JP2002532058A - 組換え遺伝子産物の産生の間の細胞傷害性を調節するためのサプレッサーｔＲＮＡの使用 - Google Patents
組換え遺伝子産物の産生の間の細胞傷害性を調節するためのサプレッサーｔＲＮＡの使用Info
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Abstract
(57)【要約】
組換え遺伝子産物を産生することになっている細胞における毒性タンパク質の発現を調節するための方法が開示される。この方法は、この毒性タンパク質のコード配列への終止コドンの導入およびサプレッサーｔＲＮＡとの相補性に依存する。
Description
【０００１】 （発明の背景） 望ましい遺伝子操作された産物の産生は、効率的であるとはいい得ない。なぜ
なら、目的の遺伝子操作された産物の適切な産生に必要なその遺伝子産物または
補助的な分子は、宿主細胞に対して毒性であり得るからである。例えば、アデノ
随伴ウイルス（ＡＡＶ）ｒｅｐタンパク質（これは、宿主細胞におけるＡＡＶゲ
ノムの組み込みおよび複製に必須である）は、しばしば、宿主細胞に対して、お
よび例えば、ヘルパーアデノウイルスに対して毒性である。
なら、目的の遺伝子操作された産物の適切な産生に必要なその遺伝子産物または
補助的な分子は、宿主細胞に対して毒性であり得るからである。例えば、アデノ
随伴ウイルス（ＡＡＶ）ｒｅｐタンパク質（これは、宿主細胞におけるＡＡＶゲ
ノムの組み込みおよび複製に必須である）は、しばしば、宿主細胞に対して、お
よび例えば、ヘルパーアデノウイルスに対して毒性である。
【０００２】 遺伝子操作の分野で通常に使用され、かつ宿主細胞に対して毒性である遺伝子
産物の他の例は、アデノウイルスのＥ４ ＯＲＦ６タンパク質、水疱性口内炎ウ
イルスのＶＳＶ−Ｇ遺伝子産物、およびＨＩＶ ｔａｔ遺伝子産物である。
産物の他の例は、アデノウイルスのＥ４ ＯＲＦ６タンパク質、水疱性口内炎ウ
イルスのＶＳＶ−Ｇ遺伝子産物、およびＨＩＶ ｔａｔ遺伝子産物である。
【０００３】 （発明の要旨） 本発明の第１の目的は、任意の外来エレメントまたはその産物（内因性であっ
てもそうでなくても、その宿主細胞に対して毒性であり得る）への宿主細胞の暴
露を最小にする条件下で、宿主細胞において組換え遺伝子産物を発現させるため
の方法を提供することである。この方法は、毒性タンパク質をコードする遺伝子
のコード配列に導入される終止コドン、およびこの毒性遺伝子産物をコードする
遺伝子コード配列に操作された終止コドンの存在を克服するための十分な量の補
完するサプレッサーｔＲＮＡ、ならびに終止コドンと通常相互作用する終結因子
、終止因子などの使用に依存して、毒性遺伝子産物の発現を調節する。毒性タン
パク質は、目的の産物であり得るか、または目的の所望の遺伝子産物の効率的な
発現に必要なタンパク質であり得る。宿主細胞に対して毒性である分子をコード
する遺伝子は、１つ以上の終止コドンを含むように作製される。複数の毒性タン
パク質を、単一の細胞においてそのような様式で操作し得る。また、複数の毒性
タンパク質を、複数の毒性タンパク質において同じアミノ酸残基で終止コドンを
導入することにより、単一種のサプレッサーｔＲＮＡによって調節し得る。十分
な量のサプレッサーｔＲＮＡは、例えば、このｔＲＮＡコード配列を保有するア
デノウイルスベクターで宿主細胞をトランスフェクトすることにより、宿主細胞
において利用可能にされる。
てもそうでなくても、その宿主細胞に対して毒性であり得る）への宿主細胞の暴
露を最小にする条件下で、宿主細胞において組換え遺伝子産物を発現させるため
の方法を提供することである。この方法は、毒性タンパク質をコードする遺伝子
のコード配列に導入される終止コドン、およびこの毒性遺伝子産物をコードする
遺伝子コード配列に操作された終止コドンの存在を克服するための十分な量の補
完するサプレッサーｔＲＮＡ、ならびに終止コドンと通常相互作用する終結因子
、終止因子などの使用に依存して、毒性遺伝子産物の発現を調節する。毒性タン
パク質は、目的の産物であり得るか、または目的の所望の遺伝子産物の効率的な
発現に必要なタンパク質であり得る。宿主細胞に対して毒性である分子をコード
する遺伝子は、１つ以上の終止コドンを含むように作製される。複数の毒性タン
パク質を、単一の細胞においてそのような様式で操作し得る。また、複数の毒性
タンパク質を、複数の毒性タンパク質において同じアミノ酸残基で終止コドンを
導入することにより、単一種のサプレッサーｔＲＮＡによって調節し得る。十分
な量のサプレッサーｔＲＮＡは、例えば、このｔＲＮＡコード配列を保有するア
デノウイルスベクターで宿主細胞をトランスフェクトすることにより、宿主細胞
において利用可能にされる。
【０００４】 本発明のなお別の目的は、例えば、ｒｅｐ遺伝子のコード配列に終止コドンを
導入し、ならびにその終止変異および内因性終止因子の存在を克服するために十
分な量の補完するサプレッサーｔＲＮＡを使用して、それにより終止コドンを保
有するそのｒｅｐ遺伝子の発現を調節することによって、毒性アデノ随伴ウイル
ス（ＡＡＶ）ｒｅｐタンパク質および毒性アデノ随伴ウイルスｃａｐタンパク質
への宿主細胞の暴露を最小化するための方法を提供することである。サプレッサ
ーｔＲＮＡは、１、２、３または４つのｒｅｐタンパク質へと標的化され得る。
さらに、サプレッサーｔＲＮＡは、任意のアミノ酸コドンへと指向され得る。適
切な標的は、全ての４つのｒｅｐタンパク質に現れるセリンである。この方法で
は、単一種のサプレッサーｔＲＮＡのみが、４つのｒｅｐタンパク質の発現を調
節するために必要とされる。
導入し、ならびにその終止変異および内因性終止因子の存在を克服するために十
分な量の補完するサプレッサーｔＲＮＡを使用して、それにより終止コドンを保
有するそのｒｅｐ遺伝子の発現を調節することによって、毒性アデノ随伴ウイル
ス（ＡＡＶ）ｒｅｐタンパク質および毒性アデノ随伴ウイルスｃａｐタンパク質
への宿主細胞の暴露を最小化するための方法を提供することである。サプレッサ
ーｔＲＮＡは、１、２、３または４つのｒｅｐタンパク質へと標的化され得る。
さらに、サプレッサーｔＲＮＡは、任意のアミノ酸コドンへと指向され得る。適
切な標的は、全ての４つのｒｅｐタンパク質に現れるセリンである。この方法で
は、単一種のサプレッサーｔＲＮＡのみが、４つのｒｅｐタンパク質の発現を調
節するために必要とされる。
【０００５】 本発明のなお別の目的は、宿主細胞における毒性遺伝子産物（例えば、組換え
ＡＡＶの産生におけるｒｅｐタンパク質）の発現を調節するために、特定の核酸
構築物、細胞、ベクターなどを提供することである。
ＡＡＶの産生におけるｒｅｐタンパク質）の発現を調節するために、特定の核酸
構築物、細胞、ベクターなどを提供することである。
【０００６】 これらおよび他の目的は、組換え遺伝子産物の産生における宿主細胞の樹立お
よび生産性を制限する毒性遺伝子産物の発現を調節するための材料および方法の
開発によって達成された。例えば、終止コドンを、毒性遺伝子産物をコードする
遺伝子のコード配列へと操作し得る。次いで、終止コドンを認識し、かつアミノ
アシル基を運搬し、従って翻訳の終止を生じるかわりに成長中のポリペプチドに
アミノ酸を取り込むサプレッサーｔＲＮＡを使用する。サプレッサーｔＲＮＡは
、終止変異を補完し、そして外来遺伝子産物の発現が所望される場合には、翻訳
が生じることを可能にする。適切な標的は、宿主細胞に対して毒性であるＡＡＶ
のｒｅｐタンパク質である。なお別の適切な標的は、ＡＡＶのｃａｐタンパク質
である。
よび生産性を制限する毒性遺伝子産物の発現を調節するための材料および方法の
開発によって達成された。例えば、終止コドンを、毒性遺伝子産物をコードする
遺伝子のコード配列へと操作し得る。次いで、終止コドンを認識し、かつアミノ
アシル基を運搬し、従って翻訳の終止を生じるかわりに成長中のポリペプチドに
アミノ酸を取り込むサプレッサーｔＲＮＡを使用する。サプレッサーｔＲＮＡは
、終止変異を補完し、そして外来遺伝子産物の発現が所望される場合には、翻訳
が生じることを可能にする。適切な標的は、宿主細胞に対して毒性であるＡＡＶ
のｒｅｐタンパク質である。なお別の適切な標的は、ＡＡＶのｃａｐタンパク質
である。
【０００７】 本発明の方法は、宿主細胞に対して毒性である産物をコードし、かつ組換え核
酸技術の分野では普通である多数の遺伝子を調節するために適用され得る。
酸技術の分野では普通である多数の遺伝子を調節するために適用され得る。
【０００８】 （発明の詳細な説明） 本発明は、宿主に対して毒性であることが公知のタンパク質のコード配列中の
１つ以上の終止コドンの戦略的置換に依存する。この宿主細胞に対して毒性であ
るタンパク質は、宿主細胞に対して異質であるものであり得るが、必ずしもそう
である必要はない。毒性タンパク質は、目的の所望の遺伝子産物であり得るか、
または組換え核酸を用いる所望の遺伝子産物の発現に必要とされ得る。導入され
た終止コドンは、毒性タンパク質の翻訳を抑制し、従って宿主細胞中の毒性タン
パク質の発現および存在をダウンレギュレートする。
１つ以上の終止コドンの戦略的置換に依存する。この宿主細胞に対して毒性であ
るタンパク質は、宿主細胞に対して異質であるものであり得るが、必ずしもそう
である必要はない。毒性タンパク質は、目的の所望の遺伝子産物であり得るか、
または組換え核酸を用いる所望の遺伝子産物の発現に必要とされ得る。導入され
た終止コドンは、毒性タンパク質の翻訳を抑制し、従って宿主細胞中の毒性タン
パク質の発現および存在をダウンレギュレートする。
【０００９】 次いで、特異的に補完するサプレッサーｔＲＮＡが用いられる。ここで、サプ
レッサーｔＲＮＡのアンチコドンは、目的の毒性タンパク質のコード配列に挿入
された停止コドンを認識し、そして代わりにアミノアシル化されるｔＲＮＡが、
成長するポリペプチドにアミノ酸を導入する。従って、終止コドンは、この部位
でのアミノ酸の導入によって無効にされ、そして転写が進み、毒性タンパク質の
産生が生じる。
レッサーｔＲＮＡのアンチコドンは、目的の毒性タンパク質のコード配列に挿入
された停止コドンを認識し、そして代わりにアミノアシル化されるｔＲＮＡが、
