囲む。転写
終結ステム−ループ構造を矢印で示す。第１のサブユニット遺伝子についての完
全なコード配列は６６５位〜２，９２９位（配列番号１）に位置し、シグナル配
列は６６５位〜７６６位に位置し、そしてＳＤＨの第１のサブユニットの成熟タ
ンパク質についてのコード配列は、７６７位〜２，９２９位（配列番号２２）に
位置する。第２のサブユニット遺伝子についての完全なコード配列は、２，９６
４位〜４，４００位（配列番号２）に位置し、シグナル配列は２，９６４位〜３
，０７１位に位置し、そしてＳＤＨの第２のサブユニットの成熟タンパク質につ
いてのコード配列は３，０７２位〜４，４００位（配列番号２３）に位置する。

【図９】 図９は、ＣｌａＩ−＃６９の制限酵素地図を表す。黒四角は、ソルビトールデ
ヒドロゲナーゼの第３のサブユニット遺伝子のコード領域を表す。

【図１０】 図１０は、ソルビトールデヒドロゲナーゼの第３のサブユニット遺伝子を含む
ＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列（配列番号８）を表す。推定アミノ酸配
列をこのヌクレオチド配列の下に示す。シグナル配列切断部位を三角として示す
。潜在的なリボソーム結合配列（ＳＤ）を四角で囲む。第３のサブユニット遺伝
子についての完全なコード配列は１，３８４位〜２，３０４位（配列番号３）に
位置し、シグナル配列は１，３８４位〜１，４６１位に位置し、そしてＳＤＨの
第３のサブユニットの成熟タンパク質についてのコード配列は１，４６２位〜２
，３０４位（配列番号２４）に位置する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 19/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ 21/02 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (71)出願人 アーカー−ダニエルズ−ミッドランド カ ンパニー アメリカ合衆国 イリノイ 62525， デ ィカター， ボックス 1470， フェリー ズ パークウェイ 4666 (72)発明者 チェ， イ−スン 大韓民国 305−600 テジョン， ユソン −ク， クン−ドン， タソル アパート メント 395−３ 102−507 (72)発明者 イ， サン−キ 大韓民国 143−210 ソウル， クワンジ ン−ク， クワンジャン−ドン， カ−ド ン 101， クク−ドン ビラ (72)発明者 イ， ウ−ネ 大韓民国 302−230 テジョン， ソー− ク， ジョウンニム−ドン， ウスン ア パートメント 112−1305 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA05 BA08 CA02 CA09 DA05 GA11 HA03 4B050 CC03 DD02 LL01 LL02 4B064 AF02 CA02 CA19 CC24 DA01 4B065 AA28 AB01 BA02 CA23 CA28 CA42 CA44

Claims (34)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 単離された核酸分子であって、以下： （ａ）配列番号１のポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号１のポリヌクレオチドの少なくとも約２０ヌクレオチド長のポ
   リヌクレオチドフラグメント； （ｃ）配列番号４のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；および （ｄ）配列番号４のアミノ酸配列の少なくとも約１０アミノ酸長のフラグメン
   トをコードするポリヌクレオチド； からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の単離された核酸分子に対して少なくとも約
   ９５％同一なポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
3. 【請求項３】 請求項１に記載の核酸を含む、ベクター。
4. 【請求項４】 請求項３に記載のベクターを産生するためのプロセスであっ
   て、該プロセスは、以下： （ａ）請求項１に記載のポリヌクレオチドを該ベクターに挿入する工程；およ
   び （ｂ）宿主細胞において該ベクターを選択および増殖させる工程、 を包含する、プロセス。
5. 【請求項５】 請求項３に記載のベクターを含む、宿主細胞。
6. 【請求項６】 単離された核酸分子であって、以下： （ａ）配列番号２のポリヌクレオチドまたはそのフラグメント； （ｂ）配列番号２のポリヌクレオチドの少なくとも約２０ヌクレオチド長のポ
   リヌクレオチドフラグメント； （ｃ）配列番号５のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；および （ｄ）配列番号５のアミノ酸配列の少なくとも約１０アミノ酸長のフラグメン
   トをコードするポリヌクレオチド； からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
