JP2002542485A - 気道炎症の存在及び重症度を評価するための方法及びテストキット - Google Patents
気道炎症の存在及び重症度を評価するための方法及びテストキットInfo
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Abstract
(57)【要約】
本発明は複雑な実験室設備及び熟練した実験人員がなくとも気道炎症のレベル及び重症度を容易かつ迅速に診断することを可能にする医師及び獣医師用の診断方法及びテストキットに関する。この方法及びテストキットは気道分泌サンプル中のマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）及び／又は関連分子（ＭＭＰ−ＲＭ）の量の偏りのない評価に基づいている。健康な人と比較した気道液中のＭＭＰの量の増大は気道の炎症のレベル、重症度及び／又は組織破壊的活性相の信頼できる指標であり、また医学的治療の効果の追跡を可能にし、並びに感染、炎症及び例えば運動競技に参加する競技者にとっての環境的及び物理的ストレス要因と関連した合併症の危険性の予測を可能にする。例えば競技産業では多額のお金が関与しているので、野外条件で働いている獣医師にとってはあるウマが競技に参加することができるか否かを決定することができるということは重要である。
Description
【０００１】 発明の技術分野 本発明は気道における炎症の存在及び重症度を評価するための方法及びテスト
キットに関する。これらの方法及びキットは炎症性肺組織損傷のレベルを評価す
るために、合併症及び急性炎症が慢性的過程に変化する危険性を予測し予防する
ために、組織破壊を減少させるための治療モダリティーの効果を追跡するために
、及び適用された治療の効力を評価するために用いることができる。診断は肺の
全部及び／又は一部を表すヒト及び／又は動物の気道分泌サンプルを用いて迅速
かつ信頼できるチェアサイドアッセイとして行われることが好ましい。これらの
方法及びテストキットは一種以上の結合物質の使用に基づいており、これらの結
合物質は前記気道分泌サンプルから一種以上のマトリックスメタロプロテイナー
ゼ（ＭＭＰ）及び／又は関連分子（ＭＭＰ−ＲＭ）（単独又は組み合わせ）を特
異的に認識することができる。
キットに関する。これらの方法及びキットは炎症性肺組織損傷のレベルを評価す
るために、合併症及び急性炎症が慢性的過程に変化する危険性を予測し予防する
ために、組織破壊を減少させるための治療モダリティーの効果を追跡するために
、及び適用された治療の効力を評価するために用いることができる。診断は肺の
全部及び／又は一部を表すヒト及び／又は動物の気道分泌サンプルを用いて迅速
かつ信頼できるチェアサイドアッセイとして行われることが好ましい。これらの
方法及びテストキットは一種以上の結合物質の使用に基づいており、これらの結
合物質は前記気道分泌サンプルから一種以上のマトリックスメタロプロテイナー
ゼ（ＭＭＰ）及び／又は関連分子（ＭＭＰ−ＲＭ）（単独又は組み合わせ）を特
異的に認識することができる。
【０００２】 発明の背景 気道は様々な汚染物質及び空気伝搬される粒子に日常的に暴露されている。こ
れらは呼吸系統の空気伝染病の始まり及び持続の原因であると考えられている。
タバコの煙に個体が暴露すると、喫煙者の気道中への損傷因子の流入が劇的に増
大する。気流制限を伴って生ずる肺疾病には気管支喘息、慢性閉塞肺疾病（ＣＯ
ＰＤ）、慢性気管支炎及び人間における気管支拡張症が含まれる。
れらは呼吸系統の空気伝染病の始まり及び持続の原因であると考えられている。
タバコの煙に個体が暴露すると、喫煙者の気道中への損傷因子の流入が劇的に増
大する。気流制限を伴って生ずる肺疾病には気管支喘息、慢性閉塞肺疾病（ＣＯ
ＰＤ）、慢性気管支炎及び人間における気管支拡張症が含まれる。
【０００３】 閉塞的徴候に加えて、前記肺疾病は気道及び肺組織における慢性炎症の様々な
レベルである共通の特徴とつながりがある。気道における慢性疾病及びすべての
炎症悪化は組織損傷をもたらし、そして結果として肺の構造的又は機能的健全さ
の維持を悪化させる。
レベルである共通の特徴とつながりがある。気道における慢性疾病及びすべての
炎症悪化は組織損傷をもたらし、そして結果として肺の構造的又は機能的健全さ
の維持を悪化させる。
【０００４】 慢性閉塞肺疾病（ＣＯＰＤ）、気管支喘息、気管支拡張症及び慢性気管支炎の
如き慢性炎症性の肺疾病は再発する炎症バーストによって特徴付けられており、
これは増大した粘液生産、上皮損傷及び気管支壁の収縮をもたらす。長く続く炎
症又はいくつかの炎症性バーストは最終的には繊維症及び呼吸系全体の永久的機
能不全をもたらす。代わりに肺炎症及び組織破壊はウイルス、細菌、微生物及び
／又は菌の感染から生じ得る。
如き慢性炎症性の肺疾病は再発する炎症バーストによって特徴付けられており、
これは増大した粘液生産、上皮損傷及び気管支壁の収縮をもたらす。長く続く炎
症又はいくつかの炎症性バーストは最終的には繊維症及び呼吸系全体の永久的機
能不全をもたらす。代わりに肺炎症及び組織破壊はウイルス、細菌、微生物及び
／又は菌の感染から生じ得る。
【０００５】 従来は人間における慢性呼吸疾病の診断は臨床テスト、放射線を用いた発見、
肺機能のテスト、痰又は上皮裏打ち液（ＥＬＦ）の細胞学並びに気道からのバイ
オプシーの形態に基づいている。
肺機能のテスト、痰又は上皮裏打ち液（ＥＬＦ）の細胞学並びに気道からのバイ
オプシーの形態に基づいている。
【０００６】 ウマの慢性閉塞肺疾病（ＣＯＰＤ）の診断は、主に下部気道に関与する感染病
である他の疾病を除外すれば健康である動物における慢性咳又は苦しそうな呼吸
の存在に基づいている。ウマのＣＯＰＤにおいては総血球数は同時感染の不在下
においては正常のままである。ＣＯＰＤの初期段階においては下部気道の初期炎
症性変化を確認するためには気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）によって得られる気道分
泌サンプルが必要である。ＢＡＬにおける最も一般的な変化は好中球の出現であ
る。しかし、好中球と疾病の重症度及び疾病の予後の過程の間の相関関係は良好
すぎるとはいえない。炎症性細胞（例、好中球）は気管洗浄物又は気管吸引液か
ら炎症変化を検出するために用いられている。
である他の疾病を除外すれば健康である動物における慢性咳又は苦しそうな呼吸
の存在に基づいている。ウマのＣＯＰＤにおいては総血球数は同時感染の不在下
においては正常のままである。ＣＯＰＤの初期段階においては下部気道の初期炎
症性変化を確認するためには気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）によって得られる気道分
泌サンプルが必要である。ＢＡＬにおける最も一般的な変化は好中球の出現であ
る。しかし、好中球と疾病の重症度及び疾病の予後の過程の間の相関関係は良好
すぎるとはいえない。炎症性細胞（例、好中球）は気管洗浄物又は気管吸引液か
ら炎症変化を検出するために用いられている。
【０００７】 ウマのＣＯＰＤにおける呼吸機能不全は動脈血ガス分析によって評価すること
ができるが、この方法は高価な設備を必要とする。また胸腔内食道圧差測定によ
っても評価することができるが、この方法は特殊な装置を必要とする。動脈血ガ
ス及び胸腔内食道圧測定の如き肺機能テストにおける明白な変化は明白な臨床的
徴候が存在する場合しか検出されない。軽微な疾病は検出されない。肺のバイオ
プシーもウマのＣＯＰＤを診断するために用いられている。しかし、それはひど
い放血を引き起こす。従ってＣＯＰＤを診断するためにそれを用いることは日常
的には勧められない。
ができるが、この方法は高価な設備を必要とする。また胸腔内食道圧差測定によ
っても評価することができるが、この方法は特殊な装置を必要とする。動脈血ガ
ス及び胸腔内食道圧測定の如き肺機能テストにおける明白な変化は明白な臨床的
徴候が存在する場合しか検出されない。軽微な疾病は検出されない。肺のバイオ
プシーもウマのＣＯＰＤを診断するために用いられている。しかし、それはひど
い放血を引き起こす。従ってＣＯＰＤを診断するためにそれを用いることは日常
的には勧められない。
【０００８】 アトロピンの投与の前後での肺機能テストはＣＯＰＤの可動性をテストするた
めに用いられているが、アトロピンはひどい副作用を引き起こす。従って診断目
的には勧められない（Lavoie, J.-P., In Current Therapy in Equine Medicine
, Ed. N. E. Robinson. Saunders Company, Philadelphia, Pennsylvania, USA,
pp. 426-437, 1997）。肺機能テストはヒトにおける肺全体の機能能力及び気道
から及び気道への空気の動き速度並びに化学物質の変化する量に対する気管支の
過反応性を測定するために用いられる。
めに用いられているが、アトロピンはひどい副作用を引き起こす。従って診断目
的には勧められない（Lavoie, J.-P., In Current Therapy in Equine Medicine
, Ed. N. E. Robinson. Saunders Company, Philadelphia, Pennsylvania, USA,
pp. 426-437, 1997）。肺機能テストはヒトにおける肺全体の機能能力及び気道
から及び気道への空気の動き速度並びに化学物質の変化する量に対する気管支の
過反応性を測定するために用いられる。
【０００９】 一般的に、肺機能テストにおける減少した値は多くの異なる多様な原因による
ものである。例えば気管支狭窄は気道筋肉痙縮、上皮肥大、痰閉塞、又は繊維症
損傷等により気道を狭める。しかし、肺機能テストは気道における炎症の存在及
び／又は重症度のいかなる指標も又は気道疾病過程における活性な進行中の組織
破壊相の指標も与えない。現在では肺における慢性炎症はコルチコステロイド治
療によって主にダウンレギュレートされる。近代肺病学における最も効果的で有
用かつ副作用が少ないステロイド治療法は測定量吸入器を用いることである。ス
テロイドを日常的に使用する目的は慢性肺炎症をカバーし慢性肺炎症の悪化を防
止することである。コルチコステロイドの如き炎症をダウンレギュレートする医
薬、特に吸入される医薬は慢性組織破壊肺疾病の治療及び予防の両方の目的のた
めに推奨される。というのは気道炎症はこれらの疾病を悪化させ進行させる主要
なかつ重要な理由であるということが示されているからである。
ものである。例えば気管支狭窄は気道筋肉痙縮、上皮肥大、痰閉塞、又は繊維症
損傷等により気道を狭める。しかし、肺機能テストは気道における炎症の存在及
び／又は重症度のいかなる指標も又は気道疾病過程における活性な進行中の組織
破壊相の指標も与えない。現在では肺における慢性炎症はコルチコステロイド治
療によって主にダウンレギュレートされる。近代肺病学における最も効果的で有
用かつ副作用が少ないステロイド治療法は測定量吸入器を用いることである。ス
テロイドを日常的に使用する目的は慢性肺炎症をカバーし慢性肺炎症の悪化を防
止することである。コルチコステロイドの如き炎症をダウンレギュレートする医
薬、特に吸入される医薬は慢性組織破壊肺疾病の治療及び予防の両方の目的のた
めに推奨される。というのは気道炎症はこれらの疾病を悪化させ進行させる主要
なかつ重要な理由であるということが示されているからである。
【００１０】 感染により誘導される又は非感染的に発生する炎症は急性又は慢性呼吸疾病の
治療のための主要な標的となりつつあるので、前記肺炎症の存在及び重症度を評
価するための、及び肺疾病の進行中の組織破壊活性相を同定するための診断材料
及び道具についての要求が増大しており、ヒト及び動物の両方における肺疾病予
防、診断及び治療のための分野において深刻な要請がある。末梢血は循環してい
る媒介因子、特に細胞外タンパク質及びサイトカインを測定することによってこ
の目的のために用いられている。いくつかの媒介因子は尿から測定されている。
一般的に血清及び尿における循環炎症性媒介因子が慢性炎症肺疾病の活性及び／
又は不活性相を特異的に区別することができるのかどうかは不明であるし、どの
ようにして区別することができるのかについても不明である。
治療のための主要な標的となりつつあるので、前記肺炎症の存在及び重症度を評
価するための、及び肺疾病の進行中の組織破壊活性相を同定するための診断材料
及び道具についての要求が増大しており、ヒト及び動物の両方における肺疾病予
防、診断及び治療のための分野において深刻な要請がある。末梢血は循環してい
る媒介因子、特に細胞外タンパク質及びサイトカインを測定することによってこ
の目的のために用いられている。いくつかの媒介因子は尿から測定されている。
一般的に血清及び尿における循環炎症性媒介因子が慢性炎症肺疾病の活性及び／
又は不活性相を特異的に区別することができるのかどうかは不明であるし、どの
ようにして区別することができるのかについても不明である。
【００１１】 最近、高張性塩水で誘導される痰からいくつかの炎症性媒介因子（例えばイン
ターロイキン）及び顆粒タンパク質（例えば細胞外タンパク質）を測定するため
のアッセイが導入されている。誘導された痰中に存在する炎症性細胞及び前記炎
症性細胞中の細胞マーカーの測定が有用であり得るということも示唆されている
。最後に、吐き出された空気の濃縮物からの反応性酸素種又はサイトカイン（Ｈ ２ Ｏ２、リューコトリエンス、吐き出されたＮＯ及びＩＬ−５）の如き炎症性媒
介因子は評価の対象となっている。
ターロイキン）及び顆粒タンパク質（例えば細胞外タンパク質）を測定するため
のアッセイが導入されている。誘導された痰中に存在する炎症性細胞及び前記炎
症性細胞中の細胞マーカーの測定が有用であり得るということも示唆されている
。最後に、吐き出された空気の濃縮物からの反応性酸素種又はサイトカイン（Ｈ ２ Ｏ２、リューコトリエンス、吐き出されたＮＯ及びＩＬ−５）の如き炎症性媒
介因子は評価の対象となっている。
【００１２】 喘息及び慢性気管支炎にかかっている患者の痰中のマトリックスメタロプロテ
イナーゼ（ＭＭＰ）とマトリックスメタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭ
Ｐ）の間の不均衡と気流制限の間の相関関係がVignola, A.M., 等によって示唆
されている（Am. J. Resp. Crit. Med., 158(6): 1945-1950, 1998）。ＭＭ−９
又は他のＭＭＰの活性型が示されなかったという事実は彼らの患者の気道におけ
る進行中の活性及び組織破壊相の欠如を示しているようにみえる。肺結合及び柔
組織並びに基底膜の酵素的分解を伴う慢性肺疾病の活性及び組織破壊相は様々な
構造的及び機能的変化の原因であり、重度の機能的疾病及び／又は機能不全を伴
う肺炎症の構造の不可逆的変化の最も代表的な特徴である。肺柔結合組織及び基
底膜における損傷は肺における炎症の主要な合併症である。かかる炎症並びに組
織及び基底膜損傷は気管支拡張症、慢性閉塞肺疾病、喘息及び他の呼吸疾病の如
き多くの肺炎症疾病における病理学的変化に例えば寄与する。
イナーゼ（ＭＭＰ）とマトリックスメタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭ
Ｐ）の間の不均衡と気流制限の間の相関関係がVignola, A.M., 等によって示唆
されている（Am. J. Resp. Crit. Med., 158(6): 1945-1950, 1998）。ＭＭ−９
又は他のＭＭＰの活性型が示されなかったという事実は彼らの患者の気道におけ
る進行中の活性及び組織破壊相の欠如を示しているようにみえる。肺結合及び柔
組織並びに基底膜の酵素的分解を伴う慢性肺疾病の活性及び組織破壊相は様々な
構造的及び機能的変化の原因であり、重度の機能的疾病及び／又は機能不全を伴
う肺炎症の構造の不可逆的変化の最も代表的な特徴である。肺柔結合組織及び基
底膜における損傷は肺における炎症の主要な合併症である。かかる炎症並びに組
織及び基底膜損傷は気管支拡張症、慢性閉塞肺疾病、喘息及び他の呼吸疾病の如
き多くの肺炎症疾病における病理学的変化に例えば寄与する。
【００１３】 様々な哺乳類の疾病の組織及び基底膜破壊過程におけるＭＭＰ及びＭＭＰ−Ｒ
Ｍの重要な役割のため、活性破壊疾病過程の部位で病理学的に増大されて活性化
されたＭＭＰを阻害及び／又はダウンレギュレートするためのＭＭＰ阻害剤の開
発にかなりの努力が集中されている。肺及び気道疾病の活性及び組織破壊相、及
び気道における炎症性及び組織破壊活性の重症度を評価して同定するための、並
びに肺疾病過程の進行中の活性相を同定するための方法及びテストキットの必要
性についてはほとんど注意が払われていない。また、薬物療法の効果は十分なテ
ストに基づく追跡を必要とする。今までのところ、気道における慢性的及び／又
は感染によって誘導された急性炎症の重症度及び活性組織破壊相を機械的作業に
よって決定して評価することを可能にする成功した迅速で信頼できるチェアサイ
ド方法及び／又はテストキットは開発されていない。
Ｍの重要な役割のため、活性破壊疾病過程の部位で病理学的に増大されて活性化
されたＭＭＰを阻害及び／又はダウンレギュレートするためのＭＭＰ阻害剤の開
発にかなりの努力が集中されている。肺及び気道疾病の活性及び組織破壊相、及
び気道における炎症性及び組織破壊活性の重症度を評価して同定するための、並
びに肺疾病過程の進行中の活性相を同定するための方法及びテストキットの必要
性についてはほとんど注意が払われていない。また、薬物療法の効果は十分なテ
ストに基づく追跡を必要とする。今までのところ、気道における慢性的及び／又
は感染によって誘導された急性炎症の重症度及び活性組織破壊相を機械的作業に
よって決定して評価することを可能にする成功した迅速で信頼できるチェアサイ
ド方法及び／又はテストキットは開発されていない。
【００１４】 しかし、肺疾病の開業医、獣医及び前記分野で働いている他の人々は彼らの日
々の仕事において多数の診断上の問題に遭遇しており、これに対して正確で迅速
で容易に利用できるチェアサイド又はベッドサイド方法及びオンフィールドテス
トキットが緊急に必要とされている。
々の仕事において多数の診断上の問題に遭遇しており、これに対して正確で迅速
で容易に利用できるチェアサイド又はベッドサイド方法及びオンフィールドテス
トキットが緊急に必要とされている。
【００１５】 患者が病院の医師又は獣医師の診察室に、診療所に、個人の応接室に、又は動
物収容所にいる場合には、又は現地状況下にある場合には、肺の全部又は一部の
状況の臨床像を与える偏りのないテストシステムを用いて呼吸系における炎症の
重症度及び疾病活性の相を正確に評価することができることが望ましいだろう。
呼吸系の病気にかかった部分と健康な影響を受けていない呼吸系とを区別するこ
とができることが有利であり、慢性又は初期活性相機能的及び破壊的欠損が開始
する前に気道炎症性疾病又は感染の初期段階を検出することが特に重要である。
他の種類の薬物療法又は治療モダリティーを含む医療治療の効果を追跡すること
、即ち選択された治療法及び選択された医薬治療の量が有効で適切かどうか調べ
ることも望ましいであろう。炎症の重症度を示す偏りのないテスト結果は治療費
用の一層正確な予測をも可能にし、特に獣医学で扱う動物においては治療の経済
的採算性を選択することをも可能にする。
物収容所にいる場合には、又は現地状況下にある場合には、肺の全部又は一部の
状況の臨床像を与える偏りのないテストシステムを用いて呼吸系における炎症の
重症度及び疾病活性の相を正確に評価することができることが望ましいだろう。
呼吸系の病気にかかった部分と健康な影響を受けていない呼吸系とを区別するこ
とができることが有利であり、慢性又は初期活性相機能的及び破壊的欠損が開始
する前に気道炎症性疾病又は感染の初期段階を検出することが特に重要である。
他の種類の薬物療法又は治療モダリティーを含む医療治療の効果を追跡すること
、即ち選択された治療法及び選択された医薬治療の量が有効で適切かどうか調べ
ることも望ましいであろう。炎症の重症度を示す偏りのないテスト結果は治療費
用の一層正確な予測をも可能にし、特に獣医学で扱う動物においては治療の経済
的採算性を選択することをも可能にする。
【００１６】 環境汚染、特に大気汚染の増大のため、及びアレルゲンの発生の増大のため、
天然の攻撃又は個体（単数又は複数）の環境における他の気道刺激物質が気道に
おいて炎症を引き起こすかどうか決定するための、又はアレルゲン又は他の気道
刺激物質での実験的攻撃が気道における炎症を引き起こすかどうかを決定するた
めの容易なモニター及びスクリーニング方法及びそのためのツールに対する多大
な要請がある。更に、推測される攻撃、気道刺激、炎症性及び感染誘導及び／又
は感染の原因となる物質の除去が気道から疾病を除去するのかどうかを評価する
ことができることが有利であろう。感染、アレルギー又は他の刺激要因の場合は
アレルギーの結果を追跡すること、即ち感染性物質、食物又は他の環境変化の除
去も炎症反応及び気道からの応答を除去するのかどうか調査すること、及びアト
ピー性固体が例えばウマ、イヌ又はトリに対して耐えることができるかどうかを
評価することが望ましい。
天然の攻撃又は個体（単数又は複数）の環境における他の気道刺激物質が気道に
おいて炎症を引き起こすかどうか決定するための、又はアレルゲン又は他の気道
刺激物質での実験的攻撃が気道における炎症を引き起こすかどうかを決定するた
めの容易なモニター及びスクリーニング方法及びそのためのツールに対する多大
な要請がある。更に、推測される攻撃、気道刺激、炎症性及び感染誘導及び／又
は感染の原因となる物質の除去が気道から疾病を除去するのかどうかを評価する
ことができることが有利であろう。感染、アレルギー又は他の刺激要因の場合は
アレルギーの結果を追跡すること、即ち感染性物質、食物又は他の環境変化の除
去も炎症反応及び気道からの応答を除去するのかどうか調査すること、及びアト
ピー性固体が例えばウマ、イヌ又はトリに対して耐えることができるかどうかを
評価することが望ましい。
【００１７】 かび又は他の気道刺激又は炎症誘導物質で汚染された家はその家の住人及びそ
の家で働いている人々に対して刺激を引き起こす。かび又は他の気道刺激又は炎
症誘導物質で汚染された家がヒト及び動物にとって住むのに好適かどうか演繹す
る可能性は有利であろう。もし消毒前後の場所における住人の気道の反応を測定
することによって汚染物質の有害効果を評価することができれば特に有利であろ
う。
の家で働いている人々に対して刺激を引き起こす。かび又は他の気道刺激又は炎
症誘導物質で汚染された家がヒト及び動物にとって住むのに好適かどうか演繹す
る可能性は有利であろう。もし消毒前後の場所における住人の気道の反応を測定
することによって汚染物質の有害効果を評価することができれば特に有利であろ
う。
【００１８】 医師又は獣医師にとっては動物収容所内の動物及び動物収容所で働いている人
々にとって動物収容所の好適さを決定することができることは重要である。これ
は小さい空気空間及び不十分な換気しか有しない収容所にとっては特に重要であ
る。現地状況で用いることができる方法及びツールは動物輸送用乗物及び動物の
ために用いられる施設における気道刺激又は炎症誘導状況についての標準の開発
を可能にし、及びその標準が追跡されるようコントロールすることを可能にする
であろう。それは不適当な状況によって引き起こされる損傷の評価をも可能にす
るであろう。
々にとって動物収容所の好適さを決定することができることは重要である。これ
は小さい空気空間及び不十分な換気しか有しない収容所にとっては特に重要であ
る。現地状況で用いることができる方法及びツールは動物輸送用乗物及び動物の
ために用いられる施設における気道刺激又は炎症誘導状況についての標準の開発
を可能にし、及びその標準が追跡されるようコントロールすることを可能にする
であろう。それは不適当な状況によって引き起こされる損傷の評価をも可能にす
るであろう。
【００１９】 現在では医師又は獣医師はある個人又は競走馬が物理的ストレスに暴露するこ
とができるかどうかを決定する必要がしばしばある。かかる状況ではその個人が
運動に参加することが許可されるかどうかを評価し、そして運動に参加した場合
の健康上の危険性を評価するための、及び競走又は競技用動物が軽度の気道炎症
にかかっているかどうかを評価するための偏りのない多かれ少なかれ科学的に信
頼できるツールを有することは有利であるだろう。
とができるかどうかを決定する必要がしばしばある。かかる状況ではその個人が
運動に参加することが許可されるかどうかを評価し、そして運動に参加した場合
の健康上の危険性を評価するための、及び競走又は競技用動物が軽度の気道炎症
にかかっているかどうかを評価するための偏りのない多かれ少なかれ科学的に信
頼できるツールを有することは有利であるだろう。
【００２０】 上述したのはしばしば遭遇される問題のある状況のいくつかの非限定的例であ
る。これに対しては案内して確認する返答がしばしば緊急に必要とされているも