成長するポリペプチドにアミノ酸を導入する。従って、終止コドンは、この部位
でのアミノ酸の導入によって無効にされ、そして転写が進み、毒性タンパク質の
産生が生じる。
【００１０】 導入された終止コドンの部位で、成長するポリペプチドに取り込まれるアミノ
酸は、終止コドンによって置換された部位で通常見出されるアミノ酸であり得る
。例えば、ポリペプチドの７番目のアミノ酸がスレオニンであり、そして７番目
のコドンが終止コドンによって置換される場合、適切に補完するサプレッサーｔ
ＲＮＡは、終止コドンを認識するアンチコドンを有するもの、およびアミノアシ
ル部位にスレオニン残基を運搬するものである。しかし、サプレッサーｔＲＮＡ
は、翻訳が終止コドンの存在にも関わらず生じる限り、アミノアシル部位に種々
のアミノ酸残基のいずれかを運搬し得、そしてこの部位にアミノ酸置換をもたら
す、得られるポリペプチドの機能は、有害な影響を全く伴わずに意図された目的
のために維持されることが見出され得る。
酸は、終止コドンによって置換された部位で通常見出されるアミノ酸であり得る
。例えば、ポリペプチドの７番目のアミノ酸がスレオニンであり、そして７番目
のコドンが終止コドンによって置換される場合、適切に補完するサプレッサーｔ
ＲＮＡは、終止コドンを認識するアンチコドンを有するもの、およびアミノアシ
ル部位にスレオニン残基を運搬するものである。しかし、サプレッサーｔＲＮＡ
は、翻訳が終止コドンの存在にも関わらず生じる限り、アミノアシル部位に種々
のアミノ酸残基のいずれかを運搬し得、そしてこの部位にアミノ酸置換をもたら
す、得られるポリペプチドの機能は、有害な影響を全く伴わずに意図された目的
のために維持されることが見出され得る。
【００１１】 終止コドンにより置換される特定のコドンは、目的の毒性タンパク質のコード
配列中でランダムに選択され得る。好ましくは、終止コドンにより置換されるべ
き標的コドンは、成長するポリペプチドの前半、好ましくは１／３、そしてより
好ましくは１／４、すなわち、アミノ末端付近に配置される。従って、好ましい
終止は、翻訳の後期よりはむしろ初期で生じる。
配列中でランダムに選択され得る。好ましくは、終止コドンにより置換されるべ
き標的コドンは、成長するポリペプチドの前半、好ましくは１／３、そしてより
好ましくは１／４、すなわち、アミノ末端付近に配置される。従って、好ましい
終止は、翻訳の後期よりはむしろ初期で生じる。
【００１２】 毒性タンパク質のコード配列に終止コドンを導入するための方法は、当該分野
で公知である。例えば、部位特異的突然変異誘発、終止コドンの標的化サブクロ
ーニングなど。
で公知である。例えば、部位特異的突然変異誘発、終止コドンの標的化サブクロ
ーニングなど。
【００１３】 同様に、適切に補完するサプレッサーｔＲＮＡの構築は、当該分野で公知の方
法による。適切なｔＲＮＡに最低限必要とされるものは、翻訳の終止を起こし、
その結果細胞傷害性タンパク質の発現を最小限にするために、コード配列に挿入
されるべきであった、または挿入されるべきである終止コドンを認識し、そして
翻訳の間に成長するポリペプチドに取り込むためにアミノアシル部位でｔＲＮＡ
に付着された適切なアミノ酸残基を運搬する、アンチコドンである。この方法で
は、終止コドンの存在にも関わらず、サプレッサーｔＲＮＡは、翻訳の間のアミ
ノ酸の取りこみを保証し続ける。
法による。適切なｔＲＮＡに最低限必要とされるものは、翻訳の終止を起こし、
その結果細胞傷害性タンパク質の発現を最小限にするために、コード配列に挿入
されるべきであった、または挿入されるべきである終止コドンを認識し、そして
翻訳の間に成長するポリペプチドに取り込むためにアミノアシル部位でｔＲＮＡ
に付着された適切なアミノ酸残基を運搬する、アンチコドンである。この方法で
は、終止コドンの存在にも関わらず、サプレッサーｔＲＮＡは、翻訳の間のアミ
ノ酸の取りこみを保証し続ける。
【００１４】 宿主細胞における翻訳の終止と関連する終結因子、終止因子および他の因子の
存在のために、適切な数のサプレッサーｔＲＮＡを有する宿主細胞を提供して、
毒性タンパク質コード遺伝子のコード配列に導入される終止コドンに対する翻訳
終止因子の影響を克服する必要がある。すなわち、細胞中に適切な量のサプレッ
サーｔＲＮＡ分子が存在する必要があり、その結果、おそらく、終止と関連する
内因性因子よりはむしろサプレッサーｔＲＮＡが、導入された終止コドンに結合
するようである。実際に、終止因子よりはむしろサプレッサーｔＲＮＡが、導入
された終止コドンに結合して、その結果毒性タンパク質の発現が生じるという可
能性をさらに高めるために、大量のｔＲＮＡ分子が宿主細胞中に存在することが
好ましい。
存在のために、適切な数のサプレッサーｔＲＮＡを有する宿主細胞を提供して、
毒性タンパク質コード遺伝子のコード配列に導入される終止コドンに対する翻訳
終止因子の影響を克服する必要がある。すなわち、細胞中に適切な量のサプレッ
サーｔＲＮＡ分子が存在する必要があり、その結果、おそらく、終止と関連する
内因性因子よりはむしろサプレッサーｔＲＮＡが、導入された終止コドンに結合
するようである。実際に、終止因子よりはむしろサプレッサーｔＲＮＡが、導入
された終止コドンに結合して、その結果毒性タンパク質の発現が生じるという可
能性をさらに高めるために、大量のｔＲＮＡ分子が宿主細胞中に存在することが
好ましい。
【００１５】 サプレッサーｔＲＮＡはまた、宿主細胞に対して毒性であり得る。従って、ｔ
ＲＮＡの存在がまた調節されるか、またはサプレッサーｔＲＮＡが、サプレッサ
ーｔＲＮＡへの宿主細胞の曝露を最小限にするために、目的の毒性タンパク質の
所望の発現の直前に、宿主細胞へと導入されることが好ましい。従って、ｔＲＮ
Ａの発現は、調節因エレメント（例えば、リプレッサーエレメントもしくは誘導
性プロモーター）の制御下であり得るか、またはｔＲＮＡコード配列を運搬する
ベクターが、目的の標的毒性タンパク質の発現が所望される時の直前に、宿主細
胞に導入され得る。組換えＡＡＶを産生すること、ならびにｒｅｐタンパク質お
よび／またはｃａｐタンパク質の発現が、本明細書中で提供される方法を用いて
調節される場合、ｔＲＮＡコード配列を運搬するための適切なベクターは、アデ
ノウイルスベクターである。なぜならば、アデノウイルスは、ＡＡＶの複製のた
めに必要なヘルパー機能を提供するからである。
ＲＮＡの存在がまた調節されるか、またはサプレッサーｔＲＮＡが、サプレッサ
ーｔＲＮＡへの宿主細胞の曝露を最小限にするために、目的の毒性タンパク質の
所望の発現の直前に、宿主細胞へと導入されることが好ましい。従って、ｔＲＮ
Ａの発現は、調節因エレメント（例えば、リプレッサーエレメントもしくは誘導
性プロモーター）の制御下であり得るか、またはｔＲＮＡコード配列を運搬する
ベクターが、目的の標的毒性タンパク質の発現が所望される時の直前に、宿主細
胞に導入され得る。組換えＡＡＶを産生すること、ならびにｒｅｐタンパク質お
よび／またはｃａｐタンパク質の発現が、本明細書中で提供される方法を用いて
調節される場合、ｔＲＮＡコード配列を運搬するための適切なベクターは、アデ
ノウイルスベクターである。なぜならば、アデノウイルスは、ＡＡＶの複製のた
めに必要なヘルパー機能を提供するからである。
【００１６】 組換え遺伝子産物を産生するために用いられ得る任意の細胞は、本発明の実施
において使用され得る。従って、原核生物細胞および真核生物細胞は、本発明の
範囲内にあることが意図される。従って、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳
動物細胞などは、宿主細胞としての機能を果たし得る。
において使用され得る。従って、原核生物細胞および真核生物細胞は、本発明の
範囲内にあることが意図される。従って、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳
動物細胞などは、宿主細胞としての機能を果たし得る。
【００１７】 現在、終結コドンを含む適切に改変されたコード配列は、当該分野において公
知の方法を実施して宿主細胞中に導入される。同様に、サプレッサーｔＲＮＡの
コード配列もまた、当該分野において公知の方法を実施して宿主細胞中に導入さ
れる。この結果は、目的の所望の産物であるか、または目的の所望の組換え産物
を得るために必要とされる毒性タンパク質の発現が調節される。
知の方法を実施して宿主細胞中に導入される。同様に、サプレッサーｔＲＮＡの
コード配列もまた、当該分野において公知の方法を実施して宿主細胞中に導入さ
れる。この結果は、目的の所望の産物であるか、または目的の所望の組換え産物
を得るために必要とされる毒性タンパク質の発現が調節される。
【００１８】 使用する直前に導入された終結コドンを含む、変更された毒性タンパク質遺伝
子を運搬する細胞に対して、サプレッサーｔＲＮＡの発現を調節することによっ
てか、またはサプレッサーｔＲＮＡを運搬するベクターの直接の曝露によって、
目的の宿主中に特定の部位または時間で、目的の所望のタンパク質の発現を指向
することが可能である。
子を運搬する細胞に対して、サプレッサーｔＲＮＡの発現を調節することによっ
てか、またはサプレッサーｔＲＮＡを運搬するベクターの直接の曝露によって、
目的の宿主中に特定の部位または時間で、目的の所望のタンパク質の発現を指向
することが可能である。
【００１９】 現在、本発明は、記載されているが、参照は、目的の本発明を例示する、本明
細書以下で留意される特定の実施例に対してなされる。本発明を実証するために
使用される系の１つは、哺乳動物細胞中での組換えＡＡＶの発現である。ＡＡＶ
の多くの異なる血清型（例えば、血清型Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ）が存
在し、そして各々の発現は、本発明の実施に受け入れられる。しかし、本実施例
は、単なる例示であり、そしていかなる様式においても、目的の本発明を限定し
ないことが認識されるべきである。
細書以下で留意される特定の実施例に対してなされる。本発明を実証するために
使用される系の１つは、哺乳動物細胞中での組換えＡＡＶの発現である。ＡＡＶ
の多くの異なる血清型（例えば、血清型Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ）が存
