JP2002526096A - トロンビン受容体に類似したｇタンパク質共役型受容体 - Google Patents
トロンビン受容体に類似したｇタンパク質共役型受容体Info
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
Abstract
(57)【要約】
新規ヒトGタンパク質共役型受容体HG52をコードするcDNA、および該cDNAにコードされるタンパク質を提供する。HG52のアゴニストおよびアンタゴニストを同定する方法も提供する。
Description
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、トロンビン受容体などのプロテアーゼ活性化受容体に対する相同性
を有するGタンパク質共役型受容体（GPCR）であるHG52をコードする新規ヒトcDN
A、該cDNAにコードされるタンパク質、および該cDNAにコードされるタンパク質
の選択的アゴニストおよびアンタゴニストを同定する方法に関する。
を有するGタンパク質共役型受容体（GPCR）であるHG52をコードする新規ヒトcDN
A、該cDNAにコードされるタンパク質、および該cDNAにコードされるタンパク質
の選択的アゴニストおよびアンタゴニストを同定する方法に関する。
【０００２】 （発明の背景） Gタンパク質共役型受容体（GPCR）は、細胞の外部から内部へ情報を中継する
膜受容体の非常に大きなクラスである。GPCRは、Gタンパク質として公知のヘテ
ロ三量体タンパク質のクラスと相互作用することにより機能する。ほとんどのGP
CRは、同様のメカニズムにより機能する。アゴニストが結合すると、GPCRは、G
タンパク質のαサブユニットからのグアノシン二リン酸（GDP）の解離を触媒す
る。これは、αサブユニットへのグアノシン三リン酸（GTP）の結合を可能にし
、βおよびγサブユニットからのαサブユニットの解離をもたらす。ついで、遊
離したαサブユニットは他の細胞成分と相互作用し、その過程で、該アゴニスト
の存在により表される細胞外シグナルを伝達する。βおよびγサブユニットが該
アゴニストシグナルを伝達することもある。
膜受容体の非常に大きなクラスである。GPCRは、Gタンパク質として公知のヘテ
ロ三量体タンパク質のクラスと相互作用することにより機能する。ほとんどのGP
CRは、同様のメカニズムにより機能する。アゴニストが結合すると、GPCRは、G
タンパク質のαサブユニットからのグアノシン二リン酸（GDP）の解離を触媒す
る。これは、αサブユニットへのグアノシン三リン酸（GTP）の結合を可能にし
、βおよびγサブユニットからのαサブユニットの解離をもたらす。ついで、遊
離したαサブユニットは他の細胞成分と相互作用し、その過程で、該アゴニスト
の存在により表される細胞外シグナルを伝達する。βおよびγサブユニットが該
アゴニストシグナルを伝達することもある。
【０００３】 GPCRは、共通の構造的特徴を有する。それらは、種々の長さの親水性アミノ酸
の配列により連結された約20〜30アミノ酸長の7個の疎水性ドメインを有する。
これらの7個の疎水性ドメインは形質膜中に挿入されて、7個の膜貫通ドメイン、
細胞外アミノ末端および細胞内カルボキシ末端を有するタンパク質を形成する（
Straderら, 1994, Ann. Rev. Biochem. 63:101-132; Scherlerら, 1993, Nature
362:770-772; Dohlmanら, 1991, Ann. Rev. Biochem. 60:653-688）。
の配列により連結された約20〜30アミノ酸長の7個の疎水性ドメインを有する。
これらの7個の疎水性ドメインは形質膜中に挿入されて、7個の膜貫通ドメイン、
細胞外アミノ末端および細胞内カルボキシ末端を有するタンパク質を形成する（
Straderら, 1994, Ann. Rev. Biochem. 63:101-132; Scherlerら, 1993, Nature
362:770-772; Dohlmanら, 1991, Ann. Rev. Biochem. 60:653-688）。
【０００４】 GPCRは多種多様な組織型において発現され、広範囲のリガンド（例えば、タン
パク質ホルモン、生物アミン、ペプチド、脂質由来メッセンジャーなど）に応答
する。それらの広範囲の発現およびリガンドを考えると、GPCRが多数の病理学的
状態に関与することは驚くべきことではない。このため、薬理学的に使用しうる
GPCR活性のモジュレーターの開発に多大な関心が寄せられている。例えば、Stad
elら, 1997, Trends Pharmacol. Sci. 18:430-437の表1には、GPCRに作用する37
個の異なる市販薬が列挙されている。したがって、GPCRの機能を理解すること、
およびGPCR活性のモジュレーションに使用しうる物質を開発することが大いに必
要とされている。
パク質ホルモン、生物アミン、ペプチド、脂質由来メッセンジャーなど）に応答
する。それらの広範囲の発現およびリガンドを考えると、GPCRが多数の病理学的
状態に関与することは驚くべきことではない。このため、薬理学的に使用しうる
GPCR活性のモジュレーターの開発に多大な関心が寄せられている。例えば、Stad
elら, 1997, Trends Pharmacol. Sci. 18:430-437の表1には、GPCRに作用する37
個の異なる市販薬が列挙されている。したがって、GPCRの機能を理解すること、
およびGPCR活性のモジュレーションに使用しうる物質を開発することが大いに必
要とされている。
【０００５】 トロンビン受容体は、7回膜貫通ドメイン受容体ファミリーのメンバーであるG
PCRである。最初に見出されたトロンビン受容体は、比較的長いアミノ末端細胞
外ドメインを有する。この細胞外ドメインはトロンビンの基質として作用する。
トロンビンは、該細胞外ドメインを、そのN末端から41アミノ酸の位置で切断し
て、新たなN末端を与える。この新たなN末端は、つなぎ留められた分子内リガン
ドとして機能することによりトロンビン受容体を活性化する（Vuら, 1991, Cell
64:1057-1068）。トロンビン受容体は、血小板、血管内皮細胞、平滑筋細胞、
繊維芽細胞、メサンギウム細胞および神経細胞におけるトロンビンの作用を媒介
しうる。トロンビン受容体の総説としては、Dennigton ＆ Berndt, 1994, Clin.
Exper. Pharmacol. Physiol. 21:349-358を参照されたい。
PCRである。最初に見出されたトロンビン受容体は、比較的長いアミノ末端細胞
外ドメインを有する。この細胞外ドメインはトロンビンの基質として作用する。
トロンビンは、該細胞外ドメインを、そのN末端から41アミノ酸の位置で切断し
て、新たなN末端を与える。この新たなN末端は、つなぎ留められた分子内リガン
ドとして機能することによりトロンビン受容体を活性化する（Vuら, 1991, Cell
64:1057-1068）。トロンビン受容体は、血小板、血管内皮細胞、平滑筋細胞、
繊維芽細胞、メサンギウム細胞および神経細胞におけるトロンビンの作用を媒介
しうる。トロンビン受容体の総説としては、Dennigton ＆ Berndt, 1994, Clin.
Exper. Pharmacol. Physiol. 21:349-358を参照されたい。
【０００６】 トロンビンに起因する以下の種々の作用を考慮すると、トロンビン受容体の医
学的重要性が高められる：血漿中のフィブリノーゲンからフィブリンへの変換、
凝固因子V、VIII、XIIIおよびプロテインCの活性化、血小板および内皮細胞の凝
血促進機能のモジュレーション、および血小板活性化の刺激（Davey ＆ Luscher
, 1967, Nature 216:857-858; Coughlinら, 1992, J. Clin. Invest. 89:351-35
5）、単球（Bar-Shavitら, 1983, Science 220:728-731）およびリンパ球（Bizi
osら, 1985, Thrombosis Res. 38:425-431）の化学走性、リンパ球および間葉細
胞（例えば、血管平滑筋細胞、繊維芽細胞および上皮細胞）の有糸分裂生起（Ch
en ＆ Buchanan, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:131-135; Reddanら, 1
982, Invest. Ophthal. Visual Sci. 22:486-493）。トロンビン受容体の活性の
モジュレーションは、トロンビンの前記作用をモジュレーションするための1つ
の可能性である。
学的重要性が高められる：血漿中のフィブリノーゲンからフィブリンへの変換、
凝固因子V、VIII、XIIIおよびプロテインCの活性化、血小板および内皮細胞の凝
血促進機能のモジュレーション、および血小板活性化の刺激（Davey ＆ Luscher
, 1967, Nature 216:857-858; Coughlinら, 1992, J. Clin. Invest. 89:351-35
5）、単球（Bar-Shavitら, 1983, Science 220:728-731）およびリンパ球（Bizi
osら, 1985, Thrombosis Res. 38:425-431）の化学走性、リンパ球および間葉細
胞（例えば、血管平滑筋細胞、繊維芽細胞および上皮細胞）の有糸分裂生起（Ch
en ＆ Buchanan, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:131-135; Reddanら, 1
982, Invest. Ophthal. Visual Sci. 22:486-493）。トロンビン受容体の活性の
モジュレーションは、トロンビンの前記作用をモジュレーションするための1つ
の可能性である。
【０００７】 米国特許第5,686,597号は、ヒトトロンビン受容体のホモログを開示している
。
。
【０００８】 （発明の概要） 本発明は、Gタンパク質共役型受容体HG52をコードする新規ヒトcDNAに関する
。HG52をコードするDNAは、他の核酸を実質的に含有せず、配列番号1に記載のヌ
クレオチド配列を有する。また、該新規cDNA配列にコードされるHG52タンパク質
も提供する。HG52タンパク質は、他のタンパク質を実質的に含有せず、配列番号
2に示すアミノ酸配列を有する。組換え系内でHG52を発現させる方法ならびにHG5
2のアゴニストおよびアンタゴニストを同定する方法を提供する。
。HG52をコードするDNAは、他の核酸を実質的に含有せず、配列番号1に記載のヌ
クレオチド配列を有する。また、該新規cDNA配列にコードされるHG52タンパク質
も提供する。HG52タンパク質は、他のタンパク質を実質的に含有せず、配列番号
2に示すアミノ酸配列を有する。組換え系内でHG52を発現させる方法ならびにHG5
2のアゴニストおよびアンタゴニストを同定する方法を提供する。
【０００９】 （図面の簡単な記載） 図１は、HG52の全cDNA配列（配列番号1）を示す。 図２は、HG52の全アミノ酸配列（配列番号2）を示す。 図３Ａ〜Ｂは、HG52オープンリーディングフレームの翻訳を示す。示されてい
るヌクレオチド配列は配列番号1である。示されているアミノ酸配列は配列番号2
である。 図４は、種々のヒト組織内でのHG52 mRNAの発現のノーザンブロットの結果を
示す。 図５は、HG52のアミノ酸配列とヒトトロンビン受容体1のアミノ酸配列（配列
番号3）とのアライメントを示す。
るヌクレオチド配列は配列番号1である。示されているアミノ酸配列は配列番号2
である。 図４は、種々のヒト組織内でのHG52 mRNAの発現のノーザンブロットの結果を
示す。 図５は、HG52のアミノ酸配列とヒトトロンビン受容体1のアミノ酸配列（配列
番号3）とのアライメントを示す。
【００１０】 （発明の詳細な記載） 本発明の目的においては、「他のタンパク質を実質的に含有しない」は、他の
タンパク質から少なくとも90％、好ましくは95％、より好ましくは99％、より一
層好ましくは99.9％フリーである（すなわち、かかる割合分は他のタンパク質を
含有しない）ことを意味する。したがって、他のタンパク質を実質的に含有しな
いHG52タンパク質調製物は、その全タンパク質に対する割合として、10％以下、
好ましくは5％以下、より好ましくは1％以下、より一層好ましくは0.1％以下の
非HG52タンパク質を含有するであろう。ある与えられたHG52タンパク質調製物が
他のタンパク質を実質的に含有しないか否かは、適当な検出方法（例えば、銀染
色または免疫ブロット法）と組合せた例えばドデシル硫酸ナトリウムポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）などのタンパク質の純度を評価する通常の技
術により判定することができる。
タンパク質から少なくとも90％、好ましくは95％、より好ましくは99％、より一
層好ましくは99.9％フリーである（すなわち、かかる割合分は他のタンパク質を
含有しない）ことを意味する。したがって、他のタンパク質を実質的に含有しな
いHG52タンパク質調製物は、その全タンパク質に対する割合として、10％以下、
好ましくは5％以下、より好ましくは1％以下、より一層好ましくは0.1％以下の
非HG52タンパク質を含有するであろう。ある与えられたHG52タンパク質調製物が
他のタンパク質を実質的に含有しないか否かは、適当な検出方法（例えば、銀染
色または免疫ブロット法）と組合せた例えばドデシル硫酸ナトリウムポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）などのタンパク質の純度を評価する通常の技
術により判定することができる。
【００１１】 「他の核酸を実質的に含有しない」は、他の核酸から少なくとも90％、好まし
くは95％、より好ましくは99％、より一層好ましくは99.9％フリーであることを
意味する。したがって、他の核酸を実質的に含有しないHG52 DNA調製物は、その
全核酸に対する割合として、10％以下、好ましくは5％以下、より好ましくは1％
以下、より一層好ましくは0.1％以下の非HG52核酸を含有するであろう。ある与
えられたHG52 DNA調製物が他の核酸を実質的に含有しないか否かは、適当な染色
方法（例えば、臭化エチジウム染色）と組合せた例えばアガロースゲル電気泳動
などの核酸の純度を評価する通常の技術により、または配列決定により判定する
ことができる。
くは95％、より好ましくは99％、より一層好ましくは99.9％フリーであることを
意味する。したがって、他の核酸を実質的に含有しないHG52 DNA調製物は、その
全核酸に対する割合として、10％以下、好ましくは5％以下、より好ましくは1％
以下、より一層好ましくは0.1％以下の非HG52核酸を含有するであろう。ある与
えられたHG52 DNA調製物が他の核酸を実質的に含有しないか否かは、適当な染色
方法（例えば、臭化エチジウム染色）と組合せた例えばアガロースゲル電気泳動
などの核酸の純度を評価する通常の技術により、または配列決定により判定する
ことができる。
【００１２】 「機能的等価体」は、選択的スプライシング、欠失、突然変異、置換または付
加により天然に存在するHG52と厳密には同じアミノ酸配列を有しないがHG52と実
質的に同じ生物活性を保有する受容体を意味する。そのような機能的等価体は、
天然に存在するHG52に対して、有意なアミノ酸配列同一性を有するであろう。そ
