JP2002535970A - イソプレノイド発現の操作 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
メバロン酸非依存イソペンテニル二リン酸合成経路を有する細胞または生物中でのイソプレノイド発現を操作する方法であって、酵素の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＰＳ）、またはその機能的等価物、誘導体または生合成前駆体の活性を変えることを含む方法が開示される。メバロン酸非依存ＩＰＰ生合成経路を有し、ＤＸＰＳまたはその機能的等価物、誘導体または生合成前駆体を発現しうる少なくとも１つの導入遺伝子を含むトランスジェニック細胞、組織または生物もまた開示される。
Description
【０００１】 （技術分野） 本発明は、天然のすべてのイソプレノイドの普遍的な前駆体であるイソペンテ
ニル二リン酸（ＩＰＰ）をメバロン酸非依存（independent）経路で生合成する
細胞または生物中でのイソプレノイド発現の操作または変更に関する。
ニル二リン酸（ＩＰＰ）をメバロン酸非依存（independent）経路で生合成する
細胞または生物中でのイソプレノイド発現の操作または変更に関する。
【０００２】 （背景技術） イソプレノイドは、天然に存在する天然産物の最大のクラスを構成しており、
今日まで２９,０００を超える個々の化合物が同定されている［１］。化学的に
は、イソプレノイドはその構造および複雑さの点で極めて多様である。イソプレ
ノイドによって発揮される基本的な生物学的機能は、すべての生物における正常
な発育および分化プロセスにイソプレノイドが必須であることを確実にしている
。これら基本的な機能には、真核生物の膜の安定化剤（ステロール）、植物ホル
モン（ジベレリンおよびアブシジン酸）、光合成色素（カロテノイドおよびクロ
ロフィルのフィトール側鎖）の提供、および電子伝達の担体（メナキノン、プラ
ストキノンおよびユビキノン）としての機能が挙げられる。
今日まで２９,０００を超える個々の化合物が同定されている［１］。化学的に
は、イソプレノイドはその構造および複雑さの点で極めて多様である。イソプレ
ノイドによって発揮される基本的な生物学的機能は、すべての生物における正常
な発育および分化プロセスにイソプレノイドが必須であることを確実にしている
。これら基本的な機能には、真核生物の膜の安定化剤（ステロール）、植物ホル
モン（ジベレリンおよびアブシジン酸）、光合成色素（カロテノイドおよびクロ
ロフィルのフィトール側鎖）の提供、および電子伝達の担体（メナキノン、プラ
ストキノンおよびユビキノン）としての機能が挙げられる。
【０００３】 すべてのイソプレノイドは、共通する代謝前駆体であるイソペンテニル二リン
酸（ＩＰＰ；Ｃ５）を経て合成される。最近まで、ＩＰＰの生合成は一般にアセ
チルＣｏＡから古典的なメバロン酸経路を経てのみ進行すると思われていた（図
１）［２］。酵素の３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａレダクター
ゼ（ＨＭＧＲ）はヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡのメバロン酸への変換を触
媒するが、これはメバロン酸に依存したＩＰＰ生合成経路の鍵となる反応である
。最近の研究は、メバロン酸がすべての生物においてＩＰＰの生合成の前駆体で
あるわけではないことを示している［３,４］。ＩＰＰ生成のための別のメバロ
ン酸非依存経路の存在が、最初に真正細菌［４,５］および緑藻［６］の幾つか
の種で同定された。この経路はその後、高等植物のプラスチドでも機能している
ことが示された［７−１０］。非メバロン酸経路の最初の反応は、ピルビン酸と
Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸とがトランスケトラーゼタイプの縮合反応
をして１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）を生成するもの
である（図１）。この反応は、酵素の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リ
ン酸シンターゼにより触媒される。この経路の第二の反応は、ＤＸＰの２−Ｃ−
メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸（ＭＥＰ）への変換である。ＭＥＰを
ＩＰＰに変換する反応は未だ特徴付けられていない。
酸（ＩＰＰ；Ｃ５）を経て合成される。最近まで、ＩＰＰの生合成は一般にアセ
チルＣｏＡから古典的なメバロン酸経路を経てのみ進行すると思われていた（図
１）［２］。酵素の３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａレダクター
ゼ（ＨＭＧＲ）はヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡのメバロン酸への変換を触
媒するが、これはメバロン酸に依存したＩＰＰ生合成経路の鍵となる反応である
。最近の研究は、メバロン酸がすべての生物においてＩＰＰの生合成の前駆体で
あるわけではないことを示している［３,４］。ＩＰＰ生成のための別のメバロ
ン酸非依存経路の存在が、最初に真正細菌［４,５］および緑藻［６］の幾つか
の種で同定された。この経路はその後、高等植物のプラスチドでも機能している
ことが示された［７−１０］。非メバロン酸経路の最初の反応は、ピルビン酸と
Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸とがトランスケトラーゼタイプの縮合反応
をして１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）を生成するもの
である（図１）。この反応は、酵素の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リ
ン酸シンターゼにより触媒される。この経路の第二の反応は、ＤＸＰの２−Ｃ−
メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸（ＭＥＰ）への変換である。ＭＥＰを
ＩＰＰに変換する反応は未だ特徴付けられていない。
【０００４】 ＤＸＰシンターゼ（ｄｘｐｓ）遺伝子のクローニングおよび特徴付けは、大腸
菌［１１,１２］および高等植物［１３−１５］を含む幾つかの生物で記載され
ている。たとえば、葉緑体の発生に関連するArabidopsis thalianaからのＣＬＡ
１遺伝子産物［１６］がＤＸＰＳ活性を呈することが示されている［１１］。最
近、非メバロン酸経路における次段階であると提唱されているＤＸＰの２−Ｃ−
メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸への還元を担う遺伝子が大腸菌からク
ローニングされた［１７］。
菌［１１,１２］および高等植物［１３−１５］を含む幾つかの生物で記載され
ている。たとえば、葉緑体の発生に関連するArabidopsis thalianaからのＣＬＡ
１遺伝子産物［１６］がＤＸＰＳ活性を呈することが示されている［１１］。最
近、非メバロン酸経路における次段階であると提唱されているＤＸＰの２−Ｃ−
メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸への還元を担う遺伝子が大腸菌からク
ローニングされた［１７］。
【０００５】 本発明者らは、驚くべきことに、メバロン酸非依存ＩＰＰ生合成経路における
最初の反応が、イソプレノイド（イソプレノイドはメバロン酸非依存ＩＰＰ生合
成経路が存在する細胞または生物で生成し得る）レベルの制御に多大な影響を及
ぼすことを見出した。酵素のＤＸＰＳまたはその機能的等価物が本発明者らによ
ってイソプレノイド生合成の律速段階として認められたのであり、該ＤＸＰＳ活
性は細胞の炭素源をイソプレノイド生合成経路に向けるうえで重要な役割を果た
している。
最初の反応が、イソプレノイド（イソプレノイドはメバロン酸非依存ＩＰＰ生合
成経路が存在する細胞または生物で生成し得る）レベルの制御に多大な影響を及
ぼすことを見出した。酵素のＤＸＰＳまたはその機能的等価物が本発明者らによ
ってイソプレノイド生合成の律速段階として認められたのであり、該ＤＸＰＳ活
性は細胞の炭素源をイソプレノイド生合成経路に向けるうえで重要な役割を果た
している。
【０００６】 （発明の開示） それゆえ、本発明の第一の側面によれば、メバロン酸非依存イソペンテニル二
リン酸合成経路を有する細胞においてイソプレノイド発現を操作する方法が提供
され、該方法は、酵素の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンター
ゼ（ＤＸＰＳ）またはその機能的等価物の活性を変えることを含む。それゆえ、
有利にも、ＤＸＰＳ活性によってＩＰＰ生合成経路に付与される律速効果を利用
して、ＤＸＰＳの活性または発現を変えることによって細胞でのイソプレノイド
のレベルを操作することができる。
リン酸合成経路を有する細胞においてイソプレノイド発現を操作する方法が提供
され、該方法は、酵素の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンター
ゼ（ＤＸＰＳ）またはその機能的等価物の活性を変えることを含む。それゆえ、
有利にも、ＤＸＰＳ活性によってＩＰＰ生合成経路に付与される律速効果を利用
して、ＤＸＰＳの活性または発現を変えることによって細胞でのイソプレノイド
のレベルを操作することができる。
【０００７】 好ましくは、細胞でのイソプレノイドのレベルは、ＤＸＰＳの活性または発現
を増大させることによって高めることができる。同様に、低減したレベルのイソ
プレノイドは細胞または生物でのＤＸＰＳの活性または発現を低減または抑制す
ることによって達成できる。ＤＸＰＳ活性の増大は、たとえば、それ自体が細胞
株または生物の一部である細胞を、当該技術分野で知られたＧＵＳアッセイに用
いるようなリポーター分子に作動可能に有利に連結したＤＸＰＳコード核酸分子
を含む発現ベクターで形質転換することによって達成できる。該ベクターは好ま
しくは、図２に例示してあるようにｐＢＳＤＸＰＳまたはｐＳＹＤＸＰＳと称す
るベクターのいずれかを含んでいる。
を増大させることによって高めることができる。同様に、低減したレベルのイソ
プレノイドは細胞または生物でのＤＸＰＳの活性または発現を低減または抑制す
ることによって達成できる。ＤＸＰＳ活性の増大は、たとえば、それ自体が細胞
株または生物の一部である細胞を、当該技術分野で知られたＧＵＳアッセイに用
いるようなリポーター分子に作動可能に有利に連結したＤＸＰＳコード核酸分子
を含む発現ベクターで形質転換することによって達成できる。該ベクターは好ま
しくは、図２に例示してあるようにｐＢＳＤＸＰＳまたはｐＳＹＤＸＰＳと称す
るベクターのいずれかを含んでいる。
【０００８】 発現を変える別の方法は、エンフォースド・エボルーション（Enforced Evolu
tion）またはＤＮＡシャフリング（DNA Shuffling）として知られる技術を利用
することを含む（Pattenら、Current Opinion in Biotechnology, 1997, Vol. 8
, No. 6, pp724-733, Crameriら、Nature 1998, Vol. 391, No. 6664, pp288-29
1およびHarayama S, Trends in Biotechnology, 1998, Vol. 16, No. 2, pp76-8
2を参照）。この方法によれば、酵素活性の改善は、ＤＮＡセグメントを相同的
組換えまたは部位特異的組換えにより完全長遺伝子に再配置することによって達
成できる。組み立てる前に、これらセグメントはしばしば、誤りの生じやすい（
error prone）ＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他のそのような方法に
よるランダムな突然変異誘発に供される。これら遺伝子は適当な微生物宿主で発
現させてＤＸＰＳなどの機能性のポリペプチドの産生に導くことができる。
tion）またはＤＮＡシャフリング（DNA Shuffling）として知られる技術を利用
することを含む（Pattenら、Current Opinion in Biotechnology, 1997, Vol. 8
, No. 6, pp724-733, Crameriら、Nature 1998, Vol. 391, No. 6664, pp288-29
1およびHarayama S, Trends in Biotechnology, 1998, Vol. 16, No. 2, pp76-8
2を参照）。この方法によれば、酵素活性の改善は、ＤＮＡセグメントを相同的
組換えまたは部位特異的組換えにより完全長遺伝子に再配置することによって達
成できる。組み立てる前に、これらセグメントはしばしば、誤りの生じやすい（
error prone）ＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他のそのような方法に
よるランダムな突然変異誘発に供される。これら遺伝子は適当な微生物宿主で発
現させてＤＸＰＳなどの機能性のポリペプチドの産生に導くことができる。
【０００９】 ＤＸＰＳをコードする核酸は、該核酸を形質転換しようとする細胞または生物
にとって内生のものであってもよいし、または外来のものであってもよい。本発
明の一つの態様において、本方法はまた、所望のイソプレノイドを産生するのに
適した１またはそれ以上の核酸配列を含むベクターで細胞または生物を形質転換
することを含む。本発明のこの側面は特に有利である。なぜなら、イソプレノイ
ド源と無関係に細胞または生物でイソプレノイドを産生させることを可能にする
からであり、イソプレノイド源はメバロン酸非依存ＩＰＰ生合成経路を有しない
細胞または生物からのものであってよいのである。同様に、亢進したレベルのイ
ソプレノイドはメバロン酸非依存ＩＰＰ生合成経路を有する細胞または生物で産
生させることができる。
にとって内生のものであってもよいし、または外来のものであってもよい。本発
明の一つの態様において、本方法はまた、所望のイソプレノイドを産生するのに
