JP2002526029A - ポリアニオン性ドメインを含んで成る修飾された酵素 - Google Patents
ポリアニオン性ドメインを含んで成る修飾された酵素Info
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Abstract
(57)【要約】
1 つの酵素及び少なくとも１つのポリアニオン性ドメイン、たとえばポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、又はポリカルボン酸を含んで成る修飾された酵素に関し、ここで前記酵素は個々の前記ポリアニオン性ドメインを含んで成るか又はそれに共有結合される。そのような修飾された酵素を含んで成る口腔ケア組成物、及び歯疾病を予防し又は処理するための、特に歯垢を予防し、又は除去するための口腔ケア組成物への使用がまた開示される。修飾された酵素は、歯におけるヒドロキシルアパタイトに結合することができる。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、ポリアニオン性ドメインを含んで成る修飾された酵素、そのような
修飾された酵素を製造するための方法、そのような修飾された酵素を含んで成る
口腔組成物、及び歯垢の予防及び/ 又は除去のためへのそのような口腔ケア組成
物の使用に関する。 【０００２】 発明の背景： 歯垢は、細菌、上皮細胞、白血球、マクロファージ、及び歯の表面上に形成さ
れる他の口腔滲出物の混合物である。歯垢の形成は、虫歯、歯肉炎、歯周病、及
び結果的に歯の損失を導く。前記細菌は非常に枝分かれされた多糖類を生成し、
そして共に、口腔からの微生物は、歯垢の連続した増殖のための付着性マトリッ
クスを形成する。 歯垢が蓄積し続けるにつれて、岩石のような硬質の白色又は黄色の付着物が生
じる。それらの付着物は、石灰化された歯垢、又は歯石と呼ばれ、そして歯垢及
び鉱物、特にカルシウムから唾液において形成される。 【０００３】口腔多糖類： 口腔多糖類は、たとえば食品又は飲料成分として口中に導入されるスクロース
（sucrose ）から、口腔において増殖するう食原生微生物、たとえばストレプト
コッカス・ムタンス（Streptococcus mutans）又はストレプトコッカス・サング
イス（Streptococcus sanguis ）の作用により生成される。 前記口腔多糖類は、α−１, ６−グリコシド結合の大きな部分を有する水溶性
デキストラン、及びα−１, ３−グリコシド結合を有する主鎖及びα−１, ６−
グリコシド結合を有する枝から構成される“ムタン”と呼ばれる水不溶性細胞外
多糖類の主用成分を含んで成る。 【０００４】 ムタンは、ヒドロキシルアパタイト（歯の硬質の外部多孔層を構成する）、及
び歯表面に付着する前記う食性細菌の細胞表面上の受容体タンパク質に結合する
。 虫歯、歯垢及び歯石の形成を妨げるために、種々の酵素、たとえはデキストラ
ナーゼ及び/ 又はムタナーゼを、口腔ケア組成物及び生成物に添加することが提
案されており、そして種々の酵素、たとえばグルカナーゼ、オキシドレダクター
ゼ、たとえばオキシターゼ及びペルオキシターゼを含む多くの口腔ケア生成物が
知られている。 【０００５】 しかしながら、既知に酵素含有口腔ケア生成物に関する問題は、酵素が一般的
に、歯又は歯垢の成分に結合しない事実であり、このことは、たとえば歯磨きに
より適用される酵素が歯及び口から比較的すばやく除去されることを意味する。
これは、そのような酵素が限定された時間のみ作用し、そしてたとえば歯垢を攻
撃することによる口腔衛生の維持のためのそれらの十分な能力が実現されないこ
とを意味する。 【０００６】 Chu and Orgel (Bioconjugate Chem., 8, 103 (1997)は、グルタミン酸のデカ
マー及びリン酸化された吉草酸のトリマーがビオチンに結合され得、そしてその
結合体がヒドロキシルアパタイトへのビオチン−結合タンパク質アビジンの結合
を介在するために使用され得ることを見出した。この文献は、アニオン性ペプチ
ドが骨へのリガンドのキャリヤーとして使用され得ることを示唆する。 【０００７】 Hosainなど. (J. Nucl. Med., 37: 105-107, Jan. 1996) は、ペプチド結合を
含むメトトレキセート−ビホスホネート接合体が骨−探索剤のように挙動するこ
とを報告している。この著者は、この発現に基づいて、抗腫瘍剤の骨腫瘍部位へ
の特異的供給のための可能性を示唆する。 １又は複数のポリアニオン性ドメインを含んで成る修飾された酵素が歯におけ
るヒドロキシルアパタイトに結合し、それにより、口腔ケア組成物における酵素
の延長された酵素作用の発揮を可能にすることが、驚くべきことには見出された
。 【０００８】 発明の要約： 従って、ポリアニオン性ドメインを含んで成るか又はそれに結合される修飾さ
れた酵素、及びそのような修飾された酵素を含んで成る口腔組成物を提供するこ
とが、本発明の目的である。 第１の観点においては、本発明は、酵素及び少なくとも１つのポリアニオン性
ドメインを含んで成る修飾された酵素に関し、ここで前記酵素は、個々の前記ポ
リアニオン性ドメインを含んで成るか、又はそれに共有結合される。 【０００９】 第２の観点においては、本発明は、そのような修飾された酵素を含んで成る口
腔ケア組成物に関する。 第３の観点においては、本発明は、歯疾病の予防又は処理のための、特に、歯
垢の形成の防止又は歯垢の除去のための本発明の修飾された酵素を含んで成る口
腔ケア組成物又は生成物の使用に関する。 【００１０】 発明の具体的な記載： 本明細書において使用される場合、用語“修飾された酵素”とは、少なくとも
１つのポリアニオン性ドメインを含んで成るか又はそれに共有結合される酵素を
意味する。結合は、化学的又は組換えDNA 技法により酵素における種々の基にポ
リアニオン性ドメインをカップリングすることによってもたらされ得、又は前記
ポリアニオン性ドメインは、組み変えDNA 技法により酵素の１又は複数の部位中
に挿入され得る。 【００１１】 本発明の好ましい態様においては、少なくとも１つのポリアニオン性ドメイン
は、酵素のカルボキシレート基及び/ 又はアミノ基に共有結合される。 本発明のさらなる好ましい態様においては、酵素成分は、酵素中のグルタミン
酸及び/ 又はアスパラギン酸残基のカルボキシル基に、及び/ 又は酵素の１又は
複数のC −末端カルボキシル基にポリアニオン性ドメインをカップリングするこ
とによって、化学的に修飾される。 【００１２】 本発明のさらなる好ましい態様においては、修飾された酵素は、組換えDNA 技
法により生成され、すなわちポリアニオン性ドメインは酵素における１又は複数
のC −及び/ 又はN −末端基に結合されることによって問題の酵素の延長を構成
し、又はポリアニオン性ドメインは酵素における１又は複数の部位中に導入され
る。 【００１３】 本発明においては、用語“ポリアニオン性ドメイン”とは、pH７で負の実効電
荷を有し、そして酵素に共有結合され得る分子又は成分を意味する。他方では、
ポリアニオン性ドメインは、酵素自体のアミノ酸配列中に組み込まれ得る。本発
明に従って使用され得る適切なドメインは、１〜150 個のアミノ酸残基、たとえ
ば１〜100 個、たとえば１〜50個、好ましくは２〜40個、たとえば２〜30個、た
とえば２〜20個、より好ましくは３〜15個、たとえば３〜10個のアミノ酸残基を
含んで成るペプチドである。いずれかの天然に存在するアミノ酸が、ドメインの
ペプチド構造体に組み込まれ得る。 【００１４】 天然に存在するアミノ酸のD −鏡像異性体、及びβ−アミノ酸もまた、ドメイ
ンに含まれ得る。ドメインがペプチドである場合、もちろん、ペプチドドメイン
はpH７で負の実効電荷を有することが、必要条件である。従って、ペプチドドメ
インがいずれの負に荷電されたアミノ酸残基を含まない場合、そのペプチドドメ
インは、少なくとも１つ、たとえば１〜150 個、たとえば１〜100 個、たとえば
１〜50個、好ましくは２〜40個、たとえば２〜30個、より好ましくは３〜15個、
たとえば３〜10個のグルタミン酸及び/ 又はアスパラギン酸残基を含むべきであ
る。 【００１５】 ポリアニオン性ペプチドドメインの好ましい例は、合計２〜100 個、たとえば
３〜75個、たとえば３〜50個、好ましくは３〜40個、たとえば３〜30個、たとえ
ば３〜20個、より好ましくは３〜15個、たとえば３〜10個、たとえば４〜８個の
グルタミン酸及び/ 又はアスパラギン酸残基を含んで成るポリグルタミン酸及び
ポリアスパラギン酸である。 【００１６】 荷電していない側鎖を有する少なくとも１つのアミノ酸と共にポリグルタミン
酸及び/ 又はポリアスパラギン酸を含むポリアニオン性ペプチドはまた、効果的
なドメインであり得るであろう。従って、荷電していない側鎖を有するそのよう
なアミノ酸は、いくつかの手段でポリアニオン性ペプチドに組み込まれ得る。多
くの場合、Asp 及び/ 又はGlu 側鎖により生成される個々の負の電荷を、Glu 及
び/ 又はAsp 残基、及び荷電していない側鎖を有するアミノ酸、たとえばアラニ
ン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプ
トファン、プロリン、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、
アスパラギン及び/ 又はグルタミンの交互の挿入により分離することが好都合で
ある。 【００１７】 多くの場合、ポリアニオン性ペプチドにおける種々のドメインは負の電荷を有
し、そして他のドメインは荷電されないまま存続し、すなわち荷電していない側
鎖を有するアミノ酸がポリアニオン性ペプチドドメインに組み込まれる場合、荷
電していない側鎖を有する前記アミノ酸は、２〜50個の残基、好ましくは３〜25
個の残基、たとえば３〜10個の残基、たとえば４〜８個の残基の１又は複数の基
に一緒に位置する。 【００１８】 適切なポリグルタミン酸、及びポリアスパラギン酸の特定の例は次のものであ
る：Glu-Glu, (Glu)3, (Glu)4, (Glu)5, (Glu)6, (Glu)7, (Glu)8, (Glu)9, (Gl
u)10, Asp-Asp, (Asp)3, (Asp)4, (Asp)5, (Asp)6, (Asp)7, (Asp)8, (Asp)9, (
Asp)10, Glu-Asp, (Glu-Asp)2, (Glu-Asp)3, (Glu-Asp)4, (Glu-Asp)5, Asp-Glu
, (Asp-Glu)2, (Asp-Glu)3, (Asp-Glu)4, (Asp-Glu)5, Xaa-Glu, (Xaa-Glu)2, (
Xaa-Glu)3, (Xaa-Glu)4, (Xaa-Glu)5, (Xaa-Glu)6, (Xaa-Glu)7, (Xaa-Glu)8, (
Xaa-Glu)9, (Xaa-Glu)10, Glu-Xaa, (Glu-Xaa)2, (Glu-Xaa)3, (Glu-Xaa)4, (Gl
u-Xaa)5, (Glu-Xaa)6, (Glu-Xaa)7, (Glu-Xaa)8, (Glu-Xaa)9, (Glu-Xaa)10, Xa
a-Asp, (Xaa-Asp)2, (Xaa-Asp)3, (Xaa-Asp)4, 【００１９】 (Xaa-Asp)5, (Xaa-Asp)6, (Xaa-Asp)7, (Xaa-Asp)8, (Xaa-Asp)9, (Xaa-Asp) 10 , Asp-Xaa, (Asp-Xaa)2, (Asp-Xaa)3, (Asp-Xaa)4, (Asp-Xaa)5, (Asp-Xaa)6,
(Asp-Xaa)7, (Asp-Xaa)8, (Asp-Xaa)9, (Asp-Xaa)10, Xaa a -(Glu 又はAsp)b -Xaac -(Glu 又はAsp)d −Xaa e 。ここでXaa は荷電していない側鎖を有するア
ミノ酸、たとえばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フ
ェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、グリシン、セリン、トレオニン、
システイン、チロシン、アスパラギン又はグルタミンであり、そしてa, b, c, d
及びe は0 〜25の範囲の整数である。 【００２０】 本発明に従って使用され得る他の興味あるポリアニオン性ドメインは、下記式
（I ）: 【化２】 【００２１】 [ 式中、n は、１〜15、好ましくは１〜８、たとえば1 〜５、たとえば1 〜３の
範囲の整数であり、ｍは、１〜50、好ましくは２〜40、たとえば２〜30、たとえ
ば２〜20、より好ましくは３〜15、たとえば３〜10の範囲の整数であり、そして
個々のR は、水素、C1-6−アルキル、C1-6−アルケニル、ヒドロキシ、アミノ及
びハロゲン、たとえばフルオロ、クロロ、ヨード及びブロモから成る群から独立
して選択される] で表されるホスホノ誘導体である。好ましくは、R は水素であ
る。 【００２２】 一般式I の適切なポリアニオン性ドメインの特定の例は、２−アミノ−３−ホ
スホノプロピオン酸（ｎ＝１, R ＝H ）、２−アミノ−４−ホスホノ酪酸（ｎ＝
２, R ＝H ）、２−アミノ−５−ホスホノ吉草酸（ｎ＝３, R ＝H ）、及び/ 又
は２−アミノ−６−ホスホノカプロン酸（ｎ＝４, R ＝H ）のトリマー（ｍ＝３
）、テトラマー（ｍ＝４）、ペンタマー（ｍ＝５）、ヘキサマー（ｍ＝６）、ペ
ンタマー（ｍ＝７）、オクタマ−（ｍ＝８）、ノナマー（ｍ＝９）、デカマー（
ｍ＝10）及びそれらの混合物である。 【００２３】 本明細書において、単独で又はもう１つの基の一部として使用される用語“C1 -6 −アルキル”とは、１〜６個の炭素原子を有する、直鎖、枝分かれ鎖又は環状
飽和炭化水素基、たとえばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ
−ブチル、イソ−ブチル、sec −ブチル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘ
キシル、シクロヘキシル、等を示す。 【００２４】 類似する態様において、用語“C2-6−アルケニル”とは、直鎖、枝分かれ鎖、
又は環状であり得、そして1 又は複数の二重結合を含むことができ、そしてシス
及び/ 又はトランス形状を有することができる、２〜６個の炭素原子を有する炭
化水素基、たとえばビニル、アリル、ノーブテニル、２−ブテニル、イソ−ブテ
ニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、４−ペンテニル、３−メチル−１−ブ
テニル、等を示す。 【００２５】 本発明の目的のために適切であると思われるさらなる他のポリアニオン性ドメ
インは、ポリホスフェート、ポリスルホン酸及びポリカルボン酸である。 用語“ポリホスフェート”とは、少なくとも２個、及び好ましくは少なくとも
３個のホスフェート基を含んで成る分子を意味する。そのようなポリホスフェー
ト中のホスフェート基がポリペプチドにおけるアミン基に結合するために使用さ
れる場合、そのポリホスフェートは好ましくは、少なくとも３個のホスフェート
基を含むべきである。好ましいポリホスフェートは、アミノ化されたポリホスフ
ェートである。 【００２６】 用語“ポリスルホン酸”とは、少なくとも２個及び好ましくは、少なくとも３
個のスルホン酸基を含んで成る分子を意味する。そのようなポリスルホン酸中の
スルホン酸基がポリペプチドにおけるアミン基への結合のために使用される場合
、そのポリスルホン酸は好ましくは、少なくとも３個のスルホン酸基を含むべき
である。好ましいポリスルホン酸は、アミノ化されたポリスルホン酸である。 【００２７】 用語“ポリカルボン酸”とは、少なくとも２個及び好ましくは、少なくとも３
個のカルボキシル基含んで成る分子を意味する。そのようなポリカルボン酸中の
カルボキシル基がポリペプチドにおけるアミン基への結合のために使用される場
合、そのポリカルボン酸は、少なくとも３個のカルボキシル基を含むべきである
。適切なポリカルボン酸の例は、クエン酸である。 【００２８】 好ましい種類のポリカルボン酸は、アミノ化されたポリカルボン酸である。ア
ミノ化されたポリカルボン酸の例は、アミノ化されたポリカルボン酸アルカン及
びその誘導体、アミノ化されたポリカルボン酸糖、アミノ化されたポリカルボン
酸アルコール及びアミノ化されたポリカルボン酸ポリアルコールである。適切な
アミノ化されたポリカルボン酸の特定の例は、アミノ化されたポリ（酢酸ビニル
−コ−クロトン酸）、アミノ化されたポリガラクツロン酸及びアミノ化されたポ
リ（アクリルアミド−コ−アシル酸）である。 【００２９】 一般的に、アミノ化されたポリカルボン酸、たとえばアミノ化されたポリカル
ボン酸アルカン、アミノ化されたポリカルボン酸糖、アミノ化されたポリカルボ
ン酸アルコール及びアミノ化されたポリカルボン酸ポリアルコールは、分子当た
り少なくとも１つのアミノ基を有するべきであるが、しかしそれらは適切には、
また、分子当たり1 つ以上のアミノ基も有することができる。 【００３０】 ポリアニオン性ドメインは、もちろん、それぞれ酵素及びポリアニオン性ドメ
インにおける実際の選択された結合基に依存するであろう種々の方法により酵素
に共有結合され得る。従って、当業者のためには、広範囲の種類の化学的カップ
リング技法が利用できる。しかしながら、酵素にポリアニオン性ドメインを化学
的にカップリングするための好ましい方法は、G. T. Hermanson “Bioconjugate
Techniques ”, Academic Press, 1996, 及びG. T. Hermanson など.,“Immobi
lized Affinity Ligand Techniques”, Academic Press, 1992に記載される方法
である。 【００３１】 酵素にポリアニオン性ドメインをカップリングするための一般的な手段は、通
常、酵素における１又は複数の官能基とポリアニオン性ドメインにおける１又は
