JP2002533116A - ヒトメラニン濃縮ホルモン受容体（ｍｃｈ１）をコードするｄｎａ、及びその利用 - Google Patents
ヒトメラニン濃縮ホルモン受容体（ｍｃｈ１）をコードするｄｎａ、及びその利用Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、ヒトＨＣＨ１受容体をコードする単離された核酸、精製されたヒトＭＣＨ１受容体、ヒトＭＣＨ１をコードする単離された核酸を含むベクター、このようなベクターを含む細胞、ヒトＭＣＨ１受容体に向けられた抗体、ヒトＭＣＨ１受容体をコードする核酸を検出するために有用な核酸プローブ、ヒトＭＣＨ１受容体をコードする核酸の独特の配列に対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、正常もしくは変異体ヒトＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡを発現するトランスジェニック非ヒト動物、ヒトＭＣＨ１受容体を単離する方法、ヒトＭＣＨ１受容体の活性にリンクした異常を治療する方法、並びにＭＣＨ１受容体に対する化合物の結合を決定する方法を提供する。
Description
【０００１】
本出願は１９９８年１２月３１日出願の米国連続番号０９／２２４，４２６の
一部継続出願であり、その内容は本明細書の一部をなすものとして本願に援用さ
れる。
一部継続出願であり、その内容は本明細書の一部をなすものとして本願に援用さ
れる。
【０００２】 本出願を通して、カッコ内の著者及び年号によって各種刊行物が引用されてい
る。これら参考資料に関する完全な引用は、配列表の直前の明細書の末尾に見る
ことができるであろう。これら刊行物の開示内容の全てを、本発明の属する分野
の技術状態をより完全に記述することを目的として、本明細書の一部をなす参照
として本願に援用する。
る。これら参考資料に関する完全な引用は、配列表の直前の明細書の末尾に見る
ことができるであろう。これら刊行物の開示内容の全てを、本発明の属する分野
の技術状態をより完全に記述することを目的として、本明細書の一部をなす参照
として本願に援用する。
【０００３】 神経制御物質は、神経系の伝達を促進し、又は変調する各種神経産物を含んで
いる。それらには、神経ペプチド、アミノ酸、生体アミン、脂質及び脂質代謝物
、及びその他代謝副産物が含まれるが、もとよりこれに限定されない。これら神
経制御物質の多くは、細胞外部から内部に信号を伝達する特異的細胞表面受容体
と相互作用する。Ｇ−タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲｓ）は多くの神経伝達物
質が相互作用し、その効果を伝達する細胞表面受容体の主要分類である。ＧＰＣ
Ｒｓは７個の膜貫通ドメインを持ち、アデニルシクラーゼの刺激の様な細胞内生
化学的変化によるＧ−タンパク質結合レセプターの活性化を介して、それらのエ
フェクターに結合すると考えられている。
いる。それらには、神経ペプチド、アミノ酸、生体アミン、脂質及び脂質代謝物
、及びその他代謝副産物が含まれるが、もとよりこれに限定されない。これら神
経制御物質の多くは、細胞外部から内部に信号を伝達する特異的細胞表面受容体
と相互作用する。Ｇ−タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲｓ）は多くの神経伝達物
質が相互作用し、その効果を伝達する細胞表面受容体の主要分類である。ＧＰＣ
Ｒｓは７個の膜貫通ドメインを持ち、アデニルシクラーゼの刺激の様な細胞内生
化学的変化によるＧ−タンパク質結合レセプターの活性化を介して、それらのエ
フェクターに結合すると考えられている。
【０００４】 メラニン濃縮ホルモン（ＭＣＨ）は、元来はサケ科（硬骨魚）下垂体より単離
された環状ペプチドである（Ｋａｗａｕｃｈｉら、１９８３）。魚類では、１７
アミノ酸のペプチドがメラニン細胞内のメラニンの凝集を誘導して、ＡＣＴＨの
放出を阻害し、α−ＭＳＨの機能的アンタゴニストとして作用している。哺乳動
物のＭＣＨ（１９アミノ酸）は、ラット、マウス及びヒトにおいて良く保存され
ており、１００％のアミノ酸同一性を有しているが、その生理学的役割は明らか
ではない。ＭＣＨは摂食、水分平衡、エネルギー代謝、一般覚醒／注意状態、記
憶及び認識機能、及び精神医学的障害（例えば、Ｂａｋｅｒ、１９９１；Ｂａｋ
ｅｒ、１９９４；Ｎａｈｏｎ、１９９４；Ｋｎｉｇｇｅら、１９９６を参照）に
関係していると報告されている。摂食又は体重制御に於けるその役割は、ＭＣＨ
がｏｂ／＋マウスに比べｏｂ／ｏｂマウスの視床下部で過剰発現されていること
、そして絶食中の肥満及び正常マウスの両方に於いて絶食がＭＣＨのｍＲＮＡを
更に増加させることを示した最近のＮａｔｕｒｅ誌（Ｑｕら、１９９６）によっ
て支持されている。ＭＣＨは側方脳室内に注入されると、正常ラットの摂食も刺
激した（Ｒｏｓｓｉら、１９９７）。更に、ＭＣＨはα−ＭＳＨの行動作用を機
能的に拮抗するとも報告されている（Ｍｉｌｌｅｒら、１９９３；Ｇｏｎｚａｌ
ｅｚら、１９９６；Ｓａｎｃｈｅｚら、１９９７）；更にストレスはＰＯＭＣの
ｍＲＮＡレベルを増加させるが、ＭＣＨ前駆体であるプレプロＭＣＨ（ｐｐＭＣ
Ｈ）ｍＲＮＡレベルは低下させる（Ｐｒｅｓｓｅら、１９９２）。即ち、ＭＣＨ
はストレスに対する反応、及び摂食や性行動の制御に関係する内因性神経ペプチ
ドとして機能しているであろう（Ｂａｋｅｒ、１９９１；Ｋｎｉｇｇｅら、１９
９６）。
された環状ペプチドである（Ｋａｗａｕｃｈｉら、１９８３）。魚類では、１７
アミノ酸のペプチドがメラニン細胞内のメラニンの凝集を誘導して、ＡＣＴＨの
放出を阻害し、α−ＭＳＨの機能的アンタゴニストとして作用している。哺乳動
物のＭＣＨ（１９アミノ酸）は、ラット、マウス及びヒトにおいて良く保存され
ており、１００％のアミノ酸同一性を有しているが、その生理学的役割は明らか
ではない。ＭＣＨは摂食、水分平衡、エネルギー代謝、一般覚醒／注意状態、記
憶及び認識機能、及び精神医学的障害（例えば、Ｂａｋｅｒ、１９９１；Ｂａｋ
ｅｒ、１９９４；Ｎａｈｏｎ、１９９４；Ｋｎｉｇｇｅら、１９９６を参照）に
関係していると報告されている。摂食又は体重制御に於けるその役割は、ＭＣＨ
がｏｂ／＋マウスに比べｏｂ／ｏｂマウスの視床下部で過剰発現されていること
、そして絶食中の肥満及び正常マウスの両方に於いて絶食がＭＣＨのｍＲＮＡを
更に増加させることを示した最近のＮａｔｕｒｅ誌（Ｑｕら、１９９６）によっ
て支持されている。ＭＣＨは側方脳室内に注入されると、正常ラットの摂食も刺
激した（Ｒｏｓｓｉら、１９９７）。更に、ＭＣＨはα−ＭＳＨの行動作用を機
能的に拮抗するとも報告されている（Ｍｉｌｌｅｒら、１９９３；Ｇｏｎｚａｌ
ｅｚら、１９９６；Ｓａｎｃｈｅｚら、１９９７）；更にストレスはＰＯＭＣの
ｍＲＮＡレベルを増加させるが、ＭＣＨ前駆体であるプレプロＭＣＨ（ｐｐＭＣ
Ｈ）ｍＲＮＡレベルは低下させる（Ｐｒｅｓｓｅら、１９９２）。即ち、ＭＣＨ
はストレスに対する反応、及び摂食や性行動の制御に関係する内因性神経ペプチ
ドとして機能しているであろう（Ｂａｋｅｒ、１９９１；Ｋｎｉｇｇｅら、１９
９６）。
【０００５】 ＭＣＨ前駆体（ｐｐＭＣＨ）をコードする遺伝子はクローニングされており、
２つの追加ペプチド、神経ペプチドＥＩ（１３ＡＡ）及び神経ペプチドＧＥ（１
９ＡＡ）をコードしており（Ｎａｈｏｎら、１９８９）、これらも生物学的活性
を有するであろう。ＭＣＨペプチドは主に様々な脳領域及び下垂体に拡散性に突
出している視床下部神経細胞内（不確帯及び外側視床下部）にて合成される（Ｂ
ｉｔｔｅｎｃｏｕｒｔら、１９９２）；ＮＥＩもまた移植された視床下部神経細
胞から、培養において同定された（Ｐａｒｋｅｓ及びＶａｌｅ、１９９３）。ｍ
ＲＮＡの局在研究は、ＭＣＨが末梢（精巣及び胃腸管；ＨｅｒｖｉｅｕとＨａｈ
ｏｎ、１９９５）が、最高濃度は視床下部内であることを示している。哺乳動物
に関してもプロＭＣＨが組織依存的に異なる処理を受ける証拠がある。異なるス
プラシングの結果生じると考えられる短いＭＣＨ遺伝子転写体が複数の脳域及び
末梢組織で見いだされており、また末梢では異なるペプチド型も見つかっている
（Ｖｉａｌｅら、１９９７）。ヒトにおいては、真性ＭＣＨをコードする遺伝子
は第１２染色体に局在しているが、２コピーの変種（端部切断型）遺伝子が第５
染色体上にあるが（Ｂｒｅｔｏｎら、１９９３）、いずれも変異体の機能的意義
は不明である。最後に、ラットＭＣＨ遺伝子は異なる読みとり枠内に追加の候補
ペプチドをコードしているらしい（Ｔｏｕｍａｎｉａｎｔｚら、１９９６）。
２つの追加ペプチド、神経ペプチドＥＩ（１３ＡＡ）及び神経ペプチドＧＥ（１
９ＡＡ）をコードしており（Ｎａｈｏｎら、１９８９）、これらも生物学的活性
を有するであろう。ＭＣＨペプチドは主に様々な脳領域及び下垂体に拡散性に突
出している視床下部神経細胞内（不確帯及び外側視床下部）にて合成される（Ｂ
ｉｔｔｅｎｃｏｕｒｔら、１９９２）；ＮＥＩもまた移植された視床下部神経細
胞から、培養において同定された（Ｐａｒｋｅｓ及びＶａｌｅ、１９９３）。ｍ
ＲＮＡの局在研究は、ＭＣＨが末梢（精巣及び胃腸管；ＨｅｒｖｉｅｕとＨａｈ
ｏｎ、１９９５）が、最高濃度は視床下部内であることを示している。哺乳動物
に関してもプロＭＣＨが組織依存的に異なる処理を受ける証拠がある。異なるス
プラシングの結果生じると考えられる短いＭＣＨ遺伝子転写体が複数の脳域及び
末梢組織で見いだされており、また末梢では異なるペプチド型も見つかっている
（Ｖｉａｌｅら、１９９７）。ヒトにおいては、真性ＭＣＨをコードする遺伝子
は第１２染色体に局在しているが、２コピーの変種（端部切断型）遺伝子が第５
染色体上にあるが（Ｂｒｅｔｏｎら、１９９３）、いずれも変異体の機能的意義
は不明である。最後に、ラットＭＣＨ遺伝子は異なる読みとり枠内に追加の候補
ペプチドをコードしているらしい（Ｔｏｕｍａｎｉａｎｔｚら、１９９６）。
【０００６】 ＭＣＨの生物学的作用は特異的受容体を介して伝達されると信じられているが
、ＭＣＨに関する結合部位はよく分かっていない。トリチウムで標識したリガン
ド（［３Ｈ］−ＭＣＨ）は脳の膜への特異的結合を阻害すると報告されているが
、飽和分析に関しては利用できず、親和性またはＢｍａｘは何れも決定されてい
ない（Ｄｒｏｚｄｚ及びＥｂｅｒｌｅ、１９９５）。位置１３のチロシンを放射
性ヨウ素化すると、リガンドの生物学的活性は劇的に低下する（Ｄｒｏｚｄｚ及
びＥｂｅｒｌｅ、１９９５参照）。これに対し、ＭＣＨ類似体の放射性ヨウ素化
［Ｐｈｅ１３、Ｔｙｒ１９］−ＭＣＨは成功し（Ｂｒｏｚｄｚら、１９９５）；
リガンドは生物学的活性を保持し、マウスメラノーマ（Ｂ１６−Ｆ１、Ｇ４Ｆ及
びＧ４Ｆ−７）、ＰＣ１２及びＣＯＳ細胞を含む各種細胞株への特異的結合を示
した。Ｇ４Ｆ−７細胞では、Ｋｐ＝０．１１８ｎＭでありＢｍａｘは〜１１００
カ所／細胞である。重要なことは、この結合はα−ＭＳＨでは阻害されないが、
ラットＡＮＦでは弱く阻害されたことである（Ｋｉ＝１１６ｎＭ対見変性ＭＣＨ
に対する１２ｎＭ）（Ｄｒｏｚｄｚら、１９９５）。最近特異的ＭＣＨ結合が形
質転換ケラチノ細胞（Ｂｕｒｇａｕｄら、１９９７）及びメラノ細胞（Ｄｒｏｚ
ｄｚら、１９９８）に報告され、光架橋研究は受容体が見かけ上の分子量約４５
−５０ｋダルトンの膜タンパク質であり、ＧＰＣＲスーパーファミリー受容体の
分子量範囲に相当することを示差した。このリガンドを用いたＭＣＨ受容体局在
に関する放射性オートラジオグラフィー研究はまだ報告されていない。
、ＭＣＨに関する結合部位はよく分かっていない。トリチウムで標識したリガン
ド（［３Ｈ］−ＭＣＨ）は脳の膜への特異的結合を阻害すると報告されているが
、飽和分析に関しては利用できず、親和性またはＢｍａｘは何れも決定されてい
ない（Ｄｒｏｚｄｚ及びＥｂｅｒｌｅ、１９９５）。位置１３のチロシンを放射
性ヨウ素化すると、リガンドの生物学的活性は劇的に低下する（Ｄｒｏｚｄｚ及
びＥｂｅｒｌｅ、１９９５参照）。これに対し、ＭＣＨ類似体の放射性ヨウ素化
［Ｐｈｅ１３、Ｔｙｒ１９］−ＭＣＨは成功し（Ｂｒｏｚｄｚら、１９９５）；
リガンドは生物学的活性を保持し、マウスメラノーマ（Ｂ１６−Ｆ１、Ｇ４Ｆ及
びＧ４Ｆ−７）、ＰＣ１２及びＣＯＳ細胞を含む各種細胞株への特異的結合を示
した。Ｇ４Ｆ−７細胞では、Ｋｐ＝０．１１８ｎＭでありＢｍａｘは〜１１００
カ所／細胞である。重要なことは、この結合はα−ＭＳＨでは阻害されないが、
ラットＡＮＦでは弱く阻害されたことである（Ｋｉ＝１１６ｎＭ対見変性ＭＣＨ
に対する１２ｎＭ）（Ｄｒｏｚｄｚら、１９９５）。最近特異的ＭＣＨ結合が形
質転換ケラチノ細胞（Ｂｕｒｇａｕｄら、１９９７）及びメラノ細胞（Ｄｒｏｚ
ｄｚら、１９９８）に報告され、光架橋研究は受容体が見かけ上の分子量約４５
−５０ｋダルトンの膜タンパク質であり、ＧＰＣＲスーパーファミリー受容体の
分子量範囲に相当することを示差した。このリガンドを用いたＭＣＨ受容体局在
に関する放射性オートラジオグラフィー研究はまだ報告されていない。
【０００７】 ＭＣＨ受容体に関するシグナル伝達のメカニズムは不明のままである。哺乳動
物にＧ−タンパク質共役が存在することを支持する直接証拠はないが、硬骨魚に
関してはＧａｑ−及び／又はＧａｉ−型の共役に関する２つの弱い証拠がある；
即ち、１）硬骨魚メラノ細胞ではＭＣＨ作用はフォスフォリパーゼＣを介すると
いう間接的証拠がある（フォスフォリパーゼＣ阻害剤、及びプロテインキナーゼ
Ｃ阻害剤がＭＣＨの用量−反応曲線を右にシフトさせ、そして低用量のＴＰＡが
ＭＣＨを模倣すること（Ａｂｒａｏら、１９９１）；及び２）ＭＣＨにより惹起
された魚メラノ細胞中の色素凝集に伴って、ノルエピネフィリンで観察されるよ
うなｃＡＭＰの基礎レベルの低下が起こること（Ｓｖｅｎｓｓｏｎら、１９９１
；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、１９９３）である。Ｇタンパク質共役に対する反論は
、その受容体がＧＰＣＲスーパーファミリーではないような、ＡＮＦとＭＣＨと
の一般的な構造的相同性である。最近、ＭＣＨの作用が、典型的なチロシンキナ
ーゼ及びサイトカイン受容体である（Ｑｕら、１９９８）フォスファチジルイノ
シトール−３−キナーゼ経路の活性化を通じ伝達されると報告された；しかし、
複数のシグナル伝達経路（受容体のクロストーク）がこの伝達体を産生している
ため、哺乳類システムに於いてＭＣＨシグナル伝達経路に関する結論は得られな
いであろう。
物にＧ−タンパク質共役が存在することを支持する直接証拠はないが、硬骨魚に
関してはＧａｑ−及び／又はＧａｉ−型の共役に関する２つの弱い証拠がある；
即ち、１）硬骨魚メラノ細胞ではＭＣＨ作用はフォスフォリパーゼＣを介すると
いう間接的証拠がある（フォスフォリパーゼＣ阻害剤、及びプロテインキナーゼ
Ｃ阻害剤がＭＣＨの用量−反応曲線を右にシフトさせ、そして低用量のＴＰＡが
ＭＣＨを模倣すること（Ａｂｒａｏら、１９９１）；及び２）ＭＣＨにより惹起
された魚メラノ細胞中の色素凝集に伴って、ノルエピネフィリンで観察されるよ
うなｃＡＭＰの基礎レベルの低下が起こること（Ｓｖｅｎｓｓｏｎら、１９９１
；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、１９９３）である。Ｇタンパク質共役に対する反論は
、その受容体がＧＰＣＲスーパーファミリーではないような、ＡＮＦとＭＣＨと
の一般的な構造的相同性である。最近、ＭＣＨの作用が、典型的なチロシンキナ
ーゼ及びサイトカイン受容体である（Ｑｕら、１９９８）フォスファチジルイノ
シトール−３−キナーゼ経路の活性化を通じ伝達されると報告された；しかし、
複数のシグナル伝達経路（受容体のクロストーク）がこの伝達体を産生している
ため、哺乳類システムに於いてＭＣＨシグナル伝達経路に関する結論は得られな
いであろう。
【０００８】 ＭＣＨペプチドの局在及び生物学的活性は、ＭＣＨ受容体の活性の変更が様々
な治療的応用に有用である可能性を示唆している。摂食行動に於けるＭＣＨの役
割は、最も良く特徴付けされた潜在的臨床応用である。ＭＣＨは、渇感及び空腹
感の制御に関与する脳領域である外側視床下部に発現されている（Ｇｒｉｌｌｏ
ｎら、１９９７）；最近、共に強力な食欲促進作用物質であるオレキシンＡ及び
Ｂが、外側視床下部に於いて、ＭＣＨと極めてよく似た局在を持つことが示され
た（Ｓａｋｕｒａｉら、１９９８）。ラットでは、食物欠乏２４時間後、この脳
領域に於けるＭＣＨのｍＲＮＡレベルが増加する（ＨｅｒｖｅとＦｅｌｌｍａｎ
、１９９７）；インシュリン注射後、ＭＣＨのｍＲＮＡレベルの顕著な増加に一
致して、ＭＣＨ免疫反応性の核周辺部及び繊維の数及び染色強度が有意に増加す
ることが観察されている（Ｂａｈｊａｏｕｉ−Ｂｏｕｈａｄｄｉら、１９９４）
。ラットに於ける摂食を促進するＭＣＨの能力に一致して（Ｒｏｓｓｉら、１９
９７）、肥満ｏｂ／ｏｂマウスの視床下部ではＭＣＨのｍＲＮＡレベルがアップ
レギュレーションされ（Ｑｕら、１９９６）、一方レプチン処理したラットの視
床下部ではこれは減少し、同時にその食物摂取量及び体重増加も減少する（Ｓａ
ｈｕ、１９９８）。ＭＣＨは食物摂取及びＨＰＡ（視床下部脳下垂体／副腎軸）
でのホルモン分泌に及ぼす作用に関しては、メラノコルチンシステムの機能的ア
ンタゴニストとして機能すると考えられる（Ｌｕｄｗｉｇら、１９９８）。これ
らデータをまとめると、エネルギーバランス及びストレスに対する応答の制御に
於ける内因性ＭＣＨの役割を示差すると共に、肥満及びストレス関連疾患の治療
での利用を目的としたＭＣＨ受容体に作用する特異的化合物の開発に合理性を与
える。
な治療的応用に有用である可能性を示唆している。摂食行動に於けるＭＣＨの役
割は、最も良く特徴付けされた潜在的臨床応用である。ＭＣＨは、渇感及び空腹
感の制御に関与する脳領域である外側視床下部に発現されている（Ｇｒｉｌｌｏ
ｎら、１９９７）；最近、共に強力な食欲促進作用物質であるオレキシンＡ及び
Ｂが、外側視床下部に於いて、ＭＣＨと極めてよく似た局在を持つことが示され
た（Ｓａｋｕｒａｉら、１９９８）。ラットでは、食物欠乏２４時間後、この脳
領域に於けるＭＣＨのｍＲＮＡレベルが増加する（ＨｅｒｖｅとＦｅｌｌｍａｎ
、１９９７）；インシュリン注射後、ＭＣＨのｍＲＮＡレベルの顕著な増加に一
致して、ＭＣＨ免疫反応性の核周辺部及び繊維の数及び染色強度が有意に増加す
ることが観察されている（Ｂａｈｊａｏｕｉ−Ｂｏｕｈａｄｄｉら、１９９４）
。ラットに於ける摂食を促進するＭＣＨの能力に一致して（Ｒｏｓｓｉら、１９
９７）、肥満ｏｂ／ｏｂマウスの視床下部ではＭＣＨのｍＲＮＡレベルがアップ
レギュレーションされ（Ｑｕら、１９９６）、一方レプチン処理したラットの視
床下部ではこれは減少し、同時にその食物摂取量及び体重増加も減少する（Ｓａ
ｈｕ、１９９８）。ＭＣＨは食物摂取及びＨＰＡ（視床下部脳下垂体／副腎軸）
でのホルモン分泌に及ぼす作用に関しては、メラノコルチンシステムの機能的ア
ンタゴニストとして機能すると考えられる（Ｌｕｄｗｉｇら、１９９８）。これ
らデータをまとめると、エネルギーバランス及びストレスに対する応答の制御に
於ける内因性ＭＣＨの役割を示差すると共に、肥満及びストレス関連疾患の治療
での利用を目的としたＭＣＨ受容体に作用する特異的化合物の開発に合理性を与
える。
【０００９】 今日までに研究された全ての種の場合、ＭＣＨ細胞グループの神経の大部分が
、それらが存在する外側視床下部及び視床腹側部の領域内のどちらかというと限
定部位を占めており、そしてそこでいわゆる「錐体外路」運動回路の一部を形成
するらしい。これらは視床及び脳皮質を含む実施的な線条−及び淡蒼球体経路、
視床下部域、及び視床核、黒質及び中脳中央部の相互接続を含む（Ｂｉｔｔｅｎ
ｃｏｕｒｔら、１９９２）。それら局所に於いて、ＭＣＨ細胞グループは適切且
つ協調した運動活性を持つ視床下部性の内臓活性発現のために橋渡し、又はメカ
ニズムを提供するであろう。臨床的にはえば錐体外路回路が関係していることが
知られているパーキンソン病やハンチントン舞踏病の様な運動障害へのＭＣＨシ
ステムの関与を考察することは意義があるであろう。
、それらが存在する外側視床下部及び視床腹側部の領域内のどちらかというと限
定部位を占めており、そしてそこでいわゆる「錐体外路」運動回路の一部を形成
するらしい。これらは視床及び脳皮質を含む実施的な線条−及び淡蒼球体経路、
視床下部域、及び視床核、黒質及び中脳中央部の相互接続を含む（Ｂｉｔｔｅｎ
ｃｏｕｒｔら、１９９２）。それら局所に於いて、ＭＣＨ細胞グループは適切且
つ協調した運動活性を持つ視床下部性の内臓活性発現のために橋渡し、又はメカ
ニズムを提供するであろう。臨床的にはえば錐体外路回路が関係していることが
知られているパーキンソン病やハンチントン舞踏病の様な運動障害へのＭＣＨシ
ステムの関与を考察することは意義があるであろう。
【００１０】 ヒトに於ける遺伝子連鎖の研究は、真性ＭＣＨ座を第１２染色体（１２ｑ２３
−２４）にあることを、そして変種ｈＭＣＨ座が第５染色体（５ｑ１２−１３）
にあることを明らかにした（Ｐｅｄｅｕｔｏｕｒら、１９９４）。座１２ｑ２３
−２４は、乗染色体優性ＩＩ型小脳性運動失調症（ＳＣＡ２）がマッピングされ
ている座に一致する（Ａｕｂｕｒｇｅｒら、１９９２；Ｔｗｅｌｌｓら、１９９
２）。この病気はオリーブ橋小脳萎縮症を含む神経退行性疾患を含む。更に、ダ
リエー病の遺伝子座が１２ｑ２３−２４にマッピングされている（Ｃｒａｄｄｏ
ｃｋら、１９９３）。ダリエー病は幾つかの家系に於いて異常なＩ型ケラチノサ
イトの接着と精神傷害により特徴付けられる。ラット及びヒトの脳に於けるＭＣ
Ｈ神経系の機能的、及び神経化学的パターンを見ると、ＭＣＨ遺伝子はＳＣＡ２
又はダリエー病の良い候補を示すであろう。興味深いことに社会に大きな影響を
与える疾患は、この座にマッピングされている。更に、慢性又は急性の脊髄筋萎
縮症に関係する遺伝子は、遺伝子連鎖分析より染色体５ｑ１２−１３に位置付け
られている（Ｍｅｌｉｋら、１９９０；Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋら、１９９２）。更
に、別の一連の証拠より、主要な精神分裂病遺伝子座も染色体５ｑ１１−１３．
３に割り当てられている（Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９８８； Ｂａｓｓｅ
ｔｔら、１９８８；Ｇｉｌｌｉａｍら、１９８９）。上記研究はＭＣＨが神経退
行性疾患または情緒障害に於いてある役割果たしていることを示唆している。
−２４）にあることを、そして変種ｈＭＣＨ座が第５染色体（５ｑ１２−１３）
にあることを明らかにした（Ｐｅｄｅｕｔｏｕｒら、１９９４）。座１２ｑ２３
−２４は、乗染色体優性ＩＩ型小脳性運動失調症（ＳＣＡ２）がマッピングされ
ている座に一致する（Ａｕｂｕｒｇｅｒら、１９９２；Ｔｗｅｌｌｓら、１９９
２）。この病気はオリーブ橋小脳萎縮症を含む神経退行性疾患を含む。更に、ダ
リエー病の遺伝子座が１２ｑ２３−２４にマッピングされている（Ｃｒａｄｄｏ
ｃｋら、１９９３）。ダリエー病は幾つかの家系に於いて異常なＩ型ケラチノサ
イトの接着と精神傷害により特徴付けられる。ラット及びヒトの脳に於けるＭＣ
Ｈ神経系の機能的、及び神経化学的パターンを見ると、ＭＣＨ遺伝子はＳＣＡ２
又はダリエー病の良い候補を示すであろう。興味深いことに社会に大きな影響を
与える疾患は、この座にマッピングされている。更に、慢性又は急性の脊髄筋萎
縮症に関係する遺伝子は、遺伝子連鎖分析より染色体５ｑ１２−１３に位置付け
られている（Ｍｅｌｉｋら、１９９０；Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋら、１９９２）。更
に、別の一連の証拠より、主要な精神分裂病遺伝子座も染色体５ｑ１１−１３．
３に割り当てられている（Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９８８； Ｂａｓｓｅ
ｔｔら、１９８８；Ｇｉｌｌｉａｍら、１９８９）。上記研究はＭＣＨが神経退
行性疾患または情緒障害に於いてある役割果たしていることを示唆している。
【００１１】 ＭＣＨ関連化合物に関する別の治療的応用は、他の生物学的システムについて
観察されたＭＣＨの作用から示唆されている。例えば、ＭＣＨは雄及び雌ラット
に於いて生殖機能を制御しているであろう。ＭＣＨ転写対及びＭＣＨペプチドは
成体ラットの生殖細胞内に見いだされており、ＭＣＨが幹細胞新生及び／又は初
期精細胞の分化に関係している可能性が示唆されている（Ｈｅｒｖｉｅｕら、１
９９６）。ＭＣＨを直接視索前野域（ＭＰＯＡ）または腹内側核（ＶＭＮ）に注
射すると、雌ラットの生殖活動を刺激した（Ｇｏｎｚａｌｅｚら、１９９６）。
エストラジオールでプライムし卵巣切除されたラットでは、ＭＣＨは黄体形成ホ
ルモン（ＬＨ）の放出を刺激したが、抗ＭＣＨ抗血清はＬＨ放出を阻害した（Ｇ
ｏｎｚａｌｅｚら、１９９７）。ＭＣＨ細胞体の大集団を含む不確帯は従来排卵
前記のＬＨ上昇に関する制御部位として同定されていた（ＭａｃＫｅｎｚｉｅら
、１９８４）。ＭＣＨはＡＣＴＨ及びオキシトシンを含む脳下垂体ホルモンの放
出に影響を及ぼすと報告されている。ＭＣＨ類似体は、てんかんの治療にも有用
であろう。ＰＴＺ発作モデルでは、発作誘導前にＭＣＨを注射するとラット及び
モルモットの両方で発作活動が阻害されることから、ＭＣＨ含有神経がＰＴＺ−
誘導発作の基礎となる神経回路に関係していることが示唆されている（Ｋｎｉｇ
ｇｅとＷａｇｎｅｒ、１９９７）。ＭＣＨは認識機能に関連する行動にも影響す
ることが観察されている。ＭＣＨ処理はラットでは受動的傾聴反応の消滅を早め
（ＭｃＢｒｉｄｅら、１９９４）、ＭＣＨ受容体アンタゴニストが記憶の保存及
び／又は維持に有益である可能性が示唆された。痛みの変調又は知覚に於いて考
え得るＭＣＨの役割は、ＭＣＨ陽性繊維による水道周囲灰白質（ＰＡＧ）の密集
神経支配により支持されている。最後に、ＭＣＨは水分摂取の制御に関係してい
るであろう。覚醒している羊にＭＣＨをＩＣＶ注入すると、血漿容積の増加に反
応して利尿、ナトリウム排泄、及びカリウム排泄が変化する（Ｐａｒｋｅｓ、１
９９６）。ＭＣＨが脳内の水分制御域に存在するという解剖学的データと合わせ
、ＭＣＨは哺乳動物に於ける水分恒常性の中枢性コントロールに関係しているこ
とが示されている。
観察されたＭＣＨの作用から示唆されている。例えば、ＭＣＨは雄及び雌ラット
に於いて生殖機能を制御しているであろう。ＭＣＨ転写対及びＭＣＨペプチドは
成体ラットの生殖細胞内に見いだされており、ＭＣＨが幹細胞新生及び／又は初
期精細胞の分化に関係している可能性が示唆されている（Ｈｅｒｖｉｅｕら、１
９９６）。ＭＣＨを直接視索前野域（ＭＰＯＡ）または腹内側核（ＶＭＮ）に注
射すると、雌ラットの生殖活動を刺激した（Ｇｏｎｚａｌｅｚら、１９９６）。
エストラジオールでプライムし卵巣切除されたラットでは、ＭＣＨは黄体形成ホ
ルモン（ＬＨ）の放出を刺激したが、抗ＭＣＨ抗血清はＬＨ放出を阻害した（Ｇ
ｏｎｚａｌｅｚら、１９９７）。ＭＣＨ細胞体の大集団を含む不確帯は従来排卵
前記のＬＨ上昇に関する制御部位として同定されていた（ＭａｃＫｅｎｚｉｅら
、１９８４）。ＭＣＨはＡＣＴＨ及びオキシトシンを含む脳下垂体ホルモンの放
出に影響を及ぼすと報告されている。ＭＣＨ類似体は、てんかんの治療にも有用
であろう。ＰＴＺ発作モデルでは、発作誘導前にＭＣＨを注射するとラット及び
モルモットの両方で発作活動が阻害されることから、ＭＣＨ含有神経がＰＴＺ−
誘導発作の基礎となる神経回路に関係していることが示唆されている（Ｋｎｉｇ
ｇｅとＷａｇｎｅｒ、１９９７）。ＭＣＨは認識機能に関連する行動にも影響す
ることが観察されている。ＭＣＨ処理はラットでは受動的傾聴反応の消滅を早め
（ＭｃＢｒｉｄｅら、１９９４）、ＭＣＨ受容体アンタゴニストが記憶の保存及
び／又は維持に有益である可能性が示唆された。痛みの変調又は知覚に於いて考
え得るＭＣＨの役割は、ＭＣＨ陽性繊維による水道周囲灰白質（ＰＡＧ）の密集
神経支配により支持されている。最後に、ＭＣＨは水分摂取の制御に関係してい
るであろう。覚醒している羊にＭＣＨをＩＣＶ注入すると、血漿容積の増加に反
応して利尿、ナトリウム排泄、及びカリウム排泄が変化する（Ｐａｒｋｅｓ、１
９９６）。ＭＣＨが脳内の水分制御域に存在するという解剖学的データと合わせ
、ＭＣＨは哺乳動物に於ける水分恒常性の中枢性コントロールに関係しているこ
とが示されている。
【００１２】
本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体又はＭＣＨ又はその類似体あるいは相同体によ
り活性化されるヒトＭＣＨ１受容体の変異体をコードしている、単離された核酸
を提供する。
り活性化されるヒトＭＣＨ１受容体の変異体をコードしている、単離された核酸
を提供する。
【００１３】 本発明は、核酸が（ａ）低厳密条件下に図１（配列番号１）に示す規定配列、
又はそれに対し相補的である配列を持つ核酸にハイブリダズし、そして（ｂ）Ｍ
ＣＨ１リガンドがＣＨＯ培養体に加えられ且つ上記規定配列又はその相補体を持
つ核酸にハイブリダイズする核酸をＣＨＯ細胞が含む場合に培養体のｐＨを変化
させることができるその能力により更に特徴付けられる、ヒトＭＣＨ１受容体を
コードする核酸を提供する。
又はそれに対し相補的である配列を持つ核酸にハイブリダズし、そして（ｂ）Ｍ
ＣＨ１リガンドがＣＨＯ培養体に加えられ且つ上記規定配列又はその相補体を持
つ核酸にハイブリダイズする核酸をＣＨＯ細胞が含む場合に培養体のｐＨを変化
させることができるその能力により更に特徴付けられる、ヒトＭＣＨ１受容体を
コードする核酸を提供する。
【００１４】 本発明は、精製されたヒトＭＣＨ１受容体タンパク質を提供する。
【００１５】 本発明はヒトＭＣＨ１受容体をコードする核酸を含むベクター、特に哺乳動物
細胞、又は非哺乳動物細胞中でのヒトＭＣＨ１受容体の発現に適したベクターを
提供する。この様なベクターの１つは、ｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ
受付番号２０３１９７）と呼ばれる、ヒトＭＣＨ１受容体をコードするヌクレオ
チド配列を含むプラスミドである。
細胞、又は非哺乳動物細胞中でのヒトＭＣＨ１受容体の発現に適したベクターを
提供する。この様なベクターの１つは、ｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ
受付番号２０３１９７）と呼ばれる、ヒトＭＣＨ１受容体をコードするヌクレオ
チド配列を含むプラスミドである。
【００１６】 本発明は更にヒトＭＣＨ１受容体をコードする核酸配列を含むベクターを含む
細胞、及びそのような細胞から単離された膜調製体も提供する。
細胞、及びそのような細胞から単離された膜調製体も提供する。
【００１７】 本発明は更に哺乳動物ＭＣＨ１受容体をコードする核酸と特異的にハイブリダ
イズする、少なくとも１５ヌクレオチドを含む核酸プローブにおいて、該プロー
ブがいずれもプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３
１９７）中に存在するヒトＭＣＨ１受容体をコードする核酸配列又はその相補体
中に存在する配列に対応する特有の配列を有しているプローブも提供する。
イズする、少なくとも１５ヌクレオチドを含む核酸プローブにおいて、該プロー
ブがいずれもプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３
１９７）中に存在するヒトＭＣＨ１受容体をコードする核酸配列又はその相補体
中に存在する配列に対応する特有の配列を有しているプローブも提供する。
【００１８】 本発明は更に哺乳動物ＭＣＨ１受容体をコードする核酸と特異的にハイブリダ
イズする、少なくとも１５ヌクレオチドを含む核酸プローブにおいて、該プロー
ブが（ａ）図１に示す核酸配列（配列番号１）又は（ｂ）その逆方向相補体に対
応する特有の配列を有しているプローブも提供する。
イズする、少なくとも１５ヌクレオチドを含む核酸プローブにおいて、該プロー
ブが（ａ）図１に示す核酸配列（配列番号１）又は（ｂ）その逆方向相補体に対
応する特有の配列を有しているプローブも提供する。
【００１９】 本発明は更に、ヒトＭＣＨ１受容体をコードするゲノムＤＮＡに対し特異的に
ハイブリダズすることができる配列を有するＲＮＡ及びアンチセンスオリゴヌク
レオチドの翻訳を阻止することを目的とした、ヒトＭＣＨ１受容体をコードする
ＲＮＡに特異的にハイブリダズすることができる配列を有するアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドを提供する。
ハイブリダズすることができる配列を有するＲＮＡ及びアンチセンスオリゴヌク
レオチドの翻訳を阻止することを目的とした、ヒトＭＣＨ１受容体をコードする
ＲＮＡに特異的にハイブリダズすることができる配列を有するアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドを提供する。
【００２０】 本発明は更にヒトＭＣＨ１受容体に対し結合できる抗体、及びヒトＭＣＨ１受
容体に対する抗体の結合を阻害できる作用物質を提供する。
容体に対する抗体の結合を阻害できる作用物質を提供する。
【００２１】 本発明は（ａ）細胞膜を通過しヒトＭＣＨ１受容体の発現を効果的に低下する
ことができる上記オリゴヌクレオチドの量、及び（ｂ）細胞膜を通過できる医薬
品として受け入れ可能なキャリアーを含む医薬組成物を提供する。
ことができる上記オリゴヌクレオチドの量、及び（ｂ）細胞膜を通過できる医薬
品として受け入れ可能なキャリアーを含む医薬組成物を提供する。
【００２２】 更に、本発明はヒトＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡを発現するトランスジ
ェニック非ヒト哺乳動物を提供する。本発明はまた、陰性ヒトＭＣＨ１受容体の
相同的組み換えノックアウトを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供す
る。本発明は更にそのゲノムヒトＭＣＨ１受容体をコードするｍＲＮＡに対し相
補的であるアンチセンスｍＲＮＡに転写され、更にヒトＭＣＨ１受容体をコード
するｍＲＮＡにハイブリダズし、それによりその翻訳を減じる様にゲノム内に配
置された、ヒトＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡに対し相補的であるアンチセ
ンスＤＮＡを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。
ェニック非ヒト哺乳動物を提供する。本発明はまた、陰性ヒトＭＣＨ１受容体の
相同的組み換えノックアウトを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供す
る。本発明は更にそのゲノムヒトＭＣＨ１受容体をコードするｍＲＮＡに対し相
補的であるアンチセンスｍＲＮＡに転写され、更にヒトＭＣＨ１受容体をコード
するｍＲＮＡにハイブリダズし、それによりその翻訳を減じる様にゲノム内に配
置された、ヒトＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡに対し相補的であるアンチセ
ンスＤＮＡを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。
【００２３】 実施態様の一つに於いて、本発明は、通常は哺乳動物ＭＣＨ１受容体を発現し
ていない、哺乳動物ＭＣＨ１受容体をコードする哺乳動物ＤＮＡを含み、その表
面に哺乳動物ＭＣＨ１受容体を発現している細胞に、好適条件下に化合物を接触
せしめるとを含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定し
、かつ哺乳動物ＭＣＨ１受容体への化合物の特異的結合を検出するための方法を
提供する。
ていない、哺乳動物ＭＣＨ１受容体をコードする哺乳動物ＤＮＡを含み、その表
面に哺乳動物ＭＣＨ１受容体を発現している細胞に、好適条件下に化合物を接触
せしめるとを含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定し
、かつ哺乳動物ＭＣＨ１受容体への化合物の特異的結合を検出するための方法を
提供する。
【００２４】 本発明は、通常は哺乳動物ＭＣＨ１受容体を発現していない、哺乳動物ＭＣＨ
１受容体をコードするＤＮＡにより形質転換され、その細胞表面上に発現してい
る細胞由来の膜調製体に結合好適条件下に化合物を接触せしめることを含む、哺
乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定し、また哺乳動物ＭＣＨ
１受容体への化合物の特異的結合を検出する方法を提供する。
１受容体をコードするＤＮＡにより形質転換され、その細胞表面上に発現してい
る細胞由来の膜調製体に結合好適条件下に化合物を接触せしめることを含む、哺
乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定し、また哺乳動物ＭＣＨ
１受容体への化合物の特異的結合を検出する方法を提供する。
【００２５】 本発明は、通常は哺乳動物ＭＣＨ１受容体を発現していないが、その表面に哺
乳動物ＭＣＨ１受容体を発現している細胞に、両化合物の結合に好適な条件下に
化合物及び受容体への結合が既知である第２化合物を別々に接触せしめること、
及び第２化合物とだけを接触せしめることを含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特
異的に結合する化合物を同定する、そして哺乳動物ＭＣＨ１受容体への化合物の
特異的結合及び哺乳動物ＭＣＨ１受容体への化合物の結合を指示する、化合物の
存在下における哺乳動物ＭＣＨ１受容体への第２化合物の結合の低下を検出する
ための競合結合を含む方法を提供する。
乳動物ＭＣＨ１受容体を発現している細胞に、両化合物の結合に好適な条件下に
化合物及び受容体への結合が既知である第２化合物を別々に接触せしめること、
及び第２化合物とだけを接触せしめることを含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特
異的に結合する化合物を同定する、そして哺乳動物ＭＣＨ１受容体への化合物の
特異的結合及び哺乳動物ＭＣＨ１受容体への化合物の結合を指示する、化合物の
存在下における哺乳動物ＭＣＨ１受容体への第２化合物の結合の低下を検出する
ための競合結合を含む方法を提供する。
【００２６】 本発明は、通常は哺乳動物ＭＣＨ１受容体を発現していないが、その表面に哺
乳動物ＭＣＨ１受容体を発現している細胞の細胞抽出部に由来する膜分画に、両
化合物の結合に好適な条件下に化合物及び受容体への結合が既知である第２化合
物を別々に接触せしめること及び第２化合物とだけを接触せしめることを含む、
哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定する、そして哺乳動物
ＭＣＨ１受容体への化合物の特異的結合及び哺乳動物ＭＣＨ１受容体への化合物
の結合を指示する、化合物存在下に於ける哺乳動物ＭＣＨ１受容体への第２化合
物の結合の低下を検出するための競合結合を含む方法を提供する。
乳動物ＭＣＨ１受容体を発現している細胞の細胞抽出部に由来する膜分画に、両
化合物の結合に好適な条件下に化合物及び受容体への結合が既知である第２化合
物を別々に接触せしめること及び第２化合物とだけを接触せしめることを含む、
哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定する、そして哺乳動物
ＭＣＨ１受容体への化合物の特異的結合及び哺乳動物ＭＣＨ１受容体への化合物
の結合を指示する、化合物存在下に於ける哺乳動物ＭＣＨ１受容体への第２化合
物の結合の低下を検出するための競合結合を含む方法を提供する。
【００２７】 本発明は、（ａ）哺乳動物ＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡにより形質転換
され、それを発現している細胞に哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合するこ
とが既知である化合物を接触せしめること；（ｂ）哺乳動物ＭＣＨ１受容体への
結合が既知の化合物にの結合を許可する条件下に、工程（ａ）の調製体と哺乳動
物ＭＣＨ１受容体への結合が既知ではない複数の化合物を接触せしめること；（
ｃ）哺乳動物ＭＣＨ１受容体への結合既知である化合物の結合が複数の化合物の
中の化合物の不在により低下するかどうかを決定すること；及び低下を示した場
合に（ｄ）複数化合物中に含まれる化合物の哺乳動物ＭＣＨ１受容体への結合を
別々に決定し、それにより哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を
同定することを含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体へ特異的に結合する化合物を同定
することを目的とした、哺乳動物ＭＣＨ１受容体への結合が不明な複数化合物を
スクリーニングする方法を提供する。
され、それを発現している細胞に哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合するこ
とが既知である化合物を接触せしめること；（ｂ）哺乳動物ＭＣＨ１受容体への
結合が既知の化合物にの結合を許可する条件下に、工程（ａ）の調製体と哺乳動
物ＭＣＨ１受容体への結合が既知ではない複数の化合物を接触せしめること；（
ｃ）哺乳動物ＭＣＨ１受容体への結合既知である化合物の結合が複数の化合物の
中の化合物の不在により低下するかどうかを決定すること；及び低下を示した場
合に（ｄ）複数化合物中に含まれる化合物の哺乳動物ＭＣＨ１受容体への結合を
別々に決定し、それにより哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を
同定することを含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体へ特異的に結合する化合物を同定
することを目的とした、哺乳動物ＭＣＨ１受容体への結合が不明な複数化合物を
スクリーニングする方法を提供する。
【００２８】 本発明は、（ａ）哺乳動物ＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡにより形質転換
されそれを発現している細胞に、哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合するこ
とが既知である化合物を接触せしめること；（ｂ）哺乳動物ＭＣＨ１受容体への
結合が既知の化合物にの結合を許可する条件下に、工程（ａ）の調製体と哺乳動
物ＭＣＨ１受容体への結合が既知ではない複数の化合物を接触せしめること；（
ｃ）哺乳動物ＭＣＨ１受容体への結合既知である化合物の結合が複数の化合物の
中の化合物の存在により低下するかどうかを決定すること；及び低下を示した場
合に（ｄ）複数化合物中に含まれる化合物の哺乳動物ＭＣＨ１受容体への結合を
別々に決定し、それにより哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を
同定することを含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体へ特異的に結合する化合物を同定
することを目的とした、哺乳動物ＭＣＨ１受容体への結合が不明な複数化合物を
スクリーニングする方法を提供する。
されそれを発現している細胞に、哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合するこ
とが既知である化合物を接触せしめること；（ｂ）哺乳動物ＭＣＨ１受容体への
結合が既知の化合物にの結合を許可する条件下に、工程（ａ）の調製体と哺乳動
物ＭＣＨ１受容体への結合が既知ではない複数の化合物を接触せしめること；（
ｃ）哺乳動物ＭＣＨ１受容体への結合既知である化合物の結合が複数の化合物の
中の化合物の存在により低下するかどうかを決定すること；及び低下を示した場
合に（ｄ）複数化合物中に含まれる化合物の哺乳動物ＭＣＨ１受容体への結合を
別々に決定し、それにより哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を
同定することを含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体へ特異的に結合する化合物を同定
することを目的とした、哺乳動物ＭＣＨ１受容体への結合が不明な複数化合物を
スクリーニングする方法を提供する。
【００２９】 本発明は、細胞より全ｍＲＮＡを獲得し、得られたｍＲＮＡをハイブリダイゼ
ーション条件下に核酸プローブと接触させ、プローブにハイブリダイゼーション
したｍＲＮＡの存在を検出し、それにより細胞による哺乳動物ＭＣＨ１受容体の
発現を検出することを含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の発現を検出する方法を提
供する。
ーション条件下に核酸プローブと接触させ、プローブにハイブリダイゼーション
したｍＲＮＡの存在を検出し、それにより細胞による哺乳動物ＭＣＨ１受容体の
発現を検出することを含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の発現を検出する方法を提
供する。
【００３０】 本発明は、抗体が受容体に結合する条件の下に細胞を抗体と接触させ、細胞に
結合した抗体の存在を検出し、それにより細胞表面上の哺乳動物ＭＣＨ１受容体
の存在を検出することを含む、細胞表面上の哺乳動物ＭＣＨ１受容体の存在を検
出する方法を提供する。
結合した抗体の存在を検出し、それにより細胞表面上の哺乳動物ＭＣＨ１受容体
の存在を検出することを含む、細胞表面上の哺乳動物ＭＣＨ１受容体の存在を検
出する方法を提供する。
【００３１】 本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体活性のレベルが、ヒトＭＣＨ１受容体発現を制
御する、誘導可能なプロモーターの利用によって変化するヒト以外のトラスジェ
ニック哺乳動物を産生することを含む、ヒトＭＣＨ１受容体の活性レベルを変化
させることの生理学的影響を決定する方法を提供する。
御する、誘導可能なプロモーターの利用によって変化するヒト以外のトラスジェ
ニック哺乳動物を産生することを含む、ヒトＭＣＨ１受容体の活性レベルを変化
させることの生理学的影響を決定する方法を提供する。
【００３２】 本発明は、それぞれが異なる量のヒトＭＣＨ１受容体を発現しているトランス
ジェニック非ヒト哺乳動物のパネルを作製することを含む、ヒトＭＣＨ１受容体
活性のレベルを変えることの生理学的影響を決定する方法を提供する。
ジェニック非ヒト哺乳動物のパネルを作製することを含む、ヒトＭＣＨ１受容体
活性のレベルを変えることの生理学的影響を決定する方法を提供する。
【００３３】 本発明は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物に投与すること、及び化合物が
ヒトＭＣＨ１受容体の過剰発現の結果として、トランスジェニック非ヒト哺乳動
物により提示された生理学的及び行動学的異常を変化させるかを決定し、異常の
緩和により化合物がアンタゴニストであると同定されることを含む、ヒトＭＣＨ
１受容体の活性を低下させることで異常が緩和する異常の軽快化が可能なアンタ
ゴニストを同定する方法を提供する。
ヒトＭＣＨ１受容体の過剰発現の結果として、トランスジェニック非ヒト哺乳動
物により提示された生理学的及び行動学的異常を変化させるかを決定し、異常の
緩和により化合物がアンタゴニストであると同定されることを含む、ヒトＭＣＨ
１受容体の活性を低下させることで異常が緩和する異常の軽快化が可能なアンタ
ゴニストを同定する方法を提供する。
【００３４】 本発明は、被験者に対し有効量のこの医薬組成物を投与し、それにより異常を
治療することを含む、ヒトＭＣＨ１受容体の活性の低下により以上が軽快化され
る被験者に於ける異常を治療する方法を提供する。
治療することを含む、ヒトＭＣＨ１受容体の活性の低下により以上が軽快化され
る被験者に於ける異常を治療する方法を提供する。
【００３５】 本発明は、化合物をトランスジェニック非ヒト哺乳動物に投与すること、そし
て化合物がそのトランスジェニック非ヒト哺乳動物により提示される生理学的及
び行動学的異常を変化させるか決定し、異常の軽快化より化合物がアゴニストで
あることを同定することを含む、ヒトＭＣＨ１受容体の活性を増加させることで
被験者の異常を軽快化できるアゴニストを同定する方法を提供する。本発明は更
にこの方法により同定されたアゴニストも提供する。本発明は更に本法により同
定されたアゴニストを含む医薬組成物も提供する。本発明は、被験者に対し本医
薬組成物の有効量を投与し、それにより異常を治療することを含む、ヒトＭＣＨ
１受容体の活性を増加させることで異常が軽快化する被験者の異常を治療する方
法を提供する。
て化合物がそのトランスジェニック非ヒト哺乳動物により提示される生理学的及
び行動学的異常を変化させるか決定し、異常の軽快化より化合物がアゴニストで
あることを同定することを含む、ヒトＭＣＨ１受容体の活性を増加させることで
被験者の異常を軽快化できるアゴニストを同定する方法を提供する。本発明は更
にこの方法により同定されたアゴニストも提供する。本発明は更に本法により同
定されたアゴニストを含む医薬組成物も提供する。本発明は、被験者に対し本医
薬組成物の有効量を投与し、それにより異常を治療することを含む、ヒトＭＣＨ
１受容体の活性を増加させることで異常が軽快化する被験者の異常を治療する方
法を提供する。
【００３６】 本発明は以下を含む、特異的哺乳動物の活性を伴う疾患の病的素因を診断する
方法を提供する：（ａ）疾患にかかっている被験者のＤＮＡを得ること；（ｂ）
制限酵素のパネルでＤＮＡを制限消化すること；（ｃ）得られたＤＮＡ断片をサ
イズ分析用ゲル上に電気泳動により分離すること；（ｄ）得られたゲルを、ヒト
ＭＣＩ受容体をコードしている核酸分子内に含まれる特異配列と特異的にハイブ
リダイズでき、且つ検出可能なマーカーにより標識された核酸プローブと接触さ
せしめること；（ｅ）検出可能マーカーにて標識された、ヒトＭＣＨ１受容体を
コードするＤＮＡにハイブリダイズし、疾患にかかった被験者のＤＮＡに特異的
な特有バンドパターンを形成する標識バンドを検出すること；（ｆ）工程（ａ）
−（ｅ）を実施して診断を目的とするＤＮＡの調製を行うこと；及び（ｇ）工程
（ｅ）より得た疾患にかかった被験者のＤＮＡに特異的な特有バンドパターンと
、工程（ｆ）より診断に関し得たＤＮＡに特異的な特有バンドパターンとを比較
してパターンが同一であるか又は異なるかを決定し、それによりパターンが同一
である場合に疾患の病的素因があると診断すること。
方法を提供する：（ａ）疾患にかかっている被験者のＤＮＡを得ること；（ｂ）
制限酵素のパネルでＤＮＡを制限消化すること；（ｃ）得られたＤＮＡ断片をサ
イズ分析用ゲル上に電気泳動により分離すること；（ｄ）得られたゲルを、ヒト
ＭＣＩ受容体をコードしている核酸分子内に含まれる特異配列と特異的にハイブ
リダイズでき、且つ検出可能なマーカーにより標識された核酸プローブと接触さ
せしめること；（ｅ）検出可能マーカーにて標識された、ヒトＭＣＨ１受容体を
コードするＤＮＡにハイブリダイズし、疾患にかかった被験者のＤＮＡに特異的
な特有バンドパターンを形成する標識バンドを検出すること；（ｆ）工程（ａ）
−（ｅ）を実施して診断を目的とするＤＮＡの調製を行うこと；及び（ｇ）工程
（ｅ）より得た疾患にかかった被験者のＤＮＡに特異的な特有バンドパターンと
、工程（ｆ）より診断に関し得たＤＮＡに特異的な特有バンドパターンとを比較
してパターンが同一であるか又は異なるかを決定し、それによりパターンが同一
である場合に疾患の病的素因があると診断すること。
【００３７】 本発明は以下を含む、精製されたヒトＭＣＨ１受容体を調製する方法を提供す
る：（ａ）細胞にヒトＭＣＨ１受容体発現を誘導すること；（ｂ）分離細胞より
ヒトＭＣＨ１受容体を回収すること；及び（ｃ）回収したヒトＭＣＨ１受容体を
精製すること。
る：（ａ）細胞にヒトＭＣＨ１受容体発現を誘導すること；（ｂ）分離細胞より
ヒトＭＣＨ１受容体を回収すること；及び（ｃ）回収したヒトＭＣＨ１受容体を
精製すること。
【００３８】 本発明は以下を含む、精製ヒトＭＣＨ１受容体を調製する方法を提供する；（
ａ）適当なベクターにヒトＭＣＨ１受容体をコードする核酸を挿入すること；（
ｂ）得られたベクターを好適な宿主細胞に導入すること；（ｃ）得られた細胞を
単離されたヒトＭＣＨ１受容体の産生を可能にする好適条件に置くこと；（ｄ）
得られた細胞により産生されるヒトＭＣＨ１受容体を回収すること；及び（ｅ）
そうして回収されたヒトＭＣＨ１受容体を精製すること。
ａ）適当なベクターにヒトＭＣＨ１受容体をコードする核酸を挿入すること；（
ｂ）得られたベクターを好適な宿主細胞に導入すること；（ｃ）得られた細胞を
単離されたヒトＭＣＨ１受容体の産生を可能にする好適条件に置くこと；（ｄ）
得られた細胞により産生されるヒトＭＣＨ１受容体を回収すること；及び（ｅ）
そうして回収されたヒトＭＣＨ１受容体を精製すること。
【００３９】 本発明は、哺乳動物ＭＣＨ１受容体をコードしているＤＮＡにより形質導入さ
れ、それを発現している細胞を、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化を可能にする
条件の下に化合物と接触せしめ、哺乳動物ＭＣＨ１受容体活性の増加を検出し、
それにより化合物が哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニストであるかを決定すること
を含む、化合物が哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニストであるか否かを決定する方
法を提供する。本発明は更に、上記方法にて決定された哺乳動物ＭＣＨ１受容体
の活性を増加するのに有効である哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニストのある量と
、医薬品として受け入れ可能なキャリアーのある量とを含む医薬組成物も提供す
る。
れ、それを発現している細胞を、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化を可能にする
条件の下に化合物と接触せしめ、哺乳動物ＭＣＨ１受容体活性の増加を検出し、
それにより化合物が哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニストであるかを決定すること
を含む、化合物が哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニストであるか否かを決定する方
法を提供する。本発明は更に、上記方法にて決定された哺乳動物ＭＣＨ１受容体
の活性を増加するのに有効である哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニストのある量と
、医薬品として受け入れ可能なキャリアーのある量とを含む医薬組成物も提供す
る。
【００４０】 本発明は、哺乳動物ＭＣＨ１受容体をコードしているＤＮＡにより形質導入さ
れ、それを発現している細胞を、既知哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニスト存在下
に哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化を可能にする条件の下、化合物と接触せしめ
、そして哺乳動物ＭＣＨ１受容体活性の増加を検出し、それにより化合物が哺乳
動物ＭＣＨ１受容体アゴニストであるかを決定することを含む、化合物が哺乳動
物ＭＣＨ１受容体アゴニストであるか否かを決定する方法を提供する。本発明は
更に、上記方法にて決定された哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性を増加するのに有
効である哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニストのある量と、医薬品として受け入れ
可能なキャリアーのある量とを含む医薬組成物も提供する。
れ、それを発現している細胞を、既知哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニスト存在下
に哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化を可能にする条件の下、化合物と接触せしめ
、そして哺乳動物ＭＣＨ１受容体活性の増加を検出し、それにより化合物が哺乳
動物ＭＣＨ１受容体アゴニストであるかを決定することを含む、化合物が哺乳動
物ＭＣＨ１受容体アゴニストであるか否かを決定する方法を提供する。本発明は
更に、上記方法にて決定された哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性を増加するのに有
効である哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニストのある量と、医薬品として受け入れ
可能なキャリアーのある量とを含む医薬組成物も提供する。
【００４１】 本発明は、元来は哺乳動物ＭＣＨ１受容体を発現していないが、２メッセンジ
ャー反応を産生し且つその細胞表面上に哺乳動物ＭＣＨ１受容体を発現している
細胞を、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化に好適な条件下に化合物と接触せしめ
ること、及び化合物の存在下または非存在下で第２メッセンジャー反応を測定す
ることを含み、化合物の存在下における第２メッセンジャー反応の変化は該化合
物が哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニストであることを示す、化合物が哺乳動物Ｍ
ＣＨ１受容体に特異的に結合し活性化するか否かを決定する方法を提供する。本
発明は更に、本方法にて哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性を増加させることに有効