適した１またはそれ以上の核酸配列を含むベクターで細胞または生物を形質転換
することを含む。本発明のこの側面は特に有利である。なぜなら、イソプレノイ
ド源と無関係に細胞または生物でイソプレノイドを産生させることを可能にする
からであり、イソプレノイド源はメバロン酸非依存ＩＰＰ生合成経路を有しない
細胞または生物からのものであってよいのである。同様に、亢進したレベルのイ
ソプレノイドはメバロン酸非依存ＩＰＰ生合成経路を有する細胞または生物で産
生させることができる。
【００１０】 それゆえ、細胞が大腸菌の場合は、大腸菌にとっては外来のものであるイソプ
レノイドの産生を操作することが可能であり、該イソプレノイドは、たとえばリ
コペンなどの植物カロテノイドあるいはヒト由来のイソプレノイドであってもよ
いのである。
レノイドの産生を操作することが可能であり、該イソプレノイドは、たとえばリ
コペンなどの植物カロテノイドあるいはヒト由来のイソプレノイドであってもよ
いのである。
【００１１】 カロテノイドは、天然に見出される黄色−オレンジ−赤色の脂質ベースの色素
である。カロテノイドは様々な応用、たとえば、サプリメント、とりわけビタミ
ンサプリメントとして、植物油ベースの食品および食品成分として、動物飼料の
飼料添加物として、および着色剤としての有用性が認められている。フィトエン
は皮膚疾患の治療に有用であることが見出されており、一方、リコペンおよびα
およびβカロテンの消費はある種の癌に対して防御効果があるとされている。そ
れゆえ、そのような化合物の産生の増大を達成でき、そのような化合物が多くの
健康増進の恩恵をもたらし得ることは本発明の非常に有利な側面である。所望の
カロテノイドまたは他のイソプレノイドが大腸菌または上記のような他の適当な
生物で産生されたら、標準バイオ技術を用いて単離することができる。
である。カロテノイドは様々な応用、たとえば、サプリメント、とりわけビタミ
ンサプリメントとして、植物油ベースの食品および食品成分として、動物飼料の
飼料添加物として、および着色剤としての有用性が認められている。フィトエン
は皮膚疾患の治療に有用であることが見出されており、一方、リコペンおよびα
およびβカロテンの消費はある種の癌に対して防御効果があるとされている。そ
れゆえ、そのような化合物の産生の増大を達成でき、そのような化合物が多くの
健康増進の恩恵をもたらし得ることは本発明の非常に有利な側面である。所望の
カロテノイドまたは他のイソプレノイドが大腸菌または上記のような他の適当な
生物で産生されたら、標準バイオ技術を用いて単離することができる。
【００１２】 あらゆる所望のイソプレノイドの濃度の増大が、ＩＰＰ生合成メバロン酸非依
存経路を有する細胞あるいは生物で達成できる。たとえば、増大したレベルのイ
ソプレノイドを産生するように農作物を本発明の方法を用いて操作することがで
き、それによってヒトが植物を消費した後に、たとえばビタミンＥやリコペンな
どの栄養上の恩恵を付与することができる。
存経路を有する細胞あるいは生物で達成できる。たとえば、増大したレベルのイ
ソプレノイドを産生するように農作物を本発明の方法を用いて操作することがで
き、それによってヒトが植物を消費した後に、たとえばビタミンＥやリコペンな
どの栄養上の恩恵を付与することができる。
【００１３】 それゆえ、メバロン酸非依存ＩＰＰ生合成経路を有し、ＤＸＰＳまたはその機
能的等価物またはその生合成前駆体をコードする核酸分子を含む発現ベクターで
形質転換またはトランスフェクションした細胞または生物が本発明のさらなる側
面により提供される。上記のように、該ベクターはまた、所望のイソプレノイド
を産生するのに適した１またはそれ以上のさらなる核酸配列をも含んでいてよく
、あるいは１またはそれ以上の該核酸配列は適当な発現調節配列に作動可能に連
結して別のベクター中に含まれていてよい。特に好ましい態様において、該細胞
または生物は植物を包含する。
能的等価物またはその生合成前駆体をコードする核酸分子を含む発現ベクターで
形質転換またはトランスフェクションした細胞または生物が本発明のさらなる側
面により提供される。上記のように、該ベクターはまた、所望のイソプレノイド
を産生するのに適した１またはそれ以上のさらなる核酸配列をも含んでいてよく
、あるいは１またはそれ以上の該核酸配列は適当な発現調節配列に作動可能に連
結して別のベクター中に含まれていてよい。特に好ましい態様において、該細胞
または生物は植物を包含する。
【００１４】 本発明による発現ベクターは、該ＤＮＡ断片を発現させうるプロモーター領域
などの調節配列に作動可能に連結した核酸配列を有するベクターを包含する。「
作動可能に連結」とは、記載した配列がその意図した仕方で機能することを可能
にする関係にある近接並置（juxtaposition）をいう。そのようなベクターは、
本発明の方法に従って適当な宿主細胞または生物に形質転換してＤＸＰＳまたは
イソプレノイドなどの所望のタンパク質を産生させることができる。それゆえ、
本発明は他の側面において所望のイソプレノイドの製造方法を提供するものであ
り、該方法は、上記発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションした宿
主細胞を、該ベクターによってＤＸＰＳまたはその機能的等価物または所望のイ
ソプレノイドを産生させるための適当なポリペプチドを発現させる条件下で培養
し、ついで発現したポリペプチドを任意に回収することを含む。
などの調節配列に作動可能に連結した核酸配列を有するベクターを包含する。「
作動可能に連結」とは、記載した配列がその意図した仕方で機能することを可能
にする関係にある近接並置（juxtaposition）をいう。そのようなベクターは、
本発明の方法に従って適当な宿主細胞または生物に形質転換してＤＸＰＳまたは
イソプレノイドなどの所望のタンパク質を産生させることができる。それゆえ、
本発明は他の側面において所望のイソプレノイドの製造方法を提供するものであ
り、該方法は、上記発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションした宿
主細胞を、該ベクターによってＤＸＰＳまたはその機能的等価物または所望のイ
ソプレノイドを産生させるための適当なポリペプチドを発現させる条件下で培養
し、ついで発現したポリペプチドを任意に回収することを含む。
【００１５】 該ベクターは、複製起点、任意に該ヌクレオチドの発現のためのプロモーター
および任意に該プロモーターのレギュレーターを有する、たとえばプラスミド、
ウイルスまたはファージベクターであってよい。該ベクターは、たとえばアンピ
シリン耐性などの１またはそれ以上の選択マーカーを含んでいてよい。
および任意に該プロモーターのレギュレーターを有する、たとえばプラスミド、
ウイルスまたはファージベクターであってよい。該ベクターは、たとえばアンピ
シリン耐性などの１またはそれ以上の選択マーカーを含んでいてよい。
【００１６】 発現に必要な調節要素としては、ＲＮＡポリメラーゼが結合するためのプロモ
ーターおよびリボソーム結合のための転写開始配列が挙げられる。たとえば、細
菌の発現ベクターは、ｌａｃプロモーターなどのプロモーターおよび転写開始の
ためのシャインダルガーノ配列および開始コドンＡＵＧを含んでいてよい。同様
に、真核生物の発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのための異種または同
種プロモーター、下流のポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ、およびリ
ボソームの脱離のための停止コドンを含んでいてよい。そのようなベクターは、
市販のものを入手できるし、あるいは記載された配列から当該技術分野でよく知
られた方法によって組み立てることができる。
ーターおよびリボソーム結合のための転写開始配列が挙げられる。たとえば、細
菌の発現ベクターは、ｌａｃプロモーターなどのプロモーターおよび転写開始の
ためのシャインダルガーノ配列および開始コドンＡＵＧを含んでいてよい。同様
に、真核生物の発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのための異種または同
種プロモーター、下流のポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ、およびリ
ボソームの脱離のための停止コドンを含んでいてよい。そのようなベクターは、
市販のものを入手できるし、あるいは記載された配列から当該技術分野でよく知
られた方法によって組み立てることができる。
【００１７】 該ＤＸＰＳをコードする核酸配列および任意にイソプレノイドを産生させるの
に適した１またはそれ以上の配列を組織特異的なプロモーターと組み合わせるこ
とにより、植物の特定の組織でイソプレノイドレベルを高めることができる。た
とえば、種子に特異的なプロモーターまたは他の転写開始領域を利用することに
より、種子でカロテノイドレベルを高めることができる。ついで種子を回収する
ことができ、目的とするイソプレノイドまたはカロテノイドの貯蔵庫として提供
することができる。
に適した１またはそれ以上の配列を組織特異的なプロモーターと組み合わせるこ
とにより、植物の特定の組織でイソプレノイドレベルを高めることができる。た
とえば、種子に特異的なプロモーターまたは他の転写開始領域を利用することに
より、種子でカロテノイドレベルを高めることができる。ついで種子を回収する
ことができ、目的とするイソプレノイドまたはカロテノイドの貯蔵庫として提供
することができる。
【００１８】 一般に、本発明の方法に従って使用したベクターに含まれる該ＤＸＰＳをコー
ドする核酸分子は、ＤＸＰＳ分子が植物のプラスチドに向けられるように植物細
胞中に形質転換されるであろう。従って、該ベクターが植物のプラスチド中に直
接挿入されない場合は、該ベクターはさらに該ＤＸＰＳまたは１またはそれ以上
の該イソプレノイド産生核酸配列に作動可能に連結した核酸配列を含み、該さら
なる配列はＤＸＰＳまたはイソプレノイドの発現をプラスチド中に向ける輸送（
transit）ペプチドをコードしているであろう。本発明のこの態様には天然また
は外来の輸送ペプチドを利用することができる。
ドする核酸分子は、ＤＸＰＳ分子が植物のプラスチドに向けられるように植物細
胞中に形質転換されるであろう。従って、該ベクターが植物のプラスチド中に直
接挿入されない場合は、該ベクターはさらに該ＤＸＰＳまたは１またはそれ以上
の該イソプレノイド産生核酸配列に作動可能に連結した核酸配列を含み、該さら
なる配列はＤＸＰＳまたはイソプレノイドの発現をプラスチド中に向ける輸送（
transit）ペプチドをコードしているであろう。本発明のこの態様には天然また
は外来の輸送ペプチドを利用することができる。
【００１９】 上記のように、メバロン酸非依存ＩＰＰ生合成経路は、高等動物、とりわけヒ
トには存在しない。それゆえ、ＤＸＰＳによって触媒される反応の抑制は、ＤＸ
ＰＳの発現レベルまたはＤＸＰＳの機能または活性を変えることによって細菌関
連感染を選択的に抑制または軽減するための独特の標的部位を提供する。
トには存在しない。それゆえ、ＤＸＰＳによって触媒される反応の抑制は、ＤＸ
ＰＳの発現レベルまたはＤＸＰＳの機能または活性を変えることによって細菌関
連感染を選択的に抑制または軽減するための独特の標的部位を提供する。
【００２０】 ＤＸＰＳの発現を抑制または防ぐ一つの方法は、アンチセンス法を利用する。
アンチセンス法は、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡのらせん形成により遺伝子
発現を制御するのに用いることができ、両方法ともＤＮＡまたはＲＮＡへのポリ
ヌクレオチド結合に基づいている。たとえば、本発明によりＤＸＰＳをコードす
る天然のＤＮＡ配列の５'コード領域を用いて、長さが１０〜５０塩基対の範囲
のアンチセンスＲＮＡヌクレオチドをデザインすることができる。ＤＮＡオリゴ
ヌクレオチドは転写に関与する遺伝子の領域に相補的になるようにデザインされ
（三重らせん− Leeら、Nucl. Acids Res., 6: 3073 (1979); Cooneyら、Scien
ce, 241: 456 (1988);およびDermanら、Science 251: 1360 (1991)を参照）、こ
の場合、アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの発現はインビボでｍＲＮＡへ
のハイブリダイゼーションを可能とし、ｍＲＮＡ分子のＤＸＰＳへの翻訳をブロ
ックする。
アンチセンス法は、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡのらせん形成により遺伝子
発現を制御するのに用いることができ、両方法ともＤＮＡまたはＲＮＡへのポリ
ヌクレオチド結合に基づいている。たとえば、本発明によりＤＸＰＳをコードす
る天然のＤＮＡ配列の５'コード領域を用いて、長さが１０〜５０塩基対の範囲
のアンチセンスＲＮＡヌクレオチドをデザインすることができる。ＤＮＡオリゴ
ヌクレオチドは転写に関与する遺伝子の領域に相補的になるようにデザインされ
（三重らせん− Leeら、Nucl. Acids Res., 6: 3073 (1979); Cooneyら、Scien
ce, 241: 456 (1988);およびDermanら、Science 251: 1360 (1991)を参照）、こ
の場合、アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの発現はインビボでｍＲＮＡへ
のハイブリダイゼーションを可能とし、ｍＲＮＡ分子のＤＸＰＳへの翻訳をブロ
ックする。
【００２１】 あるいは、メバロン酸非依存ＩＰＰ生合成経路においてＤＸＰＳの触媒活性ま
たは発現を抑制する活性について化合物をスクリーニングすることができる。そ
れゆえ、本発明のさらなる態様に従い、イソプレノイドの産生または発現を変調
する化合物の同定方法が提供され、該方法は、試験すべき該化合物をメバロン酸
非依存ＩＰＰ生合成経路からの分子とＤＸＰＳの存在下で接触させ、その際、該
分子はＤＸＰＳによって触媒された適当な反応物の存在下で反応を行うものであ
り、ついで試験すべき該化合物の不在下での同反応と比較したときの産生された
