JP2002540164A - 因 子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、神経突起発生用の薬物調製（製造）におけるＲＡＲβ２および／またはそのアゴニストの使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、神経突起成長（ｎｅｕｒｉｔｅ ｇｒｏｗｔｈ）に関する因子に関
する。

【０００２】 （発明の背景） 例えば、脊髄損傷などの神経損傷の場合、神経突起成長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ
）および／または神経突起再生などのような神経突起発生（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅ
ｎｔ）を起こさせることが望ましい。

【０００３】 神経成長因子（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）が、神経
突起成長などの一定の事象を刺激することが公知である。しかし、ＮＧＦは、高
分子量の比較的大きな分子である。さらに、ＮＧＦはプロテアーゼ媒介分解感受
性である。これらおよび他の検討材料のために、ＮＦＧは投与が困難である。Ｎ
ＧＦはまた、その調製（製造）が比較的、費用がかかる。これらは、先行技術に
関する問題である。

【０００４】 （発明の要旨） 驚いたことに、本発明者らは、レチノイン酸レセプターβ２（ＲＡＲβ２）お
よび／またはそのアゴニストの使用によって神経突起成長および／または神経突
起再生などの神経突起の発生が可能であることを見出した。

【０００５】 （本発明の態様の要旨） 本発明は、ＲＡＲβ２および／またはそのアゴニストの使用によって、神経突
起成長および／または神経突起再生などの神経突起の発生が可能であるという驚
くべき所見に基づく。

【０００６】 本発明の態様は、この所見を利用する。例えば、本明細書中で説明するＲＡＲ
β２および／またはそのアゴニストの使用によって、神経突起成長および／また
は神経突起再生などの神経突起の発生の調整法を得ることができる。

【０００７】 （発明の詳細な態様） １つの態様では、本発明は、神経突起を発生させるための薬物調製（製造）に
おけるＲＡＲβ２および／またはそのアゴニストに関する。

【０００８】 本発明では、ＲＡＲβ２および／またはアゴニストを、薬学的に活性な薬剤と
いうことができる。

【０００９】 神経突起は、種々の神経細胞型から発生する周知の構造である。これらは、発
生する細胞表面からの分岐もしくはコーム様構造または形態的突起物として出現
する。神経突起成長の例は、添付の図面およびＭａｄｅｎ、１９９８総説などの
刊行物に示されており、当該分野で周知である。

【００１０】 ＲＡＲβ２コード配列（すなわち、ＲＡＲβ２遺伝子）を、下記のように使用
する。ＲＡＲβ２遺伝子を、組換えＤＮＡ技術および／または合成技術の使用に
よって調製（製造）することができる。例えば、これを、本明細書の例に記載の
ようにプライマーなど使用して調製（製造）したＰＣＲ増幅遺伝子フラグメント
（本明細書中に詳述）を使用して調製（製造）することができるか、当該分野で
公知の任意の他の適切な方法にしたがって調製（製造）することができる。

【００１１】 別の態様では、本発明は、神経突起を発生させる薬物調製（製造）におけるＲ
ＡＲβ２および／またはそのアゴニスト（アゴニストはレチノイン酸（ＲＡ）お
よび／またはＣＤ２０１９である）の使用に関する。

【００１２】 レチノイン酸は市販されている。ＣＤ２０１９は本明細書中で考察されている
かＥｌｍａｚａｒ ｅｔ ａｌ．、１９９６、Ｔｅｒａｔｏｌｏｇｙ、第５３巻
、１５８〜１６７に記載の構造を有するＲＡＲβ２アゴニストである多環式ヘテ
ロカルビル分子である。

【００１３】 別の態様では、本発明は、神経学的障害治療用の薬物調製（製造）におけるＲ
ＡＲβ２および／またはそのアゴニストの使用に関する。

【００１４】 別の態様では、本発明は、神経学的障害（神経学的損傷を含む）治療用の薬物
調製（製造）におけるＲＡＲβ２および／またはそのアゴニストの使用に関する
。

【００１５】 別の態様では、本発明は、薬学的活性量のＲＡＲβ２レセプターおよび／また
はそのアゴニストを投与するステップを含む、神経学的障害の治療法に関する。

【００１６】 別の具体例では、本発明は、薬学的活性量のＲＡＲβ２レセプターおよび／ま
たはそのアゴニストを投与するステップを包含し、前記アゴニストがＲＡおよび
／またはＣＤ２０１９である、神経学的障害の治療法に関する。

【００１７】 別の具体例では、本発明は、薬学的活性量のＲＡＲβ２レセプターおよび／ま
たはそのアゴニストを投与するステップを包含し、前記ＲＡＲβ２レセプターを
ＲＡＲβ２発現系を含む構成要素によって投与する、神経学的障害の治療法に関
する。

【００１８】 別の具体例では、本発明は、少なくともＲＡＲβ２レセプターの一部の発現を
指示することができる核酸構成物（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｎｓｔｒｕ
ｃｔ）を得るステップと、被験体の１つまたは複数の細胞に該核酸構成物を移入
するステップと、任意選択的に、該被験体にＲＡおよび／またはＣＤ２０１９な
どのＲＡＲβアゴニストを投与するステップとを含む、被験体における神経突起
の発生法に関する。

【００１９】 さらなる態様では、本発明は、神経細胞を提供するステップと、該細胞と薬剤
とを接触させるステップと、神経突起成長の監視などによってＲＡＲβ２レセプ
ターを評価するステップとを含む、薬剤がＲＡＲβ２シグナル伝達を調整（モジ
ュレート）することができるかどうか同定するアッセイ（評価）法に関する。

【００２０】 本発明のアッセイ法で使用される神経細胞は、任意の適切な神経細胞株（培養
中に安定に維持されている細胞であっても直接動物から得た初代細胞であっても
よい）であり得る。好ましくは、細胞は、下記のように調製（製造）した胚マウ
ス背根神経節（ＤＲＧ）細胞である。

【００２１】 さらなる態様では、本発明は、（ｉ）上記のＲＡＲβ２シグナル伝達調整につ
いてのアッセイを行うステップと、（ｉｉ）前記ＲＡＲβ２シグナル伝達を調整
することができる１つまたは複数の薬剤を同定するステップと、（ｉｉｉ）１つ
または複数の同定した薬剤をいくらかの量調製（製造）するステップとを含むプ
ロセスに関する。

【００２２】 さらなる態様では、本発明は、（ｉ）上記のＲＡＲβ２シグナル伝達調整につ
いてのアッセイを行うステップと、（ｉｉ）前記ＲＡＲβ２シグナル伝達を調整
することができる１つまたは複数の薬剤を同定するステップと、（ｉｉｉ）１つ
または複数の同定した薬剤をいくらかの量調製（製造）するステップと、（ｉｖ
）１つまたは複数の同定した薬剤を含む薬剤組成物を調製（製造）するステップ
とを含むプロセスに関する。

【００２３】 さらなる態様では、本発明は、薬剤がＲＡＲβ２シグナル伝達を調節すること
ができる（例えば、上記のインビトロアッセイ法においてＲＡＲβ２シグナル伝
達を調整することができる）、薬剤がインビボでＲＡＲβ２活性に作用する方法
に関する。

【００２４】 さらなる態様では、本発明は、薬物がＲＡＲβ２シグナル伝達を調整すること
ができる（例えば、上記のインビトロアッセイ法においてＲＡＲβ２シグナル伝
達を調整することができる）神経学的障害または損傷の治療用の薬剤組成物調製
（製造）における薬剤の使用に関する。

【００２５】 さらなる態様では、本発明は、薬物がＲＡＲβ２シグナル伝達を調整すること
ができる（例えば、上記のインビトロアッセイ法においてＲＡＲβ２シグナル伝
達を調整することができる）、薬剤を用いた被験体の治療法に関する。

【００２６】 さらなる態様では、本発明は、薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤、または
賦形剤との混合物中にＲＡＲβ２および／またはそのアゴニストを含む、神経突
起を発生させるために使用される薬剤組成物に関する。

【００２７】 容易に参照できるように、本発明のこれらまたはさらなる態様を、項目に適切
な見出しをつけて考察する。しかし、各項目の教示は必ずしもそれぞれの特定の
項目を制限しない。

【００２８】 （好ましい態様） 好ましい態様では、ＲＡＲβ２の発現を指示することができる核酸構成物の投
与は、ＲＡ、好ましくはＣＤ２０１９（またはその模倣物）などのＲＡＲβ２ア
ゴニストの投与によって達成される。

【００２９】 好ましくは、アゴニストは、ＲＡＲβ２レセプターについていくらかの選択性
を有する。好ましくは、アゴニストは、ＲＡＲαレセプターに著しい影響を与え
ない。好ましくは、アゴニストは、ＲＡＲγレセプターに著しい影響を与えない
。より好ましくは、アゴニストは、ＲＡＲαレセプターまたはＲＡＲγレセプタ
ーに著しい影響を与えない。さらにより好ましくは、アゴニストは、ＲＡＲβ２
レセプターの選択性が高い。

【００３０】 好ましい態様では、ＲＡＲβ２の発現を指示することができる核酸構成物の投
与は、ベクター、好ましくはウイルスベクター、より好ましくはレトロウイルス
ベクターを用いて達成される。より好ましい具体例では、ＲＡＲβ２の発現を指
示することができる核酸構成物の投与は、神経細胞などの非分裂性哺乳動物細胞
に感染することができるレトロウイルスベクターを使用して達成される。

【００３１】 （利点） 本発明は、ＲＡＲβ２および／またはそのアゴニストが神経細胞の発生を調整
することができるので有利である。

【００３２】 また、被験体へのＮＧＦの投与を回避するという点で、本発明は有利である。

【００３３】 また、成体の神経組織における神経突起の成長を促進することができるという
点で、本発明は有利である。

【００３４】 レチノイドは、ビタミンＡ由来分子のファミリーであり、これには生物活性代
謝産物であるレチノイン酸（ＲＡ）が含まれる。ＲＡの細胞への影響は、２つの
クラスのレセプター（全てのトランスＲＡ（ｔＲＡ）および９−シス−ＲＡ（９
−シス−ＲＡ）の両方によって活性化されるレチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）
ならびに９−シス−ＲＡのみによって活性化されるレチノイドＸレセプター（Ｒ
ＸＲ））の作用によって媒介される（Ｋａｓｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９４
、Ｋｌｅｉｗｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９４）。レセプターは、３つの主要なサ
ブタイプ（α、β、γ）からなり、これらは選択的スプライシングおよびディフ
ァレンシャルプロモーターの使用のための多数のイソ型である（Ｌｅｉｄ ｅｔ
ａｌ．）。ＲＡＲは、ＲＸＲとのヘテロ二量体の形成による遺伝子発現を媒介
する一方で、ＲＸＲはホモ二量体としてか種々のオーファンレセプターとのヘテ
ロ二量体の形成によって遺伝子発現を媒介することができる（Ｍａｎｇｅｌｓｄ
ｏｒｆ ＆ Ｅｖａｎｓ、１９９５）。種々の胚性ニューロン型についての多く
の研究によって、ＲＡが神経突起の数および長さを共に刺激することができ（総
説、Ｍａｄｅｎ、１９９８）、実際ニューロトロフィンを刺激することができる
（Ｃａｍｐｅｎｏｔ、１９７７；Ｌｉｎｄｓａｙ、１９８８；Ｔｕｔｔｌｅ ａ
ｎｄ Ｍａｔｈｅｗ、１９９５）ことが示されている。ニューロトロフィンは、
末梢神経系の発生における一次感覚神経の種々のニューロンの生存に必要な成長
因子のファミリーである（Ｓｎｉｄｅｒ、１９９４）。ＰＣ１２細胞におけるＮ
ＧＦによって誘導される最初期遺伝子の１つは、オルファンレセプターＮＧＦＩ
−Ｂ（ＮＵＲＲ１）である（Ｍｉｌｌｂｒａｎｄｔ、１９８９）。これにより、
発生ニューロンにおける成長因子およびレチノイド媒介経路が相互作用すること
ができることが示唆される。

【００３５】 これらの態様の背景となる教示は、Ｖｉｃｔｏｒ Ａ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ ｅ
ｔ ａｌ．、ｈｔｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｏｍｉｎに示
されている。以下の情報は、この供給源から抜粋している。

【００３６】 ３つのレチノイン酸レセプター（α、β、およびγ）は、核レセプタの超ファ
ミリーのメンバーである。レチノイン酸は、脊椎動物で説明された最初のモルフ
ォゲンである。ＲＡＲＡおよびＲＡＲＢ遺伝子は、核レセプターファミリーの任
意の他のメンバーよりも、それぞれ第１７番染色体および第１３番染色体に存在
する２つの密接に関連するチロイドホルモンレセプターＴＨＲＡおよびＴＨＲＢ
のメンバーと相同である。これらの所見により、チロイドホルモンおよびレチノ
イン酸レセプターが遺伝子、おそらく染色体によって進化した（ファミリーのス
テロイドレセプター基の共通の祖先由来の、ある程度早期に分化した共通の祖先
由来の重複）ということが示唆される。ＲＡＲＢ遺伝子（以前にＨＡＰと記され
ている）は、体細胞ハイブリッド形成およびｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成に
よって３ｐ２４にマッピングされている。

【００３７】 Ｂｅｎｂｒｏｏｋら（１９８８年）は上皮組織中の優勢な分布を示し、それに
よりＲＡＲ（ε）を使用した。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成により、Ｍａｔ
ｔｅｉら（１９８８年）では、３ｐ２４にＲＡＲＢ遺伝子と命名した。欠失マッ
ピングを用いて、ｄｅ Ｔｈｅら（１９９０年）は、ヘルペスウイルスキナーゼ
プロモーターに対するレチノイン酸応答性を付与する、転写開始の５９ｂｐ上流
に存在する２７ｂｐフラグメントを同定した。これらは、αレセプターおよびβ
レセプターは、共に同一のＤＮＡ配列を介して作用することが示されている。Ｍ
ａｔｔｅｉ ｅｔ ａｌ．、１９９１では、マウスの第１４番染色体（バンドＡ
）およびラットの第１５番染色体に対応する遺伝子を割り当てた。

【００３８】 Ｎａｄｅａｕら（１９９２年）では、第１４番染色体の動原体部分に相補的な
マウスの割り当てを確認した。

【００３９】 特定のヒト肝細胞癌（ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｒ ｃａｒｃｉｎ
ｏｍａ：ＨＣＣ）に存在するＢ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ−Ｂ ｖｉ
ｒｕｓ：ＨＢＶ）組み込み部位と同一の肝臓の非腫瘍組織における対応する非占
有部位との比較により、Ｄｅｊｅａｎら（１９８６年）は、ＨＢＶ組み込みは、
癌遺伝子（ＥＲＢＡ）およびヒト糖質コルチコイドおよびエストロゲンレセプタ
ー遺伝子の推定ＤＮＡ結合ドメインの両方に著しく類似する肝細胞配列に隣接す
るウイルス配列に存在することを見出した。

【００４０】 Ｄｅｊｅａｎら（１９８６年）により、この遺伝子（通常、サイレントである
か正常な肝細胞中で非常に低いレベル）は、ＨＢＶ組み込みの結果として不適切
に発現するので、細胞形質転換に寄与することが示唆された。

【００４１】 げっ歯類−ヒト体細胞ハイブリッドＤＮＡのパネルによって、Ｄｅｊｅａｎ
ら（１９８６年）は、遺伝子を第３番染色体に位置付けた。Ｄｅｊｅａｎ ら（
１９８７年）によるさらなる研究により、ＨＡＰ遺伝子産物は肝臓中の不適切な
発現が幹細胞発癌に関連する新規のリガンド応答性調節タンパク質であり得るこ
とが示唆された。Ｂｒａｎｄら（１９８８年）は、ＨＡＰ（ＨＢＶ活性化タンパ
ク質）と呼ばれる新規のタンパク質はレチノイン酸レセプターであることを示し
た。彼らは、このレセプターをβ型（ＲＡＲＢ）と呼び、３ｐ２５−ｐ２１にマ
ッピングした。

【００４２】 Ｌｏｔａｎら（１９９５年）は、ＲＡＲＢのｍＲＮＡの発現が全癌状態の口頭
損傷で選択的に損失しており、イソトレチノインでの治療によって回復すること
ができることを見出した。ＲＡＲＢのｍＲＮＡ発現の回復は、臨床応答に関連し
た。

【００４３】 ＲＡＲＢ、ＲＡＲＧ、ＲＸＲＢ、およびＲＸＲＧは、線条体で発現する。転移
に対するこれらの遺伝子の効果を研究するために、Ｋｒｅｃｚｅｌ（１９９８年
）は、１遺伝子および２遺伝子のノックアウトマウスを開発し、オープンフィー
ルドおよびロータロッド試験によってマウスの歩行技術を分析した。ＲＡＲＢ−
ＲＸＲＢ、ＲＡＲＢ−ＲＸＲＧ、およびＲＸＲＢ−ＲＸＲＧの２ヌル変異マウス
（対応する１ヌル変異体ではない）は、野生型同腹子と比較した場合、正方向の
転移の減少を示した。４０％のＲＡＲＢ−ＲＸＲＢヌル変異体が、逆方向歩行を
示した。ロータロッド試験により、ＲＡＲＢ、ＲＡＲＢ−ＲＸＲＢ、ＲＡＲＢ−
ＲＸＲＧ、およびＲＸＲＢ−ＲＸＲＧマウスが異常であった。それに対して、Ｒ
ＡＲＡ、ＲＡＲＧ、ＲＡＲ−ＲＸＲＧ、およびＲＡＲＧ−ＲＸＲＧヌルマウスは
、ＲＡＲＡおよびＲＡＲＧが線条体で発現するにもかかわらず転移の欠陥は認め
られなかった。骨格筋、末梢神経、および脊髄の形態、発生、および機能は、平
衡反射と同様に、１および２ヌル変異体で正常であった。これらの結果により、
Ｋｒｅｃｚｅｌら（１９９８年）では、ＲＡＲＢ、ＲＸＲＢ、およびＲＸＲＧは
、歩行挙動の調節に特異的に関与し、ＲＡＲＢとＲＸＲＢまたはＲＸＲＧとのヘ
テロ二量体は機能的レセプター単位であるのでＲＸＲＢとＲＸＲＧは機能的に縮
重していると示唆した。