であることが決定された化合物（ＭＣＨ１受容体アゴニスト）の量と、医薬品と
して受け入れ可能なキャリアーの量とを含む、医薬組成物も提供する。
ャー反応を産生し且つその細胞表面上に哺乳動物ＭＣＨ１受容体を発現している
細胞を、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化に好適な条件下に化合物と接触せしめ
ること、及び化合物の存在下または非存在下で第２メッセンジャー反応を測定す
ることを含み、化合物の存在下における第２メッセンジャー反応の変化は該化合
物が哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニストであることを示す、化合物が哺乳動物Ｍ
ＣＨ１受容体に特異的に結合し活性化するか否かを決定する方法を提供する。本
発明は更に、本方法にて哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性を増加させることに有効
であることが決定された化合物（ＭＣＨ１受容体アゴニスト）の量と、医薬品と
して受け入れ可能なキャリアーの量とを含む、医薬組成物も提供する。
【００４２】 本発明は、元来は哺乳動物ＭＣＨ１受容体を発現していないが、２メッセンジ
ャー反応を産生し且つその細胞表面上に哺乳動物ＭＣＨ１受容体を発現している
細胞を、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化に好適な条件下に、化合物及び哺乳動
物ＭＣＨ１受容体を活性化することが既知である第２化合物の両方、ならびに第
２化合物とだけ別々に接触せしめ、そして第２化合物のみ存在する条件、及び第
２化合物と化合物の両方が存在する条件下に第２メッセンジャー反応を測定する
ことを含み、化合物及び第２化合物の両方が存在する場合の第２メッセンジャー
反応の変化が第２化合物のみ存在する場合の同変化に比べ小さいことが、化合物
が哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害することを示す、化合物が哺乳動物Ｍ
ＣＨ１受容体に特異的に結合し活性化を阻害するかどうかを決定する方法を提供
する。本発明は更に、本方法にて哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性を増加させるこ
とに有効であることが決定された化合物の量と、医薬品として受け入れ可能なキ
ャリアーの量とを含む、医薬組成物も提供する。
ャー反応を産生し且つその細胞表面上に哺乳動物ＭＣＨ１受容体を発現している
細胞を、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化に好適な条件下に、化合物及び哺乳動
物ＭＣＨ１受容体を活性化することが既知である第２化合物の両方、ならびに第
２化合物とだけ別々に接触せしめ、そして第２化合物のみ存在する条件、及び第
２化合物と化合物の両方が存在する条件下に第２メッセンジャー反応を測定する
ことを含み、化合物及び第２化合物の両方が存在する場合の第２メッセンジャー
反応の変化が第２化合物のみ存在する場合の同変化に比べ小さいことが、化合物
が哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害することを示す、化合物が哺乳動物Ｍ
ＣＨ１受容体に特異的に結合し活性化を阻害するかどうかを決定する方法を提供
する。本発明は更に、本方法にて哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性を増加させるこ
とに有効であることが決定された化合物の量と、医薬品として受け入れ可能なキ
ャリアーの量とを含む、医薬組成物も提供する。
【００４３】 本発明は以下を含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体を活性化することが未知である
複数の化合物をスクリーニングし、哺乳動物ＭＣＨ１受容体を活性化する化合物
を同定する方法を提供する：（ａ）哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化を可能にす
る条件下に、哺乳動物ＭＣＨ１受容体がトランスフェクションされ、それを発現
している細胞に、哺乳動物ＭＣＨ１受容体を活性化することが未知である複数の
化合物を接触せしめること；（ｂ）哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性が化合物存在
下に増加するかどうかを決定すること；及び増加した場合に（ｃ）前記複数の化
合物中に含まれるそれぞれの化合物により哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化が増
加するかを別々に決定し、それにより哺乳動物ＭＣＨ１受容体を活性化する化合
物を同定すること。本発明は更に本法で同定された化合物も提供する。本発明は
更に、本法により哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性増加に有効であると同定された
化合物の量と、医薬品として受け入れ可能なキャリアーとを含む医薬組成物も提
供する。
複数の化合物をスクリーニングし、哺乳動物ＭＣＨ１受容体を活性化する化合物
を同定する方法を提供する：（ａ）哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化を可能にす
る条件下に、哺乳動物ＭＣＨ１受容体がトランスフェクションされ、それを発現
している細胞に、哺乳動物ＭＣＨ１受容体を活性化することが未知である複数の
化合物を接触せしめること；（ｂ）哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性が化合物存在
下に増加するかどうかを決定すること；及び増加した場合に（ｃ）前記複数の化
合物中に含まれるそれぞれの化合物により哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化が増
加するかを別々に決定し、それにより哺乳動物ＭＣＨ１受容体を活性化する化合
物を同定すること。本発明は更に本法で同定された化合物も提供する。本発明は
更に、本法により哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性増加に有効であると同定された
化合物の量と、医薬品として受け入れ可能なキャリアーとを含む医薬組成物も提
供する。
【００４４】 本発明は以下を含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害することが未知
である複数の化合物をスクリーニングし、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化を阻
害する化合物を同定する方法を提供する：（ａ）哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性
化を可能にする条件下に、哺乳動物ＭＣＨ１受容体がトランスフェクションされ
、それを発現している細胞に、既知哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニスト存在下に
複数の化合物を接触せしめること；（ｂ）複数化合物非存在下に於ける哺乳動物
ＭＣＨ１受容体の活性化に比べ、複数化合物存在下に哺乳動物ＭＣＨ１受容体の
活性が減少するかどうかを決定すること；及び減少する場合に（ｃ）前記複数の
化合物中に含まれるそれぞれの化合物について哺乳動物ＭＣＨ１受容体活性化の
阻害を別々に決定し、それにより哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する化
合物を同定すること。本発明は更に本法で同定された化合物も提供する。本発明
は更に、本法により哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性減少に有効であると同定され
た化合物の量と、医薬品として受け入れ可能なキャリアーとを含む医薬組成物も
提供する。
である複数の化合物をスクリーニングし、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化を阻
害する化合物を同定する方法を提供する：（ａ）哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性
化を可能にする条件下に、哺乳動物ＭＣＨ１受容体がトランスフェクションされ
、それを発現している細胞に、既知哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニスト存在下に
複数の化合物を接触せしめること；（ｂ）複数化合物非存在下に於ける哺乳動物
ＭＣＨ１受容体の活性化に比べ、複数化合物存在下に哺乳動物ＭＣＨ１受容体の
活性が減少するかどうかを決定すること；及び減少する場合に（ｃ）前記複数の
化合物中に含まれるそれぞれの化合物について哺乳動物ＭＣＨ１受容体活性化の
阻害を別々に決定し、それにより哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する化
合物を同定すること。本発明は更に本法で同定された化合物も提供する。本発明
は更に、本法により哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性減少に有効であると同定され
た化合物の量と、医薬品として受け入れ可能なキャリアーとを含む医薬組成物も
提供する。
【００４５】 本発明は、異常の治療に有効な哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニストである化合
物の量を被験者に投与するを含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化上昇により
緩和される被験者の異常を治療する方法を提供する。
物の量を被験者に投与するを含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化上昇により
緩和される被験者の異常を治療する方法を提供する。
【００４６】 本発明は、異常の治療に有効な哺乳動物ＭＣＨ１受容体アンタゴニストである
化合物の量を被験者に投与するを含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化減少に
より緩和される被験者の異常を治療する方法を提供する。
化合物の量を被験者に投与するを含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化減少に
より緩和される被験者の異常を治療する方法を提供する。
【００４７】 本発明は、哺乳動物受容体に結合し、および／又はその活性化を活性化又は阻
害する化合物を同定することに関する本書記載の方法のいずれかを用いて化合物
を同定し、次に化合物、又はその新規構造的及び機能的類似体又は相同体を合成
することを含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を作製する
方法を提供する。本発明はさらに、医薬品として受け入れ可能なキャリアー、及
び哺乳動物ＭＣＨ１受容体に結合し、および／又はその活性化を活性化又は阻害
する化合物、又はその新規構造的及び機能的類似体又は相同体を同定することに
関しここに記載された方法のいずれかにより同定された化合物の医薬品として受
け入れ可能な量とを投与することを含む、医薬組成物調製に関する方法を提供す
る。
害する化合物を同定することに関する本書記載の方法のいずれかを用いて化合物
を同定し、次に化合物、又はその新規構造的及び機能的類似体又は相同体を合成
することを含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を作製する
方法を提供する。本発明はさらに、医薬品として受け入れ可能なキャリアー、及
び哺乳動物ＭＣＨ１受容体に結合し、および／又はその活性化を活性化又は阻害
する化合物、又はその新規構造的及び機能的類似体又は相同体を同定することに
関しここに記載された方法のいずれかにより同定された化合物の医薬品として受
け入れ可能な量とを投与することを含む、医薬組成物調製に関する方法を提供す
る。
【００４８】 本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体活性をコードするＤＮＡがトランスフェクショ
ンされ且つそれを発現している細胞を、ヒトＭＣＨ１受容体の活性化可能な条件
の下、既知ヒトＭＣＨ１受容体アゴニスト存在下に化合物と接触させ、そしてヒ
トＭＣＨ１受容体活性の減少を検出し、それにより化合物がヒトヒトＭＣＨ１受
容体アゴニストであるかを決定することを含み、前記ヒトＭＣＨ１受容体をコー
ドするＤＮＡが図１（配列番号１）に示す、又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−Ｔ
Ｌ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる配列を含むものであり、
前記既知ヒトＭＣＨ１受容体アゴニストがＭＣＨ又はＭＣＨの相同体あるいは類
似体であり、そして前記細胞がトランスフェクション前にはＭＣＨ１受容体を発
現していない、化合物がヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストであるかを決定する
方法を提供する。
ンされ且つそれを発現している細胞を、ヒトＭＣＨ１受容体の活性化可能な条件
の下、既知ヒトＭＣＨ１受容体アゴニスト存在下に化合物と接触させ、そしてヒ
トＭＣＨ１受容体活性の減少を検出し、それにより化合物がヒトヒトＭＣＨ１受
容体アゴニストであるかを決定することを含み、前記ヒトＭＣＨ１受容体をコー
ドするＤＮＡが図１（配列番号１）に示す、又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−Ｔ
Ｌ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる配列を含むものであり、
前記既知ヒトＭＣＨ１受容体アゴニストがＭＣＨ又はＭＣＨの相同体あるいは類
似体であり、そして前記細胞がトランスフェクション前にはＭＣＨ１受容体を発
現していない、化合物がヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストであるかを決定する
方法を提供する。
【００４９】 本発明は更に、通常はヒトＭＣＨ１受容体を発現しておらず、そしてヒトＭＣ
Ｈ１受容体をコードするＤＮＡが図１（配列番号１）に示す、又はプラスミドｐ
ＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれている配
列を含む、その表面にヒトＭＣＨ１受容体を発現し、ヒトＭＣＨ１受容体の活性
化により第２メッセンジャー反応を生じる細胞を、ヒトＭＣＨ１受容体の活性化
好適条件下に、化合物及びヒトＭＣＨ１受容体を活性化することが既知である第
２化合物の両方と、及び第２化合物とのみ接触させること、そして第２化合物の
み存在する場合と第２化合物と化合物の両方が存在する場合の第２メッセンジャ
ー反応を測定することを含み、第２化合物のみ存在する場合に比べ化合物と第２
化合物の両方が存在する場合の第２メッセンジャー反応の変化が小さいことが化
合物がヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害すること示し、且つ前記の第２化合物
がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体あるいは類似体である、化合物がヒトＭＣＨ１受容
体に特異的に結合し、その活性化を阻害するかどうかを決定するための方法を提
供する。
Ｈ１受容体をコードするＤＮＡが図１（配列番号１）に示す、又はプラスミドｐ
ＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれている配
列を含む、その表面にヒトＭＣＨ１受容体を発現し、ヒトＭＣＨ１受容体の活性
化により第２メッセンジャー反応を生じる細胞を、ヒトＭＣＨ１受容体の活性化
好適条件下に、化合物及びヒトＭＣＨ１受容体を活性化することが既知である第
２化合物の両方と、及び第２化合物とのみ接触させること、そして第２化合物の
み存在する場合と第２化合物と化合物の両方が存在する場合の第２メッセンジャ
ー反応を測定することを含み、第２化合物のみ存在する場合に比べ化合物と第２
化合物の両方が存在する場合の第２メッセンジャー反応の変化が小さいことが化
合物がヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害すること示し、且つ前記の第２化合物
がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体あるいは類似体である、化合物がヒトＭＣＨ１受容
体に特異的に結合し、その活性化を阻害するかどうかを決定するための方法を提
供する。
【００５０】 本発明は更に、以下を含むヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する化合物を同
定することを目的とした、ヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害することについて
未知である複数の化合物をスクリーニングする方法を提供する： （ａ）ヒトＭＣＨ１受容体でトランスフェクションされ、それを発現している
細胞にあって、通常はヒトＭＣＨ１受容体、及び図１（配列番号１）に示す配列
又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）
に含まれる配列を含むヒトＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡを発現していない
細胞に、ヒトＭＣＨ１受容体の活性化が可能な条件下に、ＭＣＨ又はＭＣＨの相
同体又は類似体である既知ヒトＭＣＨ１受容体アゴニスト存在下に複数の化合物
と接触させること； （ｂ）複数の化合物が存在しない状態のヒトＭＣＨ１受容体の活性化に比べ、
複数の化合物が存在する状態でのヒトＭＣＨ１受容体の活性化が低下しているか
決定すること；及びもし低下している場合に （ｃ）複数の化合物の中に含まれる各化合物について、ヒトＭＣＨ１受容体の
活性化の阻害の程度を個別に決定し、それによりヒトＭＣＨ１受容体の活性化を
阻害する化合物を同定すること。
定することを目的とした、ヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害することについて
未知である複数の化合物をスクリーニングする方法を提供する： （ａ）ヒトＭＣＨ１受容体でトランスフェクションされ、それを発現している
細胞にあって、通常はヒトＭＣＨ１受容体、及び図１（配列番号１）に示す配列
又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）
に含まれる配列を含むヒトＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡを発現していない
細胞に、ヒトＭＣＨ１受容体の活性化が可能な条件下に、ＭＣＨ又はＭＣＨの相
同体又は類似体である既知ヒトＭＣＨ１受容体アゴニスト存在下に複数の化合物
と接触させること； （ｂ）複数の化合物が存在しない状態のヒトＭＣＨ１受容体の活性化に比べ、
複数の化合物が存在する状態でのヒトＭＣＨ１受容体の活性化が低下しているか
決定すること；及びもし低下している場合に （ｃ）複数の化合物の中に含まれる各化合物について、ヒトＭＣＨ１受容体の
活性化の阻害の程度を個別に決定し、それによりヒトＭＣＨ１受容体の活性化を
阻害する化合物を同定すること。
【００５１】 本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定し、続いてそ
の化合物またはその構造的及び機能的類似体又は相同体を合成することを含むヒ
トＭＣＨ１受容体へ特異的に結合する組成物の製造方法において、ヒトＭＣＨ１
受容体をその細胞表面に発現している細胞を、両化合物の結合に好適な条件の下
化合物及び受容体への結合が既知である第二化合物の両方、及び別個に第二化合
物のみと接触させること、そしてヒトＭＣＨ１受容体への化合物の特異的結合の
強さを検出することを含み、化合物の存在下におけるヒトＭＣＨ１受容体への第
二化合物の結合の低下は該化合物がヒトＭＣＨ１受容体に結合することを示す競
合結合を含む方法によりヒトＭＣＨ１受容体への結合として前記化合物が同定さ
れ、そして前記細胞が通常ヒトＭＣＨ１受容体を発現しておらず、ヒトＭＣＨ１
受容体が図１に示す配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２
３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる配列を含む核酸によりコード
されており、且つ第２化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体あるいは類似体である
ところの製造方法を提供する。
の化合物またはその構造的及び機能的類似体又は相同体を合成することを含むヒ
トＭＣＨ１受容体へ特異的に結合する組成物の製造方法において、ヒトＭＣＨ１
受容体をその細胞表面に発現している細胞を、両化合物の結合に好適な条件の下
化合物及び受容体への結合が既知である第二化合物の両方、及び別個に第二化合
物のみと接触させること、そしてヒトＭＣＨ１受容体への化合物の特異的結合の
強さを検出することを含み、化合物の存在下におけるヒトＭＣＨ１受容体への第
二化合物の結合の低下は該化合物がヒトＭＣＨ１受容体に結合することを示す競
合結合を含む方法によりヒトＭＣＨ１受容体への結合として前記化合物が同定さ
れ、そして前記細胞が通常ヒトＭＣＨ１受容体を発現しておらず、ヒトＭＣＨ１
受容体が図１に示す配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２
３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる配列を含む核酸によりコード
されており、且つ第２化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体あるいは類似体である
ところの製造方法を提供する。
【００５２】 本発明は更に、ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定し、続い
てその化合物又はその構造的及び機能的類似体又は相同体を合成することを含む
ヒトＭＣＨ１受容体へ特異的に結合する組成物の製造方法において、ヒトＭＣＨ
１受容体をその細胞表面に発現している細胞由来の膜調製体を、両化合物の結合
に好適な条件の下、化合物及び受容体への結合が既知である第二化合物の両方、
及び別個に第二化合物のみと接触させること、及びヒトＭＣＨ１受容体への化合
物の特異的結合の強さを検出することを含み、化合物の存在下におけるヒトＭＣ
Ｈ１受容体への第二化合物の結合の低下は該化合物がヒトＭＣＨ１受容体に結合
することを指示する競合結合を包含する方法によりヒトＭＣＨ１受容体への結合
として前記化合物が同定され、そして前記細胞が通常ヒトＭＣＨ１受容体を発現
しておらず、ヒトＭＣＨ１受容体が図１に示す配列（配列番号１）又はプラスミ
ドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる配
列を含む核酸によりコードされており、且つ第２化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相
同体あるいは類似体であるところの製造方法を提供する。
てその化合物又はその構造的及び機能的類似体又は相同体を合成することを含む
ヒトＭＣＨ１受容体へ特異的に結合する組成物の製造方法において、ヒトＭＣＨ
１受容体をその細胞表面に発現している細胞由来の膜調製体を、両化合物の結合
に好適な条件の下、化合物及び受容体への結合が既知である第二化合物の両方、
及び別個に第二化合物のみと接触させること、及びヒトＭＣＨ１受容体への化合
物の特異的結合の強さを検出することを含み、化合物の存在下におけるヒトＭＣ
Ｈ１受容体への第二化合物の結合の低下は該化合物がヒトＭＣＨ１受容体に結合
することを指示する競合結合を包含する方法によりヒトＭＣＨ１受容体への結合
として前記化合物が同定され、そして前記細胞が通常ヒトＭＣＨ１受容体を発現
しておらず、ヒトＭＣＨ１受容体が図１に示す配列（配列番号１）又はプラスミ
ドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる配
列を含む核酸によりコードされており、且つ第２化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相
同体あるいは類似体であるところの製造方法を提供する。
【００５３】 本発明は更に、ヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストである化合物を同定し、続
いてその化合物またはその構造的及び機能的類似体又は相同体を合成することを
含むヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストである組成物の製造方法において、前記
化合物がヒトＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡによりトランスフェクションさ
れ且つそれを発現している細胞を、化合物の結合に好適な条件の下、既知ヒトＭ
ＣＨ１受容体アゴニスト存在下に化合物と接触させること、そしてヒトＭＣＨ１
受容体活性の低下を検出し、それにより化合物がヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニ
ストであることを決定する方法によりヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストとして
同定され、そして前記細胞が通常ヒトＭＣＨ１受容体を発現しておらず、ヒトＭ
ＣＨ１受容体は図１に示す配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−
ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる配列を含む核酸により
コードされ、且つ第２化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体あるいは類似体である
ところの製造方法を提供する。
いてその化合物またはその構造的及び機能的類似体又は相同体を合成することを
含むヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストである組成物の製造方法において、前記
化合物がヒトＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡによりトランスフェクションさ
れ且つそれを発現している細胞を、化合物の結合に好適な条件の下、既知ヒトＭ
ＣＨ１受容体アゴニスト存在下に化合物と接触させること、そしてヒトＭＣＨ１
受容体活性の低下を検出し、それにより化合物がヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニ
ストであることを決定する方法によりヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストとして
同定され、そして前記細胞が通常ヒトＭＣＨ１受容体を発現しておらず、ヒトＭ
ＣＨ１受容体は図１に示す配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−
ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる配列を含む核酸により
コードされ、且つ第２化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体あるいは類似体である
ところの製造方法を提供する。
【００５４】 本発明は更にまた、ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合し、これを阻害する化
合物を同定し、続いてその化合物またはその構造的及び機能的類似体又は相同体
を合成することを含む、ヒトＭＣＨ１受容体合に特異的に結合し、且つその活性
化を阻害する組成物の製造方法において、通常はヒトＭＣＨ１受容体を発現して
おらず、且つヒトＭＣＨ１受容体が図１に示す（配列番号１）又はプラスミドｐ
ＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる配列を
含む核酸によりコードされている、その細胞表面にヒトＭＣＨ１受容体を発現し
、ヒトＭＣＨ１受容体活性化により第２メッセンジャーを産生する細胞と、ヒト
ＭＣＨ１受容体発現に好適な条件の下、化合物及びＭＣＨ１受容体を活性化する
ことが既知である第２化合物の両方、及び第２化合物のみと別々に接触させこと
、及び第２化合物のみが存在する状態と第２化合物及び化合物の両方が存在する
状態にて第２メッセンジャー反応を測定することを含み、且つ第２化合物のみ存
在する場合に比べ化合物と第２化合物の両方が存在する場合の第２メッセンジャ
ー反応の方が小さいことが、化合物がヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害するこ
とを示し、更に前記第２化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体又は類似体である方
法により、前記化合物がヒトＭＣＨ１受容体に結合し且つその活性化を阻害する
もとして同定される製造方法を提供する。
合物を同定し、続いてその化合物またはその構造的及び機能的類似体又は相同体
を合成することを含む、ヒトＭＣＨ１受容体合に特異的に結合し、且つその活性
化を阻害する組成物の製造方法において、通常はヒトＭＣＨ１受容体を発現して
おらず、且つヒトＭＣＨ１受容体が図１に示す（配列番号１）又はプラスミドｐ
ＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる配列を
含む核酸によりコードされている、その細胞表面にヒトＭＣＨ１受容体を発現し
、ヒトＭＣＨ１受容体活性化により第２メッセンジャーを産生する細胞と、ヒト
ＭＣＨ１受容体発現に好適な条件の下、化合物及びＭＣＨ１受容体を活性化する
ことが既知である第２化合物の両方、及び第２化合物のみと別々に接触させこと
、及び第２化合物のみが存在する状態と第２化合物及び化合物の両方が存在する
状態にて第２メッセンジャー反応を測定することを含み、且つ第２化合物のみ存
在する場合に比べ化合物と第２化合物の両方が存在する場合の第２メッセンジャ
ー反応の方が小さいことが、化合物がヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害するこ
とを示し、更に前記第２化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体又は類似体である方
法により、前記化合物がヒトＭＣＨ１受容体に結合し且つその活性化を阻害する
もとして同定される製造方法を提供する。
【００５５】 本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定すること、続
いてキャリアーと化合物、またはその構造的及び機能的類似体又は相同体とを混
合すること含み、その細胞表面上にヒトＭＣＨ１受容体を発現している細胞と、
両化合物の結合好適条件下にて化合物及び受容体との結合が既知である第２化合
物の両方、及び独立に第２化合物のみと接触せしめること、及びヒトＭＣＨ１受
容体への特異的結合の強さを検出することを含み、化合物存在下でのヒトＭＣＨ
１受容体への第２化合物の結合低下が化合物がヒトＭＣＨ１受容体に結合するこ
とを示す競合結合を包含する方法により、前記化合物がヒトＭＣＨ１受容体に結
合するものとして同定され、更に前記細胞が通常はヒトＭＣＨ１受容体を発現し
ておらず、ヒトＭＣＨ１受容体が図１に示す配列（配列番号１）又はプラスミド
ｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる配列
によってコードされており、且つ第２化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体あるい
は類似体である製造方法を提供する。
いてキャリアーと化合物、またはその構造的及び機能的類似体又は相同体とを混
合すること含み、その細胞表面上にヒトＭＣＨ１受容体を発現している細胞と、
両化合物の結合好適条件下にて化合物及び受容体との結合が既知である第２化合
物の両方、及び独立に第２化合物のみと接触せしめること、及びヒトＭＣＨ１受
容体への特異的結合の強さを検出することを含み、化合物存在下でのヒトＭＣＨ
１受容体への第２化合物の結合低下が化合物がヒトＭＣＨ１受容体に結合するこ
とを示す競合結合を包含する方法により、前記化合物がヒトＭＣＨ１受容体に結
合するものとして同定され、更に前記細胞が通常はヒトＭＣＨ１受容体を発現し
ておらず、ヒトＭＣＨ１受容体が図１に示す配列（配列番号１）又はプラスミド
ｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる配列
によってコードされており、且つ第２化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体あるい
は類似体である製造方法を提供する。
【００５６】 本発明は更に、ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定すること
、続いてキャリアーと化合物、又はその構造的及び機能的類似体又は相同体とを
混合すること含み、その細胞表面上にヒトＭＣＨ１受容体を発現している細胞に
由来する膜調製体と、両化合物の結合にとって好適である条件下にて化合物と受
容体との結合が既知である第２化合物の両方、及び独立に第２化合物のみと接触
せしめること、及びヒトＭＣＨ１受容体への特異的結合の強さを検出することを
含み、化合物の存在下におけるヒトＭＣＨ１受容体への第２化合物の結合低下は
該化合物がヒトＭＣＨ１受容体に結合することを示している競合結合を含む方法
により、前記化合物がヒトＭＣＨ１受容体に結合するものとして同定され、更に
前記細胞が通常はヒトＭＣＨ１受容体を発現しておらず、ヒトＭＣＨ１受容体が
図１に示す配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（Ａ
ＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる配列によってコードされており、且つ
第２化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体あるいは類似体である製造方法を提供す
る。
、続いてキャリアーと化合物、又はその構造的及び機能的類似体又は相同体とを
混合すること含み、その細胞表面上にヒトＭＣＨ１受容体を発現している細胞に
由来する膜調製体と、両化合物の結合にとって好適である条件下にて化合物と受
容体との結合が既知である第２化合物の両方、及び独立に第２化合物のみと接触
せしめること、及びヒトＭＣＨ１受容体への特異的結合の強さを検出することを
含み、化合物の存在下におけるヒトＭＣＨ１受容体への第２化合物の結合低下は
該化合物がヒトＭＣＨ１受容体に結合することを示している競合結合を含む方法
により、前記化合物がヒトＭＣＨ１受容体に結合するものとして同定され、更に
前記細胞が通常はヒトＭＣＨ１受容体を発現しておらず、ヒトＭＣＨ１受容体が
図１に示す配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（Ａ
ＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる配列によってコードされており、且つ
第２化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体あるいは類似体である製造方法を提供す
る。
【００５７】 本発明は又、ヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストである化合物を同定し、次に
キャリアーと化合物、又はそのその構造的及び機能的類似体又は相同体とを混合
すること含み、既知ヒトＭＣＨ１受容体をコードしているＤＮＡによりトランス
フェクションされ且つそのＤＮＡを発現している細胞に、ヒトＭＣＨ１受容体の
活性化を可能にする条件の下化合物を接触せしめ、そして既知ヒトＭＣＨ１受容
体活性の減少を検出し、それにより化合物がヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニスト
であることを決定することを含む、前記細胞が通常はヒトＭＣＨ１受容体を発現
しておらず、またヒトＭＣＨ１受容体が図１に示す配列（配列番号１）又はプラ
スミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれ
る配列によってコードされており、且つ既知ヒト受容体アゴニストがＭＣＨ又は
ＭＣＨの相同体あるいは類似体である方法により前記化合物がヒトＭＣＨ１受容
体アンアゴニストとして同定される、組成物を調製する方法も提供する。
キャリアーと化合物、又はそのその構造的及び機能的類似体又は相同体とを混合
すること含み、既知ヒトＭＣＨ１受容体をコードしているＤＮＡによりトランス
フェクションされ且つそのＤＮＡを発現している細胞に、ヒトＭＣＨ１受容体の
活性化を可能にする条件の下化合物を接触せしめ、そして既知ヒトＭＣＨ１受容
体活性の減少を検出し、それにより化合物がヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニスト
であることを決定することを含む、前記細胞が通常はヒトＭＣＨ１受容体を発現
しておらず、またヒトＭＣＨ１受容体が図１に示す配列（配列番号１）又はプラ
スミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれ
る配列によってコードされており、且つ既知ヒト受容体アゴニストがＭＣＨ又は
ＭＣＨの相同体あるいは類似体である方法により前記化合物がヒトＭＣＨ１受容
体アンアゴニストとして同定される、組成物を調製する方法も提供する。
【００５８】 本発明は更に、ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合し、その活性化を阻害する
化合物を同定し、次にキャリアーと化合物、又はそのその構造的及び機能的類似
体又は相同体とを混合すること含み、その細胞表面上にヒトＭＣＨ１受容体を発
現し、ヒトＭＣＨ１受容体の活性化により第２メッセンジャー反応が生じ、且つ
通常はヒトＭＣＨ１受容体を発現しておらず、ヒトＭＣＨ１受容体が図１に示す
配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付
番号２０３１９７）に含まれる配列によってコードされている細胞に、ヒトＭＣ
Ｈ１受容体の活性化に好適な条件の下、化合物及びヒトＭＣＨ１受容体を活性化
することが既知である第２化合物の両方、及び第２化合物のみと作用せしめ、そ
して第２化合物のみ存在する場合及び第２化合物と化合物の両方が存在する場合
の第２メッセンジャー反応を測定することを含み、第２化合物のみ存在する場合
に比べ化合物及び第２化合物が共に存在する場合の変化がより小さいことが、化
合物がヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害することを示しており、前記第２化合
物がＭＣＨまたはＭＣＨの相同体あるいは類似体である、組成物を調製する方法
も提供する。
化合物を同定し、次にキャリアーと化合物、又はそのその構造的及び機能的類似
体又は相同体とを混合すること含み、その細胞表面上にヒトＭＣＨ１受容体を発
現し、ヒトＭＣＨ１受容体の活性化により第２メッセンジャー反応が生じ、且つ
通常はヒトＭＣＨ１受容体を発現しておらず、ヒトＭＣＨ１受容体が図１に示す
配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付
番号２０３１９７）に含まれる配列によってコードされている細胞に、ヒトＭＣ
Ｈ１受容体の活性化に好適な条件の下、化合物及びヒトＭＣＨ１受容体を活性化
することが既知である第２化合物の両方、及び第２化合物のみと作用せしめ、そ
して第２化合物のみ存在する場合及び第２化合物と化合物の両方が存在する場合
の第２メッセンジャー反応を測定することを含み、第２化合物のみ存在する場合
に比べ化合物及び第２化合物が共に存在する場合の変化がより小さいことが、化
合物がヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害することを示しており、前記第２化合
物がＭＣＨまたはＭＣＨの相同体あるいは類似体である、組成物を調製する方法
も提供する。
【００５９】
本明細書を通じ、特定ヌクレオチド塩基を表すために以下の標準的略語を用い
る： Ａ＝アデニン Ｇ＝グアニン Ｃ＝シトシン Ｔ＝チミン Ｕ＝ウラシル Ｍ＝アデニン又はシトシン Ｒ＝アデニン又はグアニン Ｗ＝アデニン、チミン、又はウラシル Ｓ＝シトシン又はグアニン Ｙ＝シトシン、チミン又はウラシル Ｋ＝グアニン、チミン又はウラシル Ｖ＝アデニン、シトシン、又はグアニン（チミン又はウラシルではない） Ｈ＝アデニン、シトシン、チミン又はウラシル（グアニンではない） Ｄ＝アデニン、グアニン、チミン又はウラシル（シトシンではない） Ｂ＝シトシン、グアニン、チミン又はウラシル（アデニンではない） Ｎ＝アデニン、シトシン、グアニン、チミン又はウラシル（又はイノシンの様な
その他修飾型塩基） Ｉ＝イノシン 更に、用語「アゴニスト」は本明細書を通じ、本発明ポリペプチドの何れかの
活性を増加させる何れかのペプチド又は非ペプチジル化合物を示すのに使用され
る。用語「アンタゴニスト」は、本明細書を通じ本発明ポリペプチドの何れかの
活性を低下させる何れかのペプチド又は非ペプチジル化合物を示すのに使用され
る。用語「哺乳動物」は本明細書を通じ、ヒトＭＣＨ１受容体の突然変異体型を
含むのに使用される。
る： Ａ＝アデニン Ｇ＝グアニン Ｃ＝シトシン Ｔ＝チミン Ｕ＝ウラシル Ｍ＝アデニン又はシトシン Ｒ＝アデニン又はグアニン Ｗ＝アデニン、チミン、又はウラシル Ｓ＝シトシン又はグアニン Ｙ＝シトシン、チミン又はウラシル Ｋ＝グアニン、チミン又はウラシル Ｖ＝アデニン、シトシン、又はグアニン（チミン又はウラシルではない） Ｈ＝アデニン、シトシン、チミン又はウラシル（グアニンではない） Ｄ＝アデニン、グアニン、チミン又はウラシル（シトシンではない） Ｂ＝シトシン、グアニン、チミン又はウラシル（アデニンではない） Ｎ＝アデニン、シトシン、グアニン、チミン又はウラシル（又はイノシンの様な
その他修飾型塩基） Ｉ＝イノシン 更に、用語「アゴニスト」は本明細書を通じ、本発明ポリペプチドの何れかの
活性を増加させる何れかのペプチド又は非ペプチジル化合物を示すのに使用され
る。用語「アンタゴニスト」は、本明細書を通じ本発明ポリペプチドの何れかの
活性を低下させる何れかのペプチド又は非ペプチジル化合物を示すのに使用され
る。用語「哺乳動物」は本明細書を通じ、ヒトＭＣＨ１受容体の突然変異体型を
含むのに使用される。
【００６０】 ここに開示されたポリペプチドの様なＧタンパク質共役受容体の活性は、問題
の受容体の活性化がアデニレートシクラーゼ、カルシウム代謝、アラキドン酸放
出、イオンチャンネル活性、イノシトールリン脂質加水分解又はグアニリルシク
ラーゼを含むが、これに限定されない第２メッセンジャーシステムのレベルに観
察可能な変化をもたらす各種機能的アッセイの何れかを利用し、測定されるであ
ろう。所望する第２メッセンジャー共役を得るには、本発明の核酸を発現する適
当な宿主細胞を利用した異種発現システムが利用されるであろう。受容体活性は
また卵細胞発現システムでアッセイされてよい。
の受容体の活性化がアデニレートシクラーゼ、カルシウム代謝、アラキドン酸放
出、イオンチャンネル活性、イノシトールリン脂質加水分解又はグアニリルシク
ラーゼを含むが、これに限定されない第２メッセンジャーシステムのレベルに観
察可能な変化をもたらす各種機能的アッセイの何れかを利用し、測定されるであ
ろう。所望する第２メッセンジャー共役を得るには、本発明の核酸を発現する適
当な宿主細胞を利用した異種発現システムが利用されるであろう。受容体活性は
また卵細胞発現システムでアッセイされてよい。
【００６１】 ヒトＭＣＨ１受容体遺伝子はイントロンを含むことができ、更にコーディング
又は非コーディング域に追加のイントロンが存在できる可能性もある。更にｍＲ
ＮＡのスプライス型が、現行規定されている開始メチオニンの上流、又はコーデ
ィング域内に追加のアミノ酸をコードすることもある。更に、別のエクソンの存
在及び利用も可能であり、そうすることでｍＲＮＡはエクソンを含む領域内に別
のアミノ酸配列を含むことができるであろう。更に、発現されたタンパク質のア
ミノ酸配列が元の遺伝子によりコードされたアミノ酸配列以外のものである様な
、１アミノ酸置換がＲＮＡ編集のメカニズムを介し起こることもあるであろう（
Ｂｕｒｎｓら、１９９６；Ｃｈｕら、１９９６）。この様な変異体は元の遺伝子
によりコードされたポリペプチドとは異なる薬理特性を示すであろう。
又は非コーディング域に追加のイントロンが存在できる可能性もある。更にｍＲ
ＮＡのスプライス型が、現行規定されている開始メチオニンの上流、又はコーデ
ィング域内に追加のアミノ酸をコードすることもある。更に、別のエクソンの存
在及び利用も可能であり、そうすることでｍＲＮＡはエクソンを含む領域内に別
のアミノ酸配列を含むことができるであろう。更に、発現されたタンパク質のア
ミノ酸配列が元の遺伝子によりコードされたアミノ酸配列以外のものである様な
、１アミノ酸置換がＲＮＡ編集のメカニズムを介し起こることもあるであろう（
Ｂｕｒｎｓら、１９９６；Ｃｈｕら、１９９６）。この様な変異体は元の遺伝子
によりコードされたポリペプチドとは異なる薬理特性を示すであろう。
【００６２】 本発明はここに開示されたヒトＭＣＨ１受容体のスプライス変異体を提供する
。本発明は更に別の翻訳開始部位を、あるいは本発明のヒトＭＣＨ１受容体をコ
ードする核酸のスプライス、又は編集変異体を提供する。
。本発明は更に別の翻訳開始部位を、あるいは本発明のヒトＭＣＨ１受容体をコ
ードする核酸のスプライス、又は編集変異体を提供する。
【００６３】 本発明の核酸は更に、ヒトＭＣＨ１受容体遺伝子が図１に示される又はプラス
ミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる
核酸配列を含んでいる、ヒトＭＣＨ１受容体遺伝子の核酸類似体も包含している
。ヒトＭＣＨ１受容体の核酸類似体は、ここに記載されるヒトＭＣＨ１受容体遺
伝子とは、１またはそれ以上の核酸塩基の同一性又は位置に関し異なっており（
図１に示す又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１に含まれる核酸塩基の全
てより少ないものを含む欠失類似体、図１に示す又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ
−ＴＬ２３１に含まれる１またはそれ以上の核酸塩基が他の核酸塩基で置き換え
られた置換類似体、及び核酸配列の端部又は中央部に１又はそれ以上の核酸塩基
が付加されている付加類似体）、そして図１に示す又はプラスミドｐＥＸＪ．Ｈ
Ｒ−ＴＬ２３１に含まれる核酸によりコードされたタンパク質の特性の一部又は
全てを共有しているタンパク質をコードしている。本発明の実施態様の１つでは
、核酸類似体は図２に示す、又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１に含ま
れる核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしてい
る。別の実施態様では、核酸類似体は図２に示す、又はプラスミドｐＥＸＪ．Ｈ
Ｒ−ＴＬ２３１に含まれる核酸によりコードされるアミノ酸配列とは異なるアミ
ノ酸配列を含むタンパク質をコードする。更に別の実施態様では、核酸類似体に
よりコードされたタンパク質は、図２に示すアミノ酸配列を含む受容体タンパク
質の機能に同一である機能を有する。別の実施態様では、核酸類似体によりコー
ドされるタンパク質の機能は、図２に示すアミノ酸配列を含む受容体タンパク質
の機能とは異なる。別の実施態様では、核酸配列中の変異はタンパク質の膜貫通
（ＴＭ）域内に起こる。別の実施態様では、核酸配列内の変異はＴＭ域外で起こ
る。
ミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる
核酸配列を含んでいる、ヒトＭＣＨ１受容体遺伝子の核酸類似体も包含している
。ヒトＭＣＨ１受容体の核酸類似体は、ここに記載されるヒトＭＣＨ１受容体遺
伝子とは、１またはそれ以上の核酸塩基の同一性又は位置に関し異なっており（
図１に示す又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１に含まれる核酸塩基の全
てより少ないものを含む欠失類似体、図１に示す又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ
−ＴＬ２３１に含まれる１またはそれ以上の核酸塩基が他の核酸塩基で置き換え
られた置換類似体、及び核酸配列の端部又は中央部に１又はそれ以上の核酸塩基
が付加されている付加類似体）、そして図１に示す又はプラスミドｐＥＸＪ．Ｈ
Ｒ−ＴＬ２３１に含まれる核酸によりコードされたタンパク質の特性の一部又は
全てを共有しているタンパク質をコードしている。本発明の実施態様の１つでは
、核酸類似体は図２に示す、又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１に含ま
れる核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしてい
る。別の実施態様では、核酸類似体は図２に示す、又はプラスミドｐＥＸＪ．Ｈ
Ｒ−ＴＬ２３１に含まれる核酸によりコードされるアミノ酸配列とは異なるアミ
ノ酸配列を含むタンパク質をコードする。更に別の実施態様では、核酸類似体に
よりコードされたタンパク質は、図２に示すアミノ酸配列を含む受容体タンパク
質の機能に同一である機能を有する。別の実施態様では、核酸類似体によりコー
ドされるタンパク質の機能は、図２に示すアミノ酸配列を含む受容体タンパク質
の機能とは異なる。別の実施態様では、核酸配列中の変異はタンパク質の膜貫通
（ＴＭ）域内に起こる。別の実施態様では、核酸配列内の変異はＴＭ域外で起こ
る。
【００６４】 本発明は、核酸がＤＮＡである上記の単離された核酸を提供する。ある実施態
様では、ＤＮＡはｃＤＮＡである。別の実施態様ではＤＮＡはゲノミックＤＮＡ
である。更に別の実施態様では、核酸はＲＮＡである。核酸分子を産生し、操作
する方法は当分野で良く知られている。
様では、ＤＮＡはｃＤＮＡである。別の実施態様ではＤＮＡはゲノミックＤＮＡ
である。更に別の実施態様では、核酸はＲＮＡである。核酸分子を産生し、操作
する方法は当分野で良く知られている。
【００６５】 本発明は更に、ここに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡに関し縮重して
いる核酸を提供する。ある実施態様では、核酸は図１に示したヌクレオチド配列
（配列番号２）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１に含まれるヌクレオ
チド配列に関し縮重されたヌクレオチド配列、即ち同一アミノ酸配列に翻訳され
るヌクレオチド配列を含む。
いる核酸を提供する。ある実施態様では、核酸は図１に示したヌクレオチド配列
（配列番号２）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１に含まれるヌクレオ
チド配列に関し縮重されたヌクレオチド配列、即ち同一アミノ酸配列に翻訳され
るヌクレオチド配列を含む。
【００６６】 本発明は更に、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列とはことなるが、表現形
上の変化を生じないアミノ酸配列をコードするＤＮＡ及びｃＤＮＡも包含する。
あるいは、本発明は更に本発明のＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡとハイブリダイズ
するＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡも包含する。ハイブリダイゼーション法は当業
者公知である。
上の変化を生じないアミノ酸配列をコードするＤＮＡ及びｃＤＮＡも包含する。
あるいは、本発明は更に本発明のＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡとハイブリダイズ
するＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡも包含する。ハイブリダイゼーション法は当業
者公知である。
【００６７】 本発明の核酸は更に、１またはそれ以上のアミノ酸残基の同一性又は位置に関
し天然型と異なっている抗原性ポリペプチド（タンパク質に特異的である全残基
より少ないものを含む欠失類似体、特異残基の１またはそれ以上が他の残基で置
き換えられている置換類似体、及びポリペプチドの端部又は中央部に１又はそれ
以上のアミノ酸残基が付加されている付加類似体）であり、天然型の一部又は全
ての特性を共有しているポリペプチド類似体、断片または誘導体も含む。これら
分子は：選択された非哺乳動物宿主による発現に「好適」なコドンの取り込み；
制限エンドヌクレアーゼ酵素による切断に適した部位；及び易発現ベクターの構
築を促すための追加の開始、終止又は中間配列を含む。ポリペプチド類似体の作
製は当業者公知である（Ｒ．Ｆ．Ｓｐｕｒｎｅｙら、（１９９７）；Ｆｏｎｇ、
Ｔ．Ｍ．ら、（１９９５）；Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ，Ｄ．Ｊ．ら、（１９９４）；
Ｇｒａｚｉａｎｏ、Ｍ．Ｆ．ら（１９９６）；Ｇｕａｎ Ｘ．Ｍ．ら、（１９９
５））。
し天然型と異なっている抗原性ポリペプチド（タンパク質に特異的である全残基
より少ないものを含む欠失類似体、特異残基の１またはそれ以上が他の残基で置
き換えられている置換類似体、及びポリペプチドの端部又は中央部に１又はそれ
以上のアミノ酸残基が付加されている付加類似体）であり、天然型の一部又は全
ての特性を共有しているポリペプチド類似体、断片または誘導体も含む。これら
分子は：選択された非哺乳動物宿主による発現に「好適」なコドンの取り込み；
制限エンドヌクレアーゼ酵素による切断に適した部位；及び易発現ベクターの構
築を促すための追加の開始、終止又は中間配列を含む。ポリペプチド類似体の作
製は当業者公知である（Ｒ．Ｆ．Ｓｐｕｒｎｅｙら、（１９９７）；Ｆｏｎｇ、
Ｔ．Ｍ．ら、（１９９５）；Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ，Ｄ．Ｊ．ら、（１９９４）；
Ｇｒａｚｉａｎｏ、Ｍ．Ｆ．ら（１９９６）；Ｇｕａｎ Ｘ．Ｍ．ら、（１９９
５））。
【００６８】 本発明の修飾型ポリペプチドは、例えばここに開示されているような当分野公
知の技術を利用し、一過性または安定に細胞内にトランスフェクションされるで
あろう。本発明は更にポリペプチドが一過性に又は安定した細胞株内に発現され
ている修飾型ポリペプチドを利用した結合アッセイも提供する。本発明は更にこ
きに記載の結合アッセイの様な結合アッセイでの修飾型ポリペプチドの利用によ
り特定された化合物を提供する。
知の技術を利用し、一過性または安定に細胞内にトランスフェクションされるで
あろう。本発明は更にポリペプチドが一過性に又は安定した細胞株内に発現され
ている修飾型ポリペプチドを利用した結合アッセイも提供する。本発明は更にこ
きに記載の結合アッセイの様な結合アッセイでの修飾型ポリペプチドの利用によ
り特定された化合物を提供する。
【００６９】 ここに記載され、クレーム記載されている核酸は、それらが提供するポリペプ
チドのアミノ酸配列に関する情報、そして各種組換え体技術によるポリペプチド
の大スケール合成の産物に関する情報にとって有用である。核酸分子は新しいク
ローニング及び発現ベクター、形質転換及びトランスフェクトされた前核及び真
核宿主細胞、及びポリペプチドと関連産物を発現することができる宿主細胞の培
養増殖に適した新規の有用な方法の作製に有用である。
チドのアミノ酸配列に関する情報、そして各種組換え体技術によるポリペプチド
の大スケール合成の産物に関する情報にとって有用である。核酸分子は新しいク
ローニング及び発現ベクター、形質転換及びトランスフェクトされた前核及び真
核宿主細胞、及びポリペプチドと関連産物を発現することができる宿主細胞の培
養増殖に適した新規の有用な方法の作製に有用である。
【００７０】 本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体またはＭＣＨあるいはその類似体又は相同体に
より活性化されるヒトＭＣＨ１受容体の変異体をコードする単離された核酸を提
供する。別の実施態様では、ＤＮＡはｃＤＮＡである。別の実施態様では、ＤＮ
ＡはゲノミックＤＮＡである。別の実施態様では、核酸はＲＮＡである。
より活性化されるヒトＭＣＨ１受容体の変異体をコードする単離された核酸を提
供する。別の実施態様では、ＤＮＡはｃＤＮＡである。別の実施態様では、ＤＮ
ＡはゲノミックＤＮＡである。別の実施態様では、核酸はＲＮＡである。
