JP2002524073A - 新規プロテインキナーゼ分子およびそのための用途 - Google Patents

新規プロテインキナーゼ分子およびそのための用途

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アクトン，スーザン
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ミレニアム・フアーマシユーチカルズ・インコーポレーテツド
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Abstract

(57)【要約】 本発明は新規タンパク質キナーゼをコードするＣＳＡＰＫ核酸分子と呼称される単離された核酸分子を提供する。本発明は、アンチセンス核酸分子、ＣＳＡＰＫ核酸分子を含有する組換え発現ベクター、該発現ベクターが導入されている宿主細胞、およびＣＳＡＰＫ遺伝子が導入もしくは分裂されている非ヒトのトランスジェニック動物もまた提供する。本発明は、単離されたＣＳＡＰＫタンパク質、融合タンパク質、抗原性ペプチドおよび抗ＣＳＡＰＫ抗体をなおさらに提供する。本発明の組成物を利用する診断、スクリーニングおよび治療方法もまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の背景） タンパク質としっかりと会合されたリン酸は１９世紀後半以来知られている。
それ以来、タンパク質へのリン酸の多様な共有結合が見出されている。最も普遍
的にはセリン、トレオニンおよびチロシンへのリン酸のエステル化を伴い、より
少量がリシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸および
システインに結合される。ホスホリル化されたタンパク質の発生は、タンパク質
上のアミノ酸残基をホスホリル化することが可能な１種もしくはそれ以上のプロ
テインキナーゼ、およびまたタンパク質上のホスホリル化されたアミノ酸残基を
加水分解することが可能なタンパク質ホスファターゼの存在を意味している。
【０００２】 プロテインキナーゼは、細胞の成長および分裂に関連する生化学的および形態
学的変化の調節で重要な役割を演じている（デュルソ（Ｄ’Ｕｒｓｏ，Ｇ．）ら
（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５０：７８６−７９１；ビルヒマイヤー（Ｂｉ
ｒｃｈｍｅｉｅｒ，Ｃ．）ら（１９９３）Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ １５：１８５−
１８９）。それらは成長因子レセプターおよびシグナル伝達体としてはたらき、
また、細胞の形質転換および悪性病変に関係している（ハンター（Ｈｕｎｔｅｒ
，Ｔ．）ら（１９９２）Ｃｅｌｌ ７０：３７５−３８７；ポサダ（Ｐｏｓａｄ
ａ，Ｊ．）ら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ３：５８３−５９２、
ハンター（Ｈｕｎｔｅｒ，Ｔ．）ら（１９９４）Ｃｅｌｌ ７９：５７３−５８
２）。例えば、プロテインキナーゼは、成長因子レセプターからのシグナルの伝
達（スターギル（Ｓｔｕｒｇｉｌｌ，Ｔ．Ｗ．）ら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ
３４４：７１５−７１８；ゴメス（Ｇｏｍｅｚ，Ｎ．）ら（１９９１）Ｎａｔｕ
ｒｅ ３５３：１７０−１７３）、細胞の有糸分裂への進入の制御（ナース（Ｎ
ｕｒｓｅ，Ｐ．）（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４４：５０３−５０８；モーラ
ー（Ｍａｌｌｅｒ，Ｊ．Ｌ．）（１９９１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂ
ｉｏｌ．３：２６９−２７５）、およびアクチンの束化(bundling)の調節（フセ
イン−チシュティ（Ｈｕｓａｉｎ−Ｃｈｉｓｈｔｉ，Ａ．）ら（１９８８）Ｎａ
ｔｕｒｅ ３３４：７１８−７２１）に参画していることが示されている。プロ
テインキナーゼは、アミノ酸配列の類似性、または、セリン／トレオニンもしく
はチロシン残基のいずれかへの特異性のいずれかに基づいて２種の主要な群に分
割することができる。少数の二重特異性(dual-specificity)のキナーゼは構造的
にセリン／トレオニンに特異的な群に類似している。キナーゼは幅広い分類内で
ファミリーにさらに細分することができ、ファミリーのメンバーは、より高程度
の触媒ドメインのアミノ酸配列の同一性を共有し、また、類似の生化学的特性も
また有する。大部分のプロテインキナーゼファミリーのメンバーは、それらの特
定の細胞での役割を反映しているキナーゼドメインの外側の構造的特徴もまた共
有している。これらは、キナーゼ活性もしくは他のタンパク質との相互作用を制
御する調節ドメインを包含する（ハンクス（Ｈａｎｋｓ，Ｓ．Ｋ．）ら（１９８
８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４２−５２）。
【０００３】 （発明の要約） 本発明は、少なくとも部分的に、新規核酸分子、および、本明細書で「心血管
系関連プロテインキナーゼ（Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ａ
ｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ）」（「ＣＳＡＰＫ」）と
称される、こうした核酸分子によりコードされるタンパク質の発見に基づく。本
発明のＣＳＡＰＫ核酸およびタンパク質分子は、多様な細胞の過程、例えば心細
胞の過程の調節における調節剤として有用である。従って、一局面において、本
発明は、ＣＳＡＰＫタンパク質もしくはそれらの生物学的に活性の部分をコード
する単離された核酸分子、ならびにＣＳＡＰＫをコードする核酸の検出のための
プライマーもしくはハイブリダイゼーションプローブとして適する核酸フラグメ
ントを提供する。
【０００４】 一態様において、本発明のＣＳＡＰＫ核酸分子は、配列番号１、配列番号３を
包含するヌクレオチド配列（例えば該ヌクレオチド配列の完全な長さ）もしくは
その相補物に最低６０％、６２％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、
９０％、９５％、９８％もしくはそれ以上相同である。別の態様において、ＣＳ
ＡＰＫ核酸分子は、配列番号４、配列番号６、配列番号１６、配列番号１７、配
列番号１８、配列番号１９を包含するヌクレオチド配列もしくはその相補物に５
０％、５４％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８
６％、９０％、９５％、９８％相同である。なお別の態様において、ＣＳＡＰＫ
核酸分子は、配列番号７、配列番号９を包含するヌクレオチド配列もしくはその
相補物に６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、
９７％、９８％相同である。なお別の態様において、ＣＳＡＰＫ核酸分子は、配
列番号１０、配列番号１２を包含するヌクレオチド配列もしくはその相補物に６
０％、６５％、７０％、７３％、７５％、８０％、８５％、８６％、９０％、９
５％、９８％相同である。さらなる一態様において、ＣＳＡＰＫ核酸分子は、配
列番号１３、配列番号１５を包含するヌクレオチド配列もしくはその相補物に６
０％、６５％、７０％、７５％、７８％、８０％、８５％、９０％、９５％、９
８％相同である。
【０００５】 好ましい一態様において、単離された核酸分子は、配列番号１もしくは３に示
されるヌクレオチド配列またはその相補物を包含する。別の態様において、核酸
分子は、配列番号３、および配列番号１のヌクレオチド１−２９６を包含する。
なお別の態様において、核酸分子は配列番号３、および配列番号１のヌクレオチ
ド１２０２−４１３７を包含する。別の好ましい態様において、核酸分子は配列
番号１もしくは３に示されるヌクレオチド配列を有する。別の好ましい態様にお
いて、核酸分子は、配列番号１、配列番号３のヌクレオチド配列もしくはその相
補物の最低５０９ヌクレオチドのフラグメントを含んで成る。
【０００６】 別の好ましい態様において、単離された核酸分子は、配列番号４、６、１６、
１７、１８、１９に示されるヌクレオチド配列もしくはその相補物を包含する。
別の態様において、核酸分子は配列番号６、および配列番号４のヌクレオチド１
−４６を包含する。なお別の態様において、核酸分子は配列番号６、および配列
番号４のヌクレオチド１４１１−２１２０を包含する。別の好ましい態様におい
て、核酸分子は、配列番号４、６、１６、１７、１８、１９に示されるヌクレオ
チド配列を有する。
【０００７】 別の好ましい態様において、単離された核酸分子は配列番号７もしくは９に示
されるヌクレオチド配列またはその相補物を包含する。別の態様において、核酸
分子は配列番号９、ならびに配列番号７のヌクレオチド１−５０を包含する。な
お別の態様において、核酸分子は、配列番号９、および配列番号７のヌクレオチ
ド１７９３−２４５４を包含する。別の好ましい態様において、核酸分子は配列
番号７もしくは９に示されるヌクレオチド配列を有する。
【０００８】 別の好ましい態様において、単離された核酸分子は配列番号１０もしくは１２
に示されるヌクレオチド配列またはその相補物を包含する。別の態様において、
核酸分子は配列番号１２、および配列番号１０のヌクレオチド１−２７４を包含
する。なお別の態様において、核酸分子は配列番号１２、および配列番号１０の
ヌクレオチド７５５−１８６４を包含する。別の好ましい態様において、核酸分
子は配列番号１０もしくは１２に示されるヌクレオチド配列を有する。
【０００９】 別の好ましい態様において、単離された核酸分子は配列番号１３もしくは１５
に示されるヌクレオチド配列またはその相補物を包含する。なお別の好ましい態
様において、核酸分子は配列番号１３もしくは１５に示されるヌクレオチド配列
を有する。
【００１０】 別の態様において、ＣＳＡＰＫ核酸分子は、配列番号２、配列番号５、配列番
号８、配列番号１１もしくは配列番号１４のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ
酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含する。好ましい
一態様において、ＣＳＡＰＫ核酸分子は、配列番号２を包含するアミノ酸配列（
例えば配列番号２のアミノ酸配列全体）に最低５０％、５５％、６０％、６５％
、７０％、７５％、８０％、８１％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは
それ以上相同なアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列
を包含する。別の好ましい態様において、ＣＳＡＰＫ核酸分子は、配列番号５を
包含するアミノ酸配列（例えば配列番号５のアミノ酸配列全体）に最低４２％、
４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、
９０％、９５％、９８％もしくはそれ以上相同なアミノ酸配列を有するタンパク
質をコードするヌクレオチド配列を包含する。なお別の好ましい態様において、
ＣＳＡＰＫ核酸分子は、配列番号８を包含するアミノ酸配列（例えば配列番号８
のアミノ酸配列全体）に最低４１％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％
、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくはそれ以上
相同なアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含す
る。さらなる好ましい一態様において、ＣＳＡＰＫ核酸分子は、配列番号１１を
包含するアミノ酸配列（例えば配列番号１１のアミノ酸配列全体）に最低５９％
、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％
もしくはそれ以上相同なアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオ
チド配列を包含する。別の好ましい態様において、ＣＳＡＰＫ核酸分子は、配列
番号１４を包含するアミノ酸配列（例えば配列番号１４のアミノ酸配列全体）に
最低６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８
％もしくはそれ以上相同なアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレ
オチド配列を包含する。
【００１１】 別の好ましい態様において、単離された核酸分子はヒトＣＳＡＰＫのアミノ酸
配列をコードする。なお別の好ましい態様において、核酸分子は、配列番号２、
配列番号５、配列番号８、配列番号１１もしくは配列番号１４のアミノ酸配列を
包含するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含する。なお別の好まし
い態様において、核酸分子は、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号
１１もしくは配列番号１４のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌク
レオチド配列を包含する。
【００１２】 本発明の別の態様は、非ＣＳＡＰＫタンパク質をコードする核酸分子に関して
ＣＳＡＰＫ核酸分子を特異的に検出する核酸分子、好ましくはＣＳＡＰＫ核酸分
子を特徴とする。例えば、一態様において、こうした核酸分子は長さが最低５０
、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００
、５５０、６００、６５０、７００、７５０もしくは８００ヌクレオチドであり
、かつ、ストリンジェントな条件下で、配列番号１、３、４、６、７、９、１０
、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９に示されるヌクレオチド配列もし
くはその相補物を含んで成る核酸分子にハイブリダイズする。
【００１３】 他の好ましい態様において、核酸分子は配列番号２のアミノ酸配列を包含する
ポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変異体をコードし、ここで、核酸分子
は、ストリンジェントな条件下で、配列番号１もしくは配列番号３を包含する核
酸分子にハイブリダイズする。他の好ましい態様において、核酸分子は配列番号
５のアミノ酸配列を包含するポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変異体を
コードし、ここで、核酸分子は、ストリンジェントな条件下で、配列番号４、配
列番号６、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８もしくは配列番号１９を
包含する核酸分子にハイブリダイズする。他の好ましい態様において、核酸分子
は配列番号８のアミノ酸配列を包含するポリペプチドの天然に存在する対立遺伝
子変異体をコードし、ここで、核酸分子は、ストリンジェントな条件下で、配列
番号７もしくは配列番号９を包含する核酸分子にハイブリダイズする。他の好ま
しい態様において、核酸分子は、配列番号１１のアミノ酸配列を包含するポリペ
プチドの天然に存在する対立遺伝子変異体をコードし、ここで、核酸分子は、ス
トリンジェントな条件下で、配列番号１０もしくは配列番号１２を包含する核酸
分子にハイブリダイズする。他の好ましい態様において、核酸分子は配列番号１
４のアミノ酸配列を包含するポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変異体を
コードし、ここで、核酸分子は、ストリンジェントな条件下で、配列番号１３も
しくは配列番号１５を包含する核酸分子にハイブリダイズする。
【００１４】 本発明の別の態様は、ＣＳＡＰＫ核酸分子、例えばＣＳＡＰＫ核酸分子のコー
ディング鎖にアンチセンスである単離された核酸分子を提供する。
【００１５】 本発明の別の局面は、ＣＳＡＰＫ核酸分子を含んで成るベクターを提供する。
ある態様において、ベクターは組換え発現ベクターである。別の態様において、
本発明は本発明のベクターを含有する宿主細胞を提供する。本発明は、タンパク
質が産生されるような組換え発現ベクターを含有する本発明の宿主細胞、例えば
非ヒトの哺乳動物細胞のような哺乳動物宿主細胞を適する培地中で培養すること
によるタンパク質、好ましくはＣＳＡＰＫタンパク質の製造方法もまた提供する
。
【００１６】 本発明の別の局面は単離されたもしくは組換えのＣＳＡＰＫタンパク質および
ポリペプチドを特徴とする。一態様において、単離されたタンパク質、好ましく
はＣＳＡＰＫ−１タンパク質は、最低１個のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼドメインお
よび最低１個のＡＴＰ結合部位を包含する。別の態様において、単離されたタン
パク質、好ましくはＣＳＡＰＫ−１タンパク質は、最低１個のＳｅｒ／Ｔｈｒキ
ナーゼドメインおよび最低１個のＡＴＰ結合部位を包含し、そして配列番号２を
包含するアミノ酸配列に最低５１％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％
、８０％、８１％、８５％、９０％、９５％、９９％もしくはそれ以上相同であ
るアミノ酸配列を有する。なお別の態様において、単離されたタンパク質、好ま
しくはＣＳＡＰＫ−１タンパク質は、最低１個のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼドメイ
ンおよび最低１個のＡＴＰ結合部位を包含し、かつ、心血管系の細胞で発現され
そして／もしくは機能する。なおさらなる一態様において、単離されたタンパク
質、好ましくはＣＳＡＰＫ−１タンパク質は、最低１個のＳｅｒ／Ｔｈｒキナー
ゼドメインおよび最低１個のＡＴＰ結合部位を包含し、そして、細胞の成長に関
連するシグナル伝達経路、例えば細胞周期の調節に関連するシグナル伝達経路に
おいてある役割を演じる。別の態様において、単離されたタンパク質、好ましく
はＣＳＡＰＫ−１タンパク質は、最低１個のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼドメインお
よび最低１個のＡＴＰ結合部位を包含し、そして、配列番号１もしくは配列番号
３のヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子にストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸分子によ
りコードされる。
【００１７】 別の態様において、単離されたタンパク質、好ましくはＣＳＡＰＫ−２タンパ
ク質は、最低１個の二重特異性キナーゼ触媒ドメインおよび最低１個のＡＴＰ結
合部位を包含する。別の態様において、単離されたタンパク質、好ましくはＣＳ
ＡＰＫ−２タンパク質は、最低１個の二重特異性キナーゼ触媒ドメイン、最低１
個のロイシンジッパー塩基性領域、および最低１個のＡＴＰ結合部位を包含する
。別の態様において、単離されたタンパク質、好ましくはＣＳＡＰＫ−２タンパ
ク質は、最低１個の二重特異性キナーゼ触媒ドメインおよび最低１個のＡＴＰ結
合部位を包含し、そして配列番号５を包含するアミノ酸配列に最低４２％、４５
％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０
％、９５％、９８％もしくはそれ以上相同であるアミノ酸配列を有する。なお別
の態様において、単離されたタンパク質、好ましくはＣＳＡＰＫ−２タンパク質
は、最低１個の二重特異性キナーゼ触媒ドメインおよび最低１個のＡＴＰ結合部
位を包含し、かつ、心血管系の細胞で発現されそして／もしくは機能する。なお
さらなる一態様において、単離されたタンパク質、好ましくはＣＳＡＰＫ−２タ
ンパク質は、最低１個の二重特異性キナーゼ触媒ドメインおよび最低１個のＡＴ
Ｐ結合部位を包含し、そして細胞の成長に関連するシグナル伝達経路、例えば細
胞周期の調節に関連するシグナル伝達経路においてある役割を演じる。別の態様
において、単離されたタンパク質、好ましくはＣＳＡＰＫ−２タンパク質は、最
低１個の二重特異性キナーゼ触媒ドメインおよび最低１個のＡＴＰ結合部位を包
含し、そして、配列番号４、配列番号６、配列番号１６、配列番号１７、配列番
号１８もしくは配列番号１９のヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子にストリ
ンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド
配列を有する核酸分子によりコードされる。
【００１８】 なお別の態様において、単離されたタンパク質、好ましくはＣＳＡＰＫ−３タ
ンパク質は、最低１個のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼドメインおよび最低１個のＡＴ
Ｐ結合部位を包含する。別の態様において、単離されたタンパク質、好ましくは
ＣＳＡＰＫ−３タンパク質は、最低１個のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼドメインおよ
び最低１個のＡＴＰ結合部位を包含し、そして配列番号８を包含するアミノ酸配
列に最低４１％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、
８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくはそれ以上相同であるアミノ酸
配列を有する。なお別の態様において、単離されたタンパク質、好ましくはＣＳ
ＡＰＫ−３タンパク質は、最低１個のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼドメインおよび最
低１個のＡＴＰ結合部位を包含し、かつ、心血管系の細胞で発現されそして／も
しくは機能する。なおさらなる一態様において、単離されたタンパク質、好まし
くはＣＳＡＰＫ−３タンパク質は、最低１個のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼドメイン
および最低１個のＡＴＰ結合部位を包含し、そして細胞の成長に関連するシグナ
ル伝達経路、例えば細胞周期の調節に関連するシグナル伝達経路においてある役
割を演じる。別の態様において、単離されたタンパク質、好ましくはＣＳＡＰＫ
−３タンパク質は、最低１個のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼドメインおよび最低１個
のＡＴＰ結合部位を包含し、そして、配列番号７もしくは配列番号９のヌクレオ
チド配列を含んで成る核酸分子にストリンジェントなハイブリダイゼーション条
件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされ
る。
【００１９】 別の態様において、単離されたタンパク質、好ましくはＣＳＡＰＫ−４タンパ
ク質は、最低１個のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼドメインおよび最低１個のＡＴＰ結
合部位を包含する。別の態様において、単離されたタンパク質、好ましくはＣＳ
ＡＰＫ−４タンパク質は、最低１個のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼドメインおよび最
低１個のＡＴＰ結合部位を包含し、そして配列番号１１を包含するアミノ酸配列
に最低５９％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９
５％、９８％もしくはそれ以上相同であるアミノ酸配列を有する。なお別の態様
において、単離されたタンパク質、好ましくはＣＳＡＰＫ−４タンパク質は、最
低１個のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼドメインおよび最低１個のＡＴＰ結合部位を包
含し、かつ、心血管系の細胞で発現されそして／もしくは機能する。なおさらな
る一態様において、単離されたタンパク質、好ましくはＣＳＡＰＫ−４タンパク
質は、最低１個のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼドメインおよび最低１個のＡＴＰ結合
部位を包含し、そして細胞の成長に関連するシグナル伝達経路、例えば細胞周期
の調節に関連するシグナル伝達経路においてある役割を演じる。別の態様におい
て、単離されたタンパク質、好ましくはＣＳＡＰＫ−４タンパク質は、最低１個
のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼドメインおよび最低１個のＡＴＰ結合部位を包含し、
そして、配列番号１０もしくは配列番号１２のヌクレオチド配列を含んで成る核
酸分子にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズす
るヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされる。
【００２０】 別の態様において、単離されたタンパク質、好ましくはヒトＣＳＡＰＫ−５タ
ンパク質は、最低１個のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼドメインおよび最低１個のＡＴ
Ｐ結合部位を包含する。なお別の態様において、単離されたタンパク質、好まし
くはヒトＣＳＡＰＫ−５タンパク質は、最低１個のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼドメ
インおよび最低１個のＡＴＰ結合部位を包含し、そして配列番号１４を包含する
アミノ酸配列に最低６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％
、９５％、９８％もしくはそれ以上相同であるアミノ酸配列を有する。なお別の
態様において、単離されたタンパク質、好ましくはヒトＣＳＡＰＫ−５タンパク
質は、最低１個のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼドメインおよび最低１個のＡＴＰ結合
部位を包含し、かつ、心血管系の細胞で発現されそして／もしくは機能する。な
おさらなる一態様において、単離されたタンパク質、好ましくはヒトＣＳＡＰＫ
−５タンパク質は、最低１個のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼドメインおよび最低１個
のＡＴＰ結合部位を包含し、そして細胞の成長に関連するシグナル伝達経路、例
えば細胞周期の調節に関連するシグナル伝達経路においてある役割を演じる。別
の態様において、単離されたタンパク質、好ましくはヒトＣＳＡＰＫ−５タンパ
ク質は、最低１個のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼドメインおよび最低１個のＡＴＰ結
合部位を包含し、そして、（レーマン（Ｌｅｈｍａｎ）ら（１９９０）Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：１０４８に記述される）Ｎｃｋと相互作用
することが可能である。別の態様において、単離されたタンパク質、好ましくは
ヒトＣＳＡＰＫ−５タンパク質は、最低１個のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼドメイン
および最低１個のＡＴＰ結合部位を包含し、そして、配列番号１３もしくは配列
番号１５のヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子にストリンジェントなハイブ
リダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸分
子によりコードされる。
【００２１】 別の態様において、単離されたタンパク質、好ましくはＣＳＡＰＫタンパク質
は、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１もしくは配列番号１４
のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有する。好ましい一態様において
、タンパク質、好ましくはＣＳＡＰＫタンパク質は、配列番号２、配列番号５、
配列番号８、配列番号１１もしくは配列番号１４を包含するアミノ酸配列（例え
ば、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１もしくは配列番号１４
のアミノ酸配列全体）に最低約４１％、４２％、４５％、５０％、５５％、５９
％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８５％、９０％、９５
％、９８％もしくはそれ以上相同なアミノ酸配列を有する。別の態様において、
本発明は、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１もしくは配列番
号１４のアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントを特徴とし、ここで、
該フラグメントは、それぞれ、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号
１１もしくは配列番号１４のアミノ酸配列の最低１５アミノ酸（例えば連続する
アミノ酸）を含んで成る。別の態様において、タンパク質、好ましくはＣＳＡＰ
Ｋタンパク質は、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１もしくは
配列番号１４のアミノ酸配列を有する。
【００２２】 本発明の別の態様は、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配
列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号
１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９を包含するヌ
クレオチド配列（例えば該ヌクレオチド配列の長さ全体）もしくはその相補物に
最低約５０％、５４％、５５％、６０％、６２％、６５％、７０％、７５％、７
８％、８０％、８５％、８６％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくはそれ
以上相同なヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされる単離されたタ
ンパク質、好ましくはＣＳＡＰＫタンパク質を特徴とする。本発明は、配列番号
１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号
１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１
７、配列番号１８、配列番号１９のヌクレオチド配列もしくはその相補物を含ん
で成る核酸分子にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリ
ダイズするヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされる単離されたタ
ンパク質、好ましくはＣＳＡＰＫタンパク質をさらに特徴とする。
【００２３】 本発明のタンパク質もしくはそれらの生物学的に活性の部分は、融合タンパク
質を形成するように非ＣＳＡＰＫポリペプチド（例えば異種アミノ酸配列）に効
果をもたらして連結することができる。本発明は、本発明のタンパク質、好まし
くはＣＳＡＰＫタンパク質を特異的に結合する、モノクローナルもしくはポリク
ローナル抗体のような抗体をさらに特徴とする。加えて、ＣＳＡＰＫタンパク質
もしくはそれらの生物学的に活性の部分は、場合によっては製薬学的に許容でき
る担体を包含する製薬学的組成物に組み込むことができる。
【００２４】 別の局面において、本発明は、ＣＳＡＰＫの核酸分子、タンパク質もしくはポ
リペプチドの存在が生物学的サンプル中で検出されるような、ＣＳＡＰＫの核酸
分子、タンパク質もしくはポリペプチドを検出することが可能な作用物質と生物
学的サンプルを接触させることによる、生物学的サンプル中でのＣＳＡＰＫの核
酸分子、タンパク質もしくはポリペプチドの存在の検出方法を提供する。
【００２５】 別の局面において、本発明は、ＣＳＡＰＫ活性の存在が生物学的サンプル中で
検出されるような、生物学的サンプルをＣＳＡＰＫ活性の指標を検出することが
可能な作用物質と接触させることによる、生物学的サンプル中でのＣＳＡＰＫ活
性の存在の検出方法を提供する。
【００２６】 別の局面において、本発明は、細胞中のＣＳＡＰＫ活性が調節されるような、
ＣＳＡＰＫ活性を調節する作用物質と、ＣＳＡＰＫを発現することが可能な細胞
を接触させることを含んで成る、ＣＳＡＰＫ活性の調節方法を提供する。一態様
において、作用物質はＣＳＡＰＫ活性を阻害する。別の態様において、作用物質
はＣＳＡＰＫ活性を刺激する。一態様において、作用物質はＣＳＡＰＫタンパク
質に特異的に結合する抗体である。別の態様において、作用物質は、ＣＳＡＰＫ
遺伝子の転写もしくはＣＳＡＰＫのｍＲＮＡの翻訳を調節することによりＣＳＡ
ＰＫの発現を調節する。なお別の態様において、作用物質は、ＣＳＡＰＫのｍＲ
ＮＡもしくはＣＳＡＰＫ遺伝子のコーディング鎖にアンチセンスであるヌクレオ
チド配列を有する核酸分子である。
【００２７】 一態様において、本発明の方法は、ＣＳＡＰＫのモジュレーターである作用物
質を、異常なＣＳＡＰＫのタンパク質もしくは核酸の発現または活性を特徴とす
る障害を有する被験者に投与することにより、被験者を治療するのに使用される
。一態様において、ＣＳＡＰＫのモジュレーターはＣＳＡＰＫタンパク質である
。別の態様において、ＣＳＡＰＫのモジュレーターはＣＳＡＰＫ核酸分子である
。なお別の態様において、ＣＳＡＰＫのモジュレーターは、ペプチド、ペプチド
模倣物(peptidemimetic)もしくは他の小分子である。好ましい一態様において、
異常なＣＳＡＰＫのタンパク質もしくは核酸の発現を特徴とする障害は、細胞の
成長に関連する障害、例えば心血管系障害である。
【００２８】 本発明はまた、（ｉ）ＣＳＡＰＫタンパク質をコードする遺伝子の異常な修飾
もしくは突然変異；（ｉｉ）遺伝子の誤調節(mis-regulation)；および（ｉｉｉ
）ＣＳＡＰＫタンパク質の異常な翻訳後修飾の最低１つを特徴とする遺伝子変化
の存在もしくは非存在を同定するための診断アッセイも提供し、ここで、野生型
の形態の遺伝子はＣＳＡＰＫ活性をもつタンパク質をコードする。
【００２９】 別の局面において、本発明は、ＣＳＡＰＫ活性を有するＣＳＡＰＫタンパク質
を含んで成る指標組成物を提供すること、指標組成物を試験化合物と接触させる
こと、および指標組成物中のＣＳＡＰＫ活性に対する試験化合物の影響を測定し
てＣＳＡＰＫタンパク質の活性を調節する化合物を同定することによる、ＣＳＡ
ＰＫタンパク質に結合するもしくはその活性を調節する化合物の同定方法を提供
する。
【００３０】 本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な記述および請求の範囲から明ら
かであろう。
【００３１】 （発明の詳細な記述） 本発明は、少なくとも部分的に、細胞の成長に関連するシグナル伝達経路にお
いてある役割を演じるかもしくはそこで機能する、本明細書で「心血管系関連プ
ロテインキナーゼ（Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ａｓｓｏｃ
ｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ）」もしくは「ＣＳＡＰＫ」核酸お
よびポリペプチド分子と称される新規分子の発見に基づく。一態様において、Ｃ
ＳＡＰＫ分子は、細胞の成長もしくは分化、例えば心細胞の成長もしくは分化に
関与する１種もしくはそれ以上のタンパク質の活性を調節する。別の態様におい
て、本発明のＣＳＡＰＫ分子は、ＣＳＡＰＫ分子、または細胞の成長もしくは分
化、例えば心細胞の成長もしくは分化に関与する１種もしくはそれ以上のタンパ
ク質のホスホリル化状態を調節することが可能である。
【００３２】 好ましい一態様において、ＣＳＡＰＫ分子は、心血管系の細胞、例えば心、血
管および／もしくは血液の細胞で発現されそして／または機能するプロテインキ
ナーゼである。
【００３３】 本明細書で使用されるところの「プロテインキナーゼ」という用語は、それ自
身のホスホリル化状態または別のタンパク質もしくはポリペプチドのホスホリル
化状態を調節することが可能であるタンパク質もしくはポリペプチドを包含する
。プロテインキナーゼは、セリン／トレオニン残基、チロシン残基、もしくはセ
リン／トレオニンおよびチロシン残基の双方（例えば二重特異性キナーゼ）に対
する特異性（すなわちこれらをホスホリル化する特異性）を有することができる
。本明細書で称されるところのプロテインキナーゼは、低下されたもしくは最小
限の保存を伴うアミノ酸の配列により分離されている好ましくは５〜２０、より
好ましくは５〜１５、もしくは好ましくは１１個の高度に保存されたモチーフも
しくはサブドメインを包含する、長さ約２００〜４００アミノ酸残基、好ましく
は長さ約２００〜３００アミノ酸残基、もしくはより好ましくは長さ約２５０〜
３００アミノ酸残基の触媒ドメインを好ましく包含する。チロシンもしくはセリ
ン／トレオニンのいずれかのホスホリル化に対するプロテインキナーゼの特異性
は、多様な残基が（例えばハンクス（Ｈａｎｋｓ）ら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２４１：４２−５２（その内容は引用により本明細書に組み込まれる）で記
述されるように）各分類で保存されているサブドメイン（ＶＩｂおよびＶＩＩＩ
）の２種の配列により予測することができる。これらのサブドメインもまた本明
細書にさらに詳細に記述されている。