【００４４】 Ｋｒｅｃｚｅｌら（１９９８年）は、これらのマウスにおけるＤ１ドーパミン
レセプターおよびＤ２ドーパミンレセプター（Ｄ１ＲおよびＤ２Ｒ）（線条体に
おいて最も豊富なドーパミンレセプター）を研究した。ＲＡＲＢ−ＲＸＲＢ、Ｒ
ＡＲＢ−ＲＸＲＧ、およびＲＸＲＢ−ＲＸＲＧ２ヌル変異体（ＲＡＲＢまたはＲ
ＸＲＧ１ヌル変異体ではない）は、野生型コントロールと比較した場合、前線条
体Ｄ１ＲおよびＤ２Ｒ転写物は、それぞれ４０％および３０％減少した。

【００４５】 線条体の正中領域（中隔側坐核の被殻および中心ならびに尾状核被殻を含む）
で最も減少した。減少はＤ２Ｒ発現ニューロンによらず、アポトーシスは増加し
なかった。線条体の組織学的性質は正常であった。

【００４６】 Ｓａｍａｄら（１９９７年）によるＤ２Ｒプロモーターにおけるレチノイン酸
応答エレメントの特徴により、Ｋｒｅｃｚｅｌら（１９９８年）は、Ｄ２Ｒの減
少およびＤ２Ｒ発現は転写レベルで起こることを示唆した。ＲＡＲＢ−ＲＸＲＢ
、ＲＡＲＢ−ＲＸＲＧ、およびＲＸＲＢ−ＲＸＲＧの２ヌル変異体は、Ｄ１Ｒ−
ヌルマウスの表現型を模倣したコカインによって誘導された転移の増加を示さな
かった。

【００４７】 まとめると、これらの結果はＫｒｅｃｚｅｌら（１９９８年）によって、レチ
ノイドがドーパミン作動性中脳辺縁系経路の機能の調節に関連することが示され
、レチノイン酸シグナル伝達の欠損は神経学的障害に寄与し得ることが示唆され
る。

【００４８】 （アゴニスト） 本発明のアゴニストは、任意の適切なＲＡＲβ２アゴニストであり得る。好ま
しくは、このＲＡＲβ２のアゴニストはトランス活性化においてＲＡＲβ２を活
性化することができる。

【００４９】 アゴニストは、有機化合物または他の化学物質であり得る。アゴニストは、ア
ミノ酸配列またはその化学的誘導体またはその混合物であり得る。薬剤は、セン
ス配列またはアンチセンス配列であり得るヌクレチド配列でもよい。薬剤は、抗
体であっても良い。

【００５０】 典型的には、アゴニストは、有機化合物である。典型的には、有機化合物は２
つまたはそれ以上のヒドロカルビル基を含む。本明細書中では、用語「ヒドロカ
ルビル基（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｙｌ ｇｒｏｕｐ）」は、少なくともＣおよびＨ
を含む基を意味し、任意選択的に１つまたは複数の他の適切な置換基を含み得る
。このような置換基の例には、ハロ基、アルコキシ基、ニトロ基、アルキル基、
環状基などを含み得る。置換基が環状基である可能性に加えて、置換基の組み合
わせによって、環状基が形成され得る。ヒドロカルビル基が１つを超えるＣを含
む場合、これらの炭素は適切なエレメントまたは基を介して結合し得る。例えば
、適切なエレメントまたは基を貸して、少なくとも２つの炭素原子を結合させる
ことができる。したがって、ヒドロカルビル基はヘテロ原子を含み得る。適切な
ヘテロ原子は、当業者に自明であり、これには、例えば硫黄、窒素、および酸素
が含まれる。いくつかの適用では、好ましくは、薬剤は少なくとも１つの環状基
を含む。環状基は、多環基（非融合多環基など）であり得る。いくつかの適用で
は、アゴニストは、別のヒドロカルビル基に結合した少なくとも１つの環状基を
含む。

【００５１】 （特異的アゴニスト） 本発明の特異的アゴニストの例は、レチノイン酸（ＲＡ）である。レチノイン
酸の両方の共通の形態（全トランスレチノイン酸（ｔＲＡ）または９−シス−Ｒ
Ａ）はＲＡＲβ２のアゴニストである。

【００５２】 ＣＤ２０１９は、本明細書中に記載およびＥｌｉｍａｚａｒ ｅｔ ａｌ．、
１９９６、Ｔｅｒａｔｏｌｏｇｙ、第５３巻、１５８〜１６７に記載の構造を有
するＲＡＲβ２アゴニストである。このアゴニストおよび他のアゴニストはまた
、Ｂｅａｒｄ ａｎｄ Ｃｈａｎｄｒａｒａｔｎａ、１９４；Ｊｏｈｎｓｏｎ
ｅｔ ａｌ．、１９９６に考察されている。ＣＤ２０１９の構造を、添付の図面
に式Ｉとして示す。

【００５３】 別のＲＡＲβ２アゴニストを、添付の図面に式ＩＩとして示す。

【００５４】 本発明はまた、式Ｉおよび／または式ＩＩの式の模倣物または生物学的な等価
物を含む。

【００５５】 好ましくは、本発明で有用なアゴニストは、ＲＡＲβ２選択性である。

【００５６】 （ＲＡＲβ２アゴニズムの同定アッセイ） 本発明のアゴニストの例を、ＲＡＲβ２アゴニズムの同定アッセイの使用によ
って同定および／または確認することができる。

【００５７】 したがって、本発明はまた、（ｉ）候補薬剤がＲＡＲβ２アゴニストなどとし
て作用することができるかどうかを同定するステップと、（ｉｉ）前記候補薬剤
がＲＡＲβ２アゴニストとして作用することができる場合、前記アゴニストを神
経突起を発生させる量で被験体に送達させるステップを含む。

【００５８】 （アッセイ） 任意の１つまたは複数の適切なターゲット（アミノ酸配列および／またはヌク
レオチド配列）を、任意の種々の薬物スクリーニング技術においてＲＡＲβ２を
調整することができる薬剤の同定に使用することができる。このような試験に使
用されるターゲットは、溶液中で遊離状態であり、固体支持体に固定されており
、細胞表面上に存在しているか細胞内に存在し得る。ターゲット活性の消滅また
は試験されるターゲットと薬剤との間の結合複合体の構成を測定することができ
る。

【００５９】 本発明のアッセイは、多数の薬剤を試験するスクリーニングであり得る。１つ
の態様では、本発明のアッセイ法は、高処理スクリーニングである。

【００６０】 薬物スクリーニング技術は、１９８４年９月１３日公表のＧｅｙｓｅｎの欧州
特許出願８４／０３５６４に記載の方法に基づき得る。要約すれば、多数の異な
る小さなペプチド化合物を、固体支持体（プラスチックピンまたはいくつかの他
の表面など）上で合成する。ペプチド試験化合物を、適切なターゲットまたはそ
のフラグメントと反応させ、洗浄する。次いで、結合した構成要素を、当該分野
で周知の適切に適用した方法などによって検出する。精製ターゲットを、薬物ス
クリーニング技術で使用するためにプレート上に直接コートすることもできる。
あるいは、非中和抗体を使用して、ペプチドを捕獲し、固体支持体上に固定する
ことができる。

【００６１】 本発明は、ターゲットに結合することができる中和抗体がターゲット結合用の
試験化合物と特異的に競合する競合薬物スクリーニングアッセイの使用も意図さ
れる。

【００６２】 別のスクリーニング技術により、基質に対する適切な結合親和性を有する薬剤
の高処理スクリーニング（ＨＴＳ）が得られ、これは、ＷＯ−Ａ−８４／０３５
６４に詳述の方法に基づく。

【００６３】 本発明のアッセイ法は、試験化合物の小規模および大規模スクリーニングなら
びに定量アッセイに適切であると予想される。

【００６４】 好ましい態様では、本発明は、ＲＡＲβ２を選択的に調整する薬物の同定法に
関する。

【００６５】 好ましい態様では、本発明のアッセイは、その表面上でＲＡＲβ２を提示する
細胞を利用する。これらの細胞を、このような細胞を保有する被験体から単離す
ることができる。しかし、好ましくは、細胞を、トランスフェクションの際にこ
れらの細胞がその表面ＲＡＲβ２上に提示されるような細胞のトランスフェクシ
ョンによって調製（製造）する。

【００６６】 使用することができるアッセイの別の例は、ＷＯ−Ａ−９８４９２７１に記載
されている。これは、不死化奇形癌ＣＮＳニューロン株に関し、高レベルのニュ
ーロン分化レベルを有し、ＲＡＲβ２に結合する化合物の検出に有用である。

【００６７】 （レポーター） 広範な種々のレポーターを、都合よく検出可能なシグナルが得られる好ましい
レポーターを用いる本発明のアッセイ法（ならびにスクリーニング）に使用する
ことができる。例として、レポーター遺伝子は、光吸収特性を変化させる反応を
触媒する酵素をコードすることができる。

【００６８】 他のプロトコールには、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定（ＲＩ
Ａ）、および蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）が含まれる。２つの非干渉エ
ピトープに反応性を示すモノクローナル抗体を使用する２部位のモノクローナル
抗体ベースの免疫アッセイを使用しても良い。これらおよび他のアッセイは、Ｈ
ａｍｐｔｏｎ Ｒ ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ、Ｓ
ｔ Ｐａｕｌ ＭＮおよびＭｄｄｏｘ ＤＥ ｅｔ ａｌ．、１９８３、Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．、１５、８、１２１、１に記載されている。

【００６９】 レポーター分子の例には、ガラクトシダーゼ、インベルターゼ、緑色蛍光タン
パク質、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール、アセチルトランスフェラーゼ
、グルクロニダーゼ、エクソグルカナーゼ、およびグルコアミラーゼが含まれる
が、これらに限定されない。あるいは、放射標識または蛍光タグ標識化ヌクレオ
チドを発生期の転写物に組み込んで、オリゴヌクレオチドプローブに結合した場
合に検出することができる。

【００７０】 さらなる例のために、多数の企業（ファーマシア バイオテック（Ｐｉｓｃａ
ｔａｗａｙ、ＮＪ）、プロメガ（マディソン、ＷＩ）、およびＵＳ バイオケミ
カル コーポレーション（クリーブランド、ＯＨ）など）が市販のキットおよび
アッセイ手順についてのプロトコールを提供している。適切なレセプター分子ま
たはラベルには、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光剤、または発色剤、ならび
に基質、補因子、インヒビター、磁性粒子などが含まれる。このような標識を教
示する特許には、米国特許第第３，８１７，８３７号、米国特許第３，８５０，
７５２号、米国特許第３，９３９，３５０号、米国特許第３，９９６，３４５号
、米国特許第４，２７７，４３７号、米国特許第４，２７５，１４９号、および
米国特許第４，３６６，２４１号が含まれる。

【００７１】 （宿主細胞） 本発明に使用される（ターゲットとして使用されるか、ターゲットを発現させ
るか、薬学的に活性な薬剤として使用される）ポリヌクレオチドを、宿主細胞に
移入することができる。

【００７２】 本発明に関連する用語「宿主細胞」には、本発明のポリヌクレオチド配列を含
むことができる任意の細胞が含まれる。

【００７３】 本明細書中では、ポリヌクレオチドを、原核細胞または真核細胞（例えば、酵
母、昆虫細胞、または哺乳動物細胞）に移入することができる。

【００７４】 当該分野で公知の種々の技術（トランスフェクション、形質転換、およびエレ
クトロポレーションなど）を用いて、本発明のポリヌクレオチドを適切な宿主細
胞に移入することができる。本発明のポリヌクレオチドを動物に投与した場合、
いくつかの技術（例えば、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、およびアデ
ノウイルスなどの組換えウイルスベクターの感染、核酸への直接注射、ならびに
微粒子銃による形質転換）が公知である。

【００７５】 したがって、本発明のさらなる具体例により、本発明のターゲットであるかタ
ーゲットを発現するポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた
宿主細胞が得られる。好ましくは、ポリヌクレオチドは、ターゲットであるかタ
ーゲットを発現するポリヌクレオチドの組換えおよび発現用のベクター中に保有
される。細胞は、ベクターと競合するように選択され、これは例えば原核細胞（
ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ、例えば、細菌）、真菌、酵母、または植物細胞であり
得る。

【００７６】 グラム陰性細菌大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、異種遺伝子発現用の宿主として広
く一般に使用されている。しかし、細胞内に、大量の異種タンパク質が蓄積され
る傾向がある。大量の大腸菌細胞内タンパク質由来の所望のタンパク質の適切な
精製は、しばしば困難であり得る。

【００７７】 大腸菌とは対照的に、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の細菌は、その培養培
地へのタンパク質分泌能力により異種宿主として非常に適切である。宿主として
有用な他の細菌は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびシ
ュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）由来のものである。

【００７８】 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの性質および／または発
現タンパク質のさらなるプロセシングの望ましさに依存して、酵母または他の真
菌などの真核宿主が好まれ得る。一般に、酵母細菌は、操作が容易であるので真
菌細胞よりも好ましい。しかし、いくつかのタンパク質は酵母細胞からあまり分
泌されないか、適切に処理されない場合がある（例えば、過剰グリコシル化）。
これらの場合、異なる真菌宿主生物を選択すべきである。

【００７９】 本発明の範囲内の適切な発現宿主の例は、アスペルギルス（コウジカビ：Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）類（欧州特許第０１８４４３８号および欧州特許第０２８
４６０３号に記載のものなど）およびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ類などの真菌、Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ類（欧州特許第０１３４０４８号および欧州特許第０２５３４５
５号に記載もものなど）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種、およびシュードモナス
属菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ）類などの細菌、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ類（
欧州特許第００９６４３０号および欧州特許第０３０１６７０号に記載のものな
ど）およびサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）類などの酵母である
。例として、典型的な発現宿主は、黒色麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇ
ｅｒ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｖａｒ．ｔｕｂｉｇｅｎｉｓ、
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｖａｒ．ａｗａｍｏｒｉ、Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｉｓ、コウジカビ為巣性（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｄｕｌａｎｓ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏ
ｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕ
ｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、およびＳａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから選択することができる。

【００８０】 広範に修飾されるポリヌクレオチドは、その機能を完了するための正確なプロ
セシングを必要とし得る。これらの例では、哺動物細胞発現系（ＨＥＫ−２９３
、ＣＨＯ、ＨｅＬＡなど）が必要であり、ポリペプチドは、細胞内もしくは細胞
膜上で発現されるか、適切なリーダー配列の前に存在する場合、培養培地中に分
泌される。

【００８１】 適切な宿主細胞（酵母、真菌、植物、および哺乳動物宿主細胞など）の使用に
より、本発明の組換え産物に適切な生物活性を付与するために必要であり得る翻
訳後修飾（例えば、ミリストイル化、グリコシル化、短縮、脂質付加、ならびに
チロシン、セリンまたはトレオニンのリン酸化）が得られる。

【００８２】 （生物） 本発明に関する用語「生物」には、本発明の配列および／またはそれから得ら
れる産物を含む任意の生物が含まれる。生物の例には、真菌、酵母、または植物
を含み得る。

【００８３】 本発明に関連する用語「トランスジェニック生物」には、本発明のターゲット
および／または得られた産物を含む任意の生物が含まれる。

【００８４】 （宿主細胞／宿主生物の形質転換） 上記のように、宿主生物は、原核生物または真核生物であり得る。適切な原核
生物の例には、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓが含ま
れる。原核宿主の形質転換についての教示は、当該分野で十分に報告されており
、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、１９８９、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＰｒｅｓｓおよびＡｕ
ｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９５、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏ
ｎｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと。

【００８５】 原核宿主が使用される場合、ヌクレオチド配列は、形質転換前にイントロンの
除去などによって適切に修飾される必要があり得る。

【００８６】 別の具体例では、トランスジェニック生物は、酵母であり得る。この点で、酵
母はまた、異種遺伝子発現用の伝達体として広く一般に使用されている。Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、長い工業用途（異種遺伝子発
現での使用を含む）の歴史がある。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅにおける異種遺伝子の発現は、Ｇｏｏｄｅｙ ｅｔ ａｌ．、１９８７
、Ｙｅａｓｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄ．Ｒ．Ｂｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ
．編、４０１〜４２９、Ａｌｌｅｎ ａｎｄ Ｕｎｗｉｎ、Ｌｏｎｄｏｎおよび
Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｙｅａｓｔｓ、Ｅ．Ｆ．Ｗａｌｔｏｎ ａｎｄ Ｇ．Ｔ
．Ｙａｒｒｏｎｔｏｎ編、１０７〜１３３、Ｂｌａｃｋｉｅ、Ｇｌａｓｇｏｗで
概説されている。

【００８７】 いくつかの理由により、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ） ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅは、異種遺伝子発現に非常に適切である。第１に、これは人
に対して非病原性であり、かつ一定のエンドトキシンを産生することができる。
第２に、種々の目的に何百年にもわたる商業的開発で安全に使用されている長い
歴史がある。これにより、広範な公的認容性がある。第３に、広範な商業的使用
および生物を供した研究により、遺伝学および生理学ならびにＳａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの大量発酵特性についての豊富な知識が得ら
れている。