のような機能的等価体をコードする遺伝子およびcDNAは、天然に存在するHG52を
コードするDNA配列に低いストリンジェンシーでハイブリダイズさせることによ
り検出することができる。本発明の目的においては、天然に存在するHG52は、配
列番号2に示すアミノ酸配列を有し、配列番号1にコードされる。機能的等価体を
コードする核酸は、配列番号1に対してヌクレオチドレベルで少なくとも約50％
の同一性を有する。
加により天然に存在するHG52と厳密には同じアミノ酸配列を有しないがHG52と実
質的に同じ生物活性を保有する受容体を意味する。そのような機能的等価体は、
天然に存在するHG52に対して、有意なアミノ酸配列同一性を有するであろう。そ
のような機能的等価体をコードする遺伝子およびcDNAは、天然に存在するHG52を
コードするDNA配列に低いストリンジェンシーでハイブリダイズさせることによ
り検出することができる。本発明の目的においては、天然に存在するHG52は、配
列番号2に示すアミノ酸配列を有し、配列番号1にコードされる。機能的等価体を
コードする核酸は、配列番号1に対してヌクレオチドレベルで少なくとも約50％
の同一性を有する。
【００１３】 あるポリペプチドがHG52と「実質的に同じ生物活性」を有するのは、そのポリ
ペプチドが或るリガンドに対して、配列番号2を有するHG52の該リガンドに対す
るKdのせいぜい5倍以下のKdを有する場合である。
ペプチドが或るリガンドに対して、配列番号2を有するHG52の該リガンドに対す
るKdのせいぜい5倍以下のKdを有する場合である。
【００１４】 「同類アミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基が、化学的に類似した別のアミノ
酸残基により置換されることを意味する。そのような同類置換の具体例としては
、疎水性残基（イソロイシン、ロイシン、バリンまたはメチオニン）間での置換
、ある極性残基を同じ電荷の別の極性残基で置換すること（例えば、リシンから
アルギニンへの、アスパラギン酸からグルタミン酸への置換）が挙げられる。
酸残基により置換されることを意味する。そのような同類置換の具体例としては
、疎水性残基（イソロイシン、ロイシン、バリンまたはメチオニン）間での置換
、ある極性残基を同じ電荷の別の極性残基で置換すること（例えば、リシンから
アルギニンへの、アスパラギン酸からグルタミン酸への置換）が挙げられる。
【００１５】 「単離されたHG52タンパク質」は、天然源から単離されたHG52タンパク質を意
味する。「単離（された）」なる語の使用は、HG52タンパク質が、その通常の細
胞環境から取り出されていることを示す。したがって、単離されたHG52タンパク
質は無細胞溶液中に存在していたり、あるいはそれが天然に存在する場合の環境
とは異なる細胞環境中に存在しうる。単離（された）なる語は、単離されたHG52
タンパク質が、存在する唯一のタンパク質であることを意味するのではなく、単
離されたHG52タンパク質が、該HG52タンパク質に天然で付随する非アミノ酸物質
（例えば、核酸、脂質、炭水化物）から少なくとも95％フリーであることを意味
する。例えば、HG52タンパク質のうち、それを天然（すなわち、ヒトの介入の不
存在下）では発現しない細菌内または更には真核細胞内で組換え手段により発現
されたものは、「単離されたHG52タンパク質」である。
味する。「単離（された）」なる語の使用は、HG52タンパク質が、その通常の細
胞環境から取り出されていることを示す。したがって、単離されたHG52タンパク
質は無細胞溶液中に存在していたり、あるいはそれが天然に存在する場合の環境
とは異なる細胞環境中に存在しうる。単離（された）なる語は、単離されたHG52
タンパク質が、存在する唯一のタンパク質であることを意味するのではなく、単
離されたHG52タンパク質が、該HG52タンパク質に天然で付随する非アミノ酸物質
（例えば、核酸、脂質、炭水化物）から少なくとも95％フリーであることを意味
する。例えば、HG52タンパク質のうち、それを天然（すなわち、ヒトの介入の不
存在下）では発現しない細菌内または更には真核細胞内で組換え手段により発現
されたものは、「単離されたHG52タンパク質」である。
【００１６】 本発明の1つの態様は、他のタンパク質を実質的に含有しない新規Gタンパク質
共役型受容体（GPCR）（これはHG52と称される）の同定およびクローニングであ
る。
共役型受容体（GPCR）（これはHG52と称される）の同定およびクローニングであ
る。
【００１７】 本発明のもう1つの態様は、HG52 Gタンパク質共役型受容体をコードする核酸
である。これらの核酸は他の核酸を実質的に含有しない。
である。これらの核酸は他の核酸を実質的に含有しない。
【００１８】 本発明は、図１に配列番号1として示すヌクレオチド配列を有し他の核酸を実
質的に含有しないcDNA分子を提供する。配列番号1は、359アミノ酸のタンパク質
をコードするオープンリーディングフレーム（配列番号1の23〜1,099位）を含有
する（図３Ａ〜Ｂを参照されたい）。したがって、本発明はまた、配列番号1の2
3〜1,099位のヌクレオチド配列を含み他の核酸を実質的に含有しないDNA分子を
提供する。本発明はまた、配列番号1の23〜1,099位のヌクレオチド配列を含む組
換えDNA分子を提供する。
質的に含有しないcDNA分子を提供する。配列番号1は、359アミノ酸のタンパク質
をコードするオープンリーディングフレーム（配列番号1の23〜1,099位）を含有
する（図３Ａ〜Ｂを参照されたい）。したがって、本発明はまた、配列番号1の2
3〜1,099位のヌクレオチド配列を含み他の核酸を実質的に含有しないDNA分子を
提供する。本発明はまた、配列番号1の23〜1,099位のヌクレオチド配列を含む組
換えDNA分子を提供する。
【００１９】 HG52タンパク質は、その推定アミノ酸配列に基づけば、十中八九、ロドプシン
ファミリーの新規Gタンパク質共役型受容体（GPCR）の1つであろう。なぜなら、
HG52タンパク質は、ロドプシンファミリーのGPCRに特徴的な特性（すなわち、以
下に挙げるもの）の多くを含有するからである： （a）7個の膜貫通ドメイン、 （b）GPCRのロドプシンファミリーのメンバーに対する相同性、 （c）ロドプシンファミリー内のGPCRの特徴的（シグネチャー）モチーフ。
ファミリーの新規Gタンパク質共役型受容体（GPCR）の1つであろう。なぜなら、
HG52タンパク質は、ロドプシンファミリーのGPCRに特徴的な特性（すなわち、以
下に挙げるもの）の多くを含有するからである： （a）7個の膜貫通ドメイン、 （b）GPCRのロドプシンファミリーのメンバーに対する相同性、 （c）ロドプシンファミリー内のGPCRの特徴的（シグネチャー）モチーフ。
【００２０】 ノーザンブロット分析（図４）は、HG52 RNAが、ヒトにおいて、特に免疫系（
末梢血リンパ球（PBL）、脾臓、骨髄、リンパ節）の細胞内で、約4.5kbの転写産
物として広く発現されることを示した。このことは、免疫系の機能におけるHG52
に関する役割を裏付けるものである。
末梢血リンパ球（PBL）、脾臓、骨髄、リンパ節）の細胞内で、約4.5kbの転写産
物として広く発現されることを示した。このことは、免疫系の機能におけるHG52
に関する役割を裏付けるものである。
【００２１】 HG52をコードする本発明の新規DNA配列は、全体的または部分的に、他のDNA配
列（すなわち、HG52が天然では結合していないDNA配列）に結合して、HG52を含
有する「組換えDNA分子」を形成していてもよい。HG52の組換え発現を指令する
ために、本発明の新規DNA配列をベクター内に挿入することができる。そのよう
なベクターはDNAまたはRNAを含みうる。ほとんどの目的には、DNAベクターが好
ましい。典型的なベクターには、プラスミド、修飾されたウイルス、バクテリオ
ファージ、コスミド、酵母人工染色体、およびHG52をコードしうるエピソームま
たは組込みDNAの他の形態が含まれる。当業者は、特定の用途に適したベクター
を容易に決定することができる。
列（すなわち、HG52が天然では結合していないDNA配列）に結合して、HG52を含
有する「組換えDNA分子」を形成していてもよい。HG52の組換え発現を指令する
ために、本発明の新規DNA配列をベクター内に挿入することができる。そのよう
なベクターはDNAまたはRNAを含みうる。ほとんどの目的には、DNAベクターが好
ましい。典型的なベクターには、プラスミド、修飾されたウイルス、バクテリオ
ファージ、コスミド、酵母人工染色体、およびHG52をコードしうるエピソームま
たは組込みDNAの他の形態が含まれる。当業者は、特定の用途に適したベクター
を容易に決定することができる。
【００２２】 本発明には、ストリンジェントな条件下で配列番号1にハイブリダイズするcDN
A配列が含まれる。例えば、高いストリンジェンシーの条件を用いる方法は、以
下のとおりであるが、それらに限定されるものではない。DNAを含有するフィル
ターのプレハイブリダイゼーションを、6X SSC、5Xデンハルト液および100μg/m
l変性サケ精子DNAを含むバッファー中、65℃で2時間〜一晩行なう。100μg/ml変
性サケ精子DNAおよび5〜20 X 106cpmの32P標識プローブを含有するプレハイブリ
ダイゼーション混合物中、フィルターを65℃で12〜48時間ハイブリダイズさせる
。2X SSC、0.1％ SDSを含有する溶液中、37℃で1時間、フィルターの洗浄を行な
う。この後、0.1X SSC、0.1％ SDS中、50℃で45分間の洗浄を行ない、ついでオ
ートラジオグラフィーに付す。
A配列が含まれる。例えば、高いストリンジェンシーの条件を用いる方法は、以
下のとおりであるが、それらに限定されるものではない。DNAを含有するフィル
ターのプレハイブリダイゼーションを、6X SSC、5Xデンハルト液および100μg/m
l変性サケ精子DNAを含むバッファー中、65℃で2時間〜一晩行なう。100μg/ml変
性サケ精子DNAおよび5〜20 X 106cpmの32P標識プローブを含有するプレハイブリ
ダイゼーション混合物中、フィルターを65℃で12〜48時間ハイブリダイズさせる
。2X SSC、0.1％ SDSを含有する溶液中、37℃で1時間、フィルターの洗浄を行な
う。この後、0.1X SSC、0.1％ SDS中、50℃で45分間の洗浄を行ない、ついでオ
ートラジオグラフィーに付す。
【００２３】 高いストリンジェンシーの条件を使用する他の方法は、5XSSC、5Xデンハルト
液、50％ホルムアミド中、42℃で12〜48時間行なうハイブリダイゼーション工程
、または0.2X SSPE、0.2％ SDS中、65℃で30〜60分間行なう洗浄工程を含むであ
ろう。
液、50％ホルムアミド中、42℃で12〜48時間行なうハイブリダイゼーション工程
、または0.2X SSPE、0.2％ SDS中、65℃で30〜60分間行なう洗浄工程を含むであ
ろう。
【００２４】 高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションを行なうための前記方法で
挙げた試薬は当技術分野でよく知られている。これらの試薬の組成の詳細は、例
えば、Sambrook, FritschおよびManiatis, 1989, Molecular Cloning: A Labora
tory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている
。前記のもの以外の使用しうる他の高いストリンジェンシー条件は当技術分野で
よく知られている。
挙げた試薬は当技術分野でよく知られている。これらの試薬の組成の詳細は、例
えば、Sambrook, FritschおよびManiatis, 1989, Molecular Cloning: A Labora
tory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている
。前記のもの以外の使用しうる他の高いストリンジェンシー条件は当技術分野で
よく知られている。
【００２５】 遺伝暗号の縮重性のため、2種のアミノ酸を除く全てのアミノ酸に関しては、2
以上のコドンが特定のアミノ酸をコードする。このため、配列番号1のヌクレオ
チド配列とは有意に異なるが配列番号1と同じHG52タンパク質を尚もコードする
合成DNAヌクレオチド配列を有するHG52タンパク質コード化合成DNAの構築が可能
となる。そのような合成DNAは本発明の範囲内にあると意図される。そのような
合成DNAを特定の宿主細胞または生物中で発現させたい場合には、そのような合
成DNAのコドン使用頻度を、その特定の宿主のコドン使用頻度を反映するように
調節して、より高いレベルの、該宿主内でのHG52タンパク質の発現をもたらすこ
とができる。
以上のコドンが特定のアミノ酸をコードする。このため、配列番号1のヌクレオ
チド配列とは有意に異なるが配列番号1と同じHG52タンパク質を尚もコードする
合成DNAヌクレオチド配列を有するHG52タンパク質コード化合成DNAの構築が可能
となる。そのような合成DNAは本発明の範囲内にあると意図される。そのような
合成DNAを特定の宿主細胞または生物中で発現させたい場合には、そのような合
成DNAのコドン使用頻度を、その特定の宿主のコドン使用頻度を反映するように
調節して、より高いレベルの、該宿主内でのHG52タンパク質の発現をもたらすこ
とができる。
【００２６】 本発明のもう1つの態様は、HG52をコードするDNA配列を含有および／または発
現するように操作された宿主細胞を含む。HG52を産生させるために、そのような
組換え宿主細胞を適当な条件下で培養することができる。組換え宿主細胞内でHG
52を発現させるために、HG52をコードするDNAを含有する発現ベクターを使用す
ることができる。組換え宿主細胞は、原核性または真核性であることが可能であ
り、それらには、大腸菌（E. coli）などの細菌、酵母などの真菌細胞、ヒト、
ウシ、ブタ、サルおよびげっ歯類由来の細胞系を含む（これらに限定されるもの
ではない）哺乳類細胞、およびショウジョウバエ（Drosophila）およびカイコに
由来する細胞系を含む（これらに限定されるものではない）昆虫細胞が含まれる
が、これらに限定されるものではない。HG52の組換え発現に適した、哺乳類種に
由来する商業的に入手可能な細胞系には、L細胞L-M(TK-)（ATCC CCL 1.3）、L細
胞L-M（ATCC CCL 1.2）、293（ATCC CRL 1573）、Raji（ATCC CCL 86）、CV-1（
ATCC CCL 70）、COS-1（ATCC CRL 1650）、COS-7（ATCC CRL 1651）、CHO-K1（A
TCC CCL 61）、3T3（ATCC CCL 92）、NIH/3T3（ATCC CRL 1658）、HeLa（ATCC C
CL 2）、C127I（ATCC CRL 1616）、BS-C-1（ATCC CCL 26）およびMRC-5（ATCC C
CL 171）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
現するように操作された宿主細胞を含む。HG52を産生させるために、そのような
組換え宿主細胞を適当な条件下で培養することができる。組換え宿主細胞内でHG
52を発現させるために、HG52をコードするDNAを含有する発現ベクターを使用す