在し、そして各々の発現は、本発明の実施に受け入れられる。しかし、本実施例
は、単なる例示であり、そしていかなる様式においても、目的の本発明を限定し
ないことが認識されるべきである。
【００２０】 （実施例） （方法） （Ｉ．プラスミドおよびウイルスの構築） （１．ｐＡｄｌｏｘ１２ｓｕｐ ｔＲＮＡ） アンバーサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子は、セリンアンチコドンがアンバーアン
チコドンで置換されたヒトセリンｔＲＮＡ遺伝子（Ｃａｐｏｎｅら、１９８５）
から誘導した（図３Ａ）。ＨｉｎｄＩＩＩ、ＡｆｌＩＩおよびＢａｍＨＩの認識
配列を含むリンカー領域を、クローニング目的のために、このｔＲＮＡ遺伝子の
いずれかの側に配置した。さらに、１０塩基のスペーサーを、このｔＲＮＡ遺伝
子に対して３’に挿入した。このスペーサー領域は、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩに
より転写される遺伝子の発現を増強する（Ｇｅｉｄｕｃｓｈｅｋ＆Ｔｏｃｃｈｉ
ｎｉ−Ｖａｌｅｎｔｉｎｉ、１９８８）。
チコドンで置換されたヒトセリンｔＲＮＡ遺伝子（Ｃａｐｏｎｅら、１９８５）
から誘導した（図３Ａ）。ＨｉｎｄＩＩＩ、ＡｆｌＩＩおよびＢａｍＨＩの認識
配列を含むリンカー領域を、クローニング目的のために、このｔＲＮＡ遺伝子の
いずれかの側に配置した。さらに、１０塩基のスペーサーを、このｔＲＮＡ遺伝
子に対して３’に挿入した。このスペーサー領域は、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩに
より転写される遺伝子の発現を増強する（Ｇｅｉｄｕｃｓｈｅｋ＆Ｔｏｃｃｈｉ
ｎｉ−Ｖａｌｅｎｔｉｎｉ、１９８８）。
【００２１】 ｔＲＮＡ遺伝子を含む１１６ｂｐ ＤＮＡフラグメントを、４つのオリゴヌク
レオチドプライマー（図３Ａにボールドで示される）を有するスカフォールドを
形成することによって作製した。スカフォールドにおけるギャップを、ＰＣＲ（
９４℃で１分、５５℃で１分、および７２℃で１分を１０サイクルを使用する）
によって充填した。次いで、１１６ｂｐフラグメントを、上記と同じＰＣＲ条件
の下で、プライマー１および４（２５サイクル）を使用して増幅した。ＤＮＡを
フェノール：クロロホルムでの抽出、続いて、エタノールでの沈澱により、Ｐ
ＣＲ反応混合物から精製した。ＤＮＡペレットを、Ｈ2Ｏ中に再懸濁した。
レオチドプライマー（図３Ａにボールドで示される）を有するスカフォールドを
形成することによって作製した。スカフォールドにおけるギャップを、ＰＣＲ（
９４℃で１分、５５℃で１分、および７２℃で１分を１０サイクルを使用する）
によって充填した。次いで、１１６ｂｐフラグメントを、上記と同じＰＣＲ条件
の下で、プライマー１および４（２５サイクル）を使用して増幅した。ＤＮＡを
フェノール：クロロホルムでの抽出、続いて、エタノールでの沈澱により、Ｐ
ＣＲ反応混合物から精製した。ＤＮＡペレットを、Ｈ2Ｏ中に再懸濁した。
【００２２】 このＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩで消化し、そしてＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼでリン酸化した。本質的には、ｐＡｄｌｏｘ（Ｈａｒｄｙら、１９９７）であ
るプラスミドｐＡｄｌｏｘ１２（ここでは、発現カセットが、ポリリンカーによ
って置換された）を、ＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで消化し、次いで、仔ウシ腸
ホスファターゼで脱リン酸化した。２つのＤＮＡをＴ４ ＤＮＡリガーゼで一緒
に連結して、プラスミドｐＡｄｌｏｘ１２ｓｕｐ ｔＲＮＡ（図３Ｂ）を形成し
た。このプラスミドの同一性を、ＤＮＡ配列分析により確認した。
ゼでリン酸化した。本質的には、ｐＡｄｌｏｘ（Ｈａｒｄｙら、１９９７）であ
るプラスミドｐＡｄｌｏｘ１２（ここでは、発現カセットが、ポリリンカーによ
って置換された）を、ＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで消化し、次いで、仔ウシ腸
ホスファターゼで脱リン酸化した。２つのＤＮＡをＴ４ ＤＮＡリガーゼで一緒
に連結して、プラスミドｐＡｄｌｏｘ１２ｓｕｐ ｔＲＮＡ（図３Ｂ）を形成し
た。このプラスミドの同一性を、ＤＮＡ配列分析により確認した。
【００２３】 （２ ｐＵＣ−ＡＣＧ） ｐＵＣ−ＡＣＧは、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ機能を供給するために使用さ
れるＡＡＶヘルパープラスミドである。このｐＵＣ１９．ＡＣＧ構築物は、ＰＣ
Ｒにより単離された、Ｌｉら（１９９７）に記載されるｐＡＣＧ２−１のＸｂａ
Ｉフラグメントを含む。この５’ＸｂａＩ部位を、ＨｉｎｄＩＩＩ部位に変化さ
せ、そして３’ＸｂａＩ部位をＢａｍＨＩ部位に変化させた。このフラグメント
を、ｐＵＣ１９中のＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ部位中に挿入した。そして
このフラグメントは、アデノウイルス末端反復を含まない。
れるＡＡＶヘルパープラスミドである。このｐＵＣ１９．ＡＣＧ構築物は、ＰＣ
Ｒにより単離された、Ｌｉら（１９９７）に記載されるｐＡＣＧ２−１のＸｂａ
Ｉフラグメントを含む。この５’ＸｂａＩ部位を、ＨｉｎｄＩＩＩ部位に変化さ
せ、そして３’ＸｂａＩ部位をＢａｍＨＩ部位に変化させた。このフラグメント
を、ｐＵＣ１９中のＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ部位中に挿入した。そして
このフラグメントは、アデノウイルス末端反復を含まない。
【００２４】 （３．ｐＵＣ−ＡＣＧ７８*１３） ｐＵＣ−ＡＣＧ７８*１３（図４）は、Ｒｅｐ７８／６８タンパク質のアミノ
酸番号１３のセリンをコードするＡＧＣコドン（ＡＡＶゲノム３５７位（Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ登録番号ＡＦ０４３３０３））をＴＡＧアンバー停止コドンに変更した
、ＡＡＶヘルパープラスミドである。ｐＵＣ−ＡＣＧ７８*１３を、ｐＵＣ−Ａ
ＣＧの１８７ｂｐのＰｐｕＭＩ−ＳｆｉＩフラグメントを、鋳型としてｐＵＣ−
ＡＣＧを用いて、合成オリゴヌクレオチドプライマー５’−ＧＡＴＴＡＧＧＴＣ
ＣＣＣＴＡＧＧＡＣＣＴＴＧＡＣＧＧＧＣＡＴＣ−３’および５’−ＣＣＡＣＧ
ＡＧＣＡＣＧＴＧＣＡＴＧＴＧＧ−３’を使用するＰＣＲ、続いて、ＰｐｕＭＩ
およびＳｆｉＩでの消化により生成された１８７ｂｐのＰｐｕＭＩ−ＳｆｉＩフ
ラグメントを置きかえることによって生成した。アンバーコドンに、下線を付す
。
酸番号１３のセリンをコードするＡＧＣコドン（ＡＡＶゲノム３５７位（Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ登録番号ＡＦ０４３３０３））をＴＡＧアンバー停止コドンに変更した
、ＡＡＶヘルパープラスミドである。ｐＵＣ−ＡＣＧ７８*１３を、ｐＵＣ−Ａ
ＣＧの１８７ｂｐのＰｐｕＭＩ−ＳｆｉＩフラグメントを、鋳型としてｐＵＣ−
ＡＣＧを用いて、合成オリゴヌクレオチドプライマー５’−ＧＡＴＴＡＧＧＴＣ
ＣＣＣＴＡＧＧＡＣＣＴＴＧＡＣＧＧＧＣＡＴＣ−３’および５’−ＣＣＡＣＧ
ＡＧＣＡＣＧＴＧＣＡＴＧＴＧＧ−３’を使用するＰＣＲ、続いて、ＰｐｕＭＩ
およびＳｆｉＩでの消化により生成された１８７ｂｐのＰｐｕＭＩ−ＳｆｉＩフ
ラグメントを置きかえることによって生成した。アンバーコドンに、下線を付す
。
【００２５】 （４．ｐＵＣ−ＡＣＧ７８*１３／５２*１４） ｐＵＣ−ＡＣＧ７８*１３／５２*１４（図５）において、Ｒｅｐ５２のアミノ
酸番号１４のセリンをコードするＴＣＧ（ＡＡＶゲノム１０３２位（ＧｅｎＢａ
ｎｋ登録番号ＡＦ０４３３０３））を、ＴＡＧアンバー停止コドンに変更した。
ｐＵＣ−ＡＣＧ７８*１３／５２*１４を、ｐＵＣ−ＡＣＧ７８*１３の３６２ｂ
ｐのＳａｃＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、鋳型としてｐＵＣ−ＡＣＧを用い
て、合成オリゴヌクレオチドプライマー５’−ＡＧＡＴＴＣＧＣＧＡＡＡＡＡＣ
ＴＧＡＴ−３’および５’−ＴＣＣＴＧＧＡＴＣＣＡＣＴＧＣＴＴＣＴＣＣＴＡ ＧＧＴＡＡＴＣＣＣＣＴＴＧＴＣＣＡＣＧＡ−３’を使用するＰＣＲ、続いて、
ＳａｃＩＩおよびＢａｍＨＩでの消化により生成された３６２ｂｐのＳａｃＩＩ
−ＢａｍＨＩフラグメントを置きかえることによって生成した。アンバーコドン
に、下線を付す。
酸番号１４のセリンをコードするＴＣＧ（ＡＡＶゲノム１０３２位（ＧｅｎＢａ
ｎｋ登録番号ＡＦ０４３３０３））を、ＴＡＧアンバー停止コドンに変更した。
ｐＵＣ−ＡＣＧ７８*１３／５２*１４を、ｐＵＣ−ＡＣＧ７８*１３の３６２ｂ
ｐのＳａｃＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、鋳型としてｐＵＣ−ＡＣＧを用い
て、合成オリゴヌクレオチドプライマー５’−ＡＧＡＴＴＣＧＣＧＡＡＡＡＡＣ
ＴＧＡＴ−３’および５’−ＴＣＣＴＧＧＡＴＣＣＡＣＴＧＣＴＴＣＴＣＣＴＡ ＧＧＴＡＡＴＣＣＣＣＴＴＧＴＣＣＡＣＧＡ−３’を使用するＰＣＲ、続いて、
ＳａｃＩＩおよびＢａｍＨＩでの消化により生成された３６２ｂｐのＳａｃＩＩ
−ＢａｍＨＩフラグメントを置きかえることによって生成した。アンバーコドン
に、下線を付す。
【００２６】 （５．ｐｔｅｔ ＥＦ ＧＦＰ*３） ｐｔｅｔ ＥＦ ＧＦＰ*３を、サプレッサーｔＲＮＡの発現のためのコント
ロールプラスミドをして使用するために作製した。このプラスミドを、緑色蛍光
タンパク質（ＧＦＰ）についての遺伝子中のアミノ酸３位にアンバー停止コドン
を導入することによって作製した。２９３細胞を、公知の技術（例えば、リン酸
カルシウムを使用することによる）を使用して、プラスミドを用いてトランスフ
ェクトした。トランスフェクションの５時間後、細胞を、感染多重度が２である