のの、適切な簡単な解決を今だに欠いている。上述の状況において評価するため
の効果的で迅速なオンフィールド、チェアサイド又はベッドサイド評価を行うた
めの合理的で容易に利用できるテストキット及び方法の欠如は医学及び獣医学専
門家にとっては深刻な障害である。
る。これに対しては案内して確認する返答がしばしば緊急に必要とされているも
のの、適切な簡単な解決を今だに欠いている。上述の状況において評価するため
の効果的で迅速なオンフィールド、チェアサイド又はベッドサイド評価を行うた
めの合理的で容易に利用できるテストキット及び方法の欠如は医学及び獣医学専
門家にとっては深刻な障害である。
【００２１】 呼吸疾病を診断するための従来方法は急性炎症が重度の慢性過程に変化して結
果として組織損傷をもたらす危険性を示すことについてはいずれも十分に満足で
きるものではない。肺機能テストはすべての種類及び相の肺疾病を検出すること
を可能にするわけではない。臨床上の観察は十分に信頼できるものではない。放
射線写真評価は詳細な臨床上の観察及び肺機能テストと組み合わせる必要がある
。気道からのバイオプシーの形態学的研究はあまりにも小さく局所的であるため
、肺の全部又は一部における状況の明確な臨床像を与えることができない。
果として組織損傷をもたらす危険性を示すことについてはいずれも十分に満足で
きるものではない。肺機能テストはすべての種類及び相の肺疾病を検出すること
を可能にするわけではない。臨床上の観察は十分に信頼できるものではない。放
射線写真評価は詳細な臨床上の観察及び肺機能テストと組み合わせる必要がある
。気道からのバイオプシーの形態学的研究はあまりにも小さく局所的であるため
、肺の全部又は一部における状況の明確な臨床像を与えることができない。
【００２２】 破損生成物に基づく診断も満足できるものではなかった。というのは破損生成
物の存在は迅速な代謝回転又はコラーゲンの合成を示しているかもしれず、必ず
しもその分解を示さないからである。炎症性媒介因子は研究されているが、十分
に迅速で特異的なテストは設計されていない。いくつかのホスト又は細菌／微生
物由来の酵素活性に基づくテストは開発されているが、それらは幅広い基質特異
性のため特異的ではない。
物の存在は迅速な代謝回転又はコラーゲンの合成を示しているかもしれず、必ず
しもその分解を示さないからである。炎症性媒介因子は研究されているが、十分
に迅速で特異的なテストは設計されていない。いくつかのホスト又は細菌／微生
物由来の酵素活性に基づくテストは開発されているが、それらは幅広い基質特異
性のため特異的ではない。
【００２３】 結果として組織損傷を伴う重度の気道疾病は様々な炎症性媒介因子を生産する
ことが知られている好中球の如き特定細胞と関連している。これらのいくつかは
疾病活性の評価における生化学的／免疫学的マーカーとして示唆されている。
ことが知られている好中球の如き特定細胞と関連している。これらのいくつかは
疾病活性の評価における生化学的／免疫学的マーカーとして示唆されている。
【００２４】 マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）及び／又は関連分子（ＭＭＰ−
ＲＭ）を含むタンパク質分解酵素、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ及びセリンプロ
テイナーゼの評価は気道炎症の存在及び重症度を評価するために示唆されている
。しかし、酵素の基質特異性の幅広さのため、示唆された方法のいずれも一種以
上のＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭを十分に正確で特異的で迅速な方法で測定し
て気道炎症の重症度を診断するための信頼できるツールを提供することができな
い。酵素的方法は異なるＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭ活性を区別する能力に欠
ける。それ故、一種以上のＭＭＰ及び／又ＭＭＰ−ＲＭについて特異的な方法は
肺疾病活性に関連して組織破壊現象の過程を扱うのに最適であるだろう。本発明
者はウエスタンブロッティングの結果に基づき特定のコラゲナーゼ又はゼラチナ
ーゼと気道疾病の重症度の間の相関関係を示している。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ニト
ロセルロースに移され、ラベルされたポリクローナル抗体で免疫染色することに
より、特異的酵素が同定され、肺疾病の重症度との相関関係を示した。しかし、
これらの方法は手間がかかりすぎ時間もかかるので日常的な研究室での作業にお
いて用いることができない。更に、迅速なチェアサイドテストが電気泳動に基づ
いてなしうるとは考えにくい。
ＲＭ）を含むタンパク質分解酵素、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ及びセリンプロ
テイナーゼの評価は気道炎症の存在及び重症度を評価するために示唆されている
。しかし、酵素の基質特異性の幅広さのため、示唆された方法のいずれも一種以
上のＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭを十分に正確で特異的で迅速な方法で測定し
て気道炎症の重症度を診断するための信頼できるツールを提供することができな
い。酵素的方法は異なるＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭ活性を区別する能力に欠
ける。それ故、一種以上のＭＭＰ及び／又ＭＭＰ−ＲＭについて特異的な方法は
肺疾病活性に関連して組織破壊現象の過程を扱うのに最適であるだろう。本発明
者はウエスタンブロッティングの結果に基づき特定のコラゲナーゼ又はゼラチナ
ーゼと気道疾病の重症度の間の相関関係を示している。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ニト
ロセルロースに移され、ラベルされたポリクローナル抗体で免疫染色することに
より、特異的酵素が同定され、肺疾病の重症度との相関関係を示した。しかし、
これらの方法は手間がかかりすぎ時間もかかるので日常的な研究室での作業にお
いて用いることができない。更に、迅速なチェアサイドテストが電気泳動に基づ
いてなしうるとは考えにくい。
【００２５】 従って、一種以上のＭＭＰ及び／又は関連分子（ＭＭＰ−ＲＭ）の特異的測定
に基づく気道疾病の重症度を評価する方法については許容可能な方法は今までの
ところ開発されていない。コラゲナーゼを測定するための生化学的方法は多く存
在するが、それらのいずれも信頼できる迅速なチェアサイドテストを設計するの
に十分である（これは成功するテストキットのための先行条件である）とは証明
されていない。ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ及び上述した他の方法の
如き免疫学的方法は高価な装置及び設備を必要とする。それらは時間がかかる上
、行いにくい。従ってそれらは信頼できる簡単で迅速なチェアサイドテストを提
供しない。
に基づく気道疾病の重症度を評価する方法については許容可能な方法は今までの
ところ開発されていない。コラゲナーゼを測定するための生化学的方法は多く存
在するが、それらのいずれも信頼できる迅速なチェアサイドテストを設計するの
に十分である（これは成功するテストキットのための先行条件である）とは証明
されていない。ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ及び上述した他の方法の
如き免疫学的方法は高価な装置及び設備を必要とする。それらは時間がかかる上
、行いにくい。従ってそれらは信頼できる簡単で迅速なチェアサイドテストを提
供しない。
【００２６】 上述の通り、ＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭは結合組織破壊と直接関連してお
り、進行性気道疾病の特異的で敏感な生化学的指標として役立つにちがいない。
気道分泌サンプルからポリクローナル抗ＭＭＰ及び／又は抗ＭＭＰ−ＲＭ抗体を
用いて行われたウエスタンブロットのデータは気道疾病の存在と重症度を最小の
偽陽性及び偽陰性結果を伴って示す。しかし、ポリクローナル抗ＭＭＰ又はＭＭ
Ｐ−ＲＭ抗体は十分特異的でない。それ故、ＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭを同
定する特異的なモノクローナル抗体を利用したテストが肺疾病の活性を決定する
ためには最適であり、上述した問題を克服するであろう。基質特異性の幅広さの
ため、酵素的決定は異なるＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭを区別しない。従って
酵素的テストを用いることは好適でない。酵素的テストは時間がかかり、研究室
の設備を必要とする。歯周炎を診断するために開発されたゼラチンテストスティ
ックでさえも少なくとも半時間の目的達成時間を必要とする。
り、進行性気道疾病の特異的で敏感な生化学的指標として役立つにちがいない。
気道分泌サンプルからポリクローナル抗ＭＭＰ及び／又は抗ＭＭＰ−ＲＭ抗体を
用いて行われたウエスタンブロットのデータは気道疾病の存在と重症度を最小の
偽陽性及び偽陰性結果を伴って示す。しかし、ポリクローナル抗ＭＭＰ又はＭＭ
Ｐ−ＲＭ抗体は十分特異的でない。それ故、ＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭを同
定する特異的なモノクローナル抗体を利用したテストが肺疾病の活性を決定する
ためには最適であり、上述した問題を克服するであろう。基質特異性の幅広さの
ため、酵素的決定は異なるＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭを区別しない。従って
酵素的テストを用いることは好適でない。酵素的テストは時間がかかり、研究室
の設備を必要とする。歯周炎を診断するために開発されたゼラチンテストスティ
ックでさえも少なくとも半時間の目的達成時間を必要とする。
【００２７】 本発明は免疫化学的方法及びテストキットを提供することによってこれらの問
題に対する解決を提供する。これらの方法及びテストキットは十分に特異的かつ
迅速であり、加えて同一サンプルからいくつかのＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭ
を連続的に又は同時に測定することができ、ヒト並びに動物の気道における炎症
性及び疾病活性状況の効果的で迅速な評価を可能にする。本発明の方法及びテス
トキットはマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）及びマトリックスメタ
ロプロテイナーゼ関連分子（ＭＭＰ−ＲＭ）の潜在型と活性型の両方を含む総Ｍ
ＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭの増大したレベルとして測定されるＭＭＰ及び／又
はＭＭＰ−ＲＭと上記炎症性及び疾病活性状況の間に特に関連があるという事実
に基づいている。特にそれらの活性型は炎症レベル、炎症の重症度及び特に気道
における活性疾病相を反映している。
題に対する解決を提供する。これらの方法及びテストキットは十分に特異的かつ
迅速であり、加えて同一サンプルからいくつかのＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭ
を連続的に又は同時に測定することができ、ヒト並びに動物の気道における炎症
性及び疾病活性状況の効果的で迅速な評価を可能にする。本発明の方法及びテス
トキットはマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）及びマトリックスメタ
ロプロテイナーゼ関連分子（ＭＭＰ−ＲＭ）の潜在型と活性型の両方を含む総Ｍ
ＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭの増大したレベルとして測定されるＭＭＰ及び／又
はＭＭＰ−ＲＭと上記炎症性及び疾病活性状況の間に特に関連があるという事実
に基づいている。特にそれらの活性型は炎症レベル、炎症の重症度及び特に気道
における活性疾病相を反映している。
【００２８】 また、いくつかの種類のＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭは特定の呼吸疾病を評
価することについて他のものよりも一層特異的であること、及びヒト及び動物の
様々な呼吸疾病を診断する場合の特異性及び選択性にいくらか差異があるという
ことが示されている。従って本発明の目的は呼吸疾病の間に放出される潜在型及
び活性型ＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭ分子のカスケードを同時に又は種類ごと
に評価し、特異的な診断目的のために最適かつ最も有効なＭＭＰ及び／又はＭＭ
Ｐ−ＲＭを選択する方法及びそのためのキットを提供することである。特に、テ
ストは前記疾病の活性相を診断することを目標とする。
価することについて他のものよりも一層特異的であること、及びヒト及び動物の
様々な呼吸疾病を診断する場合の特異性及び選択性にいくらか差異があるという
ことが示されている。従って本発明の目的は呼吸疾病の間に放出される潜在型及
び活性型ＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭ分子のカスケードを同時に又は種類ごと
に評価し、特異的な診断目的のために最適かつ最も有効なＭＭＰ及び／又はＭＭ
Ｐ−ＲＭを選択する方法及びそのためのキットを提供することである。特に、テ
ストは前記疾病の活性相を診断することを目標とする。
【００２９】 本発明は治療の種類及び必要な治療の効力（regimen）を評価するための極め
て有効な診断ツールを提供する。本発明の方法及びキットは気道炎症の重症度及
び疾病活性の相を評価するための診断ツールをも提供する。同時に前記方法及び
テストキットは追跡研究のための、及び治療、薬物療法又は治療モダリティーの
効力をモニターするための、並びに得られた薬物療法の用量−治療応答をモニタ
ーするための有効な手段を提供する。
て有効な診断ツールを提供する。本発明の方法及びキットは気道炎症の重症度及
び疾病活性の相を評価するための診断ツールをも提供する。同時に前記方法及び
テストキットは追跡研究のための、及び治療、薬物療法又は治療モダリティーの
効力をモニターするための、並びに得られた薬物療法の用量−治療応答をモニタ
ーするための有効な手段を提供する。
【００３０】 従って、本発明の目的は初期診断及び予防的治療のための方法及びテストキッ
トを含むシステム及びツールを提供すること；他の薬物療法を含む薬物療法の効
果及び治療の効力を追跡するためのシステム及びツールを提供すること；特に容
易で迅速なチェア又はベッドサイド診断のためのシステム及びツールを提供する
こと；前記肺疾病の活性組織破壊相を診断すること；主要な治療モダリティー及
び薬物療法のタイミング、用量及び効力を評価すること；慢性的機能変化を予防
するための気道炎症の初期診断を提供すること；呼吸系全体における又は呼吸系
の病気の部分における炎症のレベル及び疾病活性の相を評価すること；疾病にか
かっていない呼吸系又は呼吸系の疾病にかかっていない部分の健康を評価するこ
と；気道組織のどの部分が疾病にかかっているかを評価すること；薬物治療及び
薬物療法の効果を追跡すること、即ち選択された治療モダリティー又は治療法が
有効かどうかチェックすること；選択された薬物治療、薬物療法及び治療モダリ
ティーの用量が有効かどうか追跡すること；選択された医薬の用量が適切である
かどうか追跡すること；ある個人が運動をすることができるかどうかを評価する
方法を開発すること；アレルゲン又は他の気道刺激物質に対する実験的攻撃が気
道において炎症を引き起こすかどうか評価する方法を開発すること；個人の環境
における自然の攻撃が気道において炎症を引き起こすかどうか評価する方法を開
発すること；可能性のある攻撃物質（これは非感染源のもの又は感染源のもので
あることができる）の除去が気道から炎症を除去するかどうかを評価すること；
ある動物収容所がこの動物収容所の動物又はこの動物収容所で働く人々の気道に
とって好適であるかどうかを評価すること；かび又は他の気道刺激性又は炎症誘
導性物質で汚染された家がその家の住人に刺激を引き起こすかどうかを決定する
こと；気道刺激性又は炎症誘導性物質の除去が気道から炎症を除去するかどうか
をテストする方法を開発すること；気道を刺激する又は炎症を誘導する状況に動
物を保持する／保持したことによって引き起こされる重症度を評価すること；炎
症及び／又は疾病の徴候を表している競技者／競技用動物が競走又はゲームに参
加する能力を評価するための医師及び／又は獣医師用ツールを開発することであ
る。
トを含むシステム及びツールを提供すること；他の薬物療法を含む薬物療法の効
果及び治療の効力を追跡するためのシステム及びツールを提供すること；特に容
易で迅速なチェア又はベッドサイド診断のためのシステム及びツールを提供する
こと；前記肺疾病の活性組織破壊相を診断すること；主要な治療モダリティー及
び薬物療法のタイミング、用量及び効力を評価すること；慢性的機能変化を予防
するための気道炎症の初期診断を提供すること；呼吸系全体における又は呼吸系
の病気の部分における炎症のレベル及び疾病活性の相を評価すること；疾病にか
かっていない呼吸系又は呼吸系の疾病にかかっていない部分の健康を評価するこ
と；気道組織のどの部分が疾病にかかっているかを評価すること；薬物治療及び
薬物療法の効果を追跡すること、即ち選択された治療モダリティー又は治療法が
有効かどうかチェックすること；選択された薬物治療、薬物療法及び治療モダリ
ティーの用量が有効かどうか追跡すること；選択された医薬の用量が適切である
かどうか追跡すること；ある個人が運動をすることができるかどうかを評価する
方法を開発すること；アレルゲン又は他の気道刺激物質に対する実験的攻撃が気
道において炎症を引き起こすかどうか評価する方法を開発すること；個人の環境
における自然の攻撃が気道において炎症を引き起こすかどうか評価する方法を開
発すること；可能性のある攻撃物質（これは非感染源のもの又は感染源のもので
あることができる）の除去が気道から炎症を除去するかどうかを評価すること；
ある動物収容所がこの動物収容所の動物又はこの動物収容所で働く人々の気道に
とって好適であるかどうかを評価すること；かび又は他の気道刺激性又は炎症誘
導性物質で汚染された家がその家の住人に刺激を引き起こすかどうかを決定する
こと；気道刺激性又は炎症誘導性物質の除去が気道から炎症を除去するかどうか
をテストする方法を開発すること；気道を刺激する又は炎症を誘導する状況に動
物を保持する／保持したことによって引き起こされる重症度を評価すること；炎
症及び／又は疾病の徴候を表している競技者／競技用動物が競走又はゲームに参
加する能力を評価するための医師及び／又は獣医師用ツールを開発することであ
る。
【００３１】 しかし特に本発明の主目的は一以上のテストストリップを用いて一種以上のＭ
ＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭを同一サンプルから測定する及び／又は区別するこ
とができしかも容易に利用できるオンフィールド及び／又はチェアサイド又はベ
ッドサイドツールとして使用することができるテストキット及び免疫化学的方法
を提供することである。これらのテストキット及び方法は診察専門の医療又は獣
医学専門家が健康センター内の彼らの事務所、診療所及び病院で並びにオンフィ
ールドの獣医学的診断のために気道疾病の重症度、必要な治療、用量効果を診断
するために並びに様々な疾病を区別するために用いられる。最後に、このテスト
は例えば医師にかかっている喘息患者による自己診断用に用いることができる。
ＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭを同一サンプルから測定する及び／又は区別するこ
とができしかも容易に利用できるオンフィールド及び／又はチェアサイド又はベ
ッドサイドツールとして使用することができるテストキット及び免疫化学的方法
を提供することである。これらのテストキット及び方法は診察専門の医療又は獣
医学専門家が健康センター内の彼らの事務所、診療所及び病院で並びにオンフィ
ールドの獣医学的診断のために気道疾病の重症度、必要な治療、用量効果を診断
するために並びに様々な疾病を区別するために用いられる。最後に、このテスト
は例えば医師にかかっている喘息患者による自己診断用に用いることができる。
【００３２】 発明の概要 本発明の方法及びテストキットの特徴は本発明の特許請求の範囲に規定される
通りである。
通りである。
【００３３】 図面の簡単な説明 図１は健康なコントロールと比較した気管支喘息患者の誘導された痰のＭＭＰ
−９のウエスタンブロットの濃度測定走査分析の図を示す。
−９のウエスタンブロットの濃度測定走査分析の図を示す。
【００３４】 図２は健康なコントロールと比較した様々な度合いの喘息患者又は喘息が治療
された患者のＢＡＬ液のＭＭＰ−９のウエスタンブロットの濃度測定走査分析の
図を示す。
された患者のＢＡＬ液のＭＭＰ−９のウエスタンブロットの濃度測定走査分析の
図を示す。
【００３５】 図３は健康なコントロールと比較した気管支炎患者及び慢性閉塞肺疾病（ＣＯ
ＰＤ）患者のＢＡＬ液のＭＭＰ−９のウエスタンブロットの濃度測定走査分析の
図を示す。
ＰＤ）患者のＢＡＬ液のＭＭＰ−９のウエスタンブロットの濃度測定走査分析の
図を示す。
【００３６】 図４は健康なコントロールと比較した気管支喘息患者の誘導された痰のＭＭＰ
−８のウエスタンブロットの濃度測定走査分析の図を示す。
−８のウエスタンブロットの濃度測定走査分析の図を示す。
【００３７】 図５は健康なコントロールと比較した気管支拡張症患者の誘導された痰のＭＭ
Ｐ−８のウエスタンブロットの濃度測定走査分析の図を示す。
Ｐ−８のウエスタンブロットの濃度測定走査分析の図を示す。
【００３８】 図６は健康なコントロールと比較した治療前後の気管支喘息患者のＢＡＬ液の
ＭＭＰ−８のウエスタンブロットの濃度測定走査分析の図を示す。
ＭＭＰ−８のウエスタンブロットの濃度測定走査分析の図を示す。
【００３９】 図７は健康なコントロールと比較した気管支拡張症患者のＢＡＬ液のＭＭＰ−
８のウエスタンブロットの濃度測定走査分析の図を示す。
８のウエスタンブロットの濃度測定走査分析の図を示す。
【００４０】 図８はコントロールに対して気管支拡張症患者及び喘息患者で見られた、ＭＭ
Ｐ−８特異的モノクローナル抗体を利用したＩＦＭＡアッセイによって測定され
たＭＭＰ−８量の増大の図を示す。
Ｐ−８特異的モノクローナル抗体を利用したＩＦＭＡアッセイによって測定され
たＭＭＰ−８量の増大の図を示す。
【００４１】 図９は陽性のＭＭＰ−８浸漬スティック結果がＭＭＰ−８ ＩＦＭＡ値の増大
と強く関連していることを示す。ＭＭＰ−８浸漬スティック陽性被験者の大部分
は気管支拡張症又は喘息の活性相を有する。
と強く関連していることを示す。ＭＭＰ−８浸漬スティック陽性被験者の大部分
は気管支拡張症又は喘息の活性相を有する。
【００４２】 図１０は健康なコントロールに対する気管支喘息患者、ＣＯＰＤ患者及び気管
支拡張症患者のＢＡＬ液サンプルからＩＦＭＡによって得られた増大したＭＭＰ
−８濃度（μｇ／ｌ）を示す。
支拡張症患者のＢＡＬ液サンプルからＩＦＭＡによって得られた増大したＭＭＰ
−８濃度（μｇ／ｌ）を示す。
【００４３】 図１１は健康なコントロールと比較した気管支喘息患者及び気管支拡張症患者
の誘導された痰のＭＭＰ−１３のウエスタンブロットの濃度測定走査分析の図を
示す。
の誘導された痰のＭＭＰ−１３のウエスタンブロットの濃度測定走査分析の図を
示す。
【００４４】 図１２は健康なコントロールと比較した気管支拡張症患者の誘導された痰のＭ
ＭＰ−１３のウエスタンブロットの濃度測定走査分析の図を示す。
ＭＰ−１３のウエスタンブロットの濃度測定走査分析の図を示す。
【００４５】 図１３はＭＴ１−ＭＭＰ用の定量的ウエスタンブロッティングを用いて分析さ
れた誘導された痰サンプルから得られた結果の図を示す。気管支喘息患者からの
誘導された痰サンプルではＭＴ１−ＭＭＰ免疫反応性の増大が見出された。
れた誘導された痰サンプルから得られた結果の図を示す。気管支喘息患者からの
誘導された痰サンプルではＭＴ１−ＭＭＰ免疫反応性の増大が見出された。
【００４６】 図１４はＮＧＡＬ用の定量的ウエスタンブロッティングを用いて分析された誘
導された痰サンプルから得られた結果を表す図を示す。
導された痰サンプルから得られた結果を表す図を示す。
【００４７】 図１５は健康なウマ及びＣＯＰＤにかかっているウマにおけるＴＥＬＦのゼラ
チン分解活性（平均＋／−ｓｄ）を表す図を示す。すべての活性が有意に増大す
る。活性生成物はＣＯＰＤウマの気道分泌物のみにおいて検出される。