ることができる。組換え宿主細胞は、原核性または真核性であることが可能であ
り、それらには、大腸菌（E. coli）などの細菌、酵母などの真菌細胞、ヒト、
ウシ、ブタ、サルおよびげっ歯類由来の細胞系を含む（これらに限定されるもの
ではない）哺乳類細胞、およびショウジョウバエ（Drosophila）およびカイコに
由来する細胞系を含む（これらに限定されるものではない）昆虫細胞が含まれる
が、これらに限定されるものではない。HG52の組換え発現に適した、哺乳類種に
由来する商業的に入手可能な細胞系には、L細胞L-M(TK-)（ATCC CCL 1.3）、L細
胞L-M（ATCC CCL 1.2）、293（ATCC CRL 1573）、Raji（ATCC CCL 86）、CV-1（
ATCC CCL 70）、COS-1（ATCC CRL 1650）、COS-7（ATCC CRL 1651）、CHO-K1（A
TCC CCL 61）、3T3（ATCC CCL 92）、NIH/3T3（ATCC CRL 1658）、HeLa（ATCC C
CL 2）、C127I（ATCC CRL 1616）、BS-C-1（ATCC CCL 26）およびMRC-5（ATCC C
CL 171）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２７】 ヒト胎児腎（HEK 293）細胞およびチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞は
、大量のGタンパク質を発現するため、HG52タンパク質の発現に特に適している
。したがって、これらのGタンパク質の少なくとも1つは、HG52とそのリガンドと
の相互作用により生成されたシグナルと機能的に共役して、このシグナルを下流
エフェクターに伝達し、最終的には、いくつかのアッセイ可能な成分における、
測定可能な変化（例えば、cAMPレベル、レポーター遺伝子の発現、イノシトール
脂質の加水分解、または細胞内Ca2+レベル）を引き起こしうると考えられる。
、大量のGタンパク質を発現するため、HG52タンパク質の発現に特に適している
。したがって、これらのGタンパク質の少なくとも1つは、HG52とそのリガンドと
の相互作用により生成されたシグナルと機能的に共役して、このシグナルを下流
エフェクターに伝達し、最終的には、いくつかのアッセイ可能な成分における、
測定可能な変化（例えば、cAMPレベル、レポーター遺伝子の発現、イノシトール
脂質の加水分解、または細胞内Ca2+レベル）を引き起こしうると考えられる。
【００２８】 HG52タンパク質の発現に特に適した他の細胞は、アフリカツメガエル（Xenopu
s laevis）からの不死化黒色素胞色素細胞である。他の組換えGPCRの機能的アッ
セイのためのそのような黒色素胞色素細胞の使用（Graminskiら, 1993, J. Biol
. Chem. 268:5957-5964; Lerner, 1994, Trends Neurosci. 17:142-146; Potenz
a ＆ Lerner, 1992, Pigment Cell Res. 5:372-378）と同様にしてHG52の組換え
発現を用いる機能的アッセイに、そのような黒色素胞色素細胞を使用することが
できる。
s laevis）からの不死化黒色素胞色素細胞である。他の組換えGPCRの機能的アッ
セイのためのそのような黒色素胞色素細胞の使用（Graminskiら, 1993, J. Biol
. Chem. 268:5957-5964; Lerner, 1994, Trends Neurosci. 17:142-146; Potenz
a ＆ Lerner, 1992, Pigment Cell Res. 5:372-378）と同様にしてHG52の組換え
発現を用いる機能的アッセイに、そのような黒色素胞色素細胞を使用することが
できる。
【００２９】 哺乳類および他の細胞内で組換えHG52を発現させるためには、種々の哺乳類発
現ベクターを使用することができる。商業的に入手可能な適当な哺乳類発現ベク
ターには、pCR2.1（Invitrogen）、pMC1neo（Stratagene）、pSG5（Stratagene
）、pcDNAIおよびpcDNAIamp、pcDNA3、pcDNA3.1、pCR3.1（Invitrogen）、EBO-p
SV2-neo（ATCC 37593）、pBPV-1(8-2)（ATCC 37110）、pdBPV-MMTneo(342-12）
（ATCC 37224）、pRSVgpt（ATCC 37199）、pRSVneo（ATCC 37198）およびpSV2-d
hfr（ATCC 37146）が含まれるが、これらに限定されるものではない。非哺乳類
細胞内での発現のための種々の適当な発現ベクターが当技術分野において公知で
ある。ベクターの選択は、使用する細胞型、所望の発現レベルなどに左右される
であろう。組換え細胞内での発現後、HG52を、通常の技術により、他のタンパク
質を実質的に含有しないレベルにまで精製することができる。
現ベクターを使用することができる。商業的に入手可能な適当な哺乳類発現ベク
ターには、pCR2.1（Invitrogen）、pMC1neo（Stratagene）、pSG5（Stratagene
）、pcDNAIおよびpcDNAIamp、pcDNA3、pcDNA3.1、pCR3.1（Invitrogen）、EBO-p
SV2-neo（ATCC 37593）、pBPV-1(8-2)（ATCC 37110）、pdBPV-MMTneo(342-12）
（ATCC 37224）、pRSVgpt（ATCC 37199）、pRSVneo（ATCC 37198）およびpSV2-d
hfr（ATCC 37146）が含まれるが、これらに限定されるものではない。非哺乳類
細胞内での発現のための種々の適当な発現ベクターが当技術分野において公知で
ある。ベクターの選択は、使用する細胞型、所望の発現レベルなどに左右される
であろう。組換え細胞内での発現後、HG52を、通常の技術により、他のタンパク
質を実質的に含有しないレベルにまで精製することができる。
【００３０】 本発明は、他のタンパク質を実質的に含有しないHG52タンパク質を含む。完全
長HG52タンパク質のアミノ酸配列を、図２に配列番号2として示す。したがって
、本発明は、配列番号2のアミノ酸配列を有し他のタンパク質を実質的に含有し
ないHG52タンパク質を含む。
長HG52タンパク質のアミノ酸配列を、図２に配列番号2として示す。したがって
、本発明は、配列番号2のアミノ酸配列を有し他のタンパク質を実質的に含有し
ないHG52タンパク質を含む。
【００３１】 多数の受容体タンパク質の場合と同様、HG52のアミノ酸（特に、リガンド結合
ドメイン内に存在しないアミノ酸）の多数を修飾し、それでもなお、元の受容体
と実質的に同じ生物活性を保有させることが可能である。したがって、本発明は
、アミノ酸の欠失、付加または置換を有するが天然HG52と実質的に同じ生物活性
を依然として保有する修飾HG52ポリペプチドを含む。単一のアミノ酸の置換は通
常はタンパク質の生物活性を改変しないことが、一般に認められている（例えば
、Molecular Biology of the Gene, Watsonら, 1987, 第4版, The Benjamin/Cum
mings Publishing Co., Inc., p.226; およびCunningham ＆ Wells, 1989, Scie
nce 244:1081-1085を参照されたい）。したがって、本発明は、配列番号2におい
て1つのアミノ酸置換が施されておりHG52と実質的に同じ生物活性を依然として
保有するポリペプチドを含む。本発明はまた、配列番号2において2以上のアミノ
酸置換が施されておりHG52と実質的に同じ生物活性を依然として保有するポリペ
プチドを含む。特に、本発明は、前記置換が同類置換である実施形態を含む。特
に、本発明は、前記置換がHG52のリガンド結合ドメイン内に存在しない実施形態
を含む。
ドメイン内に存在しないアミノ酸）の多数を修飾し、それでもなお、元の受容体
と実質的に同じ生物活性を保有させることが可能である。したがって、本発明は
、アミノ酸の欠失、付加または置換を有するが天然HG52と実質的に同じ生物活性
を依然として保有する修飾HG52ポリペプチドを含む。単一のアミノ酸の置換は通
常はタンパク質の生物活性を改変しないことが、一般に認められている（例えば
、Molecular Biology of the Gene, Watsonら, 1987, 第4版, The Benjamin/Cum
mings Publishing Co., Inc., p.226; およびCunningham ＆ Wells, 1989, Scie
nce 244:1081-1085を参照されたい）。したがって、本発明は、配列番号2におい
て1つのアミノ酸置換が施されておりHG52と実質的に同じ生物活性を依然として
保有するポリペプチドを含む。本発明はまた、配列番号2において2以上のアミノ
酸置換が施されておりHG52と実質的に同じ生物活性を依然として保有するポリペ
プチドを含む。特に、本発明は、前記置換が同類置換である実施形態を含む。特
に、本発明は、前記置換がHG52のリガンド結合ドメイン内に存在しない実施形態
を含む。
【００３２】 HG52の機能的等価体であるポリペプチドを産生させるためにHG52のどのアミノ
酸残基を置換することができるかを決定する場合には、当業者は、HG52のアミノ
酸配列と関連タンパク質 [例えば、ヒトトロンビン受容体（Vuら, 1991, Cell 6
4:1057-1068; Ishiharaら, 1997, Nature 386:502-506、および本出願の図５を
参照されたい）]のアミノ酸配列との比較を指針とするであろう。そのような比
較は、当業者が、HG52と該関連タンパク質との間で高度に保存された領域内に施
すアミノ酸置換の数を最小にすることを可能にするであろう。したがって、本発
明は、該置換が同類的であり、HG52とヒトトロンビン受容体1とが同一アミノ酸
を共有する位置には該置換が存在しない実施形態を含む（図５を参照されたい）
。
酸残基を置換することができるかを決定する場合には、当業者は、HG52のアミノ
酸配列と関連タンパク質 [例えば、ヒトトロンビン受容体（Vuら, 1991, Cell 6
4:1057-1068; Ishiharaら, 1997, Nature 386:502-506、および本出願の図５を
参照されたい）]のアミノ酸配列との比較を指針とするであろう。そのような比
較は、当業者が、HG52と該関連タンパク質との間で高度に保存された領域内に施
すアミノ酸置換の数を最小にすることを可能にするであろう。したがって、本発
明は、該置換が同類的であり、HG52とヒトトロンビン受容体1とが同一アミノ酸
を共有する位置には該置換が存在しない実施形態を含む（図５を参照されたい）
。
【００３３】 また、当業者は、アミノ酸の小さな欠失または挿入であるHG52アミノ酸配列か
らの変化を有しHG52の機能的等価体であるポリペプチドもまた、同じ指針（すな
わち、HG52と関連タンパク質との間のアミノ酸配列における相違を最小にするこ
と）に従うことにより産生されうると認識するであろう。小さな欠失または挿入
は、一般には、約1〜5アミノ酸の範囲である。該修飾HG52ポリペプチドの生物活
性に対するそのような小さな欠失または挿入の効果は、ポリペプチドを合成的に
産生することにより、あるいはHG52をコードするDNA内に必要な変化を施し次い
で該DNAを組換え的に発現させ該組換え発現により産生されたタンパク質をアッ
セイすることにより、容易にアッセイすることができる。
らの変化を有しHG52の機能的等価体であるポリペプチドもまた、同じ指針（すな
わち、HG52と関連タンパク質との間のアミノ酸配列における相違を最小にするこ
と）に従うことにより産生されうると認識するであろう。小さな欠失または挿入
は、一般には、約1〜5アミノ酸の範囲である。該修飾HG52ポリペプチドの生物活
性に対するそのような小さな欠失または挿入の効果は、ポリペプチドを合成的に
産生することにより、あるいはHG52をコードするDNA内に必要な変化を施し次い
で該DNAを組換え的に発現させ該組換え発現により産生されたタンパク質をアッ
セイすることにより、容易にアッセイすることができる。
【００３４】 本発明はまた、HG52のC末端トランケート化形態（特に、該受容体の細胞外部
分を含むが該受容体の細胞内シグナリング部分を欠くもの）を含む。そのような
トランケート化受容体は、本明細書に記載の種々の結合アッセイにおいて、結晶
化研究に、および構造-活性相関研究に有用である。
分を含むが該受容体の細胞内シグナリング部分を欠くもの）を含む。そのような
トランケート化受容体は、本明細書に記載の種々の結合アッセイにおいて、結晶
化研究に、および構造-活性相関研究に有用である。
【００３５】 いくつかの場合には、受容体の機能を抑制するために、受容体タンパク質の膜
伸長領域を使用しうることが判明した（Ngら, 1996, Biochem. Biophys. Res. C
omm. 227:200-204; Hebertら, 1996, J. Biol. Chem. 271:16384-16392; Lofts
ら, Oncogene 8:2813-2820）。したがって、本発明は、HG52の7個の膜伸長領域
に由来するペプチド、およびHG52の機能を抑制するためのその使用を提供する。
そのようなペプチドは、該受容体膜伸長ドメインの全部または一部を含みうる。
そのようなペプチドとしては、配列番号2のアミノ酸残基31〜49、61〜82および9
8〜119を含有するペプチドが挙げられる。
伸長領域を使用しうることが判明した（Ngら, 1996, Biochem. Biophys. Res. C
omm. 227:200-204; Hebertら, 1996, J. Biol. Chem. 271:16384-16392; Lofts
ら, Oncogene 8:2813-2820）。したがって、本発明は、HG52の7個の膜伸長領域
に由来するペプチド、およびHG52の機能を抑制するためのその使用を提供する。
そのようなペプチドは、該受容体膜伸長ドメインの全部または一部を含みうる。
そのようなペプチドとしては、配列番号2のアミノ酸残基31〜49、61〜82および9
8〜119を含有するペプチドが挙げられる。
【００３６】 本発明はまた、キメラHG52タンパク質を含む。キメラHG52タンパク質は、非HG
52タンパク質のポリペプチド配列にインフレームで融合したHG52の連続的ポリペ
プチド配列よりなる。
52タンパク質のポリペプチド配列にインフレームで融合したHG52の連続的ポリペ
プチド配列よりなる。
【００３７】 本発明はまた、多量体構造の形態（例えば、二量体）であるHG52タンパク質を
含む。他のGタンパク質共役型受容体のそのような多量体は公知である（Hebert
ら, 1996, J. Biol. Chem. 271, 16384-16392; Ngら, 1996, Biochem. Biophys.
Res. Comm. 227, 200-204; Romanoら, 1996, J. Biol. Chem. 271, 28612-2861
6）。
含む。他のGタンパク質共役型受容体のそのような多量体は公知である（Hebert
ら, 1996, J. Biol. Chem. 271, 16384-16392; Ngら, 1996, Biochem. Biophys.