【００８８】 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける異種遺伝子発現
および遺伝子産物分泌の原理の総説は、Ｅ．Ｈｉｎｃｈｃｌｉｆｆｅ Ｅ．Ｋｅ
ｎｎｙ、１９９３、「異種遺伝子発現用の伝達体としての酵母」、Ｙｅａｓｔｓ
、第５巻、Ａｎｔｈｏｎｙ Ｈ．Ｒｏｓｅ ａｎｄ Ｊ．Ｓｔｕａｒｔ Ｈａｒ
ｒｉｓｏｎ編、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄに記載されてい
る。

【００８９】 酵母ベクターのいくつかの型（その維持に宿主ゲノムでの組換えが必要な組み
込みベクターおよび自律複製プラスミドベクターを含む）を得ることができる。

【００９０】 トランスジェニックＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓを調製（製造）するために、
本発明のヌクレオチド配列の酵母での発現用に設計された構築物への挿入によっ
て発現構築物を調製（製造）する。異種発現に使用するいくつかの構築物の型が
開発されている。構築物は、本発明のヌクレオチド配列に融合した酵母で活性な
プロモーター（通常、ＧＡＬ１プロモーターなどの酵母起源のプロモーター）を
含む。通常、ＳＵＣ２シグナルペプチドをコードする配列などの酵母起源のプロ
モーターを使用する。酵母で活性なターミネーターで発現系が終結している。

【００９１】 酵母の形質転換用に、いくつかの形質転換プロトコールが開発されている。例
えば、本発明のトランスジェニックサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ）を、以下の技術（Ｈｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．、１９７８、Ｐｒｏｃｅｅｄ
ｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＵＳＡ、７５、１９２９、Ｂｅｇｇｓ，Ｊ．Ｄ．、１９
７８、Ｎａｔｕｒｅ、Ｌｏｎｄｏｎ、２７５、１０４、およびＩｔｏ Ｈ．ｅｔ
ａｌ．、１９８３、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１５３、１６３〜１６８
）によって調製（製造）することができる。

【００９２】 形質転換酵母細胞を、種々の選択マーカーを用いて選択する。そのうち形質転
換に使用したマーカーは、多数の栄養要求性マーカー（ＬＥＵ２、ＨＩＳ４、お
よびＴＲＰ１など）および優性抗生物質耐性マーカー（アミノグリコシド抗生物
質マーカー（例えば、Ｇ４１８）など）である。

【００９３】 他の宿主生物は植物である。遺伝子修飾植物構築の基本的原理は、挿入遺伝物
質の安定なに維持するために、植物ゲノム中の遺伝情報を挿入することである。
遺伝情報挿入にはいくつかの技術が存在し、そのうちで腫瘍となる原理は、遺伝
情報の直接的移入およびベクター系を使用による遺伝情報の移入である。一般的
な技術の総説は、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９１、４２、２０５〜２２５お
よびＣｈｒｉｓｔｏｕ、Ａｇｒｏ−Ｆｏｏｄ−Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｈｉ−Ｔｅｃ
ｈ Ｍａｒｃｈ／Ａｐｒｉｌ、１９９４、１７〜２７の論文に見出すことができ
る。植物形質転換に関するさらなる教示を、欧州特許０４４９３７５号に見出す
ことができる。

【００９４】 本発明のヌクレオチド配列に適切なさらなる宿主には、昆虫細胞または脊椎動
物細胞などの高等動物細胞（特に、哺乳動物細胞（ヒト細胞または多細胞生物由
来の有核細胞を含む））が含まれる。近年、培養（組織培養）中の脊椎動物の調
製（製造）は、日常的手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、上
皮または線維芽細胞株（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＩＨ
３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、または２９３Ｔ細胞）である。

【００９５】 本発明のヌクレオチド配列を、宿主細胞に安定に組み込むか当該分野で公知の
方法を用いて一過性に発現することができる。例として、安定にトランスフェク
トした哺乳動物細胞を、選択マーカー遺伝子を有する発現ベクターでの細胞トラ
ンスフェクトおよびマーカー遺伝子を発現する細胞に選択的な条件下でトランス
フェクト細胞の増殖によって調製（製造）することができる。一過性トランスフ
ェクタントと調製（製造）するために、哺乳動物細胞をレポーター遺伝子でトラ
ンスフェクトして、トランスフェクション効率を監視する。

【００９６】 雇用な安定にまたは一過性にトランスフェクトした細胞を産生するために、細
胞を、十分量の本発明のヌクレオチド配列でトランスフェクトすべきである。正
確な量の本発明のヌクレオチド配列を、経験的に同定し、特定の細胞およびアッ
セイ用に最適化することができる。

【００９７】 したがって、本発明はまた、ターゲットであるかターゲットを発現させるヌク
レオチド配列で宿主細胞をトランスフェクトする方法を提供する。ヌクレオチド
配列で形質転換した宿主細胞を、コードタンパク質の発現に適切な条件下で培養
することができる。組換え細胞によって産生されたタンパク質を、細胞表面に提
示することができる。所望ならば、当業者に理解されるように、コート配列を含
む発現ベクターを、特定の原核生物または真核生物細胞膜を介してコード配列の
分泌を指示するシグナル配列で設計することができる。他の組換え構築物により
、可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌク
レオチド配列にコード配列を連結させることができる（Ｋｒｏｌｌ ＤＪ．ｅｔ ａｌ．、１９９３、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１２、４４１〜５３）。

【００９８】 （レセプター） 本明細書中に記載のＲＡＲβ２レセプターには、模倣物、本ログ、フラグメン
ト、および全遺伝子産物の一部が含まれる。好ましくは、本明細書中に記載のＲ
ＡＲβ２レセプターは、実質的に全遺伝子産物をいう。

【００９９】 （神経学的障害） 本明細書中で使用される、用語「神経学的障害」は、機械的（例えば、外傷に
よる）または化学的に誘導された（例えば、神経毒によるか免疫抑制効果を有す
る治療計画による（設計によるか副作用として））任意の損傷、ウイルス感染な
どによって発症する神経病態、任意の退行性疾患、または他の神経組織関連障害
をいうことができる。

【０１００】 神経学的障害には、パーキンソン病、アルツハイマー病、老衰、運動神経疾患
、精神分裂症、ならびに他の神経および／または神経変性障害などの病態が含ま
れる。他の神経関疾患には、緑内障、視神経、顔面神経に対する損傷の他の原因
または局所性麻痺の他の形態、根治前立腺切除後の神経損傷などによる神経ベー
スの性交不能、または他の病訴を含み得る。本発明が有用であり得る他の障害に
は、糖尿病の神経病理学的効果、ＡＩＤＳ、ニューロパシー、ハンセン病などを
含み得る。

【０１０１】 用語「神経学的障害」は、神経系（末梢神経系もしくは中枢神経系（ＣＮＳ）
、交感神経系もしくは副交感神経系、または異なる神経型の下位集合または上位
集合への影響）の任意の障害をいう。

【０１０２】 （目的のヌクレオチド（ＮＯＩ：ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒ
ｅｓｔ）） 本発明によれば、ＮＯＩ配列は、ペプチドが薬学的に活性な薬剤（ＲＡレセプ
ター、好ましくはＲＡＲβ２またはそのアゴニスト）であり得るペプチドをコー
ドし得る。

【０１０３】 このようなコードＮＯＩ配列を、典型的には、１つまたは複数の特異的細胞型
などにおけるペプチド発現を駆動することができる適切なプロモーターに作動可
能に連結することができる。

【０１０４】 本明細書中に記載のＮＯＩまたはその一部および発現調節エレメントに加えて
、送達系は、遺伝子の有効であるか調節された発現用のさらなる遺伝子エレメン
ト（プロモーター／エンハンサー、翻訳開始シグナル、内部リボゾーム侵入部位
（ＩＲＥＳ）、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルを含む）を含み得
る。

【０１０５】 ＮＯＩは、発現調節エレメント（通常、プロモーターまたはプロモーターおよ
びエンハンサー）の発現調節下であり得る。エンハンサーおよび／またはプロモ
ーターは、ＮＯＩが目的の特定の細胞（神経単位など）中で好ましく発現される
ように神経細胞中で活性であることが好ましい。したがって、治療される個体に
対するＮＯＩの任意の有意な生物学的効果または有害な影響を減少または消滅す
ることができる。多数のコピーには、発現を調節するエンハンサーエレメントま
たは他のエレメントが存在し得る。同様に、またはさらに、エンハンサーおよび
／またはプロモーターは、１つまたは複数の特異的細胞型（神経細胞（例えば、
ニューロンなどの有糸分裂後に最終的に分化した非複製細胞）など）で活性であ
ることが好ましい。

【０１０６】 用語「プロモーター」は、当該分野での通常の意味（例えば、遺伝子発現のジ
ャコブ・モノーの仮説におけるＲＮＡポリメラーゼ結合部位）として使用される
。

【０１０７】 用語「エンハンサー」には、転写開始複合体の他のタンパク質成分に結合して
その関連するプロモーターによって指示される転写の開始を促進するＤＮＡ配列
が含まれる。

【０１０８】 （発現ベクター） 好ましくは、本発明の方法で使用されるＮＯＩ（例えば、ＲＡＲβ２またはそ
の一部をコードする）を、宿主細胞によってコード配列を発現することができる
コントロール配列に作動可能に連結されたベクター（すなわち、ベクターは発現
ベクターである）に挿入する。

【０１０９】 （ターゲット化されたベクター） 用語「ターゲット化されたベクター(ｔａｒｇｅｔｅｄ ｖｅｃｔｏｒ）」は
、細胞を感染、トランスフェクト、移入するか、宿主細胞中および／またはター
ゲット細胞中で発現される能力が宿主生物内の一定の細胞型（通常、共通または
類似の表現型を有する細胞）に制限されるベクターをいう。

【０１１０】 （送達） 本発明で使用される送達系は、ＮＯＩの送達用の任意の適切な送達系であり得
る。ＮＯＩを獲得することによって関連ペプチド（例えば、ＲＡＲβ２）がイン
ビボで得られて、有利な治療効果が得られる。

【０１１１】 送達系は、ウイルス送達系であり得る。ウイルス送達系には、アデノウイルス
ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ：ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｖｉｒａｌ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、
レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクターが含まれるがこれらに限定
されない。あるいは、送達系は、非ウイルス送達系（例えば、プラスミド、染色
体、または人口染色際のＤＮＡトランスフェクション法など）であり得る。本明
細書中のトランスフェクションには、ターゲット哺乳動物細胞に遺伝子を送達さ
せるための非ウイルスベクターを使用したステップが含まれる。典型的なトラン
スフェクション法には、エレクトロポレーション、ＤＮＡ微粒子銃、脂質媒介ト
ランスフェクション、小型ＤＮＡ媒介トランスフェクション、リポソーム、免疫
リポソーム、リポフェクチン、陽性因子媒介の陽性表面の両親媒性物質（ｃａｔ
ｉｏｎｉｃ ｆａｃｉａｌ ａｍｐｈｉｐｉｌｅ：ＣＦＡ）（Ｎａｔｕｒｅ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９６、１４、５５６）、およびその組み合わせ
が含まれる。

【０１１２】 ベクターの他の例には、ｅｘビボ送達系（ｅｘ ｖｉｖｏ ｄｅｌｉｖｅｒｙ
ｓｙｓｔｅｍ）が含まれ、これには、エレクトロポレーション、ＤＮＡ微粒子
銃、脂質媒介トランスフェクション、小型ＤＮＡ媒介トランスフェクションなど
のＤＮＡトランスフェクション法が含まれるが、これらに限定されない。

【０１１３】 好ましい態様では、送達系はベクターである。

【０１１４】 より好ましい態様では、送達系は、ウイルス送達系（ウイルスベクターという
場合もある）である。

【０１１５】 （ベクター） 当該分野で周知であるように、ベクターは、ある環境から別の環境への構成要
素の導入を可能にするか容易にするツールである。例として、組換えＤＮＡ技術
に使用するいくつかのベクターにより、ＤＮＡセグメント（異種ＤＮＡセグメン
ト、異種ｃＤＮＡセグメントなど）などの構成要素をターゲット細胞に導入する
ことができる。任意選択的に一旦ターゲット細胞内に導入されると、ベクターは
、細胞内で異種ＤＮＡを維持するように作用するか、ＤＮＡ複製単位として作用
することができる。組換えＤＮＡ技術に使用されるベクターの例には、プラスミ
ド、染色体、人工染色体、またはウイルスが含まれる。

【０１１６】 用語「ベクター」には、発現ベクターおよび／または形質転換ベクターが含ま
れる。

【０１１７】 用語「発現ベクター」は、インビボまたはインビトロ／ｅｘビボ発現が可能な
構築物を意味する。

【０１１８】 用語「形質転換ベクター（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」
は、ある種から別の種へ導入することができる構築物を意味する。

【０１１９】 （ウイルスベクター） 本発明では、ＮＯＩを、ウイルス送達系（ウイルスベクター）を使用して適切
な宿主細胞に移入することができる。種々のウイルス技術（例えば、組換えウイ
ルスベクター（レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、およびアデノウイルス
など）での感染など）は当該分野で公知である。

【０１２０】 適切な組換えウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウ
イルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクタ
ー、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ポックスウイルスベ
クター、またはパルボウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない（
Ｋｅｓｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９９、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．
、１０（１０）、１６１９〜３２を参照のこと）。ウイルスベクターの場合、典
型的には、遺伝子送達はターゲット細胞のウイルス感染によって媒介される。

【０１２１】 （レトロウイルスベクター） レトロウイルスの例は、以下が含まれるが、これらに限定されない。マウス白
血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウ
イルス（ＥＩＡＶ）、マウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス
（ＲＳＶ）、フジナミ肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイル
ス（Ｍｏ−ＭＬＶ）、ＦＢＲマウス骨肉種ウイルス（ＦＢＲ ＭＳＶ）、モロニ
ーマウス肉腫ウイルス（Ｍｏ−ＭＳＶ）、アベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ
−ＭＬＶ）、トリ骨髄球腫症ウイルス−２９（ＭＣ２９）、およびトリ赤芽球症
ウイルス（ＡＥＶ）。

【０１２２】 本発明で使用される好ましいベクターは、組換えウイルスベクター（特に、レ
ンチウイルスベクターなどの組換えレトロウイルスベクター（ＲＲＶ））である
。

【０１２３】 用語「組換えレトロウイルスベクター」（ＲＲＶ）は、ターゲット細胞を感染
させることができるウイルス粒子中に、パッケージング成分の存在下でＲＮＡゲ
ノムをパッケージングすることができる十分なレトロウイルス遺伝子情報を有す
るベクターをいう。ターゲット細胞への感染には、ターゲット細胞ゲノムへの逆
転写および組み込みが含まれる。ＲＲＶは、ベクターによってターゲット細胞へ
送達される非ウイルスコード配列を保有する。ＲＲＶは、最終ターゲット細胞内
に感染レトロウイルス粒子を産生するための独立した複製が不可能である。通常
、ＲＲＶは、機能的ｇａｇ−ｐｏｌおよび／またはｅｎｖ遺伝子および／または
複製に必要な他の遺伝子を欠く。

【０１２４】 レトロウイルスの詳細なリストは、Ｃｏｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．、「レトロウ
イルス」、１９７、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ編、ＪＭ Ｃｏｆｆｉｎ、ＳＭ Ｈｕｇｈｅｓ、ＨＥ Ｖａｒｍｕｓ、７５
８〜７６３に見出すことができる。

【０１２５】 （非ウイルス送達） 薬学的に活性な薬剤（例えば、ＲＡＲβ２）を、非ウイルス技術を用いて投与
することができる。

【０１２６】 例として、薬学的に活性な薬剤を、ペプチド送達を用いて送達させることがで
きる。ペプチド送達は、原形質膜および／または核膜を介した輸送が可能なタン
パク質由来のドメインまたは配列を使用する。

【０１２７】 ＲＡＲβ２などの目的のポリペプチドを、マイクロインジェクションまたは細
胞膜と融合することができるリポソームなどの伝達体を用いた送達によって細胞
に直接移入することができる。ウイルス融合誘導ペプチドを使用して、膜融合を
促進し、細胞の細胞質へ送達させることもできる。

【０１２８】 好ましくは、ＲＡＲβ２またはそのフラグメントを、原形質膜および／または
核膜と交差することができるタンパク質とのタンパク質融合物または結合体とし
て細胞に送達させることができる。好ましくは、ＲＡＲβ２またはそのフラグメ
ントを、輸送活性を担うタンパク質由来のドメインまたは配列に融合または結合
させる。好ましい輸送ドメインおよび配列には、ＨＩＶ−１−トランス活性化タ
ンパク質（Ｔａｔ）、アンテナペディアホメオドメインタンパク質および単純ヘ
ルペス−１ウイルスＶＰ２２タンパク質由来のドメインおよび配列が含まれる。