複数の官能基とを、任意には、適切な触媒又は他のカップリング促進剤の助けを
伴って、反応せしめることを含んで成る。カップリング工程に通常適用されるも
う1 つの手段は、酵素及び/ 又はポリアニオン性ドメインにおける官能基の反応
基への転換、及び反応体、すなわち酵素及びポリアニオン性ドメインの続くカッ
プリングを包含する。 【００３２】 修飾された酵素の生成のために使用され得る適切なカップリング反応技法の例
は、アミン基、チオール基、カルボキシレート基、ヒドロキシル基、アルデヒド
/ ケトン基、活性水素基及び光反応性基を用いての反応技法である。 アミン基は、たとえばイソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、
NHS −エステル、塩化スルホニル、アルデヒド、グリオキサール、エポキシド、
オキシラン、カルボネート、アリール化剤、イミドエステル、無水物、カルボジ
イミドにより活性化された酸基、及び光反応性基、たとえばアリールアジド、ベ
ンゾフェノン、ジアゾ化合物及びジアジリジン誘導体と反応することができるの
で、酵素又はポリアニオン性ドメインにおけるそのような基の形成は、酵素にポ
リアニオン性ドメインを共有結合するために使用され得る。 【００３３】 類似する態様において、チオール反応基、たとえばハロアセタール、ハロゲン
化アルキル誘導体、マレイミド、アジリジン、アクリロイル誘導体、アクリル化
剤、チオール−ジスルフィド交換試薬、たとえばピリジルジスルフィド、TNB −
チオール及びジスルフィド還元体は、便利には、酵素又はポリアニオン性ドメイ
ンにおけるチオール基を通して、ポリアニオン性ドメインと酵素との間に共有結
合を形成するために使用され得る。 【００３４】 他の適切なカップリング手段は、カルボキシルレート−反応基、たとえばジア
ゾアルカン、ジアゾアセチル化合物、CDI 及びカルボジイミド；ヒドロキシル−
反応基、たとえばエポキシド、オキシラン、CDI, N,N’−ジスクシンイミジルカ
ルボネート、N −ヒドロキシスクシンイミジル クロロホルメート、アルキルハ
ロゲン、イソシアネート、及びペリオデ−ト酸化又は酵素酸化によるヒドロキシ
ル基からの反応性アルデヒド基の形成；アルデヒド/ ケトン反応基、たとえばヒ
ドラジン、及び反応、たとえばシッフ塩基形成、還元性アミノ化、及びMannich
縮合；活性水素−反応基、たとえばジアゾニウム誘導体及びヨー素化反応の使用
を包含する。 【００３５】 好ましくは、ポリアニオン性ドメインは、C −N 結合（好ましくは、酵素に起
因する炭素原子及び好ましくは、ポリアニオン性ドメインに起因する窒素原子）
により酵素に共有結合される。好ましい態様においては、ポリアニオン性ドメイ
ンがpH７で全体的に負の電荷を有するペプチドである場合、共有結合はペプチド
結合であり、ここで炭素原子は好ましくは、酵素に起因し、そして窒素原子は好
ましくは、ペプチドに起因する。 【００３６】 ペプチド結合を包含するC −N 結合を確立するための方法およびカップリング
剤は、当業界において良く知られており、たとえばJ. Jones“The Chemical Syn
thesis of Peptides”, Clarendon Press, Oxford, 1991,及びM. Bodanszky and
A. Bodanszky “The Practice of Peptide Synthesis ”, Springer-Verlag, B
erlin, 1994 を参照のこと。 カップリング反応のための特に好ましいカップリング剤は、カルボジイミド、
たとえば１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド（
EDC ）である。 【００３７】 EDC を用いてドメインとタンパク質とを接合するための方法は、“キャリヤー
タンパク質へのハプテン/ 小リガンドの結合のためへのEDC の使用”のためのプ
ロトコール、又は“EDC 及びN −ヒドロキシスクシンイミド又はスルホ−N −ヒ
ドロキシスクシンイミドを用いての溶液におけるタンパク質の効果的２段階カッ
プリングのためのプロトコール”のいずれかを用いて、製造業者の説明書（たと
えば、Pierce Instructions 0457 C, 22980X; 22981X; EDC ）に従って実施され
得る。 【００３８】 さらに、ポリアニオン性ドメインが遊離アミン基を含む場合、そのような基は
便利には、当業者においてよく知られている方法により保護され得る；たとえば
J. Jones, “The Chemical Synthesis of Peptides”, Clarendon Press, Oxfor
d, 1991,及びBodanszky and A. Bondanszky,“The Practice of Peptide Synthe
sis ”, Springer-Verlag, Berlin, 1994 を参照のこと。従って、ポリアニオン
性ドメイン、たとえばペプチドのアミン基は、たとえばEDC による活性化が起こ
る前、tert−ブチルオキシカルボニル（BOC ）により保護され得る。接合を完結
した後、その保護基は、たとえばトリフルオロ酢酸によりBOC 保護基を除去する
標準技法を用いて除去され得る。 【００３９】 たとえば、酵素は、カップリング緩衝液、たとえば200mM の塩化ナトリウムを
含む50mMのMES （pH5.0 ）に溶解され、又はそれにおけるサイズ排除にクロマト
グラフィー処理による透析又は脱塩により移行され得る。ポリアニオン性ドメイ
ン、たとえばペプチド及び/ 又はポリカルボン酸は、同様にカップリング緩衝液
に溶解され得る。 【００４０】 接合反応は、酵素及びドメインを混合し、酵素及びドメインの両者に関して、
たとえば３mg/ml の最終濃度にし、続いて、mg酵素当たり５mgのEDC と共に混合
することによって、進行させることができる。次に、接合反応は、連続した撹拌
を伴って、室温で約２時間、実施する。反応は、サイズ排除クロマトグラフィー
により脱塩することによって、又は５℃での0.2Mの酢酸アンモニウム（pH6.9 ）
に対しての十分に透析により、過剰の試薬の除去により停止される。次に、得ら
れる誘導体は、５℃で貯蔵され得る。 【００４１】 好ましい方法においては、酵素はまず、“タンパク質の２段階カップリング”
方法でのEDC により活性化され、続いて、透析又は脱塩により過剰のEDC が除去
される。接合反応は、活性化された酵素及びドメイン、たとえばペプチド及び/
又はポリカルボン酸を混合することによって進行することができ、そして続いて
、誘導体が標準的方法を用いて精製され得る。 【００４２】 ドメインの修飾又は組み込みの程度はもちろん、初期酵素、ドメイン及び/ 又
はカルボジイミド濃度の調節により調整され得る。カップリング緩衝液のpH又は
温度の変動はまた、特定酵素についての接合反応を最適化するためにも使用され
得る。 基質、基質類似体又は可逆性インヒビターによる活性部位保護は、修飾反応を
調整するために使用され得る。 本発明のもう1 つの好ましい態様においては、酵素は、グリコシル化された酵
素の炭水化物部分への上記ドメインの結合を通にして修飾され得る。 【００４３】 炭水化物の過ヨウ素酸塩酸化は、最初にシッフ塩基を生成する、ポリアニオン
性ドメイン上のアミノ基と容易に反応するアルデヒド基の生成のためによく確立
された従来の技法である。反応生成物は、標準方法により、たとえばNaBH4 又は
NaCNBH3 を用いての還元により安定化され得る（たとえば、G. T. Hermanson, B
ioconjugate Techniques, Academic Press, 1996を参照のこと）。この方法は、
１段階又は２段階工程として行われ得、そして多くのパラメーターが、特定の酵
素及び/ 又は特定の適用のための反応条件を最適化するために変えられ得る。 【００４４】 本発明のもう１つの好ましい態様においては、酵素は、組換えDNA −技法によ
り１又は複数のアミノ酸の置換及び/ 又は付加により修飾され得る。従って、本
発明はさらに、修飾された酵素を含んで成る修飾された酵素に関する。酵素修飾
は、たとえば、 i ）酵素の１又は複数の部位における少なくとも１つのグルタミン酸及び/ 又
はアスパラギン酸残基の挿入、たとえば１〜10個のグルタミン酸及び/ 又はアス
パラギン酸残基、好ましくは１〜７個のグルタミン酸及び/ 又はアスパラギン酸
残基、たとえば１〜５個のグルタミン酸及び/ 又はアスパラギン酸残基の挿入； 【００４５】 ii) 少なくとも１つのグルタミン酸又はアスパラギン酸を含んで成る少なくと
も１つのループ、たとえば： EEEEEEEEEEEEEEEEE, DDDDDDDDDDDDDDDDD, DEDEDEDEDEDEDEDED EPEPEPEPEPEPEPEPE, DPDPDPDPDPDPDPDPD, DADADADADADADADAD の挿入、上記配列の長さ、及びアスパラギン酸、グルタミン酸残基、及び荷電し
ていない側鎖を有するアミノ酸の数はもちろん、問題の酵素及び修飾された酵素
の所望の性質に依存して広範囲で変化することができ； 【００４６】 iii)酵素における１又は複数のN −及び/ 又はC −末端の延長であり得る。前
記延長を構成することができるアミノ酸配列の好ましい例は、前に記載された通
りであり、たとえば合計２〜100 個、たとえば３〜75個、たとえば３〜50個、好
ましくは３〜40個、たとえば３〜30個、たとえば３〜20個、より好ましくは３〜
15個、たとえば３〜10個、たとえば４〜８個のグルタミン酸及び/ 又はアスパラ
ギン酸残基を含んで成るポリグルタミン酸及びポリアスパラギン酸であり得る。 上記挿入及びN −及びC −末端延長は便利には、当業者に知られている一般的
方法及び原理を用いて、組換えDNA −技法により実施され得る。 【００４７】口腔ケア組成物： 本発明の口腔ケア組成物又は生成物は、歯のヒドロキシルアパタイトに結合さ
れる修飾された酵素の酵素作用による歯垢の予防及び/ 又は除去性を、主要機能
として有するが、そのような組成物又は生成物はまた、直接的に又は間接的に、
同時に他の口腔ケア機能、たとえば一般的に虫歯、歯肉炎及び歯周病の予防機能
を有する。 【００４８】 本発明の修飾された酵素の酵素成分は、所望する目的のために適切ないずれか
の酵素であり得る。それは特に、オキシドレダクターゼ、たとえばオキシダーゼ
及びペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、グルカナーゼ、エステラーゼ
、デアミナーゼ、ウレアーゼ及び多糖ヒドロラーゼ、又はそれらの混合物から成
る群から選択された酵素である。 口腔ケア組成物のための好ましい酵素活性は、グルカナーゼ活性、たとえばα
−グルコシダーゼ活性、たとえばデキストラナーゼ、ムタナーゼ及び/ 又はプル
ラナーゼ活性である。 【００４９】 適切なグルカナーゼは、酵素分類EC 3.2.1における酵素、特に次のものを包含
する：グルカン１, ４−α−グルコシダーゼ（3.2.1.3 ）、セルラーゼ（3.2.1.
4 ）、エンド−１, ３（４）−β−グルカナーゼ（3.2.1.6 ）、エンド−１, ４
−β−キシラナーゼ（3.2.1.8 ）、デキストラナーゼ（3.2.1.11）、キチナーゼ
（3.2.1.14）、ポリガラクツロナーゼ（3.2.1.15）、リゾチーム（3.2.1.17）、
β−グルコシダーゼ（3.2.1.21）、α−ガラクトシダーゼ（3.2.1.22）、β−ガ
ラクトシダーゼ（3.2.1.23）、アミロ−１, ６−グルコシダーゼ（3.2.1.33）、
キシラン１, ４−β−キシロシダーゼ（3.2.1.37）、 【００５０】 グルカンエンド−１, ３−β−D −グルコシダーゼ（3.2.1.39）、α−デキス
トリンエンド−１, ６−グルコシダーゼ（3.2.1.41）、スクロースα−グルコシ
ダーゼ（3.2.1.48）、グルカンエンド−１, ３−α−グルコシダーゼ（3.2.1.59
）、グルカン１, ４−β−グルコシダーゼ（3.2.1.74）、グルカンエンド−１,
６−β−グルコシダーゼ（3.2.1.75）、アラビナンエンド−１, ５−α−アラビ
ノシダーゼ（3.2.1.99）、ラクターゼ（3.2.1.108 ）及びキトナナーゼ（3.2.1.
132 ）。 【００５１】 適切なグルカナーゼの例は、次のものを包含する：トリコダーマ・ハルジアナ
ム（Trichoderma harzianum ）に由来するα−１, ３−グルカナーゼ；パエシロ
ミセス（Paecilomyces）株に由来するα−１, ６−グルカナーゼ；バチルス・ス
ブチリス（Bacillus subtilis ）に由来するβ−グルカナーゼ；ヒュミコラ・イ
ンソレンス（Humicola insolens ）に由来するβ−グルカナーゼ；アスペルギラ
ス・ニガー（Aspergillus niger ）に由来するβ−グルカナーゼ；トリコダーマ
（Trichoderma ）株に由来するβ−グルカナーゼ；オエルスコビア・キサンチネ
オリチカ（Oerskovia Xanthineolytica ）株に由来するβ−グルカナーゼ；アス
ペルギラス・ニガーに由来するエキソ−１, ４−α−D グルコシダーゼ（グルコ
アミラーゼ）。 【００５２】 次の微生物アミラーゼがまた企画される：バチルス・スブチリスに由来するα
−アミラーゼ；バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefac
iens）に由来するα−アミラーゼ；バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacill
us stearothermophilus ）に由来するα−アミラーゼ；アスペルギラス・オリザ
エ（Aspergillus oryzae）に由来するα−アミラーゼ；非病原性微生物に由来す
るαアミラーゼ。 【００５３】 さらに、企画される適切なグルカナーゼは、次のものを包含する：アスペルギ
ラス・ニガーに由来するα−ガラクトシダーゼ；ヒュミコラ・インソレンス（Hu
micola insolens ）に由来するペントサナーゼ、キシラナーゼ、セロビアーゼ、
セルラーゼ、ヘミ−セルラーゼ；トリコダーマ・レセイ（Trichoderma reesei）
に由来するセルラーゼ；非病原性カビに由来するセルラーゼ； 【００５４】 アスペルギラス・ニガーに由来するペクチナーゼ、セルラーゼ、セルテーゼ、
アラビナ−ゼ、ヘミ−セルロース；ペニシリウム・リラシナム（Penicillum lil
acinum）に由来するデキストラナーゼ；非病原性カビに由来するエンド−グルカ
ナーゼ；バチルス・アシドプリチカス（Bacillus acidopullyticus）に由来する
プルラナーゼ；クルイベロミセス・フラギリス（Kluyveromyces fragilis）に由
来するβ−ガラクトシダーゼ；トリコダーマ・レセイに由来するキシラナーゼ。 【００５５】 容易に入手できる市販のグルカナーゼの特定の例は次のものを包含する：Alph
a-Gal （商標）, Bio-Feed（商標） Alpha, Bio-Feed（商標） Beta, Bio-Feed
（商標） Plus, Novozyme （商標） 188, Carezyme（商標）, Celluclast（商標
）, Cellusoft （商標）, Ceremyl （商標）, Citrozym（商標）, Denimax （商
標）, Dezyme（商標）, Dextrozyme（商標）, Finizym （商標）, Fungamyl（商
標）, Gamanase（商標）, Glucanex（商標）, Lactozym（商標）, Maltogenase
（商標）, Pentopan（商標）, Pectinex（商標）, Promozyme （商標）, Pulpzy
me（商標）,Novamyl（商標）, Termamyl （商標）, AMG (Amyloglucosidase No
vo), Sweetzyme（商標）, Aquazym （商標）（すべての酵素は、Novo Nordisk A
/Sから入手できる）。他のカルボヒドラーゼは、他の会社から入手できる。 【００５６】 グルカナーゼ変異体がまた。酵素成分として企画されることが、理解されるべ
きである。 もう１つのグループの興味ある酵素は、オキシドレダクターゼ（すなわち、Re
commendations (1992) of the International Union of Biochemical and Molec
ular Biology (IUBMB)に従って酵素分類番号E.C.1 下で分類された酵素）である
。 【００５７】 例として、酵素分類（E.C.）番号下で分類された次のものから選択されたオキ
シドレダクターゼが包含される：グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ
NAD + (1.1.1.8),グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ NAD(P)+ (1 .1.1.94)、グリセロール−３−リン酸１−デヒドロゲナーゼ NADP (1.1.1.94)
、グルコースオキシダーゼ（1.1.3.4 ）、ヘキソースオキシダーゼ（1.1.3.5 ）
、カテコールオキシダーゼ（1.1.3.14）、ビリルビンオキシダーゼ（1.3.3.5 ）
、アラニンデヒドロゲナーゼ（1.4.1.1 ）、 【００５８】 グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（1.4.1.2 ）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ
NAD(P)+ (1.4.1.3) 、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ NADP+ (1.4.1.4)
、L −アミノ酸デヒドロゲナーゼ（1.4.1.5 ）、セリンデヒドロゲナーゼ（1.4.