生成物のレベルをモニターすることを含む。好ましくは、反応する分子はピルビ
ン酸およびグリセルアルデヒド−３−リン酸であり、これらは図１に示すように
ＤＸＰＳの存在下で縮合反応を受けて１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リ
ン酸（ＤＸＰ）を生成する。
たは発現を抑制する活性について化合物をスクリーニングすることができる。そ
れゆえ、本発明のさらなる態様に従い、イソプレノイドの産生または発現を変調
する化合物の同定方法が提供され、該方法は、試験すべき該化合物をメバロン酸
非依存ＩＰＰ生合成経路からの分子とＤＸＰＳの存在下で接触させ、その際、該
分子はＤＸＰＳによって触媒された適当な反応物の存在下で反応を行うものであ
り、ついで試験すべき該化合物の不在下での同反応と比較したときの産生された
生成物のレベルをモニターすることを含む。好ましくは、反応する分子はピルビ
ン酸およびグリセルアルデヒド−３−リン酸であり、これらは図１に示すように
ＤＸＰＳの存在下で縮合反応を受けて１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リ
ン酸（ＤＸＰ）を生成する。
【００２２】 本発明に従ってＤＸＰＳ酵素の発現または活性を妨害するものとして同定した
化合物は有利にも、たとえば、メバロン酸非依存ＩＰＰ生合成経路を有する細菌
または植物細胞を破壊する選択的な毒性剤として特に有用である。それゆえ、こ
れら化合物は、医薬または除草剤として特に有用であり、あるいは細菌関連疾患
を治療するための医薬の製造において有用であり得る。
化合物は有利にも、たとえば、メバロン酸非依存ＩＰＰ生合成経路を有する細菌
または植物細胞を破壊する選択的な毒性剤として特に有用である。それゆえ、こ
れら化合物は、医薬または除草剤として特に有用であり、あるいは細菌関連疾患
を治療するための医薬の製造において有用であり得る。
【００２３】 それゆえ、本発明のさらなる側面はまた、ＤＸＰＳまたはその機能的等価物ま
たはその生合成前駆体の発現または活性のインヒビターとして同定された化合物
を薬理学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤とともに含む医薬組成物をも
包含する。また、ＤＸＰＳ機能の発現または活性のインヒビターとして同定され
た該化合物を含む除草剤組成物も本発明により提供される。
たはその生合成前駆体の発現または活性のインヒビターとして同定された化合物
を薬理学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤とともに含む医薬組成物をも
包含する。また、ＤＸＰＳ機能の発現または活性のインヒビターとして同定され
た該化合物を含む除草剤組成物も本発明により提供される。
【００２４】 本発明のさらなる側面は、本発明による少なくとも１つのさらなるＤＸＰＳ分
子を発現しうる導入遺伝子を含む、メバロン酸非依存ＩＰＰ生合成経路を有する
トランスジェニック細胞、組織または生物を包含する。トランスジェニック細胞
、組織または生物はまた、所望のイソプレノイドを産生しうる１またはそれ以上
の核酸配列を有する導入遺伝子をも含んでいてよい。好ましくは、トランスジェ
ニック細胞は植物を包含し、さらに好ましくはトマト植物を包含する。
子を発現しうる導入遺伝子を含む、メバロン酸非依存ＩＰＰ生合成経路を有する
トランスジェニック細胞、組織または生物を包含する。トランスジェニック細胞
、組織または生物はまた、所望のイソプレノイドを産生しうる１またはそれ以上
の核酸配列を有する導入遺伝子をも含んでいてよい。好ましくは、トランスジェ
ニック細胞は植物を包含し、さらに好ましくはトマト植物を包含する。
【００２５】 本明細書において「発現しうる導入遺伝子」とは、ＤＸＰＳまたは同じ機能お
よび／または活性を有するタンパク質および／または所望のイソプレノイドを産
生しうるコードタンパク質の発現に導く適当な核酸配列を意味する。導入遺伝子
としては、たとえば、ゲノム中に組み込まれたＤＮＡを含めて、単離したゲノム
核酸または合成核酸が挙げられる。好ましくは、導入遺伝子は、ＤＸＰＳ酵素ま
たは本明細書に記載する該イソプレノイドをコードする核酸配列、または該核酸
の機能的断片を含む。該核酸の機能的断片とは、ＤＸＰＳ酵素または該イソプレ
ノイドまたはその機能的等価物、誘導体または優性ネガティブ（negative）変異
体などの非機能的誘導体、またはその生合成前駆体をコードする該核酸を含む遺
伝子の断片を意味するものとして捉えなければならない。たとえば、通常の技術
を用い、該核酸によってコードされるＤＸＰＳ酵素および／またはイソプレノイ
ド産生タンパク質のタンパク質配列およびその後の機能に影響を及ぼさないよう
にヌクレオチドの置換または欠失を行うことは当業者には明らかであろう。
よび／または活性を有するタンパク質および／または所望のイソプレノイドを産
生しうるコードタンパク質の発現に導く適当な核酸配列を意味する。導入遺伝子
としては、たとえば、ゲノム中に組み込まれたＤＮＡを含めて、単離したゲノム
核酸または合成核酸が挙げられる。好ましくは、導入遺伝子は、ＤＸＰＳ酵素ま
たは本明細書に記載する該イソプレノイドをコードする核酸配列、または該核酸
の機能的断片を含む。該核酸の機能的断片とは、ＤＸＰＳ酵素または該イソプレ
ノイドまたはその機能的等価物、誘導体または優性ネガティブ（negative）変異
体などの非機能的誘導体、またはその生合成前駆体をコードする該核酸を含む遺
伝子の断片を意味するものとして捉えなければならない。たとえば、通常の技術
を用い、該核酸によってコードされるＤＸＰＳ酵素および／またはイソプレノイ
ド産生タンパク質のタンパク質配列およびその後の機能に影響を及ぼさないよう
にヌクレオチドの置換または欠失を行うことは当業者には明らかであろう。
【００２６】 該トランスジェニック細胞、組織または生物によって発現されたＤＸＰＳ酵素
または産生されたイソプレノイドまたは該タンパク質の機能的等価物または生合
成前駆体もまた本発明の一部を構成する。 本発明の組換えＤＮＡ分子またはベクターは、当該技術分野で認められた多く
の仕方で植物細胞中に導入することができ、使用する方法の選択は形質転換の標
的となる植物の種類、すなわち単子葉植物かまたは双子葉植物かに依存すること
が評価されるであろう。植物細胞を形質転換する適当な方法としては、マイクロ
インジェクション（Crosswayら(1986) BioTechniques 4: 320-334）、エレクト
ロポレーション（Riggsら(1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5602-5606）
、Agrobacterium媒体形質転換（Hincheeら(1988) Biotechnology 6: 915-921）
およびバリスティックパーティクルアクセレレーション（ballistic particle a
cceleration）（たとえば、Sanfordら、米国特許第４,９４５,０５０号；および
MaCabeら(1988) Biotechnology 6: 923-926を参照）が挙げられる。
または産生されたイソプレノイドまたは該タンパク質の機能的等価物または生合
成前駆体もまた本発明の一部を構成する。 本発明の組換えＤＮＡ分子またはベクターは、当該技術分野で認められた多く
の仕方で植物細胞中に導入することができ、使用する方法の選択は形質転換の標
的となる植物の種類、すなわち単子葉植物かまたは双子葉植物かに依存すること
が評価されるであろう。植物細胞を形質転換する適当な方法としては、マイクロ
インジェクション（Crosswayら(1986) BioTechniques 4: 320-334）、エレクト
ロポレーション（Riggsら(1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5602-5606）
、Agrobacterium媒体形質転換（Hincheeら(1988) Biotechnology 6: 915-921）
およびバリスティックパーティクルアクセレレーション（ballistic particle a
cceleration）（たとえば、Sanfordら、米国特許第４,９４５,０５０号；および
MaCabeら(1988) Biotechnology 6: 923-926を参照）が挙げられる。
【００２７】 あるいは植物などの生物の場合、プラスチドを直接、形質転換することができ
る。葉緑体の安定な形質転換は高等植物で報告されている（たとえば、SVABら(1
990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8526-8530; SVAB & Maliga (1993) Proc
. Natl. Acad. Sci. USA 90: 913-917; Staub & Maliga (1993) Embo J. 12: 60
1-606を参照）。この方法は、選択マーカーを含むＤＮＡのパーティクルガンデ
リバリー（particle gun delivery）および相同的組換えによる該ＤＮＡのプラ
スチドゲノムへのターゲティングに依存している。そのような方法において、プ
ラスチド遺伝子の発現は、プラスチド遺伝子プロモーターの使用によって、また
はＴ７ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるものなどの選択プロモーター配列
から発現するように位置したサイレントなプラスチド含有（plastid-borne）導
入遺伝子のトランス活性化によって達成できる。サイレントなプラスチド遺伝子
は、核発現構築物からの特定のＲＮＡポリメラーゼの発現および輸送ペプチドの
使用による該ポリメラーゼのプラスチドへのターゲティングによって活性化され
る。組織特異的な発現は、そのような方法において、適当な植物組織特異的プロ
モーターから発現される、核でコードされプラスチドに向けられた特定のＲＮＡ
ポリメラーゼの使用によって得ることができる。そのような系は、McBrideら(19
94) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7301-7305で報告されている。
る。葉緑体の安定な形質転換は高等植物で報告されている（たとえば、SVABら(1
990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8526-8530; SVAB & Maliga (1993) Proc
. Natl. Acad. Sci. USA 90: 913-917; Staub & Maliga (1993) Embo J. 12: 60
1-606を参照）。この方法は、選択マーカーを含むＤＮＡのパーティクルガンデ
リバリー（particle gun delivery）および相同的組換えによる該ＤＮＡのプラ
スチドゲノムへのターゲティングに依存している。そのような方法において、プ
ラスチド遺伝子の発現は、プラスチド遺伝子プロモーターの使用によって、また
はＴ７ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるものなどの選択プロモーター配列
から発現するように位置したサイレントなプラスチド含有（plastid-borne）導
入遺伝子のトランス活性化によって達成できる。サイレントなプラスチド遺伝子
は、核発現構築物からの特定のＲＮＡポリメラーゼの発現および輸送ペプチドの
使用による該ポリメラーゼのプラスチドへのターゲティングによって活性化され
る。組織特異的な発現は、そのような方法において、適当な植物組織特異的プロ
モーターから発現される、核でコードされプラスチドに向けられた特定のＲＮＡ
ポリメラーゼの使用によって得ることができる。そのような系は、McBrideら(19
94) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7301-7305で報告されている。
【００２８】 形質転換した細胞は、当該技術分野で知られた常法に従って植物体に生育させ
ることができる。たとえば、McCormickら、Plant Cell Reports (1986), 5: 81-
84を参照。ついで、これら植物を成育させ、同じ形質転換した株かまたは異なる
株で授粉し、得られた雑種のうち所望の表現型特性を有するものを同定する。目
的とする表現型特性が安定に維持され遺伝されることを確実にするために２世代
またはそれ以上の世代を生育させ、ついで種子を回収して所望の表現型または他
の特性が達成されたことを確実にする。
ることができる。たとえば、McCormickら、Plant Cell Reports (1986), 5: 81-
84を参照。ついで、これら植物を成育させ、同じ形質転換した株かまたは異なる
株で授粉し、得られた雑種のうち所望の表現型特性を有するものを同定する。目
的とする表現型特性が安定に維持され遺伝されることを確実にするために２世代
またはそれ以上の世代を生育させ、ついで種子を回収して所望の表現型または他
の特性が達成されたことを確実にする。
【００２９】 様々な植物の宿主細胞を用いることができる。興味のもたれる種子をもたらす
植物種は特に有用である。大抵の場合、種子が大量に作られ、目的とする種子特
異的な産物が含まれ、または種子もしくは種子の一部が食べられるような植物が
選ばれるであろう。興味のもたれる種子としては、脂肪種子（oil seeds）、た
とえば脂肪種子のアブラナ（Brassica）種子、綿の種子（cotton seeds）、大豆
（soybean）、ベニバナ（safflower）、ひまわり（sunflower）、ココヤシ（coc
onut）、椰子（palm）など；穀物の種子（grain seeds）、たとえばコムギ（whe
at）、オオムギ（barley）、エンバク（oats）アマランス（amaranth）、亜麻（
flax）、ライ麦（rye）、ライコムギ（triticale）、イネ（rice）、トウモロコ
シ（corn）など；ペポカボチャ（pumpkin）、カボチャ（squash）、ゴマ（sesam
e）、ケシ（poppy）、ブドウ（grape）、ヤエナリ（mung beans）、ラッカセイ