Res. Comm. 227, 200-204; Romanoら, 1996, J. Biol. Chem. 271, 28612-2861
6）。
【００３８】 本発明はまた、単離された形態のHG52タンパク質を含む。
【００３９】 本発明は、HG52タンパク質に特異的に結合する化合物を同定する方法、および
そのような方法により同定された化合物を含む。HG52に親和性を示す化合物の結
合の特異性は、該クローン化受容体を発現する組換え細胞に対する又はそれらの
細胞からの膜に対する該化合物の親和性を測定することにより示される。該クロ
ーン化受容体の発現、およびHG52受容体に結合する化合物に関する、またはこれ
らの細胞またはこれらの細胞から調製された膜に対するHG52の公知放射能標識リ
ガンドの結合を阻害する化合物に関するスクリーニングは、HG52に対して高い親
和性を有する化合物の迅速な選択のための有効な方法を与える。そのようなリガ
ンドは、必ずしも放射能標識される必要はないが、結合放射能標識化合物を置換
するために使用しうる又は機能的アッセイにおけるアクチベーターとして使用し
うる非同位体化合物であってもよい。前記方法により同定された化合物は、HG52
のアゴニストまたはアンタゴニストであると考えられ、ペプチド、タンパク質ま
たは非タンパク質性有機分子でありうる。
そのような方法により同定された化合物を含む。HG52に親和性を示す化合物の結
合の特異性は、該クローン化受容体を発現する組換え細胞に対する又はそれらの
細胞からの膜に対する該化合物の親和性を測定することにより示される。該クロ
ーン化受容体の発現、およびHG52受容体に結合する化合物に関する、またはこれ
らの細胞またはこれらの細胞から調製された膜に対するHG52の公知放射能標識リ
ガンドの結合を阻害する化合物に関するスクリーニングは、HG52に対して高い親
和性を有する化合物の迅速な選択のための有効な方法を与える。そのようなリガ
ンドは、必ずしも放射能標識される必要はないが、結合放射能標識化合物を置換
するために使用しうる又は機能的アッセイにおけるアクチベーターとして使用し
うる非同位体化合物であってもよい。前記方法により同定された化合物は、HG52
のアゴニストまたはアンタゴニストであると考えられ、ペプチド、タンパク質ま
たは非タンパク質性有機分子でありうる。
【００４０】 したがって、本発明は、HG52のアゴニストおよびアンタゴニストを同定しうる
アッセイを含む。他の受容体のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するため
の方法は、当技術分野においてよく知られており、HG52のアゴニストおよびアン
タゴニストの同定に応用されうる。したがって、本発明は、ある物質がHG52の潜
在的アゴニストまたはアンタゴニストであるか否かを判定するための方法であっ
て、 （a）HG52をコードする発現ベクターで細胞をトランスフェクトし、 （b）HG52が発現されるのを可能にするのに十分な時間、該トランスフェク
ト化細胞を培養し、 （c）該物質の存在下および不存在下、HG52の標識リガンドに該細胞をさら
し、 （d）該物質の存在下および不存在下におけるHG52に対する該標識リガンド
の結合を測定することを含んでなり、 該標識リガンドの結合の量が該物質の不存在下より該物質の存在下において
少ない場合、該物質がHG52の潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストであるこ
とを特徴とする方法を含む。
アッセイを含む。他の受容体のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するため
の方法は、当技術分野においてよく知られており、HG52のアゴニストおよびアン
タゴニストの同定に応用されうる。したがって、本発明は、ある物質がHG52の潜
在的アゴニストまたはアンタゴニストであるか否かを判定するための方法であっ
て、 （a）HG52をコードする発現ベクターで細胞をトランスフェクトし、 （b）HG52が発現されるのを可能にするのに十分な時間、該トランスフェク
ト化細胞を培養し、 （c）該物質の存在下および不存在下、HG52の標識リガンドに該細胞をさら
し、 （d）該物質の存在下および不存在下におけるHG52に対する該標識リガンド
の結合を測定することを含んでなり、 該標識リガンドの結合の量が該物質の不存在下より該物質の存在下において
少ない場合、該物質がHG52の潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストであるこ
とを特徴とする方法を含む。
【００４１】 該方法の工程（c）を行なう条件は、タンパク質-リガンド相互作用の研究のた
めに当技術分野で典型的に用いられる条件（例えば、生理的pH；例えば、PBSな
どの一般に使用されるバッファーに典型的な又は組織培養培地における塩条件；
約4℃〜約55℃の温度）である。
めに当技術分野で典型的に用いられる条件（例えば、生理的pH；例えば、PBSな
どの一般に使用されるバッファーに典型的な又は組織培養培地における塩条件；
約4℃〜約55℃の温度）である。
【００４２】 本発明はまた、ある物質がHG52に結合する能力を有するか否か（すなわち、該
物質がHG52の潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストであるか否か）を判定す
るための方法であって、 （a）細胞内でHG52の発現を指令する発現ベクターで該細胞をトランスフェ
クトすることにより、試験細胞を準備し、 （b）該物質に該試験細胞をさらし、 （c）HG52に対する該物質の結合の量を測定し、 （d）該試験細胞におけるHG52に対する該物質の結合の量を、HG52でトラン
スフェクトされていない対照細胞に対する該物質の結合の量と比較することを含
んでなり、 該物質の結合の量が、該対照細胞と比較して該試験細胞において多い場合、
該物質がHG52に結合する能力を有することを特徴とする方法を含む。ついで、例
えば後記の乱交性（promiscuous）Gタンパク質の使用を含むアッセイなどの機能
的アッセイを用いることにより、該物質が実際にアゴニストまたはアンタゴニス
トであるか否かの判定を行うことができる。
物質がHG52の潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストであるか否か）を判定す
るための方法であって、 （a）細胞内でHG52の発現を指令する発現ベクターで該細胞をトランスフェ
クトすることにより、試験細胞を準備し、 （b）該物質に該試験細胞をさらし、 （c）HG52に対する該物質の結合の量を測定し、 （d）該試験細胞におけるHG52に対する該物質の結合の量を、HG52でトラン
スフェクトされていない対照細胞に対する該物質の結合の量と比較することを含
んでなり、 該物質の結合の量が、該対照細胞と比較して該試験細胞において多い場合、
該物質がHG52に結合する能力を有することを特徴とする方法を含む。ついで、例
えば後記の乱交性（promiscuous）Gタンパク質の使用を含むアッセイなどの機能
的アッセイを用いることにより、該物質が実際にアゴニストまたはアンタゴニス
トであるか否かの判定を行うことができる。
【００４３】 該方法の工程（b）を行なう条件は、タンパク質-リガンド相互作用の研究のた
めに当技術分野で典型的に用いられる条件（例えば、生理的pH；例えば、PBSな
どの一般に使用されるバッファーに典型的な又は組織培養培地における塩条件；
約4℃〜約55℃の温度）である。
めに当技術分野で典型的に用いられる条件（例えば、生理的pH；例えば、PBSな
どの一般に使用されるバッファーに典型的な又は組織培養培地における塩条件；
約4℃〜約55℃の温度）である。
【００４４】 前記方法の特定の実施形態においては、該細胞は真核細胞である。もう1つの
実施形態においては、該細胞は哺乳類細胞である。他の実施形態においては、該
細胞は、L細胞L-M(TK-)（ATCC CCL 1.3）、L細胞L-M（ATCC CCL 1.2）、293（AT
CC CRL 1573）、Raji（ATCC CCL 86）、CV-1（ATCC CCL 70）、COS-1（ATCC CRL
1650）、COS-7（ATCC CRL 1651）、CHO-K1（ATCC CCL 61）、3T3（ATCC CCL 92
）、NIH/3T3（ATCC CRL 1658）、HeLa（ATCC CCL 2）、C127I（ATCC CRL 1616）
、BS-C-1（ATCC CCL 26）およびMRC-5（ATCC CCL 171）である。
実施形態においては、該細胞は哺乳類細胞である。他の実施形態においては、該
細胞は、L細胞L-M(TK-)（ATCC CCL 1.3）、L細胞L-M（ATCC CCL 1.2）、293（AT
CC CRL 1573）、Raji（ATCC CCL 86）、CV-1（ATCC CCL 70）、COS-1（ATCC CRL
1650）、COS-7（ATCC CRL 1651）、CHO-K1（ATCC CCL 61）、3T3（ATCC CCL 92
）、NIH/3T3（ATCC CRL 1658）、HeLa（ATCC CCL 2）、C127I（ATCC CRL 1616）
、BS-C-1（ATCC CCL 26）およびMRC-5（ATCC CCL 171）である。
【００４５】 前記のアッセイは、HG52で一過性または安定にトランスフェクトされた細胞を
使用して行なうことができる。トランスフェクションは、HG52を該試験細胞内に
導入するための当技術分野で公知の任意の方法を包含する意である。例えば、ト
ランスフェクションには、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウムに媒介される
トランスフェクション、リポフェクション、HG52を含有するレトロウイルス構築
物の感染およびエレクトロポレーションが含まれる。
使用して行なうことができる。トランスフェクションは、HG52を該試験細胞内に
導入するための当技術分野で公知の任意の方法を包含する意である。例えば、ト
ランスフェクションには、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウムに媒介される
トランスフェクション、リポフェクション、HG52を含有するレトロウイルス構築
物の感染およびエレクトロポレーションが含まれる。
【００４６】 HG52に対する該物質またはアゴニストの結合を測定する場合には、標識された
物質またはアゴニストを使用することにより、そのような結合を測定することが
できる。該物質またはアゴニストは、当技術分野で公知の任意の簡便な方法で（
例えば、放射能、蛍光、酵素により）標識することができる。
物質またはアゴニストを使用することにより、そのような結合を測定することが
できる。該物質またはアゴニストは、当技術分野で公知の任意の簡便な方法で（
例えば、放射能、蛍光、酵素により）標識することができる。
【００４７】 前記方法の特定の実施形態においては、HG52は配列番号2のアミノ酸配列を有
する。
する。
【００４８】 前記方法を修飾することが可能であり、この場合、該試験細胞を該物質にさら
す代わりに、該試験細胞から膜を調製し、それらの膜を該物質にさらすことがで
きる。細胞の代わりに膜を使用するそのような修飾は、当技術分野でよく知られ
ており、例えば、Hessら, 1992, Biochem. Biophys. Res. Comm. 184:260-268に
記載されている。
す代わりに、該試験細胞から膜を調製し、それらの膜を該物質にさらすことがで
きる。細胞の代わりに膜を使用するそのような修飾は、当技術分野でよく知られ
ており、例えば、Hessら, 1992, Biochem. Biophys. Res. Comm. 184:260-268に
記載されている。
【００４９】 したがって、本発明は、ある物質がHG52に結合する能力を有するか否かを判定
するための方法であって、 （a）細胞内でHG52の発現を指令する発現ベクターで該細胞をトランスフェ
クトすることにより、試験細胞を準備し、 （b）該試験細胞から、HG52を含有する膜を調製し、該リガンドが該膜内のH
G52に結合する条件下で該膜をHG52のリガンドにさらし、 （c）工程（b）の後またはそれと同時に、該試験細胞からの膜を物質にさら
し、 （d）該物質の存在下および不存在下、該膜内のHG52に対する該リガンドの
結合の量を測定し、 （e）該物質の存在下および不存在下における該膜内のHG52に対する該リガ
ンドの結合の量を比較することを含んでなり、 該物質の存在下における該膜内のHG52に対する該リガンドの結合の量の減少
が、該物質がHG52に結合する能力を有することを示し、 HG52が配列番号2のアミノ酸配列を有することを特徴とする方法を提供する
。
するための方法であって、 （a）細胞内でHG52の発現を指令する発現ベクターで該細胞をトランスフェ
クトすることにより、試験細胞を準備し、 （b）該試験細胞から、HG52を含有する膜を調製し、該リガンドが該膜内のH
G52に結合する条件下で該膜をHG52のリガンドにさらし、 （c）工程（b）の後またはそれと同時に、該試験細胞からの膜を物質にさら
し、 （d）該物質の存在下および不存在下、該膜内のHG52に対する該リガンドの
結合の量を測定し、 （e）該物質の存在下および不存在下における該膜内のHG52に対する該リガ
ンドの結合の量を比較することを含んでなり、 該物質の存在下における該膜内のHG52に対する該リガンドの結合の量の減少
が、該物質がHG52に結合する能力を有することを示し、 HG52が配列番号2のアミノ酸配列を有することを特徴とする方法を提供する
。
【００５０】 本発明は、ある物質がHG52に結合する能力を有するか否かを判定するための方
法であって、 （a）細胞内でHG52の発現を指令する発現ベクターで該細胞をトランスフェ
クトすることにより、試験細胞を準備し、 （b）該試験細胞から、HG52を含有する膜を調製し、該試験細胞からの膜を
該物質にさらし、 （c）該試験細胞からの膜内のHG52に対する該物質の結合の量を測定し、 （d）該試験細胞からの膜内のHG52に対する該物質の結合の量を、HG52でト
ランスフェクトされていない対照細胞からの膜に対する該物質の結合の量と比較
することを含んでなり、 HG52が配列番号2のアミノ酸配列を有し、 該試験細胞からの膜内のHG52に対する該物質の結合の量が、該対照細胞から
の膜に対する該物質の結合の量より多い場合、該物質がHG52に結合する能力を有
することを特徴とする方法を提供する。
法であって、 （a）細胞内でHG52の発現を指令する発現ベクターで該細胞をトランスフェ
クトすることにより、試験細胞を準備し、 （b）該試験細胞から、HG52を含有する膜を調製し、該試験細胞からの膜を
該物質にさらし、 （c）該試験細胞からの膜内のHG52に対する該物質の結合の量を測定し、 （d）該試験細胞からの膜内のHG52に対する該物質の結合の量を、HG52でト
ランスフェクトされていない対照細胞からの膜に対する該物質の結合の量と比較
することを含んでなり、 HG52が配列番号2のアミノ酸配列を有し、 該試験細胞からの膜内のHG52に対する該物質の結合の量が、該対照細胞から
の膜に対する該物質の結合の量より多い場合、該物質がHG52に結合する能力を有
することを特徴とする方法を提供する。
【００５１】 前記方法のもう1つの修飾として、HG52をコードするRNAを、例えば、バクテリ
オファージT7プロモーターの制御下でHG52を含有するプラスミドを使用するイン
ビトロ転写により調製することが可能であり、HG52を卵母細胞内で発現させるた
めに、該RNAをツメガエル（Xenopus）卵母細胞内にマイクロインジェクションす
ることができる。ついで、該卵母細胞内で発現されたHG52に対する結合に関して
、物質を試験する。あるいは、結合を検出する代わりに、該卵母細胞の電気生理
学的特性に対する該物質の効果を測定することができる。
オファージT7プロモーターの制御下でHG52を含有するプラスミドを使用するイン
ビトロ転写により調製することが可能であり、HG52を卵母細胞内で発現させるた
めに、該RNAをツメガエル（Xenopus）卵母細胞内にマイクロインジェクションす
ることができる。ついで、該卵母細胞内で発現されたHG52に対する結合に関して
、物質を試験する。あるいは、結合を検出する代わりに、該卵母細胞の電気生理
学的特性に対する該物質の効果を測定することができる。
【００５２】 本発明は、HG52に媒介される機能的応答をHG52のアゴニストおよびアンタゴニ
ストが刺激または拮抗する能力により、HG52のアゴニストおよびアンタゴニスト