【００３４】 プロテインキナーゼは細胞の成長に関連するシグナル伝達経路においてある役
割を演じる。例えば、プロテインキナーゼは細胞のレセプター（例えば成長因子
レセプター）からのシグナル伝達の調節；細胞の有糸分裂への進入；および細胞
骨格機能（例えばアクチンの束化）の調節に関与する。従って、本発明のＣＳＡ
ＰＫ分子は、１）細胞のレセプター（例えば心細胞の成長因子レセプター）から
のシグナルの伝達の調節；２）細胞（例えば心前駆体細胞）の有糸分裂への進入
の調節；３）細胞の分化の調節；４）細胞死の調節；および５）細胞骨格機能（
例えばアクチンの束化）の調節に関与することができる。
【００３５】 細胞の成長に関連するシグナル伝達経路に関与するプロテインキナーゼの活性
の阻害もしくは過剰刺激は、混乱された細胞の成長につながる可能性があり、こ
れは順に細胞の成長に関連した障害につながる可能性がある。本明細書で使用さ
れるところの「細胞の成長に関連した障害」は、細胞の成長の脱調節(deregulat
ion)、例えばアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションを特徴と
する障害、疾患もしくは症状を包含する。細胞の成長の脱調節は、細胞の増殖、
細胞周期の進行、細胞の分化および／もしくは細胞の肥大の脱調節によることが
できる。細胞の成長に関連した障害の例は、心不全、高血圧、心房細動、拡張型
心筋症、特発性心筋症もしくは狭心症のような心血管系障害；癌、例えば黒色腫
、前立腺癌、子宮頸癌、乳癌、大腸癌もしくは肉腫のような増殖障害もしくは分
化障害を包含する。
【００３６】 本発明は、少なくとも部分的に、ある種の保存された構造および機能の特徴を
有する分子の一ファミリーを含んで成る、本明細書でＣＳＡＰＫタンパク質およ
び核酸分子と称される新規分子の発見に基づく。本発明のタンパク質および核酸
分子を指す場合の「ファミリー」という用語は、共通の構造ドメインもしくはモ
チーフを有しかつ本明細書で定義されるところの十分なアミノ酸もしくはヌクレ
オチド配列の相同性を有する２種もしくはそれ以上のタンパク質もしくは核酸分
子を意味することを意図している。こうしたファミリーのメンバーは天然に存在
するかもしくは天然に存在しない可能性があり、また、同一種もしくは異なる種
のいずれかからであることができる。例えば、あるファミリーは、ヒト起源の第
一のタンパク質、ならびにヒト起源の他の別個のタンパク質を含有することが可
能であるか、あるいは、非ヒト起源の相同物を含有することが可能である。ファ
ミリーのメンバーはまた共通の機能的特徴も有することができる。
【００３７】 本発明の一態様は、ＣＳＡＰＫ核酸分子、好ましくはヒトＣＳＡＰＫ分子、例
えばＣＳＡＰＫ−１、ＣＳＡＰＫ−２、ＣＳＡＰＫ−２ａ、ＣＳＡＰＫ−２ｂ、
ＣＳＡＰＫ−２ｃ、ＣＳＡＰＫ−２ｄ、ＣＳＡＰＫ−３、ＣＳＡＰＫ−４および
ＣＳＡＰＫ−５を特徴とする。これらは虚血性および特発性起源のうっ血性心不
全（ＣＨＦ）の患者の心から作成されたｃＤＮＡライブラリーから同定された。
本発明のＣＳＡＰＫ核酸およびタンパク質分子を以下のサブセクションにさらに
詳細に記述する。 Ａ．ＣＳＡＰＫ−１核酸およびタンパク質分子 一態様において、本発明の単離されたタンパク質、好ましくはＣＳＡＰＫ−１
タンパク質は、最低１個の「Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ部位」および最低１個の「
ＡＴＰ結合領域」の存在に基づいて同定される。本明細書で使用されるところの
「Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ部位」という用語は、セリンおよびトレオニン残基を
ホスホリル化しかつＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼの触媒ドメインに見出される、キナ
ーゼで保存されている長さ約２００〜４００アミノ酸残基、好ましくは長さ２０
０〜３００アミノ酸残基、そしてより好ましくは長さ２５０〜３００アミノ酸残
基のアミノ酸配列を包含する。好ましくは、Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ部位は、以
下のアミノ酸コンセンサス配列Ｘ9−ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ4−Ｖ−Ｘ12−Ｋ−Ｘ−(10- 19) −Ｅ−Ｘ66−ｈ−Ｘ8−ｈ−ｒ−Ｄ−Ｘ−Ｋ−Ｘ2−Ｎ−Ｘ17−Ｋ−Ｘ2−Ｄ−
ｆ−ｇ−Ｘ21−ｐ−Ｘ13−ｗ−Ｘ3−ｇ−Ｘ55−Ｒ−Ｘ14−ｈ−Ｘ3（配列番号２
２）（ここで不変の残基は大文字により示され、また、ほぼ不変の残基は小文字
により示される）を包含する。ほぼ不変の残基は大部分のＳｅｒ／Ｔｈｒキナー
ゼ部位で通常見出されるが、しかし、好ましくは類似の特徴を有する他のアミノ
酸により置き換えられることが可能である。例えば、上のアミノ酸コンセンサス
配列中のほぼ不変の疎水性アミノ酸は別の疎水性アミノ酸により置き換えられる
ことが最もありそうであるとみられる。Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼドメインは、例
えば、レヴィン（Ｌｅｖｉｎ Ｄ．Ｅ．）ら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：８２７２−７６（その内容は引用により本明
細書に組み込まれる）に記述されている。
【００３８】 本明細書で使用されるところの「ＡＴＰ結合領域」という用語は、それらの基
質をホスホリル化により活性化しかつアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の結合に関
与している酵素中に存在する、長さが約２０〜４０、好ましくは２０〜３０、そ
してより好ましくは２５〜３０アミノ酸残基のアミノ酸配列を包含する。ＡＴＰ
結合領域は、好ましくは以下のアミノ酸コンセンサス配列：Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｘ
−Ｇ−Ｘ（１５−２３）−Ｋ（配列番号２３）を包含する。ＡＴＰ結合領域は、
例えば、サミュエル（Ｓａｍｕｅｌ Ｋ．Ｐ．）ら（１９８７）ＦＥＢＳ Ｌｅ
ｔ．２１８（１）：８１−８６（その内容は引用により本明細書に組み込まれる
）に記述されている。ＣＳＡＰＫ−１のアミノ酸残基４０ないし６３がＡＴＰ結
合領域を含んで成る。
【００３９】 本発明の単離されたタンパク質、好ましくはＣＳＡＰＫ−１タンパク質は、配
列番号２のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するか、または、配列
番号１もしくは配列番号３に十分に相同なヌクレオチド配列によりコードされる
。本明細書で使用されるところの「十分に相同な」という用語は、第一および第
二のアミノ酸もしくはヌクレオチド配列が共通の構造ドメインもしくはモチーフ
および／または共通の機能的活性を共有するような、十分なもしくは最小限の数
の、第二のアミノ酸もしくはヌクレオチド配列に同一もしくは同等（例えば類似
の側鎖を有するアミノ酸残基）アミノ酸残基もしくはヌクレオチドを含有する第
一のアミノ酸もしくはヌクレオチド配列を指す。例えば、該ドメインのアミノ酸
配列にわたって最低３０％、４０％もしくは５０％の相同性、好ましくは６０％
の相同性、より好ましくは７０％〜８０％、そしてなおより好ましくは９０〜９
５％の相同性を有する共通の構造ドメインを共有しそして最低１および好ましく
は２個の構造ドメインもしくはモチーフを含有するアミノ酸もしくはヌクレオチ
ド配列が、本明細書で十分に相同と定義される。さらに、最低３０％、４０％も
しくは５０％、好ましくは６０％、より好ましくは７０〜８０％、もしくは９０
〜９５％の相同性を共有しかつ共通の機能的活性を共有するアミノ酸もしくはヌ
クレオチド配列が、本明細書で十分に相同と定義される。
【００４０】 本明細書で互換性に使用されるところの「ＣＳＡＰＫ−１活性」、「ＣＳＡＰ
Ｋ−１の生物学的活性」もしくは「ＣＳＡＰＫ−１の機能的活性」は、標準的技
術によりインビボもしくはインビトロで測定されるような、ＣＳＡＰＫ−１応答
性細胞もしくはＣＳＡＰＫ−１タンパク質の基質に対してＣＳＡＰＫ−１タンパ
ク質、ポリペプチドもしくは核酸分子により発揮される活性を指す。ＣＳＡＰＫ
−１の生物学的活性は本明細書に記述されている。
【００４１】 従って、本発明の別の態様はＣＳＡＰＫ−１活性を有する単離されたＣＳＡＰ
Ｋ−１タンパク質およびポリペプチドを特徴とする。好ましいタンパク質は、最
低１個のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ部位および最低１個のＡＴＰ結合領域、ならび
に好ましくはＣＳＡＰＫ−１活性を有するＣＳＡＰＫ−１タンパク質である。付
加的な好ましいタンパク質は、最低１個のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ部位および最
低１個のＡＴＰ結合領域を有し、そして、好ましくは、配列番号１もしくは配列
番号３のヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子にストリンジェントなハイブリ
ダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸分子
によりコードされる。
【００４２】 単離されたヒトＣＳＡＰＫ−１のｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびヒトＣＳ
ＡＰＫ−１ポリペプチドの予測されるアミノ酸配列を図１ならびにそれぞれ配列
番号１および２に示す。ヒトＣＳＡＰＫ−１をコードするヌクレオチド配列を含
有するプラスミドは、９８年１０月２７日にアメリカン タイプ カルチャー
コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒ
ｄ、ヴァージニア州マナサス ２０１１０−２２０９に寄託され、そして受託番
号２０３３０８を割り当てられた。この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国
際的承認に関するブダペスト条約（ｔｈｅ Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ
ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈ
ｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）の約定のも
とに維持されることができる。この寄託は、単に当業者のための便宜としてなさ
れ、そして、寄託が３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２で必要とされるという承認でな
い。
【００４３】 長さがおよそ４１３７ヌクレオチドであるＣＳＡＰＫ−１遺伝子は、およそ３
４．７ｋＤの分子量を有しかつ長さがおよそ３０２アミノ酸残基であるタンパク
質をコードする。ＣＳＡＰＫ−１遺伝子は、主として心、骨格筋もしくは胎盤で
発現される。 Ｂ．ＣＳＡＰＫ−２核酸およびタンパク質分子 別の態様において、本発明の単離されたタンパク質、好ましくはＣＳＡＰＫ−
２タンパク質は、最低１個の二重特異性キナーゼ触媒ドメインおよび最低１個の
ＡＴＰ結合領域の存在に基づいて同定される。なおさらなる一態様において、本
発明の単離されたタンパク質、好ましくはＣＳＡＰＫ−２タンパク質は、最低１
個の二重特異性キナーゼ触媒ドメイン、最低１個のＡＴＰ結合領域および最低１
個のロイシンジッパー領域の存在に基づいて同定される。
【００４４】 本明細書で使用されるところの「二重特異性キナーゼ触媒ドメイン」という用
語は、その一次配列がセリン／トレオニンキナーゼの触媒ドメインとチロシンキ
ナーゼの触媒ドメインとの間のハイブリッドであるキナーゼ触媒ドメインを包含
する、長さが２００〜４００アミノ酸残基、好ましくは長さが２００〜３００ア
ミノ酸残基、そしてより好ましくは長さが２５０〜３００アミノ酸残基のアミノ
酸配列を包含する。二重特異性キナーゼ触媒ドメインを含有するキナーゼは、セ
リン／トレオニンおよびチロシン双方の残基をホスホリル化することが可能であ
る。好ましくは、二重特異性キナーゼ触媒ドメインは、以下のアミノ酸コンセン
サス配列Ｘ9−Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ2−Ｇ−Ｘ−Ｖ−Ｘ12−Ｋ−Ｘ−(10-19)−Ｅ−Ｘ3 4 −Ｇ−Ｘ40−Ｈ−Ｒ−Ｄ−Ｘ−Ｋ−Ｘ2−Ｎ−Ｘ17−Ｋ−Ｘ2−Ｄ−Ｆ−Ｇ−Ｘ1 9 −Ｗ−Ｘ−Ａ−Ｐ−Ｅ−Ｘ13−Ｗ−Ｘ7−Ｅ−Ｘ6−Ｐ−Ｘ36−Ｃ−Ｗ−Ｘ6−Ｒ
−Ｐ−Ｘ−Ｆ−Ｘ14（配列番号２４）を包含する。二重特異性キナーゼ触媒ドメ
インは、例えばホルツマン（Ｈｏｌｚｍａｎ Ｌ．Ｂ．）ら（１９９４）Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３０８０８−８１７（その内容は引用により本明細
書に組み込まれる）に記述されている。ＣＳＡＰＫ−２タンパク質のアミノ酸残
基３１−２７７は二重特異性キナーゼ触媒ドメインを含んで成る。
【００４５】 本明細書で使用されるところの「ロイシンジッパー領域」という用語は、最低
２０〜３０アミノ酸残基、より好ましくは最低２０〜２５アミノ酸残基、そして
最も好ましくは最低２２アミノ酸残基の伸長にわたって７個の位置ごとにロイシ
ンもしくはイソロイシンのいずれかの残基を含有するタンパク質ドメインを包含
する。典型的には、ロイシンジッパードメインは荷電された残基が豊富であり、
そしてらせんの一面に下にロイシンもしくはイソロイシンの疎水性の隆起をもつ
らせん構造を形成する。ロイシンジッパーはロイシン残基の間の疎水性相互作用
により二量体化を促進する。ロイシンジッパードメインは、例えば、ラントシュ
ルツ（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｔｚ）ら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７
５９−１７６４（その内容は引用により本明細書に組み込まれる）に記述されて
いる。ＣＳＡＰＫ−２タンパク質のアミノ酸残基２９４ないし３２２がロイシン
ジッパー領域を含んで成る。場合によっては、ロイシンジッパー領域は塩基性領
域に隣接して見出される。本明細書で使用されるところの「塩基性領域」という
用語は、ロイシンジッパー領域のＮ末端もしくはＣ末端のいずれかの一連の塩基
性および疎水性のアミノ酸残基より構成される、長さが５〜３０、好ましくは５
〜２０、より好ましくは５〜１５アミノ酸残基のアミノ酸配列を包含する。例え
ば、１５アミノ酸の塩基性ドメインは最低６、８もしくは１０個の塩基性残基、
および／または最低１、２もしくは４個の疎水性残基を含有することができる。
ＣＳＡＰＫ−２タンパク質のアミノ酸残基４０７−４２１が塩基性領域を含んで
成る。
【００４６】 本発明の単離されたタンパク質、好ましくはＣＳＡＰＫ−２タンパク質は、配
列番号５のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するか、または、配列
番号４もしくは配列番号６に十分に相同なヌクレオチド配列によりコードされる
。
【００４７】 本明細書で互換性に使用されるところの「ＣＳＡＰＫ−２活性」、「ＣＳＡＰ
Ｋ−２の生物学的活性」もしくは「ＣＳＡＰＫ−２の機能的活性」は、標準的技
術によりインビボもしくはインビトロで測定されるような、ＣＳＡＰＫ−２応答
性細胞もしくはＣＳＡＰＫ−２タンパク質の基質に対してＣＳＡＰＫ−２タンパ
ク質、ポリペプチドもしくは核酸分子により発揮される活性を指す。ＣＳＡＰＫ
−２の生物学的活性は本明細書に記述されている。
【００４８】 従って、本発明の別の態様はＣＳＡＰＫ−２活性を有する単離されたＣＳＡＰ
Ｋ−２タンパク質およびポリペプチドを特徴とする。好ましいタンパク質は、最
低１個の二重特異性キナーゼ触媒ドメインおよび最低１個のＡＴＰ結合領域を有
するＣＳＡＰＫ−２タンパク質である。なおさらなる好ましいＣＳＡＰＫ−２タ
ンパク質は、最低１個の二重特異性キナーゼ触媒ドメイン、最低１個のＡＴＰ結
合領域、および最低１個のロイシンジッパー領域を有する。好ましいタンパク質
は、最低１個の二重特異性キナーゼ触媒ドメイン、最低１個のＡＴＰ結合領域、
および好ましくはＣＳＡＰＫ−２活性を有する。付加的な好ましいタンパク質は
、最低１個の二重特異性キナーゼ触媒ドメイン、最低１個のＡＴＰ結合領域を有
し、そして、好ましくは、配列番号４、配列番号６、配列番号１６、配列番号１
７、配列番号１８もしくは配列番号１９のヌクレオチド配列を含んで成る核酸分
子にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌ
クレオチド配列を有する核酸分子によりコードされる。
【００４９】 単離されたヒトＣＳＡＰＫ−２のｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびヒトＣＳ
ＡＰＫ−２ポリペプチドの予測されるアミノ酸配列を図２ならびにそれぞれ配列
番号４および５に示す。ヒトＣＳＡＰＫ−２をコードするヌクレオチド配列を含
有するプラスミドは、９８年１０月２７日にアメリカン タイプ カルチャー
コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒ
ｄ、ヴァージニア州マナサス ２０１１０−２２０９に寄託され、そして受託番
号２０３３０６を割り当てられた。この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国
際的承認に関するブダペスト条約（ｔｈｅ Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ
ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈ
ｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）の約定のも
とに維持されることができる。この寄託は、単に当業者のための便宜としてなさ
れ、そして、寄託が３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２で必要とされるという承認でな
い。
【００５０】 長さがおよそ２１２０ヌクレオチドであるＣＳＡＰＫ−２遺伝子は、およそ５
２．３ｋＤの分子量を有しかつ長さがおよそ４５５アミノ酸残基であるタンパク
質をコードする。ＣＳＡＰＫ−２遺伝子は、主として筋、例えば骨格筋もしくは
心筋で発現される。ＣＳＡＰＫ−２の４個のスプライス変異体もまた同定された
（図７−１２を参照されたい）。 Ｃ．ＣＳＡＰＫ−３核酸およびタンパク質分子 別の態様において、本発明の単離されたタンパク質、好ましくはＣＳＡＰＫ−
３タンパク質は、最低１個のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ部位および最低１個のＡＴ
Ｐ結合領域の存在に基づいて同定される。Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ部位およびＡ
ＴＰ結合領域は本明細書で記述されている。ＣＳＡＰＫ−３タンパク質のアミノ
酸残基５−１６４がＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼドメインを含んで成る。
【００５１】 本発明の単離されたタンパク質、好ましくはＣＳＡＰＫ−３タンパク質は、配
列番号８のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するか、または、配列
番号７もしくは配列番号９に十分に相同なヌクレオチド配列によりコードされる
。
【００５２】 本明細書で互換性に使用されるところの「ＣＳＡＰＫ−３活性」、「ＣＳＡＰ
Ｋ−３の生物学的活性」もしくは「ＣＳＡＰＫ−３の機能的活性」は、標準的技
術によりインビボもしくはインビトロで測定されるような、ＣＳＡＰＫ−３応答
性細胞もしくはＣＳＡＰＫ−３タンパク質の基質に対してＣＳＡＰＫ−３タンパ
ク質、ポリペプチドもしくは核酸分子により発揮される活性を指す。ＣＳＡＰＫ
−３の生物学的活性は本明細書に記述されている。
【００５３】 従って、本発明の別の態様はＣＳＡＰＫ−３活性を有する単離されたＣＳＡＰ
Ｋ−３タンパク質およびポリペプチドを特徴とする。好ましいタンパク質は、最
低１個のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ部位および最低１個のＡＴＰ結合領域を有する
ＣＳＡＰＫ−３タンパク質である。付加的な好ましいタンパク質は、最低１個の
Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ部位、最低１個のＡＴＰ結合領域、および好ましくはＣ
ＳＡＰＫ−３活性を有する。付加的な好ましいタンパク質は、最低１個のＳｅｒ
／Ｔｈｒキナーゼ部位および最低１個のＡＴＰ結合領域を有し、そして、好まし
くは、配列番号７もしくは配列番号９のヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子
にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌク
レオチド配列を有する核酸分子によりコードされる。
【００５４】 単離されたヒトＣＳＡＰＫ−３のｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびヒトＣＳ
ＡＰＫ−３ポリペプチドの予測されるアミノ酸配列を図３ならびにそれぞれ配列
番号７および８に示す。ヒトＣＳＡＰＫ−３をコードするヌクレオチド配列を含
有するプラスミドは、９８年１０月２７日にアメリカン タイプ カルチャー
コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒ
ｄ、ヴァージニア州マナサス ２０１１０−２２０９に寄託され、そして受託番
号２０３３０９を割り当てられた。この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国
際的承認に関するブダペスト条約（ｔｈｅ Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ
ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈ
ｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）の約定のも
とに維持されることができる。この寄託は、単に当業者のための便宜としてなさ
れ、そして、寄託が３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２で必要とされるという承認でな
い。
【００５５】 長さがおよそ２４５４ヌクレオチドであるＣＳＡＰＫ−３遺伝子は、およそ６
６．８ｋＤの分子量を有しかつ長さがおよそ５８１アミノ酸残基であるタンパク
質をコードする。ＣＳＡＰＫ−３遺伝子は、主として心、骨格筋、脳、胎盤、肺
、肝、腎および膵で発現される。 Ｄ．ＣＳＡＰＫ−４核酸およびタンパク質分子 別の態様において、本発明の単離されたタンパク質、好ましくはＣＳＡＰＫ−
４タンパク質は、最低１個のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ部位および最低１個のＡＴ
Ｐ結合領域の存在に基づいて同定される。Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ部位およびＡ
ＴＰ結合領域は本明細書で記述されている。ＣＳＡＰＫ−４タンパク質のアミノ
酸残基１１ないし７５がＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼドメインを含んで成る。
【００５６】 本発明の単離されたタンパク質、好ましくはＣＳＡＰＫ−４タンパク質は、配
列番号１１のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するか、または、配
列番号１０もしくは配列番号１２に十分に相同なヌクレオチド配列によりコード
される。
【００５７】 本明細書で互換性に使用されるところの「ＣＳＡＰＫ−４活性」、「ＣＳＡＰ
Ｋ−４の生物学的活性」もしくは「ＣＳＡＰＫ−４の機能的活性」は、標準的技
術によりインビボもしくはインビトロで測定されるような、ＣＳＡＰＫ−４応答
性細胞もしくはＣＳＡＰＫ−４タンパク質の基質に対してＣＳＡＰＫ−４タンパ
ク質、ポリペプチドもしくは核酸分子により発揮される活性を指す。ＣＳＡＰＫ
−４の生物学的活性は本明細書に記述されている。
【００５８】 従って、本発明の別の態様はＣＳＡＰＫ−４活性を有する単離されたＣＳＡＰ
Ｋ−４タンパク質およびポリペプチドを特徴とする。好ましいタンパク質は、最
低１個のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ部位および最低１個のＡＴＰ結合領域を有する
ＣＳＡＰＫ−４タンパク質である。付加的な好ましいタンパク質は、最低１個の
Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ部位、最低１個のＡＴＰ結合領域、および好ましくはＣ
ＳＡＰＫ−４活性を有する。付加的な好ましいタンパク質は、最低１個のＳｅｒ
／Ｔｈｒキナーゼ部位および最低１個のＡＴＰ結合領域を有し、そして、好まし
くは、配列番号１０もしくは配列番号１２のヌクレオチド配列を含んで成る核酸
分子にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする
ヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされる。
【００５９】 単離されたヒトＣＳＡＰＫ−４のｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびヒトＣＳ
ＡＰＫ−４ポリペプチドの予測されるアミノ酸配列を図４ならびにそれぞれ配列
番号１０および１１に示す。ヒトＣＳＡＰＫ−４をコードするヌクレオチド配列
を含有するプラスミドは、９８年１０月２７日にアメリカン タイプ カルチャ
ー コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖ
ａｒｄ、ヴァージニア州マナサス ２０１１０−２２０９に寄託され、そして受
託番号２０３３０７を割り当てられた。この寄託は、特許手続上の微生物の寄託
の国際的承認に関するブダペスト条約（ｔｈｅ Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔ
ｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏ
ｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ
ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）の約定
のもとに維持されることができる。この寄託は、単に当業者のための便宜として
なされ、そして、寄託が３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２で必要とされるという承認
でない。
【００６０】 長さがおよそ１８６４ヌクレオチドであるヒトＣＳＡＰＫ−４遺伝子は、およ
そ１８．４ｋＤの分子量を有しかつ長さがおよそ１６０アミノ酸残基であるタン
パク質をコードする。ＣＳＡＰＫ−４遺伝子は主として骨格筋で発現される。 Ｅ．ＣＳＡＰＫ−５核酸およびタンパク質分子 別の態様において、本発明の単離されたタンパク質、好ましくはＣＳＡＰＫ−
５タンパク質は、最低１個のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ部位および最低１個のＡＴ
Ｐ結合領域の存在に基づいて同定される。なお別の態様において、本発明の単離
されたタンパク質、好ましくはＣＳＡＰＫ−５タンパク質は、最低１個のＳｅｒ
／Ｔｈｒキナーゼ部位および最低１個のＡＴＰ結合領域の存在に基づいて同定さ
れる。
【００６１】 本発明の単離されたタンパク質、好ましくはＣＳＡＰＫ−５タンパク質は、配
列番号１４のアミノ酸配列に十分に相同なアミノ酸配列を有するか、または、配
列番号１３もしくは配列番号１５に十分に相同なヌクレオチド配列によりコード
される。
【００６２】 本明細書で互換性に使用されるところの「ＣＳＡＰＫ−５活性」、「ＣＳＡＰ
Ｋ−５の生物学的活性」もしくは「ＣＳＡＰＫ−５の機能的活性」は、標準的技
術によりインビボもしくはインビトロで測定されるような、ＣＳＡＰＫ−５応答
性細胞もしくはＣＳＡＰＫ−５タンパク質の基質に対してＣＳＡＰＫ−５タンパ
ク質、ポリペプチドもしくは核酸分子により発揮される活性を指す。ＣＳＡＰＫ
−５の生物学的活性は本明細書に記述されている。
【００６３】 従って、本発明の別の態様はＣＳＡＰＫ−５活性を有する単離されたＣＳＡＰ
Ｋ−５タンパク質およびポリペプチドを特徴とする。好ましいタンパク質は、最
低１個のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ部位および最低１個のＡＴＰ結合領域を有する
ＣＳＡＰＫ−５タンパク質である。付加的な好ましいタンパク質は、最低１個の
Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ部位、最低１個のＡＴＰ結合領域、および好ましくはＣ
ＳＡＰＫ−５活性を有する。付加的な好ましいタンパク質は、最低１個のＳｅｒ
／Ｔｈｒキナーゼ部位および最低１個のＡＴＰ結合領域を有し、そして、好まし
くは、配列番号１３もしくは配列番号１５のヌクレオチド配列を含んで成る核酸
分子にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする
ヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされる。
【００６４】 単離されたヒトＣＳＡＰＫ−５のｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびヒトＣＳ
ＡＰＫ−５ポリペプチドの予測されるアミノ酸配列を図５ならびにそれぞれ配列
番号１３および１４に示す。ヒトＣＳＡＰＫ−１をコードするヌクレオチド配列
を含有するプラスミドは、９８年１０月２７日にアメリカン タイプ カルチャ
ー コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖ
ａｒｄ、ヴァージニア州マナサス ２０１１０−２２０９に寄託され、そして受
託番号２０３３０５を割り当てられた。この寄託は、特許手続上の微生物の寄託
の国際的承認に関するブダペスト条約（ｔｈｅ Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔ
ｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏ
ｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ
ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）の約定
のもとに維持されることができる。この寄託は、単に当業者のための便宜として
なされ、そして、寄託が３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２で必要とされるという承認
でない。
【００６５】 長さがおよそ１３３３ヌクレオチドであるヒトＣＳＡＰＫ−５遺伝子は、およ
そ５１ｋＤの分子量を有しかつ長さがおよそ４４４アミノ酸残基であるタンパク
質をコードする。
【００６６】 本発明の多様な局面を以下のサブセクションでさらに詳細に記述する。すなわ
ち Ｉ．単離された核酸分子 本発明の一局面は、ＣＳＡＰＫタンパク質もしくはそれらの生物学的に活性の
部分をコードする単離された核酸分子、ならびに、ＣＳＡＰＫをコードする核酸
（例えばＣＳＡＰＫのｍＲＮＡ）を同定するためのハイブリダイゼーションプロ
ーブとしての使用に十分な核酸フラグメント、およびＣＳＡＰＫ核酸分子の増幅
もしくは突然変異のためのＰＣＲプライマーとしての使用のためのフラグメント
に関する。本明細書で使用されるところの「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分
子（例えばｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ
）、ならびにヌクレオチド類似物を使用して生成されるＤＮＡもしくはＲＮＡの
類似物を包含することを意図している。核酸分子は一本鎖もしくは二本鎖である
ことができるが、しかし好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００６７】 「単離された」核酸分子は、該核酸の天然の供給源中に存在する他の核酸分子
から分離されているものである。例えば、ゲノムＤＮＡに関して、「単離された
」という用語は、該ゲノムＤＮＡが天然に会合している染色体から分離されてい
る核酸分子を包含する。好ましくは、「単離された」核酸は、それから該核酸が
生じられる生物体のゲノムＤＮＡ中で該核酸に天然に隣接する配列（すなわち、
該核酸の５’および３’端に配置される配列）を含まない。例えば、多様な態様
において、単離されたＣＳＡＰＫ核酸分子は、それから該核酸が生じられる細胞
のゲノムＤＮＡ中で該核酸分子に天然に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２
ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂもしくは０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含有す
ることができる。さらに、ｃＤＮＡ分子のような「単離された」核酸分子は、組
換え技術により産生される場合に他の細胞性物質もしくは培地を実質的に含まな
いことができるか、または化学的に合成される場合は化学的前駆物質もしくは他
の化学物質を実質的に含まないことができる。
【００６８】 本発明の核酸分子、例えば配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６
、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列
番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８もしくは配列番号１９の
ヌクレオチド配列、またはその一部分を有する核酸分子は、標準的分子生物学技
術および本明細書に提供される配列情報を使用して単離することができる。例え
ば、配列番号１の核酸配列の全部もしくは一部分、または配列番号３のヌクレオ
チド配列をハイブリダイゼーションプローブとして使用して、（例えばサンブル
ック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．）とマ
ニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第２版、コールド スプリング
ハーバー ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ）、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー プレス（Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、ニ
ューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９に記述されるような）標準
的なハイブリダイゼーションおよびクローニングの技術を使用してＣＳＡＰＫ核
酸分子を単離することができる。
【００６９】 さらに、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配
列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番
号１６、配列番号１７、配列番号１８もしくは配列番号１９の全部もしくは一部
分を包含する核酸分子は、それぞれ、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配
列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１
３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８もしくは配列番
号１９の配列に基づいて設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用す
るポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により単離することができる。
【００７０】 本発明のある核酸は、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って、鋳型および適切なオ
リゴヌクレオチドプライマーとしてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、あるいはゲノムＤＮＡ
を使用して増幅することができる。そのように増幅された核酸を適切なベクター
中にクローン化することができ、そしてＤＮＡ配列分析により特徴づけることが
可能である。さらに、ＣＳＡＰＫのヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオ
チドは、標準的合成技術により、例えば自動ＤＮＡ合成機を使用して調製するこ
とができる。
【００７１】 好ましい一態様において、本発明の単離された核酸分子は配列番号１に示され
るヌクレオチド配列を含んで成る。配列番号１の配列は部分的なヒトＣＳＡＰＫ
−１のｃＤＮＡに対応する。このｃＤＮＡはヒトＣＳＡＰＫ−１タンパク質をコ
ードする配列（すなわち「コーディング領域」、ヌクレオチド２９７−１２０２