7. 【請求項７】 請求項６に記載の単離された核酸分子に対して少なくとも約
   ９５％同一なポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
8. 【請求項８】 請求項６に記載の核酸を含む、ベクター。
9. 【請求項９】 請求項８に記載のベクターを産生するためのプロセスであっ
   て、該プロセスは、以下： （ａ）請求項６に記載のポリヌクレオチドを該ベクターに挿入する工程；およ
   び （ｂ）宿主細胞において該ベクターを選択および増殖させる工程、 を包含する、プロセス。
10. 【請求項１０】 請求項８に記載のベクターを含む、宿主細胞。
11. 【請求項１１】 単離された核酸分子であって、以下： （ａ）配列番号３のポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号３のポリヌクレオチドの少なくとも約２０ヌクレオチド長のポ
    リヌクレオチドフラグメント； （ｃ）配列番号６のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；および （ｄ）配列番号６のアミノ酸配列の少なくとも約１０アミノ酸長のフラグメン
    トをコードするポリヌクレオチド； からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
12. 【請求項１２】 請求項１１に記載の単離された核酸分子に対して少なくと
    も約９５％同一なポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
13. 【請求項１３】 請求項１１に記載の核酸を含む、ベクター。
14. 【請求項１４】 請求項１３に記載のベクターを産生するためのプロセスで
    あって、該プロセスは、以下： （ａ）請求項１１に記載のポリヌクレオチドを該ベクターに挿入する工程；お
    よび （ｂ）宿主細胞において該ベクターを選択および増殖させる工程、 を包含する、プロセス。
15. 【請求項１５】 請求項１３に記載のベクターを含む、宿主細胞。
16. 【請求項１６】 単離された核酸分子であって、以下： （ａ）配列番号７のポリヌクレオチド；および （ｂ）配列番号７のポリヌクレオチドの少なくとも約２０ヌクレオチド長のポ
    リヌクレオチドフラグメント； からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
17. 【請求項１７】 請求項１６に記載の単離された核酸分子に対して少なくと
    も約９５％同一なポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
18. 【請求項１８】 請求項１６に記載の核酸を含む、ベクター。
19. 【請求項１９】 請求項１８に記載のベクターを産生するためのプロセスで
    あって、該プロセスは、以下： （ａ）請求項１６に記載のポリヌクレオチドを該ベクターに挿入する工程；お
    よび （ｂ）宿主細胞において該ベクターを選択および増殖させる工程、 を包含する、プロセス。
20. 【請求項２０】 請求項１８に記載のベクターを含む、宿主細胞。
21. 【請求項２１】 前記ポリヌクレオチドが、ＫＣＴＣ受託番号０５９３ＢＰ
    に含まれるＤＮＡクローンの完全なヌクレオチド配列を有する、請求項１６に記
    載の核酸分子。
22. 【請求項２２】 単離された核酸分子であって、以下： （ａ）配列番号８のポリヌクレオチド；および （ｂ）配列番号８のポリヌクレオチドの少なくとも約２０ヌクレオチド長のポ
    リヌクレオチドフラグメント； からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
23. 【請求項２３】 請求項２２に記載の単離された核酸分子に対して少なくと
    も約９５％同一なポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
24. 【請求項２４】 請求項２２に記載の核酸を含む、ベクター。
25. 【請求項２５】 請求項２４に記載のベクターを産生するためのプロセスで
    あって、該プロセスは、以下： （ａ）請求項２２に記載のポリヌクレオチドを該ベクターに挿入する工程；お
    よび （ｂ）宿主細胞において該ベクターを選択および増殖させる工程、 を包含する、プロセス。
26. 【請求項２６】 請求項２４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
27. 【請求項２７】 前記ポリヌクレオチドが、ＫＣＴＣ受託番号０５９４ＢＰ
    に含まれるＤＮＡクローンの完全なヌクレオチド配列を有する、請求項２２に記
    載の核酸分子。
28. 【請求項２８】 Ｄ−ソルビトールからＬ−ソルボースを産生するためのプ