を同定しうるアッセイを含む。HG52は、Gタンパク質共役型受容体（GPCR）とし
て公知のタンパク質のクラスに属する。GPCRは、リガンドが結合すると細胞膜を
越えてシグナルを伝達する。リガンドが結合したGPCRは、ヘテロ三量体Gタンパ
ク質と相互作用して、Gタンパク質のGαサブユニットをGβおよびGγサブユニッ
トから解離させる。ついで該Gαサブユニットは種々の第2メッセンジャー系を活
性化し続けうる。
ストが刺激または拮抗する能力により、HG52のアゴニストおよびアンタゴニスト
を同定しうるアッセイを含む。HG52は、Gタンパク質共役型受容体（GPCR）とし
て公知のタンパク質のクラスに属する。GPCRは、リガンドが結合すると細胞膜を
越えてシグナルを伝達する。リガンドが結合したGPCRは、ヘテロ三量体Gタンパ
ク質と相互作用して、Gタンパク質のGαサブユニットをGβおよびGγサブユニッ
トから解離させる。ついで該Gαサブユニットは種々の第2メッセンジャー系を活
性化し続けうる。
【００５３】 一般に、ある特定のGPCRは、ある特定のタイプのGタンパク質と共役するにす
ぎない。したがって、該GPCRからの機能的応答を観察するためには、該GPCRを含
有する系内に適当なGタンパク質が存在することを保証する必要がある。しかし
ながら、「乱交性（promiscuous）」の或る種のGタンパク質が存在することが判
明している。これらの乱交性Gタンパク質は、実質的に任意のGPCRと共役して、
それらからの機能的シグナルを伝達するであろう。Offermanns ＆ Simon, 1995,
J. Biol. Chem. 270:15175-15180（Offermanns）を参照されたい。Offermanns
は、多数のGPCRの1つの発現および乱交性Gタンパク質Gα15またはGα16の1つの
発現をもたらす発現ベクターで細胞がトランスフェクトされる系を記載している
。トランスフェクト化細胞にGPCRのアゴニストを加えると、該GCPRは活性化され
、Gα15またはGα16を介して、ホスホリパーゼCのβアイソフォームを活性化し
て、該細胞内のイノシトールリン酸レベルの増加を引き起こすことが可能であっ
た。
ぎない。したがって、該GPCRからの機能的応答を観察するためには、該GPCRを含
有する系内に適当なGタンパク質が存在することを保証する必要がある。しかし
ながら、「乱交性（promiscuous）」の或る種のGタンパク質が存在することが判
明している。これらの乱交性Gタンパク質は、実質的に任意のGPCRと共役して、
それらからの機能的シグナルを伝達するであろう。Offermanns ＆ Simon, 1995,
J. Biol. Chem. 270:15175-15180（Offermanns）を参照されたい。Offermanns
は、多数のGPCRの1つの発現および乱交性Gタンパク質Gα15またはGα16の1つの
発現をもたらす発現ベクターで細胞がトランスフェクトされる系を記載している
。トランスフェクト化細胞にGPCRのアゴニストを加えると、該GCPRは活性化され
、Gα15またはGα16を介して、ホスホリパーゼCのβアイソフォームを活性化し
て、該細胞内のイノシトールリン酸レベルの増加を引き起こすことが可能であっ
た。
【００５４】 したがって、これらの乱交性Gタンパク質をOffermannsの場合と同様に利用す
ることにより、HG52がインビボで共役するGタンパク質が未知であったとしてもH
G52に関する機能的アッセイを設計することが可能である。1つの可能性は、乱交
性Gタンパク質に融合したHG52の細胞外および膜伸長部分を含む融合またはキメ
ラタンパク質を作製することである。そのような融合タンパク質は、該融合タン
パク質のHG52部分に対するリガンドの結合後にシグナルを伝達すると予想される
であろう。したがって、本発明は、HG52のアンタゴニストを同定する方法であっ
て、 （a）C末端において乱交性Gタンパク質に融合したキメラHG52タンパク質を
発現する細胞を準備し、 （b）HG52のアゴニストに該細胞をさらし、 （c）工程（b）の後またはそれと同時に、HG52のアンタゴニストであると疑
われる物質に該細胞をさらし、 （d）該細胞内のイノシトールリン酸のレベルを測定することを含んでなり
、 該物質の不存在下の該細胞内のイノシトールリン酸のレベルと比較した場合
の該物質の存在下の該細胞内のイノシトールリン酸のレベルの減少が、該物質が
HG52のアンタゴニストであることを示すことを特徴とする方法を提供する。
ることにより、HG52がインビボで共役するGタンパク質が未知であったとしてもH
G52に関する機能的アッセイを設計することが可能である。1つの可能性は、乱交
性Gタンパク質に融合したHG52の細胞外および膜伸長部分を含む融合またはキメ
ラタンパク質を作製することである。そのような融合タンパク質は、該融合タン
パク質のHG52部分に対するリガンドの結合後にシグナルを伝達すると予想される
であろう。したがって、本発明は、HG52のアンタゴニストを同定する方法であっ
て、 （a）C末端において乱交性Gタンパク質に融合したキメラHG52タンパク質を
発現する細胞を準備し、 （b）HG52のアゴニストに該細胞をさらし、 （c）工程（b）の後またはそれと同時に、HG52のアンタゴニストであると疑
われる物質に該細胞をさらし、 （d）該細胞内のイノシトールリン酸のレベルを測定することを含んでなり
、 該物質の不存在下の該細胞内のイノシトールリン酸のレベルと比較した場合
の該物質の存在下の該細胞内のイノシトールリン酸のレベルの減少が、該物質が
HG52のアンタゴニストであることを示すことを特徴とする方法を提供する。
【００５５】 HG52と共に乱交性Gタンパク質を用いるもう1つの可能性は、HG52のアゴニスト
を同定する方法であって、 （a）HG52および乱交性Gタンパク質の両方を発現する細胞を準備し、 （b）HG52のアゴニストであると疑われる物質に該細胞をさらし、 （c）該細胞内のイノシトールリン酸のレベルを測定することを含んでなり
、 前記の疑われるアゴニストの不存在下の該細胞内のイノシトールリン酸のレ
ベルと比較した場合の該細胞内のイノシトールリン酸のレベルの増加が、該物質
がHG52のアゴニストであることを示すことを特徴とする方法を含む。
を同定する方法であって、 （a）HG52および乱交性Gタンパク質の両方を発現する細胞を準備し、 （b）HG52のアゴニストであると疑われる物質に該細胞をさらし、 （c）該細胞内のイノシトールリン酸のレベルを測定することを含んでなり
、 前記の疑われるアゴニストの不存在下の該細胞内のイノシトールリン酸のレ
ベルと比較した場合の該細胞内のイノシトールリン酸のレベルの増加が、該物質
がHG52のアゴニストであることを示すことを特徴とする方法を含む。
【００５６】 イノシトールリン酸のレベルは、カルシウムの動員をモニターすることにより
測定することができる。細胞内カルシウムの動員は、典型的には、蛍光染料を使
用して顕微鏡下で全細胞において又はエクオリンアッセイを使用してルミネセン
スにより細胞懸濁液においてアッセイする。
測定することができる。細胞内カルシウムの動員は、典型的には、蛍光染料を使
用して顕微鏡下で全細胞において又はエクオリンアッセイを使用してルミネセン
スにより細胞懸濁液においてアッセイする。
【００５７】 前記方法の特定の実施形態においては、該細胞は真核細胞である。もう1つの
実施形態においては、該細胞は哺乳類細胞である。他の実施形態においては、該
細胞は、L細胞L-M(TK-)（ATCC CCL 1.3）、L細胞L-M（ATCC CCL 1.2）、293（AT
CC CRL 1573）、Raji（ATCC CCL 86）、CV-1（ATCC CCL 70）、COS-1（ATCC CRL
1650）、COS-7（ATCC CRL 1651）、CHO-K1（ATCC CCL 61）、3T3（ATCC CCL 92
）、NIH/3T3（ATCC CRL 1658）、HeLa（ATCC CCL 2）、C127I（ATCC CRL 1616）
、BS-C-1（ATCC CCL 26）またはMRC-5（ATCC CCL 171）である。
実施形態においては、該細胞は哺乳類細胞である。他の実施形態においては、該
細胞は、L細胞L-M(TK-)（ATCC CCL 1.3）、L細胞L-M（ATCC CCL 1.2）、293（AT
CC CRL 1573）、Raji（ATCC CCL 86）、CV-1（ATCC CCL 70）、COS-1（ATCC CRL
1650）、COS-7（ATCC CRL 1651）、CHO-K1（ATCC CCL 61）、3T3（ATCC CCL 92
）、NIH/3T3（ATCC CRL 1658）、HeLa（ATCC CCL 2）、C127I（ATCC CRL 1616）
、BS-C-1（ATCC CCL 26）またはMRC-5（ATCC CCL 171）である。
【００５８】 前記方法の特定の実施形態においては、該細胞内でのHG52および該乱交性Gタ
ンパク質の発現を指令する発現ベクターで該細胞をトランスフェクトする。
ンパク質の発現を指令する発現ベクターで該細胞をトランスフェクトする。
【００５９】 該方法の工程（b）を行なう条件は、タンパク質-リガンド相互作用の研究のた
めに当技術分野で典型的に用いられる条件（例えば、生理的pH；例えば、PBSな
どの一般に使用されるバッファーに典型的な又は組織培養培地における塩条件；
約4℃〜約55℃の温度）である。
めに当技術分野で典型的に用いられる条件（例えば、生理的pH；例えば、PBSな
どの一般に使用されるバッファーに典型的な又は組織培養培地における塩条件；
約4℃〜約55℃の温度）である。
【００６０】 前記方法の特定の実施形態においては、該乱交性Gタンパク質は、Gα15または
Gα16よりなる群から選ばれる。Gα15またはGα16を含有する発現ベクターは当
技術分野において公知である。例えば、Offermanns; Buhlら, 1993, FEBS Lett.
323:132-134; Amatrudaら, 1993, J. Biol. Chem. 268:10139-10144を参照され
たい。
Gα16よりなる群から選ばれる。Gα15またはGα16を含有する発現ベクターは当
技術分野において公知である。例えば、Offermanns; Buhlら, 1993, FEBS Lett.
323:132-134; Amatrudaら, 1993, J. Biol. Chem. 268:10139-10144を参照され
たい。
【００６１】 前記アッセイは、HG52のアンタゴニストを同定する方法を得るために容易に修
飾することができる。また、そのような方法は、本発明の一部であり、 （a）HG52と乱交性Gタンパク質との両方を発現する細胞を準備し、 （b）HG52のアゴニストである物質に該細胞をさらし、 （c）工程（b）の後またはそれと同時に、HG52のアンタゴニストであると疑
われる物質に該細胞をさらし、 （d）該細胞内のイノシトールリン酸のレベルを測定することを含んでなり
、 前記の疑われるアンタゴニストの不存在下の該細胞内のイノシトールリン酸
のレベルと比較した場合の前記の疑われるアンタゴニストの存在下の該細胞内の
イノシトールリン酸のレベルの減少が、該物質がHG52のアンタゴニストであるこ
とを示すことを特徴とする。
飾することができる。また、そのような方法は、本発明の一部であり、 （a）HG52と乱交性Gタンパク質との両方を発現する細胞を準備し、 （b）HG52のアゴニストである物質に該細胞をさらし、 （c）工程（b）の後またはそれと同時に、HG52のアンタゴニストであると疑
われる物質に該細胞をさらし、 （d）該細胞内のイノシトールリン酸のレベルを測定することを含んでなり
、 前記の疑われるアンタゴニストの不存在下の該細胞内のイノシトールリン酸
のレベルと比較した場合の前記の疑われるアンタゴニストの存在下の該細胞内の
イノシトールリン酸のレベルの減少が、該物質がHG52のアンタゴニストであるこ
とを示すことを特徴とする。
【００６２】 前記方法の特定の実施形態においては、該細胞は真核細胞である。もう1つの
実施形態においては、該細胞は哺乳類細胞である。他の実施形態においては、該
細胞は、L細胞L-M(TK-)（ATCC CCL 1.3）、L細胞L-M（ATCC CCL 1.2）、293（AT
CC CRL 1573）、Raji（ATCC CCL 86）、CV-1（ATCC CCL 70）、COS-1（ATCC CRL
1650）、COS-7（ATCC CRL 1651）、CHO-K1（ATCC CCL 61）、3T3（ATCC CCL 92
）、NIH/3T3（ATCC CRL 1658）、HeLa（ATCC CCL 2）、C127I（ATCC CRL 1616）
、BS-C-1（ATCC CCL 26）およびMRC-5（ATCC CCL 171）である。
実施形態においては、該細胞は哺乳類細胞である。他の実施形態においては、該
細胞は、L細胞L-M(TK-)（ATCC CCL 1.3）、L細胞L-M（ATCC CCL 1.2）、293（AT
CC CRL 1573）、Raji（ATCC CCL 86）、CV-1（ATCC CCL 70）、COS-1（ATCC CRL
1650）、COS-7（ATCC CRL 1651）、CHO-K1（ATCC CCL 61）、3T3（ATCC CCL 92
）、NIH/3T3（ATCC CRL 1658）、HeLa（ATCC CCL 2）、C127I（ATCC CRL 1616）
、BS-C-1（ATCC CCL 26）およびMRC-5（ATCC CCL 171）である。
【００６３】 該方法の工程（b）および（c）を行なう条件は、タンパク質-リガンド相互作
用の研究のために当技術分野で典型的に用いられる条件（例えば、生理的pH；例
えば、PBSなどの一般に使用されるバッファーに典型的な又は組織培養培地にお
ける塩条件；約4℃〜約55℃の温度）である。
用の研究のために当技術分野で典型的に用いられる条件（例えば、生理的pH；例
えば、PBSなどの一般に使用されるバッファーに典型的な又は組織培養培地にお
ける塩条件；約4℃〜約55℃の温度）である。
【００６４】 前記方法の特定の実施形態においては、該細胞内でのHG52および該乱交性Gタ
ンパク質の発現を指令する発現ベクターで該細胞をトランスフェクトする。
ンパク質の発現を指令する発現ベクターで該細胞をトランスフェクトする。
【００６５】 前記方法の特定の実施形態においては、該乱交性Gタンパク質は、Gα15または
Gα16よりなる群から選ばれる。
Gα16よりなる群から選ばれる。
【００６６】 前記方法の特定の実施形態においては、HG52は配列番号2のアミノ酸配列を有
する。
する。
【００６７】 前記の方法は、明らかに、ある物質がHG52のアゴニストまたはアンタゴニスト
であるか否かの試験に関するものであるが、そのような方法は、物質の集合体（
例えば、組合せ（combinatorial）ライブラリー）を試験してそのような集合体
のいずれかのメンバーがHG52のアクチベーターまたはインヒビターであるか否か
を判定するのに応用されうることが当業者に明らかであろう。したがって、前記
方法における物質として物質の集合体またはそのような集合体の個々のメンバー
を使用することは本発明の範囲内に含まれる。
であるか否かの試験に関するものであるが、そのような方法は、物質の集合体（
例えば、組合せ（combinatorial）ライブラリー）を試験してそのような集合体
のいずれかのメンバーがHG52のアクチベーターまたはインヒビターであるか否か
を判定するのに応用されうることが当業者に明らかであろう。したがって、前記
方法における物質として物質の集合体またはそのような集合体の個々のメンバー
を使用することは本発明の範囲内に含まれる。
【００６８】 前記方法により同定されたHG52のアゴニストおよびアンタゴニストは、HG52の
不適当な発現を伴う疾患の治療において有用性を有するはずである。特に、HG52
の発現パターンを考えると（図４を参照されたい）、そのようなアゴニストおよ
びアンタゴニストは、種々の免疫系障害または例えば関節炎、喘息、狼瘡などの
炎症を伴う障害の治療において有用性を有するはずである。そのようなアゴニス
トおよびアンタゴニストはまた、種々の感染症の治療において有用であるはずで
ある。
不適当な発現を伴う疾患の治療において有用性を有するはずである。特に、HG52
の発現パターンを考えると（図４を参照されたい）、そのようなアゴニストおよ
びアンタゴニストは、種々の免疫系障害または例えば関節炎、喘息、狼瘡などの
炎症を伴う障害の治療において有用性を有するはずである。そのようなアゴニス
トおよびアンタゴニストはまた、種々の感染症の治療において有用であるはずで