Ａｄ５ ｄｌ３１２、Ｅ１Ａ-変異体か、あるいはｍ．ｏ．ｉ．が２または５で
あるＡｄ５ ｓｕｐ ｔＲＮＡで感染させた。ＧＦＰ*３プラスミドを受ける細
胞を、感染の６６時間後に蛍光顕微鏡下で試験した。この細胞の約３０％がＧＦ
Ｐを発現した。このことは、プラスミドで送達されたＧＦＰ遺伝子およびウイル
スで送達されたサプレッサーｔＲＮＡの両方が２９３細胞中で発現されたことを
示した。
ロールプラスミドをして使用するために作製した。このプラスミドを、緑色蛍光
タンパク質（ＧＦＰ）についての遺伝子中のアミノ酸３位にアンバー停止コドン
を導入することによって作製した。２９３細胞を、公知の技術（例えば、リン酸
カルシウムを使用することによる）を使用して、プラスミドを用いてトランスフ
ェクトした。トランスフェクションの５時間後、細胞を、感染多重度が２である
Ａｄ５ ｄｌ３１２、Ｅ１Ａ-変異体か、あるいはｍ．ｏ．ｉ．が２または５で
あるＡｄ５ ｓｕｐ ｔＲＮＡで感染させた。ＧＦＰ*３プラスミドを受ける細
胞を、感染の６６時間後に蛍光顕微鏡下で試験した。この細胞の約３０％がＧＦ
Ｐを発現した。このことは、プラスミドで送達されたＧＦＰ遺伝子およびウイル
スで送達されたサプレッサーｔＲＮＡの両方が２９３細胞中で発現されたことを
示した。
【００２７】 （６．Ａｄ ｓｕｐ ｔＲＮＡ） ヒトアンバーサプレッサーｔＲＮＡをコードするアデノウイルスを、Ｈａｒｄ
ｙら（１９９７）によって記載されるようにプラスミドｐＡｄｌｏｘ １２ ｓ
ｕｐ ｔＲＮＡから調製した。このサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子を、アデノウイ
ルスのＥ１領域に配置したが、ｔＲＮＡ遺伝子はまた、Ｅ３領域にも配置され得
る。さらに、ｔＲＮＡ遺伝子は、Ｅ３領域に配置され得、そしてｒＡＡＶベクタ
ー配列は、Ｅ１領域に配置されて、ｒＡＡＶベクターの一過性トランスフェクシ
ョンの必要なくｒＡＡＶの合成を可能にし得る。
ｙら（１９９７）によって記載されるようにプラスミドｐＡｄｌｏｘ １２ ｓ
ｕｐ ｔＲＮＡから調製した。このサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子を、アデノウイ
ルスのＥ１領域に配置したが、ｔＲＮＡ遺伝子はまた、Ｅ３領域にも配置され得
る。さらに、ｔＲＮＡ遺伝子は、Ｅ３領域に配置され得、そしてｒＡＡＶベクタ
ー配列は、Ｅ１領域に配置されて、ｒＡＡＶベクターの一過性トランスフェクシ
ョンの必要なくｒＡＡＶの合成を可能にし得る。
【００２８】 （７．ｒＡｄ−ｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ｌａｃＺ） ｒＡｄ−ｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ｌａｃＺを、ＡＡＶ ＩＴＲおよびプラスミドｐ
ｄｘ１１ ｌａｃＺ（ＭｃＣｏｗｎら、１９９６）由来のｌａｃＺ遺伝子を含む
フラグメントを取りだし、そしてｐＡｄｌｏｘ １２のＳｍａＩ部位へそのフラ
グメントを挿入することによって構築した。得られたプラスミドを使用して、ｌ
ａｃＺ遺伝子がＡＡＶ ＩＴＲに隣接したアデノウイルスを調製した。
ｄｘ１１ ｌａｃＺ（ＭｃＣｏｗｎら、１９９６）由来のｌａｃＺ遺伝子を含む
フラグメントを取りだし、そしてｐＡｄｌｏｘ １２のＳｍａＩ部位へそのフラ
グメントを挿入することによって構築した。得られたプラスミドを使用して、ｌ
ａｃＺ遺伝子がＡＡＶ ＩＴＲに隣接したアデノウイルスを調製した。
【００２９】 （８．ｐＲＴ４３．２６７） ｐＲＴ４３．２６７は、ＭＭＬＶ Ｐｓｉ配列（Ｇａｇ ＡＴＧ（これは、Ｔ
ＡＧに変異されている）まで）が対応するＭＭＳＶ配列に置換されたｒｋａｔ３
の改変体である（Ｆｉｎｅｒら、１９９４）。クローニング部位と逆方向鎖プラ
イマー結合部位との間のウイルスｅｎｖコード配列を欠失させた。インサートを
、ポリクローニング部位（５’−ＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ３’）へクローニングし
得る。
ＡＧに変異されている）まで）が対応するＭＭＳＶ配列に置換されたｒｋａｔ３
の改変体である（Ｆｉｎｅｒら、１９９４）。クローニング部位と逆方向鎖プラ
イマー結合部位との間のウイルスｅｎｖコード配列を欠失させた。インサートを
、ポリクローニング部位（５’−ＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ３’）へクローニングし
得る。
【００３０】 （９．ｐＴＲｏｒ６*１７） アンバー*１７変異を、ＰＣＲによって、アデノウィルス５型（Ａｄ５）のＥ
４遺伝子に導入した。このＰＣＲにおいて、２つのオリゴヌクレオチド、ｏｒｆ
６*１７（５’ＣＣＡＴＴＴＧＧＣＡＴＧＡＣＡＣＴＡＣＧＡＣＣＡＡＣＡＣＧ
ＡＴＡＧＣＧＧＴＴＧＴＣＴＣＧＧＣＧＣＡＣＴＣＣ３’）およびｏｒｆ６ ３
’（５’ＧＣＴＣＣＧＧＴＣＧＡＣＴＣＡＣＡＴＧＧＧＧＴＡＧＡＧＴＣＡＴＡ
ＡＴＣ３’）をプライマーとして使用した。全Ａｄ Ｅ４ｏｒｆ６遺伝子を作製
するため、上記のＰＣＲ産物を、プライマーｏｒｆ６ ５’（５’ＣＣＣＧＧＡ
ＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＡＣＴＡＣＧＴＣＣＧＧＣＧＴＴＣＣＡＴＴＴＧＧＣＡＴ
ＧＡＣＡＣＴＡＣ３’）およびｏｒｆ６ ３’を使用して第２のＰＣＲ反応に添
加した。引き続き、Ｅ４ ｏｒｆ６*１７フラグメントをｐＲＴ４３．２６７プ
ラスミドの唯一のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。最終プラスミド構築物は、Ｍｏｌ
ｏｎｙレトロウィルス５’ＬＴＲおよびパッケージング配列、ギャグ（ｇａｇ）
配列の半分；Ｅ４ｏｒｆ６*１７；およびＭｏｌｏｎｙレトロウィルス３’ＬＴ
Ｒを含む。このＥ４ｏｒｆ６*１７プラスミドを配列決定し、その配列の正確度
を立証した。
４遺伝子に導入した。このＰＣＲにおいて、２つのオリゴヌクレオチド、ｏｒｆ
６*１７（５’ＣＣＡＴＴＴＧＧＣＡＴＧＡＣＡＣＴＡＣＧＡＣＣＡＡＣＡＣＧ
ＡＴＡＧＣＧＧＴＴＧＴＣＴＣＧＧＣＧＣＡＣＴＣＣ３’）およびｏｒｆ６ ３
’（５’ＧＣＴＣＣＧＧＴＣＧＡＣＴＣＡＣＡＴＧＧＧＧＴＡＧＡＧＴＣＡＴＡ
ＡＴＣ３’）をプライマーとして使用した。全Ａｄ Ｅ４ｏｒｆ６遺伝子を作製
するため、上記のＰＣＲ産物を、プライマーｏｒｆ６ ５’（５’ＣＣＣＧＧＡ
ＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＡＣＴＡＣＧＴＣＣＧＧＣＧＴＴＣＣＡＴＴＴＧＧＣＡＴ
ＧＡＣＡＣＴＡＣ３’）およびｏｒｆ６ ３’を使用して第２のＰＣＲ反応に添
加した。引き続き、Ｅ４ ｏｒｆ６*１７フラグメントをｐＲＴ４３．２６７プ
ラスミドの唯一のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。最終プラスミド構築物は、Ｍｏｌ
ｏｎｙレトロウィルス５’ＬＴＲおよびパッケージング配列、ギャグ（ｇａｇ）
配列の半分；Ｅ４ｏｒｆ６*１７；およびＭｏｌｏｎｙレトロウィルス３’ＬＴ
Ｒを含む。このＥ４ｏｒｆ６*１７プラスミドを配列決定し、その配列の正確度
を立証した。
【００３１】 （１０．Ψ１７） Ψ１７は、Ｅ１領域内に、ヒト化ＣＭＶプロモーターおよび緑色蛍光タンパク
質（ＧＦＰ）遺伝子（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を有するΔＥ１／ΔＥ４アデノウィル
スベクターである。遺伝子型は、ΔＥ１ａ、ΔＥ１ｂ（ヌクレオチド４５４から
３３２８の欠失）およびΔＥ４（Ｈ５ｄｌ １０１４欠失＝ｏｒｆ１-、２-、３ - 、６-、６／７-およびｏｒｆ４+）である。このベクターは、Ｂｒｉｄｇｅ＆Ｋ
ｅｔｎｅｒ、１９９０にて記載される。
質（ＧＦＰ）遺伝子（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を有するΔＥ１／ΔＥ４アデノウィル
スベクターである。遺伝子型は、ΔＥ１ａ、ΔＥ１ｂ（ヌクレオチド４５４から
３３２８の欠失）およびΔＥ４（Ｈ５ｄｌ １０１４欠失＝ｏｒｆ１-、２-、３ - 、６-、６／７-およびｏｒｆ４+）である。このベクターは、Ｂｒｉｄｇｅ＆Ｋ
ｅｔｎｅｒ、１９９０にて記載される。
【００３２】 （１１．ｐＵＣ−ｓｕｐ） ｐＵＣ−ｓｕｐは、サプレッサーアンバーｔＲＮＡser をコードし、そしてア
デノウィルス配列を含まないプラスミドである。ｐＵＣ−ｓｕｐはプラスミドｐ
Ａｄｌｏｘ１２−ｓｕｐｔＲＮＡおよびｐＵＣ１９−ＡＣＧから作製される。ｐ
Ａｄｌｏｘ１２−ｓｕｐｔＲＮＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、
そしてサプレッサーｔＲＮＡを含む１１０ｂｐフラグメントを単離した。プラス
ミドｐＵＣ１９−ＡＣＧをＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩおよびＮｃｏＩで消化し
、ｐＵＣ１９ベクター骨格を含む２６５６ｂｐフラグメントを単離した。この１
１０ｂｐフラグメントおよび２６５６ｂｐフラグメントを連結し、ｐＵＣ−ｓｕ
ｐを形成した。
デノウィルス配列を含まないプラスミドである。ｐＵＣ−ｓｕｐはプラスミドｐ
Ａｄｌｏｘ１２−ｓｕｐｔＲＮＡおよびｐＵＣ１９−ＡＣＧから作製される。ｐ
Ａｄｌｏｘ１２−ｓｕｐｔＲＮＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、
そしてサプレッサーｔＲＮＡを含む１１０ｂｐフラグメントを単離した。プラス
ミドｐＵＣ１９−ＡＣＧをＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩおよびＮｃｏＩで消化し
、ｐＵＣ１９ベクター骨格を含む２６５６ｂｐフラグメントを単離した。この１
１０ｂｐフラグメントおよび２６５６ｂｐフラグメントを連結し、ｐＵＣ−ｓｕ
ｐを形成した。
