JP2002535616A - ミクロ製作キャピラリー電気泳動チップ及び複数のレドックス標識の同時検出方法 - Google Patents

ミクロ製作キャピラリー電気泳動チップ及び複数のレドックス標識の同時検出方法

Info

Publication number
JP2002535616A
JP2002535616A JP2000593947A JP2000593947A JP2002535616A JP 2002535616 A JP2002535616 A JP 2002535616A JP 2000593947 A JP2000593947 A JP 2000593947A JP 2000593947 A JP2000593947 A JP 2000593947A JP 2002535616 A JP2002535616 A JP 2002535616A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
different
redox
electrochemical
detection
labeled
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2000593947A
Other languages
English (en)
Other versions
JP3595265B2 (ja
Inventor
リチャード エイ マティース
パンカイ シンガール
イン シー
アレクサンダー エヌ グレイザー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Original Assignee
THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA filed Critical THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Publication of JP2002535616A publication Critical patent/JP2002535616A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3595265B2 publication Critical patent/JP3595265B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416Systems
    • G01N27/447Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704Details; Accessories
    • G01N27/44717Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones
    • G01N27/4473Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by electric means

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、マトリックスコード一覧表を使用して複数のレドックス活性標識を同時に検出するためのミクロ製作キャピラリー電気泳動チップ、及び電気泳動又はクロマトグラフ分離後に、複数の標識−検体接合体の同時電気化学的検出のために選択的に検体を標識化する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】 (政府の援助) 本発明は、米国エネルギー省によって与えられた契約番号FG03-91ER61125の下
に、政府の援助で為された。政府は、本発明に対して一定の権利を有する。 (発明の簡単な説明) 本発明は、マトリックスコード一覧表を用いて複数のレドックス活性標識を同
時に検出するためのミクロ製作キャピラリー電気泳動チップ、及び電気泳動又は
クロマトグラフ分離後、複数の標識−検体接合体を同時に電気化学的検出するた
めに検体を選択的に標識する方法に関する。
【0002】 (発明の背景) キャピラリー電気泳動法(CE)は、スラブゲル電気泳動法の伝統的アプロー
チに比し、その必要な試料量が少ないこと、高い効率及び分離が速いことにより
、DNA配列決定及び断片の分子量決定用の強力な手段として提供されている(
Swerdlow,H.及びGesteland,R.,(1990) Nucl.Acid.Res. 18,1415-1419)(Kheter
pal,I.,Scherer,J.R.,Clark,S.M.,Radhakrishnan,A.,Ju.J.,Ginther,C.L.,Sensa
baugh,G.F.及びMathies,R.A.,(1996) Electrophoresis 17,1852-1859)。さらに
最近、ミクロ製作CEデバイス及びキャピラリー配列電気泳動(CAE)ミクロ
プレートが、DNAの分子量決定及び配列決定試料の迅速な平行分離にその効力
を示している(Woolley,A.T.及びMathies,R.A.,(1994) Proc.Natl.Acad.Sci. U.
S.A. 91,11348-11352)(Woolley,A.T.及びMathies,R.A., Anal.Chem. 67,3676-
3680,1995)(Woolley,A.T.,Sensabaugh,G.F.,及びMathies,R.A.,(1997) Anal C
hem. 69,2256-2261)(Simpson,P.C.,Roach,D.,Woolley,A.T.,Thorsen,T.,Johns
ton,R.,Sensabaugh,G.F.,及びMathies,R.A.,(1998) Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A
. 95,2256-2261)。これらの小型化CEプラットホームの開発は、完全に統合さ
れ、安価で持ち運びのできる分析システムを作るというコンセプトによって進め
られている。
【0003】 電気化学的(EC)検出は、感度又は選択性を何ら犠牲にすることなく小型化
CEプラットフォームに容易に適合できるアプローチである。EC検出は、種々
の検体の高い感応的かつ選択的検出用の溶融シリカキャピラリーにおける従来の
CEで広く使用されている。この応用の重大な問題は、どのようにして電気化学
的検出システムから高い電気泳動分離電流をデカップルするかを見出すことであ
る。Wallingford及びEwingは、まず多孔性ガラス原料によるカラム上の割れ目を
使用して、小さい電気化学シグナルから高い電気泳動電流をデカップルすること
を開示した(Wallingford,R.A.及びEwing,A.G.,(1987) Anal.Chem. 59,1762-176
6)。多孔性ガラス原料は、キャピラリーの出口で釣り合わされている検出電極
より先に電気泳動電流をアースする方法を与えた。緩衝液中の検体は、キャピラ
リー中に存在する残りの電気浸透流によって、検出電極に汲み上げられた。検出
電極からの分離電場の効果的なデカップルにより、このスキームは、検体の高感
度検出を可能にした。しかし、このシステムは、繊細な多孔性ガラス原料のため
非常に脆く、かつキャピラリーの出口に電極を整列させることが難しかった。そ
れ以来電気泳動電流を分離するために、多孔性ナフィオンチューブ(O'Shea,T.J
., Greenhagen,R.D.,Lunte,S.M.,Lunte,C.E.,Smyth,M.R.,Radzik,D.M.及びWatan
abe,N.,(1992) J.Chromatogr. 593,305-312)、及びパラジウムジョイント(Kok,
W.T.,及びSahin,Y.,(1993) Anal.Chem. 65,2497-2501)を含む多くの他の設計が
使用されてきた。これらの設計はすべて非常に脆弱で、丈夫なCE-ECシステ
ムの構築には受け入れられない。そこで、カラム上の割れ目デザインの代替とし
て小径キャピラリーの末端カラム検出が提案された(Huang,X.H.,Zare,R.N.,Slo
ss,S.,及びEwing,A.G.,(1991) Anal.Chem. 63,189-192)。このアプローチは、
より小さい内径(<10μm)のキャピラリーは、そのずっと小さい領域のため
非常に低い電気泳動電流を示すという事実を利用した。従って、電気泳動電流の
ための隔離が不要であり、それによってカラム上の電流デカップラーも不要にな
った。EC検出は、フェムトモルからアトモル質量範囲の種々の検体を検出限度
とする、直径2μm程度の溶融シリカキャピラリー(Olefirowicz,T.M.及びEwing
,A.G., (1990) Anal.Chem. 62, 1872-1876)におけるキャピラリー電気泳動用の
検出方法としてうまく使用されている。同様の直径の電気泳動用キャピラリーは
、より小径の電極、又は微小電極を使用する必要がある。これら微小電極では、
バックグラウンド荷電電流の著しい減少のためバックグラウンドノイズがより低
い(Bard,A.J.及びFaulkner,L.R.,(1980) Electrochemical Methods:Fundamenta
ls and Applications, New York,John Wiley and Sons)。これは、高いS-N比
のためより良い濃度感応性を導く。これら微小電極では、高電量効果のため質量
感応性も、より大きい電極以上に高められる(前出のHuang,X.H.ら)。従って、
末端カラム検出は、感度のいずれの損失もなくCE-ECアプローチをうまく達
成させる。しかし、このような小径のキャピラリーの出口に微小電極を正確に位
置づけるためには、非常に高価な微細位置決め装置が必要である。結果として、
この設計を使用すると、実験間の再現性が非常に乏しい。多くの研究者が、CE
−キャピラリーの外側の適所に電極を接着する種々の方法を試みてきたが(Ferm
ier,A.M.,Gostkowski,M.L.,及びColon,L.A.,(1996) Anal.Chem. 68,1661-1664)
(Chen,M.C.及びHuang,H.J.,(1997) Anal.Chem.Acta. 341,83-90)、このアプロ
