JP2002541839A - Magnetic DNA extraction kit for plants - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 植物からDNAを抽出する方法およびキットが提供される。これは、高レベルの純度で植物DNAを迅速に産生する。この方法は、好ましくはクロマトグラフィー基質上に固定化された、さらに好ましくはアニオン性基(例えば、ジメチルアミノエチル(DEAE))で誘導体化された磁気ビーズに固定化されたアニオン性基を使用して、アニオン交換相互作用を介してDNA(ゲノム、葉緑体、および/またはミトコンドリアのDNA)を単離する。次いで、精製DNAは、イオン(代表的には塩溶液)で溶出される。RNAは、RNAseを用いる消化によって除去され得る。 (57) [Summary] Methods and kits for extracting DNA from plants are provided. It rapidly produces plant DNA with a high level of purity. This method employs an anionic group, preferably immobilized on a chromatographic substrate, more preferably immobilized on magnetic beads derivatized with an anionic group (eg, dimethylaminoethyl (DEAE)). To isolate DNA (genomic, chloroplast, and / or mitochondrial DNA) via anion exchange interactions. The purified DNA is then eluted with ions (typically a salt solution). RNA can be removed by digestion with RNAse.
Description
【0001】 (発明の背景) 本発明は、一般的に、DNAの抽出のための方法およびキットの分野に関し、
詳細には、植物からのDNAの抽出のための方法およびキットに関する。BACKGROUND OF THE INVENTION The present invention relates generally to the field of methods and kits for the extraction of DNA,
In particular, it relates to methods and kits for extracting DNA from plants.
【0002】 植物からDNAを抽出するための方法には、以下が含まれる。[0002] Methods for extracting DNA from plants include the following.
【0003】 Dellaporta法、Dellaporta,S.L.ら、1983。植
物DNAのミニプレパレーション:バージョンII、Plant Mol Bi
ol Rep 1:19−21。ここでDNAは、沈殿して非常に粗い調製物(
溶液中にエタノール不溶性の多くの夾雑物が存在する)を産生する。Della
porta法の変形は、数時間または一晩の塩化セシウム(CsCl)勾配を通
しての超遠心分離を介してDNAを精製するさらなる工程を導入する。Rich
ards,E.ら、1994、Current Protocols in M
olecular Biology、補遺27、2.3.1−2.3.7。Cs
Cl勾配を通してDNAを精製することは、非常に純度の高いDNAが得られ得
る、古い確立された技術であるが、時間がかかり、高価であり、そして非常に低
い収率を生じる。[0003] The Dellaporta method, Dellaporta, S. et al. L. Et al., 1983. Mini-preparation of plant DNA: Version II, Plant Mol Bi
ol Rep 1: 19-21. Here, the DNA is precipitated and a very coarse preparation (
Many ethanol-insoluble contaminants are present in the solution). Della
A variation of the porta method introduces an additional step of purifying the DNA via ultracentrifugation through a cesium chloride (CsCl) gradient for several hours or overnight. Rich
ards, E .; Et al., 1994, Current Protocols in M.
Molecular Biology, Addendum 27, 2.3.1-2.3.7. Cs
Purifying DNA through a Cl gradient is an old established technique where very pure DNA can be obtained, but is time consuming, expensive and produces very low yields.
【0004】 代替的なDNA抽出法は、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド(CTA
B)法である。Murry,M.G.ら、1980、Nucleic Acid
s Res、8:4321−4325。CTABは、カチオン性界面活性剤であ
り、これは、低濃度の塩(例えば、0.5M 塩化ナトリウム(NaCl))溶
液の存在下で、DNAとの不溶性の複合体を形成する。CTAB法において、も
ともとの溶解溶液は、約1.4M NaClを含む。DNAは、NaCl濃度が
0.5Mまで減少した場合にCTABと結合する。この方法もまた、時間がかか
り、そしてその手順は有機溶媒を使用しないので、DNAをきれいにするために
さらなる工程:ポリサッカリド化合物およびフェノール性化合物の調製物を取り
除くための、有機溶媒を用いる最終抽出、が含まれる必要がある。[0004] An alternative DNA extraction method is cetyltrimethylammonium bromide (CTA).
B) The method. Murry, M .; G. FIG. Et al., 1980, Nucleic Acid
s Res, 8: 4321-2325. CTAB is a cationic surfactant, which forms an insoluble complex with DNA in the presence of a low concentration of salt (eg, 0.5 M sodium chloride (NaCl)) solution. In the CTAB method, the original lysis solution contains about 1.4M NaCl. DNA binds to CTAB when the NaCl concentration is reduced to 0.5M. This method is also time consuming and the procedure does not use organic solvents, so a further step to clean DNA: final extraction with organic solvents to remove preparations of polysaccharide compounds and phenolic compounds , Must be included.
【0005】 細菌細胞からのDNAの抽出のための方法は、より十分に確立されている。通
常、細胞は、その細胞をアルカリ環境に置くことによって溶解される。プラスミ
ドDNAは、染色体DNAを沈殿させることおよび上清溶液中のプラスミドDN
Aをそのままにすることによって、細菌染色体DNAから分離される。Reev
eらへの米国特許第5,665,544号に記載されるように、染色体DNAが
プラスミドDNAから分離された後に、磁気ビーズが、プラスミドを含む上清中
に挿入される。プラスミドDNAはビーズに結合し、そしてそのプラスミドDN
Aは、上清中の夾雑物から分離される。Selingsonらへの米国特許第4
,935,342号は、アニオン交換カラムへの結合およびそれからの溶出に基
づく、核酸の単離および精製のための一般的方法を開示する。これには、弱いア
ニオン性交換物質および強いアニオン交換物質を含む連続するカラムの使用を包
含する。Hawkinsらへの米国特許第5,705,628号は、結合および
溶出によるDNAの精製および単離のための、官能基(具体的にはカルボキシル
基または負に荷電した基)を含むコーティングを有する磁気微粒子の使用を開示
する。Deggerdalらによる国際出願WO 96/18731は、界面活
性剤(好ましくは、アニオン性界面活性剤(例えば、SDSまたはSARCOS
YLTM))の存在下での、固体支持体(好ましくは、磁気ビーズ)への結合およ
びそれからの溶出による、核酸の単離のための方法を開示する。Wooddar
dへの米国特許第5,650,506号は、ガラスファイバーへの結合およびそ
れからの溶出によるDNA精製のために、正に荷電した表面を有するガラスフィ
ルターメンブレンの使用を開示する。[0005] Methods for the extraction of DNA from bacterial cells are more well established. Usually, cells are lysed by placing the cells in an alkaline environment. Plasmid DNA was obtained by precipitating chromosomal DNA and plasmid DN in the supernatant solution.
By leaving A in place, it is separated from the bacterial chromosomal DNA. Reev
After the chromosomal DNA has been separated from the plasmid DNA, magnetic beads are inserted into the supernatant containing the plasmid, as described in US Pat. No. 5,665,544 to E et al. The plasmid DNA binds to the beads and the plasmid DN
A is separated from contaminants in the supernatant. US Patent No. 4 to Selingson et al.
, 935, 342 discloses a general method for the isolation and purification of nucleic acids based on binding to and elution from an anion exchange column. This involves the use of successive columns containing a weak anionic exchange material and a strong anion exchange material. U.S. Patent No. 5,705,628 to Hawkins et al. Has a coating containing functional groups, specifically carboxyl groups or negatively charged groups, for purification and isolation of DNA by binding and elution. Disclosed is the use of magnetic microparticles. International application WO 96/18731 by Deggerdal et al. Describes surfactants, preferably anionic surfactants such as SDS or SARCOS.
Disclosed is a method for the isolation of nucleic acids by binding to and elution from a solid support, preferably magnetic beads, in the presence of YL ™ )). Wooddar
U.S. Pat. No. 5,650,506 to U.S. Pat. No. 5,650,506 discloses the use of a glass filter membrane with a positively charged surface for DNA purification by binding to and elution from glass fibers.
【0006】 細菌細胞からのDNAの抽出のための市販の方法は、Annovis.Inc
.によって、ISOLATETM(カタログ番号2−0300−85)として市場
に出されている。このプロトコルは以下の工程を包含する:細菌細胞を緩衝液(
pH 8.0)中に懸濁させる工程、アルカリ−界面活性剤溶液(0.2M N
aOH、1% SDS)とこの懸濁液を混合することによって細胞を溶解させる
工程、アルカリを中和し、そして3.0M 酢酸カリウム、pH 5.5を用い
て染色体DNAを沈殿させる工程、その混合物を遠心分離して、沈殿したタンパ
ク質、細胞の破片、および変性染色体DNAを沈降させる工程、プラスミドDN
Aを含む上清を、磁気ビーズを含む懸濁液と混合する工程、アニオン性相互作用
を介して、そのDNAをビーズに吸着させる工程、そのDNAをビーズから溶出
させる工程、ならびに、塩濃度を0.3に調節して、プラスミドDNAを不溶性
にするようにエタノールを添加し、そして液相からのプラスミドDNAの沈殿を
もたらす工程。しかし、この手順は、植物ゲノムDNAではうまくいかない。[0006] A commercially available method for the extraction of DNA from bacterial cells is described in Annovis. Inc
. Is marketed as ISOLATE ™ (catalog number 2-0300-85). This protocol involves the following steps: Bacterial cells are buffered (
pH 8.0), alkali-surfactant solution (0.2M N
aOH, 1% SDS) to lyse the cells, mix the suspension, neutralize the alkali and precipitate the chromosomal DNA using 3.0 M potassium acetate, pH 5.5, Centrifuging the mixture to precipitate precipitated proteins, cell debris, and denatured chromosomal DNA, plasmid DN
Mixing the supernatant containing A with the suspension containing the magnetic beads, adsorbing the DNA to the beads via anionic interaction, eluting the DNA from the beads, and reducing the salt concentration. Adjusting to 0.3, adding ethanol to make the plasmid DNA insoluble, and resulting in precipitation of the plasmid DNA from the liquid phase. However, this procedure does not work with plant genomic DNA.
【0007】 従って、本発明の目的は、短時間の間に高い精製度および完全性を有する、植
物からのDNAを抽出および精製する方法を提供することである。[0007] It is therefore an object of the present invention to provide a method for extracting and purifying DNA from plants having a high degree of purification and integrity in a short time.
【0008】 本発明の別の目的は、植物からのDNAを迅速かつ安価に抽出および精製する
ための試薬を有するキットを提供することである。Another object of the present invention is to provide a kit having reagents for quickly and inexpensively extracting and purifying DNA from a plant.
【0009】 (発明の要旨) 植物からのDNAの抽出のための方法およびキットが提供され、これは、高レ
ベルの純度で、植物DNAを迅速に精製する。この方法は、アニオン交換相互作
用を介して、固定化されたアニオン性基を使用して、好ましくは、クロマトグラ
フィー用基材上で、またはより好ましくは、アニオン基(例えば、ジエチルアミ
ノエチル(DEAE)で誘導体化した磁気ビーズ上で、DNA(ゲノムDNA、
葉緑体DNA、および/またはミトコンドリアDNA)を単離する。次いで、精
製されたDNAは、イオン(代表的には塩溶液)を用いて溶出される。RNAは
、RNAseを用いる消化によって除去され得る。SUMMARY OF THE INVENTION [0009] Methods and kits are provided for the extraction of DNA from plants, which rapidly purify plant DNA with high levels of purity. This method uses immobilized anionic groups via anion exchange interactions, preferably on a chromatographic substrate, or, more preferably, an anionic group such as diethylaminoethyl (DEAE) DNA (genomic DNA,
Chloroplast DNA and / or mitochondrial DNA) is isolated. The purified DNA is then eluted using ions (typically a salt solution). RNA can be removed by digestion with RNAse.
【0010】 (発明の詳細な説明) 以下の用語を本明細書中で使用する: アニオン性−正電荷を有する カチオン性−負電荷を有する 非イオン性−電荷を有さない 双生イオン性−対向する末端上の同じ数の正電荷および負電荷、従って、化合物
全体としては中性である。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The following terms are used herein: anionic-having a positive charge cationic-having a negative charge nonionic-having no charge Zwitterionic-facing The same number of positive and negative charges on the terminating end, and thus the compound as a whole is neutral.
【0011】 本明細書中に記載される方法は、いかなる植物材料でも使用され得、そして以
下の代表的な型の植物で効果的であることが実証された:シロイヌナズナ芽ばえ
、オオムギ胚、タバコ葉、トマト葉、ダイズ胚軸および培養細胞、ホワイトビー
ン(white bean)胚軸および根、若い松葉および古い松葉。[0011] The methods described herein can be used with any plant material and have been demonstrated to be effective on the following representative types of plants: Arabidopsis buds, barley embryos, tobacco leaves , Tomato leaves, soybean hypocotyls and cultured cells, white bean hypocotyls and roots, young and old pine needles.
【0012】 このプロセスは、一般的に以下の工程を包含する:植物材料を粉砕して組織抽
出物を作製する工程、植物細胞を溶解する工程、細胞の破片を除去する工程、お
よび、植物DNAを固定化または不溶化された物質(例えば、磁気ビーズ)(こ
こで、DNAは精製型に分離される)に結合させる工程。The process generally includes the following steps: milling plant material to produce a tissue extract, lysing plant cells, removing cell debris, and plant DNA Binding to an immobilized or insolubilized substance (eg, magnetic beads), wherein the DNA is separated into a purified form.
【0013】 好ましい方法において、植物材料を、まず液体窒素中で粉末に粉砕し、次いで
、界面活性剤(surfactant)または非イオン性界面活性剤(dete
rgent)(例えば、N−ラウリルサルコシン(N−laurylsarco
sine)(SARKOSYLTM)、TRITONTMまたはNONIDETTMP
−40)の存在下で、溶解緩衝液(0.1M Tris−HCl、pH8.0、
0.1M EDTA、pH8.0、0.25M NaClおよび100μg/m
l プロテイナーゼK)にインキュベートする。この界面活性剤または非イオン
性界面活性剤は、細胞成分を可溶化するように作用し、そして細胞を溶解するよ
うに作用する。代表的な界面活性剤を表Iに列挙する。In a preferred method, the plant material is first ground in liquid nitrogen to a powder and then a surfactant or a non-ionic surfactant (dete)
rgent) (for example, N-lauryl sarcosine)
sine) (SARKOSYL ™ ), TRITON ™ or NONIDET ™ P
-40) in the presence of a lysis buffer (0.1 M Tris-HCl, pH 8.0,
0.1 M EDTA, pH 8.0, 0.25 M NaCl and 100 μg / m
l Incubate in proteinase K). The detergent or non-ionic detergent acts to solubilize cellular components and to lyse cells. Representative surfactants are listed in Table I.
【0014】 次いで、細胞の破片を、遠心分離によって取り除き、そしてDNAおよび他の
可溶性細胞成分を含む上清を収集する。次いで、DNAが、そこに結合した陰イ
オン性基を有する、固定化または不溶性材料(例えば、DEAEを用いて誘導体
化された磁気ビーズ)に結合する。この材料を、DNAに結合した上清と混合し
、次いで、磁気セパレーターを使用して上清から取り除く。The cell debris is then removed by centrifugation and the supernatant containing DNA and other soluble cellular components is collected. The DNA is then bound to immobilized or insoluble materials (eg, magnetic beads derivatized with DEAE) having anionic groups attached thereto. This material is mixed with the supernatant bound to the DNA and then removed from the supernatant using a magnetic separator.
【0015】 このビーズを、引き続き洗浄し、次いで、DNAは、好ましくは、最終濃度1
.0MまでNaClを添加することによって、ビーズから溶出される。あるいは
、DNAは、DEAEクロマトグラフィの材料またはフィラー材料に結合させる
ことによって取り除かれ得る。このDNAは、洗浄、遠心分離または当業者に公
知の他の方法によって分離される。The beads are subsequently washed, and the DNA is then preferably purified to a final concentration of 1
. It is eluted from the beads by adding NaCl to 0M. Alternatively, DNA can be removed by binding to DEAE chromatography material or filler material. The DNA is separated by washing, centrifuging or other methods known to those skilled in the art.
【0016】 この方法およびキットは、先行技術であるDellaportaおよびCTA
B方法と等しいか、またはその先行技術よりも良好な収率で、CsCl勾配方法
と等しい精度のDNAを産生する。Dellaporta方法(CsClカラム
の使用)およびCTAB方法(陽イオン性界面活性剤の使用)の特定の問題は、
この方法によって回避される。この方法およびキットはまた、CsCl方法より
も迅速に、DNAを抽出し、そして精製する。沈殿工程を含むこの方法は、計約
2.5時間を要する;沈殿工程を伴わないと、植物DNAを抽出し、そして精製
するために、2時間未満(1時間50分)を要する:細胞の溶解のために約1時
間、磁気ビーズへのDNAの結合のために5分、ビーズの洗浄のために5分、ビ
ーズからのDNAの分離のために5分、溶液からのDNAの沈殿のために30分
、そして遠心分離によるDNAの収集のために40分を要する。対照的に、Cs
Cl遠心分離は、DNAを精製するために、多くの時間を必要とする。The methods and kits include prior art Dellaporta and CTA.
Produces DNA with the same or better yields than the B method with the same yield as the CsCl gradient method. Particular issues of the Dellaporta method (using a CsCl column) and the CTAB method (using a cationic surfactant) are:
This is avoided by this method. The method and kit also extract and purify DNA more rapidly than the CsCl method. This method, including the precipitation step, requires a total of about 2.5 hours; without the precipitation step, it takes less than 2 hours (1 hour 50 minutes) to extract and purify the plant DNA: Approximately 1 hour for lysis, 5 minutes for binding DNA to magnetic beads, 5 minutes for washing beads, 5 minutes for separating DNA from beads, for precipitating DNA from solution Takes 30 minutes, and 40 minutes for DNA collection by centrifugation. In contrast, Cs
Cl centrifugation requires a lot of time to purify DNA.
【0017】 本明細書中に記載される好ましい方法は、陰イオン交換相互作用を介して、非
常に純粋なDNA調製物を産生する。ここで、DNAは、塩化物イオン、または
任意の種々の塩から誘導された他の負に荷電したイオンによる、陰イオン交換マ
トリックス上の結合種として置換される。伝統的な陰イオン交換カラムを、ビー
ズを導入する時点で使用する場合、このカラムは、詰まるようであり、結合した
DNAの収集を妨げる。または、溶出が、強酸または強塩基を用いて果たされる
場合、有意なレベルの夾雑物質が、DNAと共に共溶出される。対照的に、ビー
ズに結合したDNAが、洗浄溶液と完全に混合され得るので、夾雑物質は、伝統
的なカラム型式よりもより容易に取り除かれて、より純粋な調製物を生じる。さ
らに、ビーズに結合したDNAは、剪断または圧縮されないので、ペレット化さ
れた場合、付着したDNAは、より長く、そしてよりインタクトな鎖からなる。The preferred methods described herein produce very pure DNA preparations via anion exchange interactions. Here, the DNA is replaced by chloride ions, or other negatively charged ions derived from any of a variety of salts, as binding species on the anion exchange matrix. If a traditional anion exchange column is used at the time of introducing the beads, the column appears to clog and hinders the collection of bound DNA. Alternatively, if elution is performed with a strong acid or base, significant levels of contaminants are co-eluted with the DNA. In contrast, contaminants are more easily removed than in traditional column types, resulting in a purer preparation, since the DNA bound to the beads can be mixed thoroughly with the wash solution. In addition, the DNA attached to the beads is not sheared or compressed, so that when pelleted, the attached DNA consists of longer and more intact strands.
【0018】 植物ゲノムDNAおよび細菌プラスミドDNAのための溶解方法は異なる。細
菌プラスミドDNAのための溶解方法は、SDSの形態における陰イオン性界面
活性剤の存在下でのアルカリ条件を使用するが、植物ゲノムDNAのための溶解
方法は、陰イオン性界面活性剤を使用する。使用される界面活性剤の型は、各々
の方法における残りの工程に影響を及ぼす。SDSは、陰イオン性(負に荷電、
DNAのように)であるので、ビーズが導入される前のプラスミド手順において
、溶液から取り除かれなければならない。さもなければ、SDSは、正に荷電し
たビーズ上で、プラスミドDNAとの結合を争う。ISOLATETMプラスミド
抽出系において、SDSは、酢酸カリウムの添加によって溶液から取り除かれて
、染色体DNAと不溶性の沈殿物を形成する。細菌ゲノムDNAとのSDSの凝
集体は、可溶性プラスミドDNAから容易に分離され得る。対照的に、植物系に
おいて、結合工程の前に沈殿は必要ではない。なぜなら、本明細書中に記載され
る方法およびキットにおいて使用される、非イオン性の非荷電界面活性剤が、D
NAと結合部位について競合しないからである。これは、ゲノムDNAが、ビー
ズ上のDEAE基に所望の結合種であるからである。従って、非イオン性界面活
性剤は、取り除かれる必要がない。一方、SDSおよび他の陰イオン性界面活性
剤は、負に荷電し、そしてDNAと陰イオン性結合部位について競合し、従って
、取り除かれる必要がある。The lysis methods for plant genomic DNA and bacterial plasmid DNA are different. The lysis method for bacterial plasmid DNA uses alkaline conditions in the presence of an anionic surfactant in the form of SDS, whereas the lysis method for plant genomic DNA uses an anionic surfactant. I do. The type of surfactant used affects the remaining steps in each method. SDS is anionic (negatively charged,
(Like DNA), it must be removed from solution in a plasmid procedure before the beads are introduced. Otherwise, SDS competes for binding to plasmid DNA on positively charged beads. In the ISOLATE ™ plasmid extraction system, SDS is removed from solution by the addition of potassium acetate to form an insoluble precipitate with chromosomal DNA. Aggregates of SDS with bacterial genomic DNA can be easily separated from soluble plasmid DNA. In contrast, in plant systems, precipitation is not required before the binding step. The non-ionic, uncharged surfactant used in the methods and kits described herein is
This is because there is no competition for binding sites with NA. This is because genomic DNA is the desired binding species for the DEAE groups on the beads. Thus, non-ionic surfactants do not need to be removed. On the other hand, SDS and other anionic surfactants are negatively charged and compete with DNA for anionic binding sites and therefore need to be removed.
【0019】 (実施例1:植物ゲノムDNAの精製) 以下の工程は、植物由来のDNAの抽出および精製を記載する。Example 1 Purification of Plant Genomic DNA The following steps describe the extraction and purification of plant-derived DNA.
【0020】 1.約0.5グラムの新鮮な植物組織を収集する。組織を、脱イオン(d.I
)水でリンスし、接着した破片を取り除き、そしてブロットドライ(blot
dry)する。1. Collect about 0.5 grams of fresh plant tissue. The tissue is deionized (d.I.
) Rinse with water to remove adhered debris and blot dry
dry).
【0021】 2.組織を液体窒素で凍結し、そして乳鉢および乳棒中で微粉に粉砕する。3
0mLのコニカルチューブに移す。あるいは、新鮮な組織を、4℃で冷溶解緩衝
液中で、機械的にホモジナイズし得る。[0021] 2. The tissue is frozen in liquid nitrogen and ground to a fine powder in a mortar and pestle. 3
Transfer to 0 mL conical tube. Alternatively, fresh tissue may be mechanically homogenized at 4 ° C. in cold lysis buffer.
【0022】 3.出発物質1g当たり、5〜20mlの溶解緩衝液(0.5〜0.01M
Tris−HCl、pH7.0〜8.0、0.001−0.5M EDTA、p
H7.0〜8.0、0.05〜0.4M NaClおよび50〜500μg/m
l プロテイナーゼK)を、凍結粉末に添加し、そしてよく混合する。[0022] 3. 5-20 ml of lysis buffer (0.5-0.01 M per gram of starting material)
Tris-HCl, pH 7.0-8.0, 0.001-0.5M EDTA, p
H 7.0-8.0, 0.05-0.4M NaCl and 50-500 μg / m
l Proteinase K) is added to the frozen powder and mixed well.
【0023】 4.最終濃度0.1%と10%の間で、N−ラウロイルサルコシン(laur
oylsarcosine)を添加する。所望であれば、25〜200μgのR
NaseAを、この時点で添加し得る。あるいは、最終的に再懸濁されたペレッ
トを、RNaseで処置し得る。50〜60℃で、30分〜1時間インキュベー
トする。[0023] 4. At a final concentration between 0.1% and 10%, N-lauroyl sarcosine (laur
oylsarcosine). If desired, 25-200 μg of R
NaseA can be added at this point. Alternatively, the final resuspended pellet can be treated with RNase. Incubate at 50-60 ° C. for 30 minutes to 1 hour.
【0024】 5.4℃で、5000×gを超えて、10分間溶解物を遠心分離し、破片をペ
レット化する。上清を、新しいチューブに移し、そして濾過し、必要であれば、
未消化の破片を取り除く。5.4 Centrifuge the lysate at 5000 ° g over 5000 xg for 10 minutes to pellet debris. Transfer the supernatant to a new tube and filter, if necessary,
Remove undigested debris.
【0025】 6.1〜30mLの磁気ビーズ(40% v/v懸濁液)を上清に添加する。
室温で、少なくとも1分間、転倒または機械的ミキサーによって、ビーズ−上清
懸濁液を穏やかに混合する。6. Add 1-30 mL of magnetic beads (40% v / v suspension) to the supernatant.
Gently mix the bead-supernatant suspension by inversion or a mechanical mixer for at least 1 minute at room temperature.
【0026】 7.磁気セパレーターに磁気ビーズを固定化し、そして上清を取り除く。[0027] 7. Immobilize the magnetic beads on a magnetic separator and remove the supernatant.
【0027】 8.5mlと20mlの間の洗浄緩衝液を添加し、蓋をし、そしてスタンドか
らチューブを取り出し、そして室温で5〜10分間穏やかに混合する。Add between 8.5 ml and 20 ml of wash buffer, cap and remove the tube from the stand and mix gently for 5-10 minutes at room temperature.
【0028】 9.磁気セパレーターに磁気ビーズを固定化し、そして上清を取り除く。上清
が、実質的に着色している場合、洗浄を繰り返す。9. Immobilize the magnetic beads on a magnetic separator and remove the supernatant. If the supernatant is substantially colored, repeat the wash.
【0029】 10.5と10mlの間の溶出緩衝液(0.7〜1.5M NaCl、0.5
〜0.01M Tris−HCl、pH7.0〜8.0、0.001〜0.5M EDTA、pH7.0〜8.0)を、磁気ビーズに添加し、そして室温で5〜
10分間混合する。[0029] Between 10.5 and 10 ml of elution buffer (0.7-1.5 M NaCl, 0.5
~ 0.01 M Tris-HCl, pH 7.0-8.0, 0.001-0.5 M EDTA, pH 7.0-8.0) is added to the magnetic beads and
Mix for 10 minutes.
【0030】 11.磁気分離機中の磁気ビーズを固定化し、そして上清を新しいチューブに
移す。[0030] 11. Immobilize the magnetic beads in the magnetic separator and transfer the supernatant to a new tube.
【0031】 12.1.0〜2.5倍の冷イソプロパノールを添加する。十分に攪拌し、そ
して−20℃で少なくとも10分間インキュベートする。12. Add 1.0 to 2.5 times cold isopropanol. Shake well and incubate at -20 ° C for at least 10 minutes.
【0032】 13.10,000〜20,000×g、4℃で少なくとも15分間の遠心分
離によってDNAを回収する。70%冷エタノールを用いてペレットを洗浄し、
そして10,000〜20,000×g、4℃で少なくとも2分間再び遠心分離
する。ペレットを室温で風乾させ、次いで、所望の緩衝液に溶解する。13. Collect the DNA by centrifugation at 10,000-20,000 × g at 4 ° C. for at least 15 minutes. Wash the pellet with 70% cold ethanol,
Then centrifuge again at 10,000-20,000 × g at 4 ° C. for at least 2 minutes. The pellet is air dried at room temperature and then dissolved in the desired buffer.
【0033】 開示された方法およびキットが、それらが変化し得るように、記載される特定
の方法論、プロトコールおよび試薬に限定されないことが理解される。本明細書
中に使用される技術用語が、特定の実施形態のみを記載する目的であり、そして
添付の特許請求の範囲によってのみ制限される本発明の範囲の限定を意図しない
こともまた、理解される。It is understood that the disclosed methods and kits are not limited to the particular methodology, protocols and reagents described as they may vary. It is also understood that technical terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only and is not intended to limit the scope of the invention, which is limited only by the appended claims. Is done.
【0034】[0034]
【表1】 [Table 1]
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZW ),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU, TJ,TM),AE,AL,AM,AT,AU,AZ, BA,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,C R,CU,CZ,DE,DK,DM,EE,ES,FI ,GB,GD,GE,GH,GM,HR,HU,ID, IL,IN,IS,JP,KE,KG,KP,KR,K Z,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MA ,MD,MG,MK,MN,MW,MX,NO,NZ, PL,PT,RO,RU,SD,SE,SG,SI,S K,SL,TJ,TM,TR,TT,TZ,UA,UG ,UZ,VN,YU,ZA,ZW──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of front page (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE ), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID , IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, UZ, VN, YU, ZA, ZW
Claims (14)
01〜0.5M EDTA、pH7.0〜8.0、0.05〜0.4M NaC
lおよび50〜500μg/ml プロテイナーゼKを含む溶解緩衝液溶液中に
該植物材料抽出物の細胞を溶解する工程、 (c)該植物細胞材料の破片を除去する工程、 (d)ビーズに固定化されるかまたは不溶性である正荷電基に該DNAを結合
する工程、 (e)残りの細胞性材料から結合したDNAを分離する工程、および (f)溶出緩衝液の塩イオン濃度を増加させることによって、該正荷電のビー
ズから結合したDNAを分離する工程、 を包含する、方法。1. A method for extracting DNA from plant material, comprising: (a) grinding the plant material to produce a plant material extract; (b) 0.5-0.01 M Tris-HCl. , PH 7.0-8.0, 0.0
01-0.5M EDTA, pH 7.0-8.0, 0.05-0.4M NaC
lysing the plant material extract cells in a lysis buffer solution containing 1 and 50-500 μg / ml proteinase K; (c) removing the plant cell material debris; and (d) immobilizing the beads. Binding the DNA to a positively charged group that is either insoluble or soluble; (e) separating the bound DNA from the remaining cellular material; and (f) increasing the salt ion concentration of the elution buffer. Separating the bound DNA from the positively charged beads.
記載の方法。2. The method of claim 1, wherein said lysis buffer comprises a non-ionic detergent.
。4. The method of claim 1, wherein said positively charged groups are on magnetic beads.
1に記載の方法。5. The method of claim 1, wherein the plant cell debris is removed by centrifugation.
0.01M Tris−HCl、pH7.0〜8.0、0.001〜0.5M
EDTA、pH7.0〜8.0を含む、請求項1に記載の方法。6. The method according to claim 1, wherein the elution buffer is 0.7 to 1.5 M NaCl, 0.5 to 1.5 M NaCl.
0.01M Tris-HCl, pH 7.0-8.0, 0.001-0.5M
2. The method of claim 1, comprising EDTA, pH 7.0-8.0.
精製DNA中の前記RNAを消化する工程をさらに包含する、請求項1に記載の
方法。7. The method of claim 1, further comprising the step of adding RNAse to said lysis buffer to digest said RNA in said plant material or purified DNA.
であって、 (a)該植物材料をすりつぶして作製した植物材料抽出物、 (b)0.5〜0.01M Tris−HCl、pH7.0〜8.0、0.0
01〜0.5M EDTA、pH7.0〜8.0、0.05〜0.4M NaC
lおよび50〜500μg/ml プロテイナーゼKを含む該植物材料抽出物中
の細胞を溶解するための溶解緩衝液溶液、 (c)ビーズに固定化されるかまたは不溶性である正荷電基、および (d)0.7〜1.5M NaCl、0.5〜0.01M Tris−HCl
、pH7.0〜8.0、0.001〜0.5M EDTA、pH7.0〜8.0
を含む、該正荷電基から結合したDNAを分離するための溶出緩衝液、 を含む、キット。8. A kit for use in a method for extracting DNA from plant material, comprising: (a) a plant material extract prepared by grinding the plant material; (b) 0.5 to 0.01 M Tris -HCl, pH 7.0 to 8.0, 0.0
01-0.5M EDTA, pH 7.0-8.0, 0.05-0.4M NaC
a lysis buffer solution for lysing cells in said plant material extract containing 1 and 50-500 μg / ml proteinase K, (c) a positively charged group immobilized on beads or insoluble, and (d) ) 0.7-1.5M NaCl, 0.5-0.01M Tris-HCl
PH 7.0-8.0, 0.001-0.5M EDTA, pH 7.0-8.0
An elution buffer for separating bound DNA from the positively charged group, comprising:
求項8に記載のキット。9. The kit according to claim 8, wherein the solution for lysing the cells is a non-ionic solution.
DEAEまたは磁気ビーズである、請求項8に記載のキット。10. The kit according to claim 8, wherein said positively charged group is DEAE or magnetic beads immobilized on a chromatography substrate.
01〜0.5M EDTA、pH7.0〜8.0、0.05〜0.4M NaC
lおよび50〜500μg/ml プロテイナーゼKを含む溶解緩衝液; (c)N−ラウロイルサルコシン; (d)表面上にDEAE基を有する磁気ビーズ;および (e)0.7〜1.5M NaCl、0.5〜0.01M Tris−HCl
、pH7.0〜8.0、0.001〜0.5M EDTA、pH7.0〜8.0
を含む溶出緩衝液、 を含む、キット。11. The kit according to claim 8, wherein (a) a plant material extract prepared by grinding the plant material; (b) 0.5 to 0.01 M Tris-HCl, pH 7.0 to 7.0. 8.0, 0.0
01-0.5M EDTA, pH 7.0-8.0, 0.05-0.4M NaC
lysis buffer containing 1 and 50-500 μg / ml proteinase K; (c) N-lauroyl sarcosine; (d) magnetic beads with DEAE groups on the surface; and (e) 0.7-1.5M NaCl, 0 0.5-0.01M Tris-HCl
PH 7.0-8.0, 0.001-0.5M EDTA, pH 7.0-8.0
An elution buffer comprising: a kit comprising:
記載のキット。12. The kit according to claim 8, further comprising RNAse in the lysis buffer.
に記載のキット。13. The method according to claim 11, further comprising an RNAse in the lysis buffer.
The kit according to 1.
求項1に記載の方法。14. The method of claim 1, wherein said lysis buffer comprises N-lauroyl sarcosine.
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