【００３３】 （ＩＩ．ｓｕｐ ｔＲＮＡ系を使用したｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＬａｃＺの産生） （１．ｐＵＣ−ＡＣＧ７８*１３） ＬａｃＺ遺伝子（ｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＬａｃＺ）をコードするｒＡＡＶを、記
載されているように（Ｓｎｙｄｅｒら、１９９６）少数の改変とともに調製した
。手短に言えば、ヒト２９３細胞を、リン酸カルシウム方法を使用して、ベクタ
ープラスミド（ｐｄｘ１１ＬａｃＺ（ＭｃＣｏｗｎら、１９９６））、およびヘ
ルパープラスミド（ｐＵＣ―ＡＧＧ）または変異ヘルパープラスミド（ｐＵＣ−
ＡＣＧ７８*１３ またはｐＵＣ−ＡＣＧ*１３*１４）のいずれか一方で同時トラ
ンスフェクトした。
載されているように（Ｓｎｙｄｅｒら、１９９６）少数の改変とともに調製した
。手短に言えば、ヒト２９３細胞を、リン酸カルシウム方法を使用して、ベクタ
ープラスミド（ｐｄｘ１１ＬａｃＺ（ＭｃＣｏｗｎら、１９９６））、およびヘ
ルパープラスミド（ｐＵＣ―ＡＧＧ）または変異ヘルパープラスミド（ｐＵＣ−
ＡＣＧ７８*１３ またはｐＵＣ−ＡＣＧ*１３*１４）のいずれか一方で同時トラ
ンスフェクトした。
【００３４】 すべてのサンプルから細胞を収集し、そして凍結／解凍を３ラウンドすること
により溶解した。各サンプルにおけるｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＬａｃＺの機能的力価
を、限界希釈の細胞溶解物に２９３細胞を感染させることにより決定した。２４
時間のインキュベーション後、細胞をＸ−ｇａｌで染色し、そしてβガラクトシ
ダーゼ陽性細胞を計数した。
により溶解した。各サンプルにおけるｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＬａｃＺの機能的力価
を、限界希釈の細胞溶解物に２９３細胞を感染させることにより決定した。２４
時間のインキュベーション後、細胞をＸ−ｇａｌで染色し、そしてβガラクトシ
ダーゼ陽性細胞を計数した。
【００３５】 機能的アッセイの結果を図７において示す。ｐＵＣ―ＡＣＧでトランスフェク
トした細胞由来のｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＬａｃＺの力価およびＡｄ ｄｌ３１２ま
たはＡｄ ｓｕｐ ｔＲＮＡで感染させた細胞由来のｒＡＡＶ−ＣＭＶ−Ｌａｃ
Ｚの力価は、それぞれ１．２×１０8および２．８×１０7であった。ｐＵＣ−Ａ
ＣＧ７８*１３でトランスフェクトした細胞およびＡｄ ｄｌ３１２に感染させ
た細胞からは、力価は検出されなかった。このアッセイの検出限界を１×１０4
と決定し、これはｒｅｐ７８におけるアンバー変異の存在に起因して、力価の少
なくとも１０3低下があったことを示唆している。ｐＵＣ−ＡＣＧ７８*１３およ
びＡｄ ｓｕｐ ｔＲＮＡを受容した細胞より得られた力価は、１．６×１０7
および３．４×１０7であった。この値は、ｐＵＣ−ＡＣＧより得られた力価と
類似し、これは、ｒｅｐ遺伝子におけるアンバー変異が十分に抑制され、ｒＡＡ
Ｖの正常力価を産生したことを示している。
トした細胞由来のｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＬａｃＺの力価およびＡｄ ｄｌ３１２ま
たはＡｄ ｓｕｐ ｔＲＮＡで感染させた細胞由来のｒＡＡＶ−ＣＭＶ−Ｌａｃ
Ｚの力価は、それぞれ１．２×１０8および２．８×１０7であった。ｐＵＣ−Ａ
ＣＧ７８*１３でトランスフェクトした細胞およびＡｄ ｄｌ３１２に感染させ
た細胞からは、力価は検出されなかった。このアッセイの検出限界を１×１０4
と決定し、これはｒｅｐ７８におけるアンバー変異の存在に起因して、力価の少
なくとも１０3低下があったことを示唆している。ｐＵＣ−ＡＣＧ７８*１３およ
びＡｄ ｓｕｐ ｔＲＮＡを受容した細胞より得られた力価は、１．６×１０7
および３．４×１０7であった。この値は、ｐＵＣ−ＡＣＧより得られた力価と
類似し、これは、ｒｅｐ遺伝子におけるアンバー変異が十分に抑制され、ｒＡＡ
Ｖの正常力価を産生したことを示している。
【００３６】 ＧＦＰ遺伝子におけるアンバー変異の６０％までの抑制を得た。同様のレベル
の抑制が、ｒｅｐ遺伝子について得られる場合、次いで、ｒｅｐ遺伝子における
アンバー変異の抑制は、正常レベルのｒＡＡＶ産生を生じ、そしてｒｅｐの発現
は、ｒＡＡＶの産生における限定要因ではない。実際に、ｃａｐ遺伝子の発現は
、ｒＡＡＶの産生について限定することが見出された。さらに、強力なプロモー
ターからのｒｅｐの高発現は、ｒＡＡＶの収率を低下することが示されている（
Ｌｉら、１９９７）。
の抑制が、ｒｅｐ遺伝子について得られる場合、次いで、ｒｅｐ遺伝子における
アンバー変異の抑制は、正常レベルのｒＡＡＶ産生を生じ、そしてｒｅｐの発現
は、ｒＡＡＶの産生における限定要因ではない。実際に、ｃａｐ遺伝子の発現は
、ｒＡＡＶの産生について限定することが見出された。さらに、強力なプロモー
ターからのｒｅｐの高発現は、ｒＡＡＶの収率を低下することが示されている（
Ｌｉら、１９９７）。
【００３７】 （２．ｐＵＣ−ＡＣＧ７８*１３，５２*１４） Ａｄ ｓｕｐ ｔＲＮＡは、ＡＡＶヘルパープラスミドにおける２つのアンバ
ー変異を抑制し得る。プラスミドｐＵＣ−ＡＣＧ７８*１３，５２*１４は、Ｒｅ
ｐ７８開始コドンの下流の最初のセリンコドン、ＡＡＶゲノム３５７位、および
Ｒｅｐ５２開始コドンの下流の最初のセリンコドン、ＡＡＶゲノム１０３２位で
アンバー変異を含む。組換えＡＡＶを、上記のように調製し、そして粗溶解物中
のｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＬａｃＺの機能的力価を、２９３細胞の形質導入によって
試験した（図８）。ヘルパープラスミドがｐＵＣ−ＡＣＧ、ｐＵＣ−ＡＣＧ７８ * １３またはｐＵＣ−ＡＣＧ７８*１３，５２*１４のいずれかである、Ａｄ ｓ
ｕｐ ｔＲＮＡでの感染後のサンプルから、同様の力価を得た（カラム２、４お
よび６）。しかし、細胞をＡｄ ｄｌ３１２に感染させた場合、ｒＡＡＶは、親
ｐＵＣ−ＡＣＧプラスミドでのみ産生された（カラム１）。単一のアンバー変異
（カラム３）または２重のアンバー変異（カラム５）のいずれを使用しても、ウ
イルスは産生されなかった。この結果は、アデノウイルスによって送達されたサ
プレッサーｔＲＮＡが、２つのアンバー変異を効果的に抑制し、ｒＡＡＶを産生
し得ることを実証する。
ー変異を抑制し得る。プラスミドｐＵＣ−ＡＣＧ７８*１３，５２*１４は、Ｒｅ
ｐ７８開始コドンの下流の最初のセリンコドン、ＡＡＶゲノム３５７位、および
Ｒｅｐ５２開始コドンの下流の最初のセリンコドン、ＡＡＶゲノム１０３２位で
アンバー変異を含む。組換えＡＡＶを、上記のように調製し、そして粗溶解物中
のｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＬａｃＺの機能的力価を、２９３細胞の形質導入によって
試験した（図８）。ヘルパープラスミドがｐＵＣ−ＡＣＧ、ｐＵＣ−ＡＣＧ７８ * １３またはｐＵＣ−ＡＣＧ７８*１３，５２*１４のいずれかである、Ａｄ ｓ
ｕｐ ｔＲＮＡでの感染後のサンプルから、同様の力価を得た（カラム２、４お
よび６）。しかし、細胞をＡｄ ｄｌ３１２に感染させた場合、ｒＡＡＶは、親
ｐＵＣ−ＡＣＧプラスミドでのみ産生された（カラム１）。単一のアンバー変異
（カラム３）または２重のアンバー変異（カラム５）のいずれを使用しても、ウ
イルスは産生されなかった。この結果は、アデノウイルスによって送達されたサ
プレッサーｔＲＮＡが、２つのアンバー変異を効果的に抑制し、ｒＡＡＶを産生
し得ることを実証する。
【００３８】 （３．ｐＵＣ−ＡＣＧ７８*１３およびｖＴＲ ＬａｃＺ） アデノウイルス上で保持されるベクタープラスミドの送達効率を調べた。２９
３細胞を、プラスミドｐＵＣ−ＡＣＧ７８*１３でトランスフェクトした。次い
で、細胞を、Ａｄ ｖＴＲ−ＬａｃＺ（ＡＡＶ ＩＴＲによって隣接されるＬａ
ｃＺ遺伝子をコードするアデノウイルス）に感染させた。ｒＡＡＶ−ＣＭＶ−Ｌ
ａｃＺを、このウイルスを感染させた細胞から調製し得る。細胞を、Ａｄ ｄｌ
３１２（図９、カラム１および２）またはＡｄ ｓｕｐ ｔＲＮＡ（カラム３お
よび４）のいずれかで同時感染させた。感染させた細胞を３日間インキュベート
し、そして溶解物を複数回の凍結融解サイクルによって調製した。各サンプルの
一部を加熱して、溶解物中に存在するＡｄ ｖＴＲ ＬａｃＺを不活化し、これ
によって、ｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ｌａｃＺのみを測定する。なぜなら、ｒＡＡＶ−
ＣＭＶ−ｌａｃＺは熱安定性であるからである。
３細胞を、プラスミドｐＵＣ−ＡＣＧ７８*１３でトランスフェクトした。次い
で、細胞を、Ａｄ ｖＴＲ−ＬａｃＺ（ＡＡＶ ＩＴＲによって隣接されるＬａ
ｃＺ遺伝子をコードするアデノウイルス）に感染させた。ｒＡＡＶ−ＣＭＶ−Ｌ
ａｃＺを、このウイルスを感染させた細胞から調製し得る。細胞を、Ａｄ ｄｌ
３１２（図９、カラム１および２）またはＡｄ ｓｕｐ ｔＲＮＡ（カラム３お
よび４）のいずれかで同時感染させた。感染させた細胞を３日間インキュベート
し、そして溶解物を複数回の凍結融解サイクルによって調製した。各サンプルの
一部を加熱して、溶解物中に存在するＡｄ ｖＴＲ ＬａｃＺを不活化し、これ
によって、ｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ｌａｃＺのみを測定する。なぜなら、ｒＡＡＶ−
ＣＭＶ−ｌａｃＺは熱安定性であるからである。
【００３９】 図９に示されるように、非加熱溶解物中のアデノウイルスの力価は、約３×１
０8機能単位／ｍｌであった（カラム１および３）。Ａｄ ｄｌ３１２に感染さ
せた細胞からはｒＡＡＶは検出されなかったが（カラム２）、Ａｄ ｓｕｐ ｔ
ＲＮＡを受け入れている細胞は、１×１０6機能単位／ｍｌの熱安定性ｒＡＡＶ
の力価を生じた（カラム４）。この結果は、ｒＡＡＶが、ｒＡＡＶベクター配列
をコードするアデノウイルスおよびサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子をコードするア