1.7 ）、バリンデヒドロゲナーゼ NADP＋ (1.4.1.8) 、ロイシンデヒドロゲナ
ーゼ（1.4.1.9 ）、グリシンデヒドロゲナーゼ（1.4.1.10）、L −アミノ酸オキ
シダーゼ（1.4.3.2 ）、D −アミノ酸オキシダーゼ（1.4.3.3 ）、L −グルタミ
ン酸オキシダーゼ（1.4.3.11）、 【００５９】 プロテイン−リシン６−オキシダーゼ（1.4.3.13）、L −リシンオキシダーゼ
（1.4.3.14）、L −アスパラギン酸オキシダーゼ（1.4.3.16）、D −アミノ酸デ
ヒドロゲナーゼ（1.4.99.1）、プロテインジスルフィドレダクターゼ（1.6.4.4
）、チオレドキシンレダクターゼ（1.6.4.5 ）、プロテインジスルフィドレダク
ターゼ（グルタチオン）（1.8.4.2 ）、ラッカーゼ（1.10.3.2）、カタラーゼ（
1.11.1.6）、ペルオキシダーゼ（1.11.1.7）、リポキシゲナーゼ（1.13.11.12）
、スーパーオキシドジスムターゼ（1.15.1.1）。 【００６０】 前記グルコースオキシダーゼは、アスペルギラス・ニガーに由来することがで
きる。 前記ラッカーゼは、ポリポラス・ピンスチタス（Polyporus pinsitus）、ミセ
リオプトラ・サーモフィラ（Myceliophtora thermophila ）、コプリナス・シネ
レウス（Coprinus cinereus ）、リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）
、リゾクトニア・プラチコラ（Rhizoctonia praticola ）、スシタリジウム・サ
ーモフィラム（Scytalidium thermophilum）及びラス・ベルニシフュラ（Rhus V
ernicifera）に由来することができる。 【００６１】 ビリルビンオキシダーゼは、ミロテケシウム・ベルカリア（Myrothechecium V
errucaria ）に由来することができる。 ペルオキシダーゼは、たとえば大豆、セイヨウワサビ又はコプリナス・シネレ
ウス（Coprinus cinereus ）に由来することができる。 プロテインジスルフィドレダクターゼは、ウシ起源のプロテインジスルフィド
レダクターゼ、アスペルギラス・オリザエに由来するプロテインジスルフィドレ
ダクターゼ、又はE.コリに由来するDsbA又はDsbCと共に、WO95/00636号, WO95/0
1425号及びWO95/01420号（Novo Nordisk A/S）のいずれかに言及され得る。 【００６２】 容易に入手できる市販のオキシドレダクターゼの特定例は、Gluzyme （商標）
(Novo Nordisk A/Sから入手できる酵素) を包含する。しかしながら、他のオキ
シドレダクターゼは、他からも入手できる。 オキシドレダクターゼの変異体はまた、親酵素として考慮されることが、理解
されるべきである。 もう１つのグループの興味ある酵素は、リパーゼ（すなわち、Recommendation
s (1992) of the International Union of Biochemistry and Molecular Biolog
y (IUBMB) に従って、酵素分類番号E.C. 3.1.1（カルボン酸エステルヒドロラー
ゼ）下で分類される酵素）であり、そしてこのグループ内のリパーゼも包含する
。 【００６３】 リパーゼの例として、酵素分類（E.C.）番号下で分類された次のものから選択
されたリパーゼを包含する：3.1.1 ( すなわち、いわゆるカルボン酸エステルヒ
ドロラーゼ) 、たとえば（3.1.1.3 ）トリアシルグリセロールリパーゼ、（3.1.
1.4 ）ホスホリパーゼA2。 【００６４】 リパーゼの例は、次の微生物に由来するリパーゼを包含する。示される特許出
願は、引用により本明細書中に組み込まれる： ヒュミコラ（Humicola）、たとえばヒュミコラ・ブレビスポラ（Humicola bre
vispora ）、ヒュミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa ）、ヒュミコラ・
ブレビスvar.サーモイデア（Humicola brevis var. thermoidea ）及びヒュミコ
ラ・インソレンス（Humicola insolens ）( アメリカ特許第4,810,414 号) ； 【００６５】 シュードモナス（Pseudomonas ）、たとえばシュードモナス・フラギ（Pseudo
monas fragi ）、シュードモナス・スツゼリ（Pseudomonas stutzeri）、シュー
ドモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia ）及びシュードモナス・フルオレス
センス（Pseudomonas fluorescens ）(WO89/04361 号) 、又はシュードモナス・
プランタリ（Pseudomonas plantarii ）又はシュードモナス・グラジオリ（Pseu
domonas gladioli）( アメリカ特許第4,950,417 号（Solvay酵素）) 又はシュー
ドモナス・アルカリゲネス（Pseudomonas alcaligenes ）及びシュードモナス・
シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes ）( ヨーロッパ特許
第218272号) 、又はシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina ）(W
O88/09367 号；アメリカ特許第5,389,536 号) ； 【００６６】 フサリウム（Fusarium）、たとえばフサリウム・オキシスポラム（Fusarium o
xysporum）( ヨーロッパ特許第130064号) 又はフサリウム・ソラニ・ピシ（Fusa
rium solani pisi）(WO90/09446 号) ； 【００６７】 ムコール（Mucor ）（また、リゾムコールとも呼ばれる）、たとえばムコール
・ミエヘイ（Mucor miehei）( ヨーロッパ特許第238023号) ； クロモバクテリウム（Chromobacterium ）( 特に、クロモバクテリウム・ビス
コサム（Chromobacterium viscosum）) ； アスペルギラス（Aspergillus ）( 特に、アスペルギラス・ニガー（Aspergil
lus niger ）) ； 【００６８】 カンジダ（Candida ）、たとえばカンジダ・シリンドラセア（Candida cylind
racea ）（カンジダ・ルゴサ（Candida rugosa）とも呼ばれる）またはカンジダ
・アンタルクチカ（Candida antarctica）（WO88/02775号）、又はカンジダ・ア
ンタルクチカ リパーゼA 又はB （WO94/01541号及びW089/02916号）； ゲオトリカム（Geotricum ）、たとえばゲオトリカム・カンジダム（Geotricu
m candidum）(Schimada など., (1989), J. Biochem., 106, 383-388) ； ペニシリウム（Penicillium ）、たとえばペニシリウム・カメンベルチ（Peni
cillium camembertii ）(Yamaguchiなど., (1991), Gene 103, 61-67) ； 【００６９】 リゾプス（Rhizopus）、たとえばリゾプス・デレマー（Rhizopus delemar）(H
ass など., (1991), Gene 109, 107-113) 、又はリゾプス・ニベウス（Rhizopus
niveus ）(Kugimiya など., (1992) Biosci. Biotech. Biochem 56, 716-719)
、又はリゾプス・オリザエ（Rhizopus oryzae ）； バチルス（Bacillus）、たとえばバチルス・スブチリス（Bacillus subtilis
）(Dartoisなど., (1993) Biochemca et Biophysica acta 1131, 253-260) 又は
バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus ）( 日本特
許64/7744992号) 、又はバチルス・プミラス（Bacillus pumilus）(WO91/16422
号) 。 【００７０】 容易に入手できる市販のリパーゼの特定例は、Lipolase（商標）, Lipolase（
商標） ultra, Lipozyme（商標）, Palatase（商標）, Novozym （商標） 435,
Lecitase（商標） (すべてはNovo Nordisk A/Sから入手できる) を包含する。 他のリパーゼの例は、次のものを包含する：Lumafast（商標）, すなわちGene
ncor Int. Inc.からのシュードモナス・メンドシナ リパーゼ；Lipomax （商標
）, すなわちGist Brocades/Genencor Int. Inc.からのシュードモナス・プソイ
ドアルカリゲネス リパーゼ；Unileverからのフサリウム・ソラニ リパーゼ（
クチナーゼ）；Solvay 酵素からのバチルスsp. リパーゼ。他のリパーゼは、他
の会社から入手できる。 【００７１】 リパーゼ変異体もまた、適切な酵素として見なされることが、理解されるべき
である。そのようなリパーゼの例は、たとえばWO93/01285号及びWO95/22615号に
記載される。 リパーゼの活性は、“Methods of Enzymatic Analysis ”, Third Edition, 1
984, Verlag Chemie, Weinhein, vol. 4に記載のようにして、又はAF95/5 GB （
Novo Nordisk A/Sからの要求に基づいて入手できる）に記載のようにして、決定
され得る。 【００７２】 好ましくは、本発明の修飾された酵素は、遊離酵素の触媒活性の少なくとも１
％好ましくは少なくとも２％、たとえば少なくとも５％、たとえば少なくとも10
％、より好ましくは少なくとも20％、たとえば少なくとも30％、たとえば少なく
とも40％、さらにより好ましくは少なくとも50％、たとえば少なくとも60％、た
とえば少なくとも70％、さらにより好ましくは少なくとも80％、たとえば少なく
とも90％、たとえば少なくとも95％である酵素活性を有し、最も好ましくは、そ
の修飾された酵素は遊離酵素の触媒活性に対して実質的に同一である（“Method
s of Enzymatic Analysis ”, 3 rd. Edition, vol.1-10, 1984, Verlag Chemie
, Weinheimに従って決定される）。 【００７３】 異なったタイプの種類の酵素の活性を決定するための方法は、この本の次のvo
l.に見出される： Oxidoreduktaser ： vol.３、 Carbohydraser ： vol.４、 Proteaser ： vol.５、 Lipaser ： vol.６。 【００７４】 他の酵素活性は、たとえばデキストラナーゼ及び/ 又はムタナーゼ、たとえば
プロテアーゼ、たとえばパパイン、エンドグルコシダーゼ、リパーゼ、アミラー
ゼ及びそれらの混合物の他に又はそれらの代わりに、本発明の口腔ケア組成物に
含まれ得ることがまた理解される。 デキストラナーゼは、糸状菌パエシロミセス（Paecilomyces）属の株、特にパ
エシロミセス・リラシナム（Paecilomyces lilacinum）の株、パエシロミセス・
リラシナム デキストラナーゼ（Novo Nordisk A/Sから入手できる）から誘導さ
れ得る。 【００７５】 本発明の口腔ケア組成物においてデキストラナーゼと組合しての使用のために
適切なムタナーゼは、次のものを含む群からの糸状菌により生成され得る：特に
、トリコダーマ・ハルジアナムの株、たとえばトリコダーマ・ハルジアナムCBS2
43.71 からのトリコダーマ、又は特に、ペニシリウム・フニキュロサム（Penici
llium funiculosum ）の株、たとえばペニシリウム・フニキュロサムNRRL1768、
ペニシリウム・リラシナムの株、たとえばペニシリウム・リラシナムNRRL896 、 【００７６】 又はペニシリウム・プルプロゲナム（Penicillum purpurogenum ）の株、たと
えばペニシリウム・プルプロゲナムCBS238.95 、又はシュードモナス属の株、又
はフラボバクテリウムsp. (Flavobacterium sp.)の株、又はバチルス・サーキュ
ランセ（Bacillus circulanse ）の株、又はアスペルギラスsp. の株、又はスト
レプトミセスの株。ムタナーゼはまた、ペニシリウム・プルプロゲナムからも誘
導され得る。 【００７７】 本発明の口腔ケア組成物は適切には、最終口腔ケア生成物における酵素活性単
位として計算される酵素活性に相当する量の酵素成分、たとえばデキストラナー
ゼ及び/ 又はムタナーゼを、それぞれ0.001 〜1000KDU/ml、好ましくは0.01〜50
0KDU/ml 、特に0.1 〜100KDU/ml 、及び0.001 〜1000MU/ml 、好ましくは0.01〜
500MU/ml、特に0.01〜100MU/ml及び0.01〜100MU/mlの範囲で組み込んでいる。 口腔ケア組成物への使用に関しては、修飾された酵素は、20℃〜45℃、特に37
℃近くの温度で（ヒトの口腔においての一般的な温度はこの範囲内にあるので）
、十分な酵素活性を示すべきである。 【００７８】口腔ケア生成物： 上記で説明されたように、本発明はまた、本明細書に記載されるような修飾さ
れた酵素を含んで成る口腔ケア組成物及び生成物にも関する。口腔ケア生成物は
、いずれかの適切な物理形（すなわち、ペースト、ゲル、液体、粉末、軟膏、錠
剤、チューインガム、等）を有することができる。“口腔ケア生成物”とは、歯
垢の形成を妨げ、歯垢を除去し、歯疾病を妨げそして/ 又は処理し、等にするこ
とによって、ヒト及び動物の口における口腔衛生を維持し又は改良するために使
用され得る生成物として定義され得る。本発明の口腔ケア生成物はまた、義歯、
人口歯及び同様のものを清浄するための生成物を包含する。 【００７９】 そのような口腔ケア生成物の例は、歯磨き、歯用クリーム、ゲル又は歯用粉末
、歯用治療剤（odontics）、マウスウオッシュ、前−又は後−ブラッシング用す
すぎ配合物、チューインガム及びトローチ剤を包含する。 歯磨き及び歯用ゲルは典型的には、研磨艶出し剤、発泡剤、風味剤、保湿剤、
結合剤、増粘剤、甘味剤、白化/ 漂白/ 染色除去剤、水及び任意には、酵素を含
む。 歯垢除去液体を包含するマウスウオッシュは典型的には、水/ アルコール溶液
、風味剤、保湿剤、甘味剤、発泡剤、着色剤、及び任意には、酵素を含んで成る
。 【００８０】 研磨艶出し剤はまた、本発明の歯磨き生成物中に導入され得る。適切な研磨艶
出し剤は、アルミナ及びその水和物、たとえばα−アルミナ三水和物、三珪酸マ
グネシウム、炭酸マグネシウム、カオリン、アルミノシリケート、たとえば焼成
珪酸アルミニウム及び珪酸アルミニウム、炭酸カルシウム、珪酸ジルコニウム、
及び又は、粉末化されたプラスチック、たとえばポリ塩化ビニル、ポリアミド、
ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、フェノール−ホルムアルデヒド樹脂
、メラミン−ホルムアルデヒド樹脂、ウレア−ホルムアルデヒド樹脂、エポキシ
樹脂、粉末化されたポリエチレン、シリカキセロゲル、ヒドロゲル及びエーロゲ
ル及び同様のものを包含する。 【００８１】 ピロリン酸カルシウム、水不溶性アルカリメタホスフェート、リン酸二カルシ
ウム及び/ 又はその二水和物、オルトリン酸二カルシウム、リン酸三カルシウム
、粒質状ヒドロキシルアパタイト及び同様のものまた、研磨剤として適切である
。それらの物質の混合物を使用することもまた可能である。 口腔ケア生成物の性質に依存して、研磨剤は、0 〜70重量％、好ましくは、１
〜70重量％の量で存在することができる。歯磨きに関しては、研磨剤含有率は、
最終歯磨き生成物の10〜70％重量％の範囲である。 【００８２】 保湿剤は、歯磨きからの水の損失を妨げるために使用される。本発明の口腔ケ
ア生成物への使用のための適切な保湿剤は次の化合物及びその混合物を含む：グ
リセロール、ポリオール、ソルビトール、ポリエチレングリコール（PEG ）、プ
ロピレングリコール、１, ３−プロパンジオール、１, ４−ブタンジオール、水
素化され、部分的に加水分解された多糖類及び同様のもの。保湿剤は、一般的に
、歯磨きにおいて、0 〜80％、好ましくは５〜70％重量％の量で存在する。 【００８３】 シリカ、スターチ、トラガカントゴム、キサンガム、トチャカの抽出物、アル
ギネート、ペクチン、セルロース誘導体、たとえばヒドロキシルエチルセルロー
ス、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及びヒドロキシプロピルセルロース
、ポリアクリル酸及びその塩、及びポリビニルピロリドンは、歯磨き生成物を安
定化するために使用され得る適切な増粘剤及び結合剤の例である。増粘剤は、歯
磨き、クリーム及びゲルにおいて、その最終生成物の0.1 〜20重量％の量で存在
し、そして結合剤は、0.01〜10重量％の量で存在する。 【００８４】 発泡剤として、石鹸、及びアニオン性、カチオン性、非イオン性、両親媒性及
び/ 又は両性イオン界面活性剤が使用され得る。それらは、最終生成物の0 〜15
重量％、好ましくは0.1 〜13重量％、より好ましくは0.25〜10重量％のレベルで
存在することができる。 界面活性剤は、それらが修飾された酵素に対して不活性化効果を付与しない程
