JP2002531823A - ミクロ抽出方法およびそのための使い捨て装置 - Google Patents

ミクロ抽出方法およびそのための使い捨て装置

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JP2002531823A JP2000585638A JP2000585638A JP2002531823A JP 2002531823 A JP2002531823 A JP 2002531823A JP 2000585638 A JP2000585638 A JP 2000585638A JP 2000585638 A JP2000585638 A JP 2000585638A JP 2002531823 A JP2002531823 A JP 2002531823A
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ラスムッセン，ナット，イー．
クログ，メッテ
ペダーセン−ブヤガード，スティグ
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ラスムッセン，ナット，イー．
クログ，メッテ
ペダーセン−ブヤガード，スティグ
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Abstract

(57)【要約】 【課題】高濃縮性の液液ミクロ抽出または液液液ミクロ抽出を実施するための方法および装置を提供する。 【解決手段】この装置は、（ａ）分析すべき溶解物質、すなわち検体を含む容積Vsの試料溶液を入れるためのコンテナと、（ｂ）前記第１コンテナ内に配置され、好ましくは使い捨てコンテナである、透過性の膜壁を有し、容積Vaのアクセプタ溶液を入れるための第二コンテナであって、（１）Vs:Va≧５０ および（２）約１μl≦Va≦５０μl が成り立ち、（ｃ）好ましくは、磁性棒である攪拌棒とを備える。この装置は、高濃縮性の液液ミクロ抽出（LLME）および液液液ミクロ抽出（LLLME）に適用できる。後者の場合、試料溶液およびアクセプタ溶液に混和しない液体が、アクセプタ溶液用のコンテナの壁に固定される。ある量の試料溶液から検体に対する固定アクセプタ溶液を吸収するための、所定の孔容積を有するスポンジ状形体である液液ミクロ抽出に使用する使い捨て装置も記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、概して、抽出技術に関する。 本発明は、さらに詳細には、液液ミクロ抽出および液液液ミクロ抽出を実施す
るための、使い捨て部材を有する装置に関する。 本発明は、さらに、アクセプタ溶液内に高濃縮された検体を得るための液液ミ
クロ抽出方法および液液液ミクロ抽出方法に関する。
【０００２】 本発明は、さらに、液液ミクロ抽出において使用する特別な使い捨て装置に関
する。 本発明の液液ミクロ抽出は、有機溶液内に高濃縮された検体が得られるように
、試料水溶液から検体を有機溶液に抽出する抽出技術に関する。
【０００３】
【従来の技術】
前記液液液ミクロ抽出に関していえば、検体は、試料水溶液から水に混和しな
い液体を介してアクセプタ水溶液に抽出される。 ガスクロマトグラフィ（GC）、毛管電気泳動（CE）、毛管電気クロマトグラフ
ィ（CEC）、ミクロ高性能液体クロマトグラフィ（HPLC）などの毛管分離方法に
おいて、注入容積はnlからμlの範囲である。これらの方法がバイオ液のような
複合マトリクス内で検体を分離するのに使用される場合、試料の予処理が必要で
ある。試料予処理の基本対象は、検体の濃度をできるだけ多くの阻害化合物の検
出および除去に適した濃度にすることを含む。大部分のタイプの試料予処理には
、一般的に抽出技術が使用される。試料抽出は、pg/mlからμg/mlの範囲の血液
、リンパ液、血漿、または尿などのバイオ液内に存在する薬物の分析において、
最も退屈で時間のかかる工程である。どのような試料調製技術も、分析器具に直
接注入するために１〜５０μlの溶剤内に検体を取り込むことはできない。理想
的には、検体は、GC器具に注入するために有機溶剤内に取り込まれ、CE器具また
はミクロHPLC器具に注入するために水性溶剤内に取り込まれるべきである。最も
頻繁に使用されている抽出技術は、液液抽出（LLE）および固相抽出（SPE）であ
る。これらの抽出技術の第一の目的は、分析マトリクスから検体を定量的に抽出
することである。これらの抽出技術が使用される場合、検体は、通常、０．２〜
１０mlの抽出溶剤に収集される。
【０００４】 LLEにおける定量抽出は、試料容積に対して大量の抽出溶剤を使用することに
よってのみ達成できる。１mlのバイオ液試料を抽出するためには、０．５〜１０
mlの抽出溶剤が使用される。濃縮を得るためには、抽出液を蒸発させ、検体を少
量の溶剤中で再構成する。 SPE においては、最終的な抽出量は基本量（bed volume）によって決まる。基
本量とは、粒子の内部孔および空隙のすべてを充たすのに必要な溶剤の量のこと
である。４０ミクロン、６０オングストロームの収着剤のための基本量は、収着
