JP2002538816A

JP2002538816A - 細胞活性アッセイ装置およびその製造方法、ならびにその使用方法

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Publication number: JP2002538816A
Application number: JP2000605716A
Authority: JP
Inventors: リチャード，エイチ．，ジュニア．グッドウィン
Original assignee: リチャード，エイチ．，ジュニア．グッドウィン
Priority date: 1999-03-18
Filing date: 2000-03-06
Publication date: 2002-11-19
Anticipated expiration: 2020-03-06
Also published as: EP1165745A4; US20020019024A1; DE60028192T2; JP4558949B2; AU3725400A; ATE327315T1; US6468786B2; US20020009796A1; US6395505B2; US6329164B1; WO2000055298A1; EP1165745B1; DE60028192D1; EP1165745A1

Abstract

(57)【要約】細胞活性、例えば、走化性応答(chemotatic response)、を測定するために電磁放射検出ビームを用いる細胞活性アッセイ装置（ＣＡＡＡ）および方法であって、大量の電磁放射が膜を貫通するのを防止する複数のオフアクシス孔を有する不透明膜を含んでいる。当該膜は、不透明なフィルムから構成され、その膜に、ほぼオフアクシスのエキシマレーザー電磁放射により除去することにより孔を形成するか、あるいは、ほぼオフアクシスの蓄積粒子を衝突させ、エッチングすることにより孔を形成する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【背景】

【０００２】

【発明の分野】

この発明は、様々な化学的環境に応じた走化性、移動、浸潤、血管形成、成長
、増殖、分化または細胞の相互作用などの細胞活性のアッセイ（CAA）調査のた
めの方法および装置に関するものである。

【０００３】

【発明の背景】

走化性は、化学物質の濃度匂配に応じた生物細胞または組織の直接的な運動（
移動）である。浸潤は、バリアの中へまたはそれを通じて細胞が運動（移動）す
ることである。癌浸潤は、インビボにて、生物学的組織等の中へまたはそれを通
じて、癌細胞によって引き起こされた運動のことである。例えば、コラーゲンや
マトリゲルのような特別な細胞を基質とするプロテインや、その他の物質によっ
て形成されたバリアの中へまたはそれを通じて、癌細胞によって引き起こされた
運動も該当する。血管形成は、内皮細胞による移動および毛細血管の形成である
。成長は、細胞のサイズ、形状、複雑性が増大することである。増殖は、細胞分
解による細胞の成長である。分化は、多様な機能的役割および新規かつ多様な形
質の発現と通常関連して、細胞が未分化な状態からより分化した状態に変化す
るプロセスである。細胞の相互作用は、付近の同種または異種細胞間による存在
および運動に応じた移動、浸潤、血管形成、成長、増殖または分化のような細胞
行動の交互変化である。ここでは、このような活性およびこれと同じような活性
をまとめて「細胞活性」と記し、アッセイを行うための装置は、「細胞活性アッ
セイ装置」と記す。

【０００４】「走化性チャンバー」、「Boydenチャンバー」、「Boyden走化性チャンバー」
、「ブラインドウェル(blind well)チャンバー」、「マイクロ走化性チャンバー
」のような様々な記述で言及される一種の一般的なシングルサイト（site）細胞
活性アッセイ装置は、膜で隔離された２つの仕切部屋（コンパートメント）を備
え、その一方または両方が大気に通じている。マルチサイト装置は、よく「マル
チウェル走化性チャンバー」または「マルチウェル Boydenチャンバー」のよう
に言及され、多数のサイトの外に、同種の基盤サイト構造を備えている（米国特
許NO.5,210,021、5,302,515参照）。この種のアッセイ用装置は、培養液にて懸
濁されている細胞を上部仕切部屋にピペットで移し、走化性因子およびコントロ
ールを底部仕切部屋にピペットで移す。走化性因子は、用量作用曲線を得るため
に様々な希釈溶液において使用され得る。このコントロールは、一般的に、(a)
ネガティブ：細胞の懸濁に用いた培養液を膜の下でも用いる場合、(b)化学運動
性(chemokinetic)：走化性因子を、同一の濃度で、細胞を含む培養液および膜の
反対側のウェルに入れる場合、および(c)ポジティブ：既知の化学誘引物質を底
部ウェルに入れる場合の３種類に分けられる。化学運動性コントロールによって
、走化性因子と接触することが要因で高められた細胞のランダム運動と、その走
化性因子の濃度匂配における直接的な反応とを区別することができる。

【０００５】細胞活性アッセイ装置は、いわゆる走化性活性の走化性因子に対する種々の由
来の細胞の反応を測定するために使用することもできる。種々の由来の細胞とは
、例えば、病気で苦しんでいる患者から取得した免疫性細胞である。この場合に
おいて、この種々の反応(differential response)が、抑制されているのか若し
くは通常なのかを観察して、問題となっている細胞の反応を、ネガティブコント
ロールといわゆる走化性因子により特定することができる。

【０００６】走化性活性は、細胞活性アッセイ装置にて、安定した濃度勾配を設定すること
によって測定される。すなわち、あらかじめ定めた時間それを培養し、それから
膜を通じて移動した細胞（または膜の中へ移動した細胞）をカウントする。そし
て、テストした走化性因子の濃度勾配があるところにおける細胞活性と、濃度勾
配がないところにおける細胞活性間において比較が行われる。

【０００７】ある一種の細胞活性アッセイ装置および方法では、走化性反応は、化学薬品を
含有するチャンバーに最も接近している膜の表面の細胞の数を、物理的にカウン
トすることによって測定される。この種の細胞活性アッセイ装置の一例は、参考
までにここに記載しておくが、米国特許NO.5,210,021（Goodwin,Jr.)に記載され
ている。定量データを取得するある従来の方法は、細胞活性アッセイ装置から膜
を取り除き、もとの細胞の懸濁液を含有するチャンバーに最も接近している膜の
表面から細胞を取り除く。そして、細胞を固定して染色し、それから顕微鏡によ
って染色された細胞を観察およびカウントする。膜をすべてを調べるための時間
と費用から、膜をすべて調べ、カウントした場合よりも結果は正確ではないが、
代表的な膜の領域だけをカウントする。

【０００８】ディスポーサブル96ウェルマイクロプレート形式を使用する細胞活性アッセイ
は、結果物を定量化する特別な方法に従う。細胞活性アッセイとして、例えば、
ChemoTx^TM（Neuro Probe, Inc.,Gaitherburg,MDから入手可能）がある。手作業
で染色およびカウントする上記の方法は、利用され得るが、時間がかかるため薦
められない。好ましい方法は、フィルタを備えたマイクロプレートに遠心力を作
用させて、フィルタを通じて移動した細胞を下部ウェルの底部に入れる。それか
ら、MTT、MTS（Promega,Madison,Wisから入手可能）などの染料で、細胞を染色
して、標準自動式実験用濃度リーダ（たまに、エリザプレートリーダと呼ばれる
）において読み取る。

【０００９】この装置を用いて定量データを取得する別の方法として、蛍光性の原料を用い
て細胞を染色する方法がある。例えば、Calcein AM（Molecular Probes, Eugene
, Oreから入手可能）である。マイクロプレートに移動させた細胞に遠心力を作
用させ、自動式蛍光プレートリーダ（例えば、Cytofluor はPE Biosystems, Fos
ter City, Ca.、Victor²はEG & G Wallac, Gaithersburg, Md.から入手可能、fm
ax Molecular Devices, Sunnyvale, Ca.から入手可能)を用いて細胞をカウント
する。この自動式プレートリーダは、１番目の光の波長で、移動させた細胞の蛍
光性の染料を励起し、２番目の波長で、放射された光を読み取る。代わりに、移
動しなかった細胞は各サイトの上面から取り除かれ、フレームされた膜が取り付
けられたプレートは、自動式蛍光プレートリーダにおいて、プレート上で細胞を
スピンさせないで、膜の底部上や膜の孔のような下部ウェルに、フィルタから落
ちた細胞をカウントすることによって、読み取られる。

【００１０】米国特許NO.5,601,997（Tchao）に記載されている別の型の走化性装置では、
走化性反応は、上述のように蛍光性の染料を細胞にラベルすることによっても測
定される。しかしながら、Tchaoの装置では、膜の一方にある細胞が、反対側か
ら細胞を取り除かなくてもカウントされるように、蛍光性染料の励起および放射
波長に対して不透明なフィルムで、膜が生成される。Tchaoの方法は、カイネテ
ィックアッセイの一例である。このようなアッセイにおいて、膜の細胞が移動す
る方向の面は、励起波長の染料によって照射される。その面の細胞は、放射波長
にて放射された光強度を測定することによって、周期的にカウントされる。これ
により、研究員は、膜を通じて移動する細胞の割合をデータとして取得すること
ができる。研究員は、アッセイを終了しなければ、細胞がもともとあった膜の面
からそれらの細胞を除去することができず、それによってカイネティックスタデ
ィを行うことが不可能になってしまうから、膜は不透明でなければならない。

【００１１】

【定義および略語】

【００１２】

【略語】

1. 「電磁放射」は、ここでは「ER.」と略書する。

【００１３】 2. 「孔の直径」は、ここでは「pd.」と略書する。

【００１４】 3. 「膜の厚さ」は、ここでは「mt.」と略書する。

【００１５】 4. 「曲率半径」は、ここでは「rc.」と略書する。

【００１６】 5. 「ハイ・スループット・スクリーニング」は、ここでは「HTS.」と略書する
。

【００１７】 6. 「細胞を用いたハイ・スループット・スクリーニング」は、ここでは「CBHT
S.」と略書する。

【００１８】 7. 「ナノメーター」は、ここでは「nm.」と略書する。

【００１９】 8. 「マイクロリットル」は、ここでは「ul.」と略書する。

【００２０】 9. 「マイクログラム」は、ここでは「ug.」と略書する。

【００２１】 10. 「変動係数」は、ここでは「CV.」と略書する。

【００２２】 11. 「細胞活性アッセイ装置」は、ここでは「CAAA」と略書する。

【００２３】 12. 「tcc」は、ここではサイトに導入された細胞の総数を略書したものである
。 13. 「U₁」は、ここでは、アッセイ開始時におけるCAAAのサイトの上部ボリュームから放射された光量を略書したものである。これは、tcc.に比例している。