チン分解活性（平均＋／−ｓｄ）を表す図を示す。すべての活性が有意に増大す
る。活性生成物はＣＯＰＤウマの気道分泌物のみにおいて検出される。
【００４８】 図１６はウエスタンブロットを走査することによって評価される通り健康なウ
マとＣＯＰＤにかかっているウマの気管上皮裏打ち液（ＴＥＬＦ）中のＭＭＰ−
９量の濃度測定走査分析の図を示す。
マとＣＯＰＤにかかっているウマの気管上皮裏打ち液（ＴＥＬＦ）中のＭＭＰ−
９量の濃度測定走査分析の図を示す。
【００４９】 図１７はウエスタンブロットを走査することによって評価される通り健康なウ
マとＣＯＰＤにかかっているウマの気管洗浄液中のＭＭＰ−９量の濃度測定走査
分析の図を示す。
マとＣＯＰＤにかかっているウマの気管洗浄液中のＭＭＰ−９量の濃度測定走査
分析の図を示す。
【００５０】 図１８は健康なウマ及びＣＯＰＤにかかっているウマの細胞不含有ＢＡＬ液中
のＭＭＰ−９量を表す図を示す。
のＭＭＰ−９量を表す図を示す。
【００５１】 図１９はウエスタンブロットを走査することによって評価される通り健康なウ
マとＣＯＰＤにかかっているウマの気管上皮裏打ち液（ＴＥＬＦ）中のＭＭＰ−
８量（平均±ＳＤ）を表す図を示す。
マとＣＯＰＤにかかっているウマの気管上皮裏打ち液（ＴＥＬＦ）中のＭＭＰ−
８量（平均±ＳＤ）を表す図を示す。
【００５２】 図２０はウエスタンブロットを走査することによって評価される通り健康なウ
マとＣＯＰＤにかかっているウマの気管上皮裏打ち液（ＴＥＬＦ）中のＭＭＰ−
１３量（平均±ＳＤ）を表す図を示す。
マとＣＯＰＤにかかっているウマの気管上皮裏打ち液（ＴＥＬＦ）中のＭＭＰ−
１３量（平均±ＳＤ）を表す図を示す。
【００５３】 発明の詳細な記述 定義 本発明において用いられる用語は人医学及び獣医学及び診断の分野において、
特にチェアサイド又はベッドサイド診断並びに免疫化学においてこれらの用語が
一般的に有する意味を有する。しかし、いくつかの用語はこの発明においてはい
くらか偏った又は広い意味で用いられる。従って不明瞭な意味の用語によって引
き起こされる不確実さを回避するため、この明細書及び特許請求の範囲において
用いられる用語のいくつかは以下でより詳細に規定される。
特にチェアサイド又はベッドサイド診断並びに免疫化学においてこれらの用語が
一般的に有する意味を有する。しかし、いくつかの用語はこの発明においてはい
くらか偏った又は広い意味で用いられる。従って不明瞭な意味の用語によって引
き起こされる不確実さを回避するため、この明細書及び特許請求の範囲において
用いられる用語のいくつかは以下でより詳細に規定される。
【００５４】 用語「気道炎症」は様々な交替を意味する。これらは重度の肺疾病活性及び肺
組織破壊の開始及び／又は不可逆的に病んだ肺に導く疾病の開始の特徴であり、
重度の構造的及び機能的異常の両方にしばしば関連している。しかしこの用語は
アレルギー性又は感染性鼻炎を含む鼻の粘膜の炎症（鼻炎）をも含む。本発明に
おいては増大した又は高レベルのＭＭＰ及びＭＭＰ−ＲＭが疾病の重症度と相関
関係にあり、特別な測定が必要であることを医師又は獣医師に示す。肺柔結合組
織及び基底膜に対する損傷及びこれらの組織破壊は炎症応答の主要な合併症であ
り、これはアレルゲンの攻撃又は他の刺激性又はアレルギー誘導物質、微生物、
細菌、ウイルス、クラミジア、マイコプラズマ、原生動物、菌及び／又は寄生虫
感染（単独又は誘導性又は感染性物質に限定されないいかなる可能な組み合わせ
）によって誘導され得るか又は引き起こされ得る。かかる感染並びに炎症性肺組
織及び基底膜損傷は例えば気管支拡張症、のう胞性繊維症、慢性閉塞肺疾病、ア
レルギー性、微生物起因喘息及び呼吸疾病、症候群、肺気腫、及びＨＩＶ陽性肺
疾病の如き多くの肺炎症疾病における病理学的変化に寄与している。これらは肺
結合柔組織及び基底膜の酵素的分解と相関関係がある。肺の細胞外マトリックス
及び基底膜の組織破壊は前記肺疾病の活性相を反映している。
組織破壊の開始及び／又は不可逆的に病んだ肺に導く疾病の開始の特徴であり、
重度の構造的及び機能的異常の両方にしばしば関連している。しかしこの用語は
アレルギー性又は感染性鼻炎を含む鼻の粘膜の炎症（鼻炎）をも含む。本発明に
おいては増大した又は高レベルのＭＭＰ及びＭＭＰ−ＲＭが疾病の重症度と相関
関係にあり、特別な測定が必要であることを医師又は獣医師に示す。肺柔結合組
織及び基底膜に対する損傷及びこれらの組織破壊は炎症応答の主要な合併症であ
り、これはアレルゲンの攻撃又は他の刺激性又はアレルギー誘導物質、微生物、
細菌、ウイルス、クラミジア、マイコプラズマ、原生動物、菌及び／又は寄生虫
感染（単独又は誘導性又は感染性物質に限定されないいかなる可能な組み合わせ
）によって誘導され得るか又は引き起こされ得る。かかる感染並びに炎症性肺組
織及び基底膜損傷は例えば気管支拡張症、のう胞性繊維症、慢性閉塞肺疾病、ア
レルギー性、微生物起因喘息及び呼吸疾病、症候群、肺気腫、及びＨＩＶ陽性肺
疾病の如き多くの肺炎症疾病における病理学的変化に寄与している。これらは肺
結合柔組織及び基底膜の酵素的分解と相関関係がある。肺の細胞外マトリックス
及び基底膜の組織破壊は前記肺疾病の活性相を反映している。
【００５５】 本発明における用語「気道炎症」はその最も広い側面においては肺の疾病のみ
ならず鼻道膜の炎症をも含む。この用語は高度の危険性の気道損傷と関連した気
道の進行性の活性炎症性状態を意味する。前記状態は総ＭＭＰ及び／又はＭＭＰ
−ＲＭの増大した量又はレベル又は前記分子の高度の活性化に相関することがあ
り得、それらの濃度は健康な人からの気道分泌サンプル中に見出される濃度より
上である。
ならず鼻道膜の炎症をも含む。この用語は高度の危険性の気道損傷と関連した気
道の進行性の活性炎症性状態を意味する。前記状態は総ＭＭＰ及び／又はＭＭＰ
−ＲＭの増大した量又はレベル又は前記分子の高度の活性化に相関することがあ
り得、それらの濃度は健康な人からの気道分泌サンプル中に見出される濃度より
上である。
【００５６】 用語「診断する」は本発明のテストキット又は方法を用いたＭＭＰ及び／又は
ＭＭＰ−ＲＭの決定、測定又は検出に基づいて気道における炎症の疾病活性の重
症度及び相を、記録された結果から判断すること、予測すること、又は評価する
ことを意味する。前記方法及びキットを用いた薬物治療の効力の評価、前記疾病
が進行する危険性の予測、並びに物理的ストレスの危険性の予測もこの用語に含
まれる。
ＭＭＰ−ＲＭの決定、測定又は検出に基づいて気道における炎症の疾病活性の重
症度及び相を、記録された結果から判断すること、予測すること、又は評価する
ことを意味する。前記方法及びキットを用いた薬物治療の効力の評価、前記疾病
が進行する危険性の予測、並びに物理的ストレスの危険性の予測もこの用語に含
まれる。
【００５７】 用語「気道分泌サンプル（ＲＳ）」は肺の全部又は一部を表す気道の上部又は
下部から採取されたサンプルを意味する。換言すれば、それは肺の特異的な小さ
い領域から得られるバイオプシーよりも肺全体における状況の一層描写的な臨床
像を与える。本発明における用語「サンプル採取」は気道又は鼻分泌サンプルを
得るための方法を意味する。気道分泌物（ＲＳ）は気管、気管支、細気管支及び
肺胞の上皮表面からの液状物質及び局所ムコイドを通常含み、及びそれらは気管
洗浄又は気管吸引によっても得ることができる。
下部から採取されたサンプルを意味する。換言すれば、それは肺の特異的な小さ
い領域から得られるバイオプシーよりも肺全体における状況の一層描写的な臨床
像を与える。本発明における用語「サンプル採取」は気道又は鼻分泌サンプルを
得るための方法を意味する。気道分泌物（ＲＳ）は気管、気管支、細気管支及び
肺胞の上皮表面からの液状物質及び局所ムコイドを通常含み、及びそれらは気管
洗浄又は気管吸引によっても得ることができる。
【００５８】 代表的な気道サンプルは例えば下部気管レベルから得られるものであり、標準
量の液体（例、塩水）を洗浄に用いることによる気管上皮裏打ち液（ＴＥＬＦ）
を含む。いわゆる気管洗浄液（ＴＦＦ）はＴＥＬＦ中の物質の量及び下部気管レ
ベルにおけるＴＥＬＦの量の両方を表す。気道サンプルの典型的な代表例は痰又
は誘導された痰（ＩＳ）の如き咳による生成物である。これらは高張性塩水を吸
入した後、咳をして標準的な方法で気道サンプルを採取するという標準的な方法
によって得ることができる。気道サンプルの他の例は気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ
Ｆ）である。これは気管支肺胞レベルから得られる気道サンプルであり、洗浄液
（生理塩水）を用いて気道表面の等しい対応する領域を標準容量で標準的手法で
洗浄することによって得られる。動物、特にウマでは滅菌塩水で洗浄することに
よって気管上皮裏打ち液（ＴＥＬＦ）を得ることが最も好ましい採取方法である
。
量の液体（例、塩水）を洗浄に用いることによる気管上皮裏打ち液（ＴＥＬＦ）
を含む。いわゆる気管洗浄液（ＴＦＦ）はＴＥＬＦ中の物質の量及び下部気管レ
ベルにおけるＴＥＬＦの量の両方を表す。気道サンプルの典型的な代表例は痰又
は誘導された痰（ＩＳ）の如き咳による生成物である。これらは高張性塩水を吸
入した後、咳をして標準的な方法で気道サンプルを採取するという標準的な方法
によって得ることができる。気道サンプルの他の例は気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ
Ｆ）である。これは気管支肺胞レベルから得られる気道サンプルであり、洗浄液
（生理塩水）を用いて気道表面の等しい対応する領域を標準容量で標準的手法で
洗浄することによって得られる。動物、特にウマでは滅菌塩水で洗浄することに
よって気管上皮裏打ち液（ＴＥＬＦ）を得ることが最も好ましい採取方法である
。
【００５９】 通常の文脈における用語「マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ、マト
リキシン）」は２０種以上の遺伝的に区別できるが構造的に関連したマトリック
スメタロプロテイナーゼのファミリーを意味する。これらのマトリックスメタロ
プロテイナーゼはほとんど全ての細胞外マトリックス（ＥＣＭ）及び基底膜（Ｂ
Ｍ）成分、セリンプロテイナーゼ阻害剤（セルピンやプラスミノーゲン活性化因
子阻害剤の如き）、サイトカイン、細胞表面成分、接着分子、及び補体成分を分
解することができる。ＭＭＰ−ファミリーメンバー及び／又はＭＭＰ−ＲＭの数
は新しいメンバーが検出されるにつれて常に増大している。本発明は用語「ＭＭ
Ｐ」及び「ＭＭＰ−ＲＭ」によってすべての存在する及び将来の新しいＭＭＰ−
ファミリーメンバー又はＭＭＰ−ＲＭを包含する。前記のＺｎ結合メタロエンド
ペプチダーゼ酵素は有意な構造的相同性及び類似性を有するプロテイナーゼのフ
ァミリーとして統合されるが、同一の酵素特性は有さない。それらの遺伝的に区
別されるしかし構造的に関連する一次構造（これらは一連のサブタイプ及びサブ
グループへのそれらの分類を可能にする）に加えて、前記プロテイナーゼはそれ
らの幅広く異なる基質特異性及びそれらの潜在型からのＮ末端ペプチドのタンパ
ク質分解的又は非タンパク質分解的除去による活性化に対するそれらの感受性に
よって特徴付けられる。ＭＭＰは分子サイズにおけるいかなる変化なしで活性化
することができる（Handbook of Proteolytic Enzymes, Eds, Barrett, A.J. Ra
wlings, N.D. & Wessner, J.F:, pp. 1-1696, Academic Press, 1998; Shapiro,
S.D., Curr. Opin. Cell Biol., 10(5):, 602-608, 1998）。
リキシン）」は２０種以上の遺伝的に区別できるが構造的に関連したマトリック
スメタロプロテイナーゼのファミリーを意味する。これらのマトリックスメタロ
プロテイナーゼはほとんど全ての細胞外マトリックス（ＥＣＭ）及び基底膜（Ｂ
Ｍ）成分、セリンプロテイナーゼ阻害剤（セルピンやプラスミノーゲン活性化因
子阻害剤の如き）、サイトカイン、細胞表面成分、接着分子、及び補体成分を分
解することができる。ＭＭＰ−ファミリーメンバー及び／又はＭＭＰ−ＲＭの数
は新しいメンバーが検出されるにつれて常に増大している。本発明は用語「ＭＭ
Ｐ」及び「ＭＭＰ−ＲＭ」によってすべての存在する及び将来の新しいＭＭＰ−
ファミリーメンバー又はＭＭＰ−ＲＭを包含する。前記のＺｎ結合メタロエンド
ペプチダーゼ酵素は有意な構造的相同性及び類似性を有するプロテイナーゼのフ
ァミリーとして統合されるが、同一の酵素特性は有さない。それらの遺伝的に区
別されるしかし構造的に関連する一次構造（これらは一連のサブタイプ及びサブ
グループへのそれらの分類を可能にする）に加えて、前記プロテイナーゼはそれ
らの幅広く異なる基質特異性及びそれらの潜在型からのＮ末端ペプチドのタンパ
ク質分解的又は非タンパク質分解的除去による活性化に対するそれらの感受性に
よって特徴付けられる。ＭＭＰは分子サイズにおけるいかなる変化なしで活性化
することができる（Handbook of Proteolytic Enzymes, Eds, Barrett, A.J. Ra
wlings, N.D. & Wessner, J.F:, pp. 1-1696, Academic Press, 1998; Shapiro,
S.D., Curr. Opin. Cell Biol., 10(5):, 602-608, 1998）。
【００６０】 用語「膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）」は従来の又
は細胞外ＭＭＰとは実質的に異なる最近発見されたマトリックスメタロプロテイ
ナーゼ又はＭＭＰサブファミリーを意味する。ＭＴ−ＭＭＰは多くの点で他のＭ
ＭＰとは異なる。それらの主要な部分はそれらの細胞表面結合に関するそれらの
膜通過ドメインによって説明される（Handbook of Proteolytic Enzymes, Eds,
Barrett, A.J. Rawlings, N.D. & Wessner, J.F:, pp. 1-1696, Academic Press
, 1998; Shapiro, S.D., Curr. Opin. Cell Biol., 10(5):, 602-608, 1998）。
ＭＴ−ＭＭＰは２４アミノ酸の疎水性ドメインを含む。これらは付着、即ち細胞
膜への結合に寄与する。ＭＴ−ＭＭＰはコラーゲン及びゼラチンを攻撃すること
ができるが、ＭＴ−ＭＭＰは細胞表面に関連した活性化、特にプロＭＭＰ−２の
それにおいて付加的に重要である。
は細胞外ＭＭＰとは実質的に異なる最近発見されたマトリックスメタロプロテイ
ナーゼ又はＭＭＰサブファミリーを意味する。ＭＴ−ＭＭＰは多くの点で他のＭ
ＭＰとは異なる。それらの主要な部分はそれらの細胞表面結合に関するそれらの
膜通過ドメインによって説明される（Handbook of Proteolytic Enzymes, Eds,
Barrett, A.J. Rawlings, N.D. & Wessner, J.F:, pp. 1-1696, Academic Press
, 1998; Shapiro, S.D., Curr. Opin. Cell Biol., 10(5):, 602-608, 1998）。
ＭＴ−ＭＭＰは２４アミノ酸の疎水性ドメインを含む。これらは付着、即ち細胞
膜への結合に寄与する。ＭＴ−ＭＭＰはコラーゲン及びゼラチンを攻撃すること
ができるが、ＭＴ−ＭＭＰは細胞表面に関連した活性化、特にプロＭＭＰ−２の
それにおいて付加的に重要である。
【００６１】 用語「マトリックスメタロプロテイナーゼ関連分子（ＭＭＰ−ＲＭ）」はＭＭ
Ｐに親密に関連して存在する分子をも含む。この例は好中球ゼラチナーゼ関連リ
ポカリン（ＮＧＡＬ）であり、これは９２ｋＤのゼラチナーゼＢ（ＭＭＰ−９）
と関連した２５ｋＤのリポカリンを含む約１２０ｋＤの複合体を形成する。
Ｐに親密に関連して存在する分子をも含む。この例は好中球ゼラチナーゼ関連リ
ポカリン（ＮＧＡＬ）であり、これは９２ｋＤのゼラチナーゼＢ（ＭＭＰ−９）
と関連した２５ｋＤのリポカリンを含む約１２０ｋＤの複合体を形成する。
【００６２】 用語「ＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭ」はＭＭＰ及びＭＭＰ−ＲＭのすべての
可能なスプライス変異体を包含する。かかるスプライス変異体はＭＭＰ−８につ
いて同定され特性決定されている（Hu, S-H., 等， FEBS Letters, 443: 8-10,
1998）。分泌シグナル配列が欠如しているので、ＭＭＰ−８並びに他のＭＭＰ及
びＭＭＰ−ＲＭのスプライス変異体はたぶん分泌タンパク質ではない。それにも
かかわらず、それらは肺組織破壊的疾病と関連した細胞死の間に気道分泌物の如
き体液中に放出されることができる。用語「ＭＭＰ−ＲＭ」はそれらのセリンプ
ロテイナーゼ活性化因子の如き主要なＭＭＰ−調節タンパク質を更に包含する。
これらの例はエラスターゼ及びトリプシンである（Sorsa, T., 等，J. Biol. Ch
em., 272(34): 21067-21074, 1997）。本発明において記述される診断テストに
おいてはこれらの分子は単独で及び／又はすべての可能な組み合わせで用いるこ
とができる。
可能なスプライス変異体を包含する。かかるスプライス変異体はＭＭＰ−８につ
いて同定され特性決定されている（Hu, S-H., 等， FEBS Letters, 443: 8-10,
1998）。分泌シグナル配列が欠如しているので、ＭＭＰ−８並びに他のＭＭＰ及
びＭＭＰ−ＲＭのスプライス変異体はたぶん分泌タンパク質ではない。それにも
かかわらず、それらは肺組織破壊的疾病と関連した細胞死の間に気道分泌物の如
き体液中に放出されることができる。用語「ＭＭＰ−ＲＭ」はそれらのセリンプ
ロテイナーゼ活性化因子の如き主要なＭＭＰ−調節タンパク質を更に包含する。
これらの例はエラスターゼ及びトリプシンである（Sorsa, T., 等，J. Biol. Ch
em., 272(34): 21067-21074, 1997）。本発明において記述される診断テストに
おいてはこれらの分子は単独で及び／又はすべての可能な組み合わせで用いるこ
とができる。
【００６３】 他のプロテイナーゼ（セリンプロテイナーゼ、細菌プロテイナーゼ及び他のＭ
ＭＰ）による活性化に加えて、潜在型プロＭＭＰは非タンパク質分解的手段によ
っても活性化されることができる。特に、酸化剤又は反応性酸素種は炎症性疾病
においてはin vivoで重要である（Saari, H., 等，Biochem. Biophys. Res. Com
mun., 171(3), 979-987, 1990）。プロＭＭＰは自己活性化されることもできる
（Sorsa, T., 等，J. Biol. Chem., 272(34): 21067-21074, 1997; Westerlund,
U., 等，J. Dent. Res., 75(8): 1553-1563, 1996; Handbook of Proteolytic
Enzymes, Eds, Barrett, A.J., Rawlings, N.D. & Wessner, J.F, pp. 1-1696,
Academic Press, 1998; Shapiro, S.D., Curr. Opin. Cell Biol., 10(5): 602-
608, 1998）。プロＭＭＰ−活性化カスケードを最初に活性化することができる
因子を同定するために、トリプシン−２がプロＭＭＰの活性化及び活性化カスケ
ードにおいて活性化したプロＭＭＰを誘導することができるということが示され
ている（Sorsa, T., 等，J. Biol. Chem., 272(34): 21067-21074, 1997）。
ＭＰ）による活性化に加えて、潜在型プロＭＭＰは非タンパク質分解的手段によ
っても活性化されることができる。特に、酸化剤又は反応性酸素種は炎症性疾病
においてはin vivoで重要である（Saari, H., 等，Biochem. Biophys. Res. Com
mun., 171(3), 979-987, 1990）。プロＭＭＰは自己活性化されることもできる
（Sorsa, T., 等，J. Biol. Chem., 272(34): 21067-21074, 1997; Westerlund,
U., 等，J. Dent. Res., 75(8): 1553-1563, 1996; Handbook of Proteolytic
Enzymes, Eds, Barrett, A.J., Rawlings, N.D. & Wessner, J.F, pp. 1-1696,
Academic Press, 1998; Shapiro, S.D., Curr. Opin. Cell Biol., 10(5): 602-
608, 1998）。プロＭＭＰ−活性化カスケードを最初に活性化することができる
因子を同定するために、トリプシン−２がプロＭＭＰの活性化及び活性化カスケ
ードにおいて活性化したプロＭＭＰを誘導することができるということが示され
ている（Sorsa, T., 等，J. Biol. Chem., 272(34): 21067-21074, 1997）。
【００６４】 結局、「マトリックスメタロプロテイナーゼ」は本発明の最も広い側面におい
て通常の細胞外に放出される「マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）」
のみならず「膜結合マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）」及び
「マトリックスメタロプロテイナーゼ関連分子（ＭＭＰ−ＲＭ）」（両方ともそ
れらの潜在型及び活性型で）並びに前記ＭＭＰ、ＭＴ−ＭＭＰ及びＭＭＰ−ＲＭ
を活性化し阻害することができる物質をも包含する。前記型のすべては本発明に
おいて用語「マトリックスメタロプロテイナーゼ関連及び／又は関連分子（ＭＭ
Ｐ−ＲＭ）」によって包含される。
て通常の細胞外に放出される「マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）」
のみならず「膜結合マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）」及び
「マトリックスメタロプロテイナーゼ関連分子（ＭＭＰ−ＲＭ）」（両方ともそ
れらの潜在型及び活性型で）並びに前記ＭＭＰ、ＭＴ−ＭＭＰ及びＭＭＰ−ＲＭ
を活性化し阻害することができる物質をも包含する。前記型のすべては本発明に
おいて用語「マトリックスメタロプロテイナーゼ関連及び／又は関連分子（ＭＭ
Ｐ−ＲＭ）」によって包含される。
【００６５】 本発明の最も好ましい実施態様においては用語「マトリックスメタロプロテイ
ナーゼ及び／又は関連分子」はとりわけＭＭＰ−２，ＭＭＰ−８，ＭＭＰ−９，
ＭＭＰ−１３，ＭＭＰ−１４（ＭＴ１−ＭＭＰ）及び／又はＮＧＡＬを、特にそ
れらの活性型で含む。
ナーゼ及び／又は関連分子」はとりわけＭＭＰ−２，ＭＭＰ−８，ＭＭＰ−９，
ＭＭＰ−１３，ＭＭＰ−１４（ＭＴ１−ＭＭＰ）及び／又はＮＧＡＬを、特にそ
れらの活性型で含む。
【００６６】 用語「マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）及び／又は関連分子（Ｍ
ＭＰ−ＭＰ）」は上で規定された分子のみならず様々な起源のそれらのアイソフ
ォーム（単独又はいかなる組み合わせ）をも含む。この用語はすべての掲示され
たＭＭＰ−ＲＭをそれらの潜在型又は活性型で又は前記型のいかなる組み合わせ
で並びにそれらの断片化された、短くされた、誘導体化された及び／又は複合体
化された型並びにスプライス変異体を包含する。
ＭＰ−ＭＰ）」は上で規定された分子のみならず様々な起源のそれらのアイソフ
ォーム（単独又はいかなる組み合わせ）をも含む。この用語はすべての掲示され
たＭＭＰ−ＲＭをそれらの潜在型又は活性型で又は前記型のいかなる組み合わせ
で並びにそれらの断片化された、短くされた、誘導体化された及び／又は複合体
化された型並びにスプライス変異体を包含する。
【００６７】 用語「アイソフォーム」は同一タンパク質の異なる型を意味し、これは異なる
源（例えば異なる動物種）から起源する。本発明においてはこの用語は断片、複
合体及びそれらの誘導体を含む。例えばメタロプロテイナーゼＭＭＰ−８の如き
活性コラゲナーゼはプロ酵素の開裂によって活性酵素を形成することによって作
り出される。様々な酵素的及び非酵素的反応、タンパク質分解及び非タンパク質
分解を含む様々な反応が活性酵素を作り出すことができる。これらの様々な反応
はプロ酵素を様々に開裂し、様々な分子種を作り出す。これらも用語「アイソフ
ォーム」のうちに包含される。しかし、ＭＭＰはそれらの分子サイズにおけるい
かなる変化なしに活性化され及び自己活性化することができる。
源（例えば異なる動物種）から起源する。本発明においてはこの用語は断片、複