から）、ならびに５’非翻訳配列（ヌクレオチド１−２９６）および３’非翻訳
配列（ヌクレオチド１２０３−４１３７）を含んで成る。あるいは、該核酸分子
は、配列番号１のコーディング領域（例えばヌクレオチド２９７−１２０２、配
列番号３に対応する）のみを含むことができる。
【００７２】 好ましい一態様において、本発明の単離された核酸分子は配列番号４に示され
るヌクレオチド配列を含んで成る。配列番号４の配列は部分的なヒトＣＳＡＰＫ
−２のｃＤＮＡに対応する。このｃＤＮＡは部分的なヒトＣＳＡＰＫ−２タンパ
ク質をコードする配列（すなわち「コーディング領域」、ヌクレオチド４７−１
４１１から）、ならびに５’非翻訳配列（ヌクレオチド１−４６）および３’非
翻訳配列（ヌクレオチド１４１２−２１２０）を含んで成る。あるいは、該核酸
分子は、配列番号４のコーディング領域（例えばヌクレオチド４７−１４１１、
配列番号６に対応する）のみを含むことができる。別の好ましい態様において、
本発明の単離された核酸分子は、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８も
しくは配列番号１９に示されるヌクレオチド配列を含んで成る。
【００７３】 好ましい一態様において、本発明の単離された核酸分子は配列番号７に示され
るヌクレオチド配列を含んで成る。配列番号７の配列は部分的なヒトＣＳＡＰＫ
−３のｃＤＮＡに対応する。このｃＤＮＡは部分的なヒトＣＳＡＰＫ−３タンパ
ク質をコードする配列（すなわち「コーディング領域」、ヌクレオチド５１−１
７９３から）、ならびに５’非翻訳配列（ヌクレオチド１−５０）および３’非
翻訳配列（ヌクレオチド１７９４−２４５４）を含んで成る。あるいは、該核酸
分子は、配列番号７のコーディング領域（例えばヌクレオチド５１−１７９３、
配列番号９に対応する）のみを含むことができる。
【００７４】 好ましい一態様において、本発明の単離された核酸分子は配列番号１０に示さ
れるヌクレオチド配列を含んで成る。配列番号１０の配列は部分的なヒトＣＳＡ
ＰＫ−４のｃＤＮＡに対応する。このｃＤＮＡは部分的なヒトＣＳＡＰＫ−４タ
ンパク質をコードする配列（すなわち「コーディング領域」、ヌクレオチド２７
５−７５４から）、ならびに５’非翻訳配列（ヌクレオチド１−２７４）および
３’非翻訳配列（ヌクレオチド７５５−１８６４）を含んで成る。あるいは、該
核酸分子は、配列番号１０のコーディング領域（例えばヌクレオチド２７５−７
５４、配列番号１２に対応する）のみを含むことができる。
【００７５】 好ましい一態様において、本発明の単離された核酸分子は配列番号１３に示さ
れるヌクレオチド配列を含んで成る。配列番号１３の配列は部分的なヒトＣＳＡ
ＰＫ−５のｃＤＮＡに対応する。このｃＤＮＡは部分的なヒトＣＳＡＰＫ−５タ
ンパク質をコードする配列（すなわち「コーディング領域」、ヌクレオチド２−
１３３３から）を含んで成る。
【００７６】 別の好ましい態様において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１、配
列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、
配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配
列番号１８もしくは配列番号１９に示されるヌクレオチド配列、またはこれらの
ヌクレオチド配列のいずれかの一部分の相補物である核酸分子を含んで成る。配
列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配
列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列
番号１７、配列番号１８もしくは配列番号１９に示されるヌクレオチド配列に相
補的である核酸分子は、それがそれぞれ配列番号１、配列番号３、配列番号４、
配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号
１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８もしくは配列
番号１９に示されるヌクレオチド配列とハイブリダイズして安定な二重鎖を形成
することができるような、それぞれ配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列
番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３
、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８もしくは配列番号
１９に示されるヌクレオチド配列に十分に相補的であるものである。
【００７７】 なお別の好ましい態様において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１
、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１
０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７
、配列番号１８もしくは配列番号１９に示されるヌクレオチド配列（例えば該ヌ
クレオチド配列の長さ全体）、またはこれらのヌクレオチド配列のいずれかの一
部分に最低約５０％、５４％、５５％、６０％、６２％、６５％、７０％、７５
％、７８％、８０％、８５％、８６％、９０％、９５％、９７％、９８％もしく
はそれ以上相同であるヌクレオチド配列を含んで成る。
【００７８】 さらに、本発明の核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番
号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、
配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８もしくは配列番号１
９の核酸配列の一部分、例えばプローブもしくはプライマーとして使用すること
ができるフラグメント、またはＣＳＡＰＫタンパク質の生物学的に活性の部分を
コードするフラグメントのみを含むことができる。ＣＳＡＰＫ遺伝子のクローニ
ングから決定されるヌクレオチド配列は、他のＣＳＡＰＫファミリーのメンバー
、ならびに他の種からのＣＳＡＰＫ相同物の同定および／もしくはクローニング
での使用のため設計されるプローブおよびプライマーの生成を見込む。該プロー
ブ／プライマーは実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを典型的に含んで成る
。該オリゴヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６
、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列
番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８もしくは配列番号１９の
センス配列、または配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番
号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５
、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８もしくは配列番号１９のアンチセ
ンス配列、または配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号
７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、
配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８もしくは配列番号１９の天然に存在
する対立遺伝子変異体もしくは突然変異体の最低約１２もしくは１５、好ましく
は約２０もしくは２５、より好ましくは約３０、３５、４０、４５、５０、５５
、６０、６５もしくは７５の連続するヌクレオチドにストリンジェントな条件下
でハイブリダイズするヌクレオチド配列の一領域を典型的に含んで成る。例示的
一態様において、本発明の核酸分子は、長さが最低３５０、４００、４５０、５
００、５５０、６００、６５０、７００、７５０もしくは８００ヌクレオチドで
ありかつ配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列
番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号
１６、配列番号１７、配列番号１８もしくは配列番号１９の核酸分子にストリン
ジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配
列を含んで成る。
【００７９】 ＣＳＡＰＫヌクレオチド配列に基づくプローブは、同一のもしくは相同なタン
パク質をコードする転写物もしくはゲノム配列を検出するのに使用することがで
きる。好ましい態様において、プローブは、それに結合された標識基をさらに含
んで成り、例えば、標識基は放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、もしくは酵素
の補助因子であることができる。こうしたプローブは、被験者からの細胞のサン
プル中でのＣＳＡＰＫをコードする核酸のレベルを測定すること、例えば、ＣＳ
ＡＰＫのｍＲＮＡのレベルを検出すること、またはゲノムのＣＳＡＰＫ遺伝子が
突然変異もしくは欠失されているかどうかを決定することによるような、ＣＳＡ
ＰＫタンパク質を誤発現する(misexpress)細胞もしくは組織を同定するための診
断的試験キットの一部として使用することができる。
【００８０】 「ＣＳＡＰＫタンパク質の生物学的に活性の部分」をコードする核酸フラグメ
ントは、ＣＳＡＰＫの生物学的活性（ＣＳＡＰＫタンパク質の生物学的活性は本
明細書に記述されている）を有するポリペプチドをコードする、配列番号１、配
列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、
配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配
列番号１８もしくは配列番号１９のヌクレオチド配列の一部分を単離すること、
（例えばインビトロの組換え発現により）ＣＳＡＰＫタンパク質のコードされた
部分を発現すること、および、ＣＳＡＰＫタンパク質のコードされた部分の活性
を評価することにより調製することができる。
【００８１】 本発明は、遺伝暗号の縮重により配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列
番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３
、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８もしくは配列番号
１９に示されるヌクレオチド配列と異なりそしてこうして配列番号１、配列番号
３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番
号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号
１８もしくは配列番号１９に示されるヌクレオチド配列によりコードされるもの
と同一のＣＳＡＰＫタンパク質をコードする核酸分子をさらに包含する。別の態
様において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号２、配列番号５、配列番
号８、配列番号１１もしくは配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するタン
パク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００８２】 配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９
、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、
配列番号１７、配列番号１８もしくは配列番号１９に示されるＣＳＡＰＫのヌク
レオチド配列に加えて、ＣＳＡＰＫタンパク質のアミノ酸配列の変化につながる
ＤＮＡ配列の多形が集団（例えばヒト集団）内に存在してよいことが当業者によ
り認識されるであろう。ＣＳＡＰＫ遺伝子中のこうした遺伝子多形は、天然の対
立遺伝子変異によりある集団内の個体間に存在してよい。本明細書で使用される
ところの「遺伝子」および「組換え遺伝子」という用語は、ＣＳＡＰＫタンパク
質、好ましくは哺乳動物のＣＳＡＰＫタンパク質をコードする１個の読み取り枠
を包含しそしてコードしない調節配列およびイントロンをさらに包含する可能性
のある核酸分子を指す。こうした天然の対立遺伝子変異は、機能的および非機能
的双方のＣＳＡＰＫタンパク質を包含し、そして、典型的には、ＣＳＡＰＫ遺伝
子のヌクレオチド配列中で１〜５％の変動をもたらす可能性がある。天然の対立
遺伝子変異の結果でありかつＣＳＡＰＫタンパク質の機能的活性を変えない、Ｃ
ＳＡＰＫ遺伝子中のいずれかのおよび全部のこうしたヌクレオチドの変異ならび
に生じるアミノ酸の多形は、本発明の範囲内にあることを意図している。
【００８３】 さらに、他のＣＳＡＰＫファミリーのメンバーをコードしそして従って配列番
号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番
号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号
１７、配列番号１８もしくは配列番号１９のＣＳＡＰＫ配列と異なるヌクレオチ
ド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内にあることを意図している。例えば
、ヒトＣＳＡＰＫのヌクレオチド配列に基づいて別のＣＳＡＰＫのｃＤＮＡを同
定することができる。さらに、異なる種からのＣＳＡＰＫタンパク質をコードし
そして従って配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、
配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列
番号１６、配列番号１７、配列番号１８もしくは配列番号１９のＣＳＡＰＫ配列
と異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内にあることを意
図している。例えば、マウスＣＳＡＰＫのｃＤＮＡはヒトＣＳＡＰＫのヌクレオ
チド配列に基づいて同定することができる。
【００８４】 天然の対立遺伝子変異体および本発明のＣＳＡＰＫのｃＤＮＡの相同物に対応
する核酸分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標準的
なハイブリダイゼーション技術により、ハイブリダイゼーションプローブとして
本明細書に開示されるｃＤＮＡもしくはその一部分を使用して、本明細書に開示
されるＣＳＡＰＫ核酸に対するそれらの相同性に基づいて単離することができる
。
【００８５】 従って、別の態様において、本発明の単離された核酸分子は、長さが最低１５
、２０、２５、３０もしくはそれ以上のヌクレオチドであり、かつ、ストリンジ
ェントな条件下で、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番
号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５
、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８もしくは配列番号１９のヌクレオ
チド配列を含んで成る核酸分子にハイブリダイズする。他の態様において、該核
酸は長さが最低３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０
、４００、４５０、５００、５５０もしくは６００ヌクレオチドである。本明細
書で使用されるところの「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」と
いう用語は、その下で相互に最低３０％、４０％、５０％もしくは６０％相同な
ヌクレオチド配列が典型的に相互にハイブリダイズされたままとどまるハイブリ
ダイゼーションおよび洗浄の条件を記述することを意図している。好ましくは、
該条件は、相互に最低約７０％、より好ましくは最低約８０％、なおより好まし
くは最低約８５％もしくは９０％相同な配列が典型的に相互にハイブリダイズさ
れたままとどまるようである。こうしたストリンジェントな条件は当業者に既知
であり、そしてＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ジョン ワイリー アンド サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ
ｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク（１９８９）、６．３．１−６．３．６に見
出すことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい
制限しない一例は、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（Ｓ
ＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、次いで５０℃、５５℃、６０℃もしくは
６５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回もしくはそれ以上の洗浄
である。好ましくは、ストリンジェントな条件下で配列番号１、配列番号３、配
列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２
、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８も
しくは配列番号１９の配列にハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子は
、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書で使用されるところの「天然に
存在する」核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド配列を有する（例えば天然
のタンパク質をコードする）ＲＮＡもしくはＤＮＡ分子を指す。
【００８６】 当業者は、集団中に存在することができるＣＳＡＰＫ配列の天然に存在する対
立遺伝子変異体に加え、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配
列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号
１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８もしくは配列番号１９のヌク
レオチド配列中に突然変異により変化が導入されて、それによりＣＳＡＰＫタン
パク質の機能的能力を変えることなくコードされるＣＳＡＰＫタンパク質のアミ
ノ酸配列中の変化につながる可能性があることをさらに認識するであろう。例え
ば、「非必須」アミノ酸残基でのアミノ酸置換につながるヌクレオチド置換を、
配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９、
配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配
列番号１７、配列番号１８もしくは配列番号１９の配列中で作成することが可能
である。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を変えることなくＣＳＡＰＫ
の野生型配列（例えば配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１もし
くは配列番号１４の配列）から変えることができる残基である一方、「必須」ア
ミノ酸残基は生物学的活性に必要とされる。例えば、本発明のＣＳＡＰＫタンパ
ク質のあいだで保存されているアミノ酸残基はとりわけ変化に容易に従わないこ
とが予測される。さらに、本発明のＣＳＡＰＫタンパク質と他のＣＳＡＰＫファ
ミリーのメンバーとの間で保存されている付加的なアミノ酸残基は、変化に容易
に従うようではない。
【００８７】 従って、本発明の別の局面は、活性に必須でないアミノ酸残基の変化を含有す
るＣＳＡＰＫタンパク質をコードする核酸分子に関する。こうしたＣＳＡＰＫタ
ンパク質は、アミノ酸配列が配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１
１もしくは配列番号１４と異なるが、それでもなお生物学的活性を保持する。一
態様において、単離された核酸分子はあるタンパク質をコードするヌクレオチド
配列を含んで成り、ここで、該タンパク質は、配列番号２、配列番号５、配列番
号８、配列番号１１もしくは配列番号１４のアミノ酸配列に最低約４１％、４２
％、４５％、５０％、５５％、５９％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０
％、８１％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくはそれ以上相同なアミノ酸
配列（例えば、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１もしくは配
列番号１４のアミノ酸配列全体）を含んで成る。
【００８８】 配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１もしくは配列番号１４の
タンパク質に相同なＣＳＡＰＫタンパク質をコードする単離された核酸分子は、
１個もしくはそれ以上のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失がコードされるタン
パク質中に導入されるような、それぞれ、配列番号１、配列番号４、配列番号７
、配列番号１０もしくは配列番号１５のヌクレオチド配列中に１個もしくはそれ
以上のヌクレオチドの置換、付加もしくは欠失を導入することにより創製するこ
とができる。突然変異は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介性の突然変
異誘発のような標準的技術により、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列
番号１０もしくは配列番号１５に導入することができる。好ましくは、保存的ア
ミノ酸置換が１個もしくはそれ以上の予測される非必須アミノ酸残基で作成され
る。「保存的アミノ酸置換」は、その中でアミノ酸残基が類似の側鎖を有するア
ミノ酸残基で置き換えられているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基
のファミリーが当該技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性
側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギ
ン酸、グルタミン酸）、荷電しない極性の側鎖（例えばグリシン、アスパラギン
、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例
えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン
、メチオニン、トリプトファン）、β分枝状側鎖（例えばトレオニン、バリン、
イソロイシン）および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプ
トファン、ヒスチジン）をもつアミノ酸を包含する。従って、ＣＳＡＰＫタンパ
ク質中の予測される非必須アミノ酸残基は、同一の側鎖のファミリーからの別の
アミノ酸残基で好ましく置き換えられる。あるいは、別の態様において、飽和突
然変異誘発によるようにＣＳＡＰＫのコーディング配列の全部もしくは一部に沿
って突然変異を無作為に導入することができ、そして、結果として生じる突然変
異体をＣＳＡＰＫの生物学的活性についてスクリーニングして活性を保持する突
然変異体を同定することが可能である。配列番号１、配列番号４、配列番号７、
配列番号１０もしくは配列番号１５の突然変異誘発の後に、コードされるタンパ
ク質を組換え的に発現させることができ、そしてタンパク質の活性を測定するこ
とが可能である。
【００８９】 好ましい一態様において、突然変異体のＣＳＡＰＫタンパク質を、１）；細胞
レセプター（例えば心細胞の成長因子レセプター）からのシグナルの伝達を調節
する；２）細胞（例えば心細胞）の有糸分裂への進入を制御する；３）細胞の分
化を調節する；４）細胞死を調節する；もしくは５）細胞骨格機能（例えばアク
チンの束化）を調節する能力についてアッセイすることが可能である。
【００９０】 本発明の別の局面は、上述されたＣＳＡＰＫタンパク質をコードする核酸分子
に加えて、それに対しアンチセンスである単離された核酸分子に関する。「アン
チセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的、例えば二
本鎖ｃＤＮＡ分子のコーディング鎖に相補的、もしくはｍＲＮＡ配列に相補的で
あるヌクレオチド配列を含んで成る。従って、アンチセンス核酸はセンス核酸に
水素結合することが可能である。アンチセンス核酸は、ＣＳＡＰＫのコーディン
グ鎖全体もしくはその一部分のみに相補的である可能性がある。一態様において
、アンチセンス核酸分子は、ＣＳＡＰＫをコードするヌクレオチド配列のコーデ
ィング鎖の「コーディング領域」に対しアンチセンスである。「コーディング領
域」という用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含んで成るヌクレオチド
配列の領域を指す（例えば、ヒトＣＳＡＰＫ−１のコーディング領域は配列番号
３に対応する）。別の態様において、アンチセンス核酸分子は、ＣＳＡＰＫをコ
ードするヌクレオチド配列のコーディング鎖の「非コーディング領域」にアンチ
センスである。「非コーディング領域」という用語は、アミノ酸に翻訳されない
コーディング領域に隣接する５’および３’配列を指す（すなわち、５’および
３’非翻訳領域ともまた称される）。
【００９１】 本明細書に開示されるＣＳＡＰＫをコードするコーディング鎖の配列（例えば
配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２もしくは配列番号１５）を
与えられれば、ワトソンおよびクリックの塩基対形成の規則に従って本発明のア
ンチセンス核酸を設計することができる。アンチセンス核酸分子は、ＣＳＡＰＫ
のｍＲＮＡのコーディング領域全体に相補的であることができるが、しかし、よ
り好ましくは、ＣＳＡＰＫのｍＲＮＡのコーディングもしくは非コーディング領
域の一部分のみにアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アン
チセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＳＡＰＫのｍＲＮＡの翻訳開始部位を取り巻
く領域に相補的であることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例え
ば、長さが約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５
０ヌクレオチドであることができる。本発明のアンチセンス核酸は、当該技術分
野で既知の手順を使用する化学合成および酵素的ライゲーション反応を使用して
構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴ
ヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、または該分子の生物学的安定
性を増大させるもしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成される二重
鎖の物理的安定性を増大させるように設計された多様に改変されたヌクレオチド
を使用して、化学的に合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体
およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することが可能である。アンチセンス
核酸を生成するのに使用することができる改変ヌクレオチドの例は、５−フルオ
ロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、
ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロ
キシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジ
ン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−
ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチル
グアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニ
ン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−ア
デニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシ
アミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキ
シカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−
イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン
、プソイドウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラ
シル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−
５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル
−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウ
ラシル、（ａｃｐ３）ｗおよび２，６−ジアミノプリンを包含する。あるいは、
アンチセンス核酸は、その中に核酸がアンチセンスの向きでサブクローニングさ
れている発現ベクターを使用して生物学的に調製することができる（すなわち、
挿入された核酸から転写されるＲＮＡは目的の標的核酸に対しアンチセンスの向
きのものであることができる。以下のサブセクションにさらに記述される）。
【００９２】 それらがＣＳＡＰＫタンパク質をコードする細胞のｍＲＮＡおよび／もしくは
ゲノムＤＮＡとハイブリダイズもしくはそれに結合してそれにより例えば転写お
よび／もしくは翻訳を阻害することにより該タンパク質の発現を阻害するような
、本発明のアンチセンス核酸分子が、典型的に被験者に投与されるかもしくはイ
ンシトゥで生成される。ハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成する慣
習的なヌクレオチド相補性によることができるか、もしくは、例えばＤＮＡ二重
鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には二重らせんの主溝中の特異的相互
作用によることができる。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の一例は組
織部位での直接注入を包含する。あるいは、アンチセンス核酸分子を、選択され
た細胞に標的を定めるよう改変しそしてその後全身的に投与することができる。
例えば、全身投与のためには、例えば細胞表面のレセプターもしくは抗原に結合
するペプチドもしくは抗体にアンチセンス核酸分子を連結することにより選択さ
れた細胞表面上で発現されるレセプターもしくは抗原にそれらが特異的に結合す
るようなアンチセンス分子を改変することができる。アンチセンス核酸分子はま
た、本明細書に記述されるベクターを使用して細胞に送達することも可能である
。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、その中でアンチセン
ス核酸分子が強力なｐｏｌ ＩＩもしくはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの制御下
に置かれるベクター構築物が好ましい。
【００９３】 なお別の態様において、本発明のアンチセンス核酸分子はα−アノマー核酸分
子である。α−アノマー核酸分子は相補的ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを
形成し、その中では、通常のβ−ユニットに反して、鎖が相互に対し平行に走る
（ゴルティエ（Ｇａｕｌｔｉｅｒ）ら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
．Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１）。該アンチセンス核酸分子は、２’−ｏ
−メチルリボヌクレオチド（井上（Ｉｎｏｕｅ）ら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８）もしくはキメラのＲＮＡ−
ＤＮＡ類似物（井上（Ｉｎｏｕｅ）ら（１９８７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５
：３２７−３３０）もまた含む可能性がある。
【００９４】 さらに別の態様において、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リ
ボザイムは、それに対しそれらが相補的領域を有するｍＲＮＡのような一本鎖核
酸を切断することが可能であるリボヌクレアーゼ活性をもつ触媒性ＲＮＡ分子で
ある。従って、ＣＳＡＰＫのｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断してそれによりＣＳ
ＡＰＫのｍＲＮＡの翻訳を阻害するのに、リボザイム（例えば、（ハゼルホフ（
Ｈａｓｅｌｈｏｆｆ）とゲルラッハ（Ｇｅｒｌａｃｈ）（１９８８）Ｎａｔｕｒ
ｅ ３３４：５８５−５９１に記述される）ハンマーヘッド型リボザイム）を使
用することができる。ＣＳＡＰＫをコードする核酸に対し特異性を有するリボザ
イムは、本明細書に開示されるＣＳＡＰＫのｃＤＮＡのヌクレオチド配列（すな
わち配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号
９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６
、配列番号１７、配列番号１８もしくは配列番号１９）に基づいて設計すること
が可能である。例えば、テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）のＬ−１９
ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を構築することができ、その中では活性部位のヌクレオ
チド配列はＣＳＡＰＫをコードするｍＲＮＡ中で切断されるべきヌクレオチド配
列に相補的である。例えば、チェック（Ｃｅｃｈ）ら 米国特許第４，９８７，
０７１号；およびチェック（Ｃｅｃｈ）ら 米国特許第５，１１６，７４２号を
参照されたい。あるいは、ＣＳＡＰＫのｍＲＮＡを使用してＲＮＡ分子のプール
から特定のリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択することができる
。例えば、バーテル（Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．）とスゾスタク（Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ
．Ｗ．）（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１４１１−１４１８を参照され
たい。
【００９５】 あるいは、ＣＳＡＰＫの遺伝子発現は、標的細胞中でのＣＳＡＰＫ遺伝子の転
写を予防する三重らせん構造を形成するように、ＣＳＡＰＫの調節領域（例えば
ＣＳＡＰＫのプロモーターおよび／もしくはエンハンサー）に相補的なヌクレオ
チド配列の標的を定めることにより阻害することができる。一般に、ヘリーン（
Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．）（１９９１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．
６（６）：５６９−８４；ヘリーン（Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．）ら（１９９２）Ａｎ
ｎ．Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ６６０：２７−３６；およびマヘル（Ｍａｈｅ
ｒ，Ｌ．Ｊ．）（１９９２）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １４（１２）：８０７−１５
を参照されたい。
【００９６】 なお別の態様において、本発明のＣＳＡＰＫ核酸分子を、例えば該分子の安定
性、ハイブリダイゼーションもしくは溶解性を改良するように、塩基部分、糖部
分もしくはリン酸バックボーンで改変することができる。例えば、核酸分子のデ
オキシリボースリン酸バックボーンを、ペプチド核酸を生成するように改変する
ことが可能である（ハイラップ（Ｈｙｒｕｐ Ｂ．）ら（１９９６）Ｂｉｏｏｒ
ｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４（１）：５−２
３を参照されたい）。本明細書で使用されるところの「ペプチド核酸」もしくは
「ＰＮＡ」という用語は，その中でデオキシリボースリン酸バックボーンが偽ペ
プチドバックボーンにより置き換えられかつ４種の天然の核塩基(nucleobase)の
みが保持される核酸模倣物(mimics)、例えばＤＮＡ模倣物を指す。ＰＮＡの中性
のバックボーンは、低イオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡに対する特異的
ハイブリダイゼーションを見込むことが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成
は、ハイラップ（Ｈｙｒｕｐ Ｂ．）ら（１９９６）上記；ペリー・オキーフ（
Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ）ら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９
３：１４６７０−６７５に記述されるような標準的固相ペプチド合成プロトコル
を使用して実施することができる。
【００９７】 ＣＳＡＰＫ核酸分子のＰＮＡは治療および診断の用途に使用することが可能で
ある。例えば、ＰＮＡは、例えば転写もしくは翻訳の停止の誘導または複製の阻
害による遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンスもしくはアンチジー
ン(antigene)作用物質として使用することができる。ＣＳＡＰＫ核酸分子のＰＮ
Ａは、遺伝子中の単一塩基対の突然変異の分析（例えばＰＮＡに向けられたＰＣ
Ｒクランピングによる）で；他の酵素（例えばＳ１ヌクレアーゼ（ハイラップ（
Ｈｙｒｕｐ Ｂ．）（１９９６）上記））と共同して使用される場合に「人工的
制限酵素」として；またはＤＮＡの配列決定もしくはハイブリダイゼーションの
ためのプローブもしくはプライマーとして（ハイラップ（Ｈｙｒｕｐ Ｂ．）ら
（１９９６）上記；ペリー・オキーフ（Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ）上記）も
また使用することができる。
【００９８】 別の態様において、ＰＮＡに親油性基もしくは他のヘルパー基を結合すること
により、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成により、またはリポソームもしくは当該技
術分野で既知の薬物送達の他の技術の使用により、（例えばそれらの安定性もし
くは細胞の取り込みを高めるように）ＣＳＡＰＫのＰＮＡを改変することができ
る。例えば、ＣＳＡＰＫ核酸分子のＰＮＡ−ＤＮＡキメラを生成することが可能
であり、これはＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組み合わせることができる。
こうしたキメラは、ＰＮＡ部分が高結合親和性および特異性を提供することがで
きる一方で、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮアーゼＨおよびＤＮＡポリメラーゼ
）をＤＮＡ部分と相互作用させる。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基の積み重なり
、核塩基の間の結合の数および向きに関して選択された適切な長さのリンカーを
使用して連結することが可能である（ハイラップ（Ｈｙｒｕｐ Ｂ．）（１９９
６）上記）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、ハイラップ（Ｈｙｒｕｐ Ｂ．）
（１９９６）上記およびフィン（Ｆｉｎｎ Ｐ．Ｊ．）ら（１９９６）Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（１７）：３３５７−６３に記述されるよう
に実施することができる。例えば、標準的ホスホルアミダイトカップリングの化
学を使用してＤＮＡ鎖を固体支持体上で合成することができ、そして、改変され
たヌクレオシド類似物、例えば５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−
デオキシチミジンホスホルアミダイトを、ＰＮＡとＤＮＡの５’端との間として
使用することが可能である（マグ（Ｍａｇ，Ｍ．）ら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１７：５９７３−８８）。その後、５’のＰＮＡセグメ
ントおよび３’のＤＮＡセグメントをもつキメラ分子を生じさせるようにＰＮＡ
モノマーを段階的様式で結合する（フィン（Ｆｉｎｎ Ｐ．Ｊ．）ら（１９９６
）上記）。あるいは、キメラ分子は、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセ
グメントを用いて合成することができる（ペテルサー（Ｐｅｔｅｒｓｅｒ，Ｋ．
Ｈ．）ら（１９７５）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５
：１１１９−１１１２４）。
【００９９】 他の態様において、オリゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付属される
基（例えばインビボで宿主細胞レセプターに標的を向けるために）、または、細
胞膜（例えば、レツィンガー（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）ら（１９８９）Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ．８６：６５５３−６５５６；ルメートル（
Ｌｅｍａｉｔｒｅ）ら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８４：６４８−６５２；ＰＣＴ公開第ＷＯ８８／０９８１０号を参照され
たい）もしくは血液脳関門（例えばＰＣＴ公開第ＷＯ８９／１０１３４号を参照
されたい）を横断する輸送を助長する作用物質を包含してよい。加えて、オリゴ
ヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発性の切断剤（例えば、クロル（Ｋ
ｒｏｌ）ら（１９８８）Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６を
参照されたい）もしくは挿入剤（例えばゾン（Ｚｏｎ）（１９８８）Ｐｈａｒｍ
．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９を参照されたい）を用いて改変することが可能で
ある。この目的のため、オリゴヌクレオチドを別の分子（例えば、ペプチド、ハ
イブリダイゼーション誘発性の架橋剤、輸送剤もしくはハイブリダイゼーション
誘発性の切断剤）に結合してよい。 ＩＩ 単離されたＣＳＡＰＫタンパク質および抗−ＣＳＡＰＫ抗体 本発明の一つの態様は、単離されたＣＳＡＰＫタンパク質、およびその生物学
的活性部分、ならびに抗−ＣＳＡＰＫ抗体を産生するための免疫原としての使用
に適するポリペプチド断片に関する。一つの実施態様では、本来のＣＳＡＰＫタ
ンパク質は、標準のタンパク質精製技術を用いる適切な精製経路により、細胞ま
たは組織源から単離できる。別の実施態様では、ＣＳＡＰＫタンパク質は、組換
えＤＮＡ技術により生成できる。組換え発現の代わりに、ＣＳＡＰＫタンパク質
またはポリペプチドは、標準のペプチド合成技術を用いて化学的に合成できる。
【０１００】 「単離した」または「精製した」タンパク質またはその生物学的活性部分は、
ＣＳＡＰＫタンパク質が誘導された細胞または組織源からの細胞物質またはその
他の混入タンパク質が本質的にないか、または化学的に合成された場合には化学
的前駆体またはその他の化学薬品が本質的にない。用語「本質的に細胞物質がな
い」は、タンパク質が単離または組み換えにより産生された細胞の細胞成分から
タンパク質が分離されたＣＳＡＰＫタンパク質の調製物を含む。一つの実施態様
では、用語「本質的に細胞物質がない」は、非−ＣＳＡＰＫタンパク質（本明細
書では「混入タンパク質」とも呼ぶ）の約３０％（乾燥質量基準）以下、より好
ましくは非−ＣＳＡＰＫタンパク質の約２０％以下、さらにより好ましくは非−
ＣＳＡＰＫタンパク質の約１０％以下、そして最も好ましくは非−ＣＳＡＰＫタ
ンパク質の約５％以下を有するＣＳＡＰＫタンパク質の調製物を包含する。ＣＳ
ＡＰＫタンパク質またはその生物学的活性部分が組換えにより産生される場合に
は、これも好ましくは本質的に培養基を含まない、すなわち培養基がタンパク質
調製物の体積の約２０％以下、より好ましくは約１０％以下、そして最も好まし
くは培養基が約５％以下である。
【０１０１】 用語「化学的前駆体またはその他の化学薬品が本質的にない」は、タンパク質
の合成に関与する化学的前駆体またはその他の化学薬品からタンパク質が分離さ
れたＣＳＡＰＫタンパク質の調製物を含む。一つの実施態様では、用語「化学的
前駆体またはその他の化学薬品が本質的にない」は、化学的前駆体または非−Ｃ
ＳＡＰＫ化学薬品の約３０％（乾燥質量基準）以下、より好ましくは化学的前駆
体または非ＣＳＡＰＫ化学薬品の約２０％以下、さらにより好ましくは化学的前
駆体または非ＣＳＡＰＫ化学薬品の約１０％、最も好ましくは化学的前駆体また
は非ＣＳＡＰＫ化学薬品の約５％以下を有するＣＳＡＰＫタンパク質の調製物を
含む。
【０１０２】 ＣＳＡＰＫタンパク質の生物学的活性部分は、ＣＳＡＰＫタンパク質のアミノ
酸配列と十分に相同またはこれから誘導されたアミノ酸配列、例えば、配列番号
２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、または配列番号１４に記載のアミ
ノ酸配列番号を含んでなりるペプチドを含み、これらはＣＳＡＰＫタンパク質の
全長よりは少ないアミノ酸を含み、そしてＣＳＡＰＫタンパク質の少なくとも１
種の活性を示す。代表的には、生物学的活性部分は、ＣＳＡＰＫタンパク質の少
なくとも１種の活性を有するドメインまたはモチーフを含んでなる。ＣＳＡＰＫ
タンパク質の生物学的活性部分は、例えば長さが少なくとも１０、２５、５０、
１００またはそれ以上のアミノ酸であるポリペプチドであることができる。
【０１０３】 好ましい実施態様では、ＣＳＡＰＫタンパク質は、配列番号２、配列番号５、
配列番号８、配列番号１１、または配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する
。別の実施態様では、ＣＳＡＰＫタンパク質は配列番号２、配列番号５、配列番
号８、配列番号１１、または配列番号１４に本質的に相同であり、配列番号２、
配列番号５、配列番号８、配列番号１１、または配列番号１４のタンパク質の機
能的活性を保持するが、しかし、上記のサブセクションＩに詳細に記載したよう
に天然の対立遺伝子変異または突然変異誘発によりアミノ酸配列は異なる。従っ
て、別の実施態様では、ＣＳＡＰＫタンパク質は、配列番号２、配列番号５、配
列番号８、配列番号１１、または配列番号１４のアミノ酸配列に少なくとも約４
１％、４２％、４５％、５０％、５５％、５９％、６０％、６５％、７０％、７
５％、８０％、８１％、８５％、９０％、９５％、９８％またはこれ以上が相同
なアミノ酸配列（例えば、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１
、または配列番号１４のアミノ酸配列全体）を含んでなるタンパク質である。
【０１０４】 ２種のアミノ酸配列または２種の核酸配列の一致百分率を決定するために、配
列は最適な比較の目的に従って配置される（例えば最適配置のための第一と第二
のアミノ酸または核酸配列の一方または双方内にギャップを挿入でき、そして非
相同配列は、比較の目的では無視できる）。好ましい実施態様では、比較の目的
で配置された参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましく
は少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは
少なくとも６０％、そしてこれら以上に好ましくは少なくとも７０％、８０％、
または９０％である（例えば、アミノ酸残基１７７個を有する配列番号２、５、
８、１１、または１４のＣＳＡＰＫアミノ酸配列に対して第二の配列を配置する
場合には、少なくとも８０個、好ましくは少なくとも１００個、より好ましくは
少なくとも１２０個、さらにより好ましくは少なくとも１４０個、そしてそして
これら以上に好ましくは少なくとも１５０、１６０、または１７０個のアミノ酸
残基が配列される）。次いで、相応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置に
おけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一の配列内の位置が、第
二の配列内の相応する位置で同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められて
いる場合には、分子はその位置では一致する（本明細書中に使用する場合に、ア
ミノ酸または核酸「一致」は、アミノ酸または核酸「相同性」と同等である。２
種の配列の間の一致百分率とは、２種の配列の最適な配置のために導入する必要
があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮に入れて、配列が共有する
一致した位置の数の関数である。
【０１０５】 ２種の配列の間の配列の比較および一致の決定は、数学的アルゴリズムを用い
て達成できる。好ましい実施態様では、２種のアミノ酸配列の間の一致百分率は
、ＧＣＧソフトウエアパッケージ中のＧＡＰプログラム（http://www.gcg.comで
入手可能）を用い、ブロサム(Blossom) ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マ
トリックスのいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギ
ャップウエイトおよび１、２、３、４、５、または６の長さウエイトを用いて決
定される。さらに別の好ましい実施態様では、２種のヌクレオチド配列間の一致
百分率は、ＧＣＧソフトウエアパッケージ中のＧＡＰプログラム（http://www.g
cg.comで入手可能）を用い、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、および
４０、５０、６０、７０、または８０のギャップウエイトおよび１、２、３、４
、５、または６の長さウエイトを用いて決定される。
【０１０６】 本発明の核酸およびタンパク質配列は、さらに、例えば他のファミリーメンバ
ーまたは関連配列の特定に対して公開データベースに関してサーチを行うための
「照会配列」として用いることができる。このようなサーチは、アルトシュルら
(Altschul, et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10) のＮＢＬＡＳＴおよび
ＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて行うことができる。ＢＬ
ＡＳＴヌクレオチドサーチは、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワー
ド長＝１２を用いて行って、本発明のＣＳＡＰＫ核酸分子に相同のヌクレオチド
配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質サーチは、ＸＢＬＡＳＴプログ
ラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行って、本発明のＣＳＡＰＫタンパ
ク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較の目的でギャップのあ
る配置を得るためには、アルトシュルら(Altschul, et al., (1997) Nucleic Ac
ids Res., 25(17):3389-3402) の記載に従って、ギャップドＢＬＡＳＴを利用で
きる。ＢＬＡＳＴおよびギャップドＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、そ
れぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォールト
パラメーターが使用できる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov.参照。
【０１０７】 本発明は、ＣＳＡＰＫキメラまたは融合タンパク質も提供する。本明細書中に
使用する場合に、ＣＳＡＰＫ「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は
、非−ＣＳＡＰＫポリペプチドに操作可能に連結したＣＳＡＰＫポリペプチドを
含んでなる。「ＣＳＡＰＫポリペプチド」は、ＣＳＡＰＫに相当するアミノ酸配
列を有するポリペプチドを呼び、一方「非−ＣＳＡＰＫポリペプチド」は、ＣＳ
ＡＰＫタンパク質に本質的に相同ではないタンパク質、例えばＣＳＡＰＫタンパ
ク質とは異なり、そして同じまたは異なる生物体から誘導されたタンパク質に相
当するアミノ酸配列を有するポリペプチドを呼ぶ。ＣＳＡＰＫ融合タンパク質の
中で、ＣＳＡＰＫポリペプチドは、ＣＳＡＰＫタンパク質のすべてまたは一部分
に相応することができる。好ましい実施態様では、ＣＳＡＰＫ融合タンパク質は
、ＣＳＡＰＫタンパク質の少なくとも１個の生物学的活性部分を含んでなる。別
の好ましい実施態様では、ＣＳＡＰＫ融合タンパク質は、ＣＳＡＰＫタンパク質
の少なくとも２個の生物学的活性部分を含んでなる。融合タンパク質の中で、用
語「操作可能に連結した」は、ＣＳＡＰＫポリペプチドおよび非−ＣＳＡＰＫポ
リペプチドが互いにフレーム内で融合していることを示すことを意図する。非−
ＣＳＡＰＫポリペプチドは、ＣＳＡＰＫポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端
に融合できる。
【０１０８】 例えば、一つの実施態様で、融合タンパク質は、ＣＳＡＰＫ配列がＧＳＴ配列
のＣ−末端に融合しているＧＳＴ−ＣＳＡＰＫ融合タンパク質である。このよう
な融合タンパク質は、組換えＣＳＡＰＫの精製を容易にすることができる。
【０１０９】 他の実施態様では、融合タンパク質は、Ｎ−末端で非相同シグナル配列を含む
ＣＳＡＰＫタンパク質である。ある宿主細胞（例えば哺乳類宿主細胞）中では、
ＣＳＡＰＫの発現および／または分泌は、非相同シグナル配列の使用により増加
できる。
【０１１０】 本発明のＣＳＡＰＫ融合タンパク質は、薬剤製剤中に混和し、そして対象体(s
ubject) の生体内に投与できる。ＣＳＡＰＫ融合タンパク質は、ＣＳＡＰＫ基質
の生物的利用能率に影響するように使用できる。ＣＳＡＰＫ融合タンパク質の使
用は、細胞増殖関連疾患、例えば心臓血管疾患の処置のために治療的に使用して
もよい。その上、本発明のＣＳＡＰＫ融合タンパク質は、ＣＳＡＰＫ配位子を精
製し、そしてＣＳＡＰＫとＣＳＡＰＫ基質との相互作用を阻害する分子を特定す
るためのスクリーニングアッセイには、対象体内で抗−ＣＳＡＰＫ抗体を産生さ
せるための免疫原として使用できる。
【０１１１】 好ましくは、本発明のＣＳＡＰＫキメラまたは融合タンパク質は、標準の組換
えＤＮＡ技術により産生される。例えば、種々のポリペプチド配列をコードする
ＤＮＡ断片を、慣用の技術、例えば連結のための平滑末端または付着末端終点の
利用、適当な末端を与えるための制限酵素消化、適切な凝集性の末端の充填、望
ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素連結に
従って、フレーム内で一緒に連結される。他の実施態様では、融合遺伝子は、自
動化ＤＮＡ合成装置を含む慣用の技術により合成できる。あるいは、遺伝子断片
のＰＣＲ増幅は、引き続いてアニールおよび再増幅してキメラ遺伝子配列を産生
できる２個の連続した遺伝子断片の間の相補的オーバーハングを発生させるアン
カープライマーを用いて行うことができる（例えばオースベルら編集「最近の分
子生物学プロトコール(Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausube
l et al, John Wiley & Sons, 1992) 参照）。さらに、すでに融合部分をコード
している多数の発現ベクター（例えばＧＳＴポリペプチド）が市場で入手できる
。ＣＳＡＰＫをコードする核酸は、融合部分がＣＳＡＰＫタンパク質にフレーム
内連結するような発現ベクター中にクローニングできる。
【０１１２】 本発明は、ＣＳＡＰＫアゴニスト（疑似体(mimetic) ）またはＣＳＡＰＫアン
タゴニストのいずれかとして機能するＣＳＡＰＫタンパク質の変種にも関する。
ＣＳＡＰＫタンパク質の変種は、突然変異誘発、例えばＣＳＡＰＫタンパク質の
離散位置突然変異または末端切り取りにより生成できる。ＣＳＡＰＫタンパク質
のアンタゴニストは、ＣＳＡＰＫタンパク質の本来的に存在する形の生物学的活
性と本質的に同等であるかまたは部分集合を保持できる。ＣＳＡＰＫタンパク質
のアンタゴニストは、例えばＣＳＡＰＫタンパク質の心臓血管系活性を競合的に
調節することによるＣＳＡＰＫタンパク質の本来的に存在する形の活性の１種ま
たはそれ以上を阻害できる。従って、特異的な生物学的効果は、限定された機能
の変種を用いる処理により誘発できる。一つの実施態様では、タンパク質の本来
的に存在する形の生物学的活性の部分集合を有する変種を用いる対象体の処理は
、ＣＳＡＰＫタンパク質の本来的に存在する形を用いる処理と比較して、対象体
内での副作用が少ない。
【０１１３】 一つの実施態様では、ＣＳＡＰＫアゴニスト（疑似体）またはＣＳＡＰＫアン
タゴニストのいずれかとして機能するＣＳＡＰＫタンパク質の変種は、ＣＳＡＰ
Ｋタンパク質の突然変異体、例えば末端切断突然変異体の組み合わせライブラリ
ーをＣＳＡＰＫタンパク質アゴニストまたはアンタゴニスト活性に関してスクリ
ーニングして特定できる。一つの実施態様では、ＣＳＡＰＫ変種の多様化ライブ
ラリーは、核酸レベルで組合わせ突然変異誘発により生成され、そして多様化遺
伝子ライブラリーによりコードされる。ＣＳＡＰＫ変種の多様化ライブラリーは
、例えば、可能なＣＳＡＰＫ配列の変性集合を個別のポリペプチドとして発現で
きるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的に連結する
ことによるか、あるいはＣＳＡＰＫ配列の集合をその中に含んでいるより大きい
融合タンパク質（例えばファージ表示のため）の集合として生成できる。可能な
ＣＳＡＰＫ変種のライブラリーを変性オリゴヌクレオチド配列から生成させるた
めに使用できる各種の方法がある。変性遺伝子配列の化学合成は、自動化ＤＮＡ
合成装置内で行うことができ、次いで合成遺伝子を適切な発現ベクター内に連結
できる。遺伝子の変性集合の使用は、一つの混合物として、可能なＣＳＡＰＫ配
列の望ましい集合をコードするすべての配列の提供を可能とする。変性オリゴヌ
クレオチドの合成のための方法は、当該技術分野では公知である〔例えば、ナラ
ン、Ｓ．Ａ．(Narang, S.A.(1983) Tetrahedron 39:3);イタクラら(Itakura et
al(1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323); イタクラら(Itakura et al(1984), Sc
ience 198:1056);イケら(Ike et al.(1983) Nucleic Acid Res. 11:477) 参照〕
。
【０１１４】 さらに、ＣＳＡＰＫタンパク質コーディング配列の断片のライブラリーは、Ｃ
ＳＡＰＫタンパク質の変種のスクリーニングおよび引き続いての選択のためのＣ
ＳＡＰＫ断片の多様化集団を生成させるために使用できる。一つの実施態様では
、コーディング配列断片のライブラリーは、ＣＳＡＰＫコーディング配列の二本
鎖ＰＣＲ断片を、ヌクリアーゼを用いて分子あたりに約一回だけのニッキングが
起きる条件下で処理し、二本鎖ＤＮＡを変性し、種々のニックした生成物からセ
ンス／アンチセンス対を含んでもよい二本鎖ＤＮＡからＤＮＡを再生し、Ｓ１ヌ
クレアーゼを用いる処理により再形成された二重体から一本鎖部分を取り除き、
そして得られた断片ライブラリーを発現ベクター中に連結することにより生成で
きる。この方法により、ＣＳＡＰＫタンパク質のＮ−末端、Ｃ−末端および種々
の大きさの内部断片をコードする発現ライブラリーが誘導できる。
【０１１５】 点突然変異または末端切断により作製される組み合わせライブラリーの遺伝子
生成物をスクリーニングするため、および選択された性質を有する遺伝子生成物
のためのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために、種々の技術が当該
技術分野では公知である。このような技術は、ＣＳＡＰＫタンパク質の組み合わ
せ突然変異誘発により生成した遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングのた
めに適用できる。大きい遺伝子ライブラリーのスクリーニングのために、高処理
量分析に適する最も広範に使用されている技術は、代表的には、遺伝子ライブラ
リーを複製可能な発現ベクター中にクローニング、適切な細胞を得られたベクタ
ーのライブラリーを用いて形質転換、および希望する活性の検出が生成物が検出
された遺伝子をコードするベクターの単離を容易とする条件下で組み合わせ遺伝
子を発現させることを含む。ライブラリー中の機能性突然変異体の頻度を増加さ
せる新しい技術であるレクルーシブ・アンサンブル突然変異誘発(recrusive ens
emble mutagenesis, REM) は、ＣＳＡＰＫ変種を特定するためのスクリーニング
アッセイと組み合わせて使用できる〔アーキンおよびユルヴァン(Arkin and You
rvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815); デルグレーブら(Del
grave et al. (1993) Protein Engineering 6(3);327-331) 。
【０１１６】 一つの実施態様では、細胞に基づくアッセイが、多様化ＣＳＡＰＫライブラリ
ーを分析するために利用できる。例えば、発現ベクターのライブラリーは、ＣＳ
ＡＰＫを普通に合成して分泌する細胞株内に移入できる。次いで、ＣＳＡＰＫお
よび特定の変異ＣＳＡＰＫが分泌され、そして細胞上清中のＣＳＡＰＫ活性に対
する突然変異体の発現の効果が、例えば多数の酵素アッセイのいずれかにより検
出できるように、移入した細胞を培養する。次いで、プラスミドＤＮＡを細胞か
ら回収して、ＣＳＡＰＫ活性の阻害、あるいは強化作用を採点し、そして個々の
クローンをさらに特性化できる。
【０１１７】 単離されたＣＳＡＰＫタンパク質、またはその一部分または断片は、ポリクロ
ーナルおよびモノクローナル抗体調製のための標準技術を用いてＣＳＡＰＫを結
合する抗体を生成するための免疫原として使用できる。全長ＣＳＡＰＫタンパク
質が使用でき、あるいは、本発明は、免疫原として使用するためのＣＳＡＰＫの
抗原ペプチド断片を提供する。ＣＳＡＰＫの抗原ペプチドは、配列番号２、配列
番号５、配列番号８、配列番号１１、または配列番号１４に記載のアミノ酸配列
の少なくともアミノ酸残基８個を含んでなり、そして、ペプチドに対して生成し
た抗体がＣＳＡＰＫと特定の免疫複合体を形成するようにＣＳＡＰＫのエピトー
プを包含する。好ましくは、抗原ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸残基
、より好ましくは少なくとも１５個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは少な
くとも２０個のアミノ酸残基、そして最も好ましくは少なくとも３０個のアミノ
酸残基を含んでなる。
【０１１８】 抗原ペプチドにより包含される好ましいエピトープは、タンパク質の表面に位
置するＣＳＡＰＫの領域、例えば親水性領域である。
【０１１９】 ＣＳＡＰＫ免疫原は、代表的には、適切な対象体（例えばラビット、ヤギ、マ
ウスまたはその他の動物）を免疫原を用いて免疫化することにより抗体を調製す
るために使用される。適切な免疫原的調製物は、例えば組換えにより発現したＣ
ＳＡＰＫタンパク質または化学的に合成したＣＳＡＰＫポリペプチドを含むこと
ができる。調製物は、さらにアジュバント、例えばフロインドの完全または不完
全アジュバント、または類似する免疫刺激性薬剤を含むことができる。免疫原Ｃ
ＳＡＰＫ調製物を用いる適切な対象体の免疫化は、ポリクローナル抗−ＣＳＡＰ
Ｋ抗体反応を誘発する。
【０１２０】 従って、本発明の他の態様は、抗−ＣＳＡＰＫ抗体に関する。用語「抗体」は
、本明細書中で使用する場合には、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分
子の免疫学的に活性な部分、すなわち特異的に抗原、例えばＣＳＡＰＫに結合（
免疫反応）する抗原結合部位を含む分子の部分を呼ぶ。免疫グロブリン分子の免
疫学的に活性な部分の例は、抗体を酵素、例えばペプシンで処置して生成できる
Ｆ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）2 断片を含む。本発明は、ＣＳＡＰＫを結合する
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。用語「モノクローナル抗
体」または「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書中で使用する場合には、
ＣＳＡＰＫの特定のエピトープと免疫反応が可能な抗原結合部位のただ一種のみ
を含む抗体分子の集団を呼ぶ。従って、モノクローナル抗体組成物は、代表的に
は免疫反応する特定のＣＳＡＰＫタンパク質に対する単一結合親和性を示す。
【０１２１】 ポリクローナル抗−ＣＳＡＰＫ抗体は、上記のように、適切な対象体をＣＳＡ
ＰＫ免疫原を用いて免疫化して調製できる。免疫化された対象体中の抗−ＣＳＡ
ＰＫ抗体力価は、標準の技術、例えば固定化したＣＳＡＰＫを用いる酵素結合免
疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて経過時間に対して測定できる。希望する場
合には、ＣＳＡＰＫに対する抗体分子を哺乳類から（例えば血液から）単離し、
さらに周知の技術、例えばタンパク質Ａクロマトグラフィーにより精製してＩｇ
Ｇ画分を得ることができる。免疫化の後の適当な時間、例えば、抗−ＣＳＡＰＫ
抗体力価が最高の時点で、抗体産生細胞を対象体から入手し、標準の技術、例え
ば最初にコーラーおよびミルステインにより記載されたハイブリドーマ法（Kohl
er and Milstein(1975) Nature 256;495-497) 〔さらに、ブラウンら(Brown et
al., (1983) J. Immunol. 127:539-546); ブラウンら(Brown et al., (1983) J.
Biol. Chem. 255:4980-4983); イェーら(Yeh et al., (1976) Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 76:2927-2931)、およびイェーら(Yeh et al., (1982) Int. J. Ca
ncer 29:269-275)も参照〕、さらに最近ではヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（コ
ズボールら(Kozbor et al, (1983) Immunol Today 4:72) ）、ＥＢＶハイブリド
ーマ法（コールら(Cole et al.(1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Ther
apy, Alan R. Liss, Inc., pp77-96) ）またはトリオーマ(Trioma)技術などによ
りモノクローナル抗体調製に使用できる。モノクローナル抗体ハイブリドーマ生
成のための技術は、周知である〔一般的には、Ｒ．Ｈ．ケネス(R.H.Kenneth, in
Monoclonal Antibodies, A New Dimension In Biological Analyses, Plenum P
ublishing Corp., New York, New York (1980));Ｅ．Ａ．ラーナー(E.A. Lerner
(1981) Yale J. Biol. Med. 54:387-402):Ｍ．Ｌ．ジェフターら(M.L. Gefter e
t al., (1977) Somatic Cell Genet. 3: 231-236) 参照〕。要約すると、不死細
胞株（代表的には骨髄腫）を、ＣＳＡＰＫ免疫原を用いて免疫化した哺乳類から
上記のようにしてリンパ球（代表的には脾細胞）に融合し、そして得られたハイ
ブリドーマ細胞のカルチャー上清をスクリーニングして、ＣＳＡＰＫを結合する
モノクローナル抗体を生成するハイブリドーマを特定する。
【０１２２】 リンパ球と不死化した細胞株とを融合するために使用される多数の周知のプロ
トコールのいずれも、抗−ＣＳＡＰＫモノクローナル抗体を生成する目的のため
に適用できる〔例えばＧ．ガルフルら(G. Gelfre et al.(1977) Nature 266:550
52);ガルフルら(G. Gelfre et al. Somatic Cell Genet.,前出);ラーナー(Lerne
r Yale J. Biol. Med.前出);ケネス(Kenneth, Monoclonal Antibodies, 前出）
参照〕。さらに、普通の熟練者は、使用できるこのような方法の多数の変種があ
ることを認めるであろう。代表的には、不死細胞株（例えば骨髄腫細胞株）が、
リンパ球と同じ哺乳類種から誘導される。例えば、マウスのハイブリドーマは、
本発明の免疫原製剤を用いて免疫化したマウスからのリンパ球を不死化したマウ
ス細胞株と融合させることにより調製できる。好ましい不死細胞株は、ヒポキサ
ンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養基（「ＨＡＴ培養基」）に感
受性のマウス骨髄腫細胞株である。多数の骨髄腫細胞株、例えばＰ３−ＮＳ１／
１−Ａｇ−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３またはＳｐ2 ／Ｏ−Ａｇ１４骨髄
腫株のいずれでも、標準的な技術に従う融合相手として使用できる。これらの骨
髄腫株は、ＡＴＣＣから入手できる。代表的には、ＨＡＴ−感受性のマウス骨髄
腫細胞は、ポリエチレングリコール（〔ＰＥＧ」）を用いてマウス脾細胞に融合
される。次いで、融合からもたらされるハイブリドーマ細胞は、未融合および非
産生性融合骨髄腫細胞を死滅させるＨＡＴ培養基を用いて選択する（未融合骨髄
腫細胞は、形質転換されていないので数日後に死滅する）。本発明のモノクロー
ナル抗体を産生する骨髄腫細胞は、ＣＳＡＰＫを結合する抗体に関して、例えば
標準ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、骨髄腫カルチャー上清をスクリーニングして
検出される。
【０１２３】 モノクローナル抗体分泌骨髄腫を作製する代わりに、組換え組み合わせ(recom
binant combinatorial) 免疫グロブリンライブラリー（例えば抗体ファージ表示
ライブラリー）をＣＳＡＰＫを用いてスクリーニングして、モノクローナル抗−
ＣＳＡＰＫ抗体が特定および単離でき、これによりＣＳＡＰＫを結合する免疫グ
ロブリンライブラリーメンバーを単離する。ファージ表示ライブラリーを生成お
よびスクリーニングするためのキットは、市場で入手できる（例えばファルマシ
ア組換えファージ抗体システム(Pharumacia Recombinant Phage Antibody Syste
m)、カタログ番号２７−９４００−０１；およびストラタジーン(Stratagene)
ＳｕｒｆＺＡＰTMファージ表示キット、カタログ番号２４０６１２）。さらに、
抗体表示ライブラリーを生成およびスクリーニングに使用するために特に適する
方法および試薬の例は、例えば、ラドナーら(Ladner et al.) 米国特許第５，２
２３，４０９号、カングら(Kang et al.) ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ９２／１
８６１９、ダウアーら(Dower et al.)ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ９１／１７２
７１、ウインターら(Winter et al.) ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ９２／２０７
９１、マークランドら(Markland et al.) ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ９２／１
５６７９、ブライトリングら(Breitling et al.)ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ９
３／０１２８８、マッカファティら(McKafferty et al.) ＰＣＴ国際特許公開番
号ＷＯ９２／０１０４７、ガラードら(Garrard et al.)ＰＣＴ国際特許公開番号
ＷＯ９２／０９６９０、ラドナーら(Ladner et al.) ＰＣＴ国際特許公開番号Ｗ
Ｏ９０／０２８０９、フックスら(Fuchs et al (1991) Bio/Technology 9:1370-
1372);ヘイら(Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85); ヒュー
ズら(Huse et al (1989) Science 246 1275-1281);グリフィスら(Griffith
et al.(1993) EMBO J. 12:725-734); ホーキンズら(Hawkins et al., (1992) J.