ーチは、極小径キャピラリーにより未だ非常に冗漫かつ再現性がない。また、小
さいキャピラリー電極を配列したこのようなアセンブリを多数確実に作ることは
非常に困難である。従って、従来のキャピラリー及び電極による末端カラム検出
は、日常的かつ自動化分析では役に立たない。
【0004】 ミクロ製作チャネルの出口における電極のミクロ製作は、電極が高い精度及び
再現性で永久的に作製されうるので、日常的に末端カラム検出を行うことを可能
にする。最近、完全なミクロ製作システムに関するCE-EC検出へのアプロー
チが、Woolleyらによって示された(Woolley,A.T.,Lao,K.,Glazer,A.N.及びMath
ies,R.A.,(1998) Anal.Chem. 70,684-688)。白金微小電極が、ガラスプレート
にエッチングされたCE−チャネルの出口に作製され、末端カラム検出様式の電
気泳動電流から検出システムを有効に隔離させる。アトモル範囲の検出限度によ
る神経伝達物質の感受性検出が、高い再現性で達成された。電気化学的検出が統
合されたミクロ製作キャピラリーチップを使用して、高感度のDNA制限酵素断
片解析及びPCR生成物の分子量決定を行う可能性も示された。DNA断片は、
電気泳動緩衝液に電気活性インターカレーター、鉄−フェナントロリンを添加す
ることによって間接的に検出された。このアプローチを用いてφxHAE-III制限
消化が検出された。603塩基対(bp)断片の検出限度は30ゼプトモルぐらいであ
り、サルモネラ菌からのPCR生成物は、内部制限酵素断片標準に対して容易に
分子量決定された。このことは、ミクロ製作CE-ECシステムは、高感度検出
の能力があることを示している。
【0005】 しかし、間接的な検出は、所望の検体の検出に対して特異的でないので、複雑
な混合物中の特定の典型的検体の選択的な検出には適さない。さらに、我々の以
前の研究では、間接的かつ非−共有結合性のレドックス活性標識はただ一つしか
なかったので、シグナルが重なってしまい、未知のDNA断片の大きさをそれ又
は標準と比較することはさらに困難であった。検体の直接標識化は、一般に種々
の検体の選択的な同時多重検出を達成するのに必要とされる。例えば、蛍光に基
づいたDNA配列決定の場合、サンガージデオキシ法によって生成された4つの
各塩基終止ラダーの同時検出に、4つの異なった蛍光標識が必要とされ使用され
た(Sanger,F.,Nicklen,S.,及びCoulson,A.R.,(1977) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A. 74,5463-5467)(Smith,L.M.,Sanders,J.Z.,Kaiser,R.J.,Hughes,P.,Dodd,C.
, Connell,C.R.,Heiner,C.,Kent,S.B.及びHood,L.E.,(1986) Nature 321,674-67
9)(Prober,J.M.,Trainor,G.L.,Dam,R.J.,Hobbs,F.W.,Robertson,C.W.,Zaguesk
y,R.J.,Cocuzza,A.J.,Jensen,M.A.及びBaumeister,K.,(1987) Science 238,336-
341)。これらの研究では、特異的標識との伸展反応で用いられるプライマー又
はターミネーターのいずれかを標識化することによって、4つの異なった配列決
定断片ラダーに、特異的な蛍光標識が連結された。さらに、米国特許第5,436,13
0号は、単一のスラブゲルレーン又は電気泳動キャピラリーを使用するDNA配
列決定法を開示している。配列決定断片は、前記レーン中で分離され、かつレー
ザー励起された共焦点蛍光スキャナーによって検出された。この場合、DNA配
列決定断片の各セットは、同一のレーンで分離され、それから4セットの配列決
定断片を特異的に標識化するために2つの異なった蛍光標識のみを利用する二進
コード一覧表によって区別される。また、放射性同位元素標識を使用して同様に
断片をコード化し、又は標識化する方法が記載されている。DNA配列決定用途
では、多重電気化学的標識化、分離及び検出方法の開発は明らかに有益である。
また、DNA断片の多重標識化の同様の方法を開発して、RFLP、STR又は
SNPアッセイ等を利用するDNA診断で使用することも有益である。CE-E
C実験における複数標識の同時検出には、このような系によって生成される複数
の電気化学シグナルの検出が可能な戦略の開発が必要である。異なった化合物間
のレドックス電位の相異を、EC検出を用いた選択的測定に利用することができ
る。伝統的なボルタンメトリー法は、文献で広く使用されており、これらの相異
を利用している(Kristensen,E.W.,Kuhr,W.G.,及びWightman,R.M.,(1987) Anal.
Chem. 59,p.1752)。しかし、これらの方法は、大きなバックグラウンド荷電電
流を導く電極電位の速いスキャニングを含む。これら大きい荷電電流によって生
じる高いバックグラウンドノイズのめ、感度に乏しい。
【0006】 (発明の目的及び概要) 本発明の一般的な目的は、複数電極を用いて複数の化学電気シグナルを同時に
検出するための方法及び装置を提供することである。 本発明の他の目的は、特異的な標識又は検体の検出用に各電極が最適化された
複数の電極を有するミクロ製作CEチップを提供することである。 本発明のさらなる他の目的は、複数の検体の多重標識化と電気化学的検出のた
めの方法及び装置を提供することである。 さらに、本発明の他の目的は、レドックス標識を検体に結合させ、電気泳動的
に該検体を分離し、かつ電気化学的に個々に分離された検体を検出する方法を提
供することである。 他の目的は、明確に検出可能な異なったEC−標識で、複数の検体を標識化す
る方法を開発することによって達成される。
【0007】 本発明の上述及び他の目的は、広くなって検出貯蔵部になる分離チャネルを含
むミクロ製作電気泳動チップであって、その分離チャネルの末端に近接して、前
記検出貯蔵部中に伸長する複数の薄膜検出電極又は作用電極を有するミクロ製作
電気泳動チップによって達成される。本発明の他の目的は、検体がその電気泳動
チップ中で分離された後に、検体混合物中の検体に結合された異なるレドックス
標識によって、前記検出電極で生成される電気化学シグナルを同時に検出する方
法によって達成される。 別の目的は、同時に複数の検体を識別するために種々の検体を多重電気化学的
標識化及びコード化する方法である。 さらなる目的は、電気化学的検出によって遺伝子分類及び配列決定を行うため
の分離、検出及び標識化方法を開発することである。 本発明の上記及び他の目的は、図面を参照しながら以下の説明を読むことで、
さらに明瞭に理解されるだろう。
【0008】 (好ましい実施形態の説明) 複数の検体の高度に選択的な多重標識化及び電気化学的検出のための新規なア
プローチについて記載する。レドックス標識は、DNA、RNA、ヌクレオチド
、ペプチド及びタンパク質、炭水化物及びアミノ酸等のようなすべての可能な検
体に結合させることができる。標識化された検体は、分離法と共に検出される。
分離法は、CE、キャピラリーゾーン電気泳動法(CZE)、ミセルクロマトグ
ラフィー(MEKC)、等電集束法(IEF)、等速電気泳動法(ITP)、液
体クロマトグラフィー(LC)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、キ
ャピラリー電気クロマトグラフィー(CEC)、キャピラリーゲル電気泳動法(
CGC)、及び電気泳動又はクロマトグラフ的分離の他のいずれの形態でもよい
。我々は、レドックス活性標識をオリゴヌクレオチドに結合させるアプローチを
示すが、レドックス活性又は他の標識の他分子への結合について文献に記載され
ている他の合成経路も使用できる。特に、3又は4つの異なる電気化学標識を使
用して、DNA配列決定実験における4セットの塩基ラダーの検出及び同定で必
要とされるような、標識:標的接合体の選択的な電気化学的検出の概念を示す。
複数のシグナルを同時に検出し、かつマトリックス値に基づく標識を特異的に同
定できるマトリックスを基にしたコード一覧表を記載する。このコード一覧表は
、レドックス活性電位及び/又は電極面における反応速度論によって相互に異な
る種々のレドックス活性標識について使用できる。本方法は、電気化学的検出が
統合されたCE−チャネルを用いて、電気泳動条件下、レドックス標識を検出す
ることによって例証される。本コード化法は、他のレドックス標識の検出及び同
定、又は検体が特徴的なレドックス特性を有する場合は標識化されない検体の検
出のために同様の様式で使用できる。ミクロ製作され、分離の際、複数検体の同
時検出のためにレドックス活性標識間のこれらの相異を利用できる新規なCE-
ECチップの設計について記載する。
【0009】 ジ−、トリ−、テトラ−、及びペンタヌクレオチド反復を含むような多重DN
A配列の遺伝分析の一領域は、しばしば遺伝学的に多型である。EC標識化及び
分析は、短い縦列の反復又はSTRsの分析に有用である。2000以上のこれら短
い縦列の反復(STR)の多型性は、ヒトゲノムに関してマッピングされており
、かつ発見されるべき数千以上が残存していると考えられている。このタイプの
多型性の豊富さ及びポリメラーゼ鎖反応(PCR)による増幅後のSTR検出の
容易さのため、STRsは、遺伝子マッピング研究でマーカーとしての広範な用
途を見出してきており、かつ父系性及び人格的同一性の試験での用途に可能性の
あるマーカーとして世に出てきている。遺伝子マッピング及び集団多型性データ
バンクの開発におけるサイズ標準に対する複数のSTRマーカーの分析は、PC
R段階で用いられるプライマーの多重レドックス標識化及び電気化学的検出によ
って達成することができる。同様のプライマー標識化法は、制限酵素断片長多型
性(RFLP)の遺伝子分類又は種々のタイプの標識化ポリヌクレオチド連結アッ
セイでも使用できるだろう。また、核酸断片が未知の型に対するサイズ標準とし
て独特な電気化学的標準化断片ラダーを使用することも可能であり、そのサイズ