デノウイルスの同時感染によって産生され得ることを示す。このことは、ｒｅｐ
７８*１３遺伝子またはｒｅｐ７８*１３，５２*１４遺伝子が、安定なプロデュ
ーサー細胞株における宿主染色体内に組み込まれる、ｒＡＡＶプロデューサー細
胞のクローンのスクリーニングに有用であることを証明するはずである。
０8機能単位／ｍｌであった（カラム１および３）。Ａｄ ｄｌ３１２に感染さ
せた細胞からはｒＡＡＶは検出されなかったが（カラム２）、Ａｄ ｓｕｐ ｔ
ＲＮＡを受け入れている細胞は、１×１０6機能単位／ｍｌの熱安定性ｒＡＡＶ
の力価を生じた（カラム４）。この結果は、ｒＡＡＶが、ｒＡＡＶベクター配列
をコードするアデノウイルスおよびサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子をコードするア
デノウイルスの同時感染によって産生され得ることを示す。このことは、ｒｅｐ
７８*１３遺伝子またはｒｅｐ７８*１３，５２*１４遺伝子が、安定なプロデュ
ーサー細胞株における宿主染色体内に組み込まれる、ｒＡＡＶプロデューサー細
胞のクローンのスクリーニングに有用であることを証明するはずである。
【００４０】 （ＩＩＩ．アデノウイルスの産生） アデノウイルスＥ４遺伝子は、アデノウイルス増殖に必要である。このＥ４領
域を欠失する、組換えアデノウイルスベクターを構築し得るが、これらのベクタ
ーは、Ｅ４でのトランス補完（ｔｒａｎｓｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を
必要とする。Ｅ４タンパク質を発現する細胞株は、Ｅ４タンパク質の毒性性質の
ために産生することが困難である。従って、Ｅ４ｏｒｆ６遺伝子発現の厳密な制
御が、これらの配列を欠失する組換えアデノウイルスベクターの産生のための、
Ｅ４ｏｒｆ６を発現し得る安定な細胞株を生成するために重要である。
域を欠失する、組換えアデノウイルスベクターを構築し得るが、これらのベクタ
ーは、Ｅ４でのトランス補完（ｔｒａｎｓｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を
必要とする。Ｅ４タンパク質を発現する細胞株は、Ｅ４タンパク質の毒性性質の
ために産生することが困難である。従って、Ｅ４ｏｒｆ６遺伝子発現の厳密な制
御が、これらの配列を欠失する組換えアデノウイルスベクターの産生のための、
Ｅ４ｏｒｆ６を発現し得る安定な細胞株を生成するために重要である。
【００４１】 安定な２９３ｏｒｆ６*１７細胞株を、２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５
７３）を、高グルコースおよび１０％ウシ血清を含むＤＭＥＭ中で増殖させるこ
とによって、作製した。この細胞を、トランスフェクションの６時間前に、１０
ｃｍプレートあたり６×１０6で播種した。次いで、１０μｇのｐＲＴｏｒｆ６* １７および１μｇのｐＰＵＲ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ、ＳＶ４０プロモーターの制御
下でピューロマイシン耐性遺伝子をコードする）を、リン酸カルシウム沈殿によ
って、この２９３細胞に同時トランスフェクトした。この細胞に１６時間後、通
常の培地を再供給した。トランスフェクションの約４８時間後、この培地を、１
μｌ／ｍｌピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含む選択培地に変えた。この細胞
に、約２〜３週間、３日毎に新鮮な選択培地を再供給した。１２個のクローンを
単離し、そして以降の特徴付けのために増殖させた。
７３）を、高グルコースおよび１０％ウシ血清を含むＤＭＥＭ中で増殖させるこ
とによって、作製した。この細胞を、トランスフェクションの６時間前に、１０
ｃｍプレートあたり６×１０6で播種した。次いで、１０μｇのｐＲＴｏｒｆ６* １７および１μｇのｐＰＵＲ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ、ＳＶ４０プロモーターの制御
下でピューロマイシン耐性遺伝子をコードする）を、リン酸カルシウム沈殿によ
って、この２９３細胞に同時トランスフェクトした。この細胞に１６時間後、通
常の培地を再供給した。トランスフェクションの約４８時間後、この培地を、１
μｌ／ｍｌピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含む選択培地に変えた。この細胞
に、約２〜３週間、３日毎に新鮮な選択培地を再供給した。１２個のクローンを
単離し、そして以降の特徴付けのために増殖させた。
【００４２】 ２９３ｏｒｆ６*１７細胞株および２９３細胞株（コントロールとして）を、
トランスフェクションの６時間前に、プレートあたり２．５×１０6でｂｃｍプ
レートにプレートした。次いで、３μｇのｐＡｄｌｏｘ ｓｕｐｔＲＮＡを、リ
ン酸カルシウム沈殿によって、これらの細胞に導入した。トランスフェクション
の約２４時間後、全てのプレートを、ＭＯＩ＝１（２μｌの、１．２５×１０9
ｐｆｕ／ｍｌのΨ１７溶解物）であるΨ１７に感染させた。感染４日後に、細胞
を全てのプレートから収集した。３回の凍結融解後、１００μｌの溶解物を使用
して、３×１０6の２９３細胞を形質導入した。４日後、これらの細胞を、２９
３細胞への第２継代のために収集した。アデノウイルスを感染させた陽性細胞を
計数して、生成されたウイルス力価を測定した。
トランスフェクションの６時間前に、プレートあたり２．５×１０6でｂｃｍプ
レートにプレートした。次いで、３μｇのｐＡｄｌｏｘ ｓｕｐｔＲＮＡを、リ
ン酸カルシウム沈殿によって、これらの細胞に導入した。トランスフェクション
の約２４時間後、全てのプレートを、ＭＯＩ＝１（２μｌの、１．２５×１０9
ｐｆｕ／ｍｌのΨ１７溶解物）であるΨ１７に感染させた。感染４日後に、細胞
を全てのプレートから収集した。３回の凍結融解後、１００μｌの溶解物を使用
して、３×１０6の２９３細胞を形質導入した。４日後、これらの細胞を、２９
３細胞への第２継代のために収集した。アデノウイルスを感染させた陽性細胞を
計数して、生成されたウイルス力価を測定した。
【００４３】 図１４に示されるように、Ｅ４を発現しない２９３細胞は、Ψ１７ウイルスを
産生しなかった。しかし、安定なＥ４産生細胞は、Ψ１７ベクターを補完して、
Ψ１７ウイルスを産生した。
産生しなかった。しかし、安定なＥ４産生細胞は、Ψ１７ベクターを補完して、
Ψ１７ウイルスを産生した。
【００４４】 （参考文献）
【００４５】
【表１】
【００４６】
【００４７】 本明細書中に引用された全ての参考文献は、参考として援用される。
【００４８】 現在、本発明が記載および例示されているが、当業者には、様々な変化および
改変が、本発明の精神および範囲を逸脱せずに、本発明に対してなされ得ること
が明らかである。
改変が、本発明の精神および範囲を逸脱せずに、本発明に対してなされ得ること
が明らかである。
【図１】 図１は、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子産物の毒性効果を不活化するためのスキームで
ある。ｒｅｐ遺伝子産物の発現は、例えば、Ｒｅｐ７８／６８の最初のセリンコ
ドンをアンバー変異で置き換えて（Ｒｅｐ７８*１３）、それによってｐ５メッ
セージの翻訳を停止させることによって不活化され得る。同様に、ｐ１９プロモ
ーターからのＲｅｐ ５２／４０の発現は、１４位のアンバー停止コドンをこれ
らのタンパク質の最初のセリンコドンに配置する（Ｒｅｐ７８*１４）ことによ
って不活化し得る。４つすべてのｒｅｐタンパク質についてのオープンリーディ
ングフレームが、その部位で同一であることに注目のこと。従って、ｒｅｐ５２ * １４停止コドンは、４つすべてのｒｅｐタンパク質の発現を不活化する。
ある。ｒｅｐ遺伝子産物の発現は、例えば、Ｒｅｐ７８／６８の最初のセリンコ
ドンをアンバー変異で置き換えて（Ｒｅｐ７８*１３）、それによってｐ５メッ
セージの翻訳を停止させることによって不活化され得る。同様に、ｐ１９プロモ
ーターからのＲｅｐ ５２／４０の発現は、１４位のアンバー停止コドンをこれ
らのタンパク質の最初のセリンコドンに配置する（Ｒｅｐ７８*１４）ことによ
って不活化し得る。４つすべてのｒｅｐタンパク質についてのオープンリーディ
ングフレームが、その部位で同一であることに注目のこと。従って、ｒｅｐ５２ * １４停止コドンは、４つすべてのｒｅｐタンパク質の発現を不活化する。
【図２】 図２は、サプレッサーｔＲＮＡを示す。ｒｅｐタンパク質合成の翻訳停止は、
終止コドンサプレッサーｔＲＮＡを用いる補完によってバイパスされ得る。ヒト
セリンｔＲＮＡ（左側）およびＧＣＵアンチコドンがＣＵＡアンチコドンで置き
換えられているアンバーサプレッサーｔＲＮＡ（右側）の構造を示す。セリンｔ
ＲＮＡは、１３位でＲｅｐ７８タンパク質にセリンを挿入するが、Ｒｅｐ７８*
１３の１３番目のコドンを認識しない。従って、Ｒｅｐ７８*１３にセリンを挿
入しない。他方、アンバーサプレッサーｔＲＮＡは、Ｒｅｐ７８*１３における
アンバー変異を認識し、そして今度は成長中のポリペプチド鎖にセリンを挿入し
て、全長Ｒｅｐ７８を作る。アンバーサプレッサーは、ｒｅｐ７８およびｒｅｐ
５２通常のオーカー停止コドンに対して、そしてまたｒｅｐ６８およびｒｅｐ４
０のオパール停止コドンに対しても悪影響を有さないべきである。
終止コドンサプレッサーｔＲＮＡを用いる補完によってバイパスされ得る。ヒト
セリンｔＲＮＡ（左側）およびＧＣＵアンチコドンがＣＵＡアンチコドンで置き
換えられているアンバーサプレッサーｔＲＮＡ（右側）の構造を示す。セリンｔ
ＲＮＡは、１３位でＲｅｐ７８タンパク質にセリンを挿入するが、Ｒｅｐ７８*
１３の１３番目のコドンを認識しない。従って、Ｒｅｐ７８*１３にセリンを挿
入しない。他方、アンバーサプレッサーｔＲＮＡは、Ｒｅｐ７８*１３における
アンバー変異を認識し、そして今度は成長中のポリペプチド鎖にセリンを挿入し
て、全長Ｒｅｐ７８を作る。アンバーサプレッサーは、ｒｅｐ７８およびｒｅｐ