    ロセスであって、以下： （ａ）以下： （ｂ）配列番号１のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド； （ｃ）配列番号２のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；および （ｄ）配列番号３のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、 からなる群より選択される少なくとも１つの単離されたヌクレオチド配列で宿主
    細胞を形質転換する工程；ならびに （ｅ）該形質転換された宿主細胞を選択および増殖させる工程、 を包含する、プロセス。
29. 【請求項２９】 前記宿主細胞がＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒである、請求
    項２８に記載のプロセス。
30. 【請求項３０】 単離されたポリペプチドであって、以下： （ａ）配列番号３のポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド配列； （ｂ）配列番号６のポリペプチド配列；および （ｃ）配列番号６のポリペプチド配列由来の少なくとも約１０アミノ酸長のポ
    リペプチド； からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む、ポリペプチド。
31. 【請求項３１】 ポリペプチドを産生するためのプロセスであって、以下： （ａ）請求項１５に記載の宿主細胞を増殖させる工程； （ｂ）請求項２９に記載のポリペプチドを発現させる工程；および （ｃ）該ポリペプチドを単離する工程； を包含する、プロセス。
32. 【請求項３２】 ２−ケト−Ｌ−グロン酸の産生を増加させるためのプロセ
    スであって、以下： （ａ）以下： （ｂ）配列番号１のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド； （ｃ）配列番号２のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；および （ｄ）配列番号３のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド； からなる群より選択される少なくとも１つの単離されたヌクレオチド配列で宿主
    細胞を形質転換する工程；ならびに （ｅ）該形質転換された宿主細胞を選択および増殖させる工程、 を包含する、プロセス。
33. 【請求項３３】 単離された核酸分子であって、以下： （ａ）配列番号２８として同定される、配列番号７のヌクレオチド１〜６６４
    ； （ｂ）配列番号２９として同定される、配列番号７のヌクレオチド５０〜６６
    ４； （ｃ）配列番号３０として同定される、配列番号７のヌクレオチド１００〜６
    ６４； （ｄ）配列番号３１として同定される、配列番号７のヌクレオチド１５０〜６
    ６４； （ｅ）配列番号３２として同定される、配列番号７のヌクレオチド２００〜６
    ６４； （ｆ）配列番号３３として同定される、配列番号７のヌクレオチド２５０〜６
    ６４； （ｇ）配列番号３４として同定される、配列番号７のヌクレオチド３００〜６
    ６４； （ｈ）配列番号３５として同定される、配列番号７のヌクレオチド３５０〜６
    ６４； （ｉ）配列番号３６として同定される、配列番号７のヌクレオチド４００〜６
    ６４； （ｊ）配列番号３７として同定される、配列番号７のヌクレオチド４５０〜６
    ６４； （ｋ）配列番号３８として同定される、配列番号７のヌクレオチド５００〜６
    ６４； （ｌ）配列番号３９として同定される、配列番号７のヌクレオチド５５０〜６
    ６４； （ｍ）配列番号４０として同定される、配列番号７のヌクレオチド６００〜６
    ６４； （ｎ）配列番号１として同定される、配列番号７のヌクレオチド６６５〜２，
    ９２９の、本発明のＳＤＨの全長サブユニット１タンパク質をコードするヌクレ
    オチド配列； （ｏ）配列番号２２として同定される、配列番号７のヌクレオチド７６７〜２
    ，９２９の、本発明のＳＤＨの成熟形態のサブユニット１タンパク質をコードす
    るヌクレオチド配列； （ｐ）配列番号４１として同定される、配列番号７のヌクレオチド２，９３０
    〜２，９６３； （ｑ）配列番号２として同定される、配列番号７のヌクレオチド２，９６４〜
    ４，４００の、本発明のＳＤＨの全長サブユニット２タンパク質をコードするヌ
    クレオチド配列； （ｒ）配列番号２３として同定される、配列番号７のヌクレオチド３，０７２
    〜４，４００の、本発明のＳＤＨの成熟形態のサブユニット２タンパク質をコー
    ドするヌクレオチド配列； （ｓ）配列番号４２として同定される、配列番号７のヌクレオチド４，４０１
    〜４，４５１； （ｔ）配列番号４３として同定される、配列番号７のヌクレオチド４，４０１
    〜４，５０１； （ｕ）配列番号４４として同定される、配列番号７のヌクレオチド４，４０１
    〜４，５５１； （ｖ）配列番号４５として同定される、配列番号７のヌクレオチド４，４０１
    〜４，６０１； （ｗ）配列番号４６として同定される、配列番号７のヌクレオチド４，４０１