標準は、EC−標識化プライマー又はヌクレオチドを用いてPCRによって生成
される。
【0010】 サンガージデオキシ鎖終結法(Sangerら,Proc.Natl.Acad.Sci. 74,5463-5467(
1972))は、大規模な配列決定プロジェクトに受け入れられる方法である。プラ
イマー又はターミネーターは、レドックス標識で標識化可能であり、分析される
DNA鋳型のすべての可能な断片を生成するのに使用され、4つの異なった塩基
(A、C、G、T)で終結する断片が分離され、かつ同時に電気化学的にその異
なったレドックス電位によって同定される。多重レドックス標識化及び電気化学
的検出は、すべて標識化及び遺伝的変異を決定するためにプライマー又はターミ
ネーターを使用するRFLP分析、ミクロサテライト分析、及び単一ヌクレオチ
ド多型性(SNP)分析のような遺伝子分類する他の方法と共に使用することが
できる。RFLP、STR、オリゴヌクレオチド連結アッセイ、及び単一ヌクレ
オチド多型性分類(本質的に配列決定する)の達成のために使用される方法では
、標識化プライマー、標識化塩基又は標識化ターミネーターのいずれかを取り入
れることができるので、電気化学的に活性な標識をどのように利用して、これら
の全種類のアッセイを行うかを直ちに理解することができる。
【0011】 本発明の一観点に従い、4''−ガラスウェーハ11をエッチングしてCE分離
チャネル12と、検出貯蔵部13を形成した。一実施例では、該チャネルは、幅
33μm及び深さ14μmであった。1000オングストローム以下の厚さの白金(P
t)層を、RFスパッタリングによってウェーハ全体に被膜生成し、標準的なフ
ォトリソグラフィーによってパターン化した。そして、熱王水(3:1,HCl:HNO3
で、硬く焼きつけられた(hard-baked)フォトレジストで保護されたPtパターン
を残して、露光されたPt層をエッチングした。次いで、フォトレジストを除去
して、図1に示されるような所望の電極パターンを露出させた。パターンは、P
tのCE基底電極16、作用電極1〜4、補助電極17、及び参照電極18を含
む。作用電極は、幅10μm、間隔5μmをあけて離し、かつ好ましくはCEチャ
ネルの出口から20μmの間隔をあけて離した。作用電極は、該チャネルの末端
から100μm以下であることが好ましいが、該チャネルの末端から500μm程
度でもよい。CE電流からの作用電極の隔離後に、何らの有意な損失もなく分離
カラムから溶出する検体を検出できるという原理は、以前に開示されている(Wo
olley,A.T.,Lao,K.,Glazer,A.N.及びMathies,R.A.,(1998) Anal.Chem. 70,684-6
88)(Mathies,R.A.,Glazer,A.N.,Woolley,A.T.,及びLao,K.,(1996) 米国特許出
願第703,394号;1996年8月26日提出、「ミクロ製作キャピラリー電気泳動チップ
上に組み込まれた電気化学的検出部」及び1997年8月22日に提出された一部継続
出願番号08/916,557)。要するに、分離チャネルが、広くなって該チャネルの1
0〜100倍の幅の検出貯蔵部になっている。電気泳動電流がこの貯蔵部に入る
と、領域が大きくなり、かつ溶液の抵抗が減少するので、電気泳動電流は瞬時に
アースされる。電気泳動電流からの干渉は、広くなっている点から20μmに、
作用電極を配置することで最少化される。検体の拡散損失は、作用電極がチャネ
ルの出口に近接して配置されているため最小である。結果として、作用電極で検
出される検体濃度は高いが、電気泳動電流からのピックアップは最少化される。
【0012】 記載する実験では、特に言及しない限り、すべての分離は、単一の作用電極を
有するミクロ製作電気泳動チップを備えたキャピラリーゾーン電気泳動と同一条
件下で行った。陽極23及び検出貯蔵部を浮かせながら、試料貯蔵部21に40
秒間+400ボルトかけ、かつ試料廃物貯蔵部22をアースすることによって注
入を行った。そして、陽極の貯蔵部に+400ボルトの高い正の電圧をかけ、か
つ該貯蔵部をアースされる検出末端(陰極)に保持することによって、電圧を分
離用に切り換えた。実験の際それぞれに+300ボルトをかけて、試料貯蔵部及
び試料廃物貯蔵部をバックバイアスした。すべての分離は、分離緩衝液として2
5mMのモルフォリノ−エタン−スルホン酸(MES、1mM Cl-と共に,pH=5.65
)を用いて行った。
【0013】 すべての電位は、参照電極18に対する相対値であり、低ノイズポテンシオス
タット24(Low-current module,BioAnalytical Systems,IN)を使用して印加し
た。シグナルは同一のポテンシオスタットで収集し、Apple Macintosh PowerBoo
k 1400cで、Lab Viewソフトウェア及びDAQ-1200カード(National Instruments,
TX)を用いて、5Hzのサンプリング速度でデジタル化した。
【0014】 キノン及びヒドロキノンは、生物学的酸化還元プロセスの電気化学的研究でモ
デル化合物として広く使用され、その電気化学的性質がよく知られているので、
初期分離用の標識の例として選択した(Enzyme and Metabolic Inhibitors,J.L.
Webb,Academic Press,N.Y.,Vol.3,pp.421-594(1966))。これら化合物は、入手し
やすく、通常の実験条件下で扱い易く、複雑でない電気化学的反応性を示し、か
つ広範な構造及び化学的性質を示すので有利である。これら化合物のレドックス
電位は、種々の置換基、複素環芳香族性、環のひずみ及び溶媒に依存する。化学
構造を変えることによってレドックス電位を調節する能力は、適度にレドックス
電位に差のある非常に近接した関連化合物の系統群を生成する方法を与える。図
2は、MECN又はEtOHのような有機溶液中で異なったレドックス電位Ep
を有する種々のキノイドレドックス標識の一覧を示す。4つの標識、すなわち、
1,4-ジヒドロキノン(1)、1,4-ジヒドロキシ-2-ナフトエ酸(2)、1-メチル,4-ベ
ンゾキノン(3)、及び2,5-ジクロロ-1,4-ベンゾキノン(4)は有意に異なる電位
で検出されるので、選択された。代表値を生成するのに使用される特定の実験及
び溶媒条件下で、それぞれ、1及び2は、+0.46及び+0.23ボルトの正の(又は
酸化)電位で検出され、3及び4は、−0.58及び−0.18ボルトの負の(又は還元
)電位で検出される。
【0015】 検出チャネル間のクロストークのいかなる可能性も最小限にするために、標識
の検出電位を選択して、相互に200mV以上の差があるようにする。2つの酸化
性標識及び2つの還元性標識の使用により、図3に示されるようなマトリックス
コード化法を用いてこれらのシグナルを説明する。特定の標識についての酸化電
極におけるシグナルは、その電位でバックグラウンド以上に有意なシグナルが見
られるかどうかによって、「正の高(+1)又は低(0)」として分類される。
還元シグナル(反対の極性である)は、この場合もやはりその電極でバックグラ
ウンド以上に有意なシグナルが見られるかどうかによって、「負の高(又は−1
)及び低(0)」として分類される。より高い酸化電位(V2)を有する標識は
、最も高い酸化電極でのみ検出され、マトリックスコード(0,1)が与えられ
る。これは、図3中の標識1によって例示され、この実験の特定条件下、電位V 2 で酸化されるが、より低電位V1に保持された電極では酸化されない。低酸化電
位V1を有する他の酸化性標識は、両方の酸化電極で検出されるので、それはコ
ード(1,1)が与えられる。同様に、2つの還元性シグナルは、(0,−1)
及び(−1,−1)にコード化される。結果として、各標識は特異的な「符号付
き二進コード」又はマトリックス値を有し、それゆえ明解に同定できる。このコ
ード化法は、検出シグナルを相互に分解する方法を与えるので、種々の標識化検
体から電気化学シグナルの特異的な測定を確実にする。
【0016】 このアプローチを用いた2つの酸化性標識の選択的な電気化学的検出が、図4
A、4Bに示されている。1(1,4-ジヒドロキノン)及び2(1,4-ジヒドロキシ-2-
ナフトエ酸)は、異なった電極電位を用いて選択的に検出される。検体をCEチ
ャネルに注入し、キャピラリーゾーン電気泳動法によって分離した。我々の実験
条件では、1は+0.9ボルトのより高い酸化電位で容易に検出されるが、そのシ
グナルは、電極電位を+0.6ボルト以下に下げることによって完全になくなる(
図4A)。一方、同一条件下で、2は+0.9ボルト及び+0.6ボルトでも非常に容
易に検出される(図4B)。結果として、2つの酸化性標識は、+0.6ボルト(V 1 )で2(のみ)を検出する電極と、0.9ボルト(V2)で1及び2の両方を検出する電
極とを釣り合わせることによって、相互に区別することができる。これらの検出
電圧は、溶媒及び緩衝液の実験条件が異なるため、図2に示されるものとはいく
らか相異する。1についてのマトリックス値は、それが高電位電極でのみ検出さ
れるので、(0,1)であるのに対して、2のマトリックス値は、それが両電極
で検出されるので、(1,1)である。
【0017】 同様のアプローチが、図5A、5Bに示されるように、還元性標識の選択的検
出について例示される。我々の実験条件下、3(1-メチル,4-ベンゾキノン)は、
−0.4ボルト以上でのみ検出されるのに対して、4(2,5-ジクロロ-1,4-ベンゾキ
ノン)は、−0.2ボルトと−0.4ボルトで容易に検出される。従って、1つの電極
を4のみの検出用に−0.2ボルトに合わせ、かつ他方の電極を3と4両方の検出
用に−0.4ボルトに合わせることによって、2つの標識は区別される。3のマト
リックス値は、それが最も負の電極でのみ検出されるので、(0,−1)であるが
、4は両方の還元電極で検出されるので、(−1,−1)という値は4をコード
する。4つの標識は、特異なマトリックス値を有するので、一意的にコード化さ
れ、結果的に確実に同定される。
【0018】 このコード一覧表で、他の組合せを使用できる。例えば、標識がそれぞれ異な
るレドックス電位で反応する4つの酸化性(又は4つの還元性)標識を使用でき
る。図6は、酸化的場合に適用するマトリックス値を示す。各標識に対して値が