【０１２９】 外因的に添加したＨＩＶ−１トランス活性化タンパク質（Ｔａｔ）を原形質膜
を介して輸送して核に到達させ、ウイルスゲノムをトランス活性化させることが
できる。輸送活性は、ＨＩＶ−Ｔａｔのアミノ酸３７〜７２（Ｆａｗｅｌｌ ｅ
ｔ ａｌ．、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．
、９１、６６４〜６６８）、３７〜６２（Ａｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９
９３、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９４、８
７６〜８８４）、および４９〜５８（塩基配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲを有する）で
見出されている。Ｖｉｖｅｓ ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．、２７２、１６０１０〜７は、細胞遺伝子の輸送、核局在化、およびトラン
ス活性化に重要であると考えられるアミノ酸４８〜６０（ＣＧＲＫＫＲＲＱＲＲ
ＲＰＰＱＣ）からなる配列を同定した。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａアンテナペディア
ホメオドメインタンパク質の第３へリックスはまた、類似の特性を保有すること
が認められている（Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ，Ａ．、１９９９、Ａｎｎ．ＮＹ Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．、８８６、１７２〜９に概説されている）。アンテナペディア
における輸送を担うドメインは、配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫを有す
る塩基性アミノ酸が豊富な１６アミノ酸長のペプチドに局在化されている（Ｄｅ
ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９、１
０４４４〜５０）。このペプチドを使用して、培養において細胞質および核に生
物活性物質が指示されている（Ｔｈｅｏｄｏｒｅ，ｅｔ ａｌ．、１９９５、Ｊ
．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１５、７１５８〜７１６７）。単純ヘルペスウイルスの
ＶＰ２２外被タンパク質は、細胞間輸送が可能であり、細胞亜集団中で発現した
ＶＰ２２タンパク質が集団中の他の細胞に拡散する（Ｅｌｌｉｏｔ ａｎｄ Ｏ
’Ｈａｒｅ、１９９７、Ｃｅｌｌ、８８、２２３〜３３）。ＧＦＰ（Ｅｌｌｉｏ
ｔｔ ａｎｄ Ｏ’Ｈａｒｅ、１９９９、Ｇｅｎｅ、Ｔｈｅｒ．、６、１４９〜
５１）、チミジンキナーゼタンパク質（Ｄｉｌｂｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９９
、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、６、１２〜２１）、またはｐ５３（Ｐｈｅｌａｎ ｅ
ｔ ａｌ．、１９９８、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６、４４０〜３）
とＶＰ２２とからなる融合タンパク質が、この様式でターゲット化されている。
上記の任意のドメインまたは配列を使用して、ＲＡＲβ２またはそのフラグメン
トを細胞に指示することができる。上記の任意のドメインもしくは配列または輸
送活性を有すると同定された他の配列を使用して、ＲＡＲβ２またはそのフラグ
メントを細胞に指示することができる。

【０１３０】 （薬剤組成物） 本発明はまた、治療有効量の本発明の薬剤（本明細書中に記載のＲＡＲβ２お
よび／またはそのアゴニストなど）および薬学的許容可能なキャリア、希釈剤、
または賦形剤（その組み合わせを含む）を投与するステップを含む、薬剤組成物
を提供する。

【０１３１】 薬剤組成物は、２つの成分（第１の成分はＲＡＲβ２を含み、第２の成分はそ
のアゴニストを含む）を含み得る。第１および第２の成分を、連続的、同時、ま
たは共に、さらに異なる投与経路でさえも送達させることができる。

【０１３２】 薬剤組成物は、ヒトおよび獣医学における薬物においてヒトまたは動物用への
使用であり、典型的には、任意の１つまたは複数の薬学的に許容可能な希薄物、
キャリア、または賦形剤を含む。治療用の許容可能なキャリアまたは希釈剤薬学
分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ
ｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ａ．Ｒ
．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９８５に記載されている。薬学的キャリア、賦形剤、ま
たは希釈剤の選択を、意図する投与経路および標準的な薬学業務に関して選択す
ることができる。

【０１３３】 薬剤組成物は、キャリア、賦形剤、または希釈剤として、またはそれに加えて
、任意の適切な結合剤、潤滑剤、懸濁剤、被覆剤、可溶化剤を含み得る。

【０１３４】 保存剤、安定剤、色素、および香料も薬剤組成物に含めることができる。保存
剤の例には、安息香酸ナトリウムおよびｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルが含ま
れる。抗酸化剤および懸濁剤も使用することができる。

【０１３５】 異なる送達形に依存して異なる組成／処方の必要条件が存在し得る。例として
、本発明の薬剤組成物を処方して、ミニポンプの使用または粘膜経路（例えば吸
入用の鼻内噴霧またはエアロゾルとして）または経口溶液または組成物送達に注
射可能な形態で処方された非経口（例えば、静脈内、筋肉内、または皮下位経路
）で送達させることができる。あるいは、処方物を、両経路で送達させるように
設計することができる。

【０１３６】 薬剤が、胃腸粘膜を介して粘膜送達される場合、胃腸管において安定に維持さ
れるべきである。例えば、酸性ｐＨでタンパク質分解に対して安定に耐性を示し
、且つ胆汁の洗浄効果に耐性であるべきである。

【０１３７】 適切な場合、薬剤組成物を、吸入、局所（座薬または膣座薬の形態、皮膚パッ
チの使用によるローション、溶液、クリーム、軟膏、または粉剤の形態）、経口
（デンプンまたはラクトースなどの賦形剤を含む錠剤の形態または単独または賦
形剤と混合したカプセルまたは小卵、または香料または着色料を含むエリキシル
、溶液または懸濁液の形態）によって投与するか、非経口（例えば、静脈内、筋
肉内、または皮下）で注射することができる。非経口投与用に、組成物を、他の
物質（例えば、血液と等張の溶液を作製するのに十分な塩または単糖類）を含み
得る滅菌水溶液の形態で使用するのが最良であり得る。口内または舌下投与用に
、組成物を、従来の様式で処方することができる錠剤またはトローチ剤の形態で
投与することができる。

【０１３８】 （薬学的組み合わせ） 本発明の薬剤を、１つまたは複数の他の薬学的に活性な物質と共に投与するこ
とができる。例として、本発明は、本発明の薬剤および１つまたは複数のステロ
イド、鎮痛薬、抗ウイルス薬、または他の薬学的に活性な物質での同時または連
続治療を対象とする。

【０１３９】 投薬計画には、物質を連続的、同時、または共同で投与することが理解される
。

【０１４０】 例。本発明を、以下の図面を参考に例示のみを目的として記載する。

【０１４１】 図を、以下の例の部でより完全に記載する。 （例１：神経突起成長の刺激（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｉ
ｔｅ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）） 神経成長因子（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）は、レチ
ノイン酸合成を介して神経突起成長を刺激するように作用する。

【０１４２】 神経成長因子（ＮＧＦ）は、培養成体後根神経節（ｄｏｒｓａｌ ｒｏｏｔ
ｇａｎｇｌｉａ：ＤＧＲ）１からの神経突起成長を刺激する。ビタミンＡ誘導体
レチノイン酸（ｖｉｔａｍｉｎｅ Ａ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｖｅｔｉｎｏｉ
ｃ ａｃｉｄ：ＲＡ）はまた、種々の供給源（ＤＲＧ２、３を含む）からの神経
突起増殖を誘導する。神経突起成長を誘導する同一の遺伝子カスケード成分であ
るので、このようなＮＧＦおよびＲＡの効果は類似するのであろうか？。ＲＡは
、高親和性ＮＧＦレセプターおよび低親和性ＮＧＦレセプター３、４を上方制御
し、ＮＧＦ自体の転写を誘導することにより、ＲＡはカスケード中のＮＧＦの上
流に存在し得ることが示唆される。しかし、本発明者らは、その逆、すなわち、
ＮＧＦはＲＡの上流に存在すること示す。本発明者らは、成体マウスＤＲＧをＮ
ＧＦおよびＲＡ合成に関連する酵素を阻害する化合物の存在下で培養した場合、
神経突起成長は起こらないことを示す。それに対して、ＲＡをＮＧＦの阻害抗体
と共に添加した場合、神経突起成長は正常に行われる。本発明者らは、さらに、
ＮＧＦはレチノイン酸合成酵素ＲＡＬＤＨ−２およびレチノイン酸レセプターβ
の転写ならびに合成ＲＡの検出可能な放出を誘導することを示す。本発明者らは
、ＲＡは成体ＤＲＧ神経突起再生を必要とし、ＮＧＦはその合成を誘導するよう
にＲＡの上流で作用することを提唱する。

【０１４３】 ＲＡの細胞効果は、リガンド活性化転写因子である核レセプターへの結合によ
って媒介される。２つのクラスのレセプター（レチノイン酸レセプター（ＲＡＲ
）およびレチノイドＸレセプター（ＲＸＲ）（それぞれ、α、β、γ６，７の亜
型を有する））が存在する。さらに、選択的スプライシングおよびディファレン
シャルプロモーターの利用により各サブタイプの多数のイソ型が存在する。ＲＡ
Ｒレセプターは、ＲＸＲとのヘテロ二量体の形成によって遺伝子発現を媒介する
のに対して、ＲＸＲはホモ二量体としてかオルファンレセプター（ＬＸＲ８など
）とのヘテロ二量体の形成のいずれかによって遺伝子発現を媒介することができ
る。ＮＧＦとＲＡ経路との間のさらなる機械的関連は、核レセプターＮＧＦＩＢ
がＲＸＲｓ８とヘテロ二量体を形成することおよびＮＧＦＩＢがＮＧＦ９の投与
によってＰＣ１２細胞中に迅速に誘導されることによって示唆される。

【０１４４】 ＲＡには胚ＤＲＧ２，３からの神経突起成長の刺激という明白な役割があるに
もかかわらず、成体ＤＲＧで同様の役割を果たすかどうかは未知である。これを
試験するために、本発明者らは、脱脂血清中でＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）また
はＲＡ（１００ｎＭ）の存在下で成体マウスＤＲＧを５日間培養した。両方とも
神経突起成長が認められた（図１ｂ）。脱脂血清のみで培養した成体ＤＲＧ中で
は神経突起成長はほとんど認められないか全く認められなかった（図１ａ）。神
経突起数の相違は有意であった（図２ａ、１、２、および３）。ＲＡまたはＮＧ
Ｆ処理成体ＤＲＧから成長した神経突起数は、未処理ＤＲＧから成長した数より
有意に多いにもかかわらず、胚組織を用いて得た数より少ないことに留意するこ
とが重要である。ＲＡをＮＧＦと共に添加した場合、２つの処理についてさらな
る効果は認められず（図１ｃ）、ＲＡ、ＮＧＦ、またはＲＡ＋ＮＧＦ群の間で有
意な相違は認められなかった（図２ａ、２、３、４）。ＮＧＦおよびＲＡは共に
それぞれの飽和濃度を有し得るにもかかわらず、相乗作用の欠損はまた、ＮＧＦ
およびＲＡは神経突起を成長させるために同一の経路を介して作用することを意
図し得る。ＲＡ合成酵素の刺激によって、ＮＧＦ産生を誘導するＲＡ産生または
ＲＡ産生を誘導するＮＧＦを推測することができる。

【０１４５】 これらの仮説のうちどの仮説が最も起こるかを試験するために、本発明者らは
、ＮＧＦおよび１０μＭジスルフィラム（酵素アルデヒドデヒドロゲナーゼ１０
の阻害によるレチナールデヒドのＲＡへの変換を阻害する化合物）の存在下で成
体ＤＲＧを培養した。ＲＡがジスルフィラムよりＮＧＦ産生を刺激するように作
用する場合、ジスルフィラムはＮＧＦ刺激神経突起成長に影響を与えない一方で
、ＮＧＦがＲＡ合成を誘導する場合、ジスルフィラムは成長を阻害しないはずで
ある。図１ｄに示すように、ＮＧＦと共に１０μＭのジスルフィラムを添加した
場合はＮＧＦ誘導神経突起成長が完全に消失したが（有意な相違、図２ａ、２お
よび５）、ＤＭＳＯ（ジスルフィラムの媒体）およびＮＧＦの添加では神経突起
成長に影響を与えなかった（図２ａ、２および６）。ジスルフィラムが外植片内
での細胞生存に影響を与えないことを確認するために、本発明者らは、２つの型
のレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）を行った。両方の場合、外植片を、ジスルフィラ
ムを補足した培地中で８日間培養した。第１のレスキューでは、実験当初から外
植片に１００ｎＭ ＲＡを添加し、第２のレスキューではＲＡを４日目に添加し
た。両方の場合、ジスルフィラムのみを補足した培地で増殖させた培養物と比較
して、有意に多数の神経突起成長が認められた（図１のｅ、ｆ、および２ｂ）。
ＲＡは細胞応答をレスキューすることができるので、これらの実験によりＲＡ合
成経路についてのジスルフィラムの特異性も確認される。

【０１４６】 ジスルフィラムによってＲＡではなくＮＧＦの誘導効果が阻害されることによ
り、神経突起成長を誘導するカスケードにおいてＮＧＦはＲＡの上流に存在し得
ることが示唆される。これを試験するために、本発明者らは、ＮＧＦに対する阻
害抗体を使用した。ＮＧＦおよび阻害抗体の存在下で、事実上神経突起の成長は
認められなかった（図１ｇ、ＮＧＦのみの存在下で培養したＤＲＧと比較）。そ
れに対して、ＮＧＦ阻害抗体および１００ｎＭ ＲＡの存在下で培養したＤＲＧ
（図１ｈ）は、ＮＧＦのみで得たＤＲＧと等価の神経突起成長を示した（図１ｂ
および２ｃ）。

【０１４７】 ＮＧＦがＲＡの上流である場合、ＮＧＦはＤＲＧ培養物の添加後にＲＡの合成
を誘導する。この予想を試験するために、本発明者らは、ｌａｃＺ遺伝子に連結
したれレチノイン酸応答エレメント（ＲＡＲＥ）を含む１．８ｋｂのマウスＲＡ
Ｒβ２遺伝子プロモーターでのトランスフェクションによるＲＡの存在に対して
特異的に応答するＦ９レポーター細胞株を使用した（Ｓｏｎｎｅｖｅｌｄ，Ｅ．
、ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｋ，Ｃ．Ｅ．、ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｅｅｄｅ，Ｂ．Ｊ
．、Ｍａｄｅｎ，Ｍ ＆ ｖａｎ ｄｅｒ Ｓａａｇ，Ｐ．Ｔ．、１９９９、「
ｍＲＡＲｂ２−ｌａｃＺで安定にトランスフェクトした胚癌細胞株と活性レチノ
イドレベル測定用の感度の高い系」、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．、２５０、２
８４〜２９７）。ＲＡの存在下で、βガラクトシダーゼ組織化学的染色後に活性
化細胞を検出することができる。本発明者らは、最初に、ＮＧＦ自体がＮＧＦ（
１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下での増殖によりＦ９細胞を活性化させるという可能
性を消去した（その際バックグラウンド上にＦ９細胞の標識は存在しなかった）
。次いで、本発明者らは、以下の３つの異なる条件下での脱脂結成中で成体ＤＲ
Ｇを５日間培養した。ＮＧＦの非存在下、ＮＧＦの存在下、またはＮＧＦおよび
ＮＧＦ阻害抗体両方の存在下で行なった。培養したＤＲＧを超音波処理して、Ｆ
９レセプターセル上に置いた。ＮＧＦ処理ＤＲＧホモジネートは、未処理ＤＲＧ
と比較して明確なＲＡシグナルを示した（図２ｄ）。ＤＲＧをＮＧＦを添加した
阻害抗体と培養した場合、この活性化は阻害された（図２ｄ）。

【０１４８】 次に、本発明者らは、レチノイン酸合成酵素をＮＧＦによって誘導することが
できるのかを考察した。レチノールは、２段階の酸化ステップによってアルデヒ
ドであるレチナールに変換され、その後レチノイン酸に酸化される（総説として
、引例１１を参照のこと）。レチナールデヒドデヒドロゲナーゼ２（ＲＡＬＤＨ
−２）は神経系（ＤＲＧ１２を含む）の発生において発現されることが認められ
ている。ＲＴ−ＰＣＲを使用して、培養成体ＤＲＧ中でＮＧＦによってＲＡＬＤ
Ｈ−２の強力な誘導が同様に認められた。最後に、ＮＧＦ刺激培地中でＲＡＲβ
レセプターの上方制御が認められた（神経突起成長１３に関連することを示す現
象）。

【０１４９】 これらの結果は、ＲＡが成体神経組織ＤＲＧからの神経突起成長を刺激するこ
とができることを示す。ＮＧＦはこの組織からの神経突起成長を同時に刺激する
ので、ＮＧＦは酵素ＲＡＬＤＨ−２を介したＲＡ合成の誘導により激することが
示された。ＮＧＦ阻害抗体またはＲＡ合成インヒビターのいずれかの存在下で、
ＮＧＦは作用できない。したがって、おそらくＮＧＦによる神経突起成長の誘導
事象の配列は、ＮＧＦＲＡＬＤＨ−２ＲＡＲＡＲβ２神経突起成長である。本発
明者らは、ＮＧＦがＲＡＬＤＨ−２の誘導を直接担うかまたはいくつかの媒介タ
ンパク質がこのステップに必要であるかどうかを未だに同定していない。しかし
、ＮＧＦＩＧがＮＧＦ９によって誘導された最初期遺伝子の１つであり、かつそ
の産物はＲＸＲｓ８とヘテロ二量体化することができるので、ＮＧＦＩＢ／ＲＸ
Ｒヘテロ二量体は、ＲＡＬＤＨ−２遺伝子の活性化を担い得る。古典的には、ニ
ューロトロフィンは、神経再生１４の誘導および神経変性疾患１５の治療用の潜
在的な薬剤と考えられているが、その使用の主要な問題点は、損傷部位への有効
な送達様式を欠くことである。ＲＡは再生応答に必要であり、かつＮＧＦの下流
に存在し、ＲＡは経口投与可能な低分子親油性化合物であることから、損傷への
送達の問題は解決できるであろう。したがって、ＲＡは、神経学における使用に
重要であり得る。

【０１５０】 （例１の図面） [図１]脱脂血清＋（ａ）添加物なし、（ｂ）ＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、（ｃ
）ＮＧＦおよび１００ｎＭのｔＲＡ、（ｄ）ＮＧＦおよび１０Ｍジスルフィラム
、（ｅ）ジスルフィラムおよびｔＲＡを０日目に添加、（ｆ）ジスルフィラム、
（ｇ）ＮＧＦおよび阻害抗体、（ｈ）ＮＧＦ阻害抗体およびｔＲＡの存在下で５
日間（ａ〜ｄ、ｇ、ｈ）または８日間（ｅ、ｆ）培養した成体マウスＤＲＧにお
ける神経突起成長。