剤１００mg当り１２０μlのオーダである。バイオ液試料１mlは、通常、収着剤
１００mg上に抽出される。必要な最小溶離量は、２基本量または０．２４mlの溶
剤である。その結果、１ml試料のSPEにおいて、最大で４倍の濃縮が達成される
。濃縮度をさらに上げるためには、溶離溶剤を蒸発させてより少ない量の溶剤中
で検体を再構成しなければならない。
【０００５】 実際上の制限により、１００μlよりも少量の溶剤中に検体を再構成すること
は困難である。検体が１００μl の溶剤中に再構成された場合、検体濃度は、１
ml試料の検体濃度の１０倍を超えない。より高い濃縮度が、毛管分離方法により
微量の検体を検知するために、たいてい必要である。この事実は、毛管分離方法
のバイオ分析への適用力を大きく低下させる。 ミクロ抽出 この問題の解決法の一つは、ミクロ抽出（ME）技術を適用することである。ミ
クロ抽出において、検体は、多量の試料溶液から少量のアクセプタ相に抽出され
る。アクセプタ相は、固相ミクロ抽出（SPME）の場合のように固体であってもよ
く、また液液ミクロ抽出（LLME）の場合のように有機溶剤であってもよい。定量
化し得る量の検体を収集するために多量の試料が使われ、少量のアクセプタ相に
検体を取り込むことにより、濃縮が容易になる。抽出は、平衡になるまで実施さ
れる。
【０００６】 図１は、従来のLLEと、LLMEとの違いを示している。LLE においては、１μg/m
lの検体を含む１ml試料が１mlの溶剤に抽出されるが、LLMEにおいては、１μg/m
lの検体を含む１mlの試料が１０μlの溶剤に抽出される。水性マトリクスと有機
溶剤との間の検体分配係数は、１００である。図１は、LLEによって０．９９μg
の検体が有機抽出液に抽出され、０．００９９μgが試料内に残ることを示して
いる。抽出液中の検体濃度は、０．９９μg/mlである。LLMEにおいては、０．５
μgの検体が有機アクセプタ相に抽出され、０．５μgが試料内に残る。アクセプ
タ相中の試料濃度は５０μg/mlである。この事実は、LLMEにおいては、溶剤の蒸
発および再構成なしに極めて高い濃縮度が得られることを示している。
【０００７】 SPMEは、充分に確立された、溶剤を使わない試料調製技術である。SPMEにおい
て、アクセプタ相は、ファイバ上にコーティングされた固体ポリマーである。こ
のポリマーアクセプタ相は不揮発性で、検体の分配のための収着剤の機能を果す
。ポリマーアクセプタ相の容積は、１μl以下である。SPMEは、元来、水性試料
中の有機化合物を分析するために開発されたもので、GC分析を行なう前に実施す
る揮発性有機化合物の微量分析に特に有用である。SPMEを血漿や尿などのバイオ
分析試料に適用する場合、いくつかの困難が観察される。バイオマトリクスから
の薬物分析濃縮は、純水試料からの濃縮に比べて大きく低下する。これは、アク
セプタ相の容量が低下したためである。さらに、SPMEをバイオ分析に適用した場
合、ポリマーアクセプタ相は汚染されやすく、試料間の相互汚染が起こりやすい
。これらの事実は、SPMEのバイオ分析への適用性を大きく制限する。この問題の
一解決法は、LLME技術の適用である。 LLMEの基本原理 SPMEの基本理論は充分に実証されており、これはLLMEにも適用できる。アクセ
プタ/試料の分配係数をKas、アクセプタ溶液の量をVa、試料溶液の量をVs、そし
て最初の試料濃度をC0とすると、アクセプタ相に取り込まれた検体の量ｎは、下
記の式１で表わされる。
【０００８】
【数１】 アクセプタ相に取り込まれた検体の濃度Caは、
【０００９】
【数２】 Kas Va ＜＜ Vs であるとき、アクセプタ相に収集された検体の量は、
【００１０】
【数３】 表１は、１μgの検体を含む１ml試料溶液を抽出した後、０．００１ml〜１mlの
アクセプタ相に取り込んだ検体の平衡濃度を示している。分配係数は、１０、１
００、１０００および∞である。
【００１１】
【表１】
【００１２】 表１に示された濃度は、分配係数が高ければ、LLMEにより０．００１〜０．
０５mlのアクセプタ相に得られた濃縮度は、従来の抽出方法により得られる濃縮
度よりも高いことを示している。 しかしながら、少量の有機溶液を用いたバイオ液の抽出には、実際的な問題が
ある。液液抽出過程において、バイオ液にエマルジョンが形成されやすく、少量
の溶液は、容易に乳化される。遠心分離の後でさえ、少量の溶液を収集するのは
困難である。したがって、５０μlよりも少量の溶液でのバイオ液の抽出は、従
来の分析的方法では実施されない。
【００１３】 これらの問題の可能な一解決方法は、使い捨てスポンジを使用すること、また
は図３および図４に示した装置を使用することである。 使い捨て抽出スポンジ 上記の問題点は、使い捨て抽出スポンジによって解決できる。使い捨て抽出ス
ポンジは、１０〜５０μlの抽出溶液を固定するために使用される。抽出スポン
ジを有するLLMEは、GC分析の前に、バイオ液の試料を調製するのに特に適してい
る。抽出スポンジに固定された溶剤は、少量の溶剤によって起こる取り扱いの困
難さを減少させる。これは、固定された溶剤は、乳化されず、抽出後、容易に収