特異的なので、複数のシグナルの完全な同定が可能である。この検出戦略は、単
一分離で検出する必要のある電気化学的標識のいかなる数にも容易に増減される
。「N」個の検体は、「N」個の異なる標識(酸化性及び還元性の両方)を該検
体に結合させることによって検出されうる。選択性は、一般的に、それらのレド
ックス電位が約60mV以上離れるように設計された標識間で達成することができ
る(Bard,A.J.及びFauikner,L.R.,(1980) Electrochemical Methods;Fundament
als and Applications,New York,Jhon Wiley and Sons)。従って、混合物中の
複数試料の分析は、所望の標的で標識を接合する各試料用の適切な標識を合成後
、そのコード化された標識:標的接合体を検出して達成できる。
【0019】 選択的な電気化学的検出の別のアプローチは、電極面における不均一電子伝達
速度定数(k0)の異なるレドックス標識を設計することである。大部分の電極は
、レドックス活性の非常に制限された電位窓(−1.0〜+1.0ボルト)のみを示す
ので、レドックス電位差による選択的検出に使用可能な標識を限定する。しかし
、分子のレドックス活性についての反応速度論は、種々の電極面で、10-6cm2/
sから10-9cm2/sに容易に変化しうる。従って、異なるk0値を有する標識を設
計すると、レドックス電位差に比し、ずっと広範な選択性を与える。このk0
差を利用し、伝統的なボルタンメトリー法を用いて電気活性標識を選択的に検出
できる。例えば、4種の検体は、異なるスキャン速度で検出電位範囲を横断して
4つの電極を循環させることによって検出されうる。異なるスキャン速度は、1
つの電極が1つの検体毎の検出用のk0に対応するようにオーダーを増やして選
択される。最も遅い反応検体(最小k0)は、最も遅いスキャニング電極のみで
検出され、他のより速いスキャニング電極では検出されない。次に遅い検体は、
2つの遅いスキャニング電極で検出されるなどである。この場合、レドックス電
位を基礎とする選択性について、図6に示されたものと類似のコード一覧表が達
成されうる。しかし、これらボルタンメトリー法の感度は、高々ミクロモル濃度
範囲なので、DNA配列決定生成物のような低レベルの検体を検出するのには十
分な感度ではない。その場合、正弦波ボルタンメトリー検出は、伝統的なボルタ
ンメトリー検出に比し、優れた選択性及び感度なので利用できる(Singhal,P.,K
awagoe,K.T., Christian,C.N.,及びKuhr,W.G.,(1997) Anal.Chem. 69,1662-1668
)。この方法は、大きい振幅の正弦波形を使用して、電極面上を電極窓を横断し
てスキャンする。伝統的なアプローチが時間に対する電気化学シグナルを観察す
るのに代えて、この技術は、電気化学シグナルの調和アイソレーション及びデジ
タル相ロッキングに依る。それは、定電位検出の少なくとも2桁大きい感度であ
り、かつ循環ボルタンメトリー検出より4桁まで大きい感度である。ナノモル程
度の種々の炭水化物(Singhal,P.,Kawagoe,K.T.,Christian,C.N.,及びKuhr,W.G.
,(1997) Anal.Chem. 69,1662-1668)及びヌクレオチド(Singhal,P.及びKuhr,W.
G.,(1997) Anal.Chem. 69,3552-3557)、及びピコモル程度のオリゴヌクレオチ
ド及びDNA(Singhal,P.及びKuhr,W.G.,(1997) Anal.Chem. 69,3552-3557)が
、この方法で検出されうる。ポリメラーゼ伸長を利用する配列決定及び遺伝子分
類用途におけるシグナル対ノイズを高める別のアプローチは、伸長又はPCR反
応でレドックス標識化されたdTNPsを使用して、複数の標識が分子決定すべ
き各断片中に導入される。
【0020】 上述のすべてのアプローチは、レドックス活性標識を検出するために1種の電
極材料(白金)のみを必要とする。電極として他の金属を利用しても選択的検出を
達成できる。例えば、銅電極は、プリン及びピリミジン塩基の両ヌクレオチドを
電気触媒的に酸化することが示されている(Singhal,P.及びKuhr,W.G.,(1997) A
nal.Chem. 69,3552-3557)。そこで、DNA配列決定の場合は、すべての4つの
白金電極の使用に代えて、1つの電極を銅から作ることができる。この電極は、
基本的に検出器末端における各DNA断片の到着用カウンターとして作用する。
そして、3つの他の電極を使用して、3つの異なる標識化塩基を検出することが
できる。このような3色の組合せコード化法は、最近、Kheterpalらによって詳
細に記載され(Kheterpal,I.,Li,L.Speed,T.P.及びMathies,R.A.,(1998) Electr
ophoresis 19,1403-1414)、かつ蛍光に基づくDNA配列決定について非常にう
まくいくことが示された。従って、このアプローチは、以前に記載された方法で
必要とされる4つの標識の代わりに、3つのみのレドックス活性標識の合成が必
要である。このアプローチは、シグナルが相互に容易に分解される、より簡単な
標識化及び検出方法を実現することができる。
【0021】 レドックス活性標識は、多種多様の合成アプローチによって、問題の種々の検
体に結合させることができる。M-13試料のための2(1,4-ジヒドロキシ-2-ナ
フトエ酸)のDNAプライマーへの結合は、この研究では、レドックス活性標識
をオリゴヌクレオチドに付けるのに使用される合成経路の例として示されている
。まず、図7の上部に示されるスキームによって、2の活性なN-ヒドロキシス
クシンイミドエステルを合成した。そして、その活性誘導体を5'-アミノヘキシ
ル-末端プライマーと連結することによって、電気化学的に活性なDNAプロー
ブを調製した。この手順は、伝統的なヌクレオシドホスホラミダイト化学を利用
する5'-アミノ機能化プライマーオリゴヌクレオチドの初期固相合成を含む。こ
の後に、1,4-ジヒドロキシ-2-ナフトエ酸のN-ヒドロキシスクシンイミドエステ
ルに、CPG固体担体オリゴヌクレオチドを接合した。次いで、この担体を水酸
化アンモニウム水溶液にさらして、完全に脱保護されたプライマー接合体を遊離
させ、逆相HPLCで精製した。図8は、ヒドロキノン標識の結合後のM-13
プライマーの高感度検出を示している。この標識化された検体の質量検出限界は
ゼプトモルの範囲内であり、誘導体化がレドックス活性標識の高感度検出に有害
でないことを示している。また、それらの標識は電荷のない低分子量化合物なの
で、その結合によって、検体の移動度はいかなる変化も生じない。このことは、
分離の分解能及び効率が何ら低下することなく、現存の分離条件を標識化検体に
容易に使用できることを意味している。また、異なった標識と接合されたDNA
断片の2つの異なるセットを分析するとき、移動度シフト補正のための難解かつ
不完全なソフトウェアの問題も不要である。これら低分子量標識の他の利点は、
プライマーに接合された場合、それらは、PCR又は他の増幅、伸長若しくは連
結過程の際、該プライマー又はオリゴヌクレオチドがハイブリダイズされるDN
A断片の増幅のためのいかなる立体的又は他の障害が存在しないことである。図
9は、レドックス標識1で標識化されたM-13正プライマー及び標識化されな
いM-13逆プライマーによるPCR増幅後、ベクター中に閉鎖された735bpのAn
abenaDNA挿入断片の電気泳動分離及び検出を示す。この断片の検出は、レド
ックス標識化DNAプライマーを使用して、現在PCRに用いられ、かつEC検
出によるCEで分析される標準的な手順で、DNAを増幅できることを示してい
る。このように、レドックス標識化プライマー、標識化オリゴヌクレオチドトリ
ホスフェート、標識化ジデオキシヌクレオチドトリホスフェート又は標識化オリ
ゴヌクレオチドが、多種多様のポリメラーゼによるDNA配列決定伸長反応の遂
行、及び/又は連結後の連結された断片のサイズ解析の遂行、及び/又は全タイ
プのPCR増幅若しくはローリングサークル増幅法後の増幅された生成物のサイ
ズ解析の遂行に成功するであろうと考えられるあらゆる理由がある。
【0022】 上述の誘導体化法と同様に、他のレドックス活性標識の活性なN-ヒドロキシ
スクシンイミドエステルを合成し、かつ5'-アミノヘキシル末端DNAに結合さ
せることができる。図10(A)は、本研究で用いる標識1、3及び4用の活性
エステルを調製する合成経路を示す。これらのレドックス活性標識は、DNA鎖
ターミネーターに結合させることもでき、多くの利点を与える。従って、レドッ
クス活性ターミネーターから生成されるDNA配列決定断片のみを検出すること
ができる。アルキニルアミノ-ヌクレオシドトリホスフェートは、DNA配列決
定における鎖ターミネーターとして有用であるとして報告されている(Habbs,F.
及びCocuzza,A. 1987,特許第5,047,519号)。A、G、C、Tのレドックス活性
アルキニルアミノ-ヌクレオシドトリホスフェートは、レドックス活性標識の活
性N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを、アルキニルアミノヌクレオシドト
リホスフェートと反応させることによるアミド結合によって調製できる。同様の
方法を、3'-OH基を有するレドックス標識dNTPsに使用でき、かつ伸長反
応に使用できる。さらに、標識化はキノン/ヒドロキノン化合物に限定されない
。メタロポルフィリンのような他のレドックス活性標識の活性エステルは、図1
0(B)に示されるように調製できる。RNA、PNA、ペプチド、タンパク質
、炭水化物、アミノ酸及び他の分子のような種々の他の化合物も、文献に広範に
記載されている標識の接合のための多種多様な合成スキームを用いて、電気化学
標識で標識化できる。(Bioconjugate Techniques,G.7.Hermanson,Academic Pre
ss,NY(1996))。次いで、これらの化合物は、上述のCE-ECチップを基礎とす
るシステム及びコード一覧表を用いて検出されうる。図11は、この概念を用い