【００７１】 本発明は図１に示す核酸配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−
ＴＬ２３１にコードされている核酸配列によりコードされたＭＣＨ１受容体の種
相同体をコードする単離された核酸を利用する方法も提供する。実施態様の一つ
では、核酸は実質的にプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１によりコードされ
ているＭＣＨ１受容体と同一のアミノ酸配列を有する哺乳動物ＭＣＨ１受容体相
同体をコードしている。別の実施態様では、核酸はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−
ＴＬ２３１によりコードされるＭＣＨ１受容体に対し６５％を越える；好ましく
はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１によりコードされるＭＣＨ１受容体に
対し７５％を越える；より好ましくはプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１に
よりコードされるＭＣＨ１受容体に対し８５％を越える；最も好ましくはプラス
ミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１によりコードされるＭＣＨ１受容体に対し９５
％を越える同一性を有する哺乳動物ＭＣＨ１受容体相同体をコードしている。別
の実施態様では、哺乳動物ＭＣＨ１受容体相同体はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−
ＴＬ２３１に含まれるＭＣＨ１受容体遺伝子に対し７０％を越える、好ましくは
プラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１に含まれるＭＣＨ１受容体遺伝子に対し
８０％を越える、より好ましくはプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１に含ま
れるＭＣＨ１受容体遺伝子に対し９０％を越える核酸同一性を有する。種相同体
を分離し、精製する方法の例は他所に記載されている（例えば、米国特許第５，
６０２，０２４号、ＷＯ９４／１４９５７、ＷＯ９７／２６８５３、ＷＯ９８／
２５５７０）。
ＴＬ２３１にコードされている核酸配列によりコードされたＭＣＨ１受容体の種
相同体をコードする単離された核酸を利用する方法も提供する。実施態様の一つ
では、核酸は実質的にプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１によりコードされ
ているＭＣＨ１受容体と同一のアミノ酸配列を有する哺乳動物ＭＣＨ１受容体相
同体をコードしている。別の実施態様では、核酸はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−
ＴＬ２３１によりコードされるＭＣＨ１受容体に対し６５％を越える；好ましく
はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１によりコードされるＭＣＨ１受容体に
対し７５％を越える；より好ましくはプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１に
よりコードされるＭＣＨ１受容体に対し８５％を越える；最も好ましくはプラス
ミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１によりコードされるＭＣＨ１受容体に対し９５
％を越える同一性を有する哺乳動物ＭＣＨ１受容体相同体をコードしている。別
の実施態様では、哺乳動物ＭＣＨ１受容体相同体はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−
ＴＬ２３１に含まれるＭＣＨ１受容体遺伝子に対し７０％を越える、好ましくは
プラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１に含まれるＭＣＨ１受容体遺伝子に対し
８０％を越える、より好ましくはプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１に含ま
れるＭＣＨ１受容体遺伝子に対し９０％を越える核酸同一性を有する。種相同体
を分離し、精製する方法の例は他所に記載されている（例えば、米国特許第５，
６０２，０２４号、ＷＯ９４／１４９５７、ＷＯ９７／２６８５３、ＷＯ９８／
２５５７０）。
【００７２】 本発明の別の実施態様では、核酸はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１に
よりコードされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するＭＣＨ１受容体を
コードする。別の実施態様では、ＭＣＨ１受容体は図２（配列番号２）に示すア
ミノ酸配列と実質同一である配列を含む。別の実施態様では、ＭＣＨ１受容体は
図２に示すアミノ酸配列（配列番号２）を含む。
よりコードされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するＭＣＨ１受容体を
コードする。別の実施態様では、ＭＣＨ１受容体は図２（配列番号２）に示すア
ミノ酸配列と実質同一である配列を含む。別の実施態様では、ＭＣＨ１受容体は
図２に示すアミノ酸配列（配列番号２）を含む。
【００７３】 ある実施態様では、変異体ヒトＭＣＨ１受容体は、図１３に示すアミノ酸配列
（配列番号２７）を含む。別の実施態様では、変異体ヒトＭＣＨ１受容体は、図
１４に示すアミノ酸配列（配列番号２８）を含む。更に別の実施態様では、変異
体ヒトＭＣＨ１受容体は、図１５に示すアミノ酸配列（配列番号２９）を含む。
（配列番号２７）を含む。別の実施態様では、変異体ヒトＭＣＨ１受容体は、図
１４に示すアミノ酸配列（配列番号２８）を含む。更に別の実施態様では、変異
体ヒトＭＣＨ１受容体は、図１５に示すアミノ酸配列（配列番号２９）を含む。
【００７４】 別の実施態様では、ヒトＭＣＨ１受容体は３ある開始（ＡＴＧ）コドンの何れ
かより始まる図１に示す核酸配列によりコードされる。
かより始まる図１に示す核酸配列によりコードされる。
【００７５】 本発明は、３カ所の細胞内ドメイン中に欠失、置換又は付加を持つことにより
ヒトＭＣＨ１受容体とは異なっている修飾型ヒトＭＣＨ１受容体をコードする単
離された核酸を提供する。
ヒトＭＣＨ１受容体とは異なっている修飾型ヒトＭＣＨ１受容体をコードする単
離された核酸を提供する。
【００７６】 本発明は、（ａ）低厳密条件下に図１に示す規定配列を持つ核酸またはそれに
相補的な配列とハイブリダズし、そして（ｂ）ＭＣＨ１リガンドがＣＨＯ細胞の
培養体に加えられ、且つそのＣＨＯ細胞が規定配列またはその相補体を有する核
酸にハイブリダズする核酸を含む時、ＣＨＯ細胞培養体のｐＨに変化をもたらす
ことができる能力により更に特徴付けられる、ヒトＭＣＨ１受容体をコードする
核酸を提供する。低厳密性ハイブリダイゼーションは２５％フォルムアミド、５
Ｘ ＳＳＣ、７ｍＭ Ｔｒｉｓ、１× Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、２５μｌ／ｍｌ
サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション緩衝液中にて実施される。０．１
× ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中、４０℃にて洗浄する。ｐＨの変化は、受容体
伝達細胞外酸性化速度の微小生理学的計測法を利用し測定される。細胞代謝は実
質的に広範囲の細胞事象に関係することから（他メッセンジャー経路の受容体活
性化を含む）、細胞代謝への微量物理学的計測法の利用は原則的には受容体シグ
ナル伝達経路の特異性に関係なく、いずれかの受容体の活性化に生起する細胞活
動の一般的アッセイを提供する。一過的な受容体発現に関する一般的指針は他所
に記載されている（Ｓａｌｏｎ、Ｊ．Ａ．及びＯｗｉｃｋｉ、Ｊ．Ａ．，１９９
６）。受容体及び／又はコントロールベクターは、製造元（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡ
ＭＩＮＥ、ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）推奨法に従っ
たリポソーム伝達トランスフェクションによりＣＨＯ−Ｋ１細胞内に一過性に発
現され、ＨａｍのＦ−１２完全培地中（１０％血清）に維持された。合計１０μ
ｇのＤＮＡを用い、トランスフェクション２４時間前に分割され、トランスフェ
クション時に７０−８０％の集密度に達していた各７５ｃｍ３のフラスコをトラ
ンスフェクションした。トランスフェクション２４時間後、細胞を集め微量物理
計測計カプセル内に３×１０５細胞を播いた。細胞を２４時間カプセル膜に接着
させ；最後１６時間の間細胞を無血清Ｆ−１２完全培地に移し、血清因子の組合
せに起因する不明確な代謝刺激を最小にした。実験当日、細胞カプセルを微量物
理計測計に移し、記録媒体中で平衡化させ（０．１％無血清ＢＳＡを含む低緩衝
液ＲＰＭＩ１６４０、重炭酸無し、血清無し（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃ
ｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｕｎｎｙｂａｌｅ、ＣＡ））、その間に基礎
代謝活性のベースライン測定を行った。標準的記録プロトコールでは流速１００
μｌ／分であり、全ポンプ時間は酸性化速度を測定する間の３０秒間の流れ中断
を含み２分である。リガンド処理では、処理後最初の速度測定直前に１分２０秒
間の処理が行われ、続いて合計５分２０秒間のサンプル処理に関し更に２回ポン
プサイクルが行われた。典型的には、一次スクリーニング中の薬物は細胞に対し
１０μＭの最終濃度で提供された。次にリガンドサンプルは洗浄され、酸性化速
度は、処理直前に観察されたベースライン率に対するピーク反応の％増加として
表される。ＭＣＨリガンドの例には、内因性ＭＣＨペプチドが含まれるが、もと
よりこれに限定されない。
相補的な配列とハイブリダズし、そして（ｂ）ＭＣＨ１リガンドがＣＨＯ細胞の
培養体に加えられ、且つそのＣＨＯ細胞が規定配列またはその相補体を有する核
酸にハイブリダズする核酸を含む時、ＣＨＯ細胞培養体のｐＨに変化をもたらす
ことができる能力により更に特徴付けられる、ヒトＭＣＨ１受容体をコードする
核酸を提供する。低厳密性ハイブリダイゼーションは２５％フォルムアミド、５
Ｘ ＳＳＣ、７ｍＭ Ｔｒｉｓ、１× Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、２５μｌ／ｍｌ
サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション緩衝液中にて実施される。０．１
× ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中、４０℃にて洗浄する。ｐＨの変化は、受容体
伝達細胞外酸性化速度の微小生理学的計測法を利用し測定される。細胞代謝は実
質的に広範囲の細胞事象に関係することから（他メッセンジャー経路の受容体活
性化を含む）、細胞代謝への微量物理学的計測法の利用は原則的には受容体シグ
ナル伝達経路の特異性に関係なく、いずれかの受容体の活性化に生起する細胞活
動の一般的アッセイを提供する。一過的な受容体発現に関する一般的指針は他所
に記載されている（Ｓａｌｏｎ、Ｊ．Ａ．及びＯｗｉｃｋｉ、Ｊ．Ａ．，１９９
６）。受容体及び／又はコントロールベクターは、製造元（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡ
ＭＩＮＥ、ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）推奨法に従っ
たリポソーム伝達トランスフェクションによりＣＨＯ−Ｋ１細胞内に一過性に発
現され、ＨａｍのＦ−１２完全培地中（１０％血清）に維持された。合計１０μ
ｇのＤＮＡを用い、トランスフェクション２４時間前に分割され、トランスフェ
クション時に７０−８０％の集密度に達していた各７５ｃｍ３のフラスコをトラ
ンスフェクションした。トランスフェクション２４時間後、細胞を集め微量物理
計測計カプセル内に３×１０５細胞を播いた。細胞を２４時間カプセル膜に接着
させ；最後１６時間の間細胞を無血清Ｆ−１２完全培地に移し、血清因子の組合
せに起因する不明確な代謝刺激を最小にした。実験当日、細胞カプセルを微量物
理計測計に移し、記録媒体中で平衡化させ（０．１％無血清ＢＳＡを含む低緩衝
液ＲＰＭＩ１６４０、重炭酸無し、血清無し（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃ
ｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｕｎｎｙｂａｌｅ、ＣＡ））、その間に基礎
代謝活性のベースライン測定を行った。標準的記録プロトコールでは流速１００
μｌ／分であり、全ポンプ時間は酸性化速度を測定する間の３０秒間の流れ中断
を含み２分である。リガンド処理では、処理後最初の速度測定直前に１分２０秒
間の処理が行われ、続いて合計５分２０秒間のサンプル処理に関し更に２回ポン
プサイクルが行われた。典型的には、一次スクリーニング中の薬物は細胞に対し
１０μＭの最終濃度で提供された。次にリガンドサンプルは洗浄され、酸性化速
度は、処理直前に観察されたベースライン率に対するピーク反応の％増加として
表される。ＭＣＨリガンドの例には、内因性ＭＣＨペプチドが含まれるが、もと
よりこれに限定されない。
【００７７】 本発明は、精製されたヒトＭＣＨ１受容体タンパク質を提供する。
【００７８】 本発明はヒトＭＣＨ１受容体をコードする核酸を含むベクターを提供する。実
施態様では、ベクターはヒトＭＣＨ１受容体をコードする核酸と作動可能に結合
し、その発現を可能にする細胞内核酸の発現に必要な制御要素を含む細胞内での
発現に適合している。別の実施態様では、細胞は細菌細胞、両生類細胞、酵母細
胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞である。別の実施態様では、ベクターはバキュロ
ウイルスである。実施態様の一つでは、ベクターはプラスミドである。
施態様では、ベクターはヒトＭＣＨ１受容体をコードする核酸と作動可能に結合
し、その発現を可能にする細胞内核酸の発現に必要な制御要素を含む細胞内での
発現に適合している。別の実施態様では、細胞は細菌細胞、両生類細胞、酵母細
胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞である。別の実施態様では、ベクターはバキュロ
ウイルスである。実施態様の一つでは、ベクターはプラスミドである。
【００７９】 本発明はｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）と命
名されたプラスミドを提供する。本プラスミドはヒトＭＣＨ１受容体をコードす
るＤＮＡを発現可能にするために、それに作動可能に結合している、哺乳動物細
胞内のＤＮＡの発現に必要な制御要素を含む。
名されたプラスミドを提供する。本プラスミドはヒトＭＣＨ１受容体をコードす
るＤＮＡを発現可能にするために、それに作動可能に結合している、哺乳動物細
胞内のＤＮＡの発現に必要な制御要素を含む。
【００８０】 本プラスミドは、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペス
ト条約に則り１９９８年、９月１７日に米国標準株コレクション（Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、１２
３０１パークローンドライブ、ロックビル、メリーランド（Ｐａｒｋｌａｗｎ
Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）２０８５２、米国に寄託
され、ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７が付与された。
ト条約に則り１９９８年、９月１７日に米国標準株コレクション（Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、１２
３０１パークローンドライブ、ロックビル、メリーランド（Ｐａｒｋｌａｗｎ
Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）２０８５２、米国に寄託
され、ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７が付与された。
【００８１】 本発明は更に、所望宿主細胞内での発現、又は結合あるいは機能アッセイでの
利用に有益である修飾型非翻訳配列を含む何れかのベクター又はプラスミドを提
供する。例えば、各種長さの非翻訳配列を持つベクター又はプラスミドは、使用
する宿主細胞に依存し異なる量のポリペプチドを発現するであろう。ある実施態
様では、ベクター又はプラスミドはポリペプチドのコーディング配列及び宿主細
胞での発現に必要な制御要素を含む。
利用に有益である修飾型非翻訳配列を含む何れかのベクター又はプラスミドを提
供する。例えば、各種長さの非翻訳配列を持つベクター又はプラスミドは、使用
する宿主細胞に依存し異なる量のポリペプチドを発現するであろう。ある実施態
様では、ベクター又はプラスミドはポリペプチドのコーディング配列及び宿主細
胞での発現に必要な制御要素を含む。
【００８２】 本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体をコードしている核酸を含むベクターを具備す
る細胞を提供する。
る細胞を提供する。
【００８３】 実施態様の一つでは、細胞は非哺乳動物細胞である。別の実施態様では非哺乳
動物細胞はアフリカツメガエルの卵細胞、またはアフリカツメガエルのメラノ細
胞である。別の実施態様では、細胞は哺乳動物細胞である。別の実施態様では哺
乳動物細胞はＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胎児腎臓細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、
ＬＭ（ｔｋ−）細胞、マウスＹ１細胞、又はＣＨＯ細胞である。
動物細胞はアフリカツメガエルの卵細胞、またはアフリカツメガエルのメラノ細
胞である。別の実施態様では、細胞は哺乳動物細胞である。別の実施態様では哺
乳動物細胞はＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胎児腎臓細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、
ＬＭ（ｔｋ−）細胞、マウスＹ１細胞、又はＣＨＯ細胞である。
【００８４】 本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体をコードしている核酸を含む昆虫細胞での発現
に適合したベクターを具備する昆虫細胞を提供する。別の実施態様では、昆虫細
胞はＳｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞又はＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ ５Ｂ−４
（ＨｉｇｈＦｉｖｅ）細胞である。
に適合したベクターを具備する昆虫細胞を提供する。別の実施態様では、昆虫細
胞はＳｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞又はＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ ５Ｂ−４
（ＨｉｇｈＦｉｖｅ）細胞である。
【００８５】 本発明は上記細胞のいずれか１種より単離された膜調製体を提供する。
【００８６】 本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体をコードする核酸と特異的にハイブリダイズす
る、少なくとも１５ヌクレオチドを含む核酸プローブにおいて、該プローブがプ
ラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１中に存在するヒトＭＣＨ１受容体をコード
する核酸配の２本鎖の一方の中に存在している配列に対応する特有配列を有して
いるプローブを提供する。本発明は更に、ヒトＭＣＨ１受容体をコードする核酸
と特異的にハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドを含む核酸プロー
ブにおいて、該プローブが（ａ）図１に示す核酸配列（配列番号１）又は（ｂ）
その逆方向相補体に対応する特有の配列を有しているプローブも提供する。実施
態様の一つでは、核酸はＤＮＡである。別の実施態様では、核酸はＲＮＡである
。
る、少なくとも１５ヌクレオチドを含む核酸プローブにおいて、該プローブがプ
ラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１中に存在するヒトＭＣＨ１受容体をコード
する核酸配の２本鎖の一方の中に存在している配列に対応する特有配列を有して
いるプローブを提供する。本発明は更に、ヒトＭＣＨ１受容体をコードする核酸
と特異的にハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドを含む核酸プロー
ブにおいて、該プローブが（ａ）図１に示す核酸配列（配列番号１）又は（ｂ）
その逆方向相補体に対応する特有の配列を有しているプローブも提供する。実施
態様の一つでは、核酸はＤＮＡである。別の実施態様では、核酸はＲＮＡである
。
【００８７】 ここで用いる場合、句「特異的にハイブリダイズする」とはそれ自体に相補的
である核酸配列を認識し、相補的塩基対間の水素結合により二重螺旋断片を形成
する核酸分子の能力を意味する。
である核酸配列を認識し、相補的塩基対間の水素結合により二重螺旋断片を形成
する核酸分子の能力を意味する。
【００８８】 核酸プローブ技術は当業者に良く知られており、これらプローブが非常に多様
な長さを持ち、そして放射性同位元素または蛍光色素の様な検出可能な標識体に
より標識されることでプローブの検出が容易になることを容易に理解するであろ
う。ＤＮＡプローブ分子は、当分野公知の方法を使い、本発明のポリペプチドを
コードするＤＮＡ分子をプラスミド又はバクテリオファージの様な好適ベクター
内に挿入し、好適な細菌宿主細胞内に形質導入し、形質転換された細菌宿主細胞
ないにて複製させ、ＤＮＡプローブを集めることで作製できるであろう。あるい
は、プローブはＤＮＡ合成装置により化学的に作製されるであろう。
な長さを持ち、そして放射性同位元素または蛍光色素の様な検出可能な標識体に
より標識されることでプローブの検出が容易になることを容易に理解するであろ
う。ＤＮＡプローブ分子は、当分野公知の方法を使い、本発明のポリペプチドを
コードするＤＮＡ分子をプラスミド又はバクテリオファージの様な好適ベクター
内に挿入し、好適な細菌宿主細胞内に形質導入し、形質転換された細菌宿主細胞
ないにて複製させ、ＤＮＡプローブを集めることで作製できるであろう。あるい
は、プローブはＤＮＡ合成装置により化学的に作製されるであろう。
【００８９】 ＲＮＡプローブは本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を、Ｔ３、Ｔ
７、又はＳＰ６の様なバクテリオファージプロモター下流に挿入することで作製
されるであろう。適当なＲＮＡポリメラーゼ存在下に、上流プロモーターを含む
直線化された断片と標識ヌクレオチドとをインキュベーションすることで、大量
のＲＮＡプローブが作製されるであろう。
７、又はＳＰ６の様なバクテリオファージプロモター下流に挿入することで作製
されるであろう。適当なＲＮＡポリメラーゼ存在下に、上流プロモーターを含む
直線化された断片と標識ヌクレオチドとをインキュベーションすることで、大量
のＲＮＡプローブが作製されるであろう。
【００９０】 本発明はヒトＭＣＨ１受容体をコードしているＲＮＡに特異的にハイブリダイ
ゼーションでき、ＲＮＡの転写を阻害できる配列を有するアンチセンスオリゴヌ
クレオチドを提供する。本発明は更に、ヒトＭＣＨ１受容体をコードしているゲ
ノミックＤＮＡに特異的にハイブリダイゼーションできる配列を有するアントセ
ンスオリゴヌクレオチドも提供する。実施態様の一つでは、オリゴヌクレオチド
は化学的に修飾されたヌクレオチド、又はヌクレオチド類似体を含む。
ゼーションでき、ＲＮＡの転写を阻害できる配列を有するアンチセンスオリゴヌ
クレオチドを提供する。本発明は更に、ヒトＭＣＨ１受容体をコードしているゲ
ノミックＤＮＡに特異的にハイブリダイゼーションできる配列を有するアントセ
ンスオリゴヌクレオチドも提供する。実施態様の一つでは、オリゴヌクレオチド
は化学的に修飾されたヌクレオチド、又はヌクレオチド類似体を含む。
【００９１】 本発明は更にヒトＭＣＨ１受容体をコードする核酸によりコードされたヒトＭ
ＣＨ１受容体に結合できる抗体を提供する。本発明は更に、ヒトＭＣＨ１受容体
に対する抗体の結合を競合的に阻害できる作用物質を提供する。実施態様の一つ
では、抗体はモノクローナル抗体又は抗血清である。
ＣＨ１受容体に結合できる抗体を提供する。本発明は更に、ヒトＭＣＨ１受容体
に対する抗体の結合を競合的に阻害できる作用物質を提供する。実施態様の一つ
では、抗体はモノクローナル抗体又は抗血清である。
【００９２】 本発明は（ａ）細胞膜を通過しヒトＭＣＨ１受容体の発現を効果的に低下する
ことができる量の上記オリゴヌクレオチド、及び（ｂ）細胞膜を通過できる医薬
品として受け入れ可能なキャリアーを含む医薬組成物を提供する。ある実施態様
では、オリゴヌクレオチドはｍＲＮＡを不活性化する物質に結合している。別の
実施態様では、ｍＲＮＡを不活性化する物質はリボザイムである。他の実施態様
では、医薬品として受け入れ可能なキャリアーは、その構造体に結合した後に細
胞によって取り込まれることができる細胞上のヒトＭＣＨ１受容体に結合した構
造体を含む。別の実施態様では、医薬品として受け入れ可能なキャリアーは、選
択された細胞の型に特異的であるヒトＭＣＨ１受容体に結合できる。
ことができる量の上記オリゴヌクレオチド、及び（ｂ）細胞膜を通過できる医薬
品として受け入れ可能なキャリアーを含む医薬組成物を提供する。ある実施態様
では、オリゴヌクレオチドはｍＲＮＡを不活性化する物質に結合している。別の
実施態様では、ｍＲＮＡを不活性化する物質はリボザイムである。他の実施態様
では、医薬品として受け入れ可能なキャリアーは、その構造体に結合した後に細
胞によって取り込まれることができる細胞上のヒトＭＣＨ１受容体に結合した構
造体を含む。別の実施態様では、医薬品として受け入れ可能なキャリアーは、選
択された細胞の型に特異的であるヒトＭＣＨ１受容体に結合できる。
【００９３】 本発明はヒトＭＣＨ１受容体へのリガンド結合を遮断するのに有効である抗体
と医薬品として受け入れ可能なキャリアーを含む、医薬組成物を提供する。
と医薬品として受け入れ可能なキャリアーを含む、医薬組成物を提供する。
【００９４】 ここで用いる場合、「医薬品として受け入れ可能なキャリアー」という句は、
標準的な医薬品として受け入れ可能なキャリーの何れかを意味する。例としては
リン酸緩衝化生理食塩水、生理食塩水、水及び水／油乳剤の様な乳剤があるが、
これに限定されるものではない。
標準的な医薬品として受け入れ可能なキャリーの何れかを意味する。例としては
リン酸緩衝化生理食塩水、生理食塩水、水及び水／油乳剤の様な乳剤があるが、
これに限定されるものではない。
【００９５】 本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡを発現するトランスジェニ
ック非ヒト哺乳動物を提供する。本発明は更に未変性ヒトＭＣＨ１受容体の相同
的組換え体ノックアウトを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物も提供する。
本発明は更に、そのゲノム内にヒトＭＣＨ１受容体をコードするｍＲＮＡに対し
相補的であり、ヒトＭＣＨ１受容体をコードするｍＲＮＡに対し相補的であるア
ンチセンスｍＲＮＡに転写され、更にヒトＭＣＨ１受容体をコードするｍＲＮＡ
にハイブリダズし、それによりその翻訳を減じる様にゲノム内に配置されている
ヒトＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡに対し相補的であるアンチセンスＤＮＡ
を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。ある実施態様では、ヒ
トＭＣＨ１受容体をコードしているＤＮＡは、更に誘導可能なプロモーターを含
む。別の実施態様では、ヒトＭＣＨ１受容体をコードしているＤＮＡは更に組織
特異的制御要素を含む。別の実施態様では、トランスジェニック非ヒト哺乳動物
はマウスである。
ック非ヒト哺乳動物を提供する。本発明は更に未変性ヒトＭＣＨ１受容体の相同
的組換え体ノックアウトを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物も提供する。
本発明は更に、そのゲノム内にヒトＭＣＨ１受容体をコードするｍＲＮＡに対し
相補的であり、ヒトＭＣＨ１受容体をコードするｍＲＮＡに対し相補的であるア
ンチセンスｍＲＮＡに転写され、更にヒトＭＣＨ１受容体をコードするｍＲＮＡ
にハイブリダズし、それによりその翻訳を減じる様にゲノム内に配置されている
ヒトＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡに対し相補的であるアンチセンスＤＮＡ
を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。ある実施態様では、ヒ
トＭＣＨ１受容体をコードしているＤＮＡは、更に誘導可能なプロモーターを含
む。別の実施態様では、ヒトＭＣＨ１受容体をコードしているＤＮＡは更に組織
特異的制御要素を含む。別の実施態様では、トランスジェニック非ヒト哺乳動物
はマウスである。
【００９６】 本発明のポリペプチドの生理学的及び行動学的役割を推測する動物モデルシス
テムは、各種技術によりポリペプチドの活性が増加あるいは減少し、又は発現し
たポリペプチドの活性が変化するトランスジェニック哺乳動物を作製することで
作られる。この様な技術の例には、１）マイクロインジェクション、エレクトロ
ポレーション、レトロウイルストランスフェクション、またはその他当分野公知
の方法により、ポリペプチドをコードしている正常あるいは変異型ＤＮＡを適当
な受精胚に挿入し、トランスジェニック動物を作製する方法、又は２）変異型ま
たは正常のヒト、あるいは動物のこれら遺伝子をトランスジェニック動物内の未
変性遺伝子座と相同的組み換えし、これらポリペプチド配列の発現の制御または
構造を変える方法があるが、これに限定されない。相同的組み換えの技術は当分
野公知である。これは未変性遺伝子を挿入遺伝子で交換するものであり、従って
未変性ポリペプチドは発現できないが例えば挿入された変態ポリペプチドを発現
し、それが組み換えによって動物ゲノム内の未変性ポリペプチドに置き換わり、
その結果トランスポーターの過小発現がもたらされる動物の作製に有用である。
マイクロインジェクションはゲノムに遺伝子を加えるが、それを取り除かないた
め、それ自体及び追加ポリペプチドを発現し、その結果ポリペチドを過剰発現し
ている動物の作製に有用である。
テムは、各種技術によりポリペプチドの活性が増加あるいは減少し、又は発現し
たポリペプチドの活性が変化するトランスジェニック哺乳動物を作製することで
作られる。この様な技術の例には、１）マイクロインジェクション、エレクトロ
ポレーション、レトロウイルストランスフェクション、またはその他当分野公知
の方法により、ポリペプチドをコードしている正常あるいは変異型ＤＮＡを適当
な受精胚に挿入し、トランスジェニック動物を作製する方法、又は２）変異型ま
たは正常のヒト、あるいは動物のこれら遺伝子をトランスジェニック動物内の未
変性遺伝子座と相同的組み換えし、これらポリペプチド配列の発現の制御または
構造を変える方法があるが、これに限定されない。相同的組み換えの技術は当分
野公知である。これは未変性遺伝子を挿入遺伝子で交換するものであり、従って
未変性ポリペプチドは発現できないが例えば挿入された変態ポリペプチドを発現
し、それが組み換えによって動物ゲノム内の未変性ポリペプチドに置き換わり、
その結果トランスポーターの過小発現がもたらされる動物の作製に有用である。
マイクロインジェクションはゲノムに遺伝子を加えるが、それを取り除かないた
め、それ自体及び追加ポリペプチドを発現し、その結果ポリペチドを過剰発現し
ている動物の作製に有用である。
【００９７】 マウスを例にとった場合、トランスジェニック動物作製に好適は方法の一つは
次の通りである：雌マウスを交配させ、得られた受精卵をその卵管から切り出す
。卵はＭ２培地の様な適当な媒体中に保存される。本発明のポリペプチドをコー
ドしているＤＮＡ又はｃＤＮＡを当分野既知の方法によりベクターから精製する
。誘導可能なプロモーターをＤＮＡのコーディング域と融合することで、トラン
ス遺伝子の発現を制御する実験手段が提供されるであろう。あるいは、又は更に
、組織特異的制御要素はコーディング域と融合され、トランス遺伝子の組織特異
的発現が可能になるであろう。適当に緩衝化された溶液中あるＤＮＡを、マイク
ロインジェクション用の針（ピペットプーラーを用いキャピラリーチューブより
作製される）に入れ、注射される卵を凹スライドに入れる。針は卵の前核内に挿
入され、ＤＮＡ液が注入される。注射された卵は次に偽妊娠させられたマウス（
実際には妊娠していないが、妊娠を維持するために適当なホルモンによって維持
されたマウス）の卵管内に移され、そこで卵は子宮に進み、着床し、発生し出産
する。上記の如く、マイクロインジェクションは卵細胞にＤＮＡを挿入するため
の唯一の方法ではなく、ここでは例示を目的としてのみ用いられる。
次の通りである：雌マウスを交配させ、得られた受精卵をその卵管から切り出す
。卵はＭ２培地の様な適当な媒体中に保存される。本発明のポリペプチドをコー
ドしているＤＮＡ又はｃＤＮＡを当分野既知の方法によりベクターから精製する
。誘導可能なプロモーターをＤＮＡのコーディング域と融合することで、トラン
ス遺伝子の発現を制御する実験手段が提供されるであろう。あるいは、又は更に
、組織特異的制御要素はコーディング域と融合され、トランス遺伝子の組織特異
的発現が可能になるであろう。適当に緩衝化された溶液中あるＤＮＡを、マイク
ロインジェクション用の針（ピペットプーラーを用いキャピラリーチューブより
作製される）に入れ、注射される卵を凹スライドに入れる。針は卵の前核内に挿
入され、ＤＮＡ液が注入される。注射された卵は次に偽妊娠させられたマウス（
実際には妊娠していないが、妊娠を維持するために適当なホルモンによって維持
されたマウス）の卵管内に移され、そこで卵は子宮に進み、着床し、発生し出産
する。上記の如く、マイクロインジェクションは卵細胞にＤＮＡを挿入するため
の唯一の方法ではなく、ここでは例示を目的としてのみ用いられる。
【００９８】 本発明は、哺乳動物ＭＣＨ１受容体をコードしているＤＮＡを含み且つその表
面上にそれを発現している細胞に、結合好適条件下に化合物を接触させること及
び哺乳動物ＭＣＨ１受容体への化合物の特異的結合を検出することを含み、前記
細胞が通常は哺乳動物ＭＣＨ１受容体を発現しておらず、そして哺乳動物受容体
をコードしているＤＮＡが（ａ）低厳密条件下に図１に示す規定配列（配列番号
１）を有する核酸又はその相補体配列にハイブリダイズし、且つ（ｂ）ＭＣＨ１
リガンドがＣＨＯ細胞の培養体に加えられ、且つそのＣＨＯ細胞が規定配列また
はその相補体を有する核酸にハイブリダズする核酸を含む時、ＣＨＯ細胞培養体
のｐＨに変化をもたらすことができる能力により更に特徴付けられる、ヒトＭＣ
Ｈ１受容体に特異的に結合する化合物を同定する方法を提供する。本発明はまた
、哺乳動物ＭＣＨ１受容体をコードしているＤＮＡを含み且つその表面上にそれ
を発現している細胞からの膜調製体に、結合好適条件下に化合物を接触させるこ
と及び哺乳動物ＭＣＨ１受容体への化合物の特異的結合を検出することを含み、
前記細胞が通常は哺乳動物ＭＣＨ１受容体を発現しておらず、そして哺乳動物受
容体をコードしているＤＮＡが（ａ）低厳密条件下に図１に示す規定配列（配列
番号１）を有する核酸又はその相補体配列にハイブリダイズし、且つ（ｂ）ＭＣ
Ｈ１リガンドがＣＨＯ細胞の培養体に加えられ、且つそのＣＨＯ細胞が規定配列
またはその相補体を有する核酸にハイブリダズする核酸を含む時、ＣＨＯ細胞培
養体のｐＨに変化をもたらすことができる能力により更に特徴付けられる、ヒト
ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定する方法を提供する。実施態様
の一つでは、ＭＣＨ１受容体はヒトＭＣＨ１受容体である。別の実施態様ではＭ
ＣＨ１受容体はラットＭＣＨ１受容体である。別の実施態様では、哺乳動物ＭＣ
Ｈ１受容体はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１にコードされるヒトＭＣＨ
１受容体の配列と同一のアミノ酸配列を含む。別の実施態様では、哺乳動物ＭＣ
Ｈ１受容体は図２に示すもの（配列番号２）と実質的同一であるアミノ酸配列を
含む。別の実施態様では、哺乳動物ＭＣＨ１受容体は図２に示すアミノ酸配列（
配列番号２）を含む。別の実施態様では、哺乳動物ＭＣＨ１受容体は図１３に示
すアミノ酸配列（配列番号２７）を含む。別の実施態様では、哺乳動物ＭＣＨ１
受容体は図１４に示すアミノ酸配列（配列番号２８）を含む。更に別の実施態様
では、哺乳動物ＭＣＨ１受容体は図１５に示すアミノ酸配列（配列番号２９）を
含む。別の実施態様では、化合物は哺乳動物ＭＣＨ１受容体に対し結合すること
が事前には知られていない。本発明は更に、上記方法により特定された化合物を
提供する。
面上にそれを発現している細胞に、結合好適条件下に化合物を接触させること及
び哺乳動物ＭＣＨ１受容体への化合物の特異的結合を検出することを含み、前記
細胞が通常は哺乳動物ＭＣＨ１受容体を発現しておらず、そして哺乳動物受容体
をコードしているＤＮＡが（ａ）低厳密条件下に図１に示す規定配列（配列番号
１）を有する核酸又はその相補体配列にハイブリダイズし、且つ（ｂ）ＭＣＨ１
リガンドがＣＨＯ細胞の培養体に加えられ、且つそのＣＨＯ細胞が規定配列また
はその相補体を有する核酸にハイブリダズする核酸を含む時、ＣＨＯ細胞培養体
のｐＨに変化をもたらすことができる能力により更に特徴付けられる、ヒトＭＣ
Ｈ１受容体に特異的に結合する化合物を同定する方法を提供する。本発明はまた
、哺乳動物ＭＣＨ１受容体をコードしているＤＮＡを含み且つその表面上にそれ
を発現している細胞からの膜調製体に、結合好適条件下に化合物を接触させるこ
と及び哺乳動物ＭＣＨ１受容体への化合物の特異的結合を検出することを含み、
前記細胞が通常は哺乳動物ＭＣＨ１受容体を発現しておらず、そして哺乳動物受
容体をコードしているＤＮＡが（ａ）低厳密条件下に図１に示す規定配列（配列
番号１）を有する核酸又はその相補体配列にハイブリダイズし、且つ（ｂ）ＭＣ
Ｈ１リガンドがＣＨＯ細胞の培養体に加えられ、且つそのＣＨＯ細胞が規定配列
またはその相補体を有する核酸にハイブリダズする核酸を含む時、ＣＨＯ細胞培
養体のｐＨに変化をもたらすことができる能力により更に特徴付けられる、ヒト
ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定する方法を提供する。実施態様
の一つでは、ＭＣＨ１受容体はヒトＭＣＨ１受容体である。別の実施態様ではＭ
ＣＨ１受容体はラットＭＣＨ１受容体である。別の実施態様では、哺乳動物ＭＣ
Ｈ１受容体はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１にコードされるヒトＭＣＨ
１受容体の配列と同一のアミノ酸配列を含む。別の実施態様では、哺乳動物ＭＣ
Ｈ１受容体は図２に示すもの（配列番号２）と実質的同一であるアミノ酸配列を
含む。別の実施態様では、哺乳動物ＭＣＨ１受容体は図２に示すアミノ酸配列（
配列番号２）を含む。別の実施態様では、哺乳動物ＭＣＨ１受容体は図１３に示
すアミノ酸配列（配列番号２７）を含む。別の実施態様では、哺乳動物ＭＣＨ１
受容体は図１４に示すアミノ酸配列（配列番号２８）を含む。更に別の実施態様
では、哺乳動物ＭＣＨ１受容体は図１５に示すアミノ酸配列（配列番号２９）を
含む。別の実施態様では、化合物は哺乳動物ＭＣＨ１受容体に対し結合すること
が事前には知られていない。本発明は更に、上記方法により特定された化合物を
提供する。
【００９９】 上記方法の実施態様の一つでは、細胞は昆虫細胞である。別の実施態様では、
細胞は哺乳動物細胞である。別の実施態様では細胞は非神経性起源である。別の
実施態様では、非神経細胞はＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胎児腎臓細胞、ＣＨＯ
細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、マウスＹ１細胞、又はＬＭ（ｔｋ−）細胞である。
細胞は哺乳動物細胞である。別の実施態様では細胞は非神経性起源である。別の
実施態様では、非神経細胞はＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胎児腎臓細胞、ＣＨＯ
細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、マウスＹ１細胞、又はＬＭ（ｔｋ−）細胞である。
【０１００】 本発明は、その表面に哺乳動物ＭＣＨ１受容体を発現している細胞に、化合物
及び受容体への結合が既知である第２化合物の両方を、両化合物の結合に好適な
条件下に接触せしめること、及び第２化合物とだけ接触せしめること、及び哺乳
動物ＭＣＨ１受容体への化合物の特異的結合を検出することを含み、化合物の存
在下における哺乳動物ＭＣＨ１受容体への第２化合物の結合の低下は化合物が哺
乳動物ＭＣＨ１受容体に結合することを示し、前記細胞が通常は哺乳動物ＭＣＨ
１受容体を発現しておらず、そして哺乳動物受容体をコードしているＤＮＡが（
ａ）低厳密条件下に図１に示す規定配列（配列番号１）を有する核酸又はその相
補体配列にハイブリダイズし、且つ（ｂ）ＭＣＨ１リガンドがＣＨＯ細胞の培養
体に加えられ、且つそのＣＨＯ細胞が規定配列またはその相補体を有する核酸に
ハイブリダズする核酸を含む時、ＣＨＯ細胞培養体のｐＨに変化をもたらすこと
ができる能力により更に特徴付けられる、哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結
合する化合物を同定することに適した競合結合を含む方法を提供する。
及び受容体への結合が既知である第２化合物の両方を、両化合物の結合に好適な
条件下に接触せしめること、及び第２化合物とだけ接触せしめること、及び哺乳
動物ＭＣＨ１受容体への化合物の特異的結合を検出することを含み、化合物の存
在下における哺乳動物ＭＣＨ１受容体への第２化合物の結合の低下は化合物が哺
乳動物ＭＣＨ１受容体に結合することを示し、前記細胞が通常は哺乳動物ＭＣＨ
１受容体を発現しておらず、そして哺乳動物受容体をコードしているＤＮＡが（
ａ）低厳密条件下に図１に示す規定配列（配列番号１）を有する核酸又はその相
補体配列にハイブリダイズし、且つ（ｂ）ＭＣＨ１リガンドがＣＨＯ細胞の培養
体に加えられ、且つそのＣＨＯ細胞が規定配列またはその相補体を有する核酸に
ハイブリダズする核酸を含む時、ＣＨＯ細胞培養体のｐＨに変化をもたらすこと
ができる能力により更に特徴付けられる、哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結
合する化合物を同定することに適した競合結合を含む方法を提供する。
【０１０１】 本発明はまた、その表面に哺乳動物ＭＣＨ１受容体を発現している細胞からの
膜調製体に、化合物及び受容体への結合が既知である第２化合物の両方を、両化
合物の結合に好適な条件下に接触せしめること、及び第２化合物とだけ接触せし
めること、及び哺乳動物ＭＣＨ１受容体への化合物の特異的結合を検出すること
を含み、化合物の存在下における哺乳動物ＭＣＨ１受容体への第２化合物の結合
の低下は該化合物が哺乳動物ＭＣＨ１受容体に結合することを示し、前記細胞が
通常は哺乳動物ＭＣＨ１受容体を発現しておらず、そして哺乳動物受容体をコー
ドしているＤＮＡが（ａ）低厳密条件下に図１に示す規定配列（配列番号１）を
有する核酸又はその相補体配列にハイブリダイズし、且つ（ｂ）ＭＣＨ１リガン
ドがＣＨＯ細胞の培養体に加えられ、且つそのＣＨＯ細胞が規定配列またはその
相補体を有する核酸にハイブリダズする核酸を含む時、ＣＨＯ細胞培養体のｐＨ
に変化をもたらすことができる能力により更に特徴付けられる、哺乳動物ＭＣＨ
１受容体に特異的に結合する化合物を同定することに適した競合結合を含む方法
を提供する。
膜調製体に、化合物及び受容体への結合が既知である第２化合物の両方を、両化
合物の結合に好適な条件下に接触せしめること、及び第２化合物とだけ接触せし
めること、及び哺乳動物ＭＣＨ１受容体への化合物の特異的結合を検出すること
を含み、化合物の存在下における哺乳動物ＭＣＨ１受容体への第２化合物の結合
の低下は該化合物が哺乳動物ＭＣＨ１受容体に結合することを示し、前記細胞が
通常は哺乳動物ＭＣＨ１受容体を発現しておらず、そして哺乳動物受容体をコー
ドしているＤＮＡが（ａ）低厳密条件下に図１に示す規定配列（配列番号１）を
有する核酸又はその相補体配列にハイブリダイズし、且つ（ｂ）ＭＣＨ１リガン
ドがＣＨＯ細胞の培養体に加えられ、且つそのＣＨＯ細胞が規定配列またはその
相補体を有する核酸にハイブリダズする核酸を含む時、ＣＨＯ細胞培養体のｐＨ
に変化をもたらすことができる能力により更に特徴付けられる、哺乳動物ＭＣＨ
１受容体に特異的に結合する化合物を同定することに適した競合結合を含む方法
を提供する。
【０１０２】 実施態様の一つでは、哺乳動物ＭＣＨ１受容体はヒトＭＣＨ１受容体またはＭ
ＣＨあるいはその類似体又は相同体により活性化されるヒトＭＣＨ１受容体の変
異体である。別の実施態様では、哺乳動物ＭＣＨ１受容体はラットＭＣＨ１受容
体である。別の実施態様では、哺乳動物ＭＣＨ１受容体はプラスミドｐＥＸＪ．
ＨＲ−ＴＬ２３１にコードされるヒトＭＣＨ１受容体と実質同一であるアミノ酸
配列を含む。別の実施態様では、哺乳動物ＭＣＨ１受容体は図２に示すもの（配
列番号２）と実質的同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施態様では、哺乳動
物ＭＣＨ１受容体は図２に示すアミノ酸配列（配列番号２）を含む。
ＣＨあるいはその類似体又は相同体により活性化されるヒトＭＣＨ１受容体の変
異体である。別の実施態様では、哺乳動物ＭＣＨ１受容体はラットＭＣＨ１受容
体である。別の実施態様では、哺乳動物ＭＣＨ１受容体はプラスミドｐＥＸＪ．
ＨＲ−ＴＬ２３１にコードされるヒトＭＣＨ１受容体と実質同一であるアミノ酸
配列を含む。別の実施態様では、哺乳動物ＭＣＨ１受容体は図２に示すもの（配
列番号２）と実質的同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施態様では、哺乳動
物ＭＣＨ１受容体は図２に示すアミノ酸配列（配列番号２）を含む。
【０１０３】 実施態様の一つでは、細胞は昆虫細胞である。別の実施態様では、細胞は哺乳
動物細胞である。別の実施態様では細胞は非神経性起源である。別の実施態様で
は、非神経細胞はＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胎児腎臓細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＩ
Ｈ−３Ｔ３細胞、マウスＹ１細胞、又はＬＭ（ｔｋ−）細胞である。実施態様の
一つでは、化合物は哺乳動物ＭＣＨ１受容体に結合することが従来知られていな
い。
動物細胞である。別の実施態様では細胞は非神経性起源である。別の実施態様で
は、非神経細胞はＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胎児腎臓細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＩ
Ｈ−３Ｔ３細胞、マウスＹ１細胞、又はＬＭ（ｔｋ−）細胞である。実施態様の
一つでは、化合物は哺乳動物ＭＣＨ１受容体に結合することが従来知られていな
い。
【０１０４】 本発明は、上記方法により特定された化合物を提供する。
【０１０５】 本発明は、（ａ）哺乳動物ＭＣＨ１受容体に結合することが既知である化合物
の結合を可能にする条件の下、哺乳動物ＭＣＨ１受容体をコードしているＤＮＡ
がトランスフェクションされ且つそれを発現している細胞に、哺乳動物ＭＣＨ１
受容体に特異的に結合することが既知でない複数の化合物を接触せしめること；
（ｂ）複数の化合物中にある化合物存在下に、哺乳動物ＭＣＨ１受容体へ結合す
ることが既知である化合物の結合が複数の化合物が存在しない状態での化合物の
結合に比べ低下するかどうかを決定すること；及び低下する場合に（ｃ）複数の
化合物に含まれる化合物の哺乳動物ＭＣＨ１受容体への結合を別々に決定し、そ
れにより哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定することを含
む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定することを目的と
した、哺乳動物ＭＣＨ１受容体への結合が既知でない複数の化合物をスクリーニ
ングする方法を提供する。
の結合を可能にする条件の下、哺乳動物ＭＣＨ１受容体をコードしているＤＮＡ
がトランスフェクションされ且つそれを発現している細胞に、哺乳動物ＭＣＨ１
受容体に特異的に結合することが既知でない複数の化合物を接触せしめること；
（ｂ）複数の化合物中にある化合物存在下に、哺乳動物ＭＣＨ１受容体へ結合す
ることが既知である化合物の結合が複数の化合物が存在しない状態での化合物の
結合に比べ低下するかどうかを決定すること；及び低下する場合に（ｃ）複数の
化合物に含まれる化合物の哺乳動物ＭＣＨ１受容体への結合を別々に決定し、そ
れにより哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定することを含
む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定することを目的と
した、哺乳動物ＭＣＨ１受容体への結合が既知でない複数の化合物をスクリーニ
ングする方法を提供する。
【０１０６】 本発明は、（ａ）哺乳動物ＭＣＨ１受容体に結合することが既知である化合物
の結合を可能にする条件の下、哺乳動物ＭＣＨ１受容体をコードしているＤＮＡ
がトランスフェクションされ且つそれを発現している細胞からの膜調製体に、哺
乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合することが既知でない複数の化合物を接触
せしめること；（ｂ）複数の化合物中にある化合物存在下に、哺乳動物ＭＣＨ１
受容体へ結合することが既知である化合物の結合が複数の化合物が存在しない状
態での化合物の結合に比べ低下するかどうかを決定すること；及び低下する場合
に（ｃ）複数の化合物に含まれる化合物の哺乳動物ＭＣＨ１受容体への結合を別
々に決定し、それにより哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同
定することを含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定す
ることを目的とした、哺乳動物ＭＣＨ１受容体への結合が既知でない複数の化合
物をスクリーニングする方法を提供する。
の結合を可能にする条件の下、哺乳動物ＭＣＨ１受容体をコードしているＤＮＡ
がトランスフェクションされ且つそれを発現している細胞からの膜調製体に、哺
乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合することが既知でない複数の化合物を接触
せしめること；（ｂ）複数の化合物中にある化合物存在下に、哺乳動物ＭＣＨ１
受容体へ結合することが既知である化合物の結合が複数の化合物が存在しない状
態での化合物の結合に比べ低下するかどうかを決定すること；及び低下する場合
に（ｃ）複数の化合物に含まれる化合物の哺乳動物ＭＣＨ１受容体への結合を別
々に決定し、それにより哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同
定することを含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定す
ることを目的とした、哺乳動物ＭＣＨ１受容体への結合が既知でない複数の化合
物をスクリーニングする方法を提供する。
【０１０７】 上記方法の実施態様の一つでは、哺乳動物ＭＣＨ１受容体はヒトＭＣＨ１受容
体、又はＭＣＨあるいはその類似体又は相同体により活性化されるヒトＭＣＨ１
受容体の変異体である。別の実施態様では、哺乳動物ＭＣＨ１受容体はラットＭ
ＣＨ１受容体である。別の実施態様では、細胞は哺乳動物細胞である。別の実施
態様では細胞は非神経性起源である。別の実施態様では、非神経細胞はＣＯＳ−
７細胞、２９３ヒト胎児腎臓細胞、ＬＭ（ｔｋ−）細胞、ＣＨＯ細胞、マウスＹ
１細胞又はＮＩＨ−３Ｔ３細胞である。
体、又はＭＣＨあるいはその類似体又は相同体により活性化されるヒトＭＣＨ１
受容体の変異体である。別の実施態様では、哺乳動物ＭＣＨ１受容体はラットＭ
ＣＨ１受容体である。別の実施態様では、細胞は哺乳動物細胞である。別の実施
態様では細胞は非神経性起源である。別の実施態様では、非神経細胞はＣＯＳ−
７細胞、２９３ヒト胎児腎臓細胞、ＬＭ（ｔｋ−）細胞、ＣＨＯ細胞、マウスＹ
１細胞又はＮＩＨ−３Ｔ３細胞である。
【０１０８】 本発明は、細胞より全ｍＲＮＡを獲得し、得られたｍＲＮＡをハイブリダイゼ
ーション条件下に核酸プローブと接触させること、プローブにハイブリダイゼー
ションしたｍＲＮＡの存在を検出すること、それにより細胞による哺乳動物ＭＣ
Ｈ１受容体の発現を検出することを含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の発現を検出
する方法も提供する。
ーション条件下に核酸プローブと接触させること、プローブにハイブリダイゼー
ションしたｍＲＮＡの存在を検出すること、それにより細胞による哺乳動物ＭＣ
Ｈ１受容体の発現を検出することを含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の発現を検出
する方法も提供する。
【０１０９】 本発明は更に、抗体が受容体に結合する条件の下に細胞を抗体と接触させるこ
と、細胞に結合した抗体の存在を検出すること、それにより細胞表面上の哺乳動
物ＭＣＨ１受容体の存在を検出することを含む、細胞表面上の哺乳動物ＭＣＨ１
受容体の存在を検出する方法を提供する。
と、細胞に結合した抗体の存在を検出すること、それにより細胞表面上の哺乳動
物ＭＣＨ１受容体の存在を検出することを含む、細胞表面上の哺乳動物ＭＣＨ１
受容体の存在を検出する方法を提供する。
【０１１０】 本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体活性のレベルが、ヒトＭＣＨ１受容体発現を制
御する誘導可能なプロモーターの利用によって変化する、ヒト以外のトラスジェ
ニック哺乳動物を産生することを含む、ヒトＭＣＨ１受容体の活性レベルを変化
させることの生理学的影響を決定する方法を提供する。
御する誘導可能なプロモーターの利用によって変化する、ヒト以外のトラスジェ
ニック哺乳動物を産生することを含む、ヒトＭＣＨ１受容体の活性レベルを変化
させることの生理学的影響を決定する方法を提供する。
【０１１１】 本発明は、それぞれが異なる量のヒトＭＣＨ１受容体を発現しているトランス
ジェニック非ヒト哺乳動物のパネルを作製することを含む、ヒトＭＣＨ１受容体
活性のレベルを変えることの生理学的影響を決定する方法も提供する。
ジェニック非ヒト哺乳動物のパネルを作製することを含む、ヒトＭＣＨ１受容体
活性のレベルを変えることの生理学的影響を決定する方法も提供する。
【０１１２】 本発明は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物に投与すること、及び化合物が
ヒトＭＣＨ１受容体の過剰発現の結果として、トランスジェニック非ヒト哺乳動
物により提示された生理学的及び行動学的異常を変化させるかを決定すること、
及び異常の緩和により化合物がアンタゴニストであると同定されることを含む、
ヒトＭＣＨ１受容体の活性を低下させることで異常が緩和する異常の軽快化が可
能なアンタゴニストを同定する方法を提供する。本発明は更に上記方法により同
定されたアンタゴニストも提供する。本発明は更に上記方法により同定されたア
ンタゴニスト及び医薬品として受け入れ可能なキャリアーを含む医薬組成物を提
供する。本発明は、被験者に対し有効量のこの医薬組成物を投与し、それにより
異常を治療することを含む、ヒトＭＣＨ１受容体の活性の低下により異常が軽快
化される被験者に於ける異常を治療する方法を提供する。
ヒトＭＣＨ１受容体の過剰発現の結果として、トランスジェニック非ヒト哺乳動
物により提示された生理学的及び行動学的異常を変化させるかを決定すること、
及び異常の緩和により化合物がアンタゴニストであると同定されることを含む、
ヒトＭＣＨ１受容体の活性を低下させることで異常が緩和する異常の軽快化が可
能なアンタゴニストを同定する方法を提供する。本発明は更に上記方法により同
定されたアンタゴニストも提供する。本発明は更に上記方法により同定されたア
ンタゴニスト及び医薬品として受け入れ可能なキャリアーを含む医薬組成物を提