５２通常のオーカー停止コドンに対して、そしてまたｒｅｐ６８およびｒｅｐ４
０のオパール停止コドンに対しても悪影響を有さないべきである。
【図３Ａ】 図３Ａは、アンバーサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子をコードするプラスミドの構
築を示す。アンバーサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子は、ヒトセリンｔＲＮＡ遺伝子
（大文字で示す）から誘導された。ここではセリンアンチコドンは、アンバーア
ンチコドン（下線を付した）で置換された。リンカー領域（小文字で示される）
を、ｔＲＮＡ遺伝子のいずれかの側に配置した。５’リンカーは、ＨｉｎｄＩＩ
ＩおよびＡｆｌＩＩ認識配列からなり、そして３’リンカーは、１０塩基のスペ
ーサー、続いてＢａｍＨＩ認識配列からなる。１１６ｂｐのＤＮＡフラグメント
は、４つのオリゴヌクレオチドプライマー（太字で示す）を用いるスカフォール
ド形成、続いてＰＣＲによって生成された。
築を示す。アンバーサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子は、ヒトセリンｔＲＮＡ遺伝子
（大文字で示す）から誘導された。ここではセリンアンチコドンは、アンバーア
ンチコドン（下線を付した）で置換された。リンカー領域（小文字で示される）
を、ｔＲＮＡ遺伝子のいずれかの側に配置した。５’リンカーは、ＨｉｎｄＩＩ
ＩおよびＡｆｌＩＩ認識配列からなり、そして３’リンカーは、１０塩基のスペ
ーサー、続いてＢａｍＨＩ認識配列からなる。１１６ｂｐのＤＮＡフラグメント
は、４つのオリゴヌクレオチドプライマー（太字で示す）を用いるスカフォール
ド形成、続いてＰＣＲによって生成された。
【図３Ｂ】 図３Ｂは、アンバーサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子をコードするプラスミドの構
築を示す。１１６ｂｐのｔＲＮＡフラグメントを、ＢａｍＨＩを用いて消化し、
次いで３３３２ｂｐのｐＡｄｌｏｘのＥｃｏＲＶ−ＢａｍＨＩフラグメントに連
結して、プラスミドｐＡｄｌｏｘ１２ｓｕｐ ｔＲＮＡを形成した。
築を示す。１１６ｂｐのｔＲＮＡフラグメントを、ＢａｍＨＩを用いて消化し、
次いで３３３２ｂｐのｐＡｄｌｏｘのＥｃｏＲＶ−ＢａｍＨＩフラグメントに連
結して、プラスミドｐＡｄｌｏｘ１２ｓｕｐ ｔＲＮＡを形成した。
【図３Ｃ】 図３Ｃは、アンバーサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子をコードするプラスミドの構
築を示す。ｐＡｄｌｏｘ１２は、発現カセットが除去され、そしてポリリンカー
が除去されたｐＡｄｌｏｘ（Ｈａｒｄｙら、１９９７）である。具体的には、Ｐ
ｖｕＩＩとＣｌａＩとの間の配列が、ｐＡｄｌｏｘから除去され、そして図３Ｃ
において示されたポリリンカー配列によって置換された。
築を示す。ｐＡｄｌｏｘ１２は、発現カセットが除去され、そしてポリリンカー
が除去されたｐＡｄｌｏｘ（Ｈａｒｄｙら、１９９７）である。具体的には、Ｐ
ｖｕＩＩとＣｌａＩとの間の配列が、ｐＡｄｌｏｘから除去され、そして図３Ｃ
において示されたポリリンカー配列によって置換された。
【図３Ｄ】 図３Ｄは、アンバーサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子をコードするプラスミドの構
築を示す。
築を示す。
【図４】 図４は、プラスミドｐＵＣ−ＡＣＧ ７８*１３の図である。プラスミドｐＵ
Ｃ−ＡＣＧ ７８*１３におけるＴＡＧアンバー変異は、１６５位のＡｖｒＩＩ
部位によって同定される。
Ｃ−ＡＣＧ ７８*１３におけるＴＡＧアンバー変異は、１６５位のＡｖｒＩＩ
部位によって同定される。
【図５】 図５は、プラスミドｐＵＣ−ＡＣＧ ７８*１３、５２*１４の図である。ｒｅ
ｐ７８遺伝子のコドン１３におけるアンバー変異およびｒｅｐ５２遺伝子のコド
ン１４におけるアンバー変異は、それぞれ、１６５位および８４０位のＡｖｒＩ
Ｉ部位によって同定される。
ｐ７８遺伝子のコドン１３におけるアンバー変異およびｒｅｐ５２遺伝子のコド
ン１４におけるアンバー変異は、それぞれ、１６５位および８４０位のＡｖｒＩ
Ｉ部位によって同定される。
【図６】 図６は、Ａｄ ｓｕｐ ｔＲＮＡの図である。サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子を
コードするアデノウイルスは、Ｅ１領域またはＥ３領域のいずれかに配置され得
る。アンバーサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子がＥ３領域に配置され、そしてｒＡＡ
Ｖベクター配列がＥ１領域に配置されているアデノウイルスもまた、作製され得
る。逆に、ｔＲＮＡ遺伝子はＥ１領域に配置され得、そしてｒＡＡＶ配列はＥ３
領域に配置され得る。調節エレメントがｔＲＮＡ遺伝子に対して５’に含まれる
アデノウイルスもまた、構築され得る。
コードするアデノウイルスは、Ｅ１領域またはＥ３領域のいずれかに配置され得
る。アンバーサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子がＥ３領域に配置され、そしてｒＡＡ
Ｖベクター配列がＥ１領域に配置されているアデノウイルスもまた、作製され得
る。逆に、ｔＲＮＡ遺伝子はＥ１領域に配置され得、そしてｒＡＡＶ配列はＥ３
領域に配置され得る。調節エレメントがｔＲＮＡ遺伝子に対して５’に含まれる
アデノウイルスもまた、構築され得る。
【図７】 図７は、ｒｅｐ７８*１３／ｓｕｐ ｔＲＮＡ系を使用するｒＡＡＶ−ＣＭＶ
−ＬａｃＺの産生である。ヒト２９３細胞を、ｐＵＣ−ＡＣＧ（カラム１および
２）またはｐＵＣ−ＡＣＧ ｒｅｐ７８*１３（カラム３〜５）のいずれかを用
いてトランスフェクトした。５時間後、細胞を、ＭＯＩが２であるＡｄ５ ｄｌ
３１２（カラム１および３）または推定ＭＯＩが２であるＡｄ５ ｓｕｐ ｔＲ
ＮＡ（カラム２および４）または推定ＭＯＩが１０であるＡｄ５ ｓｕｐ ｔＲ
ＮＡ（カラム５）のいずれかに感染させた。ｓｕｐ ｔＲＮＡ発現をモニターす
るコントロールとして、細胞を、コドン３にアンバー変異を含むＧＦＰ遺伝子を
発現するプラスミドに感染させ、次いで、ＭＯＩが２であるＡｄ５ ｓｕｐ ｔ
ＲＮＡに感染させた（カラム６）。細胞を、３日間のインキュベーションの後に
収集し、そして溶解した。次いで、細胞溶解物を、２９３細胞の形質導入によっ
て、ｒＡＡＶについてアッセイした。結果を、力価として、機能的粒子／ｍｌで
示す。
−ＬａｃＺの産生である。ヒト２９３細胞を、ｐＵＣ−ＡＣＧ（カラム１および
２）またはｐＵＣ−ＡＣＧ ｒｅｐ７８*１３（カラム３〜５）のいずれかを用
いてトランスフェクトした。５時間後、細胞を、ＭＯＩが２であるＡｄ５ ｄｌ
３１２（カラム１および３）または推定ＭＯＩが２であるＡｄ５ ｓｕｐ ｔＲ
ＮＡ（カラム２および４）または推定ＭＯＩが１０であるＡｄ５ ｓｕｐ ｔＲ
ＮＡ（カラム５）のいずれかに感染させた。ｓｕｐ ｔＲＮＡ発現をモニターす
るコントロールとして、細胞を、コドン３にアンバー変異を含むＧＦＰ遺伝子を
発現するプラスミドに感染させ、次いで、ＭＯＩが２であるＡｄ５ ｓｕｐ ｔ
ＲＮＡに感染させた（カラム６）。細胞を、３日間のインキュベーションの後に
収集し、そして溶解した。次いで、細胞溶解物を、２９３細胞の形質導入によっ
て、ｒＡＡＶについてアッセイした。結果を、力価として、機能的粒子／ｍｌで
示す。
【図８】 図８は、ｒｅｐ７８*１３，５２*１４を使用するｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＬａｃＺ
の産生である。ヒト２９３細胞を、ｐＵＣ−ＡＣＧ（カラム１および２）、ｐＵ
Ｃ−ＡＣＧ ７８*１３（カラム３および４）またはｐＵＣ−ＡＣＧ ７８*１３
，５２*１４（カラム５および６）のいずれかを用いてトランスフェクトした。
５時間後、細胞を、ＭＯＩが２であるＡｄ５ ｄｌ３１２（カラム１、３および
５）または推定ＭＯＩが２であるＡｄ５ ｓｕｐ ｔＲＮＡ（カラム２、４およ
び６）のいずれかに感染させた。細胞を、３日間のインキュベーションの後に収
集し、そして溶解した。次いで、細胞溶解物を、２９３細胞の形質導入によって
、ｒＡＡＶについてアッセイした。結果を、力価として、機能的粒子／ｍｌで示
す。
の産生である。ヒト２９３細胞を、ｐＵＣ−ＡＣＧ（カラム１および２）、ｐＵ
Ｃ−ＡＣＧ ７８*１３（カラム３および４）またはｐＵＣ−ＡＣＧ ７８*１３
，５２*１４（カラム５および６）のいずれかを用いてトランスフェクトした。
５時間後、細胞を、ＭＯＩが２であるＡｄ５ ｄｌ３１２（カラム１、３および
５）または推定ＭＯＩが２であるＡｄ５ ｓｕｐ ｔＲＮＡ（カラム２、４およ
び６）のいずれかに感染させた。細胞を、３日間のインキュベーションの後に収
集し、そして溶解した。次いで、細胞溶解物を、２９３細胞の形質導入によって
、ｒＡＡＶについてアッセイした。結果を、力価として、機能的粒子／ｍｌで示
す。
【図９】 図９は、ｒｅｐ７８*１３／ｓｕｐ ｔＲＮＡ系およびＡＡＶ／アデノウイル
スハイブリッドを使用するｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＬａｃＺの産生である。２９３細
胞を、ｐＵＣ−ＡＣＧ ７８*１３を用いてトランスフェクトし、次いで、Ａｄ
ｖＴＲ−ＬａｃＺとＡｄ ｄｌ３１２（カラム１および２）、またはＡｄ ｖ
ＴＲ−ＬａｃＺとＡｄ ｓｕｐ ｔＲＮＡ（カラム３および４）のいずれかに同
時感染させた。３日後、細胞溶解物を調製し、そして各溶解物の一部を加熱して
アデノウイルスを不活性化した。非加熱サンプル（カラム１および３）ならびに
加熱サンプル（カラム２および４）の両方を、形質導入によって、ｒＡＡＶにつ
いてアッセイした。結果を、力価として、機能的粒子／ｍｌで示す。
スハイブリッドを使用するｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＬａｃＺの産生である。２９３細
胞を、ｐＵＣ−ＡＣＧ ７８*１３を用いてトランスフェクトし、次いで、Ａｄ