て2つの検体を同時に検出する例を示す。図1に記載されたのと同様のCE-E
Cチップを使用したが、作用電極は2つだけである。そして、CZE分離後、両
方の作用電極において、+0.8ボルトでドーパミンとカテコールの両方が検出さ
れた。2つの電極を異なる電位に合わせ、これら2つの検体を同時に選択的に検
出した。この場合、ドーパミンのみが、+0.3ボルトの低い電位に合わせた電極
#1で検出された。+0.8ボルトに合わせた電極#2では、ドーパミンとカテコ
ールの両方が検出された。従って、カテコールについてはマトリックス値が(0
,1)であり、ドーパミンについてはマトリックス値が(1,1)である。この
研究は、CE-チャネルの外側に複数の作用電極をミクロ製作することによって
CE-ECチップを使用して、多重検出が達成されうることを直接的に実証して
いる。
【0023】 図12は、分岐された分離チャネルを利用することを除き、図1と同様のミク
ロ製作チップを示す。同様の部分には同様の参照番号を付した。この実施形態で
は、単一のCE-チャネルが、その出口端の直前で多数の小さい分岐B1、B2
、B3、B4に枝分かれしている。分岐数は、検出される電気化学的標識の数に
対応する。検出電極1、2、3又は4は、各分岐の出口でミクロ製作され、特定
の分岐からの溶出剤用の検出部として働く。この様式では、各チャネル分岐中の
溶出緩衝液流から1つだけの検体の検出用に各電極を釣り合わせることができる
。これは、検体の感度が何ら損失することなく、電極を相互に離して(>10〜
15μm)配置できるので、種々の電極間の拡散的及び電気的クロストークを最
小化する。
【0024】 高い電気泳動電流からの干渉は、作用電極にかけられた電圧の可変性低下を導
き、IR低下として知られる(Iは電気泳動電流であり、Rは作用電極と参照電
極との間の溶液の抵抗である)。IR低下は、電極電位の予測不可能なシフトを
生じさせ、結果として電気化学シグナルの高いバックグランドノイズを導く。参
照電極は、ミクロ製作によって正確かつ永久的に作用電極に非常に近接して(〜
100-200μm)配置させることができる。これは、溶液の抵抗を有意に減少させる
ことによって、いかなるIR低下も最小にする(Rは作用電極と参照電極との間
の距離に比例するので)。参照電極の組込みも、より安定なバックグラウンドシ
グナルを有するより頑強なCE-ECチップを導く。
【0025】 Ag/AgCl参照電極をCE-ECチップ上に組み込むことができる。銀(A
g)は、CE-ECチップ上に析出されている別の金属上に直接析出又は電気メッ
キされうる。直接析出は、スパッタリング又は文献に記載されている他の通常用
いられる金属析出法によって行うことができる。第2のアプローチでは、上述の
ようにミクロ製作されたPt電極上にAgを電気メッキすることができる。Pt
電極(作用電極、補助電極、基底電極などを除いて)はミクロ製作され、電気メ
ッキによってAg/AgCl電極に変換されうる。Ptは、Agで電気メッキさ
れ、次いで塩化物溶液中で酸化されてメッキされたAg上にAgClの沈殿物を
生成し、それによってAg/AgCl電極を与える。
【0026】 「符号付き二進コード」一覧表を使用することによって、選択的に標識化し、
かつレドックス活性標識を検出する方法について記載する。本方法は、電気泳動
又はクロマトグラフ分離後、複数の標識を同時に選択的に検出することを可能に
する。CE-ECによるDNA配列決定で4つの異なる塩基を同定するのに使用
できる、4つの異なる電気活性の標識についての特定の適用について詳述する。
作用電極の数を増やすことによって、本方法及びマイクロチップをいくつでも異
なる電気活性標識に適用できることは明かである。さらに、本方法は、RNA、
PNA、ペプチド、タンパク質、アミノ酸、炭水化物及び他の化合物も、レドッ
クス活性標識で標識化されうるので、又は検体自体が特異的なレドックス特性を
有する場合は、それらにも容易に拡張される。レドックス活性標識による標識化
は、本質的に非電気活性化合物をEC検出に対して敏感に反応するようにする。
種々の標識化検体間の選択性は、レドックス電位及び/又は電極面で反応する際
のそれらの反応速度論を識別することによって達成される。シグナルは、特異的
なマトリックス値を有する各標識についてのコード化マトリックスを使用するこ
とによって効率的にお互いから区別される。この方法は、複数の電気化学的標識
の同時検出及び同定のための非常に正確なアプローチを保証する。従って、単一
の分離での複数検体の検出が、非常に高い選択性及び信頼性で、かつ光学的検出
の欠点なしに為されうる。また本発明を実施するためのミクロ製作キャピラリー
電気泳動チップについても記載されている。しかし、選択的標識化及び検出方法
を他の分離装置に適用できることは明かである。
【0027】 説明の目的のため、上述の記載は、特定の専門用語を用いて、本発明の完全な
理解を与えた。しかし、特定の詳細は本発明を実施するために必要でないことは
、本技術の当業者には明かだろう。本発明の特定の実施形態に関する上記記述は
、例示及び説明の目的のためにある。それらは、網羅的又は開示された正確な形
態に本発明を限定する意図ではない;上記教示を考慮すると、明らかに多くの変
更及び変形が可能である。実施形態は、本発明の原理及びその実際的な適用を最
もよく説明し、それによって、本技術の当業者が本発明及び考慮される特定用途
に合わせるように種々の変更を有する種々の実施形態を利用できるようにするた
めに選択され、記載された。本発明の範囲は、特許請求の範囲及びその均等物に
よって定義されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図1】 本発明の一実施形態のミクロ製作キャピラリー電気泳動チップを示す。
【図2】 電気化学的検出用の標識として使用するいくつかのヒドロキノン/キノン誘導
体のレドックス電位を示す。(CRC Handbook Series in Organic Electrochemist
ry,Vol.1-5,Eds.Mertes,Zuman,Scott,Campbell,Kardos,Fenner,Rupp,CRC Press,
Inc.)
【図3】 2つの酸化性標識と2つの還元性標識を利用した複数標識の選択的な電気化学
的検出用のコード化フォーマットを示す。ここで、│V2│>│V1│かつ│V4
│>│V3│である。
【図4A】 Ag/AgClに対する+0.9ボルトにおける1(1,4-ジヒドロキノン)の選択
的な電気化学的検出を示すが、0.6ボルトでは検出されない。1のマトリックス
値は(0,1)である。
【図4B】 +0.6及び+0.9ボルトの両方における2(1,4-ジヒドロキシ-2-ナフトエ酸)の
電気化学的検出を示す。2のマトリックス値は(+1,+1)である。
【図5A】 −0.4ボルトにおける3(メチル-1,4-ベンゾキノン)の選択的な電気化学的検出
を示すが、そのシグナルは電位を−0.2ボルト以下に下げることによって完全に
なくなる。3のマトリックス値は(0,−1)である。
【図5B】 −0.2及び−0.4ボルトの両方における4(2,5-ジクロロ-1,4-ベンゾキノン)の
選択的な電気化学的検出を示す。4のマトリックス値は(−1,−1)である。
【図6】 4つの酸化性標識と4つの還元性標識を利用した複数標識の選択的な電気化学
的検出用のコード化フォーマットを示す。ここで、│V1│<│V2│<│V3
<│V4│である。
【図7】 レドックス活性標識でDNAを標識化して、その接合体を電気活性にするため
の合成スキームを示す。
【図8】 1,4-ジヒドロキシ-2-ナフトエ酸が付加されたM-13DNA-プライマーの、
電気化学チップを用いたキャピラリー電気泳動電気化学的検出を示す。
【図9】 EC−標識化M-13プライマーを使用して、増幅後に得られたPCR生成物
のキャピラリーゲル電気泳動的分離及びEC−検出を示す。該生成物は、分離マ
トリックスとして0.75%HECを用いてEC-CEチップ中で分離された。
【図10A】 電気化学的検出用のキノン又はヒドロキノン誘導体のレドックス活性標識の活
性エステルへの合成経路案を示す。
【図10B】 多重電気化学的検出用のメタロポルフィリンのレドックス活性標識の活性エス
テルへの合成経路案を示す。
【図11】 図1に示される設計の電気化学チップを用いた2つの検体の同時多重検出を示
す。
【図12】 本発明の他の実施形態のミクロ製作キャピラリー電気化学チップを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZW ),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU, TJ,TM),AE,AL,AM,AT,AU,AZ, BA,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,C R,CU,CZ,DE,DK,DM,EE,ES,FI ,GB,GD,GE,GH,GM,HR,HU,ID, IL,IN,IS,JP,KE,KG,KP,KR,K Z,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MD ,MG,MK,MN,MW,MX,NO,NZ,PL, PT,RO,RU,SD,SE,SG,SI,SK,S L,TJ,TM,TR,TT,TZ,UA,UG,UZ ,VN,YU,ZA,ZW (72)発明者 シンガール パンカイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94704 バークレイ デュラント アベニ ュー 2000−#116 (72)発明者 シー イン アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94596 ウォルナット クリーク クリー クサイド ドライヴ 1355−#203 (72)発明者 グレイザー アレクサンダー エヌ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94563 オリンダ キャノン ドライヴ 135 Fターム(参考) 2G045 DA12 DA13 FB05 FB07