供する。本発明は、被験者に対し有効量のこの医薬組成物を投与し、それにより
異常を治療することを含む、ヒトＭＣＨ１受容体の活性の低下により異常が軽快
化される被験者に於ける異常を治療する方法を提供する。
【０１１３】 本発明は、化合物をトランスジェニック非ヒト哺乳動物に投与すること、そし
て化合物がそのトランスジェニック非ヒト哺乳動物により提示される生理学的及
び行動学的異常を変化させるかを決定することを含み、異常の軽快化で化合物が
アゴニストでとして特定される、ヒトＭＣＨ１受容体の活性を増加させることで
異常が軽快化される、異常を軽快化することができるアゴニストを同定する方法
を提供する。本発明は更にこの方法により同定されたアゴニストも提供する。本
発明は更に本法により同定されたアゴニストを含む医薬組成物も提供する。本発
明は、被験者に対し本医薬組成物の有効量を投与し、それにより異常を治療する
ことを含む、ヒトＭＣＨ１受容体の活性を増加させることで異常が軽快化する被
験者の異常を治療する方法を提供する。
て化合物がそのトランスジェニック非ヒト哺乳動物により提示される生理学的及
び行動学的異常を変化させるかを決定することを含み、異常の軽快化で化合物が
アゴニストでとして特定される、ヒトＭＣＨ１受容体の活性を増加させることで
異常が軽快化される、異常を軽快化することができるアゴニストを同定する方法
を提供する。本発明は更にこの方法により同定されたアゴニストも提供する。本
発明は更に本法により同定されたアゴニストを含む医薬組成物も提供する。本発
明は、被験者に対し本医薬組成物の有効量を投与し、それにより異常を治療する
ことを含む、ヒトＭＣＨ１受容体の活性を増加させることで異常が軽快化する被
験者の異常を治療する方法を提供する。
【０１１４】 本発明は以下を含む、特異的哺乳動物の活性を伴う疾患の病的素因を診断する
方法を提供する：（ａ）疾患にかかっている被験者のＤＮＡを得ること；（ｂ）
制限酵素のパネルでＤＮＡを制限消化すること；（ｃ）得られたＤＮＡ断片をサ
イズ分析用ゲル上に電気泳動により分離すること；（ｄ）得られたゲルをヒトＭ
ＣＩ受容体をコードしている核酸分子内に含まれる特異配列と特異的にハイブリ
ダイズでき、且つ検出可能なマーカーにより標識された核酸プローブと接触させ
しめること；（ｅ）検出可能マーカーにて標識された、ヒトＭＣＨ１受容体をコ
ードするＤＮＡにハイブリダイズし、疾患にかかった被験者のＤＮＡに特異的な
特有バンドパターンを形成する標識バンドを検出すること；（ｆ）工程（ａ）−
（ｅ）を実施して診断を目的とするＤＮＡの調製を行うこと；及び（ｇ）工程（
ｅ）より得た疾患にかかった被験者のＤＮＡに特異的な特有バンドパターンと、
工程（ｆ）より診断に関し得たＤＮＡに特異的な特有バンドパターンとを比較し
てパターンが同一であるか又は異なるかを決定し、それによりパターンが同一で
ある場合に疾患の病的素因があると診断すること。実施態様の一つでは、特異的
哺乳動物対立遺伝子の活性が伴う疾患が診断される。
方法を提供する：（ａ）疾患にかかっている被験者のＤＮＡを得ること；（ｂ）
制限酵素のパネルでＤＮＡを制限消化すること；（ｃ）得られたＤＮＡ断片をサ
イズ分析用ゲル上に電気泳動により分離すること；（ｄ）得られたゲルをヒトＭ
ＣＩ受容体をコードしている核酸分子内に含まれる特異配列と特異的にハイブリ
ダイズでき、且つ検出可能なマーカーにより標識された核酸プローブと接触させ
しめること；（ｅ）検出可能マーカーにて標識された、ヒトＭＣＨ１受容体をコ
ードするＤＮＡにハイブリダイズし、疾患にかかった被験者のＤＮＡに特異的な
特有バンドパターンを形成する標識バンドを検出すること；（ｆ）工程（ａ）−
（ｅ）を実施して診断を目的とするＤＮＡの調製を行うこと；及び（ｇ）工程（
ｅ）より得た疾患にかかった被験者のＤＮＡに特異的な特有バンドパターンと、
工程（ｆ）より診断に関し得たＤＮＡに特異的な特有バンドパターンとを比較し
てパターンが同一であるか又は異なるかを決定し、それによりパターンが同一で
ある場合に疾患の病的素因があると診断すること。実施態様の一つでは、特異的
哺乳動物対立遺伝子の活性が伴う疾患が診断される。
【０１１５】 本発明は以下を含む、精製されたヒトＭＣＨ１受容体を調製する方法を提供す
る：（ａ）細胞にヒトＭＣＨ１受容体発現を誘導すること；（ｂ）分離細胞より
ヒトＭＣＨ１受容体を回収すること；及び（ｃ）回収したヒトＭＣＨ１受容体を
精製すること。
る：（ａ）細胞にヒトＭＣＨ１受容体発現を誘導すること；（ｂ）分離細胞より
ヒトＭＣＨ１受容体を回収すること；及び（ｃ）回収したヒトＭＣＨ１受容体を
精製すること。
【０１１６】 本発明は以下を含む、精製ヒトＭＣＨ１受容体を調製する方法を提供する；（
ａ）適当なベクターにヒトＭＣＨ１受容体をコードする核酸を挿入すること；（
ｂ）得られたベクターを好適な宿主細胞に導入すること；（ｃ）得られた細胞を
単離されたヒトＭＣＨ１受容体の産生を可能にする好適条件に置くこと；（ｄ）
得られた細胞により産生されるヒトＭＣＨ１受容体を回収すること；及び（ｅ）
そうして回収されたヒトＭＣＨ１受容体を精製すること。
ａ）適当なベクターにヒトＭＣＨ１受容体をコードする核酸を挿入すること；（
ｂ）得られたベクターを好適な宿主細胞に導入すること；（ｃ）得られた細胞を
単離されたヒトＭＣＨ１受容体の産生を可能にする好適条件に置くこと；（ｄ）
得られた細胞により産生されるヒトＭＣＨ１受容体を回収すること；及び（ｅ）
そうして回収されたヒトＭＣＨ１受容体を精製すること。
【０１１７】 本発明は、哺乳動物ＭＣＨ１受容体をコードしているＤＮＡがトランスフェク
ションされそれを発現している細胞に、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化を可能
にする条件下に化合物を接触させること、哺乳動物ＭＣＨ１受容体活性の増加を
検出し、それにより化合物が哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニストであるかを決定
することを含む、化合物が哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニストであるか否かを決
定する方法を提供する。本発明は更に、哺乳動物ＭＣＨ１受容体をコードしてい
るＤＮＡがトランスフェクションされそれを発現している細胞に、哺乳動物ＭＣ
Ｈ１受容体の活性化を可能にする条件下に、既知哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニ
ストが存在する状態で化合物を接触させること、哺乳動物ＭＣＨ１受容体活性の
減少を検出し、それにより化合物が哺乳動物ＭＣＨ１受容体アンタゴニストであ
るかを決定することを含む、化合物が哺乳動物ＭＣＨ１受容体アンタゴニストで
あるか否かを決定する方法を提供する。実施態様の一つでは、哺乳動物ＭＣＨ１
受容体はヒトＭＣＨ１受容体、又はＭＣＨあるいはその類似体又は相同体により
活性化されるヒトＭＣＨ１受容体の変異体である。
ションされそれを発現している細胞に、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化を可能
にする条件下に化合物を接触させること、哺乳動物ＭＣＨ１受容体活性の増加を
検出し、それにより化合物が哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニストであるかを決定
することを含む、化合物が哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニストであるか否かを決
定する方法を提供する。本発明は更に、哺乳動物ＭＣＨ１受容体をコードしてい
るＤＮＡがトランスフェクションされそれを発現している細胞に、哺乳動物ＭＣ
Ｈ１受容体の活性化を可能にする条件下に、既知哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニ
ストが存在する状態で化合物を接触させること、哺乳動物ＭＣＨ１受容体活性の
減少を検出し、それにより化合物が哺乳動物ＭＣＨ１受容体アンタゴニストであ
るかを決定することを含む、化合物が哺乳動物ＭＣＨ１受容体アンタゴニストで
あるか否かを決定する方法を提供する。実施態様の一つでは、哺乳動物ＭＣＨ１
受容体はヒトＭＣＨ１受容体、又はＭＣＨあるいはその類似体又は相同体により
活性化されるヒトＭＣＨ１受容体の変異体である。
【０１１８】 本発明は更に、上記方法にて決定された哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性を増加
するのに有効である哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニストのある量と、医薬品とし
て受け入れ可能なキャリアーのある量とを含む医薬組成物を提供する。
するのに有効である哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニストのある量と、医薬品とし
て受け入れ可能なキャリアーのある量とを含む医薬組成物を提供する。
【０１１９】 本発明は更に、上記方法にて決定された哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性を増加
するのに有効である哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニストのある量と、医薬品とし
て受け入れ可能なキャリアーのある量とを含む医薬組成物も提供する。実施態様
の一つでは、哺乳動物受容体アンタゴニストは従来知られていない。
するのに有効である哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニストのある量と、医薬品とし
て受け入れ可能なキャリアーのある量とを含む医薬組成物も提供する。実施態様
の一つでは、哺乳動物受容体アンタゴニストは従来知られていない。
【０１２０】 本発明は、元来哺乳動物ＭＣＨ１受容体を発現していないが、２メッセンジャ
ー反応を生じ且つその細胞表面上に哺乳動物ＭＣＨ１受容体を発現している細胞
に、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化の好適条件下に化合物を接触させること、
及び化合物存在下、又は非存在下に第２メッセンジャー反応を測定することを含
み、化合物存在下における第２メッセンジャー反応の変化は該化合物が哺乳動物
ＭＣＨ１受容体アゴニストであることを示す、化合物が哺乳動物ＭＣＨ１受容体
に特異的に結合し活性化するか否かを決定する方法を提供する。実施態様の一つ
では、第２メッセンジャー反応は塩素イオンチャンネル活性化を含み、そして第
２メッセンジャーの変化は内向き塩素流のレベル増加である。
ー反応を生じ且つその細胞表面上に哺乳動物ＭＣＨ１受容体を発現している細胞
に、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化の好適条件下に化合物を接触させること、
及び化合物存在下、又は非存在下に第２メッセンジャー反応を測定することを含
み、化合物存在下における第２メッセンジャー反応の変化は該化合物が哺乳動物
ＭＣＨ１受容体アゴニストであることを示す、化合物が哺乳動物ＭＣＨ１受容体
に特異的に結合し活性化するか否かを決定する方法を提供する。実施態様の一つ
では、第２メッセンジャー反応は塩素イオンチャンネル活性化を含み、そして第
２メッセンジャーの変化は内向き塩素流のレベル増加である。
【０１２１】 本発明は、元来は哺乳動物ＭＣＨ１受容体を発現していないが、２メッセンジ
ャー反応を生じ且つその細胞表面上に哺乳動物ＭＣＨ１受容体を発現している細
胞に、哺乳動物ＭＣＨ１受容体活性化の好適条件下に、化合物及び哺乳動物ＭＣ
Ｈ１受容体を活性化することが既知である第２化合物の両方、ならびに第２化合
物とだけ別々に接触せしめること、そして第２化合物のみ存在する条件、及び第
２化合物と化合物の両方が存在する条件下に第２メッセンジャー反応を測定する
ことを含み、化合物及び第２化合物の両方が存在する場合の第２メッセンジャー
反応の変化が第２化合物のみ存在する場合の同変化に比べ小さいことが、化合物
が哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害することを示す、化合物が哺乳動物Ｍ
ＣＨ１受容体に特異的に結合し且つ活性化を阻害するかどうかを決定する方法を
提供する。実施態様の一つでは、第２メッセンジャー反応は塩素イオンチャンネ
ル活性化を含み、そして第２メッセンジャーの変化は第２化合物のみ存在する場
合に比べ化合物及び第２化合物の両方が存在する場合の内向き塩素流のレベル増
加が小さいことである。本発明は更に、第２メッセンジャー反応を生じ、且つ哺
乳動物ＭＣＨ１受容体にてトランスフェクションされそれを発現している細胞か
らの膜調製体を用いジシされる上記方法も提供する。
ャー反応を生じ且つその細胞表面上に哺乳動物ＭＣＨ１受容体を発現している細
胞に、哺乳動物ＭＣＨ１受容体活性化の好適条件下に、化合物及び哺乳動物ＭＣ
Ｈ１受容体を活性化することが既知である第２化合物の両方、ならびに第２化合
物とだけ別々に接触せしめること、そして第２化合物のみ存在する条件、及び第
２化合物と化合物の両方が存在する条件下に第２メッセンジャー反応を測定する
ことを含み、化合物及び第２化合物の両方が存在する場合の第２メッセンジャー
反応の変化が第２化合物のみ存在する場合の同変化に比べ小さいことが、化合物
が哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害することを示す、化合物が哺乳動物Ｍ
ＣＨ１受容体に特異的に結合し且つ活性化を阻害するかどうかを決定する方法を
提供する。実施態様の一つでは、第２メッセンジャー反応は塩素イオンチャンネ
ル活性化を含み、そして第２メッセンジャーの変化は第２化合物のみ存在する場
合に比べ化合物及び第２化合物の両方が存在する場合の内向き塩素流のレベル増
加が小さいことである。本発明は更に、第２メッセンジャー反応を生じ、且つ哺
乳動物ＭＣＨ１受容体にてトランスフェクションされそれを発現している細胞か
らの膜調製体を用いジシされる上記方法も提供する。
【０１２２】 上記方法のある実施態様では、哺乳動物ＭＣＨ１受容体はヒトＭＣＨ１受容体
、又はＭＣＨあるいはその類似体又は相同体により活性化されるヒトＭＣＨ１受
容体の変異体である。別の実施態様では、哺乳動物ＭＣＨ１受容体はラットＭＣ
Ｈ１受容体である。別の実施態様では、哺乳動物ＭＣＨ受容体は、プラスミドｐ
ＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１によりコードされている同一アミノ酸配列を実質的に
含む。別の実施態様では、哺乳動物ＭＣＨ１受容体は、図２に示すもの（配列番
号２）と同一のアミノ酸配列を実質含む。別の実施態様では、哺乳動物ＭＣＨ１
受容体は、図２に示すアミノ酸配列（配列番号２）を含む。細胞は昆虫細胞であ
る。別の実施態様では、細胞は哺乳動物細胞である。別の実施態様では、細胞は
非神経性起源である。別の実施態様では、非神経細胞はＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ
細胞、２９３ヒト胎児腎臓細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、又はＬＭ（ｔｋ−）細胞
である。ある実施態様では、化合物は哺乳動物ＭＣＨ１受容体への結合が従来知
られていない。本発明は又上記方法により決定された化合物も提供する。
、又はＭＣＨあるいはその類似体又は相同体により活性化されるヒトＭＣＨ１受
容体の変異体である。別の実施態様では、哺乳動物ＭＣＨ１受容体はラットＭＣ
Ｈ１受容体である。別の実施態様では、哺乳動物ＭＣＨ受容体は、プラスミドｐ
ＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１によりコードされている同一アミノ酸配列を実質的に
含む。別の実施態様では、哺乳動物ＭＣＨ１受容体は、図２に示すもの（配列番
号２）と同一のアミノ酸配列を実質含む。別の実施態様では、哺乳動物ＭＣＨ１
受容体は、図２に示すアミノ酸配列（配列番号２）を含む。細胞は昆虫細胞であ
る。別の実施態様では、細胞は哺乳動物細胞である。別の実施態様では、細胞は
非神経性起源である。別の実施態様では、非神経細胞はＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ
細胞、２９３ヒト胎児腎臓細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、又はＬＭ（ｔｋ−）細胞
である。ある実施態様では、化合物は哺乳動物ＭＣＨ１受容体への結合が従来知
られていない。本発明は又上記方法により決定された化合物も提供する。
【０１２３】 本発明は、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性を増加させるのに有効である上記方
法にて決定された哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニストのある量と、医薬品として
受け入れ可能なキャリアーとを含む医薬組成物も提供する。実施態様の一つでは
、哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニストは従来知られていない。
法にて決定された哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニストのある量と、医薬品として
受け入れ可能なキャリアーとを含む医薬組成物も提供する。実施態様の一つでは
、哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニストは従来知られていない。
【０１２４】 本発明は、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性を減少させるのに有効である上記方
法にて決定された哺乳動物ＭＣＨ１受容体アンタゴニストのある量と、医薬品と
して受け入れ可能なキャリアーとを含む医薬組成物も提供する。実施態様の一つ
では、哺乳動物ＭＣＨ１受容体アンタゴニストは従来知られていない。
法にて決定された哺乳動物ＭＣＨ１受容体アンタゴニストのある量と、医薬品と
して受け入れ可能なキャリアーとを含む医薬組成物も提供する。実施態様の一つ
では、哺乳動物ＭＣＨ１受容体アンタゴニストは従来知られていない。
【０１２５】 本発明は以下を含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体を活性化することが未知である
複数の化合物をスクリーニングし、哺乳動物ＭＣＨ１受容体を活性化する化合物
を同定する方法を提供する：（ａ）哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化が可能な条
件下に、哺乳動物ＭＣＨ１受容体がトランスフェクションされそれを発現してい
る細胞に、哺乳動物ＭＣＨ１受容体を活性化することが未知である複数の化合物
を接触せしめること；（ｂ）哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性が化合物存在下に増
加するかどうかを決定すること；及び増加した場合に（ｃ）前記複数の化合物中
に含まれる各化合物によって哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化が増加するか個別
に決定し、それにより哺乳動物ＭＣＨ１受容体を活性化する化合物を同定するこ
と。実施態様の一つでは、哺乳動物ＭＣＨ１受容体はヒトＭＣＨ１受容体、又は
ＭＣＨあるいはその類似体又は相同体により活性化されるヒトＭＣＨ１受容体の
変異体である。別の実施態様では、哺乳動物ＭＣＨ１受容体はラットＭＣＨ１受
容体である。
複数の化合物をスクリーニングし、哺乳動物ＭＣＨ１受容体を活性化する化合物
を同定する方法を提供する：（ａ）哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化が可能な条
件下に、哺乳動物ＭＣＨ１受容体がトランスフェクションされそれを発現してい
る細胞に、哺乳動物ＭＣＨ１受容体を活性化することが未知である複数の化合物
を接触せしめること；（ｂ）哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性が化合物存在下に増
加するかどうかを決定すること；及び増加した場合に（ｃ）前記複数の化合物中
に含まれる各化合物によって哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化が増加するか個別
に決定し、それにより哺乳動物ＭＣＨ１受容体を活性化する化合物を同定するこ
と。実施態様の一つでは、哺乳動物ＭＣＨ１受容体はヒトＭＣＨ１受容体、又は
ＭＣＨあるいはその類似体又は相同体により活性化されるヒトＭＣＨ１受容体の
変異体である。別の実施態様では、哺乳動物ＭＣＨ１受容体はラットＭＣＨ１受
容体である。
【０１２６】 本発明は以下を含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害することが未知
である複数の化合物をスクリーニングし、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化を阻
害する化合物を同定する方法を提供する：（ａ）哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性
化を可能にする条件下に、哺乳動物ＭＣＨ１受容体がトランスフェクションされ
それを発現している細胞に、既知哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニスト存在下に複
数の化合物を接触せしめること；（ｂ）複数化合物非存在下に於ける哺乳動物Ｍ
ＣＨ１受容体の活性化に比べ、複数の化合物の存在下に哺乳動物ＭＣＨ１受容体
の活性が減少するかどうかを決定すること；及び減少する場合に（ｃ）前記複数
の化合物中に含まれるそれぞれの化合物について哺乳動物ＭＣＨ１受容体活性化
の阻害を別々に決定し、それにより哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する
化合物を同定すること。実施態様の一つでは、哺乳動物ＭＣＨ１受容体はヒトＭ
ＣＨ１受容体、又はＭＣＨあるいはその類似体又は相同体により活性化されるヒ
トＭＣＨ１受容体の変異体である。別の実施態様では、哺乳動物ＭＣＨ１受容体
はラットＭＣＨ１受容体である。
である複数の化合物をスクリーニングし、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化を阻
害する化合物を同定する方法を提供する：（ａ）哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性
化を可能にする条件下に、哺乳動物ＭＣＨ１受容体がトランスフェクションされ
それを発現している細胞に、既知哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニスト存在下に複
数の化合物を接触せしめること；（ｂ）複数化合物非存在下に於ける哺乳動物Ｍ
ＣＨ１受容体の活性化に比べ、複数の化合物の存在下に哺乳動物ＭＣＨ１受容体
の活性が減少するかどうかを決定すること；及び減少する場合に（ｃ）前記複数
の化合物中に含まれるそれぞれの化合物について哺乳動物ＭＣＨ１受容体活性化
の阻害を別々に決定し、それにより哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する
化合物を同定すること。実施態様の一つでは、哺乳動物ＭＣＨ１受容体はヒトＭ
ＣＨ１受容体、又はＭＣＨあるいはその類似体又は相同体により活性化されるヒ
トＭＣＨ１受容体の変異体である。別の実施態様では、哺乳動物ＭＣＨ１受容体
はラットＭＣＨ１受容体である。
【０１２７】 上記方法の実施態様の一つでは、細胞は哺乳動物細胞である。別の実施態様で
は、細胞は非神経性起源である。別の実施態様では、非神経細胞はＣＯＳ−７細
胞、２９３ヒト胎児腎臓細胞、ＬＭ（ｔｋ−）細胞又はＮＩＨ−３Ｔ３細胞であ
る。
は、細胞は非神経性起源である。別の実施態様では、非神経細胞はＣＯＳ−７細
胞、２９３ヒト胎児腎臓細胞、ＬＭ（ｔｋ−）細胞又はＮＩＨ−３Ｔ３細胞であ
る。
【０１２８】 本発明は、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性増加に有効であると上記方法により
同定された化合物と医薬品として受け入れ可能なキャリアーとを含む医薬組成物
を提供する。
同定された化合物と医薬品として受け入れ可能なキャリアーとを含む医薬組成物
を提供する。
【０１２９】 本発明は更に、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性低下に有効であると上記方法に
より同定された化合物と医薬品として受け入れ可能なキャリアーとを含む医薬組
成物も提供する。
より同定された化合物と医薬品として受け入れ可能なキャリアーとを含む医薬組
成物も提供する。
【０１３０】 本発明は更にアフリカツメガエル卵細胞発現システム又はメラノ細胞の様な卵
細胞発現システム中の受容体を測定する方法を提供する。ある実施態様では、受
容体活性化はイオンチャンネル活性の測定により決定される。別の実施態様では
、受容体活性化はエコーリン発光により測定される。
細胞発現システム中の受容体を測定する方法を提供する。ある実施態様では、受
容体活性化はイオンチャンネル活性の測定により決定される。別の実施態様では
、受容体活性化はエコーリン発光により測定される。
【０１３１】 アフリカツメガエル卵細胞に於ける遺伝子発現は当分野公知であり（Ｃｌｏｅ
ｍａｎｍＡ．，１９８４；Ｍａｓｕ、Ｙら、１９９４）、未変性ｍＲＮＡ又はイ
ンビトロ合成されたｍＲＮＡのカエル卵細胞へのマイクロインジェクションを利
用して実施される。インビトロ合成されたｍＲＮＡの調製は、ｍＣＡＰ ＲＮＡ
マッピングキット（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））によるＴ７ポ
リメラーゼの利用を含む各種標準的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）によ
り実施できる。
ｍａｎｍＡ．，１９８４；Ｍａｓｕ、Ｙら、１９９４）、未変性ｍＲＮＡ又はイ
ンビトロ合成されたｍＲＮＡのカエル卵細胞へのマイクロインジェクションを利
用して実施される。インビトロ合成されたｍＲＮＡの調製は、ｍＣＡＰ ＲＮＡ
マッピングキット（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））によるＴ７ポ
リメラーゼの利用を含む各種標準的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）によ
り実施できる。
【０１３２】 本発明は、異常の治療に有効な哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニストである化合
物の量を被験者に投与することを含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化上昇に
より緩和される被験者の異常を治療する方法を提供する。別の実施態様では、異
常はステロイド又は脳下垂体ホルモン障害、エピネフィリン放出障害、胃腸管障
害、心臓血管病、電解質平衡障害、高血圧、糖尿病、呼吸器障害、喘息、生殖機
能障害、免疫障害、内分泌障害、筋肉骨格系障害、神経内分泌障害、意識障害、
アルツハイマー病の様な記憶障害、感覚変調及び伝達障害、運動協調障害、感覚
統合障害、運動統合障害、パーキンソン病の様なドパーミン性機能障害、感覚伝
達障害、味覚障害、交感神経支配障害、抑鬱の様な感情障害、ストレス関連障害
、体液バランス障害、尿失禁の様な排尿障害、心因性発作傷害、疼痛、分裂症の
様な精神病性行動、モルヒネ耐性、オピエート嗜好、又は偏頭痛の制御である。
物の量を被験者に投与することを含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化上昇に
より緩和される被験者の異常を治療する方法を提供する。別の実施態様では、異
常はステロイド又は脳下垂体ホルモン障害、エピネフィリン放出障害、胃腸管障
害、心臓血管病、電解質平衡障害、高血圧、糖尿病、呼吸器障害、喘息、生殖機
能障害、免疫障害、内分泌障害、筋肉骨格系障害、神経内分泌障害、意識障害、
アルツハイマー病の様な記憶障害、感覚変調及び伝達障害、運動協調障害、感覚
統合障害、運動統合障害、パーキンソン病の様なドパーミン性機能障害、感覚伝
達障害、味覚障害、交感神経支配障害、抑鬱の様な感情障害、ストレス関連障害
、体液バランス障害、尿失禁の様な排尿障害、心因性発作傷害、疼痛、分裂症の
様な精神病性行動、モルヒネ耐性、オピエート嗜好、又は偏頭痛の制御である。
【０１３３】 本発明は、異常の治療に有効な哺乳動物ＭＣＨ１受容体アンタゴニストである
化合物の量を被験者に投与するを含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性低下によ
り緩和される被験者の異常を治療する方法を提供する。別の実施態様では、異常
はステロイド又は脳下垂体ホルモン障害、エピネフィリン放出障害、胃腸管障害
、心臓血管病、電解質平衡障害、高血圧、糖尿病、呼吸器障害、喘息、生殖機能
障害、免疫障害、内分泌障害、筋肉骨格系障害、神経内分泌障害、意識障害、ア
ルツハイマー病の様な記憶障害、感覚変調及び伝達障害、運動協調障害、感覚統
合障害、運動統合障害、パーキンソン病の様なドパーミン性機能障害、感覚伝達
障害、味覚障害、交感神経支配障害、抑鬱の様な感情障害、ストレス関連障害、
体液バランス障害、尿失禁の様な排尿障害、心因性発作傷害、疼痛、分裂症の様
な精神病性行動、モルヒネ耐性、オピエート嗜好、又は偏頭痛の制御である。
化合物の量を被験者に投与するを含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性低下によ
り緩和される被験者の異常を治療する方法を提供する。別の実施態様では、異常
はステロイド又は脳下垂体ホルモン障害、エピネフィリン放出障害、胃腸管障害
、心臓血管病、電解質平衡障害、高血圧、糖尿病、呼吸器障害、喘息、生殖機能
障害、免疫障害、内分泌障害、筋肉骨格系障害、神経内分泌障害、意識障害、ア
ルツハイマー病の様な記憶障害、感覚変調及び伝達障害、運動協調障害、感覚統
合障害、運動統合障害、パーキンソン病の様なドパーミン性機能障害、感覚伝達
障害、味覚障害、交感神経支配障害、抑鬱の様な感情障害、ストレス関連障害、
体液バランス障害、尿失禁の様な排尿障害、心因性発作傷害、疼痛、分裂症の様
な精神病性行動、モルヒネ耐性、オピエート嗜好、又は偏頭痛の制御である。
【０１３４】 本発明は、哺乳動物受容体に結合し、および／又はその活性を活性化又は阻害
する化合物を同定することに関する本書記載の方法のいずれかを用いて化合物を
同定し、次に化合物、又はその新規構造的及び機能的類似体又は相同体を合成す
ることを含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を作製する方
法を提供する。実施態様の一つでは、哺乳動物ＭＣＨ１受容体はヒトＭＣＨ１受
容体、又はＭＣＨあるいはその類似体又は相同体により活性化されるヒトＭＣＨ
１受容体の変異体である。別の実施態様では、哺乳動物ＭＣＨ１受容体はラット
ＭＣＨ１受容体である。
する化合物を同定することに関する本書記載の方法のいずれかを用いて化合物を
同定し、次に化合物、又はその新規構造的及び機能的類似体又は相同体を合成す
ることを含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を作製する方
法を提供する。実施態様の一つでは、哺乳動物ＭＣＨ１受容体はヒトＭＣＨ１受
容体、又はＭＣＨあるいはその類似体又は相同体により活性化されるヒトＭＣＨ
１受容体の変異体である。別の実施態様では、哺乳動物ＭＣＨ１受容体はラット
ＭＣＨ１受容体である。
【０１３５】 本発明は更に、医薬品として受け入れ可能なキャリアーと哺乳動物ＭＣＨ１受
容体に結合し、および／又はその活性を活性化又は阻害する化合物、及びその機
能的類似体又は相同体を同定することに関しここに記載された方法の何れかによ
り同定された化合物の治療有効量とを含む組成物を調製する工程を提供する。実
施態様の一つでは、哺乳動物ＭＣＨ１受容体はヒトＭＣＨ１受容体、又はＭＣＨ
あるいはその類似体又は相同体により活性化されるヒトＭＣＨ１受容体の変異体
である。別の実施態様では、哺乳動物ＭＣＨ１受容体はラットＭＣＨ１受容体で
ある。
容体に結合し、および／又はその活性を活性化又は阻害する化合物、及びその機
能的類似体又は相同体を同定することに関しここに記載された方法の何れかによ
り同定された化合物の治療有効量とを含む組成物を調製する工程を提供する。実
施態様の一つでは、哺乳動物ＭＣＨ１受容体はヒトＭＣＨ１受容体、又はＭＣＨ
あるいはその類似体又は相同体により活性化されるヒトＭＣＨ１受容体の変異体
である。別の実施態様では、哺乳動物ＭＣＨ１受容体はラットＭＣＨ１受容体で
ある。
【０１３６】 本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体活性をコードするＤＮＡがトランスフェクショ
ンされ且つそれを発現している細胞を、ヒトＭＣＨ１受容体の活性化が可能な条
件の下、既知ヒトＭＣＨ１受容体アゴニスト存在下に化合物と接触させること、
そしてヒトＭＣＨ１受容体活性の減少を検出し、それにより化合物がヒトヒトＭ
ＣＨ１受容体アゴニストであるかを決定することを含み、前記ヒトＭＣＨ１受容
体をコードするＤＮＡが図１（配列番号１）に示す、又はプラスミドｐＥＸＪ．
ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる配列を含むもの
であり、前記既知ヒトＭＣＨ１受容体アゴニストがＭＣＨ又はＭＣＨの相同体あ
るいは類似体であり、そして前記細胞がトランスフェクション前にはＭＣＨ１受
容体を発現していない、化合物がヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストであるかを
決定する工程を提供する。
ンされ且つそれを発現している細胞を、ヒトＭＣＨ１受容体の活性化が可能な条
件の下、既知ヒトＭＣＨ１受容体アゴニスト存在下に化合物と接触させること、
そしてヒトＭＣＨ１受容体活性の減少を検出し、それにより化合物がヒトヒトＭ
ＣＨ１受容体アゴニストであるかを決定することを含み、前記ヒトＭＣＨ１受容
体をコードするＤＮＡが図１（配列番号１）に示す、又はプラスミドｐＥＸＪ．
ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる配列を含むもの
であり、前記既知ヒトＭＣＨ１受容体アゴニストがＭＣＨ又はＭＣＨの相同体あ
るいは類似体であり、そして前記細胞がトランスフェクション前にはＭＣＨ１受
容体を発現していない、化合物がヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストであるかを
決定する工程を提供する。
【０１３７】 本発明はまた、通常はヒトＭＣＨ１受容体を発現しておらず、そしてヒトＭＣ
Ｈ１受容体をコードするＤＮＡが図１（配列番号１）に示す配列又はプラスミド
ｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれている
配列を含み、且つその表面にヒトＭＣＨ１受容体を発現し、さらにヒトＭＣＨ１
受容体の活性化により第２メッセンジャー反応を生じる細胞に、ヒトＭＣＨ１受
容体の活性化好適条件下に、化合物及びヒトＭＣＨ１受容体を活性化することが
既知である第２化合物の両方、及び第２化合物のみと接触させること、さらに第
２化合物のみ存在する場合と第２化合物と化合物の両方が存在する場合の第２メ
ッセンジャー反応を測定することを含み、第２化合物のみ存在する場合に比べ化
合物と第２化合物の両方が存在する場合の第２メッセンジャー反応の変化が小さ
いことが化合物がヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害すること示し、且つ前記の
第２化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体あるいは類似体である、化合物がヒトＭ
ＣＨ１受容体に特異的に結合し、その活性化を阻害するかどうかを決定する工程
を提供する。 本発明は、以下を含むヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する化合物を同定す
ることを目的とした、ヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害することについて未知
である複数の化合物をスクリーニングする方法を提供する： （ａ）ヒトＭＣＨ１受容体でトランスフェクションされ、それを発現している
細胞にあって、通常はヒトＭＣＨ１受容体、及び図１（配列番号１）に示す配列
又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）
に含まれる配列を含むヒトＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡを発現していない
細胞に、ヒトＭＣＨ１受容体の活性化が可能な条件下に、ＭＣＨ又はＭＣＨの相
同体あるいは類似体である既知ヒトＭＣＨ１受容体アゴニスト存在下に複数の化
合物と接触させること； （ｂ）複数の化合物が存在しない状態でのヒトＭＣＨ１受容体の活性化に比べ
、複数の化合物が存在する状態でのヒトＭＣＨ１受容体の活性化が低下するかど
うかを決定すること；及びもし低下する場合 （ｃ）複数の化合物の中に含まれる各化合物について、ヒトＭＣＨ１受容体の
活性化の阻害の程度を個別に決定し、それによりヒトＭＣＨ１受容体の活性化を
阻害する化合物を同定すること。
Ｈ１受容体をコードするＤＮＡが図１（配列番号１）に示す配列又はプラスミド
ｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれている
配列を含み、且つその表面にヒトＭＣＨ１受容体を発現し、さらにヒトＭＣＨ１
受容体の活性化により第２メッセンジャー反応を生じる細胞に、ヒトＭＣＨ１受
容体の活性化好適条件下に、化合物及びヒトＭＣＨ１受容体を活性化することが
既知である第２化合物の両方、及び第２化合物のみと接触させること、さらに第
２化合物のみ存在する場合と第２化合物と化合物の両方が存在する場合の第２メ
ッセンジャー反応を測定することを含み、第２化合物のみ存在する場合に比べ化
合物と第２化合物の両方が存在する場合の第２メッセンジャー反応の変化が小さ
いことが化合物がヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害すること示し、且つ前記の
第２化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体あるいは類似体である、化合物がヒトＭ
ＣＨ１受容体に特異的に結合し、その活性化を阻害するかどうかを決定する工程
を提供する。 本発明は、以下を含むヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する化合物を同定す
ることを目的とした、ヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害することについて未知
である複数の化合物をスクリーニングする方法を提供する： （ａ）ヒトＭＣＨ１受容体でトランスフェクションされ、それを発現している
細胞にあって、通常はヒトＭＣＨ１受容体、及び図１（配列番号１）に示す配列
又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）
に含まれる配列を含むヒトＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡを発現していない
細胞に、ヒトＭＣＨ１受容体の活性化が可能な条件下に、ＭＣＨ又はＭＣＨの相
同体あるいは類似体である既知ヒトＭＣＨ１受容体アゴニスト存在下に複数の化
合物と接触させること； （ｂ）複数の化合物が存在しない状態でのヒトＭＣＨ１受容体の活性化に比べ
、複数の化合物が存在する状態でのヒトＭＣＨ１受容体の活性化が低下するかど
うかを決定すること；及びもし低下する場合 （ｃ）複数の化合物の中に含まれる各化合物について、ヒトＭＣＨ１受容体の
活性化の阻害の程度を個別に決定し、それによりヒトＭＣＨ１受容体の活性化を
阻害する化合物を同定すること。
【０１３８】 上記方法の実施態様の一つでは、細胞は昆虫細胞である。別の実施態様では、
細胞は哺乳動物細胞である。更に別の実施態様では哺乳動物細胞は非神経起源で
ある。更に別の実施態様では、細胞はＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、２９３ヒト
胚腎臓細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、マウスＹ１細胞又はＬＭ（ｔｋ−）細胞であ
る。
細胞は哺乳動物細胞である。更に別の実施態様では哺乳動物細胞は非神経起源で
ある。更に別の実施態様では、細胞はＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、２９３ヒト
胚腎臓細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、マウスＹ１細胞又はＬＭ（ｔｋ−）細胞であ
る。
【０１３９】 本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定すること、及
び次にその化合物またはその構造的及び機能的類似体又は相同体を合成すること
を含むヒトＭＣＨ１受容体へ特異的に結合する組成物の製造方法において、ヒト
ＭＣＨ１受容体をその細胞表面に発現している細胞を、両化合物の結合に好適な
条件の下に化合物及び受容体への結合が既知である第２化合物の両方、及び別個
に第二化合物のみと接触させること、及びヒトＭＣＨ１受容体への化合物の特異
的結合の強さを検出することを含み、化合物の存在下におけるヒトＭＣＨ１受容
体への第２化合物の結合低下は該化合物がヒトＭＣＨ１受容体に結合することを
示している競合結合を含む方法により前記化合物がヒトＭＣＨ１受容体への結合
として同定され、前記細胞が通常ヒトＭＣＨ１受容体を発現しておらず、ヒトＭ
ＣＨ１受容体が図１に示す配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−
ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる配列を含む核酸により
コードされており、且つ第２化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体あるいは類似体
である製造方法を提供する。
び次にその化合物またはその構造的及び機能的類似体又は相同体を合成すること
を含むヒトＭＣＨ１受容体へ特異的に結合する組成物の製造方法において、ヒト
ＭＣＨ１受容体をその細胞表面に発現している細胞を、両化合物の結合に好適な
条件の下に化合物及び受容体への結合が既知である第２化合物の両方、及び別個
に第二化合物のみと接触させること、及びヒトＭＣＨ１受容体への化合物の特異
的結合の強さを検出することを含み、化合物の存在下におけるヒトＭＣＨ１受容
体への第２化合物の結合低下は該化合物がヒトＭＣＨ１受容体に結合することを
示している競合結合を含む方法により前記化合物がヒトＭＣＨ１受容体への結合
として同定され、前記細胞が通常ヒトＭＣＨ１受容体を発現しておらず、ヒトＭ
ＣＨ１受容体が図１に示す配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−
ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる配列を含む核酸により
コードされており、且つ第２化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体あるいは類似体
である製造方法を提供する。
【０１４０】 本発明は更に、ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定すること
、次にその化合物又はその構造的及び機能的類似体又は相同体を合成することを
含むヒトＭＣＨ１受容体へ特異的に結合する組成物の製造方法において、ヒトＭ
ＣＨ１受容体をその細胞表面に発現している細胞に由来する膜調製体を、両化合
物の結合に好適な条件の下、化合物及び受容体への結合が既知である第二化合物
の両方、及び別個に第二化合物のみと接触させること、及びヒトＭＣＨ１受容体
への化合物の特異的結合の強さを検出することを含み、化合物の存在下における
ヒトＭＣＨ１受容体への第二化合物の結合の低下は該化合物がヒトＭＣＨ１受容
体に結合することを示している競合結合を含む方法により前記化合物がヒトＭＣ
Ｈ１受容体への結合として同定され、そして前記細胞が通常ヒトＭＣＨ１受容体
を発現しておらず、ヒトＭＣＨ１受容体が図１に示す配列（配列番号１）又はプ
ラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含ま
れる配列を含む核酸によりコードされており、且つ第２化合物がＭＣＨ又はＭＣ
Ｈの相同体あるいは類似体である製造方法を提供する。
、次にその化合物又はその構造的及び機能的類似体又は相同体を合成することを
含むヒトＭＣＨ１受容体へ特異的に結合する組成物の製造方法において、ヒトＭ
ＣＨ１受容体をその細胞表面に発現している細胞に由来する膜調製体を、両化合
物の結合に好適な条件の下、化合物及び受容体への結合が既知である第二化合物
の両方、及び別個に第二化合物のみと接触させること、及びヒトＭＣＨ１受容体
への化合物の特異的結合の強さを検出することを含み、化合物の存在下における
ヒトＭＣＨ１受容体への第二化合物の結合の低下は該化合物がヒトＭＣＨ１受容
体に結合することを示している競合結合を含む方法により前記化合物がヒトＭＣ
Ｈ１受容体への結合として同定され、そして前記細胞が通常ヒトＭＣＨ１受容体
を発現しておらず、ヒトＭＣＨ１受容体が図１に示す配列（配列番号１）又はプ
ラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含ま
れる配列を含む核酸によりコードされており、且つ第２化合物がＭＣＨ又はＭＣ
Ｈの相同体あるいは類似体である製造方法を提供する。
【０１４１】 本発明はまた、ヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストである化合物を同定するこ
と、及び次にその化合物またはその構造的及び機能的類似体又は相同体を合成す
ることを含む、ヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストである組成物の製造方法にお
いて、ヒトＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡによりトランスフェクションされ
且つそれを発現している細胞に、化合物の結合に好適な条件の下、既知ヒトＭＣ
Ｈ１受容体アゴニスト存在下に化合物と接触させること、そしてヒトＭＣＨ１受
容体活性の低下を検出し、それにより化合物がヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニス
トであることを決定する方法によって前記化合物がヒトＭＣＨ１受容体アンタゴ
ニストとして同定され、前記細胞が通常ヒトＭＣＨ１受容体を発現しておらず、
ヒトＭＣＨ１受容体は図１に示す配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．
ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる配列を含む核酸
によりコードされ、且つ第２化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体あるいは類似体
であるところの製造方法も提供する。
と、及び次にその化合物またはその構造的及び機能的類似体又は相同体を合成す
ることを含む、ヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストである組成物の製造方法にお
いて、ヒトＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡによりトランスフェクションされ
且つそれを発現している細胞に、化合物の結合に好適な条件の下、既知ヒトＭＣ
Ｈ１受容体アゴニスト存在下に化合物と接触させること、そしてヒトＭＣＨ１受
容体活性の低下を検出し、それにより化合物がヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニス
トであることを決定する方法によって前記化合物がヒトＭＣＨ１受容体アンタゴ
ニストとして同定され、前記細胞が通常ヒトＭＣＨ１受容体を発現しておらず、
ヒトＭＣＨ１受容体は図１に示す配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．
ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる配列を含む核酸
によりコードされ、且つ第２化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体あるいは類似体
であるところの製造方法も提供する。
【０１４２】 本発明は更にまた、ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合しこれを阻害する化合
物を同定すること、及び次にその化合物またはその構造的及び機能的類似体又は
相同体を合成することを含む、ヒトＭＣＨ１受容体合に特異的に結合し、且つそ
の活性化を阻害する組成物の製造方法において、通常はヒトＭＣＨ１受容体を発
現しておらず、且つヒトＭＣＨ１受容体が図１に示す（配列番号１）又はプラス
ミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる
配列を含む核酸によりコードされている、その細胞表面にヒトＭＣＨ１受容体を
発現しヒトＭＣＨ１受容体活性化により第２メッセンジャーを産生する細胞を、
ヒトＭＣＨ１受容体発現に好適な条件の下、化合物及びＭＣＨ１受容体を活性化
することが既知である第２化合物の両方、及び第２化合物のみと別々に接触させ
こと、及び第２化合物のみが存在する状態と第２化合物及び化合物の両方が存在
する状態にて第２メッセンジャー反応を測定することを含み、且つ第２化合物の
み存在する場合に比べ化合物と第２化合物の両方が存在する場合の第２メッセン
ジャー反応の方が小さいことが、化合物がヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害す
ることを示し、前記第２化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体又は類似体である方
法により前記化合物がヒトＭＣＨ１受容体に結合し且つその活性化を阻害するも
として同定される製造方法も提供する。実施態様の一つでは第２メッセンジャー
反応は塩素イオンチャンネル活性化を含み、第２メッセンジャー反応の変化は、
第２化合物のみ存在する場合に比べ、化合物と第２化合物の両方が存在する場合
の内向き塩素イオン流の増加レベルがより小さいことである。
物を同定すること、及び次にその化合物またはその構造的及び機能的類似体又は
相同体を合成することを含む、ヒトＭＣＨ１受容体合に特異的に結合し、且つそ
の活性化を阻害する組成物の製造方法において、通常はヒトＭＣＨ１受容体を発
現しておらず、且つヒトＭＣＨ１受容体が図１に示す（配列番号１）又はプラス
ミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる
配列を含む核酸によりコードされている、その細胞表面にヒトＭＣＨ１受容体を
発現しヒトＭＣＨ１受容体活性化により第２メッセンジャーを産生する細胞を、
ヒトＭＣＨ１受容体発現に好適な条件の下、化合物及びＭＣＨ１受容体を活性化
することが既知である第２化合物の両方、及び第２化合物のみと別々に接触させ
こと、及び第２化合物のみが存在する状態と第２化合物及び化合物の両方が存在
する状態にて第２メッセンジャー反応を測定することを含み、且つ第２化合物の
み存在する場合に比べ化合物と第２化合物の両方が存在する場合の第２メッセン
ジャー反応の方が小さいことが、化合物がヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害す
ることを示し、前記第２化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体又は類似体である方
法により前記化合物がヒトＭＣＨ１受容体に結合し且つその活性化を阻害するも
として同定される製造方法も提供する。実施態様の一つでは第２メッセンジャー
反応は塩素イオンチャンネル活性化を含み、第２メッセンジャー反応の変化は、
第２化合物のみ存在する場合に比べ、化合物と第２化合物の両方が存在する場合
の内向き塩素イオン流の増加レベルがより小さいことである。
【０１４３】 本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定すること、及
び次にキャリアーと化合物、又はその構造的及び機能的類似体又は相同体とを混
合すること含む組成物調製方法において、その細胞表面上にヒトＭＣＨ１受容体
を発現している細胞に、両化合物の結合にとって好適である条件下にて化合物及
び受容体との結合が既知である第２化合物の両方、ならびに独立に第２化合物の
みと接触せしめること、及びヒトＭＣＨ１受容体への特異的結合の強さを検出す
ることを含み、化合物の存在下におけるヒトＭＣＨ１受容体への第２化合物の結
合低下は該化合物がヒトＭＣＨ１受容体に結合することを示している競合結合を
含む方法により、前記化合物がヒトＭＣＨ１受容体に結合するものとして同定さ
れる、前記細胞が通常はヒトＭＣＨ１受容体を発現しておらず、ヒトＭＣＨ１受
容体が図１に示す配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３
１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる配列によってコードされており
、且つ第２化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体あるいは類似体である製造方法を
提供する。
び次にキャリアーと化合物、又はその構造的及び機能的類似体又は相同体とを混
合すること含む組成物調製方法において、その細胞表面上にヒトＭＣＨ１受容体
を発現している細胞に、両化合物の結合にとって好適である条件下にて化合物及
び受容体との結合が既知である第２化合物の両方、ならびに独立に第２化合物の
みと接触せしめること、及びヒトＭＣＨ１受容体への特異的結合の強さを検出す
ることを含み、化合物の存在下におけるヒトＭＣＨ１受容体への第２化合物の結
合低下は該化合物がヒトＭＣＨ１受容体に結合することを示している競合結合を
含む方法により、前記化合物がヒトＭＣＨ１受容体に結合するものとして同定さ
れる、前記細胞が通常はヒトＭＣＨ１受容体を発現しておらず、ヒトＭＣＨ１受
容体が図１に示す配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３
１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる配列によってコードされており
、且つ第２化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体あるいは類似体である製造方法を
提供する。
【０１４４】 本発明は更に、ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定すること
、及び次にキャリアーと化合物、又はその構造的及び機能的類似体又は相同体と
を混合すること含む組成物調製方法において、その細胞表面上にヒトＭＣＨ１受
容体を発現している細胞に由来する膜調製体と、両化合物の結合にとって好適で
ある条件下に化合物及び受容体との結合が既知である第２化合物の両方、ならび
に独立に第２化合物のみと接触せしめること、及びヒトＭＣＨ１受容体への特異
的結合の強さを検出することを含み、化合物の存在下におけるヒトＭＣＨ１受容
体への第２化合物の結合低下は買い化合物がヒトＭＣＨ１受容体に結合すること
を示している競合結合を含む方法により、前記化合物がヒトＭＣＨ１受容体に結
合するものとして同定される、前記細胞が通常はヒトＭＣＨ１受容体を発現して
おらず、ヒトＭＣＨ１受容体が図１に示す配列（配列番号１）又はプラスミドｐ
ＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる配列に
よってコードされており、且つ第２化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体あるいは
類似体である方法を提供する。
、及び次にキャリアーと化合物、又はその構造的及び機能的類似体又は相同体と
を混合すること含む組成物調製方法において、その細胞表面上にヒトＭＣＨ１受
容体を発現している細胞に由来する膜調製体と、両化合物の結合にとって好適で
ある条件下に化合物及び受容体との結合が既知である第２化合物の両方、ならび
に独立に第２化合物のみと接触せしめること、及びヒトＭＣＨ１受容体への特異
的結合の強さを検出することを含み、化合物の存在下におけるヒトＭＣＨ１受容
体への第２化合物の結合低下は買い化合物がヒトＭＣＨ１受容体に結合すること
を示している競合結合を含む方法により、前記化合物がヒトＭＣＨ１受容体に結