集されるためである。
【００１４】 抽出スポンジの製造に使用される材料は、溶剤に対して耐性を有し、多孔性で
圧縮できる材料であるべきである。さらに、水に混和しない溶剤を固定できるよ
うに、充分な疎水性を有しているべきである。孔の大きさは、数マイクロメート
ルからミリメートルの範囲であってよい。膨張ポリマーとポリマーフォームが特
に適している。溶剤に対して耐性を有するポリマーの例として、テフロン（登録 商標）、テフゼル（Tefzel）、ハラー（Halar）、ポリエチレンおよびポリプロ ピレンが挙げられる。ポリマー材料は、所定の容積の溶剤を固定できるような大 きさに切断される。 使い捨て抽出スポンジを有するLLME 抽出スポンジは、固定すべき溶剤を入れたコンテナ内に充填される。スポンジ
は、孔の中に閉じ込められた空気を除去するために圧縮された後、溶剤に浸され
る。これで、スポンジは抽出に備えることができる。
【００１５】 試料溶液は、抽出バイアルに入れられる。試料溶液の典型的な量は、０．５〜
５mlである。定量分析は、内部標準を試料溶液に加えることにより、常に実施さ
れる。内部標準は、抽出前に試料に加えられ、すべての分析的段階を通じて検体
を追う。内部標準は、操作中のすべてのばらつきを相殺する。検体を有機溶剤に
抽出しやすくするために、抽出前に試料の化学的性質が変えられる。これは、pH
の最適化および塩の添加を含む。
【００１６】 固定した溶剤を含む溶剤スポンジは、コンテナから取り出して抽出バイアルに
加えられる。抽出は攪拌により行なわれる。たとえば、磁性攪拌棒を用いた攪拌
など、あらゆる種類の攪拌が使用できる。抽出は平衡が達成されるまで（１０〜
３０分間）続けられる。その後、溶剤スポンジは、試料バイアルから取り出され
る。濃縮された検体とともに固定された溶剤は、圧縮により分離される。圧縮は
、圧搾に適した装置内で容易に実施することができる。たとえば、スポンジを使
い捨ての医療用針付き注射器内で圧縮することが可能であり、分離した溶剤は、
GC用オートインジェクタに嵌入できるように形成されたミクロ試料バイアルに入
れられる。
【００１７】 ２５μlの溶剤を固定できるスポンジは、多くの用途に適している。表１に示
されているように、３０の濃縮度は、分配係数１００を有する検体の場合に得ら
れる。２５μlの溶剤量は、容易に取り扱うのに充分な量である。この溶剤量は
、抽出における過荷重と濃度低下とを防ぐのに十分な量である。各試料に一個の
スポンジを使用し、使用済みのスポンジは、破棄する時まで容器内に安全に保管
することができる。従来の試料調製方法に比べて、溶剤スポンジを有するLLMEは
、溶剤の消費量と作業者および環境に与える害を大きく減らす。
【００１８】 本発明の目的は、上記の問題点を、上記および以下に液液液ミクロ抽出（LLLM
E）と称する、いわゆるミクロ逆抽出を利用することにより解決し、充分高濃度
の分析されるべき物質をアクセプタ溶液内に得ることである。 LLLMEの原理をさらに詳細に以下に説明する。 液液液ミクロ抽出（LLLME） 毛管ゾーン電気泳動、ミセル動電クロマトグラフィ、および電気クロマトグラ
フィのような毛管電気泳動に使用する分離技術は、低イオン強度の水性試料の注
入を好む。nlの量の試料を注入するので、バイオ液に微量に存在する薬物をバイ
オ分析するには、高濃縮が必要である。
【００１９】 たいていの薬物は、イオン性である。イオン状態の有機物は、LLLMEにより濃
縮できる。イオン性の有機分子を単離するLLLMEの原理が、図２に示されている
。検体の浄化および濃縮は、検体を多量の水性試料マトリクスから膜を介して少
量の水性アクセプタ相内に分配することによって行なわれる。膜は、二つの水性
相間の浄化バリアとして機能する。塩基性化合物と酸性化合物の両方がLLLMEに
よって濃縮できる。マトリクスのpHは、検体が荷電しないように調整される。こ
れによって、検体は、膜を通って他方の水性アクセプタ溶液内に達することがで
きる。アクセプタ溶液のpHは、検体がイオン化されるpHに調整されるため、検体
が膜に再び入ることを防ぐ。荷電していない小さい分子だけが膜を通過でき、膜
およびアクセプタ溶液に溶解できる分子だけが濃縮され得る。水溶性の中性物質
は、マトリクス内に残る。中性の疎水性物質は、膜内に入るが、アクセプタ相内
には入らない。検体とは逆の電荷を有する物質は、マトリクス内に残る。したが
って、LLLMEは、強力な浄化技術である。
【００２０】 抽出の駆動力は、膜と試料溶液との間の検体分配係数およびアクセプタ相と膜
との間の検体分配係数との積に依存し、これは、アクセプタ相と試料マトリクス
との間の検体分配係数と等しい。二つの水性相間の分配係数が大きい化合物は、
濃縮される。多くの薬物に関して、この分配係数は大きい。したがって、LLLME
は、多くのイオン性の薬物に対して有力な濃縮技術および浄化技術となることが
可能である。
【００２１】 アクセプタ／膜分配係数をKal、膜／試料分配係数をKls、アクセプタ／サンプ
ル分配をKas、アクセプタ容積をVa、膜容積をVl、試料容積をVs、試料の最初の
濃度をCoとすると、LLMBEによって抽出される検体の量nは、下記の式４で表わさ