Mol. Biol. 226:889-896); クラークソンら(Clarkson et al., (1991) Nature
352: 624-628);グラムら(Gram et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3
576-3580);ガラドら(Garrad et al., (1991) Bio/Technology 9:1373-1377); ホ
ゲンブームら(Hoogenboom et al. (1991) Nuc. Acid. Res. 19:4133-4137);バル
バスら(Barbas et al.(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982);およ
びマッカファーティら(McCafferty et al. Nature (1990) 348: 552-554)中に見
いだすことができる。
【０１２４】 その上、標準の組換えＤＮＡ技術を用いて調製できるヒトおよび非−ヒト部分
の両方を含んでなる、組換え抗−ＣＳＡＰＫ抗体、例えばキメラおよび人体適応
モノクローナル抗体は、本発明の範囲内である。このようなキメラおよび人体適
応モノクローナル抗体は、当該技術分野で公知の組換えＤＮＡ技術、例えばロビ
ンソンら(Robinson et al.) 国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９、
アキラら(Akira et al.)欧州特許出願第１８４，１８７号、タニグチ、Ｍ．(Tan
iguti, M.)欧州特許出願第１７１，４９６号、モリソンら(Morrison et al.) 欧
州特許出願第１７３，４９４号、ノイバーガーら(Neuberger et al.)ＰＣＴ国際
特許公開番号ＷＯ８６／０１５３３、カビリら(Cabilly et al.)米国特許第４，
８１６，５６７号、カビリら(Cabilly et al.)欧州特許出願第１２５，０２３号
、ベターら(Better et al. (1988) Science 240:1041-1043); リウら(Liu et al
. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443);リウら(Liu et al. (198
7) J. Immunol. 139:3521-3526);サンら(Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 84:214-218);ニシムラら(Nishimura et al. (1987) Canc Res. 47:99
9-1005);ウッドら(Wood et al., (1985) Nature 314:446-449); およびショーら
(Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559);モリソン(Morriso
n, S.L. (1985) Science 229:1202-1207); オイら(Oi et al. (1986) BioTechn
iques 4:214); ウインター(Winter)米国特許第５，２２５，５３９号、ジョーン
ズら(Jones et al., (1986) Nature 321:552-525);ヴェルホイアンら(Verhoeyan
n et al. (1988) Science 239:1534);およびベイドラーら(Beidler et al. (198
8) J. Immunol. 141:4053-4060) 中に記載の方法を用いて生成できる。
【０１２５】 抗−ＣＳＡＰＫ抗体（例えばモノクローナル抗体）は、標準の方法、例えばア
フィニティークロマトグラフィまたは免疫沈降法によりＣＳＡＰＫを単離するた
めに使用できる。抗−ＣＳＡＰＫ抗体は、細胞からの本来のＣＳＡＰＫおよび宿
主細胞中に発現された組換え産生ＣＳＡＰＫの精製を容易とすることができる。
さらに、抗−ＣＳＡＰＫ抗体は、ＣＳＡＰＫタンパク質の発現の発現量およびパ
ターンを評価するために、ＣＳＡＰＫタンパク質を検出するために使用できる（
例えば細胞溶解産物または細胞上清中）。抗−ＣＳＡＰＫ抗体は、臨床試験方法
の一部として組織中のタンパク質レベルを測定するため、例えば与えられた処理
方針の効力を決定するために、診断的に使用きる。検出は、抗体と検出できる物
質とのカプリング（例えば物理的連結）により容易とすることができる。検出可
能な物質の例は、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質
、および放射性物質を含む、適合する酵素の例は、ホースラッディシュペルオキ
シダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコ
リンエステラーゼを含む。適合する補欠分子族複合体の例は、ストレプタビジン
／ビオチンおよびアビジン／ビオチンである。適合する蛍光物質の例は、ウンベ
リフェロン、フルオレセイン、フルオレセイン・イソチオシアネート、ローダミ
ン、ジクロロトリアジニルアミン・フルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフ
ィコエリトリンを含む。発光物質の例は、ルミノールを含む。生物発光物質の例
は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンを含む。そして適合する
放射性物質の例は、 125Ｉ、 131Ｉ、35Ｓまたは 3Ｈを含む。 ＩＩＩ．組換え発現ベクターおよび宿主細胞 本発明の他の態様は、ベクター、好ましくはＣＳＡＰＫタンパク質（またはそ
の一部分）をコードする核酸を含む発現ベクターに関する。本明細書中に使用す
る場合には、用語「ベクター」は、連結している他の核酸を輸送する能力を有す
る核酸分子を呼ぶ。ベクターの一種類は「プラスミド」であり、これは、その中
に別のＤＮＡ断片が連結できる環状二本鎖ＤＮＡループを呼ぶ。別の種類のベク
ターはウイルスベクターであり、別のＤＮＡ断片がウイルスゲノム内に連結でき
る。ある種のベクターは、これらが導入された宿主細胞内で自律的複製をする能
力がある（例えば複製の細菌起源を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類
ベクター）。その他のベクター（例えば非−エピソーム哺乳類ベクター）は、宿
主細胞中に導入されると宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、そしてこれにより宿
主ゲノムと一緒に複製される。さらに、ある種のベクターは、これらが操作可能
に連結している遺伝子の発現を指令する能力がある。このようなベクターを、本
明細書中では「発現ベクター」と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技術に役立つ発現
ベクターは、しばしばプラスミドの形である。プラスミドがベクターの最も一般
的に使用される形であるので、本明細書中では、「プラスミド」および「ベクタ
ー」は、互換可能に使用される。しかし、本発明は、他の形の発現ベクター、例
えば同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば複製欠失レトロウイルス、ア
デノウイルスおよびアデノ関連ウイルス）なども含むことを意図する。
【０１２６】 本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中の核酸の発現のために適合する形
にある本発明の核酸を含んでなり、これは組換え発現ベクターが、発現されるべ
き核酸配列に操作可能に連結している、発現のために用いる宿主細胞に基づいて
選択された１種またはそれ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベ
クターの内で、「操作可能に連結」は、当該ヌクレオチド配列が、ヌクレオチド
配列の発現を許容するような様式で調節配列に連結していることを意味すると意
図する（例えば生体内転写／翻訳系内またはベクターが宿主細胞内に導入された
場合の宿主細胞内）。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび
その他の発現制御要素（例えばポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する
。このような調節配列は、例えばゲッデル「遺伝子発現技術、酵素学的方法」(G
oeddel;Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic P
ress, San Diego, CA(1990))中に記載されている。調節配列は、多くのタイプの
宿主細胞中のヌクレオチド配列の構成的発現を指令するもの、および一定の宿主
細胞内のみでヌクレオチド配列の発現を指令するものを含む（例えば組織特異性
調節配列）。当該技術分野の専門家は、発現ベクターの設計は、形質転換される
宿主細胞の選択、希望するタンパク質の発現のレベル、などの因子に依存できる
ことを認めるであろう。本発明の発現ベクターは、宿主細胞中に導入でき、これ
により本明細書中に記載の核酸によりコードされる融合タンパク質またはペプチ
ドを含むタンパク質またはペプチド（例えばＣＳＡＰＫタンパク質、ＣＳＡＰＫ
タンパク質の変異形、融合タンパク質など）を産生する。
【０１２７】 本発明の組換え発現ベクターは、原核または真核細胞中のＣＳＡＰＫタンパク
質の発現のために設計できる。例えばＣＳＡＰＫタンパク質は、細菌細胞、例え
ば大腸菌(E. coli) 、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いて）、酵
母細胞または哺乳類細胞中で発現できる。適合する宿主細胞は、さらにゲッデル
「遺伝子発現技術、酵素学的方法」(Goeddel;Gene Expression Technology, Met
hods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990))中で考察され
ている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えばＴ７プロモーター調節配列お
よびＴ７ポリメラーゼを用いて、生体内で転写および翻訳できる。
【０１２８】 原核生物内のタンパク質の発現は、融合または非融合タンパク質のいずれの発
現も指令する構成的または誘導可能なプロモーターを含むベクターを用いて大腸
菌中で最も頻繁に実行されている。融合ベクターは、多数のアミノ酸をその中に
コードされているタンパク質、通常は組換えタンパク質のアミノ末端に加える。
このような融合ベクターは、代表的には、３種類の目的に役立っている。１）組
換えタンパク質の発現を増加させるため、２）組換えタンパク質の溶解性を上昇
させるため、および３）アフィニティー精製における配位子として作用して組換
えタンパク質の精製を支援するため。しばしば、融合発現ベクター中で、タンパ
ク質分解性開裂部位が融合部分と組換えタンパク質との結合部分に導入され、融
合タンパク質の精製に引き続いて融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能
とさせる。このような酵素、およびそのコグネイト認識配列は、因子Ｘａ、トロ
ンビンおよびエンテロキナーゼを含む。代表的な融合発現ベクターは、ｐＧＥＸ
（ファルマシア・バイオテク社(Pharmacia Biotech Inc.)、スミス、Ｄ．Ｂ．お
よびジョンソン、Ｋ．Ｓ．(Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31
-40)）、ｐＭＡＬ（ニューイングランド・バイオラブズ(New England Biolabs,
Beverly, MA)）、およびｐＲＩＴ５（ファルマシア(Pharmacia, Piscataway, NJ
) ）を含み、これらはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルト
ースＥ発現タンパク質、またはプロテインＡをそれぞれ標的組換えタンパク質に
融合させる。
【０１２９】 精製した融合タンパク質は、ＣＳＡＰＫ活性アッセイ（例えば以下に詳細に記
載する直接アッセイまたは競合的アッセイ）中、または例えばＣＳＡＰＫタンパ
ク質に特異的な抗体を生成するために使用できる。好ましい実施態様では、本発
明のレトロウイルス発現ベクター中に発現されたＣＳＡＰＫ融合タンパク質は、
骨髄細胞に感染させるために使用でき、これは引き続いて照射した被移植者内に
移植される。次いで、十分な時間が経過した（例えば６週間）後に、対象被移植
者の病状を検査する。
【０１３０】 適合する誘導可能な非融合大腸菌発現ベクターの例は、ｐＴｒｃ（アマンら(A
mann et al. (1988) Gene 69:301-315) ）およびｐＥＴ１１ｄ（スタジャら(Stu
dier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Acade
mic Press, San Diego, California (1990) 60-89)）を含む。ｐＴｒｃベクター
からの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの
宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。ｐＥＴ１１ｄベクターからの標的遺伝
子発現は、同時発現されるウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｇｎ１）により媒
介されるＴ７ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する。このウ
イルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下で、Ｔ７ｇｎ１
遺伝子を含有する定住プロファージから宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ
１７４（ＤＥ３）により供給される。
【０１３１】 大腸菌内の組換えタンパク質発現を最大化する一つの戦略は、組換えタンパク
質をタンパク質分解的に開裂する損なわれた能力を有する宿主細菌中のタンパク
質を発現することにある（ゴッテスマン、Ｓ．「遺伝子発現技術、酵素学的方法
」(Gottesman, S.;Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185,
Academic Press, San Diego, California(1990))中 119-128）。別の戦略は、発
現ベクター内に挿入される核酸の核酸配列を、各アミノ酸の個別のコドンが大腸
菌内に優先的に使用されるものであるように改変することである（ワダら(Wada
et al,. (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118)）。このような本発明の核
酸配列の改変は、標準ＤＮＡ合成技術により実行できる。
【０１３２】 別の実施態様では、ＣＳＡＰＫ発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵素
Ｓ．セルビサエ(S. cervisae) 中の発現のためのベクターの例は、ｐＹｅｐＳｅ
ｃ１（バルダリら(Baldari et al., (1987) Embo. J. 6:229-234) ）、ｐＭＦａ
（クルヤンおよびヘルスコヴィッツ(Kurjan and Herskowitz (1982) Cell 30:93
3-943)）、ｐＪＲＹ８８（シュルツら(Schultz et al., (1987) Gene 54:113-12
3)）、ｐＹＥＳ２（インヴィトロジェン社(Invitrogen Corporation, San Diego
, CA) ）およびｐｉｃＺ（インヴィトロジェン社(San Diego, CA) ）を含む。
【０１３３】 あるいは、ＣＳＡＰＫタンパク質は、バキュロウイルス発現ベクターを用いて
昆虫細胞内に発現できる。培養昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）内のタンパク質の
発現のために利用できるバキュロウイルスベクターは、ｐＡｃシリーズ（スミス
ら(Smith et al (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165)）およびｐＶＬシリーズ
（ルクロウおよびサマーズ(Luklow and Summers (1989) Virololgy 170:31-39)
）を含む。
【０１３４】 さらに他の実施態様では、本発明の核酸は、哺乳類発現ベクターを用いて哺乳
類細胞中に発現される。哺乳類発現ベクターの例は、ｐＣＤＭ8(シード、Ｂ．(S
eed, B. (1987) Nature 329:840)）およびｐＭＴ２ＰＣ（カウフマンら(Kaufman
n et al. (1987) EMBO J. 6:187-195)）を含む、哺乳類細胞中で使用される場合
に、発現ベクターの制御機能は、しばしばウイルス調節要素により提供される。
例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、
サイトメガロウイルスおよびサルウイルス４０から誘導される。原核および真核
細胞の双方に対するその他の適切な発現系は、サンブルック、Ｊ．、フリッチュ
、Ｅ．Ｆ．およびマニアティス、Ｔ．「分子クローニング、実験マニュアル」第
二版(Sambrook, J., Fritsh, E.F., and Maniatis, T. "Molecular Cloning, A
Laboratory Manual" 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) の第16章および
第17章を参照のこと。
【０１３５】 他の実施態様では、組換え哺乳類発現ベクターは、優先的に特定の細胞タイプ
内で核酸の発現を指令する能力がある（例えば組織特異性調節要素が核酸を発現
させるために使用される）。組織特異性調節要素は、当該技術分野では公知であ
る。適切な組織特異性調節要素の限定的ではない例は、アルブミンプロモーター
（肝臓特異性、ピンカートら(Pinkert et al., (1987) Genes Dev. 1:268-277)
）、リンパ系特異性プロモーター（カラムおよびイートン(Calame and Eaton
(1988) Adv. Immunol. 43:235-275)）、特にはＴ細胞受容体のプロモーター（ウ
イノトおよびボルチモア(Winoto and Baltimore (1989) EMBO J, 8: 729-733)）
および免疫グロブリン（バネルジら(Banerji et al., (1983) Cell 33:729-740)
; クイーンおよびボルチモア(Queen and Baltimore (1983) Cell 33:741-748)）
、神経細胞非特異性プロモーター（例えば神経フィラメントプロモーター、バー
ンおよびラッドル(Byrne and Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:54
73-5477)）、膵臓特異性プロモーター（エドランドら(Edlund et al (1985) Sci
ence 230:912-916) ）および乳腺特異性プロモーター（例えば乳清(milk whey)
プロモーター、米国特許第４，８７３，３１６号および欧州特許出願公開第２６
４，１６６号）を含む。発生的に調節されるプロモーター、例えばネズミ膝腱症
(hox) プロモーター（ケッセルおよびグルス(Kessel and Gruss (1990) Science
249:374-379) ）およびα−胎児タンパク質プロモーター（カンペスおよびティ
ルグマン(Campes and Tilghman (1989) Gene Dev. 3:537-546)）も包含する。
【０１３６】 本発明は、さらにアンチセンス方向に発現ベクター中にクローニングされた本
発明のＤＮＡ分子を含んでなる組換え発現ベクターも提供する。すなわち、ＤＮ
Ａ分子は、ＣＳＡＰＫｍＲＮＡにアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ
分子の転写による）を許容する様式で調節配列に操作可能に連結している。アン
チセンス方向にクローニングされた核酸に操作可能に連結する調節配列は、種々
のタイプの細胞、例えばウイルスプロモーターおよび／またはエンハンサー内で
アンチセンスＲＮＡ分子の連続発現を指令するように選択でき、または調節配列
は、構成的、組織特異的または細胞タイプ特異的なアンチセンスＲＮＡの発現を
指令するように選択できる。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、
ファージェミドまたはアンチセンス核酸が高効率調節領域の制御下で産生される
弱毒化ウイルスの形であってもよく、その活性はベクターが導入される細胞のタ
イプにより決定できる。アンチセンス遺伝子を用いる遺伝子発現の調節の考察に
関しては、ワイントラウブ、Ｈ．ら「遺伝子分析のための分子ツールとしてのア
ンチセンスＲＮＡ」(Weintraub H. et al, Antisense RNA as a molecular tool
for genetic analysis, Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986)参照。
【０１３７】 本発明の別の態様は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関
する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中では互換可能
に使用される。この用語は、特定の対象細胞に関するだけでなく、このような細
胞の後代または可能性がある後代も呼ぶと理解される。ある種の変性は、突然変
異または環境の影響のいずれによっても後続世代中に起き得るので、このような
後代は、実際は、親細胞と同等ではなくてもよいが、しかし本明細書中で使用す
る用語の範囲内にはまだ含まれる。
【０１３８】 宿主細胞は、原核または真核細胞であることができる。例えば、ＣＳＡＰＫタ
ンパク質は、細菌細胞、例えば大腸菌、昆虫細胞、酵母または哺乳類細胞（例え
ばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）中で発現され
ることができる。その他の適切な宿主細胞は、当該技術分野の専門家には公知で
ある。
【０１３９】 ベクターＤＮＡは、慣用の形質転換または移入技術を利用して原核または真核
細胞内に導入できる。本明細書中に使用する場合には、用語「形質転換」および
「移入」は、宿主細胞内への外来核酸（例えばＤＮＡ）の導入のための当該技術
分野で承認されている種々の技術、例えばリン酸カルシウムまたは塩化カルシウ
ム同時沈降、ＤＥＡＥ−デキストラン−媒介移入、リポフェクション、またはエ
レクトロポレーションを含む技術を呼ぶことを意図する。宿主細胞を形質転換ま
たは移入するために適切な技術は、サンブルックら「分子クローニング、実験マ
ニュアル」第二版(Sambrook et al. "Molecular Cloning, A Laboratory Manual
" 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)およびその他の実験マニュアル中に見い
だされる。
【０１４０】 哺乳類細胞の安定した移入のために、使用した発現ベクターおよび移入技術に
応じて、細胞の小部分しかそのゲノム中に外来ＤＮＡを組み込めないことが知ら
れている。これらの組込み体を特定および選択するために、選択可能なマーカー
（例えば抗生物質に耐性）をコードする遺伝子を一般的に当該遺伝子と一緒に宿
主細胞内に導入する。好ましい選択可能なマーカーは、薬剤に耐性を与えるもの
、例えばＧ４１８ハイグロマイシンおよびメトトレキセートを含む。選択可能な
マーカーをコードする核酸は、ＣＳＡＰＫタンパク質をコードするものと同じベ
クターで宿主細胞内に導入できるか、または別のベクターで導入できる。導入さ
れた核酸を用いて安定し移入される細胞は、薬剤選択により特定できる（例えば
選択可能なマーカー遺伝子を組み込んでいる細胞は生き残り、他の細胞は死滅す
る）。
【０１４１】 培養基内の本発明の宿主細胞、例えば原核または真核宿主細胞は、ＣＳＡＰＫ
タンパク質を産生（すなわち発現）するために使用できる。従って、本発明は、
さらに、本発明の宿主細胞を用いるＣＳＡＰＫタンパク質の産生のための方法も
提供する。一つの実施態様では、その方法は、本発明の宿主細胞（その中にＣＳ
ＡＰＫタンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入されている）を、適合
する媒体中で、例えばＣＳＡＰＫタンパク質が産生されるように培養することを
含んでなる。別の実施態様では、本方法は、さらに、媒体または宿主細胞からの
ＣＳＡＰＫタンパク質の単離も含んでなる。
【０１４２】 本発明の宿主細胞は、またヒト以外の形質転換動物を生産するためにも使用で
きる。ＣＳＡＰＫ−２核酸配列を発現する形質転換動物が生産されている（実施
例５参照）。例えば、一つの実施態様では、本発明の宿主細胞は、その中にＣＳ
ＡＰＫをコードする配列が導入されている受精卵母細胞または胚幹細胞である。
従って、このような宿主細胞は、外因性ＣＳＡＰＫ配列がこれらのゲノム内に導
入されているヒト以外の形質転換動物または内因性ＣＳＡＰＫ配列が改変されて
いる相同組換え動物を創成するために使用できる。このような動物は、ＣＳＡＰ
Ｋの機能および／または活性の研究のためおよびＣＳＡＰＫ活性のモジュレータ
ーの特定および／または評価のために使用される。本明細書中で使用する場合に
、「形質転換動物」は、動物の細胞の１個またはそれ以上が導入遺伝子を含むヒ
ト以外の動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはげっ歯類、例えばラットま
たはマウスである。形質転換動物のその他の例は、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、
イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類、および類似動物である。導入遺伝子は、
形質転換動物が発生した細胞のゲノム内に組み込まれており、そして成熟動物の
ゲノム内に残っており、これにより形質転換動物の１種またはそれ以上の細胞タ
イプまたは組織中にコードされた遺伝子生成物の発現を指令する外因性ＤＮＡで
ある。本明細書中で使用する場合に、「相同組換え動物」は、動物の発生の前に
、内因性遺伝子と、動物の細胞、例えば動物の胚細胞内に導入された外因性ＤＮ
Ａ分子との間の相同性組換えにより内因性ＣＳＡＰＫ遺伝子が改変されているヒ
ト以外の動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはマウスである。
【０１４３】 本発明の形質転換動物は、受精した卵母細胞の雄前核内に、例えばミクロ注射
、レトロウイルス注射によりＣＳＡＰＫコード核酸を導入して創成され、そして
卵母細胞を擬妊娠メス養育動物内で発育させることができる。配列番号１、配列
番号４、配列番号７、配列番号１０、または配列番号１３のＣＳＡＰＫｃＤＮＡ
配列は、ヒト以外の動物のゲノム中に導入遺伝子として導入できる。あるいは、
ヒトＣＳＡＰＫ遺伝子の非ヒト相同体、例えばマウスまたはラットのＣＳＡＰＫ
遺伝子は、導入遺伝子として使用できる。あるいは、ＣＳＡＰＫ遺伝子相同体、
例えば他のＣＳＡＰＫファミリーメンバーは、配列番号１、配列番号３、配列番
号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配
列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、また
は配列番号１９（詳細は上記のサブセクションＩに記載）のＣＳＡＰＫｃＤＮＡ
配列へのハイブリダイゼーションに基づいて単離し、そして導入遺伝子として使
用できる。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルは、導入遺伝子の発現
の効率を増加するために導入遺伝子内に含まれることもできる。組織特異性調節
配列は、特定の細胞に対するＣＳＡＰＫタンパク質の発現を指令するために、Ｃ
ＳＡＰＫ導入遺伝子に操作可能に連結することができる。胚操作またはミクロ注
射を利用する形質転換動物、特には例えばマウスなどの動物の生成のための方法
は、当該技術分野内で慣用となっており、例えばいずれもレーダーら(Lader et
al.)による米国特許第４，７３６，８６６号および第４，８７０，００９号、ワ
グナーら(Wagner et al.) による米国特許第４，８７３，１９１号およびホーガ
ン Ｂ．「マウス胚の操作」(Hogan, B. Manipulating the Mouse Embryo, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1986) に記載さ
れている。同様の方法は、その他の形質転換動物の生産にも使用される。形質転
換創始(founder) 動物は、そのゲノム内のＣＳＡＰＫ導入遺伝子の存在および／
または動物の組織または細胞内のＣＳＡＰＫｍＲＮＡの発現に基づいて識別でき
る。次いで形質転換創始動物は、導入遺伝子を有する別の動物を繁殖するために
使用できる。さらに、ＣＳＡＰＫタンパク質をコードする導入遺伝子を有する形
質転換動物は、他の導入遺伝子を有する他の形質転換動物に対してさらに交配で
きる。
【０１４４】 相同組換え動物を創成するために、欠失、付加または置換が導入されそれによ
りＣＳＡＰＫ遺伝子を改変、例えば機能的に崩壊された少なくとも１部のＣＳＡ
ＰＫ遺伝子を含むベクターを調製する。ＣＳＡＰＫ遺伝子は、ヒト遺伝子（例え
ば、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列
番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９）であることがで
きるが、しかし、さらに好ましくは、これはヒトＣＳＡＰＫ遺伝子の非ヒト相同
体（例えば、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１
３、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９のヌクレ
オチド配列を用いるストリンジェントなハイブリダイゼーションにより単離され
るｃＤＮＡ）である。例えば、マウスＣＳＡＰＫ遺伝子は、マウスゲノム内の内
因性ＣＳＡＰＫ遺伝子を改変するために適合する相同組換えベクターを構築する
ために使用できる。好ましい実施態様では、相同組換えの際に、内因性ＣＳＡＰ
Ｋ遺伝子が機能的に崩壊されるようにベクターを設計する（すなわち、機能性タ
ンパク質をコードしなくなる、「ノックアウト」ベクターとも呼ばれる）。ある
いは、ベクターは、相同組換えの際に、内因性ＣＳＡＰＫ遺伝子が突然変異され
るかあるいは改変されるが、しかしまだ機能性タンパク質をコードするように設
計できる（例えば、上流調節領域は改変ができ、これにより内因性ＣＳＡＰＫタ
ンパク質の発現を改変する）。相同組換えベクターにおいて、ＣＳＡＰＫ遺伝子
の改変された部分は、ＣＳＡＰＫ遺伝子の追加の核酸配列によりその５’および
３’末端に隣接し、これによりベクターが有する外因性ＣＳＡＰＫ遺伝子と胚幹
細胞内の内因性ＣＳＡＰＫ遺伝子の間に発生する相同組換えを許容する。追加の
隣接ＣＳＡＰＫ核酸配列は、内因性遺伝子との成功した相同組換えのために十分
な長さである。代表的には、隣接ＤＮＡの数キロ塩基（５’および３’の双方）
がベクター内に含まれる（例えば、相同組換えベクターの説明に関してはトーマ
ス、Ｋ．Ｒ．およびカペッキ、Ｍ．Ｒ．(Thomas, K.R. and Capecchi, M.R. (19
87) Cell 51:503 参照）。ベクターは、胚幹細胞株内に導入され（例えばエレク
トロポレーションにより）、そして導入されたＣＳＡＰＫ遺伝子が内因性ＣＳＡ
ＰＫ遺伝子と相同的に組み換えられている細胞が選択される（例えばリー、Ｅ．
ら(Li, E. et al. (1992) Cell 69:915)参照）。次いで、選択された細胞を動物
（例えばマウス）の胚盤胞内に注入して、集合キメラを形成される（例えばブラ
ッドレー、Ａ．(Bradley, A. in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:
A Practical Approach, E.J. Robertson, ed.(IRL, Oxford,1987) 113-152)参
照）。次いで、キメラ胚を適切な擬妊娠雌養育動物内に移植し、胚を発育開始さ
せることができる。生殖細胞中に相同組換えＤＮＡを含む後代は、動物のすべて
の細胞が導入遺伝子の生殖細胞系伝達による相同組換えＤＮＡを含む動物の繁殖
に使用できる。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築するための方法
は、さらにはブラッドレー、Ａ．(Bradley, A. (1991) Current Opinion in Bio
technology 2: 823-829)およびルムエレクら(LeMouellec et al)によるＰＣＴ国
際特許公開番号ＷＯ９０／１１３５４、スミシーズら(Smithies et al.) による
ＷＯ９１／０１１４０、ザイルストラら(Zijlstra et al.) によるＷＯ９２／０
９６８、およびバーンズら(Berns et al.)によるＷＯ９３／０４１６９に記載さ
れている。
【０１４５】 他の実施態様では、導入遺伝子の調節された発現を許容する選択された系を含
む形質転換されたヒト以外の動物が生産できる。このような系の一つの例は、バ
クテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰ組換え酵素系である。ｃｒｅ／ｌｏｘ
Ｐ組換え酵素系の説明としては、例えばラクソら(Lakso et al. (1992) Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236) 参照。他の組換え酵素系の例は、サッカロ
ミセス・セレヴィシアエ(Saccharomyces cerevisiae)のＦＬＰ組換え酵素系であ
る（オゴルマンら(O'Gorman et al. (1991) Science 251:1351-1355)）。ｃｒｅ
／ｌｏｘＰ組換え酵素系を導入遺伝子の発現を調節するために使用する場合には
、Ｃｒｅ組換え酵素と選択されたタンパク質との両者をコードする導入遺伝子を
含む動物が必要である。このような動物は、「二重」形質転換動物、例えば一方
では選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子を含む動物と、他方では組換
え酵素をコードする導入遺伝子を含む動物の２種の形質転換動物を構築して提供
できる。
【０１４６】 本明細書に記載したヒト以外の形質転換動物のクローンは、ウイルムート、Ｉ
．ら(Wilmut, I. et al. (1997) Nature 385:810-813) およびＰＣＴ国際特許公
開番号ＷＯ９７／０７６６８およびＷＯ９７／０７６６９に記載されている方法
に従っても生産できる。要約すると、形質転換動物からの細胞、例えば体性細胞
は、単離および誘導されて増殖サイクルから外れ、Ｇ0 相に入ることができる。
次いで、鎮静細胞を例えば電気パルスを用いて、鎮静細胞が単離されたと同じ種
の動物からの核摘出卵母細胞に融合できる。次いで、再構築された卵母細胞を、
これがモルラまたは胚盤胞に発育するように培養し、次いで擬妊娠雌養育動物に
移行させる。この雌養育動物の生まれた子孫は、細胞、例えば体性細胞が単離さ
れた動物のクローンとなる。ＩＶ．製薬学的組成物 本発明のＣＳＡＰＫ核酸分子、ＣＳＡＰＫタンパク質及び抗−ＣＳＡＰＫ抗体
（本明細書では「活性化合物」とも呼ばれる）は投与のために適当な製薬学的組
成物に配合することができる。このような組成物は典型的には核酸分子、タンパ
ク質、又は抗体及び製薬学的に許容しうる担体を含有して成る。本明細書で使用
された用語「製薬学的に許容しうる担体」は、製薬学的投与に適合性のいかなる
且つすべての溶媒、分散媒体（ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ ｍｅｄｉａ）、コーティ