合するものとして同定される、前記細胞が通常はヒトＭＣＨ１受容体を発現して
おらず、ヒトＭＣＨ１受容体が図１に示す配列（配列番号１）又はプラスミドｐ
ＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる配列に
よってコードされており、且つ第２化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体あるいは
類似体である方法を提供する。
【０１４５】 本発明はまた、ヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストである化合物を同定するこ
と、及び次にキャリアーと化合物、又はそのその構造的及び機能的類似体又は相
同体とを混合すること含む組成物調製方法において、既知ヒトＭＣＨ１受容体を
コードしているＤＮＡによりトランスフェクションされ且つそのＤＮＡを発現し
ている細胞に、既知ヒトＭＣＩ受容体アゴニスト存在下、ヒトＭＣＨ１受容体の
活性化を可能にする条件の下化合物を接触せしめ、そして既知ヒトＭＣＨ１受容
体活性の減少を検出し、それにより化合物がヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニスト
であることを決定することを含む方法により前記化合物がヒトＭＣＨ１受容体ア
ンアゴニストとして同定される、前記細胞が通常はヒトＭＣＨ１受容体を発現し
ておらず、またヒトＭＣＨ１受容体が図１に示す配列（配列番号１）又はプラス
ミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる
配列によってコードされており、且つ既知ヒト受容体アゴニストがＭＣＨ又はＭ
ＣＨの相同体あるいは類似体である、調製方法も提供する。
と、及び次にキャリアーと化合物、又はそのその構造的及び機能的類似体又は相
同体とを混合すること含む組成物調製方法において、既知ヒトＭＣＨ１受容体を
コードしているＤＮＡによりトランスフェクションされ且つそのＤＮＡを発現し
ている細胞に、既知ヒトＭＣＩ受容体アゴニスト存在下、ヒトＭＣＨ１受容体の
活性化を可能にする条件の下化合物を接触せしめ、そして既知ヒトＭＣＨ１受容
体活性の減少を検出し、それにより化合物がヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニスト
であることを決定することを含む方法により前記化合物がヒトＭＣＨ１受容体ア
ンアゴニストとして同定される、前記細胞が通常はヒトＭＣＨ１受容体を発現し
ておらず、またヒトＭＣＨ１受容体が図１に示す配列（配列番号１）又はプラス
ミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる
配列によってコードされており、且つ既知ヒト受容体アゴニストがＭＣＨ又はＭ
ＣＨの相同体あるいは類似体である、調製方法も提供する。
【０１４６】 本発明は更に、ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合し、その活性化を阻害する
化合物を同定すること、及び次にキャリアーと化合物、又はその構造的及び機能
的類似体又は相同体とを混合すること含む組成物調製法において、その細胞表面
上にヒトＭＣＨ１受容体を発現し、ヒトＭＣＨ１受容体の活性化により第２メッ
センジャー反応を生じる細胞であり、且つ通常はヒトＭＣＨ１受容体を発現して
おらず、前記ヒトＭＣＨ１受容体が図１に示す配列（配列番号１）又はプラスミ
ドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる配
列によってコードされている細胞に、ヒトＭＣＨ１受容体の活性化に好適な条件
の下、化合物及びヒトＭＣＨ１受容体を活性化することが既知である第２化合物
の両方、及び第２化合物のみを別個に接触せしめること、及び第２化合物のみ存
在する場合と第２化合物及び化合物の両方が存在する場合について第２メッセン
ジャー反応を測定することを含み、第２化合物のみ存在する場合に比べ化合物及
び第２化合物が共に存在する場合の変化がより小さいことが、化合物がヒトＭＣ
Ｈ１受容体の活性化を阻害することを示し、前記第２化合物がＭＣＨまたはＭＣ
Ｈの相同体あるいは類似体である方法により、前記化合物がヒトＭＣＨ１受容体
に結合し、その活性化を阻害するものとして同定される、組成物調製方法を提供
する。実施態様の一つでは第２メッセンジャー反応は塩素イオンチャンネル活性
化を含み、第２メッセンジャー反応の変化は、第２化合物のみ存在する場合に比
べ、化合物と第２化合物の両方が存在する場合の内向き塩素イオン流の増加レベ
ルがより小さいことである。
化合物を同定すること、及び次にキャリアーと化合物、又はその構造的及び機能
的類似体又は相同体とを混合すること含む組成物調製法において、その細胞表面
上にヒトＭＣＨ１受容体を発現し、ヒトＭＣＨ１受容体の活性化により第２メッ
センジャー反応を生じる細胞であり、且つ通常はヒトＭＣＨ１受容体を発現して
おらず、前記ヒトＭＣＨ１受容体が図１に示す配列（配列番号１）又はプラスミ
ドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる配
列によってコードされている細胞に、ヒトＭＣＨ１受容体の活性化に好適な条件
の下、化合物及びヒトＭＣＨ１受容体を活性化することが既知である第２化合物
の両方、及び第２化合物のみを別個に接触せしめること、及び第２化合物のみ存
在する場合と第２化合物及び化合物の両方が存在する場合について第２メッセン
ジャー反応を測定することを含み、第２化合物のみ存在する場合に比べ化合物及
び第２化合物が共に存在する場合の変化がより小さいことが、化合物がヒトＭＣ
Ｈ１受容体の活性化を阻害することを示し、前記第２化合物がＭＣＨまたはＭＣ
Ｈの相同体あるいは類似体である方法により、前記化合物がヒトＭＣＨ１受容体
に結合し、その活性化を阻害するものとして同定される、組成物調製方法を提供
する。実施態様の一つでは第２メッセンジャー反応は塩素イオンチャンネル活性
化を含み、第２メッセンジャー反応の変化は、第２化合物のみ存在する場合に比
べ、化合物と第２化合物の両方が存在する場合の内向き塩素イオン流の増加レベ
ルがより小さいことである。
【０１４７】 上記方法の実施態様の一つでは、細胞は昆虫細胞である。別の実施態様では、
細胞は哺乳動物細胞である。更に別の実施態様では哺乳動物細胞は非神経起源で
ある。更に別の実施態様では、細胞はＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胚腎臓細胞、
ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、マウスＹ１細胞又はＬＭ（ｔｋ−）細胞であ
る。
細胞は哺乳動物細胞である。更に別の実施態様では哺乳動物細胞は非神経起源で
ある。更に別の実施態様では、細胞はＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胚腎臓細胞、
ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、マウスＹ１細胞又はＬＭ（ｔｋ−）細胞であ
る。
【０１４８】 即ち、標的となる受容体サブタイプに関する遺伝子がクローン化されると、そ
れはレシピエント細胞内に入れられ、続いてそれはその表面に標的受容体サブタ
イプを発現する。標的となるヒト受容体サブタイプの単一集団を発現するこの細
胞は次に継代され、細胞株が確立される。薬物発見システムを構成するこの細胞
株は２つの異なるアッセイ：結合アッセイ及び機能アッセイに利用される。結合
アッセイでは、特定の薬物発見プログラムの標的である受容体サブタイプと副作
用と関連するであろう別の受容体サプタイプの両方に関する化合物の親和性が測
定される。この測定により、化合物の効力を推測し、また別の受容体サブタイプ
に比較した化合物の標的受容体サブタイプに対する選択性の強さを推測すること
ができる。結合アッセイから得られたデータによって化学者は、最適治療有効量
にとって、適切なものとして、当該サブタイプの１つまたは複数に対して、また
はそれらとは別に化合物を設計できるようにする。機能アッセイでは、化合物に
対する受容体サブタイプの反応の性質が決定される。機能アッセイのデータは、
化合物が受容体サブタイプに作用し、その活性を阻害または促進するかを示し、
これにより薬理学者は彼らの目的とするヒト受容体サブタイプ標的に於いて化合
物を迅速に評価でき、化学者は既存薬物に比べより効果的であり、また副作用が
殆どないか、又は実質低い薬物を合理的に設計することができる。
れはレシピエント細胞内に入れられ、続いてそれはその表面に標的受容体サブタ
イプを発現する。標的となるヒト受容体サブタイプの単一集団を発現するこの細
胞は次に継代され、細胞株が確立される。薬物発見システムを構成するこの細胞
株は２つの異なるアッセイ：結合アッセイ及び機能アッセイに利用される。結合
アッセイでは、特定の薬物発見プログラムの標的である受容体サブタイプと副作
用と関連するであろう別の受容体サプタイプの両方に関する化合物の親和性が測
定される。この測定により、化合物の効力を推測し、また別の受容体サブタイプ
に比較した化合物の標的受容体サブタイプに対する選択性の強さを推測すること
ができる。結合アッセイから得られたデータによって化学者は、最適治療有効量
にとって、適切なものとして、当該サブタイプの１つまたは複数に対して、また
はそれらとは別に化合物を設計できるようにする。機能アッセイでは、化合物に
対する受容体サブタイプの反応の性質が決定される。機能アッセイのデータは、
化合物が受容体サブタイプに作用し、その活性を阻害または促進するかを示し、
これにより薬理学者は彼らの目的とするヒト受容体サブタイプ標的に於いて化合
物を迅速に評価でき、化学者は既存薬物に比べより効果的であり、また副作用が
殆どないか、又は実質低い薬物を合理的に設計することができる。
【０１４９】 受容体サブタイプ選択的化合物を設計し、合成する方法は良く知られており、
また共にコンピューター支援分子モデリングにより支えられている従来の医薬化
学及びより新しい技術であるコンビナトリアル化学を含む。この様な方法と共に
、化学者及び薬理学者は標的とする受容体サブタイプの構造及び受容体サブタイ
プへの結合及び／又はその活性の活性化または阻害が決定されている化合物の構
造に関する彼らの知識を利用して、これら受容体サブタイプに於いて活性を有す
るであろう構造体を設計し、合成する。
また共にコンピューター支援分子モデリングにより支えられている従来の医薬化
学及びより新しい技術であるコンビナトリアル化学を含む。この様な方法と共に
、化学者及び薬理学者は標的とする受容体サブタイプの構造及び受容体サブタイ
プへの結合及び／又はその活性の活性化または阻害が決定されている化合物の構
造に関する彼らの知識を利用して、これら受容体サブタイプに於いて活性を有す
るであろう構造体を設計し、合成する。
【０１５０】 コンビナトリアル化学は、化学的構築体ブロックの各種組合せを使い、それら
を組み立てることによる各種新規化合物の自動合成を含む。コンビナトリアル化
学の利用は、化合物作製のプロセスを大きく促進する。得られた化合物の並びは
ライブラリーと呼ばれ、問題の受容体に於いて十分なレベルの活性を示す化合物
（「誘導化合物」）のスクリーニングに利用される。コンビナトリアル化学を利
用することで、所望の標的受容体に対しより偏向している化合物の「絞り込まれ
た」ライブラリーを合成することができる。
を組み立てることによる各種新規化合物の自動合成を含む。コンビナトリアル化
学の利用は、化合物作製のプロセスを大きく促進する。得られた化合物の並びは
ライブラリーと呼ばれ、問題の受容体に於いて十分なレベルの活性を示す化合物
（「誘導化合物」）のスクリーニングに利用される。コンビナトリアル化学を利
用することで、所望の標的受容体に対しより偏向している化合物の「絞り込まれ
た」ライブラリーを合成することができる。
【０１５１】 コンビナトリアル化学又は従来の医薬化学等を利用して誘導化合物が同定され
た後は、化学構造体及び生物学的又は機能的活性との間の相関性の理解を促進す
るために各種相同体及び類似体が調製される。これら研究は構造活性相関を規定
し、次にこれを利用して改良された効力、選択性及び薬物動態特性を持つ薬物が
設計される。コンビナトリアル化学は、誘導体最適化を目的とした各種構造の迅
速作製にも利用される。１度に１種類の化合物を合成することを含む従来の医薬
化学もまた、更に洗練された、自動化技術では達成できない化合物の作製に利用
される。この様に薬物が規定されると、製薬及び化学工業を通じ利用される標準
的化学製造法を利用して製造スケールが拡大される。
た後は、化学構造体及び生物学的又は機能的活性との間の相関性の理解を促進す
るために各種相同体及び類似体が調製される。これら研究は構造活性相関を規定
し、次にこれを利用して改良された効力、選択性及び薬物動態特性を持つ薬物が
設計される。コンビナトリアル化学は、誘導体最適化を目的とした各種構造の迅
速作製にも利用される。１度に１種類の化合物を合成することを含む従来の医薬
化学もまた、更に洗練された、自動化技術では達成できない化合物の作製に利用
される。この様に薬物が規定されると、製薬及び化学工業を通じ利用される標準
的化学製造法を利用して製造スケールが拡大される。
【０１５２】 本発明は以下の実験の詳細により、よりよく理解されるであろう。しかし、当
業者は、論じられる具体的方法及び結果が、以下に続くクレーム内により完全に
記載されている発明の単なる例示であることを容易に認識するであろう。
業者は、論じられる具体的方法及び結果が、以下に続くクレーム内により完全に
記載されている発明の単なる例示であることを容易に認識するであろう。
【０１５３】
材料と方法 ヒトＭＣＨ１受容体のクローニング ＦＢ４１ａに対するＧＥＮＥＭＢＬ相同体の中からの発現配列タグ（ＥＳＴ） Ｆ０７２２８の発見 ＧＥＮＥＭＢＬのＢＬＳＡＴ検索を、検索源としてシナプティック製薬（Ｓｙ
ｎａｐｔｉｃ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）所有
配列であるＦＢ４１ａを用い、ＧＣＧ配列分析パッケージ（ジェネティックスコ
ンピューターグループ、マジソン、ウイスコンシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏ
ｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））を利用して実施した。そ
の結果ＦＢ４１ａ及びソマトスタチン、オピエート及びガラニン受容体に対し高
い相同性を持つＥＳＴ（受付番号Ｆ０７２２８）が特定された。
ｎａｐｔｉｃ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）所有
配列であるＦＢ４１ａを用い、ＧＣＧ配列分析パッケージ（ジェネティックスコ
ンピューターグループ、マジソン、ウイスコンシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏ
ｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））を利用して実施した。そ
の結果ＦＢ４１ａ及びソマトスタチン、オピエート及びガラニン受容体に対し高
い相同性を持つＥＳＴ（受付番号Ｆ０７２２８）が特定された。
【０１５４】 ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーの構築とスクリーニング ポリＡ＋ＲＮＡは、ヒト海馬ＲＮＡ（クローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）
）より、ＦａｓｔＴｒａｃｋキット（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
、Ｃｏｒｐ））を利用して精製された。ＤＳ−ｃＤＮＡは若干の改良を加えたＧ
ｕｂｌｅｒとＨｏｆｆｍａｎ（１９８３）の方法に従いポリＡ＋ＲＮＡから合成
された。得られたｃＤＮＡはＢｓｔＸＩアダプター（インビトロゲン社）に連結
され、過剰なアダプターは排除カラムクロマトグラフィーにて取り除かれた。分
子量選別されたｄｓ−ｃＤＮＡの中の高分子分画を、ＢｓｔＸＩ及びその他追加
の制限部位を含む用にｐｃＥＸＶ（ＭｉｌｌｅｒとＧｅｒｍａｉｎ、１９８６）
を改変したＯｋａｙａｍａとＢｅｒｇ発現ベクターであるｐＥＸＪ．ＢＳに連結
した。合計２．２×１０６の平均挿入サイズ３．０ｋｂの独立クローンが作製さ
れた。ライブラリーは寒天プレート上に培養され（アンピシリン選択）、５００
０独立クローンの４５０プールのグリセロールストックが調製された。一次グリ
セロールストックは約１０のグループにまとめられ、スーパープールも作られた
。
）より、ＦａｓｔＴｒａｃｋキット（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
、Ｃｏｒｐ））を利用して精製された。ＤＳ−ｃＤＮＡは若干の改良を加えたＧ
ｕｂｌｅｒとＨｏｆｆｍａｎ（１９８３）の方法に従いポリＡ＋ＲＮＡから合成
された。得られたｃＤＮＡはＢｓｔＸＩアダプター（インビトロゲン社）に連結
され、過剰なアダプターは排除カラムクロマトグラフィーにて取り除かれた。分
子量選別されたｄｓ−ｃＤＮＡの中の高分子分画を、ＢｓｔＸＩ及びその他追加
の制限部位を含む用にｐｃＥＸＶ（ＭｉｌｌｅｒとＧｅｒｍａｉｎ、１９８６）
を改変したＯｋａｙａｍａとＢｅｒｇ発現ベクターであるｐＥＸＪ．ＢＳに連結
した。合計２．２×１０６の平均挿入サイズ３．０ｋｂの独立クローンが作製さ
れた。ライブラリーは寒天プレート上に培養され（アンピシリン選択）、５００
０独立クローンの４５０プールのグリセロールストックが調製された。一次グリ
セロールストックは約１０のグループにまとめられ、スーパープールも作られた
。
【０１５５】 ＭＣＨ１の完全長配列のクローニング ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーからのスーパープール及び一次プールのグリセ
ロールストックを、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイム、イン
ディアナポリス、インディアナ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉ
ｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、及び以下のＰＣＲプロトコールを用いたＰ０
７２２８特異的プライマーＴ５７９及びＴ５８０によるＰＣＲを用いスクリーニ
ングした：９４℃５分間維持：９４℃２分間、６８℃４分間を４０サイクル；６
８℃７分間維持、サンプルをゲルにかけるまで４℃に保存。陽性であった１個の
一次プール４９０を更にサブプールに分割し、一晩ＬＢ培地上で増幅させ、プラ
イマーＴ５７９及び５８０を使ったＰＣＲによりスクリーニングした。陽性サブ
プールの１つである４９０−４−１０−２３を寒天プレート上に播き（アンピシ
リン選別）、コロニーをニトロセルロース膜（シュライヒャーアンドシュール社
、キーネ、ニューハンプシャ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ
、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ））に移した。フィルターを２日間、高厳密性条件下に１０ ６ ｃｐｍ／ｍｌのＦ０７２２８ＥＳＴ配列に対し設計された３２Ｐ標識ｃＤＮＡ
プローブ、Ｔ５８１でハイブリダイズした。フィルターは洗浄され、Ｂｉｏｍａ
ｘ ＭＳフィルム（コダック社（Ｋｏｄａｋ））に感光させた。７個の陽性コロ
ニーを拾い上げ、ＬＢ−ＡＭＰプレートに線条接種し、一晩増殖した。元の７個
のコロニーそれぞれから２個の独立したコロニーを取り上げ、ベクターＴ９５と
Ｔ５８０及びＴ９４とＴ５７９のプライマー対を用いベクターアンカードＰＣＲ
にかけた。１個の陽性コロニーＧ１をＴＢ中にて一晩増殖し、プラスミド精製に
かけた。このプラスミドはＴＬ２３０と命名され、配列決定キット（ＵＳバイオ
ケミカル、クリーブランド、オハイオ（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｃｌｅ
ｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏ））にて両方の鎖について配列決定された。ヌクレオチ
ド及びペプチド配列分析は、ＧＣＧプログラム（ジェネティックス コンピュー
ターグループ、マジソン、ウイスコンシン）を用い実施された。ＴＬ２３０のＨ
ｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩ断片を哺乳動物発現ベクターｐＥＸＪ内にサブクローニ
ングされ、ＴＬ２３１と命名された。
ロールストックを、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイム、イン
ディアナポリス、インディアナ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉ
ｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、及び以下のＰＣＲプロトコールを用いたＰ０
７２２８特異的プライマーＴ５７９及びＴ５８０によるＰＣＲを用いスクリーニ
ングした：９４℃５分間維持：９４℃２分間、６８℃４分間を４０サイクル；６
８℃７分間維持、サンプルをゲルにかけるまで４℃に保存。陽性であった１個の
一次プール４９０を更にサブプールに分割し、一晩ＬＢ培地上で増幅させ、プラ
イマーＴ５７９及び５８０を使ったＰＣＲによりスクリーニングした。陽性サブ
プールの１つである４９０−４−１０−２３を寒天プレート上に播き（アンピシ
リン選別）、コロニーをニトロセルロース膜（シュライヒャーアンドシュール社
、キーネ、ニューハンプシャ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ
、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ））に移した。フィルターを２日間、高厳密性条件下に１０ ６ ｃｐｍ／ｍｌのＦ０７２２８ＥＳＴ配列に対し設計された３２Ｐ標識ｃＤＮＡ
プローブ、Ｔ５８１でハイブリダイズした。フィルターは洗浄され、Ｂｉｏｍａ
ｘ ＭＳフィルム（コダック社（Ｋｏｄａｋ））に感光させた。７個の陽性コロ
ニーを拾い上げ、ＬＢ−ＡＭＰプレートに線条接種し、一晩増殖した。元の７個
のコロニーそれぞれから２個の独立したコロニーを取り上げ、ベクターＴ９５と
Ｔ５８０及びＴ９４とＴ５７９のプライマー対を用いベクターアンカードＰＣＲ
にかけた。１個の陽性コロニーＧ１をＴＢ中にて一晩増殖し、プラスミド精製に
かけた。このプラスミドはＴＬ２３０と命名され、配列決定キット（ＵＳバイオ
ケミカル、クリーブランド、オハイオ（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｃｌｅ
ｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏ））にて両方の鎖について配列決定された。ヌクレオチ
ド及びペプチド配列分析は、ＧＣＧプログラム（ジェネティックス コンピュー
ターグループ、マジソン、ウイスコンシン）を用い実施された。ＴＬ２３０のＨ
ｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩ断片を哺乳動物発現ベクターｐＥＸＪ内にサブクローニ
ングされ、ＴＬ２３１と命名された。
【０１５６】 プライマー及びプローブ： ＴＬ５７９：５’−ＧＧＧＡＡＣＴＣＣＡＣＧＧＴＣＡＴＣＴＴＣＧＣＧＧＴ
−３’（配列番号５） ＴＬ５８０：５’−ＴＡＧＣＧＧＴＣＡＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＣＧＧＴＣＡＧ
−３’（配列番号６） ＴＬ５８１：５’−ＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＡＴＧＡＴＣＣＡ
ＣＣＡＧＣＴＣＡＴＧＧＧＣＡＡＴＧＧＧ−３’（配列番号７） ＴＬ９４：５’−ＣＴＴＣＴＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＧＧＡＡＧＴＧＴＴＡ−３
’（配列番号８） ＴＬ９５：５’−ＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＣＣＡＡＡＣＴＣＡＴＣＡＡＴＧ
−３’（配列番号９） ＴＬ２３１（ヒトＭＣＨ１）の種相同体の断片の分離 ＴＬ２３１の種相同体の断片を得るためには、種ゲノムＤＮＡ（クローンテッ
ク）をＴＬ２３１のＴＭ域の一つに対応する前向きＰＣＲプライマーと、ＴＬ２
３１の別のＴＭ領域に対応する逆方向プライマーを使い増幅される。ＰＣＲはイ
クスパンドロングテンプレートＰＣＲシステム（Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅ
ｍｐｌａｔｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ）（ベーリンガーマンハイム）を使い、例
えばそれぞれ９４℃５分間と６８℃７分間の前及び後インキュベーションを行う
９４℃３０秒間、５０℃１．５分間、６８℃１．５分間、４０サイクルの条件の
下実施された。バンドが分離され、ＴＡクローニングキット（インビトロゲン社
）を使いサブクローニングされ、配列決定される。配列はＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３
７７ ＢｉｇＤｙｅターミネーターサイクルシークエンシングキット配列分析装
置にかけられ、配列決定される。この配列に対し前向き及び逆方向ＰＣＲプライ
マーを設計し、これを利用して例えばそれぞれ９４℃５分間と６８℃５分間の前
及び後インキュベーションを伴う９４℃３０秒間、６８℃１．５分間、３５サイ
クルの条件のでゲノムＤＮＡからバンドを増幅した。ＰＣＲ産物はＴＡクローニ
ングキット（インビトロゲン社）を使いサブクローニングされる。形質転換体の
ミニプレップ培養体を調製し、上記同様にして配列決定される。
−３’（配列番号５） ＴＬ５８０：５’−ＴＡＧＣＧＧＴＣＡＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＣＧＧＴＣＡＧ
−３’（配列番号６） ＴＬ５８１：５’−ＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＡＴＧＡＴＣＣＡ
ＣＣＡＧＣＴＣＡＴＧＧＧＣＡＡＴＧＧＧ−３’（配列番号７） ＴＬ９４：５’−ＣＴＴＣＴＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＧＧＡＡＧＴＧＴＴＡ−３
’（配列番号８） ＴＬ９５：５’−ＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＣＣＡＡＡＣＴＣＡＴＣＡＡＴＧ
−３’（配列番号９） ＴＬ２３１（ヒトＭＣＨ１）の種相同体の断片の分離 ＴＬ２３１の種相同体の断片を得るためには、種ゲノムＤＮＡ（クローンテッ
ク）をＴＬ２３１のＴＭ域の一つに対応する前向きＰＣＲプライマーと、ＴＬ２
３１の別のＴＭ領域に対応する逆方向プライマーを使い増幅される。ＰＣＲはイ
クスパンドロングテンプレートＰＣＲシステム（Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅ
ｍｐｌａｔｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ）（ベーリンガーマンハイム）を使い、例
えばそれぞれ９４℃５分間と６８℃７分間の前及び後インキュベーションを行う
９４℃３０秒間、５０℃１．５分間、６８℃１．５分間、４０サイクルの条件の
下実施された。バンドが分離され、ＴＡクローニングキット（インビトロゲン社
）を使いサブクローニングされ、配列決定される。配列はＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３
７７ ＢｉｇＤｙｅターミネーターサイクルシークエンシングキット配列分析装
置にかけられ、配列決定される。この配列に対し前向き及び逆方向ＰＣＲプライ
マーを設計し、これを利用して例えばそれぞれ９４℃５分間と６８℃５分間の前
及び後インキュベーションを伴う９４℃３０秒間、６８℃１．５分間、３５サイ
クルの条件のでゲノムＤＮＡからバンドを増幅した。ＰＣＲ産物はＴＡクローニ
ングキット（インビトロゲン社）を使いサブクローニングされる。形質転換体の
ミニプレップ培養体を調製し、上記同様にして配列決定される。
【０１５７】 ＴＬ２３１の完全長種相同体（ヒトＭＣＨ１）の分離 ＭＣＨ１受容体をコードしている核酸は、以下簡単に記述された様な標準的分
子生物学的技術と方法を用い、分離されるであろう。
子生物学的技術と方法を用い、分離されるであろう。
【０１５８】 方法＃１：完全長ＭＣＨ１受容体を得るために、コスミッドライブラリーが３ ２ Ｐ−標識オリゴヌクレオチドプローブでスクリーグされるであろう。
【０１５９】 完全長配列は、このコスミッドクローンを追加の配列決定用プライマーを使い
配列決定することで得られるであろう。この領域にはイントロンが１つ存在して
いるため、通常の分子生物学的技術を利用しｃＤＮＡより完全長の無イントロン
遺伝子が得られるであろう。例えば５’ＵＴ中に設計された前向きＰＣＲプライ
マーと３’ＵＴ内に設計された逆方向ＰＣＲプライマーを用い、ｃＮＤＡより完
全長の無イントロン遺伝子が増幅されるであろう。標準的分子生物学技術は、こ
の遺伝子を哺乳動物発現ベクター内にサブクローニングするのに利用できるであ
ろう。
配列決定することで得られるであろう。この領域にはイントロンが１つ存在して
いるため、通常の分子生物学的技術を利用しｃＤＮＡより完全長の無イントロン
遺伝子が得られるであろう。例えば５’ＵＴ中に設計された前向きＰＣＲプライ
マーと３’ＵＴ内に設計された逆方向ＰＣＲプライマーを用い、ｃＮＤＡより完
全長の無イントロン遺伝子が増幅されるであろう。標準的分子生物学技術は、こ
の遺伝子を哺乳動物発現ベクター内にサブクローニングするのに利用できるであ
ろう。
【０１６０】 方法＃２：標準的分子生物学技術を利用し、高厳密条件下に３２Ｐ標識オリゴ
ヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーションにより市販のｃＤＮＡファ
ージライブラリーをスクリーニングすることができるであろう。ラムダライブラ
リーから精製されたクローンのプラークを得て、次にダイレクトＤＮＡシークエ
ンシングにかけることで完全長ＭＣＨ１受容体を分離できるであろう。あるいは
、標準的分子生物学技術を用い、ＭＣＨ１配列に対するプライマーを利用したラ
イブラリープールのＰＣＲ増幅することで自前のｃＤＮＡプラスミドライブラリ
ーをスクリーニングすることができる。完全長クローンは、３２Ｐ標識オリゴヌ
クレオチドプローブを用いた陽性プールをサザンハイブリダイゼーションしてコ
ロニーリフトすることで分離することができるであろう。
ヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーションにより市販のｃＤＮＡファ
ージライブラリーをスクリーニングすることができるであろう。ラムダライブラ
リーから精製されたクローンのプラークを得て、次にダイレクトＤＮＡシークエ
ンシングにかけることで完全長ＭＣＨ１受容体を分離できるであろう。あるいは
、標準的分子生物学技術を用い、ＭＣＨ１配列に対するプライマーを利用したラ
イブラリープールのＰＣＲ増幅することで自前のｃＤＮＡプラスミドライブラリ
ーをスクリーニングすることができる。完全長クローンは、３２Ｐ標識オリゴヌ
クレオチドプローブを用いた陽性プールをサザンハイブリダイゼーションしてコ
ロニーリフトすることで分離することができるであろう。
【０１６１】 方法＃３：更に別の方法として、３’及び５’ＲＡＣＥを利用してＭＣＨ１の
追加配列を含むＭＣＨ１を発現するｃＤＮＡからＰＣＲ産物を作製することがで
きる。次にこれらＲＡＣＥのＰＣＲ産物を配列決定し、消失配列を決定すること
ができる。次にこの新規配列を利用し、５’ＵＴ内に前向きＰＣＲプライマーを
、そして３’ＵＴ内に逆方向プライマーを設計することができる。次にこれらプ
ライマーを利用し、ｃＤＮＡより完全長ＭＣＨ１クローンを増幅することができ
るであろう。
追加配列を含むＭＣＨ１を発現するｃＤＮＡからＰＣＲ産物を作製することがで
きる。次にこれらＲＡＣＥのＰＣＲ産物を配列決定し、消失配列を決定すること
ができる。次にこの新規配列を利用し、５’ＵＴ内に前向きＰＣＲプライマーを
、そして３’ＵＴ内に逆方向プライマーを設計することができる。次にこれらプ
ライマーを利用し、ｃＤＮＡより完全長ＭＣＨ１クローンを増幅することができ
るであろう。
【０１６２】 ヒトＭＣＨ１変異体の構築 プラスミドＴＬ２３１はフレーム内に３個のメチオニン残基をコードしており
、その何れかがＭＣＨ１受容体の翻訳を開始させることができると考えられる。
これら残基が異種発現システム内にて機能する能力は、メチオニン下流にある１
又はそれ以上のメチオニン残基がアラニンに変異しているＴＬ２３１の突然変異
体を構築することで検証される。突然変異導入はクイックチェンジ（Ｑｕｉｃｋ
Ｃｈａｎｇｅ）部位特異的変異導入キット（ストラタジーン社）を用い実施され
た。５０ｕｌのＰＣＲ反応液にはそれぞれ、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの（Ｎ
Ｈ４）２ＳＯ４、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、２ｍＭのＭｇＳ
Ｏ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１ｍｇ／ｍｌの無ヌクレアー
ゼＢＳＡ，各１１４ｎｇの２種類の変異誘導プライマー（以下参照）、５０ｎｇ
のプラスミド鋳型ＤＮＡ（以下参照）、２．５単位のＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡポ
リメラーゼ、及びキット内に提供されたｄＮＴＰ混合体１ｕｌが含まれていた。
サーモサイクリングは以下のサイクリングパラメータを用いアプライドバイオシ
ステム（Ａｐｐｌｉｅｄバイオシステムス）９７００装置にて実施された：９５
℃３０秒１サイクル；９５℃３０秒、５５℃１分、６８℃２．５分を１８サイク
ル；最後に４℃に固定。次にＤｐｎＩ制限酵素を１ｕｌ（１０単位）を変異誘導
反応液に加え、３７℃にて１時間インキュベーションした。この消化体の一部２
ｕｌを用い、変異導入キットが提供した大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞５０ｕｌを
形質転換した。形質転換体を、１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢプレー
ト上、３７℃にて増殖する能力から選別した。一晩インキュベーションしたプレ
ートから得た単一コロニーを用い、ＬＢ−アンピシリンの２ｍｌ培養液を接種胃
し、振盪しながら３７℃にて一晩増殖させた。これら培養体から、キアジェン社
（Ｑｉａｇｅｎ）ミニプレップシステムを用いミニプレップＤＮＡを調製し、自
動配列分析装置にかけた。これにより、所望変異体の確認と、ＭＣＨ１コーディ
ング配列の残り部分の統合ができる。正確に変異導入されたクローンを同定した
後、キアジェンメガプレップカラムを用いて、大規模スケールのＤＮＡプレップ
を調製した。
、その何れかがＭＣＨ１受容体の翻訳を開始させることができると考えられる。
これら残基が異種発現システム内にて機能する能力は、メチオニン下流にある１
又はそれ以上のメチオニン残基がアラニンに変異しているＴＬ２３１の突然変異
体を構築することで検証される。突然変異導入はクイックチェンジ（Ｑｕｉｃｋ
Ｃｈａｎｇｅ）部位特異的変異導入キット（ストラタジーン社）を用い実施され
た。５０ｕｌのＰＣＲ反応液にはそれぞれ、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの（Ｎ
Ｈ４）２ＳＯ４、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、２ｍＭのＭｇＳ
Ｏ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１ｍｇ／ｍｌの無ヌクレアー
ゼＢＳＡ，各１１４ｎｇの２種類の変異誘導プライマー（以下参照）、５０ｎｇ
のプラスミド鋳型ＤＮＡ（以下参照）、２．５単位のＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡポ
リメラーゼ、及びキット内に提供されたｄＮＴＰ混合体１ｕｌが含まれていた。
サーモサイクリングは以下のサイクリングパラメータを用いアプライドバイオシ
ステム（Ａｐｐｌｉｅｄバイオシステムス）９７００装置にて実施された：９５
℃３０秒１サイクル；９５℃３０秒、５５℃１分、６８℃２．５分を１８サイク
ル；最後に４℃に固定。次にＤｐｎＩ制限酵素を１ｕｌ（１０単位）を変異誘導
反応液に加え、３７℃にて１時間インキュベーションした。この消化体の一部２
ｕｌを用い、変異導入キットが提供した大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞５０ｕｌを
形質転換した。形質転換体を、１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢプレー
ト上、３７℃にて増殖する能力から選別した。一晩インキュベーションしたプレ
ートから得た単一コロニーを用い、ＬＢ−アンピシリンの２ｍｌ培養液を接種胃
し、振盪しながら３７℃にて一晩増殖させた。これら培養体から、キアジェン社
（Ｑｉａｇｅｎ）ミニプレップシステムを用いミニプレップＤＮＡを調製し、自
動配列分析装置にかけた。これにより、所望変異体の確認と、ＭＣＨ１コーディ
ング配列の残り部分の統合ができる。正確に変異導入されたクローンを同定した
後、キアジェンメガプレップカラムを用いて、大規模スケールのＤＮＡプレップ
を調製した。
【０１６３】 Ｍ７０Ａ変異体のみをコードするクローンを作製するたの鋳型ＤＮＡはＴＬ２
３１であり、変異誘導プライマーはＲＰ１９２とＲＰ１９３であった。このクロ
ーンはＲ１０６と命名され（配列番号１６）、最初の２つの潜在的開始コドンの
みを含んだ（図１２参照）。Ｍ６Ａ及びＭ７０Ａの両変異体をコードするクロー
ンを得るための鋳型ＤＮＡはＲ１０６であり、変異誘導プライマーはＲＰ１９０
とＲＰ１９１であった。得られたクローンはＲ１１４と命名され（配列番号１７
）、最初の１個の開始コドンのみを含んだ（図１２参照）。
３１であり、変異誘導プライマーはＲＰ１９２とＲＰ１９３であった。このクロ
ーンはＲ１０６と命名され（配列番号１６）、最初の２つの潜在的開始コドンの
みを含んだ（図１２参照）。Ｍ６Ａ及びＭ７０Ａの両変異体をコードするクロー
ンを得るための鋳型ＤＮＡはＲ１０６であり、変異誘導プライマーはＲＰ１９０
とＲＰ１９１であった。得られたクローンはＲ１１４と命名され（配列番号１７
）、最初の１個の開始コドンのみを含んだ（図１２参照）。
【０１６４】 必要に応じて同一の変異誘導技術を利用し、別のメチオニン残基との組合せを
コードする別のＭＣＨ１変異体を構築することができる。変異体Ｍ１Ａは、プラ
イマーＸ１とＸ２を利用し構築できるであろう。この様な変化により第１メチオ
ニンは排除されるが、下流にある２個の残基は保持するであろう。同様に、二重
変異体Ｍ１Ａ、Ｍ７０Ａは、プライマー対Ｘ１／Ｘ２及びＲＰ１９２／ＲＰ１９
３を連続的に利用することで構築できるであろう。これにより、第２メチオニン
のみが未変性で残る遺伝子が構築されるであろう。
コードする別のＭＣＨ１変異体を構築することができる。変異体Ｍ１Ａは、プラ
イマーＸ１とＸ２を利用し構築できるであろう。この様な変化により第１メチオ
ニンは排除されるが、下流にある２個の残基は保持するであろう。同様に、二重
変異体Ｍ１Ａ、Ｍ７０Ａは、プライマー対Ｘ１／Ｘ２及びＲＰ１９２／ＲＰ１９
３を連続的に利用することで構築できるであろう。これにより、第２メチオニン
のみが未変性で残る遺伝子が構築されるであろう。
【０１６５】 ｈＭＣＨ１変態受容体構築体の作製に用いたプライマー： 変異プライマー プライマー配列 Ｒ１０６ ＲＰ１９２ ５’ＣＧＧＣＡＣＴＧＧＣＴＧＧＧＣＧＧＡＣＣＴＧ
ＧＡＡＧＣＣＴＣＧ３’（配列番号１８） Ｍ７０Ａ）ＲＰ１９３ ５’ＣＧＡＧＧＣＴＴＣＣＡＧＧＴＣＣＧＣＣＣＡＧ
ＣＣＡＧＴＧＣＣＧ３’（配列番号１９） Ｒ１１４ ＲＰ１９０ ５’ＡＴＧＴＣＡＧＴＧＧＧＡＧＣＣＧＣＧＡＡＧＡ
ＡＧＧＧＡＧＴＧＧＧ３’（配列番号２０） （Ｍ６Ａ、ＲＰ１９１ ５’ＣＣＣＡＣＴＣＣＣＴＴＣＴＴＣＧＣＧＧＣＴＣ
ＣＣＡＣＴＧＡＣＡＴ３’（配列番号２１） （Ｍ１Ａ Ｘ１ ５’ＴＡＡＴＧＴＧＴＣＴＡＧＧＴＧＧＣＧＴＣＡＧＴＧＧ
ＧＡＧＣＣＡＴＧ３’（配列番号２２） Ｘ２ ５’ＣＡＴＧＧＣＴＣＣＣＡＣＴＧＡＣＧＣＣＡＣＣＴＡＧＡＣＡＣＡ
ＴＴＡ３’（配列番号２３） ヒトＭＣＨ１受容体の短型の構築 ３個ある潜在的開始メチオニンの内最下流だけを発現しているヒトＭＣＨ１受
容体の短型を以下の様にして作製した。ＴＬ２３１をＢＰ１１２２（ＴＬ２３１
内にある第３メチオニンの１０ヌクレオチド上流から始まる前向きプライマーで
あり、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を取り込んでいる）及びＢＢ１１２３（第２膜貫通ド
メイン内にある逆方向プライマー）を用い増幅し、得られた産物をＨｉｎｄＩＩ
Ｉ及びＢｇ１ＩＩＡにて消化した。エクスパンドロングテンプレート（Ｅｘｐａ
ｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ）ＰＣＲシステム（ロシュ漏れキュラーバイ
オケミカルス、インディアナポリス、インディアナ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用い
、次の条件下に実施した：それぞれ９４℃５分間及び６８℃７分間の前−及び後
−インキュベーションと９４℃２０秒、６８℃１分間を４０サイクル。２７０ｂ
ｐの産物をゲル精製し、ＴＬ２３１より得た４ｋｂのＨＩｎｄＩＩＩ／Ｂｇ１Ｉ
Ｉ制限酵素断片に連結した。得られた構築体はＢＯ１２０と命名された（配列番
号２４）。
ＧＡＡＧＣＣＴＣＧ３’（配列番号１８） Ｍ７０Ａ）ＲＰ１９３ ５’ＣＧＡＧＧＣＴＴＣＣＡＧＧＴＣＣＧＣＣＣＡＧ
ＣＣＡＧＴＧＣＣＧ３’（配列番号１９） Ｒ１１４ ＲＰ１９０ ５’ＡＴＧＴＣＡＧＴＧＧＧＡＧＣＣＧＣＧＡＡＧＡ
ＡＧＧＧＡＧＴＧＧＧ３’（配列番号２０） （Ｍ６Ａ、ＲＰ１９１ ５’ＣＣＣＡＣＴＣＣＣＴＴＣＴＴＣＧＣＧＧＣＴＣ
ＣＣＡＣＴＧＡＣＡＴ３’（配列番号２１） （Ｍ１Ａ Ｘ１ ５’ＴＡＡＴＧＴＧＴＣＴＡＧＧＴＧＧＣＧＴＣＡＧＴＧＧ
ＧＡＧＣＣＡＴＧ３’（配列番号２２） Ｘ２ ５’ＣＡＴＧＧＣＴＣＣＣＡＣＴＧＡＣＧＣＣＡＣＣＴＡＧＡＣＡＣＡ
ＴＴＡ３’（配列番号２３） ヒトＭＣＨ１受容体の短型の構築 ３個ある潜在的開始メチオニンの内最下流だけを発現しているヒトＭＣＨ１受
容体の短型を以下の様にして作製した。ＴＬ２３１をＢＰ１１２２（ＴＬ２３１
内にある第３メチオニンの１０ヌクレオチド上流から始まる前向きプライマーで
あり、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を取り込んでいる）及びＢＢ１１２３（第２膜貫通ド
メイン内にある逆方向プライマー）を用い増幅し、得られた産物をＨｉｎｄＩＩ
Ｉ及びＢｇ１ＩＩＡにて消化した。エクスパンドロングテンプレート（Ｅｘｐａ
ｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ）ＰＣＲシステム（ロシュ漏れキュラーバイ
オケミカルス、インディアナポリス、インディアナ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用い
、次の条件下に実施した：それぞれ９４℃５分間及び６８℃７分間の前−及び後
−インキュベーションと９４℃２０秒、６８℃１分間を４０サイクル。２７０ｂ
ｐの産物をゲル精製し、ＴＬ２３１より得た４ｋｂのＨＩｎｄＩＩＩ／Ｂｇ１Ｉ
Ｉ制限酵素断片に連結した。得られた構築体はＢＯ１２０と命名された（配列番
号２４）。
【０１６６】 端部切断型ヒトＭＣＨ１受容体の構築に用いたプライマー： ＢＢ１１２２ ５’−ＴＧＡＣＡＣＴＡＡＧＣＴＴＣＡＣＴＧＧＣＴＧＧＡＴ
ＧＧＡＣＣＴＧＧＡＡＧＣ−３’（配列番号２５） ＢＢ１１２３ ５’−ＧＣＣＣＡＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＴＣＴＡＣ−
３’（配列番号２６） 宿主細胞 異種発現タンパク質の研究には、広範囲の宿主細胞が利用できる。これら細胞
には、Ｃｏｓ−７、ＣＨＯ、ＬＭ（ｔｋ−）、ＨＥＫ２９３等；Ｓｆ９、Ｓｆ２
１等の昆虫細胞株；アフリカツメガエル卵細胞の様な両生類細胞；等が含まれる
が、これに限定されない。
ＧＧＡＣＣＴＧＧＡＡＧＣ−３’（配列番号２５） ＢＢ１１２３ ５’−ＧＣＣＣＡＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＴＣＴＡＣ−
３’（配列番号２６） 宿主細胞 異種発現タンパク質の研究には、広範囲の宿主細胞が利用できる。これら細胞
には、Ｃｏｓ−７、ＣＨＯ、ＬＭ（ｔｋ−）、ＨＥＫ２９３等；Ｓｆ９、Ｓｆ２
１等の昆虫細胞株；アフリカツメガエル卵細胞の様な両生類細胞；等が含まれる
が、これに限定されない。
【０１６７】 ＣＯＳ−７細胞は補給物入りＤＭＥＭ（１０％子ウシ血清、４ｍＭグルタミン
、１００単位／ｍｌのペニシリン／１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン添加
ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）改良型イーグル培地）の入った１５０ｍｍプレ
ート上、３７℃、５％ＣＯ２下に増殖させられる。ＣＯＳ−７細胞の保存プレー
トはトリプシン処理され、３−４日ごとに１：６に分割される。
、１００単位／ｍｌのペニシリン／１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン添加
ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）改良型イーグル培地）の入った１５０ｍｍプレ
ート上、３７℃、５％ＣＯ２下に増殖させられる。ＣＯＳ−７細胞の保存プレー
トはトリプシン処理され、３−４日ごとに１：６に分割される。
【０１６８】 ヒト胚腎臓２９３細胞は、補給物入りＤＭＥＭ（１０％子ウシ血清、４ｍＭグ
ルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン／１００μｇ／ｍｌのストレプトマイ
シン）の入った１５０ｍｍプレート上、３７℃、５％ＣＯ２下に増殖させられる
。２９３細胞の保存プレートはトリプシン処理され、３−４日ごとに１：６に分
割される。
ルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン／１００μｇ／ｍｌのストレプトマイ
シン）の入った１５０ｍｍプレート上、３７℃、５％ＣＯ２下に増殖させられる
。２９３細胞の保存プレートはトリプシン処理され、３−４日ごとに１：６に分
割される。
【０１６９】 マウス繊維芽ＬＭ（５ｋ−）細胞は補給物入りＤＭＥＭ（１０％子ウシ血清、
４ｍＭグルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン／１００μｇ／ｍｌのストレ
プトマイシン添加ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）改良型イーグル培地）の入っ
た１５０ｍｍプレート上、３７℃、５％ＣＯ２下に増殖させられる。ＬＭ（−ｔ
ｋ）細胞の保存プレートはトリプシン処理され、３−４日ごとに１：１０に分割
される。
４ｍＭグルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン／１００μｇ／ｍｌのストレ
プトマイシン添加ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）改良型イーグル培地）の入っ
た１５０ｍｍプレート上、３７℃、５％ＣＯ２下に増殖させられる。ＬＭ（−ｔ
ｋ）細胞の保存プレートはトリプシン処理され、３−４日ごとに１：１０に分割
される。
【０１７０】 チャイニーズハムスタ卵巣（ＣＨＯ）細胞は補給物入りＨＡＭのＦ−１２培地
（１０％子ウシ血清、４ｍＭＬ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン／
１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）の入った１５０ｍｍプレート上、３７
℃、５％ＣＯ２下に増殖させられる。ＣＨＯ細胞の保存プレートはトリプシン処
理され、３−４日ごとに１：８に分割される。
（１０％子ウシ血清、４ｍＭＬ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン／
１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）の入った１５０ｍｍプレート上、３７
℃、５％ＣＯ２下に増殖させられる。ＣＨＯ細胞の保存プレートはトリプシン処
理され、３−４日ごとに１：８に分割される。
【０１７１】 マウス胚繊維芽ＮＩＨ−３細胞は補給物（１０％子ウシ血清、４ｍＭグルタミ
ン、１００単位／ｍｌのペニシリン／１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）
添加物入りダルベッコ改良型イーグル培地（ＤＭＥＭ）の入った１５０ｍｍプレ
ート上、３７℃、５％ＣＯ２下に増殖させられる。ＮＩＨ−３細胞の保存プレー
トはトリプシン処理され、３−４日ごとに１：１５に分割される。
ン、１００単位／ｍｌのペニシリン／１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）
添加物入りダルベッコ改良型イーグル培地（ＤＭＥＭ）の入った１５０ｍｍプレ
ート上、３７℃、５％ＣＯ２下に増殖させられる。ＮＩＨ−３細胞の保存プレー
トはトリプシン処理され、３−４日ごとに１：１５に分割される。
【０１７２】 Ｓｆ９及びＳｆ２１は１０％ウシ胎児血清が添加されたＴＭＮ−ＦＨ培地中、
１５０ｍｍ組織培養皿上、２７℃、無ＣＯ２に単層増殖させられる。ハイファイ
ブ昆虫細胞もまた、Ｌ−グルタミンが補給されたＥｘ−Ｃｅｌｌ ４００ＴＭ培
地中、１５０ｍｍの組織培養皿上、２７℃、無ＣＯ２で増殖させられる。
１５０ｍｍ組織培養皿上、２７℃、無ＣＯ２に単層増殖させられる。ハイファイ
ブ昆虫細胞もまた、Ｌ−グルタミンが補給されたＥｘ−Ｃｅｌｌ ４００ＴＭ培
地中、１５０ｍｍの組織培養皿上、２７℃、無ＣＯ２で増殖させられる。
【０１７３】 幾つかの例では、細胞収率を上げ日常の受容体スクリーニング作業に関し均一
なアッセイ材料の大規模バッチを提供することを目的に、接着単層として増殖す
る細胞株は懸濁培養に転換することができる。
なアッセイ材料の大規模バッチを提供することを目的に、接着単層として増殖す
る細胞株は懸濁培養に転換することができる。
【０１７４】 アフリカツメガエル卵細胞も異種タンパク質の一過的発現の宿主システムとし
て利用することができる。その維持及び利用法は以下の電気生理学的方法に記載
される。
て利用することができる。その維持及び利用法は以下の電気生理学的方法に記載
される。
【０１７５】 一過性発現 研究対象のタンパク質をコードしているＤＮＡは、リン酸カルシウム介在、Ｄ
ＥＡＤ−デキストラン介在、リポソーム介在、ウイルス介在、エレクトロポレー
ション介在、及びマイクロインジェクションによる供与を含む複数の方法により
、各種哺乳動物、昆虫、両生類及びその他細胞株に一過性に発現できるが、これ
ら方法に限定されない。これら方法はそれぞれＤＮＡ、細胞株、そして続いて実
施されるアッセイのタイプに拠り実験パラメータの組合せを最適化する必要があ
る。
ＥＡＤ−デキストラン介在、リポソーム介在、ウイルス介在、エレクトロポレー
ション介在、及びマイクロインジェクションによる供与を含む複数の方法により
、各種哺乳動物、昆虫、両生類及びその他細胞株に一過性に発現できるが、これ
ら方法に限定されない。これら方法はそれぞれＤＮＡ、細胞株、そして続いて実
施されるアッセイのタイプに拠り実験パラメータの組合せを最適化する必要があ
る。
【０１７６】 ＬＭ（−ｔｋ）細胞でのリン酸カルシウム法に関する典型的プロトコールを以
下に記す；接着細胞をトランスフェクション約２４時間前に集め、１００ｍｍ組
織培養更に１−２×１０５細胞／ｃｍ２の密度に再接種し、３７℃、５％ＣＯ２ にて一晩インキュベーションする。ＣａＣｌ２及びＤＮＡの混合液２５０μｌ（
２５０ｍＭＣａＣｌ２中２０μｇＤＮＡ）を５ｍｌのプラスチック製チューブに
加え、２５０ｕｌの２×ＨＢＳ（２５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＫＣｌ、１
．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１２ｍＭのデキストロース、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ
）をゆっくり、攪拌しながら加えた。混合体を２０分間、室温でインキュベーシ
ョンし、ＤＮＡの沈殿を形成させた。次に細胞を完全培地で洗浄し、各プレート
に１０ｍｌの培地を加え、続いてＤＮＡ沈殿を加えた。次に細胞を３７℃、５％
ＣＯ２下に２４ないし４８時間インキュベーションした。
下に記す；接着細胞をトランスフェクション約２４時間前に集め、１００ｍｍ組
織培養更に１−２×１０５細胞／ｃｍ２の密度に再接種し、３７℃、５％ＣＯ２ にて一晩インキュベーションする。ＣａＣｌ２及びＤＮＡの混合液２５０μｌ（
２５０ｍＭＣａＣｌ２中２０μｇＤＮＡ）を５ｍｌのプラスチック製チューブに
加え、２５０ｕｌの２×ＨＢＳ（２５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＫＣｌ、１
．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１２ｍＭのデキストロース、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ
）をゆっくり、攪拌しながら加えた。混合体を２０分間、室温でインキュベーシ
ョンし、ＤＮＡの沈殿を形成させた。次に細胞を完全培地で洗浄し、各プレート
に１０ｍｌの培地を加え、続いてＤＮＡ沈殿を加えた。次に細胞を３７℃、５％
ＣＯ２下に２４ないし４８時間インキュベーションした。
【０１７７】 Ｃｏｓ−７細胞に応用した場合のＤＥＡＥ−デキストラン法に関する典型的プ
ロトコールを以下に記す；トランスフェクションに用いる細胞を、トランスフェ
クション約２４時間前フラスコに分割し、トランスフェクション時に７０−８０
％の集密度にした。簡単に述べると、受容体ＤＮＡ８μｇに８μｇの必要とされ
る追加ＤＮＡ（例えばＧ０タンパク質発現ベクター、レポーター構築体、抗生物
質耐性マーカー、模擬ベクター等）を９ｍｌの完全ＤＥＭＥとＤＥＡＥデキスト
ラン混合体（ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍｌ）に加えた。Ｔ２２５フラスコに接種され
たＣｏｓ−７細胞（準周密度）をＰＢＳで洗浄し、ＤＮＡ混合体を各フラスコに
加えた。細胞を３０分間、３７℃、５％ＣＯ２にてインキュベーションした。イ
ンキュベーション後、８０μＭのクロロキニンを含む完全ＤＭＥＭ３６ｍｌを各
フラスコに加え、更に３時間インキュベーションした。次に培地を吸引し、１０
％ＤＭＳＯを含む完全培地２４ｍｌ中に正確に２分間おいて、更に吸引した。次
に細胞をＰＢＳで２回洗浄し、各フラスコに３０ｍｌの完全ＤＭＥＭを加えた。
次に細胞を一晩インキュベーションした。翌日細胞をトリプシン処理し集め、実
施しするアッセイの型に応じて、随意再度接種した。
ロトコールを以下に記す；トランスフェクションに用いる細胞を、トランスフェ
クション約２４時間前フラスコに分割し、トランスフェクション時に７０−８０
％の集密度にした。簡単に述べると、受容体ＤＮＡ８μｇに８μｇの必要とされ
る追加ＤＮＡ（例えばＧ０タンパク質発現ベクター、レポーター構築体、抗生物
質耐性マーカー、模擬ベクター等）を９ｍｌの完全ＤＥＭＥとＤＥＡＥデキスト
ラン混合体（ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍｌ）に加えた。Ｔ２２５フラスコに接種され
たＣｏｓ−７細胞（準周密度）をＰＢＳで洗浄し、ＤＮＡ混合体を各フラスコに
加えた。細胞を３０分間、３７℃、５％ＣＯ２にてインキュベーションした。イ
ンキュベーション後、８０μＭのクロロキニンを含む完全ＤＭＥＭ３６ｍｌを各
フラスコに加え、更に３時間インキュベーションした。次に培地を吸引し、１０
％ＤＭＳＯを含む完全培地２４ｍｌ中に正確に２分間おいて、更に吸引した。次
に細胞をＰＢＳで２回洗浄し、各フラスコに３０ｍｌの完全ＤＭＥＭを加えた。
次に細胞を一晩インキュベーションした。翌日細胞をトリプシン処理し集め、実
施しするアッセイの型に応じて、随意再度接種した。
【０１７８】 ＣＨＯ細胞に応用した場合のリポソーム伝達トランスフェクションに関する典
型的プロトコールを以下に記す；トランスフェクションに用いる細胞を、トラン
スフェクション約２４時間前フラスコに分割し、トランスフェクション時に７０
−８０％の集密度にした。各種比率で受容体ＤＮＡと必要な追加ＤＮＡ（例えば
Ｇ０タンパク質発現ベクター、レポーター構築体、抗生物質耐性マーカー、模擬
ベクター等）を含んでいる合計１００μｇのＤＮＡを用い、細胞の各７５ｃｍ２ フラスコをトランスフェクションした。リポソーム伝達トランスフェクションは