合体及びそれらの誘導体を含む。例えばメタロプロテイナーゼＭＭＰ−８の如き
活性コラゲナーゼはプロ酵素の開裂によって活性酵素を形成することによって作
り出される。様々な酵素的及び非酵素的反応、タンパク質分解及び非タンパク質
分解を含む様々な反応が活性酵素を作り出すことができる。これらの様々な反応
はプロ酵素を様々に開裂し、様々な分子種を作り出す。これらも用語「アイソフ
ォーム」のうちに包含される。しかし、ＭＭＰはそれらの分子サイズにおけるい
かなる変化なしに活性化され及び自己活性化することができる。
【００６８】 いくつかのＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭは他のものよりもよく呼吸疾病の重
症度と相関すること、及びいくつかのＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭは動物より
もヒトに適用されたときによく相関するということが示されている。かくして、
本発明のより選択的及び／又は特異的実施態様を提供するために選択された診断
目的に最も良く相関するメンバーをＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭのグループか
ら選択することが好都合である。例えば本発明はＭＭＰ−８はＣＯＰＤ及び気管
支拡張症の重症度と極めて良く相関することを示している。ＭＴ１−ＭＭＰはヒ
トにおける気管支喘息の重症度と特に相関する。ＭＭＰ−９は特にその活性型で
又は活性化を反映する断片として、ウマにおけるＣＯＰＤの重症度と良く相関す
る。
症度と相関すること、及びいくつかのＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭは動物より
もヒトに適用されたときによく相関するということが示されている。かくして、
本発明のより選択的及び／又は特異的実施態様を提供するために選択された診断
目的に最も良く相関するメンバーをＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭのグループか
ら選択することが好都合である。例えば本発明はＭＭＰ−８はＣＯＰＤ及び気管
支拡張症の重症度と極めて良く相関することを示している。ＭＴ１−ＭＭＰはヒ
トにおける気管支喘息の重症度と特に相関する。ＭＭＰ−９は特にその活性型で
又は活性化を反映する断片として、ウマにおけるＣＯＰＤの重症度と良く相関す
る。
【００６９】 気道液におけるＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭの量は「結合物質」を用いて決
定される。この「結合物質」は結合タンパク質又はペプチド並びにマトリックス
メタロプロテイナーゼを認識する抗体（ａＭＭＰ）及び／又は関連分子を認識す
る抗体（ａＭＭＰ−ＲＭ）を含む。用語「マトリックスメタロプロテイナーゼ及
び／又は関連分子を認識する結合物質（ａＭＭＰ及び／又はａＭＭＰ−ＲＭ）」
はその最も幅広い側面において本発明の少なくとも一種以上のＭＭＰ−ＲＭ又は
その一部を特異的に認識して結合することができるいかなる物質をも意味する。
かかる物質は例えばＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭに特異的に結合することがで
きるレセプター又は結合タンパク質又はペプチドであるが、とりわけそれらは一
種以上のＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭ（単独又はいかなる組み合わせ）を特異
的に認識することができる抗体を意味する。その抗体はポリクローナル及び／又
はモノクローナル抗体の両方並びにそれらの断片又は誘導体を含む。必要条件は
結合物質は少なくとも一種の上述のＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭ又は部分、例
えばそれらの活性部位又はエピトープ（単独又はいかなる組み合わせ）を特異的
に認識することができるということである。
定される。この「結合物質」は結合タンパク質又はペプチド並びにマトリックス
メタロプロテイナーゼを認識する抗体（ａＭＭＰ）及び／又は関連分子を認識す
る抗体（ａＭＭＰ−ＲＭ）を含む。用語「マトリックスメタロプロテイナーゼ及
び／又は関連分子を認識する結合物質（ａＭＭＰ及び／又はａＭＭＰ−ＲＭ）」
はその最も幅広い側面において本発明の少なくとも一種以上のＭＭＰ−ＲＭ又は
その一部を特異的に認識して結合することができるいかなる物質をも意味する。
かかる物質は例えばＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭに特異的に結合することがで
きるレセプター又は結合タンパク質又はペプチドであるが、とりわけそれらは一
種以上のＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭ（単独又はいかなる組み合わせ）を特異
的に認識することができる抗体を意味する。その抗体はポリクローナル及び／又
はモノクローナル抗体の両方並びにそれらの断片又は誘導体を含む。必要条件は
結合物質は少なくとも一種の上述のＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭ又は部分、例
えばそれらの活性部位又はエピトープ（単独又はいかなる組み合わせ）を特異的
に認識することができるということである。
【００７０】 前記「ａＭＭＰ」及び「ａＭＭＰ−ＲＭ」は「抗原」として作用することがで
きるいかなるＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭ、それらのアイソフォーム並びにそ
れらの断片、誘導体及び複合体を用いて生産することができる。従って用語「ａ
ＭＭＰ及び／又はａＭＭＰ−ＲＭ」はいかなる組成物又は材料、特に前記ＭＭＰ
及び／又はＭＭＰ−ＲＭ組成物又は材料に対する特異的応答として誘発された抗
体を意味する。前記抗体はポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生産す
るための従来技術によって生産することができる。モノクローナル抗体を調製す
るための方法はハイブリドーマ技術を含む。抗体断片又は特異的結合ペプチドの
如き他の結合タンパク質はファージディスプレイ技術によって開発することがで
き、組み換えＤＮＡ技術によって生産することができる。これらの方法は全て当
該技術分野の当業者には周知であり、実験室の手引き書に記述されている。
きるいかなるＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭ、それらのアイソフォーム並びにそ
れらの断片、誘導体及び複合体を用いて生産することができる。従って用語「ａ
ＭＭＰ及び／又はａＭＭＰ−ＲＭ」はいかなる組成物又は材料、特に前記ＭＭＰ
及び／又はＭＭＰ−ＲＭ組成物又は材料に対する特異的応答として誘発された抗
体を意味する。前記抗体はポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生産す
るための従来技術によって生産することができる。モノクローナル抗体を調製す
るための方法はハイブリドーマ技術を含む。抗体断片又は特異的結合ペプチドの
如き他の結合タンパク質はファージディスプレイ技術によって開発することがで
き、組み換えＤＮＡ技術によって生産することができる。これらの方法は全て当
該技術分野の当業者には周知であり、実験室の手引き書に記述されている。
【００７１】 用語「免疫アッセイ」はＭＭＰ又はＭＭＰ−ＲＭの如き物質を検出及び／又は
測定することができる方法又は手順を意味し、そこでは活性で特異的な試薬は前
記物質に特異的に結合することができる少なくとも一種の抗体を含む。免疫アッ
セイの周知の例は放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、放射免疫測定アッセイ（ＩＲＭ
Ａ）、蛍光免疫測定アッセイ（ＩＦＭＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、酵素
連結免疫溶媒アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫アッセイ（ＦＩＡ）、ルミネセ
ンス免疫アッセイ、免疫凝集アッセイ、比濁分析免疫アッセイ等である。これら
の方法は全て当該技術分野の当業者には周知であり、実験室の手引き書に記述さ
れている。免疫アッセイの基本的なタイプはとりわけ「サンドイッチアッセイ」
を含む。この用語は以下で規定する。
測定することができる方法又は手順を意味し、そこでは活性で特異的な試薬は前
記物質に特異的に結合することができる少なくとも一種の抗体を含む。免疫アッ
セイの周知の例は放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、放射免疫測定アッセイ（ＩＲＭ
Ａ）、蛍光免疫測定アッセイ（ＩＦＭＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、酵素
連結免疫溶媒アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫アッセイ（ＦＩＡ）、ルミネセ
ンス免疫アッセイ、免疫凝集アッセイ、比濁分析免疫アッセイ等である。これら
の方法は全て当該技術分野の当業者には周知であり、実験室の手引き書に記述さ
れている。免疫アッセイの基本的なタイプはとりわけ「サンドイッチアッセイ」
を含む。この用語は以下で規定する。
【００７２】 用語「サンドイッチアッセイ」はサンプル中の抗原又は抗体の量を検出又は定
量することができる少なくとも２種の抗体を用いる免疫アッセイを意味する。こ
のアッセイにおいては抗原上の二つの異なる重複しない（競合しない）エピトー
プに結合することができる二つの異なる抗体が用いられる。以下に述べるように
様々なタイプの「サンドイッチアッセイ」が存在する。
量することができる少なくとも２種の抗体を用いる免疫アッセイを意味する。こ
のアッセイにおいては抗原上の二つの異なる重複しない（競合しない）エピトー
プに結合することができる二つの異なる抗体が用いられる。以下に述べるように
様々なタイプの「サンドイッチアッセイ」が存在する。
【００７３】 用語「側流（Lateral Flow）技術」は免疫クロマトグラフィーの原理を用いた
免疫アッセイを意味する。これは液体形態のサンプル又はテスト用液がテストス
トリップに沿って動くテストにとって一般的である。これとは対照的に「フロー
スルー（Flow Through）技術」ではテスト用液はテスト装置中の膜を通って流動
させられる。
免疫アッセイを意味する。これは液体形態のサンプル又はテスト用液がテストス
トリップに沿って動くテストにとって一般的である。これとは対照的に「フロー
スルー（Flow Through）技術」ではテスト用液はテスト装置中の膜を通って流動
させられる。
【００７４】 用語「フロースルー技術」はサンドイッチ技術にしばしば基づく免疫アッセイ
を意味する。サンプル又はテスト溶液を含む抗原はスポットとして適用され、装
置中の膜を通って拡散させられる。
を意味する。サンプル又はテスト溶液を含む抗原はスポットとして適用され、装
置中の膜を通って拡散させられる。
【００７５】 「チェアサイド又はベッドサイド並びにオンフィールドアッセイ」はいかなる
実験室設備を用いずとも及び熟練した実験室人員を必要とすることなしに行われ
る手順又はテストを意味する。「チェアサイドテスト」は患者が医師を訪問して
いる間に医師によって行うことができる。一方、「ベッドサイドアッセイ」は医
師が患者のベッドサイドに日常的に訪問している間に行うことができる。「オン
フィールドアッセイ」は例えば動物収容所における現場条件下で獣医師によって
行われるテストを意味する。またいわゆる「自己テスト」も含まれる。これは医
師と親密な協力にある患者が患者自身でテストを行うものである。「チェアサイ
ド又はベッドサイドアッセイ及びオンフィールドアッセイ」はテストストリップ
のような「固体支持体」上で行うことが好ましい。様々なＭＭＰ及び／又はＭＭ
Ｐ−ＲＭを同一スティック上で同時に検出することができる。
実験室設備を用いずとも及び熟練した実験室人員を必要とすることなしに行われ
る手順又はテストを意味する。「チェアサイドテスト」は患者が医師を訪問して
いる間に医師によって行うことができる。一方、「ベッドサイドアッセイ」は医
師が患者のベッドサイドに日常的に訪問している間に行うことができる。「オン
フィールドアッセイ」は例えば動物収容所における現場条件下で獣医師によって
行われるテストを意味する。またいわゆる「自己テスト」も含まれる。これは医
師と親密な協力にある患者が患者自身でテストを行うものである。「チェアサイ
ド又はベッドサイドアッセイ及びオンフィールドアッセイ」はテストストリップ
のような「固体支持体」上で行うことが好ましい。様々なＭＭＰ及び／又はＭＭ
Ｐ−ＲＭを同一スティック上で同時に検出することができる。
【００７６】 本発明の一般的説明 従来、肺の機能的能力及び気道からの及び気道への空気の速度並びに化学物質
の増大量に対する気管支の過剰反応性を測定するためには肺機能テストが用いら
れてきた。気管支喘息及び慢性閉塞肺疾病（ＣＯＰＤ）の如き初期閉塞性呼吸疾
病においては、炎症は肺機能の変化を進行させる。肺機能テストにおける値の減
少は気管支狭窄、つまり痰閉塞及び／又は上皮肥大による気道の狭窄によるもの
であることがあり得るが、気道における慢性的変化の徴候としての繊維損傷の結
果でもあり得る。しかし、肺機能テストは肺機能の悪化の間接的証拠を示すにす
ぎず、慢性的炎症過程の原因、段階及び重症度の直接的評価は与えない。それは
気道における炎症の存在又はレベルを測定しない。
の増大量に対する気管支の過剰反応性を測定するためには肺機能テストが用いら
れてきた。気管支喘息及び慢性閉塞肺疾病（ＣＯＰＤ）の如き初期閉塞性呼吸疾
病においては、炎症は肺機能の変化を進行させる。肺機能テストにおける値の減
少は気管支狭窄、つまり痰閉塞及び／又は上皮肥大による気道の狭窄によるもの
であることがあり得るが、気道における慢性的変化の徴候としての繊維損傷の結
果でもあり得る。しかし、肺機能テストは肺機能の悪化の間接的証拠を示すにす
ぎず、慢性的炎症過程の原因、段階及び重症度の直接的評価は与えない。それは
気道における炎症の存在又はレベルを測定しない。
【００７７】 慢性的に病気の患者における活性で進行中の炎症の現状及び段階を予後するこ
とは常に医師及び獣医師のゴールであった。気道における感染性又は非感染性起
源の慢性炎症の開始の初期診断は、活性炎症と関連した閉塞徴候の開始又は悪化
を防止する可能性を与える。同時に、気道の疾病及び増大する大気汚染と関連す
る疾病においてみられるようなアレルギー発病率の増大は、気道の疾病と関連し
た健康リスクを評価するための方法及びツールに対する要請を作り出した。
とは常に医師及び獣医師のゴールであった。気道における感染性又は非感染性起
源の慢性炎症の開始の初期診断は、活性炎症と関連した閉塞徴候の開始又は悪化
を防止する可能性を与える。同時に、気道の疾病及び増大する大気汚染と関連す
る疾病においてみられるようなアレルギー発病率の増大は、気道の疾病と関連し
た健康リスクを評価するための方法及びツールに対する要請を作り出した。
【００７８】 マトリックスメタプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）
、上皮、内皮及び基底膜（ＢＭ）の分解に、それらのタンパク質構成成分のほと
んど全てを開裂させることによって参加することが知られている（Handbook of
Proteolytic Enzymes. Eds Barrett, A.J., 等，pp. 1-1696, Acad. Press., 19
98）。呼吸疾病の病原におけるＭＭＰの関与についての研究はＭＭＰの病原的側
面に集中している。しかしながら、肺疾病の活性相の臨床診断におけるＭＭＰの
利用は完全に未研究のままに滞まっている。生理的状況における再モデル化に参
加すること以外に病理学的に増大したレベルのＭＭＰは肺炎症状況（例えば肺気
腫、気管支拡張症、喘息及び慢性閉塞肺疾病（ＣＯＰＤ）、ＨＩＶ感染に関連し
た肺疾病及び呼吸疾病並びにのう胞性繊維症）の間に組織破壊を引き起こすかも
しれない。病気の洗浄液、痰などの如きすべての液体サンプルにおいては、ＭＭ
Ｐが活性化された場合、実際の疾病過程は肺組織破壊に関して活性相にあるとい
うことが示されている。
、上皮、内皮及び基底膜（ＢＭ）の分解に、それらのタンパク質構成成分のほと
んど全てを開裂させることによって参加することが知られている（Handbook of
Proteolytic Enzymes. Eds Barrett, A.J., 等，pp. 1-1696, Acad. Press., 19
98）。呼吸疾病の病原におけるＭＭＰの関与についての研究はＭＭＰの病原的側
面に集中している。しかしながら、肺疾病の活性相の臨床診断におけるＭＭＰの
利用は完全に未研究のままに滞まっている。生理的状況における再モデル化に参
加すること以外に病理学的に増大したレベルのＭＭＰは肺炎症状況（例えば肺気
腫、気管支拡張症、喘息及び慢性閉塞肺疾病（ＣＯＰＤ）、ＨＩＶ感染に関連し
た肺疾病及び呼吸疾病並びにのう胞性繊維症）の間に組織破壊を引き起こすかも
しれない。病気の洗浄液、痰などの如きすべての液体サンプルにおいては、ＭＭ
Ｐが活性化された場合、実際の疾病過程は肺組織破壊に関して活性相にあるとい
うことが示されている。
【００７９】 ウマにおいてはゼラチン分解性及びコラーゲン分解性であるが免疫反応性では
ないＭＭＰ活性が、ＣＯＰＤにかかっているウマの気管上皮裏打ち液（ＴＥＬＦ
）において増大しかつ活性化されていることが示されている。これらのゼラチン
分解性及びコラーゲン分解性活性の基質特異的が幅広いため、どのゼラチン分解
性及びコラーゲン分解性活性が重度の気道炎症において増大しているかを同定す
ることは不可能であり、観察に基づいて正確かつ迅速で特異的なチェアサイドツ
ールを開発することは不可能であった。
ないＭＭＰ活性が、ＣＯＰＤにかかっているウマの気管上皮裏打ち液（ＴＥＬＦ
）において増大しかつ活性化されていることが示されている。これらのゼラチン
分解性及びコラーゲン分解性活性の基質特異的が幅広いため、どのゼラチン分解
性及びコラーゲン分解性活性が重度の気道炎症において増大しているかを同定す
ることは不可能であり、観察に基づいて正確かつ迅速で特異的なチェアサイドツ
ールを開発することは不可能であった。
【００８０】 ＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭ（単独又はいかなる組み合わせ）の量の増大は
感染源ありでの又は感染源なしでの炎症の存在を反映しているが、病理学的に増
大した度合いのＭＭＰの活性化のみが活性相、つまり炎症部位で実際に進行しつ
つある組織破壊疾病過程と直接的に関連する証拠である。たとえタンパク質合成
及び細胞外及び細胞表面結合ＭＭＰの放出並びに身体の主要なＭＭＰ阻害剤（α
−２−マクログロブリン及びＭＭＰの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）の如き）による阻
害がＭＭＰのレベルに影響しても、進行する肺組織破壊及びその活性相に関する
主要な制御ステップはマトリックスメタロプロテイナーゼの潜在的プロ型（プロ
ＭＭＰ）単独及び／又はＭＭＰ−ＲＭ（いかなる組み合わせで）の活性化である
。
感染源ありでの又は感染源なしでの炎症の存在を反映しているが、病理学的に増
大した度合いのＭＭＰの活性化のみが活性相、つまり炎症部位で実際に進行しつ
つある組織破壊疾病過程と直接的に関連する証拠である。たとえタンパク質合成
及び細胞外及び細胞表面結合ＭＭＰの放出並びに身体の主要なＭＭＰ阻害剤（α
−２−マクログロブリン及びＭＭＰの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）の如き）による阻
害がＭＭＰのレベルに影響しても、進行する肺組織破壊及びその活性相に関する
主要な制御ステップはマトリックスメタロプロテイナーゼの潜在的プロ型（プロ
ＭＭＰ）単独及び／又はＭＭＰ−ＲＭ（いかなる組み合わせで）の活性化である
。
【００８１】 ＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭの活性は主に炎症部位で通常増大することが見
出されているが、一般的な循環ＭＭＰレベルの増大は気道炎症過程の関連では検
出されていない。このことは気道サンプルを用いることの重要性を示唆する。そ
れ故、ＭＭＰは肺の全部又は一部を表す組織液（例えば上皮裏打ち液（ＥＬＦ）
、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）、誘導された痰（ＩＳ）及び痰）から測定され
る必要がある。
出されているが、一般的な循環ＭＭＰレベルの増大は気道炎症過程の関連では検
出されていない。このことは気道サンプルを用いることの重要性を示唆する。そ
れ故、ＭＭＰは肺の全部又は一部を表す組織液（例えば上皮裏打ち液（ＥＬＦ）
、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）、誘導された痰（ＩＳ）及び痰）から測定され
る必要がある。
【００８２】 肺の全部又は一部を表す気道分泌サンプル中のＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭ
レベルは様々な既知の方法によって評価されている。本発明者は健康な及び病気
のヒト及び動物からの肺の全部を表す気道分泌サンプル並びに部分的な肺サンプ
ル中の潜在型及び活性型ＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭのレベルをザイモグラフ
を用いた方法、ＩＦＭＡ及び特異的抗体を用いたウエスタンブロットによって推
定した。
レベルは様々な既知の方法によって評価されている。本発明者は健康な及び病気
のヒト及び動物からの肺の全部を表す気道分泌サンプル並びに部分的な肺サンプ
ル中の潜在型及び活性型ＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭのレベルをザイモグラフ
を用いた方法、ＩＦＭＡ及び特異的抗体を用いたウエスタンブロットによって推
定した。
【００８３】 異なるＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭもウエスタンブロッティングによって同
定されている。酵素、調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、バンドはニトロセルロース
上に移され、前記ＭＭＰ及び／又はＭＭＰ／ＭＭＰ−ＲＭに対して特異的なポリ
クローナル抗体を用いて染色することによって特徴付けられた（Lauhio, A., 等
，Clin Exp Immunol 1994, 98: 21-28; Sorsa, T., 等，Ann. N.Y. Acad. Sci.,
732:112-131, 1994; Westerlund, U., 等，J. Dent. Res., 75(8): 1553-1563,
1996）。このような方法を用いると疾病の重症度とＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−
ＲＭの病理学的に増大したレベルの活性化の度合いとの相関関係を示す特異的結
果が得られたが、前記方法は日常的に用いるにはあまりにも面倒で時間がかかる
。更に、いかなる種類のものであれ電気泳動に基づいた迅速なチェアサイドテス
トを開発することは現時点では不可能である。しかし、重度の呼吸炎症は獣医師
によって動物収容所内で診断されるべきであり、分子的に同定されるべきである
。それ故、適切な治療を適切な時に与えることを可能にするため並びに抗炎症、
抗組織破壊及び抗コラーゲン分解治療の効果をモニターするため、診断は肺組織
破壊を表す気道サンプルから炎症の度合い、及びその重症度及び疾病の活性相を
評価することを目標とすべきである。炎症レベルの測定に加えて、増大したＭＭ
Ｐ及び／又はＭＭＰ−ＲＭレベルは肺疾病の重症度と関連した組織破壊の度合い
、治療モダリティーを含む治療の結果、並びに疾病の予後についての情報を与え
るべきである。ＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭのレベルが高いほど、それは組織
破壊のレベルが大きいということを、及び一層用心深い予後、本発明で示される
ような有用な治療モダリティー及び薬物治療の選択が必要となるということを意
味する。特定治療法の効力は疾病の重症度及び実際の活性と関連している。
定されている。酵素、調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、バンドはニトロセルロース