度まで適切である。界面活性剤は、脂肪アルコールスルフェート、10〜20個の炭
素原子を有するスルホン化されたモノグリセリド又は脂肪酸の塩、脂肪酸−アル
ブミン縮合生成物、脂肪酸アミド及びタウリンの塩、及び/ 又はイセチオン酸の
脂肪酸エステルの塩を包含する。 【００８５】 適切な甘味剤は、サッカリンを包含する。 風味剤、たとえば、ハッカは、通常、低い量で、たとえば0.01〜約５重量％、
特に0.1 〜５重量％の量で存在する。 白化/ 漂白剤は、H2O2を包含し、そして最終生成物の重量に基づいて計算され
ル場合、５重量％以下、好ましくは0.25〜４重量％の量で添加され得る。 水は通常、生成物、たとえば歯磨きに流動形を付与するために十分な量で添加
される。 【００８６】 さらに、水溶性抗菌剤、たとえばクロルヘキシジンジグルコネード、ヘキセチ
ジン、アレキシジン、第四アンモニウム抗菌化合物、及び一定の金属イオン、た
とえば亜鉛、銅、銀及び錫の水溶性源（たとえば、塩化亜鉛、銅、及び第一錫、
及び硝酸銀）がまた含まれ得る。 フルオリド源、顔料/ 着色剤、保存剤、ビタミン、pH−調節剤、抗−虫歯剤、
脱感作剤、等として使用され得る化合物の添加もまた、本発明に従って考慮され
る。 【００８７】 酵素は、口腔の洗浄のために使用される場合、いくつかの利点を提供する。プ
ロテアーゼは、歯表面上に吸着され、そして歯垢の最初の層である薄膜を形成す
る唾液タンパク質を分解する。リパーゼと共にプロテアーゼは、細菌細胞壁及び
膜の構造成分を形成するタンパク質及び脂質を溶解することによって細菌を破壊
する。 【００８８】 デキストラナーゼは、細菌付着のためのマトリックスを形成する、細菌により
生成される有機骨格構造体を分解する。プロテアーゼ及びアミラーゼは、歯垢形
成を妨げるのみならず、またカルシウムを結合する炭水化物−タンパク質複合体
を分解し、すなわちミネラリゼーションを妨げることによって、歯石の進行も妨
げる。 【００８９】 本発明の口腔ケア組成物から生成される歯磨き（最終歯磨き組成物中の重量％
）は、典型的には、次の成分を含んで成る： 研磨剤 ：10〜70％ 保湿剤 ：0 〜80％ 増粘剤 ：0.1 〜20％ 結合剤 ：0.01〜10％ 甘味剤 ：0.1 〜5 ％ 発泡剤 ：0 〜15％ 白化剤 ：0 〜5 ％ 修飾された酵素 ：0.0001〜20％。 【００９０】 本発明の口腔ケア組成物から生成されるマウスウォッシュ（最終口腔洗浄組成
物中の重量％）は、典型的には、次の成分を含んで成る： 0 〜20％ ：保湿剤 0 〜2 ％ ：界面活性剤 0 〜5 ％ ：修飾された酵素 0 〜20％ ：エタノール 0 〜2 ％ ：他の成分（たとえば、風味剤、甘味剤、活性成分、たとえば 弗化物） 0 〜70％ ：水。 マウスウオッシュは、非希釈形（すなわち、使用の前に希釈されるべきである
）又はすぐ使用できる形で存在することができる。 【００９１】口腔ケア組成物又は生成物の使用： 第３の観点において、本発明は、歯垢の形成を妨げ又は歯垢を除去するためへ
の本発明の組成物又は本発明の口腔ケア生成物の使用に関する。 【００９２】 本発明の生成物の使用は典型的には、口腔に安全且つ効果的な量の前記生成物
を適用することを包含する。それらの量（たとえば、0.3 〜約2g）は、歯磨き又
は歯用ゲルである場合、適切な時間、たとえば約15秒〜約12時間、口腔に維持さ
れる。修飾された酵素含有口腔ケア組成物又は生成物自体が、歯磨き又はマウス
ウオッシュに関して、限定された期間、たとえば約１〜３分間、口腔に単に維持
される場合でさえ、前記修飾された酵素は、歯表面に結合されるようになり、そ
して従って、延長された期間、酵素作用を付与することができることは、上記の
記載から明らかであろう。 【００９３】製造方法： 本発明の口腔ケア組成物及び生成物は、口腔生成物分野において一般的である
方法を用いて製造され得る。 本発明は、次の非制限的な例でさらに例示されるであろう。材料及び方法： 【００９４】酵素： パエシロミセス・リラシナム（Paecilomyces lilacinum）由来の組換えデキス
トラナーゼ（Novo Nordisk A/Sから入手できる）。 サーモミセス・ラヌギノサス（Thermomyces lanuginosus ）由来の組換えリパ
ーゼ（Novo Nordisk A/Sから入手できる）。 【００９５】方法： ヒドロキシアパタイトディスクの調製： ヒドロキシアパタイトディスクを、５分間、約5,900kg （13,000lb）で、ディ
スクダイにおいて250mg のヒドロキシアパタイトを圧縮することによって調製す
る。次に、ディスクを600 ℃で４時間、燒結し、そして最終的に無菌脱イオン水
により水和化した。 【００９６】ヒドロキシアパタイトディスクの殺菌： HAP ディスクを、180 ℃で２時間、殺菌し、無菌脱イオン水により水和化し、
そしてNunc管（10mlの体積）の蓋に配置する。デキストラナーゼ（KDU ）の決定： １Kilo Novoデキストラナーゼ単位（１KDU ）は、次の標準条件に基づいての
デキストラナーゼの決定のためのNovo Nordisk方法において１時間当たり１g の
マルトースに相当する還元糖を形成するデキストランを分解する酵素の量である
： 【００９７】 基質： デキストラン500 （Pharmacia ） 反応時間： 20分 温度： 40℃ pH： 5.4 。 Novo Nordisk’s 分析方法（AF120 ）の詳細な記載は、必要に応じて入手でき
る。 【００９８】 【実施例】例１ ．修飾されたデキストラナーゼの調製 カルボジイミド−介在性カップリングを通してのポリグルタミン酸とデキスト
ラナーゼとの結合を、標準的方法に従って行った；たとえば、G. T. Hermanson,
Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996を参照のこと。 デキストラナーゼの酵素原液を、250mM のNaClを含む、pH6.0 での50mMのMES
緩衝液に希釈した。反応混合物におけるデキストラナーゼの最終濃度は、ml当た
り3.7mg の酵素であった。 【００９９】 反応混合物におけるデキストラナーゼを、周囲温度で１時間、１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC ；表１を参照のこと）
の添加により活性化した。 １時間後、その活性化されたデキストラナーゼを、PD10カラム（Pharmacia ）
上でのサイズ−排除クロマトグラフィーにより精製した。次に、50mgのポリグル
タミン酸（Mr＝1000D ）（Sigma ＃p1818 ）を添加し、そしてカップリングを室
温で20時間、進行せしめた。 【０１００】 反応を停止し、そして過剰の試薬を、酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5 で10mM）
に対しての65時間の透析により除去した。酢酸ナトリウム緩衝液を、この期間、
数回、変えた。 反応の程度を、等電点電気泳動により追跡した。 この態様で生成される接合体を、５℃で貯蔵した。 【０１０１】 【表１】【０１０２】例２ ．ヒドロキシルアパタイト結合試験 50mMのBritton −Robinson緩衝液（pH 4, 5, 6, 7, 8及び9 での）中、10mg/m
l のヒドロキシルアパタイト（HAP ）の溶液500 μl を、デキストラナーゼ接合
体溶液（A280＝0.1 まで水において希釈されている）500 μl に添加した。得ら
れる混合物を室温で30分間、撹拌しながらインキュベートした。次に、サンプル
を、14,000G で４分間遠心分離し、そして上清液500 μl を、水1.5ml に希釈し
た。次に、酵素又は修飾された酵素濃度を、Perkin ElmerからのLS50分光計（励
起：280nm 、発光：340nm ）を用いて蛍光分光分析法により測定した。HAP 添加
を伴わない対照が包含され、そして結合された酵素は又は修飾された酵素の百分
率を、対照に比較して計算した。 【０１０３】 【表２】【０１０４】例３ ．修飾されたリパーゼの調製 カルボジイミド−介在性カップリングを通してのポリグルタミン酸とのリポラ
ーゼの接合を、標準方法に従って行った；たとえばG. T. Hermanson, Bioconjug
ate Techniques, Academic Press, 1996を参照のこと。 リポラーゼの酵素原液を、pH6.0 での250mM のNaClを含む50mMのMES 緩衝液に
希釈した。反応混合物におけるリポラーゼの最終濃度は、ml当たり10mgの酵素で
あった。 【０１０５】 反応混合物におけるリポラーゼを、周囲温度で１時間、１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC ；表１を参照のこと）の添加
により活性化した。 １時間後、その活性化されたリポラーゼを、PD10カラム（Pharmacia ）上での
サイズ−排除クロマトグラフィーにより精製した。次に、50mgのポリグルタミン
酸（Mr＝2000−15000D）（Sigma ＃P4636 ）を添加し、そしてカップリングを、
室温で20時間、進行せしめた。 【０１０６】 反応を停止し、そして過剰の試薬を、燐酸ナトリウム緩衝液（pH７での10mM）
に対しての16時間の透析により除去した。 反応程度を、等電点電気泳動により追跡した。 この態様で生成された接合体を、5 ℃で貯蔵した。 【０１０７】 【表３】 【０１０８】例４ ．ヒドロキシルアパタイト結合試験 50mMのBritton −Robinson緩衝液（pH 4, 5, 6, 7, 8及び9 での）中、10mg/m
l のヒドロキシルアパタイト500 μl を、A280＝0.1 まで水により希釈された、
500 μl の酵素（リポラーゼ、又はEDC −ポリ−Glu 修飾されたリポラーゼ（例
３における接合体３又は４））に添加した。得られる混合物を、室温で30分間、
撹拌しながらインキュベートした。次にサンプルを14,000G で４分間、遠心分離
し、そして上清液500 μl を、1.5ml の水に希釈した。次に、酵素濃度を、Perk
in ElmerからのLS50B 分光計（励起：280nm 、発光：340nm ）を用いて蛍光分光
分析法により測定した。対照は、HAP 添加を有さなかった。結合を、対照に対し
て計算した。 【０１０９】 【表４】 本発明の結果は、全pH範囲でヒドロキシルアパタイトに対するEDC −ポリ−Gl
u 修飾されたリポラーゼ（接合体３）の改良された結合性を示す。 【０１１０】 【表５】 本発明の結果は、pH５及びpH６の両者でヒドロキシルアパタイトに対するEDC
−ポリ−Glu 修飾されたリポラーゼ（接合体４）のさらなる改良された結合性を
示す。 【０１１１】例５ ．DL−２−アミノ−３−ホスホノプロピオン酸及びDL−２−アミノ−４−ホ
スホノ酪酸のオリゴマーの合成 DL−２−アミノ−３−ホスホノプロピオン酸及びDL−２−アミノ−４−ホスホ
ノ酪酸のオリゴマーを、縮合剤として３倍過剰量のカルボニルジイミダゾール（
CDI ）を用いて、対応するモノマー（CAS ：20263-06-3, 20263-07-4）(Sigma)
から合成した（K. W. Ehler and L. E. Orgel, Biochim. Acta, 434 (1976)233-
243 ）。 【０１１２】 84.5mgのDL−２−アミノ−３−ホスホノプロピオン酸を、室温で５mlのイミダ
ゾール緩衝液（pH＝７, １M ）に溶解した。その混合物を0 ℃に冷却し、そして
260mg のイミダゾールを少しづつ添加した。その混合物をゆっくりと室温にし、
そして撹拌を３日間、続けた。 DL−２−アミノ−４−ホスホノ酪酸のオリゴマーの合成を、105mg のDL−２−
アミノ−４ホスホノ酪酸及び280mg のイミダゾールを用いて、DL−２−アミノ−
３−ホスホノプロピオン酸のオリゴマーの合成について上記で記載された同じ手
段で行った。 【０１１３】例６ ．修飾されたリパーゼの調製 カルボジイミド−介在性カップリングを通してのDL−２−アミノ−３−ホスホ
ノプロピオン酸のオリゴマーとリポラーゼとの接合を、標準的方法に従って行っ
た；たとえば、G. T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press,
1996を参照のこと。 リポラーゼの酵素原液を、pH6.0 での250mM のNaClを含む、50mMのMES 緩衝液
に希釈した。反応混合物におけるリポラーゼの最終濃度は、ml当たり9.2mg の酵
素であった。 【０１１４】 反応混合物におけるリポラーゼを、周囲温度で２時間、１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC ；表１を参照のこと）の添加
により活性化した。 ２時間後、活性化されたリポラーゼを、PD10カラム（Pharmacia ）上でのサイ
ズ排除クロマトグラフィーにより精製した。EDC −活性化されたリポラーゼ１ml
当たり2.5ml のDL−２−アミノ−３−ホスホノプロピオン酸のオリゴマーを添加
し、そしてカップリングを周囲温度で16時間、進行せしめた。 【０１１５】 反応を停止し、そして過剰の試薬を、リン酸ナトリウム緩衝液（pH６で10mM）
に対する5 ℃での16時間の透析により除去した。 反応の程度を、等電点電気泳動により追跡した。この態様で生成された接合体
５を、５℃で貯蔵した。 接合体６を、EDC −活性化されたリポラーゼ１ml当たり2.5ml のDL−２−アミ
ノ−３−ホスホノ酪酸のオリゴマーの添加により類似する経路を通して実質的に
生成した。カップリングを、周囲温度で16時間、進行せしめ、続いて上記のよう
にして透析し、そして接合体６を５℃で貯蔵した。 【０１１６】 【表６】 【０１１７】例７ ．ヒドロキシルアパタイト結合試験 50mMのBritton −Robinson緩衝液（pH 4, 5, 6, 7,及び 8での）中、10mg/ml
のヒドロキシルアパタイト（HAP ）500 μl を、A280＝0.1 まで水により希釈さ
れた、500 μl の酵素（リポラーゼ、又はホスホノ誘導体−修飾されたリポラー
ゼ（例６における接合体５又は６））に添加した。 【０１１８】 得られる混合物を、室温で30分間、撹拌しながらインキュベートした。次にサ
ンプルを14,000G で４分間、遠心分離し、そして上清液500 μl を、1.5ml の水
に希釈した。次に、酵素濃度を、Perkin ElmerからのLS50B 分光計（励起：280n
m 、発光：340nm ）を用いて蛍光分光分析法により測定した。対照は、HAP 添加
を有さなかった。結合を、対照に対して計算した。 【０１１９】 【表７】 本発明の結果は、全pH範囲において、リポラーゼ対照に比較して、HAP へのリ
ポラーゼ接合体の有意に良好な結合を示す。
修飾された酵素を製造するための方法、そのような修飾された酵素を含んで成る
口腔組成物、及び歯垢の予防及び/ 又は除去のためへのそのような口腔ケア組成
物の使用に関する。 【０００２】 発明の背景： 歯垢は、細菌、上皮細胞、白血球、マクロファージ、及び歯の表面上に形成さ
れる他の口腔滲出物の混合物である。歯垢の形成は、虫歯、歯肉炎、歯周病、及
び結果的に歯の損失を導く。前記細菌は非常に枝分かれされた多糖類を生成し、
そして共に、口腔からの微生物は、歯垢の連続した増殖のための付着性マトリッ
クスを形成する。 歯垢が蓄積し続けるにつれて、岩石のような硬質の白色又は黄色の付着物が生
じる。それらの付着物は、石灰化された歯垢、又は歯石と呼ばれ、そして歯垢及
び鉱物、特にカルシウムから唾液において形成される。 【０００３】口腔多糖類： 口腔多糖類は、たとえば食品又は飲料成分として口中に導入されるスクロース
（sucrose ）から、口腔において増殖するう食原生微生物、たとえばストレプト
コッカス・ムタンス（Streptococcus mutans）又はストレプトコッカス・サング
イス（Streptococcus sanguis ）の作用により生成される。 前記口腔多糖類は、α−１, ６−グリコシド結合の大きな部分を有する水溶性
デキストラン、及びα−１, ３−グリコシド結合を有する主鎖及びα−１, ６−
グリコシド結合を有する枝から構成される“ムタン”と呼ばれる水不溶性細胞外
多糖類の主用成分を含んで成る。 【０００４】 ムタンは、ヒドロキシルアパタイト（歯の硬質の外部多孔層を構成する）、及
び歯表面に付着する前記う食性細菌の細胞表面上の受容体タンパク質に結合する
。 虫歯、歯垢及び歯石の形成を妨げるために、種々の酵素、たとえはデキストラ
ナーゼ及び/ 又はムタナーゼを、口腔ケア組成物及び生成物に添加することが提
案されており、そして種々の酵素、たとえばグルカナーゼ、オキシドレダクター
ゼ、たとえばオキシターゼ及びペルオキシターゼを含む多くの口腔ケア生成物が
知られている。 【０００５】 しかしながら、既知に酵素含有口腔ケア生成物に関する問題は、酵素が一般的
に、歯又は歯垢の成分に結合しない事実であり、このことは、たとえば歯磨きに
より適用される酵素が歯及び口から比較的すばやく除去されることを意味する。
これは、そのような酵素が限定された時間のみ作用し、そしてたとえば歯垢を攻
撃することによる口腔衛生の維持のためのそれらの十分な能力が実現されないこ
とを意味する。 【０００６】 Chu and Orgel (Bioconjugate Chem., 8, 103 (1997)は、グルタミン酸のデカ
マー及びリン酸化された吉草酸のトリマーがビオチンに結合され得、そしてその
結合体がヒドロキシルアパタイトへのビオチン−結合タンパク質アビジンの結合
を介在するために使用され得ることを見出した。この文献は、アニオン性ペプチ