、メーカー（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮ、ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ
、ＭＤ）の推奨に従い実施された。トランスフェクトされた細胞は、トランスフ
ェクション２４時間後に実施予定のアッセイの条件に従って集められ、用いられ
、又は再接種された。
型的プロトコールを以下に記す；トランスフェクションに用いる細胞を、トラン
スフェクション約２４時間前フラスコに分割し、トランスフェクション時に７０
−８０％の集密度にした。各種比率で受容体ＤＮＡと必要な追加ＤＮＡ（例えば
Ｇ０タンパク質発現ベクター、レポーター構築体、抗生物質耐性マーカー、模擬
ベクター等）を含んでいる合計１００μｇのＤＮＡを用い、細胞の各７５ｃｍ２ フラスコをトランスフェクションした。リポソーム伝達トランスフェクションは
、メーカー（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮ、ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ
、ＭＤ）の推奨に従い実施された。トランスフェクトされた細胞は、トランスフ
ェクション２４時間後に実施予定のアッセイの条件に従って集められ、用いられ
、又は再接種された。
【０１７９】 Ｃｏｓ−７細胞に応用した場合のエレクトロポレーションに関する典型的プロ
トコールを以下に記す；トランスフェクションに用いる細胞を、トランスフェク
ション約２４時間前フラスコに分割し、トランスフェクション時に準集密度にし
た。細胞をトリプシン処理し集め、その増殖培地中に懸濁して細胞数を測定した
。４×１０６細胞を３００μｌのＤＭＥＭに懸濁し、エレクトロポレーションキ
ュベット内に入れた。受容体ＤＮＡ８μｇ及び必要な追加ＤＮＡ８μｇ（例えば
Ｇ０タンパク質発現ベクター、レポーター構築体、抗生物質耐性マーカー、模擬
ベクター等）を細胞懸濁液に加え、キュベットをＢａｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐ
ｕｌｓｅｒに装着し、電気パルスを加えた（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒの設定：電
圧０．２５ｋＶ、電気容量９５０μＦ）。パルスを加えた後、完全培地を各キュ
ベットに加え、懸濁液を無菌チューブに移した。最終濃度が１×１０５細胞／１
００μｌになる様に各チューブに完全培地が加えられた。次に細胞を実施される
アッセイの型に応じて接種された。
トコールを以下に記す；トランスフェクションに用いる細胞を、トランスフェク
ション約２４時間前フラスコに分割し、トランスフェクション時に準集密度にし
た。細胞をトリプシン処理し集め、その増殖培地中に懸濁して細胞数を測定した
。４×１０６細胞を３００μｌのＤＭＥＭに懸濁し、エレクトロポレーションキ
ュベット内に入れた。受容体ＤＮＡ８μｇ及び必要な追加ＤＮＡ８μｇ（例えば
Ｇ０タンパク質発現ベクター、レポーター構築体、抗生物質耐性マーカー、模擬
ベクター等）を細胞懸濁液に加え、キュベットをＢａｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐ
ｕｌｓｅｒに装着し、電気パルスを加えた（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒの設定：電
圧０．２５ｋＶ、電気容量９５０μＦ）。パルスを加えた後、完全培地を各キュ
ベットに加え、懸濁液を無菌チューブに移した。最終濃度が１×１０５細胞／１
００μｌになる様に各チューブに完全培地が加えられた。次に細胞を実施される
アッセイの型に応じて接種された。
【０１８０】 昆虫Ｓｆ９細胞のバキュロウイルス感染に関する異種タンパク質のウイルス伝
達発現に関する典型的なプロトコールを以下記述する。ここに開示された受容体
をコードするＤＮＡのコーディング域は、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ内のポリペプ
チドの５’及び３’ないしコーディング域内配列中にある既存の制限酵素部位ま
たは新たに作られた部位にサブクローニングされる。バキュロウイルスを作製す
るためには、ウイルスＤＮＡ（ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ）０．５μｇとポリペプチ
ドをコードしているＤＮＡ構築体３μｇを２×１０６Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆ
ｒｕｇｉｐｅｒｄａ昆虫Ｓｆ９細胞内に、ファルミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅ
ｎ）（「バキュロウイスル発現ベクターシステム：手順と方法マニュアル（Ｂａ
ｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ：Ｐ
ｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ）」）に概略記載
されている様にカルシウムリン酸による共沈殿によりコトランスフェクションさ
れるであろう。次に細胞を５日間、２７℃にインキュベーションされる。コトラ
ンスフェクションプレートの上清は遠心分離により集められ、組換え体ウイルス
プラークが精製された。細胞にウイルスを感染させ、ウイルスの保存体を調製し
、ウイルス保存体の力価を測定する手順は、ファーミンゲンマニュアルに記載の
通りである。一般にレトロウイルス、シムリキ森林（Ｓｉｍｌｉｋｉ ｆｏｒｅ
ｓｔ）ウイルス及びアデノ−、ヘルペス−、及びワクシニア−ウイルスの様な２
本酸ＤＮＡ等による哺乳動物細胞発現にも同様の原理が適用されるであろう。
達発現に関する典型的なプロトコールを以下記述する。ここに開示された受容体
をコードするＤＮＡのコーディング域は、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ内のポリペプ
チドの５’及び３’ないしコーディング域内配列中にある既存の制限酵素部位ま
たは新たに作られた部位にサブクローニングされる。バキュロウイルスを作製す
るためには、ウイルスＤＮＡ（ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ）０．５μｇとポリペプチ
ドをコードしているＤＮＡ構築体３μｇを２×１０６Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆ
ｒｕｇｉｐｅｒｄａ昆虫Ｓｆ９細胞内に、ファルミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅ
ｎ）（「バキュロウイスル発現ベクターシステム：手順と方法マニュアル（Ｂａ
ｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ：Ｐ
ｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ）」）に概略記載
されている様にカルシウムリン酸による共沈殿によりコトランスフェクションさ
れるであろう。次に細胞を５日間、２７℃にインキュベーションされる。コトラ
ンスフェクションプレートの上清は遠心分離により集められ、組換え体ウイルス
プラークが精製された。細胞にウイルスを感染させ、ウイルスの保存体を調製し
、ウイルス保存体の力価を測定する手順は、ファーミンゲンマニュアルに記載の
通りである。一般にレトロウイルス、シムリキ森林（Ｓｉｍｌｉｋｉ ｆｏｒｅ
ｓｔ）ウイルス及びアデノ−、ヘルペス−、及びワクシニア−ウイルスの様な２
本酸ＤＮＡ等による哺乳動物細胞発現にも同様の原理が適用されるであろう。
【０１８１】 所望のタンパク質をコードするｃＲＮＡのマイクロインジェクションは、アフ
リカツメガエル卵細胞及び培養哺乳動物内に於けるタンパク質機能の研究に有用
である。ｃＲＮＡの調製及びアフリカツメガエル卵細胞内への注射の典型的なプ
ロトコールは、下記電気生理学的の節内に見いだすことができる。
リカツメガエル卵細胞及び培養哺乳動物内に於けるタンパク質機能の研究に有用
である。ｃＲＮＡの調製及びアフリカツメガエル卵細胞内への注射の典型的なプ
ロトコールは、下記電気生理学的の節内に見いだすことができる。
【０１８２】 安定発現 異種ＤＮＡは宿主細胞内に安定して取り込まれることができ、細胞に外来タン
パク質を永続的に発現させる。細胞内にＤＮＡを供与する方法は、一過性発現に
関する上記記述に類似しているが、標的宿主細胞上に薬物耐性を付与するための
補助的遺伝子のコトランスフェクションが必要である。薬剤耐性の付与は、異種
ＤＮＡを取り込んだ哺乳動物細胞を選別し、維持するのに活用できる。耐性遺伝
子の組合せが利用可能であり、ネオマイシン、カナマイシン及び非グロマイシン
がふくまれるが、もとよりこれに限定されない。受容体研究の目的に関しては、
異種受容体タンパク質の安定発現はＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＬＭ（ｔｋ−）等を
含む哺乳動物にて実施されるが、これに限定する必要はない。
パク質を永続的に発現させる。細胞内にＤＮＡを供与する方法は、一過性発現に
関する上記記述に類似しているが、標的宿主細胞上に薬物耐性を付与するための
補助的遺伝子のコトランスフェクションが必要である。薬剤耐性の付与は、異種
ＤＮＡを取り込んだ哺乳動物細胞を選別し、維持するのに活用できる。耐性遺伝
子の組合せが利用可能であり、ネオマイシン、カナマイシン及び非グロマイシン
がふくまれるが、もとよりこれに限定されない。受容体研究の目的に関しては、
異種受容体タンパク質の安定発現はＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＬＭ（ｔｋ−）等を
含む哺乳動物にて実施されるが、これに限定する必要はない。
【０１８３】 細胞膜調製 結合アッセイの場合、トランスフェクトされた細胞の沈査を氷冷された緩衝液
中に懸濁し（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．４）
、７秒間超音波処理されホモジェナイズされる。細胞溶解体は２００×ｇにて５
分間、４℃で遠心分離される。次に上清が４０，０００ｇ、２０分間、４℃にて
遠心分離される。得られた沈査をホモジェナイゼーション緩衝液にて１回洗浄し
、結合緩衝液（放射性リガンド結合に関する方法を見よ）中に懸濁される。タン
パク質濃度は標準物質としてウシ血清アルブミンを用いるＢｒａｄｆｏｒｄ（１
９７６）の方法により決定される。結合アッセイは通常は直ぐに実施されるが、
バッチで膜を調製し、将来の利用に備え液体窒素内に凍結保存することができる
。
中に懸濁し（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．４）
、７秒間超音波処理されホモジェナイズされる。細胞溶解体は２００×ｇにて５
分間、４℃で遠心分離される。次に上清が４０，０００ｇ、２０分間、４℃にて
遠心分離される。得られた沈査をホモジェナイゼーション緩衝液にて１回洗浄し
、結合緩衝液（放射性リガンド結合に関する方法を見よ）中に懸濁される。タン
パク質濃度は標準物質としてウシ血清アルブミンを用いるＢｒａｄｆｏｒｄ（１
９７６）の方法により決定される。結合アッセイは通常は直ぐに実施されるが、
バッチで膜を調製し、将来の利用に備え液体窒素内に凍結保存することができる
。
【０１８４】 放射性リガンド結合アッセイ 細胞は放射性リガンド結合（以下詳述）により、内因性ヒト受容体の存在に関
しスクリーニングされる。ここに開示された内因性ヒト受容体を持たないか、又
は低レベルで持つ細胞に外来性受容体がトランスフェクションされるであろう。
しスクリーニングされる。ここに開示された内因性ヒト受容体を持たないか、又
は低レベルで持つ細胞に外来性受容体がトランスフェクションされるであろう。
【０１８５】 トランスフェクトされた細胞の膜（２０−４０μｇ膜タンパク質）を利用した
ＭＣＨ１結合実験は、５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．４、１０ｍＭのＭｇＣｌ２ 、２μｇ／ｍｌアプロトニン、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ及び５０μｇ／ｍｌのバシ
トラシンから成るインキュベーション緩衝液を用い０．１ｎＭ［１２５Ｉ］Ｐｈ
ｅ１３−Ｔｙｒ１８−ＭＣＨ（ＮＥＮにより別個標識された）を使い実施される
。結合は２５℃にて１時間実施される。インキュベーションは、５％ＰＥＩに前
もって浸漬されたＧＦ／Ｃガラス繊維フィルタ−と０．０１％トリトンＸ−１０
０を含む５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．４を洗浄液として利用する迅速真空濾過
により停止される。いずれの実験でも、非特異的結合は１０μＭの非標識ＭＣＨ
を利用して規定される。
ＭＣＨ１結合実験は、５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．４、１０ｍＭのＭｇＣｌ２ 、２μｇ／ｍｌアプロトニン、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ及び５０μｇ／ｍｌのバシ
トラシンから成るインキュベーション緩衝液を用い０．１ｎＭ［１２５Ｉ］Ｐｈ
ｅ１３−Ｔｙｒ１８−ＭＣＨ（ＮＥＮにより別個標識された）を使い実施される
。結合は２５℃にて１時間実施される。インキュベーションは、５％ＰＥＩに前
もって浸漬されたＧＦ／Ｃガラス繊維フィルタ−と０．０１％トリトンＸ−１０
０を含む５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．４を洗浄液として利用する迅速真空濾過
により停止される。いずれの実験でも、非特異的結合は１０μＭの非標識ＭＣＨ
を利用して規定される。
【０１８６】 機能アッセイ 細胞は機能アッセイ（以下詳述）を利用し、内因性哺乳動物ＭＣＨ１受容体の
存在についてスクリーニングされる。内因性ヒト受容体を持たないか、又は低レ
ベルで持つ細胞は、以下の機能アッセイでの利用のために外来性受容体がトラン
スフェクションされるであろう。
存在についてスクリーニングされる。内因性ヒト受容体を持たないか、又は低レ
ベルで持つ細胞は、以下の機能アッセイでの利用のために外来性受容体がトラン
スフェクションされるであろう。
【０１８７】 受容体の活性化をスクリーニングするためには、様々なアッセイが利用できる
。それらアッセイは、フォスファチジルイノシトール、ｃＡＭＰ、Ｃａ＋＋及び
Ｋ＋に関する従来の測定から、例えばこれら同一第２メッセンジャーを測定する
ものではあるが、より大量処理できる、より一般的である、そしてより高感度に
改良され、または適合されたシステム；例えば代謝性の変化、分化、及び細胞分
裂／増殖といった受容体活性化の結果としてより一般的である細胞事象を報告す
る細胞をベースとしたプラットフォーム；例えば心臓血管、鎮痛性、食欲促進、
抗不安除去、及び鎮静作用を含む、受容体活性化に関係すると思われる複雑な生
理学的又は行動変化をモニターする高次生物アッセイまで含まれる。
。それらアッセイは、フォスファチジルイノシトール、ｃＡＭＰ、Ｃａ＋＋及び
Ｋ＋に関する従来の測定から、例えばこれら同一第２メッセンジャーを測定する
ものではあるが、より大量処理できる、より一般的である、そしてより高感度に
改良され、または適合されたシステム；例えば代謝性の変化、分化、及び細胞分
裂／増殖といった受容体活性化の結果としてより一般的である細胞事象を報告す
る細胞をベースとしたプラットフォーム；例えば心臓血管、鎮痛性、食欲促進、
抗不安除去、及び鎮静作用を含む、受容体活性化に関係すると思われる複雑な生
理学的又は行動変化をモニターする高次生物アッセイまで含まれる。
【０１８８】 環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）アッセイ 受容体伝達環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）形成の促進又は阻害は、哺乳動物ＭＣＨ１
受容体を発現している細胞にてアッセイされるであろう。細胞は９６ウエル型プ
レートに播かれ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのイソブチルメチルキサンチン
が補給されたダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、２０分間、３７
℃、５％ＣＯ２にてインキュベーションされる。試験化合物を１０μＭのフォル
スコリン有り、又は無しに加えられ、更に１０分間３７℃にてインキュベーショ
ンされた。次に培地は吸引され、１００ｍＭのＨＣｌの添加により反応は停止さ
れる。プレートは４℃にて１５分間保存され、放射性免疫アッセイにより停止溶
液中のｃＡＭＰ含有量が測定された。放射活性はデータ変換ソフトウエアーが装
備されたガンマーカウンターを用い定量されるであろう。
受容体を発現している細胞にてアッセイされるであろう。細胞は９６ウエル型プ
レートに播かれ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのイソブチルメチルキサンチン
が補給されたダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、２０分間、３７
℃、５％ＣＯ２にてインキュベーションされる。試験化合物を１０μＭのフォル
スコリン有り、又は無しに加えられ、更に１０分間３７℃にてインキュベーショ
ンされた。次に培地は吸引され、１００ｍＭのＨＣｌの添加により反応は停止さ
れる。プレートは４℃にて１５分間保存され、放射性免疫アッセイにより停止溶
液中のｃＡＭＰ含有量が測定された。放射活性はデータ変換ソフトウエアーが装
備されたガンマーカウンターを用い定量されるであろう。
【０１８９】 アラキドン酸放出アッセイ 哺乳動物受容体を発現している細胞は９６ウエル型プレートに播かれ、３日間
補給物入りＨＡＭのＦ−１２内に増殖させる。各ウエルにその内の一部１００μ
Ｌとして［３Ｈ］−アラキドン酸（比活性＝０．７５μＣｉ／ｍｌ）が加えられ
、サンプルは１８時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションされた。標識
細胞は２００μＬのＨＡＭのＦ−１２で３回洗浄される。次にウエルに培地（２
００μＬ）を満たし、ペプチド又は緩衝液（２２μＬ）を加えアッセイを開始す
る。細胞は３７℃、５％ＣＯ２にて３０分間インキュベーションされる。上清は
マイクロタイタープレートに移され、真空オーブン内にて７５℃で蒸発、乾燥さ
せられる。次にサンプルを２５μＬの蒸留水に溶解し、再懸濁する。各ウエルに
シンチラント（３００μＬ）を加え、Ｔｒｉｌｕｘプレートリーダーにてサンプ
ルの３Ｈを測定する。データはＧｒａｐｈＰＡＤ Ｐｒｉｓｍパッケージ（サン
ジェゴ、カリフォルニア（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））内にて利用できる非線
形回帰及び統計技法を用い分析された。
補給物入りＨＡＭのＦ−１２内に増殖させる。各ウエルにその内の一部１００μ
Ｌとして［３Ｈ］−アラキドン酸（比活性＝０．７５μＣｉ／ｍｌ）が加えられ
、サンプルは１８時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションされた。標識
細胞は２００μＬのＨＡＭのＦ−１２で３回洗浄される。次にウエルに培地（２
００μＬ）を満たし、ペプチド又は緩衝液（２２μＬ）を加えアッセイを開始す
る。細胞は３７℃、５％ＣＯ２にて３０分間インキュベーションされる。上清は
マイクロタイタープレートに移され、真空オーブン内にて７５℃で蒸発、乾燥さ
せられる。次にサンプルを２５μＬの蒸留水に溶解し、再懸濁する。各ウエルに
シンチラント（３００μＬ）を加え、Ｔｒｉｌｕｘプレートリーダーにてサンプ
ルの３Ｈを測定する。データはＧｒａｐｈＰＡＤ Ｐｒｉｓｍパッケージ（サン
ジェゴ、カリフォルニア（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））内にて利用できる非線
形回帰及び統計技法を用い分析された。
【０１９０】 細胞内カルシウム移動アッセイ 細胞内遊離型カルシウム濃度は、蛍光指示色素であるＦｕｒａ−２／ＡＭ（Ｂ
ｕｓｈら、１９９１）を利用した微量分光蛍光測定法により測定されるであろう
。細胞はガラス製カバースリップ挿入体を含む３５ｍｍ培養皿に播かれ、ＨＢＳ
で洗浄され、１００μＬのＦｕｒａ−２／ＡＭ（１０μＭ）を２０ないし４０分
間負荷される。ＨＢＳ洗浄によりＦｕｒａ−２／ＡＭ液を除いた後、細胞はＨＢ
Ｓに１０ないし２０分間平衡化される。次に細胞は４０×の対物レンズのついた
ライツ（Ｌｅｉｔｚ）社製Ｆｌｕｏｖｅｒｔ ＦＳ顕微鏡を用い視覚化され、励
起波長を３４０ｎＭから３８０ｎＭの範囲で変えながら５１０ｎＭの蛍光発光が
決定される。蛍光生データは標準カルシウム濃度曲線とソフトウエアー分析技術
を利用し、カルシウム濃度に変換される。
ｕｓｈら、１９９１）を利用した微量分光蛍光測定法により測定されるであろう
。細胞はガラス製カバースリップ挿入体を含む３５ｍｍ培養皿に播かれ、ＨＢＳ
で洗浄され、１００μＬのＦｕｒａ−２／ＡＭ（１０μＭ）を２０ないし４０分
間負荷される。ＨＢＳ洗浄によりＦｕｒａ−２／ＡＭ液を除いた後、細胞はＨＢ
Ｓに１０ないし２０分間平衡化される。次に細胞は４０×の対物レンズのついた
ライツ（Ｌｅｉｔｚ）社製Ｆｌｕｏｖｅｒｔ ＦＳ顕微鏡を用い視覚化され、励
起波長を３４０ｎＭから３８０ｎＭの範囲で変えながら５１０ｎＭの蛍光発光が
決定される。蛍光生データは標準カルシウム濃度曲線とソフトウエアー分析技術
を利用し、カルシウム濃度に変換される。
【０１９１】 イノシトールリン酸アッセイ 一過性にトランスフェクトされたＣｏｓ−７細胞を含む典型的なプロトコール
に関する細胞調製法のガイドライン及び第２メッセンジャーであるイノシトール
リン酸（ＩＰ）のアッセイを以下記載する；９６ウエル型マイクロプレート式ア
ッセイでは、細胞はウエル当たり７０，０００細胞播かれ、トランスフェクショ
ン操作後２４時間インキュベーションされる。次に細胞はマイクロウエル当たり
０．５μＣｉ［３Ｈ］ミオ−イノシトールで一晩、３７℃、５％ＣＯ２で標識さ
れた。アッセイ直前に培地を取り除き、１０ｍＭのＬｉＣｌを含む９０μｌのＰ
ＢＳで置換える。次にプレートは１５分間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベー
ションされる。インキュベーション後、トランスフェクタントにアゴニスト（１
０μｌ／ウエル；１０×濃度）を３０分間、３７℃、５％ＣＯ２にて作用させる
。作用を停止し、１００μｌの冷５％ｖ／ｖトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を加え、
４℃にて３０分以上インキュベーションし細胞を溶解した。イオン交換クロマト
グラフィーにより、細胞溶解物より全ＩＰｓが分離される。簡単に述べると、ウ
エル中の溶解物を１００μｌのＤｏｗｅｘ ＡＧ１−Ｘ８懸濁液（５０％ｖ／ｖ
、水：樹脂）を含むマルチスクリーンＨＶフィルタープレート（ミリポア（Ｍｉ
ｌｌｉｐｏｒｅ）社）（２００−４００メッシュ、ギ酸エステル）に移される。
フィルタープレートを真空マニフォールドに設置し、樹脂ベッドを洗浄し、溶出
する。各ウエルをまず２００μｌの５ｍＭミオイノシトールにて洗浄する。全［
３Ｈ］ＩＰｓは７５μｌの１．２ｍＭギ酸アンモニウム／０．１Ｍギ酸によりワ
ラック（Ｗａｌｌａｃ）社製９６ウエル型プレート内に溶出される。２００μｌ
のＳｕｐｅｒＭｉｘシンチレーションカクテルが各ウエルに加えられ、良く混合
し、平衡化し、Ｍｉｃｒｏ Ｂｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘシンチレーションカウンタ
ー上にて測定される（注意：本アッセイは単純に試薬容積を調節し、個別型クロ
マトグラフィーカラムを利用することで２４ウエル形式まで拡張できるであろう
） ＧＴＰγ機能アッセイ 哺乳動物ＭＣＨ１受容体がトランスフェクトされた細胞の膜は、０．２％ＢＳ
Ａ及び１０μＭＧＤＰが補給されたアッセイ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０
０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）中に懸濁される。膜は氷
上にて２０分間インキュベーションされ、９６ウエル型ミリポアマイクロタイタ
ーＧＦ／Ｃフィルタープレートに移され、ＧＴＰγＳ有り、又は無し（最終濃度
＝１００μＭ）でＧＴＰγ３５Ｓ（例えば２５０，０００ｃｐｍ／サンプル、比
活性〜１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）と混合される。最終膜タンパク質濃度は９０μ
ｇ／ｍｌである。サンプルはＭＣＨ（最終濃度＝１μＭ）有り、又は無しにて３
０分間、室温にてインキュベーションされ、次にミリポア真空マニフォールドに
て濾過され、冷アッセイ緩衝液にて３回洗浄される。フィルタープレート上に集
められたサンプルをシンチラントで処理し、Ｔｒｉｌｕｘ（ワラック社）液体シ
ンチレーションカウンター上にて３５Ｓ測定される。哺乳動物ＭＣＨ１受容体膜
標本が適切に遺伝子工学処理された異種発現システムに由来する場合、即ち発現
システムが哺乳動物ＭＣＨ１受容体の高レベル発現をもたらし、および／又は高
い回転率を持つＧタンパク質を発現する（ＧＴＰに関するＧＤＰの交換に関し）
場合に、最適な結果が得られると予想される。ＧＴＰγＳアッセイは当分野公知
であり、上記方法に関する変法、例えばＴｉａｎら（１９９４）又はＬａｚａｒ
ｅｎｏとＢｉｒｄｓａｌｌ（１９９３）により記載されている様な方法は、当業
者により利用できると推測される。
に関する細胞調製法のガイドライン及び第２メッセンジャーであるイノシトール
リン酸（ＩＰ）のアッセイを以下記載する；９６ウエル型マイクロプレート式ア
ッセイでは、細胞はウエル当たり７０，０００細胞播かれ、トランスフェクショ
ン操作後２４時間インキュベーションされる。次に細胞はマイクロウエル当たり
０．５μＣｉ［３Ｈ］ミオ−イノシトールで一晩、３７℃、５％ＣＯ２で標識さ
れた。アッセイ直前に培地を取り除き、１０ｍＭのＬｉＣｌを含む９０μｌのＰ
ＢＳで置換える。次にプレートは１５分間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベー
ションされる。インキュベーション後、トランスフェクタントにアゴニスト（１
０μｌ／ウエル；１０×濃度）を３０分間、３７℃、５％ＣＯ２にて作用させる
。作用を停止し、１００μｌの冷５％ｖ／ｖトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を加え、
４℃にて３０分以上インキュベーションし細胞を溶解した。イオン交換クロマト
グラフィーにより、細胞溶解物より全ＩＰｓが分離される。簡単に述べると、ウ
エル中の溶解物を１００μｌのＤｏｗｅｘ ＡＧ１−Ｘ８懸濁液（５０％ｖ／ｖ
、水：樹脂）を含むマルチスクリーンＨＶフィルタープレート（ミリポア（Ｍｉ
ｌｌｉｐｏｒｅ）社）（２００−４００メッシュ、ギ酸エステル）に移される。
フィルタープレートを真空マニフォールドに設置し、樹脂ベッドを洗浄し、溶出
する。各ウエルをまず２００μｌの５ｍＭミオイノシトールにて洗浄する。全［
３Ｈ］ＩＰｓは７５μｌの１．２ｍＭギ酸アンモニウム／０．１Ｍギ酸によりワ
ラック（Ｗａｌｌａｃ）社製９６ウエル型プレート内に溶出される。２００μｌ
のＳｕｐｅｒＭｉｘシンチレーションカクテルが各ウエルに加えられ、良く混合
し、平衡化し、Ｍｉｃｒｏ Ｂｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘシンチレーションカウンタ
ー上にて測定される（注意：本アッセイは単純に試薬容積を調節し、個別型クロ
マトグラフィーカラムを利用することで２４ウエル形式まで拡張できるであろう
） ＧＴＰγ機能アッセイ 哺乳動物ＭＣＨ１受容体がトランスフェクトされた細胞の膜は、０．２％ＢＳ
Ａ及び１０μＭＧＤＰが補給されたアッセイ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０
０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）中に懸濁される。膜は氷
上にて２０分間インキュベーションされ、９６ウエル型ミリポアマイクロタイタ
ーＧＦ／Ｃフィルタープレートに移され、ＧＴＰγＳ有り、又は無し（最終濃度
＝１００μＭ）でＧＴＰγ３５Ｓ（例えば２５０，０００ｃｐｍ／サンプル、比
活性〜１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）と混合される。最終膜タンパク質濃度は９０μ
ｇ／ｍｌである。サンプルはＭＣＨ（最終濃度＝１μＭ）有り、又は無しにて３
０分間、室温にてインキュベーションされ、次にミリポア真空マニフォールドに
て濾過され、冷アッセイ緩衝液にて３回洗浄される。フィルタープレート上に集
められたサンプルをシンチラントで処理し、Ｔｒｉｌｕｘ（ワラック社）液体シ
ンチレーションカウンター上にて３５Ｓ測定される。哺乳動物ＭＣＨ１受容体膜
標本が適切に遺伝子工学処理された異種発現システムに由来する場合、即ち発現
システムが哺乳動物ＭＣＨ１受容体の高レベル発現をもたらし、および／又は高
い回転率を持つＧタンパク質を発現する（ＧＴＰに関するＧＤＰの交換に関し）
場合に、最適な結果が得られると予想される。ＧＴＰγＳアッセイは当分野公知
であり、上記方法に関する変法、例えばＴｉａｎら（１９９４）又はＬａｚａｒ
ｅｎｏとＢｉｒｄｓａｌｌ（１９９３）により記載されている様な方法は、当業
者により利用できると推測される。
【０１９２】 転写アッセイ ９６マイクロウエル形式にてＤＥＡＥ−デキストラン法により一過性にトラン
スフェクトされたＣｏｓ−７細胞の細胞調製及び受容体介在転写のアッセイに関
するガイドラインは以下の通りである；これら研究に用いるｃ−ｆｏｓ−β−ｇ
ａｌプロモーター／レポーター構築体は、βガラクトシダーゼｃＤＮＡ含有発現
ベクターｐＮＡＳＳβ（クローンテック）の上流に挿入されたｃｆｏｓプロモー
ター領域（−３８４ないし＋１９）（Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇら、１９９１、Ｙａｌ
ｋｉｎｏｇｌｕら、１９９５）より成る。転写活性は、βガラクトシダーゼ酵素
活性を比色アッセイにて検出するアッセイにより測定される。一過性トランスフ
ェクション４８時間後、培地を取り除き、典型的には１０μＭ濃度である作用物
質（例えばＭＣＨ）を含む培地に置き換える。細胞を３７℃、５％ＣＯ２にて少
なくとも１８時間インキュベーションし、その後培地を吸引してから細胞を２０
０μｌＰＢＳ／ウエルで洗浄する。次に細胞を１００μｌのＡＢ緩衝液（１００
ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１ｍＭの
ＭｎＣｌ２）を利用し、１０分間、室温にて溶解する。次に各ウエルに１００μ
ｌのＡＢ／Ｔｘ／β−メルカプトエタノール（０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
、４０ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含むＡＢ緩衝液）を加え、溶解物を更
に１０分間室温でインキュベーションする。酵素発色反応は基質であるＯＮＰＧ
／ＡＢ（４ｍｇ／ｍｌのＯ−ニトロフェニル−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシドを含
むＡＢ緩衝液）の添加により開始される。反応は３０分間又は黄色の発色が見ら
れるまで続ける。光学密度の測定はダイナテック社（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）製マイ
クロプレートリーダーを用い、４０５ｎｍにて行われる。
スフェクトされたＣｏｓ−７細胞の細胞調製及び受容体介在転写のアッセイに関
するガイドラインは以下の通りである；これら研究に用いるｃ−ｆｏｓ−β−ｇ
ａｌプロモーター／レポーター構築体は、βガラクトシダーゼｃＤＮＡ含有発現
ベクターｐＮＡＳＳβ（クローンテック）の上流に挿入されたｃｆｏｓプロモー
ター領域（−３８４ないし＋１９）（Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇら、１９９１、Ｙａｌ
ｋｉｎｏｇｌｕら、１９９５）より成る。転写活性は、βガラクトシダーゼ酵素
活性を比色アッセイにて検出するアッセイにより測定される。一過性トランスフ
ェクション４８時間後、培地を取り除き、典型的には１０μＭ濃度である作用物
質（例えばＭＣＨ）を含む培地に置き換える。細胞を３７℃、５％ＣＯ２にて少
なくとも１８時間インキュベーションし、その後培地を吸引してから細胞を２０
０μｌＰＢＳ／ウエルで洗浄する。次に細胞を１００μｌのＡＢ緩衝液（１００
ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１ｍＭの
ＭｎＣｌ２）を利用し、１０分間、室温にて溶解する。次に各ウエルに１００μ
ｌのＡＢ／Ｔｘ／β−メルカプトエタノール（０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
、４０ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含むＡＢ緩衝液）を加え、溶解物を更
に１０分間室温でインキュベーションする。酵素発色反応は基質であるＯＮＰＧ
／ＡＢ（４ｍｇ／ｍｌのＯ−ニトロフェニル−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシドを含
むＡＢ緩衝液）の添加により開始される。反応は３０分間又は黄色の発色が見ら
れるまで続ける。光学密度の測定はダイナテック社（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）製マイ
クロプレートリーダーを用い、４０５ｎｍにて行われる。
【０１９３】 ＭＡＰキナーゼアッセイ ＭＡＰキナーゼ（マイトジェン活性化キナーゼ）をモニターし、受容体活性化
を評価することができるであろう。ＭＡＰキナーゼは細胞内の複数の経路により
活性化される。活性化の一次様式は、ラット／ｒａｆ／ＭＥＫ／ＭＡＰキナーゼ
経路を含む。成長因子（チロシンキナーゼ）受容体はＳＨＣ／Ｇｒｂ−２／ＳＯ
Ｓ／ｒａｓを介しこの経路内に取り込まれる。Ｇｉ共役受容体もｒａｓを活性化
し、続いてＭＡＰキナーゼの活性化を生じることが知られている。フォスフォリ
パーゼＣ（Ｇｑ及びＧ１１）を活性化する受容体はフォスファチジルイノシトー
ル加水分解の結果としてジアリルグリセロール（ＤＡＧ）を生ずる。ＤＡＧはプ
ロテインキナーゼＣを活性化し、つぎにこれがＭＡＰキナーゼをリン酸化する。
を評価することができるであろう。ＭＡＰキナーゼは細胞内の複数の経路により
活性化される。活性化の一次様式は、ラット／ｒａｆ／ＭＥＫ／ＭＡＰキナーゼ
経路を含む。成長因子（チロシンキナーゼ）受容体はＳＨＣ／Ｇｒｂ−２／ＳＯ
Ｓ／ｒａｓを介しこの経路内に取り込まれる。Ｇｉ共役受容体もｒａｓを活性化
し、続いてＭＡＰキナーゼの活性化を生じることが知られている。フォスフォリ
パーゼＣ（Ｇｑ及びＧ１１）を活性化する受容体はフォスファチジルイノシトー
ル加水分解の結果としてジアリルグリセロール（ＤＡＧ）を生ずる。ＤＡＧはプ
ロテインキナーゼＣを活性化し、つぎにこれがＭＡＰキナーゼをリン酸化する。
【０１９４】 ＭＡＰキナーゼ活性化は幾つかの方法により検出できる。１つの方法は、非リ
ン酸化（不活性）又はリン酸化（活性）いずれのリン酸化状態にあるか評価する
ことに基づく。リン酸化タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の移動度が遅く、従っ
てウエスタンブロッティングを利用し非刺激タンパク質と比較することができる
。あるいは、リン酸化キナーゼ中の増加を検出するのに利用できるリン酸化タン
パク質に特異的な抗体が利用できる。いずれの方法でも、細胞はマイトーゲンに
より刺激され、続いてリームリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）緩衝液で抽出される。可溶性
分画がＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられ、タンパク質は電気泳動的にニトロセルロー
ス又はイムビロン上に移される。免疫反応性のバンドは標準的ウエスタンブロッ
ティング技術により検出される。可視的又は化学発光シグナルはフィルム上に記
録され、デンシトメトリー法により定量化される。
ン酸化（不活性）又はリン酸化（活性）いずれのリン酸化状態にあるか評価する
ことに基づく。リン酸化タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の移動度が遅く、従っ
てウエスタンブロッティングを利用し非刺激タンパク質と比較することができる
。あるいは、リン酸化キナーゼ中の増加を検出するのに利用できるリン酸化タン
パク質に特異的な抗体が利用できる。いずれの方法でも、細胞はマイトーゲンに
より刺激され、続いてリームリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）緩衝液で抽出される。可溶性
分画がＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられ、タンパク質は電気泳動的にニトロセルロー
ス又はイムビロン上に移される。免疫反応性のバンドは標準的ウエスタンブロッ
ティング技術により検出される。可視的又は化学発光シグナルはフィルム上に記
録され、デンシトメトリー法により定量化される。
【０１９５】 別の方法はリン酸化アッセイを介したＭＡＰキナーゼ活性の評価に基づく。細
胞はマイトーゲンにより刺激され、可溶性分画が調製される。抽出物は３０℃に
て１０分間ガンマ−３２−ＡＴＰ、ＡＴＰ産生システム、及びインシュリン又は
ＰＨＡＳ−１により制御されたリン酸化熱及び酸安定タンパク質の様なＭＡＰキ
ナーゼの特異的基質とインキュベーションされる。反応はＨ３ＰＯ４の添加によ
り終止され、サンプルは氷に移される。一部を、リン酸化タンパク質を保持する
ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）Ｂ８１クロマトグラフィーペーパーにスポットす
る。クロマトグラフィーペーパーを洗浄し、液体シンチレーションカウンター内
にて３２Ｐについて測定する。あるいは、細胞抽出物はガンマ−３２−ＡＴＰ、
ＡＴＰ産生システム、及びフィルター支持体にストレプトアビジンを介して結合
したビオチン化されたミエリン塩基性タンパク質とインキュベーションされる。
ミエリン塩基性タンパク質は活性化ＭＡＰキナーゼの基質である。リン酸化反応
は１０分間、３０℃にて実施される。次に抽出物はリン酸化ミエリン塩基性タン
パク質を保持しているフィルターより吸引される。フィルターは洗浄され、液体
シンチレーションカウンター内にて３２Ｐについて測定される。
胞はマイトーゲンにより刺激され、可溶性分画が調製される。抽出物は３０℃に
て１０分間ガンマ−３２−ＡＴＰ、ＡＴＰ産生システム、及びインシュリン又は
ＰＨＡＳ−１により制御されたリン酸化熱及び酸安定タンパク質の様なＭＡＰキ
ナーゼの特異的基質とインキュベーションされる。反応はＨ３ＰＯ４の添加によ
り終止され、サンプルは氷に移される。一部を、リン酸化タンパク質を保持する
ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）Ｂ８１クロマトグラフィーペーパーにスポットす
る。クロマトグラフィーペーパーを洗浄し、液体シンチレーションカウンター内
にて３２Ｐについて測定する。あるいは、細胞抽出物はガンマ−３２−ＡＴＰ、
ＡＴＰ産生システム、及びフィルター支持体にストレプトアビジンを介して結合
したビオチン化されたミエリン塩基性タンパク質とインキュベーションされる。
ミエリン塩基性タンパク質は活性化ＭＡＰキナーゼの基質である。リン酸化反応
は１０分間、３０℃にて実施される。次に抽出物はリン酸化ミエリン塩基性タン
パク質を保持しているフィルターより吸引される。フィルターは洗浄され、液体
シンチレーションカウンター内にて３２Ｐについて測定される。
【０１９６】 細胞増殖アッセイ Ｇタンパク質共役受容体の活性化は、［３Ｈ］チミジン取り込みによりモニタ
ーできるマイトーゲン又は増殖反応をもたらすであろう。培養細胞を［３Ｈ］チ
ミジンとインキュベーションした場合、チミジンは核内に移行し、そこでリン酸
化されチミジン３リン酸になる。ヌクレオチド３リン酸は次に細胞の増殖速度に
比例した速度で細胞ＤＮＡに取り込まれる。典型的には、細胞は１−３日間培養
され増殖させられる。細胞は２４時間血清を除去され、飢餓状態に置かれる。次
にマイトーゲン作用物質が培地に加えられる。２４時間後、細胞は比活性１ない
し１０μＣｉ／ｍｌの範囲の［３Ｈ］チミジンと２−６時間インキュベーション
される。細胞回収法は、トリプシン処理及び可溶性チミジンを抽出するためのＴ
ＣＡないでの事前インキュベーション有り、又は無しでのＧＦ／Ｃフィルターに
よる濾過を利用した細胞捕獲を含むであろう。濾過液はシンチレーターで処理さ
れ、シンチレーションカウンター上にて３Ｈについて測定される。あるいは、接
着細胞はＭｅＯＨ又はＴＣＡにより固定され、水で洗浄されてから０．０５％の
デオキシコレート／０．１ＮのＮａＯＨで可溶化される。可溶化抽出物はシンチ
レーションバイアルに移され、液体シンチレーションカウンター測定により３Ｈ
について測定される。
ーできるマイトーゲン又は増殖反応をもたらすであろう。培養細胞を［３Ｈ］チ
ミジンとインキュベーションした場合、チミジンは核内に移行し、そこでリン酸
化されチミジン３リン酸になる。ヌクレオチド３リン酸は次に細胞の増殖速度に
比例した速度で細胞ＤＮＡに取り込まれる。典型的には、細胞は１−３日間培養
され増殖させられる。細胞は２４時間血清を除去され、飢餓状態に置かれる。次
にマイトーゲン作用物質が培地に加えられる。２４時間後、細胞は比活性１ない
し１０μＣｉ／ｍｌの範囲の［３Ｈ］チミジンと２−６時間インキュベーション
される。細胞回収法は、トリプシン処理及び可溶性チミジンを抽出するためのＴ
ＣＡないでの事前インキュベーション有り、又は無しでのＧＦ／Ｃフィルターに
よる濾過を利用した細胞捕獲を含むであろう。濾過液はシンチレーターで処理さ
れ、シンチレーションカウンター上にて３Ｈについて測定される。あるいは、接
着細胞はＭｅＯＨ又はＴＣＡにより固定され、水で洗浄されてから０．０５％の
デオキシコレート／０．１ＮのＮａＯＨで可溶化される。可溶化抽出物はシンチ
レーションバイアルに移され、液体シンチレーションカウンター測定により３Ｈ
について測定される。
【０１９７】 アフリカツメガエル卵細胞中の電流を記録する方法 雌アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ−１、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）に
０．２％トリカイン（３−アミノ安息香酸エチルエステル、シグマケミカル社（
Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ））で麻酔をかけ、卵巣の一部を無菌
的技法により取り出す（ＱｕｉｃｋとＬｅｓｔｅｒ、１９９４）。卵細胞を８７
．５ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２及び５ｍＭのＨＥＰ
ＥＳ、ｐＨ７．５を含む２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（ウォーリントンバイオケ
ミカル社、フリーホールド、ニュージャージー（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ））溶液にて処理し
て卵膜を除去した。卵細胞には哺乳動物ｍＲＮＡが注射されるであろう（Ｎａｎ
ｏｊｅｔ、ドラモノドサイエンティフィック（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ Ｓｃｉｅｎｔ
ｉｆｉｃ）、ブルーマル、ペンシルバニア（Ｂｒｏｏｍａｌｌ、ＰＡ））。その
他卵細胞には哺乳動物ｍＲＮＡとＧタンパク質活性化内向き整流器に関する遺伝
子（ＧＩＲＫ１及びＧＩＲＫ４、米国特許第５，７３４，０２１号及び第５，７
２８，５３５号）をコードしているｍＲＮＡが注射されるであろう。Ｇタンパク
質内向き整流Ｋ＋（ＧＩＲＫ）チャンネル１及び４（ＧＩＲＫ１及びＧＩＲＫ４
）をコードしている遺伝子は、公開されている配列（Ｋｕｂｏら、１９９３；Ｄ
ａｓｃａｌら、１９９３；Ｋｒａｐｉｖｉｎｓｋｙら、１９９５及び１９９５ｂ
）を用いたＰＣＲにより得られ、適当な５’及び３’プライマーが導かれた。ヒ
ト心臓ｃＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーと共に、ＧＩＲＫ１については ５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＴＡＴＧＴＣＴＧＣＡＣＴＣＣＧＡＡＧＧＡＡＡ
ＴＴＴＧ−３’（配列番号１０）及び ５’−ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＡＧＡＧＴＴＣＡＴ
ＴＴＴＴＣ−３’（配列番号１１）が、ＧＩＲＫ４については、 ５’−ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＡＴＴＣＴＡＧＧＡＡＴ
Ｇ−３’（配列番号１２）及び ５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＣＣＴＣＡＣＡＣＣＧＡＧＣＣＣＣＴＧＧ−３’（
配列番号１３）が用いられた。
０．２％トリカイン（３−アミノ安息香酸エチルエステル、シグマケミカル社（
Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ））で麻酔をかけ、卵巣の一部を無菌
的技法により取り出す（ＱｕｉｃｋとＬｅｓｔｅｒ、１９９４）。卵細胞を８７
．５ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２及び５ｍＭのＨＥＰ
ＥＳ、ｐＨ７．５を含む２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（ウォーリントンバイオケ
ミカル社、フリーホールド、ニュージャージー（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ））溶液にて処理し
て卵膜を除去した。卵細胞には哺乳動物ｍＲＮＡが注射されるであろう（Ｎａｎ
ｏｊｅｔ、ドラモノドサイエンティフィック（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ Ｓｃｉｅｎｔ
ｉｆｉｃ）、ブルーマル、ペンシルバニア（Ｂｒｏｏｍａｌｌ、ＰＡ））。その
他卵細胞には哺乳動物ｍＲＮＡとＧタンパク質活性化内向き整流器に関する遺伝
子（ＧＩＲＫ１及びＧＩＲＫ４、米国特許第５，７３４，０２１号及び第５，７
２８，５３５号）をコードしているｍＲＮＡが注射されるであろう。Ｇタンパク
質内向き整流Ｋ＋（ＧＩＲＫ）チャンネル１及び４（ＧＩＲＫ１及びＧＩＲＫ４
）をコードしている遺伝子は、公開されている配列（Ｋｕｂｏら、１９９３；Ｄ
ａｓｃａｌら、１９９３；Ｋｒａｐｉｖｉｎｓｋｙら、１９９５及び１９９５ｂ
）を用いたＰＣＲにより得られ、適当な５’及び３’プライマーが導かれた。ヒ
ト心臓ｃＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーと共に、ＧＩＲＫ１については ５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＴＡＴＧＴＣＴＧＣＡＣＴＣＣＧＡＡＧＧＡＡＡ
ＴＴＴＧ−３’（配列番号１０）及び ５’−ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＡＧＡＧＴＴＣＡＴ
ＴＴＴＴＣ−３’（配列番号１１）が、ＧＩＲＫ４については、 ５’−ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＡＴＴＣＴＡＧＧＡＡＴ
Ｇ−３’（配列番号１２）及び ５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＣＣＴＣＡＣＡＣＣＧＡＧＣＣＣＣＴＧＧ−３’（
配列番号１３）が用いられた。
【０１９８】 各プライマー対では、上流側プライマーがＢａｍＨＩ部位を、下流側プライマ
ーがＥｃｏＲＩ部位を持ち、ＰＣＲ産物のｐｃＤＮＡ１−Ａｍｐ（インビトゲン
）へのクローニングを容易にしている。哺乳動物ＭＣＨ１受容体の転写鋳型も同
時に得ることができるであろう。ｍＲＮＡは、哺乳動物受容体の完全コーディン
グ域、ＧＩＲＫ１及びＧＩＲＫ４を含む別のＤＮＡプラスミドから調製される。
プラスミドは直線化され、Ｔ７ポリメラーゼを用いて転写される（「メッセージ
マシーン」、アンビコン社（Ａｍｂｉｃｏｎ））。あるいは、ｍＲＮＡはＰＣＲ
により作製された鋳型より転写され、Ｔ７プロモーター及びポリＡ＋テールを取
り込む。各卵細胞はそれぞれ２ｎｇのＧＩＲＫ１及びＧＩＲＫ４ｍＲＮＡを２５
ｎｇの哺乳動物受容体ｍＲＮＡと組合せ受け取るであろう。ｍＲＮＡ注射後、卵
細胞は１６℃、旋回式プラットフォーム上で３ないし８日間インキュベーション
される。二重電極ボルテージクランプ（「ジーンクランプ（ＧｅｎｅＣｌａｍｐ
）」、アクソンインスツルメント、フォスターシティー、カリフォルニア（Ａｘ
ｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を、１−３オ
ームの抵抗を持つ３ＭのＫＣｌが充填されたガラス製微小電極を用い実施される
。特記ない限り、卵細胞は保持電圧−８０ｍＶにてボルテージクランプされた。
記録中、卵細胞は９６ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、
２ｍＭのＭｇＣｌ２、及び５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５（「ＮＤ９６」）を
含む培地連続流（２−５ｍｌ／分）、ＧＩＲＫ１及びＧＩＲＫ４を発現している
卵細胞の場合には、９６ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２ 、２ｍＭのＭｇＣｌ２及び５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５のＫ＋濃度を上げた
培地（「ｈＫ」）の連続流内に浸した。薬剤は重力送り込み灌流ラインのシリー
ズを変更することで供給される。
ーがＥｃｏＲＩ部位を持ち、ＰＣＲ産物のｐｃＤＮＡ１−Ａｍｐ（インビトゲン
）へのクローニングを容易にしている。哺乳動物ＭＣＨ１受容体の転写鋳型も同
時に得ることができるであろう。ｍＲＮＡは、哺乳動物受容体の完全コーディン
グ域、ＧＩＲＫ１及びＧＩＲＫ４を含む別のＤＮＡプラスミドから調製される。
プラスミドは直線化され、Ｔ７ポリメラーゼを用いて転写される（「メッセージ
マシーン」、アンビコン社（Ａｍｂｉｃｏｎ））。あるいは、ｍＲＮＡはＰＣＲ
により作製された鋳型より転写され、Ｔ７プロモーター及びポリＡ＋テールを取
り込む。各卵細胞はそれぞれ２ｎｇのＧＩＲＫ１及びＧＩＲＫ４ｍＲＮＡを２５
ｎｇの哺乳動物受容体ｍＲＮＡと組合せ受け取るであろう。ｍＲＮＡ注射後、卵
細胞は１６℃、旋回式プラットフォーム上で３ないし８日間インキュベーション
される。二重電極ボルテージクランプ（「ジーンクランプ（ＧｅｎｅＣｌａｍｐ
）」、アクソンインスツルメント、フォスターシティー、カリフォルニア（Ａｘ
ｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を、１−３オ
ームの抵抗を持つ３ＭのＫＣｌが充填されたガラス製微小電極を用い実施される
。特記ない限り、卵細胞は保持電圧−８０ｍＶにてボルテージクランプされた。
記録中、卵細胞は９６ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、
２ｍＭのＭｇＣｌ２、及び５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５（「ＮＤ９６」）を
含む培地連続流（２−５ｍｌ／分）、ＧＩＲＫ１及びＧＩＲＫ４を発現している
卵細胞の場合には、９６ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２ 、２ｍＭのＭｇＣｌ２及び５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５のＫ＋濃度を上げた
培地（「ｈＫ」）の連続流内に浸した。薬剤は重力送り込み灌流ラインのシリー
ズを変更することで供給される。
【０１９９】 アフリカツメガエル卵細胞内でのＧＰＣＲｓ異種発現は、アゴニスト刺激によ
り活性化されるシグナル伝達経路の同一性を決定するのに広く用いられている（
Ｇｕｎｄｅｒｓｅｎら、１９８３；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９８７）。フォス
フォリパーゼＣ（ＰＬＣ）経路の活性化は、ＤＮ９６液内の試験化合物を事前に
哺乳動物受容体のｍＲＮＡが注射されている卵細胞内に適用し、−８０ｍＶの維
持電圧に於ける内向き電流を観察することでアッセイされる。−２５ｍＶにて逆
転するが、Ｃａ＋＋活性化Ｃｌ−（塩素イオン）チャンネルのその他特性を示し
ている電流の出現はあ、ＰＬＣの哺乳動物受容体活性化及びＩＰ３及び細胞内Ｃ
ａ＋＋の放出の指標である。この様な活性は、Ｇｑと共役しているＧＰＣＲによ
り示される。
り活性化されるシグナル伝達経路の同一性を決定するのに広く用いられている（
Ｇｕｎｄｅｒｓｅｎら、１９８３；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９８７）。フォス
フォリパーゼＣ（ＰＬＣ）経路の活性化は、ＤＮ９６液内の試験化合物を事前に
哺乳動物受容体のｍＲＮＡが注射されている卵細胞内に適用し、−８０ｍＶの維
持電圧に於ける内向き電流を観察することでアッセイされる。−２５ｍＶにて逆
転するが、Ｃａ＋＋活性化Ｃｌ−（塩素イオン）チャンネルのその他特性を示し
ている電流の出現はあ、ＰＬＣの哺乳動物受容体活性化及びＩＰ３及び細胞内Ｃ
ａ＋＋の放出の指標である。この様な活性は、Ｇｑと共役しているＧＰＣＲによ
り示される。
【０２００】 内向きの整流Ｋ＋（カリウム）チャンネル（ＧＩＲＫ）活性の測定は、哺乳動
物受容体をコードしているｍＲＮＡ、ＧＩＲＫ１、及びＧＩＲＫ４が同時に注射
されている卵細胞にてモニタリングされる。２種類のＧＩＲＫ遺伝子産物はコア
ッセンブルされＧｉ又はＧｏと共役している複数のＧＰＣＲｓにより活性化され
ることが知られているＧ−タンパク質活性化（即ち刺激されること）カリウムチ
ャンネルを形成する（Ｋｕｂｏら、１９９３；Ｄａｓｃａｌら、１９９３）。哺
乳動物受容体と２種類のＧＩＲＫサブユニットを発現している卵細胞は、高Ｋ＋ 溶液（ｈＫ）中でのＫ＋電流を測定することで、化合物の反応性を試験される。
３００μＭのＢａ＋＋に感受性である内向きの整流電流の活性化は、哺乳動物受
容体が卵細胞内のＧｉ及びＧｏ経路に共役していることを示している。
物受容体をコードしているｍＲＮＡ、ＧＩＲＫ１、及びＧＩＲＫ４が同時に注射
されている卵細胞にてモニタリングされる。２種類のＧＩＲＫ遺伝子産物はコア
ッセンブルされＧｉ又はＧｏと共役している複数のＧＰＣＲｓにより活性化され
ることが知られているＧ−タンパク質活性化（即ち刺激されること）カリウムチ
ャンネルを形成する（Ｋｕｂｏら、１９９３；Ｄａｓｃａｌら、１９９３）。哺
乳動物受容体と２種類のＧＩＲＫサブユニットを発現している卵細胞は、高Ｋ＋ 溶液（ｈＫ）中でのＫ＋電流を測定することで、化合物の反応性を試験される。
３００μＭのＢａ＋＋に感受性である内向きの整流電流の活性化は、哺乳動物受
容体が卵細胞内のＧｉ及びＧｏ経路に共役していることを示している。
【０２０１】 受容体／Ｇタンパク質コトランスフェクション試験 ＭＣＨ１が選択されたＧタンパク質と好適に共役できるか決定する方法には、
Ｇタンパク質サブユニットのｃＤＮＡと一緒に宿主細胞内にＭＣＨ１受容体ｃＤ
ＮＡをトランスフェクションすることが含まれる。Ｇアルファサブユニットの例
には、Ｇαｉ／Ｇα０類（Ｇαｔ２及びＧαｚを含む）、Ｇαｑ類、Ｇαｓ類、
及びＧα１２／１３類のメンバーが含まれる。典型的な方法は、Ｃｏｓ−７の様
な宿主細胞への一過性のトランスフェクションを含む。他の宿主細胞も利用でき
るであろう。重要なことは、細胞が下流にエフェクター（例えば、特定のアデニ
レートシクラーゼ、フォスフォリパーゼＣ又はチャンネルイソフォーム）を有し
、調査対象のＧタンパク質を介した機能的反応が支えられているか考慮すること
である。元来細胞にあるＧタンパク質ベータガンマサブユニットは、Ｇタンパク
質ヘテロトリマーを完成させると推測される；一方特定のベータ及びガンマサブ
ユニットも同様にコトランスフェクションできるであろう。更にアルファ、ベー
タ、又はガンマサブユニットは個別または組合せのによりコトランスフェクショ
ンでき、受容体により伝達される機能的シグナルを最適化するであろう。
Ｇタンパク質サブユニットのｃＤＮＡと一緒に宿主細胞内にＭＣＨ１受容体ｃＤ
ＮＡをトランスフェクションすることが含まれる。Ｇアルファサブユニットの例
には、Ｇαｉ／Ｇα０類（Ｇαｔ２及びＧαｚを含む）、Ｇαｑ類、Ｇαｓ類、