上に移され、前記ＭＭＰ及び／又はＭＭＰ／ＭＭＰ−ＲＭに対して特異的なポリ
クローナル抗体を用いて染色することによって特徴付けられた（Lauhio, A., 等
，Clin Exp Immunol 1994, 98: 21-28; Sorsa, T., 等，Ann. N.Y. Acad. Sci.,
732:112-131, 1994; Westerlund, U., 等，J. Dent. Res., 75(8): 1553-1563,
1996）。このような方法を用いると疾病の重症度とＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−
ＲＭの病理学的に増大したレベルの活性化の度合いとの相関関係を示す特異的結
果が得られたが、前記方法は日常的に用いるにはあまりにも面倒で時間がかかる
。更に、いかなる種類のものであれ電気泳動に基づいた迅速なチェアサイドテス
トを開発することは現時点では不可能である。しかし、重度の呼吸炎症は獣医師
によって動物収容所内で診断されるべきであり、分子的に同定されるべきである
。それ故、適切な治療を適切な時に与えることを可能にするため並びに抗炎症、
抗組織破壊及び抗コラーゲン分解治療の効果をモニターするため、診断は肺組織
破壊を表す気道サンプルから炎症の度合い、及びその重症度及び疾病の活性相を
評価することを目標とすべきである。炎症レベルの測定に加えて、増大したＭＭ
Ｐ及び／又はＭＭＰ−ＲＭレベルは肺疾病の重症度と関連した組織破壊の度合い
、治療モダリティーを含む治療の結果、並びに疾病の予後についての情報を与え
るべきである。ＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭのレベルが高いほど、それは組織
破壊のレベルが大きいということを、及び一層用心深い予後、本発明で示される
ような有用な治療モダリティー及び薬物治療の選択が必要となるということを意
味する。特定治療法の効力は疾病の重症度及び実際の活性と関連している。
【００８４】 常住性肺結合組織細胞（繊維芽細胞）及び気道裏打ち上皮及び腺細胞並びに浸
潤性炎症細胞（好中球単球、マクロファージ及び形質細胞）によって放出される
プロテアーゼは活性炎症性応答と関連した肺組織及び基底膜損傷及び破壊におい
て主要な役割を果たしていると示唆されている。少なくとも二つのクラスのプロ
テアーゼが炎症性肺組織損傷に関連していた。即ち、マトリックスメタロプロテ
イナーゼ（ＭＭＰ、マトリキシン）及びセリンプロテイナーゼ（エラスターゼ、
トリプシン、キモトリプシン等）である。前記酵素群は様々なしかし部分的に重
複し並びに補完する基質特異性を示し、破壊活動のモードはカスケードを形成す
ると示唆されている。そこではセリンプロテイナーゼが初めに潜在型プロＭＭＰ
を活性化し（Sorsa, T., 等，J. Biol. Chem., 272(34): 21067-21074, 1997）
、in vivoの炎症の活性相の部位で触媒的に競合するようにさせる。
潤性炎症細胞（好中球単球、マクロファージ及び形質細胞）によって放出される
プロテアーゼは活性炎症性応答と関連した肺組織及び基底膜損傷及び破壊におい
て主要な役割を果たしていると示唆されている。少なくとも二つのクラスのプロ
テアーゼが炎症性肺組織損傷に関連していた。即ち、マトリックスメタロプロテ
イナーゼ（ＭＭＰ、マトリキシン）及びセリンプロテイナーゼ（エラスターゼ、
トリプシン、キモトリプシン等）である。前記酵素群は様々なしかし部分的に重
複し並びに補完する基質特異性を示し、破壊活動のモードはカスケードを形成す
ると示唆されている。そこではセリンプロテイナーゼが初めに潜在型プロＭＭＰ
を活性化し（Sorsa, T., 等，J. Biol. Chem., 272(34): 21067-21074, 1997）
、in vivoの炎症の活性相の部位で触媒的に競合するようにさせる。
【００８５】 ＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭの増大した触媒活性に導く活性化の量及び度合
いは炎症部位で主に増大するが、一般的な循環マトリックスメタロプロテイナー
ゼレベルの増大は気道炎症過程では検出できないという事実に基づき、本発明者
は肺の全部又は一部における状況を表す気道分泌サンプルからＭＭＰ及び／又は
ＭＭＰ−ＲＭを測定することができる方法及びテストキットを開発した。かかる
液体サンプルは上皮裏打ち液（ＥＬＦ）、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）、誘導
された痰（ＩＳ）及び痰である。本発明者は痰、誘導された痰又は気管支肺胞洗
浄液（ＢＡＬ）が材料の獲得の時点の気道の状況を表すのに用いることができる
ということを示すことができた。ＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭをテストするた
めにこれらの気道分泌材料を用いて、本発明者は気道制限疾病の重度の悪化を予
測することが可能であること、及び悪化の過程及び適用された治療の結果を追跡
することが可能であることを示すことができた。
いは炎症部位で主に増大するが、一般的な循環マトリックスメタロプロテイナー
ゼレベルの増大は気道炎症過程では検出できないという事実に基づき、本発明者
は肺の全部又は一部における状況を表す気道分泌サンプルからＭＭＰ及び／又は
ＭＭＰ−ＲＭを測定することができる方法及びテストキットを開発した。かかる
液体サンプルは上皮裏打ち液（ＥＬＦ）、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）、誘導
された痰（ＩＳ）及び痰である。本発明者は痰、誘導された痰又は気管支肺胞洗
浄液（ＢＡＬ）が材料の獲得の時点の気道の状況を表すのに用いることができる
ということを示すことができた。ＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭをテストするた
めにこれらの気道分泌材料を用いて、本発明者は気道制限疾病の重度の悪化を予
測することが可能であること、及び悪化の過程及び適用された治療の結果を追跡
することが可能であることを示すことができた。
【００８６】 上述の通り、ＭＭＰは幅広く多岐にわたる基質特異的及び活性を有し、これら
はそれらの構造に加えて一連のサブタイプへのそれらの分類を可能にする。コラ
ゲナーゼは間質コラーゲンＩ、II及びIIIの三重ヘリックス領域を特異的に分解
する能力によって特徴付けられる間質コラゲナーゼ１（ＭＭＰ−１）、好中球コ
ラゲナーゼ又はコラゲナーゼ２（ＭＭＰ−８）及びコラゲナーゼ３（ＭＭＰ−１
３）を含む。ゼラチナーゼはゼラチン及び生のタイプIVコラーゲン、エラスチン
及び他の基質を特異的に開裂する能力によって特徴付けられるゼラチナーゼＡ及
びＢ（それぞれ７２ｋＤのタイプIVコラゲナーゼ（ＭＭＰ−２）及び９２ｋＤの
タイプIVコラゲナーゼ（ＭＭＰ−９））を含む。ストロメリシン（ＭＭＰ−３、
ＭＭＰ−１０及びＭＭＰ−１１）はアグレカン、フィブロネクシン、ラミニン、
多数のコラーゲンタイプを含む様々な基質を特徴的に分解し、他の潜在型プロＭ
ＭＰの活性化において、役割を果たす。ＭＭＰファミリーはコラゲナーゼ、ゼラ
チナーゼ及びストロメリシンサブファミリーには適合しない他のＭＭＰをいくつ
か含む。マトリリシン（ＭＭＰ−７；ＰＵＭＰ−１）は他のＭＭＰファミリーメ
ンバーには共通するＣ末端ドメインを欠失しているという点で構造的に実質的に
異なる。メタロエラスターゼ（ＭＭＰ−１２）はエラスチンを分解するその能力
によって特徴付けられる。ＭＭＰ−２０（エナメリシン）はアメロゲニンを分解
することができ、歯の発育に関与していることが示されているが（Llano, E.,
等，Biochemistry, 36(49):15101-08, 1997）、がんの進行にも関与しているこ
とが示されている（Salo, T., 等，J. Dent. Res., 77:879, Abstr 1978, 1997
）。膜型ＭＭＰは細胞表面で単独に発現され、がん及び転移形成に特に関連して
いると従来考えられていた。前記ＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭは全て本発明の
範囲に組み入れられる。
はそれらの構造に加えて一連のサブタイプへのそれらの分類を可能にする。コラ
ゲナーゼは間質コラーゲンＩ、II及びIIIの三重ヘリックス領域を特異的に分解
する能力によって特徴付けられる間質コラゲナーゼ１（ＭＭＰ−１）、好中球コ
ラゲナーゼ又はコラゲナーゼ２（ＭＭＰ−８）及びコラゲナーゼ３（ＭＭＰ−１
３）を含む。ゼラチナーゼはゼラチン及び生のタイプIVコラーゲン、エラスチン
及び他の基質を特異的に開裂する能力によって特徴付けられるゼラチナーゼＡ及
びＢ（それぞれ７２ｋＤのタイプIVコラゲナーゼ（ＭＭＰ−２）及び９２ｋＤの
タイプIVコラゲナーゼ（ＭＭＰ−９））を含む。ストロメリシン（ＭＭＰ−３、
ＭＭＰ−１０及びＭＭＰ−１１）はアグレカン、フィブロネクシン、ラミニン、
多数のコラーゲンタイプを含む様々な基質を特徴的に分解し、他の潜在型プロＭ
ＭＰの活性化において、役割を果たす。ＭＭＰファミリーはコラゲナーゼ、ゼラ
チナーゼ及びストロメリシンサブファミリーには適合しない他のＭＭＰをいくつ
か含む。マトリリシン（ＭＭＰ−７；ＰＵＭＰ−１）は他のＭＭＰファミリーメ
ンバーには共通するＣ末端ドメインを欠失しているという点で構造的に実質的に
異なる。メタロエラスターゼ（ＭＭＰ−１２）はエラスチンを分解するその能力
によって特徴付けられる。ＭＭＰ−２０（エナメリシン）はアメロゲニンを分解
することができ、歯の発育に関与していることが示されているが（Llano, E.,
等，Biochemistry, 36(49):15101-08, 1997）、がんの進行にも関与しているこ
とが示されている（Salo, T., 等，J. Dent. Res., 77:879, Abstr 1978, 1997
）。膜型ＭＭＰは細胞表面で単独に発現され、がん及び転移形成に特に関連して
いると従来考えられていた。前記ＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭは全て本発明の
範囲に組み入れられる。
【００８７】 前記ＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭは様々な体の組織バリヤー及び膜を通って
細胞が侵入して移行する能力に本質的であるが、追加的にそれらは細胞外膜（Ｅ
ＣＭ）及び基底膜（ＢＭ）タンパク質構成成分に対する直接的分解作用によって
も特徴付けられる。加えて、ＭＭＰはセリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン）、
接着分子、細胞表面要素及びサイトキシン並びに前炎症性媒介因子及び補体成分
を分解して不活性化する。かくしてＭＭＰは正常な再構築されつつある更新状況
においては低レベルで体細胞及び組織によって発現され合成されるが、異常な状
況（例えば炎症性の病気にかかった肺組織と関連する状況）においてはＭＭＰ及
び／又はＭＭＰ−ＲＭは増大したＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭ活性化としばし
ば関連した病理学的に増大したレベルで発現される。これはカスケードで生じか
つ作用することができ、体自身の内在性抗プロテイナーゼシールドを克服する。
最後に述べた特徴は本発明においては特に例証され利用される。そこでは様々な
ＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭの発現レベルの増大は病気にかかった気道分泌サ
ンプルにおけるそれらの活性化の度合いの増大と通常関連しており、一方触媒的
に不競合の潜在的プロ型のＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭの低レベルは持続的に
存在する。特にＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭはそれらの潜在的プロ型からのＮ
末端プロペプチドのタンパク質分解的除去による活性化に対するそれらの感受性
によって他のプロテイナーゼとは区別される。活性化に加えてプロＭＭＰ、つま
り潜在的プロ型はそれらの細胞外調節において主要なステップである。ＭＭＰは
転写レベル、タンパク質合成及び放出レベルで更に調節される。特に、複合体化
された又は誘導体化されたＭＭＰ型（ＭＭＰ−ＲＭ）、内在性阻害剤（即ちＭＭ
Ｐの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）及びα−２−マクログロブリン（α−２Ｍ）によっ
てトラップされた又は結合されたＭＭＰ型（ＭＭＰ−ＲＭ）は疾病の部位でin v
ivo活性化されたＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭを表す（Handbook of Proteolyt
ic Enzymes, Eds., Barrett, A.J. 等，pp. 1-1696, Academic Press, 1998）。
細胞が侵入して移行する能力に本質的であるが、追加的にそれらは細胞外膜（Ｅ
ＣＭ）及び基底膜（ＢＭ）タンパク質構成成分に対する直接的分解作用によって
も特徴付けられる。加えて、ＭＭＰはセリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン）、
接着分子、細胞表面要素及びサイトキシン並びに前炎症性媒介因子及び補体成分
を分解して不活性化する。かくしてＭＭＰは正常な再構築されつつある更新状況
においては低レベルで体細胞及び組織によって発現され合成されるが、異常な状
況（例えば炎症性の病気にかかった肺組織と関連する状況）においてはＭＭＰ及
び／又はＭＭＰ−ＲＭは増大したＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭ活性化としばし
ば関連した病理学的に増大したレベルで発現される。これはカスケードで生じか
つ作用することができ、体自身の内在性抗プロテイナーゼシールドを克服する。
最後に述べた特徴は本発明においては特に例証され利用される。そこでは様々な
ＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭの発現レベルの増大は病気にかかった気道分泌サ
ンプルにおけるそれらの活性化の度合いの増大と通常関連しており、一方触媒的
に不競合の潜在的プロ型のＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭの低レベルは持続的に
存在する。特にＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭはそれらの潜在的プロ型からのＮ
末端プロペプチドのタンパク質分解的除去による活性化に対するそれらの感受性
によって他のプロテイナーゼとは区別される。活性化に加えてプロＭＭＰ、つま
り潜在的プロ型はそれらの細胞外調節において主要なステップである。ＭＭＰは
転写レベル、タンパク質合成及び放出レベルで更に調節される。特に、複合体化
された又は誘導体化されたＭＭＰ型（ＭＭＰ−ＲＭ）、内在性阻害剤（即ちＭＭ
Ｐの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）及びα−２−マクログロブリン（α−２Ｍ）によっ
てトラップされた又は結合されたＭＭＰ型（ＭＭＰ−ＲＭ）は疾病の部位でin v
ivo活性化されたＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭを表す（Handbook of Proteolyt
ic Enzymes, Eds., Barrett, A.J. 等，pp. 1-1696, Academic Press, 1998）。
【００８８】 異なる型のＭＴ−ＭＭＰが細胞外炎症性体液中に発現されて放出されるのかど
うかは今までのところ明らかにされていなかった。本発明において初めて得られ
て記述された結果は活性な／活性化された型の可溶性ＭＴ１−ＭＭＰのレベルの
増大がヒトの気管支喘息のような肺疾病の誘導された咳／ＢＡＬ液中に存在し、
活性ＭＴ１−ＭＭＰ型は病気の咳中のみに生ずるということを示す。また、ＭＭ
Ｐ−２は同一サンプル中で活性化された。このことはヒトの気管支喘息の如き肺
疾病におけるこのＭＴ１−ＭＭＰ−ＭＭＰ−２カスケードの潜在的な関与を示唆
する。
うかは今までのところ明らかにされていなかった。本発明において初めて得られ
て記述された結果は活性な／活性化された型の可溶性ＭＴ１−ＭＭＰのレベルの
増大がヒトの気管支喘息のような肺疾病の誘導された咳／ＢＡＬ液中に存在し、
活性ＭＴ１−ＭＭＰ型は病気の咳中のみに生ずるということを示す。また、ＭＭ
Ｐ−２は同一サンプル中で活性化された。このことはヒトの気管支喘息の如き肺
疾病におけるこのＭＴ１−ＭＭＰ−ＭＭＰ−２カスケードの潜在的な関与を示唆
する。
【００８９】 肺疾病、肺炎症及び／又は肺組織破壊の活性相はＭＭＰ−２，ＭＭＰ−８，Ｍ
ＭＰ−９，ＭＭＰ−１３，ＭＭＰ−１４及びＮＧＡＬの如きＭＭＰ及び／又はＭ
ＭＰ−ＲＭを記録することによって評価される。ＭＭＰ−ＲＭ免疫反応性は気道
サンプル（ＲＳ）、ＴＥＬＦ（気管気管支上皮裏打ち液）、ＢＡＬＦ（気管支肺
胞洗浄液）、Ｓ（痰）及びＩＳ（誘導された痰）から測定される。気管気管支上
皮裏打ち液（ＴＥＬＦ）は内視鏡のバイオプシーチャネルを通して挿入されたカ
テーテルを通して吸引される。気管気管支洗浄液も内視鏡のバイオプシーチャネ
ルを通して挿入されたカテーテルを通してＮａＣｌで洗浄することによって得る
ことができるし、又は気管洗浄によって得られた気管気管支洗浄液として得るこ
とができる（Roberts, C.A., Equine Vet. Educ., 4: 266-268, 1992）。気管支
肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）はファイバー内視鏡を用いることによって得られ（Baug
ham, R.P., Bronchoalveolar Lavage, Mosby Year Book, Inc., 1992）、及び誘
導された痰は高張性ＮａＣｌの吸入によって得られる（Kips, J.C., 等，Eur. R
espir. J., Suppl.,26:9s-12s, 1998; Kips, J.C., 等，Eur. Respir. J., 11(3
):529-533, 1998）。気道呼気の空気濃縮物はしかるべくして得られる。
ＭＰ−９，ＭＭＰ−１３，ＭＭＰ−１４及びＮＧＡＬの如きＭＭＰ及び／又はＭ
ＭＰ−ＲＭを記録することによって評価される。ＭＭＰ−ＲＭ免疫反応性は気道
サンプル（ＲＳ）、ＴＥＬＦ（気管気管支上皮裏打ち液）、ＢＡＬＦ（気管支肺
胞洗浄液）、Ｓ（痰）及びＩＳ（誘導された痰）から測定される。気管気管支上
皮裏打ち液（ＴＥＬＦ）は内視鏡のバイオプシーチャネルを通して挿入されたカ
テーテルを通して吸引される。気管気管支洗浄液も内視鏡のバイオプシーチャネ
ルを通して挿入されたカテーテルを通してＮａＣｌで洗浄することによって得る
ことができるし、又は気管洗浄によって得られた気管気管支洗浄液として得るこ
とができる（Roberts, C.A., Equine Vet. Educ., 4: 266-268, 1992）。気管支
肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）はファイバー内視鏡を用いることによって得られ（Baug
ham, R.P., Bronchoalveolar Lavage, Mosby Year Book, Inc., 1992）、及び誘
導された痰は高張性ＮａＣｌの吸入によって得られる（Kips, J.C., 等，Eur. R
espir. J., Suppl.,26:9s-12s, 1998; Kips, J.C., 等，Eur. Respir. J., 11(3
):529-533, 1998）。気道呼気の空気濃縮物はしかるべくして得られる。
【００９０】 かくして本発明においては合成されて続いて細胞外環境に放出されたマトリッ
クスメタロプロテイナーゼに加えて膜タイプのマトリックスメタプロテイナーゼ
（ＭＴ−ＭＭＰ）（これは細胞表面及び／又は細胞膜に結合するのみであると従
来信じられていた）も実際にはヒトの気管支喘息及び気管支拡張症患者の気管支
肺胞洗浄液／誘導された痰上澄み中に見出されるということが初めて示された。
前記の増大したレベルのＭＴ−ＭＭＰは病気の液体において活性化されもするが
、健康な液体細胞中に見出される低レベルは不活性のままである。かくして、本
発明によって明らかに示されたように、ヒトの気管支喘息患者の誘導された痰／
ＢＡＬ液における及び肺液体サンプルにおける膜タイプのマトリックスメタロプ
ロテイナーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）の増大されて活性化されたレベルは他のＭＭＰ及
び／又はＭＭＰ−ＲＭと同様に診断テストにおいて単独で又はいかなる組み合わ
せで用いることができる。
クスメタロプロテイナーゼに加えて膜タイプのマトリックスメタプロテイナーゼ
（ＭＴ−ＭＭＰ）（これは細胞表面及び／又は細胞膜に結合するのみであると従
来信じられていた）も実際にはヒトの気管支喘息及び気管支拡張症患者の気管支
肺胞洗浄液／誘導された痰上澄み中に見出されるということが初めて示された。
前記の増大したレベルのＭＴ−ＭＭＰは病気の液体において活性化されもするが
、健康な液体細胞中に見出される低レベルは不活性のままである。かくして、本
発明によって明らかに示されたように、ヒトの気管支喘息患者の誘導された痰／
ＢＡＬ液における及び肺液体サンプルにおける膜タイプのマトリックスメタロプ
ロテイナーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）の増大されて活性化されたレベルは他のＭＭＰ及
び／又はＭＭＰ−ＲＭと同様に診断テストにおいて単独で又はいかなる組み合わ
せで用いることができる。
【００９１】 対応する観察がいわゆる「マトリックスメタロプロテイナーゼ関連分子」の代
表（即ち好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）であり、これは９２ｋ
ＤのゼラチナーゼＢ（ＭＭＰ−９）と関連する２５ｋＤのリポカリンを含む約１
２０ｋＤの複合体を形成する）と関連して行われた。健康なコントロールに対す
るモノマー、マルチマー及び／又は断片化されたＮＧＡＬ免疫反応性の増大した
レベルは気管支喘息及び気管支拡張症患者の誘導された痰の上澄み液中に観察さ
れた。従って、ＮＧＡＬの如きＭＭＰに関連した及び／又はＭＭＰ調節分子（Ｍ
ＭＰ−ＲＭ）は本発明の診断的チェアサイドテスト装置において用いることがで
きる。
表（即ち好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）であり、これは９２ｋ
ＤのゼラチナーゼＢ（ＭＭＰ−９）と関連する２５ｋＤのリポカリンを含む約１
２０ｋＤの複合体を形成する）と関連して行われた。健康なコントロールに対す
るモノマー、マルチマー及び／又は断片化されたＮＧＡＬ免疫反応性の増大した
レベルは気管支喘息及び気管支拡張症患者の誘導された痰の上澄み液中に観察さ
れた。従って、ＮＧＡＬの如きＭＭＰに関連した及び／又はＭＭＰ調節分子（Ｍ
ＭＰ−ＲＭ）は本発明の診断的チェアサイドテスト装置において用いることがで
きる。
【００９２】 マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）及び／又は関連分子（ＭＭＰ−
ＲＭ）に対して誘導された抗体であってそれらを特異的に認識することができる
抗体がヒト及びウマから得られた気道分泌サンプルの免疫ブロット分析において
本発明者によって用いられた。示された結果は、それぞれの遺伝的に区別される
細胞外及び膜型メンバーのＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭはそれらの活性型及び
／又は潜在型、スプライス変異体のみならず、それらの誘導体化され、複合体化
され、断片化され、トラップされ及び／又は短くされた形態でも、活性化された
ＭＭＰ（これらはα−２−マクログロブリン（α−２Ｍ）、ＭＭＰでの組織阻害
剤（ＴＩＭＰ）及びＮＧＡＬの如きそれらの阻害剤及び他の調節タンパク質に結
合及び／又はトラップされている）を反映することを明らかに示した。細胞外及
び膜型ＭＭＰ及び関連分子の誘導体化され、断片化され及び／又は短くされた形
態並びにスプライス変異体も気道における重度の炎症及び組織破壊によって引き
起こされるＭＭＰ活性化及び／又はＭＭＰ活性化カスケードを反映する。ＲＳサ
ンプルの如き体液中の細胞内スプライス変異体生成物の放出及び存在は肺の炎症
／疾病部位での細胞死を反映していることがあり得る。