【０１５１】 [図２]（ａ〜ｃ）セロゲン中で培養した成体ＤＲＧによって産生された神経突起
。（ａ）５日目のＮＦＧ、ＲＡ、およびジスルフィラム（１は添加物なし、２は
ＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、３はＲＡ（１００ｎＭ）、４はＮＧＦ（１００ｎ
ｇ／ｍｌおよびＲＡ（１００ｎＭ））、５は１００ｎｇ／ｍｌＮＧＦおよび１０
Ｍジスルフィラム、６はＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＤＭＳＯ）の効果。
エラーバー、ｓ．ｅ．：ｎ＝６（全群）。ＮＧＦ処理（２）と他の群との相違： ^* ｐ＜０．０１；^**ｐ＜０．０００１；スチューデントｔ試験。（ｂ）１０Ｍジ
スルフィラムで処理したＤＲＧのＲＡレスキュー（左から右へ、ＲＡなし；１０
０ｎＭ ＲＡ（０日目）；１００ｎＭ ＲＡ（４日目））。エラーバー、ｓ．ｅ
．：ｎ＝６（全群）。ＲＡ非存在培地との相違：^*ｐ＜０．０１；^**ｐ＜０．０
００１；スチューデントｔ試験。（ｃ）５日目のＤＲＧ培養に対するＮＧＦ阻害
抗体の効果。左、ＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）；中央、ＮＧＦ＋阻害抗体；右、
阻害抗体＋１００ｎＭ ＲＡ（ｎ＝４）。ＮＧＦ＋阻害抗体との相違：^*ｐ＜０
．０１；^**ｐ＜０．０００１；スチューデントｔ試験。（ｄ）ＮＧＦの存在また
は非存在下で培養したＤＲＧに応答するβ−ｇａｌ陽性Ｆ９細胞の割合の増加。
左、添加物なし；中央、ＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）；右、ＮＧＦ＋阻害抗体。
β−ｇａｌ陽性細胞の割合とＮＧＦ処理ＤＲＧによって産生されたものとの相違
：^*ｐ＜０．０２５；スチューデントｔ試験（各群についてｎ＝９）。（ｅ）Ｎ
ＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で５日間培養した成体ＤＲＧ
におけるＲＡＬＤＨ−２酵素およびＲＡＲβ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。ＧＡＰＤ
Ｈを使用して、両サンプル中のｃＤＮＡの存在を示した。ニワトリ胚でのＲＡ分
布研究におけるＦ９レポーター細胞の使用を、１６に示した。

【０１５２】 （例２：成体神経組織における神経突起発生の誘導） 驚いたことに、本明細書中で、レチノイン酸レセプターβ２は成体マウス脊髄
での神経突起成長を誘導することが示された。

【０１５３】 レチノイン酸は、神経突起成長に必要であることが示されている。本発明者ら
は、最近、末梢神経再生におけるその作用機構は、レチノイン酸レセプターβ２
の活性化によることを示した。成体中枢神経系は再生することができなかった。
したがって、本発明者らは、成体脊髄における再生の失敗がレチノイン酸レセプ
ターβ２の発現に関連するかどうかを調査した。

【０１５４】 [結果]本発明者らは、再生することができる胚マウス脊髄において、ＲＡＲβ２
は神経突起成長を最大限に刺激する濃度で上方制御されることを報告する。それ
に対して、成体マウス脊髄では、ＲＡβ２は検出されることも、ＲＡによって誘
導されることも無く、神経突起はインビトロで成長しない。成体脊髄がＲＡＲβ
２でトランスフェクトされた場合、神経突起の再生を誘導することができる。脊
椎をＲＡＲβの別のイソ型（ＲＡＲβ４）でトランスフェクトした場合、神経突
起成長は認められない。これにより、神経突起再生におけるレセプター特異性の
重要性が示される。

【０１５５】 [結論]これらのデータにより、成体ＣＮＳの再生潜在性の欠損は一部はＲＡＲβ
２の発現の欠損の結果であり、これはニューロン自体の本来の性質であるにこと
が示唆される。ＲＡＲβ２での遺伝子治療により、損傷脊髄の機能を回復するこ
とができることが示唆される。

【０１５６】 [背景]成体中枢神経系（ＣＮＳ）における軸索再生の誘導は、神経生物学の主要
な目的である。正常な環境下でのＣＮＳ軸索再生の失敗は、以下の原因の１つま
たは組み合わせに起因していた。神経栄養因子の存在が少ないこと、成長促進分
子が存在しないこと、成長阻害分子が存在すること。したがって、ＣＮＳで増殖
した軸索を再刺激する試みを、この３つの可能性に集中させた。末梢神経移植片
を使用して寛容な環境が得られる場合、脊髄ニューロンおよび髄質ニューロンは
成体のラットにおいて３０ｍｍまで軸索を成長させた¹。線維芽細胞成長因子と
組み合わせた類似のストラテジーにより、後肢機能が部分的に回復した²。ミエ
リン中に存在する神経突起成長インヒビターの抗体での中和により、コントロー
ル幼若ラットよりも軸索が長く成長し³、脊髄損傷後の特異的反射および転移が
回復した⁴。ニューロトロフィン３とこれらの抗体との組み合わせにより、長い
皮質脊髄路（ＣＳＴ）軸索の再生が首尾よく誘導された⁵。嗅覚被覆細胞の懸濁
物もまた、ラットの損傷ＣＳＴの転移機能の回復に有効であった⁶。ニューロト
ロフィンが生存している軸索切断ニューロンを単に維持するように作用する場合
、これらの再生誘導方法において、これは、ニューロン自体の本来の能力よりも
注目される軸索周囲の環境である。しかし、ＣＮＳの再生欠損の少なくとも一部
は、ニューロン自体に固有である（引例４）。これにより、非再生の成体ＣＮＳ
で発現されないが神経突起を再生することができる発生ＣＮＳに存在する遺伝子
の同定により、遺伝子治療による新規の脊髄治療ストラテジーを得ることができ
ることが示唆される。

【０１５７】 本発明者らは、このような遺伝子は、レチノイン酸（ＲＡ）（ビタミンＡの生
物活性代謝物）によって活性化されるＲＡＲβ２であることを示す。ＲＡは、発
生中の胚および成体動物、特に神経系の種々の組織に存在する⁸〜¹³。その非存
在下では、ＣＮＳのニューロンの発生は、周囲に神経突起を成長させない^14,15
。それに対して、培養ニューロンに適用した場合、ＲＡはより多数かつより長い
神経突起を誘導し¹⁶、その成長を指示することができる¹⁷。ＲＡは、２つのクラ
スの核転写因子（レチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）およびレチノイドＸレセプ
ター（ＲＸＲ））のリガンドであるので遺伝子転写レベルで作用する^18,19。レ
チノイドレセプターの核クラスには３つのメンバー（ａ、ｂ、およびｇ）ならび
に各メンバーにはいくつかのイソ型が存在し、この多様性は細胞におけるＲＡの
多面的効果を担い得る。

【０１５８】 本発明者らは、ニューロンにおけるＲＡ作用の分子機構を研究し、これらのレ
チノイン酸レセプターＲＡＲβ２の１つがＲＡが神経突起成長を刺激する条件下
で下方制御されるニューロンにおけるＲＡシグナルの変換器であると結論付けた ²⁰ 。したがって、本発明者らは、成体の脊髄におけるこの核レセプターの閾値レ
ベルが存在しないかそれ以下であると、この組織が軸索成長を再生することが不
可能であると仮定した。

【０１５９】 （結果および考察） （インビトロでの胚マウス脊髄に対するＲＡの効果） 本発明者らは、マウス胚脊髄が他の胚領域で行われるように神経突起成長によ
ってＲＡに応答することの確認を開始した。Ｅ１３．５脊髄をマウス胚から切り
出し、セロゲン基質上に置き、１０％脱脂血清中で培養した。全てのトランス−
ＲＡを３つの異なる濃度（１０^-8Ｍ、１０^-7Ｍ、１０^-6Ｍ）で添加し、５日後に
外植片を神経フィラメント抗体で染色し、神経突起の存在について試験した。Ｒ
Ａ濃度が増加するにつれて培養脊髄から出現した神経突起が増加し、その効果は
１０^-6Ｍで最大であった（図１Ｃ、Ｅ、Ｇ）。ＲＡが存在しない場合でさえ、胚
脊髄は神経突起を成長したが（図１Ａ）、これはおそらくＲＡおよびその前駆体
レチノールの内因性含有率が高いためであろう^9,13。実際に、ＲＡの内因生合成
がジスルフィラムで阻害された場合、神経突起は成長しない²⁴。神経突起の誘導
が上方制御に関連することを証明するために、同程度のＲＡ処理の５日後の培養
物に対してＲＴ−ＰＣＲを行った。これにより、ＲＡＲβ２は使用した全てのＲ
Ａ濃度で胚脊髄を正常に発現し（図２Ａ、レーン１〜５）、１×１０−６Ｍ Ｒ
Ａ処理後強力に上方制御され（図２Ａ、レーン５）、この濃度で神経突起成長が
最大となることが明らかとなった。

【０１６０】 （インビトロでの成体マウス脊髄に対するＲＡ効果の欠如） 本発明者らは、次に、胚脊髄よりも１０月齢の生態脊髄を使用して同一の一連
の実験を行った。胚脊髄と対照的に、ＲＡはいかなる試験濃度でも未処理コント
ロールと同様に神経突起成長に対する効果が無く、これらのＲＡ処理の成体脊髄
はいかなる神経突起も成長することができなかった（図１Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）。Ｒ
Ｔ−ＰＣＲによるＲＡＲβ２の関与を試験することにより、コントロール成体脊
髄はこのレセプターの内因性レベルがほとんど検出されないか全く検出されず（
図２Ｂ、レーン１）、胚脊髄と異なりこのレベルではいかなる濃度でのＲＡ処理
に対する応答にも変化がないことが明らかとなった（図２、レーン２〜５）。

【０１６１】 （成体脊髄における神経突起の誘導） したがって、本発明者らは、この現象は成体脊髄の完全に不活性な挙動を担い
得るＲＡＲβ２発現の欠如であると仮定した。神経突起の成長によってＲＡに対
して応答する成体ＤＲＧもまたＲＡＲβ２を上方制御させるという本発明者らの
以前の所見により²⁴、胚および適切な成体ニューロンによって同一の挙動が惹起
され、ＰＮＳとＣＮＳニューロンとの間の制御的挙動の相違が強化されることが
示される。本発明者らの仮説を試験するために、本発明者らは、欠陥単純ヘルペ
スウイルス１型（ＨＳＶ−１）ベクターを使用して、成体（１０月齢）マウス脊
髄の一片をトランスフェクトした。

【０１６２】 ３つの異なるトランスフェクションを行い、そのうちの２つをコントロール（
対照）として用意した。第１に、ｌａｃＺのみを含むベクター（ｐＨＳＶｌａｃ
Ｚ）；第２にＲＡＲβ２を含むベクター（ｐＨＳＶＲＡＲβ２）；第３にＲＡＲ
ｂ遺伝子の別のイソ型（ＲＡＲβ４）を含むベクター（ｐＨＳＶＲＡＲβ４）。
本発明者らの以前の実験においてニューロンのＲＡ処理後ＲＡＲβ４イソ型を検
出されず²⁰、神経突起成長に関連しないので後者を非常に正確なトランスフェク
ションのコントロールとして用意した。本発明者らは、第１に、トランスフェク
ションは成功し、関連するレセプターイソ型が培養脊髄で発現されたことを確認
した。脊髄片を適切な構築物で一晩トランスフェクトし、３日後または４日後に
分析した。成体脊髄のβガラクトシダーゼ染色によって判断したところ、ｐＨＳ
ＶｌａｃＺ処理脊髄は、有意なトランスフェクション量を示した（図３Ｂ）。Ｒ
Ｔ−ＰＣＲにより、ＲＡＲβ２ベクターでのトランスフェクションによりＲＡＲ
β２は発現されるが（図４、レーン３）ＲＡＲβ４は発現されず（図４、レーン
４）、ＲＡＲβ４ベクターのトランスフェクションによりＲＡＲβ４は発現され
るが（図４、レーン８）ＲＡＲβ２は発現されない（図４、レーン７）ことが示
された。非トランスフェクト脊髄では、ＲＡＲβ２もＲＡＲβ４も検出されなか
った（図４、レーン２および６）。

【０１６３】 神経突起成長に対するこれらのトランスフェクションの効果を明白である。ｐ
ＨＳＶｌａｃＺでのトランスフェクションでは、培養脊髄の挙動を変化させるこ
とができずに神経突起成長に関して完全に未反応なままであった（図５Ａ、１２
／１２トランスフェクション）。同様に、ｐＨＳＶＲＡＲβ４でのトランスフェ
クションにより、培養脊髄は応答せずに不活性なままであった（図５Ｃ、１２／
１２トランスフェクション）。しかし、ｐＨＳＶＲＡＲβ２イソ型でのトランス
フェクションにより異なる挙動が明白に現れ、多数の神経突起が培養物中に拡大
した（図５Ｂ、８／１２トランスフェクション）。ｐＨＳＶＲＡＲβ２脊髄で産
生された神経突起数は、３〜２３の間で変化した。ｐＨＳｌａｃＺトランスフェ
クションでは、外植片あたりのｌａｃＺ陽性細胞数に有意なばらつきが存在した
。これにより、神経突起数のばらつきはトランスフェクト細胞数のばらつきによ
ることが示唆される。

【０１６４】 これらの結果により、ＲＡＲβ２イソ型はＲＡに対する神経突起成長の誘導に
重要な役割を果たし、これは損傷成体ＣＮＳにおいて上方制御することができな
い重要な成分であり得るという本発明者らの仮説に強力な支持が得られる。本発
明者らの仮説は、再生または非再生ニューロン組織およびそのＲＡに対する応答
に関連するいくつかの実験に基づく。したがって、胚マウス脊髄、胚マウスＤＲ
Ｇ、および成体マウスＤＲＧは全てＲＡＲβ２の上方制御によってＲＡに応答し
て神経突起を成長させる。それに対して、成体マウス脊髄は、ＲＡＲβ２を上方
制御して神経突起を成長できない。さらに、ＮＧＦは、神経突起成長を刺激して
ＲＡＲβ２の上方制御によって作用し²⁴、胚マウスＤＲＧ由来の神経突起成長を
ＲＡＲβアゴニストによって刺激することができる²⁰。

【０１６５】 これらの結果により、ニューロン自体のゲノムを操作すると再生を再び引き起
こすことができることが明らかである。これは、ＣＮＳ環境に存在する阻害因子
が濃縮されたインビボでの神経突起成長の誘導とは対照的である¹〜⁵。発生中、
脊髄の再生能の欠如は、ミエリン関連神経突起成長阻害分子の出現と相関し、こ
れらのいくつかは希突起膠細胞によって産生されると考えられる²⁵。本発明者ら
の培地中でみとめられ、環境を操作した培養物で認められた神経突起再生は２つ
の異なる神経突起再生機構であるか、関連するステップである。後者の見解は、
ＣＮＳニューロン自体が髄鞘形成に関連することが認められているという事実に
よって支持される。したがって、発生中のニューロンにおけるＲＡＲβ２の存在
は髄鞘形成に関連する遺伝子を制御することができ、このステップは成体ＣＮＳ
におけるＲＡＲベータ３遺伝子のトランスフェクションによって再利用されると
いう推測が意図される。

【０１６６】 ＲＡＲβ２トランスフェクト脊髄において、適切な長さに成長する神経突起は
認められなかった。これにより、神経突起成長には、異なる遺伝子セットの発現
が必要であり得ることが示唆される。これが真であるという証拠は成体ＰＮＳに
おける軸索の再生から認められ、これは成長の分岐から成長への移行は転写依存
性スイッチに依存する²⁷。あるいは、本発明者らの培養物の成長の失敗は、おそ
らくトランスフェクションの移行性による長期間のＲＡＲβ２発生の欠如であり
、これにより十分な時間成長できないという事実による。

【０１６７】 それにもかかわらず、本発明者らは、これらの予備データは成体ＣＮＳにおけ
る神経突起再生のＲＡＲβ２の役割を支持し、他の処理と組み合わせたこの転写
物での遺伝子治療は損傷脊髄の機能的回復を先導することを提唱する。

【０１６８】 （方法） [培養]Ｅ１３．５または１０月齢のマウスから脊髄を切り出し、横方向に約５ｍ
ｍの断片にした。これを、１体積の７．５％重炭酸ナトリウム、１体積の１０×
ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、および８重量部のセロゲン（ＩＣＮ ｆｌｏｗ）の混合
によって調製（製造）したセロゲン基質（ＩＣＮ ｆｌｏｗ）中で培養した。５
Ｍ ＮａＯＨの滴下によって、ｐＨを７．５に調整した。外植片を２日ごとに供
給した。培地は、グルタミンを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）、６％グル
コース、ＧＭＳ−Ａ（Ｇｉｂｃｏ）、１０％脱脂血清、および全トランス−ＲＡ
（ストック溶液、１×１０^-5Ｍ、Ｓｉｇｍａ）からなる。５日目にこれらを４％
パラホルムアルデヒドで固定し、神経フィラメント抗体ＮＦ２００（Ｓｉｇｍａ
）で染色した。

【０１６９】 [ＲＴ−ＰＣＲ分析]ＲＮＡを抽出し（トリゾール、Ｇｉｂｃｏ）、ｃＤＮＡを製
造者の指示に従ってＰｈａｒｍａｃｉａキットの使用によって調製（製造）した
。使用したプライマーは、ＧＡＰＤＨ、ＲＡＲβ２、およびＲＡＲβ４由来であ
った（詳細は要請に応じる）。ＰＣＲを、胚脊髄について２５サイクル、成体脊
髄について４０サイクル行った。増幅を以下のように行った。９５℃で３０秒間
の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の成長。得られた産
物の１／５をゲル上で塩基泳動した。