ある。
【００６９】 HG52とトロンビン受容体との類似性を考えると、HG52のアゴニストおよびアン
タゴニストは薬理学的活性を有し、したがってトロンビン受容体のアゴニストお
よびアンタゴニストが有用であるのと同様に（すなわち、トロンビンの効果のモ
ジュレーターとして）有用であると予想される。したがって、HG52のアゴニスト
およびアンタゴニストは、血漿中のフィブリノーゲンからフィブリンへの変換、
凝固因子V、VIII、XIIIおよびプロテインCの活性化、血小板および内皮細胞の凝
固促進性機能、血小板活性化の刺激、単球およびリンパ球の化学走性、リンパ球
および間葉細胞（例えば血管平滑筋細胞、繊維芽細胞および上皮細胞）の有糸分
裂生起のモジュレーションにおける有用性を有すると考えられる。
タゴニストは薬理学的活性を有し、したがってトロンビン受容体のアゴニストお
よびアンタゴニストが有用であるのと同様に（すなわち、トロンビンの効果のモ
ジュレーターとして）有用であると予想される。したがって、HG52のアゴニスト
およびアンタゴニストは、血漿中のフィブリノーゲンからフィブリンへの変換、
凝固因子V、VIII、XIIIおよびプロテインCの活性化、血小板および内皮細胞の凝
固促進性機能、血小板活性化の刺激、単球およびリンパ球の化学走性、リンパ球
および間葉細胞（例えば血管平滑筋細胞、繊維芽細胞および上皮細胞）の有糸分
裂生起のモジュレーションにおける有用性を有すると考えられる。
【００７０】 本発明は、HG52のアゴニストおよびアンタゴニストを含んでなる医薬組成物を
含む。一般には、該アゴニストおよびアンタゴニストを医薬上許容される担体と
組合せて、医薬組成物を得る。アゴニストおよびアンタゴニストと担体とを含有
する医薬組成物の製剤化のそのような担体および方法の具体例は、Remington’s
Pharmaceutical Sciencesに記載されている。有効な投与に適した医薬上許容さ
れる組成物を形成させるためには、そのような組成物は、該アゴニストおよびア
ンタゴニストの治療的に有効な量を含有するであろう。
含む。一般には、該アゴニストおよびアンタゴニストを医薬上許容される担体と
組合せて、医薬組成物を得る。アゴニストおよびアンタゴニストと担体とを含有
する医薬組成物の製剤化のそのような担体および方法の具体例は、Remington’s
Pharmaceutical Sciencesに記載されている。有効な投与に適した医薬上許容さ
れる組成物を形成させるためには、そのような組成物は、該アゴニストおよびア
ンタゴニストの治療的に有効な量を含有するであろう。
【００７１】 治療用または予防用組成物は、HG52の活性が異常である状態を治療または予防
するのに十分な量で個体に投与する。該有効量は、個体の状態、体重、性別、年
齢などの種々の因子によって様々となりうる。他の因子には、投与様式が含まれ
る。熟練した医師であれば、適当な量を決定することが可能である。
するのに十分な量で個体に投与する。該有効量は、個体の状態、体重、性別、年
齢などの種々の因子によって様々となりうる。他の因子には、投与様式が含まれ
る。熟練した医師であれば、適当な量を決定することが可能である。
【００７２】 組成物は、単独で適当な投与量で使用することができる。あるいは、他の物質
の同時投与または連続的投与が望ましいことがある。
の同時投与または連続的投与が望ましいことがある。
【００７３】 該組成物は、通常の投与用ビヒクル中の多種多様な治療用剤形で投与すること
ができる。例えば、該組成物は、錠剤、カプセル剤（それぞれは時限放出（time
d release）および徐放製剤を含む）、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チ
ンキ剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、乳剤などの経口剤形として又は注射により
投与することができる。同様に、それらを、静脈内（ボーラスおよび注入の両方
）、腹腔内、皮下、局所（閉塞（occlusion）の存在下または不存在下）または
筋肉内形態として投与することも可能であり、それらはすべて、薬学分野の当業
者によく知られた形態を用いることが可能である。
ができる。例えば、該組成物は、錠剤、カプセル剤（それぞれは時限放出（time
d release）および徐放製剤を含む）、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チ
ンキ剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、乳剤などの経口剤形として又は注射により
投与することができる。同様に、それらを、静脈内（ボーラスおよび注入の両方
）、腹腔内、皮下、局所（閉塞（occlusion）の存在下または不存在下）または
筋肉内形態として投与することも可能であり、それらはすべて、薬学分野の当業
者によく知られた形態を用いることが可能である。
【００７４】 組成物を単回1日量で投与したり、あるいは合計1日量を2、3または4分割量で
毎日投与するのが有利かもしれない。さらに、組成物は、適当な鼻腔内ビヒクル
の局所的使用により鼻腔内形態で、または当業者によく知られた経皮皮膚パッチ
の形態を使用して経皮経路により投与することができる。もちろん、経皮デリバ
リーシステムの形態で投与する場合には、該投与量の投与は、該投与計画の全体
にわたり、断続的なものではなく連続的なものとなるであろう。
毎日投与するのが有利かもしれない。さらに、組成物は、適当な鼻腔内ビヒクル
の局所的使用により鼻腔内形態で、または当業者によく知られた経皮皮膚パッチ
の形態を使用して経皮経路により投与することができる。もちろん、経皮デリバ
リーシステムの形態で投与する場合には、該投与量の投与は、該投与計画の全体
にわたり、断続的なものではなく連続的なものとなるであろう。
【００７５】 該組成物を使用する投与計画は、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別および
医学的状態；治療する状態の重症度；投与経路；患者の腎、肝および心臓血管機
能；および使用するその個々の組成物を含む種々の因子に応じて選択される。通
常の技量を有する医師は、該状態の進行の予防、阻止または停止に必要な組成物
の有効量を容易に決定し、処方することができる。毒性を伴うことなく効力を与
える範囲内の組成物濃度を最適に正確に得るためには、標的部位に対する該組成
物のアベイラビリティーの速度論に基づく計画が必要である。これは、組成物の
分布、平衡および排泄に関する考慮を含む。
医学的状態；治療する状態の重症度；投与経路；患者の腎、肝および心臓血管機
能；および使用するその個々の組成物を含む種々の因子に応じて選択される。通
常の技量を有する医師は、該状態の進行の予防、阻止または停止に必要な組成物
の有効量を容易に決定し、処方することができる。毒性を伴うことなく効力を与
える範囲内の組成物濃度を最適に正確に得るためには、標的部位に対する該組成
物のアベイラビリティーの速度論に基づく計画が必要である。これは、組成物の
分布、平衡および排泄に関する考慮を含む。
【００７６】 本発明はまた、組換え系内でHG52を発現させ、ついでその組換え発現されたHG
52をカウンター（対抗）スクリーニングに使用する方法を含む。標的受容体と特
異的に相互作用する潜在的医薬を同定するために化合物をスクリーニングする場
合には、同定される化合物が該標的受容体に対して可能な限り特異的であること
を保証する必要がある。これを行なうためには、該標的受容体に類似した可能な
限り多種多様な受容体に対して化合物をスクリーニングする必要がある。例えば
、受容体Aと相互作用する潜在的医薬である化合物を見出すためには、該化合物
が受容体A（「プラス標的」）と相互作用し受容体Aを介して所望の薬理学的効果
を与えることを保証する必要があるばかりでなく、該化合物が受容体B、C、Dな
ど（「マイナス標的」）とは相互作用しないことを確認する必要もある。一般に
、スクリーニング計画の一部として、可能な限り多数のマイナス標的を有するこ
とが重要である（Hodgson, 1992, Bio/Technology 10:973-980、980頁を参照さ
れたい）。したがって、HG52タンパク質、およびHG52タンパク質をコードするDN
Aは、カウンタースクリーニングにおいて有用である。すなわち、それらは、他
のGタンパク質共役型受容体と特異的に相互作用する化合物を同定するよう設計
されたスクリーニング計画に関連したカウンタースクリーニングにおいて、「マ
イナス標的」として使用することができる。
52をカウンター（対抗）スクリーニングに使用する方法を含む。標的受容体と特
異的に相互作用する潜在的医薬を同定するために化合物をスクリーニングする場
合には、同定される化合物が該標的受容体に対して可能な限り特異的であること
を保証する必要がある。これを行なうためには、該標的受容体に類似した可能な
限り多種多様な受容体に対して化合物をスクリーニングする必要がある。例えば
、受容体Aと相互作用する潜在的医薬である化合物を見出すためには、該化合物
が受容体A（「プラス標的」）と相互作用し受容体Aを介して所望の薬理学的効果
を与えることを保証する必要があるばかりでなく、該化合物が受容体B、C、Dな
ど（「マイナス標的」）とは相互作用しないことを確認する必要もある。一般に
、スクリーニング計画の一部として、可能な限り多数のマイナス標的を有するこ
とが重要である（Hodgson, 1992, Bio/Technology 10:973-980、980頁を参照さ
れたい）。したがって、HG52タンパク質、およびHG52タンパク質をコードするDN
Aは、カウンタースクリーニングにおいて有用である。すなわち、それらは、他
のGタンパク質共役型受容体と特異的に相互作用する化合物を同定するよう設計
されたスクリーニング計画に関連したカウンタースクリーニングにおいて、「マ
イナス標的」として使用することができる。
【００７７】 本発明のDNAまたは該DNAに基づくハイブリダイゼーションプローブは、HG52遺
伝子の又はHG52関連タンパク質をコードする遺伝子の染色体位置を同定するため
の染色体マッピング研究において使用することができる。そのようなマッピング
研究は、よく知られた遺伝的および／または染色体マッピング技術、例えば、公
知染色体マーカーに関する連鎖解析またはin situハイブリダイゼーションを用
いて行うことができる。例えば、Vermaら, 1988, Human Chromosomes: A Manual
of Basic Techniques, Pergamon Press, New York, NYを参照されたい。HG52遺
伝子またはHG52関連タンパク質をコードする遺伝子の染色体位置を同定した後、
この情報を、遺伝地図データ（例えば、the Genome Issue of Science (1994, 2
65:1981-2144)に記載のデータ）に含まれる公知疾患原因遺伝子の位置と比較す
ることができる。このようにして、HG52遺伝子の又はHG52関連タンパク質をコー
ドする遺伝子の染色体位置を公知疾患原因遺伝子の位置と相関させることができ
、したがって、そのような疾患原因遺伝子を含有するDNA領域を限定するのに役
立ちうる。これは、そのような疾患原因遺伝子をクローニングする方法を単純化
するであろう。また、HG52遺伝子の又はHG52関連タンパク質をコードする遺伝子
の染色体位置と公知疾患原因遺伝子の位置との連鎖が確認されたら、その連鎖を
診断に用いて、該HG52遺伝子またはHG52関連タンパク質をコードする遺伝子の周
辺の制限断片長多型（RFLP）を同定することができる。そのようなRFLPは疾患原
因遺伝子に関連しており、したがって該疾患原因遺伝子を保持する個体の同定に
用いることができる。
伝子の又はHG52関連タンパク質をコードする遺伝子の染色体位置を同定するため
の染色体マッピング研究において使用することができる。そのようなマッピング
研究は、よく知られた遺伝的および／または染色体マッピング技術、例えば、公
知染色体マーカーに関する連鎖解析またはin situハイブリダイゼーションを用
いて行うことができる。例えば、Vermaら, 1988, Human Chromosomes: A Manual
of Basic Techniques, Pergamon Press, New York, NYを参照されたい。HG52遺
伝子またはHG52関連タンパク質をコードする遺伝子の染色体位置を同定した後、
この情報を、遺伝地図データ（例えば、the Genome Issue of Science (1994, 2
65:1981-2144)に記載のデータ）に含まれる公知疾患原因遺伝子の位置と比較す
ることができる。このようにして、HG52遺伝子の又はHG52関連タンパク質をコー
ドする遺伝子の染色体位置を公知疾患原因遺伝子の位置と相関させることができ
、したがって、そのような疾患原因遺伝子を含有するDNA領域を限定するのに役
立ちうる。これは、そのような疾患原因遺伝子をクローニングする方法を単純化
するであろう。また、HG52遺伝子の又はHG52関連タンパク質をコードする遺伝子
の染色体位置と公知疾患原因遺伝子の位置との連鎖が確認されたら、その連鎖を
診断に用いて、該HG52遺伝子またはHG52関連タンパク質をコードする遺伝子の周
辺の制限断片長多型（RFLP）を同定することができる。そのようなRFLPは疾患原
因遺伝子に関連しており、したがって該疾患原因遺伝子を保持する個体の同定に
用いることができる。
【００７８】 本明細書に記載の染色体マッピング研究の場合、本発明のDNAに加えて、本発
明のDNAの逆相補体または本発明のDNAに対応するRNAを使用するのが好都合かも
しれない。
明のDNAの逆相補体または本発明のDNAに対応するRNAを使用するのが好都合かも
しれない。
【００７９】 本発明はまた、HG52タンパク質に対する抗体を含む。そのような抗体は、ポリ
クローナル抗体またはモノクローナル抗体であることが可能であり、HG52タンパ
ク質の不適当な発現または活性を伴う免疫系の障害の治療に有用である。本発明
の抗体は、当技術分野でよく知られた方法により、全HG52タンパク質に対して、
または適当な担体（例えば、血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシ
アニン）と共役した該タンパク質の適当な抗原断片に対して産生させる。タンパ
ク質の適当な抗原断片を同定する方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ho
pp ＆ Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3824-3828; およびJameso
n ＆ Wolf, 1988, CABIOS (Computer Applications in the Biosciences) 4:181
-186を参照されたい。
クローナル抗体またはモノクローナル抗体であることが可能であり、HG52タンパ
ク質の不適当な発現または活性を伴う免疫系の障害の治療に有用である。本発明
の抗体は、当技術分野でよく知られた方法により、全HG52タンパク質に対して、
または適当な担体（例えば、血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシ
アニン）と共役した該タンパク質の適当な抗原断片に対して産生させる。タンパ
ク質の適当な抗原断片を同定する方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ho
pp ＆ Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3824-3828; およびJameso
n ＆ Wolf, 1988, CABIOS (Computer Applications in the Biosciences) 4:181
-186を参照されたい。
【００８０】 ポリクローナル抗体の産生のためには、HG52タンパク質または抗原断片（適当
な担体と共役させたもの）を、適当な非ヒト宿主動物（例えば、ウサギ、ヒツジ
、ヤギ、ラット、マウス）に定期的に注射する。該動物から定期的に採血し、得
られた血清を、注射された抗原に対する抗体の存在に関して試験する。該注射は
、筋肉内、腹腔内、皮下などに行なうことができ、アジュバントと共に行なうこ
とができる。
な担体と共役させたもの）を、適当な非ヒト宿主動物（例えば、ウサギ、ヒツジ
、ヤギ、ラット、マウス）に定期的に注射する。該動物から定期的に採血し、得