ＲＭ）に対して誘導された抗体であってそれらを特異的に認識することができる
抗体がヒト及びウマから得られた気道分泌サンプルの免疫ブロット分析において
本発明者によって用いられた。示された結果は、それぞれの遺伝的に区別される
細胞外及び膜型メンバーのＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭはそれらの活性型及び
／又は潜在型、スプライス変異体のみならず、それらの誘導体化され、複合体化
され、断片化され、トラップされ及び／又は短くされた形態でも、活性化された
ＭＭＰ（これらはα−２−マクログロブリン（α−２Ｍ）、ＭＭＰでの組織阻害
剤（ＴＩＭＰ）及びＮＧＡＬの如きそれらの阻害剤及び他の調節タンパク質に結
合及び／又はトラップされている）を反映することを明らかに示した。細胞外及
び膜型ＭＭＰ及び関連分子の誘導体化され、断片化され及び／又は短くされた形
態並びにスプライス変異体も気道における重度の炎症及び組織破壊によって引き
起こされるＭＭＰ活性化及び／又はＭＭＰ活性化カスケードを反映する。ＲＳサ
ンプルの如き体液中の細胞内スプライス変異体生成物の放出及び存在は肺の炎症
／疾病部位での細胞死を反映していることがあり得る。
【００９３】 以下に掲げるＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭを認識するポリクローナル及びモ
ノクローナル抗体の様々な代表例は本質的に既知の方法によって生産することが
できるが、これらは以下の供給源からも例えば商業的に入手することができる。
ノクローナル抗体の様々な代表例は本質的に既知の方法によって生産することが
できるが、これらは以下の供給源からも例えば商業的に入手することができる。
【００９４】
【外１】
【００９５】
【外２】
【００９６】 本発明のモノクローナル抗体はKoehler及びMilsteinのオリジナル技術（Natur
e 256, 495, 1975）に従って生産された。ＭＭＰ−８を特にその活性型で認識す
る前記抗体の生産方法は米国特許第５７３６３４１号に記載されている。これは
参考文献としてここに組み入れる。同様に、他のマトリックスメタロプロテイナ
ーゼ関連分子を認識するモノクローナル抗体は当該技術分野の当業者によって生
産されることができる。ＭＭＰ−ＲＭを認識する結合物質の代表例としてはＮＧ
ＡＬを認識する結合物質を挙げることができる。それらの検出及び生産方法は米
国特許第５８６６４３２号に記載されている。これも参考文献としてここに組み
入れる。
e 256, 495, 1975）に従って生産された。ＭＭＰ−８を特にその活性型で認識す
る前記抗体の生産方法は米国特許第５７３６３４１号に記載されている。これは
参考文献としてここに組み入れる。同様に、他のマトリックスメタロプロテイナ
ーゼ関連分子を認識するモノクローナル抗体は当該技術分野の当業者によって生
産されることができる。ＭＭＰ−ＲＭを認識する結合物質の代表例としてはＮＧ
ＡＬを認識する結合物質を挙げることができる。それらの検出及び生産方法は米
国特許第５８６６４３２号に記載されている。これも参考文献としてここに組み
入れる。
【００９７】 抗体はＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭ（単独又は組み合わせ）の存在又は不在
を記録可能にすることができるラベル又はマーカー分子を所望により取り付けら
れることができる。様々なラベル、マーカー又はタグ又はいわゆるトレーサーが
抗体又はそれぞれの抗原との組み合わせで知られており、文献、実験室の手引き
書及び特許文献に記載されている。かかるラベル又はマーカーは例えば着色ラテ
ックス粒子、蛍光色素、リポソーム、金属コロイド等である。しかし、かかるラ
ベル及びマーカーは必ずしも用いる必要がないということに注意すべきである。
例えば比濁分析アッセイでは一種類のポリクローナル抗体のみが用いられ、これ
が抗原に結合するとサンプル溶液は混濁する。この混濁は反応中に形成した抗体
−抗原集合体によって生ずる。前記集合体は可視的に検出することができる。
を記録可能にすることができるラベル又はマーカー分子を所望により取り付けら
れることができる。様々なラベル、マーカー又はタグ又はいわゆるトレーサーが
抗体又はそれぞれの抗原との組み合わせで知られており、文献、実験室の手引き
書及び特許文献に記載されている。かかるラベル又はマーカーは例えば着色ラテ
ックス粒子、蛍光色素、リポソーム、金属コロイド等である。しかし、かかるラ
ベル及びマーカーは必ずしも用いる必要がないということに注意すべきである。
例えば比濁分析アッセイでは一種類のポリクローナル抗体のみが用いられ、これ
が抗原に結合するとサンプル溶液は混濁する。この混濁は反応中に形成した抗体
−抗原集合体によって生ずる。前記集合体は可視的に検出することができる。
【００９８】 得られた結果及び利用可能な抗体に基づき、本発明者は炎症状況及び組織破壊
状況の有効かつ迅速で信頼できる評価を行うための、並びにヒト及び動物の気道
における疾病活性の相を同定するための新規の方法及びテストキットを開発した
。本発明の方法及びテストキットはＭＭＰの活性化（これはＭＭＰ−２，ＭＭＰ
−８，ＭＭＰ−９，ＭＭＰ−１３，ＭＭＰ−１４，ＭＴ１−ＭＭＰ及びＮＧＡＬ
の如き総ＭＭＰ、特にそれらの活性化型から例えば測定される）と気道における
炎症、組織破壊の重症度及び疾病活性の相との間に特に関連があるという事実に
基づいている。肺疾病の部位での細胞死はＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭスプラ
イス変異体を分析することによって測定することができる。また、特定のＭＭＰ
及び／又はＭＭＰ−ＲＭ（単独又はいかなる組み合わせ）は他のものよりも特定
肺疾病を評価することにおいて一層特異的であること、及びヒトと動物では特異
性及び選択性においていくらか差異があることが示されている。従って、多数の
ＭＭＰ及びＭＭＰ−ＲＭ（単独又は組み合わせ）を同一のテストストリップ上で
又は別々のテストストリップ上で同時に測定することができるキットを開発する
ことが有利である。好ましい実施態様においては、特定の診断目的にとって最も
好適又は有効であることが示されているＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭ（単独又
はいかなる組み合わせ）がテストキット用に選択された。
状況の有効かつ迅速で信頼できる評価を行うための、並びにヒト及び動物の気道
における疾病活性の相を同定するための新規の方法及びテストキットを開発した
。本発明の方法及びテストキットはＭＭＰの活性化（これはＭＭＰ−２，ＭＭＰ
−８，ＭＭＰ−９，ＭＭＰ−１３，ＭＭＰ−１４，ＭＴ１−ＭＭＰ及びＮＧＡＬ
の如き総ＭＭＰ、特にそれらの活性化型から例えば測定される）と気道における
炎症、組織破壊の重症度及び疾病活性の相との間に特に関連があるという事実に
基づいている。肺疾病の部位での細胞死はＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭスプラ
イス変異体を分析することによって測定することができる。また、特定のＭＭＰ
及び／又はＭＭＰ−ＲＭ（単独又はいかなる組み合わせ）は他のものよりも特定
肺疾病を評価することにおいて一層特異的であること、及びヒトと動物では特異
性及び選択性においていくらか差異があることが示されている。従って、多数の
ＭＭＰ及びＭＭＰ−ＲＭ（単独又は組み合わせ）を同一のテストストリップ上で
又は別々のテストストリップ上で同時に測定することができるキットを開発する
ことが有利である。好ましい実施態様においては、特定の診断目的にとって最も
好適又は有効であることが示されているＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭ（単独又
はいかなる組み合わせ）がテストキット用に選択された。
【００９９】 実験で得られた様々な数値結果はテスト条件において結合物質又は抗体の様々
な組み合わせを使用したこと及び他の変化を反映している。しかし、活性ＭＭＰ
及び／又はＭＭＰ−ＲＭについて疾病の人と健康な人の間の比はほぼ同じであり
、定性的、半定量的又は定量的テストでさえも気道における疾病の重症度のチェ
アサイド又はベッドサイド評価用に開発することができるということに注意する
ことは重要である。結果は記録可能な結合反応を行うことができる基質を加える
ことによって直接的に又は間接的に装置によって又は可視的に記録することがで
きる。
な組み合わせを使用したこと及び他の変化を反映している。しかし、活性ＭＭＰ
及び／又はＭＭＰ−ＲＭについて疾病の人と健康な人の間の比はほぼ同じであり
、定性的、半定量的又は定量的テストでさえも気道における疾病の重症度のチェ
アサイド又はベッドサイド評価用に開発することができるということに注意する
ことは重要である。結果は記録可能な結合反応を行うことができる基質を加える
ことによって直接的に又は間接的に装置によって又は可視的に記録することがで
きる。
【０１００】 これらの発見は総、つまり潜在型及び活性型ＭＭＰ又はＭＭＰ−ＲＭ（単独又
は組み合わせ）の両方を測定するモノクローナル抗体を用いる免疫クロマトグラ
フィーテストが呼吸疾病活性を診断するために十分満足できるということを示す
。本明細書に開示された発明は必要な治療の種類及び治療法の効力を正確に評価
するための高度に有効な診断ツールを提供する。本発明の方法及びキットは気道
炎症の重症度及び前記疾病に関連して感染及び／又は物理的ストレスによって生
ずる危険性を評価するための代替的なチェアサイド又はベッドサイド及びオンフ
ィールド診断ツールをも提供する。同時にその方法及びテストキットは治療法の
効力並びに得られた用量治療応答の研究を追跡するための有効なツールを提供す
る。
は組み合わせ）の両方を測定するモノクローナル抗体を用いる免疫クロマトグラ
フィーテストが呼吸疾病活性を診断するために十分満足できるということを示す
。本明細書に開示された発明は必要な治療の種類及び治療法の効力を正確に評価
するための高度に有効な診断ツールを提供する。本発明の方法及びキットは気道
炎症の重症度及び前記疾病に関連して感染及び／又は物理的ストレスによって生
ずる危険性を評価するための代替的なチェアサイド又はベッドサイド及びオンフ
ィールド診断ツールをも提供する。同時にその方法及びテストキットは治療法の
効力並びに得られた用量治療応答の研究を追跡するための有効なツールを提供す
る。
【０１０１】 これらの発見に基づき、気道における炎症のレベル及び／又は重症度並びに肺
組織破壊疾病過程の活性相を診断するための、及び薬物治療、他の治療モダリテ
ィー、他の薬物療法の効力を評価するための、及び／又は前記疾病が進行する危
険性を予測するための方法及びテストキットであって、検出が感染によって誘導
された又は誘導されていない気道分泌サンプルから一種以上のＭＭＰ及び／又は
ＭＭＰ−ＲＭ、及び膜型ＭＭＰ（ＭＴ−ＭＭＰ）、ＭＭＰ活性化因子（ＭＭＰ−
ＲＭに含まれる）及びＭＭＰ−又はＭＭＰ−ＲＭスプライス変異体（単独及び／
又は組み合わせ）を特異的に測定することによる、気道分泌サンプルを用いる迅
速かつ信頼できる免疫学的チェアサイドアッセイとして行われる方法及びテスト
キットが開発された。
組織破壊疾病過程の活性相を診断するための、及び薬物治療、他の治療モダリテ
ィー、他の薬物療法の効力を評価するための、及び／又は前記疾病が進行する危
険性を予測するための方法及びテストキットであって、検出が感染によって誘導
された又は誘導されていない気道分泌サンプルから一種以上のＭＭＰ及び／又は
ＭＭＰ−ＲＭ、及び膜型ＭＭＰ（ＭＴ−ＭＭＰ）、ＭＭＰ活性化因子（ＭＭＰ−
ＲＭに含まれる）及びＭＭＰ−又はＭＭＰ−ＲＭスプライス変異体（単独及び／
又は組み合わせ）を特異的に測定することによる、気道分泌サンプルを用いる迅
速かつ信頼できる免疫学的チェアサイドアッセイとして行われる方法及びテスト
キットが開発された。
【０１０２】 ＭＭＰを測定するための本発明のテストキットの調製及び開発は米国特許第５
７３６３４１号に記載されており、これは参考文献としてここに組み入れる。た
とえ前記特許がＭＭＰ−８の活性部位を認識する結合物質の助けによって歯周病
を診断するためのテストキットの開発に制限されているとしても、当業者はその
情報を本発明のＭＭＰ−ＲＭを測定するための対応するテストキットを開発する
ために使用できる。チェアサイド又はベッドサイドキットとして有用な及びオン
フィールドテストキットとして適用できる他の方法及びテストキットは以下に示
す特許公報の非限定的なリストに記載されている：ＵＳ ５５９１６４５，ＵＳ
５７１２１７０，ＵＳ ５６０２０４０，ＵＳ ５６２２８７１，ＵＳ ５６
５６５０３，ＥＰ １４９１６８，ＵＳ ４５５２８３９，ＵＳ ４３６１５３
７，ＵＳ ４３７３９３２，ＷＯ ８６／０４６８３，ＥＰ １５４７４９，Ｅ
Ｐ ７６５４，ＷＯ ８６／０３８３９，ＥＰ １９１６４０，ＥＰ ２１２５
９９，ＵＳ ４５５２８３９，ＥＰ １５８７４６，ＥＰ ２２５０５４。
７３６３４１号に記載されており、これは参考文献としてここに組み入れる。た
とえ前記特許がＭＭＰ−８の活性部位を認識する結合物質の助けによって歯周病
を診断するためのテストキットの開発に制限されているとしても、当業者はその
情報を本発明のＭＭＰ−ＲＭを測定するための対応するテストキットを開発する
ために使用できる。チェアサイド又はベッドサイドキットとして有用な及びオン
フィールドテストキットとして適用できる他の方法及びテストキットは以下に示
す特許公報の非限定的なリストに記載されている：ＵＳ ５５９１６４５，ＵＳ
５７１２１７０，ＵＳ ５６０２０４０，ＵＳ ５６２２８７１，ＵＳ ５６
５６５０３，ＥＰ １４９１６８，ＵＳ ４５５２８３９，ＵＳ ４３６１５３
７，ＵＳ ４３７３９３２，ＷＯ ８６／０４６８３，ＥＰ １５４７４９，Ｅ
Ｐ ７６５４，ＷＯ ８６／０３８３９，ＥＰ １９１６４０，ＥＰ ２１２５
９９，ＵＳ ４５５２８３９，ＥＰ １５８７４６，ＥＰ ２２５０５４。
【０１０３】 気道炎症の重症度を診断するために並びに疾病の進行及び医学治療の効果を縦
方向又は横方向にスクリーニングするためにいかなる免疫化学テスト方法も原則
として用いることができる。しかし、可視的な凝集、フロースルー及び免疫クロ
マトグラフィー方法が迅速なチェアサイド又はベッドサイドテストには最も適し
ている。いくつかの異なる抗体を別々のゾーンに含むテストスティック又はテス
トストリップを調製することが可能であり、それを用いていくつかのＭＭＰ及び
／又はＭＭＰ−ＲＭを同時に検出することが可能である。
方向又は横方向にスクリーニングするためにいかなる免疫化学テスト方法も原則
として用いることができる。しかし、可視的な凝集、フロースルー及び免疫クロ
マトグラフィー方法が迅速なチェアサイド又はベッドサイドテストには最も適し
ている。いくつかの異なる抗体を別々のゾーンに含むテストスティック又はテス
トストリップを調製することが可能であり、それを用いていくつかのＭＭＰ及び
／又はＭＭＰ−ＲＭを同時に検出することが可能である。
【０１０４】 本発明の特異的な実施態様では、医師又は獣医師は吸収性ストリップ又は対応
する固体支持体を内視鏡装置及び／又はカテーテルに配置することによって肺の
全部又は一部を表す気道分泌サンプルの標本を採取することができる。テストス
トリップは気道から液体を好ましくは標準化された時間の間吸収させられる。最
後に、浸漬スティックタイプのテスト装置はテスト装置中に直接吸収されたサン
プル源と接触して配置される吸収端を含むように設計されることができる。
する固体支持体を内視鏡装置及び／又はカテーテルに配置することによって肺の
全部又は一部を表す気道分泌サンプルの標本を採取することができる。テストス
トリップは気道から液体を好ましくは標準化された時間の間吸収させられる。最
後に、浸漬スティックタイプのテスト装置はテスト装置中に直接吸収されたサン
プル源と接触して配置される吸収端を含むように設計されることができる。
【０１０５】 本発明の方法及びテストキットの実行可能性及び適用性は行われた実験及びそ
の結果を記述する以下の実施例において記述される。
の結果を記述する以下の実施例において記述される。
【０１０６】 実施例１ ヒトにおけるサンプル採取方法 ａ．ＢＡＬの実行及びＢＡＬＦ処理 ＢＡＬは局所麻酔下で光ファイバー気管支鏡を介して行われた。五つの２０ｍ
ｌの０．９％ ＮａＣｌは３７℃に温められ、分節気管支に注入され、直ちに各
量が吸引によって戻された。未処理の／未遠心分離のＢＡＬＦから５０μｌがTr
ypanブルー染色のために用いられてＢＡＬＦ細胞のサーベイランスが評価された
。そして３ｍｌが細胞遠心分離（cyto-centrifuge）調製のために用いられた。
残りのＢＡＬＦは５００ｇで１５分間遠心分離され、上澄みは分離され、５００
μｌずつ−７０℃で保存された。細胞ペレットは細胞遠心分離調製物として−７
０℃で保存された。
ｌの０．９％ ＮａＣｌは３７℃に温められ、分節気管支に注入され、直ちに各
量が吸引によって戻された。未処理の／未遠心分離のＢＡＬＦから５０μｌがTr
ypanブルー染色のために用いられてＢＡＬＦ細胞のサーベイランスが評価された
。そして３ｍｌが細胞遠心分離（cyto-centrifuge）調製のために用いられた。
残りのＢＡＬＦは５００ｇで１５分間遠心分離され、上澄みは分離され、５００
μｌずつ−７０℃で保存された。細胞ペレットは細胞遠心分離調製物として−７
０℃で保存された。
【０１０７】 ｂ．誘導された痰 超音波噴霧器（そのレシーバーは１００ｍｌ滅菌３％塩水で満たされた）が用
いられた。口をすすいだ後、痰の誘導は溶液を患者が５分間〜３０分間吸入する
ことによって行われた。患者は彼らの痰サンプルを５０ｍｌの滅菌チューブに採
取した。このチューブはサンプル採取中氷上に保持されていた。誘導された材料
は次のようにして分離された：（ｉ）等量のジチオトリエトール１０％（Sputol
ysin; Behring Diagnostics Inc., Somerville, NY）がサンプルに添加され、溶
液は室温で１５分間渦によって混合された。５００ｇで２０分間遠心分離した後
、上澄みは分離され、−７０℃で保存された。細胞ペレットはＰＢＳ中に懸濁さ
れ、細胞遠心分離された。代わりに、以下のサンプル採取プロトコールも用いる
ことができる。痰サンプルの一部は５００００ｇで４℃で６０分間遠心分離され
、上澄みの分離相は少量ずつ−７０℃で保存された。一方、細胞ペレットは上述
したのと同じ処理に供された。
いられた。口をすすいだ後、痰の誘導は溶液を患者が５分間〜３０分間吸入する
ことによって行われた。患者は彼らの痰サンプルを５０ｍｌの滅菌チューブに採
取した。このチューブはサンプル採取中氷上に保持されていた。誘導された材料
は次のようにして分離された：（ｉ）等量のジチオトリエトール１０％（Sputol
ysin; Behring Diagnostics Inc., Somerville, NY）がサンプルに添加され、溶
液は室温で１５分間渦によって混合された。５００ｇで２０分間遠心分離した後
、上澄みは分離され、−７０℃で保存された。細胞ペレットはＰＢＳ中に懸濁さ
れ、細胞遠心分離された。代わりに、以下のサンプル採取プロトコールも用いる
ことができる。痰サンプルの一部は５００００ｇで４℃で６０分間遠心分離され
、上澄みの分離相は少量ずつ−７０℃で保存された。一方、細胞ペレットは上述
したのと同じ処理に供された。
【０１０８】 ｃ．痰 気道からの天然の非強制的材料としての痰は口をすすいだ後患者が咳をするこ
とによって得られた。採取された痰サンプルは上述した誘導された痰と同様に処
理された。
とによって得られた。採取された痰サンプルは上述した誘導された痰と同様に処
理された。
【０１０９】 実施例２ ウマにおけるサンプル採取方法 気管上皮裏打ち液（ＴＥＬＦ）は内視鏡のバイオプシーチャネルを通して挿入
されたカテーテルを用いて滅菌生理塩水（１０ｍｌ）で気道の気管気管支壁を洗
浄することによって採取された（Raulo, S.M. 等，AJVR, 59(7): 818-823, 1998
）。下部気管における洗浄によって形成されたプールは完全に吸引された。血清
中及び気管洗浄液中の尿素濃度は平行的に分析され、塩水の希釈効果が修正され
た（Rennard, S.I., 等，J. Appl. Physiol., 60(2):532-538, 1986）。この方
法によって未希釈の気管上皮裏打ち液（ＴＥＬＦ）中の活性及び濃度が測定でき
た。またそのままのＴＥＬＦも代わりにカテーテル又は他のサンプリング装置を
用いて吸引された。
されたカテーテルを用いて滅菌生理塩水（１０ｍｌ）で気道の気管気管支壁を洗
浄することによって採取された（Raulo, S.M. 等，AJVR, 59(7): 818-823, 1998
）。下部気管における洗浄によって形成されたプールは完全に吸引された。血清
中及び気管洗浄液中の尿素濃度は平行的に分析され、塩水の希釈効果が修正され
た（Rennard, S.I., 等，J. Appl. Physiol., 60(2):532-538, 1986）。この方
法によって未希釈の気管上皮裏打ち液（ＴＥＬＦ）中の活性及び濃度が測定でき
た。またそのままのＴＥＬＦも代わりにカテーテル又は他のサンプリング装置を
用いて吸引された。
【０１１０】 気管洗浄液（ＴＦＦ）はＴＥＬＦと同様に洗浄することによって得られた。尿
素修正をしていない生の気管洗浄液が分析に用いられ、それは気道におけるＴＥ
ＬＦの量及びＴＥＬＦ中の酵素量の両方を表す。もし上述のサンプリング方法が
用いられると、６０−９０ｃｍ２の下部気管床がサンプルされる。酵素的組織破
壊に対する気道上皮表面の特定領域の傾向はＴＥＬＦの質（ＴＥＬＦ中の分解酵
素の作用）及びＴＥＬＦの量の両方に依存する。
素修正をしていない生の気管洗浄液が分析に用いられ、それは気道におけるＴＥ
ＬＦの量及びＴＥＬＦ中の酵素量の両方を表す。もし上述のサンプリング方法が
用いられると、６０−９０ｃｍ２の下部気管床がサンプルされる。酵素的組織破
壊に対する気道上皮表面の特定領域の傾向はＴＥＬＦの質（ＴＥＬＦ中の分解酵
素の作用）及びＴＥＬＦの量の両方に依存する。
【０１１１】 気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）は気道の鎮静及び局所麻酔下で２．５ｍ長の内
視鏡を用いて採取された。内視鏡は気管支に入り込み、そして０．８ｃｍの直径
の気管支から生ずる肺葉は３００ｍｌの滅菌塩水で洗浄された。細胞は遠心分離
によって分離され、上澄みが分析のために用いられた。細胞は懸濁され、臨床診
断のために細胞遠心分離された。
視鏡を用いて採取された。内視鏡は気管支に入り込み、そして０．８ｃｍの直径
の気管支から生ずる肺葉は３００ｍｌの滅菌塩水で洗浄された。細胞は遠心分離
によって分離され、上澄みが分析のために用いられた。細胞は懸濁され、臨床診
断のために細胞遠心分離された。
【０１１２】 実施例３ 健康なコントロール及び病気の個体における誘導された痰（ＩＳ）中のＭＭＰ−
９の発現 誘導された痰（ＩＳ）サンプルは実施例１で上述した方法に従って採取され、
標準化された。ＭＭＰ−９は健康なコントロール（ｎ＝１４）及び気管支喘息の
患者（ｎ＝１９）からウエスタンブロッティングによって同定され、定量された
（Sorsa, T., 等，Ann. N.Y. Acad. Sci., 732: 112-131, 1994; Westerlund, U
., 等，J. Dent. Res., 75(8): 1553-1563, 1996）。分子型の率は画像分析及び
処理システム（Bio-Rad Model GS-700）を用いて定量され、任意単位として表さ
れた。
９の発現 誘導された痰（ＩＳ）サンプルは実施例１で上述した方法に従って採取され、
標準化された。ＭＭＰ−９は健康なコントロール（ｎ＝１４）及び気管支喘息の
患者（ｎ＝１９）からウエスタンブロッティングによって同定され、定量された
（Sorsa, T., 等，Ann. N.Y. Acad. Sci., 732: 112-131, 1994; Westerlund, U
., 等，J. Dent. Res., 75(8): 1553-1563, 1996）。分子型の率は画像分析及び
処理システム（Bio-Rad Model GS-700）を用いて定量され、任意単位として表さ
れた。
【０１１３】 図１は健康なコントロールと比較した気管支喘息患者の誘導された痰のＭＭＰ
−９のウエスタンブロットの濃度測定走査分析の図を示す。総ＭＭＰ−９免疫反
応性の量の増大がコントロールと比較して重度及び軽度の喘息患者の痰において
みられる。喘息の痰においては病理学的に増大したＭＭＰ−９が一貫して活性化
されていることは注目に値する。
−９のウエスタンブロットの濃度測定走査分析の図を示す。総ＭＭＰ−９免疫反
応性の量の増大がコントロールと比較して重度及び軽度の喘息患者の痰において
みられる。喘息の痰においては病理学的に増大したＭＭＰ−９が一貫して活性化