ドが骨へのリガンドのキャリヤーとして使用され得ることを示唆する。 【０００７】 Hosainなど. (J. Nucl. Med., 37: 105-107, Jan. 1996) は、ペプチド結合を
含むメトトレキセート−ビホスホネート接合体が骨−探索剤のように挙動するこ
とを報告している。この著者は、この発現に基づいて、抗腫瘍剤の骨腫瘍部位へ
の特異的供給のための可能性を示唆する。 １又は複数のポリアニオン性ドメインを含んで成る修飾された酵素が歯におけ
るヒドロキシルアパタイトに結合し、それにより、口腔ケア組成物における酵素
の延長された酵素作用の発揮を可能にすることが、驚くべきことには見出された
。 【０００８】 発明の要約： 従って、ポリアニオン性ドメインを含んで成るか又はそれに結合される修飾さ
れた酵素、及びそのような修飾された酵素を含んで成る口腔組成物を提供するこ
とが、本発明の目的である。 第１の観点においては、本発明は、酵素及び少なくとも１つのポリアニオン性
ドメインを含んで成る修飾された酵素に関し、ここで前記酵素は、個々の前記ポ
リアニオン性ドメインを含んで成るか、又はそれに共有結合される。 【０００９】 第２の観点においては、本発明は、そのような修飾された酵素を含んで成る口
腔ケア組成物に関する。 第３の観点においては、本発明は、歯疾病の予防又は処理のための、特に、歯
垢の形成の防止又は歯垢の除去のための本発明の修飾された酵素を含んで成る口
腔ケア組成物又は生成物の使用に関する。 【００１０】 発明の具体的な記載： 本明細書において使用される場合、用語“修飾された酵素”とは、少なくとも
１つのポリアニオン性ドメインを含んで成るか又はそれに共有結合される酵素を
意味する。結合は、化学的又は組換えDNA 技法により酵素における種々の基にポ
リアニオン性ドメインをカップリングすることによってもたらされ得、又は前記
ポリアニオン性ドメインは、組み変えDNA 技法により酵素の１又は複数の部位中
に挿入され得る。 【００１１】 本発明の好ましい態様においては、少なくとも１つのポリアニオン性ドメイン
は、酵素のカルボキシレート基及び/ 又はアミノ基に共有結合される。 本発明のさらなる好ましい態様においては、酵素成分は、酵素中のグルタミン
酸及び/ 又はアスパラギン酸残基のカルボキシル基に、及び/ 又は酵素の１又は
複数のC −末端カルボキシル基にポリアニオン性ドメインをカップリングするこ
とによって、化学的に修飾される。 【００１２】 本発明のさらなる好ましい態様においては、修飾された酵素は、組換えDNA 技
法により生成され、すなわちポリアニオン性ドメインは酵素における１又は複数
のC −及び/ 又はN −末端基に結合されることによって問題の酵素の延長を構成
し、又はポリアニオン性ドメインは酵素における１又は複数の部位中に導入され
る。 【００１３】 本発明においては、用語“ポリアニオン性ドメイン”とは、pH７で負の実効電
荷を有し、そして酵素に共有結合され得る分子又は成分を意味する。他方では、
ポリアニオン性ドメインは、酵素自体のアミノ酸配列中に組み込まれ得る。本発
明に従って使用され得る適切なドメインは、１〜150 個のアミノ酸残基、たとえ
ば１〜100 個、たとえば１〜50個、好ましくは２〜40個、たとえば２〜30個、た
とえば２〜20個、より好ましくは３〜15個、たとえば３〜10個のアミノ酸残基を
含んで成るペプチドである。いずれかの天然に存在するアミノ酸が、ドメインの
ペプチド構造体に組み込まれ得る。 【００１４】 天然に存在するアミノ酸のD −鏡像異性体、及びβ−アミノ酸もまた、ドメイ
ンに含まれ得る。ドメインがペプチドである場合、もちろん、ペプチドドメイン
はpH７で負の実効電荷を有することが、必要条件である。従って、ペプチドドメ
インがいずれの負に荷電されたアミノ酸残基を含まない場合、そのペプチドドメ
インは、少なくとも１つ、たとえば１〜150 個、たとえば１〜100 個、たとえば
１〜50個、好ましくは２〜40個、たとえば２〜30個、より好ましくは３〜15個、
たとえば３〜10個のグルタミン酸及び/ 又はアスパラギン酸残基を含むべきであ
る。 【００１５】 ポリアニオン性ペプチドドメインの好ましい例は、合計２〜100 個、たとえば
３〜75個、たとえば３〜50個、好ましくは３〜40個、たとえば３〜30個、たとえ
ば３〜20個、より好ましくは３〜15個、たとえば３〜10個、たとえば４〜８個の
グルタミン酸及び/ 又はアスパラギン酸残基を含んで成るポリグルタミン酸及び
ポリアスパラギン酸である。 【００１６】 荷電していない側鎖を有する少なくとも１つのアミノ酸と共にポリグルタミン
酸及び/ 又はポリアスパラギン酸を含むポリアニオン性ペプチドはまた、効果的
なドメインであり得るであろう。従って、荷電していない側鎖を有するそのよう
なアミノ酸は、いくつかの手段でポリアニオン性ペプチドに組み込まれ得る。多
くの場合、Asp 及び/ 又はGlu 側鎖により生成される個々の負の電荷を、Glu 及
び/ 又はAsp 残基、及び荷電していない側鎖を有するアミノ酸、たとえばアラニ
ン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプ
トファン、プロリン、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、
アスパラギン及び/ 又はグルタミンの交互の挿入により分離することが好都合で
ある。 【００１７】 多くの場合、ポリアニオン性ペプチドにおける種々のドメインは負の電荷を有
し、そして他のドメインは荷電されないまま存続し、すなわち荷電していない側
鎖を有するアミノ酸がポリアニオン性ペプチドドメインに組み込まれる場合、荷
電していない側鎖を有する前記アミノ酸は、２〜50個の残基、好ましくは３〜25
個の残基、たとえば３〜10個の残基、たとえば４〜８個の残基の１又は複数の基
に一緒に位置する。 【００１８】 適切なポリグルタミン酸、及びポリアスパラギン酸の特定の例は次のものであ
る：Glu-Glu, (Glu)3, (Glu)4, (Glu)5, (Glu)6, (Glu)7, (Glu)8, (Glu)9, (Gl
u)10, Asp-Asp, (Asp)3, (Asp)4, (Asp)5, (Asp)6, (Asp)7, (Asp)8, (Asp)9, (
Asp)10, Glu-Asp, (Glu-Asp)2, (Glu-Asp)3, (Glu-Asp)4, (Glu-Asp)5, Asp-Glu
, (Asp-Glu)2, (Asp-Glu)3, (Asp-Glu)4, (Asp-Glu)5, Xaa-Glu, (Xaa-Glu)2, (
Xaa-Glu)3, (Xaa-Glu)4, (Xaa-Glu)5, (Xaa-Glu)6, (Xaa-Glu)7, (Xaa-Glu)8, (
Xaa-Glu)9, (Xaa-Glu)10, Glu-Xaa, (Glu-Xaa)2, (Glu-Xaa)3, (Glu-Xaa)4, (Gl
u-Xaa)5, (Glu-Xaa)6, (Glu-Xaa)7, (Glu-Xaa)8, (Glu-Xaa)9, (Glu-Xaa)10, Xa
a-Asp, (Xaa-Asp)2, (Xaa-Asp)3, (Xaa-Asp)4, 【００１９】 (Xaa-Asp)5, (Xaa-Asp)6, (Xaa-Asp)7, (Xaa-Asp)8, (Xaa-Asp)9, (Xaa-Asp) 10 , Asp-Xaa, (Asp-Xaa)2, (Asp-Xaa)3, (Asp-Xaa)4, (Asp-Xaa)5, (Asp-Xaa)6,
(Asp-Xaa)7, (Asp-Xaa)8, (Asp-Xaa)9, (Asp-Xaa)10, Xaa a -(Glu 又はAsp)b -Xaac -(Glu 又はAsp)d −Xaa e 。ここでXaa は荷電していない側鎖を有するア
ミノ酸、たとえばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フ
ェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、グリシン、セリン、トレオニン、
システイン、チロシン、アスパラギン又はグルタミンであり、そしてa, b, c, d
及びe は0 〜25の範囲の整数である。 【００２０】 本発明に従って使用され得る他の興味あるポリアニオン性ドメインは、下記式
（I ）: 【化２】 【００２１】 [ 式中、n は、１〜15、好ましくは１〜８、たとえば1 〜５、たとえば1 〜３の
範囲の整数であり、ｍは、１〜50、好ましくは２〜40、たとえば２〜30、たとえ
ば２〜20、より好ましくは３〜15、たとえば３〜10の範囲の整数であり、そして
個々のR は、水素、C1-6−アルキル、C1-6−アルケニル、ヒドロキシ、アミノ及
びハロゲン、たとえばフルオロ、クロロ、ヨード及びブロモから成る群から独立
して選択される] で表されるホスホノ誘導体である。好ましくは、R は水素であ
る。 【００２２】 一般式I の適切なポリアニオン性ドメインの特定の例は、２−アミノ−３−ホ
スホノプロピオン酸（ｎ＝１, R ＝H ）、２−アミノ−４−ホスホノ酪酸（ｎ＝
２, R ＝H ）、２−アミノ−５−ホスホノ吉草酸（ｎ＝３, R ＝H ）、及び/ 又
は２−アミノ−６−ホスホノカプロン酸（ｎ＝４, R ＝H ）のトリマー（ｍ＝３
）、テトラマー（ｍ＝４）、ペンタマー（ｍ＝５）、ヘキサマー（ｍ＝６）、ペ
ンタマー（ｍ＝７）、オクタマ−（ｍ＝８）、ノナマー（ｍ＝９）、デカマー（
ｍ＝10）及びそれらの混合物である。 【００２３】 本明細書において、単独で又はもう１つの基の一部として使用される用語“C1 -6 −アルキル”とは、１〜６個の炭素原子を有する、直鎖、枝分かれ鎖又は環状
飽和炭化水素基、たとえばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ
−ブチル、イソ−ブチル、sec −ブチル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘ
キシル、シクロヘキシル、等を示す。 【００２４】 類似する態様において、用語“C2-6−アルケニル”とは、直鎖、枝分かれ鎖、
又は環状であり得、そして1 又は複数の二重結合を含むことができ、そしてシス
及び/ 又はトランス形状を有することができる、２〜６個の炭素原子を有する炭
化水素基、たとえばビニル、アリル、ノーブテニル、２−ブテニル、イソ−ブテ
ニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、４−ペンテニル、３−メチル−１−ブ
テニル、等を示す。 【００２５】 本発明の目的のために適切であると思われるさらなる他のポリアニオン性ドメ
インは、ポリホスフェート、ポリスルホン酸及びポリカルボン酸である。 用語“ポリホスフェート”とは、少なくとも２個、及び好ましくは少なくとも
３個のホスフェート基を含んで成る分子を意味する。そのようなポリホスフェー
ト中のホスフェート基がポリペプチドにおけるアミン基に結合するために使用さ
れる場合、そのポリホスフェートは好ましくは、少なくとも３個のホスフェート
基を含むべきである。好ましいポリホスフェートは、アミノ化されたポリホスフ
ェートである。 【００２６】 用語“ポリスルホン酸”とは、少なくとも２個及び好ましくは、少なくとも３
個のスルホン酸基を含んで成る分子を意味する。そのようなポリスルホン酸中の
スルホン酸基がポリペプチドにおけるアミン基への結合のために使用される場合
、そのポリスルホン酸は好ましくは、少なくとも３個のスルホン酸基を含むべき
である。好ましいポリスルホン酸は、アミノ化されたポリスルホン酸である。 【００２７】 用語“ポリカルボン酸”とは、少なくとも２個及び好ましくは、少なくとも３
個のカルボキシル基含んで成る分子を意味する。そのようなポリカルボン酸中の
カルボキシル基がポリペプチドにおけるアミン基への結合のために使用される場
合、そのポリカルボン酸は、少なくとも３個のカルボキシル基を含むべきである
。適切なポリカルボン酸の例は、クエン酸である。 【００２８】 好ましい種類のポリカルボン酸は、アミノ化されたポリカルボン酸である。ア
ミノ化されたポリカルボン酸の例は、アミノ化されたポリカルボン酸アルカン及
びその誘導体、アミノ化されたポリカルボン酸糖、アミノ化されたポリカルボン
酸アルコール及びアミノ化されたポリカルボン酸ポリアルコールである。適切な
アミノ化されたポリカルボン酸の特定の例は、アミノ化されたポリ（酢酸ビニル
−コ−クロトン酸）、アミノ化されたポリガラクツロン酸及びアミノ化されたポ
リ（アクリルアミド−コ−アシル酸）である。 【００２９】 一般的に、アミノ化されたポリカルボン酸、たとえばアミノ化されたポリカル
ボン酸アルカン、アミノ化されたポリカルボン酸糖、アミノ化されたポリカルボ
ン酸アルコール及びアミノ化されたポリカルボン酸ポリアルコールは、分子当た
り少なくとも１つのアミノ基を有するべきであるが、しかしそれらは適切には、
また、分子当たり1 つ以上のアミノ基も有することができる。 【００３０】 ポリアニオン性ドメインは、もちろん、それぞれ酵素及びポリアニオン性ドメ
インにおける実際の選択された結合基に依存するであろう種々の方法により酵素
に共有結合され得る。従って、当業者のためには、広範囲の種類の化学的カップ
リング技法が利用できる。しかしながら、酵素にポリアニオン性ドメインを化学
的にカップリングするための好ましい方法は、G. T. Hermanson “Bioconjugate
Techniques ”, Academic Press, 1996, 及びG. T. Hermanson など.,“Immobi
lized Affinity Ligand Techniques”, Academic Press, 1992に記載される方法
である。 【００３１】 酵素にポリアニオン性ドメインをカップリングするための一般的な手段は、通
常、酵素における１又は複数の官能基とポリアニオン性ドメインにおける１又は
複数の官能基とを、任意には、適切な触媒又は他のカップリング促進剤の助けを
伴って、反応せしめることを含んで成る。カップリング工程に通常適用されるも
う1 つの手段は、酵素及び/ 又はポリアニオン性ドメインにおける官能基の反応
基への転換、及び反応体、すなわち酵素及びポリアニオン性ドメインの続くカッ
プリングを包含する。 【００３２】 修飾された酵素の生成のために使用され得る適切なカップリング反応技法の例
は、アミン基、チオール基、カルボキシレート基、ヒドロキシル基、アルデヒド
/ ケトン基、活性水素基及び光反応性基を用いての反応技法である。 アミン基は、たとえばイソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、
NHS −エステル、塩化スルホニル、アルデヒド、グリオキサール、エポキシド、
オキシラン、カルボネート、アリール化剤、イミドエステル、無水物、カルボジ
イミドにより活性化された酸基、及び光反応性基、たとえばアリールアジド、ベ
ンゾフェノン、ジアゾ化合物及びジアジリジン誘導体と反応することができるの
で、酵素又はポリアニオン性ドメインにおけるそのような基の形成は、酵素にポ
リアニオン性ドメインを共有結合するために使用され得る。 【００３３】 類似する態様において、チオール反応基、たとえばハロアセタール、ハロゲン
化アルキル誘導体、マレイミド、アジリジン、アクリロイル誘導体、アクリル化
剤、チオール−ジスルフィド交換試薬、たとえばピリジルジスルフィド、TNB −
チオール及びジスルフィド還元体は、便利には、酵素又はポリアニオン性ドメイ
ンにおけるチオール基を通して、ポリアニオン性ドメインと酵素との間に共有結
合を形成するために使用され得る。 【００３４】 他の適切なカップリング手段は、カルボキシルレート−反応基、たとえばジア
ゾアルカン、ジアゾアセチル化合物、CDI 及びカルボジイミド；ヒドロキシル−
反応基、たとえばエポキシド、オキシラン、CDI, N,N’−ジスクシンイミジルカ
ルボネート、N −ヒドロキシスクシンイミジル クロロホルメート、アルキルハ
ロゲン、イソシアネート、及びペリオデ−ト酸化又は酵素酸化によるヒドロキシ
ル基からの反応性アルデヒド基の形成；アルデヒド/ ケトン反応基、たとえばヒ
ドラジン、及び反応、たとえばシッフ塩基形成、還元性アミノ化、及びMannich
縮合；活性水素−反応基、たとえばジアゾニウム誘導体及びヨー素化反応の使用
を包含する。 【００３５】 好ましくは、ポリアニオン性ドメインは、C −N 結合（好ましくは、酵素に起
因する炭素原子及び好ましくは、ポリアニオン性ドメインに起因する窒素原子）
により酵素に共有結合される。好ましい態様においては、ポリアニオン性ドメイ
ンがpH７で全体的に負の電荷を有するペプチドである場合、共有結合はペプチド
結合であり、ここで炭素原子は好ましくは、酵素に起因し、そして窒素原子は好
ましくは、ペプチドに起因する。 【００３６】 ペプチド結合を包含するC −N 結合を確立するための方法およびカップリング
剤は、当業界において良く知られており、たとえばJ. Jones“The Chemical Syn
thesis of Peptides”, Clarendon Press, Oxford, 1991,及びM. Bodanszky and
A. Bodanszky “The Practice of Peptide Synthesis ”, Springer-Verlag, B
erlin, 1994 を参照のこと。 カップリング反応のための特に好ましいカップリング剤は、カルボジイミド、
たとえば１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド（
EDC ）である。 【００３７】 EDC を用いてドメインとタンパク質とを接合するための方法は、“キャリヤー