Claims (46)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 広くなって検出貯蔵部になる伸長された細い分離チャネルと
    、このチャネルに沿って分離電圧をかける手段である、前記細い分離チャネル末
    端の近傍の前記検出貯蔵部中に伸長された2つ以上の間隔をおいて配置された薄
    膜作用電極と、前記検出貯蔵部中に前記作用電極から間隔をおいて配置された基
    底電極及び参照電極とを有する基板を含んでなるミクロ製作キャピラリー電気泳
    動チップであって、前記作用電極が、レドックス反応を起こす分子によって生じ
    る電流を検出するために、該分子が前記チャネルを下方に移動した後、前記薄膜
    電極を越えて移動するときに、高い電気泳動電位から最小の影響を受ける、ミク
    ロ製作キャピラリー電気泳動チップ。
  2. 【請求項2】 前記伸長された細い分離チャネルが分岐して、各作用電極の
    末端の反対側に、複数の出口チャネルを形成している請求項1に記載のミクロ製
    作キャピラリー電気泳動チップ。
  3. 【請求項3】 前記作用電極の末端が、前記伸長された分離チャネルの末端
    から100μm以下である請求項1又は2に記載のミクロ製作キャピラリー電気泳動
    チップ。
  4. 【請求項4】 前記作用電極の末端が、前記チャネルの末端から1,000μm以
    下である請求項1又は2に記載のミクロ製作キャピラリー電気泳動チップ。
  5. 【請求項5】 前記分離チャネルが、ゲルで充填されている請求項1又は2
    に記載のミクロ製作キャピラリー電気泳動チップ。
  6. 【請求項6】 前記チャネルが、クロマトグラフ分離媒体で充填されている
    請求項1又は2に記載のミクロ製作キャピラリー電気泳動チップ。
  7. 【請求項7】 前記基底電極及び参照電極が、薄膜電極である請求項1又は
    2に記載のミクロ製作キャピラリー電気泳動チップ。
  8. 【請求項8】 検体複合混合物中の検体の選択的な電気化学的検出方法であ
    って、以下の工程: 他の検体に結合される標識とは異なる電気化学シグナルを生じるレドックス標
    識で、前記混合物中の各検体を標識化する工程、 前記混合物を分離して、個々の標識化検体を与える工程、 前記分離された検体上の前記レドックス標識によって生じた異なる電気化学シ
    グナルを同時に検出して、個々の検体を同定する工程 を含んでなる方法。
  9. 【請求項9】 前記異なる電気化学シグナルが、同時に、個々の作用電極に
    異なる電圧をかけ、かつ前記レドックス標識の酸化及び/又は還元を検出するこ
    とによって検出される請求項8に記載の方法。
  10. 【請求項10】 前記異なる電気化学シグナルが、複数の電極における異な
    る検体の異なる不均一電子伝達速度定数に基づいて検出される請求項8に記載の
    方法。
  11. 【請求項11】 前記異なる電気化学シグナルが、複数の電極における電気
    化学シグナルの同時ボルタンメトリー検出によって検出される請求項8に記載の
    方法。
  12. 【請求項12】 前記異なる電気化学シグナルが、複数の電極における電気
    化学シグナルの正弦波ボルタンメトリー検出によって同時に検出される請求項8
    に記載の方法。
  13. 【請求項13】 前記検体が、電気泳動的に分離される請求項8、9、10
    、11又は12に記載の方法。
  14. 【請求項14】 前記検体が、クロマトグラフ的に分離される請求項8、9
    、10、11又は12に記載の方法。
  15. 【請求項15】 検体複合混合物中の検体の選択的な電気化学的検出方法で
    あって、以下の工程: 他の検体に結合される標識とは異なる電気化学シグナルを生じるレドックス標
    識で、前記混合物中の各検体を標識化する工程、 前記混合物を分離して、個々の標識化検体を与える工程、 前記分離された検体上の前記レドックス標識によって生じた異なる電気化学シ
    グナルを検出して、個々の検体を同定する工程 を含んでなる方法。
  16. 【請求項16】 前記異なる電気化学シグナルが、前記混合物中の少なくと
    も1つの作用電極に異なる電圧をかけ、かつ前記レドックス標識の酸化及び/又
    は還元を検出することによって検出される請求項15に記載の方法。
  17. 【請求項17】 前記異なる電気化学シグナルが、前記少なくとも1つの電
    極における異なる検体の異なる不均一電子伝達速度定数に基づいて検出される請
    求項15に記載の方法。
  18. 【請求項18】 前記異なる電気化学シグナルが、前記少なくとも1つの電
    極における電気化学シグナルの同時ボルタンメトリー検出によって検出される請
    求項15に記載の方法。
  19. 【請求項19】 前記異なる電気化学シグナルが、前記少なくとも1つの電
    極における電気化学シグナルの正弦波ボルタンメトリー検出によって同時に検出
    される請求項15に記載の方法。
  20. 【請求項20】 前記検体が、電気泳動的に分離される請求項15、16、
    17、18又は19に記載の方法。
  21. 【請求項21】 前記検体が、クロマトグラフ的に分離される請求項15、
    16、17、18又は19に記載の方法。
  22. 【請求項22】 検体混合物中の個々の検体を電気化学的に検出する方法で
    あって、以下の工程: 他の検体に結合される標識とは異なる電気化学シグナルを生じるレドックス標
    識で、前記混合物中の各検体を標識化する工程、 前記混合物を電気泳動分離チャネル中で分離する工程、 1つ以上の電気化学的検出電極を、前記分離チャネルの末端又は末端近傍に配
    置する工程、及び 前記1つ以上の検出電極のそれぞれで前記レドックス標識によって生じた異な
    る電気化学シグナルを同時に検出して、一意的に個々の標識化検体を同定する工
    程 を含んでなる方法。
  23. 【請求項23】 前記検体混合物が4つの検体を含み、かつその検体のうち
    の2つが酸化性標識で標識化され、2つが還元性標識で標識化されている請求項
    22に記載の検体混合物中の個々の検体を電気化学的に検出する方法。
  24. 【請求項24】 前記混合物が4つの検体を含み、かつその4つの検体が、
    4つの異なる酸化性又は還元性標識で標識化されている請求項22に記載の検体
    混合物中の個々の検体を電気化学的に検出する方法。
  25. 【請求項25】 前記混合物中の各検体用に、1つの電気化学的検出電極が
    ある請求項22に記載の検体混合物中の個々の検体を検出する方法。
  26. 【請求項26】 DNA鋳型の配列を決定する方法であって、以下の工程: 配列決定されるDNA鋳型の可能性のあるすべての相補的配列決定断片を生成
    し、かつレドックス標識化する工程であって、4つの異なる塩基(A、C、G、
    T)で終結する断片のセットが、別個のセット又は断片のそれぞれに結合された
    前記レドックス標識によって生成される別個の電気化学シグナルによって同定さ
    れる工程、 単一チャネル又はレーン中で、前記標識化断片のセットを電気化学的に分離す
    る工程、及び 前記レドックス標識によって生成された異なる電気化学シグナルを同時に検出
    して、個々の断片を同定する工程 を含んでなる方法。
  27. 【請求項27】 前記断片が、プライマー又はターミネーターを利用するジ
    デオキシ終結法で生成され、かつ前記プライマー又はターミネーターが、レドッ
    クス標識で標識化される請求項26に記載の方法。
  28. 【請求項28】 前記異なる電気化学シグナルが、前記混合物中の各断片に
    対して1つの電極である、複数の電極における異なる不均一電子伝達速度定数に
    基づいて検体を検出することによって検出される請求項26に記載の方法。
  29. 【請求項29】 前記異なる電気化学シグナルが、複数の電極における電気
    化学シグナルの同時ボルタンメトリー検出によって検出される請求項26に記載
    の方法。
  30. 【請求項30】 前記異なる電気化学シグナルが、複数の電極における電気
    化学シグナルの正弦波ボルタンメトリー検出によって同時に検出される請求項2
    6に記載の方法。
  31. 【請求項31】 前記プライマー又はターミネーターのうちの2つが、酸化
    性レドックス標識で標識化され、かつ2つが還元性レドックス標識で標識化され
    る請求項26に記載の方法。
  32. 【請求項32】 前記4つのプライマー又はターミネーターのそれぞれが、
    異なる酸化性又は還元性レドックス標識で標識化される請求項26に記載の方法
  33. 【請求項33】 異なるヒドロキノン誘導体が、DNA−プライマー、ター
    ミネーター又はヌクレオチドトリホスフェートに結合されて、配列断片のセット
    を電気活性にする請求項26に記載の方法。
  34. 【請求項34】 配列断片が、ジデオキシ鎖終結法で生成され、かつ鎖伸長
    に使用される3'-OHヌクレオチドトリホスフェートが、電気化学標識で標識化
    される請求項26に記載の方法。
  35. 【請求項35】 電気化学的検出を用いて核酸遺伝子分類を行う方法であっ
    て、以下の工程: 混合物中の各核酸検体を、他の検体に結合される標識とは異なる電気化学シグ
    ナルを生じる特異的なレドックス活性標識で標識化する工程、 ゲル充填キャピラリー又はチャネル中で、前記混合物を電気泳動的に分離する
    工程、 2つ以上の電気化学的検出電極を、前記分離キャピラリー又はチャネルの末端
    又は末端近傍に配置する工程、 前記検出電極のそれぞれで前記レドックス標識によって生じた異なる電気化学
    シグナルを同時に検出して、個々の標識化検体を一意的に同定する工程 を含んでなる方法。
  36. 【請求項36】 遺伝子分類される前記核酸検体が、少なくとも1つが特異
    的な電気化学標識で標識化されている正プライマー及び逆プライマーを使用する
    ポリメラーゼ鎖反応によって生成される請求項35に記載の方法。
  37. 【請求項37】 増幅及び標識化された核酸検体が、制限酵素によって消化
    されて、遺伝子分類のための標識化かつ制限された断片を生成する請求項36に
    記載の方法。
  38. 【請求項38】 遺伝子分類される前記核酸検体が、短いタンデム反復断片
    である請求項36に記載の方法。
  39. 【請求項39】 前記レドックス標識が、異なるヒドロキノン誘導体である
    請求項36に記載の方法。
  40. 【請求項40】 前記異なる電気化学シグナルが、異なる不均一電子伝達速
    度定数に基づいて検出される請求項36に記載の方法。
  41. 【請求項41】 前記標識化核酸検体が、相補的鋳型媒介反応で2つのオリ
    ゴヌクレオチドを連結することによって生成され、その連結されるオリゴヌクレ
    オチドの少なくとも1つが、特異的なレドックス活性標識で標識化され、かつそ
    の連結され標識化された核酸検体の存在が、前記相補的鋳型配列の存在の診断上
    役立つ、請求項35に記載の方法。
  42. 【請求項42】 前記標識化核酸検体が、レドックス標識化プライマー又は
    レドックス標識化ターミネーター又はレドックス標識化ヌクレオチドトリホスフ
    ェートのいずれかを用いる、ポリメラーゼとのプライマー及び鋳型媒介伸長反応
    を行うことによって生成され、かつ前記鋳型配列中の特定塩基の同一性の決定が
    、単一のヌクレオチドの多型性を定義する請求項35に記載の方法。
  43. 【請求項43】 本質的にレドックス活性な検体の複合混合物中の検体の選
    択的な電気化学的検出の方法であって、以下の工程: キャピラリー又はチャネル中で前記混合物を電気泳動的に分離する工程、 2つ以上の電気化学的検出電極を、前記分離キャピラリー又はチャネルの末端
    又は末端近傍に配置する工程、 前記検出電極のそれぞれで前記レドックス活性検体によって生じた異なる電気
    化学シグナルを同時に検出して、個々の検体を一意的に同定する工程 を含んでなる方法。
  44. 【請求項44】 前記異なる電気化学シグナルが、前記混合物中の各断片に
    対して1つの電極である、複数の電極における異なる不均一電子伝達速度定数に
    基づいて検体を検出することによって検出される請求項43に記載の方法。
  45. 【請求項45】 前記異なる電気化学シグナルが、複数の電極における電気
    化学シグナルの同時ボルタンメトリー検出によって検出される請求項43に記載
    の方法。
  46. 【請求項46】 前記異なる電気化学シグナルが、複数の電極における電気
    化学シグナルの正弦波ボルタンメトリー検出によって同時に検出される請求項4
    3に記載の方法。
JP2000593947A 1999-01-11 1999-11-19 ミクロ製作キャピラリー電気泳動チップ及び複数のレドックス標識の同時検出方法 Expired - Fee Related JP3595265B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/229,386 1999-01-11
US09/229,386 US6361671B1 (en) 1999-01-11 1999-01-11 Microfabricated capillary electrophoresis chip and method for simultaneously detecting multiple redox labels
PCT/US1999/027495 WO2000042424A1 (en) 1999-01-11 1999-11-19 Microfabricated capillary electrophoresis chip and method for simultaneously detecting multiple redox labels