されていることは注目に値する。
【０１１４】 実施例４ 健康なコントロール及び病気の個体におけるＢＡＬ液中のＭＭＰ−９の発現 健康なコントロール（ｎ＝１４）及び気管支喘息患者（ｎ＝４５）、ＣＯＰＤ
患者（ｎ＝２３）及び気管支炎患者（ｎ＝４８）の気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ
）が上述の方法に従って得られた。ＭＭＰ−９は実施例３に従ってウエスタンブ
ロッティングを用いて同定され定量された。分子型は画像分析及び処理システム
（Bio-Rad）を用いて定量され、任意単位として表わされた。
患者（ｎ＝２３）及び気管支炎患者（ｎ＝４８）の気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ
）が上述の方法に従って得られた。ＭＭＰ−９は実施例３に従ってウエスタンブ
ロッティングを用いて同定され定量された。分子型は画像分析及び処理システム
（Bio-Rad）を用いて定量され、任意単位として表わされた。
【０１１５】 図２及び３は健康なコントロールと比較した気管支喘息患者、気管支炎患者及
び慢性閉塞肺疾病患者のＢＡＬ液のＭＭＰ−９のウエスタンブロットの濃度測定
走査分析の図を示す。総ＭＭＰ−９免疫反応性の量の増大が喘息（図２）、気管
支炎及びＣＯＰＤ（図３）のＢＡＬＦにおいてみられる。病理学的に増大したＭ
ＭＰ−９が一貫して活性化されている。更に、コルチコステロイドを用いた喘息
治療が成功して病理学的に増大したＭＭＰ−９量を減少させ、その活性化度合い
は健康なコントロールにおいてみられる値に近い（図２）。
び慢性閉塞肺疾病患者のＢＡＬ液のＭＭＰ−９のウエスタンブロットの濃度測定
走査分析の図を示す。総ＭＭＰ−９免疫反応性の量の増大が喘息（図２）、気管
支炎及びＣＯＰＤ（図３）のＢＡＬＦにおいてみられる。病理学的に増大したＭ
ＭＰ−９が一貫して活性化されている。更に、コルチコステロイドを用いた喘息
治療が成功して病理学的に増大したＭＭＰ−９量を減少させ、その活性化度合い
は健康なコントロールにおいてみられる値に近い（図２）。
【０１１６】 実施例５ 健康なコントロール及び病気の個体における誘導された痰（ＩＳ）中のＭＭＰ−
８の発現 誘導された痰（ＩＳ）サンプルは実施例１に従って採取された。ＭＭＰ−８／
コラゲナーゼ２は健康なコントロール（ｎ＝１４）から及び気管支喘息患者（ｎ
＝１９）及び気管支拡張症患者（ｎ＝８）からウエスタンブロッティングによっ
て同定され定量された（Sorsa, T., 等，Ann. N.Y. Acad. Sc., 732: 112-131,
1994; Golub, L. M., 等，Infl. Res., 46(8): 310-329, 1997; Lauhio, A., 等
，Clin. Exp. Immunol., 98(1): 21-28, 1994）。分子型は画像分析及び処理シ
ステム（Bio-Rad）を用いて定量され、任意単位として表わされた。
８の発現 誘導された痰（ＩＳ）サンプルは実施例１に従って採取された。ＭＭＰ−８／
コラゲナーゼ２は健康なコントロール（ｎ＝１４）から及び気管支喘息患者（ｎ
＝１９）及び気管支拡張症患者（ｎ＝８）からウエスタンブロッティングによっ
て同定され定量された（Sorsa, T., 等，Ann. N.Y. Acad. Sc., 732: 112-131,
1994; Golub, L. M., 等，Infl. Res., 46(8): 310-329, 1997; Lauhio, A., 等
，Clin. Exp. Immunol., 98(1): 21-28, 1994）。分子型は画像分析及び処理シ
ステム（Bio-Rad）を用いて定量され、任意単位として表わされた。
【０１１７】 図４及び５は健康なコントロールと比較した気管支喘息患者及び気管支拡張症
患者の誘導された痰のＭＭＰ−８のウエスタンブロットの濃度測定走査分析の図
を示す。ＭＭＰ−８／コラゲナーゼ２の量の増大がコントロールと比較して喘息
患者（図４）及び気管支拡張症患者（図５）の痰でみられた。病理学的に増大し
たＭＭＰ−８が一貫して活性化されていることは注目に値する。
患者の誘導された痰のＭＭＰ−８のウエスタンブロットの濃度測定走査分析の図
を示す。ＭＭＰ−８／コラゲナーゼ２の量の増大がコントロールと比較して喘息
患者（図４）及び気管支拡張症患者（図５）の痰でみられた。病理学的に増大し
たＭＭＰ−８が一貫して活性化されていることは注目に値する。
【０１１８】 実施例６ 健康なコントロール及び病気の個体におけるＢＡＬ液中のＭＭＰ−８の発現 健康なコントロール（ｎ＝１４）及び気管支喘息患者（ｎ＝４５）及び気管支
拡張症患者（ｎ＝４８）の気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）は実施例１に従って採
取され、実施例５に従って定量的ウエスタンブロットが行われた。
拡張症患者（ｎ＝４８）の気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）は実施例１に従って採
取され、実施例５に従って定量的ウエスタンブロットが行われた。
【０１１９】 図６及び７は健康なコントロールと比較した治療前後の気管支拡張症患者及び
気管支喘息患者のＢＡＬ液のＭＭＰ−８のウエスタンブロットの濃度測定走査分
析の図を示す。ＭＭＰ−８の量の増大がコントロールと比較して喘息患者（図６
）及び気管支拡張症患者（図７）のＢＡＬＦで見られた。注目に値する病理学的
に増大したＭＭＰ−８は一貫して活性化され、コルチコステロイドを用いた喘息
治療が成功して病理学的に増大したＭＭＰ−８を減少させ、その活性化度合いは
健康なコントロールにおいてみられる値に近い。
気管支喘息患者のＢＡＬ液のＭＭＰ−８のウエスタンブロットの濃度測定走査分
析の図を示す。ＭＭＰ−８の量の増大がコントロールと比較して喘息患者（図６
）及び気管支拡張症患者（図７）のＢＡＬＦで見られた。注目に値する病理学的
に増大したＭＭＰ−８は一貫して活性化され、コルチコステロイドを用いた喘息
治療が成功して病理学的に増大したＭＭＰ−８を減少させ、その活性化度合いは
健康なコントロールにおいてみられる値に近い。
【０１２０】 実施例７ 免疫蛍光測定アッセイによるヒトＭＭＰ−８の測定 気管支喘息患者（ｎ＝１６）、気管支拡張症患者（ｎ＝４）及び健康なコント
ロール（ｎ＝９）から実施例１に記述のようにして採取された誘導された痰サン
プル中のＭＭＰ−８の量はヒトＭＭＰ−８に対する二つのモノクローナル抗体８
７０６及び８７０８を用いる時間分析免疫蛍光測定アッセイ（ＩＦＭＡ）によっ
て分析された（Medix Biochemica, Kauniainen, Finland; Hanemaaijer, R., 等
，J. Biol. Chem., 272(50): 31504-31509, 1997）。８７０８はマクロティトレ
ーションウエル上に被覆され、ユーロピウムキレートでラベルされた８７０６（
Hemmilae, I., 等，Anal. Biochem., 137: 335-343, 1984）がトレーサーとして
用いられた。サンプル及びアッセイ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
７．５、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、５０ｎｍ ＺｎＣｌ２及
び０．５％ウシ血清アルブミン）は被覆されたウェル中で１時間インキュベート
され、その後、ウェルは洗浄されてトレーサー抗体を含むアッセイ緩衝液１００
μｌを満たされた。更に１時間インキュベートした後、ウェルは洗浄され、１０
０μｌの強化溶液（Wallac, Turku, Finland）が各ウェルに添加された。蛍光は
５分後1234 Delfia Research Fluorometer （Wallac, Turku, Finland）を用い
て測定され、サンプルは標準の既知の濃度と比較された。ＭＭＰ−８レベルはｎ
ｇ／ｍｌ又はμｇ／ｌで表された。
ロール（ｎ＝９）から実施例１に記述のようにして採取された誘導された痰サン
プル中のＭＭＰ−８の量はヒトＭＭＰ−８に対する二つのモノクローナル抗体８
７０６及び８７０８を用いる時間分析免疫蛍光測定アッセイ（ＩＦＭＡ）によっ
て分析された（Medix Biochemica, Kauniainen, Finland; Hanemaaijer, R., 等
，J. Biol. Chem., 272(50): 31504-31509, 1997）。８７０８はマクロティトレ
ーションウエル上に被覆され、ユーロピウムキレートでラベルされた８７０６（
Hemmilae, I., 等，Anal. Biochem., 137: 335-343, 1984）がトレーサーとして
用いられた。サンプル及びアッセイ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
７．５、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、５０ｎｍ ＺｎＣｌ２及
び０．５％ウシ血清アルブミン）は被覆されたウェル中で１時間インキュベート
され、その後、ウェルは洗浄されてトレーサー抗体を含むアッセイ緩衝液１００
μｌを満たされた。更に１時間インキュベートした後、ウェルは洗浄され、１０
０μｌの強化溶液（Wallac, Turku, Finland）が各ウェルに添加された。蛍光は
５分後1234 Delfia Research Fluorometer （Wallac, Turku, Finland）を用い
て測定され、サンプルは標準の既知の濃度と比較された。ＭＭＰ−８レベルはｎ
ｇ／ｍｌ又はμｇ／ｌで表された。
【０１２１】 図８はコントロールに対して気管支拡張症患者及び喘息患者で見られた、ＭＭ
Ｐ−８特異的モノクローナル抗体を利用したＩＦＭＡアッセイによって測定され
たＭＭＰ−８量の増大の図を示す。
Ｐ−８特異的モノクローナル抗体を利用したＩＦＭＡアッセイによって測定され
たＭＭＰ−８量の増大の図を示す。
【０１２２】 ＩＦＭＡによって健康なコントロールと比較して気管支拡張症患者及び喘息患
者の痰中に検出されたＭＭＰ−８の量の増大（実施例７中、及び図８に示される
）は実施例８において記述される浸漬スティックテストキットを用いて得られた
結果と比較された。
者の痰中に検出されたＭＭＰ−８の量の増大（実施例７中、及び図８に示される
）は実施例８において記述される浸漬スティックテストキットを用いて得られた
結果と比較された。
【０１２３】 実施例８ 健康な個体及び病気の個体における誘導された痰中のＭＭＰ−８の陽性度を示す
浸漬スティック結果 誘導された痰（ＩＳ）サンプルは上述の方法に従って採取されて標準化された
。ＭＭＰ−８／コラゲナーゼ２の増大したレベルの存在は健康なコントロール（
ｎ＝９）及び気管支喘息患者及び気管支拡張症患者から浸漬スティックテストに
よって決定された。
浸漬スティック結果 誘導された痰（ＩＳ）サンプルは上述の方法に従って採取されて標準化された
。ＭＭＰ−８／コラゲナーゼ２の増大したレベルの存在は健康なコントロール（
ｎ＝９）及び気管支喘息患者及び気管支拡張症患者から浸漬スティックテストに
よって決定された。
【０１２４】 浸漬スティックは以下のようにして調製された： ニトロセルロースストリップ（ストリップ１、約６０×２５０ｍｍ）の狭い領
域がＭＭＰ−８に対するモノクローナル抗体（クローン８７０６、Oy Medix Bio
chemica Ab）で被覆された。着色されたラテックス粒子が別のＭＭＰ−８抗体（
クローン８７０８、Oy Medix Biochemica Ab）で被覆された。被覆されたラテッ
クス粒子は吸収性ポリエチレン材料のストリップ（ストリップ２、約６０×３０
０ｍｍ）の中央の領域に乾燥された。ラテックス粒子の直径は両方のストリップ
材料中の孔をそれらが自由に流れて通り抜けることができるほど十分小さかった
。二つのストリップは互いに接触するようにプラスチック裏打ち（約６０×１０
００ｍｍ）上に取り付けられた。これによりストリップ２の端が液体中に浸漬さ
れた場合にストリップ２からストリップ１へのサンプル液の毛細管流動が可能に
なる。過剰の液体を吸収するため、濾紙のパッドがストリップ２の反対側のスト
リップ１と接触して取り付けられた。構築された浸漬スティックは以下の指示に
従って迅速なＭＭＰ−８テストを行うために用いられた。
域がＭＭＰ−８に対するモノクローナル抗体（クローン８７０６、Oy Medix Bio
chemica Ab）で被覆された。着色されたラテックス粒子が別のＭＭＰ−８抗体（
クローン８７０８、Oy Medix Biochemica Ab）で被覆された。被覆されたラテッ
クス粒子は吸収性ポリエチレン材料のストリップ（ストリップ２、約６０×３０
０ｍｍ）の中央の領域に乾燥された。ラテックス粒子の直径は両方のストリップ
材料中の孔をそれらが自由に流れて通り抜けることができるほど十分小さかった
。二つのストリップは互いに接触するようにプラスチック裏打ち（約６０×１０
００ｍｍ）上に取り付けられた。これによりストリップ２の端が液体中に浸漬さ
れた場合にストリップ２からストリップ１へのサンプル液の毛細管流動が可能に
なる。過剰の液体を吸収するため、濾紙のパッドがストリップ２の反対側のスト
リップ１と接触して取り付けられた。構築された浸漬スティックは以下の指示に
従って迅速なＭＭＰ−８テストを行うために用いられた。
【０１２５】 免疫クロマトグラフィーＭＭＰ−８テストの実行： １．サンプルは緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍ
Ｍ ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、０．１％ アルブミン、ｐＨ ７．５）で１：１０
に希釈された。
Ｍ ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、０．１％ アルブミン、ｐＨ ７．５）で１：１０
に希釈された。
【０１２６】 ２．浸漬スティックの一端（ストリップ２の端）がサンプル液中に浸漬され、
液の最前線がストリップ１に到達するまで放置され、そしてサンプルから除去さ
れた。
液の最前線がストリップ１に到達するまで放置され、そしてサンプルから除去さ
れた。
【０１２７】 ３． ５分間のインキュベーション中、サンプルはストリップ中を移行し、ラ
テックス粒子は抗体被覆領域を越えて浸漬スティックの他の端まで液体と共に移
動した。
テックス粒子は抗体被覆領域を越えて浸漬スティックの他の端まで液体と共に移
動した。
【０１２８】 ４．ストリップ１が観察された。もし着色領域が形成されたなら、結果は陽性
として解釈された。検出限界は約４０μｇ／ｌの希釈サンプル中のＭＭＰ−８で
あった。
として解釈された。検出限界は約４０μｇ／ｌの希釈サンプル中のＭＭＰ−８で
あった。
【０１２９】 モノクローナル抗体ベースのＭＭＰ−８浸漬スティックテストによって得られ
たデータはＭＭＰ−８ ＩＦＭＡ分析と比較された；ＭＭＰ−８の増大したレベ
ルはＭＭＰ−８浸漬スティック分析とよく相関していた（図９）。５００μｇ／
ｌのＭＭＰ−８周辺のカットオフ領域がコントロールから活性肺疾病を区別する
ために調整された。陽性浸漬スティック結果は気管支拡張症及び気管支喘息と強
く／大部分関連していた。これらの患者は病理学的に増大したＭＭＰ−８ ＩＦ
ＭＡ値を有していた（図８）。
たデータはＭＭＰ−８ ＩＦＭＡ分析と比較された；ＭＭＰ−８の増大したレベ
ルはＭＭＰ−８浸漬スティック分析とよく相関していた（図９）。５００μｇ／
ｌのＭＭＰ−８周辺のカットオフ領域がコントロールから活性肺疾病を区別する
ために調整された。陽性浸漬スティック結果は気管支拡張症及び気管支喘息と強
く／大部分関連していた。これらの患者は病理学的に増大したＭＭＰ−８ ＩＦ
ＭＡ値を有していた（図８）。
【０１３０】 実施例９ 健康なコントロール及び病気の個体におけるＢＡＬＦ液サンプル中のＭＭＰ−８
の濃度 健康なコントロール（ｎ＝９）及び気管支喘息患者（ｎ＝２６）、ＣＯＰＤ患
者（ｎ＝１７）及び気管支拡張症患者（ｎ＝９）の気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ
）は実施例１に従って採取された。ＭＭＰ−８／コラゲナーゼ２の濃度はＩＦＭ
Ａによって測定された（実施例７参照）。
の濃度 健康なコントロール（ｎ＝９）及び気管支喘息患者（ｎ＝２６）、ＣＯＰＤ患
者（ｎ＝１７）及び気管支拡張症患者（ｎ＝９）の気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ
）は実施例１に従って採取された。ＭＭＰ−８／コラゲナーゼ２の濃度はＩＦＭ
Ａによって測定された（実施例７参照）。
【０１３１】 図１０は健康なコントロールに対する気管支喘息患者、ＣＯＰＤ患者及び気管
支拡張症患者のＢＡＬ液サンプル中の増大したＭＭＰ−８濃度（μｇ／ｌ）を示
す。
支拡張症患者のＢＡＬ液サンプル中の増大したＭＭＰ−８濃度（μｇ／ｌ）を示
す。
【０１３２】 実施例１０ 健康なコントロール及び病気の個体における誘導された痰（ＩＳ）中のＭＭＰ−
１３の発現 誘導された痰（ＩＳ）サンプルは実施例１に記載されるようにして採取された
。ＭＭＰ−１３／コラゲナーゼ３は健康なコントロール（ｎ＝１４）及び気管支
喘息患者（ｎ＝１９）からウエスタンブロッティングによって同定され定量され
た（Golub, L. M., 等，Infl. Res., 46(8): 310-329, 1997）。分子型は画像分
析及び処理システム（Bio-Rad）を用いて定量され、任意単位として表わされた
。
１３の発現 誘導された痰（ＩＳ）サンプルは実施例１に記載されるようにして採取された
。ＭＭＰ−１３／コラゲナーゼ３は健康なコントロール（ｎ＝１４）及び気管支
喘息患者（ｎ＝１９）からウエスタンブロッティングによって同定され定量され
た（Golub, L. M., 等，Infl. Res., 46(8): 310-329, 1997）。分子型は画像分
析及び処理システム（Bio-Rad）を用いて定量され、任意単位として表わされた
。
【０１３３】 図１１及び１２は健康なコントロールと比較した気管支喘息患者及び気管支拡
張症患者の誘導された痰のＭＭＰ−１３のウエスタンブロットの濃度測定走査分
析の図を示す。増大したＭＭＰ−１３量は喘息患者から誘導された痰においてみ
られた。注目に値することに、病理学的に増大したＭＭＰ−１３は一貫して活性
化されている。
張症患者の誘導された痰のＭＭＰ−１３のウエスタンブロットの濃度測定走査分
析の図を示す。増大したＭＭＰ−１３量は喘息患者から誘導された痰においてみ
られた。注目に値することに、病理学的に増大したＭＭＰ−１３は一貫して活性
化されている。
【０１３４】 実施例１１ 誘導された痰からウエスタンブロッティングによって測定されたＭＴ１−ＭＭＰ 実施例１に記載されるようにして採取された誘導された痰サンプルはＭＴ１−
ＭＭＰについて実施例３に記載されるように定量的ウエスタンブロッティングを
用いて分析された。増大したＭＴ１−ＭＭＰ免疫反応性は健康なコントロール（
ｎ＝６）と比較して気管支喘息患者（ｎ＝４）から誘導された痰サンプル中に示
されている。増大されたＭＴ１−ＭＭＰの可溶型は喘息患者サンプルにおいて一
貫して活性化されていた。
ＭＭＰについて実施例３に記載されるように定量的ウエスタンブロッティングを
用いて分析された。増大したＭＴ１−ＭＭＰ免疫反応性は健康なコントロール（
ｎ＝６）と比較して気管支喘息患者（ｎ＝４）から誘導された痰サンプル中に示
されている。増大されたＭＴ１−ＭＭＰの可溶型は喘息患者サンプルにおいて一
貫して活性化されていた。
【０１３５】 図１３。誘導された痰サンプルは定量的ウエスタンブロッティングを用いてＭ
Ｔ１−ＭＭＰについて分析された。増大したＭＴ１−ＭＭＰ免疫反応性は健康な
コントロール（ｎ＝６）と比較して気管支喘息患者（ｎ＝４）から誘導された痰
サンプル中に存在した；増大したＭＴ１−ＭＭＰの可溶型は喘息患者サンプルに
おいて一貫して活性化されていた。
Ｔ１−ＭＭＰについて分析された。増大したＭＴ１−ＭＭＰ免疫反応性は健康な
コントロール（ｎ＝６）と比較して気管支喘息患者（ｎ＝４）から誘導された痰
サンプル中に存在した；増大したＭＴ１−ＭＭＰの可溶型は喘息患者サンプルに
おいて一貫して活性化されていた。
【０１３６】 実施例１２ 誘導された痰からウエスタンブロッティングによって測定されたＮＧＡＬ 実施例１に記載されるようにして採取された誘導された痰サンプルはＮＧＡＬ
について実施例３に記載されるように定量的ウエスタンブロッティングを用いて
分析された。増大したＮＧＡＬ免疫反応性は健康なコントロール（ｎ＝６）と比
較して気管支喘息患者（ｎ＝４）から誘導された痰サンプル中に見出された。
について実施例３に記載されるように定量的ウエスタンブロッティングを用いて
分析された。増大したＮＧＡＬ免疫反応性は健康なコントロール（ｎ＝６）と比
較して気管支喘息患者（ｎ＝４）から誘導された痰サンプル中に見出された。
【０１３７】 図１４。誘導された痰サンプルは定量的ウエスタンブロッティングを用いてＮ
ＧＡＬについて分析された。増大したＮＡＧＬ免疫反応性は健康なコントロール
（ｎ＝６）と比較して気管支喘息患者（ｎ＝４）から誘導された痰サンプル中に
存在していた。
ＧＡＬについて分析された。増大したＮＡＧＬ免疫反応性は健康なコントロール
（ｎ＝６）と比較して気管支喘息患者（ｎ＝４）から誘導された痰サンプル中に
存在していた。
【０１３８】 実施例１３ ＣＯＰＤにかかっているウマにおけるＴＥＬＦ中のゼラチン分解活性 健康な個体及び病気の個体における気管上皮裏打ち液（ＴＥＬＦ）中のゼラチ
ンザイモグラフィーによるゼラチン分解活性の発現。健康なウマ（ｎ＝１５）及
びＣＯＰＤにかかっているウマ（ｎ＝１７）の気道の気管気管支領域からの上皮
裏打ち液（ＴＥＬＦ）は内視鏡のバイオプシーチャネルを通してカテーテルを用
いて洗浄することによって採取され、本発明者によって以前に用いられている方
法に従って調製された（Raulo, S.M., 等、A.V.J.R. 59(7): 818-823, 1998）。
ンザイモグラフィーによるゼラチン分解活性の発現。健康なウマ（ｎ＝１５）及
びＣＯＰＤにかかっているウマ（ｎ＝１７）の気道の気管気管支領域からの上皮
裏打ち液（ＴＥＬＦ）は内視鏡のバイオプシーチャネルを通してカテーテルを用
いて洗浄することによって採取され、本発明者によって以前に用いられている方
法に従って調製された（Raulo, S.M., 等、A.V.J.R. 59(7): 818-823, 1998）。
【０１３９】 ＴＥＬＦは１０ｍｌの生理的滅菌塩水を用いて内視鏡の可視コントロール下で
洗浄することによって採取された。下部気管において洗浄することによって形成
されたプールは完全に吸引して戻された。血清中及び気管洗浄液中の尿素濃度は
平行して分析され、塩水の希釈効果が修正された（Rennard, S.I. 等、J. Appl.
Physiol., 60: 532-538, 1986）。この方法によって未希釈の上皮裏打ち液中の
ゼラチン分解活性が測定できた。ザイモグラフィーはゼラチンを基質として用い
ることによって行われた（Sepper, R., 等、Chest, 106(4):1129-1133, 1994）
。ＴＥＬＦサンプル（尿素方法によって評価されるように１：６希釈）は１ｍｇ
／ｍｌのブタ皮膚ゼラチンを基質として含む８−１０％架橋ゲルを用いてドデシ
ル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離
された（Sorsa, T., 等、J. Biol. Chem., 272: 21067-21074, 1997）。電気泳
動後、ゲルは洗浄されてＳＤＳが除去され、その後Ｃａ２＋及びＺｎ２＋富化緩
衝液中で３７℃で１６時間インキュベートされた。インキュベート中、ゼラチン
はゼラチン分解酵素によって分解され、様々な分子量領域における分解はクーマ
シーブリリアントブルーを用いて可視化された。分解は青色の背景に対して明る
いバンドとして可視化された。分解のレベルは画像分析及び処理システム（Crea
m（商標）, Kem-En-Tek, Copenhagen, Denmark）を用いて濃度測定的に定量され
た。各サンプルのゼラチン分解活性は同一電気泳動の標準の活性と比較された。
ゼラチン分解活性は同一電気泳動内の標準（ウマの好中球ＭＭＰ−９）と比較し
て表され、濃度測定単位として表された。すべてのゼラチナーゼ活性は健康な及
び病気のウマと比較してＣＯＰＤにおいては有意に増大する。ゼラチナーゼ生成
物の活性型はＣＯＰＤウマの気道分泌物からの増大された量においてのみ検出さ
れる。
洗浄することによって採取された。下部気管において洗浄することによって形成
されたプールは完全に吸引して戻された。血清中及び気管洗浄液中の尿素濃度は
平行して分析され、塩水の希釈効果が修正された（Rennard, S.I. 等、J. Appl.