【０１７０】 [トランスフェクション]ウイルスストックを調製（製造）し、引例２８に記載の
ようにβガラクトシダーゼ染色を行った。使用した力価は以下であった。ｐＨＳ
Ｖ ＲＡＲβ２（５×１０^-4 ｉｐ／μｌ）、ｐＨＳＶ ＲＡＲβ４（４×１０ ^-4 ｉｐ／μｌ）、ｐＨＳＶｌａｃＺ（５×１０^-4 ｉｐ／μｌ）。

【０１７１】 （例２の図面） [図１]培養したＥ１３．５（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）および１０月齢の成体脊髄（Ｂ、
Ｄ、Ｆ、Ｈ）の神経突起成長に対するレチノイン酸の効果の比較。脊髄片を１０
％脱脂血およびＲＡが存在するセロゲン中で５日間培養した。２日ごとに培地を
交換した。Ａ、ＢはＲＡなしであり、Ｃ、Ｄは１×１０^-8Ｍ ＲＡであり、Ｅ、
Ｆは１×１０^-7Ｍ ＲＡであり、Ｇ、Ｈは１×１０^-6Ｍ ＲＡである。

【０１７２】 [図２]Ｅ１３．５および１０月齢の成体脊髄におけるＲＡＲβ２の発現。脊髄片
を、種々の濃度のＲＡの存在下で５日間培養し、その後ＲＡＲβ２のＲＴ−ＰＣ
Ｒ分析を行った。ＡはＥ．１３．５（レーン２〜５）およびＢは１０月齢成体脊
髄（レーン２〜５）。レーン１はｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ＨＰＡＩＩサイズマー
カー、レーン２はＲＡなし、レーン３は３．１×１０^-8Ｍ ＲＡ、レーン４は１
×１０^-7Ｍ ＲＡ、レーン５は１×１０^-6Ｍ ＲＡ。ＧＡＰＤＨの存在を使用し
て、サンプル中の同量のｃＤＮＡを示した。

【０１７３】 [図３]ｐＦＳＶｌａｃＺでの成体脊髄のトランスフェクション。培養した１０月
齢の生態脊髄を、５×１０^-4ｉｐｕ／μｌ ｐＨＳＶｌａｃＺで一晩トランスフ
ェクトし、３日後にβガラクトシダーゼ染色について分析した。Ａは非トランス
フェクト成体脊髄。ＢはｐＨＳＶｌａｃＺでトランスフェクトした成体脊髄。

【０１７４】 [図４]ｐＨＳＶＲＡＲβ２またはｐＨＳＶＲＡＲβ４のいずれかでの成体脊髄の
トランスフェクション。成体脊髄をセロゲン中で培養し、４×１０^-4ｉｐｕ／μ
ｌのｐＨＳＶＲＡＲβ２または４×１０^-4ｉｐｕ／μｌのｐＨＳＶＲＡＲβ４で
一晩トランスフェクトした。レーン２、６（ウイルスなし）、３、７（ｐＨＳＶ
ＲＡＲβ２）、４、８（ｐＨＳＶＲＡＲβ４）でトランスフェクトした成体脊髄
におけるＲＡＲβ２（レーン２〜４）およびＲＡＲβ４（レーン６〜８）発現の
トランスフェクションから５日後のＲＴ−ＰＣＲ分析。ＧＡＰＤＨの存在を使用
して、サンプル中の同量のｃＤＮＡを示した。レーン１、２（ｂｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔ／ＨＰＡ ＩＩサイズマーカー）。

【０１７５】 [図５]神経突起成長に対するｐＨＳＶｌａｃＺ、ｐＨＳＶＲＡＲβ２、またはｐ
ＨＳＶＲＡＲβ４トランスフェクションの効果。１０月齢の脊髄をセロゲン中で
培養し、５×１０^-4ｉｐｕ／μｌのｐＨＳＶｌａｃＺ、５×１０^-4ｉｐｕ／μｌ
のｐＨＳＶＲＡＲβ２、または４×１０^-4ｉｐｕ／μｌのｐＨＳＶＲＡＲβ４で
一晩トランスフェクトし、トランスフェクションから４日後にＮＦ２００で染色
した神経突起について分析した。ＡはｐＨＳＶｌａｃＺ、ＢはｐＨＳＶＲＡＲβ
２、ＣはｐＨＳＶＲＡＲβ４でトランスフェクトした培養脊髄。

【０１７６】 [図６]脊髄外植片に対する平均神経突起数の棒グラフ。 （例３：マウス神経節ニューロンからの神経突起成長） 胚マウス背根神経節の異なる集団からの神経突起成長におけるレチノイン酸レ
セプターの役割。

【０１７７】 背根神経節（ｄｏｒｓａｌ ｒｏｏｔ ｇａｎｇｌｉｏｎ：ＤＲＧ）ニューロ
ンを、その生存に必要なニューロトロフィンに基づいて少なくとも３つの型に分
類することができる。本発明者らは、胚１３．５マウスＤＲＧから単離したＮＧ
Ｆ、ＮＴ−３、およびＢＤＮＦ中のレチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）およびレ
チノイドＸレセプター８ＲＸＲ９の発現を分析した。本発明者らは、ニューロン
の各集団がそれぞれ３つのＲＸＲ（α、β、およびγ）を発現することを示す。
しかし、ＮＧＦおよびＮＴ−３依存性ニューロンが各ＲＡＲ（α、β、γ）を発
現する一方で、ＢＤＮＦ依存性ニューロンはＲＡＲαおよびβしか発現しなかっ
た。レチノイン酸を各ニューロンクラスに添加した場合、ＮＧＦおよびＮＴ−３
依存性ニューロンのみが神経突起成長に応答し、この応答はＲＡＲβ２の上方制
御に依存する。ＲＡＲβ選択性化合物のみが神経突起成長を刺激するので、この
特異性をレセプター選択性アゴニストの使用によって確認する。

【０１７８】 （移入） ニューロトロフィンは、神経系の発生における種々の一次感覚ニューロンの生
存に必要な成長因子のファミリーである（Ｓｎｉｄｅｒ、１９９４）。このファ
ミリーには、神経成長因子（ＮＧＦ）（Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ、１９
８７）、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ ｅｔ
ａｌ．）、１９９０、および脳由来ニューロトロフィン向神経因子（ＢＤＮＦ
）（Ｂａｒｄｅ ｅｔ ａｌ．、１９８２）が含まれる。これらは、末梢神経に
よって刺激されたターゲットフィールドで合成され、発生ニューロンの生存を支
持するターゲットフィールド由来の逆行性機構によって輸送されると考えられて
いる。ニューロトロフィンは、Ｔｒｋと呼ばれるレセプターチロシンキナーゼを
介して作用する。ＮＧＦは、ＴｒｋＡを特異的に活性化し、ＢＤＮＦはＴｒｋＢ
を活性化し、ＮＴ−３はＴｒｋＣを活性化する（Ｓｎｉｄｅｒ、１９９４に概説
）。ニュートロフィンおよびレセプターチロシンキナーゼの機能実験の欠如から
得た表現型分析により、背根神経節（ＤＲＧ）ニューロンを少なくとも３つの型
に分類することができることが明らかになった。その生存にＮＧＦが必要なニュ
ーロンは、痛覚（痛み）および熱感受性機能を媒介する。周囲では、軸索は皮膚
の表層で終結し、脊髄の表在薄膜を刺激する（Ｃｒｏｗｌｅｙ ｅｔ ａｌ．、
１９９４、Ｓｍｅｙｎｅ ｅｔ ａｌ．、１９９４）。ＮＧＦ型ニューロンより
はるかに大きく、筋紡錘の主な終末の周囲に出現し、側枝分岐を脊髄の運動プー
ルまで成長する自己受容ニューロン（肢の間に存在する感覚）は、その生存をＮ
Ｔ−３に依存する（Ｅｍｆｏｒｓ ｅｔ ａｌ．、１９９４；Ｆａｒｉｎａｓ
ｅｔ ａｌ．、１９９４；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、１９９４）。ＢＤＮＦニ
ューロンは、小型か中型であり、これには、機械レセプターのいくつかのクラス
が含まれる（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、１９９３；Ｊｏｈｎｅｓ ｅｔ ａｌ
．、１９９４）。

【０１７９】 ニューロンの生存に関与する成長因子に加えて、レチノイドもまた、同一の役
割を果たし得る。レチノイドはビタミンＡ由来分子のファミリーであり、これに
は、生物活性代謝産物レチノイン酸（ＲＡ）が含まれる。ＲＡの細胞効果は、２
つのクラスのレセプター（全トランス−ＲＡ（ｔＲＡ）および９−シス−ＲＡ（
９−シス−ＲＡ）の両方によって活性化されるレチノイン酸レセプター（ＲＡＲ
）および９−シス−ＲＡにみによって活性化されるレチノイドＸレセプター）の
作用によって媒介される（Ｋａｓｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９４；Ｋｌｅｉ
ｗｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９４）。このレセプターには３つの主要なサブタイ
プ（α、β、γ）が存在し、このサブタイプには選択的スプライシングおよびデ
ィファレンシャルプロモーター用による多数のイソ型が存在する（Ｌｅｉｄ ｅ
ｔ ａｌ．、１９９２）。ＲＡＲはＲＸＲとのヘテロ二量体形成による遺伝子発
現を媒介する一方で、ＲＸＲはホモダイマーとしてまたは種々のオルファンレセ
プターとのヘテロ二量体形成によって遺伝子発現を媒介することができる（Ｍａ
ｎｇｅｌｓｄｏｒｆ ＆ Ｅｖａｎｓ、１９９５）。興味深いことに、ＰＣ１２
細胞においてＮＧＦによって誘導される最初期遺伝子の１つは、オルファンレセ
プターＮＧＦＩ−Ｂ（ＮＵＲＲＩ）である（Ｍｉｌｌｂｒａｎｄｔ、１９８９）
。これにより、ニューロンの発生における成長因子およびレチノイド媒介経路は
相互作用し得ることが示唆される。ＲＡがニューロンの生存および分化に関連す
ることが示されている（Ｗｕａｒｉｎ ａｎｄ Ｓｉｄｅｌｌ、１９９１；Ｑｕ
ｉｎｎ ａｎｄ Ｄｅ Ｂｏｎｉ、１９９１）ので、この相互作用は、ニューロ
ンの生存に受容であり得る。さらに、種々の胚ニューロンについての多くの研究
により、ＲＡは神経細胞の数および長さを刺激することができ（Ｍａｄｅｎ、１
９９８に概説）、実際ニュートロフィンを刺激することができる（Ｃａｍｐｅｎ
ｏｔ、１９７７；Ｌｉｎｄｓａｙ、１９８８；Ｔｕｔｔｌｅ ａｎｄ Ｍａｔｈ
ｅｗ、１９９５）ことが示されている。最近、本発明者らは、ＲＡは成体ＤＲＧ
における神経突起再生において重要であり、その合成をＮＧＦによって制御する
ことができることを示した（Ｃｏｒｃｏｒａｎ ａｎｄ Ｍａｄｅｎ、１９９９
）。

【０１８０】 上記研究では、本発明者は、レチノイド媒介経路と成長因子経路との間の相互
作用の性質をＲＡＲおよびＲＸＲがその生存に異なるニュートロフィンに依存す
るニューロンで発現されるかどうかを確認することによってさらに調査するため
にＥ１３．５またはＤＲＧを使用している。本発明者らは、異なるレチノイドレ
セプタープロフィールが実際にＮＧＦ、ＮＴ−３、およびＢＤＮＦニューロンで
発現され、このプロフィールが神経突起成長を誘導するＲＡ処理後に変化するこ
とを示す。特に、ＲＡＲβ２はＮＧＦおよびＮＴ−３ニューロンで上方制御され
るが、ＢＤＮＦ型ニューロンでは上方制御されない。この結果を、レセプター選
択性アゴニストの使用によって、誘導神経突起成長においてＲＡがＲＡＲβアゴ
ニストのみと置換されることで確認した。これらの結果により、神経突起成長に
おけるＲＡＲβ２を介したＲＡ作用の役割が示唆される。

【０１８１】 （材料と方法） [ＤＲＧ培養]ＤＲＧをＥ１３．５マウスから獲得し、非神経節組織を供給し、氷
冷無カルシウム、マグネシウムリン酸緩衝化生理食塩水中に回収した。分離細胞
懸濁液を調製（製造）するために、神経節を１５℃で１５分間０．０５％トリプ
シン処理した。１％血清の添加により反応を停止させ、２３Ｇニードルでの粉砕
によって１つの細胞を得た。次いで、細胞を１００ｇで１０分間スピンし、培地
中に再懸濁した。これらを、１００μｇ／ｍｌポリＤリジンで２時間プレコート
下ウェル中に約２５０００細胞／ｃｍ²の密度でプレートした。２日ごとに培養
物を供給した。

【０１８２】 培養培地は、グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、６％グルコース、ＩＴＳ（Ｇｉｂｃ
ｏ）を含むＤＭＥＭ−Ｆ１２からなる。使用した成長因子は、５０ｎｇ／ｍｌ
ＮＧＦ（７ｓ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、５０ｎｇ／ｍｌ ＮＴ３（Ｐｒｏｍｅｇａ）
、または５０ｎｇ／ｍｌ ＢＤＮＦ（Ｐｒｏｍｅｇａ）であった。レチノイドを
、１×１０^-7Ｍの濃度で使用した。全トランス−レチノイン酸をＳｉｇｍａから
購入し、レセプターアゴニストをＣＩＲＤ Ｇａｌｄｅｒｍａによって合成した
。ＣＤ３６６はＲＡＲαを活性化し、ＣＤ２０１９はＲＡＲβを活性化し、ＣＤ
４３７はＲＡＲγを活性化し、ＣＤ２８０９は全てのＲＸＲを活性化する。

【０１８３】 [ＲＴ−ＰＣＲ分析]ＲＮＡを抽出し（トリゾール、Ｇｉｂｃｏ）、ｃＤＮＡを製
造者の指示に従ってＰｈａｒｍａｃｉａキットの使用によって調製（製造）した
。使用したプライマーは、マウスＲＡＲ、ＲＸＲ、およびＧＡＰＤＨ由来であっ
た（詳細は陽性に応じる）。ＲＡＲ／ＲＸＲレセプターが神経突起成長に関連す
るかどうかを同定するために、半定量ＰＣＲを使用した。増幅を、各ＲＡＲおよ
びＲＸＲについて直線範囲で行い、その発現レベルをＧＡＰＤＨと比較した。Ｒ
ＸＲには２８サイクル行い、ＲＡＲαおよびＲＡＲガンマには２５サイクル、Ｒ
ＡＲβおよびＧＡＰＤＨには２２サイクルを使用した。増幅を以下のように行っ
た。９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分
間の成長。得られた産物の１／５をゲル上で塩基泳動してブロッティングした。
次いで、基準化のためにこれを適切なＲＡＲ、ＲＸＲ、またはＧＡＰＤＨで探索
した。

【０１８４】 [ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成]細胞をＰＢＳで１回洗浄し、４％ＰＦＡで３
０分間固定した。これを、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＴ）で５分間を
２回洗浄した。ハイブリッド形成を５５℃で一晩行った。緩衝液は、０．１Ｍ
Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ９．５）、０．０５ＭのＭｇＣｌ₂、０．１ＭのＮａＣｌ
、および０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０からなる。細胞を、６５℃の５０％ハイブ
リッド形成緩衝液、５０％の２×ＳＳＣ、１００％の２×ＳＳＣ、最後に０．２
％ ＳＳＣで連続的に洗浄した。次いで、それぞれ７５％の０．２×ＳＳＣ、２
５％のＰＢＴ、５０％の０．２×ＳＳＣ、５０％のＰＢＴ、２５％の０．２×Ｓ
ＳＣ、７５％のＰＢＴ、および１００％のＰＢＴ中で５分間の反応時間で洗浄し
た。細胞を、ＰＢＴの２％ヒツジ血清溶液で１時間ブロックし、ＤＩＧ抗体と４
℃で一晩インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＴで２時間８回洗浄した。製
造者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の指示に従ってＮＢＴ／ＢＣ
ＩＰの使用によって、発色させた。

【０１８５】 [免疫組織化学および神経突起の長さの測定]細胞を、ＰＢＳで１回洗浄し、４％
ＰＦＡで３０分間固定した。次いで、これらをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ（
ＰＢＴ）中で５分間を２回洗浄した。これを、一次抗体ＮＦ２００（Ｓｉｇｍａ
）と４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＴ中で２時間を８回洗浄した。二次抗体
を２時間の反応時間で適用し、細胞を再びＰＢＴ中で２時間を８回洗浄した。次
いで、これらを０．５ｍｇ／ｍｌのＤＡＢおよび６％Ｈ₂Ｏ₂を含むＰＢＳ中で５
分間インキュベートした。神経突起の長さを、ＮＩＨ画像ソフトウェアの使用に
よって測定した。実験を３回繰り返し、各分析のために３つの領域を無作為に選
択した。平均して、各領域に４０個のニューロンが存在し、所与のニューロンに
ついて最も長い神経突起分岐を測定した。