【００２４】 14. 「L₁」は、ここでは、従来の技術(background)で知られているように、ア
ッセイ開始時におけるCAAAのサイトの下部ボリュームから放射された光量を略書
したものである。

【００２５】 15. 「U₂」は、ここでは、アッセイ終了時におけるCAAAのサイトの上部ボリュ
ームから放射された光量を略書したものである。

【００２６】 16. 「L₂」は、ここでは、アッセイ終了時におけるCAAAのサイトの下部ボリュ
ームから放射された光量を略書したものである。

【００２７】 17. 「CL₂」は、ここでは、CAAAのサイトの下部ボリュームから放射された光量
L₂から、もとのL1(background L1)を控除したものを略書したものである。

【００２８】 18. 「cmc」は、ここでは、CL₂に比例する「完全に移動した細胞数」を略書し
たものである。

【００２９】 19. 「cmc％」は、ここでは、そのサイトに導入した総細胞数におけるcmcのパ
ーセント、すなわちcmc／tccを略書したものである。

【００３０】 20. 「pmc」は、ここでは、U₁−(CL₂＋U₂)に比例する「部分的に移動した細胞
数」を略書したものである。

【００３１】 21. 「pmc％」は、そのサイトに導入した総細胞数における部分的に移動した細
胞のパーセント、すなわちpmc／tccを略書したものである。

【００３２】 22. 「mc」は、ここでは、cmc＋pmcに等しい「移動した細胞」を略書したもの
である。

【００３３】 1. 「mc％」は、ここでは、mc／tccであるmcのパーセントを略書したものであ
る。

【００３４】

【定義】

1. 「チャンバー」、「ウェル」または「ボリューム」は、ここでCAAAにおいて
使用されるとき、液体サンプルを含有するCAAAの３次元のエリアを意味する。

【００３５】 2. 「オフアクシス」は、ここで膜の孔について使用されるとき、平らにした場
合に、0°を越え90°未満の傾斜角度を有して、膜に対して傾いている孔を意味
する。

【００３６】 3. 「正確に垂直」は、ここでERビームおよび平らな表面において使用されると
き、すべてのERビームが、その表面に垂直であることを意味している。

【００３７】 4. 「β-ノーマル」は、ここでERビームおよび平らな表面において使用される
とき、その表面に対していくつかは(some of)正確に垂直であるERビームを意味
し、βが最大角度であり、90°程度未満の角度範囲内の入射角の差である。言い
換えれば、表面におけるβ-ノーマル ERビームは、図２に示すように、最大入射
角度としてβをもつ光のコーンである。 5. 「ほぼ垂直」は、ここでERおよび平らな表面において使用されるとき、その
ERが前記表面に対してβ-ノーマルであり、かつβが15°未満であることを意味
している。（一般的な細胞活性アッセイ用検出・定量化システムは、βが15°未
満である検出ビームを備えていることを認識(recognition)している。） 6. 「検出ビーム」は、ここでERにおいて使用されるとき、特定の距離および特
定の穴から特定のコーン(cone)内の装置のサイトに導かれた自動式リーダーまた
は検出・定量化システムのERを意味している。

【００３８】 7. 「β-ノーマル検出ビーム」は、ここで使用されるとき、β-ノーマル ERを
使用する検出ビームを意味している。

【００３９】 8. 「理想的な不透明」は、ここでフィルムについて使用されるとき、すべての
ERをストップまたはブロックするフィルムを意味している。

【００４０】 9. 「R-不透明」は、ここでフィルムまたは膜について使用されるとき、R波長
範囲内において、ERをストップするフィルムまたは膜を意味している。このRは
、nm.表示のER波長の範囲を定めるブラケットの数値(a pair of numbers in bra
ckets)によって、条件として指定されたものである(is specified)。

【００４１】 10. 「R-不透明＠P％」は、ここでフィルムまたは膜について使用されるとき、
R範囲内において、P％を越えるERをストップするフィルムまたは膜を意味してい
る。このPは、0〜100の十進法の数値であり、ブロックされるERのパーセントを
表している。例えば、この発明の実施形態で使用される１のフィルムは、480〜5
80nm.の波長範囲内において、99.0％以上のERをブロックする。これと同じフィ
ルムは、480〜490および510〜540nm.のER範囲内において、99.9％をブロックす
る。ここでは、このフィルムは、「480-580-不透明＠99.0％」、「480-490-不透
明＠99.9％」および「510-540-不透明＠99.9％」と表す。

【００４２】 11. 「理想的な不透明」は、ここで膜について使用されるとき、(a)膜を形成す
るフィルムが理想的に不透明であり、(b)膜の複数の孔が、垂直かつ平行になら
んでおり、さらに(c)その複数の孔が、膜が平らである場合に、正確に垂直なER
が、孔をまっすぐ通過できないように配置され、角度をなしている膜を意味して
いる。

【００４３】 12. 「β-ノーマル不透明」は、ここで膜について使用されるとき、β-ノーマ
ル ERは、どの孔もまっすぐ通過することができないような膜を意味している。

【００４４】 13. 「実質的に不透明」は、ここで膜について使用されるとき、ほぼ垂直なER
が、孔をまっすく通過することができないような膜を意味している。

【００４５】 14. 「幾何学的にR-不透明＠P％）」は、ここで膜について使用されるとき、(a
)原料のフィルムがR-不透明＠P％であり、さらに(b)正確に垂直なERが、膜のど
の孔もまっすぐ通過しない膜を意味している。図１に示すように、膜のオフアク
シス孔の最小入射角度αは、次式を満たさなければならない。

【００４６】 α＞φ where φ＝sin^-1(pd/mt). (1) 15. 「β-ノーマル R-不透明＠P％」は、ここで膜について使用されるとき、(a
)膜のフィルムがR-不透明＠P％であり、さらに(b)β-ノーマル ERが、どの孔も
まっすぐ通過しないことを意味している。図2に示すように、膜のオフアクシス
孔の最小入射角度αは、次式を満たさなければならない。

【００４７】 α＞(β＋θ), where θ＝sin^-1(［pd×cosβ］/mt). (2) 16. 「実質的にR-不透明＠P％」は、ここで膜について使用されるとき、(a)R-不
透明＠P％で形成されており、(b)ほぼ垂直な ERが、どの孔もまっすぐ通過させ
ない膜を意味している。このような膜のオフアクシス孔の最小入射角度αは、β
が15°未満において、上記(2)式を満たさなければならない。

【００４８】 17. 「ほぼ垂直」は、ここで膜の孔について使用されるとき、膜を平らにした
場合に、15°以下の入射角度をもつ膜に対して傾いている孔を意味している。

【００４９】 R-不透明＠P％膜は、必ずしも、実質的に R-不透明＠P％、β-ノーマル R-不
透明＠P％、幾何学的に R-不透明＠P％ではないことを書き留めておく。なぜな
ら、ほぼ垂直な光をまっすぐ通過させる垂直な孔を有している場合があるからで
ある。

【００５０】細胞活性のアッセイに適する膜として、99.0％以上のPを有しており、孔によ
って形成された膜の開口領域が、膜の2％以上の大きさになるように、孔の直径
が3ミクロンを越えることが好ましいことを書き留めておく。特に、仮に、孔が
ほぼ垂直ならば、表面に対してほぼ垂直なERが、膜をまっすぐ通過するから、こ
れらの用途の膜はR-不透明＠P％になり得ない。一方、仮に、孔が実質的にオフ
アクシスであり、その他の特徴が同じであるならば、膜は、実質的に R-不透明
＠P％、β-ノーマル R-不透明＠P％、幾何学的に R-不透明＠P％になり得る。

【００５１】

【発明の概要】

本発明は、膜を採用したＣＡＡ装置ならびに、ＨＴＳ、ＣＢＨＴＳおよび細胞
ベースのスクリーニング用であるとともに、細胞活性の基礎研究用のＣＡＡ装置
を用いた方法を提供する。特に、本発明は、ほぼＲ−不透明＠Ｐ％の膜の集合を
用いたＣＡＡ装置に関する。また、本発明は、前記ＣＡＡ装置に用いられる膜、
およびその製造方法を含んでいる。

【００５２】本発明の膜は、ＣＡＡ装置を用いる検出および数値化に用いられる機器のＥＲ
の波長に対してほぼＲ−不透明＠Ｐ％であるので、膜の片側から細胞を検出し、
その数を数える作業は、当該膜の反対側の細胞、または、それと同時又はその次
に行われる当該膜の他方側の細胞の検出および集計による影響を受けない。これ
により、従来の方法よりも正確な結果が得られる。特に、このことは、ピペット
量のばらつき、および、その中に細胞が保持(suspended)されたメデイア内への
細胞の不均等な分配によるエラーの両方を除去する検出および数値化法を用いる
ことで可能となる。これにより、薬物の発見および開発においてＨＴＳ用および
ＣＢＨＴＳ用に適切となるようアッセイのＣＶを低下させることができる。