（peanut）エンドウ（peas）、インゲンマメ（beans）、ハツカダイコン（radis
h）、アルファルファ（alfalfa）、ココア（cocoa）、コーヒー（coffee）、ツ
リーナッツ（tree nuts）、たとえばクルミノキ（walnuts）、アーモンド（almo
nds）、ペカン（pecans）、ヒヨコマメ（chick-peas）などを含む、他の食べら
れる種子または食べられる部分を有する種子が挙げられる。
植物種は特に有用である。大抵の場合、種子が大量に作られ、目的とする種子特
異的な産物が含まれ、または種子もしくは種子の一部が食べられるような植物が
選ばれるであろう。興味のもたれる種子としては、脂肪種子（oil seeds）、た
とえば脂肪種子のアブラナ（Brassica）種子、綿の種子（cotton seeds）、大豆
（soybean）、ベニバナ（safflower）、ひまわり（sunflower）、ココヤシ（coc
onut）、椰子（palm）など；穀物の種子（grain seeds）、たとえばコムギ（whe
at）、オオムギ（barley）、エンバク（oats）アマランス（amaranth）、亜麻（
flax）、ライ麦（rye）、ライコムギ（triticale）、イネ（rice）、トウモロコ
シ（corn）など；ペポカボチャ（pumpkin）、カボチャ（squash）、ゴマ（sesam
e）、ケシ（poppy）、ブドウ（grape）、ヤエナリ（mung beans）、ラッカセイ
（peanut）エンドウ（peas）、インゲンマメ（beans）、ハツカダイコン（radis
h）、アルファルファ（alfalfa）、ココア（cocoa）、コーヒー（coffee）、ツ
リーナッツ（tree nuts）、たとえばクルミノキ（walnuts）、アーモンド（almo
nds）、ペカン（pecans）、ヒヨコマメ（chick-peas）などを含む、他の食べら
れる種子または食べられる部分を有する種子が挙げられる。
【００３０】実施例１ 材料および方法 細菌株、プラスミドおよび培養条件 大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Stratagene）を用いて遺伝子クローニングおよび
プラスミドの発現を行った。大腸菌をLuria Broth培地［１８］で１８℃にてロ
ータリーシェーカー上、２５０ｒｐｍにて（特に断らない限り）増殖させた。ア
ンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）お
よび１.０ｍＭのイソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）（すべ
てSigmaから購入）を必要に応じて加えた。プラスミドpBluescript（Stratagene
）をクローニングおよび発現の両研究のためのベクターとして用いた。Synechoc
ystis種ＰＣＣ ６８０３をInstitute Pasteur（パリ）から入手し、０.５％グル
コースを添加したＢＧ１１培地［１９］中、３０℃および２,０００ルックスに
て増殖させた。Bacillus subtilis株ＰＹ７９のＤＮＡはP. Wakeley（Royal Hol
loway, University of London）から好意で寄贈されたものであった。プラスミ
ドｐＡＣＣＲＴ−ＥＩＢは、それを導入した大腸菌菌体中でリコペンを生合成す
るのに必要なE. uredovoraのｃｒｔＥ、ｃｒｔＢおよびｃｒｔＩ遺伝子を発現す
るが、該プラスミドの構築は以前に記載されている［２０］。pBluescript中に
クローニングしたＨＭＧＲ１の発現に必要なプラスミド（ｐＨＭＧＲ１）もまた
、いずれかに記載されている［２１］。
プラスミドの発現を行った。大腸菌をLuria Broth培地［１８］で１８℃にてロ
ータリーシェーカー上、２５０ｒｐｍにて（特に断らない限り）増殖させた。ア
ンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）お
よび１.０ｍＭのイソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）（すべ
てSigmaから購入）を必要に応じて加えた。プラスミドpBluescript（Stratagene
）をクローニングおよび発現の両研究のためのベクターとして用いた。Synechoc
ystis種ＰＣＣ ６８０３をInstitute Pasteur（パリ）から入手し、０.５％グル
コースを添加したＢＧ１１培地［１９］中、３０℃および２,０００ルックスに
て増殖させた。Bacillus subtilis株ＰＹ７９のＤＮＡはP. Wakeley（Royal Hol
loway, University of London）から好意で寄贈されたものであった。プラスミ
ドｐＡＣＣＲＴ−ＥＩＢは、それを導入した大腸菌菌体中でリコペンを生合成す
るのに必要なE. uredovoraのｃｒｔＥ、ｃｒｔＢおよびｃｒｔＩ遺伝子を発現す
るが、該プラスミドの構築は以前に記載されている［２０］。pBluescript中に
クローニングしたＨＭＧＲ１の発現に必要なプラスミド（ｐＨＭＧＲ１）もまた
、いずれかに記載されている［２１］。
【００３１】組換えＤＮＡ技術 組換えＤＮＡ技術はすべて、標準法により［２２］または提供者の教示に従っ
て行った。ゲノムＤＮＡの抽出は、Qiagen Genomic-tip 20/Gキットを用いて全
ての生物から行った。
て行った。ゲノムＤＮＡの抽出は、Qiagen Genomic-tip 20/Gキットを用いて全
ての生物から行った。
【００３２】ｄｘｐｓ遺伝子のクローニング Synechocystis種ＰＣＣ ６８０３についてのゲノムデータベースからのＯＲＦ
ｓｌｌ１９４５のヌクレオチド配列［２３］に基づき、ポリメラーゼ連鎖反応（
ＰＣＲ）による推定ｄｘｐｓ遺伝子のクローニングのためにプライマーをデザイ
ンした。フォアウォードプライマー
ｓｌｌ１９４５のヌクレオチド配列［２３］に基づき、ポリメラーゼ連鎖反応（
ＰＣＲ）による推定ｄｘｐｓ遺伝子のクローニングのためにプライマーをデザイ
ンした。フォアウォードプライマー
【化１】 はコーディング配列の開始部分と重複している。リバースプライマー
【化２】 は該遺伝子の停止コドンの外側に位置している。Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（S
tratagene）を用いたＰＣＲ（２５サイクル）は予測されたサイズ（〜１.９ｋｂ
）のＤＮＡ断片を生成した。その後の該断片のシークエンシングは、生成物がＯ
ＲＦ ｓｌｌ１９４５であることを確認した。
tratagene）を用いたＰＣＲ（２５サイクル）は予測されたサイズ（〜１.９ｋｂ
）のＤＮＡ断片を生成した。その後の該断片のシークエンシングは、生成物がＯ
ＲＦ ｓｌｌ１９４５であることを確認した。
【００３３】 B. subtilisのｄｘｐｓ遺伝子もまた、Bacillus subtilisゲノムデータベース
［２４］で同定された、生成物ＹｑｉＥをコードする遺伝子を増幅すべくデザイ
ンしたプライマーを用いたＰＣＲによりクローニングした。フォアウォードプラ
イマー
［２４］で同定された、生成物ＹｑｉＥをコードする遺伝子を増幅すべくデザイ
ンしたプライマーを用いたＰＣＲによりクローニングした。フォアウォードプラ
イマー
【化３】 は、大腸菌での発現を改善するために予測される開始コドン（下線）に修飾塩基
置換を含んでいる。リバースプライマー
置換を含んでいる。リバースプライマー
【化４】 はｄｘｐｓ遺伝子の開始コドンの外側に位置している。ＰＣＲ（２５サイクル）
の後に予測されたサイズ（〜１.９ｋｂ）のＤＮＡ生成物が得られ、シークエン
シングしたときに生成物ＹｑｉＥをコードする遺伝子と同一であることが確認さ
れた。両反応からのＰＣＲ生成物をＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Gibco BRL）で
７２℃にて１０分間処理して平滑末端断片を合成した。ついで、これら断片をＴ
４ ＤＮＡリガーゼ（Fermentas）を用いてpBluescriptベクター（Stratagene）
のＥｃｏＲＶ部位にクローニングした（図２）。
の後に予測されたサイズ（〜１.９ｋｂ）のＤＮＡ生成物が得られ、シークエン
シングしたときに生成物ＹｑｉＥをコードする遺伝子と同一であることが確認さ
れた。両反応からのＰＣＲ生成物をＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Gibco BRL）で
７２℃にて１０分間処理して平滑末端断片を合成した。ついで、これら断片をＴ
４ ＤＮＡリガーゼ（Fermentas）を用いてpBluescriptベクター（Stratagene）
のＥｃｏＲＶ部位にクローニングした（図２）。
【００３４】インビトロＤＸＰシンターゼアッセイ 適当なプラスミドで形質転換した大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ菌体を、適当な抗生
物質を加えたLuria Broth培地中、３７℃にてＯＤ６２０ｎｍが０.６となるまで
増殖させ、１.０ｍＭのＩＰＴＧを加えて２８℃で２時間誘発させた。細菌を遠
心分離（６,０００ｇで１０分間）により回収し、緩衝液Ａ（１００ｍＭのＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、１ｍＭのジチオトレイトール、０.３Ｍのショ糖）
で洗浄した。菌体を緩衝液Ｂ（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、
１ｍＭのジチオトレイトール、０.１ｍＭのフェニルメタンスルホニルフルオラ
イド、１μ／ｍｌのペプスタチン、１μｇ／ｍｌのロイペプチン、１ｍｇ／ｍｌ
のリゾチーム）中で再浮遊させて最初の容量とした。ついで、菌体を穏やかに攪
拌しながら３０℃で１５分間インキュベートし、ついで４℃で短時間超音波処理
して破砕した。上澄み液を回収し、Bradfordアッセイ［２５］を用いてタンパク
質濃度を決定した。
物質を加えたLuria Broth培地中、３７℃にてＯＤ６２０ｎｍが０.６となるまで
増殖させ、１.０ｍＭのＩＰＴＧを加えて２８℃で２時間誘発させた。細菌を遠
心分離（６,０００ｇで１０分間）により回収し、緩衝液Ａ（１００ｍＭのＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、１ｍＭのジチオトレイトール、０.３Ｍのショ糖）
で洗浄した。菌体を緩衝液Ｂ（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、
１ｍＭのジチオトレイトール、０.１ｍＭのフェニルメタンスルホニルフルオラ
イド、１μ／ｍｌのペプスタチン、１μｇ／ｍｌのロイペプチン、１ｍｇ／ｍｌ
のリゾチーム）中で再浮遊させて最初の容量とした。ついで、菌体を穏やかに攪
拌しながら３０℃で１５分間インキュベートし、ついで４℃で短時間超音波処理
して破砕した。上澄み液を回収し、Bradfordアッセイ［２５］を用いてタンパク
質濃度を決定した。
【００３５】 上澄み液のアリコート（１００μｌ）を、１００μｌのアッセイ緩衝液（１０
０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８.０）、３ｍＭのＡＴＰ、３ｍＭのＭｎ２＋、３ｍＭ
のＭｇ２＋、１ｍＭのＫＦ、１ｍＭのチアミン二リン酸、（０.１％）Ｔｗｅｅ
ｎ６０、０.６ｍＭのｍＤＬ−グリセルアルデヒド−３−リン酸、３０μＭの［
２−１４Ｃ］ピルビン酸（０.５μＣｉ）を含有）とともにEppendorf管に移した
。混合物を穏やかに攪拌しながら３０℃にて２時間インキュベートした。混合物
を８０℃にて３分間加熱することにより反応を停止させた。１３,０００ｇで５
分間遠心分離した後、上澄み液を清浄な管に移し、蒸発乾固させた。残渣をメタ
ノール（５０μｌ）に再懸濁し、ＴＬＣ（シリカゲル６０）にロードした。クロ
マトグラムをｎ−プロピルアルコール／酢酸エチル／Ｈ２Ｏ（６：１：３ ｖ／
ｖ／ｖ）で展開した。
０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８.０）、３ｍＭのＡＴＰ、３ｍＭのＭｎ２＋、３ｍＭ
のＭｇ２＋、１ｍＭのＫＦ、１ｍＭのチアミン二リン酸、（０.１％）Ｔｗｅｅ
ｎ６０、０.６ｍＭのｍＤＬ−グリセルアルデヒド−３−リン酸、３０μＭの［
２−１４Ｃ］ピルビン酸（０.５μＣｉ）を含有）とともにEppendorf管に移した
。混合物を穏やかに攪拌しながら３０℃にて２時間インキュベートした。混合物
を８０℃にて３分間加熱することにより反応を停止させた。１３,０００ｇで５
分間遠心分離した後、上澄み液を清浄な管に移し、蒸発乾固させた。残渣をメタ
ノール（５０μｌ）に再懸濁し、ＴＬＣ（シリカゲル６０）にロードした。クロ
マトグラムをｎ−プロピルアルコール／酢酸エチル／Ｈ２Ｏ（６：１：３ ｖ／
ｖ／ｖ）で展開した。
【００３６】 挿入物なしのpBluescriptベクターのみを含む菌体での対照アッセイに対し、S
ynechocystis種ＰＣＣ ６８０３かまたはB. subtilisのＤＸＰＳを発現する誘導
菌体の抽出物で酵素アッセイを行った。ｄｘｐｓクローンの１つを発現するアッ
セイのＴＬＣ分析は、ＤＸＰと推定される主要なバンド（Ｒｆ ０.１４）を示し
、これは対照では観察されないものであった。１４Ｃ−標識ＤＸＰの定量は、反
応生成物をＴＬＣ上で単離することにより行った。ＤＸＰバンドをプレートから
掻き取り、メタノールを用いてシリカから溶出し、ついで液体シンチレーション
カウンティングにより定量した。
ynechocystis種ＰＣＣ ６８０３かまたはB. subtilisのＤＸＰＳを発現する誘導
菌体の抽出物で酵素アッセイを行った。ｄｘｐｓクローンの１つを発現するアッ
セイのＴＬＣ分析は、ＤＸＰと推定される主要なバンド（Ｒｆ ０.１４）を示し
、これは対照では観察されないものであった。１４Ｃ−標識ＤＸＰの定量は、反
応生成物をＴＬＣ上で単離することにより行った。ＤＸＰバンドをプレートから
掻き取り、メタノールを用いてシリカから溶出し、ついで液体シンチレーション
カウンティングにより定量した。
【００３７】 アッセイ生成物の酵素的脱リン酸化は、ＴＬＣ上で分析したときに（Ｒｆ ０.