ング、抗バクテリア剤及び抗菌・カビ剤（ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｇｅｎｔｓ
）、等張剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ ａｇｅｎｔｓ）及び吸収遅延剤等を包含する。
製薬学的に活性な物質のためのこのような媒体及び作用物質（ａｇｅｎｔｓ）の
使用は当業界では周知されている。慣用の媒体及び作用物質が活性化合物と非適
合性である場合を除いて、組成物におけるその使用が意図される。組成物に補助
活性化合物を配合することもできる。
【０１４７】 本発明の製薬学的組成物はその意図する投与経路と適合性であるように処方さ
れる。投与経路の例は非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸
入）、経皮（局所的）、経粘膜（ｔｒａｎｓｍｕｃｏｓａｌ）及び直腸投与を包
含する。非経口、皮内又は皮下適用のために使用される溶液又は懸濁液は下記の
成分：無菌希釈剤、例えば注射用の水、塩溶液（ｓａｌｉｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏ
ｎ）、不揮発性油（ｆｉｘｅｄ ｏｉｌｓ）、ポリエチレングリコール類、グリ
セリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒；抗バクテリア剤、例えば、ベ
ンジルアルコールもしくはメチルパラベン類；酸化防止剤、例えばアスコルビン
酸もしくは亜硫酸水素ナトリウム；キレート化剤、例えばエチレンジアミン四酢
酸；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩並びに張度（ｔｏｎｉｃｉ
ｔｙ）調節剤、例えば塩化ナトリウム又はデキストロースを含むことができる。
ｐＨは酸又は塩基、例えば塩酸又は水酸化ナトリウムにより調節することができ
る。非経口製剤はガラス又はプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器又は多
重用量バイアル（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｏｓｅ ｖｉａｌｓ）中に密閉すること
ができる。
【０１４８】 注射可能な使用に適当な製薬学的組成物は、無菌水性溶液（水溶性である場合
）又は分散液及び無菌の注射可能な溶液又は分散液の処方箋に応じた調製のため
の無菌粉末を包含する。静脈内投与のために、適当な担体は生理食塩水、静菌水
（ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ ｗａｔｅｒ）、クレモフォール（Ｃｒｅｍｏ
ｐｈｏｒ）ＥＬTM（ニュージャーシー州、パーシッパニーのＢＡＳＦ）又はリン
酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を包含する。すべての場合に、組成物は無菌でな
ければならずそして容易に注射可能である程度に流動性（ｆｌｕｉｄ）であるべ
きである。それは製造及び貯蔵の条件下に安定でなければならず、そしてバクテ
リア及び菌・カビ類のような微生物の汚染作用に対して保存されなければならな
い。担体は例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロ
ピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）及び適当なそれらの混
合物を含有する溶媒又は分散媒体であることができる。例えば、レシチンの如き
コーティングの使用、分散液の場合の必要に粒径の維持及び界面活性剤の使用に
より適正な流動性を維持することができる。微生物の作用の阻止は種々の抗バク
テリア剤及び抗菌・カビ剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノー
ル、アスコルビン酸、チメロサール（ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ）等により達成する
ことができる。多くの場合に、組成物中に等張剤、例えば糖、ポリアルコール、
例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含むことが好ましいであ
ろう。注射可能な組成物の長期の吸収は吸収を遅延させる作用物質、例えばアル
ミニウムモノステアレート及びゼラチンを組成物中に含ませることにより引き起
こすことができる。
【０１４９】 無菌の注射可能な溶液は、上記に列挙した成分の１種又は組み合わせと共に活
性化合物（例えば、ＣＳＡＰＫタンパク質又は抗−ＣＳＡＰＫ抗体）を適当な溶
媒中に必要に量で配合し、必要に応じて滅菌ろ過することにより製造することが
できる。一般に、分散液は、上記に列挙したものの中から基本的分散媒体（ｂａ
ｓｉｃ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）及び必要な他の成分を含有する
無菌のビヒクル中に活性成分を配合することにより製造される。無菌の注射可能
な溶液の製造のための無菌粉末の場合には、好ましい製造方法は、活性成分＋任
意の追加の所望の成分の前以て無菌ろ過された溶液から活性成分＋任意の追加の
所望の成分の粉末を生じさせる真空乾燥及び凍結乾燥である。
【０１５０】 経口組成物は一般に不活性希釈剤又は食用担体（ｅｄｉｂｌｅ ｃａｒｒｉｅ
ｒ）を含む。それらはゼラチンカプセル中に囲む（ｅｎｃｌｏｓｅｄ）か又は打
錠して（ｃｏｍｐｒｅｓｓｅｄ）錠剤とすることができる。経口治療投与の目的
で、活性化合物は賦形剤と共に配合することができそして錠剤、トローチ剤又は
カプセル剤の形態で使用することができる。経口組成物は、流動性担体中の化合
物が経口的に適用され、スイッシュされ（ｓｗｉｓｈｅｄ）そして吐き出され又
は燕下される口内洗剤として使用するための流動性担体を使用して製造すること
もできる。製薬学的に適合性の結合剤及び／又は補助物質を組成物の一部として
含ませることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤等は、下記の成分
のいずれか又は同様な性質の化合物：結合剤、例えば微結晶セルロース、トラガ
カントゴム又はゼラチン；賦形剤、例えばテンプンもしくはラクトース、崩壊剤
、例えばアルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）もしくはトウモロコシデ
ンプン；滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムもしくはステローテス（Ｓｔｅ
ｒｏｔｅｓ）；滑り剤（ｇｌｉｄａｎｔ）、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘
味料、例えばスクロースもしくはサッカリン；又は香味料（ｆｌａｖｏｒｉｎｇ
ａｇｅｎｔｓ）、例えばペパーミント、サリチル酸メチル又はオレンジ香味料
を含有することができる。
【０１５１】 吸入による投与のために、化合物は加圧された容器又は適当なプロペラント、
例えば二酸化炭素のようなガスを含有するディスペンサー（ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ
）又は噴霧器（ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ）からエアゾル噴霧の形態で送達される。
【０１５２】 全身系投与は経粘膜又は経皮手段によることもできる。経粘膜もしくは経皮投
与のために、浸透されるべきバリヤーに適切な浸透剤（ｐｅｎｅｔｒａｎｔｓ）
が配合物において使用される。このような浸透剤は当業界で一般に知られており
そして、例えば、経粘膜投与のためには、洗剤、胆汁酸塩及びフシジン酸誘導体
を包含する。経粘膜投与は鼻噴霧剤（ｎａｓａｌ ｓｐｒａｙｓ）又は坐剤によ
り達成することができる。経皮投与では、活性化合物は当業界で公知の軟膏（ｏ
ｉｎｔｍｅｎｔｓ）、膏薬（ｓａｌｖｅｓ）、ゲル又はクリームに配合される。
【０１５３】 化合物は坐剤（例えば、ココアバター又は他のグリセリド類の如き慣用の坐剤
ベースと共に）又は直腸投与のための停留浣腸剤（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｅｎｅ
ｍａｓ）の形態で調製することもできる。
【０１５４】 １つの態様では、活性化合物は、移植片（ｉｍｐｌａｎｔｓ）及びマイクロカ
プセルに包まれた送達系（ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅ
ｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ）を包含する制御された放出処方の如き身体からの急速な
除去に対して化合物を保護するであろう担体と共に調製される。エチレン酢酸ビ
ニル、ポリ無水物（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅｓ）、ポリグリコール酸、コラ
ーゲン、ポリオルトエステル（ｐｏｌｙｏｒｔｈｏｅｓｔｅｒｓ）及びポリ乳酸
の如き生物分解性の生物適合性ポリマーを使用することができる。このような配
合物の製造方法は当業者には明らかであろう。該物質は、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏ
ｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商
業的に得ることもできる。リポソーム懸濁液（ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｓｕｓｐｅ
ｎｓｉｏｎｓ）（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体により感染細胞を標
的とするリポソームを包含する）を製薬学的に許容しうる担体として使用するこ
ともできる。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載のように
、当業者には知られた方法に従って製造することができる。
【０１５５】 投与を容易にするため及び投与量を均一にするために、経口及び非経口組成物
を投与単位形態（ｄｏｓａｇｅ ｕｎｉｔ ｆｏｒｍ）において配合することは
有利である。本明細書で使用した投与単位形態は、処置される（ｔｒｅａｔｅｄ
）べき被験者（ｓｕｂｊｅｃｔ）に単一投与量（ｕｎｉｔａｒｙ ｄｏｓａｇｅ
ｓ）として適した物理的に分離した単位を指し、各単位は必要な製薬学的担体と
共に所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の活性化合物を含有する
。本発明の投与単位形態の明細は、活性化合物の独特の特徴及び達成されるべき
特定の治療効果及び固体の治療のためのこのような活性化合物の配合分野におけ
る固有の制限により支配されそして直接依存する。
【０１５６】 このような化合物の毒性及び治療効力は、例えば、ＬＤ５０（母集団の５０％
の致死用量）及びＥＤ５０（母集団の５０％において治療的に有効な用量）を決
定するために、細胞培養又は実験動物における標準の製薬学的手順により決定す
ることができる。毒性効果と治療的効果との用量比（ｄｏｓｅ ｒａｔｉｏ）は
治療インデックスであり、それは比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる
。大きい治療インデックスを示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を
使用してもよいが、感染していない細胞に対する損害の可能性を最小にするため
に、羅患した組織の部位をこのような化合物の標的とし、それにより副作用を減
少させる送達系を考案するように注意を払うべきである。
【０１５７】 細胞培養アッセイ及び動物研究で得られたデータは、ヒトで使用する投与量の
範囲を処方するのに使用することができる。このような化合物の投与量は、毒性
が殆どないか又は全然ないＥＤ５０を含む循環濃度（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ）の範囲内にあるのが好ましい。投与量は、使用
する投与形態及び利用される投与経路に依存してこの範囲内で変えることができ
る。本発明の方法で使用されるいかなる化合物についても、治療的に有効な用量
は最初に細胞培養アッセイから評価することができる。用量（ｄｏｓｅ）は、細
胞培養で決定されたとおりのＩＣ５０（即ち、最大の半分の症状の抑制を達成す
る試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｐｌ
ａｓｍａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒａｎｇｅ）を達成するように動物モ
デルにおいて処方することができる。このような情報を使用して、ヒトの有用な
用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは例えば高速液体クロ
マトグラフィーにより測定することができる。
【０１５８】 本発明の核酸分子は、ベクターに挿入することができそして遺伝子治療ベクタ
ーとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、
局所的投与（米国特許第５，３２８，４７０号参照）により又は定位注射（ｓｔ
ｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）（例えばＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．
（１９９４） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３０５
４−３０５７参照）により被験者に送り込むことができる。遺伝子治療ベクター
の製薬学的調製物は、許容しうる希釈剤中の遺伝子治療ベクターを含むことがで
き又は遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれている遅延放出マトリックスを含有して
成ることができる。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが組換え細胞、例えば
レトロウイルスベクターから元のままで（ｉｎｔａｃｔ）製造されうる場合には
、製薬学的調製物は遺伝子送達系を生成する１つ又はそれより多くの細胞を含む
ことができる。
【０１５９】 製薬学的組成物は投与のため指示と共に容器、パック又はディスペンサー中に
含ませることができる。
【０１６０】 Ｖ．本発明の使用及び方法 本明細書に記載の核酸分子、タンパク質、タンパク質相同体（ｐｒｏｔｅｉｎ
ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ）及び抗体は下記の方法の１つ又はそれより多くにおい
て使用することができる：ａ）スクリーニングアッセイ；ｂ）予知医学（例えば
診断アッセイ、予後アッセイ、監視臨床実験（ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｃｌｉｎ
ｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ）及び薬理遺伝学（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ
）；並びにｃ）処置の方法（例えば、治療及び予防）。本発明の単離された核酸
分子を使用して、例えば、ＣＳＡＰＫタンパク質を発現させることができ（例え
ば、遺伝子治療適用において宿主細胞中の組換え発現ベクターを介して）、ＣＳ
ＡＰＫｍＲＮＡ（例えば生物学的サンプル中の）又はＣＳＡＰＫ遺伝子における
遺伝的変化（ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）を検出することができ、
そして更に下記するとおりＣＳＡＰＫ活性を調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）こと
ができる。ＣＳＡＰＫタンパク質を使用して、ＣＳＡＰＫ基質の不十分なもしく
は過剰の産生又はＣＳＡＰＫ抑制剤（ＣＳＡＰＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）の産
生により特徴付けられる障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）を処置することができる。
更に、ＣＳＡＰＫタンパク質を使用して、天然に存在するＣＳＡＰＫ基質をスク
リーニングすることができ、ＣＳＡＰＫ活性を調節する薬剤又は化合物をスクリ
ーニングすることができ、並びにＣＳＡＰＫタンパク質の不十分なもしくは過剰
の産生又はＣＳＡＰＫ野生型タンパク質と比較して減少したもしくは異常な（ａ
ｂｅｒｒａｎｔ）活性を有するＣＳＡＰＫタンパク質形態の産生により特徴付け
られる障害を処置することができる。更に、本発明の抗−ＣＳＡＰＫ抗体を使用
してＣＳＡＰＫタンパク質を検出及び単離することができ、ＣＳＡＰＫタンパク
質の生物利用性を調節することができそしてＣＳＡＰＫ活性を調節することがで
きる。 Ａ． スクリーニングアッセイ： 本発明は、モジュレーター（ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）、即ちＣＳＡＰＫタンパ
ク質に結合するか、例えばＣＳＡＰＫの発現またはＣＳＡＰＫの活性などに刺激
または阻害効果を示すか、或は例えばＣＳＡＰＫ基質の発現または活性などに刺
激または阻害効果を示す候補品または試験化合物または作用物質［例えばペプチ
ド、ペプチドミメティックス（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）、小型分子ま
たは他の薬剤］を同定する方法（本明細書ではまた「スクリーニングアッセイ」
とも呼ぶ）を提供する。
【０１６１】 １つの態様において、本発明は、ＣＳＡＰＫタンパク質またはポリペプチドま
たはそれの生物活性部分の基質である候補品または試験化合物を選抜するアッセ
イを提供する。別の態様において、本発明は、ＣＳＡＰＫタンパク質またはポリ
ペプチドまたはそれの生物活性部分に結合するか或はそれの活性を調節、例えば
ＣＳＡＰＫがそれのコグネイトリガンド（ｃｏｇｎａｔｅ ｌｉｇａｎｄ）と相
互作用する能力を調節する候補品または試験化合物を選抜するアッセイを提供す
る。本技術分野で公知の組み合わせライブラリー方法の数多くのアプローチのい
ずれかを用いて本発明の試験化合物を得ることができ、そのようなアプローチに
は、生物学的ライブラリー、空間的にアドレス可能な並行（ｓｐａｔｉａｌｌｙ
ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ ｐａｒａｌｌｅｌ）固相もしくは液相ライブラリー
、デコンボリューション（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）が必要な合成ライブラ
リー方法、「１ビード１化合物（ｏｎｅ−ｂｅａｄ ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ
）」ライブラリー方法、およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いた
合成ライブラリー方法が含まれる。生物学的ライブラリーのアプローチはペプチ
ドのライブラリーに限定されるが、他の４アプローチはペプチド、非ペプチドオ
リゴマーまたは小型分子化合物のライブラリーに適用可能である［Ｌａｍ，Ｋ．
Ｓ．（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４５）］
。
【０１６２】 分子のライブラリーを合成する方法の例を例えば下記の技術に見ることができ
る：ＤｅＷｉｔｔ他（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂ他（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ他（１９９４）Ｊ
．Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏ他（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌ他（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎ
ｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｒｅｌｌ他（１９９４）Ａｎｇｅ
ｗ．Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；そしてＧａｌｌｏｐ
他（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３。
【０１６３】 化合物のライブラリーを溶液の状態［例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２−４２１］、またはビード［Ｌａｍ（
１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４］、チップ［Ｆｏｄｏｒ（１９９
３）Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６］、細菌（Ｌａｄｎｅｒの米国特許
第５，２２３，４０９号）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ米国特許第’４０９号）、プラ
スミド［Ｃｕｌｌ他（１９９２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ
Ａ ８９：１８６５−１８６９］またはファ−ジ［ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ
（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０］；［Ｄｅｖｌｉｎ（１
９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６］；［Ｃｗｉｒｌａ他（１９
９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−６３８２］；
［Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０］
；（Ｌａｎｄｅｒ、上記）に表示させることができる。
【０１６４】 別の態様におけるアッセイは細胞を基とするアッセイであり、これは、ＣＳＡ
ＰＫ標的分子（ＣＳＡＰＫ ｔａｒｇｅｔ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）［例えばＣＳ
ＡＰＫホスホリル化基質（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｕｂｓｔｒａｔ
ｅ］を発現する細胞を試験化合物に接触させそして前記試験化合物が前記ＣＳＡ
ＰＫ標的分子の活性を調節（例えば刺激または阻害）する能力を測定することを
含んで成る。試験化合物がＣＳＡＰＫ標的分子の活性を調節する能力を測定する
時、これは、例えば、ＣＳＡＰＫタンパク質がＣＳＡＰＫ標的分子と結合するか
或はそれと相互作用する能力を測定するか或はＣＳＡＰＫタンパク質がＣＳＡＰ
Ｋ標的分子をホスホリル化する能力を測定することなどを通して達成可能である
。
【０１６５】 ＣＳＡＰＫタンパク質がＣＳＡＰＫ標的分子をホスホリル化する能力の測定は
、例えばインビトロキナーゼアッセイなどで実施可能である。簡単に述べると、
ＣＳＡＰＫ標的分子、例えばそのような分子を発現する細胞系から免疫沈降させ
た（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ）ＣＳＡＰ標的分子をＣＳＡＰＫタ
ンパク質および放射性ＡＴＰ、例えば［γ−32Ｐ］ＡＴＰなどと一緒にＭｇＣｌ 2 とＭｎＣｌ2が入っている緩衝液、例えばＭｇＣｌ2が１０ｍＭとＭｎＣｌ2が５
ｍＭ入っている緩衝液など中でインキュベートしてもよい。インキュベーション
後、免疫沈降させたＣＳＡＰＫ標的分子を還元条件下のＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で分離し、膜、例えばＰＶＤＦ膜などに転移させた後、それを
オートラジオグラフィーにかけてもよい。オートラジオグラフに検出可能な帯が
現れることは、ＣＳＡＰＫ基質がホスホリル化を受けたことを示している。また
、ＣＳＡＰＫ基質のどの残基がホスホリル化を受けたかを測定する目的で、前記
ホスホリル化を受けさせた基質のホスホアミノ酸分析を実施することも可能であ
る。簡単に述べると、ラジオホスホリル化を受けた（ｒａｄｉｏｐｈｏｓｐｈｏ
ｒｙｌａｔｅｄ）タンパク質の帯をＳＤＳゲルから切除した後、それに部分酸加
水分解を受けさせる。次に、その産物を一次元電気泳動で分離しそして例えばホ
スホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）などで分析した後、ニンヒド
リンで染色したホスホアミノ酸標準と比較してもよい。
【０１６６】 ＣＳＡＰＫタンパク質がＣＳＡＰＫ標的分子と結合するか或はそれと相互作用
する能力を測定する時、これは、直接結合（ｄｉｒｅｃｔ ｂｉｎｄｉｎｇ）の
測定で達成可能である。ＣＳＡＰＫタンパク質がＣＳＡＰＫ標的分子と結合する
か或はそれと相互作用する能力を測定する時、これは、複合体に入っている標識
を付けたＣＳＡＰＫタンパク質を検出することでＣＳＡＰＫタンパク質がＣＳＡ
ＰＫ標的分子に結合したことを測定することができるように、例えばＣＳＡＰＫ
タンパク質を放射性同位元素または酵素標識に連成させることなどで達成可能で
ある。例えば、ＣＳＡＰＫ分子、例えばＣＳＡＰＫタンパク質などを125Ｉ、35
Ｓ、14Ｃまたは3Ｈで直接または間接的に標識して、このような放射性同位元素
をラジオエミッション（ｒａｄｉｏｅｍｍｉｓｓｉｏｎ）の直接的計数またはシ
ンチレーション計数（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｃｏｕｎｔｉｎｇ）などで
検出してもよい。別法として、ＣＳＡＰＫ分子に例えば西洋わさびのペルオキシ
ダーゼ、アルカリ性ホスファターゼまたはルシフェラーゼなどによる酵素標識を
付けて、この酵素標識を適切な基質が産物に変わる変換を測定することを通して
検出してもよい。
【０１６７】 また、ある化合物がＣＳＡＰＫとそれの標的分子の間の相互作用を調節する能
力を測定する［相互作用物（ｉｎｔｅｒａｃｔａｎｔｓ）のいずれにも標識を付
けることなく］ことも本発明の範囲内である。例えば、ミクロフィジオメーター
（ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒ）を用いてＣＳＡＰＫとそれの標的分子の
相互作用をＣＳＡＰＫにも標的分子にも標識を付けることなく検出することがで
きる。ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｈ．Ｍ．他（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：
１９０６−１９１２。本明細書で用いる如き「ミクロフィジオメーター」（例え
ばＣｙｔｏｓｅｎｓｏｒ）は、細胞がそれの環境を酸性にする速度を光アドレス
可能ポテンシオメトリックセンサー（ｌｉｇｈｔ−ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ ｐ
ｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃ ｓｅｎｓｏｒ）（ＬＡＰＳ）で測定する分析装置
である。このような酸性化速度の変化を化合物と受容体［レセプタ（ｒｅｃｅｐ
ｔｏｒ）］の間の相互作用の指標として用いることができる。
【０１６８】 ＣＳＡＰＫタンパク質がＣＳＡＰＫ標的分子と結合するか或はそれと相互作用
する能力を測定する時、好適な態様では、前記標的分子の活性を測定することで
それを達成することができる。例えば標的の細胞第二メッセンジャー（ｃｅｌｌ
ｕｌａｒ ｓｅｃｏｎｄ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ）（例えば細胞内Ｃａ2+、ジアシ
ルグリセロール、ＩＰ3など）の誘導を検出するか、標的である適切な基質の触
媒作用／酵素活性を検出するか、レポーター遺伝子［検出可能なマーカー、例え
ばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコード化する核酸に有効
連結（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）している標的応答調節要素（ｔ
ａｒｇｅｔ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）
を含んで成る］の誘導を検出するか、或は標的調節細胞応答（ｔａｒｇｅｔ−ｒ
ｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を検出することを通
して、標的分子の活性を測定することができる。
【０１６９】 更に別の態様における本発明のアッセイは細胞を用いないアッセイであり、こ
のアッセイでは、ＣＳＡＰＫタンパク質またはそれの生物活性部分を試験化合物
に接触させそしてこの試験化合物がＣＳＡＰＫタンパク質またはそれの生物活性
部分と結合する能力を測定する。この試験化合物がＣＳＡＰＫタンパク質と結合
するか否かをこの上に記述したように直接または間接的に測定することができる
。好適な態様におけるアッセイは、ＣＳＡＰＫタンパク質またはそれの生物活性
部分をＣＳＡＰＫと結合する既知化合物に接触させてアッセイ混合物を生じさせ
、このアッセイ混合物を試験化合物に接触させた後、前記試験化合物がＣＳＡＰ
Ｋタンパク質と相互作用する能力を測定することを包含し、ここで、前記試験化
合物がＣＳＡＰＫタンパク質と相互作用する能力を測定することは、前記試験化
合物が前記既知化合物に比較して優先的にＣＳＡＰＫまたはそれの生物活性部分
と結合する能力を測定することを含んで成る。
【０１７０】 別の態様におけるアッセイも細胞を用いないアッセイであり、このアッセイで
は、ＣＳＡＰＫタンパク質またはそれの生物活性部分を試験化合物に接触させ、
そしてこの試験化合物がＣＳＡＰＫタンパク質またはそれの生物活性部分の活性
を調節（例えば刺激または阻害）する能力を測定する。前記試験化合物がＣＳＡ
ＰＫタンパク質の活性を調節する能力を測定する時、これは、例えばこの上に直
接結合の測定で記述した方法の１つを用いて、ＣＳＡＰＫタンパク質がＣＳＡＰ
Ｋ標的分子に結合する能力を測定することなどで達成可能である。また、リアル
タイム生分子相互作用分析（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＢＩＡ）の如き技術を用いて、
ＣＳＡＰＫタンパク質がＣＳＡＰＫ標的分子に結合する能力の測定を達成するこ
とも可能である。Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．およびＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．
（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５そしてＳｚａｂｏ
他（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７
０５。本明細書で用いる如き「ＢＩＡ」は、相互作用物（例えばＢＩＡｃｏｒｅ
）のいずれにも標識を付けることなく生特異的（ｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）相互
作用をリアルタイムで試験する技術である。表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）の光
学現象の変化を生物学的分子間のリアルタイム反応の指標として用いることがで
きる。
【０１７１】 代替態様では、ＣＳＡＰＫタンパク質がＣＳＡＰＫ標的分子［例えばＣＳＡＰ
Ｋ介在シグナルトランスダクションパスウエイ成分（ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｉｇ
ｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）］
の活性を更に調節する能力を測定することを通して、試験化合物がＣＳＡＰＫタ
ンパク質の活性を調節する能力の測定を達成することができる。例えば、エフェ
クター分子が適切な標的に対して示す活性を測定してもよいか、或はエフェクタ
ーと適切な標的の結合をこの上で記述したように測定してもよい。
【０１７２】 更に別の態様における細胞を用いないアッセイは、ＣＳＡＰＫタンパク質また
はそれの生物活性部分をＣＳＡＰＫタンパク質と結合する既知化合物と接触させ
ることでアッセイ混合物を生じさせ、このアッセイ混合物を試験化合物に接触さ
せた後、この試験化合物がＣＳＡＰＫタンパク質と相互作用する能力を測定する
ことを伴い、ここで、試験化合物がＣＳＡＰＫタンパク質と相互作用する能力の
測定は、ＣＳＡＰＫタンパク質がＣＳＡＰＫ標的分子と優先的に結合するか或は
それの活性を調節する能力を測定することを含んで成る。
【０１７３】 本発明の無細胞アッセイ（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ａｓｓａｙｓ）は、可溶形態
および／または膜結合形態両方のタンパク質（例えばＣＳＡＰＫタンパク質また
はそれの生物活性部分、またはＣＳＡＰＫが結合する受容体）の使用を受け入れ
る。膜結合形態のタンパク質（例えば細胞表面のＣＳＡＰＫ受容体）を用いる無
細胞アッセイの場合、膜結合形態のタンパク質が溶液内に維持されるように可溶
化剤（ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を用いるのが望ましい可能性が
ある。そのような可溶化剤の例には非イオン界面活性剤、例えばｎ−オクチルグ
ルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−
Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（商
標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（商標）、イ
ソトリデシポリ（エチレングリコールエーテル）n、３−［（３−コラミドプロ
ピル）ジメチルアミニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［
（３−コラミドプロピル）ジメチルアミニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパン
スルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）またはＮ−ドデシル＝Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ア
ンモニオ−１−プロパンスルホネートなどが含まれる。
【０１７４】 本発明の前記アッセイ方法の２つ以上の態様において、ＣＳＡＰＫまたはそれ
の標的分子のいずれかを固定することで、このようなタンパク質の一方または両
方の複合形態を未複合形態（ｕｎｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｆｏｒｍ）から分離する
のを容易にするばかりでなくアッセイの自動化に適合させるのが望ましい可能性
がある。試験化合物をＣＳＡＰＫタンパク質に結合させるか或はＣＳＡＰＫタン
パク質と標的分子の相互作用を候補品化合物の存在有り無しで起こさせることを
反応体を入れるに適した任意容器内で達成することができる。適切な容器の例に
はミクロタイタープレート、試験管およびミクロ遠心分離管が含まれる。１つの
態様では、前記タンパク質の一方または両方がマトリックス（ｍａｔｒｉｘ）と
結合するのを可能にするドメイン（ｄｏｍａｉｎ）を付加させる融合タンパク質
（ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）を与えてもよい。例えば、グルタチオン−Ｓ
−トランスフェラーゼ／ＣＳＡＰＫ融合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−ト