【００５３】Ｔｃｈａｏの膜は、いくつかの蛍光染料の励起および放出波長に対して不透明
なフィルムにより構成されている。すなわち、Ｔｃｈａｏ膜は、Ｒ−不透明＠Ｐ
％膜である、ここで、Ｒは、前記検出および数量化システムにより用いられる波
長範囲であり、Ｐは、ブロックされる割合である。しかし、Ｔｃｈａｏ膜は、特
に、ほぼ垂直に貫通する孔が求められている。したがって、”形状的に(geometr
ically)Ｒ−不透明＠Ｐ％”な膜、”および”βーノーマルＲ−透明＠Ｐ％”な
膜のいずれでもない、ここで、”β”は、検出ビームにおける光の最大入射角度
であり、”Ｒ”は、光の波長範囲である。したがって、”ほぼＲ−不透明＠Ｐ％
”な膜ではない。孔は、ほぼ垂直に形成されているので、標準的な検出器からの
検出ビームは、孔をそのまま通過する。したがって、細胞活性アッセイ用に通常
用いられている、５％から１５％のオープン領域（孔の総面積）を有する膜を用
いると、膜の孔を通過する光は、かなりの量となる。励起ビームにより膜の表面
に対して垂直に伝送された波長は、ほぼ垂直な孔を通過し、当該膜の反対側にあ
る細胞は、検出ビームによりカウントされる。すなわち、光、つまり、βーノー
マル、ここでβは、１５度未満であり、は膜を貫通し、活性細胞(excite cell)
は、孔を越え、光を発し、（この光は、ほぼ垂直な孔をサイド通過するので）カ
ウントされる(over pores which will emit light and be counted)。これによ
り、膜を通じて移動しなかった細胞は、ＥＲを発するためにシミュレートされ、
カウントされ、結果の精度を低下させる。このことは、以下の二つから力学アッ
セイ用には、問題とならない。まず第一に、膜のオープン領域は、５％から１５
％の間にすぎず、アッセイに用いられる細胞の数を、それが膜の１０％だけを覆
うように設定することができる。これにより、孔を越える細胞の数が減少する。
二番目に、力学的な研究(kinetic study)において、重要なパラメーターは、変
化レートであり、細胞が孔を越えて移動した場合に、膜の開始側(origination s
ide)にある細胞がカウントされるという事は、検出器は、励起ビ−ムがそのまま
通過しないように形成したオフアクシスの孔を有する同じフィルムで作った不透
明膜を用いた場合よりも早く細胞をカウントするということだけを意味する。他
方、力学だけでなく他の、または、力学的な数値を測定しないアッセイに関し、
この方法は、かかるアッセイにおいて膜の両側の異なる点において全ての細胞を
カウントし、上述の方法のように、ほぼ垂直な孔を形成してアッセイの精度を低
下させ、ＣＶを著しく上昇させる。

【００５４】

【詳細な説明】膜のジオメトリー図１は、正確に垂直なＥＲ１５０で作製した、本発明の膜の理想的な実施形態
の一部分の拡大切断面を示す。図１の膜１００は、第１表面１１０、第２表面１
２０、複数の孔１３０を備えている。膜１００の孔は、あらゆる孔の最小入射角
がαであるようなオフアクシス（ｏｆｆ−ａｘｉｓ）となっている。孔１３０は
、検出ビームが孔を通って膜の第２表面から第１表面（または逆）へ直接進行す
ることができないような入射角を有している。図１に示すように、最小入射角α
はφよりも大きくなければならない。ここで、φは次式で定義される。

【００５５】 φ ＝ｓｉｎ^−１（ｐｄ／ｍｔ）（１）ここで、ｐｄは孔直径であり、ｍｔは膜厚さである。この場合、正確に垂直な検
出ビームから放射されるＥＲは、膜の孔を通って直線的に進行することができな
い。

【００５６】図２は、本発明の膜の一部分の、拡大した切断面の略図である。β−ノーマル
不透明膜２００は、上面２１０、底面２２０及び複数の孔２３０を有している。
検出ビームの最大入射角を持つ、β‐ノーマル検出ビームから放射される光線２
６０は、図２に示している。孔直径ｐｄ及び膜厚さｍｔは図示したとおりである
。最小入射角での膜の孔の角度はαである。膜２００は、以下の場合に限りβ−
ノーマル不透明である。

【００５７】 α＞（β＋q）ここで、q＝ｓｉｎ^−１（［ｐｄ×ｃｏｓβ］／ｍｔ）（２）
である。

【００５８】図３は、曲線状の孔３００を有する本発明の膜の実施態様の一部分の拡大した
切断面の略図である。図には、上面３１０、底面３２０、及び孔３３０が示され
ている。β−ノーマル検出ビームから放射される光線３６０は、検出ビームの最
大入射角βを有しており、これは図３に示されている。孔直径ｐｄ及び膜厚さｍ
ｔは示したとおりである。膜の孔の最小入射角αは、図３に示されているように
決定される。膜３００は、式（２）を満たす場合に限り、β−ノーマル不透明で
ある。

【００５９】 α＞（β＋q）ここで、q＝ｓｉｎ^−１（［ｐｄ×ｃｏｓβ］／ｍｔ）（２）
である。

【００６０】膜作製図４ａは、本発明の膜の実施態様の作製に用いる装置の、縮小した切断面の略
図である。膜を作製するもととなるフィルムは、巻き出しロール（ｕｎｗｉｎｄ
ｒｏｌｌ）４１０と呼ばれるロールの上でウェブを形成しており、フィルムは
、巻き出され、巻き出しロール４１０と、第２ロールである、作製された膜を有
する巻き取りロール（ｒｅｗｉｎｄｒｏｌｌ）４３０との間の平面部分４２０
で保持される。巻き出しロール４１０と巻き取りロール４３０との間のフィルム
の平面部分４２０は、エキシマレーザーライト４４０の複数のビームの下を通過
し、それぞれのビームは、作製される孔よりもわずかに小さい直径を有している
。どれくらい小さいかについては、フィルムの厚さ、フィルムの材料、レーザー
からのＥＲの波長によって決定される。ＥＲの波長が、一般的には２００ｎｍか
ら４００ｎｍの間と非常に短いことを理由として、エキシマレーザーを利用する
こととしている。これにより、孔をミクロン以下にすることができる。しかしな
がら、本発明の好ましい実施態様での孔のサイズは、１．０、２．０、５．０、
８．０、１０．０、１２．０、１４．０ミクロンであり、これらは、サブミクロ
ンの孔と比べると比較的作成が容易である。レーザーライト４４０のビームは、
図４ａに示すように角度αにてフィルムにあたる。好ましい実施態様においては
、αは、特定のβ−ノーマル不透明膜が要求する膜厚さ、孔直径、実行する細胞
活性アッセイの性質に依存して、１５°から７０°の間である。いくつかのアッ
セイでは、最短の孔が最適であり、他のアッセイでは、より長い孔が最適である
。例えば、最小の培養期間のためにデザインしたアッセイでは、短い孔が好まし
い。一方、最大の感度が優先されるならば、より少ない数のネガティブコントロ
ール細胞が膜を通過するであろうから、より長い孔が好適であると考えられる。

【００６１】エキシマレーザーＥＲの複数のビームは、レーザー出力を多数の分散ビーム、
例えば幾千ものビームを形成するマスクに衝突させることによって得られるもの
であり、それらは、その後フィルムに集中する。レーザーＥＲは、フィルムをア
ブレーション（ａｂｌａｔｅ）し、材料を通過する直線状の孔を生成する。アブ
レーションの時間は、レーザーのパワー、フィルム材料の組成、厚さによって決
定される。詳細については、当該分野の当業者にとって周知である。レーザーに
よる膜作製の一つの利点は、正確な位置と孔の数をコントロールすることができ
ることにある。異なる数及び位置の孔を有する細胞活性アッセイ装置の、異なる
サイトに関連するばらつきを除くことで、アッセイのＣＶ（変動係数）を低くす
ることができるのであるから、レーザーによる膜作製は有効である。また、各サ
イトのための小さい体積と面積が要求される細胞ベースのアッセイには、レーザ
ーによる膜作製が必須である。本発明の一つの好ましい実施態様は、１ｍｍ直径
に１５３６サイトを有するマイクロプレートサイズの装置（５．０３０”×３．
３６５”フットプリント）を用いて行った。この装置によって行われたβ−ノー
マル不透明膜の好ましい実施態様は、１、２、３、５、８、１０、１２、１４ミ
クロンの孔直径を有しており、厚さは、５から５０ミクロンの間である。孔密度
は、１×１０^３から２×１０^７孔／ｃｍ^２の範囲である。アッセイサイトに対す
る膜の面積が小さくなればなるほど、孔の不規則分布に関連する誤差が大きくな
る。このことは、アッセイ全体のＣＶに消極的に影響する。したがって、孔のサ
イズ、数、角度、位置において実質的に変動のないエキシマレーザーによる膜作
製には、重要な利点がある。

【００６２】図４ｂは、本発明の膜の好適な作製方法の平面斜視略図であり、図４ｃは、そ
の側面図である。この方法では、膜は、図４ａに示すレーザー装置による孔のア
ブレーションによって得られるフィルムから構成される。この方法において、一
面に結合するフィルム４６１を備えるＣＡＡＡ４６０のフレームは、図４ｃに示
すように、スライド部材４７１を持つ角度をもったジグ４７０に正確に位置する
。作製される孔の直径に比例した直径を有する多数のレーザービーム４４０は、
図示するように入射角αでフィルムにあたる。上述したように、β−ノーマル不
透明膜を構成するためには、式（２）が満たされていなければならない。その式
は、 α＞（β＋q）ここで、q＝ｓｉｎ^−１（［ｐｄ×ｃｏｓβ］／ｍｔ）（２）
であり、図２に示すように、ｍｔは膜厚さであり、ｐｄは孔直径である。もし、
β＜１５度であれば、作製される膜は実質的に不透明であろう。フレームされた
フィルム４６１は、レーザービーム４４０の下で、矢印４７５で示される方向に
増分ステップ（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌｓｔｅｐ）で移動し、レーザービーム
がフィルムにあたる位置において角度αを保っている。レーザーライト源（図示
せず）と、フィルム上のレーザービームのクラスターを集中させるフォーカスレ
ンズシステム４５０との間の光学距離において分散するビームのクラスターを形
成するマスク（図示せず）によって定められるパターンで、ビーム４４０は、孔
の配列を連続的にアブレーションする。レーザーによる膜作製装置の本実施態様
において、レーザービーム４４０は、図４ｂに示す１５３６サイトからなる３２
×４８配列を有するＣＡＡＡのサイトに一致する、パターン４８０に集中される
。この作製技術は、（ａ）各サイトの孔の数が固定され、（ｂ）前記孔は、フレ
ームされたフィルム４６１全体にまたがった、様々な固定された均一パターンで
位置されうる、という利点がある。このことは、フレームされた膜を用いたＣＡ
ＡＡにおけるサイト毎の変動は、膜について実質的にゼロであるということを意
味する。このことは、さらに、いくつかの実施態様（以下に詳述する）における
疎水性のマスクの適用は、位置的にも、寸法的にも、サイトの均一性に起因する
アッセイのＣＶに関して、もはや不可欠ではないということを意味している。