られた血清を、注射された抗原に対する抗体の存在に関して試験する。該注射は
、筋肉内、腹腔内、皮下などに行なうことができ、アジュバントと共に行なうこ
とができる。
【００８１】 モノクローナル抗体の産生のためには、HG52タンパク質または抗原断片（適当
な担体と共役させたもの）を、ポリクローナル抗体の産生に関して前記したのと
同様の適当な非ヒト宿主動物に注射する。モノクローナル抗体の場合には、該動
物は一般にはマウスである。ついで該動物の脾臓細胞を不死化させる。これは、
しばしば、Kohler ＆ Milstein, 1975, Nature 256:495-497に記載のとおり、骨
髄腫細胞との融合により行なう。モノクローナル抗体の産生の更に詳しい説明に
ついては、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow ＆ Lane編, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 1988を参照されたい。
な担体と共役させたもの）を、ポリクローナル抗体の産生に関して前記したのと
同様の適当な非ヒト宿主動物に注射する。モノクローナル抗体の場合には、該動
物は一般にはマウスである。ついで該動物の脾臓細胞を不死化させる。これは、
しばしば、Kohler ＆ Milstein, 1975, Nature 256:495-497に記載のとおり、骨
髄腫細胞との融合により行なう。モノクローナル抗体の産生の更に詳しい説明に
ついては、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow ＆ Lane編, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 1988を参照されたい。
【００８２】 HG52ポリペプチドを標的器官の細胞内に導入するために、遺伝子治療を用いる
ことができる。HG52ポリペプチドをコードするヌクレオチドを、受容細胞への感
染により該ヌクレオチドの導入を媒介するウイルスベクター内に連結させること
ができる。適当なウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、ア
デノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスおよびポリオウイル
スに基づくベクターが含まれる。あるいは、リガンド-ヌクレオチドコンジュゲ
ート、リポフェクション、膜融合または直接マイクロインジェクションを用いて
、受容体媒介標的化導入（receptor-mediated targeted transfer）を含む非ウ
イルス技術により、HG52ポリペプチドをコードするヌクレオチドを遺伝子治療の
ために細胞内に導入することができる。これらの方法およびそれらの変法は、エ
クスビボ（ex vivo）およびインビボ遺伝子治療に適している。HG52ポリペプチ
ドでの遺伝子治療は、HG52の活性を上昇させることが有益である疾患の治療に特
に有用であろう。
ことができる。HG52ポリペプチドをコードするヌクレオチドを、受容細胞への感
染により該ヌクレオチドの導入を媒介するウイルスベクター内に連結させること
ができる。適当なウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、ア
デノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスおよびポリオウイル
スに基づくベクターが含まれる。あるいは、リガンド-ヌクレオチドコンジュゲ
ート、リポフェクション、膜融合または直接マイクロインジェクションを用いて
、受容体媒介標的化導入（receptor-mediated targeted transfer）を含む非ウ
イルス技術により、HG52ポリペプチドをコードするヌクレオチドを遺伝子治療の
ために細胞内に導入することができる。これらの方法およびそれらの変法は、エ
クスビボ（ex vivo）およびインビボ遺伝子治療に適している。HG52ポリペプチ
ドでの遺伝子治療は、HG52の活性を上昇させることが有益である疾患の治療に特
に有用であろう。
【００８３】 完全長HG20をコードするcDNA断片は、適当なプライマー対を使用するポリメラ
ーゼ連鎖反応（PCR）を用いることにより適当なヒトcDNAライブラリーから単離
することができる。そのようなプライマー対は、図１に配列番号1として示すHG2
0のcDNA配列に基づいて選択することができる。適当なプライマー対としては、
以下のものが挙げられるであろう： ACCCCTCCAGGATGCAGG（配列番号4）および ACTCAGAACACACTCTCC（配列番号5）。
ーゼ連鎖反応（PCR）を用いることにより適当なヒトcDNAライブラリーから単離
することができる。そのようなプライマー対は、図１に配列番号1として示すHG2
0のcDNA配列に基づいて選択することができる。適当なプライマー対としては、
以下のものが挙げられるであろう： ACCCCTCCAGGATGCAGG（配列番号4）および ACTCAGAACACACTCTCC（配列番号5）。
【００８４】 前記プライマーは例示的なものである。当業者は、種々の他の適当なプライマ
ーを設計しうると認識するであろう。例えば、プライマーHG52.NotI（配列番号6
）およびHG52.KpnI（配列番号7）（実施例1を参照されたい）を使用することが
可能であろう。
ーを設計しうると認識するであろう。例えば、プライマーHG52.NotI（配列番号6
）およびHG52.KpnI（配列番号7）（実施例1を参照されたい）を使用することが
可能であろう。
【００８５】 AmpliTaq、AmpliTaq GoldまたはVentポリメラーゼを含む（これらに限定され
るものではない）種々の耐熱性酵素でPCR反応を行なうことができる。AmpliTaq
の場合には、10mM Tris-Cl, pH8.3、2.0mM MgCl2、200μMの各dNTP、50mM KCl、
0.2μMの各プライマー、10ngのDNA鋳型、0.05単位/μlのAmpliTaq中で反応を行
なうことができる。該反応を95℃で3分間加熱し、ついで95℃で20秒間、62℃で2
0秒間、72℃で3分間のサイクリングパラメーターを用いる35サイクルに付す。こ
れらの条件に加えて、適当な種々のPCRプロトコールがPCR Primer, A Laborator
y Manual, C.W. DieffenbachおよびG.S. Dveksler編, 1995, Cold Spring Harbo
r Laboratory Press、またはPCR Protocols: A Guide to Methods and Applicat
ions, Michaelら編, 1990, Academic Pressに記載されている。
るものではない）種々の耐熱性酵素でPCR反応を行なうことができる。AmpliTaq
の場合には、10mM Tris-Cl, pH8.3、2.0mM MgCl2、200μMの各dNTP、50mM KCl、
0.2μMの各プライマー、10ngのDNA鋳型、0.05単位/μlのAmpliTaq中で反応を行
なうことができる。該反応を95℃で3分間加熱し、ついで95℃で20秒間、62℃で2
0秒間、72℃で3分間のサイクリングパラメーターを用いる35サイクルに付す。こ
れらの条件に加えて、適当な種々のPCRプロトコールがPCR Primer, A Laborator
y Manual, C.W. DieffenbachおよびG.S. Dveksler編, 1995, Cold Spring Harbo
r Laboratory Press、またはPCR Protocols: A Guide to Methods and Applicat
ions, Michaelら編, 1990, Academic Pressに記載されている。
【００８６】 HG52をコードするクローンが単離される適当なcDNAライブラリーは、末梢血リ
ンパ球、脾臓、リンパ節または骨髄からのRNAから調製したヒトcDNAライブラリ
ーであろう。そのようなライブラリーは、当技術分野でよく知られた方法により
調製することができる。あるいは、いくつかの商業的に入手可能なライブラリー
、例えば、ヒト白血球5'伸長＋cDNAライブラリーおよびヒト脾臓5'伸長＋Clonte
ch Laboratories, Inc.（Palo Alto, CA, USA）のcDNAライブラリーが適当であ
ろう。そのようなライブラリーの一次クローンをプールに細分することができ（
各プールは約20,000個のクローンを含有する）、各プールを別々に増幅すること
ができる。
ンパ球、脾臓、リンパ節または骨髄からのRNAから調製したヒトcDNAライブラリ
ーであろう。そのようなライブラリーは、当技術分野でよく知られた方法により
調製することができる。あるいは、いくつかの商業的に入手可能なライブラリー
、例えば、ヒト白血球5'伸長＋cDNAライブラリーおよびヒト脾臓5'伸長＋Clonte
ch Laboratories, Inc.（Palo Alto, CA, USA）のcDNAライブラリーが適当であ
ろう。そのようなライブラリーの一次クローンをプールに細分することができ（
各プールは約20,000個のクローンを含有する）、各プールを別々に増幅すること
ができる。
【００８７】 この方法により、359アミノ酸のオープンリーディングフレーム（配列番号2）
をコードするcDNA断片を得ることができる。このcDNA断片を、適当なクローニン
グベクターまたは発現ベクター内にクローニングすることができる。例えば、該
断片を、哺乳類発現ベクターpcDNA3.1（Invitrogen, San Diego, CA）内にクロ
ーニングすることができる。ついでHG52またはその一部をコードする発現ベクタ
ーを適当な宿主細胞内に導入し、該宿主細胞を適当な条件下で増殖させることに
より、HG52タンパク質を産生させることができる。ついで当技術分野でよく知ら
れた方法により、HG52タンパク質を単離することができる。
をコードするcDNA断片を得ることができる。このcDNA断片を、適当なクローニン
グベクターまたは発現ベクター内にクローニングすることができる。例えば、該
断片を、哺乳類発現ベクターpcDNA3.1（Invitrogen, San Diego, CA）内にクロ
ーニングすることができる。ついでHG52またはその一部をコードする発現ベクタ
ーを適当な宿主細胞内に導入し、該宿主細胞を適当な条件下で増殖させることに
より、HG52タンパク質を産生させることができる。ついで当技術分野でよく知ら
れた方法により、HG52タンパク質を単離することができる。
【００８８】 前記PCR法に代わる方法としては、オリゴヌクレオチドプローブでcDNAライブ
ラリーをスクリーニングするための当技術分野でよく知られた方法を用いHG52に
特異的なオリゴヌクレオチドをプローブとして使用して、HG52をコードするcDNA
クローンをcDNAライブラリーから単離することができる。そのような方法は、例
えば、Sambrookら, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spr
ing Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D.M. (編),
1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K.,
Vol. I, IIに記載されている。HG52に特異的でcDNAライブラリーのスクリーニン
グに使用されうるオリゴヌクレオチドは、図１に配列番号1として示すHG52のcDN
A配列に基づき容易に設計することができ、当技術分野でよく知られた方法によ
り合成することができる。
ラリーをスクリーニングするための当技術分野でよく知られた方法を用いHG52に
特異的なオリゴヌクレオチドをプローブとして使用して、HG52をコードするcDNA
クローンをcDNAライブラリーから単離することができる。そのような方法は、例
えば、Sambrookら, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spr
ing Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D.M. (編),
1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K.,
Vol. I, IIに記載されている。HG52に特異的でcDNAライブラリーのスクリーニン
グに使用されうるオリゴヌクレオチドは、図１に配列番号1として示すHG52のcDN
A配列に基づき容易に設計することができ、当技術分野でよく知られた方法によ
り合成することができる。
【００８９】 HG52遺伝子を含有するゲノムクローンは、商業的に入手可能なヒトPACまたはB
ACライブラリー（例えば、Research Genetics, Huntsville, ALから入手される
もの）から得ることができる。あるいは、本明細書に開示するHG52ヌクレオチド
配列に基づくプローブを使用して、HG52含有ゲノムクローンが単離されうるゲノ
ムライブラリー（特に、P1人工染色体ベクター中のもの）を調製することができ
る。そのようなライブラリーの調製方法は当技術分野で公知である（Ioannouら,
1994, Nature Genet. 6:84-89）。
ACライブラリー（例えば、Research Genetics, Huntsville, ALから入手される
もの）から得ることができる。あるいは、本明細書に開示するHG52ヌクレオチド
配列に基づくプローブを使用して、HG52含有ゲノムクローンが単離されうるゲノ
ムライブラリー（特に、P1人工染色体ベクター中のもの）を調製することができ
る。そのようなライブラリーの調製方法は当技術分野で公知である（Ioannouら,
1994, Nature Genet. 6:84-89）。
【００９０】 本発明を更に例示するために、以下に非限定的な実施例を記載する。
【００９１】 実施例1 HG52のクローニングおよび配列決定 EST（GenBank受託番号aa804531）を推定Gタンパク質共役型受容体として同定
した。プライマーHG52.F91およびHG52.R242を該EST配列から設計し、胎児脳、前
立腺、胎盤および精巣の組織に由来するスーパープールプラスミドライブラリー
のスクリーニングに使用した。ついで個々のライブラリープールからHG52の完全
長コード配列を単離するために、RCCAを行った。一次反応においては、プライマ
ーHG52.F91をPBS.873FまたはPBS.543Rのいずれかと対にし、HG52.R310をPBS.873
FまたはPBS.543Rのいずれかと対にした。二次反応においては、プライマーHG52.
F165をPBS.838FまたはPBS.578Rのいずれかと対にし、HG52.R242をPBS.838Fまた
はPBS.578Rのいずれかと対にした。PCR産物を配列決定し、指標体（guide）とし
てのaa804531 ESTと集合させた。プライマーHG52.506FおよびHG52.603Rを新たな
配列から設計し、それらを使用して、組織特異的プラスミドライブラリーおよび
該スーパープール中の新たなプールを同定した。以下のプライマーの組合せを使
用して、これらの新たなプール上でRCCAを行った：HG52.506FとPBS.543RまたはP
BS.873Fとの組合せ、およびHG52.623RとPBS.543RまたはPBS.873Fとの組合せ。PC
R産物を配列決定し、集合させた。ついでネスティドRCCAを行って、より特異的
、かつ、より長いPCR産物を同定した。一次反応においては、HG52.357FをPBS.54
3RまたはPBS.873Fのいずれかと対にし、HG52.623RをPBS.543RまたはPBS.873Fの
いずれかと対にした。二次反応においては、HG52.F506をPBS.578RまたはPBS.838
Fのいずれかと対にし、HG52.526RをPBS.578RまたはPBS.838Fのいずれかと対にし
た。PCR産物を精製し、配列決定し、コンティグに集合させた。新たな5'転写産
物を同定するために、ヒト白血球ファージライブラリーをプライマーHG52.357F
およびHG52.623Rでスキャンした。ついで以下のプライマーの組合せを使用して
、該陽性ウェル上でネスティドRCCAを行った。一次反応においては、HG52.357F
をラムダgt10 3'またはラムダgt10 5'のいずれかと対にし、HG52.623Rをラムダg
t10 3'またはラムダgt10 5'のいずれかと対にした。二次反応においては、HG52.