ｖＴＲ−ＬａｃＺとＡｄ ｄｌ３１２（カラム１および２）、またはＡｄ ｖ
ＴＲ−ＬａｃＺとＡｄ ｓｕｐ ｔＲＮＡ（カラム３および４）のいずれかに同
時感染させた。３日後、細胞溶解物を調製し、そして各溶解物の一部を加熱して
アデノウイルスを不活性化した。非加熱サンプル（カラム１および３）ならびに
加熱サンプル（カラム２および４）の両方を、形質導入によって、ｒＡＡＶにつ
いてアッセイした。結果を、力価として、機能的粒子／ｍｌで示す。
【図１０】 図１０は、アデノウイルスの産生のためにＥ４の毒性効果を最小にするための
略図である。Ｅ４の発現を、例えば、セリンコドンを操作し、そしてアンバー変
異を使用して翻訳を破壊することによって、制御し得る。
略図である。Ｅ４の発現を、例えば、セリンコドンを操作し、そしてアンバー変
異を使用して翻訳を破壊することによって、制御し得る。
【図１１】 図１１は、プラスミドｐＲｏｒｆ６*１７の模式図である。ＴＡＧアンバー変
異を強調している。
異を強調している。
【図１２】 図１２は、Ａｄ Ψ１７の模式図である。ＩＴＲは、逆方向末端反復である。
ＣＭＶは、サイトメガロウイルスプロモーターである。ＧＦＰは、グリーン蛍光
タンパク質である。
ＣＭＶは、サイトメガロウイルスプロモーターである。ＧＦＰは、グリーン蛍光
タンパク質である。
【図１３】 図１３は、ｐＵＣ−ｓｕｐの模式図である。セリンコドンにアンバー変異を含
むが、何のアデノウイルス配列も含まない、ベクターである。
むが、何のアデノウイルス配列も含まない、ベクターである。
【図１４】 図１４は、アデノウイルス産生である。Ｅ４を発現する安定な細胞を、ｓｕｐ
ｔＲＮＡベクターおよびアデノウイルスベクターを用いてトランスフェクトし
て、その細胞によるアデノウイルスの発現を決定した。陽性細胞のレベルは、ウ
イルスに感染した細胞の数を表し、そしてこのレベルは、このトランスフェクト
された細胞により生成されるΨ１７ウイルス力価を示す。２９３細胞（カラム１
および２）ならびに２９３ｏｒｆ６*１７細胞（カラム３および４）を、ｐＡｄ
ｌｏｘ ｓｕｐ ｔＲＮＡ（カラム２および４）を用いてトランスフェクトし、
そしてΨ１７に感染させた。
ｔＲＮＡベクターおよびアデノウイルスベクターを用いてトランスフェクトし
て、その細胞によるアデノウイルスの発現を決定した。陽性細胞のレベルは、ウ
イルスに感染した細胞の数を表し、そしてこのレベルは、このトランスフェクト
された細胞により生成されるΨ１７ウイルス力価を示す。２９３細胞（カラム１
および２）ならびに２９３ｏｒｆ６*１７細胞（カラム３および４）を、ｐＡｄ
ｌｏｘ ｓｕｐ ｔＲＮＡ（カラム２および４）を用いてトランスフェクトし、
そしてΨ１７に感染させた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ハーディー， スティーブン エフ． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94404， フォスター シティ， レイクサイド ドライブ 342， セル ジェネシス， インコーポレイテッド内 (72)発明者 スナイダー， リチャード オー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94404， フォスター シティ， レイクサイド ドライブ 342， セル ジェネシス， インコーポレイテッド内 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA32 CA06 CA11 DA03 EA02 FA02 GA11 HA01 HA19 4B065 AA93X AA95X AB01 AC20 BA02 CA23
Claims (19)
- 【請求項１】 細胞において組換え遺伝子産物を発現させるための方法であ
って、ここで該遺伝子産物が、該細胞に対して毒性であるタンパク質であるか、
または該遺伝子産物の発現が、該細胞に対して毒性である補助的なタンパク質を
必要とし、該方法が、以下の工程： （ａ）終止コドンを、該細胞において該遺伝子産物をコードする核酸または該
補助的なタンパク質をコードする核酸に導入して、該遺伝子産物または該補助的
なタンパク質の産生をダウンレギュレートする工程； （ｂ）該細胞においてｔＲＮＡを発現させて、該導入された終止コドンを抑制
する工程であって、ここで該ｔＲＮＡが、該導入された終止コドンについてのア
ンチコドン、および翻訳の間にポリペプチドに取り込むためのアミノ酸を含む、
工程；ならびに、次いで、 （ｃ）該細胞から該遺伝子産物を回収する工程であって、ここで該タンパク質
または該補助的なタンパク質が、該導入された終止コドンの位置に対応する部位
に該アミノ酸を含む、工程、 を包含する、方法。 - 【請求項２】 前記終止コドンがアンバーコドン、オパールコドン、または
オーカーコドンである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記補助的なタンパク質が、ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質であ
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 前記補助的なタンパク質が、ＡＡＶ ｃａｐタンパク質であ
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 前記終止コドンが、前記遺伝子産物をコードする前記核酸ま
たは前記補助的なタンパク質をコードする前記核酸の前半に導入される、請求項
１に記載の方法。 - 【請求項６】 前記導入された終止コドンが、セリンコドンを置換する、請
求項３に記載の方法。 - 【請求項７】 前記ｔＲＮＡが、アデノウイルスベクターを用いて発現され
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項８】 以下を含む、キット： （ａ）核酸を含む細胞であって、該核酸は該細胞に対して毒性であるタンパク
質をコードし、ここで、該核酸が、導入された終止コドンを含む、細胞；および （ｂ）ｔＲＮＡをコードする核酸を含むベクターであって、ここで該ｔＲＮＡ
が、該導入された終止コドンについてのアンチコドン、およびｔＲＮＡのアミノ
アシル部位にアミノ酸を含む、ベクター。 - 【請求項９】 前記核酸が、ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質をコードする、請求
項８に記載のキット。 - 【請求項１０】 前記終止コドンがアンバーコドン、オパールコドン、また
はオーカーコドンである、請求項８に記載のキット。 - 【請求項１１】 前記細胞が、２９３細胞である、請求項８に記載のキット
。 - 【請求項１２】 前記ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項８
に記載のキット。 - 【請求項１３】 前記核酸が、ＡＡＶ ｃａｐタンパク質をコードする、請
求項８に記載のキット。 - 【請求項１４】 前記導入された終止コドンが、セリンコドンを置換する、
請求項９に記載のキット。 - 【請求項１５】 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を産生するための方法であ
って、以下の工程： （ａ）遺伝子産物を発現するか、または該遺伝子産物の発現が補助的なタンパ
ク質を必要とする宿主細胞を、該細胞において該遺伝子産物をコードする核酸ま
たは該補助的なタンパク質をコードする核酸に終止コドンを導入して、該遺伝子
産物または該補助的なタンパク質の産生をダウンレギュレートすることにより、
産生する工程であって、ここで該遺伝子産物、該補助的なタンパク質、またはそ
の両方が、ＡＡＶ産生および該細胞に対する毒性を必要とする、工程； （ｂ）該宿主細胞に、ＡＡＶ粒子の成分を発現するためのＡＡＶパッケージン
グプラスミドを導入する工程； （ｃ）該細胞においてｔＲＮＡを発現させて、該導入された終止コドンを抑制
する工程であって、ここで該ｔＲＮＡが、該導入された終止コドンについてのア
ンチコドン、および翻訳の間にポリペプチドに取り込むためのアミノ酸を含む、
工程；ならびに、 （ｄ）該宿主細胞により産生されるＡＡＶを回収する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項１６】 前記補助的なタンパク質が、ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質で
ある、請求項１５に記載の方法。 - 【請求項１７】 前記補助的なタンパク質が、ＡＡＶ ｃａｐタンパク質で
ある、請求項１５に記載の方法。 - 【請求項１８】 アデノウイルスを産生するための方法であって、以下の工
程： （ａ）遺伝子産物を発現するか、または該遺伝子産物の発現が補助的なタンパ
ク質を必要とする宿主細胞を、該細胞において該遺伝子産物をコードする核酸ま
たは該補助的なタンパク質をコードする核酸に終止コドンを導入して、該遺伝子
産物または該補助的なタンパク質の産生をダウンレギュレートすることにより、
産生する工程であって、ここで該遺伝子産物、該補助的なタンパク質、またはそ
の両方が、アデノウイルス産生および該細胞に対する毒性を必要とする、工程； （ｂ）該宿主細胞に、アデノウイルス粒子の成分を発現するためのアデノウイ
ルスパッケージングプラスミドを導入する工程； （ｃ）該細胞においてｔＲＮＡを発現させて、該導入された終止コドンを抑制
する工程であって、ここで該ｔＲＮＡが、該導入された終止コドンについてのア
ンチコドン、および翻訳の間にポリペプチドに取り込むためのアミノ酸を含む、
工程；ならびに、 （ｄ）該宿主細胞により産生されるアデノウイルスを回収する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項１９】 前記遺伝子産物がＥ４である、請求項１８に記載の方法。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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