【００６３】図４ｄは、図４ａに示すように、孔が加工され、焼かれ、レーザーによってア
ブレーションされているフィルムから、本発明の膜を作製する方法を示している
。膜を作製するもととなるフィルムは、巻き出しロール４１０の上でウェブを形
成しており、フィルムは、巻き出され、第２ローラー４９０の付近を通り、そこ
で９０度方向を変えて、非常に小さい直径の作製ロール４９５の付近を通ってい
る。作製ロール４９５の直径は、この方法で作製される孔の曲率半径（ｒｃ）に
比例しており：作製ロール４９５の直径が小さくなればなるほど、孔のｒｃも小
さくなっている。レーザーＥＲは、作製ローラー４９５の付近で曲がっているフ
ィルム領域の非常に狭い部分での角度範囲で、フィルムにあたる。レーザーＥＲ
は、曲がったフィルム中で直線状の孔をアブレーションし、そのため、膜が平面
状になったときに孔が曲がる（図３参照）。膜のウェブは、それから、ロール４
９１に付近で直角になり、作製された膜として巻き出され、巻き取りロール４３
０に向かう。フィルムは、矢印４７５で示される方向に、非常に小さい増分ステ
ップで移動し、ステップの増分は、レーザーがフィルムの孔をアブレーションす
る面積の幅によって決定される。レーザービーム４４０は、連続して孔の配列を
アブレーションし、直径とパターンはマスクによって決定される（図示せず）。
孔の角度範囲は、作製ロール４９５の直径、及び、レーザービーム４４０がフィ
ルムにあたる領域の面積に比例する。

【００６４】図５ａは、本発明の膜の実施態様の作製に使用する第２種目の装置の、縮小し
た切断面の略図を示す。膜を作製するもととなるフィルムは、巻き出しロール５
１０上でウェブ形状をしており、フィルムは、巻き出され、中間ロール５３０と
５４０との間の平面５２０に保持され、それから、照射を受けた膜を巻き取る巻
き取りロール５５０に向かって移動する。フィルムの部分は、平面及び中間ロー
ル（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｒｏｌｌ）５３０と５４０との間のトート（ｔ
ａｕｇｈｔ）５２０に保持され、サイクロトロン（図示せず）によって放射され
た高エネルギー荷電粒子のビーム５６０の下を通過する。一つの好ましい実施態
様における高エネルギー粒子ビームの直径は約６ｃｍであり、その高エネルギー
粒子ビームは、図５ｂに示すスィーピングマグネット５７０からの電磁場によっ
て偏向されたウェブに沿って、前後に偏向される。ビームは、ウェブの動作のラ
インに垂直な軌道で、フィルムの幅にそって前後に偏向する。ビーム（またはイ
オンの霧）は、フィルムを通過するときには、スィーピングマグネット５７０か
ら約５ｍの距離にある。フィルム５２０の幅を超えてビームが前後に偏向するの
に従って、フィルムは、膜に要求される孔の密度によって決定される一定の割合
（ｓｔｅａｄｙｒａｔｅ）でビームの下を移動する。フィルムがビームの下を
通過するのに従い、荷電粒子が通過し、フィルムを構成するポリマー鎖の分子結
合を切る。ビーム中の粒子のエネルギーは、１から２百万エレクトロンボルトの
範囲にあり、ビームの入射角αでフィルムを完全に通過するのに十分であるに違
いない。この角度αは、１５°から７０°に設定されている。特定のβ−ノーマ
ル不透明膜のための最適な角度は、膜厚さ、孔直径、実行する細胞活性アッセイ
の性質によって決定される。

【００６５】この作製技術において、プロセスの第２工程は、示してはいないが、エッチン
グバス中で水浸する照射されたフィルムによって構成されている。この工程では
、サイクロトロンからの高エネルギー粒子によって生成されたフィルムを介して
、孔を、切断されたポリマーの直線軌道に沿ってエッチングする。孔の直径は、
エッチングプロセスの時間、エッチングバスの温度及び濃度によって決定される
。このプロセスの詳細については、照射−エッチング（ｔｒａｃｋ−ｅｔｃｈ）
膜作製分野の当業者にとって周知である。

【００６６】細胞活性アッセイ装置図6aから6cは、本発明のある実施形態の略図である。複数サイトＣＡＡ装置６
００は、βーノーマルＲ−透明＠Ｐ％膜を有し、これは、特に、上述のＲ−不透
明＠Ｐ％膜と同等なものである。図6aは、装置全体の平面および断面図であり、
図6bおよび図6cは、当該装置の部分拡大図である。

【００６７】アッセイ装置６００は、三つの剛性部品：剛性フレーム６２０に接着された透
明フィルム６２１からなる上部、第二剛性部６５０に接着された膜６５１からな
る中間部、および、透明な射出成形マイクロプレート６８０からなる底部、から
構成されている。

【００６８】膜６５１は、プラスチック、ガラス、セラミック、有機物質、またはこれらの
組み合わせを含む様々な素材から製造可能なフィルムから構成することができる
。膜孔６９５（図6cのみに表されている）は、いろいろな方法で形成することが
でき、そのうち二つは、上で説明した。フレーム６５０は、プラスチック、鋼、
ステンレス鋼、アルミニウム、又は他の適切な材料でもよい。かかるフレームは
、それ自身に取り付けられている、膜、および格子(grids)、被覆物(coatings)
又はサイトデリミネーテイング装置(site-deliminating devices) のいずれをも
ほぼ平らに保持するのに十分な剛性を有していなければならない。前記の膜は、
適切な方法であれば、接着剤、ヒートシール超音波シールまたは機械的方法を含
むどのような固定方法によってフレームに接着してもよい。

【００６９】図6aは、８個ｘ１２個で配列されたＣＡＡ装置６００の９６個のアッセイサイ
ト６３０を示している。各アッセイサイト６３０は、膜６５１の上に位置する上
方ボリューム６９３および膜６５の下に位置するマイクロプレート６８０内の下
方ボリューム又はウエル６９２である二次元コンパートメント（ウェル）ととも
に膜６５１の分離・分割領域６５６を備えている。

【００７０】フィルム６２１は、各上方ボリューム６９３の頂面を区切り、検出ビームによ
るＥＲおよびテストサイト６３０の上方ウエルから放射されたＥＲの反射および
屈折を最小化し、光学的に都合がよい平面を形成する。フィルム６２１の底面に
固定された不透明マスク６２５が、アッセイサイト６３０の頂面において透明の
スポット６２７を取り囲み、分離する。かかるマスクも、疎水性であり、上方ボ
リューム６９３の頂面を取り囲む(circumscribes)。

【００７１】図6cは、ＣＡＡ装置６００の中間部を構成するフレーム６５０を有する膜６５
１の側面を非常に大きく拡大した図である。図6cは、ほぼＲ−不透明＠Ｐ％膜６
５１である膜のオフアクシル孔６９５を示している。また、この図は、アッセイ
サイト６３０の端部における膜部(membrane section)を示し、膜６５１に固定さ
れている、頂面６５３上の一つ（６５５）および底面６５２上の一つ（６５４）
の二つの疎水性マスクを図示している。疎水性マスク６５５は、サイト６３０の
上方ボリュームの底面周辺(bottm perimeter)を区切るとともに、膜を越えてて
細胞が活性可能な膜エリアを囲む。疎水性マスク６５４は、以下で述べるように
、下方ボリュームの頂面を取り囲み易くする。

【００７２】アッセイ中、各サイト６３０の上方ボリューム（上のウエル）６９３および下
方ボリューム（下のウエル）６９２は、化学物質および／又は、図6bおよび図6a
の断面図の斜線により示された懸濁状態の生物学的細胞を含んだ溶液で満たされ
る。各上方ボリューム６９３内の溶液の表面張力は、疎水性マスクのペア６２５
および６５５と一緒になって、上方ボリュームに溶液を閉じこめるとともに、上
方ボリュームを取り囲み分離する空間６９７を創り出す。下方ボリューム６９２
のリム６８５に固定されている疎水性コーテイング６８６は、膜６５１の下側６
５２上の疎水性マスク６５４で封をするようなシールドを形成する。膜６５１は
、下方ボリューム溶液を閉じこめる下方ウエル６９２のリム６８５上、又は、そ
れと対向するよう位置し、保持される。マイクロプレート６９０のウエルの平ら
な透明底面６８２は、光がそこを通じて６９２に出入りすることができる光学的
に優れた平面である。

【００７３】図7a1および図7b1は、１、５３６個のアッセイサイトを有するＣＡＡ装置７０
０の平面図および側面図をそれぞれ示す。本実施形態において、アッセイサイト
７３０は、標準のマイクロプレート（５．０３０インチｘ３．３６５インチ）の
使用面積(footprnt)内に３２ｘ４８のアレイが配列されている。この装置７００
は、上方剛性フレーム７２０、中間剛性フレーム７５０および下方剛性フレーム
７８０の三つの剛性部品から構成されている。上方剛性フレーム７２０は、透明
フィルム７２１に接着されている。また、中間剛性フレーム７５０は、実質的に
Ｒ−不透明＠Ｐ％膜７５１に接着されている。さらに、下方剛性フレーム７８０
は、透明フィルム７８１に接着されている。アッセイサイト７３０のそれぞれは
、図7bに示すように、上方ボリューム７９３および下方ボリューム７９２を有し
ている。