    〜４，６５１； （ｘ）配列番号４７として同定される、配列番号７のヌクレオチド４，４０１
    〜４，７０１； （ｙ）配列番号４８として同定される、配列番号７のヌクレオチド４，４０１
    〜４，７５１； （ｚ）配列番号４９として同定される、配列番号７のヌクレオチド４，４０１
    〜４，８０１；および （ａａ）配列番号５０として同定される、配列番号７のヌクレオチド４，４０
    １〜４，８３０； からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
34. 【請求項３４】 単離された核酸分子であって、以下： （ａ）配列番号５１として同定される、配列番号８のヌクレオチド１〜１，３
    ８３； （ｂ）配列番号５２として同定される、配列番号８のヌクレオチド５０〜１，
    ３８３； （ｃ）配列番号５３として同定される、配列番号８のヌクレオチド１００〜１
    ，３８３； （ｄ）配列番号５４として同定される、配列番号８のヌクレオチド１５０〜１
    ，３８３； （ｅ）配列番号５５として同定される、配列番号８のヌクレオチド２００〜１
    ，３８３； （ｆ）配列番号５６として同定される、配列番号８のヌクレオチド２５０〜１
    ，３８３； （ｇ）配列番号５７として同定される、配列番号８のヌクレオチド３００〜１
    ，３８３； （ｈ）配列番号５８として同定される、配列番号８のヌクレオチド３５０〜１
    ，３８３； （ｉ）配列番号５９として同定される、配列番号８のヌクレオチド４００〜１
    ，３８３； （ｊ）配列番号６０として同定される、配列番号８のヌクレオチド４５０〜１
    ，３８３； （ｋ）配列番号６１として同定される、配列番号８のヌクレオチド５００〜１
    ，３８３； （ｌ）配列番号６２として同定される、配列番号８のヌクレオチド５５０〜１
    ，３８３； （ｍ）配列番号６３として同定される、配列番号８のヌクレオチド６００〜１
    ，３８３； （ｎ）配列番号６４として同定される、配列番号８のヌクレオチド６００〜１
    ，３８３； （ｏ）配列番号６５として同定される、配列番号８のヌクレオチド６５０〜１
    ，３８３； （ｐ）配列番号６６として同定される、配列番号８のヌクレオチド７００〜１
    ，３８３； （ｑ）配列番号６７として同定される、配列番号８のヌクレオチド７５０〜１
    ，３８３； （ｒ）配列番号６８として同定される、配列番号８のヌクレオチド８００〜１
    ，３８３； （ｓ）配列番号６９として同定される、配列番号８のヌクレオチド８５０〜１
    ，３８３； （ｔ）配列番号７０として同定される、配列番号８のヌクレオチド９００〜１
    ，３８３； （ｕ）配列番号７１として同定される、配列番号８のヌクレオチド９５０〜１
    ，３８３； （ｖ）配列番号７２として同定される、配列番号８のヌクレオチド１，０００
    〜１，３８３； （ｗ）配列番号７３として同定される、配列番号８のヌクレオチド１，０５０
    〜１，３８３； （ｘ）配列番号７４として同定される、配列番号８のヌクレオチド１，１００
    〜１，３８３； （ｙ）配列番号７５として同定される、配列番号８のヌクレオチド１，１５０
    〜１，３８３； （ｚ）配列番号７６として同定される、配列番号８のヌクレオチド１，２００
    〜１，３８３； （ａａ）配列番号７７として同定される、配列番号８のヌクレオチド１，２５
    ０〜１，３８３； （ｂｂ）配列番号７８として同定される、配列番号８のヌクレオチド１，３０
    ０〜１，３８３； （ｃｃ）配列番号７９として同定される、配列番号８のヌクレオチド１，３５
    ０〜１，３８３； （ｄｄ）配列番号３として同定される、配列番号８のヌクレオチド１，３８４
    〜１，４６１の、本発明の全長ＳＤＨサブユニット３タンパク質をコードするヌ
    クレオチド配列； （ｅｅ）配列番号２４として同定される、配列番号８のヌクレオチド１，４６
    ２〜２，３０４の、本発明の成熟形態のＳＤＨサブユニット３タンパク質をコー
    ドするヌクレオチド配列； （ｆｆ）配列番号８０として同定される、配列番号８のヌクレオチド２，３０
    ５〜２，３５５； （ｇｇ）配列番号８１として同定される、配列番号８のヌクレオチド２，３０
    ５〜２，４０５； （ｈｈ）配列番号８２として同定される、配列番号８のヌクレオチド２，３０
    ５〜２，４５５； （ｉｉ）配列番号８２として同定される、配列番号８のヌクレオチド２，３０
    ５〜２，５０５； （ｊｊ）配列番号８３として同定される、配列番号８のヌクレオチド２，３０
    ５〜２，５５５； （ｋｋ）配列番号８５として同定される、配列番号８のヌクレオチド２，３０
    ５〜２，６０５； （ｌｌ）配列番号８６として同定される、配列番号８のヌクレオチド２，３０
    ５〜２，６５５；および （ｍｍ）配列番号８７として同定される、配列番号８のヌクレオチド２，３０
    ５〜２，７００； からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む、核酸分子。