ランスフェラーゼ／標的融合タンパク質をグルタチオンセファロースビード（Ｓ
ｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはグルタチオン誘
導化（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）ミクロタイタープレートに吸着させてもよく、
その後、それらを試験化合物と一緒にするか或は試験化合物および吸着しなかっ
た標的タンパク質またはＣＳＡＰＫタンパク質のいずれかと一緒にして、この混
合物を複合体形成を助長する条件（例えば塩およｐＨに関して生理学的条件）下
でインキュベートする。インキュベーション後、前記ビードまたはミクロタイタ
ープレートのウエルを洗浄して、いくらか存在する未接着成分を除去すると、ビ
ードの場合にはマトリックスが不動態化し、複合体を例えばこの上に記述したよ
うに直接または間接的に測定する。別法として、複合体をマトリックスから解離
させてもよくそしてＣＳＡＰＫの結合または活性のレベルを標準的技術で測定す
る。
【０１７５】 本発明のスクリーニングアッセイではまたタンパク質をマトリックスに固定す
る他の技術を用いることも可能である。例えば、ビオチンおよびストレプトアビ
ジンの接合を利用してＣＳＡＰＫタンパク質またはＣＳＡＰＫ標的分子のいずれ
かを固定してもよい。本技術分野で良く知られている技術［例えばビオチニル化
キット（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ）、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ］を用いてビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ
−スクシニミド）からビオチニル化ＣＳＡＰＫタンパク質もしくは標的分子を調
製して、ストレプトアビジンで覆った９６個のウエルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウエルに固定してもよい。別法として、ＣＳＡＰＫタンパ
ク質もしくは標的分子に反応性を示すがＣＳＡＰＫタンパク質とそれの標的分子
の結合を妨害しない抗体を前記プレートのウエルに誘導化して、結合しなかった
標的もしくはＣＳＡＰＫタンパク質を抗体接合で前記ウエル内に捕捉させてもよ
い。この上に示した如きＧＳＴ不動態化（ＧＳＴ−ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）複
合体に関して記述した方法に加えて、そのような複合体を検出する方法には、Ｃ
ＳＡＰＫタンパク質もしくは標的分子に反応性を示す抗体を用いた複合体の免疫
検出ばかりでなくＣＳＡＰＫタンパク質もしくは標的分子に関連した酵素活性の
検出に頼る酵素連結アッセイが含まれる。
【０１７６】 別の態様では、細胞を候補品である化合物に接触させそして前記細胞がＣＳＡ
ＰＫのｍＲＮＡもしくはタンパク質を発現するか否かを測定する方法でＣＳＡＰ
Ｋ発現のモジュレーターを同定する。候補品である化合物の存在下で起こるＣＳ
ＡＰＫのｍＲＮＡもしくはタンパク質の発現のレベルを候補品である化合物が存
在しない時に起こるＣＳＡＰＫのｍＲＮＡもしくはタンパク質の発現のレベルと
比較する。次に、この比較を基にして前記候補品である化合物がＣＳＡＰＫ発現
のモジュレーターであるとして同定することができる。例えば、ＣＳＡＰＫのｍ
ＲＮＡもしくはタンパク質の発現が候補品化合物存在時の方が不存在時の時より
も大きい（統計学的に有意に大きい）場合には、そのような候補品である化合物
をＣＳＡＰＫのｍＲＮＡもしくはタンパク質の発現の刺激剤であるとして同定す
る。また、ＣＳＡＰＫのｍＲＮＡもしくはタンパク質の発現が候補品化合物が存
在する時の方が存在しない時よりも小さい（統計学的に有意に小さい）場合には
、そのような候補品である化合物をＣＳＡＰＫのｍＲＮＡもしくはタンパク質の
発現の阻害剤であるとして同定する。細胞内のＣＳＡＰＫのｍＲＮＡもしくはタ
ンパク質の発現のレベルは、本明細書でＣＳＡＰＫのｍＲＮＡもしくはタンパク
質の検出に関して記述した方法で測定可能である。
【０１７７】 本発明の更に別の面では、ＣＳＡＰＫタンパク質をツーハイブリッドアッセイ
（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ａｓｓａｙ）またはスリーハイブリッドアッセイ［例
えば米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓ他（１９９３）Ｃｅｌｌ
７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａ他（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌ他（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ １４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉ他（１９９３）Ｏｎｃ
ｏｇｅｎｅ ８：１６９３−１６９６；およびＢｒｅｎｔ ＷＯ９４／１０３０
０参照］で「ベイトタンパク質（ｂａｉｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」として用いて
、ＣＳＡＰＫと結合するか或はそれと相互作用する他のタンパク質（「ＣＳＡＰ
Ｋ結合タンパク質」または「ＣＳＡＰＫ−ｂｐ」）を同定することができ、それ
はＣＳＡＰＫ活性に関与する。そのようなＣＳＡＰＫ結合タンパク質は、また、
ＣＳＡＰＫタンパク質もしくはＣＳＡＰＫ標的によるシグナル伝達に例えばＣＳ
ＡＰＫ介在シグナル路の下流要素（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｅｌｅｍｅｎｔｓ
ｏｆ ＣＳＡＰＫ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ）
などとして関与している可能性もある。また、そのようなＣＳＡＰＫ結合タンパ
ク質はＣＳＡＰＫ阻害剤である可能性もある。
【０１７８】 前記ツーハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合ドメインと活性化ド
メインから成る大部分の転写因子のモデュラー（ｍｏｄｕｌａｒ）性質を基にし
ている。簡単に述べると、このようなアッセイでは異なる２種類のＤＮＡ構築物
（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）を用いる。１つの構築物では、ＣＳＡＰＫタンパク質
をコードする遺伝子を既知転写因子（例えばＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメイン
をコードする遺伝子に融合させる。もう一方の構築物では、未同定タンパク質（
「プレイ（ｐｒｅｙ）」または「サンプル」）をコード化するＤＮＡ配列（ＤＮ
Ａ配列のライブラリーから得た）を既知転写因子の活性ドメインをコードする遺
伝子に融合させる。そのような「ベイト」と「プレイ」タンパク質がインビボで
相互作用してＣＳＡＰＫ依存複合体を形成する能力を有するならば、そのような
転写因子のＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインは非常に緊密に接近する。その
ような接近によって、前記転写因子に応答し得る転写調節部位（ｔｒａｎｓｃｒ
ｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｉｔｅ）に有効連結しているレポ
ーター遺伝子（例えばＬａｃＺ）の転写が起こる。このレポーター遺伝子の発現
は検出可能であり、そして機能的転写因子を含有する細胞コロニーを単離して、
これを用いて、ＣＳＡＰＫタンパク質と相互作用するタンパク質をコードするよ
うにクローン化した遺伝子を得ることができる。
【０１７９】 本発明は、更に、上述したスクリーニングアッセイで同定した新規な作用物質
にも関する。従って、本明細書に記述する如き適切な動物モデルで同定した作用
物質のさらなる使用も本発明の範囲内である。例えば、本明細書に記述する如く
同定した作用物質［例えばＣＳＡＰＫ調節剤（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎ
ｔ）、アンチセンスＣＳＡＰＫ核酸分子、ＣＳＡＰＫ特異的抗体、またはＣＳＡ
ＰＫ結合相手］を動物モデルで用いてそのような作用物質による治療の効力、毒
性または副作用などを測定することができる。別法として、本明細書に記述する
如く同定した作用物質を動物モデルで用いてそのような作用物質が示す作用の機
構を測定することができる。本発明は、更に、この上に記述したスクリーニング
アッセイで同定した新規な作用物質を本明細書に記述する如き治療で用いること
にも関する。 Ｂ． 検出アッセイ 本明細書で同定したｃＤＮＡ配列の一部またはフラグメント（および相当する
完全な遺伝子配列）をポリヌクレオチド反応体としていろいろな方法で用いるこ
とができる。例えば、そのような配列を用いて、（ｉ）それらの個々の遺伝子が
染色体上に存在する場所の地図を作成、従って遺伝病に関連した遺伝子領域の場
所を決めることができ、（ｉｉ）非常に僅かな生物学的サンプルから個人を同定
する（組織型を分類する）ことができ、そして（ｉｉｉ）生物学的サンプルの法
廷同定を補助することができる。このような用途を以下に示すサブセクション（
ｓｕｂｓｅｃｔｉｏｎｓ）に記述する。１． 染色体地図作成 遺伝子の配列（または配列の一部）を単離した後、この配列を用いて当該遺伝
子が染色体上に存在する場所を決定することができる。このような方法を染色体
地図作成と呼ぶ。従って、本明細書に記述するＣＳＡＰＫヌクレオチド配列の一
部またはフラグメントを用いてＣＳＡＰＫ遺伝子が染色体上に存在する場所を決
定することができる。ＣＳＡＰＫ配列が染色体に存在する場所を決定することは
そのような配列と病気に関連した遺伝子の相互関係を示そうとする時の重要な第
一段階である。
【０１８０】 簡単に述べると、ＣＳＡＰＫヌクレオチド配列からＰＣＲプライマー（好適に
は長さが１５−２５ｐｂの）を調製することを通して、ＣＳＡＰＫ遺伝子が染色
体に存在する場所を決定する（ｂｅ ｍａｐｐｅｄ ｔｏ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍ
ｅｓ）ことができる。ＣＳＡＰＫ配列のコンピューター解析を用いて、ゲノムＤ
ＮＡに含まれる２つ以上のエキソンをつながない（ｄｏ ｎｏｔ ｓｐａｎ）、
従って増幅過程を複雑にしているプライマー（ｐｒｉｍｅｒｓ）を予測すること
ができる。次に、このようなプライマーを人の染色体を含有させた体細胞ハイブ
リッドのＰＣＲスクリーニングで用いることができる。ＣＳＡＰＫ配列に相当す
るヒト遺伝子を含有させたハイブリッドのみが増幅フラグメントをもたらすであ
ろう。
【０１８１】 いろいろな哺乳動物から得た体細胞（例えばヒトおよびマウスの細胞）を融合
させることを通して体細胞ハイブリッドを調製する。ヒト細胞とマウス細胞のハ
イブリッドが増殖して分裂するにつれて、それらは次第にランダムな順でヒト染
色体を失うが、マウス染色体を保持する。特別な酵素を欠乏させていることから
マウス細胞は増殖しないがヒト細胞は増殖し得る媒体を用いると、必要な酵素を
コード化する遺伝子を含有するある種のヒト染色体が保持されるであろう。いろ
いろな媒体を用いることを通して、ハイブリッド細胞系のパネル（ｐａｎｅｌｓ
）を確立することができる。あるパネルの各細胞系は単一のヒト染色体か或は少
ない数のヒト染色体を含有しかつ全組み（ａ ｆｕｌｌ ｓｅｔ）のマウス染色
体を含有し、それによって、個々の遺伝子が特定のヒト染色体に存在する場所を
容易に決定することができる。［Ｄ’Ｅｕｓｔａｃｈｉｏ Ｐ．他（１９８３）
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２０：９１９−９２４］。また、転座および欠失を伴うヒト
染色体を用いてヒト染色体のフラグメントのみを含有する体細胞ハイブリッドを
生じさせることも可能である。
【０１８２】 体細胞ハイブリッドのＰＣＲ地図作成は、特定な配列を特定の染色体に割り当
てる迅速な手順である。サーマルサイクラー（ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ）
を用いると１つのサーマルサイクラーで１日に３以上の配列を割り当てることが
できる。ＣＳＡＰＫヌクレオチド配列を用いてオリゴヌクレオチドプライマーを
設計し、特定の染色体から生じさせたフラグメントのパネルを用いることで、副
次的位置決め（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を達成することができる。９
ｏ、１ｐまたは１ｖ配列がそれの染色体に存在する場所を決定する目的で同様に
使用可能な他の地図作成方策には、インサイチューハイブリッド形成［Ｆａｎ，
Ｙ．他（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：６
２２３−２７に記述］、標識を付けた流れ分類分け（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）
染色体を用いた予備スクリーニング、そして染色体特異的ｃＤＮＡライブラリー
へのハイブリッド形成による予備選択が含まれる。
【０１８３】 更に、正確な染色体位置決めを１段階で行う目的で、中期染色体拡散（ｍｅｔ
ａｐｈａｓｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｓｐｒｅａｄ）へのＤＮＡ配列の蛍光
インサイチューハイブリッド形成（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ
ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（ＦＩＳＨ）を用いることも可能である。紡錘
体を分裂させる化学品、例えばコルセミドなどで分裂を中期で遮断させた細胞を
用いて染色体拡散を作り出すことができる。この染色体をトリプシンで短期間処
理した後、Ｇｉｅｍｓａで染色してもよい。明色帯および暗色帯の模様が各染色
体上に生じ、その結果として、染色体を個別に同定することができる。このよう
なＦＩＳＨ技術をＤＮＡ配列が５００または６００個の塩基の如き短い場合に使
用することも可能である。しかしながら、塩基の数が１，０００を越えるクロー
ンの場合には、それらがユニークな染色体位置に結合する可能性がより高くなる
ことから、シグナル強度が充分に高くなることで検出が簡単になる。妥当な時間
で良好な結果を得ようとする場合、好適には、塩基の数を１，０００、より好適
には塩基の数を２，０００にすることで充分である。この技術の再吟味に関して
はＶｅｒｍａ他、Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏ
ｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ １９８８を参照のこと。
【０１８４】 染色体地図作成用反応体を個別に用いて単一の染色体または当該染色体上の単
一部位に印を付けることができるか、或は反応体のパネルを用いて複数の部位お
よび／または複数の染色体に印を付けることができる。地図作成の目的で用いる
には、実際、遺伝子の遺伝情報を指定しない領域に相当する反応体が好適である
。遺伝情報を指定する配列は遺伝系列内に保存される可能性が高く、従って染色
体地図作成中にクロスハイブリッド形成（ｃｒｏｓｓ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉ
ｏｎｓ）が起こる機会が増大する。
【０１８５】 ある配列の正確な染色体位置を決めた後、この染色体上の当該配列の物理的場
所と遺伝地図データを相互に関係付けることができる［そのようなデータは、例
えばＪｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄ
ｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙを通してオンラインで入手可能なＶ．ＭｃＫｕｓｉｃ
ｋ、Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎに見られる］
。次に、例えばＥｇｅｌａｎｄ，Ｊ．他（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ、３２５：７
８３−７８７に記述されている連結分析（ｌｉｎｋａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）
［物理的に隣接する遺伝子のコインヘリタンス（ｃｏ−ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ
）］を用いて、同じ染色体領域に存在することを決定した遺伝子と病気の間の関
係を同定することができる。
【０１８６】 更に、ＣＳＡＰＫ遺伝子に関連した病気にかかっている人とかかっていない人
の間のＤＮＡ配列の差を決定することも可能である。病気にかかっている人の数
人または全部に変異が観察されるが病気にかかっていない人には全く変異が観察
されない場合、そのような変異はその特定の病気の原因となる作用物質である可
能性が高い。病気にかかっている人と病気にかかっていない人の比較は、一般に
、最初に染色体の構造的変化、例えば染色体拡散から見ることができるか或は当
該ＤＮＡ配列を基にしたＰＣＲを用いて検出可能な欠失または転座などを探すこ
とを伴う。最終的に、数人の遺伝子の完全な配列決定を実施することで変異の存
在を実証しかつ変異を多形性から区別することができる。２． 組織型分類分け 本発明のＣＳＡＰＫ配列を用いてまた僅かな生物学的サンプルから個人を同定
することも可能である。例えば、米国軍は、兵員の識別で制限フラグメント長多
形性（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍ
ｏｒｐｈｉｓｍ）（ＲＦＬＰ）の使用を考えている。この技術では、個人のゲノ
ムＤＮＡを１種以上の制限酵素で消化させ、そしてサザンブロットで厳密に探る
ことで識別用のユニークな帯を生じさせる。このような方法は、現在のところ「
ドッグタグ（Ｄｏｇ Ｔａｇｓ）」が失われるか、切り替わるか或は盗まれるこ
とが制限になって明確な識別を行うのが困難であると言った欠点を持たない。本
発明の配列はＲＦＬＰ（米国特許第５，２７２，０５７号に記述されている）の
追加的ＤＮＡマーカーとして用いるに有用である。
【０１８７】 本発明の配列を用いて、更に、個人のゲノムの選択した部分の実際の塩基が並
んだ（ｂａｓｅ−ｂｙ−ｂａｓｅ）ＤＮＡ配列を測定する代替技術を提供するこ
とができる。このように、本明細書に記述するＣＳＡＰＫヌクレオチド配列を用
いて、この配列の５’および３’末端から２つのＰＣＲプライマーを生じさせる
ことができる。次に、前記プライマーを用いて個人のＤＮＡを増幅させた後、そ
れの配列を決定することができる。
【０１８８】 このような様式で個人から生じさせた相当するＤＮＡ配列のパネルは個人に固
有の識別を与える可能性がある、と言うのは、各個人は対立遺伝子が異なること
が原因で固有の１組のそのようなＤＮＡ配列を持つと思われるからである。本発
明の配列を用いて個人および組織からそのような識別用配列を得ることができる
。本発明のＣＳＡＰＫヌクレオチド配列は一意にヒトゲノムの一部に相当する。
対立遺伝子の変化は前記配列のコード化領域にある程度起こりかつ非コード化領
域に大きな度合で起こる。個人と個人の間の対立遺伝子の変化は５００塩基毎に
約１回の頻度で起こると推定される。本明細書に記述する配列は各々、ある程度
ではあるが、人を識別する目的で比較することができるＤＮＡはどのＤＮＡであ
るかを決める時の標準として用いるとができる。多形性は非コード化領域の方が
大きな数で生じることから、個人を区別するに必要な配列の数は少ない。ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８またはＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１９の非コード化配列は、恐らく１０から１，０００個のプライマー（各々
が１００個の塩基から成る増幅した非コード化配列をもたらす）のパネルを用い
ると明確な個人識別をうまく与える可能性がある。予測したコード化配列、例え
ばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９
、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８またはＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１９におけるコード化配列を用いるならば、明確な個人識別用プラ
イマーのより適切な数は５００−２，０００であろう。
【０１８９】 本明細書に記述するＣＳＡＰＫヌクレオチド配列に由来する反応体のパネルを
用いて個人に固有の識別用データベースを生じさせるならば、そのような同じ反
応体を後で用いてその個人に由来する組織を同定することができる。このような
固有の識別データベースを用いると極めて少ない組織サンプルから個人の明確な
識別を生死に関係なく行うことができる。３． 法廷生物学における部分ＣＳＡＰＫ配列の使用 ＤＮＡを基とする識別技術をまた法廷生物学で用いることも可能である。法廷
生物学は、例えば犯罪の加害者を明確に識別する手段として犯罪現場で見つかっ
た生物学的証拠の遺伝型分類を用いる科学分野である。このような識別を行う時
、ＰＣＲ技術を用いて、犯罪現場で見つかった非常に少量の生物学的サンプル、
例えば組織、例えば髪または皮膚など、または体液、例えば血液、唾液または精
液などから得たＤＮＡ配列を増幅させることができる。次に、その増幅させた配
列を標準と比較することで、生物学的サンプルの源を識別することができる。
【０１９０】 本発明の配列を用いて、ヒトゲノムの特定座を標的とするポリヌクレオチド反
応体、例えばＰＣＲプライマーなどを生じさせることができ、それによって、例
えば別の「識別用マーカー」（即ち、特別な個人に固有の別のＤＮＡ配列）を準
備することなどを通して、ＤＮＡを基とする法廷識別の信頼度を高めることがで
きる。この上に述べたように、制限酵素で生じさせたフラグメントを用いて生じ
させたパターンに対する正確な代替として、正確な塩基配列の情報を用いて識別
を行うことができる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
１８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９の非コード化領域を標的とする配列がその
ような使用に特に適切である、と言うのは、非コード化領域に起こる多形性の数
の方が多いことから、そのような技術を用いて個人を区別するのがより容易にな
るからである。ポリヌクレオチド反応体の例には、ＣＳＡＰＫヌクレオチド配列
またはそれの一部、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９の非コード化領域に由来するフラグメ
ントが含まれ、これらに少なくとも２０個の塩基、好適には少なくとも３０個の
塩基から成る長さを持たせる。
【０１９１】 本明細書に記述するＣＳＡＰＫヌクレオチド配列を用いて更にポリヌクレオチ
ド反応体、例えば標識を付けたか或は標識を付けることができるプローブを生じ
させることができ、このようなプローブは、例えばインサイチューハイブリッド
形成技術などで、特定の組織、例えば脳の組織などの同定で使用可能である。こ
れは、法廷病理学者に源が未知の組織が提示される場合に非常に有用であり得る
。そのようなＣＳＡＰＫプローブのパネルを用いると種および／または器官型に
よって組織を同定することができる。
【０１９２】 同様な様式で、そのような反応体、例えばＣＳＡＰＫプライマーまたはプロー
ブを用いて組織培養物を混入に関して選別することができる（即ち、ある培養物
に異なる種類の細胞の混合物が存在することを選別することができる）。 Ｃ． 予測薬剤（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）： 本発明は、また、診断アッセイ、予知アッセイおよび監視臨床試行（ｍｏｎｉ
ｔｏｒｉｎｇ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ）を予知（予測）目的で用いて
人を予防的に治療する予測薬剤の分野にも関する。従って、本発明の１つの面は
、生物学的サンプル（例えば血液、血清、細胞、組織）に関連してＣＳＡＰＫタ
ンパク質および／または核酸の発現ばかりでなくＣＳＡＰＫ活性を測定すること
で人がＣＳＡＰＫの発現もしくは活性が異常なことに関連した病気または疾患に
苦しんでいるか或はそのような疾患を発病する危険性があるか否かを決定する診
断アッセイに関する。本発明は、また、人がＣＳＡＰＫタンパク質もしくは核酸
の発現または活性に関連した疾患を発病するか否かを決定する予知（または予測
）アッセイも提供する。例えば、生物学的サンプルにＣＳＡＰＫ遺伝子の変異が
存在することを評価することができる。そのようなアッセイを予知または予測の
目的で用いることで、ＣＳＡＰＫタンパク質もしくは核酸の発現または活性で特
徴づけられるか或はそれに関連した病気が始まる前に人を予防的に治療すること
ができる。
【０１９３】 本発明の別の面は、臨床試行においてＣＳＡＰＫの発現または活性に対する作
用物質（例えば薬剤、化合物）の影響を監視することに関する。
【０１９４】 そのような作用物質および他の作用物質を以下のセクションに更に詳しく記述
する。 １． 診断アッセイ ＣＳＡＰＫタンパク質もしくは核酸が生物学的サンプルに存在するか否かを検
出する典型的な方法は、被験体から生物学的サンプルを得てその生物学的サンプ
ルをＣＳＡＰＫタンパク質またはＣＳＡＰＫタンパク質をコードする核酸（例え
ばｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出する能力を有する化合物または作用物質に接
触させることで当該生物学的サンプルにＣＳＡＰＫタンパク質もしくは核酸が存
在するか否かを検出することを伴う。ＣＳＡＰＫのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ
の検出に好適な作用物質は、ＣＳＡＰＫのｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡとハイ
ブリッドを形成し得る標識付き核酸プローブである。そのような核酸プローブは
、例えばヒトＣＳＡＰＫ核酸、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９の核酸またはそれらの一部
、例えばヌクレオチドの数が少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０また
は５００の長さを有していてＣＳＡＰＫのｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡにスト
リンジェントな条件下で特異的にハイブリッド形成するに充分なオリゴヌクレオ
チドなどであり得る。本発明の診断アッセイで用いるに適した他のプローブは本
明細書に記述するプローブである。
【０１９５】 ＣＳＡＰＫタンパク質の検出に好適な作用物質は、ＣＳＡＰＫタンパク質に結
合し得る抗体、好適には検出可能な標識を付けた抗体である。抗体はポリクロー
ナル、より好適にはモノクローナルであり得る。完全な抗体またはそれのフラグ
メント［例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ’）2］を用いることができる。プローブ
または抗体に関する用語「標識を付けた」は、この用語に、検出可能な物質をプ
ローブまたは抗体に連成（即ち物理的に連結）させることでプローブまたは抗体
を直接標識することばかりでなく直接標識を付けた別の反応体に対する反応性を
用いてプローブまたは抗体を間接的に標識することを包含させることを意図する
。間接的な標識付けの例には、蛍光標識を付けた二次抗体を用いて一次抗体を検
出すること、そして蛍光標識を付けたストレプトアビジンでＤＮＡプローブを検
出することができるようにＤＮＡプローブの末端をビオチンで標識することが含
まれる。用語「生物学的サンプル」は、この用語に、被験体から単離した組織、
細胞および生物学的流体ばかりでなく被験体内に存在する組織、細胞および流体
を包含させることを意図する。即ち、本発明の検出方法は、生物学的サンプルに
含まれるＣＳＡＰＫのｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡをインビトロに
加えてインビボで検出する目的で使用可能である。例えば、ＣＳＡＰＫのｍＲＮ
Ａを検出するインビトロ技術には、ノーザンハイブリッド形成およびインサイチ
ューハイブリッド形成が含まれる。ＣＳＡＰＫタンパク質を検出するインビトロ
技術には、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロッ
ト、免疫沈降および免疫蛍光法が含まれる。ＣＳＡＰＫゲノムＤＮＡを検出する
インビトロ技術にはサザンハイブリッド形成が含まれる。更に、ＣＳＡＰＫタン
パク質を検出するインビボ技術には、標識を付けた抗ＣＳＡＰＫ抗体を被験体に
導入することが含まれる。例えば、この抗体に放射性マーカーの標識を付けて、
それが被験体内に存在するか否かおよびそれの場所を標準的画像形成技術で検出
することができる。
【０１９６】 １つの態様における生物学的サンプルは被験体から得たタンパク質分子を含有
するサンプルである。別法としての生物学的サンプルは、被験体から得たｍＲＮ
Ａ分子または被験体から得たゲノムＤＮＡ分子を含有するサンプルであってもよ
い。好適な生物学的サンプルは被験体から通常手段で単離した血清サンプルであ
る。
【０１９７】 別の態様では、この方法に、更に、対照被験体から対照生物学的サンプルを得
て、この対照サンプルをＣＳＡＰＫタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを
検出し得る化合物または作用物質と接触させることで当該生物学的サンプルにＣ
ＳＡＰＫタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡが存在するか否かを検出し、
そして対照サンプル中のＣＳＡＰＫタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの
存在を試験サンプル中のＣＳＡＰＫタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの
存在と比較することを含める。
【０１９８】 本発明は、また、ＣＳＡＰＫが生物学的サンプルに存在するか否かを検出する
ためのキットも包含する。このキットは、例えば、生物学的サンプル中のＣＳＡ
ＰＫタンパク質またはｍＲＮＡを検出し得る標識付き化合物または作用物質、サ
ンプル中のＣＳＡＰＫの量を測定する手段、およびサンプル中のＣＳＡＰＫの量
を標準と比較するための手段を含んで成り得る。前記化合物または作用物質を適
切な容器に入れておいてもよい。このキットに、更に、このキットをＣＳＡＰＫ
タンパク質または核酸の検出で用いる使用を示す指示を含めておいてもよい。 ２． 予知アッセイ 本明細書に記述する診断方法を用いて、更に、ＣＳＡＰＫの発現または活性が
異常なことに関連した病気または疾患を発病しているか或は発病の危険性がある
被験者を識別することも可能である。例えば、本明細書に記述するアッセイ、例
えば前以て行う診断アッセイまたは後に行うアッセイなどを用いて、ＣＳＡＰＫ
タンパク質、核酸発現または活性に関連した疾患を発病しているか或は発病する
危険性のある被験者を識別することができる。従って、本発明は、ＣＳＡＰＫの
発現もしくは活性が異常なことに関連した病気または疾患を識別する方法を提供
し、この方法では、被験者から試験サンプルを得た後、ＣＳＡＰＫタンパク質も
しくは核酸（例えばｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出し、ここで、ＣＳＡＰＫタ
ンパク質もしくは核酸が存在するか否かが、ＣＳＡＰＫの発現もしくは活性が異
常なことに関連した病気または疾患を発病しているか或は発病の危険がある被験
者の診断になる。本明細書で用いる如き「試験サンプル」は、興味の持たれる被
験者から得た生物学的サンプルを指す。例えば、試験サンプルは生物学的流体（
例えば血清）、細胞サンプルまたは組織であり得る。
【０１９９】 更に、本明細書に記述する予知アッセイを用いて、ＣＳＡＰＫの発現もしくは
活性が異常なことに関連した病気または疾患を治療する作用物質（例えば作動薬
、拮抗薬、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチド、核酸、小型分子また
は他の薬剤候補品）を被験者に投与することができるか否かを決定することがで
きる。従って、本発明は、ＣＳＡＰＫの発現もしくは活性が異常なことに関連し
た疾患用の作用物質を用いて被験者を有効に治療することができるか否かを決定
する方法を提供し、この方法では、試験サンプルを得た後、ＣＳＡＰＫタンパク
質もしくは核酸の発現または活性を検出する（例えば、ＣＳＡＰＫタンパク質ま
たは核酸の発現または活性が豊富なことは、ＣＳＡＰＫの発現もしくは活性が異
常なことに関連した疾患を治療する作用物質を被験者に投与してもよいと言った
診断である）。
【０２００】 本発明の方法を用いてまたＣＳＡＰＫ遺伝子が遺伝的に変化しているか否かを
検出することで変化した遺伝子を有する被験者がＣＳＡＰＫ遺伝子に関連した病
気になる危険があるか否かを決定することができる。好適な態様における方法は
、被験者から得た細胞のサンプルにＣＳＡＰＫタンパク質をコード化する遺伝子
の一体性に影響を与える変化またはＣＳＡＰＫ遺伝子の誤発現の少なくとも１つ
によって特徴づけられる遺伝子変化が存在するか否かを検出することを包含する
。そのような遺伝子変化は、例えば１）ＣＳＡＰＫ遺伝子からヌクレオチドが１
つ以上欠失していること、２）１つ以上のヌクレオチドがＣＳＡＰＫ遺伝子に付
加していること、３）ＣＳＡＰＫ遺伝子の１つ以上のヌクレオチドが置き換わっ
ていること、４）ＣＳＡＰＫ遺伝子の染色体転位が起こっていること、５）ＣＳ
ＡＰＫ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写のレベルが変化していること、６）Ｃ
ＳＡＰＫ遺伝子の修飾が異常、例えばゲノムＤＮＡのメチル化パターンが異常な
こと、７）ＣＳＡＰＫ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写の非野生型スプライシ
ングパターンが存在すること、８）ＣＳＡＰＫタンパク質の非野生型レベル、９
）ＣＳＡＰＫ遺伝子の対立遺伝子損失、そして１０）ＣＳＡＰＫタンパク質の翻
訳後修飾が適切でないことの中の少なくとも１つが存在することを確かめること
を通して検出可能である。本明細書に記述するように、ＣＳＡＰＫ遺伝子におけ
る変化の検出で用いることができる公知アッセイ技術は本技術分野に数多く存在
する。好適な生物学的サンプルは被験者から通常手段で単離した組織または血清
サンプル、例えば心臓組織サンプルなどである。
【０２０１】 特定の態様における前記変化の検出は、プローブ／プライマーをポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば米国特許第４，６８３，１９５号および４，６８３
，２０２号を参照）、例えばアンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣＲ、または別
法として連結連鎖反応（ＬＣＲ）［例えばＬａｎｄｅｇｒａｎ他（１９８８）Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−１０８０；およびＮａｋａｚａｗａ他（１９
９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３６０−３６４
を参照］で用いることを伴い、特にＣＳＡＰＫ遺伝子における点変異（ｐｏｉｎ
ｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）を検出しようとする場合には後者が有用であり得る［
Ａｂｒａｖａｙａ他（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：