【００７４】図7bは、ＣＡＡ装置７００の一部を示す拡大断面図である。上方フイルム７２
１は、その底面７２３に接着された疎水性マスク７２５を有している。膜７５１
は、その頂面７５３に接着された頂面疎水性マスク７５５、および、その底面７
５２に接着された疎水性マスク７５４を有している。下方フィルム７８１は、そ
れに疎水性マスク７８４が接着された頂面７８２を有している。

【００７５】各アッセイサイト７３０は、上方フイルム７２１の透明領域７２７および前記
透明領域７２７を取り囲む底面７２３上の疎水性マスク７２５、膜７５１のオー
プン領域７５６および７５６を取り囲む膜７５１の頂面７５３上の疎水性マスク
７５５、膜７５１の底面７５２上の疎水性マスク７５４、下方フィルム７８１の
透明領域７８６、下方フィルム７８１の頂面７８２上の疎水性マスク７８４、上
方ボリューム７９３ならびに下方ボリューム７９２から構成されている。上方の
気室(air space)７９７および下方の気室７９８が各サイトを取り囲むとともに
分離する。この実施形態においては、ボリィーム７９３および７９２は、０．５
マイクロリットルから２．５マイクロリットルであり、サイト７３０の中央まで
の距離は２．２５ミリメートルである。

【００７６】疎水性マスク７２５および７８４は、半透明であり、上方フイルム７２７およ
び下方フイルム７８６のそれぞれの透明領域を取り囲み、以下の各アッセイサイ
トの真上に位置する。検出ビーム７６０および７６１からのＥＲおよび上方およ
び下方ボリュームにおける蛍光性染料によって発せられたＥＲ７６２および７６
３は、下方透明領域７２７および上方透明領域７８６を通じてそれぞれ出入りす
る。上方フイルム７２１上の検出／定量化装置は、ハウジング７４０、サイト７
３０の頂面７５３および上方ボリューム７９３から発せられたＥＲ７６２を集光
するための光ファイバー束７４２、ならびにサイト７３０の膜の上方ボリューム
７９３および頂面７５３に対して励起ＥＲ７６０を伝送するための他の光学経路
(conduit)７４４から構成されている。下方フイルム７８１下の検出／定量化装
置は、カウジング７４１、サイト７３０の下方ボリューム７９２から発せられた
ＥＲ７６３を集光するための光ファイバー束７４３、ならびにサイト７３０の膜
の下方ボリューム７９２および底面７５２に対して励起ＥＲ７６１を伝送するた
めの他の光学経路７４５から構成されている。

【００７７】三つの剛性フレーム７８０、７５０および７２０間のインターフェースは、気
体交換(gas exchange)のために密閉してもよいし、アッセイが必要としない場合
は密閉しなくてもよい。ほとんどの細胞ベースアッセイにおいては、酸素および
二酸化炭素の拡散を抑制しすぎることなく過度の蒸発を防ぐため、空気流を最小
にする必要がある。これを達成するには、オープンセル形式(open cell form)の
薄い膜をフレーム間に位置させること、フレーム間に複数の小さなチャネルを設
けること、膜７２１および／または７８１用に適切なガス交換率を有するフィル
ム素材を用いること、テストサイト間の膜７２１および／または７８１に顕微鏡
でしか見えない程度の穴(microscopic holes)を設けること、または適切なガス
交換率を得るため、テストサイトの７２１および／または７８１に顕微鏡でしか
見えない程度の孔を十分に設けること、を含めて多くの方法がある。

【００７８】半透明膜の製造のために用いられる適切なフィルムが得られる素材には、プラ
スチック、有機物質、金属、ガラスセラミックおよびこれらの組み合わせを含ん
でいる。本発明の半透明膜の好ましい実施形態においては、様々な波長範囲で当
該膜を半透明にし、セル活性アッセイに用いられるセル識別用の染料の蛍光励起
と放出帯域とを一致させる様々な染料を含むポリエステルフィルムが用いられる
。上述の実施形態のサイクロトロン照射(cyclotron bomberdment)およびエッチ
ング技術で製造されるものには、エッチング可能な素材を用いることが必要であ
る。ポリエステルおよびポリカーボネートは、非常に優れたエッチング特性を有
しており、広く用いられている。ポリエステルは、一旦製造した後、染料をフィ
ルム内に混入させるのが容易なのでポリカーボネートよりも好ましい。こうして
、ベースフィルムに染料を混入させてポリカーボネートフィルムが構成されるが
、このフィルムの他の特性、特に厚みが均一でないので、フィルム材料としては
余り好ましくない。

【００７９】膜を半透明にする他の方法には、金属膜をプラスチックフィルムおよび／また
は膜上にコーテイングまたは堆積させることがある。かかる製造方法には、利益
と不利益がある。例えば、染色済みのほぼ不透明な膜を用いると、孔内の反射を
によっていくらかの光が孔を通過する。しかし、細胞活性アッセイに用いられる
標準的な検出／数値化システムは、それを測定できるほど感度がよくないので、
通過する光の量は、非常に小さいく実用上問題とはならない。しかし、膜が金属
原子でコートされている場合、孔の内表面は、非常に反射しやすくなっている。
このことは、Ｐが９９．９％の実質的にＲ−不透明＠Ｐ％膜を製造しようとする
目的とは反するものである。さらに、堆積されたコーテイングは、アッセイにお
いて用いられる細胞の活性を阻害又はそれに影響を与えてはならない。

【００８０】細胞アッセイ装置を用いた方法上記図6aから図6cに図示された本発明の実施形態を用いた方法において、測定
対象の細胞は、膜の一方側に配置され、細胞活性におよぼす溶液の影響アッセイ
しようとするその溶液は、前記膜の正反対の側に配置される。本実施形態の好ま
しい膜は、ほぼＲ−不透明＠Ｐ％膜である、ここで、Ｒは４００ナノメーターか
ら５８０ナノメーターで、Ｐ％は、９９．９％で、膜厚は、３１ミクロンであり
、孔の直径が８ミクロンであり、オフアクシス孔の入り口(incodent)の角度範囲
は、４４度から４６度の間である。励起に４８５ナノメーターのＥＲを有するＣ
ＡＡ装置およびサイト内細胞によって発せられたＥＲ用の５３０ナノメーター検
出／数値化システムを用いると、膜の反対側の細胞の励起／検出／数値化システ
ムからの貢献度は、任意のサイトのカウント数の０．０００５％未満である。か
かる膜は、平方センチ当たり１ｘ１０^３から２ｘ１０^９の範囲の孔密度、１から
１０００ミクロンの膜厚、約１５度から７０度の入口角度を持った孔を有するも
のであってもよい。

【００８１】以下に、ＣＡＡ装置６００を用いた他の方法又はそれと同様の方法を説明する
。

【００８２】方法Ｉ方法Ｉは、以下のステップを備えている：１．約８４個の下方ボリューム（ウエル）６９２を、３０マイクロリットル
の試験溶液で満たす、すなわち、ポジテイブコントロール、ネガテイブコントロ
ール又は、未知コントロールである。

【００８３】２．残りの、下方プレート６８０の約一列を、前記検出／数値化システムの最
低感度又はその少し下まで低下させる段階的希釈(serial dilusion)を行うよう
２５マイクロリットルの細胞懸濁液(cell suspension)で満たす。これにより、
テストサイトの下方ボリュームの読み取りが読み取り行われた場合のエラーの補
償基準が設定される。

【００８４】３．フレームにしっかり取り付けられた膜６５０／６５１は、マイクロプレー
トに位置し、そこに取り付けられる。

【００８５】４．テストサイトのうち約８４個の上方ボリューム６９３において膜６５１の
頂面に約２５マイクロリットルの細胞懸濁液が、滴下される。ステップ２のよう
に、段階的希釈が行われている約２５マイクロリットルの同じ細胞懸濁液が、残
りの上方サイトに滴下される。

【００８６】５．蓋６２０／６２１がＣＡＡ装置に置し、そこに取り付けられる。

【００８７】６．自動蛍光読み取り機(automatic fluorescence rreader)が、組み立てられ
たＣＡＡ装置６００ならびに各サイトにおけるＵ_１およびＬ_１の読み取りのため
に用いられる。かかるデータは、後に行われる比較、補償、および演算のため、
メモリに記憶される。

【００８８】７．ＣＡＡ装置６００は、適切な温度および湿度で（例えば、人間用ＣＡＡの
場合、３７℃で９８％の相対湿度が、通常適切である）ならびに、特定細胞活性
のアッセイのため適切な時間間隔で、インキュベートされる。この間隔は、通常
、１５分から４８時間の間である。光学的インキュベーションの長さは、力学計
算を行うこと(doing kinetics)または異なるインキュベーション時間による連続
的実験を行い、次に、最善の実験結果を得られるインキュベーション時間を選択
することにより決定される。細胞活性アッセイにおいて、このことは、通常、ネ
ガテイブコントロールサイトにおける計測値間の差とポジテイブコントロールサ
イトにおける計測値間の差が最大化されることを意味する。しかし、ＨＴＳにお
いては、インキュベーション時間が長ければ長いほど、アッセイが高価になるの
で、最良のインキュベーションを短くせざる得ない。これは、ネガテイブコント
ロールサイト、ポジテイブコントロールサイト、および検査される化学物質を有
するサイト間に著しい差が存在するかどうかを決定するための最短時間である。

【００８９】８．ＣＡＡ装置６００が、インキューベーターから取り除かれ、ステップ（６
）で説明したように、第二の時間ならびに各サイトにおけるＵ_２およびＬ_２を読
み出し、係るデータをコンピュータのメモリに記憶する。