５０）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース（ＤＸ）の生成という結果となった。非
放射性のピルビン酸をアッセイで用いた場合には、ＤＸＰ（Ｒｆ ０.１２、紫色
に染色）およびＤＸ（Ｒｆ ０.４７、青色に染色）はｐ−アニスアルデヒド／硫
酸（３：１）で染色することにより同定した。このＤＸＰは、真正の化学的に合
成したＤＸＰ（これも紫色に染色）と一緒にクロマトグラフィーされた。反応の
基質であるピルビン酸（Ｒｆ ０.３６、黄色に染色）、ＤＬ−グリセルアルデヒ
ド−３−リン酸（Ｒｆ ０.１５、オレンジ色に染色）およびＤ−グリセルアルデ
ヒド（Ｒｆ ０.７４、オレンジ色に染色）もまた、このＴＬＣ系を用いて観察さ
れた。アッセイ生成物を脱リン酸化した反応では、ＤＸＰはＴＬＣで観察されず
、ＤＸのみが観察された。
５０）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース（ＤＸ）の生成という結果となった。非
放射性のピルビン酸をアッセイで用いた場合には、ＤＸＰ（Ｒｆ ０.１２、紫色
に染色）およびＤＸ（Ｒｆ ０.４７、青色に染色）はｐ−アニスアルデヒド／硫
酸（３：１）で染色することにより同定した。このＤＸＰは、真正の化学的に合
成したＤＸＰ（これも紫色に染色）と一緒にクロマトグラフィーされた。反応の
基質であるピルビン酸（Ｒｆ ０.３６、黄色に染色）、ＤＬ−グリセルアルデヒ
ド−３−リン酸（Ｒｆ ０.１５、オレンジ色に染色）およびＤ−グリセルアルデ
ヒド（Ｒｆ ０.７４、オレンジ色に染色）もまた、このＴＬＣ系を用いて観察さ
れた。アッセイ生成物を脱リン酸化した反応では、ＤＸＰはＴＬＣで観察されず
、ＤＸのみが観察された。
【００３８】リコペンおよびユビキノンＱＢ−８の大腸菌での定量 細菌の増殖をＯＤ６２０ｎｍから決定した。乾燥菌体重量を、１３,０００ｇ
での５分間の遠心分離により回収し、１回水洗し、ついで再遠心分離した培養液
の既知の容量から計算した。菌体を一夜凍結乾燥し、乾燥菌体ペレットの重量を
決定した。菌体のリコペン含量を、１３,０００ｇで５分間の遠心分離により大
腸菌菌体のアリコートを回収し、１回水洗し、ついで再遠心分離することにより
決定した。菌体をアセトン（２００μｌ）に再浮遊させ、ついで暗所にて６８℃
で１０分間インキュベートした。試料を再度１３,０００ｇで１０分間遠心分離
にかけ、リコペンを含有するアセトン上澄み液を清浄な管に入れた。抽出物をＮ
２流の下で蒸発乾固させ、暗所にて−２０℃で貯蔵した。抽出物のリコペン含量
を、Beckman DU Series 7000ダイオードアレイ分光光度計を用いた可視光吸収ス
ペクトルにより決定した。アセトン中でのスペクトルをＡ１％ １ｃｍ ３４５０
を用いて記録した［２６］。
での５分間の遠心分離により回収し、１回水洗し、ついで再遠心分離した培養液
の既知の容量から計算した。菌体を一夜凍結乾燥し、乾燥菌体ペレットの重量を
決定した。菌体のリコペン含量を、１３,０００ｇで５分間の遠心分離により大
腸菌菌体のアリコートを回収し、１回水洗し、ついで再遠心分離することにより
決定した。菌体をアセトン（２００μｌ）に再浮遊させ、ついで暗所にて６８℃
で１０分間インキュベートした。試料を再度１３,０００ｇで１０分間遠心分離
にかけ、リコペンを含有するアセトン上澄み液を清浄な管に入れた。抽出物をＮ
２流の下で蒸発乾固させ、暗所にて−２０℃で貯蔵した。抽出物のリコペン含量
を、Beckman DU Series 7000ダイオードアレイ分光光度計を用いた可視光吸収ス
ペクトルにより決定した。アセトン中でのスペクトルをＡ１％ １ｃｍ ３４５０
を用いて記録した［２６］。
【００３９】 ＵＱ−８を菌体からYoshidaらの方法［２７］に基づいて抽出した。菌体を遠
心分離により回収し、１回水洗し、ついで一夜凍結乾燥した。菌体を乳棒および
乳鉢を用いて破砕することにより、ｎ−プロパノール（３ｍｌ）および内部標準
として１５μｇのＵＱ−１０を含有するｎ−ヘキサン（５ｍｌ）中で抽出した。
溶媒相および水性相ｎ−ヘキサン（３ｍｌ）からの第二の抽出によって得られた
溶媒相を一緒にし、Ｎ２下で蒸発乾固させた。残渣をエタノールに再懸濁し、以
前に記載された［２８］逆相ＨＰＬＣにより分析した。その溶出プロフィルをＵ
Ｑ−７、ＵＱ−９およびＵＱ−１０標準と比較することによりピークを同定した
。ＵＱ−８の標準は利用できなかったので、ＵＱ−８ピークはその溶出プロフィ
ルを他の標準のものと比較することにより同定した。
心分離により回収し、１回水洗し、ついで一夜凍結乾燥した。菌体を乳棒および
乳鉢を用いて破砕することにより、ｎ−プロパノール（３ｍｌ）および内部標準
として１５μｇのＵＱ−１０を含有するｎ−ヘキサン（５ｍｌ）中で抽出した。
溶媒相および水性相ｎ−ヘキサン（３ｍｌ）からの第二の抽出によって得られた
溶媒相を一緒にし、Ｎ２下で蒸発乾固させた。残渣をエタノールに再懸濁し、以
前に記載された［２８］逆相ＨＰＬＣにより分析した。その溶出プロフィルをＵ
Ｑ−７、ＵＱ−９およびＵＱ−１０標準と比較することによりピークを同定した
。ＵＱ−８の標準は利用できなかったので、ＵＱ−８ピークはその溶出プロフィ
ルを他の標準のものと比較することにより同定した。
【００４０】ｄｘｐｓ遺伝子のクローニング 大腸菌からのｄｘｐｓのクローニングおよびその遺伝子産物ＤＸＰＳの特徴付
けは、最近、２つの研究グループにより報告されている［１１,１２］。この遺
伝子産物はＤＸＰシンターゼ活性を呈することが示されており、これはＩＰＰ生
合成のためのメバロン酸非依存経路の最初の反応であると考えられる（図１）［
５］。大腸菌のｄｘｐｓヌクレオチド配列に基づき、該遺伝子のホモログをB. s
ubtilisおよびSynechocystis種ＰＣＣ ６８０３の真正細菌ゲノムで同定した。S
ynechocystis種ＰＣＣ ６８０３ゲノム中のオープンリーディングフレームｓｌ
ｌ１９４５をＰＣＲによりクローニングし、ベクターpBluescript中にライゲー
トし、ついでｐＳＹＤＸＰＳと称した（図２）。この遺伝子は１９２０ｂｐにわ
たって広がり、６４０アミノ酸のポリペプチドをコードするオープンリーディン
グフレームを含んでおり、６９ｋＤａの予測された分子量を有していた。B. sub
tilisゲノム中のｄｘｐｓホモログは、生成物ＹｑｉＥをコードするＯＲＦとし
て同定された。これをＰＣＲによりクローニングし、pBluescript中に導入して
プラスミドｐＢＳＤＸＰＳを生成した（図２）。この遺伝子は１８９９ｂｐにわ
たって広がり、６３３アミノ酸のポリペプチドをコードしており、７０ｋＤａの
予測された分子量を有していた。
けは、最近、２つの研究グループにより報告されている［１１,１２］。この遺
伝子産物はＤＸＰシンターゼ活性を呈することが示されており、これはＩＰＰ生
合成のためのメバロン酸非依存経路の最初の反応であると考えられる（図１）［
５］。大腸菌のｄｘｐｓヌクレオチド配列に基づき、該遺伝子のホモログをB. s
ubtilisおよびSynechocystis種ＰＣＣ ６８０３の真正細菌ゲノムで同定した。S
ynechocystis種ＰＣＣ ６８０３ゲノム中のオープンリーディングフレームｓｌ
ｌ１９４５をＰＣＲによりクローニングし、ベクターpBluescript中にライゲー
トし、ついでｐＳＹＤＸＰＳと称した（図２）。この遺伝子は１９２０ｂｐにわ
たって広がり、６４０アミノ酸のポリペプチドをコードするオープンリーディン
グフレームを含んでおり、６９ｋＤａの予測された分子量を有していた。B. sub
tilisゲノム中のｄｘｐｓホモログは、生成物ＹｑｉＥをコードするＯＲＦとし
て同定された。これをＰＣＲによりクローニングし、pBluescript中に導入して
プラスミドｐＢＳＤＸＰＳを生成した（図２）。この遺伝子は１８９９ｂｐにわ
たって広がり、６３３アミノ酸のポリペプチドをコードしており、７０ｋＤａの
予測された分子量を有していた。
【００４１】 Synechocystis種６８０３およびB. subtilisのＤＸＰＳタンパク質のアミノ酸
配列は、お互いにその全長にわたって（４７％の同一性）および大腸菌ＤＸＰＳ
と（B. subtilis（４４％の同一性）およびSynechocystis種６８０３（４６％の
同一性））有意の類似性を呈した（図３）。これら３つのポリペプチドはすべて
２つの保存されたドメインを共通して有していた；すなわち、チアミン結合に関
与すると考えられるもの［３０］とプロトン移動に参画することが提唱されてい
るヒスチジン残基［３１］であり、ともに図３に詳細に説明してある。これらポ
リペプチドの各々にチアミン結合ドメインが存在することは、ＤＸＰＳ活性に対
してチアミンが補因子として必要であることを説明している［１２］。これら３
つにおける高程度のポリペプチド配列の同一性、とりわけ保存されたドメインの
分布は、これらがすべてＤＸＰＳまたは密接に関連する遺伝子産物をコードして
いることを示している。
配列は、お互いにその全長にわたって（４７％の同一性）および大腸菌ＤＸＰＳ
と（B. subtilis（４４％の同一性）およびSynechocystis種６８０３（４６％の
同一性））有意の類似性を呈した（図３）。これら３つのポリペプチドはすべて
２つの保存されたドメインを共通して有していた；すなわち、チアミン結合に関
与すると考えられるもの［３０］とプロトン移動に参画することが提唱されてい
るヒスチジン残基［３１］であり、ともに図３に詳細に説明してある。これらポ
リペプチドの各々にチアミン結合ドメインが存在することは、ＤＸＰＳ活性に対
してチアミンが補因子として必要であることを説明している［１２］。これら３
つにおける高程度のポリペプチド配列の同一性、とりわけ保存されたドメインの
分布は、これらがすべてＤＸＰＳまたは密接に関連する遺伝子産物をコードして
いることを示している。
【００４２】大腸菌形質転換体でのリコペンおよびＵＱ−８の定量 ｐＡＣＣＲＴ−ＥＩＢ［２０］で形質転換した大腸菌の菌体は、リコペンの蓄
積のためにピンク色に染まる。リコペンを産生するように操作した大腸菌菌体を
ｐＢＳＤＸＰＳ、ｐＳＹＤＸＰＳ、ｐＨＭＧＲ、または対照として振舞うpBlues
criptで形質転換して、外来のＤＸＰＳが菌体内で発現されたときのリコペン生
合成に及ぼす影響をモニターした。大腸菌を５０ｍｌの培養液中、３０℃にて増
殖させ、ＩＰＴＧにより４８時間（この時点までには大腸菌は増殖の定常期に達
していた）誘導した。図４は、４８時間の培養期間の間の培養液中のリコペンの
蓄積を示す。このグラフは、外来のｄｘｐｓを発現する大腸菌培養液が対照の培
養液に比べて遥かに高率でリコペンを蓄積したことを明らかに示している。組換
えｄｘｐｓ株の最終的なリコペン含量は対照のおよそ２倍であった（図５）。同
様の増大は、無色のカロテノイドのフィトエンを産生するように操作した大腸菌
でも得られた（データは示していない）。
積のためにピンク色に染まる。リコペンを産生するように操作した大腸菌菌体を
ｐＢＳＤＸＰＳ、ｐＳＹＤＸＰＳ、ｐＨＭＧＲ、または対照として振舞うpBlues
criptで形質転換して、外来のＤＸＰＳが菌体内で発現されたときのリコペン生
合成に及ぼす影響をモニターした。大腸菌を５０ｍｌの培養液中、３０℃にて増
殖させ、ＩＰＴＧにより４８時間（この時点までには大腸菌は増殖の定常期に達
していた）誘導した。図４は、４８時間の培養期間の間の培養液中のリコペンの
蓄積を示す。このグラフは、外来のｄｘｐｓを発現する大腸菌培養液が対照の培
養液に比べて遥かに高率でリコペンを蓄積したことを明らかに示している。組換
えｄｘｐｓ株の最終的なリコペン含量は対照のおよそ２倍であった（図５）。同
様の増大は、無色のカロテノイドのフィトエンを産生するように操作した大腸菌
でも得られた（データは示していない）。
【００４３】 イソプレノイドの内生レベルの変化は、菌体のユビキノン含量を測定すること
により決定した。大腸菌では、主として見出されるキノンはユビキノン（ＵＱ−
８）およびメナキノン（ＭＫ−８）である［３２］。ユビキノンは好気的な呼吸
鎖の主たる成分である。大腸菌では各酸化複合体に対して約５０のユビキノン分
子が存在すると推定されている［３３］。比較的大量に産生される最終産物を測
定することにより、生合成速度の変化を容易に検出できると考えられる。組換え
ｄｘｐｓ株のＵＱ−８含量は対照の１.５倍であった（図５）。A. thalianaから
のｈｍｇｒｌで形質転換した大腸菌でリコペンおよびＵＱ−８レベルを測定して
、これが菌体のイソプレノイド含量に変化をもたらすか否かをモニターした。A.