【０１８６】 （結果） （ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成によるレセプターの発現） 本発明者らは、最初に、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成によるＥ１３．５マ
ウスＤＲＧの初代培養物におけるＲＡＲおよびＲＸＲの発現を試験した。分離Ｄ
ＲＧニューロンをＮＧＦ、ＮＴ−３、またはＢＤＮＦのいずれかを含む無血清培
地中で５日間培養した。ニューロトロフィンの非存在下では、細胞は死滅した。
本発明者らは、３つ全てのニューロン型はＲＸＲα（図１のＤ、Ｊ、Ｐ）、ＲＸ
Ｒβ（図１のＥ、Ｋ、Ｑ）、およびＲＸＲγ（図１のＦ、Ｌ、Ｒ）を発現するこ
とを見出した。それに対して、ＲＡＲは、３つのニューロン型とは異なる発現を
示した。ＮＧＦおよびＮＴ−３依存性ニューロンはＲＡＲα（図１のＡ、Ｇ）、
ＲＡＲβ（図１のＢ、Ｈ）、およびＲＡＲγ（図１のＣ、Ｉ）を発現する一方で
、ＢＤＮＦ依存性ニューロンはＲＡＲα（図１のＭ）およびＲＡＲβ（図１のＮ
）のみを発現する。ＲＡＲγを、ＢＤＮＦ依存性培養物のｉｎ ｓｉｔｕハイブ
リッド形成によって検出可能であった。

【０１８７】 （神経突起成長に対するＲＡの効果） 異なるニューロン母集団に対するＲＡの任意の栄養効果を消失するために、本
発明者らは、無血清培地＋関連ニューロトロフィン中において、２日間ニューロ
ンを成長させ、その後１×１０^-7Ｍ ＲＡを３日間添加した。コントロール培地
は、ＲＡを添加せずにニューロトロフィンのみの培地中で維持した。ＲＡの有無
による培養ニューロン数に有意な差は存在しなかった。これにより、ＲＡは、使
用した異なる培養条件下での神経突起成長および神経突起成長ニューロンのサブ
セットの選択的生存に効果が無かったことが示唆される。神経突起成長を分析す
るために、５日目に培養物を固定し、モノクローナル抗体ＮＦ２００で染色した
。神経突起の長さを、ＮＩＨ画像ソフトウェアによって測定した。実験を、３回
繰り返した。全部で焼く１２０個のニューロンを各実験で計算し、最も長い神経
突起を各ニューロンから測定し、各処理ごとに平均神経突起長を計算した。ＲＡ
の非存在下では、ＢＤＮＦ依存性ニューロン（図２Ｅおよび図７Ｃカラム１）は
、神経突起を成長させるが、ＮＧＦ（図２Ａ）およびＮＴ−３依存性ニューロン
（図２Ｃ）は、神経突起成長の制限が認められた（図７ＡおよびＢのカラム１）
。それに対して、培地にＲＡを添加した場合、ＮＧＦ（図２Ｂ）およびＮＴ−３
依存性ニューロン（図２Ｄ）において神経突起の長さおよび数の劇的な増加が認
められ、この相違は、神経突起長を比較した場合有意であることが認められた（
図７ＡおよびＢ、カラム１および２）。それに対して、ＲＡはＢＤＮＦ依存性ニ
ューロンの神経突起成長に影響を与えなかった（図２Ｆおよび図７Ｃ、カラム１
および２）。

【０１８８】 （レセプターの発現およびＴＲ−ＰＣＲによるＲＡに対する応答） どのレセプターが神経突起成長に関与しているかを同定するために、材料と方
法に記載のようにＲＸＲおよび各ＲＡＲに対するプライマーを使用して半定量的
ＰＣＲをおこなった。ＲＡの有無による各３つの型の培養ニューロンのＲＸＲ発
現に相違は認められなかった。それに対して、ＲＡＲレセプタープロフィールに
おける相違は認められた。ＮＧＦ（図３Ａ、レーン８）およびＮＴ−３（図３Ｂ
、レーン８）依存性ニューロンに対する応答を上方制御し、ＢＤＮＦ依存性ニュ
ーロン（図３Ｃ、レーン８）をわずかに情報制御するＲＡＲα１（図３Ａ、Ｂ、
Ｃ，レーン１）を発現する。図３から、ＲＡＲα１イソ型のみがこれらのＤＲＧ
ニューロン中に容易に検出可能であるにもかかわらず、ブロットの過剰暴露によ
りＮＴ−３依存性ニューロンはＲＡＲα５およびＲＡＲα７イソ型を発現し、Ｂ
ＤＮＦ依存性ニューロンはＲＡＲα６およびＲＡＲα７イソ型を発現することが
明らかである。

【０１８９】 ４つの可能なＲＡＲβイソ型のうち、ＲＡＲβ２イソ型のみが３つ全てのニュ
ーロン型で検出された。このイソ型は、非刺激培地（図４Ａ、Ｂ、Ｃ、レーン２
）と比較して、ＮＧＦ（図４Ａ、レーン６）およびＮＴ−３依存性ニューロン（
図４Ｂ、レーン６）においてＲＡによって強力に上方制御されたが、ＢＤＮＦ依
存性ニューロン（図４Ｃ、レーン６）では上方制御されなかった。

【０１９０】 ７つのＲＡＲγイソ型のうち、ＲＡＲγ１イソ型のみがニューロン培地（ＮＧ
Ｆ（図５Ａ、レーン１および８）およびＮＴ−３依存性ニューロン（図５Ｂ、レ
ーン１および８）のみ）で検出された。ＢＤＮＦ依存性ニューロンにおいて、Ｒ
Ｔ−ＰＣＲによってＲＡＲγ１は検出されなかった。

【０１９１】 （レセプター選択性アナログおよび神経突起成長） 上記のデータにより、ＲＡＲα１およびＲＡＲβ２の上方制御はＮＧＦおよび
ＮＴ−３依存性ニューロンで認められた神経突起成長の増加を担い得ることが示
唆された（図２Ｂ、Ｄ）。このレセプターはＢＤＮＦ依存性ニューロンで上方制
御されず、これらをＲＡで刺激しても神経突起成長の増加は認められないが、Ｒ
ＡＲα１イソ型はＲＡに対する神経突起応答が欠如していても上方制御されるの
で、おそらくＲＡＲβ２であろう。これら２つのレセプターの間の相違を区別す
るために、本発明者らは、各レセプターを特異的に活性化させるように開発され
たレポーター選択性合成レチノイドを使用した。ＣＤ３６６はＲＡＲαを活性化
し、ＣＤ２０１９はＲＡＲβを活性化し、ＣＤ４３７はＲＡＲγを活性化し、Ｃ
Ｄ２８０９は全てのＲＸＲを活性化する。

【０１９２】 ＲＡＲαアゴニストの存在下で、いかなるニューロン集団においても神経突起
成長の有意な増加を認められなかった（図６Ａ、Ｅ、Ｉおよび図７Ａ、Ｂ、およ
びＣ、カラム１および３）。それに対して、ＲＡＲβアゴニストは、未処理ニュ
ーロンと比較してＮＧＦおよびＮＴ−３依存性ニューロンで神経突起成長が有意
に増加したが（図６Ｂ、Ｆおよび図７Ａ、Ｂ、カラム１および４）、ＢＤＮＦ依
存性ニューロンでは神経突起成長に影響を与えなかった（図６Ｊおいよび図７Ｃ
、カラム１および４）。ＲＡＲγアゴニストの存在下で異なるニューロン集団を
培養した場合、ＮＧＦおよびＮＴ−３依存性ニューロンでの神経突起成長は有意
に減少する（図６Ｃ、Ｇおよび図７Ａ、Ｂ、カラム１および５）一方で、ＢＤＮ
Ｆ依存性ニューロンでは神経突起成長は依然として認められた（図６Ｋおよび図
７Ｃ、カラム１および５）。ＲＸＲアゴニストの存在下で培養した場合、いかな
るニューロン集団においても神経突起成長に対する有意な効果は認められなかっ
た（図６Ｄ、Ｈ、Ｌおよび図７Ａ、ＢおよびＣ、カラム１および６）。

【０１９３】 したがって、ＲＴ−ＰＣＲデータと一致して、ＲＡＲβ２は神経突起成長に必
要である。さらに、ＲＡＲγは神経突起成長を阻害する。

【０１９４】 [ＲＡＲの相互関係]最後に、本発明者らは、レセプターＲＡＲβ２およびＲＡＲ
γ１には相反する神経突起成長効果を有するので、これらの間の任意の制御相互
作用が存在するかどうかの調査を試みた。これを試験するために、本発明者らは
、ＲＡＲγアゴニストまたはＲＡＲβアゴニストのいずれかを含む無血清培地中
でＮＧＦおよびＮＴ−３依存性ニューロンを培養し、２４時間後に半定量ＲＴ−
ＰＣＲによってレセプター発現レベルを監視した。ＲＡＲβアゴニストは、非刺
激培養物（図８、レーン１および４）と比較して、ＮＧＦおよびＮＴ−３依存性
ニューロン（図８Ｂ、レーン３および６）でＲＡＲβ２の発現を情報制御するが
、ＲＡＲγ１（図７Ａ、レーン３および６）の発現に影響は無かった。しかし、
ＲＡＲγアゴニストの存在下で、非刺激培養物（図８Ｂ、レーン１および４）と
比較してＮＧＦおよびＮＴ−３依存性ニューロン（図８Ｂ、レーン２および５）
の両方でＲＡＲβ２が減少した。ＲＡＲγアゴニストはＲＡＲγ１レベルに効果
を有した（図８Ａ、レーン２および５）。したがって、ＲＡＲγ１は、ＲＡＲβ
２の発現を制御することができる。

【０１９５】 （例３の考察） これらの結果は、単離した３つの後根神経節集団（ＮＧＦ、ＮＴ−３およびＢ
ＤＮＦ依存性）はそれぞれレチノイドレセプターの共通のセットおよび固有のセ
ットを発現することを示す。ＲＸＲに関して、これらはＲＸＲα、ＲＸＲβ、お
よびＲＸＲγを発現し、これらのうち神経突起成長に直接関与するものは認めら
れなかった。それに対して、これらを選択するために使用したニュートロフィン
に依存して、ニューロンは異なるＲＡＲを発現した。さらに、ＮＧＦおよびＮＴ
−３集団は、分析した測定点でＢＤＮＦ集団で発現されなかったＲＡＲγ１を発
現した。

【０１９６】 ＮＧＦおよびＮＴ−３依存性ニューロンのみが神経突起成長によってＲＡに応
答する一方で、ＢＤＮＦ依存性ニューロンはＲＡの有無に関係なく神経突起を産
生した。同時に、ＲＡ添加後にＲＡＲプロフィールが変化した。ＲＡＲα１およ
びＲＡＲβ２は、ＮＧＦおよびＮＴ−３依存性ニューロンで強力に上方制御され
る一方で、ＢＤＮＦ依存性ニューロンではＲＡＲα１にみが上方制御された。こ
れにより、ＲＡＲβ２は神経突起成長の誘導に必要であることが示唆され、この
所見を確認するために本発明者らはレセプター選択性アゴニストを使用した。

【０１９７】 レセプター選択的アゴニストの開発により、特定の生物学的ステップにおける
各レセプターの役割を試験するための非常に価値あるツールが得られた。本発明
者らは、ＲＡＲβアゴニストＣＤ２０１のみがＮＧＦおよびＮＴ−３ニューロン
での神経突起成長の誘導によるＲＡの効果を模倣するので、これによりＲＴ−Ｐ
ＣＲの結果が確認されたことを示した。

【０１９８】 ＲＡＲγアゴニストがＮＧＦおよびＮＴ−３依存性ニューロンの神経突起成長
を減少させることもまた認められた。これがＲＡＲβ２発現に関与するかどうか
を示すために、本発明者らはＲＡＲアゴニストがレセプター発現に任意の効果を
有するかどうかを試験した。ＲＡＲβアゴニストはＲＡＲβ２発現を上方制御す
るが、ＲＡＲγ１発現に対する効果は認められなかった。それに対して、ＲＡＲ
γアゴニストはＲＡＲγ１発現に対する効果を有する一方で、ＲＡＲβ２発現レ
ベルを下方制御し、この現象はまた神経突起成長の兆しであり得る。これにより
、ＲＡＲγ／ＲＸＲへテロ二量体によってＲＡＲβ転写を制御することができる
ことが示唆される。ＢＤＮＦ依存性ニューロンのＲＡに対する神経突起成長の増
加の欠如により、このニューロン型ではＲＡＲβは、研究した胚の段階でＮＧＦ
およびＮＴ−３依存性ニューロンでのＲＡＲβを別に制御することができること
も示唆される。

【０１９９】 これらの結果により、ＲＸＲ／オルファンレセプターを活性化するＲＸＲアゴ
ニストは神経突起成長に効果的ではない一方でＲＡＲ／ＲＸＲヘテロ二量体を活
性化するＲＡＲβアゴニストは神経突起成長量を増加させるので、神経突起成長
を担うＲＡＲ経路の活性化であることが示唆される。これにより、例えばＮＧＦ
Ｉ−Ｂの利用によってＲＸＲ／オルファンレセプター経路を介してＮＧＦが作用
する場合、これらの胚段階において、神経突起成長を直接担わず、むしろニュー
ロン生存に必要であり得ることが示唆される。興味深いことに、成体ではその逆
が真である。ＮＧＦは神経突起生存に必要ではないが、神経突起成長に必要であ
る（Ｌｉｎｄｓａｙ、１９８８）。したがって、発生中の神経突起成長と成体の
神経突起の再生は異なる機構が存在し得る。しかし、発生中の神経突起成長にお
いてＲＡは絶対的に必要である。ビタミンＡ欠乏ウズラでは、神経管周囲に神経
突起を成長させることができない（Ｍａｄｅｎ ｅｔ ａｌ．、１９９６；Ｍａ
ｄｅｎ ｅｔ ａｌ．、１９９８）。

【０２００】 ＲＡおよびレセプターアゴニストに対するこれらのニューロンの特異な応答は
、その発生および／または生存にレチノイドが必要な胚および成体組織にいらか
の有意性を示す。異なるＲＡＲ／ＲＸＲおよびＲＸＲ／オルファンレセプターの
組み合わせを活性化するために、組織に存在する異なるレチノイドが存在し得る
。この見解は、発生中に局在化された発現を示す多数のＲＡ賛成酵素が存在する
こと（ＭｃＣａｆｆｅｒｙ ｅｔ ａｌ．、１９９２；Ｄｒａｇｅｒ ＆ Ｍｃ
Ｃａｆｆｅｒｙ、１９９５；Ｇｏｄｂｏｕｔ ｅｔ ａｌ．、１９９６；Ｎｅｒ
ｉｄｅｒｒｅｉｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９７；Ａｎｇ ＆ Ｄｕｅｓｔｅ
ｒ、１９９７）、これらの各酵素が異なるレチノイドを作製することができると
いう事実によっていくつかの支持が得られる。今までに、いくつかの新規のレチ
ノイド（例えば、腸で見出された５，６−エポキシレチノイン酸（ＭｃＣｏｒｍ
ｉｃｋ ｅｔ ａｌ．、１９７８）、マウス胚Ｆ９細胞の分化を担う生物活性代
謝産物である４−オキソ−レチノール（Ａｃｈｋａｒ ｅｔ ａｌ．、１９９６
）、およびＢリンパ球で見出された１４−ヒドロキシ−４，１４−レトロレチノ
ール（Ｂｕｃｋ ｅｔ ａｌ．、１９９１））が発見されている。

【０２０１】 したがって、胚は異なるレチノイドの合成によって神経突起成長の量を制御す
ることができる。ＲＡＲβ２／ＲＸＲへテロ二量体の活性化により、神経突起を
成長させることができ、ＲＡＲγ／ＲＸＲヘテロ二量体の活性化により、神経突
起成長を停止させることができる。さらに、神経突起成長量をレチノイン酸量で
制御することができる。例えば、マウス脊髄の発生では、上腕および腰部の拡大
部において高濃度のレチノイドが存在する（ＭｃＣａｆｆｅｒｙ ＆ Ｄｒａｇ
ｅｒ、１９９４）。これは、神経突起は、その最終ターゲットに到達するまで長
距離を進行しなければならない肢の先端の神経支配のために固有に必要であり得
る一方で、レチノイド濃度が低い胸部ではこのような神経突起ｋの成長は必要で
はない。

【０２０２】 （例３の図の説明） [図１]ＮＧＦ、ＮＴ−３、またはＢＤＮＦのいずれかの存在下で培養したＥ１３
．５マウス胚ＤＲＧニューロンによるＲＡＲおよびＲＸＲの発現。以下のｉｎ
ｓｉｔｕハイブリッド形成はＡ〜Ｆであり、ＮＧＦニューロンはＧ〜Ｌであり、
ＮＴ−３ニューロンはＭ〜Ｒである、ＢＤＮＦニューロン。以下の発現：Ａ、Ｇ
、Ｍ、ＲＡＲα；Ｂ、Ｈ、Ｎ、ＲＡＲβ；Ｃ、Ｉ、Ｏ、ＲＡＲγ；Ｄ、Ｊ、Ｐ、
ＲＸＲα；Ｅ、Ｋ、ＲＸＲβ；Ｆ、Ｌ、Ｒ、ＲＸＲγ。

【０２０３】 [図２]ＤＲＧニューロンからの神経突起成長に対するＲＡの効果。ＮＧＦ、ＮＴ
−３、またはＢＤＮＦのいずれかの存在下でＤＲＧニューロンを２日間培養し、
この時点で１×１０−７Ｍの全トランス−ＲＡを添加した。次いで、これらを、
５日後にＮＦ２００抗体を用いて神経突起成長について試験した。Ａ、ＮＧＦ；
Ｂ、ＮＧＦ＋１×１０^-7Ｍ ＲＡ；Ｃ、ＮＴ−３；Ｄ、ＮＴ−３＋１×１０^-7Ｍ
；Ｅ、ＢＤＮＦ；Ｆ、ＢＤＮＦ＋１×１０^-7Ｍ ＲＡ。