【００９０】９．コンピュータは、ステップ６およびステップ８において集めたデータから
ｃｍｃ、ｃｍｃのパーセント、ｐｍｃ、ＰＭＣのパーセント、ｍｃ、およびｍｃ
のパーセントを算出する。コンピュータは、細胞懸濁液を段階的に希釈させた列
サイトから集めたデータを用いて検出／数値化システムのエラーを補償すること
もできる。次に、コンピュータは、両端サイト(replicatesite)の各セット用に
上述の数値の平均値を算出し、ポジテイブサイトのセット、ネガテイブサイトの
セットおよび未知サイトのセットを比較した全アッセイの結果を集計する。また
、コンピュータは、アッセイ用にＣＶを算出する。こうして算出された結果は、
後の分析に利用可能である。

【００９１】方法ＩＩ方法ＩＩは、方法Ｉと同じステップを備えており、さらにステップ７の後に行
われるステップ7aをさらに備えている； 7a. 例えば、２５４ナノメーターの短波長のＥＲを照射することにより上方
ウエル内の細胞を全て死滅させるか、装置内の全ての細胞を死滅させ、（２）蓋
６２０／６２１を取り除き、フィルム６２１の底表面６２３上の各サイトに約１
０マイクロリットルの溶液を有し、細胞を素早く死滅させる他の蓋に置き換え、
又は（３）これと等価の方法を行うことによりこれを達成する。

【００９２】方法ＩＩＩ方法ＩＩＩは、方法Ｉと同じステップを備えており、さらにステップ７の後に
行われるステップ７ｂをさらに備えている； 7b. 以下の事を行うことにより、上方ウエル内又は装置内の全ての細胞を不
活性化させる(immobilize)：（１）細胞を凍結させる（通常、装置全体を凍結さ
せる事により達成される）、（２）細胞（又は装置）の温度を０℃から４℃の間
に急激に低下させ、（３）蓋６２０／６２１を、例えば、４ミリモル(millimola
r)のＥＤＴＡ等の細胞を不活性にするフィルム６２１の下方表面上の全てのサイ
トに固定されている液を有する他の蓋と置き換え、又は（４）これと等価の方法
を行うことによりこれを達成する。

【００９３】細胞活性が急激すぎ、異なるテストサイトで細胞が活性化する時間の差により
結果の精度が低下する(compromised)ような場合、方法ＩＩおよび方法ＩＩＩは
、方法Ｉよりも好ましい。このことは、インキュベーション時間が短い、例えば
、３０分未満であり、検出／数値化時間が長い、例えば、１０分である場合に特
に顕著である。ＨＴＳ用および超ＨＴＳ用に沢山のサイト（例えば、１５３６サ
イトおよび３４５６サイトと）を有する場合、正確な結果を得るため、細胞を死
滅あるいは不活性化させなければならない。

【００９４】方法ＩＶから方法ＶＩ方法ＩＶは、方法Ｉを簡略化したものである。この方法において、ステップ（
６）を除き、方法Ｉの全てのステップが実行される。これにより、かかる方法に
おいて、上方および下方ウエルからの放射読み取り値(readings of the emissio
ns)は、一度だけしか得られない。

【００９５】方法Ｖは、方法Ｉを簡略化したものであり、方法ＶＩは、方法ＩＩＩを簡略化
したものである。すなわち、上述したように、ステップ（６）の読み取りは行わ
れない。

【００９６】簡略化されていない方法と比べ、これらの簡略化法ＩＶからＶＩは十分なデー
タを出力せず、かかるデータから抽出された情報は十分でもないし、重要性も低
いが、いくつかのスクリーニング状況では十分である。かかる簡略化法は、方法
Ｉから方法ＩＩＩに比べ、高速で、しかも安価であるという利点がある。

【００９７】方法ＶＩＩ方法ＶＩＩは、本質的な方法の集合である。方法ＶＩＩは、方法Ｉから方法Ｖ
Ｉのすべてを備えており、Ｒ−不透明＠Ｐ％膜を有する装置を用いているが、実
質的にはＲ−不透明＠Ｐ％ではない。すなわち、この方法の集合に用いられてい
る膜は、最新鋭の検出／数値化システムにより用いられるような、ほぼ垂直のＥ
Ｒを許容する孔を有し、膜をそのまま貫通させるものである。これにより、感度
は低下するが、いくつかのＣＢＨＴＳ状況下においては、方法Ｉから方法ＩＩＩ
と比較すると適切な結果が得られる。

【００９８】方法ＶＩＩＩ方法ＶＩＩＩは、他の方法の集合である。かかる方法は、上記で開示し、図7a1
, 7a2、7bおよび7cに示されているようなＣＡＡ装置を用いている。これらの方法
において、方法Ｉから方法ＶＩＩまでの最初の五つのステップは、以下のように
変更される： 1a. 様々な制御溶液(control solutions)、ポジテイブおよびネガテイブ、なら
びにテスト溶液、例えば、走化性要因(chemotatic factors)、が冷たい状態で準
備される。これらの溶液は、約２０℃から４０℃の間の温度でゲル化させるため
、アッセイの細胞と互換性のある、十分な割合のコラーゲン(collagen)、ゼラチ
ン(gelatin)、ファイバーネクチン(fibernectin)、ラマニン(lamanin)または他
の適切なゲル形成材料を含んでいる。これらの溶液は、約４℃から１０℃に置か
れている場合にはゲル化しないので、予め４℃で貯蔵することで準備することが
できる。２０℃から３７℃に達すると、これらの液はゲル化してしまう。ゲル化
剤の温度、ペーハー値、および濃度は、ゲル化するのに要する時間量によって決
定される。これらのパラメーターは、一定の制限内で、都合にあわせて操作する
ことができる。例えば、１ミリリットルのＤＭＥＭバッファ中の、約１００μグ
ラムタイプＩのコラーゲンであってペーハー値が７．２のものは、多くの細胞活
性アッセイ用に適切な溶剤である（臨床癌研究、Vol. 5, 1999年３月、M.E.スタ
ーンス等を参照のこと）。

【００９９】テストされる化合物と混合したゲル形成化合物を含む０．５μリットルから２
．５μリットル間の低温溶液と同量（例えば、ポジテイブコントロール（既知の
走化性要因）、追加化合物の無いネガテイブコントロール、および未知のもの）
は、テストサイト７３０の下のボリュームの底面を定める疎水性マスク７８４に
よって取り囲まれる下方フィルム７８１の頂面７８２上にピペッテイングロボッ
ト（例えば、コネチカット州、ブルックフィールドのサイバーラボ社のモデルＣ
−３００またはモデルＣ−４００）を用いてピボットされる。使用可能な１５３
６個のうち約１５００個のサイトにピボットがなされる。液の水滴が、フィルム
７８１に付着し、頂面７８２から１．０ｍｍから１．７ｍｍ上昇する。疎水性マ
スクは、細胞活性テストサイトを視覚的に定め、テスト溶液の横方向への移動を
阻止する。

【０１００】 2a. 残りのテストサイトは、段階的希釈が行われている細胞懸濁液で満たされ
るが、この場合、ステップ（1a）と同量が用いられる。システムの様々な部品の
エラーの検出を促進するとともに、かかるエラーを補償するため、他の種類のコ
ントロールおよび調整溶液、例えば、蛍光性染料、を装置の様々な場所に置くこ
ともできる。

【０１０１】 3a. フレームにしっかり取り付けられた膜７５０／７５１は、下のフレームに
取り付けられた膜７８０／７８１上に位置するとともに、それに取り付けられる
。位置決めまたは取り付け金具または接着剤は、装置の下方と中間部品とを一緒
にし、固定する。膜と底のフィルム間の最終的な距離は、下方フィルム上の溶液
が膜７５１の下表面７５２に接し、それを濡らすように、フレームの一部である
、下方フィルム７８２の頂面と膜７５２の底面間の厚みによって決定される。そ
の範囲内で低い方のボリュームを所望する場合、かかる距離は短くなるが、反対
の場合もありうる。

【０１０２】 3b. 一つになったこれら二つの部品７８０および７５０は、溶液をゲル化させ
るために、取っておかれ、または、１０分から９０分の間インキュベーター内に
置いておかれる。

【０１０３】 4a. 次に、０．５マイクロリットルと２．５μリットルの間の細胞懸濁液が、
の膜７５１の頂面７５３上の約１５００個のサイト上に滴下される。しかし、こ
の場合、段階的希釈が行われているサイトおよびコントロールおよび調整溶液を
有する他のサイトに、細胞懸濁液が滴下されることはない。これは、ＣＡＡ装置
６００と異なり、ＣＡＡ装置７００においては下方ウエルにおけるこれらのサイ
トの溶液が、膜の底面側７５４と接触するからである。

【０１０４】 5a. 次に、蓋７２１／７２０は、フレームに取り付けられた膜７５０／７５１
上に位置するとともに、取り付け金具または接着剤によって固定された前記二つ
の下方部品上に置かれる。上法フィルム７２１の下面７２３は、約１５００個の
ボリューム内の細胞懸濁液と接触し、装置の三つの剛性部品７２０、７５０およ
び７８０がユニット７００を構成する。

【０１０５】本手順のこの時点で、方法Ｉから方法ＶＩＩＩのいずれかにおいても、（上述
の）ステップ（６）から始まる工程についてハードウエアの必要に応じて変更を
加えるようにしてもよい。例えば、動蛍光読み取り機の検出ビーム発生器(detec
tor beams)は、サイトの上方および下方ボリュームから発せられた光を集め、そ
の量を測定する集光システム(optical collection system)よりも小型でなけれ
ばならない。

【０１０６】上述の方法においては、各サイドにおいて、(a)ピペットされた細胞の数、(b)
膜を通じて移動した細胞の数、(c)移動していない数、(d)膜内に移動しているが
、それを通過していない数、および(e)移動総数、の検出および数値化を可能に
するため装置６００、７００、又はそれに近似した装置を用いている。このデー
タから、いずれのサイトから移動した細胞の割合とともに、そのサイトの膜を通
過した細胞の割合をも算出することができる。この結果は各サイトごとに算出す
ることが可能なので、ピペットにより生じるエラー（量のばらつき）および各ボ
リューム内への細胞の不均等な分配によるエラーの両方を除去することができる
。