thaliana ｈｍｇｒｌ ｃＤＮＡの発現は、菌体内のリコペンおよびＵＱ−８レ
ベルのいずれにも影響を及ぼさなかった（図５）。
により決定した。大腸菌では、主として見出されるキノンはユビキノン（ＵＱ−
８）およびメナキノン（ＭＫ−８）である［３２］。ユビキノンは好気的な呼吸
鎖の主たる成分である。大腸菌では各酸化複合体に対して約５０のユビキノン分
子が存在すると推定されている［３３］。比較的大量に産生される最終産物を測
定することにより、生合成速度の変化を容易に検出できると考えられる。組換え
ｄｘｐｓ株のＵＱ−８含量は対照の１.５倍であった（図５）。A. thalianaから
のｈｍｇｒｌで形質転換した大腸菌でリコペンおよびＵＱ−８レベルを測定して
、これが菌体のイソプレノイド含量に変化をもたらすか否かをモニターした。A.
thaliana ｈｍｇｒｌ ｃＤＮＡの発現は、菌体内のリコペンおよびＵＱ−８レ
ベルのいずれにも影響を及ぼさなかった（図５）。
【００４４】 これら結果は、ＤＸＰＳの増大した発現が組換え大腸菌菌体内でのリコペンお
よびＵＱ−８レベルの増大に導くことを示している。このことは、ＩＰＰ生合成
のためのメバロン酸非依存経路の最初の反応であるＤＸＰ合成の速度を増大させ
るとイソプレノイドの産生が上昇することを示している。対照的に、ｈｍｇｒｌ
の発現はイソプレノイドの生合成には何ら影響を及ぼさず、大腸菌ではメバロン
酸依存ＩＰＰ生合成がＩＰＰ生合成において殆どまたは全く役割を有していない
ことを示唆している。メバロン酸依存ＩＰＰ生合成経路のためのタンパク質につ
いての大腸菌ゲノムデータベースの類似性サーチは該ゲノムにおいて可能なホモ
ログを同定することができず、この経路が該生物でおそらく存在しないことを示
唆していた。
よびＵＱ−８レベルの増大に導くことを示している。このことは、ＩＰＰ生合成
のためのメバロン酸非依存経路の最初の反応であるＤＸＰ合成の速度を増大させ
るとイソプレノイドの産生が上昇することを示している。対照的に、ｈｍｇｒｌ
の発現はイソプレノイドの生合成には何ら影響を及ぼさず、大腸菌ではメバロン
酸依存ＩＰＰ生合成がＩＰＰ生合成において殆どまたは全く役割を有していない
ことを示唆している。メバロン酸依存ＩＰＰ生合成経路のためのタンパク質につ
いての大腸菌ゲノムデータベースの類似性サーチは該ゲノムにおいて可能なホモ
ログを同定することができず、この経路が該生物でおそらく存在しないことを示
唆していた。
【００４５】インビトロ酵素活性 外来のＤＸＰＳを発現する大腸菌でのカロテノイドおよびＵＱ−８の増大した
レベルは、該菌体内でのＤＸＰＳ酵素活性の増大によるものであると仮定された
。このことは、ＩＰＴＧで誘導した後に組換え大腸菌株からの菌体ホモジネート
を調製することにより確認された。反応生成物を２時間にわたって測定し、ＴＬ
Ｃにより分離し、ついで液体シンチレーションカウンティングにより定量した。
反応から得られた主たる生成物は化学合成したＤＸＰと一緒にクロマトグラフィ
ーされた。このことによりアッセイの主たる反応生成物としてＤＸＰが確認され
る。生成物のＹｑｉＥをコードするB. subtilisのＯＲＦおよびSynechocystis種
６８０３ＯＲＦ ｓｌｌ１９４５の推定ＤＸＰＳ機能が、これら結果により確立
された。表１は、組換え大腸菌株でのＤＸＰＳの比活性を示す。これら結果は、
ＤＸＰＳ活性が内生のｄｘｐｓ遺伝子を発現する大腸菌で増大したことを示して
いる。この増大はB. subtilisのＤＸＰＳを含むホモジネートで最大であり、対
照に比べて２.０倍の増大が観察された。Synechocystis種６８０３のＤＸＰＳを
含むホモジネートは、対照の反応に比べて１.８倍の増大を呈した。それゆえ、
大腸菌でのＤＸＰＳ活性の増大は、トランスジェニック株で観察されるカロテノ
イドおよびＵＱ−８の増大レベルによると思われる。
レベルは、該菌体内でのＤＸＰＳ酵素活性の増大によるものであると仮定された
。このことは、ＩＰＴＧで誘導した後に組換え大腸菌株からの菌体ホモジネート
を調製することにより確認された。反応生成物を２時間にわたって測定し、ＴＬ
Ｃにより分離し、ついで液体シンチレーションカウンティングにより定量した。
反応から得られた主たる生成物は化学合成したＤＸＰと一緒にクロマトグラフィ
ーされた。このことによりアッセイの主たる反応生成物としてＤＸＰが確認され
る。生成物のＹｑｉＥをコードするB. subtilisのＯＲＦおよびSynechocystis種
６８０３ＯＲＦ ｓｌｌ１９４５の推定ＤＸＰＳ機能が、これら結果により確立
された。表１は、組換え大腸菌株でのＤＸＰＳの比活性を示す。これら結果は、
ＤＸＰＳ活性が内生のｄｘｐｓ遺伝子を発現する大腸菌で増大したことを示して
いる。この増大はB. subtilisのＤＸＰＳを含むホモジネートで最大であり、対
照に比べて２.０倍の増大が観察された。Synechocystis種６８０３のＤＸＰＳを
含むホモジネートは、対照の反応に比べて１.８倍の増大を呈した。それゆえ、
大腸菌でのＤＸＰＳ活性の増大は、トランスジェニック株で観察されるカロテノ
イドおよびＵＱ−８の増大レベルによると思われる。
【００４６】 プラスミドｐＳＹＮＤＸＳＰおよびｐＢＳＤＸＰＳを発現する大腸菌間でのカ
ロテノイドレベルの相対的な増大は、インビトロの研究で観察される増大と極め
て近似している。このことは、ＤＸＰＳ活性と菌体のカロテノイド含量との間に
直接的な相関が存在することを示唆している。このことはＵＱ−８には当てはま
らず、ＵＱ−８レベルの増大はもっと抑制されているが、これは後のＵＱ−８生
合成経路での律速反応によるものかもしれない［３４］。これら結果は、大腸菌
での増大したＤＸＰＳ活性がカロテノイドおよびＵＱ−８の増大レベルとなると
いう仮説を支持している。これらデータは、大腸菌でのイソプレノイドレベルが
ＤＸＰＳ活性を高めることによって増大させ得ることを示唆している。
ロテノイドレベルの相対的な増大は、インビトロの研究で観察される増大と極め
て近似している。このことは、ＤＸＰＳ活性と菌体のカロテノイド含量との間に
直接的な相関が存在することを示唆している。このことはＵＱ−８には当てはま
らず、ＵＱ−８レベルの増大はもっと抑制されているが、これは後のＵＱ−８生
合成経路での律速反応によるものかもしれない［３４］。これら結果は、大腸菌
での増大したＤＸＰＳ活性がカロテノイドおよびＵＱ−８の増大レベルとなると
いう仮説を支持している。これらデータは、大腸菌でのイソプレノイドレベルが
ＤＸＰＳ活性を高めることによって増大させ得ることを示唆している。
【００４７】トマト植物での形質転換プロトコール ３親（Triparental）交配 リファンピシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有する液体ＬＢ培地（５ｍｌ）に、
ＬＢ／ｒｉｆプレートから取り出した単一のAgrobacterium tumefaciensのコロ
ニーを接種した。ついで、これを暗所にて２７℃のシェーキングインキュベータ
ー（２２５〜２５０ｒｐｍ）で４８時間インキュベートした。ヘルパー株大腸菌
ＨＢ１０１／ｐＲＫ２０１３（カナマイシン耐性）およびドナーの単一コロニー
も取り出し、適当な抗生物質を含むＬＢ液体培地中、３７℃で一夜増殖させた。
インキュベーション期間の後、各細菌培養液を１０,０００ｒｐｍで２分間遠心
分離にかけた。上澄み液を捨て、ペレットをＬＢ液体培地に再懸濁した。ついで
、各株のアリコート（各１００μｌ）を混合し、選択なしのＬＢプレート上に滅
菌スプレッダーで広げた。プレートを逆さまにし、暗所、２７℃にて一夜インキ
ュベートした。ついで、１白金耳（loopful）の一夜交配混合物を、選択抗生物
質（リファンピシンを１００μｇ／ｍｌおよびカナマイシンを５０μｇ／ｍｌ）
を含むＬＢプレート上に条を付けた。プレートを逆さまにし、暗所、２７℃にて
４８〜７２時間インキュベートした。ついで、単一のコロニーをトマト外植片の
形質転換に使用するため選択した。
ＬＢ／ｒｉｆプレートから取り出した単一のAgrobacterium tumefaciensのコロ
ニーを接種した。ついで、これを暗所にて２７℃のシェーキングインキュベータ
ー（２２５〜２５０ｒｐｍ）で４８時間インキュベートした。ヘルパー株大腸菌
ＨＢ１０１／ｐＲＫ２０１３（カナマイシン耐性）およびドナーの単一コロニー
も取り出し、適当な抗生物質を含むＬＢ液体培地中、３７℃で一夜増殖させた。
インキュベーション期間の後、各細菌培養液を１０,０００ｒｐｍで２分間遠心
分離にかけた。上澄み液を捨て、ペレットをＬＢ液体培地に再懸濁した。ついで
、各株のアリコート（各１００μｌ）を混合し、選択なしのＬＢプレート上に滅
菌スプレッダーで広げた。プレートを逆さまにし、暗所、２７℃にて一夜インキ
ュベートした。ついで、１白金耳（loopful）の一夜交配混合物を、選択抗生物
質（リファンピシンを１００μｇ／ｍｌおよびカナマイシンを５０μｇ／ｍｌ）
を含むＬＢプレート上に条を付けた。プレートを逆さまにし、暗所、２７℃にて
４８〜７２時間インキュベートした。ついで、単一のコロニーをトマト外植片の
形質転換に使用するため選択した。
【００４８】種子の滅菌 Ailsa craig品種のトマト種子を滅菌５０ｍｌ容Falcon管に入れた。これら種
子を７０％エタノールで３０秒間洗浄し、エタノールを除いた。ついで、１％Vi
rkonを加え、管を振盪しながら２７℃で２０〜３０分間インキュベートした。つ
いで、１％Virkonを加え、管を振盪しながら２７℃で２０〜３０分間インキュベ
ートした。ついで、これら種子を滅菌ふるいにより滅菌ｄＨ２Ｏ（〜５００ｍｌ
）で洗浄した。
子を７０％エタノールで３０秒間洗浄し、エタノールを除いた。ついで、１％Vi
rkonを加え、管を振盪しながら２７℃で２０〜３０分間インキュベートした。つ
いで、１％Virkonを加え、管を振盪しながら２７℃で２０〜３０分間インキュベ
ートした。ついで、これら種子を滅菌ふるいにより滅菌ｄＨ２Ｏ（〜５００ｍｌ
）で洗浄した。
【００４９】種子の種蒔き ＭＳ３Ｓ培地（１２５ｍｌ）を滅菌ダブルMagnetaポット（Sigma）当たりに注
ぎ、固まらせた。 ついで、５つの滅菌種子を各ポットに蒔き、制御温度室（２７℃）中、１６時
間の光周期および７０％の相対湿度の５つの冷白色光管の下で５週間インキュベ
ートした。
ぎ、固まらせた。 ついで、５つの滅菌種子を各ポットに蒔き、制御温度室（２７℃）中、１６時
間の光周期および７０％の相対湿度の５つの冷白色光管の下で５週間インキュベ
ートした。
【００５０】外植片の調製 ペトリ皿にＭＳ３Ｃ５ＺＲ培地を添加する（培地１リットル当たり２５プレー
ト）ことにより、外植片の調製のためにプレートを調製した。ついで、滅菌した
８.５ｃｍの濾過ディスクを各プレートに置いた。プレートをクリングフィルム
（cling film）に包み、室温で貯蔵した。外植片を５週齢の種苗のために無菌条
件下で取り出した。上記子葉から１〜１.５ｃｍの切片を切り出し、すべての葉
、根および葉節を除去した。外植片を段階１で調製したようにプレインキュベー
ション培地上の濾過ディスク上に置いた（プレート当たり１０）。ついで、プレ
ートを密封し、２６℃で低光強度にて貯蔵した。
ト）ことにより、外植片の調製のためにプレートを調製した。ついで、滅菌した
８.５ｃｍの濾過ディスクを各プレートに置いた。プレートをクリングフィルム
（cling film）に包み、室温で貯蔵した。外植片を５週齢の種苗のために無菌条
件下で取り出した。上記子葉から１〜１.５ｃｍの切片を切り出し、すべての葉
、根および葉節を除去した。外植片を段階１で調製したようにプレインキュベー
ション培地上の濾過ディスク上に置いた（プレート当たり１０）。ついで、プレ
ートを密封し、２６℃で低光強度にて貯蔵した。
【００５１】A. tumefaciensの培養調製物 ｐＶＢ６ ＴＳＥＣ−ＬＭＬかまたはｐＶＢ６ ３５Ｓ ＴＳＥＣ−ＬＭＬの
いずれかを含む３親交配からの幾つかのA. tumefaciensのコロニーを取り出し、
カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ液体培地（１０ｍｌ）を接種するの
に用いた。培養液をシェーキングインキュベーター（２２５〜２５０ｒｐｍ）中
、２７℃で２４時間インキュベートした。この一夜培養液（１０ｍｌ）をカナマ
イシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ液体培地（５０ｍｌ）に加えた。ついで、
この第二の培養液をシェーキングインキュベーター（２２５〜２５０ｒｐｍ）中
、２７℃で２４時間インキュベートした。
いずれかを含む３親交配からの幾つかのA. tumefaciensのコロニーを取り出し、
カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ液体培地（１０ｍｌ）を接種するの
に用いた。培養液をシェーキングインキュベーター（２２５〜２５０ｒｐｍ）中
、２７℃で２４時間インキュベートした。この一夜培養液（１０ｍｌ）をカナマ
イシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ液体培地（５０ｍｌ）に加えた。ついで、
この第二の培養液をシェーキングインキュベーター（２２５〜２５０ｒｐｍ）中
、２７℃で２４時間インキュベートした。
【００５２】 ついで、上記A. tumefaciens培養液（４０ｍｌ）をベンチトップ遠心管で短期
間遠心分離して（３,０００ｒｐｍまで）増殖の凝集塊を除去した。ついで、上
澄み液を滅菌５０ｍｌ容Falcon管に注意深く回収した。この上澄み液をベンチト
ップ遠心管中で３,０００ｒｐｍにて１０分間回転させ、上澄み液を捨てた。ペ
レットをＭＳ３Ｓ（３０ｍｌ）中に攪拌して再懸濁させた。培養液をＭＳ３Ｓで
１／１０倍に希釈し、５５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）をブランクとしてＭＳ３
Ｓを用いて測定した。ＯＤをＭＳ３Ｓで０.１に調節し、形質転換した各５０の
外植片について２０〜２５ｍｌの培養液を調製した。
間遠心分離して（３,０００ｒｐｍまで）増殖の凝集塊を除去した。ついで、上
澄み液を滅菌５０ｍｌ容Falcon管に注意深く回収した。この上澄み液をベンチト
ップ遠心管中で３,０００ｒｐｍにて１０分間回転させ、上澄み液を捨てた。ペ
レットをＭＳ３Ｓ（３０ｍｌ）中に攪拌して再懸濁させた。培養液をＭＳ３Ｓで
１／１０倍に希釈し、５５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）をブランクとしてＭＳ３
Ｓを用いて測定した。ＯＤをＭＳ３Ｓで０.１に調節し、形質転換した各５０の
外植片について２０〜２５ｍｌの培養液を調製した。
【００５３】外植片の形質転換 上記のようにして５０の外植片（５つのプレート）を調製し、ペトリ皿に移し
、ペトリ皿当たり２５ｍｌのA. tumefaciens溶液を注いだ。ついで、これらを二
重層の滅菌濾紙を含むペトリ皿に移す前に室温で１０分間インキュベートした。
ついで、外植片を、ＭＳ３ＳＣ５ＺＲ培地を含むプレートに移した（プレート当
たり１０）。プレートを密封し、ついで制御温度室（２７℃）で４８時間インキ
ュベートした。
、ペトリ皿当たり２５ｍｌのA. tumefaciens溶液を注いだ。ついで、これらを二
重層の滅菌濾紙を含むペトリ皿に移す前に室温で１０分間インキュベートした。
ついで、外植片を、ＭＳ３ＳＣ５ＺＲ培地を含むプレートに移した（プレート当
たり１０）。プレートを密封し、ついで制御温度室（２７℃）で４８時間インキ
ュベートした。
【００５４】選択 外植片を選択培地ＭＳ３Ｃ５ＲＣＫに移し（プレート当たり１０の外植片）、
制御温度室に戻す前に２週間密封した。
制御温度室に戻す前に２週間密封した。
【００５５】外植片の継代培養 選択後、外植片をＭＳ３Ｃ５ＺＲＣＫ培地上で２週間ごとに継代培養した。苗
条が発生したら注意深く切り取り、ＭＳ３Ｃ５ＣＫを含むPhytatrays（Sigma）
に移した。苗条が充分に成長したらＰＣＲ分析用のＤＮＡ試料を回収した。苗条
が根付いたら温室に移し、その際、まず１ｇ／ＬのOsmocote遅放出肥料とともに
バーミキュライト中に入れ、ついで根が確立されたら土に移した。
条が発生したら注意深く切り取り、ＭＳ３Ｃ５ＣＫを含むPhytatrays（Sigma）
に移した。苗条が充分に成長したらＰＣＲ分析用のＤＮＡ試料を回収した。苗条
が根付いたら温室に移し、その際、まず１ｇ／ＬのOsmocote遅放出肥料とともに
バーミキュライト中に入れ、ついで根が確立されたら土に移した。
【００５６】形質転換のための構築物 ｐＶＢ６ ３５Ｓ−ＴＳＥＣ−ＬＭＬおよびｐＶＢ６−ＴＳＥＣ−ＬＭＬは、
それぞれ図７および図６に模式図で示してある。形質転換体の分析 １．形質転換はすべて、大腸菌のＤｘｐｓ特異的プライマー：フォアウォード ：
それぞれ図７および図６に模式図で示してある。形質転換体の分析 １．形質転換はすべて、大腸菌のＤｘｐｓ特異的プライマー：フォアウォード ：
【化５】 リバース：
【化６】 を用いたＰＣＲを用い、導入遺伝子について試験した。 ２．ＰＣＲ陽性のものは、ｎｐｔＩＩプローブを用い、サザーンブロット分析に
より挿入物の数について試験した。
より挿入物の数について試験した。
【００５７】 ３．ついで、ＲＴ−ＰＣＲおよび上記１のプライマーを用い、単一挿入形質転換
をＤｘｐｓ発現について分析した。 ４．発現株のＤＸＰＳタンパク質レベルについて、大腸菌ＤＸＰＳタンパク質に
特異的な抗体を用いたウエスタンブロットを用いて試験した。約６９ｋＤａのバ
ンドが見出され、導入遺伝子の発現および成熟タンパク質からの輸送ペプチドの
開裂の両者を示していた。 ５．種子を全ての単一挿入株から種蒔きのために回収した。 ６．Ｔ１子孫を色素分析および表現型の遺伝のために培養した。
をＤｘｐｓ発現について分析した。 ４．発現株のＤＸＰＳタンパク質レベルについて、大腸菌ＤＸＰＳタンパク質に
特異的な抗体を用いたウエスタンブロットを用いて試験した。約６９ｋＤａのバ
ンドが見出され、導入遺伝子の発現および成熟タンパク質からの輸送ペプチドの
開裂の両者を示していた。 ５．種子を全ての単一挿入株から種蒔きのために回収した。 ６．Ｔ１子孫を色素分析および表現型の遺伝のために培養した。
【００５８】 イソプレノイドは大きな化合物群を構成しており、その多くは高い経済価値を
有する。ピルビン酸の脱カルボキシルに由来する（ヒドロキシ）チアミンとグリ
セルアルデヒド−３−リン酸とが縮合して１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５
−リン酸を生じる反応は、ＩＰＰの生合成および最終的にはイソプレノイドの生
合成のためのメバロン酸非依存経路における最初の反応であると考えられる。提
示したデータは、大腸菌でＤＸＰ合成速度が増大するとイソプレノイドの生合成
が増大する結果になることを示している。それゆえ、この知見は細菌からのイソ
プレノイドの工業的生産を最適化するのに利用することができる。
有する。ピルビン酸の脱カルボキシルに由来する（ヒドロキシ）チアミンとグリ
セルアルデヒド−３−リン酸とが縮合して１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５
−リン酸を生じる反応は、ＩＰＰの生合成および最終的にはイソプレノイドの生
合成のためのメバロン酸非依存経路における最初の反応であると考えられる。提
示したデータは、大腸菌でＤＸＰ合成速度が増大するとイソプレノイドの生合成
が増大する結果になることを示している。それゆえ、この知見は細菌からのイソ
プレノイドの工業的生産を最適化するのに利用することができる。
【００５９】 ＤＸＰＳと協調して特定のイソプレノイドの生合成において重要な酵素活性の
操作は、大腸菌または他の適当な細胞または生物、たとえば増大したイソプレノ
イドの産生を穀物の風味、香気および色の改善に利用できる植物において、特定
の高価値のイソプレノイドを産生させるべく操作するのに用いることができる。
あるいは、医薬および／または栄養特性を有するイソプレノイドを増大した濃度
で産生するために穀物を操作することができる。表１：大腸菌ホモジネートでのＤＸＰシンターゼ活性 比活性 活性増大の ｎｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質 倍数 対照 ５.８±０.０７ １.０ B. subtilis １１.５±０.５８ ２.０Syn.種６８０３ １０.４±０.２４ １.８
操作は、大腸菌または他の適当な細胞または生物、たとえば増大したイソプレノ
イドの産生を穀物の風味、香気および色の改善に利用できる植物において、特定
の高価値のイソプレノイドを産生させるべく操作するのに用いることができる。
あるいは、医薬および／または栄養特性を有するイソプレノイドを増大した濃度
で産生するために穀物を操作することができる。表１：大腸菌ホモジネートでのＤＸＰシンターゼ活性 比活性 活性増大の ｎｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質 倍数 対照 ５.８±０.０７ １.０ B. subtilis １１.５±０.５８ ２.０Syn.種６８０３ １０.４±０.２４ １.８
【００６０】参考文献
【表１】
【００６１】
【表２】
【００６２】
【表３】
【００６３】
【表４】
【図１】 ＩＰＰの生合成のための（Ａ）メバロン酸依存経路および（Ｂ）
メバロン酸非依存経路の説明図である。ＤＸＰＳによって触媒されるピルビン酸
およびグリセルアルデヒド−３−リン酸からの１−デオキシ−Ｄ−キシルロース
−５−リン酸の生合成について提唱された反応は囲みの内部に示してある。
メバロン酸非依存経路の説明図である。ＤＸＰＳによって触媒されるピルビン酸
およびグリセルアルデヒド−３−リン酸からの１−デオキシ−Ｄ−キシルロース
−５−リン酸の生合成について提唱された反応は囲みの内部に示してある。
【図２】 プラスミドｐＢＳＤＸＰＳおよびｐＳＹＤＸＰＳの構造を示す模
式図である。
式図である。
【図３】 本発明に用いたＤＸＰシンターゼ、Synechocystis種６８０３（S
. s）（GenBank D90903）、B. subtilis（B. s）（GenBank D84432）および大腸
菌（E. c）（GenBank AF035440）のアミノ酸配列のアラインメントを示す。コン
センサスライン（consen）は、３つの配列の全て（大文字）で保存された残基か
または２つの配列で同一で第三の配列では同等のアミノ酸で置換されている残基
（＋）を示す。プロトン移動に関与していると推定される保存されたヒスチジン
ドメインには上部に線を引いてあり、１の番号を付してある。第二の上部に線を
引いたドメイン（２）は、コンセンサスチアミンピロリン酸（ＴＰＰ）結合モチ
ーフを示す。
. s）（GenBank D90903）、B. subtilis（B. s）（GenBank D84432）および大腸
菌（E. c）（GenBank AF035440）のアミノ酸配列のアラインメントを示す。コン
センサスライン（consen）は、３つの配列の全て（大文字）で保存された残基か
または２つの配列で同一で第三の配列では同等のアミノ酸で置換されている残基
（＋）を示す。プロトン移動に関与していると推定される保存されたヒスチジン
ドメインには上部に線を引いてあり、１の番号を付してある。第二の上部に線を
引いたドメイン（２）は、コンセンサスチアミンピロリン酸（ＴＰＰ）結合モチ
ーフを示す。
【図４】 ベクターのみ（
【化７】 ）、B. subtilis ＤＸＰＳ（
【化８】 ）およびSynechocystis種６８０３ ＤＸＰＳ（
【化９】 ）を発現する組換え大腸菌培養液でのリコペンの蓄積を示すグラフである（デー
タは３つの独立した決定からの平均±Ｓ.Ｅ.Ｍ.である）。
タは３つの独立した決定からの平均±Ｓ.Ｅ.Ｍ.である）。
【図５】 大腸菌対照培養液（ベクターのみ）または外来B. subtilis dxps