506Fをラムダgt10 3'またはラムダgt10 5'のいずれかと対にし、HG52.526Rをラ
ムダgt10 3'またはラムダgt10 5'のいずれかと対にした。ついでPCR産物を精製
し、配列決定し、コンティグに集合させた。これらのPCR伸長および配列決定か
ら、359アミノ酸のポリペプチド配列をコードする1,080bpのオープンリーディン
グフレームを得た。ついでHG52をコードする完全長cDNAを、プライマーHG52.Not
IおよびHG52.KpnIを使用して増幅し、発現ベクターpcDNA3.1(+)内にサブクロー
ニングした。HG52を配列決定しクローニングするために使用するプライマーの配
列を、以下に列挙する。
した。プライマーHG52.F91およびHG52.R242を該EST配列から設計し、胎児脳、前
立腺、胎盤および精巣の組織に由来するスーパープールプラスミドライブラリー
のスクリーニングに使用した。ついで個々のライブラリープールからHG52の完全
長コード配列を単離するために、RCCAを行った。一次反応においては、プライマ
ーHG52.F91をPBS.873FまたはPBS.543Rのいずれかと対にし、HG52.R310をPBS.873
FまたはPBS.543Rのいずれかと対にした。二次反応においては、プライマーHG52.
F165をPBS.838FまたはPBS.578Rのいずれかと対にし、HG52.R242をPBS.838Fまた
はPBS.578Rのいずれかと対にした。PCR産物を配列決定し、指標体（guide）とし
てのaa804531 ESTと集合させた。プライマーHG52.506FおよびHG52.603Rを新たな
配列から設計し、それらを使用して、組織特異的プラスミドライブラリーおよび
該スーパープール中の新たなプールを同定した。以下のプライマーの組合せを使
用して、これらの新たなプール上でRCCAを行った：HG52.506FとPBS.543RまたはP
BS.873Fとの組合せ、およびHG52.623RとPBS.543RまたはPBS.873Fとの組合せ。PC
R産物を配列決定し、集合させた。ついでネスティドRCCAを行って、より特異的
、かつ、より長いPCR産物を同定した。一次反応においては、HG52.357FをPBS.54
3RまたはPBS.873Fのいずれかと対にし、HG52.623RをPBS.543RまたはPBS.873Fの
いずれかと対にした。二次反応においては、HG52.F506をPBS.578RまたはPBS.838
Fのいずれかと対にし、HG52.526RをPBS.578RまたはPBS.838Fのいずれかと対にし
た。PCR産物を精製し、配列決定し、コンティグに集合させた。新たな5'転写産
物を同定するために、ヒト白血球ファージライブラリーをプライマーHG52.357F
およびHG52.623Rでスキャンした。ついで以下のプライマーの組合せを使用して
、該陽性ウェル上でネスティドRCCAを行った。一次反応においては、HG52.357F
をラムダgt10 3'またはラムダgt10 5'のいずれかと対にし、HG52.623Rをラムダg
t10 3'またはラムダgt10 5'のいずれかと対にした。二次反応においては、HG52.
506Fをラムダgt10 3'またはラムダgt10 5'のいずれかと対にし、HG52.526Rをラ
ムダgt10 3'またはラムダgt10 5'のいずれかと対にした。ついでPCR産物を精製
し、配列決定し、コンティグに集合させた。これらのPCR伸長および配列決定か
ら、359アミノ酸のポリペプチド配列をコードする1,080bpのオープンリーディン
グフレームを得た。ついでHG52をコードする完全長cDNAを、プライマーHG52.Not
IおよびHG52.KpnIを使用して増幅し、発現ベクターpcDNA3.1(+)内にサブクロー
ニングした。HG52を配列決定しクローニングするために使用するプライマーの配
列を、以下に列挙する。
【００９２】
【化１】
【００９３】 実施例２ HG52 RNA転写産物の組織分布 Clontech（Palo Alto, CA）から購入したヒト多組織ノーザンブロットを使用
して、図４に示すデータを得た。プローブとしてHG52の全コード領域を使用して
、Clontechが推奨しているとおりにハイブリダイゼーションを行った。
して、図４に示すデータを得た。プローブとしてHG52の全コード領域を使用して
、Clontechが推奨しているとおりにハイブリダイゼーションを行った。
【００９４】 本発明の範囲は、本明細書に記載の特定の実施形態により限定されるものでは
ない。実際のところ、本明細書に記載のものの他に本発明の種々の修飾が、以上
の記載から当業者に明らかとなるであろう。そのような修飾は、添付の請求の範
囲の範囲内に含まれると意図される。
ない。実際のところ、本明細書に記載のものの他に本発明の種々の修飾が、以上
の記載から当業者に明らかとなるであろう。そのような修飾は、添付の請求の範
囲の範囲内に含まれると意図される。
【００９５】 本明細書中には種々の刊行物が引用されているが、それらの開示の全体を参照
により本明細書に組み入れることとする。
により本明細書に組み入れることとする。
【図１】 HG52の全cDNA配列（配列番号1）を示す。
【図２】 HG52の全アミノ酸配列（配列番号2）を示す。
【図３Ａ】 Ａは、HG52オープンリーディングフレームの翻訳を示す。示されているヌクレ
オチド配列は配列番号1である。示されているアミノ酸配列は配列番号2である。
オチド配列は配列番号1である。示されているアミノ酸配列は配列番号2である。
【図３Ｂ】 Ｂは、HG52オープンリーディングフレームの翻訳を示す。示されているヌクレ
オチド配列は配列番号1である。示されているアミノ酸配列は配列番号2である。
オチド配列は配列番号1である。示されているアミノ酸配列は配列番号2である。
【図４】 種々のヒト組織内でのHG52 mRNAの発現のノーザンブロットの結果を示す。
【図５】 HG52のアミノ酸配列とヒトトロンビン受容体1のアミノ酸配列（配列番号3）と
のアライメントを示す。
のアライメントを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ａ (72)発明者 マクドナルド，テレンス・ピー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 ワン，ロイピン アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 DA13 FB02 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 DA02 EA04 GA12 HA11 4B063 QA01 QA20 QQ08 QQ61 QR66 QS02 QX01 4B065 AA01X AA57X AA72X AA90X AA90Y AB01 BA04 CA24 CA46 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA45 DA50 DA76 EA50 EA54 FA72 FA74
Claims (17)
- 【請求項１】 配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
る組換えDNA分子。 - 【請求項２】 配列番号1と配列番号1の23〜1,099位とよりなる群から選ば
れるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のDNA分子。 - 【請求項３】 請求項１に記載のDNAにストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズするDNA分子。 - 【請求項４】 請求項１に記載のDNAを含んでなる発現ベクター。
- 【請求項５】 請求項１に記載のDNAを含んでなる組換え宿主細胞。
- 【請求項６】 配列番号2のアミノ酸配列を有する単離されたHG52タンパク
質。 - 【請求項７】 他のタンパク質を実質的に含有しない、請求項６に記載の単
離されたHG52タンパク質。 - 【請求項８】 単一のアミノ酸置換を含有する、請求項６に記載のHG52タン
パク質。 - 【請求項９】 該タンパク質が2以上のアミノ酸置換を含有し、該置換が同
類的であり、HG52とヒトトロンビン受容体1とが同一アミノ酸を共有する位置に
は該置換が存在しない、請求項６に記載のHG52タンパク質。 - 【請求項１０】 ある物質がHG52の潜在的アゴニストまたはアンタゴニスト
であるか否かを判定するための方法であって、 （a）HG52をコードする発現ベクターで細胞をトランスフェクトし、 （b）HG52が発現されるのを可能にするのに十分な時間、該トランスフェク
ト化細胞を培養し、 （c）該物質の存在下および不存在下、HG52の標識リガンドに該細胞をさら
し、 （d）HG52に対する該標識リガンドの結合を測定することを含んでなり、 該標識リガンドの結合の量が該物質の不存在下より該物質の存在下において
少ない場合、該物質がHG52の潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストであり、 HG52が配列番号2のアミノ酸配列を有することを特徴とする方法。 - 【請求項１１】 ある物質がHG52に結合する能力を有するか否かを判定する
ための方法であって、 （a）細胞内でHG52の発現を指令する発現ベクターで該細胞をトランスフェ
クトすることにより、試験細胞を準備し、 （b）該物質に該試験細胞をさらし、 （c）HG52に対する該物質の結合の量を測定し、 （d）該試験細胞におけるHG52に対する該物質の結合の量を、HG52でトラン
スフェクトされていない対照細胞に対する該物質の結合の量と比較することを含
んでなり、 該物質の結合の量が、該対照細胞と比較して該試験細胞において多い場合、
該物質がHG52に結合する能力を有し、 HG52が配列番号2のアミノ酸配列を有することを特徴とする方法。 - 【請求項１２】 ある物質がHG52に結合する能力を有するか否かを判定する
ための方法であって、 （a）細胞内でHG52の発現を指令する発現ベクターで該細胞をトランスフェ
クトすることにより、試験細胞を準備し、 （b）該試験細胞から、HG52を含有する膜を調製し、該リガンドが該膜内のH
G52に結合する条件下で該膜をHG52のリガンドにさらし、 （c）工程（b）の後またはそれと同時に、該試験細胞からの膜を物質にさら
し、 （d）該物質の存在下および不存在下、該膜内のHG52に対する該リガンドの
結合の量を測定し、 （e）該物質の存在下および不存在下における該膜内のHG52に対する該リガ
ンドの結合の量を比較することを含んでなり、 該物質の存在下における該膜内のHG52に対する該リガンドの結合の量の減少
が、該物質がHG52に結合する能力を有することを示し、 HG52が配列番号2のアミノ酸配列を有することを特徴とする方法。 - 【請求項１３】 ある物質がHG52に結合する能力を有するか否かを判定する
ための方法であって、 （a）細胞内でHG52の発現を指令する発現ベクターで該細胞をトランスフェ
クトすることにより、試験細胞を準備し、 （b）該試験細胞から、HG52を含有する膜を調製し、該試験細胞からの膜を
該物質にさらし、 （c）該試験細胞からの膜内のHG52に対する該物質の結合の量を測定し、 （d）該試験細胞からの膜内のHG52に対する該物質の結合の量を、HG52でト
ランスフェクトされていない対照細胞からの膜に対する該物質の結合の量と比較
することを含んでなり、 HG52が配列番号2のアミノ酸配列を有し、 該試験細胞からの膜内のHG52に対する該物質の結合の量が、該対照細胞から
の膜に対する該物質の結合の量より多い場合、該物質がHG52に結合する能力を有
することを特徴とする方法。 - 【請求項１４】 HG52のアンタゴニストを同定する方法であって、 （a）C末端において乱交性Gタンパク質に融合したキメラHG52タンパク質を
発現する細胞を準備し、 （b）HG52のアゴニストに該細胞をさらし、 （c）工程（b）の後またはそれと同時に、HG52のアンタゴニストであると疑
われる物質に該細胞をさらし、 （d）該細胞内のイノシトールリン酸のレベルを測定することを含んでなり
、 該物質の不存在下の該細胞内のイノシトールリン酸のレベルと比較した場合
の該物質の存在下の該細胞内のイノシトールリン酸のレベルの減少が、該物質が
HG52のアンタゴニストであることを示すことを特徴とする方法。 - 【請求項１５】 HG52のアゴニストを同定する方法であって、 （a）HG52と乱交性Gタンパク質との両方を発現する細胞を準備し、 （b）HG52のアゴニストであると疑われる物質に該細胞をさらし、 （c）該細胞内のイノシトールリン酸のレベルを測定することを含んでなり
、 前記の疑われるアゴニストの不存在下の該細胞内のイノシトールリン酸のレ
ベルと比較した場合の該細胞内のイノシトールリン酸のレベルの増加が、該物質
がHG52のアゴニストであることを示し、 HG52が配列番号2のアミノ酸配列を有することを特徴とする方法。 - 【請求項１６】 HG52のアンタゴニストを同定する方法であって、 （a）HG52と乱交性Gタンパク質との両方を発現する細胞を準備し、 （b）HG52のアゴニストである物質に該細胞をさらし、 （c）工程（b）の後またはそれと同時に、HG52のアンタゴニストであると疑
われる物質に該細胞をさらし、 （d）該細胞内のイノシトールリン酸のレベルを測定することを含んでなり
、 前記の疑われるアンタゴニストの不存在下の該細胞内のイノシトールリン酸
のレベルと比較した場合の前記の疑われるアンタゴニストの存在下の該細胞内の
イノシトールリン酸のレベルの減少が、該物質がHG52のアンタゴニストであるこ
とを示し、 HG52が配列番号2のアミノ酸配列を有することを特徴とする方法。 - 【請求項１７】 HG52（該HG52は配列番号2のアミノ酸配列を有する）に特
異的に結合する抗体。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US10295898P | 1998-10-02 | 1998-10-02 | |
| US60/102,958 | 1998-10-02 | ||
| PCT/US1999/022634 WO2000020438A1 (en) | 1998-10-02 | 1999-09-29 | G protein-coupled receptor resembling the thrombin receptor |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002526096A true JP2002526096A (ja) | 2002-08-20 |
Family
ID=22292613
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000574549A Withdrawn JP2002526096A (ja) | 1998-10-02 | 1999-09-29 | トロンビン受容体に類似したｇタンパク質共役型受容体 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1124844A1 (ja) |
| JP (1) | JP2002526096A (ja) |
| CA (1) | CA2346134A1 (ja) |
| WO (1) | WO2000020438A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| WO2002068591A2 (en) * | 2001-02-23 | 2002-09-06 | Bristol-Myers Squibb Company | G-protein coupled receptor nucleic acids, polypeptides, antibodies and uses thereof |
-
1999
- 1999-09-29 EP EP99950014A patent/EP1124844A1/en not_active Withdrawn
- 1999-09-29 CA CA002346134A patent/CA2346134A1/en not_active Abandoned
- 1999-09-29 WO PCT/US1999/022634 patent/WO2000020438A1/en not_active Application Discontinuation
- 1999-09-29 JP JP2000574549A patent/JP2002526096A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2000020438A9 (en) | 2000-09-28 |
| EP1124844A1 (en) | 2001-08-22 |
| CA2346134A1 (en) | 2000-04-13 |
| WO2000020438A1 (en) | 2000-04-13 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20061205 |