及びＧα１２／１３類のメンバーが含まれる。典型的な方法は、Ｃｏｓ−７の様
な宿主細胞への一過性のトランスフェクションを含む。他の宿主細胞も利用でき
るであろう。重要なことは、細胞が下流にエフェクター（例えば、特定のアデニ
レートシクラーゼ、フォスフォリパーゼＣ又はチャンネルイソフォーム）を有し
、調査対象のＧタンパク質を介した機能的反応が支えられているか考慮すること
である。元来細胞にあるＧタンパク質ベータガンマサブユニットは、Ｇタンパク
質ヘテロトリマーを完成させると推測される；一方特定のベータ及びガンマサブ
ユニットも同様にコトランスフェクションできるであろう。更にアルファ、ベー
タ、又はガンマサブユニットは個別または組合せのによりコトランスフェクショ
ンでき、受容体により伝達される機能的シグナルを最適化するであろう。
【０２０２】 受容体／Ｇアルファがコトランスフェクトされた細胞は、最適なＧタンパク質
共役の存在により放射性リガンド結合が促進される結合アッセイ、又は受容体／
Ｇタンパク質の仮説を検証するために工夫された機能的アッセイにより評価され
る。例の１つでは、ＭＣＨ１受容体はＧαｉ／Ｇα０類のＧアルファサブユニッ
トとの共役を通じ、ｃＡＭＰの蓄積を阻害すると仮定されるであろう。ＭＣＨ１
受容体と適当なＧアルファサブユニットのｃＤＮＡがコトランスフェクトされた
宿主細胞は、上記ｃＡＭＰ法に記したように、フォスフォコリン＋／−ＭＣＨ１
アゴニストにより刺激される。細胞内ｃＡＭＰは放射免疫アッセイによる分析の
ために抽出される。ｃＡＭＰ阻害に関しては、ＧＴＰγ３５Ｓ結合アッセイ及び
イノシトールリン酸加水分解アッセイを含むその他アッセイに置換えることがで
きるであろう。Ｇアルファ無しのＭＣＨ１−又はＭＣＨ１無しのＧアルファでト
ランスフェクトされた宿主細胞が、陰性コントロールとして同時に試験されるで
あろう。コトランスフェクトされた細胞でのＭＣＨ１受容体の発現は、トランス
フェクトされた細胞からの膜を利用した放射性リガンド結合試験により確認され
るであろう。トランスフェクトされた細胞でのＧアルファの発現は、問題のＧタ
ンパク質に特異的な抗体を利用した、トランスフェクトされた細胞からの膜のウ
エスタンブロット分析により確認されるであろう。
共役の存在により放射性リガンド結合が促進される結合アッセイ、又は受容体／
Ｇタンパク質の仮説を検証するために工夫された機能的アッセイにより評価され
る。例の１つでは、ＭＣＨ１受容体はＧαｉ／Ｇα０類のＧアルファサブユニッ
トとの共役を通じ、ｃＡＭＰの蓄積を阻害すると仮定されるであろう。ＭＣＨ１
受容体と適当なＧアルファサブユニットのｃＤＮＡがコトランスフェクトされた
宿主細胞は、上記ｃＡＭＰ法に記したように、フォスフォコリン＋／−ＭＣＨ１
アゴニストにより刺激される。細胞内ｃＡＭＰは放射免疫アッセイによる分析の
ために抽出される。ｃＡＭＰ阻害に関しては、ＧＴＰγ３５Ｓ結合アッセイ及び
イノシトールリン酸加水分解アッセイを含むその他アッセイに置換えることがで
きるであろう。Ｇアルファ無しのＭＣＨ１−又はＭＣＨ１無しのＧアルファでト
ランスフェクトされた宿主細胞が、陰性コントロールとして同時に試験されるで
あろう。コトランスフェクトされた細胞でのＭＣＨ１受容体の発現は、トランス
フェクトされた細胞からの膜を利用した放射性リガンド結合試験により確認され
るであろう。トランスフェクトされた細胞でのＧアルファの発現は、問題のＧタ
ンパク質に特異的な抗体を利用した、トランスフェクトされた細胞からの膜のウ
エスタンブロット分析により確認されるであろう。
【０２０３】 一過性トランスフェクション法の効率は、刺激アッセイ以上に阻害アッセイに
於いてシグナル対ノイズにとって重要な要素である。全ての細胞に存在する正の
シグナル（フォスフォコリン刺激ｃＡＭＰ蓄積の様な）が受容体とＧアルファが
上手くトランスフェクトされた細胞分画でのみ阻害される場合には、シグナル対
ノイズ比は不良であろう。シグナル対ノイズ比を改善する方法の一つは、１００
％の細胞が受容体とＧアルファサブユニットの両方を発現する安定トランスフェ
クション細胞株を作製することである。別の方法には、阻害されるシグナルを正
に制御するＧタンパク質共役受容体に関する第３のｃＤＮＡを一過性にコトラン
スフェクションする方法が含まれる。コトランスフェクトされた細胞が刺激型受
容体と阻害型、そして阻害型受容体に必須なＧタンパク質を同時に発現すれば、
受容体特異的アゴニストの利用によりトランスフェクトされた細胞で正のシグナ
ルが選択的に増加するであろう。例には５−ＨＴ４受容体、ＭＣＨ１受容体及び
ＧアルファサブユニットによるＣＯＳ−７細胞のコトランスフェクションが含ま
れる。トランスフェクトされた細胞は、５ＨＴ４アゴニスト＋／−ＭＣＨ１アゴ
ニストにより刺激される。環状ＡＭＰはＭＣＨ１及び問題のＧアルファサブユニ
ットも同時に発現している細胞でのみ増加すると予想されており、そしてＭＣＨ
１依存型の阻害は改善されたシグナル対ノイズ比で測定されるであろう。
於いてシグナル対ノイズにとって重要な要素である。全ての細胞に存在する正の
シグナル（フォスフォコリン刺激ｃＡＭＰ蓄積の様な）が受容体とＧアルファが
上手くトランスフェクトされた細胞分画でのみ阻害される場合には、シグナル対
ノイズ比は不良であろう。シグナル対ノイズ比を改善する方法の一つは、１００
％の細胞が受容体とＧアルファサブユニットの両方を発現する安定トランスフェ
クション細胞株を作製することである。別の方法には、阻害されるシグナルを正
に制御するＧタンパク質共役受容体に関する第３のｃＤＮＡを一過性にコトラン
スフェクションする方法が含まれる。コトランスフェクトされた細胞が刺激型受
容体と阻害型、そして阻害型受容体に必須なＧタンパク質を同時に発現すれば、
受容体特異的アゴニストの利用によりトランスフェクトされた細胞で正のシグナ
ルが選択的に増加するであろう。例には５−ＨＴ４受容体、ＭＣＨ１受容体及び
ＧアルファサブユニットによるＣＯＳ−７細胞のコトランスフェクションが含ま
れる。トランスフェクトされた細胞は、５ＨＴ４アゴニスト＋／−ＭＣＨ１アゴ
ニストにより刺激される。環状ＡＭＰはＭＣＨ１及び問題のＧアルファサブユニ
ットも同時に発現している細胞でのみ増加すると予想されており、そしてＭＣＨ
１依存型の阻害は改善されたシグナル対ノイズ比で測定されるであろう。
【０２０４】 ここに記した細胞株は、本発明の哺乳動物受容体の結合及び機能評価に利用さ
れる方法の単なる例示であること、そしてここに記載のアッセイにはその他好適
な細胞が利用できると理解される。
れる方法の単なる例示であること、そしてここに記載のアッセイにはその他好適
な細胞が利用できると理解される。
【０２０５】 混合第２メッセンジャーアッセイ 混合Ｇαサブユニットの利用を介して、異なる機能分類の受容体を制御しシグ
ナルを所定の経路に通すことができる。例えば、外来性に提供されたＧα１６又
の様な混合Ｇαサブユニット又はＧαｚｑの様なキメラＧαサブユニットを持つ
細胞をベースとしたアッセイシステムを提供することで、通常は特定のシグナル
伝達経路（例えばＧｓ、Ｇｉ、Ｇｑ、Ｇｚ等）を介し共役することが多いＧＰＣ
Ｒを、混合Ｇαサブユニットによって規定された経路を介し共役させること、そ
してアゴニスト活性化によりそのサブユニットの経路に関連する第２メッセンジ
ャーを生ずることができる。Ｇα１６及び／又はＧαｑｚの場合、これにはＧｑ
経路の活性化と第２メッセンジャーであるイノシトールリン酸の産生が含まれる
。同様の方法と手段を利用し、受容体シグナル伝達をＣａ＋＋、ｃＡＭＰ、Ｋ＋
電流等のその他第２メッセンジャーを生ずる経路に偏向させることができる。
ナルを所定の経路に通すことができる。例えば、外来性に提供されたＧα１６又
の様な混合Ｇαサブユニット又はＧαｚｑの様なキメラＧαサブユニットを持つ
細胞をベースとしたアッセイシステムを提供することで、通常は特定のシグナル
伝達経路（例えばＧｓ、Ｇｉ、Ｇｑ、Ｇｚ等）を介し共役することが多いＧＰＣ
Ｒを、混合Ｇαサブユニットによって規定された経路を介し共役させること、そ
してアゴニスト活性化によりそのサブユニットの経路に関連する第２メッセンジ
ャーを生ずることができる。Ｇα１６及び／又はＧαｑｚの場合、これにはＧｑ
経路の活性化と第２メッセンジャーであるイノシトールリン酸の産生が含まれる
。同様の方法と手段を利用し、受容体シグナル伝達をＣａ＋＋、ｃＡＭＰ、Ｋ＋
電流等のその他第２メッセンジャーを生ずる経路に偏向させることができる。
【０２０６】 微小生理学的アッセイ 細胞の代謝は広範囲の細胞事象（各種第２メッセンジャー経路の受容体活性化
を含む）に複雑に関連し、また影響されることから、細胞代謝の微量物理計測の
利用は原則として、受容体の基部シグナル伝達経路の特異性に関係なく、何れか
の受容体の活性化により生じた細胞活動に関する全体的なアッセイを提供する。
を含む）に複雑に関連し、また影響されることから、細胞代謝の微量物理計測の
利用は原則として、受容体の基部シグナル伝達経路の特異性に関係なく、何れか
の受容体の活性化により生じた細胞活動に関する全体的なアッセイを提供する。
【０２０７】 細胞調製及び微量物理的アッセイの記録に関する一般ガイドラインは既に報告
されている（Ｓａｌｏｎ、Ｊ．Ａ．及びＯｗｉｃｋｉ、Ｊ．Ａ．，１９９６）。
一過性にトランスフェクトされたＣＨＯを利用する典型的なプロトコールは次の
通りである；記録２４時間前に、トランスフェクション細胞を集め、細胞数を測
る。３×１０５細胞を細胞培養カプセル（コースター（Ｃｏｓｔａｒ））に接種
し、カプセル膜に接着させる。１０時間後（記録１４時間前）に細胞培地を無血
清Ｆ−１２完全培地に変更し、血清因子の組合せによる不確定な代謝刺激を最小
化する。
されている（Ｓａｌｏｎ、Ｊ．Ａ．及びＯｗｉｃｋｉ、Ｊ．Ａ．，１９９６）。
一過性にトランスフェクトされたＣＨＯを利用する典型的なプロトコールは次の
通りである；記録２４時間前に、トランスフェクション細胞を集め、細胞数を測
る。３×１０５細胞を細胞培養カプセル（コースター（Ｃｏｓｔａｒ））に接種
し、カプセル膜に接着させる。１０時間後（記録１４時間前）に細胞培地を無血
清Ｆ−１２完全培地に変更し、血清因子の組合せによる不確定な代謝刺激を最小
化する。
【０２０８】 実験日には、細胞カプセルを微量物理計測装置（サイトセンサー、漏れキュラ
ーディバイス社、サニーバール、カリフォルニア（Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ、Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｕｎｎｙｖａｌ
ｅ、ＣＡ））に移し、０．１％無血清ＢＳＡ（脂肪酸を含まない）を含む記録媒
体（低緩衝液ＲＰＭＩ１６４０、重炭酸無し、血清無し）に平衡化させ、その間
に基礎代謝活性のベースライン測定を行う。記録プロトコールは、流速１００μ
ｌ／分、及び率測定中に３０秒間の流れ中断を含む２分のポンプサイクルより構
成されている。処理には、処理後最初の速度測定を行う直前に薬物に１分２０秒
作用させること、続いて合計５分２０秒の薬物作用に関する２回のポンプサイク
ルを含む。次に薬物は洗い流され、速度をベースラインに戻す。報告される細胞
外酸性化速度は、処理直前に観察されたベースライン率に対するピーク反応の％
増加として表される。
ーディバイス社、サニーバール、カリフォルニア（Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ、Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｕｎｎｙｖａｌ
ｅ、ＣＡ））に移し、０．１％無血清ＢＳＡ（脂肪酸を含まない）を含む記録媒
体（低緩衝液ＲＰＭＩ１６４０、重炭酸無し、血清無し）に平衡化させ、その間
に基礎代謝活性のベースライン測定を行う。記録プロトコールは、流速１００μ
ｌ／分、及び率測定中に３０秒間の流れ中断を含む２分のポンプサイクルより構
成されている。処理には、処理後最初の速度測定を行う直前に薬物に１分２０秒
作用させること、続いて合計５分２０秒の薬物作用に関する２回のポンプサイク
ルを含む。次に薬物は洗い流され、速度をベースラインに戻す。報告される細胞
外酸性化速度は、処理直前に観察されたベースライン率に対するピーク反応の％
増加として表される。
【０２０９】 ＧＰＣＲリガンドライブラリー ＭＣＨ１の様な新規受容体の機能アッセイは、全ての既知ＧＰＣＲｓに関する
代表的なアゴニスト及び予想ＧＰＣＲｓに関するアゴニストであろう、又はＧＰ
ＣＲｓに関連する末梢標的に対するエフェクターであろうその他化合物を含む化
合物の小ライブラリーを対象とした予備試験を含むであろう。本研究に用いた集
団にはＧＰＣＲｓに関し報告されている４５分類以上（セロトニン、ドーパミン
、ノルアドレナリン、オピオイド等）について約１８０種類の化合物（小分子、
ホルモン、プレプロホルモン、ペプチド等を含む）を含んでおり、さらに既知の
又は予想されているが必ずしも薬理学的特徴付け、またはクローン化されていな
いＧＰＣＲファミリー（ＭＣＨの様な）も含まれている。
代表的なアゴニスト及び予想ＧＰＣＲｓに関するアゴニストであろう、又はＧＰ
ＣＲｓに関連する末梢標的に対するエフェクターであろうその他化合物を含む化
合物の小ライブラリーを対象とした予備試験を含むであろう。本研究に用いた集
団にはＧＰＣＲｓに関し報告されている４５分類以上（セロトニン、ドーパミン
、ノルアドレナリン、オピオイド等）について約１８０種類の化合物（小分子、
ホルモン、プレプロホルモン、ペプチド等を含む）を含んでおり、さらに既知の
又は予想されているが必ずしも薬理学的特徴付け、またはクローン化されていな
いＧＰＣＲファミリー（ＭＣＨの様な）も含まれている。
【０２１０】 ライブラリーの範囲を広げ、ＧＰＣＲサブタイプに特異的なアゴニスト及びア
ンタゴニスト、コンビナトリアルペプチド、及び／又は小分子ライブラリー、天
然産物コレクション等を含めることもできる。ロボット処理を容易にするために
、基質は個別の、又はプールされた化合物濃縮体として９６ウエルプレートに分
注され、調製済み試薬プレートとして凍結保存される。
ンタゴニスト、コンビナトリアルペプチド、及び／又は小分子ライブラリー、天
然産物コレクション等を含めることもできる。ロボット処理を容易にするために
、基質は個別の、又はプールされた化合物濃縮体として９６ウエルプレートに分
注され、調製済み試薬プレートとして凍結保存される。
【０２１１】 ヒトＭＣＨ１受容体をコードするｍＲＮＡの局在 ＭＣＨ１に適したプローブの開発：放射線標識したアンチセンスＲＮＡプロー
ブの産生を容易にするために、ラットＭＣＨ１をコードしている遺伝子断片をＲ
ＮＡポリメラーゼプロモーター部位を含むプラスミドベクター内にサブクローニ
ングする。ラットＭＣＨ１をコードしている完全長ｃＤＮＡをＰｓｔ１で消化し
、（ヌクレオチド９０５−１１９４）この２８９ヌクレオチドの断片をｓｐ６及
びＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位を両方含むｐＧＥＭ３ｚのＰｓｔＩ
部位にクローニングする。この構築体を配列決定し、配列の同一性と方向を確認
した。ＲＮＡのアンチセンス鎖を合成するために、この構築体をＨｉｎｄＩＩＩ
又はＥｃｏＲＩにて直線化し（方向に依存して）、Ｔ７又はｓｐ６ＲＮＡポリメ
ラーゼを用い以下の様にして放射線標識ヌクレオチドを取り込ませる。
ブの産生を容易にするために、ラットＭＣＨ１をコードしている遺伝子断片をＲ
ＮＡポリメラーゼプロモーター部位を含むプラスミドベクター内にサブクローニ
ングする。ラットＭＣＨ１をコードしている完全長ｃＤＮＡをＰｓｔ１で消化し
、（ヌクレオチド９０５−１１９４）この２８９ヌクレオチドの断片をｓｐ６及
びＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位を両方含むｐＧＥＭ３ｚのＰｓｔＩ
部位にクローニングする。この構築体を配列決定し、配列の同一性と方向を確認
した。ＲＮＡのアンチセンス鎖を合成するために、この構築体をＨｉｎｄＩＩＩ
又はＥｃｏＲＩにて直線化し（方向に依存して）、Ｔ７又はｓｐ６ＲＮＡポリメ
ラーゼを用い以下の様にして放射線標識ヌクレオチドを取り込ませる。
【０２１２】 構成的に発現されるタンパク質である、ラットのグリセルアルデヒド３−リン
酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子をコードするプローブを同時に用いた
。ＧＡＰＤＨは全ての組織にて比較的一定のレベルで発現され、その検出を利用
して異なる領域でのラットＭＣＨ１受容体遺伝子の発現レベルを比較する。
酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子をコードするプローブを同時に用いた
。ＧＡＰＤＨは全ての組織にて比較的一定のレベルで発現され、その検出を利用
して異なる領域でのラットＭＣＨ１受容体遺伝子の発現レベルを比較する。
【０２１３】 プローブの合成：ファージポリメラーゼプロモーター配列が先行するＭＣＨ１
及びＧＡＰＤＨのｃＤＮＡ配列を用い放射線標識リボプローブが合成されるであ
ろう。リボプローブの合成条件は以下の通りである：０．２５−１．０μｇ直線
化ＤＮＡプラスミド鋳型、１．５μｌのＡＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ（各１０ｍＭ）
、３μｌのジチオスレイトール（０．１Ｍ）、３０単位のＲＮＡｓｉｎ ＲＮＡ
ｓｅ阻害剤、０．５−１．０μｌ（１５−２０単位／μｌ）のＲＮＡポリメラー
ゼ、７．０μｌの転写緩衝液（プロメガ社）及び１２．５μｌのα−３２Ｐ−Ｃ
ＴＰ（比活性３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）。０．１ｍＭのＣＴＰ（０．０２−１
．０μｌ）が反応液に加えられ、容積はＤＥＰＣ処理水により３５μｌに調製さ
れるであろう。標識反応は３７℃にて６０分間行われ、その後３単位のＲＱ１無
ＲＮＡｓｅＤＮＡｓｅ（プロメタ社）が加えられ鋳型は消化されるであろう。リ
ボプローブはマイクロスピン（Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ）Ｓ−３００カラム（ファル
マシアバイオテック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用い、未取り込
みヌクレオチドから分離されるであろう。ＴＣＡ沈殿と液体シンチレーション分
光測定法を用い、プローブ内に取り込まれた標識体量が測定されるであろう。合
成された全リボプローブ分画は０．２５ｍｍ厚の７Ｍ尿素、４．５％アクリルア
ミド配列決定ゲル上にて分子量分画されるであろう。これらゲルは記憶型燐光ス
クリーンに接触させられ、燐光画像解析装置（モレキュラーディバイス、サニー
ベール、カリフォルニア）を用いオートラジオグラフィースキャンされ、合成さ
れたプローブが完全長であり、分解していないことが確認される。
及びＧＡＰＤＨのｃＤＮＡ配列を用い放射線標識リボプローブが合成されるであ
ろう。リボプローブの合成条件は以下の通りである：０．２５−１．０μｇ直線
化ＤＮＡプラスミド鋳型、１．５μｌのＡＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ（各１０ｍＭ）
、３μｌのジチオスレイトール（０．１Ｍ）、３０単位のＲＮＡｓｉｎ ＲＮＡ
ｓｅ阻害剤、０．５−１．０μｌ（１５−２０単位／μｌ）のＲＮＡポリメラー
ゼ、７．０μｌの転写緩衝液（プロメガ社）及び１２．５μｌのα−３２Ｐ−Ｃ
ＴＰ（比活性３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）。０．１ｍＭのＣＴＰ（０．０２−１
．０μｌ）が反応液に加えられ、容積はＤＥＰＣ処理水により３５μｌに調製さ
れるであろう。標識反応は３７℃にて６０分間行われ、その後３単位のＲＱ１無
ＲＮＡｓｅＤＮＡｓｅ（プロメタ社）が加えられ鋳型は消化されるであろう。リ
ボプローブはマイクロスピン（Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ）Ｓ−３００カラム（ファル
マシアバイオテック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用い、未取り込
みヌクレオチドから分離されるであろう。ＴＣＡ沈殿と液体シンチレーション分
光測定法を用い、プローブ内に取り込まれた標識体量が測定されるであろう。合
成された全リボプローブ分画は０．２５ｍｍ厚の７Ｍ尿素、４．５％アクリルア
ミド配列決定ゲル上にて分子量分画されるであろう。これらゲルは記憶型燐光ス
クリーンに接触させられ、燐光画像解析装置（モレキュラーディバイス、サニー
ベール、カリフォルニア）を用いオートラジオグラフィースキャンされ、合成さ
れたプローブが完全長であり、分解していないことが確認される。
【０２１４】 液体ハイブリダイゼーション／リボヌクレアーゼ保護アッセイ（ＲＰＡ）： 液体ハイブリダイゼーションに関しては、２．０μｇの組織より分離したｍＲ
ＮＡが用いられるであろう。陰性コントロールは３０μｇの転移ＲＮＡ（ｔＲＮ
Ａ）又は組織無しのブランクである。いずれのｍＲＮＡ鎖ヌルも１．５ｍｌの微
量遠心チューブに入れられ、真空乾燥させられる。０．２５−２．０Ｅ６カウン
トの各プローブを含むハイブリダイゼーション緩衝液（４０μｌの４００ｍＭ
ＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐｈ６．４、２ｍＭのＥＤＴＡ、８０％フォル
ムアミド液）が各チューブに加えられるであろう。サンプルは９５℃にて１５分
間加熱され、その後温度はハイブリダイゼーションに合わせ５５℃まで下げられ
る。
ＮＡが用いられるであろう。陰性コントロールは３０μｇの転移ＲＮＡ（ｔＲＮ
Ａ）又は組織無しのブランクである。いずれのｍＲＮＡ鎖ヌルも１．５ｍｌの微
量遠心チューブに入れられ、真空乾燥させられる。０．２５−２．０Ｅ６カウン
トの各プローブを含むハイブリダイゼーション緩衝液（４０μｌの４００ｍＭ
ＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐｈ６．４、２ｍＭのＥＤＴＡ、８０％フォル
ムアミド液）が各チューブに加えられるであろう。サンプルは９５℃にて１５分
間加熱され、その後温度はハイブリダイゼーションに合わせ５５℃まで下げられ
る。
【０２１５】 １４−１８時間ハイブリダイゼーションさせた後、ＲＮＡ／プローブ混合体は
ＲＮＡｓｅＡ（シグマ）及びＲＮＡｓｅＴ１（ライフテックノロジー社（Ｌｉｆ
ｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により消化されるであろう。３３０ｍＭのＮａ
Ｃｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）及び５ｍＭのＥＤＴＡ（４００μｌ）
を含む緩衝液の２．０μｇのＲＮＡｓｅＡ及び１０００単位のＲＮＡｓｅＴ１混
合体を各サンプルに加え、室温にて９０分間インキュベーションする。ＲＮＡｓ
ｅにて消化した後、１０％ＳＤＳ２０μｌ及び５０μｇのプロテネースＫを各チ
ューブに加え、３７℃にて１５分間インキュベーションされる。サンプルはフェ
ノール／クロロフォルム：イソアミルアルコールで抽出され、２容量のエタノー
ル中に、１時間、−７０℃にて沈殿させられるであろう。ペレットペイント（ノ
バジェン社（Ｎｏｖａｇｅｎ））がキャリアーとして各チューブに加えられ（２
．０μｇ）沈殿が加速するであろう。沈殿後、サンプルは遠心分離され、冷７０
％エタノールで洗浄、真空乾燥されるであろう。サンプルはフォルムアミド添加
緩衝液に溶解され、尿素／アクリルアミド配列決定ゲル（７．０Ｍ尿素、４．５
％アクリルアミドのＴｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡ）上にて分子サイズ分画される
であろう。ゲルは乾燥され、記憶型燐光スクリーンにかけられ、燐光画像処理装
置（モレキュラーダイナミックス、サニーベール、カリフォルニア）を用いスキ
ャンされるであろう。
ＲＮＡｓｅＡ（シグマ）及びＲＮＡｓｅＴ１（ライフテックノロジー社（Ｌｉｆ
ｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により消化されるであろう。３３０ｍＭのＮａ
Ｃｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）及び５ｍＭのＥＤＴＡ（４００μｌ）
を含む緩衝液の２．０μｇのＲＮＡｓｅＡ及び１０００単位のＲＮＡｓｅＴ１混
合体を各サンプルに加え、室温にて９０分間インキュベーションする。ＲＮＡｓ
ｅにて消化した後、１０％ＳＤＳ２０μｌ及び５０μｇのプロテネースＫを各チ
ューブに加え、３７℃にて１５分間インキュベーションされる。サンプルはフェ
ノール／クロロフォルム：イソアミルアルコールで抽出され、２容量のエタノー
ル中に、１時間、−７０℃にて沈殿させられるであろう。ペレットペイント（ノ
バジェン社（Ｎｏｖａｇｅｎ））がキャリアーとして各チューブに加えられ（２
．０μｇ）沈殿が加速するであろう。沈殿後、サンプルは遠心分離され、冷７０
％エタノールで洗浄、真空乾燥されるであろう。サンプルはフォルムアミド添加
緩衝液に溶解され、尿素／アクリルアミド配列決定ゲル（７．０Ｍ尿素、４．５
％アクリルアミドのＴｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡ）上にて分子サイズ分画される
であろう。ゲルは乾燥され、記憶型燐光スクリーンにかけられ、燐光画像処理装
置（モレキュラーダイナミックス、サニーベール、カリフォルニア）を用いスキ
ャンされるであろう。
【０２１６】 ＲＴ−ＰＣＲ：ヒトＭＣＨ１をコードするＲＮＡを検出するために、ヒト組織
より抽出されたｍＲＮＡについてＲＴ−ＰＣＲを実施した。逆転写及びＰＣＲ反
応はＥＺｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ））を用い、５０ｍｌの容量にて実施した。以下の配列を持つプライ
マーを用いた： 前方向プライマー（ＲＡ ＳＬＣ１ａ／ＭＣＨ Ｆ）； ＴＣＡ ＧＣＴ Ｃ
ＧＧ ＴＴＧ ＴＧＧ ＧＡＧ ＣＡ（配列番号１４） 逆方向プライマー（ＲＡ／ＳＬＣ１ａ／ＭＣＨ Ｂ）； ＣＴＴ ＧＧＡ Ｃ
ＴＴ ＣＴＴ ＣＡＣ ＧＡＣ（配列番号１５） これらプライマーはヌクレオチド１６９から４１７の２４８ｂｐ塩基対断片を
増幅するであろう。
より抽出されたｍＲＮＡについてＲＴ−ＰＣＲを実施した。逆転写及びＰＣＲ反
応はＥＺｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ））を用い、５０ｍｌの容量にて実施した。以下の配列を持つプライ
マーを用いた： 前方向プライマー（ＲＡ ＳＬＣ１ａ／ＭＣＨ Ｆ）； ＴＣＡ ＧＣＴ Ｃ
ＧＧ ＴＴＧ ＴＧＧ ＧＡＧ ＣＡ（配列番号１４） 逆方向プライマー（ＲＡ／ＳＬＣ１ａ／ＭＣＨ Ｂ）； ＣＴＴ ＧＧＡ Ｃ
ＴＴ ＣＴＴ ＣＡＣ ＧＡＣ（配列番号１５） これらプライマーはヌクレオチド１６９から４１７の２４８ｂｐ塩基対断片を
増幅するであろう。
【０２１７】 各反応液は、０．１μｇのｍＲＮＡ及び０．３μＭの各プライマーを含む。各
反応液の試薬濃度は：ＧＴＰ：ｄＡＴＰ；ｄＣＴＰ；ｄＴＴＰそれぞれ３００μ
Ｍ；２．５ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２；５０ｍＭのビシン；１１５ｍＭの酢酸カリ
ウム、８％のグリセロール及び５単位のＥＺｒＴｈｔ ＤＮＡポリメラーゼ。Ｐ
ＣＲに関するいずれの試薬（ｍＲＮＡ及びオリゴヌクレオチドプライマーを除く
）もパーキンエルマー社より得た。反応は以下の条件に実施された：６５℃６０
分、９４℃２分、（９４℃、１分、６５℃、１分）３５サイクル、７２℃、１０
分。ＰＣＲ反応液は１０％ポリアクリルアミドを用いたゲル電気泳動によりサイ
ズ分画された。ＤＮＡはＳＹＢＲグリーンＩ（モレキュラープローブ、ユージー
ン、オレゴン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）によ
り染色され、モレキュラーダイナミクス社製（サニーベール）Ｓｔｏｒｍ８６０
により、４５０ｎＭの青蛍光モードにてスキャンされた。
反応液の試薬濃度は：ＧＴＰ：ｄＡＴＰ；ｄＣＴＰ；ｄＴＴＰそれぞれ３００μ
Ｍ；２．５ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）２；５０ｍＭのビシン；１１５ｍＭの酢酸カリ
ウム、８％のグリセロール及び５単位のＥＺｒＴｈｔ ＤＮＡポリメラーゼ。Ｐ
ＣＲに関するいずれの試薬（ｍＲＮＡ及びオリゴヌクレオチドプライマーを除く
）もパーキンエルマー社より得た。反応は以下の条件に実施された：６５℃６０
分、９４℃２分、（９４℃、１分、６５℃、１分）３５サイクル、７２℃、１０
分。ＰＣＲ反応液は１０％ポリアクリルアミドを用いたゲル電気泳動によりサイ
ズ分画された。ＤＮＡはＳＹＢＲグリーンＩ（モレキュラープローブ、ユージー
ン、オレゴン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）によ
り染色され、モレキュラーダイナミクス社製（サニーベール）Ｓｔｏｒｍ８６０
により、４５０ｎＭの青蛍光モードにてスキャンされた。
【０２１８】 ＰＣＲ反応の陽性コントロールは、プラスミド構築体より得た標的配列の増幅
、及び既知配列の逆転写と増幅より成る。陰性コントロールはｍＲＮＡブランク
、及びプライマーとｍＲＮＡブランクより成る。ｍＲＮＡがゲノムＤＮＡに汚染
されていないことを確認するために、サンプルは逆転写前にＲＮＡｓｅ処理され
た。ＲＮＡの完全性はＧＡＰＤＨをコードするｍＲＮＡの増幅により検証された
。
、及び既知配列の逆転写と増幅より成る。陰性コントロールはｍＲＮＡブランク
、及びプライマーとｍＲＮＡブランクより成る。ｍＲＮＡがゲノムＤＮＡに汚染
されていないことを確認するために、サンプルは逆転写前にＲＮＡｓｅ処理され
た。ＲＮＡの完全性はＧＡＰＤＨをコードするｍＲＮＡの増幅により検証された
。
【０２１９】 結果と考察 クローニングと配列決定 ＦＢ４１ａに対するＧＥＮＥＭＬ相同体中に発現されている配列タグ（ＥＳＴ ）Ｆ０７２２８の発見 シナプティック製薬所有配列、ＦＢ４１ａを用いたＧＥＮＥＭＢＬのＢＬＡＳ
Ｔ検索の結果、ＦＢ４１ａ及び、ソマトスタチン、オピエート及びガラニン受容
体に高い相同性を持つＥＳＴ（受付番号Ｆ０７２２８）が同定された。
Ｔ検索の結果、ＦＢ４１ａ及び、ソマトスタチン、オピエート及びガラニン受容
体に高い相同性を持つＥＳＴ（受付番号Ｆ０７２２８）が同定された。
【０２２０】 ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーの構築とスクリーニング 平均挿入サイズ３．０ｋｂを持つ合計２．２×１０６個の独立クローンを含む
ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーを発現ベクターｐＥＸＪ．ＢＳ内に調製した。ラ
イブラリーは寒天プレート（アンピシリン選別）に接種され、５０００個の独立
クローンの４５０プールのグリセロール保存体が調製された。一次グリセロール
保存体はさらに約１０にまとめられ、スーパープールが作られた。
ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーを発現ベクターｐＥＸＪ．ＢＳ内に調製した。ラ
イブラリーは寒天プレート（アンピシリン選別）に接種され、５０００個の独立
クローンの４５０プールのグリセロール保存体が調製された。一次グリセロール
保存体はさらに約１０にまとめられ、スーパープールが作られた。
【０２２１】 ＭＣＨ１の完全長配列のクローニング ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーより得たスーパープール及び一次プールのグリ
セロール保存体を、Ｆ０７２２８特異的プライマーＴ５７９及びＴ５８０を用い
たＰＣＲにてスクリーニングした。陽性一次プールの一つ４９０が上手くサブプ
ールに分割でき、ＬＢ培地中に一晩増幅され、プライマーＴ５７９及びＴ５８０
を利用したＰＣＲプライマーにてスクリーニングされた。陽性サブプールの一つ
４９０−４−１０−２３を寒天培地上に接種し（アンピシリン選別）、コロニー
をニトロセルロース膜（シュライヒャーアンドシュール社、ケニー、ニューハン
プシャー）に移した。フィルターを２日間、高厳密条件下に１０６ｃｐｍ／ｍｌ
の３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブであり、Ｆ０７２２８ＥＳＴ配列に対し設計され
たＴ５８１とハイブリダイゼーションした。フィルターを洗浄し、バイオマック
ス（Ｂｉｏｍａｘ）ＭＳフィルム（コダック）に感光させた。７つの陽性コロニ
ーを拾い上げ、ＬＢ−ＡＭＰプレートに線条接種し、一晩増殖させた。元の７個
のコロニーから２個の独立したコロニーを拾い上げ、次のプライマー対を用いた
ベクターアンカーＰＣＲにかけた：Ｔ９５とＴ５８０、及びＴ９４とＴ５７９。
１個の陽性コロニー、Ｇ１をＴＢ中で一晩増幅させ、プラスミド精製にかけた。
このプラスミドはＴＬ２３０と命名され、両方の鎖について配列決定された。ヌ
クレオチド配列及びペプチド配列分析はＧＣＧプログラムを用い実施された（ジ
ェネンティックコンピューターグループ、マジソン、ウイスコンシン）。ＴＬ２
３０のＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩ断片を哺乳動物発現ベクターｐＥＸＪにサブク
ローニングし、ＴＬ２３１と命名した。本構築体中最大のオープンリーディング
フレームは１２６６ヌクレオチドを含み（図１）、これは４２２アミノ酸のタン
パク質をコードすると推測されている（図２）。アミノ末端には３カ所フレーム
内メチオニンがあり、その結果４２２，４１７及び３５３アミン酸のタンパク質
が生じる可能性がある。タンパク質の疎水性分析はＧタンパク質共役受容体ファ
ミリーの指標である７個の膜貫通ドメインの推定立体構造と一致した（図３）。
ＴＬ２３１はＭＣＨ１と命名された。
セロール保存体を、Ｆ０７２２８特異的プライマーＴ５７９及びＴ５８０を用い
たＰＣＲにてスクリーニングした。陽性一次プールの一つ４９０が上手くサブプ
ールに分割でき、ＬＢ培地中に一晩増幅され、プライマーＴ５７９及びＴ５８０
を利用したＰＣＲプライマーにてスクリーニングされた。陽性サブプールの一つ
４９０−４−１０−２３を寒天培地上に接種し（アンピシリン選別）、コロニー
をニトロセルロース膜（シュライヒャーアンドシュール社、ケニー、ニューハン
プシャー）に移した。フィルターを２日間、高厳密条件下に１０６ｃｐｍ／ｍｌ
の３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブであり、Ｆ０７２２８ＥＳＴ配列に対し設計され
たＴ５８１とハイブリダイゼーションした。フィルターを洗浄し、バイオマック
ス（Ｂｉｏｍａｘ）ＭＳフィルム（コダック）に感光させた。７つの陽性コロニ
ーを拾い上げ、ＬＢ−ＡＭＰプレートに線条接種し、一晩増殖させた。元の７個
のコロニーから２個の独立したコロニーを拾い上げ、次のプライマー対を用いた
ベクターアンカーＰＣＲにかけた：Ｔ９５とＴ５８０、及びＴ９４とＴ５７９。
１個の陽性コロニー、Ｇ１をＴＢ中で一晩増幅させ、プラスミド精製にかけた。
このプラスミドはＴＬ２３０と命名され、両方の鎖について配列決定された。ヌ
クレオチド配列及びペプチド配列分析はＧＣＧプログラムを用い実施された（ジ
ェネンティックコンピューターグループ、マジソン、ウイスコンシン）。ＴＬ２
３０のＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩ断片を哺乳動物発現ベクターｐＥＸＪにサブク
ローニングし、ＴＬ２３１と命名した。本構築体中最大のオープンリーディング
フレームは１２６６ヌクレオチドを含み（図１）、これは４２２アミノ酸のタン
パク質をコードすると推測されている（図２）。アミノ末端には３カ所フレーム
内メチオニンがあり、その結果４２２，４１７及び３５３アミン酸のタンパク質
が生じる可能性がある。タンパク質の疎水性分析はＧタンパク質共役受容体ファ
ミリーの指標である７個の膜貫通ドメインの推定立体構造と一致した（図３）。
ＴＬ２３１はＭＣＨ１と命名された。
【０２２２】 ＭＣＨ１配列のデータベース分析は、それがソマトスタチン受容体に最も類似
していることを示した。更にデータベース分析は、ＴＬ２３１のラット相同体と
思われるジーンバンク寄託（受付番号ＡＦ００８６５０、１９９７年１０月１日
寄託）を示した。ＡＦ００８６５０はＭＣＨ１に比べ５’末端側が６９ヌクレオ
チド短く、開始メチオニンが異なると推測された。図４及び図５はそれぞれラッ
トＣＭＨ１受容体のヌクレオチド及びアミノ酸配列の例示である。
していることを示した。更にデータベース分析は、ＴＬ２３１のラット相同体と
思われるジーンバンク寄託（受付番号ＡＦ００８６５０、１９９７年１０月１日
寄託）を示した。ＡＦ００８６５０はＭＣＨ１に比べ５’末端側が６９ヌクレオ
チド短く、開始メチオニンが異なると推測された。図４及び図５はそれぞれラッ
トＣＭＨ１受容体のヌクレオチド及びアミノ酸配列の例示である。
【０２２３】 ＭＣＨ１トランスフェクション細胞のイノシトールリン酸反応 ＭＣＨ１ｃＤＮＡを含む発現ベクター（ｐＥＸＪ）はＧα１６サブユニットを
含む発現ベクターと組合せ、エレクトロポレーション法によりＣｏｓ−７細胞内
にトランスフェクトされた。プレート接種し［３Ｈ］−ミオイノシトールにより
標識した後、トランスフェクタントにその他のものと共にメラニン濃縮ホルモン
（ＭＣＨ）（１０μＭ最終濃度）を含むリガンドライブラリーを作用させ、続い
てイノシトールリン酸（ＩＰ）形成についてアッセイした。７回のスクリーニン
グ中５回で、Ｇα１でトランスフェクトされた細胞に比べＭＣＨ１がトランスフ
ェクトされた細胞（Ｇα１６と共に）が、ＭＣＨを作用された時にのみＩＰ産生
が約１．４倍増加した。
含む発現ベクターと組合せ、エレクトロポレーション法によりＣｏｓ−７細胞内
にトランスフェクトされた。プレート接種し［３Ｈ］−ミオイノシトールにより
標識した後、トランスフェクタントにその他のものと共にメラニン濃縮ホルモン
（ＭＣＨ）（１０μＭ最終濃度）を含むリガンドライブラリーを作用させ、続い
てイノシトールリン酸（ＩＰ）形成についてアッセイした。７回のスクリーニン
グ中５回で、Ｇα１でトランスフェクトされた細胞に比べＭＣＨ１がトランスフ
ェクトされた細胞（Ｇα１６と共に）が、ＭＣＨを作用された時にのみＩＰ産生
が約１．４倍増加した。
【０２２４】 その後の実験は、ＭＣＨ１が単独トランスフェクトされたＣｏｓ−７細胞にお
いて１０μＭのＭＣＨがＩＰ放出をベースのレベルに比べ３．４倍増加させるこ
とができることを示し、この受容体がＧｑシグナル伝達経路を介し共役している
ことが示唆された。ＩＰ反応はＭＣＨに対し用量依存的であり、ＥＣ５０値は９
．３±１．７ｎＭ（ｎ＝２）であり、Ｅｍａｘはベースの値の約４００％であっ
た（４０４±７２）（図６）。
いて１０μＭのＭＣＨがＩＰ放出をベースのレベルに比べ３．４倍増加させるこ
とができることを示し、この受容体がＧｑシグナル伝達経路を介し共役している
ことが示唆された。ＩＰ反応はＭＣＨに対し用量依存的であり、ＥＣ５０値は９
．３±１．７ｎＭ（ｎ＝２）であり、Ｅｍａｘはベースの値の約４００％であっ
た（４０４±７２）（図６）。
【０２２５】 複数の追加化合物が、そのＭＣＨ１活性化能について試験された。ソマトスタ
チン、ハロペリドール、又はジノルフィンＡ１−１３を作用させた場合、ＭＣＨ
１がトランスフェクトされたＣｏｓ−７細胞にイノシトールリン酸形成に関する
用量反応性は検出されず、ＭＣＨ１がソマトスタチン様又はオピオイド様、ある
いはシグマ様ＧＰＣＲサブタイプをコードしている可能性は少なくなった（図７
）。
チン、ハロペリドール、又はジノルフィンＡ１−１３を作用させた場合、ＭＣＨ
１がトランスフェクトされたＣｏｓ−７細胞にイノシトールリン酸形成に関する
用量反応性は検出されず、ＭＣＨ１がソマトスタチン様又はオピオイド様、ある
いはシグマ様ＧＰＣＲサブタイプをコードしている可能性は少なくなった（図７
）。
【０２２６】 ＭＣＨ１トランスフェクション細胞のＭＣＨに対する微小生理学的反応 ＣＨＯ細胞がリポフェクタントを利用し一過性にＭＣＨ１でトランスフェクシ
ョンされ、ＭＣＨまたはＰｈｅ１３、Ｔｙｒ１９−ＭＣＨを濃度を上げながら作
用させ、その後の細胞外酸性化速度の変化をモニタリングした。両リガンドとも
用量依存的に酸性化速度を増加し、ＥＣ５０値はＭＣＨに関しては８．６ｎＭで
ありＰｈｅ１３、Ｔｙｒ１９−ＭＣＨについては５１．８ｎＭであった。元のＣ
ＨＯ細胞又は模擬（ｐＥＸＪ）トランスフェクションＣＨＯ細胞はいずれも、Ｍ
ＣＨまたはＰｈｅ１３、Ｔｙｒ１９−ＭＣＨを作用させても酸性化速度に変化を
示さなかった（図８）。
ョンされ、ＭＣＨまたはＰｈｅ１３、Ｔｙｒ１９−ＭＣＨを濃度を上げながら作
用させ、その後の細胞外酸性化速度の変化をモニタリングした。両リガンドとも
用量依存的に酸性化速度を増加し、ＥＣ５０値はＭＣＨに関しては８．６ｎＭで
ありＰｈｅ１３、Ｔｙｒ１９−ＭＣＨについては５１．８ｎＭであった。元のＣ
ＨＯ細胞又は模擬（ｐＥＸＪ）トランスフェクションＣＨＯ細胞はいずれも、Ｍ
ＣＨまたはＰｈｅ１３、Ｔｙｒ１９−ＭＣＨを作用させても酸性化速度に変化を
示さなかった（図８）。
【０２２７】 ＭＣＨ１−トランスフェクション細胞の転写反応 Ｃｏｓ−７細胞をＤＥＡＥ−デキストラン法によりＭＣＨ１及びｃ−ｆｏｓ−
β−ｇａｌレポーター構築体により一過性にトランスフェクションした。細胞に
ＭＣＨを含む薬剤の組合せを作用させ、βガラクトシダーゼタンパク質の発現に
関する比色アッセイにより転写活性を測定した。１０μＭの濃度のＭＣＨによる
初回単一投与によりｃ−ｆｏｓ−制御転写活性は、培地のみを作用させた場合に
比べ約３．９倍増加した。ｃ−ｆｏｓ−β−ｇａｌ構築体のみトランスフェクト
された細胞は、ＭＣＨにたいする反応を示さなかった。続く実験は、この転写活
性化反応がＭＣＨに対し用量依存的であり、ＥＣ５０値が１１６ｎＭであること
を示した（図９）。
β−ｇａｌレポーター構築体により一過性にトランスフェクションした。細胞に
ＭＣＨを含む薬剤の組合せを作用させ、βガラクトシダーゼタンパク質の発現に
関する比色アッセイにより転写活性を測定した。１０μＭの濃度のＭＣＨによる
初回単一投与によりｃ−ｆｏｓ−制御転写活性は、培地のみを作用させた場合に
比べ約３．９倍増加した。ｃ−ｆｏｓ−β−ｇａｌ構築体のみトランスフェクト
された細胞は、ＭＣＨにたいする反応を示さなかった。続く実験は、この転写活
性化反応がＭＣＨに対し用量依存的であり、ＥＣ５０値が１１６ｎＭであること
を示した（図９）。
【０２２８】 ＭＣＨ１トランスフェクション細胞に於ける［１２５Ｉ］Ｐｈｅ１３、Ｔｙｒ １９−ＭＣＨの結合 ＤＥＡＥ−デキストラン法によりＭＣＨ１がトランスフェクトされたＣｏｓ−
７細胞より集めた膜は、０．１ｎＭ放射性リガンド濃度に於いて模擬トランスフ
ェクション細胞（約２０ｆｍｏｌ／ｍｇ膜タンパク質）に比べ［１２５Ｉ］Ｐｈ
ｅ１３、Ｔｙｒ１９−ＭＣＨに対し特異的な結合（約８０ｆｍｏｌ／ｍｇ膜タン
パク質）を表した。０．１ｎＭの放射性リガンド濃度に於いて、特異的［１２５ Ｉ］Ｐｈｅ１３、Ｔｙｒ１９−ＭＣＨ結合は全結合の約７０％であった（図１０
）。
７細胞より集めた膜は、０．１ｎＭ放射性リガンド濃度に於いて模擬トランスフ
ェクション細胞（約２０ｆｍｏｌ／ｍｇ膜タンパク質）に比べ［１２５Ｉ］Ｐｈ
ｅ１３、Ｔｙｒ１９−ＭＣＨに対し特異的な結合（約８０ｆｍｏｌ／ｍｇ膜タン
パク質）を表した。０．１ｎＭの放射性リガンド濃度に於いて、特異的［１２５ Ｉ］Ｐｈｅ１３、Ｔｙｒ１９−ＭＣＨ結合は全結合の約７０％であった（図１０
）。
【０２２９】 ヒトＭＣＨ１受容体をコードするｍＲＮＡの局在 ＲＴ−ＰＣＲを利用し、各種ヒト組織から単離されたｍＲＮＡサンプル中のＭ
ＣＨ１受容体をコードしているメッセージの存在について調べた（表１、図１１
）。増幅後、ＰＣＲ反応は１０％ポリアクリルアミドゲル上にてサイズ分画され
、ＳＹＢＲグリーンＩで染色された。画像はモレキュラーダイナミクス社製Ｓｔ
ｏｒｍ８６０ワークステーションを用い解析された。ＭＣＨ１受容体に対応する
増幅バンド（４９０塩基対）が示された（矢印）。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ヒトＭ
ＣＨ１受容体をコードするｍＲＮＡが、中枢神経系組織や末梢器官を含めた調査
対象全ての組織に広く分布していることを示した。この広範囲の分布は、神経系
や内分泌メカニズムを含む広範な制御機能を暗示している。
ＣＨ１受容体をコードしているメッセージの存在について調べた（表１、図１１
）。増幅後、ＰＣＲ反応は１０％ポリアクリルアミドゲル上にてサイズ分画され
、ＳＹＢＲグリーンＩで染色された。画像はモレキュラーダイナミクス社製Ｓｔ
ｏｒｍ８６０ワークステーションを用い解析された。ＭＣＨ１受容体に対応する
増幅バンド（４９０塩基対）が示された（矢印）。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ヒトＭ
ＣＨ１受容体をコードするｍＲＮＡが、中枢神経系組織や末梢器官を含めた調査
対象全ての組織に広く分布していることを示した。この広範囲の分布は、神経系
や内分泌メカニズムを含む広範な制御機能を暗示している。
【０２３０】
【表１】 ヒトＭＣＨ１受容体をコードしている遺伝子のクローニングは、薬理学的特徴
付け、及びそのｍＲＮＡ分布のノーザン及びインサイチューマッピングからその
生理学的役割を推測する手段を提供する。更に、ヒトＭＣＨ１受容体をコードす
るＤＮＡが利用できることは、インビボでの遺伝子産物の機能を規定する上で有
用な抗体及びアンチセンス技術の開発を容易にするであろう。ｍＲＮＡを標的と
し、インビトロに於ける遺伝子産物の翻訳を選択的に阻止するアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドは、単一遺伝子の発現とその後の機能とを上手く結びつけること
に利用されている。即ち、この受容体遺伝子のクローニングにより、神経系及び
その他の部位に於ける生理学的役割を探索し、それによってＧＰＣＲスーパーフ
ァミリー内に於ける構造／機能相関を推測するのに役立つ手段が提供される。
付け、及びそのｍＲＮＡ分布のノーザン及びインサイチューマッピングからその
生理学的役割を推測する手段を提供する。更に、ヒトＭＣＨ１受容体をコードす
るＤＮＡが利用できることは、インビボでの遺伝子産物の機能を規定する上で有
用な抗体及びアンチセンス技術の開発を容易にするであろう。ｍＲＮＡを標的と
し、インビトロに於ける遺伝子産物の翻訳を選択的に阻止するアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドは、単一遺伝子の発現とその後の機能とを上手く結びつけること
に利用されている。即ち、この受容体遺伝子のクローニングにより、神経系及び
その他の部位に於ける生理学的役割を探索し、それによってＧＰＣＲスーパーフ
ァミリー内に於ける構造／機能相関を推測するのに役立つ手段が提供される。
【０２３１】 ＴＬ２３１のｃＤＮＡ配列中に３カ所の潜在的開始コドンがあることから、可
能な転写たいのうちどれが活性型ＭＣＨ受容体を生ずるのかという疑問がわく。
ＴＬ２３１の第１及び第２開始コドンの転写体が機能的ヒトＭＣＨ受容体をコー
ドしていることを確かめるために、ＴＬ２３１のメチオニン６及び７０をアラニ
ンに変異させた（構築体Ｒ１１４；図１２参照）。位置７０にある第３メチオニ
ンもアラニンに変異させた（構築体Ｒ１０６；図１２参照）。ＴＬ２３１、Ｒ１
０６又はＲ１１４いずれをトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞も、カルシ
ウム色素Ｆｌｕｏ−３（ＦＬＩＰＲ、モレキュラーディバイス社）を負荷した細
胞内の蛍光強度測定プレートリーダーによる測定では、ＭＣＨ−伝達細胞内カル
シウムを増加した。表２に示す様に、ＴＬ２３１、Ｒ１０６、Ｒ１１４及びＢＯ
１２０でトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞は、濃度を上げながらＭＣＨを
作用させた時、細胞内カルシウムが用量依存的に可動化することが示された。こ
れらデータは、ＴＬ２３１の第１及び／又は第２、そして第３メチオニンから開
始する転写体が機能的なヒトＭＣＨ受容体をコードしていることを示している。
能な転写たいのうちどれが活性型ＭＣＨ受容体を生ずるのかという疑問がわく。
ＴＬ２３１の第１及び第２開始コドンの転写体が機能的ヒトＭＣＨ受容体をコー
ドしていることを確かめるために、ＴＬ２３１のメチオニン６及び７０をアラニ
ンに変異させた（構築体Ｒ１１４；図１２参照）。位置７０にある第３メチオニ
ンもアラニンに変異させた（構築体Ｒ１０６；図１２参照）。ＴＬ２３１、Ｒ１
０６又はＲ１１４いずれをトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞も、カルシ
ウム色素Ｆｌｕｏ−３（ＦＬＩＰＲ、モレキュラーディバイス社）を負荷した細
胞内の蛍光強度測定プレートリーダーによる測定では、ＭＣＨ−伝達細胞内カル
シウムを増加した。表２に示す様に、ＴＬ２３１、Ｒ１０６、Ｒ１１４及びＢＯ
１２０でトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞は、濃度を上げながらＭＣＨを
作用させた時、細胞内カルシウムが用量依存的に可動化することが示された。こ
れらデータは、ＴＬ２３１の第１及び／又は第２、そして第３メチオニンから開
始する転写体が機能的なヒトＭＣＨ受容体をコードしていることを示している。
【０２３２】
【表２】 ＊ ２回の独立した実験より得た結果。
【０２３３】 ＊＊ ＲＦＵ＝相対蛍光単位
【０２３４】
【参照文献】
【０２３５】
【配列表】
【図１】 ヒトＭＣＨ１受容体（ＭＣＨ１）をコードするヌクレオチド配列（配列番号１
）。３カ所の潜在的開始（ＡＴＧ）コドン及びストップ（ＴＧＡ）コドンには下
線を付けた。
）。３カ所の潜在的開始（ＡＴＧ）コドン及びストップ（ＴＧＡ）コドンには下
線を付けた。
【図２】 図１（配列番号１）に示すヌクレオチド配列にコードされるヒトＭＣＨ１受容
体（ＭＣＨ１）の演繹アミノ酸配列（配列番号２）
体（ＭＣＨ１）の演繹アミノ酸配列（配列番号２）
【図３】 ヒトＭＣＨ１に関する演繹アミノ酸配列（配列番号２）。７カ所の推定膜貫通
（ＴＭ）域に下線を付した。
（ＴＭ）域に下線を付した。
【図４】 ラットＭＣＨ１のヌクレオチド配列（配列番号３）。１開始コドン（ＡＴＧ）
及び停止コドン（ＴＧＡ）に下線を付した。
及び停止コドン（ＴＧＡ）に下線を付した。
【図５】 ラットＭＣＨ１に関する演繹アミノ酸配列（配列番号４）。
【図６】 ＭＣＨに対するＭＣＨ１−伝達ＰＩ用量反応。
【図７】 複数の関心化合物を用いたＭＣＨ１の誘発。
【図８】 ＭＣＨ及びＰｈｅ１３、Ｔｙｒ１９−ＭＣＨに対するＭＣＨ１−伝達細胞外酸
性化反応。結果は２重測定で実施された２回の独立実験の平均として報告されて
いる。
性化反応。結果は２重測定で実施された２回の独立実験の平均として報告されて
いる。
【図９】 ＭＣＨ１−トランスフェクトＣｏｓ−７細胞のＭＣＨに対する転写反応。
【図１０】 ＭＣＨ１−トランスフェクトＣｏｓ−７細胞膜に対する［１２５Ｉ］Ｐｈｅ１ ３ 、Ｔｙｒ１９−ＭＣＨの結合。結果は３重測定の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（縦線
）。
）。
【図１１】 ヒトｍＲＮＡサンプル中のＭＣＨ１受容体ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ検出。
【図１２】 各種プラスミドによりコードされたＭＣＨ１受容体のＮ−末端域のアミノ酸ア
ラインメント。Ｒ１０６（配列番号１６）及びＲ１１４（配列番号１７）に存在
する突然変異は小文字で示されている。潜在的開始メチオニンは太文字で示され
ている。位置１００の下流のアミノ酸配列は４種類全てのプラスミドで同一であ
る。
ラインメント。Ｒ１０６（配列番号１６）及びＲ１１４（配列番号１７）に存在
する突然変異は小文字で示されている。潜在的開始メチオニンは太文字で示され
ている。位置１００の下流のアミノ酸配列は４種類全てのプラスミドで同一であ
る。
【図１３】 プラスミドＲ１０６によりコードされる突然変異型ヒトＭＣＨ１受容体のアミ
ノ酸配列（配列番号２７）。
ノ酸配列（配列番号２７）。
【図１４】 プラスミドＲ１１４によりコードされる突然変異型ヒトＭＣＨ１受容体のアミ
ノ酸配列（配列番号２８）。
ノ酸配列（配列番号２８）。
【図１５】 プラスミドＢＯ１２０によりコードされる突然変異型ヒトＭＣＨ１受容体のア
ミノ酸配列（配列番号２９）。
ミノ酸配列（配列番号２９）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 3/12 ４Ｃ０８４ 3/12 5/06 ４Ｃ０８６ 5/06 9/00 ４Ｈ０４５ 9/00 9/12 9/12 11/00 11/00 11/06 11/06 15/00 15/00 21/00 21/00 25/00 25/00 25/02 １０３ 25/02 １０３ 25/04 25/04 25/06 25/06 25/36 25/36 37/00 37/00 43/00 43/00 Ｃ０７Ｋ 14/72 Ｃ０７Ｋ 14/72 16/28 16/28 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 21/08 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｍ 33/50 33/566 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ， ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｃ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ナゴーニー、ライサ アメリカ合衆国、ニュージャージー州 07410 フェア・ローン、シリル・アベニ ュー ３−31 (72)発明者 ウィルソン、アミー・イー アメリカ合衆国、ニューヨーク州 10128 ニューヨーク、イースト・ナインティセ カンド・ストリート 310、アパートメン ト・２ ダブリュ Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 BB01 BB48 BB50 BB51 CB01 DA13 DA36 FB02 FB08 FB12 GC15 4B024 AA01 AA11 BA63 CA03 CA04 CA09 CA12 CA20 DA01 DA02 DA05 DA11 DA12 EA02 EA04 FA02 GA12 GA13 GA14 GA25 HA11 HA13 HA14 HA17 4B063 QA01 QA05 QA13 QA17 QA19 QQ21 QQ41 QQ43 QQ53 QQ61 QQ79 QQ89 QR32 QR35 QR40 QR56 QR72 QR77 QR80 QS16 QS32 QS34 QS36 QX02 QX05 QX10 4B064 AG20 AG27 CA02 CA05 CA06 CA10 CA11 CA19 CA20 CC01 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA58X AA72X AA90X AA91X AA91Y AA93X AA93Y AB01 AC14 AC20 BA03 BA04 BA05 BA16 BD50 CA44 CA46 4C084 AA13 AA17 NA14 ZA022 ZA082 ZA112 ZA182 ZA362 ZA422 ZA592 ZA612 ZA662 ZA812 ZA942 ZB072 ZC032 ZC042 ZC212 ZC352 ZC392 ZC422 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA08 ZA11 ZA18 ZA36 ZA42 ZA59 ZA61 ZA66 ZA81 ZA94 ZC03 ZC04 ZC21 ZC35 ZC39 ZC42 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA50 DA75 DA76 EA20 EA34 FA74
Claims (168)
- 【請求項１】 ヒトＭＣＨ１受容体、又はＭＣＨまたはその類似体あるいは
相同体により活性化されるヒトＭＣＨ１受容体の変異体をコードしている単離さ
れた核酸。 - 【請求項２】 核酸がＤＮＡである、請求項１の核酸。
- 【請求項３】 ＤＮＡがｃＤＮＡである、請求項２の核酸。
- 【請求項４】 ＤＮＡがゲノミックＤＮＡである、請求項２の核酸。
- 【請求項５】 核酸がＲＮＡである、請求項１の核酸。
- 【請求項６】 ヒトＭＣＨ１受容体が、プラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２
３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）によりコードされるものと同一のアミノ
酸配列を持つ、請求項１の核酸。 - 【請求項７】 ヒトＭＣＨ１受容体が、図２（配列番号２）に示す様なアミ
ノ酸配列を含む、請求項１の核酸。 - 【請求項８】 ヒトＭＣＨ１受容体が、図１３（配列番号２７）に示す様な
アミノ酸配列を含む、請求項１の核酸。 - 【請求項９】 ヒトＭＣＨ１受容体が、図１４（配列番号２８）に示す様な
アミノ酸配列を含む、請求項１の核酸。 - 【請求項１０】 ヒトＭＣＨ１受容体が、図１５（配列番号２９）に示す様
なアミノ酸配列を含む、請求項１の核酸。 - 【請求項１１】 精製されたヒトＭＣＨ１受容体タンパク質。
- 【請求項１２】 請求項１の核酸を含むベクター
- 【請求項１３】 受容体をコードしている核酸にそれが発現可能な様に作動