【０１０７】装置６００または装置７００において用いられるほぼＲ−不透明＠Ｐ％膜が、
図４ｂおよび図４ｃで開示された方法により製造されている場合、サイトからサ
イト間の孔の数を完全に均一にすることができるので、ＣＶを更に減少させるこ
とが可能となる。

【０１０８】方法ＶＩＩＩが、Ｒ−不透明＠Ｐ％膜といっているが、実質的にＲ−不透明＠
Ｐ％ではない膜を採用したＣＡＡ装置を用いた場合でも、いくつかのＣＢＨＴＳ
状況下で、適切な結果が得られる。これらの結果は、(a)孔密度が非常に低く、(
b)孔の直径の大きい、(c)膜厚が薄い、および(d)細胞密度の低い、ものを用いる
ことが好ましいアッセイを含んでいる。また、このシステムは、非常に低いバッ
クグランド蛍光性(background fluorescence)を有していなければならならず、
検出／数値化システムは、非常に高い感度を有しなければならない。かかる状況
において、検出システムは、細胞が孔を通って移動する場合に、かかる細胞を検
出する。例えば、セロミックス社（ペンシルバニア州、ピッツバーグ）により、
このことを達成するような新たな検出機器であって、解像度の高い光学システム
が開発されている。この状況において、いくつの細胞が膜を通過して移動したか
を測定することはできないが、孔を介していくつ移動したかは測定することが出
来る。かかるアッセイは、珍しく、高価である。このようなＣＢＨＴＳ状況が、
存在する場合、これに用いられる方法は、多分、細胞活性の運動(kinetics)に関
するデータを取得し、かかる方法は、上述したものとは異なる。

【０１０９】上述の全ての方法は、ＣＡＡ装置の下方ウエル内に細胞が挿入されるよう変更
することができる。例えば、方法ＶＩＩＩにおいて、上述のように、細胞を、ゲ
ル化していないゲル溶液(ungelled gel solution)として保留(suspended)してお
き、膜の底面が反転した場合、膜の底面上のサイトに滴下することができる。反
転したフレーム取り付け下方フィルム(inverted lower framed film)は、次に、
反転したフレーム取り付け膜(inverted framed membrane)上に位置すると共にそ
れに取り付けられる。溶液がゲル化すると、装置は、反転し、テスト溶液および
コントロールが膜の上方サイトに滴下され、次に、フレーム取り付け上方フィル
ムが位置し、取り付けられる。こうして、細胞は、フィルターを通じて上に移動
する。装置の相違に適合する変更を行うことにより、６００に近似するＣＡＡ装
置を用いて同様の結果を得ることができる。

【０１１０】本明細書中で説明した実施形態に関し、上記の開示を考慮に入れて様々な変更
を加え、改良を行うことは、当業者にとって自明のことである。例えば、既存の
ものに代わる新しいＣＡＡ装置において、各サイトが、ウエルを上方チャンバー
および下方チャンバーに分割する挿入物(an insert)を有するウエルである。こ
のようなＣＡＡ装置において、挿入物は、プレートの形になるよう一緒に接着さ
れる。かかる挿入物は、本発明の膜を組み込む。

【０１１１】他の例としては、特定の場合、細胞サンプルおよび当該サンプル液内の化学物
質間、または膜を介しての細胞の移動後に溶液内に混合された化学物質の化学的
な相互作用が、ＥＲビームを導入すること無く検出可能な光を生成する。かかる
場合に、化学物質が膜の反対側のチャンバー内に拡散していると、移動しない細
胞により発せられるＥＲの通過を阻止するため、角度を付けて孔を設けなければ
ならなくなる。さらに、本発明は、サンプルが液体培地(liquid medium)でなく
てもよいアッセイをも含み、導入され検出されたＥＲの波長に対し、膜がほぼ不
透明である限り、例えば、気体培地(gas medium)によって運ぶようにしてもよい
。

【０１１２】前記の実施形態の開示および本発明の方法は、図示および説明の目的でなされ
たものであり、本発明を、開示されたものと同じ形式のものに完全に限定するこ
とを意図するものではない。本発明の範囲は、添付した特許請求の範囲およびそ
の均等物のみによって決められる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、正確に垂直なＥＲによる本発明の一つの膜の一部分の切断面の略図で
ある。

【図２】図２は、β−ノーマルＥＲによる本発明の膜の一部分の切断面の略図である。

【図３】図３は、曲線状の（ｃｕｒｖｅｄ）孔（ｐｏｒｅｓ）及びノーマルなＥＲによ
る本発明の膜の一部分の切断面の略図である。

【図４ａ】図４ａは、フィルムのウェブ（ｗｅｂ）及びエキシマレーザーによる本発明の
膜の作製プロセスの略図である。

【図４ｂ】図４ｂは、フレームされたフィルム及びエキシマレーザーによる本発明の膜の
作製プロセスの平面図の略図である。

【図４ｃ】図４ｃは、フレームされたフィルム及びエキシマレーザーによる本発明の膜の
作製プロセスを示す図４ｂの側面図である。

【図４ｄ】図４ｄは、エキシマレーザーによる本発明の曲線状の孔を有する膜の作製プロ
セスの略図である。

【図５ａ】図５ａは、サイクロトロン照射（及びそれに続くエッチング）を用いた、本発
明の膜の第２作製プロセスの側面図の略図である。

【図５ｂ】図５ｂは、サイクロトロン照射を用いた、本発明の膜の第２作製プロセスの平
面図の略図である。

【図６ａ】図６ａは、上述の図で見た本発明の好ましい実施態様で構成されるＣＡＡＡの
略図である。

【図６ｂ】図６ｂは、図６ａの好ましい実施態様の、拡大した切断面の略図の一部分を示
す。

【図６ｃ】図６ｃは、膜の孔を示す図６ａの好ましい実施態様の、さらに拡大した切断面
の一部分の略図である。

【図７ａ】図７ａ_１及び図７ａ_２は、それぞれ、本発明のその他の好ましい実施態様の平
面図及び側面図である。

【図７ｂ】図７ｂは、図７ａ_１及び図７ａ_２で示す本発明の好ましい実施態様の一部分の
、拡大した切断面の略図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷＦターム(参考） 2G043 AA06 BA16 CA04 DA06 EA01 GA07 GB03 HA05 LA01 2G045 AA01 AA24 BB24 BB46 CA01 CB01 FA11 FA29 FB07 FB12 GA01 GC15 GC22 HA14 JA07 4B029 AA07 BB11 CC02 CC07 FA02 FA11 4B063 QA01 QQ08 QR50 QR54 QR69 QS11 QS24 QS36 QS39 QX04