Physiol., 60: 532-538, 1986）。この方法によって未希釈の上皮裏打ち液中の
ゼラチン分解活性が測定できた。ザイモグラフィーはゼラチンを基質として用い
ることによって行われた（Sepper, R., 等、Chest, 106(4):1129-1133, 1994）
。ＴＥＬＦサンプル（尿素方法によって評価されるように１：６希釈）は１ｍｇ
／ｍｌのブタ皮膚ゼラチンを基質として含む８−１０％架橋ゲルを用いてドデシ
ル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離
された（Sorsa, T., 等、J. Biol. Chem., 272: 21067-21074, 1997）。電気泳
動後、ゲルは洗浄されてＳＤＳが除去され、その後Ｃａ２＋及びＺｎ２＋富化緩
衝液中で３７℃で１６時間インキュベートされた。インキュベート中、ゼラチン
はゼラチン分解酵素によって分解され、様々な分子量領域における分解はクーマ
シーブリリアントブルーを用いて可視化された。分解は青色の背景に対して明る
いバンドとして可視化された。分解のレベルは画像分析及び処理システム（Crea
m（商標）, Kem-En-Tek, Copenhagen, Denmark）を用いて濃度測定的に定量され
た。各サンプルのゼラチン分解活性は同一電気泳動の標準の活性と比較された。
ゼラチン分解活性は同一電気泳動内の標準（ウマの好中球ＭＭＰ−９）と比較し
て表され、濃度測定単位として表された。すべてのゼラチナーゼ活性は健康な及
び病気のウマと比較してＣＯＰＤにおいては有意に増大する。ゼラチナーゼ生成
物の活性型はＣＯＰＤウマの気道分泌物からの増大された量においてのみ検出さ
れる。
【０１４０】 図１５は健康なウマ及びＣＯＰＤにかかっているウマにおけるＴＥＬＦのゼラ
チン分解活性（平均＋／−ｓｄ）を表す図を示す。すべての活性が有意に増大す
る。活性生成物はＣＯＰＤウマの気道分泌物のみにおいて検出される。複合体＝
ゼラチン分解活性を有する複合化されたＭＭＰ−ＲＭ；プロ＝プロＭＭＰ−９；
活性型＝活性化されたゼラチン分解性ＭＭＰ−９及び他の活性化されたゼラチン
分解ＭＭＰ。
チン分解活性（平均＋／−ｓｄ）を表す図を示す。すべての活性が有意に増大す
る。活性生成物はＣＯＰＤウマの気道分泌物のみにおいて検出される。複合体＝
ゼラチン分解活性を有する複合化されたＭＭＰ−ＲＭ；プロ＝プロＭＭＰ−９；
活性型＝活性化されたゼラチン分解性ＭＭＰ−９及び他の活性化されたゼラチン
分解ＭＭＰ。
【０１４１】 実施例１４ 健康な個体及び病気の個体における気管上皮裏打ち液（ＴＥＬＦ）中のＭＭＰ−
９の発現 気管上皮裏打ち液は実施例２で記載した方法に従って採取され標準化された。
ＭＭＰ−９は健康なウマ（ｎ＝１２）及びＣＯＰＤにかかっているウマ（ｎ＝１
３）のＴＥＬＦからウエスタンブロティングによって同定され定量された（Sors
a, T., 等、J. Biol. Chem., 272(34): 21067-21074, 1997）。分子型の強度は
画像分析及び処理システム（Cream（商標）, Kem-En-Tek, Copenhagen, Denmark
）を用いて濃度測定的に定量された。ＭＭＰ−９の活性化を反映する活性化され
たＭＭＰ−９断片はＣＯＰＤにおいて検出されたのみである。総免疫反応性及び
ＭＭＰ−９の全断片の免疫反応性はＣＯＰＤのＴＥＬＦでは有意に増大する（ｐ
＜０．０５−Ｐ＜０．００１）。活性化を反映する断片は最も有意に増大した。
９の発現 気管上皮裏打ち液は実施例２で記載した方法に従って採取され標準化された。
ＭＭＰ−９は健康なウマ（ｎ＝１２）及びＣＯＰＤにかかっているウマ（ｎ＝１
３）のＴＥＬＦからウエスタンブロティングによって同定され定量された（Sors
a, T., 等、J. Biol. Chem., 272(34): 21067-21074, 1997）。分子型の強度は
画像分析及び処理システム（Cream（商標）, Kem-En-Tek, Copenhagen, Denmark
）を用いて濃度測定的に定量された。ＭＭＰ−９の活性化を反映する活性化され
たＭＭＰ−９断片はＣＯＰＤにおいて検出されたのみである。総免疫反応性及び
ＭＭＰ−９の全断片の免疫反応性はＣＯＰＤのＴＥＬＦでは有意に増大する（ｐ
＜０．０５−Ｐ＜０．００１）。活性化を反映する断片は最も有意に増大した。
【０１４２】 図１６はウエスタンブロットを走査することによって評価される通り健康なウ
マとＣＯＰＤにかかっているウマの気管上皮裏打ち液（ＴＥＬＦ）中のＭＭＰ−
９量の濃度測定走査分析の図を示す。複合体＝ＭＭＰ−９の複合体；プロ＝プロ
ＭＭＰ−９；活性型＝活性なＭＭＰ−９；断片＝活性化を反映するＭＭＰ−９の
断片。
マとＣＯＰＤにかかっているウマの気管上皮裏打ち液（ＴＥＬＦ）中のＭＭＰ−
９量の濃度測定走査分析の図を示す。複合体＝ＭＭＰ−９の複合体；プロ＝プロ
ＭＭＰ−９；活性型＝活性なＭＭＰ−９；断片＝活性化を反映するＭＭＰ−９の
断片。
【０１４３】 実施例１５ 健康なコントロール及び病気の個体における気管洗浄液（ＴＦＦ）中のＭＭＰ−
９の発現 気管洗浄液は実施例２と同様にして採取された。生の気管洗浄液（ＴＦＦ）は
下部気管床の６０−９０ｃｍ２のＲＳの総プールを反映する。このＴＦＦは肺の
気管支及び肺胞領域に由来する。肺疾病においては上皮裏打ち液の量は増大し、
かくしてオリジナルの洗浄液の酵素活性はＴＥＬＦ中の活性及び気道中のＴＥＬ
Ｆの量の両方を表す。酵素的分解に関する上皮表面の特定領域の傾向は質（ＴＥ
ＬＦ中の分解酵素の活性）及びＴＥＬＦの量の両方に依存する。
９の発現 気管洗浄液は実施例２と同様にして採取された。生の気管洗浄液（ＴＦＦ）は
下部気管床の６０−９０ｃｍ２のＲＳの総プールを反映する。このＴＦＦは肺の
気管支及び肺胞領域に由来する。肺疾病においては上皮裏打ち液の量は増大し、
かくしてオリジナルの洗浄液の酵素活性はＴＥＬＦ中の活性及び気道中のＴＥＬ
Ｆの量の両方を表す。酵素的分解に関する上皮表面の特定領域の傾向は質（ＴＥ
ＬＦ中の分解酵素の活性）及びＴＥＬＦの量の両方に依存する。
【０１４４】 ウエスタンブロッティングによるＭＭＰ−９濃度は実施例１４と同様にして同
一プロトコールを用いて評価された。健康なウマ及びＣＯＰＤにかかっているウ
マの結果は図１７に示されている。活性化されたＭＭＰ−９量はＣＯＰＤにおい
て検出される。総免疫反応性及びＭＭＰ−９の全断片の免疫反応性はＣＯＰＤの
ＴＦＦにおいて有意に増大する（ｐ＜０．０５−Ｐ＜０．００１）。
一プロトコールを用いて評価された。健康なウマ及びＣＯＰＤにかかっているウ
マの結果は図１７に示されている。活性化されたＭＭＰ−９量はＣＯＰＤにおい
て検出される。総免疫反応性及びＭＭＰ−９の全断片の免疫反応性はＣＯＰＤの
ＴＦＦにおいて有意に増大する（ｐ＜０．０５−Ｐ＜０．００１）。
【０１４５】 図１７はウエスタンブロットを走査することによって評価される通り健康なウ
マとＣＯＰＤにかかっているウマの生の気管洗浄液中のＭＭＰ−９量の濃度測定
走査分析の図を示す。複合体＝ＭＭＰ−９の複合体；プロ＝プロＭＭＰ−９；活
性型＝活性なＭＭＰ−９；断片＝活性化を反映するＭＭＰ−９の断片。
マとＣＯＰＤにかかっているウマの生の気管洗浄液中のＭＭＰ−９量の濃度測定
走査分析の図を示す。複合体＝ＭＭＰ−９の複合体；プロ＝プロＭＭＰ−９；活
性型＝活性なＭＭＰ−９；断片＝活性化を反映するＭＭＰ−９の断片。
【０１４６】 実施例１６ 健康な個体及び病気の個体における気管支肺胞洗浄（ＢＡＬＦ）液中のＭＭＰ−
９免疫反応性 気管支肺胞洗浄液は健康なウマ及びＣＯＰＤにかかっているウマからの気道の
鎮静及び局所麻酔下で２．５ｍ長の内視鏡を用いて採取された。内視鏡は気管支
に入り込み、０．８ｃｍの直径の気管支から生ずる肺葉は３００ｍｌの滅菌塩水
を用いて洗浄された。細胞は遠心分離によって分離され、上澄みのＭＭＰ−９免
疫反応性は実施例１４に記載されるようにウエスタンブロティングによって測定
された。活性化されたＭＭＰ−９断片の総量（ｐ＜０．００１）及び分離された
活性ＭＭＰ−９免疫反応性断片（ｐ＜０．０１）は健康なコントロールと比較す
るとＣＯＰＤにおいて有意に増大する。
９免疫反応性 気管支肺胞洗浄液は健康なウマ及びＣＯＰＤにかかっているウマからの気道の
鎮静及び局所麻酔下で２．５ｍ長の内視鏡を用いて採取された。内視鏡は気管支
に入り込み、０．８ｃｍの直径の気管支から生ずる肺葉は３００ｍｌの滅菌塩水
を用いて洗浄された。細胞は遠心分離によって分離され、上澄みのＭＭＰ−９免
疫反応性は実施例１４に記載されるようにウエスタンブロティングによって測定
された。活性化されたＭＭＰ−９断片の総量（ｐ＜０．００１）及び分離された
活性ＭＭＰ−９免疫反応性断片（ｐ＜０．０１）は健康なコントロールと比較す
るとＣＯＰＤにおいて有意に増大する。
【０１４７】 図１８は健康なウマ及びＣＯＰＤにかかっているウマの細胞不含有ＢＡＬ液中
のＭＭＰ−９量を表す図を示す。活性化されたＭＭＰ−９及びＭＭＰ−９の活性
化から生ずるＭＭＰ−９断片の総量は健康なコントロールと比較してＣＯＰＤで
増大する。
のＭＭＰ−９量を表す図を示す。活性化されたＭＭＰ−９及びＭＭＰ−９の活性
化から生ずるＭＭＰ−９断片の総量は健康なコントロールと比較してＣＯＰＤで
増大する。
【０１４８】 実施例１７ 健康なコントロール及び病気の個体におけるＴＥＬＦ中のＭＭＰ−８の発現 気管上皮裏打ち液は実施例２に記載の方法に従って採取され標準化された。Ｍ
ＭＰ−８は健康なウマ（ｎ＝８）及びＣＯＰＤにかかっているウマ（ｎ＝１１）
のＴＥＬＦからウエスタンブロッティングによって同定され定量された（Golub,
L. M., 等、Infl. Res., 46(8): 310-329, 1997）。分子型の強度は画像分析及
び処理システム（Cream（商標）, Kem-En-Tek, Copenhagen, Denmark）を用いて
定量された。繊維芽細胞型（ｐ＜０．００１）及び多形核白血球型（ｐ＜０．０
５）ＭＭＰ−８の両方において明らかな増大がウマＣＯＰＤのＴＥＬＦにおいて
検出された。最も明らかな増大（ｐ＜０．００１）はＭＭＰ断片又は分子量の小
さい種において検出された。最後の結果は繊維芽細胞及びＰＭＮ型ＭＭＰ−８の
両方の活性化を反映する。
ＭＰ−８は健康なウマ（ｎ＝８）及びＣＯＰＤにかかっているウマ（ｎ＝１１）
のＴＥＬＦからウエスタンブロッティングによって同定され定量された（Golub,
L. M., 等、Infl. Res., 46(8): 310-329, 1997）。分子型の強度は画像分析及
び処理システム（Cream（商標）, Kem-En-Tek, Copenhagen, Denmark）を用いて
定量された。繊維芽細胞型（ｐ＜０．００１）及び多形核白血球型（ｐ＜０．０
５）ＭＭＰ−８の両方において明らかな増大がウマＣＯＰＤのＴＥＬＦにおいて
検出された。最も明らかな増大（ｐ＜０．００１）はＭＭＰ断片又は分子量の小
さい種において検出された。最後の結果は繊維芽細胞及びＰＭＮ型ＭＭＰ−８の
両方の活性化を反映する。
【０１４９】 図１９はウエスタンブロットを走査することによって評価される通り健康なウ
マとＣＯＰＤにかかっているウマの気管上皮裏打ち液（ＴＥＬＦ）中のＭＭＰ−
８量の（平均±ＳＤ）を表す図を示す。図中、プロＰＭＮ−８は多形核白血球型
ＭＭＰ−８を示し；プロＦＢ−８は繊維芽型ＭＭＰ−８を示し、活性型ＦＢ−８
は活性型繊維芽型ＭＭＰ−８を示し、断片はＭＭＰ−８の活性化による分解生成
物を意味する。ウマＴＥＬＦにおけるＭＭＰ−８のプロ及び活性型の明らかな増
大は健康なコントロールと比較してＣＯＰＤについて検出可能であった。最も顕
著なものは健康なＴＥＬＦと比較してＣＯＰＤのＴＥＬＦにおけるＭＭＰ−８の
活性化から生ずる断片化生成物の増大であった。
マとＣＯＰＤにかかっているウマの気管上皮裏打ち液（ＴＥＬＦ）中のＭＭＰ−
８量の（平均±ＳＤ）を表す図を示す。図中、プロＰＭＮ−８は多形核白血球型
ＭＭＰ−８を示し；プロＦＢ−８は繊維芽型ＭＭＰ−８を示し、活性型ＦＢ−８
は活性型繊維芽型ＭＭＰ−８を示し、断片はＭＭＰ−８の活性化による分解生成
物を意味する。ウマＴＥＬＦにおけるＭＭＰ−８のプロ及び活性型の明らかな増
大は健康なコントロールと比較してＣＯＰＤについて検出可能であった。最も顕
著なものは健康なＴＥＬＦと比較してＣＯＰＤのＴＥＬＦにおけるＭＭＰ−８の
活性化から生ずる断片化生成物の増大であった。
【０１５０】 実施例１８ 健康な個体及び病気の個体におけるＴＥＬＦ中のＭＭＰ−１３の発現 気管上皮裏打ち液は実施例２に記載の方法に従って採取され標準化された。Ｍ
ＭＰ−１３は健康なウマ（ｎ＝９）及びＣＯＰＤにかかっているウマ（ｎ＝１１
）からウエスタンブロッティングを用いて同定され定量された（Golub, L. M.,
等，Infl. Res., 46: 310-317, 1997）。分子型の強度は画像分析及び処理シス
テム（Cream（商標）, Kem-En-Tek, Copenhagen, Denmark）を用いて定量された
。プロＭＭＰ−１３（ｐ＜０．０１）及びＭＭＰ−１３の分解断片（ｐ＜０．０
５）の両方における明らかな増大が健康なＴＥＬＦと比較してウマのＣＯＰＤの
ＴＥＬＦから検出された。
ＭＰ−１３は健康なウマ（ｎ＝９）及びＣＯＰＤにかかっているウマ（ｎ＝１１
）からウエスタンブロッティングを用いて同定され定量された（Golub, L. M.,
等，Infl. Res., 46: 310-317, 1997）。分子型の強度は画像分析及び処理シス
テム（Cream（商標）, Kem-En-Tek, Copenhagen, Denmark）を用いて定量された
。プロＭＭＰ−１３（ｐ＜０．０１）及びＭＭＰ−１３の分解断片（ｐ＜０．０
５）の両方における明らかな増大が健康なＴＥＬＦと比較してウマのＣＯＰＤの
ＴＥＬＦから検出された。
【０１５１】 図２０はウエスタンブロットを走査することによって評価される通り健康なウ
マとＣＯＰＤにかかっているウマの気管上皮裏打ち液（ＴＥＬＦ）中のＭＭＰ−
１３量（平均±ＳＤ）を表す図を示す。図中、プロＭＭＰ−１３はＭＭＰ−１３
のプロ型であり、断片はＭＭＰ−１３の活性化に関する／活性化を反映する分解
生成物を意味する。プロＭＭＰ−１３における明らかな増大及びＭＭＰ−１３の
活性化から生ずる活性化／断片化生成物における一層の増大が健康なＴＥＬＦと
比較してＣＯＰＤのＴＥＬＦにおいて検出された。
マとＣＯＰＤにかかっているウマの気管上皮裏打ち液（ＴＥＬＦ）中のＭＭＰ−
１３量（平均±ＳＤ）を表す図を示す。図中、プロＭＭＰ−１３はＭＭＰ−１３
のプロ型であり、断片はＭＭＰ−１３の活性化に関する／活性化を反映する分解
生成物を意味する。プロＭＭＰ−１３における明らかな増大及びＭＭＰ−１３の
活性化から生ずる活性化／断片化生成物における一層の増大が健康なＴＥＬＦと
比較してＣＯＰＤのＴＥＬＦにおいて検出された。
【図１】 健康なコントロールと比較した気管支喘息患者の誘導された痰のＭＭＰ−９の
ウエスタンブロットの濃度測定走査分析の図を示す。
ウエスタンブロットの濃度測定走査分析の図を示す。
【図２】 健康なコントロールと比較した様々な度合いの喘息患者又は喘息が治療された
患者のＢＡＬ液のＭＭＰ−９のウエスタンブロットの濃度測定走査分析の図を示
す。
患者のＢＡＬ液のＭＭＰ−９のウエスタンブロットの濃度測定走査分析の図を示
す。
【図３】 健康なコントロールと比較した気管支炎患者及び慢性閉塞肺疾病（ＣＯＰＤ）
患者のＢＡＬ液のＭＭＰ−９のウエスタンブロットの濃度測定走査分析の図を示
す。
患者のＢＡＬ液のＭＭＰ−９のウエスタンブロットの濃度測定走査分析の図を示
す。
【図４】 健康なコントロールと比較した気管支喘息患者の誘導された痰のＭＭＰ−８の
ウエスタンブロットの濃度測定走査分析の図を示す。
ウエスタンブロットの濃度測定走査分析の図を示す。
【図５】 健康なコントロールと比較した気管支拡張症患者の誘導された痰のＭＭＰ−８
のウエスタンブロットの濃度測定走査分析の図を示す。
のウエスタンブロットの濃度測定走査分析の図を示す。
【図６】 健康なコントロールと比較した治療前後の気管支喘息患者のＢＡＬ液のＭＭＰ
−８のウエスタンブロットの濃度測定走査分析の図を示す。
−８のウエスタンブロットの濃度測定走査分析の図を示す。
【図７】 健康なコントロールと比較した気管支拡張症患者のＢＡＬ液のＭＭＰ−８のウ
エスタンブロットの濃度測定走査分析の図を示す。
エスタンブロットの濃度測定走査分析の図を示す。
【図８】 コントロールに対して気管支拡張症患者及び喘息患者で見られた、ＭＭＰ−８
特異的モノクローナル抗体を利用したＩＦＭＡアッセイによって測定されたＭＭ
Ｐ−８量の増大の図を示す。
特異的モノクローナル抗体を利用したＩＦＭＡアッセイによって測定されたＭＭ
Ｐ−８量の増大の図を示す。
【図９】 陽性のＭＭＰ−８浸漬スティック結果がＭＭＰ−８ ＩＦＭＡ値の増大と強く
関連していることを示す。
関連していることを示す。
【図１０】 健康なコントロールに対する気管支喘息患者、ＣＯＰＤ患者及び気管支拡張症
患者のＢＡＬ液サンプルからＩＦＭＡによって得られた増大したＭＭＰ−８濃度
（μｇ／ｌ）を示す。
患者のＢＡＬ液サンプルからＩＦＭＡによって得られた増大したＭＭＰ−８濃度
（μｇ／ｌ）を示す。
【図１１】 健康なコントロールと比較した気管支喘息患者及び気管支拡張症患者の誘導さ
れた痰のＭＭＰ−１３のウエスタンブロットの濃度測定走査分析の図を示す。
れた痰のＭＭＰ−１３のウエスタンブロットの濃度測定走査分析の図を示す。
【図１２】 健康なコントロールと比較した気管支拡張症患者の誘導された痰のＭＭＰ−１
３のウエスタンブロットの濃度測定走査分析の図を示す。
３のウエスタンブロットの濃度測定走査分析の図を示す。
【図１３】 ＭＴ１−ＭＭＰ用の定量的ウエスタンブロッティングを用いて分析された誘導
された痰サンプルから得られた結果の図を示す。
された痰サンプルから得られた結果の図を示す。
【図１４】 ＮＧＡＬ用の定量的ウエスタンブロッティングを用いて分析された誘導された
痰サンプルから得られた結果を表す図を示す。
痰サンプルから得られた結果を表す図を示す。
【図１５】 健康なウマ及びＣＯＰＤにかかっているウマにおけるＴＥＬＦのゼラチン分解
活性（平均＋／−ｓｄ）を表す図を示す。
活性（平均＋／−ｓｄ）を表す図を示す。
【図１６】 ウエスタンブロットを走査することによって評価される通り健康なウマとＣＯ
ＰＤにかかっているウマの気管上皮裏打ち液（ＴＥＬＦ）中のＭＭＰ−９量の濃
度測定走査分析の図を示す。
ＰＤにかかっているウマの気管上皮裏打ち液（ＴＥＬＦ）中のＭＭＰ−９量の濃
度測定走査分析の図を示す。
【図１７】 ウエスタンブロットを走査することによって評価される通り健康なウマとＣＯ
ＰＤにかかっているウマの気管洗浄液中のＭＭＰ−９量の濃度測定走査分析の図
を示す。
ＰＤにかかっているウマの気管洗浄液中のＭＭＰ−９量の濃度測定走査分析の図
を示す。
【図１８】 健康なウマ及びＣＯＰＤにかかっているウマの細胞不含有ＢＡＬ液中のＭＭＰ
−９量を表す図を示す。
−９量を表す図を示す。
【図１９】 ウエスタンブロットを走査することによって評価される通り健康なウマとＣＯ
ＰＤにかかっているウマの気管上皮裏打ち液（ＴＥＬＦ）中のＭＭＰ−８量（平
均±ＳＤ）を表す図を示す。
ＰＤにかかっているウマの気管上皮裏打ち液（ＴＥＬＦ）中のＭＭＰ−８量（平
均±ＳＤ）を表す図を示す。
【図２０】 ウエスタンブロットを走査することによって評価される通り健康なウマとＣＯ
ＰＤにかかっているウマの気管上皮裏打ち液（ＴＥＬＦ）中のＭＭＰ−１３量（
平均±ＳＤ）を表す図を示す。
ＰＤにかかっているウマの気管上皮裏打ち液（ＴＥＬＦ）中のＭＭＰ−１３量（
平均±ＳＤ）を表す図を示す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年７月１１日（２００１．７．１１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項３２】 ＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭが前記分子を特異的に認識
する結合物質を調製するために、及び免疫クロマトグラフィーテストストリップ
上での単一ステップで気道炎症の重症度を評価することを可能にするチェアサイ
ド又はベッドサイドテストキットを調製するために用いられる請求項２９−３１
記載の使用方法。
する結合物質を調製するために、及び免疫クロマトグラフィーテストストリップ
上での単一ステップで気道炎症の重症度を評価することを可能にするチェアサイ
ド又はベッドサイドテストキットを調製するために用いられる請求項２９−３１
記載の使用方法。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年１０月２３日（２００１．１０．２３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 プリク， カイウ エストニア， 2400 タルト， ペートリ カツ 86／１ (72)発明者 ラウロ， サーラ フィンランド， エフアイエヌ−00170 ヘルシンキ， マウリンカツ 16 エー 10 (72)発明者 チカノヤ， サリ フィンランド， エフアイエヌ−00100 ヘルシンキ， ヴェイネモイセンカツ 29 ビー 24 (72)発明者 ソルサ， チモ フィンランド， エフアイエヌ−00200 ヘルシンキ， ラウネイスヴェイレ 17
Claims (17)
- 【請求項１】 感染源ありでの又は感染源なしでの気道炎症の存在及び重症
度及び肺組織損傷のレベルを評価するための、合併症の危険性を予測して予防す
るための、急性炎症が慢性的過程に変化する危険性を予測するための、感染源あ
りでの又は感染源なしでの組織破壊を減少させるための治療モダリティー及び薬
物療法の効果を追跡するための、及び適用された治療の効力を評価するための方
法であって、検出が以下のステップを含む免疫化学的アッセイとして行われる方
法： ａ）肺の全部又は一部を表す気道分泌サンプルを得る； ｂ）前記サンプルを、一種以上の潜在型及び／又は活性型マトリックスメタロ
プロテイナーゼ（ＭＭＰ）及び／又は関連分子（ＭＭＰ−ＲＭ）並びに活性化剤
、スプライス変異体、阻害剤断片、誘導体、それらの複合体を単独で又は組み合
わせで直接的又は間接的に認識することができる一種以上の結合物質と接触させ
る； ｃ）ステップｂ）の一種以上の結合物質（これらはＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−
ＲＭの存在又は不在を記録することができるラベルを所望により付けられている
）を用いて、一種以上の気道潜在型及び／又は活性型マトリックスメタロプロテ
イナーゼ（ＭＭＰ）及び／又は関連分子（ＭＭＰ−ＲＭ）並びに断片、スプライ
ス変異体、誘導体又はそれらの複合体の存在を単独で又は組み合わせで記録する
；及び ｄ）ステップｃ）で記録されたＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭが健康なコント
ロールのヒト又は動物からのサンプル中の量よりも本質的に高い量で存在するか
どうかを評価する。 - 【請求項２】 決定されるべきＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭがマトリック
スメタロプロテイナーゼ、膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ、及びそれら
の活性化剤、調節剤、スプライス変異体及び／又は阻害剤の如き気道分泌サンプ
ル中に存在するマトリックスメタロプロテイナーゼ関連分子からなる群から選択
される請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 決定されるべきＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭが潜在型及び
／又は活性型ＭＭＰ−２，ＭＭＰ−８，ＭＭＰ−９，ＭＭＰ−１３，ＭＭＰ−１
４，ＭＴ１−ＭＭＰ，ＮＧＡＬ、それらのアイソフォーム並びに断片、スプライ
ス変異体、誘導体及び／又はそれらの複合体からなる群から選択される請求項１
記載の方法。 - 【請求項４】 ＭＭＰ−ＲＭが一種以上のマトリックスメタロプロテイナー
ゼ及び／又は関連分子のそれらの潜在型での総量に基づいて決定される請求項１
記載の方法。 - 【請求項５】 潜在型及び／又は活性型ＭＭＰ−ＲＭが一種以上のＭＭＰ及
び／又はＭＭＰ−ＲＭのそれらの活性型での総量に基づいて決定される請求項１
記載の方法。 - 【請求項６】 ステップｄ）の評価が免疫クロマトグラフィーテストストリ
ップ上での単一ステップのチェアサイド又はベッドサイドテストとして行われる
請求項１記載の方法。 - 【請求項７】 請求項１−５記載の方法を用いて気道炎症の存在及び重症度
及び肺組織損傷のレベルを評価するための、合併症の危険性を予測して予防する
ための、急性炎症が慢性的過程に変化する危険性を予測するための、感染源あり
での又は感染源なしでの組織破壊を減少させるための治療モダリティー及び薬物
療法の効果を追跡するための、及び適用された治療及び薬物療法の効力を評価す
るためのテストキットであって、前記テストキットが肺の全部又は一部を表す気
道分泌サンプルから一種以上の潜在型及び／又は活性型ＭＭＰ及び／又はＭＭＰ
−ＲＭ、それらのアイソフォーム並びに断片、スプライス変異体、誘導体又はそ
れらの複合体を単独で又は組み合わせで特異的に認識することができる一種以上
の結合物質並びに一種以上の所望の基質及び／又は担体を含むテストキット。 - 【請求項８】 結合物質が抗体であり、その抗体が気道分泌サンプル中に存
在するマトリックスメタロプロテイナーゼ、膜型マトリックスメタロプロテイナ
ーゼ、及びマトリックスメタロプロテイナーゼ関連分子からなる群から選択され
る潜在型及び／又は活性型ＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭを特異的に認識するこ
とができる請求項７記載のテストキット。 - 【請求項９】 結合物質が抗体であり、その抗体がＭＭＰ−２，ＭＭＰ−８
，ＭＭＰ−９，ＭＭＰ−１３，ＭＭＰ−１４，（ＭＴ１−ＭＭＰ）及びＮＧＡＬ
並びに、それらの活性化剤、スプライス変異体、調節剤及び／又は阻害剤、それ
らのアイソフォーム並びに断片、誘導体及び／又はそれらの複合体からなる群か
ら選択されるマトリックスメタロプロテイナーゼ及び／又は関連分子を特異的に
認識することができる請求項７記載のテストキット。 - 【請求項１０】 前記結合物質が結合ペプチド、ポリクローナル抗体、モノ
クローナル抗体及び／又はポリクローナル又はモノクローナル抗体の断片である
請求項７記載のテストキット。 - 【請求項１１】 テストキットが少なくとも一種の潜在型及び／又は活性型
ＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭを特異的に認識するモノクローナル抗体である第
一結合物質に加えて少なくとも一種の第二結合物質を含み、その第二結合物質が
最初に言及したＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭとは異なる同一のＭＭＰ及び／又
はＭＭＰ−ＲＭの他の部分を認識する請求項７記載のテストキット。 - 【請求項１２】 ＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭを特異的に認識することが
できる結合物質の少なくとも一種がマーカーを与えられており、そのマーカーが
ＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭの濃度が健康なコントロールからのサンプル中の
濃度よりも上である場合にのみ陽性信号を与えるように適合されている請求項７
記載のテストキット。 - 【請求項１３】 テストキットが免疫クロマトグラフィーテストストリップ
として構成されており、その上で記録及び評価がチェアサイド又はベッドサイド
テストとして単一ステップで行うことができる請求項７記載のテストキット。 - 【請求項１４】 気道炎症のレベル、重症度及び／又は疾病活性相を診断し
、モニターし、及び／又はスクリーニングするための、薬物療法、治療モダリテ
ィーの効果を追跡するための、前炎症性媒介因子、感染因子並びに生理的及び／
又は環境的ストレス要因によって生ずる危険性を予測するための一種以上のＭＭ
Ｐ及び／又はＭＭＰ−ＲＭを認識する結合物質の使用方法。 - 【請求項１５】 気道炎症のレベル、重症度及び／又は疾病活性相を診断す
るための、治療モダリティーの効果を追跡するための、前炎症性媒介因子、感染
因子並びに生理的及び／又は環境的ストレス要因によって生ずる危険性を予測す
るためのテストキットを製造するための一種以上のＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−Ｒ
Ｍを認識する結合物質の使用方法。 - 【請求項１６】 気道炎症のレベル、重症度及び／又は疾病活性相を診断す
るための、治療モダリティー及び薬物療法の効果を追跡するための、危険群個体
に対する生理的ストレス及び／又は環境要因によって生ずる危険性を予測するた
めのマーカーとしての一種以上のＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭの使用方法。 - 【請求項１７】 ＭＭＰ及び／又はＭＭＰ−ＲＭが前記分子を特異的に認識
する結合物質を調製するために、及び免疫クロマトグラフィーテストストリップ
上での単一ステップで気道炎症の重症度を評価することを可能にするチェアサイ
ド又はベッドサイドテストキットを調製するために用いられる請求項１４−１６
記載の使用方法。
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