れる。
【００２２】
【数４】 LLLMEにおいて、膜の容積は、できるだけ小さくすべきである。したがって、K ls Vl は無視できる量であり、式４は下記の式５になる。
【００２３】
【数５】 式５は、１μg/mlの検体を含む１mlの試料溶液から、アクセプタ相量と分配係
数との関数として、検体濃度を算出するのに用いることができる。得られた結果
は、１mlの試料から０．００１〜０．０５mlのアクセプタ溶液への濃縮が従来の
抽出方法により得られる濃縮よりも大きいことを示した表１の結果に等しい。
【００２４】 多くのイオン性の薬物は、二つの水性相、すなわち薬物が荷電しているpHを有す
る水性相および薬物が荷電していないpHを有する水性相の間に１００よりも大き
い分配係数を有している。分配係数１００の検体が、濃度１μ/mlの１ml試料から
１０μlのアクセプタ溶液に取り込まれると、アクセプタ相の検体濃度は、５０μ
g/mlである。この事実は、LLLMEが他の抽出方法では得られない濃縮を提供するこ
とを示している。したがって、LLLMEは、CEのような最新の毛管分離方法にとっ
て特に有用な抽出技術である。
【００２５】 分析時間を短くするために、膜の化学的性質が特に重要である。抽出は、三相
間の平衡が確立するまで持続されるべきである。膜／試料分配係数が小さければ
、膜にきわめてわずかしか溶解できない検体にとって平衡に達するまでの時間は
長く、無限大に近い。したがって、膜を形成する溶剤は、目的とする検体にとって
良好な溶剤でなければならない。膜の化学的性質は、選択性の調整にも重要であ
る。
【００２６】
【発明の要旨】
本発明は、公知技術を改良して上記に示唆した可能性を利用することを目的と
する。したがって、本発明は、第一に、高濃縮性の液液ミクロ抽出または液液液
ミクロ抽出を実施する装置に関し、この装置は、 （ａ）分析されるべき溶解物質、すなわち検体を含む容積Vsの試料溶液用コンテ
ナ、 （ｂ）前記第１コンテナ内に配置され、好ましくは使い捨てコンテナであり、透
過性の膜壁を有する容積Vaのアクセプタ溶液用の第２コンテナであって、 （１）Vs:Va≧５０ および （２）約１μl≦Va≦５０μl が成り立ち、 （ｃ）好ましくは磁性棒である攪拌手段 を含むことを特徴とする。
【００２７】 一実施例において、上記アクセプタ溶液用コンテナは、微小孔性の中空ファイ
バであり、活性ポリマー製であってよい。 前述のように、本発明はまた、抽出方法に関する。したがって、第１抽出様相
において、上述の装置を用いる高濃縮性の液液ミクロ抽出方法に関し、この抽出
方法は、 （ａ）所定量のアクセプタ溶液が膜壁にしみ込み、コンテナを満たすように、ア
クセプタ溶液用コンテナは、アクセプタ溶液中に沈められ、 （ｂ）前記（ａ）のようにアクセプタ溶液で満たしたコンテナは、目的とする検
体を含有する所定量の試料溶液を入れたコンテナに移され、 （ｃ）検体を含む試料溶液は、二つの溶液内の検体に抽出平衡が確立されるまで
攪拌され、 （ｄ）検体を分析するために、濃縮された検体を含むアクセプタ溶液を、そのコ
ンテナから取り出す、 ことを特徴とする。
【００２８】 第二抽出様相において、本発明は、請求項１に記載の装置を使用する高濃縮液液
液ミクロ抽出方法に関し、この方法は、 （ａ）アクセプタ溶液用コンテナの壁は、試料溶液およびアクセプタ溶液と混和 しない液体を固定するために、この液体に浸され、 （ｂ）アクセプタ溶液用コンテナに所定量の前記液体が満たされて、 （ｃ）このアクセプタ溶液用コンテナが、目的とする検体を含む所定量の試料溶 液を有するコンテナ内に沈められ、 （ｄ）この検体を含む試料溶液を、 （i）試料溶液および固定された液体ならびに （ii）固定された液体およびアクセプタ溶液 の抽出平衡が確立するまで攪拌し、 （ｅ）検体を分析するために、濃縮された検体を含むアクセプタ溶液をコンテナ
から取り出す、 ことを特徴とする。
【００２９】 後者の抽出方法は、酸性検体または塩基性検体の濃縮に特に適している。たと
えば、酸性化された水性液であるアクセプタ液とこの水性液に混和せず膜に固定
された有機液とを使用することにより、塩基性で水性のバイオ試料から塩基性検
体が濃縮できる。 ここで前記のように、微孔性の中空ファイバを使用すると有利であるが、活性ポ
リマーを使用することも可能である。
【００３０】 最後の様相において、前記のように、本発明は液液ミクロ抽出に使用する使い
捨て装置に関する。この使い捨て装置は、ある量の試料溶液から検体を取り出す
ための固定アクセプタ溶液を吸収のための、所定の孔容積を有するスポンジ状で
あることを特徴とする装置である。
【００３１】
【発明の実施の形態】
次に、添付図面を参照して本発明をさらに詳細に説明する。 LLLME用の使い捨て装置 LLLME用の装置は、多量の試料から微量の膜を介して少量の水性アクセプタ溶液
への抽出を達成すべきである。膜は、表面積の大きい薄膜であるべきである。膜
は、 固体（液固液ミクロ抽出、LSLME）または液体（液液液ミクロ抽出、LLLME
）であってもよい。
【００３２】 LLLMEにおいて、液膜を形成している溶剤は、固定されるべきである。水に混
和しない溶剤を固定できる物質ならば、いかなる物質も使用できる。疎水性の中
空ファイバは特に有用である。ファイバは、テフロン、ポリプロピレンまたはポ
リエチレンのようなポリマー材料から形成することができる。中空ファイバの内
径は０．０５〜１mmの範囲であり、壁厚は典型的には０．０１〜０．３mmの範囲
であり、孔の平均寸法は０．０１〜１０μmの範囲である。５〜５０μlの固定量
のアクセプタ溶液を中空ファイバに充填するために、ファイバの長さは、典型的
には２〜１０cmである。
【００３３】 LSLMEにおいて、膜は、荷電していない化合物を収着できる物質から成るポリ
マー膜であってよい。このような物質の例として、ポリジメチルシロクサン（PD
MS）、ポリアクリレートまたはポリスチレンジビニルベンゼンが挙げられる。こ
れらの物質はまた、SPMEにおける公知の収着剤としても使用される。膜厚は、好
ましくは０．５〜５０μmである。膜は、剛性の枠に支持されてもよく、また上
述の中空ファイバと同じ寸法のチューブ状に形成されてもよい。
【００３４】 LLLME用の装置は、使い捨てであるべきである。ある試料の不純物が膜に取り
込まれて、これらの不純物が他の試料を汚染する可能性がある。したがって、各
試料ごとに１つの試料予処理装置が使用されるべきである。使い捨て装置は、ま
た、市販の試料調製バイアルに連結されるべきである。 LLLME用の使い捨て装置は、図３aと図４aとに示されている。図３bおよび図４
bは、試料溶液を満たした試料バイアルに連結された装置を示している。ガイド
ロッドは、ステンレス鋼ロッドまたはポリマー材料からなるロッドでよい。ガイ
ドロッドの先端は、中空ファイバに注射器からアクセプタ溶液を充填できるよう
に、ニードルガイドに連結することができる。図３bの中空ファイバは、両端が
ガイドロッドに連結されている。 使い捨てLLLME装置による試料調製 LSLMEにおいて、膜はそのままで使用できる。LLLMEにおいては、中空ファイバ
を有機溶剤に５〜３０秒間浸してファイバの孔に溶剤をしみ込ませることにより
、液膜を形成する。次に、アクセプタ溶液を注射器でファイバに充填する。これ
は、１０μlのアクセプタ溶液は、検体を高濃縮し、１０μlの量は市販の注射器
によって扱えるため、通常、内部チューブ容積が１０μlであるファイバが好ま
しい。アクセプタ溶液は、目的とする検体が荷電されるpHを有する。LLLME装置
を試料バイアルに連結することにより抽出が行なわれる。試料バイアルに満たさ
れた試料は、検体が中性になるpHに緩衝される。典型的な試料量は、０．５〜５
mlのバイオ液である。抽出工程中のばらつきを補うため、抽出前常に、内部標準
が試料液に加えられる。たとえば、試料バイアル内に設置された磁性攪拌棒で攪
拌することにより、抽出が行なわれる。三相間に平衡が確立するまで、抽出を続
ける。平衡に達したとき（１５〜６０分後）、アクセプタ溶液を注射器で収集し
、分析器具に自動的に注入するために自動試料採取バイアルに入れる。
【００３５】 次に例を参照して本発明をさらに詳細に説明する。 図４aに示した装置は、液液ミクロ抽出および液液液ミクロ抽出の潜在性を示
すために使用された。使用された中空ファイバは、孔の寸法が０．２μmのポリ
プロピレンファイバ（Accurel PP Q３／２）であり、Akuzo Nobel（Wuppertal,
ドイツ）から購入した。内径は、６００μm、壁厚は２００μm、長さは５．５cm
であった。
【００３６】
【実施例】
実施例１ 液液ミクロ抽出(LLME) LLMEは、１．０ＭのpH５．５アセテート緩衝液、尿および人の血漿において調
製したジアゼパム（diazepam）（D）とプラゼパム（plazepam）（P）の５nmol/m
l試料溶液の抽出により実証される。ガスクロマトグラフに直接注入するための
参照溶液としてオクタノール中の標準溶液（５nmol/ml）を調製した。抽出前に
、尿中の標準溶液のpHを５．５に調整した。ベンゾジアゼピンのタンパク質結合
を減らすため、抽出前に、血漿の分別部分（aliquote）（１０８０μl）が１２
０μlのメタノールに加えられ、この混合物を１分間攪拌した。１．２mlの試料
溶液を２mlの自動試料採取バイアル（Chromacol, Trumball, CT., 米国） に
入れて、LLMEを完了した。中空ファイバに１０μlの１−オクタノールを充填し
た。１分後、溶液を完全に孔に浸入させるために中空ファイバを自動試料採取バ
イアルに浸した。抽出の間、試料溶液を磁性攪拌棒で攪拌した。３０分後、GC注
射器を使用して中空ファイバから１μlのオクタノールを取り出し、ガスクロマ
トグラフに注入した。ポリー−（ジメチルシロキサン）カラム（内径３０×０．
２５mm、膜厚０．２５mm）上でガスクロマトグラフ分離を実施し、窒素−リン検
出器（NPD）を用いて化合物を検出した。搬送ガスとしてヘリウム（１ml/min）
を使用した。温度プログラムによりクロマトグラフ分離を実施した。温度は、１
分間１８０℃に保った後、２０℃/分で３００℃に上昇させた。図５は、オクタ
ノール中の参照溶液（５nmol/ml）のクロマトグラムと、LLMEにより濃縮した後
のアセテート緩衝液、尿および血漿におけるジアゼパムおよびプラゼパムの試料
溶液（５nmol/ml）のクロマトグラムを示している。これらのクロマトグラムは
、アセテート緩衝液、尿および血漿試料からのジアゼパムとプラゼパムのそれぞ
れ１００倍と７０倍の予濃縮を示している。 実施例２ 液液液ミクロ抽出(LLLME) １−オクタノールを固定液として使用して、LLLMEを実施した。中空ファイバを
５秒間、１−オクタノールに浸した。これは、ファイバの孔に浸透して満たすの
に充分な１−オクタノールである。アクセプタ溶液として０．１MのHClを１０μ
l使用し、これを注射器で浸潤ファイバに充填した。０．１MのHClに４μg/mlの
ジフェンハイドラミン（diphenhydramine）を加えた標準溶液を、CE器具への直
接注入のために、参照溶液として調製した。さらに、ジフェンハイドラミン（４
μm/ml）の試料溶液を０．１MのNaOH、尿および血漿中で調製した。抽出前、尿
および血漿の試料溶液中のpHをNaOHで pH１２〜１３に調整した。１．５mlの試
料溶液を２mlの自動試料採取バイアルに入れた。磁性攪拌棒で３０分間攪拌する
ことによりLLLMEを完了した。抽出後、アクセプタ溶液を取り出して、CEにより
分析した。有効長１０cm(全長５２cm)×内径５０μmの溶融シリカ毛管内で分離
を行なった。酢酸でpH４．５に調整した２０mMの酢酸ナトリウム緩衝液を、分離
緩衝液として使用した。０．５psiの圧力で５秒間、流体力注入を行ない、試料
を注入した。分離は２５kVで行ない、検出は２１５nmで実施した。図６に電気泳
動図が示されている。この電気泳動図は、ジフェンハイドラミン(DH)が、０．１
MのNaOH中と尿中とで調製した試料溶液から９０倍予濃縮されたことを示してい
る。血漿からは、５０倍の予濃縮が行なわれた。血漿からの濃縮度が低いのは、
検体のタンパク質結合によるものである。尿と血漿との両方のバイオ試料に関し
、検体濃縮に加えて良好な試料浄化が観察された。試料の高複雑性にもかかわら
ず、毛管ゾーン電気泳動によって得られた電気泳動図には、マトリクス成分はほ
とんど観察されなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】 液液ミクロ抽出と液液液ミクロ抽出との比較を示す。
【図２】 液液液ミクロ抽出の原理を示す。
【図３】 LLLMEまたはLLMEに使用するための可能な装置を示す。
【図４】 LLLMEまたはLLMEに使用する、別の可能な装置を示す。
【図５】 実施例１に関連して得られるクロマトグラムを示す。
【図６】 実施例２に関連して得られる電気泳動図を示す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年３月５日（２００１．３．５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項３
【補正方法】変更
【補正内容】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｂ０１Ｄ 63/02 Ｂ０１Ｄ 63/02 Ｇ０１Ｎ 30/00 Ｇ０１Ｎ 30/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 クログ，メッテ ノルウェー，オスロ Ｎ−0467，マリダル スヴェイエン 235Ｂ番地 (72)発明者 ペダーセン−ブヤガード，スティグ ノルウェー，オスロ Ｎ−0491，ソリドグ レンダ 82番地 Ｆターム(参考） 2G052 AA30 AA32 AD06 AD26 DA15 EA01 EA02 EA11 GA22 GA27 JA09 4D006 GA12 GA23 HA01 JA32Z MA01 MA18 MC22 MC23 MC30 MC37 MC65 PA02 PC38 4D056 AB11 AC22 BA20 CA06 CA10 CA31 CA36 CA40

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）分析すべき溶解物質、すなわち検体を含む容積Vsの試料溶液を入れるた
    めのコンテナと、 （ｂ）前記第１コンテナ内に配置され、好ましくは使い捨てコンテナである、
    透過性の膜壁を有し容積Vaのアクセプタ溶液を入れるための第２コンテナであっ
    て、 （１）Vs:Va≧５０ および （２）約１μl≦Va≦５０μl が成り立ち、 (ｃ）好ましくは、磁性棒である攪拌棒 とを含むことを特徴とする、高濃縮性の液液ミクロ抽出または液液液ミクロ抽出
    を実施するための装置。
  2. 【請求項２】 前記アクセプタ溶液を入れるための前記コンテナが微孔性の中空ファイバであ
    ることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
  3. 【請求項３】 前記コンテナが活性ポリマーの中空ファイバであることを特徴とする、請求項
    １および２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 （ａ）アクセプタ溶液を入れるための前記コンテナは、前記膜壁に所定量のア
    クセプタ溶液をしみ込ませ、前記コンテナが前記所定量の前記アクセプタ溶液で
    満たされるように、前記コンテナはアクセプタ溶液内に沈められ、 （ｂ）前記（ａ）のように満たされた前記コンテナは、目的とする検体を含有
    する所定量の試料溶液を入れた前記コンテナに移され、 （ｃ）検体を含む前記試料溶液は、前記二つの溶液内の前記検体に関して抽出
    平衡が確立されるまで攪拌され、 （ｄ）濃縮された検体を含む前記アクセプタ溶液が、検体の分析のために、そ
    のコンテナから取り出される ことを特徴とする、請求項１に記載の装置を使用した高濃縮性の液液ミクロ抽出
    のための方法。
  5. 【請求項５】 （ａ）前記アクセプタ溶液用の前記コンテナの前記壁は、前記試料溶液および
    前記アクセプタ溶液と混和しない液体を固定するために、この液体をしみ込ませ
    、 （ｂ）アクセプタ溶液用前記コンテナに所定量の前記液体が満たされ、 （ｃ）このアクセプタ溶液用前記コンテナが、目的とする前記検体を含む所定
    量の前記試料溶液を有する前記コンテナ内に沈められ、 （ｄ）検体を含む前記試料溶液を、 （i）前記試料溶液および前記固定された液体ならびに （ii）前記固定された液体および前記アクセプタ溶液 の抽出平衡が確立するまで攪拌し、 （ｅ）前記検体を分析するために、濃縮された検体を含む前記アクセプタ溶液
    をそのコンテナから取り出す ことを特徴とする、請求項１に記載の装置を使用した高濃縮性の液液液ミクロ抽
    出のための方法。
  6. 【請求項６】 微孔性中空ファイバがアクセプタ溶液用前記コンテナとして使用されることを
    特徴とする請求項４および５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 活性ポリマーからなる微孔性中空ファイバが前記アクセプタ溶液用前記コンテ
    ナとして使用されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記試料溶液および前記アクセプタ溶液の両方が水性液であることを特徴とす
    る請求項５ないし７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記膜に固定された前記液が、水性液に混和しない有機液であることを特徴と
    する請求項５、６および８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記試料溶液が塩基性の水性バイオ試料で、前記アクセプタ溶液が塩基性の検
    体を抽出するための酸性化された水性液であることを特徴とする請求項５ないし
    ９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 ある量の試料溶液から、検体に対する固定アクセプタ溶液を吸収するための、所
    定の孔容積を有するスポンジ状形体であることを特徴とする液液ミクロ抽出に使
    用する使い捨て装置。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007248442A (ja) * 2006-02-20 2007-09-27 Shimadzu Corp 微量溶媒抽出法及び溶媒抽出装置
JP2021094550A (ja) * 2019-12-12 2021-06-24 中国計量大学 抽出システム

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7285199B2 (en) 2000-10-31 2007-10-23 Hitachi Chemical Research Center, Inc. Apparatus and method for electrophoretic microspot concentration
EP1388005B1 (en) * 2001-04-26 2006-11-15 Varian, Inc. Hollow fiber membrane sample preparation devices
CA2445307A1 (en) * 2001-04-26 2002-11-07 Johan Berhin A separation unit, a method for separation, and a device for mounting a separation unit in a separation apparatus
US7445939B2 (en) 2004-02-27 2008-11-04 Varian, Inc. Stable liquid membranes for liquid phase microextraction
NO20053226D0 (no) * 2005-06-30 2005-06-30 Uni I Oslo Fremgangsmate for elektrokinetisk migrasjon.
EP2461150B1 (en) 2010-12-06 2019-11-06 Greibrokk & Trones Septech AS Device and process for electro membrane extraction (EME)
CN102974127B (zh) * 2012-11-23 2017-12-08 中国计量学院 一种中空纤维膜微萃取器及其应用
CN103877746B (zh) * 2012-12-21 2016-06-15 中国科学院大连化学物理研究所 一种调节电驱动液-液-液萃取极性阴离子选择性的方法
CN104034572A (zh) * 2014-06-24 2014-09-10 广西中烟工业有限责任公司 一种类胡萝卜素的中空纤维膜液相微萃取的方法
US10272389B2 (en) 2017-04-04 2019-04-30 Extraction Technologies Norway AS Devices for electromembrane extraction (EME)

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5732701A (en) * 1980-08-07 1982-02-22 Agency Of Ind Science & Technol Solute permeating device
JPS61204004A (ja) * 1985-03-06 1986-09-10 Hitachi Zosen Corp 溶媒抽出方法
JPS6331505A (ja) * 1985-06-10 1988-02-10 ザ　スタンダ−ド　オイル　カンパニ− ポリマ−状親和性吸着剤とサイズ選択性膜とを用いる選択的透析方法
JPH05506715A (ja) * 1990-04-02 1993-09-30 ポーリスジーン、ジャヌスズ・ビー 固相微量抽出及び脱着の方法及び装置
US5277821A (en) * 1989-09-25 1994-01-11 Symbiotech Incorporated Purification of samples by interphase mass transfer using microporous hollow-fiber membranes
JPH0894597A (ja) * 1994-09-15 1996-04-12 Hewlett Packard Co <Hp> 固相抽出法及び固相抽出装置
WO1997025606A1 (en) * 1996-01-11 1997-07-17 Rasmussen Knut E Method for liquid-liquid microextraction
JPH09299707A (ja) * 1996-05-17 1997-11-25 Shimadzu Corp 化学物質の濃縮抽出除去装置
WO1998006496A1 (en) * 1996-08-12 1998-02-19 Hampshire Advisory And Technical Services Limited Diagnostic test container
JPH10229871A (ja) * 1997-02-21 1998-09-02 Eiken Kizai Kk 環境微生物検査用拭き取り器具

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5732701A (en) * 1980-08-07 1982-02-22 Agency Of Ind Science & Technol Solute permeating device
JPS61204004A (ja) * 1985-03-06 1986-09-10 Hitachi Zosen Corp 溶媒抽出方法
JPS6331505A (ja) * 1985-06-10 1988-02-10 ザ　スタンダ−ド　オイル　カンパニ− ポリマ−状親和性吸着剤とサイズ選択性膜とを用いる選択的透析方法
US5277821A (en) * 1989-09-25 1994-01-11 Symbiotech Incorporated Purification of samples by interphase mass transfer using microporous hollow-fiber membranes
JPH05506715A (ja) * 1990-04-02 1993-09-30 ポーリスジーン、ジャヌスズ・ビー 固相微量抽出及び脱着の方法及び装置
JPH0894597A (ja) * 1994-09-15 1996-04-12 Hewlett Packard Co <Hp> 固相抽出法及び固相抽出装置
WO1997025606A1 (en) * 1996-01-11 1997-07-17 Rasmussen Knut E Method for liquid-liquid microextraction
JPH09299707A (ja) * 1996-05-17 1997-11-25 Shimadzu Corp 化学物質の濃縮抽出除去装置
WO1998006496A1 (en) * 1996-08-12 1998-02-19 Hampshire Advisory And Technical Services Limited Diagnostic test container
JPH10229871A (ja) * 1997-02-21 1998-09-02 Eiken Kizai Kk 環境微生物検査用拭き取り器具

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007248442A (ja) * 2006-02-20 2007-09-27 Shimadzu Corp 微量溶媒抽出法及び溶媒抽出装置
JP2021094550A (ja) * 2019-12-12 2021-06-24 中国計量大学 抽出システム

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