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2002535616A true JP2002535616A (ja) 2002-10-22
JP3595265B2 JP3595265B2 (ja) 2004-12-02

Family

ID=22861013

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000593947A Expired - Fee Related JP3595265B2 (ja) 1999-01-11 1999-11-19 ミクロ製作キャピラリー電気泳動チップ及び複数のレドックス標識の同時検出方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US6361671B1 (ja)
EP (1) EP1062502A1 (ja)
JP (1) JP3595265B2 (ja)
AU (1) AU1824200A (ja)
CA (1) CA2322465C (ja)
WO (1) WO2000042424A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7201042B2 (en) 2002-11-01 2007-04-10 Arkray, Inc. Measuring instrument provided with solid component concentrating means

Families Citing this family (115)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5591578A (en) * 1993-12-10 1997-01-07 California Institute Of Technology Nucleic acid mediated electron transfer
US6780591B2 (en) * 1998-05-01 2004-08-24 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
US7875440B2 (en) 1998-05-01 2011-01-25 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
US7501245B2 (en) * 1999-06-28 2009-03-10 Helicos Biosciences Corp. Methods and apparatuses for analyzing polynucleotide sequences
US6818395B1 (en) * 1999-06-28 2004-11-16 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences
WO2001007665A2 (en) 1999-07-26 2001-02-01 Clinical Micro Sensors, Inc. Sequence determination of nucleic acids using electronic detection
JP4272800B2 (ja) * 2000-06-22 2009-06-03 富士フイルム株式会社 複数の電位を用いる遺伝子の発現解析
IL138229A (en) * 2000-09-04 2005-03-20 Yissum Res Dev Co Method and system for detecting nucleic acids
EP1343973B2 (en) 2000-11-16 2020-09-16 California Institute Of Technology Apparatus and methods for conducting assays and high throughput screening
AU2002251946A1 (en) * 2001-02-14 2002-08-28 Science And Technology Corporation @ Unm Nanostructured devices for separation and analysis
US20030143556A1 (en) * 2001-04-03 2003-07-31 Gary Blackburn Nucleic acid reactions using labels with different redox potentials
EP1527194A4 (en) * 2001-04-03 2005-07-20 Clinical Micro Sensors Inc NUCLEIC ACID REACTIONS USING MARKERS WITH DIFFERENT REDOX POTENTIALS
AU2002307152A1 (en) 2001-04-06 2002-10-21 California Institute Of Technology Nucleic acid amplification utilizing microfluidic devices
US6596140B2 (en) * 2001-05-01 2003-07-22 Applera Corporation Multi-channel capillary electrophoresis device and method
GB2379018B (en) 2001-08-10 2006-02-22 Univ Hull Monitoring of chemical reactions
US6890409B2 (en) 2001-08-24 2005-05-10 Applera Corporation Bubble-free and pressure-generating electrodes for electrophoretic and electroosmotic devices
US20030104386A1 (en) * 2001-08-31 2003-06-05 The Regents Of The University Of California Methods for the specific detection of redox-active tags and the use thereof for capillary gel electrophoresis and DNA sequencing
KR100438828B1 (ko) * 2001-11-08 2004-07-05 삼성전자주식회사 칩 상의 전기적 미세 검출기
EP2360234B1 (en) * 2001-11-30 2015-07-22 Fluidigm Corporation Microfluidic device and methods of using same
US7125478B2 (en) * 2002-01-18 2006-10-24 The Regents Of The University Of Michigan Microscale electrophoresis devices for biomolecule separation and detection
US7344628B2 (en) * 2002-02-08 2008-03-18 The University Of Louisville Research Foundation Capillary electrophoresis-electrochemical detection microchip device and supporting circuits
US7312085B2 (en) * 2002-04-01 2007-12-25 Fluidigm Corporation Microfluidic particle-analysis systems
AU2003224817B2 (en) * 2002-04-01 2008-11-06 Fluidigm Corporation Microfluidic particle-analysis systems
DE10223127C1 (de) * 2002-05-24 2003-10-02 Fraunhofer Ges Forschung Elektrisches Mikrofluidik-Multiplex-System und dessen Verwendung
WO2003104420A2 (en) * 2002-06-07 2003-12-18 The Regents Of The University Of California Electrochemical detection of single nucleotide polymorphisms (snps)
AU2003277853A1 (en) * 2002-06-24 2004-01-06 Fluidigm Corporation Recirculating fluidic network and methods for using the same
US20040011650A1 (en) * 2002-07-22 2004-01-22 Frederic Zenhausern Method and apparatus for manipulating polarizable analytes via dielectrophoresis
EP2213615A3 (en) * 2002-09-25 2012-02-29 California Institute of Technology Microfluidic Large Scale Integration
AU2003299541A1 (en) 2002-10-02 2004-05-25 California Institute Of Technology Microfluidic nucleic acid analysis
US7138121B2 (en) * 2003-01-23 2006-11-21 Spangler Brenda D Biosensors utilizing dendrimer-immobilized ligands and there use thereof
US20040149568A1 (en) * 2003-01-24 2004-08-05 Huang Lotien Richard Method for loading and unloading macro-molecules from microfluidic devices
US7604965B2 (en) 2003-04-03 2009-10-20 Fluidigm Corporation Thermal reaction device and method for using the same
US20050170367A1 (en) * 2003-06-10 2005-08-04 Quake Stephen R. Fluorescently labeled nucleoside triphosphates and analogs thereof for sequencing nucleic acids
CN100425983C (zh) * 2003-08-29 2008-10-15 中国科学院生态环境研究中心 激光诱导荧光和光吸收双功能检测微流控电泳芯片
US7169560B2 (en) 2003-11-12 2007-01-30 Helicos Biosciences Corporation Short cycle methods for sequencing polynucleotides
US20060172408A1 (en) * 2003-12-01 2006-08-03 Quake Steven R Device for immobilizing chemical and biochemical species and methods of using same
US7465381B2 (en) * 2004-01-22 2008-12-16 Stc.Unm Electrokinetic molecular separation in nanoscale fluidic channels
CA2553833C (en) 2004-01-28 2012-10-02 454 Corporation Nucleic acid amplification with continuous flow emulsion
US20060065528A1 (en) * 2004-02-03 2006-03-30 Gabriel Lopez Nanostructured devices for separation and analysis
KR100580644B1 (ko) * 2004-02-16 2006-05-16 삼성전자주식회사 생물분자를 고체 기판상에 비공유적으로 고정화 하는 방법및 그에 의하여 제조되는 마이크로어레이
EP1716254B1 (en) 2004-02-19 2010-04-07 Helicos Biosciences Corporation Methods for analyzing polynucleotide sequences
US20060046258A1 (en) * 2004-02-27 2006-03-02 Lapidus Stanley N Applications of single molecule sequencing
US7438792B2 (en) * 2004-04-20 2008-10-21 The Regents Of The University Of California Separation system with a sheath-flow supported electrochemical detector
US20050239085A1 (en) * 2004-04-23 2005-10-27 Buzby Philip R Methods for nucleic acid sequence determination
US20070117103A1 (en) * 2005-11-22 2007-05-24 Buzby Philip R Nucleotide analogs
US20070117104A1 (en) * 2005-11-22 2007-05-24 Buzby Philip R Nucleotide analogs
US7476734B2 (en) * 2005-12-06 2009-01-13 Helicos Biosciences Corporation Nucleotide analogs
US8536661B1 (en) 2004-06-25 2013-09-17 University Of Hawaii Biosensor chip sensor protection methods
US8105471B1 (en) 2004-07-19 2012-01-31 Han Sang M Nanofluidics for bioseparation and analysis
US20060024678A1 (en) * 2004-07-28 2006-02-02 Helicos Biosciences Corporation Use of single-stranded nucleic acid binding proteins in sequencing
US7211184B2 (en) * 2004-08-04 2007-05-01 Ast Management Inc. Capillary electrophoresis devices
WO2006022370A1 (ja) * 2004-08-27 2006-03-02 National Institute For Materials Science 電界効果デバイスを用いたdna塩基配列解析方法及び塩基配列解析装置
US9040305B2 (en) 2004-09-28 2015-05-26 Singulex, Inc. Method of analysis for determining a specific protein in blood samples using fluorescence spectrometry
US8685711B2 (en) 2004-09-28 2014-04-01 Singulex, Inc. Methods and compositions for highly sensitive detection of molecules
US7572640B2 (en) * 2004-09-28 2009-08-11 Singulex, Inc. Method for highly sensitive detection of single protein molecules labeled with fluorescent moieties
US7785785B2 (en) 2004-11-12 2010-08-31 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Charge perturbation detection system for DNA and other molecules
US20060118754A1 (en) * 2004-12-08 2006-06-08 Lapen Daniel C Stabilizing a polyelectrolyte multilayer
US7220549B2 (en) * 2004-12-30 2007-05-22 Helicos Biosciences Corporation Stabilizing a nucleic acid for nucleic acid sequencing
US20060172328A1 (en) * 2005-01-05 2006-08-03 Buzby Philip R Methods and compositions for correcting misincorporation in a nucleic acid synthesis reaction
US7482120B2 (en) * 2005-01-28 2009-01-27 Helicos Biosciences Corporation Methods and compositions for improving fidelity in a nucleic acid synthesis reaction
US20060263790A1 (en) * 2005-05-20 2006-11-23 Timothy Harris Methods for improving fidelity in a nucleic acid synthesis reaction
CN1715902B (zh) * 2005-07-12 2010-10-27 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 一种夹流进样的毛细管电泳芯片及其使用方法
US7666593B2 (en) 2005-08-26 2010-02-23 Helicos Biosciences Corporation Single molecule sequencing of captured nucleic acids
US7988839B2 (en) * 2005-09-20 2011-08-02 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Capillary electrophoresis systems and methods
US20070117102A1 (en) * 2005-11-22 2007-05-24 Buzby Philip R Nucleotide analogs
US20070128610A1 (en) * 2005-12-02 2007-06-07 Buzby Philip R Sample preparation method and apparatus for nucleic acid sequencing
WO2007082549A1 (en) * 2006-01-19 2007-07-26 El Hadidy Mohamed Roshdy Solim 2-in-1 biochip
US7815868B1 (en) * 2006-02-28 2010-10-19 Fluidigm Corporation Microfluidic reaction apparatus for high throughput screening
EP3156799B1 (en) 2006-04-04 2024-01-24 Novilux, LLC Analyzer and method for highly sensitive detection of analytes
JP2009536727A (ja) 2006-04-04 2009-10-15 シングレックス,インコーポレイテッド 高感度のマーカー分析および分子検出のための方法および組成物
US8349167B2 (en) 2006-12-14 2013-01-08 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for detecting molecular interactions using FET arrays
EP2653861B1 (en) 2006-12-14 2014-08-13 Life Technologies Corporation Method for sequencing a nucleic acid using large-scale FET arrays
US11339430B2 (en) 2007-07-10 2022-05-24 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
US8262900B2 (en) 2006-12-14 2012-09-11 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
WO2009029550A2 (en) * 2007-08-24 2009-03-05 Singulex, Inc. Highly sensitive system and methods for analysis of prostate specific antigen (psa)
JP2011508219A (ja) 2007-12-19 2011-03-10 シンギュレックス・インコーポレイテッド 単一分子検出走査分析器およびその使用方法
JP2011513753A (ja) * 2008-03-05 2011-04-28 シンギュレックス・インコーポレイテッド 分子の高感度検出の方法および組成物
WO2010008480A2 (en) 2008-06-25 2010-01-21 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes using large scale fet arrays
GB2464183A (en) * 2008-09-19 2010-04-14 Singulex Inc Sandwich assay
US20100137143A1 (en) 2008-10-22 2010-06-03 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
US20100301398A1 (en) 2009-05-29 2010-12-02 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
US8776573B2 (en) 2009-05-29 2014-07-15 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes
US20120261274A1 (en) 2009-05-29 2012-10-18 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes
US8673627B2 (en) 2009-05-29 2014-03-18 Life Technologies Corporation Apparatus and methods for performing electrochemical reactions
AU2010259022B2 (en) 2009-06-08 2016-05-12 Singulex, Inc. Highly sensitive biomarker panels
CA2798149A1 (en) 2010-05-06 2011-11-10 Singulex, Inc Methods for diagnosing, staging, predicting risk for developing and identifying treatment responders for rheumatoid arthritis
CN103080739B (zh) 2010-06-30 2016-12-21 生命科技公司 用于测试isfet阵列的方法和装置
US8415176B2 (en) 2010-06-30 2013-04-09 Life Technologies Corporation One-transistor pixel array
CN103154718B (zh) 2010-06-30 2015-09-23 生命科技公司 感测离子的电荷堆积电路和方法
US11307166B2 (en) 2010-07-01 2022-04-19 Life Technologies Corporation Column ADC
CN103168341B (zh) 2010-07-03 2016-10-05 生命科技公司 具有轻度掺杂的排出装置的化学敏感的传感器
EP2617061B1 (en) 2010-09-15 2021-06-30 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes
US8685324B2 (en) 2010-09-24 2014-04-01 Life Technologies Corporation Matched pair transistor circuits
WO2013056241A2 (en) * 2011-10-14 2013-04-18 Pacific Biosciences Of California, Inc. Real-time redox sequencing
US9970984B2 (en) 2011-12-01 2018-05-15 Life Technologies Corporation Method and apparatus for identifying defects in a chemical sensor array
US8747748B2 (en) 2012-01-19 2014-06-10 Life Technologies Corporation Chemical sensor with conductive cup-shaped sensor surface
US8821798B2 (en) 2012-01-19 2014-09-02 Life Technologies Corporation Titanium nitride as sensing layer for microwell structure
WO2013168835A1 (ko) * 2012-05-09 2013-11-14 서울대학교산학협력단 전기화학적 검출을 위한 전기영동칩
US9217179B2 (en) 2012-05-24 2015-12-22 The Governing Council Of The University Of Toronto Systems and methods for multiplexed electrochemical detection
US8786331B2 (en) 2012-05-29 2014-07-22 Life Technologies Corporation System for reducing noise in a chemical sensor array
US9080968B2 (en) 2013-01-04 2015-07-14 Life Technologies Corporation Methods and systems for point of use removal of sacrificial material
US9841398B2 (en) 2013-01-08 2017-12-12 Life Technologies Corporation Methods for manufacturing well structures for low-noise chemical sensors
US8962366B2 (en) 2013-01-28 2015-02-24 Life Technologies Corporation Self-aligned well structures for low-noise chemical sensors
US8963216B2 (en) 2013-03-13 2015-02-24 Life Technologies Corporation Chemical sensor with sidewall spacer sensor surface
US8841217B1 (en) 2013-03-13 2014-09-23 Life Technologies Corporation Chemical sensor with protruded sensor surface
US9116117B2 (en) 2013-03-15 2015-08-25 Life Technologies Corporation Chemical sensor with sidewall sensor surface
EP2972281B1 (en) 2013-03-15 2023-07-26 Life Technologies Corporation Chemical device with thin conductive element
US9835585B2 (en) 2013-03-15 2017-12-05 Life Technologies Corporation Chemical sensor with protruded sensor surface
WO2014149780A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Life Technologies Corporation Chemical sensor with consistent sensor surface areas
EP2972279B1 (en) 2013-03-15 2021-10-06 Life Technologies Corporation Chemical sensors with consistent sensor surface areas
US20140336063A1 (en) 2013-05-09 2014-11-13 Life Technologies Corporation Windowed Sequencing
US10458942B2 (en) 2013-06-10 2019-10-29 Life Technologies Corporation Chemical sensor array having multiple sensors per well
TWI832669B (zh) 2014-12-18 2024-02-11 美商生命技術公司 具有傳輸器組態的高資料速率積體電路
US10077472B2 (en) 2014-12-18 2018-09-18 Life Technologies Corporation High data rate integrated circuit with power management
WO2016100521A1 (en) 2014-12-18 2016-06-23 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale fet arrays