タンパク質へのハプテン/ 小リガンドの結合のためへのEDC の使用”のためのプ
ロトコール、又は“EDC 及びN −ヒドロキシスクシンイミド又はスルホ−N −ヒ
ドロキシスクシンイミドを用いての溶液におけるタンパク質の効果的２段階カッ
プリングのためのプロトコール”のいずれかを用いて、製造業者の説明書（たと
えば、Pierce Instructions 0457 C, 22980X; 22981X; EDC ）に従って実施され
得る。 【００３８】 さらに、ポリアニオン性ドメインが遊離アミン基を含む場合、そのような基は
便利には、当業者においてよく知られている方法により保護され得る；たとえば
J. Jones, “The Chemical Synthesis of Peptides”, Clarendon Press, Oxfor
d, 1991,及びBodanszky and A. Bondanszky,“The Practice of Peptide Synthe
sis ”, Springer-Verlag, Berlin, 1994 を参照のこと。従って、ポリアニオン
性ドメイン、たとえばペプチドのアミン基は、たとえばEDC による活性化が起こ
る前、tert−ブチルオキシカルボニル（BOC ）により保護され得る。接合を完結
した後、その保護基は、たとえばトリフルオロ酢酸によりBOC 保護基を除去する
標準技法を用いて除去され得る。 【００３９】 たとえば、酵素は、カップリング緩衝液、たとえば200mM の塩化ナトリウムを
含む50mMのMES （pH5.0 ）に溶解され、又はそれにおけるサイズ排除にクロマト
グラフィー処理による透析又は脱塩により移行され得る。ポリアニオン性ドメイ
ン、たとえばペプチド及び/ 又はポリカルボン酸は、同様にカップリング緩衝液
に溶解され得る。 【００４０】 接合反応は、酵素及びドメインを混合し、酵素及びドメインの両者に関して、
たとえば３mg/ml の最終濃度にし、続いて、mg酵素当たり５mgのEDC と共に混合
することによって、進行させることができる。次に、接合反応は、連続した撹拌
を伴って、室温で約２時間、実施する。反応は、サイズ排除クロマトグラフィー
により脱塩することによって、又は５℃での0.2Mの酢酸アンモニウム（pH6.9 ）
に対しての十分に透析により、過剰の試薬の除去により停止される。次に、得ら
れる誘導体は、５℃で貯蔵され得る。 【００４１】 好ましい方法においては、酵素はまず、“タンパク質の２段階カップリング”
方法でのEDC により活性化され、続いて、透析又は脱塩により過剰のEDC が除去
される。接合反応は、活性化された酵素及びドメイン、たとえばペプチド及び/
又はポリカルボン酸を混合することによって進行することができ、そして続いて
、誘導体が標準的方法を用いて精製され得る。 【００４２】 ドメインの修飾又は組み込みの程度はもちろん、初期酵素、ドメイン及び/ 又
はカルボジイミド濃度の調節により調整され得る。カップリング緩衝液のpH又は
温度の変動はまた、特定酵素についての接合反応を最適化するためにも使用され
得る。 基質、基質類似体又は可逆性インヒビターによる活性部位保護は、修飾反応を
調整するために使用され得る。 本発明のもう1 つの好ましい態様においては、酵素は、グリコシル化された酵
素の炭水化物部分への上記ドメインの結合を通にして修飾され得る。 【００４３】 炭水化物の過ヨウ素酸塩酸化は、最初にシッフ塩基を生成する、ポリアニオン
性ドメイン上のアミノ基と容易に反応するアルデヒド基の生成のためによく確立
された従来の技法である。反応生成物は、標準方法により、たとえばNaBH4 又は
NaCNBH3 を用いての還元により安定化され得る（たとえば、G. T. Hermanson, B
ioconjugate Techniques, Academic Press, 1996を参照のこと）。この方法は、
１段階又は２段階工程として行われ得、そして多くのパラメーターが、特定の酵
素及び/ 又は特定の適用のための反応条件を最適化するために変えられ得る。 【００４４】 本発明のもう１つの好ましい態様においては、酵素は、組換えDNA −技法によ
り１又は複数のアミノ酸の置換及び/ 又は付加により修飾され得る。従って、本
発明はさらに、修飾された酵素を含んで成る修飾された酵素に関する。酵素修飾
は、たとえば、 i ）酵素の１又は複数の部位における少なくとも１つのグルタミン酸及び/ 又
はアスパラギン酸残基の挿入、たとえば１〜10個のグルタミン酸及び/ 又はアス
パラギン酸残基、好ましくは１〜７個のグルタミン酸及び/ 又はアスパラギン酸
残基、たとえば１〜５個のグルタミン酸及び/ 又はアスパラギン酸残基の挿入； 【００４５】 ii) 少なくとも１つのグルタミン酸又はアスパラギン酸を含んで成る少なくと
も１つのループ、たとえば： EEEEEEEEEEEEEEEEE, DDDDDDDDDDDDDDDDD, DEDEDEDEDEDEDEDED EPEPEPEPEPEPEPEPE, DPDPDPDPDPDPDPDPD, DADADADADADADADAD の挿入、上記配列の長さ、及びアスパラギン酸、グルタミン酸残基、及び荷電し
ていない側鎖を有するアミノ酸の数はもちろん、問題の酵素及び修飾された酵素
の所望の性質に依存して広範囲で変化することができ； 【００４６】 iii)酵素における１又は複数のN −及び/ 又はC −末端の延長であり得る。前
記延長を構成することができるアミノ酸配列の好ましい例は、前に記載された通
りであり、たとえば合計２〜100 個、たとえば３〜75個、たとえば３〜50個、好
ましくは３〜40個、たとえば３〜30個、たとえば３〜20個、より好ましくは３〜
15個、たとえば３〜10個、たとえば４〜８個のグルタミン酸及び/ 又はアスパラ
ギン酸残基を含んで成るポリグルタミン酸及びポリアスパラギン酸であり得る。 上記挿入及びN −及びC −末端延長は便利には、当業者に知られている一般的
方法及び原理を用いて、組換えDNA −技法により実施され得る。 【００４７】口腔ケア組成物： 本発明の口腔ケア組成物又は生成物は、歯のヒドロキシルアパタイトに結合さ
れる修飾された酵素の酵素作用による歯垢の予防及び/ 又は除去性を、主要機能
として有するが、そのような組成物又は生成物はまた、直接的に又は間接的に、
同時に他の口腔ケア機能、たとえば一般的に虫歯、歯肉炎及び歯周病の予防機能
を有する。 【００４８】 本発明の修飾された酵素の酵素成分は、所望する目的のために適切ないずれか
の酵素であり得る。それは特に、オキシドレダクターゼ、たとえばオキシダーゼ
及びペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、グルカナーゼ、エステラーゼ
、デアミナーゼ、ウレアーゼ及び多糖ヒドロラーゼ、又はそれらの混合物から成
る群から選択された酵素である。 口腔ケア組成物のための好ましい酵素活性は、グルカナーゼ活性、たとえばα
−グルコシダーゼ活性、たとえばデキストラナーゼ、ムタナーゼ及び/ 又はプル
ラナーゼ活性である。 【００４９】 適切なグルカナーゼは、酵素分類EC 3.2.1における酵素、特に次のものを包含
する：グルカン１, ４−α−グルコシダーゼ（3.2.1.3 ）、セルラーゼ（3.2.1.
4 ）、エンド−１, ３（４）−β−グルカナーゼ（3.2.1.6 ）、エンド−１, ４
−β−キシラナーゼ（3.2.1.8 ）、デキストラナーゼ（3.2.1.11）、キチナーゼ
（3.2.1.14）、ポリガラクツロナーゼ（3.2.1.15）、リゾチーム（3.2.1.17）、
β−グルコシダーゼ（3.2.1.21）、α−ガラクトシダーゼ（3.2.1.22）、β−ガ
ラクトシダーゼ（3.2.1.23）、アミロ−１, ６−グルコシダーゼ（3.2.1.33）、
キシラン１, ４−β−キシロシダーゼ（3.2.1.37）、 【００５０】 グルカンエンド−１, ３−β−D −グルコシダーゼ（3.2.1.39）、α−デキス
トリンエンド−１, ６−グルコシダーゼ（3.2.1.41）、スクロースα−グルコシ
ダーゼ（3.2.1.48）、グルカンエンド−１, ３−α−グルコシダーゼ（3.2.1.59
）、グルカン１, ４−β−グルコシダーゼ（3.2.1.74）、グルカンエンド−１,
６−β−グルコシダーゼ（3.2.1.75）、アラビナンエンド−１, ５−α−アラビ
ノシダーゼ（3.2.1.99）、ラクターゼ（3.2.1.108 ）及びキトナナーゼ（3.2.1.
132 ）。 【００５１】 適切なグルカナーゼの例は、次のものを包含する：トリコダーマ・ハルジアナ
ム（Trichoderma harzianum ）に由来するα−１, ３−グルカナーゼ；パエシロ
ミセス（Paecilomyces）株に由来するα−１, ６−グルカナーゼ；バチルス・ス
ブチリス（Bacillus subtilis ）に由来するβ−グルカナーゼ；ヒュミコラ・イ
ンソレンス（Humicola insolens ）に由来するβ−グルカナーゼ；アスペルギラ
ス・ニガー（Aspergillus niger ）に由来するβ−グルカナーゼ；トリコダーマ
（Trichoderma ）株に由来するβ−グルカナーゼ；オエルスコビア・キサンチネ
オリチカ（Oerskovia Xanthineolytica ）株に由来するβ−グルカナーゼ；アス
ペルギラス・ニガーに由来するエキソ−１, ４−α−D グルコシダーゼ（グルコ
アミラーゼ）。 【００５２】 次の微生物アミラーゼがまた企画される：バチルス・スブチリスに由来するα
−アミラーゼ；バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefac
iens）に由来するα−アミラーゼ；バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacill
us stearothermophilus ）に由来するα−アミラーゼ；アスペルギラス・オリザ
エ（Aspergillus oryzae）に由来するα−アミラーゼ；非病原性微生物に由来す
るαアミラーゼ。 【００５３】 さらに、企画される適切なグルカナーゼは、次のものを包含する：アスペルギ
ラス・ニガーに由来するα−ガラクトシダーゼ；ヒュミコラ・インソレンス（Hu
micola insolens ）に由来するペントサナーゼ、キシラナーゼ、セロビアーゼ、
セルラーゼ、ヘミ−セルラーゼ；トリコダーマ・レセイ（Trichoderma reesei）
に由来するセルラーゼ；非病原性カビに由来するセルラーゼ； 【００５４】 アスペルギラス・ニガーに由来するペクチナーゼ、セルラーゼ、セルテーゼ、
アラビナ−ゼ、ヘミ−セルロース；ペニシリウム・リラシナム（Penicillum lil
acinum）に由来するデキストラナーゼ；非病原性カビに由来するエンド−グルカ
ナーゼ；バチルス・アシドプリチカス（Bacillus acidopullyticus）に由来する
プルラナーゼ；クルイベロミセス・フラギリス（Kluyveromyces fragilis）に由
来するβ−ガラクトシダーゼ；トリコダーマ・レセイに由来するキシラナーゼ。 【００５５】 容易に入手できる市販のグルカナーゼの特定の例は次のものを包含する：Alph
a-Gal （商標）, Bio-Feed（商標） Alpha, Bio-Feed（商標） Beta, Bio-Feed
（商標） Plus, Novozyme （商標） 188, Carezyme（商標）, Celluclast（商標
）, Cellusoft （商標）, Ceremyl （商標）, Citrozym（商標）, Denimax （商
標）, Dezyme（商標）, Dextrozyme（商標）, Finizym （商標）, Fungamyl（商
標）, Gamanase（商標）, Glucanex（商標）, Lactozym（商標）, Maltogenase
（商標）, Pentopan（商標）, Pectinex（商標）, Promozyme （商標）, Pulpzy
me（商標）,Novamyl（商標）, Termamyl （商標）, AMG (Amyloglucosidase No
vo), Sweetzyme（商標）, Aquazym （商標）（すべての酵素は、Novo Nordisk A
/Sから入手できる）。他のカルボヒドラーゼは、他の会社から入手できる。 【００５６】 グルカナーゼ変異体がまた。酵素成分として企画されることが、理解されるべ
きである。 もう１つのグループの興味ある酵素は、オキシドレダクターゼ（すなわち、Re
commendations (1992) of the International Union of Biochemical and Molec
ular Biology (IUBMB)に従って酵素分類番号E.C.1 下で分類された酵素）である
。 【００５７】 例として、酵素分類（E.C.）番号下で分類された次のものから選択されたオキ
シドレダクターゼが包含される：グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ
NAD + (1.1.1.8),グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ NAD(P)+ (1 .1.1.94)、グリセロール−３−リン酸１−デヒドロゲナーゼ NADP (1.1.1.94)
、グルコースオキシダーゼ（1.1.3.4 ）、ヘキソースオキシダーゼ（1.1.3.5 ）
、カテコールオキシダーゼ（1.1.3.14）、ビリルビンオキシダーゼ（1.3.3.5 ）
、アラニンデヒドロゲナーゼ（1.4.1.1 ）、 【００５８】 グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（1.4.1.2 ）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ
NAD(P)+ (1.4.1.3) 、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ NADP+ (1.4.1.4)
、L −アミノ酸デヒドロゲナーゼ（1.4.1.5 ）、セリンデヒドロゲナーゼ（1.4.
1.7 ）、バリンデヒドロゲナーゼ NADP＋ (1.4.1.8) 、ロイシンデヒドロゲナ
ーゼ（1.4.1.9 ）、グリシンデヒドロゲナーゼ（1.4.1.10）、L −アミノ酸オキ
シダーゼ（1.4.3.2 ）、D −アミノ酸オキシダーゼ（1.4.3.3 ）、L −グルタミ
ン酸オキシダーゼ（1.4.3.11）、 【００５９】 プロテイン−リシン６−オキシダーゼ（1.4.3.13）、L −リシンオキシダーゼ
（1.4.3.14）、L −アスパラギン酸オキシダーゼ（1.4.3.16）、D −アミノ酸デ
ヒドロゲナーゼ（1.4.99.1）、プロテインジスルフィドレダクターゼ（1.6.4.4
）、チオレドキシンレダクターゼ（1.6.4.5 ）、プロテインジスルフィドレダク
ターゼ（グルタチオン）（1.8.4.2 ）、ラッカーゼ（1.10.3.2）、カタラーゼ（
1.11.1.6）、ペルオキシダーゼ（1.11.1.7）、リポキシゲナーゼ（1.13.11.12）
、スーパーオキシドジスムターゼ（1.15.1.1）。 【００６０】 前記グルコースオキシダーゼは、アスペルギラス・ニガーに由来することがで
きる。 前記ラッカーゼは、ポリポラス・ピンスチタス（Polyporus pinsitus）、ミセ
リオプトラ・サーモフィラ（Myceliophtora thermophila ）、コプリナス・シネ
レウス（Coprinus cinereus ）、リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）
、リゾクトニア・プラチコラ（Rhizoctonia praticola ）、スシタリジウム・サ
ーモフィラム（Scytalidium thermophilum）及びラス・ベルニシフュラ（Rhus V
ernicifera）に由来することができる。 【００６１】 ビリルビンオキシダーゼは、ミロテケシウム・ベルカリア（Myrothechecium V
errucaria ）に由来することができる。 ペルオキシダーゼは、たとえば大豆、セイヨウワサビ又はコプリナス・シネレ
ウス（Coprinus cinereus ）に由来することができる。 プロテインジスルフィドレダクターゼは、ウシ起源のプロテインジスルフィド
レダクターゼ、アスペルギラス・オリザエに由来するプロテインジスルフィドレ
ダクターゼ、又はE.コリに由来するDsbA又はDsbCと共に、WO95/00636号, WO95/0
1425号及びWO95/01420号（Novo Nordisk A/S）のいずれかに言及され得る。 【００６２】 容易に入手できる市販のオキシドレダクターゼの特定例は、Gluzyme （商標）
(Novo Nordisk A/Sから入手できる酵素) を包含する。しかしながら、他のオキ
シドレダクターゼは、他からも入手できる。 オキシドレダクターゼの変異体はまた、親酵素として考慮されることが、理解
されるべきである。 もう１つのグループの興味ある酵素は、リパーゼ（すなわち、Recommendation
s (1992) of the International Union of Biochemistry and Molecular Biolog
y (IUBMB) に従って、酵素分類番号E.C. 3.1.1（カルボン酸エステルヒドロラー
ゼ）下で分類される酵素）であり、そしてこのグループ内のリパーゼも包含する
。 【００６３】 リパーゼの例として、酵素分類（E.C.）番号下で分類された次のものから選択
されたリパーゼを包含する：3.1.1 ( すなわち、いわゆるカルボン酸エステルヒ
ドロラーゼ) 、たとえば（3.1.1.3 ）トリアシルグリセロールリパーゼ、（3.1.