（B. subtilis）、Synechocystis種６８０３ dxps（sp. 6803）もしくはA. thal
iana hmgr1（ＨＭＧＲ１）遺伝子を発現する大腸菌培養液のリコペン（空白のカ
ラム）およびＵＱ−８（影をつけたカラム）含量を示す（データは３つの独立し
た決定からの平均±Ｓ.Ｅ.Ｍ.である）。
（B. subtilis）、Synechocystis種６８０３ dxps（sp. 6803）もしくはA. thal
iana hmgr1（ＨＭＧＲ１）遺伝子を発現する大腸菌培養液のリコペン（空白のカ
ラム）およびＵＱ−８（影をつけたカラム）含量を示す（データは３つの独立し
た決定からの平均±Ｓ.Ｅ.Ｍ.である）。
【図６】 ベクターｐＶＢ６ ＴＳＥＣ ＬＭＬの模式図である。
【図７】 プラスミドｐＶＢ６ ３５Ｓ ＴＳＥＣ−ＬＭＬの模式図である
。
。
【図８】 大腸菌ＤＸＰＳのアミノ酸配列を示す。
【図９】 トマト植物に用いた輸送ペプチドを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/19 ４Ｈ０１１ 1/19 1/21 1/21 9/16 Ｂ 5/10 15/00 ＺＮＡＡ 9/16 5/00 Ａ Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ピーター・マイケル・ブラムリー イギリス、ティダブリュー20・０イーエッ クス、サリー、イーガム、デパートメン ト・オブ・バイオケミストリー、スクー ル・オブ・バイオロジカル・サイエンシー ズ、ロイヤル・ホロウェイ・ユニバーシテ ィ・オブ・ロンドン (72)発明者 マーク・ハーカー イギリス、ピーイー19・３キューエヌ、セ ント・ネオッツ、イートン・ソーコン、ラ ングウッド・クロース10番 Ｆターム(参考） 2B030 AB03 CA15 CA17 CA19 4B024 AA01 AA08 BA11 CA01 DA01 DA06 DA12 FA02 FA17 GA11 GA17 HA20 4B050 CC03 EE10 LL01 LL10 4B065 AA26X AA72X AA83X AA88X AB01 AC14 BA02 CA14 CA31 CA44 CA47 CA53 4C084 AA17 ZB212 ZB352 4H011 AB01 AB04 BB21 BB22 BB23
Claims (35)
- 【請求項１】 メバロン酸非依存イソペンテニル二リン酸合成経路を有する
細胞または生物中でイソプレノイド発現を操作する方法であって、酵素の１−デ
オキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＰＳ）、またはその機
能的等価物、誘導体または生合成前駆体の活性を変えることを含む方法。 - 【請求項２】 該イソプレノイドの産生が、該ＤＸＰＳの活性または発現を
促進することによって増大され、または該ＤＸＰＳ酵素の活性または発現を抑制
することによって低減される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 該促進されたＤＸＰＳ活性が、発現調節配列に作動可能に連
結した該ＤＸＰＳをコードする核酸分子および任意にリポーター分子を含むベク
ターでの該細胞または生物の形質転換によって生じる、請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 該核酸配列によってコードされる該ＤＸＰＳが該細胞または
生物にとって内生のものである、請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 該ベクターが、該細胞または生物中で所望のイソプレノイド
を産生しうるポリペプチドをコードする１またはそれ以上の核酸配列を含む、請
求項３または４に記載の方法。 - 【請求項６】 該細胞または生物が、所望のイソプレノイドを産生しうるポ
リペプチドをコードする１またはそれ以上の核酸配列を含む別のベクターで形質
転換される、請求項３または４に記載の方法。 - 【請求項７】 該細胞が、細菌、酵母または藻類の細胞である、請求項１な
いし６のいずれかに記載の方法。 - 【請求項８】 該細菌細胞が大腸菌である、請求項７に記載の方法。
- 【請求項９】 該生物が植物である、請求項１ないし８のいずれかに記載の
方法。 - 【請求項１０】 該ＤＸＰＳおよび／または該イソプレノイドを産生しうる
該ポリペプチドをコードする該核酸配列を含む該ベクターが、組織特異的なプロ
モーターの核酸配列および／またはプラスチド輸送ペプチドをコードする核酸配
列のいずれかをさらに含む、請求項３ないし９のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１１】 該所望のイソプレノイドが、栄養上の恩恵または美的な表
現型を付与するものである、請求項５ないし１０のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１２】 該イソプレノイドが、カロテノイド、ビタミンＥ、Ｂ１ま
たはＢ６、クロロフィル、フェニルキノンまたはジテルペンのいずれかを含む、
請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】 メバロン酸非依存ＩＰＰ生合成経路を有し、発現調節配列
に作動可能に連結したＤＸＰＳまたはその機能的等価物、誘導体または生合成前
駆体をコードする核酸配列を含むベクターで形質転換またはトランスフェクショ
ンされている細胞または生物。 - 【請求項１４】 該ベクターが、リポーター分子をコードする核酸分子をさ
らに含む、請求項１３に記載の細胞または生物。 - 【請求項１５】 所望のイソプレノイドを産生しうる１またはそれ以上のポ
リペプチドをコードする１またはそれ以上の核酸配列を含むベクターをさらに含
む、請求項１３または１４に記載の細胞または生物。 - 【請求項１６】 該所望のイソプレノイドが、カロテノイド、ビタミンＥ、
Ｂ１またはＢ６、クロロフィル、フェニルキノンまたはジテルペンのいずれかを
含む、請求項１５に記載の細胞または生物。 - 【請求項１７】 イソプレノイドの活性または発現を変調する化合物の同定
方法であって、試験すべき該化合物を、メバロン酸非依存ＩＰＰ生合成経路の成
員である分子とＤＸＰＳまたはその機能的等価物の存在下で接触させ、その際、
該分子は適当な反応物の存在下でＤＸＰＳ活性によって触媒される反応を担うも
のであり、ついで試験すべき該化合物の不在下で行った同反応と比較して該反応
の生成物の収量をモニターすることを含む方法。 - 【請求項１８】 該分子がピルビン酸を含み、該適当な反応物がグリセルア
ルデヒド−３−リン酸を含む、またはその逆である、請求項１７に記載の方法。 - 【請求項１９】 請求項１７または１８に記載の方法に従ってイソプレノイ
ド活性または発現のモデュレーターとして同定された化合物。 - 【請求項２０】 ＤＸＰＳまたはＤＸＰＳの機能的等価物のインヒビターを
含む、請求項１９に記載の化合物。 - 【請求項２１】 医薬または除草剤として用いるためのものである、請求項
２０に記載の化合物。 - 【請求項２２】 細菌関連疾患を治療する医薬を調製するための請求項２０
に記載の化合物の使用。 - 【請求項２３】 薬理学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤とともに
請求項２０に記載の化合物を含む、医薬組成物。 - 【請求項２４】 請求項２０に記載の化合物を含む、除草剤組成物。
- 【請求項２５】 メバロン酸非依存ＩＰＰ生合成経路を有し、ＤＸＰＳまた
はその機能的等価物、誘導体または生合成前駆体を発現しうる少なくとも１つの
導入遺伝子を含む、トランスジェニック細胞、組織または生物。 - 【請求項２６】 図３に記載の核酸配列のいずれかまたはその相補鎖の少な
くとも１つのさらなるコピーを含む、請求項２５に記載のトランスジェニック細
胞、組織または生物。 - 【請求項２７】 所望のイソプレノイドまたはその機能的等価物、誘導体ま
たは生合成前駆体を産生しうる１またはそれ以上のポリペプチドを発現しうる導
入遺伝子をさらに含む、請求項２５または２６に記載のトランスジェニック細胞
、組織または生物。 - 【請求項２８】 該生物が植物である、請求項２５ないし２７のいずれかに
記載のトランスジェニック細胞、組織または生物。 - 【請求項２９】 該植物がLycopersicon種のものである、請求項２８に記載
のトランスジェニック細胞、組織または生物。 - 【請求項３０】 請求項２５ないし２９のいずれかに記載の生物の子孫。
- 【請求項３１】 図８に記載の配列を有する大腸菌からのＤＸＰＳを発現し
うる導入遺伝子を含み、形質転換していない植物に比べて高いレベルのイソプレ
ノイドを含む、形質転換した植物。 - 【請求項３２】 図６および図７に示す構築物ｐＶＢ６ ＴＳＥＣ ＬＭＬ
またはｐＶＢ６ ３５Ｓ ＴＳＥＣ−ＬＭＬのいずれかを含む、請求項３１に記
載の形質転換した植物。 - 【請求項３３】 該植物がトマト植物である、請求項３１または３２に記載
の形質転換した植物。 - 【請求項３４】 請求項３３に記載の植物によって産生されたトマト果実。
- 【請求項３５】 請求項３３に記載の植物によって産生された種子。
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|---|---|---|---|
| GBGB9901902.8A GB9901902D0 (en) | 1999-01-28 | 1999-01-28 | Manipulating isoprenoid expression |
| GB9901902.8 | 1999-01-28 | ||
| PCT/GB2000/000263 WO2000044912A1 (en) | 1999-01-28 | 2000-01-28 | Manipulating isoprenoid expression |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000596152A Pending JP2002535970A (ja) | 1999-01-28 | 2000-01-28 | イソプレノイド発現の操作 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP2002535970A (ja) |
| AU (1) | AU2121100A (ja) |
| CA (1) | CA2360334A1 (ja) |
| GB (1) | GB9901902D0 (ja) |
| WO (1) | WO2000044912A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014500710A (ja) * | 2010-10-20 | 2014-01-16 | ジェノプランテ−ヴァロール | 向上したテルペン生合成に重要である１−デオキシ−ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ対立遺伝子 |
| JP2016019537A (ja) * | 2006-05-26 | 2016-02-04 | アムイリス， インコーポレイテッド | 生物有機化合物を製造するための装置 |
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|---|---|---|---|---|
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| US6660507B2 (en) * | 2000-09-01 | 2003-12-09 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Genes involved in isoprenoid compound production |
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