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2244135B (en) * 1990-05-04 1994-07-13 Gen Electric Co Plc Sensor devices
GB9320286D0 (en) 1993-10-01 1993-11-17 Drew Scient Ltd Electro-chemical detector
US20020012902A1 (en) 1995-10-06 2002-01-31 Martin Fuchs Methods and kit for hybridization analysis using peptide nucleic acid probes
US6027890A (en) * 1996-01-23 2000-02-22 Rapigene, Inc. Methods and compositions for enhancing sensitivity in the analysis of biological-based assays
US6045676A (en) * 1996-08-26 2000-04-04 The Board Of Regents Of The University Of California Electrochemical detector integrated on microfabricated capilliary electrophoresis chips
US6159353A (en) 1997-04-30 2000-12-12 Orion Research, Inc. Capillary electrophoretic separation system

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7201042B2 (en) 2002-11-01 2007-04-10 Arkray, Inc. Measuring instrument provided with solid component concentrating means

Also Published As

Publication number Publication date
US6361671B1 (en) 2002-03-26
CA2322465A1 (en) 2000-07-20
EP1062502A1 (en) 2000-12-27
CA2322465C (en) 2004-01-27
JP3595265B2 (ja) 2004-12-02
AU1824200A (en) 2000-08-01
WO2000042424A1 (en) 2000-07-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3595265B2 (ja) ミクロ製作キャピラリー電気泳動チップ及び複数のレドックス標識の同時検出方法
US9938573B2 (en) Methods and kits for nucleic acid sequencing
Du et al. Simultaneous determination of polyamines and catecholamines in PC‐12 tumor cell extracts by capillary electrophoresis with laser‐induced fluorescence detection
Dolnik et al. Applications of capillary electrophoresis on microchip
Zhao et al. Determination of uric acid in human urine and serum by capillary electrophoresis with chemiluminescence detection
EP0854937B1 (en) Methods and kit for hybridization analysis using peptide nucleic acid probes
JP3233851B2 (ja) 遺伝子の電気化学的検出法およびその装置
WO1997012995A9 (en) Methods and kit for hybridization analysis using peptide nucleic acid probes
Irie et al. Automated DNA fragment collection by capillary array gel electrophoresis in search of differentially expressed genes
US6887668B2 (en) Nucleic acid separation and detection by electrophoresis with a counter-migrating high-affinity intercalating dye
WO2003021010A2 (en) Methods for the specific detection of redox-active tags and the use thereof for capillary gel electrophoresis and dna sequencing
Xu et al. Discovered triethylamine as impurity in synthetic DNAs for and by electrochemiluminescence techniques
Pan et al. Separation and determination of protocatechuic aldehyde and protocatechuic acid in Salivia miltorrhrza by capillary electrophoresis with amperometric detection
US5958215A (en) Detection of purine and pyrimidine nucleotides and underivatized nucleic acids by sinusoidal voltammetry
Kailasa et al. Microchip‐Based Capillary Electrophoresis for DNA Analysis in Modern Biotechnology: A Review
Wang et al. Trace measurements of nucleic acids using flow injection amperometry
Landers Capillary electrophoresis: Pioneering new approaches for biomolecular analysis
US20050230254A1 (en) Separation system with a sheath-flow supported electrochemical detector
JPH0347097A (ja) ハイブリダイゼーション方法、これを用いた遺伝子変異検出方法及びその装置
Novotny Capillary electrophoresis
Schwartz et al. Separation of DNA by capillary electrophoresis
EP1543153A2 (en) Electrochemical detection of single nucleotide polymorphisms (snps)
Zhong et al. Multiplexed capillary electrophoresis for DNA sequencing with ultra violet absorption detection
Brazill The implementation of a frequency-based electrochemical detection system for the analysis of biomolecules
EP1477572A2 (en) Methods and kit for hybridization analysis using peptide nucleic acid probes

Legal Events

Date Code Title Description
A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20040426

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20040507

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20040726

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20040816

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20040902

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080910

Year of fee payment: 4

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090910

Year of fee payment: 5

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees