NO311464B1

NO311464B1 - Fremgangsmåte og engangsinnretning for mikro-ekstrahering

Info

Publication number: NO311464B1
Application number: NO19985613A
Authority: NO
Inventors: Knut E Rasmussen; Mette Krogh; Stig Pedersen-Bjergaard
Original assignee: Pedersen Bjergaard Stig
Priority date: 1998-12-01
Filing date: 1998-12-01
Publication date: 2001-11-26
Also published as: NO985613L; CA2353130A1; NO985613D0; AU1698600A; WO2000033050A1; EP1137924A1; AU766012B2; JP2002531823A; CA2353130C

Description

Foreliggende oppfinnelse angår generelt ekstraksjonsteknologi.

Nærmere bestemt angår oppfinnelsen i et første aspekt en apparatur med engangs-elementer for gjennomføring av væske-væske-mikro-ekstraksjon og væske-væske-væske-mikro-ekstraksj on.

Oppfinnelsen angår videre fremgangsmåter for væske-væske-mikro-ekstraksjon og væske-væske-væske-mikro-ekstraksjon ved hvilke det oppnås en høy oppkonsentrering av analytt i akseptor-oppløsningen.

Til slutt angår oppfinnelsen en spesiell engangsinnretning til bruk ved væske-væske-mikro-ekstraksjon.

Når det gjelder væske-væske-mikro-ekstraksjon gjelder dette særlig ekstraksjon av en analytt fra en vandig prøveoppløsning til et organisk oppløsningsmiddel hvor analytten oppkonsentreres i det organiske oppløsningsmiddel.

Når det gjelder den ovenfor nevnte væske-væske-væske-mikro-ekstraksjon blir en analytt ekstrahert fra en vandig prøveoppløsning gjennom en med vann ikke-blandbar væske til en vandig akseptor-oppløsning.

Av kjent teknikk på dette området skal det henvises til NO 302.056-B1 som beskriver en fremgangsmåte ved ekstrahering og analyse av høytkokende og/eller stormolekylære stoffer i komplekse materialer, særlig biologisk materiale, og som generelt omfatter å tilveiebringe en eventuelt modifisert bæreroverflate på en egnet bærer, å immobilisere et oppløsningsmiddel på overflaten av bæreren for så å bringe bæreren i kontakt med materialet inneholdende det stoff som skal analyseres, å oppkonsentrere og å fiksere stoffet som skal analyseres i oppløsningsmidlet som er fiksert på bæreren og så å bringe bæreren med det oppkonsentrerte stoff som skal analyseres inn i en analyseapparatur for desorbsjon og analyse.

Introduksjon

I kapillar-separeringsmetoder som gasskromatografi (GC), kapillærelektroforese (CE), kapillærelektrokromatografi (CEC) og mikro-høyytelsesvæske-kromatografi (HPLC), ligger injeksjonsvolumene i ni- til ul-området. Prøveforbehandling er nødvendig når disse metoder benyttes for å bestemme analytter i komplekse matrikser som biologiske fluider. Hovedformålene ved prøve-forbehandlingen involverer konsentrasjon av analyttene til en konsentrasjon som er egnet for detektering og fjerning av så mange interfererende forbindelser som mulig. Bruken av en ekstraksjonsteknikk er vanlig ved forbehandling av de fleste typer prøver. Prøve-ekstrahering er det mest kompliserte og tidkrevende trinn i analysen av medikamenter som er tilstede i pg/ml- til ug/ml-området i biologiske fluider som blod, serum, plasma eller urin.

Ingen prøveprepareringsteknikk er i stand til å fange analytter i 1 til 50 ul oppløsnings-middel for direkte injeksjon til det analyttiske instrument. Ideelt bør analyttene oppfanges i et organisk oppløsningsmiddel for injeksjon i et GC-instrument og i et vandig oppløsningsmiddel for injeksjon i et CE-instrument eller et mikro-HPLC-instrument. De oftest benyttede ekstraksjonsteknikker er væske-væske-ekstraksj on (LLE) og fastfase-ekstraksjon (SPE). Det primære formål ved disse ekstraksjonsteknikker er å ekstrahere analyttene kvantitativt fra den analyttiske matriks. Når disse teknikker benyttes blir analyttene vanligvis samlet i 0,2 til 10 ml ekstraksjonsoppløsningsmiddel. Kvantitativ ekstrahering ved LLE kan kun oppnås ved bruk av store volumer ekstraheirngsopp-løsningsmiddel i forhold til prøvevolumet. For ekstrahering av en 1 ml prøve av et biologisk fluid benyttes 0,5 til 10 ml ekstraheringsoppløsningsmiddel. For å oppnå anrikning blir ekstrakten fordampet og analytten rekonstituert i en mindre mengde oppløsningsmiddel.

Ved SPE styres det endelige ekstraheirngsvolum av sjiktvolumet. Sjiktvolumet er den mengde oppløsningsmiddel som er nødvendig for å fylle alle de indre porer og inter-stitiale rom i partiklene. For et 40 mikron, 60 Angstrøm sorbent, er sjiktvolumene i størrelsesorden 120 ul/100 mg sorbent. En 1 ml prøve av et biologisk fluid ekstraheres vanligvis på 100 mg sorbent. Det minimale elueringsvolum som kreves er 2 sjikt-volumer eller 0,24 ml oppløsningsmiddel. Konsekvensen er at et maksimum på 4 gangers anrikning kan oppnås ved SPE for en 1 ml prøve. For å oppnå høyere anrikninger må elueringsoppløsningsmidlet fordampes og analytten rekonstitueres i et mindre volum av oppløsningsmidlet.

På grunn av praktiske begrensninger er det vanskelig å rekonstituere en prøve i oppløsningsmiddelvolumer mindre enn 100 ul. Når analytten rekonstitueres i 100 ul oppløsningsmiddel vil analyttkonsentrasjonen ikke overskride 10 ganger analytt-konsentrasjonen i en 1 ml prøve. Høyere anrikninger er ofte nødvendige for å detektere spormengder av analytter ved kapillar-separasjonsmetoder. Dette faktum reduserer vesentlig anvendeligheten for kapillar-separasjonsmetodene ved bioanalyse.

Mikroekstraksi on

En løsning på dette problem er å anvende en mikro-ekstraksjons (ME)-teknikk der analyttene ekstraheres fra et stort volum prøveoppløsning til et lite volum av en akseptorfase. Akseptorfasen kan enten være et faststoff som ved fastfase-mikro-ekstraksjon (SPME), eller et organisk oppløsningsmiddel som ved væske-væske-mikro-ekstraksjon (LLME). Et stort prøvevolum benyttes for å samle kvantifiserbare mengder av analyttene og anrikningen lettes ved å fange analyttene i det lille volum av akseptor-fase. Ekstraheringen gjennomføres til ekvilibrium.

Figur 1 illustrerer forskjellen mellom tradisjonell LLE og LLME. En 1 ml prøve inneholdende 1 ug/ml analytt ekstraheres til 1 ml oppløsningsmiddel i LLE og til 10 ul oppløsningsmiddel i LLME. Analyttfordelingskoeffisienten mellom den vandige matriks og det organiske oppløsningsmiddel er 100. Figur 1 viser at 0,99 ug av analytten ekstraheres til den organiske ekstrakt ved LLE og at 0,0099 ug forblir i prøven. Analytt-konsentrasjonen i ekstrakten er 0,99 ug/ml. Ved LLME blir 0,5 ug analytt ekstrahert til den organiske akseptor-fase mens 0,5 ug forblir i prøven. Prøve-konsentrasjonen i akseptorfasen er 50 ug/ml. Dette faktum viser at meget høye anrikninger kan oppnås ved LLME uten oppløsningsmiddelfordamping og rekonstituering.

SPME er en godt etablert, oppløsningsmiddelfri prøve-prepareringsteknikk. Ved SPME er akseptorfasen en fast polymer som er belagt på en fiber. Den polymere akseptorfase er ikke-flyktig og virker som sorbent for fordeling av analyttene. Volumet av den polymere akseptorfase er mindre 1 ul. SPME ble opprinnelig utviklet for analyse av organiske forbindelser i vannprøver og metoden er spesielt brukbar for sporanalyse av flyktige, organiske forbindelser før GC-analyse. Når SPME anvendes ved bioanalytiske prøver som plasma eller urin, observeres diverse vanskeligheter. Ved medikament-analyse blir anrikning fra en biologisk matriks sterkt redusert sammenlignet med anrikning fra en ren vannprøve. Dette skyldes akseptorfasens reduserte kapasitet. I tillegg kontamineres den polymere akseptorfase lett når SPME anvendes ved bioanalyse og krysskontaminering kan lett skje mellom prøver. Disse fakta begrenser sterkt anvendeligheten for SPME ved bioanalyse. En løsning på dette problem er å anvende en LLME-teknikk.

Hovedprinsippene ved LLME

Basis-teorien for SPME er godt dokumentert og kan anvendes også for LLME. Hvis vi definerer akseptonprøvefordelingskoeffisienten som K,,, volumet i akseptor-opp-løsningen som Va, volumet for prøve-oppløsningen som Vs og utgangskonsentrasjonen for prøven som C0, er den mengde analytt som oppfanges i akseptorfasen, n, vist i ligning 1:

Konsentrasjonen av analytt som er fanget i akseptorfasen, Ca, er:

Når Kgs Va« Vs, er mengden analytt som er samlet i akseptorfasen :

Tabell 1 viser likevektskonsentrasjonen for analytten fanget i 0,001 ml -1 ml akseptorfase efter ekstrahering av en 1 ml prøveoppløsning inneholdende 1 ug/ml analytt. Fordelingskoeffisientene er 10, 100,1000 og oo.

Konsentrasjonene som vist i tabell 1 viser at så lenge fordelingskoeffisientene er høye er de anrikninger som oppnås ved LLME til 0,001- 0,05 ml akseptorfase overlegne de anrikninger som oppnås ved tradisjonelle ekstraksjonsmetoder.

Det foreligger imidlertid praktiske problemer i forbindelse med ekstrahering av biologiske fluider med små volumer organiske oppløsningsmidler. I biologiske fluider dannes det lett en emulsjon under væske-væske-ekstraksjon og små volumer oppløs-ningsmiddel blir lett emulgert. Selv efter sentrifugering er det vanskelig å fange opp små oppløsningsmiddelvolumer. Ekstrahering av biologiske fluider med oppløsningsmiddelvolumer mindre enn 50 ul gjennomføres derfor ikke i tradisjonelle, analyttiske prosedyrer.

En mulig vei for å løse disse problemer er å benytte såkalte engangssvamper eller å benytte innretninger som beskrevet i figurene 3 og 4.

Engangsekstraheringssvamper

Problemene som nevnt ovenfor kan løses ved engangsekstraheringssvamper. Engangsekstraheringssvamper benyttes for å immobilisere 10 til 50 ul ekstraheringsoppløsnings-middel. LLME med ekstraheringssvamper er spesielt godt egnet for prøvepreparering av biologiske fluider før GC-analyse. Oppløsningsmiddel som er immobilisert i ekstraheringssvampene eliminerer behandlingsproblemene i forbindelse med små oppløs-ningsmiddelvolumer fordi immobiliserte oppløsningsmidler ikke emulgeres og også lett kan samles efter ekstrahering.

Materialer som benyttes ved fremstilling av ekstraheringssvamper må være oppløs-ningsmiddel-resistente, porøse og komprimerbare. I tillegg bør materialene være tilstrekkelig hydrofobe til å immobilisere vann-ublandbare oppløsningsmidler. Pore-størrelsen kan ligge fra noen få mikrometer opp til mm. Ekspanderte polymerer og polymerskum er spesielt egnet. Eksempler på oppløsningsmiddel-resistente polymerer er Teflon, Tefzel, Halar, polyetylen og polypropylen. Størrelsen av polymermaterialet tilskjæres for å stemme over ens med immobiliseringen av et på forhånd bestemt volumoppløsningsmiddel.

LLME med éngangsekstraheringssvamper.

Ekstraheringssvampene fylles i en beholder med oppløsningsmidlet som skal immobiliseres. Svampene komprimeres for å fjerne luft som er fanget i porene og dynkes derefter i oppløsningsmidlet. Svampene er så ferdige for ekstrahering. Prøveoppløsningene fylles i ekstraheringsampuller. Typiske volumer for prøveopp-løsningen er 0,5 til 5 ml. Kvantitativ analyse gjennomføres alltid ved tilsetning av en indre standard til prøveoppløsningen. Den indre standard settes til prøven før ekstraheringen og følger analytten gjennom alle analyttiske trinn. Den indre standard kompenserer for alle fluktueringer ved prosedyren. Den kjemiske art av prøven endres før ekstrahering for å lette analytt-ekstrahering til det organiske oppløsningsmiddel. Dette involverer optimalisering av pH-verdi og tilsetning av salt.

En oppløsningsmiddelsvamp med immobilisert oppløsningsmiddel fjernes fra beholderen og bringes inn i ekstraheringsampullen. Ekstraheringen gjennomføres ved omrøring. En hvilken som helst type omrøring, for eksempel en magnetrører, kan benyttes. Ekstraheringen fortsettes til likevekt (10 til 30 minutter). Oppløsningsmiddel-svampen fjernes deretter fra prøveampullen. Immobilisert oppløsningsmiddel med anriket analytt settes fri ved komprimering. Denne komprimering kan gjennomføres i et hvilket som helst egnet utstyr for sammenpressing. For eksempel kan svampene komprimeres i en medisinsk engangssprøyte utstyrt med en nål og det frigjorte oppløsningsmiddel fylles i en mikroprøve-ampulle tilpasset en GC-autoinjektor.

Svamper som er i stand til å immobilisere 25 ul oppløsningsmiddel er egnet ved mange anvendelser. Som vist i tabell 1 oppnås anrikninger på 30 for analytter med en fordelingskoeffisient på 100. Et oppløsningsmiddel på 25 ul er tilstrekkelig stort til å tillate lett håndtering. Dette oppløsningsmiddelvolum er også stort nok til å unngå overopp-fylling og redusert anrikning under ekstrahering. En svamp benyttes for hver prøve og benyttede svamper kan lagres sikkert i en egnet beholder før destruering. Sammenlignet med tradisjonelle metoder for prøvepreparering, reduserer LLME med oppløsnings-middelsvamper i vesentlig grad oppløsningsmiddelforbruket og risiki overfor personalet og omgivelsene.

Foreliggende oppfinnelse tar sikte på å løse problemet ovenfor ved å benytte såkalt mikro-tilbake-ekstraksjon, ovenfor og nedenfor kalt væske-væske-væske-mikro-ekstraksjon (LLLME) for å oppnå en tilstrekkelig høy konsentrasjon av materialet som skal analyseres, i akseptor-oppløsningen.

Prinsippene ved LLLME skal forklares i større detalj nedenfor.

Væske- væske- væske- mikro- ekstraksion ( LLLME).

Separasjonsteknikker som benyttes ved kapillar-elektroforese, for eksempel kapillarsone-elektroforese, miscellær elektrokinetisk kromatografi og kapillærelektrokromatografi, favoriserer injeksjon av vandige prøver med lav ionestyrke. På grunn av injeksjonen av ni-volumer av prøver kreves det høye anrikninger ved bioanalyse av medikamenter som er tilstede i spormengder i biologiske fluider.

De fleste medikamenter er ioniske. Ioniske, organiske substanser kan anrikes ved LLLME. Prinsippet ved LLLME for isolering av ioniske, organiske molekyler er vist i figur 2. Opprensing og konsentrasjon av analytter er basert på fordeling av analyttene fra et stort volum av den vandige prøvematriks gjennom en membran og inn i et lite volum av en vandig akseptorfase. Membranen virker som opprensningsbarriére mellom to vandige faser. Både basiske og sure forbindelser kan anrikes ved LLLME. pH-verdien for matriksen justeres slik at analyttene er uladet. Dette tillater at de passerer gjennom membranen inn i den vandige akseptor-oppløsning på den andre side. pH-verdien i akseptor-oppløsningen justeres til en pH-verdi der analyttene er ionisert for derved å forhindre en gjeninntreden i membranen. Kun små ikke-ladede molekyler kan passere gjennom membranen og kun molekyler som er oppløselige i denne og i akseptor-oppløsningen vil bli anriket. Vannoppløselige, nøytrale substanser forblir i matriksen. Nøytrale, hydrofobe substanser fordeles inn i membranen og ikke inn i akseptor-fasen. Substanser med motsatt ladning til analyttenes ladning forblir i matriksen. LLLME er således en sterk opprensningsteknikk.

Drivkraften for ekstraheringen avhenger av produktet av analytt-fordelingskoeffisientene mellom membranen og prøveoppløsningen og mellom akseptor-fasen og

membranen, som er ekvivalent analyttfordelingskoeffisienten mellom akseptorfasen og prøvematriksen. Forbindelser med høy fordelingskoeffisient mellom de to vandige faser vil anrikes. Denne fordelingskoeffisient vil være stor for mange medikamenter. LLLME har derfor potensiale av å virke både som en sterk anriknings- og opprenskningsteknikk for mange ioniske medikamenter.

Hvis vi definerer akseptonmembran-fordelingskoeffisienten som K^, membran:prøve-fordelingskoeffisienten som Kls, akseptonprøve-fordelingskoeffisienten som K^, akseptor-volumet som Va, membranvolumet som Vl5 prøvevolumet som Vs og prøve-utgangskonsentrasjonen som C0, er den mengde analytt som ekstraheres ved LLME:

I LLLME bør membranvolumet være så lite som mulig. Da vil K1s V, være neglisjerbart og ligning 4 kan reduseres til:

Ligning 5 kan benyttes for å estimere analytt-anrikning fra en 1 ml prøveoppløsning inneholdende 1 ug/ml analytt som funksjon av akseptorfase-volumet og fordelingskoeffisienten. De oppnådde resultater er ekvivalente med de resultater som er vist i tabell 1 og som viser at anrikninger fra en 1 ml prøve til 0,001 til 0,05 ml akseptor-oppløsning er overlegne de anrikninger som oppnås ved tradisjonelle ekstraherings-metoder.

Mange ioniske medikamenter har fordelingskoeffisienter større enn 100 mellom to vandige faser: en med en pH-verdi der medikamentene lades og den andre en pH-verdi der medikamentene er uladet. Når en analytt med en fordelingskoeffisient på 100 fanges opp i 10 ul akseptor-oppløsning fra 1 ml prøve med en konsentrasjon på 1 ug/ml, er analyttkonsentrasjonen i akseptorfasen 50 fig/ml. Dette faktum viser at LLLME er i stand til å gi anrikninger som ikke kan oppnås ved noen annen ekstraksjonsmetode. LLLME er derfor spesielt brukbar som en ekstraksjonsteknikk for moderne kapillær-separasjonsmetoder som CE.

Den kjemiske natur av membranen er viktig når det gjelder å oppnå korte analysetider. Ekstraksjoner må fortsette inntil det er oppnådd likevekt mellom de tre faser. Hvis membran:prøve-fordelingskoeffisienten er lav, vil likevektstidene være lange og vil nærme seg uendelig for analytter som er meget lite oppløselige i membranen. Opp-løsningsmidlet som danner membranen bør derfor være et godt oppløsningsmiddel for målanalytten. Den kjemiske art for membranen er også viktig når det gjelder innstilling av selektiviteten.

Foreliggende oppfinnelse tar sikte på å forbedre den kjente teknikk og benytte de ovenfor antydede muligheter og angår derfor, i et første aspekt, en apparatur for gjennomføring av væske-væske-mikro-ekstraksjon eller væske-væske-væske-mikro-ekstraksjon med høy anrikning, og denne apparatur karakteriseres ved at den omfatter: a) en beholder for prøveoppløsning med et volum Vs med oppløst stoff, analytt, som skal analyseres, b) en andre beholder anordnet i den første beholder, fortrinnsvis engangsbeholder, med permeable membranvegger, for en akseptor-oppløsning,

med et volum Va der

c) omrøringsmidler, fortrinnsvis en magnetstav.

I en utførelsesform er beholderen for akseptor-oppløsning en mikro-porøs, hul fiber,

eventuelt av en aktiv polymer.

Som nevnt innledningsvis angår oppfinnelsen også fremgangsmåte for ekstrahering og angår derfor, i et første ekstraheringsaspekt, en fremgangsmåte for væske-væske-mikro-ekstraksjon med høy anrikning, ved bruk av den ovenfor beskrevne apparatur, og denne metode karakteriseres ved

a) at beholderen for akseptor-oppløsningen senkes ned i en akseptor-oppløsning slik at membranveggen er impregnert med, og beholderen fyllt med, et definert

volum av akseptor-oppløsningen,

b) at beholderen fyllt under a) overføres til beholderen med et definert volum av prøveoppløsningen med den søkte analytt, c) at prøveoppløsningen med analytt omrøres inntil ekstraksjonslikevekt for analytten i de to oppløsninger, og d) at akseptor-oppløsningen inneholdende den anrikede analytt fjernes fra beholderen for analyse av analytten.

I et andre ekstraksjonsaspekt angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for væske-væske-væske-mikro-ekstraksjon med høy anrikning ved bruk av apparaturen ifølge krav 1, og denne fremgangsmåte karakteriseres ved

a) at veggene i beholderen for akseptor-oppløsningen impregneres med, for immobilisering av, en væske som er blandbar med prøveoppløsningen og

makoseptor-oppløsningen,

b) at beholderen for akseptor-oppløsningen fylles med et definert volum av denne og c) senkes i beholderen med et definert volum av prøve-oppløsningen med den søkte analytt, d) at prøve-oppløsningen med analytt omrøres inntil det er oppnådd ekstraksjonslikevekt mellom

i) prøve-oppløsningen og den immobiliserte væske, og

ii) den immobiliserte væske og akseptor-oppløsningen, og

e) at akseptor-oppløsningen med oppkonsentrert analytt fjernes fra sin beholder for analyse av analytten.

Den sistnevnte metode er særlig velegnet for oppkonsentrering av sure eller basiske analytter. For eksempel kan basiske analytter anrikes fra basiske, vandige, biologiske prøver under anvendelse av en akseptorvæske i form av en surgjort, vandig væske og en organisk væske som er immobilisert i membranen og som er ublandbar med de vandige væsker.

Her kan det, som nevnt tidligere, være fordelaktig å benytte en mikroporøs hulfiber men det er også mulig å benytte en aktiv polymer.

I et siste aspekt angår oppfinnelsen, som nevnt ovenfor, en engangsinnretning for anvendelse ved væske-væske-mikro-ekstraksjon og som karakteriseres ved at den har form av et svamp-lignende legeme med et definert porevolum for absorbsjon av en immobilisert akseptor-oppløsning for en analytt fra et volum av en prøve-oppløsning.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere i større detalj under henvisning til de ledsagende tegninger der: figur 1 viser en sammenligning mellom væske-væske-ekstraksjon og væske- væske-mikro-ekstraksjon,

figur 2 viser prinsippet for væske-væske-væske-mikro-ekstraksjon,

figur 3 viser en mulig innretning for anvendelse ved LLLME, eller LLME, figur 4 viser en andre mulig innretning for LLLME, eller LLME,

figur 5 viser kromatogrammer oppnådd i forbindelse med eksempel 1, og figur 6 viser elektro-ferogrammer oppnådd i forbindelse med eksempel 2.

Engangsinnretninger for LLLME.

Innretninger for LLLME må kunne muliggjøre ekstrahering fra et stort prøvevolum gjennom et neglisjerbart membranvolum til et lite volum av en vandig akseptor-oppløsning. Membranen bør være en tynn film med en stor overflate. Membranen kan være enten et faststoff eller en væske (væske-faststoff-væske-mikro-ekstraksjon, LSLME) eller en væske (væske-væske-væske-mikro-ekstraksjon, LLLME).

Ved LLLME må oppløsningsmidlet som utgjør den flytende membran, immobiliseres. Et hvilket som helst materiale som er i stand til å immobilisere et vannublandbart opp-løsningsmiddel, kan benyttes. Hydrofobe hulfibre er spesielt brukbare. Fibrene kan fremstilles av polymermaterialer som Teflon, polypropylen eller polyetylen. Den indre diameter for hulfibrene ligger i området 0,05 til 1 mm, veggtykkelsen ligger karakteristisk i området 0,001 til 0,3 mm og den midlere porestørrelse i området 0,01 til 10 mm. Fiberlengden er karakteristisk 2 til 10 cm for å tillate at fastlagte volumer av akseptor-oppløsning i området 5 til 50 (il fylles inn i hulfiberen.

Ved LSLME kan membranen være en polymerfilm bestående av et materiale som er i stand til å sorbere ikke-ladede forbindelser. Eksempler på slike materialer er poly-dimetylsiloksan (PDMS), polyakrylat eller polystyrendivinylbenzen. Disse materialer benyttes også som velkjente sorbenter ved SPME. Membrantykkelsen er fortrinnsvis 0,5 til 50 um. Membranen kan bæres av et stivt rammeverk og omdannes til rør med samme dimensjoner som hulfibrene som beskrevet ovenfor.

Innretninger for LLLME bør være av engangstypen. Urenheter fra én prøve kan fanges i membranen og disse urenheter kan kontaminere andre prøver. En prøve-forbehandling bør derfor benyttes for hver prøve. Engangsinnretninger bør også være forbundet med kommersielt tilgjengelige prøveprepareirngsampuUer.

Engangsinnretninger for LLLMG er vist i figurene 3a og 4a. Figurene 3b og 4b viser innretningene forbundet til prøveampuller fylt med prøveoppløsning. Føringsstaven eller røret kan være av rustfritt stål eller av et polymermateriale. Toppen av denne kan være utstyrt med eller forbundet til en nåleføring for å tillate fylling av hulfibren med. akseptoroppløsning fra en sprøyte. Hulfiberen i figur 3b er i begge ender utstyrt med slike føringselementer.

Prøvepreparering med LLLME- engangsinnretninger.

Ved LSLME kan membranen benyttes som den er. Ved LLLME blir den flytende membran dannet ved å dyppe hulfibrene i en organisk oppløsning i 5 til 30 sekunder for å tillate oppløsningsmidlet å trenge inn i porene i fiberen. Akseptor-oppløsning ble så fyllt inn i fibrene ved hjelp av en sprøyte. Vanligvis er fibre med et indre rørvolum på 10 ul foretrukket fordi 10 ul akseptor-oppløsning gir høy analytt-oppkonsentrering og 10 ul volumer lett kan håndteres med kommersielt tilgjengelige sprøyter. Akseptor-oppløsningen har en pH-verdi der mål-analyttene er ladet. Ekstraheringen gjennomføres ved å forbinde LLLME-innretningen med prøveampullen. Prøven som er fyllt i prøve-ampullen er bufret til en pH-verdi der analyttene er nøytrale. Typiske prøvevolumer er 0,5 til 5 ml av et biologisk fluid. En indre standard blir som nevnt ovenfor alltid tilsatt til prøveoppløsningen før ekstrahering for å kompensere for fluktueringer ved prosedyren. Ekstrahering gjennomføres ved omrøring, for eksempel med en magnetisk rørestav i prøveampullen. Ekstraheringen fortsettes inntil likevekt er oppnådd mellom de tre faser. Når likevekt er nådd (15 til 60 minutter) samles akseptor-oppløsningen med en sprøyte og fylles i auto-sampler-ampuller for automatisert injeksjon i det analytiske instrument.

Oppfinnelsen skal forklares i større detalj under henvisning til de følgende eksempler.

Innretningen som vist i figur 4 ble benyttet for å demonstrere potensialet ved væske-væske-mikro-ekstraksjon og væske-væske-væske-mikro-ekstraksjon. Den benyttede hulfiber var en polypropylen-fiber med porestørrelse 0,2 um (Accurel® PP Q3/2). Den indre diameter var 600 um, veggtykkelsen var 200 um og lengden var 5,5 cm.

Eksempel 1: Væske- væske- mikro- ekstraksjon ( LLME).

LLME demonstreres ved ekstrahering av 5 nmol/ml prøveoppløsninger av diazepam (D) og prazepam (P), preparert i 0,1 M acetatbuffer pH 5,5, i urin og i human plasma. En standard oppløsning i octanol (5 nmol/ml) ble preparert som referanse-oppløsning for direkte injeksjon i gasskromatografen. pH-verdien for standard-oppløsningen i urin ble justert til pH 5,5 før ekstrahering. Til en plasma-aliquot (1080 ul) ble det satt 120 ul metanol for å redusere proteinbindingen av benzodiazepinene før ekstrahering og deretter ble blandingen omrørt i 1 minutt. LLME ble gjennomført ved å anbringe 1,2 ml av prøveoppløsningene i 2 ml autosampler-ampuller. Hulfiberen ble fylt med 10 ul 1 oktanol. Efter 1 minutt ble hulfibrene, for å sikre at oppløsningsmidlet fullstendig ville penetrere porene, nedsenket i autosampler-ampullene. Prøveoppløsningen ble omrørt med en magnetisk rørestav under ekstraheringen. Efter 30 minutter ble 1 ul oktanol trekket av fra hulfiberen med en GC-sprøyte og injisert i gasskromatografen. Den gasskromatografiske separering ble oppnådd på en poly-(dimetylsiloksan)-kolonne (30 x 0,25 mm i.D., 0,25 mm filmtykkelse) og forbindelsene ble detektert med en nitrogen-fosfordetektor (NPD). Helium (1 ml/min.) ble benyttet som bærergass. Den kromato-grafiske separering ble oppnådd ved temperaturprogrammering. Temperaturen ble holdt ved 180°C i 1 minutt og økt med 20°C pr. minutt til 300°C. Figur 5 viser kromatogrammer av referanse-oppløsningen i oktanol (5 nmol/ml) og kromatogrammer for prøveoppløsningene (5 nmol/ml) av diazepam og prazepam i azetatbuffer, i urin og i plasma efter oppkonsentrering ved LLME. Kromatogrammene viser en prekonsentrasjon med en faktor på 100 respektivt 70 for diazepam respektivt prazepam fra azetatbuffer-, urin- og plasmaprøven.

Eksempel 2: Væske- væske- væske- mikro- ekstraksion ( LLLME).

LLLME ble gjennomført med 1-oktanol som immobilisert væske. Hulfibren ble nedsenket i 5 sekunder i 1-oktanol, noe som er tilstrekkelig til at 1-oktanol kan penetrere og fylle fiberens porer. 10 ul 0,1 M HC1 ble benyttet som akseptoroppløsning og ble fylt i den impregnerte fiber med en sprøyte. En standardoppløsning på 4 ug/ml difenylhydramin i 0,1 M HC1 ble preparert som en referanse for direkte injeksjon i CE-instrumentet. I tillegg ble det preparert oppløsninger av difenylhydramin (4 ug/ml) i 0,1M NaOH, i urin og i plasma. Før ekstrahering ble pH-verdien i urin- og plasma-prøveoppløsningene justert til en pH-verdi på 12 til 13 med NaOH. 1,5 ml av prøve-oppløsningene ble anbragt i 0,2 ml autosampler-ampuller.

LLLME ble gjennomført under omrøring med en magnetstav i 30 minutter. Akseptor-oppløsningen ble fjernet efter ekstrahering og analysert med CE. Separeringer ble gjennomført inne i en dampet silika-kapillær med 10 cm effektiv lengde (25 cm total lengde) x 50 um indre diameter. En 20 mM natriumacetatbuffer, justert til pH 4,5 med eddiksyre, ble benyttet som separasjonsbuffer. Prøveinnføringen ble gjennomført ved hydrodynamisk injeksjon under et trykk på 0,5 psi i 5 sekunder. Separeringen ble gjennomført ved 25 kV og detekteringen ble gjennomført ved 215 nm. Elektroferrogrammene er vist i figur 6. Elektroferrogrammene viser at difenylhydramin (DH) ble prekonsentrert med en faktor 90 fra prøveoppløsningen preparert til 0,1 M NaOH og i urin. En prekonsentrasjon på 50 ble oppnådd fra plasma. Den lavere oppkonsentrering fra plasma skyldes proteinbinding i analytten. For begge de biologiske prøver ble en utmerket prøveopprensing observert i tillegg til analytt-oppkonsentrering. På tross av den høye prøvekompleksitet ble det så og si ikke observert noen matriks-komponenter i de elektroferrogrammer som ble oppnådd ved kapillarsone-elektroforese.

Claims

1. Apparatur for gjennomføring av væske-væske-mikro-ekstraksjon eller væske-væske-væske-mikro-ekstraksjon med høy oppkonsentrering, karakterisert ved at den omfatter a) en beholder for en prøveoppløsning med volum Vs med oppløst stoff, analytt, som skal analyseres, b) en i den første beholder anordnet andre beholder, fortrinnsvis engangsbeholder, med permeabel membranvegg, med volum Va for en akseptor-oppløsning, idet 1) Vs:Va>50og 2) ca. 1 ul < Va < 50 ul, c) omrøringsmidler, fortrinnsvis en magnetstav.

2. Apparatur ifølge krav 1, karakterisert ved at beholderen for akseptor-oppløsningen er en mikro-porøs hulfiber.

3. Apparatur ifølge krav log2, karakterisert ved at beholderen er en hulfiber av en aktiv polymer.

4. Fremgangsmåte for væske-væske-mikro-ekstraksjon med høy oppkonsentrering ved bruk av apparatur ifølge krav 1, karakterisert veda) at beholderen for akseptor-oppløsning senkes i en akseptor-oppløsning slik at membran-veggen impregneres med og beholderen fylles med et definert volum av akseptor-oppløsningen, b) at den under a) fylte beholder overføres til beholderen med et definert volum av prøveoppløsningen med den søkte analytt, c) at prøveoppløsningen med analytt omrøres til det er oppnådd ekstraksjonslikevekt for analytten i de to oppløsninger, og d) at akseptor-oppløsningen med oppkonsentrert analytt fjernes fra sin beholder for analyse av analytten.

5. Fremgangsmåte for væske-væske-væske-mikro-ekstraksjon med høy oppkonsentrering ved bruk av apparaturen ifølge krav 1, karakterisert ved a) at veggene i beholderen for akseptor-oppløsningen impregneres med, for immobilisering av, en væske som er ublandbar med prøveoppløsningen og akseptor-oppløsningen, b) at beholderen for akseptoroppløsningen fylles med et definert volum av denne og c) senkes i beholderen med et definert volum av prøve-oppløsningen med den søkte analytt, d) at prøve-oppløsningen med analytt omrøres inntil det er oppnådd ekstraksjonslikevekt mellom i) prøve-oppløsningen og den immobiliserte væske, og ii) den immobiliserte væske og akseptor-oppløsningen, og e) at akseptor-oppløsningen med oppkonsentrert analytt fjernes fra sin beholder for analyse av analytten.

6. Fremgangsmåte ifølge kravene 4 og 5, karakterisert v e d at det som beholder for akseptor-væsker benyttes en mikroporøs hulfiber.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at det som beholder for akseptor-væsken benyttes en hulfiber laget av en aktiv polymer.

8. Fremgangsmåte ifølge kravene 5 til 7, karakterisert v e d at både prøveoppløsningen og akseptor-oppløsningen er vandige væsker.

9. Fremgangsmåte ifølge kravene 5 og 6 samt 8, karakterisert v e d at væsken som er immobilisert i membranen er en med vandige væsker ublandbar, organisk væske.

10. Fremgangsmåte ifølge kravene 5 til 9, karakterisert v e d at prøveoppløsningen er en basisk, vandig biologisk prøve og akseptor-oppløsningen er en surgjort, vandig væske for ekstrahering av basiske analytter.

11. Engangsinnretning til bruk ved væske-væske-mikro-ekstraksjon, karakterisert ved at den har form av et svamp-legeme med definert porevolum for opptak av en immobilisert mottaker-oppløsning for en analytt fra et volum av en prøveoppløsning.