1.4 ）ホスホリパーゼA2。 【００６４】 リパーゼの例は、次の微生物に由来するリパーゼを包含する。示される特許出
願は、引用により本明細書中に組み込まれる： ヒュミコラ（Humicola）、たとえばヒュミコラ・ブレビスポラ（Humicola bre
vispora ）、ヒュミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa ）、ヒュミコラ・
ブレビスvar.サーモイデア（Humicola brevis var. thermoidea ）及びヒュミコ
ラ・インソレンス（Humicola insolens ）( アメリカ特許第4,810,414 号) ； 【００６５】 シュードモナス（Pseudomonas ）、たとえばシュードモナス・フラギ（Pseudo
monas fragi ）、シュードモナス・スツゼリ（Pseudomonas stutzeri）、シュー
ドモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia ）及びシュードモナス・フルオレス
センス（Pseudomonas fluorescens ）(WO89/04361 号) 、又はシュードモナス・
プランタリ（Pseudomonas plantarii ）又はシュードモナス・グラジオリ（Pseu
domonas gladioli）( アメリカ特許第4,950,417 号（Solvay酵素）) 又はシュー
ドモナス・アルカリゲネス（Pseudomonas alcaligenes ）及びシュードモナス・
シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes ）( ヨーロッパ特許
第218272号) 、又はシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina ）(W
O88/09367 号；アメリカ特許第5,389,536 号) ； 【００６６】 フサリウム（Fusarium）、たとえばフサリウム・オキシスポラム（Fusarium o
xysporum）( ヨーロッパ特許第130064号) 又はフサリウム・ソラニ・ピシ（Fusa
rium solani pisi）(WO90/09446 号) ； 【００６７】 ムコール（Mucor ）（また、リゾムコールとも呼ばれる）、たとえばムコール
・ミエヘイ（Mucor miehei）( ヨーロッパ特許第238023号) ； クロモバクテリウム（Chromobacterium ）( 特に、クロモバクテリウム・ビス
コサム（Chromobacterium viscosum）) ； アスペルギラス（Aspergillus ）( 特に、アスペルギラス・ニガー（Aspergil
lus niger ）) ； 【００６８】 カンジダ（Candida ）、たとえばカンジダ・シリンドラセア（Candida cylind
racea ）（カンジダ・ルゴサ（Candida rugosa）とも呼ばれる）またはカンジダ
・アンタルクチカ（Candida antarctica）（WO88/02775号）、又はカンジダ・ア
ンタルクチカ リパーゼA 又はB （WO94/01541号及びW089/02916号）； ゲオトリカム（Geotricum ）、たとえばゲオトリカム・カンジダム（Geotricu
m candidum）(Schimada など., (1989), J. Biochem., 106, 383-388) ； ペニシリウム（Penicillium ）、たとえばペニシリウム・カメンベルチ（Peni
cillium camembertii ）(Yamaguchiなど., (1991), Gene 103, 61-67) ； 【００６９】 リゾプス（Rhizopus）、たとえばリゾプス・デレマー（Rhizopus delemar）(H
ass など., (1991), Gene 109, 107-113) 、又はリゾプス・ニベウス（Rhizopus
niveus ）(Kugimiya など., (1992) Biosci. Biotech. Biochem 56, 716-719)
、又はリゾプス・オリザエ（Rhizopus oryzae ）； バチルス（Bacillus）、たとえばバチルス・スブチリス（Bacillus subtilis
）(Dartoisなど., (1993) Biochemca et Biophysica acta 1131, 253-260) 又は
バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus ）( 日本特
許64/7744992号) 、又はバチルス・プミラス（Bacillus pumilus）(WO91/16422
号) 。 【００７０】 容易に入手できる市販のリパーゼの特定例は、Lipolase（商標）, Lipolase（
商標） ultra, Lipozyme（商標）, Palatase（商標）, Novozym （商標） 435,
Lecitase（商標） (すべてはNovo Nordisk A/Sから入手できる) を包含する。 他のリパーゼの例は、次のものを包含する：Lumafast（商標）, すなわちGene
ncor Int. Inc.からのシュードモナス・メンドシナ リパーゼ；Lipomax （商標
）, すなわちGist Brocades/Genencor Int. Inc.からのシュードモナス・プソイ
ドアルカリゲネス リパーゼ；Unileverからのフサリウム・ソラニ リパーゼ（
クチナーゼ）；Solvay 酵素からのバチルスsp. リパーゼ。他のリパーゼは、他
の会社から入手できる。 【００７１】 リパーゼ変異体もまた、適切な酵素として見なされることが、理解されるべき
である。そのようなリパーゼの例は、たとえばWO93/01285号及びWO95/22615号に
記載される。 リパーゼの活性は、“Methods of Enzymatic Analysis ”, Third Edition, 1
984, Verlag Chemie, Weinhein, vol. 4に記載のようにして、又はAF95/5 GB （
Novo Nordisk A/Sからの要求に基づいて入手できる）に記載のようにして、決定
され得る。 【００７２】 好ましくは、本発明の修飾された酵素は、遊離酵素の触媒活性の少なくとも１
％好ましくは少なくとも２％、たとえば少なくとも５％、たとえば少なくとも10
％、より好ましくは少なくとも20％、たとえば少なくとも30％、たとえば少なく
とも40％、さらにより好ましくは少なくとも50％、たとえば少なくとも60％、た
とえば少なくとも70％、さらにより好ましくは少なくとも80％、たとえば少なく
とも90％、たとえば少なくとも95％である酵素活性を有し、最も好ましくは、そ
の修飾された酵素は遊離酵素の触媒活性に対して実質的に同一である（“Method
s of Enzymatic Analysis ”, 3 rd. Edition, vol.1-10, 1984, Verlag Chemie
, Weinheimに従って決定される）。 【００７３】 異なったタイプの種類の酵素の活性を決定するための方法は、この本の次のvo
l.に見出される： Oxidoreduktaser ： vol.３、 Carbohydraser ： vol.４、 Proteaser ： vol.５、 Lipaser ： vol.６。 【００７４】 他の酵素活性は、たとえばデキストラナーゼ及び/ 又はムタナーゼ、たとえば
プロテアーゼ、たとえばパパイン、エンドグルコシダーゼ、リパーゼ、アミラー
ゼ及びそれらの混合物の他に又はそれらの代わりに、本発明の口腔ケア組成物に
含まれ得ることがまた理解される。 デキストラナーゼは、糸状菌パエシロミセス（Paecilomyces）属の株、特にパ
エシロミセス・リラシナム（Paecilomyces lilacinum）の株、パエシロミセス・
リラシナム デキストラナーゼ（Novo Nordisk A/Sから入手できる）から誘導さ
れ得る。 【００７５】 本発明の口腔ケア組成物においてデキストラナーゼと組合しての使用のために
適切なムタナーゼは、次のものを含む群からの糸状菌により生成され得る：特に
、トリコダーマ・ハルジアナムの株、たとえばトリコダーマ・ハルジアナムCBS2
43.71 からのトリコダーマ、又は特に、ペニシリウム・フニキュロサム（Penici
llium funiculosum ）の株、たとえばペニシリウム・フニキュロサムNRRL1768、
ペニシリウム・リラシナムの株、たとえばペニシリウム・リラシナムNRRL896 、 【００７６】 又はペニシリウム・プルプロゲナム（Penicillum purpurogenum ）の株、たと
えばペニシリウム・プルプロゲナムCBS238.95 、又はシュードモナス属の株、又
はフラボバクテリウムsp. (Flavobacterium sp.)の株、又はバチルス・サーキュ
ランセ（Bacillus circulanse ）の株、又はアスペルギラスsp. の株、又はスト
レプトミセスの株。ムタナーゼはまた、ペニシリウム・プルプロゲナムからも誘
導され得る。 【００７７】 本発明の口腔ケア組成物は適切には、最終口腔ケア生成物における酵素活性単
位として計算される酵素活性に相当する量の酵素成分、たとえばデキストラナー
ゼ及び/ 又はムタナーゼを、それぞれ0.001 〜1000KDU/ml、好ましくは0.01〜50
0KDU/ml 、特に0.1 〜100KDU/ml 、及び0.001 〜1000MU/ml 、好ましくは0.01〜
500MU/ml、特に0.01〜100MU/ml及び0.01〜100MU/mlの範囲で組み込んでいる。 口腔ケア組成物への使用に関しては、修飾された酵素は、20℃〜45℃、特に37
℃近くの温度で（ヒトの口腔においての一般的な温度はこの範囲内にあるので）
、十分な酵素活性を示すべきである。 【００７８】口腔ケア生成物： 上記で説明されたように、本発明はまた、本明細書に記載されるような修飾さ
れた酵素を含んで成る口腔ケア組成物及び生成物にも関する。口腔ケア生成物は
、いずれかの適切な物理形（すなわち、ペースト、ゲル、液体、粉末、軟膏、錠
剤、チューインガム、等）を有することができる。“口腔ケア生成物”とは、歯
垢の形成を妨げ、歯垢を除去し、歯疾病を妨げそして/ 又は処理し、等にするこ
とによって、ヒト及び動物の口における口腔衛生を維持し又は改良するために使
用され得る生成物として定義され得る。本発明の口腔ケア生成物はまた、義歯、
人口歯及び同様のものを清浄するための生成物を包含する。 【００７９】 そのような口腔ケア生成物の例は、歯磨き、歯用クリーム、ゲル又は歯用粉末
、歯用治療剤（odontics）、マウスウオッシュ、前−又は後−ブラッシング用す
すぎ配合物、チューインガム及びトローチ剤を包含する。 歯磨き及び歯用ゲルは典型的には、研磨艶出し剤、発泡剤、風味剤、保湿剤、
結合剤、増粘剤、甘味剤、白化/ 漂白/ 染色除去剤、水及び任意には、酵素を含
む。 歯垢除去液体を包含するマウスウオッシュは典型的には、水/ アルコール溶液
、風味剤、保湿剤、甘味剤、発泡剤、着色剤、及び任意には、酵素を含んで成る
。 【００８０】 研磨艶出し剤はまた、本発明の歯磨き生成物中に導入され得る。適切な研磨艶
出し剤は、アルミナ及びその水和物、たとえばα−アルミナ三水和物、三珪酸マ
グネシウム、炭酸マグネシウム、カオリン、アルミノシリケート、たとえば焼成
珪酸アルミニウム及び珪酸アルミニウム、炭酸カルシウム、珪酸ジルコニウム、
及び又は、粉末化されたプラスチック、たとえばポリ塩化ビニル、ポリアミド、
ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、フェノール−ホルムアルデヒド樹脂
、メラミン−ホルムアルデヒド樹脂、ウレア−ホルムアルデヒド樹脂、エポキシ
樹脂、粉末化されたポリエチレン、シリカキセロゲル、ヒドロゲル及びエーロゲ
ル及び同様のものを包含する。 【００８１】 ピロリン酸カルシウム、水不溶性アルカリメタホスフェート、リン酸二カルシ
ウム及び/ 又はその二水和物、オルトリン酸二カルシウム、リン酸三カルシウム
、粒質状ヒドロキシルアパタイト及び同様のものまた、研磨剤として適切である
。それらの物質の混合物を使用することもまた可能である。 口腔ケア生成物の性質に依存して、研磨剤は、0 〜70重量％、好ましくは、１
〜70重量％の量で存在することができる。歯磨きに関しては、研磨剤含有率は、
最終歯磨き生成物の10〜70％重量％の範囲である。 【００８２】 保湿剤は、歯磨きからの水の損失を妨げるために使用される。本発明の口腔ケ
ア生成物への使用のための適切な保湿剤は次の化合物及びその混合物を含む：グ
リセロール、ポリオール、ソルビトール、ポリエチレングリコール（PEG ）、プ
ロピレングリコール、１, ３−プロパンジオール、１, ４−ブタンジオール、水
素化され、部分的に加水分解された多糖類及び同様のもの。保湿剤は、一般的に
、歯磨きにおいて、0 〜80％、好ましくは５〜70％重量％の量で存在する。 【００８３】 シリカ、スターチ、トラガカントゴム、キサンガム、トチャカの抽出物、アル
ギネート、ペクチン、セルロース誘導体、たとえばヒドロキシルエチルセルロー
ス、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及びヒドロキシプロピルセルロース
、ポリアクリル酸及びその塩、及びポリビニルピロリドンは、歯磨き生成物を安
定化するために使用され得る適切な増粘剤及び結合剤の例である。増粘剤は、歯
磨き、クリーム及びゲルにおいて、その最終生成物の0.1 〜20重量％の量で存在
し、そして結合剤は、0.01〜10重量％の量で存在する。 【００８４】 発泡剤として、石鹸、及びアニオン性、カチオン性、非イオン性、両親媒性及
び/ 又は両性イオン界面活性剤が使用され得る。それらは、最終生成物の0 〜15
重量％、好ましくは0.1 〜13重量％、より好ましくは0.25〜10重量％のレベルで
存在することができる。 界面活性剤は、それらが修飾された酵素に対して不活性化効果を付与しない程
度まで適切である。界面活性剤は、脂肪アルコールスルフェート、10〜20個の炭
素原子を有するスルホン化されたモノグリセリド又は脂肪酸の塩、脂肪酸−アル
ブミン縮合生成物、脂肪酸アミド及びタウリンの塩、及び/ 又はイセチオン酸の
脂肪酸エステルの塩を包含する。 【００８５】 適切な甘味剤は、サッカリンを包含する。 風味剤、たとえば、ハッカは、通常、低い量で、たとえば0.01〜約５重量％、
特に0.1 〜５重量％の量で存在する。 白化/ 漂白剤は、H2O2を包含し、そして最終生成物の重量に基づいて計算され
ル場合、５重量％以下、好ましくは0.25〜４重量％の量で添加され得る。 水は通常、生成物、たとえば歯磨きに流動形を付与するために十分な量で添加
される。 【００８６】 さらに、水溶性抗菌剤、たとえばクロルヘキシジンジグルコネード、ヘキセチ
ジン、アレキシジン、第四アンモニウム抗菌化合物、及び一定の金属イオン、た
とえば亜鉛、銅、銀及び錫の水溶性源（たとえば、塩化亜鉛、銅、及び第一錫、
及び硝酸銀）がまた含まれ得る。 フルオリド源、顔料/ 着色剤、保存剤、ビタミン、pH−調節剤、抗−虫歯剤、
脱感作剤、等として使用され得る化合物の添加もまた、本発明に従って考慮され
る。 【００８７】 酵素は、口腔の洗浄のために使用される場合、いくつかの利点を提供する。プ
ロテアーゼは、歯表面上に吸着され、そして歯垢の最初の層である薄膜を形成す
る唾液タンパク質を分解する。リパーゼと共にプロテアーゼは、細菌細胞壁及び
膜の構造成分を形成するタンパク質及び脂質を溶解することによって細菌を破壊
する。 【００８８】 デキストラナーゼは、細菌付着のためのマトリックスを形成する、細菌により
生成される有機骨格構造体を分解する。プロテアーゼ及びアミラーゼは、歯垢形
成を妨げるのみならず、またカルシウムを結合する炭水化物−タンパク質複合体
を分解し、すなわちミネラリゼーションを妨げることによって、歯石の進行も妨
げる。 【００８９】 本発明の口腔ケア組成物から生成される歯磨き（最終歯磨き組成物中の重量％
）は、典型的には、次の成分を含んで成る： 研磨剤 ：10〜70％ 保湿剤 ：0 〜80％ 増粘剤 ：0.1 〜20％ 結合剤 ：0.01〜10％ 甘味剤 ：0.1 〜5 ％ 発泡剤 ：0 〜15％ 白化剤 ：0 〜5 ％ 修飾された酵素 ：0.0001〜20％。 【００９０】 本発明の口腔ケア組成物から生成されるマウスウォッシュ（最終口腔洗浄組成
物中の重量％）は、典型的には、次の成分を含んで成る： 0 〜20％ ：保湿剤 0 〜2 ％ ：界面活性剤 0 〜5 ％ ：修飾された酵素 0 〜20％ ：エタノール 0 〜2 ％ ：他の成分（たとえば、風味剤、甘味剤、活性成分、たとえば 弗化物） 0 〜70％ ：水。 マウスウオッシュは、非希釈形（すなわち、使用の前に希釈されるべきである
）又はすぐ使用できる形で存在することができる。 【００９１】口腔ケア組成物又は生成物の使用： 第３の観点において、本発明は、歯垢の形成を妨げ又は歯垢を除去するためへ
の本発明の組成物又は本発明の口腔ケア生成物の使用に関する。 【００９２】 本発明の生成物の使用は典型的には、口腔に安全且つ効果的な量の前記生成物
を適用することを包含する。それらの量（たとえば、0.3 〜約2g）は、歯磨き又
は歯用ゲルである場合、適切な時間、たとえば約15秒〜約12時間、口腔に維持さ
れる。修飾された酵素含有口腔ケア組成物又は生成物自体が、歯磨き又はマウス
ウオッシュに関して、限定された期間、たとえば約１〜３分間、口腔に単に維持
される場合でさえ、前記修飾された酵素は、歯表面に結合されるようになり、そ
して従って、延長された期間、酵素作用を付与することができることは、上記の
記載から明らかであろう。 【００９３】製造方法： 本発明の口腔ケア組成物及び生成物は、口腔生成物分野において一般的である
方法を用いて製造され得る。 本発明は、次の非制限的な例でさらに例示されるであろう。材料及び方法： 【００９４】酵素： パエシロミセス・リラシナム（Paecilomyces lilacinum）由来の組換えデキス
トラナーゼ（Novo Nordisk A/Sから入手できる）。 サーモミセス・ラヌギノサス（Thermomyces lanuginosus ）由来の組換えリパ
ーゼ（Novo Nordisk A/Sから入手できる）。 【００９５】方法： ヒドロキシアパタイトディスクの調製： ヒドロキシアパタイトディスクを、５分間、約5,900kg （13,000lb）で、ディ
スクダイにおいて250mg のヒドロキシアパタイトを圧縮することによって調製す
る。次に、ディスクを600 ℃で４時間、燒結し、そして最終的に無菌脱イオン水
により水和化した。 【００９６】ヒドロキシアパタイトディスクの殺菌： HAP ディスクを、180 ℃で２時間、殺菌し、無菌脱イオン水により水和化し、