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】膜により分離された少なくとも二つのチャンバーを有しており、細胞活性(cel
l activity)を測定するために電磁放射検出ビームを用いる細胞活性アッセイ(ce
ll activity assay)装置において、前記膜は、第一表面、第二表面、厚みmt、および、直径pdの複数のオフアクシ
ス孔(off-axis pores)を有し、前記オフアクシス孔は、前記膜の前記第一表面に
垂直な線に対して角度αで前記第一表面から前記第二表面へと前記膜を貫通して
いること、を特徴とするもの。
【請求項２】請求項１の細胞活性アッセイ装置において、前記角度αは、約１５度から７０
度であること、を特徴とするもの。
【請求項３】請求項１の細胞活性アッセイ装置において、前記角度αは、電磁放射の検出ビ
ームが前記第一表面に対し正確に垂直となり、前記第一表面と前記第二表面間を
通過しないようにするものであること、を特徴とするもの。
【請求項４】請求項１の細胞活性アッセイ装置において、前記角度αは、角度φより大きく
、その角度φは、式φ＝sin^−１(pd/mt)で定義されるものであること、を特徴とするもの。
【請求項５】請求項１の細胞活性アッセイ装置において、前記角度αは、ある入射角範囲を
有する電磁放射の検出ビームが前記膜の前記第一表面とほぼ垂直に入射しても、
前記第一表面と前記第二表面間を通過しないようにするものであること、を特徴とするもの。
【請求項６】請求項１の細胞活性アッセイ装置において、前記角度αは、角度βと角度θと
の和よりも大きく、角度βは、前記第一表面に垂直な線に対する前記検出ビーム
の最大入射角度であり、角度θは、式θ＝sin^−１ ([pd x cosβ]/mt)で定義
されるものであること、を特徴とするもの。
【請求項７】請求項１の細胞活性アッセイ装置において、さらに、前記膜に取り付けられた
剛性フレームであって、前記膜が剛性フレームにより平らに保持されるようなも
のを備えたこと、を特徴とするもの。
【請求項８】細胞活性を測定するために電磁放射検出ビームを用いる細胞活性アッセイ装置
に用いられる膜であって、第一および第二表面、厚みmt、および、直径pdの複数のオフアクシス孔(off-a
xis pores)を有するフィルムを備え、前記オフアクシス孔は、前記フィルムの前
記第一表面に垂直な線に対して角度αで前記第一表面から前記第二表面へと前記
膜を貫通していること、を特徴とするもの。
【請求項９】請求項１にかかる膜において、前記角度αは、約３度から７０度の間であるこ
と、を特徴とするもの。
【請求項１０】請求項８にかかる膜において、前記角度αは、電磁放射の検出ビームが前記第
一表面に対し正確に垂直となり、前記第一表面と前記第二表面間を通過しないよ
うにするものであること、を特徴とするもの。
【請求項１１】請求項８にかかる膜において、前記角度αは、角度φより大きく、その角度
φは、式φ＝sin^−１(pd/mt)で定義されるものであること、を特徴とするもの。
【請求項１２】請求項８にかかる膜において、前記角度αは、ある入射角範囲を有する電磁放
射の検出ビームが前記膜の前記第一表面とほぼ垂直に入射しても、前記第一表面
と前記第二表面間を通過しないようにするものであること、を特徴とするもの。
【請求項１３】請求項８にかかる膜において、前記角度αは、角度βと角度θとの和よりも大
きく、角度βは、前記第一表面に垂直な線に対する前記検出ビームの最大入射角
度であり、角度θは、式θ＝sin^−１ ([pd x cosβ]/mt)で定義されるもので
あること、を特徴とするもの。
【請求項１４】細胞活性を測定する方法であって、 (a) 第一表面および第二表面を有し、前記第一表面と接触する複数の細胞
を含む第一液体試料と、前記第二表面と接触する第二液体試料を分離する多孔性
の不透明膜を有する細胞活性アッセイ装置を設けるステップと； (b) 細胞活性アッセイ装置をインキュベートするステップと； (c) 第一の波長を有する電磁放射の第一ビームを、前記第一液体試料を介
し前記膜の前記第一表面方向に向けるステップと； (d) 第二の波長を有する放射された電磁放射の第一の量を測定するステッ
プと； (e) 第一の波長を有する電磁放射の第二ビームを、前記第二液体試料を介
し前記膜の前記第二表面方向に向けるステップと；および (f) 第二の波長を有する放射された電磁放射の第二の量を測定するステッ
プ；を備えたこと、を特徴とするもの。
【請求項１５】請求項１４の方法において、さらに、初期測定(initilal reading)を行うステ
ップを備え、前記初期測定は、請求項１４のインキュベートステップの前に完了
し、前記初期測定は、 (i) 電磁放射の第一ビームを、前記第一液体試料を介し前記膜の前記
第一表面方向に向けるステップと； (ii) 第二の波長を有する放射された電磁放射の初期第一量を測定する
ステップと； (iii) 電磁放射の第二ビームを、前記第二液体試料を介し前記膜の前
記第二表面方向に向けるステップと；および (iv) 第二の波長を有する放射された電磁放射の初期第二量を測定する
ステップ；を備えたこと、を特徴とするもの。
【請求項１６】請求項１４の方法において、さらに、前記複数の細胞を死滅させるステップを
備え、前記複数の細胞を死滅させるステップは、請求項１４のインキュベートス
テップの後に開始されること、を特徴とするもの。
【請求項１７】請求項１６の方法において、波長の短い電磁放射を一定量前記複数の細胞に照
射することにより前記複数の細胞を死滅させること、を特徴とするもの。
【請求項１８】請求項１７の方法において、前記一定量の電磁放射は、約２００ナノメーター
と約３００ナノメーターの波長を有すること、を特徴とするもの。
【請求項１９】請求項１４の方法において、さらに、前記複数の細胞を不活性化(immobilizin
g)するステップを備えており、前記複数の細胞の不活性化は、請求項１４の前記
インキュベートステップの後に開始されること、を特徴とするもの。
【請求項２０】請求項１９の方法において、前記複数の細胞は、前記複数の細胞の温度を低下
させることによって不活性化すること、を特徴とするもの。
【請求項２１】請求項１９の方法において、前記複数の細胞は、前記第一液体試料に化学物質
を混入させることにより不活性化すること、を特徴とするもの。
【請求項２２】請求項２１の方法において、前記化学物質は、エチレンジアミン4酢酸（ＥＤ
ＴＡ）（ethylenediamine tetraacetic acid）であること、を特徴とするもの。
【請求項２３】請求項１４の方法において、細胞の前記試料は、染料によりラベル付け(label
ed)されること、を特徴とするもの。
【請求項２４】請求項２３の方法において、前記第一の波長を有する前記電磁放射が当たると
、前記第二の波長を有する前記電磁放射を発するように前記染料を選択すること
、を特徴とするもの。
【請求項２５】請求項１４の方法において、前記膜は、厚みｍｔを有し、前記複数のオフアク
シス孔は直径pdを有しており、であり、前記メッセージを前記送信機に送信する
こと、前記複数のオフアクシス孔は、前記膜の前記第一表面に垂直な線に対して
角度αで前記第一表面から前記第二表面へと前記膜を貫通しており、前記角度α
は、角度βと角度θとの和よりも大きく、角度βは、前記第一表面に垂直な線に
対する前記検出ビームの最大入射角度であり、角度θは、式θ＝sin^−１ ([p
d x cosβ]/mt)で定義されるものであること、を特徴とするもの。
【請求項２６】請求項１４の方法において、前記第一の波長は、第一の波長範囲を備えており
；前記第二の波長は、第二の波長範囲を備えていること、を特徴とするもの。
【請求項２７】細胞活性を測定する方法であって、 (a) 第一液を収納するための、上方リムを有する第一チャンバーを設ける
ステップと； (b) 前記第一液体試料を前記第一チャンバーに注入するステップと； (c) 前記上方リムを第一の疎水性化合物(hydrophobic compound)で覆うス
テップと； (d) 下表面、上表面、および前記上表面から前記下表面に前記膜を貫通す
る複数のオフアクシス孔を有する膜を設けるステップと； (e) 第一領域が前記第一チャンバーの前記上方リムと同じサイズかつ同じ
形を有するように前記膜の前記下表面の第一領域を第二の疎水性化合物で覆うス
テップと； (f) 前記第一の疎水性化合物と前記第二の疎水性化合物が近接するよう前
記膜で前記第一チャンバーに蓋をするステップと； (g) 前記膜の上表面を、前記膜の第二領域を取り囲む第三の疎水性化合物
で覆い、これにより、複数の細胞を有する第二液体試料を収納するための第二チ
ャンバーステップが前記第一チャンバーとは正反対に形成されるステップと； (h) 前記第二液体試料を前記第二チャンバーに注入するステップと； (i) 前記第一液体試料および前記第二液体試料を収納する前記第一チャン
バーおよび第二チャンバーをインキュベートするステップと； (j) 前記膜の前記第一表面に対し第一ビームがほぼ垂直になるような入射
角範囲を有する第一波長の電磁放射の前記第一ビームを前記第一チャンバー方向
に向けるステップと；および (k) 第二の波長を有する放射された電磁放射の第一量を測定するステップ
；を備えたこと、を特徴とするもの
【請求項２８】請求項２６の方法において、さらに、さらに、前記第二液体試料を前記第二チ
ャンバーに注入するステップの後に前記第二チャンバーを透明フィルムで覆うス
テップを備えたこと、を特徴とするもの。
【請求項２９】請求項２７の方法において、前記第二チャンバーを覆う前記透明膜は、前記第
二液体試料と接触する下表面を有すること、を特徴とするもの。
【請求項３０】請求項２６の方法において、前記複数の細胞は、染料によりラベル付け(label
ed)されること、を特徴とするもの。
【請求項３１】請求項２９の方法において、前記第一の波長を有する前記電磁放射が当たると
、前記第二の波長を有する前記電磁放射を発するように前記染料を選択すること
、を特徴とするもの。
【請求項３２】請求項２６の方法において、前記膜は、前記検出ビームが前記第一表面と前記
第二表面の間を通過することを防止すること、を特徴とするもの。
【請求項３３】請求項２６の方法において、前記膜は、厚みｍｔを有し、前記複数のオフアク
シス孔は直径pdを有しており、であり、前記メッセージを前記送信機に送信する
こと、前記複数のオフアクシス孔は、前記膜の前記第一表面に垂直な線に対して
角度αで前記第一表面から前記第二表面へと前記膜を貫通しており、前記角度α
は、角度βと角度θとの和よりも大きく、角度βは、前記第一表面に垂直な線に
対する前記検出ビームの最大入射角度であり、角度θは、式θ＝sin^−１ ([p
d x cosβ]/mt)で定義されるものであること、を特徴とするもの。
【請求項３４】請求項２６の方法において、さらに、初期測定を行うステップを備え、前記初
期測定は、請求項２６のインキュベートステップの前に完了し、前記初期測定は
、 (a) 前記膜の前記第上表面に対し第二ビームがほぼ垂直になるような
入射角範囲を有する第一波長の電磁放射の前記第二ビームを前記第二チャンバー
方向に向けるステップ；および (b) 第二の波長を有する放射された電磁放射の初期第一量を測定する
ステップ；を備えたこと、を特徴とするもの。
【請求項３５】細胞活性アッセイ装置に用いられる膜を構成する方法であって、 (a) エキシマレーザー装置により放射された２００ナノメーターから
４００ナノメーターの波長を有するレーザービームであって、マスクに当たると
複数の分散したビームになるレーザービームをフィルム方向に向けるステップと
； (b) フイルムに垂直な線に対して、１５度から７０度の間の角度αで
前記フィルム材上に前記複数の分散ビームの焦点を合わせるステップと；および (c) 除去法(ablation)によって前記フイルムを貫通する孔を形成する
ステップ；を備えたこと、を特徴とするもの。
【請求項３６】請求項３４の方法において、前記孔の直径は、１から１４ミクロンであること
、を特徴とするもの。
【請求項３７】請求項３４の方法において、前記膜における前記孔の密度は、平方センチ当た
り１ｘ１０^３から２ｘ１０^７の範囲であること、を特徴とするもの。
【請求項３８】請求項３４の方法において、前記膜は、所定の波長範囲において半透明である
こと、を特徴とするもの。
【請求項３９】細胞活性アッセイ装置に用いられるまっすぐなオフアクシス孔を有する膜を構
成する方法であって、高いエネルギーが蓄積された粒子の流れをフィルムに照射するステップと；前記高エネルギー蓄積粒子の流れを、前記フィルムに垂直な線に対して角度α
で前記フィルムに衝突させ、これにより、破壊されたポリマーの軌跡を作るステ
ップと；および前記破壊されたポリマーの軌跡をエッチングし、これにより、膜内にまっすぐ
なオフアクシス孔を形成するステップ；を備えており、前記角度αは、約１５度から７０度であること、を特徴とするもの。
【請求項４０】請求項３８の方法において、前記膜は、所定の波長範囲において半透明である
こと、を特徴とするもの。