可能に結合している、細胞内核酸の発現に必要な制御要素を含む細菌、両生類、
酵母、昆虫または哺乳動物細胞中での発現に適合した、請求項１２のベクター。 - 【請求項１４】 ベクターがバキュロウイルスである、請求項１３のベクタ
ー。 - 【請求項１５】 ベクターがプラスミドである、請求項１２のベクター。
- 【請求項１６】 ｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１
９７）と命名された請求項１５のプラスミド。 - 【請求項１７】 請求項１３のベクターを含む細胞。
- 【請求項１８】 細胞が非哺乳動物細胞である、請求項１７の細胞。
- 【請求項１９】 非哺乳動物細胞がアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）
卵細胞、又はアフリカツメガエルのメラノ細胞である、請求項１８のベクター。 - 【請求項２０】 細胞が哺乳動物細胞である、請求項１７の細胞。
- 【請求項２１】 細胞がＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胎児腎臓細胞、ＮＩＨ
−３Ｔ３細胞、ＬＭ（ｔｋ−）細胞、マウスＹ１細胞、又はＣＨＯ細胞である、
請求項２０の哺乳動物細胞。 - 【請求項２２】 請求項１３のベクターを含む昆虫細胞。
- 【請求項２３】 昆虫細胞がＳｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞又はＴｒｉｃｈｏｐ
ｌｕｓｉａ ｎｉ ５Ｂ−４細胞である、請求項２２の昆虫細胞。 - 【請求項２４】 請求項１７の細胞から単離された膜調製体。
- 【請求項２５】 ヒトＭＣＨ１受容体をコードしている核酸に特異的にハイ
ブリダイズする少なくとも１５ヌクレオチドを含み、プラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ
−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）内に存在するヒトＭＣＨ１受容
体をコードする２本鎖の核酸の１本内に存在する配列に対応する特異配列を有す
る核酸プローブ。 - 【請求項２６】 ヒトＭＣＨ１受容体をコードしている核酸に特異的にハイ
ブリダイズする少なくとも１５ヌクレオチドを含み、（ａ）図１に示す核酸配列
（配列番号１）又は（ｂ）その逆方向相補体内に存在する配列に対応する特異配
列を有する核酸プローブ。 - 【請求項２７】 核酸がＤＮＡである請求項２５又は２６の核酸プローブ。
- 【請求項２８】 核酸がＲＮＡである請求項２５又は２６の核酸プローブ。
- 【請求項２９】 ＲＮＡの翻訳を阻止する様に請求項５のＲＮＡに特異的に
ハイブイダイゼーションすることができる配列を持つアンチセンスオリゴヌクレ
オチド。 - 【請求項３０】 請求項４のゲノミックＤＮＢＡに特異的にハイブイダイゼ
ーションすることができる配列を持つアンチセンスオリゴヌクレオチド。 - 【請求項３１】 オリゴヌクレオチドが化学的に修飾されたヌクレオチド、
又はヌクレオチド類似体を含む、請求項２９又は３０のアンチセンスオリゴヌク
レオチド。 - 【請求項３２】 請求項１の核酸によりコードされているヒトＭＣＨ１受容
体に結合できる抗体。 - 【請求項３３】 ヒトＭＣＨ１受容体に対する請求項３２の抗体の結合を競
合的に阻害することができる作用物質。 - 【請求項３４】 抗体がモノクローナル抗体又は抗血清である、請求項３２
の抗体。 - 【請求項３５】 （ａ）細胞膜を通過でき、ヒトＭＣＨ１受容体の発現低下
に効果的である量のる請求項２９のオリゴヌクレオチド、及び（ｂ）細胞膜を通
過できる医薬品として受け入れ可能なキャリアーを含む医薬組成物。 - 【請求項３６】 オリゴヌクレオチドがｍＲＮＡを不活性化する物質に結合
している、請求項３５の医薬組成物。 - 【請求項３７】 ｍＲＮＡを不活性化する物質がリボザイムである、請求項
３６の医薬組成物。 - 【請求項３８】 医薬品として受け入れ可能なキャリアーが、その構造体に
結合した後に細胞によって取り込まれることができる細胞上のヒトＭＣＨ１受容
体に結合している構造体を含んでいる、請求項３５の医薬組成物。 - 【請求項３９】 医薬品として受け入れ可能なキャリアーが選択された細胞
の型に特異的であるヒトＭＣＨ１受容体に結合できる、請求項３５の医薬組成物
。 - 【請求項４０】 ヒトＭＣＨ１受容体に対するリガンドの結合を阻止するの
に有効な量の請求項３２の抗体と、医薬品として受け入れ可能なキャリアーを含
む、医薬組成物。 - 【請求項４１】 請求項１のヒトＭＣＨ１受容体をコードしているＤＮＡを
発現する、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。 - 【請求項４２】 未変性ヒトＭＣＨ１受容体の相同的組み換えノックアウト
を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。 - 【請求項４３】 そのゲノムが、ヒトＭＣＨ１受容体をコードしているｍＲ
ＮＡに対し相補的であり、ヒトＭＣＨ１受容体をコードするｍＲＮＡにハイブリ
ダイゼーションしその転写を減少させるアンチセンスｍＲＮＡに転写される様ゲ
ノム内に配置されている、請求項１のヒトＭＣＨ１受容体をコードしているＤＮ
Ａに対し相補的であるアンチセンスＤＮＡを含んでいる、トランスジェニック非
ヒト哺乳動物。 - 【請求項４４】 ヒトＭＣＨ１受容体をコードしているＤＮＡが更に誘導可
能なプロモーターを含んでいる、請求項４１又は４２のトランスジェニック非ヒ
ト哺乳動物。 - 【請求項４５】 ヒトＭＣＨ１受容体をコードしているＤＮＡが更に組織特
異的な制御要素を含んでいる、請求項４１又は４２のトランスジェニック非ヒト
哺乳動物。 - 【請求項４６】 トランスジェニック非ヒト哺乳動物がマウスである、請求
項４１、４２、又は４３のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。 - 【請求項４７】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡを含み且つそ
の細胞表面上にそれを発現している細胞に、結合に好適な条件下に化合物を接触
せしめること、及び哺乳動物ＭＣＨ１受容体への化合物の特異的結合を検出する
ことを含み、前記細胞が通常は哺乳動物ＭＣＨ１受容体を発現しておらず、哺乳
動物ＭＣＨ１受容体をコードしているＤＮＡが（ａ）低厳密条件下に図１に示す
規定配列（配列番号１）又はそれに対する相補配列を含む核酸とハイブリダイゼ
ーションし、そして（ｂ）ＭＣＨ１リガンドが培養体に加えられ且つＣＨＯ細胞
が上記規定配列またはその相補体を有する核酸にハイブリダイゼーションする核
酸を含む場合に、ＣＨＯ細胞培養体のｐＨに変化をもたらすその能力によって更
に特徴付けられる、哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定す
る方法。 - 【請求項４８】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡを含み且つそ
の細胞表面上にそれを発現している細胞に由来する膜調製体に、結合に好適な条
件下に化合物を接触せしめること、及び哺乳動物ＭＣＨ１受容体への化合物の特
異的結合を検出することを含み、前記細胞が通常は哺乳動物ＭＣＨ１受容体を発
現しておらず、哺乳動物ＭＣＨ１受容体をコードしているＤＮＡが（ａ）低厳密
条件下に図１に示す規定配列（配列番号１）又はそれに対する相補配列を含む核
酸とハイブリダイゼーションし、そして（ｂ）ＭＣＨ１リガンドが培養体に加え
られ且つＣＨＯ細胞が上記規定配列またはその相補体を有する核酸にハイブリダ
イゼーションする核酸を含む場合に、ＣＨＯ細胞培養体のｐＨに変化をもたらす
その能力によって更に特徴付けられる、哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合
する化合物を同定する方法。 - 【請求項４９】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体がヒトＭＣＨ１受容体である、請
求項４７又は４８の方法。 - 【請求項５０】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体がラットＭＣＨ１受容体である、
請求項４７又は４８の方法。 - 【請求項５１】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体が、プラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−
ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）によりコードされるヒトＭＣＨ１
受容体の配列に実質同一であるアミノ酸配列を有する、請求項４７又は４８の方
法。 - 【請求項５２】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体が、図２（配列番号２）に示すも
のと実質同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４７又は４８の方法。 - 【請求項５３】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体が、図２（配列番号２）に示すア
ミノ酸配列を含む、請求項４７又は４８の方法。 - 【請求項５４】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体が、図１３（配列番号２７）に示
すアミノ酸配列を含む、請求項４７又は４８の方法。 - 【請求項５５】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体が、図１４（配列番号２８）に示
すアミノ酸配列を含む、請求項４７又は４８の方法。 - 【請求項５６】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体が、図１５（配列番号２９）に示
すアミノ酸配列を含む、請求項４７又は４８の方法。 - 【請求項５７】 化合物が哺乳動物ＭＣＨ１受容体への結合が従来未知であ
る、請求項４７又は４８の方法。 - 【請求項５８】 請求項５７の方法により同定される化合物。
- 【請求項５９】 細胞が昆虫細胞である、請求項４７又は４８の方法。
- 【請求項６０】 細胞が哺乳動物細胞である、請求項４７又は４８の方法。
- 【請求項６１】 細胞が非神経起源である、請求項６０の方法。
- 【請求項６２】 非神経細胞がＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胚腎臓細胞、Ｃ
ＨＯ細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、マウスＹ１細胞、又はＬＭ（ｔｋ−）細胞であ
る、請求項６１の方法。 - 【請求項６３】 化合物が哺乳動物ＭＣＨ１受容体に結合することがこれま
でに知られていない化合物である、請求項６０の方法。 - 【請求項６４】 請求項６３の方法により同定された化合物。
- 【請求項６５】 ヒトＭＣＨ１受容体をその細胞表面に発現している細胞に
、化合物及び受容体への結合が既知である第２化合物を、両化合物の結合に好適
な条件下に接触せしめること、及びヒトＭＣＨ１受容体への化合物の特異的結合
を検出することを含み、化合物の存在下におけるヒトＭＣＨ１受容体への第二化
合物の結合の低下は該化合物がヒトＭＣＨ１受容体に結合することを示しており
、前記細胞は通常哺乳動物ＭＣＨ１受容体を発現しておらず、哺乳動物ＭＣＨ１
受容体をコードするＤＮＡが（ａ）低厳密条件下に図１に示す規定配列（配列番
号１）又はそれに相補的な配列を有する核酸にハイブリダイズし、且つ（ｂ）Ｍ
ＨＣ１リガンドが培養体に加えられ、そしてＣＨＯ細胞が上記規定配列またはそ
の相補体を有する核酸に対しハイブリダイズする核酸を含んでいる時に培養体の
ｐＨに変化を引き起こすことができる能力により更に特徴付けられる、哺乳動物
ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物の同定に適した競合結合を含む方法。 - 【請求項６６】 ヒトＭＣＨ１受容体をその細胞表面に発現している細胞由
来の膜調製体に、化合物及び受容体への結合が既知である第２化合物を、両化合
物の結合に好適な条件下に接触せしめること、及びヒトＭＣＨ１受容体への化合
物の特異的結合を検出することを含み、化合物の存在下におけるヒトＭＣＨ１受
容体への第二化合物の結合の低下は該化合物がヒトＭＣＨ１受容体に結合するこ
とを示しており、前記細胞は通常哺乳動物ＭＣＨ１受容体を発現しておらず、哺
乳動物ＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡが（ａ）低厳密条件下に図１に示す規
定配列（配列番号１）又はそれに相補的な配列を有する核酸にハイブリダイズし
、且つ（ｂ）ＭＨＣ１リガンドが培養体に加えられ、そしてＣＨＯ細胞が上記規
定配列またはその相補体を有する核酸に対しハイブリダイズする核酸を含んでい
る時に培養体のｐＨに変化を引き起こすことができる能力により更に特徴付けら
れる、哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物の同定に適した競合結
合を含む方法。 - 【請求項６７】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体がヒトＭＣＨ１受容体またはＭＣ
Ｈあるいはその類似体又は相同体により活性化される様なヒトＭＣＨ１受容体の
変異体である、請求項６５又は６６の方法。 - 【請求項６８】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体がラットＭＣＨ１受容体である、
請求項６５又は６６の方法。 - 【請求項６９】 細胞が昆虫細胞である、請求項６５又は６６の方法。
- 【請求項７０】 細胞が哺乳動物細胞である、請求項６５又は６６の方法。
- 【請求項７１】 細胞が非神経起源である、請求項７０の方法。
- 【請求項７２】 非神経細胞がＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胚腎臓細胞、Ｃ
ＨＯ細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、マウスＹ１細胞、又はＬＭ（ｔｋ−）細胞であ
る、請求項７１の方法。 - 【請求項７３】 化合物が哺乳動物ＭＣＨ１受容体に結合することがこれま
でに知られていない化合物である、請求項７０の方法。 - 【請求項７４】 請求項７３の方法により同定された化合物。
- 【請求項７５】 以下を含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する
化合物を同定することを目的とした、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害す
ることについて既知でない複数の化合物をスクリーニングする方法： （ａ）哺乳動物ＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡがトランスフェクションさ
れ、それを発現している細胞に、哺乳動物ＭＣＨ１受容体への結合が既知である
化合物の結合を可能にする条件の下、哺乳動物ＭＣＨ１受容体への結合が既知で
ない複数の化合物を接触せしめること； （ｂ）複数の化合物が存在しない場合に比べ、複数の化合物中にある化合物が
存在する場合に、哺乳動物ＭＣＨ１受容体への結合が既知である化合物の結合が
低下するかどうかを決定すること；及び、もし低下し場合に （ｃ）複数の化合物の中に含まれる化合物の哺乳動物ＭＣＨ１受容体に対する
結合を決定し、それにより哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を
同定すること。 - 【請求項７６】 以下を含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する
化合物を同定することを目的とした、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害す
ることについて既知でない複数の化合物をスクリーニングする方法： （ａ）哺乳動物ＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡでトランスフェクションさ
れ、それを発現している細胞に由来する膜調製体に、哺乳動物ＭＣＨ１受容体へ
の結合が既知である化合物の結合を可能にする条件の下、哺乳動物ＭＣＨ１受容
体への結合が既知でない複数の化合物を接触せしめること； （ｂ）複数の化合物が存在しない場合に比べ、複数の化合物中にある化合物が
存在する場合に、哺乳動物ＭＣＨ１受容体への結合が既知である化合物の結合が
低下するかどうかを決定すること；及び、もし低下し場合に （ｃ）複数の化合物の中に含まれる化合物の哺乳動物ＭＣＨ１受容体に対する
結合を決定し、それにより哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を
同定すること。 - 【請求項７７】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体がヒトＭＣＨ受容体または、ＭＣ
Ｈあるいはその類似体又は相同体により活性化されるヒトＭＣＨ１受容体である
、請求項７５または７６の方法。 - 【請求項７８】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体がラットＭＣＨ１受容体である、
請求項７５又は７６の方法。 - 【請求項７９】 細胞が昆虫細胞である、請求項７５又は７６の方法。
- 【請求項８０】 細胞が非神経起源である、請求項７９の方法。
- 【請求項８１】 非神経細胞がＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胚腎臓細胞、Ｌ
Ｍ（ｔｋ−）細胞、ＣＨＯ細胞、マウスＹ１細胞、又はＮＩＨ−３Ｔ３細胞であ
る、請求項８０の方法。 - 【請求項８２】 細胞から全ｍＲＮＡを得ること、及びそうして得たｍＲＮ
Ａと請求項２５、２６、２７、又は２８の何れかの核酸プローブとをハイブリダ
イゼーション条件下に接触せしめること、プローブにハイブリダイズしているｍ
ＲＮＡの存在を検出し、それにより細胞による哺乳動物ＭＣＨ１受容体の発現を
検出することを含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体をコードしているｍＲＮＡの存在
を検出することによる、哺乳動物ＭＣＨ１受容体発現を検出する方法。 - 【請求項８３】 受容体への抗体の結合を可能にする条件の下、細胞を請求
項３２の抗体細胞に接触せしめること、細胞に結合した抗体の存在を検出するこ
と、及びそれにより細胞表面上の哺乳動物ＭＣＨ１受容体の存在を検出すること
を含む、細胞表面上の哺乳動物ＭＣＨ１受容体の存在を検出する方法。 - 【請求項８４】 ＭＣＨ受容体活性のレベルが、ヒトＭＣＨ１受容体発現を
制御する誘導可能なプロモーターの利用により変化する請求項４４のトランスジ
ェニック非ヒト哺乳動物を産生することを含む、ヒトＭＣＨ受容体活性のレベル
を変化させることの生理学的影響を決定する方法。 - 【請求項８５】 それぞれが異なる量のヒトＭＣＨ１受容体を発現している
請求項４４のトランスジェニック非ヒト哺乳動物のパネルを産生することを含む
、ヒトＭＣＨ１受容体の活性のレベルを変化させることの生理学的影響を決定す
る方法。 - 【請求項８６】 その異常がヒトＭＣＨ１受容体の活性を低下させることで
緩和され、請求項４１、４４、４５又は４６のトランスジェニック非ヒト哺乳動
物に化合物を投与すること、及び化合物がヒトＭＣＨ１受容体の過剰活性の結果
としてトランスジェニック非ヒト哺乳動物により提示される生理学的及び行動学
的異常を変化させることを含み、異常の緩和により化合物をアンタゴニストと特
定する、異常を緩和できるアンタゴニストを同定する方法。 - 【請求項８７】 請求項８６の方法により同定されたアンタゴニスト。
- 【請求項８８】 請求項８７のアンタゴニスト及び医薬品として受け入れ可
能なキャリアーとを含む、医薬組成物。 - 【請求項８９】 被験者に請求項８８の医薬組成物の有効量を投与し、それ
により異常を治療することを含む、ヒトＭＣＨ１受容体の活性を低下させること
で緩和される被験者の異常を治療する方法。 - 【請求項９０】 化合物を請求項４１、４４、４５又は４６のトランスジェ
ニック非ヒト哺乳動物に投与すること、及び化合物がトランスジェニック非ヒト
哺乳動物により提示あれる生理学的及び行動学的異常を緩和するかどうかを決定
することを含み、異常の緩和により化合物がアゴニストであると判定するヒトＭ
ＣＨ１受容体の活性を増加させることで緩和される被験者の異常を緩和できるア
ゴニストを同定する方法。 - 【請求項９１】 請求項９０の方法により同定されたアゴニスト。
- 【請求項９２】 請求項９１のアゴニスト及び医薬品として受け入れ可能な
キャリアーとを含む、医薬組成物。 - 【請求項９３】 被験者に請求項９２の医薬組成物の有効量を投与し、それ
により異常を治療することを含む、ヒトＭＣＨ１受容体の活性を増加させること
で緩和される被験者の異常を治療する方法。 - 【請求項９４】 以下を含む特異的哺乳動物対立遺伝子の活動に伴う疾患素
質を診断する方法： （ａ）疾患にかかった被験者のＤＮＡを得ること； （ｂ）ＤＮＡを制限酵素のパネルで制限消化すること； （ｃ）得られたＤＮＡ断片を、サイズ分析用ゲル上に電気泳動的に分離するこ
と； （ｄ）得られたゲルをヒトＭＣＨ１受容体をコードする核酸分子の配列内に含
まれ、且つ検出可能なマーカーにより標識された特異配列と特異的にハイブリダ
イゼーションできる核酸プローブと接触させること； （ｅ）障害にかかった被験者のＤＮＡに対し特異的である特有のバンドパター
ンを形成する、ヒトＭＣＨ１受容体をコードし且つ検出可能マーカーにて標識さ
れた請求項１のヒトＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡにハイブリダズした標識
バンドを検出すること； （ｆ）工程（ａ）−（ｅ）により診断を目的として得たＤＮＡを調製すること
；及び （ｇ）工程（ｅ）より得た疾患にかかった被験者のＤＮＡに特有なバンドパタ
ーンと工程（ｆ）より得た診断のためのＤＮＡとを比較し、パターンが同一であ
るか又異なるかを決定し、それによりパターンが同一の場合には疾患素質がある
と診断すること。 - 【請求項９５】 特定の哺乳動物対立遺伝子の活動を伴う疾患が診断される
、請求項９４の方法。 - 【請求項９６】 以下を含む、請求項１１の精製されたヒトＭＣＨ１受容体
を調製する方法： （ａ）細胞にヒトＭＣＨ１受容体の発現を誘導すること； （ｂ）誘導された細胞からヒトＭＣＨ１受容体を回収すること；及び （ｃ）そうして回収されたヒトＭＣＨ１受容体を精製すること。 - 【請求項９７】 以下を含む、請求項１１の精製されたヒトＭＣＨ１受容体
を調製する方法： （ａ）ヒトＭＣＨ１受容体をコードする核酸を好適ベクター内に挿入すること
； （ｂ）得られたベクターを好適宿主細胞内に導入すること； （ｃ）得られた細胞を好適条件に置いて単離されたヒトＭＣＨ１受容体の産生
を可能すること； （ｄ）得られた細胞により産生されたヒトＭＣＨ１受容体を回収すること；及
び （ｅ）そうして回収されたヒトＭＣＨ１受容体を精製すること。 - 【請求項９８】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡによりトラン
スフェクションされ、且つそれを発現している細胞を哺乳動物ＭＣＨ１受容体の
活性化が可能な条件下に化合物と接触させること、及び哺乳動物ＭＣＨ１受容体
の活性の増加を検出し、それにより化合物が哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニスト
であるかを決定することを含む、化合物が哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニストで
あるかを決定する方法。 - 【請求項９９】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡによりトラン
スフェクションされ、且つそれを発現している細胞に既知哺乳動物ＭＣＨ１受容
体アゴニストが存在する状態にて、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化が可能な条
件の下に化合物と接触させること、及び哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性の減少を
検出し、それにより化合物が哺乳動物ＭＣＨ１受容体アンタゴニストであるかを
決定することを含む、化合物が哺乳動物ＭＣＨ１受容体アンタゴニストであるか
を決定する方法。 - 【請求項１００】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体がヒトＭＣＨ１受容体であるか
、ＭＣＨまたはその類似体あるいは相同体により活性化されるヒトＭＣＨ１受容
体の変異体である、請求項９８又は９９の方法。 - 【請求項１０１】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体がラットＭＣＨ１受容体である
、請求項９８又は９９の方法。 - 【請求項１０２】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性を上昇させるのに有効な
量の請求項９８の方法により決定された哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニスト、及
び医薬品として受け入れ可能なキャリアーとを含む医薬組成物。 - 【請求項１０３】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニストが既知でない、請求
項１０２の医薬組成物。 - 【請求項１０４】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性を低下させるのに有効な
量の請求項９９の方法により決定された哺乳動物ＭＣＨ１受容体アンタゴニスト
、及び医薬品として受け入れ可能なキャリアーとを含む医薬組成物。 - 【請求項１０５】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体アンタゴニストが既知でない、
請求項１０４の医薬組成物。 - 【請求項１０６】 第２メッセンジャー反応を生じ、且つその細部表面上に
哺乳動物ＭＣＨ１受容体を発現しているが、通常は哺乳動物ＭＣＨ１受容体を発
現していない細胞に、ＭＣＨ１受容体の活性化に好適な条件の下化合物と接触さ
せること、及び化合物存在下、及び非存在下に第２メッセンジャー反応を測定す
ることを含み、化合物存在下の第２メッセンジャー反応の変化は該化合物が哺乳
動物ＭＣＨ１受容体を活性化することを示す、化合物が哺乳動物ＭＣＨ１受容体
に特異的に結合し且つ活性化するかどうかを決定する方法。 - 【請求項１０７】 第２メッセンジャー反応が塩素イオンチャンネル活性化
を含み、第２メッセンジャー反応の変化が内向きの塩素イオン流のレベルの増加
である、請求項１０６の方法。 - 【請求項１０８】 第２メッセンジャー反応を生じ且つその細部表面上に哺
乳動物ＭＣＨ１受容体を発現しているが、通常は哺乳動物ＭＣＨ１受容体を発現
していない細胞に、ＭＣＨ１受容体の活性化に好適な条件の下、化合物及び哺乳
動物ＭＣＨ１受容体を活性化することが既知である第２化合物の両方、及び第２
化合物のみと別々に接触させること、そして第２化合物のみ存在する場合と第２
化合物と化合物が共に存在する場合について第２メッセンジャー反応を測定する
ことを含み、第２化合物のみ存在する場合に比べ化合物と第２化合物の両方が存
在する場合の第２メッセンジャー反応の変化がより小さいことが化合物が哺乳動
物ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害することを示している、化合物が哺乳動物ＭＣ
Ｈ１受容体に特異的に結合し且つその活性化を阻害するかどうかを決定する方法
。 - 【請求項１０９】 第２メッセンジャー反応が塩素イオンチャンネル活性化
を含み、且つ第２メッセンジャー反応の変化が第２化合物のみ存在する場合に比
べ化合物と第２化合物の両方が存在する場合により小さい内向きの塩素イオン流
のレベルの増加である、請求項１０８の方法。 - 【請求項１１０】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体がヒトＭＣＨ１受容体であるか
、ＭＣＨまたはその類似体あるいは相同体により活性化されるヒトＭＣＨ１受容
体の変異体である、請求項１０６、１０７、１０８、又は１０９いずれかの方法
。 - 【請求項１１１】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体がラットＭＣＨ１受容体である
、請求項１０６、１０７、１０８又は１０９いずれかの方法。 - 【請求項１１２】 細胞が昆虫細胞である、請求項１０６、１０７、１０８
又は１０９いずれかの方法。 - 【請求項１１３】 細胞が哺乳動物細胞である、請求項１０６、１０７、１
０８又は１０９いずれかの方法。 - 【請求項１１４】 哺乳動物細胞が非神経起源である、請求項１１３の方法
。 - 【請求項１１５】 非神経細胞がＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、２９３ヒト
胚腎臓細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、又はＬＭ（ｔｋ−）細胞である、請求項１１
４の方法。 - 【請求項１１６】 化合物が哺乳動物ＭＣＨ１受容体への結合について既知
でない請求項１０６、１０７、１０８、又は１０９の方法。 - 【請求項１１７】 請求項１１６の方法により決定された化合物。
- 【請求項１１８】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性を上昇させるのに有効な
量の請求項１０６又は１０７の方法により決定された哺乳動物ＭＣＨ１受容体ア
ゴニスト、及び医薬品として受け入れ可能なキャリアーとを含む医薬組成物。 - 【請求項１１９】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニストが既知でない、請求
項１１８の医薬組成物。 - 【請求項１２０】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性を低下させるのに有効な
量の請求項１０８又は１０９の方法により決定された哺乳動物ＭＣＨ１受容体ア
ンタゴニスト、及び医薬品として受け入れ可能なキャリアーとを含む医薬組成物
。 - 【請求項１２１】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体アンタゴニストが既知でない、
請求項１２０の医薬組成物。 - 【請求項１２２】 以下を含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化する化合
物を同定することを目的とした、哺乳動物ＭＣＨ１受容体を活性化することが既
知でない複数の化合物をスクリーニングする方法： （ａ）哺乳動物ＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡがトランスフェクションさ
れ、それを発現している細胞に、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化を可能にする
条件の下、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化が既知でない複数の化合物を接触せ
しめること； （ｂ）化合物が存在する状態で、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性が増加するか
どうかを決定すること；及び、もし増加した場合に （ｃ）複数の化合物の中に含まれる各化合物によって哺乳動物ＭＣＨ１受容体
の活性化が上昇するかを決定し、それにより哺乳動物ＭＣＨ１受容体を活性化す
る化合物を同定すること。 - 【請求項１２３】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体がヒトＭＣＨ１受容体であるか
、ＭＣＨまたはその類似体あるいは相同体により活性化されるヒトＭＣＨ１受容
体の変異体である、請求項１２２の方法。 - 【請求項１２４】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体がラットＭＣＨ１受容体である
、請求項１２２の方法。 - 【請求項１２５】 以下を含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害す
る化合物を同定することを目的とした、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害
することが既知でない複数の化合物をスクリーニングする方法： （ａ）哺乳動物ＭＣＨ１受容体でトランスフェクションされそれを発現してい
る細胞に、哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化を可能にする条件の下、既知哺乳動
物ＭＣＨ１アゴニスト存在下に複数の化合物を接触せしめること； （ｂ）複数の化合物が存在しない状態での哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化に
比べ、複数の化合物が存在する状態にて哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性が低下す
るかどうかを決定すること；及び、低下する場合に （ｃ）複数の化合物の中に含まれる各化合物に関する哺乳動物ＭＣＨ１受容体
の活性化の阻害を決定し、それにより哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害す
る化合物を同定すること。 - 【請求項１２６】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体がヒトＭＣＨ１受容体であるか
、ＭＣＨまたはその類似体あるいは相同体により活性化されるヒトＭＣＨ１受容
体の変異体である、請求項１２５の方法。 - 【請求項１２７】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体がラットＭＣＨ１受容体である
、請求項１２５の方法。 - 【請求項１２８】 細胞が哺乳動物細胞である、請求項１２３、１２４、１
２５、１２６又は１２７いずれかの方法。 - 【請求項１２９】 哺乳動物細胞が非神経起源である、請求項１２８の方法
。 - 【請求項１３０】 非神経細胞がＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胚腎臓細胞、
ＬＭ（ｔｋ−）細胞、又はＮＩＨ−３Ｔ３細胞である、請求項１２９の方法。 - 【請求項１３１】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性を上昇させるのに有効な
量の請求項１２３又は１２４の方法により決定された化合物、及び医薬品として
受け入れ可能なキャリアーとを含む医薬組成物。 - 【請求項１３２】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体の活性を低下させるのに有効な
量の請求項１２５又は１２６の方法により決定された化合物、及び医薬品として
受け入れ可能なキャリアーとを含む医薬組成物。 - 【請求項１３３】 被験者に哺乳動物ＭＣＨ１受容体アゴニストである化合
物を異常の治療に有効な量を投与することを含む、異常が哺乳動物ＭＣＨ１受容
体の活性を増加させることで緩和される被験者の異常を治療する方法。 - 【請求項１３４】 異常がステロイド又は脳下垂体ホルモン障害、エピネフ
ィリン放出障害、胃腸管障害、心臓血管病、電解質平衡障害、高血圧、糖尿病、
呼吸器障害、喘息、生殖機能障害、免疫障害、内分泌障害、筋肉骨格系障害、神
経内分泌障害、意識障害、記憶障害、感覚変調及び伝達障害、運動協調障害、感
覚統合障害、運動統合障害、ドパーミン性機能障害、感覚伝達障害、味覚障害、
交感神経支配障害、疼痛、精神病性行動、モルヒネ耐性、オピエート嗜好、感情
障害、ストレス関連障害、体液バランス障害、心因性発作又は偏頭痛の制御であ
る、請求項１３３の方法。 - 【請求項１３５】 被験者に哺乳動物ＭＣＨ１受容体アンタゴニストである
化合物を異常の治療に有効な量を投与することを含む、異常が哺乳動物ＭＣＨ１
受容体の活性を減少させることで緩和される被験者の異常を治療する方法。 - 【請求項１３６】 異常がステロイド又は脳下垂体ホルモン障害、エピネフ
ィリン放出障害、胃腸管障害、心臓血管病、電解質平衡障害、高血圧、糖尿病、
呼吸器障害、喘息、生殖機能障害、免疫障害、内分泌障害、筋肉骨格系障害、神
経内分泌障害、意識障害、記憶障害、感覚変調及び伝達障害、運動協調障害、感
覚統合障害、運動統合障害、ドパーミン性機能障害、感覚伝達障害、味覚障害、
交感神経支配障害、疼痛、精神病性行動、モルヒネ耐性、オピエート嗜好、感情
障害、ストレス関連障害、体液バランス障害、心因性発作又は偏頭痛の制御であ
る、請求項１３５の方法。 - 【請求項１３７】 請求項４７、４８、６５、６６、７５又は７６の何れか
の方法を利用し化合物を同定し、次に化合物又はその新規構造及び機能的類似体
あるいは相同体を合成することを含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合
する組成物を製造する方法。 - 【請求項１３８】 請求項９８、１０６又は１２２の何れかの方法を利用し
化合物を同定し、次に化合物又はその新規構造及び機能的類似体あるいは相同体
を合成することを含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する組成物を製
造する方法。 - 【請求項１３９】 請求項９９、１０８又は１２５の何れかの方法を利用し
化合物を同定し、次に化合物又はその新規構造及び機能的類似体あるいは相同体
を合成することを含む、哺乳動物ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する組成物を製
造する方法。 - 【請求項１４０】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体がヒトＭＣＨ１受容体であるか
、又はＭＣＨあるいはその類似体もしくは相同体により活性化されるヒトＭＣＨ
１受容体の変異体である、請求項１３７、１３８又は１３９いずれかの方法。 - 【請求項１４１】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体がヒトＭＣＨ１受容体である、
請求項１３７、１３８又は１３９いずれかの方法。 - 【請求項１４２】 医薬品として受け入れ可能なキャリアーと請求項４７、
４８、６５、６６、７５又は７６いずれかの方法により同定された化合物、又は
その新規構造及び機能的類似体あるいは相同体の治療有効量を混合することを含
む、組成物を調製する方法。 - 【請求項１４３】 医薬品として受け入れ可能なキャリアーと請求項９８、
１０６又は１２２いずれかの方法により同定された化合物、又はその新規構造及
び機能的類似体あるいは相同体の治療有効量を混合することを含む、組成物を調
製する方法。 - 【請求項１４４】 医薬品として受け入れ可能なキャリアーと請求項９９、
１０８又は１２５いずれかの方法により同定された化合物、又はその新規構造及
び機能的類似体あるいは相同体の治療有効量を混合することを含む、組成物を調
製する方法。 - 【請求項１４５】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体がヒトＭＣＨ１受容体であるか
、ＭＣＨまたはその類似体あるいは相同体により活性化されるヒトＭＣＨ１受容
体の変異体である、請求項１４２、１４３又は１４４いずれかの方法。 - 【請求項１４６】 哺乳動物ＭＣＨ１受容体がラットＭＣＨ１受容体である
、請求項１４２、１４３又は１４４いずれかの方法。 - 【請求項１４７】 ヒトＭＣＨ１受容体活性をコードするＤＮＡがトランス
フェクションされ且つそれを発現している細胞を、ヒトＭＣＨ１受容体の活性化
可能な条件の下、既知ヒトＭＣＨ１受容体アゴニスト存在下に化合物と接触させ
ること、そしてヒトＭＣＨ１受容体活性の減少を検出し、それにより化合物がヒ
トヒトＭＣＨ１受容体アゴニストであるかを決定することを含み、前記ヒトＭＣ
Ｈ１受容体をコードするＤＮＡが図１（配列番号１）に示す、又はプラスミドｐ
ＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる配列を
含むものであり、前記既知ヒトＭＣＨ１受容体アゴニストがＭＣＨ又はＭＣＨの
相同体あるいは類似体であり、そして前記細胞がトランスフェクション前にはＭ
ＣＨ１受容体を発現していない、化合物がヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストで
あるかを決定する方法。 - 【請求項１４８】 通常はヒトＭＣＨ１受容体を発現しておらず、そしてヒ
トＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡが図１（配列番号１）に示す配列又はプラ
スミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれ
ている配列を含んでいる、その表面にヒトＭＣＨ１受容体を発現し、ヒトＭＣＨ
１受容体の活性化により第２メッセンジャー反応を生じる細胞に、ヒトＭＣＨ１
受容体の活性化好適条件下に、化合物及びヒトＭＣＨ１受容体を活性化すること
が既知である第２化合物の両方、及び第２化合物のみと接触させること、及び第
２化合物のみ存在する場合と第２化合物と化合物の両方が存在する場合の第２メ
ッセンジャー反応を測定することを含み、第２化合物のみ存在する場合に比べ化
合物と第２化合物の両方が存在する場合の第２メッセンジャー反応の変化が小さ
いことが化合物がヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害すること示し、且つ前記の
第２化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体あるいは類似体である、化合物がヒトＭ
ＣＨ１受容体に特異的に結合し、その活性化を阻害するかどうかを決定する方法
。 - 【請求項１４９】 第２メッセンジャー反応が塩素イオンチャンネルの活性
化を含み、第２メッセンジャー反応が第２化合物のみ存在する場合に比べ化合物
と第２化合物の両方が存在する場合のより小さい内向きの塩素イオン流のレベル
上昇である、請求項１４８の方法。 - 【請求項１５０】 以下を含むヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する化合
物を同定することを目的とした、ヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害することに
ついて未知である複数の化合物をスクリーニングする方法： （ａ）ヒトＭＣＨ１受容体でトランスフェクションされ、それを発現している
細胞にあって、通常はヒトＭＣＨ１受容体、及び図１に示す配列又はプラスミド
ｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる配列
を含むヒトＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡを発現していない細胞に、ヒトＭ
ＣＨ１受容体の活性化が可能な条件下に、ＭＣＨ又はＭＣＨの相同体あるいは類
似体である既知ヒトＭＣＨ１受容体アゴニスト存在下に複数の化合物と接触させ
ること； （ｂ）複数の化合物が存在しない状態でのヒトＭＣＨ１受容体の活性化に比べ
、複数の化合物が存在する状態でのヒトＭＣＨ１受容体の活性化が低下するかど
うかを決定すること；及びもし低下する場合 （ｃ）複数の化合物の中に含まれる各化合物について、ヒトＭＣＨ１受容体の
活性化の阻害の程度を個別に決定し、それによりヒトＭＣＨ１受容体の活性化を
阻害する化合物を同定すること。 - 【請求項１５１】 細胞が昆虫細胞である、請求項１４７、１４８又は１５
０いずれかの方法。 - 【請求項１５２】 細胞が哺乳動物細胞である、請求項１４７、１４８又は
１５０いずれかの方法。 - 【請求項１５３】 細胞が非神経起源である、請求項１４７、１４８又は１
５０いずれかの方法。 - 【請求項１５４】 非神経細胞がＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、２９３ヒト
胚腎臓細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、マウスＹ１細胞又はＬＭ（ｔｋ−）細胞であ
る、請求項１４７、１４８又は１５０いずれかの方法。 - 【請求項１５５】 ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定す
ること、次にその化合物またはその構造的及び機能的類似体又は相同体を合成す
ることを含むヒトＭＣＨ１受容体へ特異的に結合する組成物の製造方法において
、ヒトＭＣＨ１受容体をその細胞表面に発現している細胞を、両化合物の結合に
好適な条件の下に化合物及び受容体への結合が既知である第２化合物の両方、及
び別個に第二化合物のみと接触させること、及びヒトＭＣＨ１受容体への化合物
の特異的結合の強さを検出することを含み、化合物の存在下におけるヒトＭＣＨ
１受容体への第２化合物の結合低下は該化合物がヒトＭＣＨ１受容体に結合する
ことを示している競合結合を含む方法により前記化合物がヒトＭＣＨ１受容体へ
の結合として同定され、前記細胞が通常ヒトＭＣＨ１受容体を発現しておらず、
ヒトＭＣＨ１受容体が図１に示す配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．
ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる配列を含む核酸
によりコードされており、且つ第２化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体あるいは
類似体である製造方法。 - 【請求項１５６】 ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定す
ること、次にその化合物又はその構造的及び機能的類似体又は相同体を合成する
ことを含むヒトＭＣＨ１受容体へ特異的に結合する組成物の製造方法において、
ヒトＭＣＨ１受容体をその細胞表面に発現している細胞に由来する膜調製体を、
両化合物の結合に好適な条件の下、化合物及び受容体への結合が既知である第二
化合物の両方、及び別個に第二化合物のみと接触させること、及びヒトＭＣＨ１
受容体への化合物の特異的結合の強さを検出することを含み、化合物の存在下に
おけるヒトＭＣＨ１受容体への第二化合物の結合の低下は該化合物がヒトＭＣＨ
１受容体に結合することを示している競合結合を含む方法により前記化合物がヒ
トＭＣＨ１受容体への結合として同定され、そして前記細胞が通常ヒトＭＣＨ１
受容体を発現しておらず、ヒトＭＣＨ１受容体が図１に示す配列（配列番号１）
又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）
に含まれる配列を含む核酸によりコードされており、且つ第２化合物がＭＣＨ又
はＭＣＨの相同体あるいは類似体である製造方法。 - 【請求項１５７】 ヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストである化合物を同定
すること、及び次にその化合物またはその構造的及び機能的類似体又は相同体を
合成することを含む、ヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストである組成物の製造方
法において、ヒトＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡによりトランスフェクショ
ンされ且つそれを発現している細胞に、化合物の結合に好適な条件の下、既知ヒ
トＭＣＨ１受容体アゴニスト存在下に化合物と接触させること、そしてヒトＭＣ
Ｈ１受容体活性の低下を検出し、それにより化合物がヒトＭＣＨ１受容体アンタ
ゴニストであることを決定する方法によって前記化合物がヒトＭＣＨ１受容体ア
ンタゴニストとして同定され、前記細胞が通常ヒトＭＣＨ１受容体を発現してお
らず、ヒトＭＣＨ１受容体は図１に示す配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥ
ＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる配列を含
む核酸によりコードされ、且つ第２化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体あるいは
類似体であるところの製造方法。 - 【請求項１５８】 ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合し、これを阻害する
化合物を同定すること、及び次にその化合物またはその構造的及び機能的類似体
又は相同体を合成することを含む、ヒトＭＣＨ１受容体合に特異的に結合し、且
つその活性化を阻害する組成物の製造方法において、通常はヒトＭＣＨ１受容体
を発現しておらず、且つヒトＭＣＨ１受容体が図１に示す（配列番号１）又はプ
ラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含ま
れる配列を含む核酸によりコードされている、その細胞表面にヒトＭＣＨ１受容
体を発現しヒトＭＣＨ１受容体活性化により第２メッセンジャーを産生する細胞
を、ヒトＭＣＨ１受容体発現に好適な条件の下、化合物及びＭＣＨ１受容体を活
性化することが既知である第２化合物の両方、及び第２化合物のみと別々に接触
させこと、及び第２化合物のみが存在する状態と第２化合物及び化合物の両方が
存在する状態にて第２メッセンジャー反応を測定することを含み、且つ第２化合
物のみ存在する場合に比べ化合物と第２化合物の両方が存在する場合の第２メッ
センジャー反応の方が小さいことが、化合物がヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻
害することを示し、前記第２化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体又は類似体であ
る方法により前記化合物がヒトＭＣＨ１受容体に結合し且つその活性化を阻害す
るもとして同定される製造方法。 - 【請求項１５９】 第２メッセンジャー反応が塩素イオンチャンネルの活性
化を含み、第２メッセンジャー反応が第２化合物のみ存在する場合に比べ化合物
と第２化合物の両方が存在する場合のより小さい内向きの塩素イオン流のレベル
上昇である、請求項１５８の方法。 - 【請求項１６０】 ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定す
ること、及び次にキャリアーと化合物、又はその構造的及び機能的類似体又は相
同体とを混合すること含む組成物調製方法において、その細胞表面上にヒトＭＣ
Ｈ１受容体を発現している細胞に、両化合物の結合にとって好適である条件下に
て化合物及び受容体との結合が既知である第２化合物の両方、ならびに独立に第
２化合物のみと接触せしめること、及びヒトＭＣＨ１受容体への特異的結合の強
さを検出することを含み、化合物の存在下におけるヒトＭＣＨ１受容体への第２
化合物の結合低下は該化合物がヒトＭＣＨ１受容体に結合することを示している
競合結合を含む方法により、前記化合物がヒトＭＣＨ１受容体に結合するものと
して同定される、前記細胞が通常はヒトＭＣＨ１受容体を発現しておらず、ヒト
ＭＣＨ１受容体が図１に示す配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ
−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる配列によってコード
されており、且つ第２化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体あるいは類似体である
製造方法。 - 【請求項１６１】 ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定す
ること、及び次にキャリアーと化合物、又はその構造的及び機能的類似体又は相
同体とを混合すること含む組成物調製方法において、その細胞表面上にヒトＭＣ
Ｈ１受容体を発現している細胞に由来する膜調製体と、両化合物の結合にとって
好適である条件下に化合物及び受容体との結合が既知である第２化合物の両方、
ならびに独立に第２化合物のみと接触せしめること、及びヒトＭＣＨ１受容体へ
の特異的結合の強さを検出することを含み、化合物の存在下におけるヒトＭＣＨ
１受容体への第２化合物の結合低下は該化合物がヒトＭＣＨ１受容体に結合する
ことを示している競合結合を含む方法により、前記化合物がヒトＭＣＨ１受容体
に結合するものとして同定される、前記細胞が通常はヒトＭＣＨ１受容体を発現
しておらず、ヒトＭＣＨ１受容体が図１に示す配列（配列番号１）又はプラスミ
ドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる配
列によってコードされており、且つ第２化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体ある
いは類似体である方法。 - 【請求項１６２】 ヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストである化合物を同定
すること、及び次にキャリアーと化合物、又はそのその構造的及び機能的類似体
又は相同体とを混合すること含む組成物調製方法にあり、既知ヒトＭＣＨ１受容
体をコードしているＤＮＡによりトランスフェクションされ且つそのＤＮＡを発
現している細胞に、ヒトＭＣＨ１受容体の活性化を可能にする条件の下化合物を
接触せしめ、そして既知ヒトＭＣＨ１受容体活性の減少を検出し、それにより化
合物がヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストであることを決定するこを含む方法に
より前記化合物がヒトＭＣＨ１受容体アンアゴニストとして同定される、前記細
胞が通常はヒトＭＣＨ１受容体を発現しておらず、またヒトＭＣＨ１受容体が図
１に示す配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴ
ＣＣ受付番号２０３１９７）に含まれる配列によってコードされており、且つ既
知ヒト受容体アゴニストがＭＣＨ又はＭＣＨの相同体あるいは類似体である組成
物を調製する方法。 - 【請求項１６３】 ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合し、その活性化を阻
害する化合物を同定すること、及び次にキャリアーと化合物、又はそのその構造
的及び機能的類似体又は相同体とを混合すること含む組成物調製法において、そ
の細胞表面上にヒトＭＣＨ１受容体を発現し、ヒトＭＣＨ１受容体の活性化によ
り第２メッセンジャー反応が生じる細胞であり、且つ通常はヒトＭＣＨ１受容体
を発現しておらず、前記ヒトＭＣＨ１受容体が図１に示す配列（配列番号１）又
はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受付番号２０３１９７）に
含まれる配列によってコードされている細胞に、ヒトＭＣＨ１受容体の活性化に
好適な条件の下、化合物及びヒトＭＣＨ１受容体を活性化することが既知である
第２化合物の両方、及び第２化合物のみと作用せしめること、及び第２化合物の
み存在する場合と第２化合物及び化合物の両方が存在する場合について第２メッ
センジャー反応を測定することを含み、第２化合物のみ存在する場合に比べ化合
物及び第２化合物が共に存在する場合の変化がより小さいことが、化合物がヒト
ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害することを示し、前記第２化合物がＭＣＨまたは
ＭＣＨの相同体あるいは類似体である方法により、前記化合物がヒトＭＣＨ１受
容体に結合し、その活性化を阻害するものとして同定される、組成物調製方法。 - 【請求項１６４】 第２メッセンジャー反応が塩素イオンチャンネル活性化
を含み、且つ第２メッセンジャー反応の変化が第２化合物のみ存在する場合に比
べ化合物と第２化合物の両方が存在する場合により小さい内向きの塩素イオン流
のレベルの増加である、請求項１６３の方法。 - 【請求項１６５】 細胞が昆虫細胞である請求項１５５、１５６、１５７、
１５８、１６０、１６１、１６２又は１６３何れかの方法。 - 【請求項１６６】 細胞が哺乳動物細胞である請求項１５５、１５６、１５
７、１５８、１６０、１６１、１６２又は１６３何れかの方法。 - 【請求項１６７】 細胞が非神経起源である、請求項１６６の方法。
- 【請求項１６８】 非神経細胞がＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胚腎臓細胞、
ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、マウスＹ１細胞又はＬＭ（ｔｋ−）細胞であ
る、請求項１６７の方法。
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