そしてNunc管（10mlの体積）の蓋に配置する。デキストラナーゼ（KDU ）の決定： １Kilo Novoデキストラナーゼ単位（１KDU ）は、次の標準条件に基づいての
デキストラナーゼの決定のためのNovo Nordisk方法において１時間当たり１g の
マルトースに相当する還元糖を形成するデキストランを分解する酵素の量である
： 【００９７】 基質： デキストラン500 （Pharmacia ） 反応時間： 20分 温度： 40℃ pH： 5.4 。 Novo Nordisk’s 分析方法（AF120 ）の詳細な記載は、必要に応じて入手でき
る。 【００９８】 【実施例】例１ ．修飾されたデキストラナーゼの調製 カルボジイミド−介在性カップリングを通してのポリグルタミン酸とデキスト
ラナーゼとの結合を、標準的方法に従って行った；たとえば、G. T. Hermanson,
Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996を参照のこと。 デキストラナーゼの酵素原液を、250mM のNaClを含む、pH6.0 での50mMのMES
緩衝液に希釈した。反応混合物におけるデキストラナーゼの最終濃度は、ml当た
り3.7mg の酵素であった。 【００９９】 反応混合物におけるデキストラナーゼを、周囲温度で１時間、１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC ；表１を参照のこと）
の添加により活性化した。 １時間後、その活性化されたデキストラナーゼを、PD10カラム（Pharmacia ）
上でのサイズ−排除クロマトグラフィーにより精製した。次に、50mgのポリグル
タミン酸（Mr＝1000D ）（Sigma ＃p1818 ）を添加し、そしてカップリングを室
温で20時間、進行せしめた。 【０１００】 反応を停止し、そして過剰の試薬を、酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5 で10mM）
に対しての65時間の透析により除去した。酢酸ナトリウム緩衝液を、この期間、
数回、変えた。 反応の程度を、等電点電気泳動により追跡した。 この態様で生成される接合体を、５℃で貯蔵した。 【０１０１】 【表１】【０１０２】例２ ．ヒドロキシルアパタイト結合試験 50mMのBritton −Robinson緩衝液（pH 4, 5, 6, 7, 8及び9 での）中、10mg/m
l のヒドロキシルアパタイト（HAP ）の溶液500 μl を、デキストラナーゼ接合
体溶液（A280＝0.1 まで水において希釈されている）500 μl に添加した。得ら
れる混合物を室温で30分間、撹拌しながらインキュベートした。次に、サンプル
を、14,000G で４分間遠心分離し、そして上清液500 μl を、水1.5ml に希釈し
た。次に、酵素又は修飾された酵素濃度を、Perkin ElmerからのLS50分光計（励
起：280nm 、発光：340nm ）を用いて蛍光分光分析法により測定した。HAP 添加
を伴わない対照が包含され、そして結合された酵素は又は修飾された酵素の百分
率を、対照に比較して計算した。 【０１０３】 【表２】【０１０４】例３ ．修飾されたリパーゼの調製 カルボジイミド−介在性カップリングを通してのポリグルタミン酸とのリポラ
ーゼの接合を、標準方法に従って行った；たとえばG. T. Hermanson, Bioconjug
ate Techniques, Academic Press, 1996を参照のこと。 リポラーゼの酵素原液を、pH6.0 での250mM のNaClを含む50mMのMES 緩衝液に
希釈した。反応混合物におけるリポラーゼの最終濃度は、ml当たり10mgの酵素で
あった。 【０１０５】 反応混合物におけるリポラーゼを、周囲温度で１時間、１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC ；表１を参照のこと）の添加
により活性化した。 １時間後、その活性化されたリポラーゼを、PD10カラム（Pharmacia ）上での
サイズ−排除クロマトグラフィーにより精製した。次に、50mgのポリグルタミン
酸（Mr＝2000−15000D）（Sigma ＃P4636 ）を添加し、そしてカップリングを、
室温で20時間、進行せしめた。 【０１０６】 反応を停止し、そして過剰の試薬を、燐酸ナトリウム緩衝液（pH７での10mM）
に対しての16時間の透析により除去した。 反応程度を、等電点電気泳動により追跡した。 この態様で生成された接合体を、5 ℃で貯蔵した。 【０１０７】 【表３】 【０１０８】例４ ．ヒドロキシルアパタイト結合試験 50mMのBritton −Robinson緩衝液（pH 4, 5, 6, 7, 8及び9 での）中、10mg/m
l のヒドロキシルアパタイト500 μl を、A280＝0.1 まで水により希釈された、
500 μl の酵素（リポラーゼ、又はEDC −ポリ−Glu 修飾されたリポラーゼ（例
３における接合体３又は４））に添加した。得られる混合物を、室温で30分間、
撹拌しながらインキュベートした。次にサンプルを14,000G で４分間、遠心分離
し、そして上清液500 μl を、1.5ml の水に希釈した。次に、酵素濃度を、Perk
in ElmerからのLS50B 分光計（励起：280nm 、発光：340nm ）を用いて蛍光分光
分析法により測定した。対照は、HAP 添加を有さなかった。結合を、対照に対し
て計算した。 【０１０９】 【表４】 本発明の結果は、全pH範囲でヒドロキシルアパタイトに対するEDC −ポリ−Gl
u 修飾されたリポラーゼ（接合体３）の改良された結合性を示す。 【０１１０】 【表５】 本発明の結果は、pH５及びpH６の両者でヒドロキシルアパタイトに対するEDC
−ポリ−Glu 修飾されたリポラーゼ（接合体４）のさらなる改良された結合性を
示す。 【０１１１】例５ ．DL−２−アミノ−３−ホスホノプロピオン酸及びDL−２−アミノ−４−ホ
スホノ酪酸のオリゴマーの合成 DL−２−アミノ−３−ホスホノプロピオン酸及びDL−２−アミノ−４−ホスホ
ノ酪酸のオリゴマーを、縮合剤として３倍過剰量のカルボニルジイミダゾール（
CDI ）を用いて、対応するモノマー（CAS ：20263-06-3, 20263-07-4）(Sigma)
から合成した（K. W. Ehler and L. E. Orgel, Biochim. Acta, 434 (1976)233-
243 ）。 【０１１２】 84.5mgのDL−２−アミノ−３−ホスホノプロピオン酸を、室温で５mlのイミダ
ゾール緩衝液（pH＝７, １M ）に溶解した。その混合物を0 ℃に冷却し、そして
260mg のイミダゾールを少しづつ添加した。その混合物をゆっくりと室温にし、
そして撹拌を３日間、続けた。 DL−２−アミノ−４−ホスホノ酪酸のオリゴマーの合成を、105mg のDL−２−
アミノ−４ホスホノ酪酸及び280mg のイミダゾールを用いて、DL−２−アミノ−
３−ホスホノプロピオン酸のオリゴマーの合成について上記で記載された同じ手
段で行った。 【０１１３】例６ ．修飾されたリパーゼの調製 カルボジイミド−介在性カップリングを通してのDL−２−アミノ−３−ホスホ
ノプロピオン酸のオリゴマーとリポラーゼとの接合を、標準的方法に従って行っ
た；たとえば、G. T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press,
1996を参照のこと。 リポラーゼの酵素原液を、pH6.0 での250mM のNaClを含む、50mMのMES 緩衝液
に希釈した。反応混合物におけるリポラーゼの最終濃度は、ml当たり9.2mg の酵
素であった。 【０１１４】 反応混合物におけるリポラーゼを、周囲温度で２時間、１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC ；表１を参照のこと）の添加
により活性化した。 ２時間後、活性化されたリポラーゼを、PD10カラム（Pharmacia ）上でのサイ
ズ排除クロマトグラフィーにより精製した。EDC −活性化されたリポラーゼ１ml
当たり2.5ml のDL−２−アミノ−３−ホスホノプロピオン酸のオリゴマーを添加
し、そしてカップリングを周囲温度で16時間、進行せしめた。 【０１１５】 反応を停止し、そして過剰の試薬を、リン酸ナトリウム緩衝液（pH６で10mM）
に対する5 ℃での16時間の透析により除去した。 反応の程度を、等電点電気泳動により追跡した。この態様で生成された接合体
５を、５℃で貯蔵した。 接合体６を、EDC −活性化されたリポラーゼ１ml当たり2.5ml のDL−２−アミ
ノ−３−ホスホノ酪酸のオリゴマーの添加により類似する経路を通して実質的に
生成した。カップリングを、周囲温度で16時間、進行せしめ、続いて上記のよう
にして透析し、そして接合体６を５℃で貯蔵した。 【０１１６】 【表６】 【０１１７】例７ ．ヒドロキシルアパタイト結合試験 50mMのBritton −Robinson緩衝液（pH 4, 5, 6, 7,及び 8での）中、10mg/ml
のヒドロキシルアパタイト（HAP ）500 μl を、A280＝0.1 まで水により希釈さ
れた、500 μl の酵素（リポラーゼ、又はホスホノ誘導体−修飾されたリポラー
ゼ（例６における接合体５又は６））に添加した。 【０１１８】 得られる混合物を、室温で30分間、撹拌しながらインキュベートした。次にサ
ンプルを14,000G で４分間、遠心分離し、そして上清液500 μl を、1.5ml の水
に希釈した。次に、酵素濃度を、Perkin ElmerからのLS50B 分光計（励起：280n
m 、発光：340nm ）を用いて蛍光分光分析法により測定した。対照は、HAP 添加
を有さなかった。結合を、対照に対して計算した。 【０１１９】 【表７】 本発明の結果は、全pH範囲において、リポラーゼ対照に比較して、HAP へのリ
ポラーゼ接合体の有意に良好な結合を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ
，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)
，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，
ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ
Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ
，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，
ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ
Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ
，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，
ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ
Ａ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ
Ｆターム(参考） 4B050 CC02 CC04 GG02 GG10 KK01
LL01
4C083 AB102 AC102 AD471 AD472
BB01 CC41 EE33 EE36 FF01
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項１】 酵素及び少なくとも1 つのポリアニオン性ドメインを含んで
成る修飾された酵素であって、前記酵素が、個々の前記ポリアニオン性ドメイン
を含んで成るか又はそれに共有結合されている修飾された酵素。 【請求項２】 前記ポリアニオン性ドメインが前記酵素のC −末端カルボキ
シレート基又はN −末端アミノ基に結合され、又は前記ポリアニオン性ドメイン
が前記酵素のアミノ酸配列中に組み込まれている請求項１記載の修飾された酵素
。 【請求項３】 前記修飾された酵素が、組換えDNA 技法により生成される請
求項２記載の修飾された酵素。 【請求項４】 前記ポリアニオン性ドメインが、前記酵素のカルボキシレー
ト基、アミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、及び/ 又はアルデヒド基に共有
結合されている請求項１又は２記載の修飾された酵素。 【請求項５】 前記ポリアニオン性ドメインが、前記酵素のカルボキシレー
ト基及び/ 又はアミノ基に共有結合されている請求項１〜４のいずれか１項記載
の修飾された酵素。 【請求項６】 前記ポリアニオン性ドメインが、下記一般式（I ）： 【化１】 [ 式中、ｎは１〜15の範囲の整数であり、ｍは１〜50の範囲の整数であり、そし
て個々のR は、水素、C1-6−アルキル、C2-6−アルケニル、ヒドロキシ、アミノ
及びハロゲン、たとえばフルオロ、クロロ、ヨード及びブロモから成る群から独
立して選択される] で表される化合物；ポリカルボン酸；及びアミノ化されたポ
リカルボン酸から成る群から選択される請求項１、４又は５記載の修飾された酵
素。 【請求項７】 前記ポリアニオン性ドメインが、１〜150 個のアミノ酸残基
を含んで成るペプチド（前記ペプチドはpH７で負の実効電荷を有する）、好まし
くは１〜50個のアミノ酸残基を含んで成るペプチドから成る群から選択される請
求項１〜５のいずれか１項記載の修飾された酵素。 【請求項８】 前記ポリアニオン性ドメインが、ポリグルタミン酸及び/ 又
はポリアスパラギン酸から選択され、又は前記ポリアニオン性ドメインが合計３
〜10個のグルタミン酸及び/ 又はアスパラギン酸残基を含んで成る請求項７記載
の修飾された酵素。 【請求項９】 前記ポリアニオン性ドメインが、少なくとも１つのC −N 結
合（前記炭素原子は酵素に起因し、そして窒素原子はポリアニオン性ドメインに
起因する）により酵素に共有結合される請求項１〜８のいずれか１項記載の修飾
された酵素。 【請求項１０】 前記ポリアニオン性ドメインが、少なくとも１つのC −N
結合（前記炭素原子はポリアニオン性ドメインに起因し、そして窒素原子は酵素
に起因する）により酵素に共有結合される請求項１〜９のいずれか１項記載の修
飾された酵素。 【請求項１２】 前記酵素と前記ポリアニオン性ドメインとの間の共有結合
が、ペプチド結合である請求項９又は１０記載の修飾された酵素。 【請求項１３】 前記酵素が、オキシドレダクターゼ、プロテアーゼ、リパ
ーゼ、グルカナーゼ、エステラーゼ、デアミナーゼ、ウレアーゼ及び多糖ヒドロ
ラーゼから成る群から選択される請求項１〜12のいずれか１項記載の修飾された
酵素。 【請求項１４】 前記酵素が、グルカナーゼ、特にデキストラナーゼ及び/
又はムタナーゼである請求項13記載の修飾された酵素。 【請求項１５】 前記修飾された酵素の触媒活性が、“Methods of Enzymat
ic Analysis ”, 3 rd . Edition, vol. 1-10, 1984, Verlag Chemie, Weinhei
に従って決定される場合、遊離酵素の触媒活性の少なくとも１％、好ましくは少
なくとも２％、たとえば少なくとも５％、たとえば少なくとも10％、より好まし
くは少なくとも20％、たとえば少なくとも30％、たとえば少なくとも40％、さら
により好ましくは少なくとも50％、たとえば少なくとも60％、たとえば少なくと
も70％、さらにより好ましくは少なくとも80％、たとえば少なくとも90％、たと
えば少なくとも95％であり、最も好ましくは、前記修飾された酵素が遊離酵素の
触媒活性に対して実質的に同一である請求項１〜14のいずれか１項記載の修飾さ
れた酵素。 【請求項１６】 前記修飾された酵素が、ヒドロキシルアパタイト（HAP ）
、フルオロアパタイト、リン酸カルシウム、歯又は骨に結合することができる請
求項１〜15のいずれか１項記載の修飾された酵素。 【請求項１７】 HAP に結合する修飾された酵素の量が、pH７での“ヒドロ
キシルアパタイト結合試験”において定義される場合、少なくとも５％、好まし
くは少なくとも10％、たとえば少なくとも20％、たとえば少なくとも30％、より
好ましくは少なくとも40％、たとえば少なくとも50％、たとえば少なくとも60％
、さらにより好ましくは少なくとも70％、たとえば少なくとも80％、たとえば少
なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％、たとえば少なくとも99％である
請求項16記載の修飾された酵素。 【請求項１８】 請求項１〜17のいずれか１項記載の少なくとも1 つの修飾
された酵素を含んで成る口腔ケア組成物。 【請求項１９】 歯の疾病の予防又は処理、特に歯垢の形成の防止又は歯垢
の除去への、請求項１〜17のいずれか１項記載の少なくとも１つの修飾された酵
素を含んで成る口腔ケア組成物又は口腔管理生成物の使用。
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|---|---|---|---|
| DK154797 | 1997-12-29 | ||
| DK1547/97 | 1997-12-29 | ||
| PCT/DK1998/000569 WO1999033957A1 (en) | 1997-12-29 | 1998-12-21 | Modified enzymes comprising a polyanionic domain |
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|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000526615A Withdrawn JP2002526029A (ja) | 1997-12-29 | 1998-12-21 | ポリアニオン性ドメインを含んで成る修飾された酵素 |
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| JP (1) | JP2002526029A (ja) |
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-
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- 1998-12-21 WO PCT/DK1998/000569 patent/WO1999033957A1/en not_active Application Discontinuation
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