【０２０４】 [図３]ＲＡの非存在下または存在下で培養したＤＲＧニューロンにおけるＲＡＲ
αイソ型の発現。ＤＲＧニューロンを、ＮＧＦ、ＮＴ−３、またはＢＤＮＦの存
在下で２日間培養し、１×１０^-7Ｍ ＲＡを添加して、ＲＡＲαイソ型の存在を
、ＲＴ−ＰＣＲでアッセイした。コントロールはＲＡを添加しなかった。Ａ、コ
ントロールＮＧＦニューロンレーン１〜７；ＮＧＦニューロン＋１×１０^-7Ｍ
ＲＡレーン８〜１４。Ｂ、コントロールＮＴ−３ニューロンレーン１〜７；ＮＴ
−３ニューロン＋１×１０^-7Ｍ ＲＡレーン８〜１４。Ｃ、コントロールＢＤＮ
Ｆニューロンレーン１〜７；ＢＤＮＦニューロン＋１×１０^-7Ｍ ＲＡレーン８
〜１４。レーンは１および８であり、ＲＡＲα１；２および９、ＲＡＲα２；３
および１０、ＲＡＲα３；４および１１、ＲＡＲα４；５および１２、ＲＡＲα
５；６および１３、ＲＡＲα６；７および１４、ＲＡＲα７。

【０２０５】 [図４]ＲＡの非存在下または非存在下で培養したＤＲＧニューロンにおけるＲＡ
Ｒβイソ型の発現。ＤＲＧニューロンを、ＮＧＦ、ＮＴ−３、またはＢＤＮＦの
存在下で２日間培養し、１×１０^-7Ｍ ＲＡを添加して、ＲＡＲβイソ型の存在
を、ＲＴ−ＰＣＲでアッセイした。コントロールはＲＡを添加しなかった。Ａ、
コントロールＮＧＦニューロンレーン１〜４；ＮＧＦニューロン＋１×１０^-7Ｍ
ＲＡレーン５〜８。Ｂ、コントロールＮＴ−３ニューロンレーン１〜４；ＮＴ
−３ニューロン＋１×１０^-7Ｍ ＲＡレーン５〜８。Ｃ、コントロールＢＤＮＦ
ニューロンレーン１〜４；ＢＤＮＦニューロン＋１×１０^-7Ｍ ＲＡレーン５〜
８。レーン：１および５、ＲＡＲβ１；２および６、ＲＡＲβ２；３および７、
ＲＡＲβ３；４および８、ＲＡＲβ４。

【０２０６】 [図５]ＲＡの非存在下または非存在下で培養したＤＲＧニューロンにおけるＲＡ
Ｒβイソ型の発現。ＤＲＧニューロンを、ＮＧＦ、ＮＴ−３、またはＢＤＮＦの
存在下で２日間培養し、１×１０^-7Ｍ ＲＡを添加して、ＲＡＲγイソ型の存在
を、ＲＴ−ＰＣＲでアッセイした。コントロールはＲＡを添加しなかった。Ａ、
コントロールＮＧＦニューロンレーン１〜７；ＮＧＦニューロン＋１×１０^-7Ｍ
ＲＡレーン８〜１４。Ｂ、コントロールＮＴ−３ニューロンレーン１〜７；Ｎ
Ｔ−３ニューロン＋１×１０^-7Ｍ ＲＡレーン８〜１４。レーン：１および８、
ＲＡＲγ１；２および９、ＲＡＲγ２；３および１０、ＲＡＲγ３；４および１
１、ＲＡＲγ４；５および１２、ＲＡＲγ５；６および１３、ＲＡＲγ６；７お
よび１４、ＲＡＲγ７。

【０２０７】 [図６]ＤＲＧニューロンから神経突起成長に対するＲＡＲおよびＲＸＲアゴニス
トの効果。ＤＲＧニューロンを、ＮＧＦ、ＮＴ−３、またはＢＤＮＦの存在下で
２日間培養し、この時点で、１×１０^-7ＭのＣＤ３６６（ＲＡＲαアゴニスト）
、ＣＤ２０１９（ＲＡＲβアゴニスト）、ＣＤ４３７（ＲＡＲγアゴニスト）、
またはＣＤ２８０９（ｐａｎ−ＲＸＲアゴニスト）を培養物に添加した。次いで
、５日目に培養物をＮＦ２００抗体で神経突起成長を染色した。Ａ〜Ｄ、ＮＧＦ
型ニューロン；Ｅ〜Ｈ、ＮＴ−３型ニューロン；Ｉ〜Ｌ、ＢＤＮＦ型ニューロン
。アゴニスト：ＲＡＲα、Ａ、Ｅ、Ｉ；ＲＡＲβ、Ｂ、Ｆ、Ｊ；ＲＡＲγ、Ｃ、
Ｇ、Ｋ；ＲＸＲ、Ｄ、Ｈ、Ｌ。

【０２０８】 [図７]Ａ、ＮＧＦ型ニューロン；Ｂ、ＮＴ−３型ニューロン；Ｃ、ＢＤＮＦ型ニ
ューロンからの神経突起長に対するレチノイドアゴニストの効果。カラム１、ア
ゴニストなし；２、ＲＡ；３、ＲＡＲα；４、ＲＡＲβ；５、ＲＡＲγ；６、Ｒ
ＸＲ。エラーバーｓ．ｅ．ｍ．ｎ＝５０。^*ｐ＜０．０１。

【０２０９】 [図８]ＮＧＦまたはＮＴ−３の存在下で培養したＤＲＧニューロンでのＲＡＲγ
１およびＲＡＲβ２発現に対するＲＡＲγまたはＲＡＲβアゴニストの効果。Ｄ
ＲＧニューロンを、無血清培地の存在下で培養した。２日後、１×１０^-7Ｍ Ｒ
ＡＲγまたはＲＡＲβアゴニストを、２４時間培地に添加した。ＮＧＦ（レーン
１〜３）およびＮＴ−３（レーン４〜６）型ニューロンでのＡ、ＲＡＲγ１；Ｂ
、ＲＡＲβ２発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。レーン：１、４、アゴニストなし；２、
５、ＲＡＲγアゴニスト；３、６、ＲＡＲβアゴニスト。

【０２１０】 （概要） 例は、ＲＡＲβ２および／またはそのアゴニストを使用して神経突起発生を引
き起こすことができる。

【０２１１】 特に、本発明者らは、特に、ＲＡＲβ２の活性化による末梢神経における神経
突起再生を刺激するためのレチノイドの使用を示す。

【０２１２】 再生しない中枢神経系の神経と異なり、末梢神経が損傷した場合にはいくらか
再生される。しかし、神経突起の再生を進行できないギャップが作製されるよう
に神経組織の欠如が存在する外傷神経損傷が存在する場合、末梢神経の再生は特
に制限される。この神経再生の遅延により、筋肉退化を引き起こし、永久的な能
力喪失状態となる。

【０２１３】 末梢神経損傷に応答して、ニューロトロフィンが産生される。これは、種々の
ニューロンの生存に必要な成長因子のファミリーである。このファミリーには、
神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、および脳由来向
神経因子（ＢＤＮＦ）が含まれる。ＰＮＳ損傷の治療にニューロトロフィンを使
用することができることが期待された。しかし、結果は推奨されていない。２つ
の主要な問題（第１に損傷の送達問題および第２に異なるニューロンが異なるニ
ューロトロフィンを必要とするので再生するための全ての神経に投与するための
ニューロトロフィンのカクテル）が提起されている。本発明者らは、ニューロト
ロフィンは神経突起再生を刺激するかどうかを調査した。

【０２１４】 本発明者らは、ＮＧＦに類似のビタミンＡ誘導体（全トランスレチノイン酸（
ｔＲＡ））は種々の胚供給源（ＰＮＳを含む）から神経突起成長を誘導すること
を見出した。ｔＲＡの細胞効果は、リガンド活性化転写因子である各レセプター
への結合によって媒介される。２つのクラスのレセプター（レチノイン酸レセプ
ター（ＲＡＲ）およびレチノイドＸレセプター（ＲＸＲ））が存在し、これらに
はそれぞれ３つのサブタイプ（α、β、およびγ）が存在する。ＲＡＲレセプタ
ーは、ＲＸＲとのヘテロ二量体の形成によって遺伝子発現が媒介される一方で、
ＲＸＲはホモダイマーとして、またはオルファンレセプターとのヘテロ二量体の
形成によって遺伝子発現を媒介することができる。

【０２１５】 本発明者らは、ＲＡＲβ２のみが培養したニューロンの全ての型の神経突起成
長に必要であることを見出した。さらに、成体マウスＤＲＧをＮＧＦを帯びｔＲ
Ａ合成のインヒビターの存在下で培養した場合、神経突起成長は認められない。
それに対して、ＲＡをＮＧＦの阻害抗体と共に添加した場合、神経突起成長は正
常に行われる。本発明者らは、さらに、ＮＧＦはレチノイン酸合成酵素ＲＡＬＤ
Ｈ−２およびレチノイン酸レセプターβの転写ならびに合成ＲＡの検出可能な放
出を誘導することを示す。

【０２１６】 本発明者らは、ＲＡＲβ２の刺激は末梢神経系における神経突起の再生に本質
的に必要であり、これは重大にニューロトロフィンの下流に存在することを提唱
する。したがって、末梢神経系に関して、神経突起の再生させるためにＲＡＲβ
２レセプターを活性化することができるレチノイドを投与することが望ましい。

【０２１７】 本発明者らは所見をＣＮＳにまで拡大した。本発明者らは、胚脊髄はＲＡＲβ
２を発現し、その発現量は神経突起成長量に相関することを見出した。それに対
して、成体脊髄はＲＡＲβ２を発現しないので神経突起を再生することができな
い。本発明者らは、欠陥単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）ベクターの使
用により培養成体脊髄にＲＡＲβ２をトランスフェクトして、神経突起を成長す
ることができるＲＡＲβ２で正常な不活性脊髄を形質転換したことを示した。し
たがって、本発明者らは、損傷脊髄のＲＡＲβ２を用いた遺伝子治療により機能
が回復することを提唱する。

【０２１８】 ＰＮＳ損傷治療用のレチノイドの使用には、ニューロトロフィンの使用よりも
少なくとも３つの主要な利点が存在する。第１に、レチノイドはニューロトロフ
ィンと異なり、損傷部位に容易に投与することができる小さな親油性分子である
ので、ニューロトロフィンで達成することができる再生よりもより迅速に再生さ
れるはずであり、これは、筋肉萎縮およびそれによる麻痺を減少させるはずであ
る。第２に、ＲＡＲβ２の刺激が全てのニューロンの再生に重要であるので、本
発明者らは、ニューロトロフィンのカクテルの投与の必要性を回避する必要があ
るレチノイドの１つの型のみを試験した。第３に、レチノイドはニューロトロフ
ィンと異なり、合成が比較的容易である。

【０２１９】 ＣＮＳ損傷治療のためのＲＡＲβ２での遺伝子治療により、機能改善されるは
ずであり、それにより麻痺が予防される。

【０２２０】 ＰＮＳおよびＣＮＳ損傷は世界中で起こっており、運なことにこのような損傷
の発生率は減少する見込みがない。世界で１年間に百万人あたり１０００人が脊
髄損傷を罹患し、その１０倍に人数がある種のＰＮＳ損傷を罹患している。

【０２２１】 さらに、レチノイドを使用する他の３つの領域が存在する。ハンセン病、糖尿
病およびＡＩＤＳでは、神経障害が起こり（神経突起の死）、これはＰＮＳ損傷
に相当する。ハンセン病および糖尿病では、両タイプの患者の皮膚でＮＧＦが欠
如し、痛覚および潰瘍を形成し得る炎症を引き起こすことが示されている。ＡＩ
ＤＳ患者では、痛覚は、ＨＩＶ感染の最も一般的な影響の１つであり、この病態
の治療にＮＧＦが既に使用されている。

【０２２２】 したがって、本発明者らは、ＲＡＲβ２アゴニストを使用して、ハンセン病、
糖尿病、およびＡＩＤＳに関連する神経障害を含むＰＮＳ損傷を治療することが
できることを提唱する。

【０２２３】 まとめると、本発明者らの結果は、一定のニューロンクラスからの神経突起成
長におけるＲＡＲβ２を介して作用するＲＡの役割示す。

【０２２４】 したがって、本発明は、レチノイン酸レセプターＲＡＲβ２の発現による罹患
細胞または組織を確認する、神経変性疾患の治療法を含む。ＲＡＲβ２レセプタ
ーのアゴニストでの治療または遺伝子治療（すなわち、このレセプターをコード
する拡散の挿入）によって、これを達成することができる。本発明はまた、末梢
神経損傷治療用および脊髄再生用（対麻痺の場合）の薬物治療におけるこれらの
薬剤の使用として認められる。

【０２２５】 本明細書中に記載の全ての刊行物は、本明細書中で参考として援用される。本
発明の範囲および精神を逸脱することなく本発明の記載の方法および系の種々の
修正形態および変形形態が当業者に明らかである。本発明は、特定の好ましい具
体例に関連して記載されているが、特許請求の範囲に記載されている発明がこの
ような特定の具体例によって不当に制限されるべきではないことが理解されるべ
きである。実際、生化学分野、生物工学分野、化学分野、または関連分野の当業
者に明白な発明実施の記載の形態の種々の修正形態は添付の特許請求の範囲の範
囲内であることが意図される。例えば、本発明のいくつかまたは全てのＲＡＲβ
２および／またはいくつかまたは全てのＲＡＲβ２アゴニストをＲＡＲβ２のア
ンタゴニストのインヒビターに置き換えることが可能である。

【０２２６】 ＜レチノイン酸分野に対する引用文献＞

【表１】

【０２２７】

【表１（つづき）】

【０２２８】 ＜例１に対する引用文献＞

【表２】

【０２２９】 ＜例２に対する引用文献＞

【表３】

【０２３０】

【表３（つづき）】

【０２３１】

【表３（つづき）】

【０２３２】 ＜例３に対する引用文献＞

【表４】

【０２３３】

【表４（つづき）】

【０２３４】

【表４（つづき）】

【０２３５】

【表４（つづき）】

【０２３６】 ＜配列＞

【化１】

【０２３７】

【化２】

【０２３８】

【化３】

【０２３９】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 写真を示す（例１における図１）。

【図２】 棒グラフおよび写真示す（例１における図２）。

【図３】 写真を示す（例２における図１）。

【図４】 写真を示す（例２における図２）。

【図５】 写真を示す（例２における図３）。

【図６】 写真を示す（例２における図４）。

【図７】 写真を示す（例２における図５）。

【図８】 写真を示す（例２における図６）。

【図９】 写真を示す（例３における図１）。

【図１０】 写真を示す（例３における図２）。

【図１１】 写真を示す（例３における図３）。

【図１２】 写真を示す（例３における図４）。

【図１３】 写真を示す（例３における図５）。

【図１４】 写真を示す（例３における図６）。

【図１５】 写真を示す（例３における図７）。

【図１６】 写真を示す（例３における図８）。

【図１７】 化学式を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ // Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 メイデン，マルコム イギリス国、ダブリューシー２ビー ５ア ールエル ロンドン、ドルリー・レイン 26／29、キングズ・カレッジ・ロンドン、 デヴェロップメンタル・バイオロジー・リ サーチ・センター、バイオメディカル・サ イセンシズ・ディヴィジョン／ザ・ランド ール・インスティテュート (72)発明者 コーコラン，ジョナサン・パトリック・ト ーマス イギリス国、ダブリューシー２ビー ５ア ールエル ロンドン、ドルリー・レイン 26／29、キングズ・カレッジ・ロンドン、 デヴェロップメンタル・バイオロジー・リ サーチ・センター、バイオメディカル・サ イセンシズ・ディヴィジョン／ザ・ランド ール・インスティテュート Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA12 DA13 DA14 DA36 DA80 FB03 FB07 4B024 AA01 CA01 DA03 EA02 GA11 HA17 4C084 AA17 DC50 NA13 ZA012 4C086 AA01 AA02 BB02 GA03 NA14 ZA01 4C206 AA01 AA02 DA12 DA17 NA14 ZA01

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 神経突起を発生させる薬物製造におけるＲＡＲβ２および／
   またはそのアゴニストの使用。
2. 【請求項２】 前記アゴニストがレチノイン酸（ＲＡ）および／またはＣＤ
   ２０１９である、請求項１に記載のＲＡＲβ２および／またはそのアゴニストの
   使用。
3. 【請求項３】 神経学的障害治療用の薬物製造におけるＲＡＲβ２および／
   またはそのアゴニストの使用。
4. 【請求項４】 前記神経学的障害が神経学的損傷を含む請求項３に記載のＲ
   ＡＲβ２および／またはそのアゴニストの使用。
5. 【請求項５】 薬学的活性量のＲＡＲβ２レセプターおよび／またはそのア
   ゴニストを投与するステップを含む神経学的障害の治療方法。
6. 【請求項６】 前記アゴニストはＲＡおよび／またはＣＤ２０１９である請
   求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記ＲＡＲβ２レセプターがＲＡＲβ２発現系を含む構成要
   素によって投与される請求項５または請求項６に記載の方法。
8. 【請求項８】 ＲＡＲβ２レセプターの少なくとも一部の発現を指示するこ
   とができる核酸構成物を提供するステップと、 被験体の１つまたは複数の細胞に該核酸構成物を移入するステップと、 任意選択的に、該被験体にＲＡおよび／またはＣＤ２０１９などのＲＡＲβ２
   アゴニストを投与するステップと を含む被験体における神経突起の発生法。
9. 【請求項９】 薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤を有す
   る混合物中にＲＡＲβ２および／またはアゴニストを含む、神経突起発生に使用
   される薬剤組成物。