６７５−６８２参照］。このような方法は、患者から細胞のサンプルを集め、こ
のサンプルの細胞から核酸（例えばゲノム、ｍＲＮＡまたは両方）を単離し、こ
の核酸サンプルをＣＳＡＰＫ遺伝子に特異的にハイブリッド形成する１種以上の
プライマーにＣＳＡＰＫ遺伝子（存在する場合）のハイブリッド形成および増幅
が起こる条件下で接触させ、そして増幅産物が存在するか否かを検出するか或は
増幅産物の大きさを検出しそしてそれを対照サンプルの長さと比較する段階を含
み得る。本明細書に記述する変異の検出で用いる技術のいずれかと協力させてＰ
ＣＲおよび／またはＬＣＲを予備増幅段階として用いるのが望ましい可能性があ
るとして予測される。
【０２０２】 代替増幅方法には、自己保持型配列複製［Ｇｕａｔｅｌｌｉ，Ｊ．Ｃ．他（１
９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４−１
８７８］、転写増幅システム［Ｋｗｏｈ，Ｄ．Ｙ．他（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３−１１７７］、Ｑ−Ｂｅｔ
ａ Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ［Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．他（１９８８）、Ｂｉｏ−
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７］、または他の任意の核酸増幅方法が含ま
れ、その後、その増幅させた分子を本分野の技術者に良く知られている技術を用
いて検出する。このような検出案は、特に、核酸分子が非常に少ない数で存在す
る場合に前記分子を検出しようとする時に有用である。
【０２０３】 代替態様では、サンプルの細胞から得たＣＳＡＰＫ遺伝子における変異を制限
酵素による開裂パターンの変化で識別することができる。例えばサンプルおよび
対照ＤＮＡを単離し、増幅させ（場合により）、１種以上の制限エンドヌクレア
ーゼで消化させた後、ゲル電気泳動でフラグメントの長さサイズを決定して比較
を行う。サンプルのＤＮＡと対照のＤＮＡの間にフラグメント長のサイズに差が
あることはサンプルのＤＮＡに変異が存在することを示している。更に、リボザ
イム（例えば米国特許第５，４９８，５３１号を参照）に特異的な配列を用いて
、リボザイムによる開裂部位が生じるか或は失われるかによって特異的変異の存
在を評価することができる。
【０２０４】 他の態様では、サンプルの核酸と対照の核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを数
百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含有させた高密度のアレイ（ａｒ
ｒａｙ）［Ｃｒｏｎｉｎ，Ｍ．Ｔ．他（１９９６）Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏ
ｎ ７：２４４−２５５；Ｋｏｚａｌ，Ｍ．Ｊ．他（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２：７５３−７５９］にハイブリッド形成させることを通し
てＣＳＡＰＫの遺伝子変異を識別することができる。例えばＣｒｏｎｉｎ，Ｍ．
Ｔ．他（上記）が記述した如き光発生（ｌｉｇｈｔ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ）ＤＮ
Ａプローブを含有させた二次元アレイでＣＳＡＰＫの遺伝子変異を識別すること
ができる。簡単に述べると、逐次的に重なるプローブから成る線形アレイを作成
することによって、１番目のハイブリッド形成アレイ（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉ
ｏｎ ａｒｒａｙ）のプローブを用いてサンプルおよび対照中のＤＮＡの長いス
トレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈｅｓ）に渡って走査することで配列間の塩基変化を識
別することができる。このような段階によって点変異を識別することができる。
この段階の後、２番目のハイブリッド形成アレイを用い、検出すべき変化または
変異の全部に相補的な特殊なプローブアレイ（より小型）を用いて特定の変異を
特徴付けることができる。各変異アレイ（ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｒｒａｙ）は並
列プローブセット（ｐａｒａｌｌｅｌ ｐｒｏｂｅ ｓｅｔｓ）で構成されてい
る、即ち１つは野生型遺伝子に相補的でありそしてもう１つは変異遺伝子に相補
的である。
【０２０５】 更に別の態様では、本技術分野で公知の多様な配列決定反応（ｓｅｑｕｅｎｃ
ｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）のいずれかを用いてＣＳＡＰＫ遺伝子の配列を直
接決定しそしてサンプルのＣＳＡＰＫの配列を相当する野生型（対照）配列と比
較することで変異を検出することができる。配列決定反応の例には、Ｍａｘａｍ
およびＧｉｌｂｅｒｔが開発した技術［（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５６０］またはＳａｎｇｅｒが開発した技術［（
１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３］
を基とする反応が含まれる。また、診断アッセイ［（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ １９：４４８］を実施する時には多様な自動配列決定手順のいず
れかを用いることも可能であると予測され、それには、質量分析による配列決定
［例えばＰＣＴ国際公開番号ＷＯ ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎ他（１９９６
）Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３６：１２７−１６２およびＧｒｉｆｆｉｎ
他（１９９３）Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４
７−１５９参照］が含まれる。
【０２０６】 ＣＳＡＰＫ遺伝子における変異を検出する他の方法には、開裂用作用物質から
の保護を用いてＲＮＡ／ＲＮＡもしくはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖のミスマッ
チ塩基を検出する方法［Ｍｙｅｒｓ他（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１
２４２］が含まれる。一般的には、野生型ＣＳＡＰＫ配列を含有する（標識付き
）ＲＮＡもしくはＤＮＡを組織サンプルから得た恐らくは変異体であるＲＮＡも
しくはＤＮＡとハイブリッド形成させることでヘテロ二本鎖を生じさせることを
通して、前記技術の「ミスマッチ開裂（ｍｉｓｍａｔｃｈ ｃｌｅａｖａｇｅ）
」技術を開始させる。この二本鎖の二重らせん（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅ
ｄ ｄｕｐｌｅｘｅｓ）を、この二重らせんの１本鎖領域、例えば対照鎖とサン
プル鎖の間の塩基対ミスマッチが原因で存在する１本鎖領域を開裂させる作用物
質で処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重らせんをＲＮアーゼで処理しそして
ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドをＳ１ヌクレアーゼで処理することで、ミスマッチ
領域を酵素で消化させてもよい。他の態様では、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／
ＤＮＡいずれかの二重らせんをヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムで処
理しそしてピペリジンで処理することでミスマッチ領域を消化させてもよい。そ
のようなミスマッチ領域を消化させた後、その結果として生じた材料を変性ポリ
アクリルアミドゲルを用いて大きさで分けることで変異の部位を決定する。例え
ばＣｏｔｔｏｎ他（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａ他（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ．２１７：２８６−２９５を参照のこと。好適な態様では、検出の目的で対
照ＤＮＡまたはＲＮＡに標識を付けてもよい。
【０２０７】 更に別の態様におけるミスマッチ開裂反応では、２本鎖ＤＮＡにおけるミスマ
ッチ塩基対を認識する１種以上のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復
」酵素）を限定した系で用いて、細胞のサンプルから得たＣＳＡＰＫのｃＤＮＡ
における点変異を検出して、その場所を決める。例えば、大腸菌のｍｕｔＹ酵素
はＧ／ＡミスマッチのＡを開裂させ、そしてヒーラー細胞のチミジンＤＮＡグリ
コシラーゼはＧ／ＴミスマッチのＴを開裂させる［Ｈｓｕ他（１９９４）Ｃａｒ
ｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １５：１６５７−１６６２］。典型的な態様に従い、
ＣＳＡＰＫ配列、例えば野生型ＣＳＡＰＫ配列を基とするプローブを試験細胞１
種または２種以上から得たｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物とハイブリッド形成さ
せる。このような二重らせんをＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理し、そして開裂
産物（もしあれば）を電気泳動プロトコルなどで検出することができる。例えば
米国特許第５，４５９，０３９号を参照のこと。
【０２０８】 他の態様では、電気泳動の可動性の変化を用いてＣＳＡＰＫ遺伝子における変
異を識別することができるであろう。例えば、１本鎖の配座多形性（ｓｉｎｇｌ
ｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（
ＳＳＣＰ）を用いて、変異体と野生型核酸の間の電気泳動可動性の差を検出する
ことができる［Ｏｒｉｔａ他（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ：８６：２７６６、またＣｏｔｔｏｎ（１９９３）Ｍｕｔａｔ Ｒｅ
ｓ ２８５：１２５−１４４；およびＨａｙａｓｈｉ（１９９２）Ｇｅｎｅｔ
Ａｎａｌ Ｔｅｃｈ Ａｐｐｌ ９：７３−７９も参照のこと］。サンプルおよ
び対照ＣＳＡＰＫ核酸の１本鎖ＤＮＡフラグメントを変性させた後、復元させる
ことができるであろう。１本鎖核酸の二次構造は配列に応じて変わり、その結果
として電気泳動可動性が変わることから、塩基が１つのみ変わっても、そのよう
な変化を検出することができる。前記ＤＮＡフラグメントに標識を付けてもよい
か或は標識を付けたプローブを用いてそれらを検出してもよい。このようなアッ
セイの感度はＲＮＡ（ＤＮＡではなく）を用いると高くなる可能性があり、この
場合、二次構造が配列の変化に対して示す感受性はより高い。好適な態様におけ
る主題方法では２本鎖のヘテロ２本鎖分子の分離でヘテロ２本鎖分析を用い、こ
れは電気泳動の可動性における変化を基礎にしている［Ｋｅｅｎ他（１９９１）
Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ ７：５）。
【０２０９】 更に別の態様では、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）［Ｍｙｅｒｓ他（１９
８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４９５］を用いて、変性剤を勾配を付けて含有さ
せたポリアクリルアミドゲルの中を変異体または野生型フラグメントが移動する
速度を評価する。ＤＧＧＥを分析方法として用いる場合、ＤＮＡが完全には変性
を受けないことを確保する目的で、例えばＰＣＲを用いて高融点のＧＣが豊富な
ＤＮＡの約４０ｂｐのＧＣクランプ（ｃｌａｍｐ）を加えることなどでＤＮＡに
修飾を受けさせる。さらなる態様では、対照およびサンプルＤＮＡの可動性の差
を識別する目的で変性勾配の代わりに温度勾配を用いる［Ｒｏｓｅｎｂａｕｍお
よびＲｅｉｓｓｎｅｒ（１９８７）Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ ２６５：１２７
５３］。
【０２１０】 点変異を検出する他の技術の例には、これらに限定するものでないが、選択的
オリゴヌクレオチドハイブリッド形成、選択的増幅または選択的プライマー伸長
（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）が含まれる。例えば、既知変異が中心に位置するオリゴ
ヌクレオチドプライマーを調製した後、完全な一致（ｍａｔｃｈ）が見られる場
合のみにハイブリッド形成が起こるような条件下でそれを標的ＤＮＡにハイブリ
ッド形成させる［Ｓａｉｋｉ他（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２４：１６３）；
Ｓａｉｋｉ他（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
６：６２３０］。そのような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドをＰＣＲで増
幅させた標的ＤＮＡとハイブリッド形成させるか、或は前記オリゴヌクレオチド
をハイブリッド形成膜に結合させた時には多種多様な変異体とハイブリッド形成
させた後に標識を付けた標的ＤＮＡとハイブリッド形成させる。
【０２１１】 別法として、この直ぐに利用できる発明に関連して、選択的ＰＣＲ増幅に依存
する対立遺伝子特異的増幅技術を用いることも可能である。特異的増幅用プライ
マーとして用いるオリゴヌクレオチドは、興味の持たれる変異を分子の中心に持
つものであってもよい（その結果として増幅は示差ハイブリッド形成に依存する
）［Ｇｉｂｂｓ他（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １７：２
４３７−２４４８］か或は１つのプライマーの極限３’末端に持つものであって
もよく、この場合、適切な条件を用いるとミスマッチによってポリメラーゼ伸長
が防止され得るか或はその度合が低くなり得る［Ｐｒｏｓｓｎｅｒ他（１９９３
）Ｔｉｂｔｅｃｈ １１：２３８］。加うるに、変異領域に新規な制限部位を導
入して、開裂を基とする検出部を作り出すのが望ましい可能性もある［Ｇａｓｐ
ａｒｉｎｉ他（１９９２）Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＰｒｏｂｅｓ ６：１］。特定の態
様ではまたＴａｑリガーゼを増幅で用いて増幅を実施することも可能であると予
測される［Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８８：１８９］。このような場合、５’配列の３’末端の所に完全な一
致が存在する場合のみに連結が起こり、それによって、増幅が起こるか否かを確
認することで既知変異が特定部位の所に存在するか否かを検出することができる
。
【０２１２】 本明細書に記述する方法は、例えば、本明細書に記述する少なくとも１種のプ
ローブである核酸または反応体である抗体を含んで成るように前以て包装してお
いた診断キットなどを用いて実施可能であり、これを、便利には、例えばＣＳＡ
ＰＫ遺伝子が関与する疾患または病気の症状を示すか或は家族が病歴を示す患者
を診断する臨床設定などで用いることができる。
【０２１３】 本明細書に記述する予知アッセイでは、更に、ＣＳＡＰＫを発現する如何なる
種類の細胞も組織も使用可能である。 ３． 臨床試行中の効果の監視 ＣＳＡＰＫタンパク質の発現または活性に対する作用物質（例えば薬剤または
化合物）の影響を監視することは、基本的な薬剤スクリーニングに適用可能なば
かりでなくまた臨床試行にも適用可能である。例えば本明細書に記述した如きス
クリーニングアッセイでＣＳＡＰＫ遺伝子の発現またはタンパク質のレベルを高
くするか或はＣＳＡＰＫの活性を上方に調節する（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅ）と測
定された作用物質の効果を、ＣＳＡＰＫ遺伝子の発現またはタンパク質のレベル
が低下しているか或はＣＳＡＰＫ活性のダウンレギュレート（ｄｏｗｎｒｅｇｕ
ｌａｔｅ）を示す被験体の臨床試行で監視することができる。別法として、スク
リーニングアッセイでＣＳＡＰＫ遺伝子の発現またはタンパク質のレベルを低く
するか或はＣＳＡＰＫの活性を下方に調節すると測定された作用物質の効果を、
ＣＳＡＰＫ遺伝子の発現またはタンパク質のレベルが高いか或はＣＳＡＰＫ活性
の上方調節を示す被験体の臨床試行で監視することができる。そのような臨床試
行では、ＣＳＡＰＫ遺伝子、好適には疾患に関係していると推測された他の遺伝
子の発現または活性を個々の細胞の表現型の「読み出し（ｒｅａｄ ｏｕｔ）」
またはマーカーとして用いることができる。
【０２１４】 例えば、決して限定するものでないが、ＣＳＡＰＫ活性を調節する作用物質（
例えば化合物、薬剤または小型分子）（例えば、本明細書に記述した如きスクリ
ーニングアッセイで同定した）による処理で調節を受ける遺伝子（ＣＳＡＰＫを
包含）（細胞内に存在する）を識別することができる。従って、例えば臨床試行
などでＣＳＡＰＫに関連した疾患に対する作用物質の効果を試験しようとする場
合には、細胞を単離してＲＮＡを調製した後、ＣＳＡＰＫおよびＣＳＡＰＫに関
連した疾患に関係すると思われる他の遺伝子それぞれの発現のレベルを分析する
。遺伝子発現のレベル（即ち遺伝子発現パターン）は、本明細書に記述する如き
ノーザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲで量化可能であるか、或は別法として
、タンパク質の産出量を本明細書に記述した如き方法の１つで測定するか、或は
ＣＳＡＰＫまたは他の遺伝子の活性レベルを測定することを通して量化可能であ
る。このようにして、遺伝子の発現パターンを、細胞が作用物質に対して示す生
理学的応答を指示するマーカーとして用いることができる。従って、このような
応答の状態の測定は、人を作用物質で処置する前、そして処置中のいろいろな時
点で実施可能である。
【０２１５】 本発明は、好適な態様において、被験者を作用物質（例えば、本明細書に記述
したスクリーニングアッセイで同定した作動薬、拮抗薬、ペプチドミメティック
、タンパク質、ペプチド、核酸、小型分子または他の薬剤候補品）で処置した時
の効果を監視する方法を提供し、この方法は、（ｉ）当該作用物質を投与する前
の被験者から投与前サンプルを得、（ｉｉ）この投与前サンプルに含まれるＣＳ
ＡＰＫタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現のレベルを検出し、（ｉ
ｉｉ）当該被験者から投与後サンプルを１つ以上得、（ｉｖ）この投与後サンプ
ルに含まれるＣＳＡＰＫタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現または
活性のレベルを検出し、（ｖ）投与前サンプルに入っているＣＳＡＰＫタンパク
質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを投与後サンプルま
たはサンプル２つ以上に入っているＣＳＡＰＫタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノ
ムＤＮＡのそれと比較し、そして（ｖｉ）それに応じて当該作用物質を当該被験
者に投与する方法を変える段階を含んで成る。例えば、ＣＳＡＰＫの発現または
活性を検出されたそれよりも高いレベルにする、即ち当該作用物質の効果を高め
ようとする場合には、当該作用物質の投与量を多くするのが望ましい可能性があ
る。また、ＣＳＡＰＫの発現または活性を検出されたそれよりも低いレベルにす
る、即ち当該作用物質の効果を低くしようとする場合には、当該作用物質の投与
量を少なくするのが望ましい可能性がある。このような態様に従い、観察可能な
表現型応答が存在しない場合でも、ＣＳＡＰＫの発現もしくは活性をある作用物
質の効果の指標として用いることができる。
【０２１６】 Ｃ．処置の方法 本発明は、異常なＣＳＡＰＫ発現又は活性（ａｂｅｒｒａｎｔ ＣＳＡＰＫ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ）と関連した疾患の危険のある
（にかかり易い）又は疾患を有する被験者（ｓｕｂｊｅｃｔ）を処置する予防及
び治療方法の両方を提供する。予防及び治療処置方法の両方に関して、このよう
な処置は薬理ゲノミックス（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）の分野から得
られた知見に基づいて特定的に適合させ（ｔａｉｌｏｒｅｄ）又は改変する（ｍ
ｏｄｏｆｉｅｄ）ことができる。本明細書で使用した「薬理ゲノミックス」は、
臨床的開発中の及び市場の薬剤に対する遺伝子配列決定、統計的遺伝学及び遺伝
子発現解析の如き遺伝学の技術の適用を指す。更に特定的には、この用語は、患
者の遺伝子が薬剤に対する彼又は彼女の応答（例えば、患者の「薬剤応答表現型
」（ｄｒｕｇ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）又は「薬剤応答遺伝子
型（ｄｒｕｇ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ））をいかに決定するかに
ついての研究を指す。かくして、本発明の他の観点は、個体の予防又は治療処置
を、その個体の薬剤応答遺伝子型に従って本発明のＣＳＡＰＫ分子又はＣＳＡＰ
Ｋモジュレーター（ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）により適合させる方法を提供する。
薬理ゲノミックスは、臨床医又は医師が予防又は治療処置をその処置から最も多
く利益を得るであろう患者に目標を定めること及び毒性の薬剤関連副作用を経験
するであろう患者の処置を回避することを可能とする。
【０２１７】 １．予防方法 １つの観点では、本発明は、被験者にＣＳＡＰＫ、又はＣＳＡＰＫ発現もしく
は少なくとも１つのＣＳＡＰＫ活性をモデュレートする（ｍｏｄｕｌａｔｅｓ）
作用物質（ａｇｅｎｔ）を被験者に投与することにより、被験者において異常な
ＣＳＡＰＫ発現又は活性と関連した疾患又は状態を防止する方法を提供する。異
常なＣＳＡＰＫ発現又は活性により引き起こされるか又は寄与される疾患の危険
のある被験者は、例えば、本明細書に記載した診断アッセイ又は予後アッセイの
いずれか又は組み合わせにより鑑定することができる。疾患（ｄｉｓｅａｓｅ）
又は障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）を防止するるか又はその進行を遅らせるように、
ＣＳＡＰＫ異常（ＣＳＡＰＫ ａｂｅｒｒａｎｃｙ）の特徴的症状の発現の前に
予防剤（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ａｇｅｎｔ）の投与を行うことができる。
ＣＳＡＰＫ異常の型に依存して、例えば、ＣＳＡＰＫ、ＣＳＡＰＫアゴニスト剤
（ＣＳＡＰＫ ａｇｏｎｉｓｔ ａｇｅｎｔ）、ＣＳＡＰＫアンタゴニスト剤（
ＣＳＡＰＫ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ａｇｅｎｔ）を被験者の処置のために使用
することができる。適当な作用物質は本明細書に記載のスクリーニングアッセイ
に基づいて決定することができる。
【０２１８】 ２．治療方法 本発明の他の観点は、治療の目的でＣＳＡＰＫ発現又は活性をモデュレートす
る方法に関する。従って、例示的態様では、本発明の調節方法（ｍｏｄｕｌａｔ
ｏｒｙ ｍｅｔｈｏｄ）は、細胞を、ＣＳＡＰＫ又は該細胞と関連したＣＳＡＰ
Ｋタンパク質活性の１つ又はそれより多くの活性をモデュレートする（ｍｏｄｕ
ｌａｔｅｓ）作用物質と接触させることを含む。ＣＳＡＰＫタンパク質活性をモ
デュレートする作用物質は核酸もしくはタンパク質、ＣＳＡＰＫタンパク質の天
然に存在する標的分子（例えば、ＣＳＡＰＫリン酸化基質）、ＣＳＡＰＫ抗体、
ＣＳＡＰＫアゴニストもしくはアンタゴニスト、ＣＳＡＰＫアゴニストもしくは
アンタゴニストのペプチド擬似体（ｐｅｐｔｉｄｅｍｉｍｅｔｉｃ）、又は他の
小さな分子の如き本明細書に記載の作用物質であることができる。１つの態様で
は、作用物質は１つ又はそれより多くのＣＳＡＰＫ活性を刺激する。このような
刺激剤の例は、活性なＣＳＡＰＫタンパク質及び細胞に導入されたＣＳＡＰＫを
コードしている核酸分子を包含する。他の態様では、作用物質は１つ又はそれよ
り多くのＣＳＡＰＫ活性を抑制する（ｉｎｈｉｂｉｔｓ）。このような抑制剤の
例は、アンチセンスＣＳＡＰＫ核酸分子、抗−ＣＳＡＰＫ抗体及びＣＳＡＰＫ抑
制剤を包含する。これらの調節方法は、生体外で（例えば細胞を作用物質と共に
培養することにより）行うことができ、又は生体内で（例えば作用物質を被験者
に投与することにより）行うことができる。このようなものとして、本発明は、
ＣＳＡＰＫタンパク質又は核酸分子の異常な発現又は活性により特徴付けられる
疾患又は障害で苦しめられている個体を処置する方法を提供する。１つの態様で
は、この方法は、作用物質（例えば、本明細書に記載のスクリーニングアッセイ
により同定された作用物質）又はＣＳＡＰＫ発現又は活性を調節する［例えば、
アップレギュレーションする（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｓ）か又はダウンレギュレ
ーションする（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｓ）］作用物質の組み合わせを投与す
ることを含む。他の態様では、この方法は、減少した又は異常なＣＳＡＰＫ発現
又は活性を補償する（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｅ）ための治療としてＣＳＡＰＫタン
パク質又は核酸分子を投与することを含む。
【０２１９】 ＣＳＡＰＫ活性の刺激は、ＣＳＡＰＫが異常にダウンレギュレーションされて
いる状況及び／又は増加したＣＳＡＰＫ活性が有利な効果を与えると思われる状
況において望ましい。例えば、ＣＳＡＰＫ活性の刺激は、ＣＳＡＰＫがダウンレ
ギュレーションされている状況及び／又は増加したＣＳＡＰＫ活性が有利な効果
を与えると思われる状況において望ましい。同様に、ＣＳＡＰＫ活性の抑制はＣ
ＳＡＰＫが異常にアップレギュレーションされている状況及び／又は減少したＣ
ＳＡＰＫ活性が有利な効果を与えると思われる状況において望ましい。
【０２２０】 ３．薬理ゲノミックス 本発明のＣＳＡＰＫ分子並びに本明細書に記載のスクリーニングアッセイによ
り確認されたＣＳＡＰＫ活性（例えば、ＣＳＡＰＫ遺伝子発現）に対して刺激又
は抑制効果を有する作用物質又はモジュレーターを個体に投与して、異常なＣＳ
ＡＰＫ活性と関連した疾患（例えば、うっ血性心不全（ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ
ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ）の如き心臓血管疾患）を処置する（予防的及び治
療的）ことができる。このような処置と共に、薬理ゲノミックス（即ち、個体の
遺伝子型と外来化合物（又は薬剤）に対するその個体の応答との関係の研究）を
考慮することができる。治療の代謝の差は、薬理学的に活性な薬剤の用量と血中
濃度との関係を変えることにより、ひどい毒性又は治療の失敗に導くことがある
。かくして、医師又は臨床医は、ＣＳＡＰＫ分子もしくはＣＳＡＰＫモジュレー
ターを投与するかどうかを決定する際、並びに投与量（ｄｏｓａｇｅ）及び／又
はＣＳＡＰＫ分子もしくはＣＳＡＰＫモジュレーターによる処置の治療的養生法
（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｒｅｇｉｍｅｎ）を適合させる際に、適切な薬理ゲ
ノミックスの研究で得られた知見を適用することを考慮することができる。
【０２２１】 薬理ゲノミックスは、病に冒された人々における変化した薬性癖（ａｌｔｅｒ
ｅｄ ｄｒｕｇ ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）及び異常な作用による薬剤に対する
応答の臨床的に重要な遺伝性の変化（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｖａｒｉａｔｉｏ
ｎｓ）を取り扱う。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９
６）Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ ２３（１０−１
１）：９８３−９８５及びＬｉｎｄｅｒ，Ｍ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．（１９９７）
Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．４３（２）：２５４−２６６参照。一般に、２つの型の薬
理遺伝学的状態が区別されうる。薬剤が身体に作用する方法を変化させる単一因
子（ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ）として伝達された（ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ
）遺伝的状態（ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）［変化した薬剤作用（
ａｌｔｅｒｅｄ ｄｒｕｇ ａｃｔｉｏｎ）］又は身体が薬剤に作用する方法を
変化させる単一因子として伝達された遺伝的状態［変化した薬剤代謝（ａｌｔｅ
ｒｅｄ ｄｒｕｇ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）］。これらの薬理遺伝学的状態は、
まれな遺伝的欠陥として又は自然に起こる多形性（ｎａｔｕｒａｌｌｙ−ｏｃｃ
ｕｒｉｎｇ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）として起こりうる。例えば、グルコ
ース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ欠乏症（Ｇ６ＰＤ）は、主な臨床的合併症が
酸化剤薬（抗マラリヤ剤、スルホンアミド類、鎮痛薬、ニトロフラン類）の摂取
及びソラマメ（ｆａｖａ ｂｅａｎｓ）の消費（ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ）の後
の溶血である共通の遺伝性酵素病（ｃｏｍｍｏｎ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｅｎｚ
ｙｍｏｐａｔｈｙ）である。
【０２２２】 「ゲノム−ワイドアソシエーション（ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ａｓｓｏｃｉ
ａｔｉｏｎ））として知られた、薬剤応答を予言する遺伝子を同定するための１
つの薬理ゲノミックスアプローチは、主として既知の遺伝子関連マーカー（例え
ば、その各々が２つの変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）を有する、ヒトゲノム上の６
０，０００〜１００，０００の多形部位又は可変部位（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｏｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｉｔｅｓ）から成る「バイアレリック（ｂｉａｌ
ｌｅｌｉｃ）」遺伝子マーカーマップから成るヒトゲノムの高解像力マップに頼
る。このような高解像力遺伝子マップを、相ＩＩ／ＩＩＩ薬剤試験（Ｐｈａｓｅ
ＩＩ／ＩＩＩ ｄｒｕｇ ｔｒｉａｌ）に参加する統計的に有意な数の患者の
各々のゲノムのマップと比較して、特定の観察された薬剤応答又は副作用と関連
したマーカーを同定することができる。あるいは、このような高解像力マップは
、ヒトゲノムにおける数千万の知られた単一ヌクレオチド多形性（ＳＮＰｓ）の
組み合わせから発生させることができる。本明細書で使用した「ＳＮＰ」は、Ｄ
ＮＡの伸長した状態（ｓｔｒｅｔｃｈ）における単一ヌクレオチド塩基において
起こる共通の変化（ｃｏｍｍｏｎ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）である。例えば、Ｓ
ＮＰは、ＤＮＡの１０００塩基毎に１回起こりうる。ＳＮＰは疾患プロセスに関
与していることがあるが、大多数は疾患に関連していないことがある。このよう
なＳＮＰｓの発生に基づいた遺伝子マップが与えられると、個体を、それらの個
々のゲノムにおけるＳＮＰｓの特定のパターンに依存して遺伝子カテゴリーに分
類することができる。このような方式で、処置養生法は、このような遺伝的に同
様な個体の間で共通でありうる特質を考慮して、遺伝的に同様な個体のグループ
に適合させることができる。
【０２２３】 別法として、「候補遺伝子アプローチ」（ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｇｅｎｅ ａ
ｐｐｒｏａｃｈ）と呼ばれる方法を利用して薬剤応答を予言する遺伝子を同定す
ることができる。この方法に従えば、薬剤標的をコードしている遺伝子が知られ
ている（例えば、本発明のＣＳＡＰＫタンパク質又はＣＳＡＰＫ受容体）ならば
、その遺伝子のすべての共通の変異体（ｃｏｍｍｏｎ ｖａｒｉａｎｔｓ）を母
集団において相当容易に同定することができ、そして他に対する遺伝子の１つの
バージョンを有することが特定の薬剤応答と関連しているかどうかを決定するこ
とができる。
【０２２４】 例示的態様として、薬剤代謝酵素の活性は、薬剤作用の強さ及び期間の両方の
主要な決定因（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）である。薬剤代謝酵素の遺伝的多形性
（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ ２（ＮＡＴ ２）及びシトクロー
ムＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｃ１９）は、何故或る患者が予想され
た薬剤効果を得ないか又は標準の且つ安全な用量の薬剤を取り込んだ後誇大な（
ｅｘａｇｇｅｒａｔｅｄ）薬剤応答及びひどい毒性を示すかに関する説明を与え
た。これらの多形性は、母集団において２つの表現型、広範な代謝剤（ｅｘｔｅ
ｎｓｉｖｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＥＭ）及び劣悪な代謝剤（ｐｏｏｒ
ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＰＭ）において発現される。ＰＭの有病率は異なる
母集団の間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードしている遺伝子は高度に多
形性でありそしていくつかの突然変異がＰＭにおいて同定され、そられはすべて
機能的ＣＹＰ２Ｄ６の不存在をもたらした。ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｃ１９の
劣悪な代謝剤は、それらが標準用量を受け取るとき非常にしばしば、誇大な薬剤
応答及び副作用を経験する。代謝産物が活性な治療的モイエティ（ｔｈｅｒａｐ
ｅｕｔｉｃ ｍｏｉｅｔｙ）であるならば、そのＣＹＰ２Ｄ６で形成された（Ｃ
ＹＰ２Ｄ６−ｆｏｒｍｅｄ）代謝産物モルフィンにより媒介されたコデインの鎮
痛効果について証明されたように、ＰＭは治療的応答を示さない。他の極端な場
合は標準用量に応答しないいわゆる超急速代謝剤（ｕｌｔｒａ−ｒａｐｉｄ ｍ
ｅｔａｂｏｌｉｚｅｒｓ）である。最近、超急速代謝の分子的基礎はＣＹＰ２Ｄ
６遺伝子増幅によるものであることが確認された。
【０２２５】 別法として、「遺伝子発現プロフィリング」（ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）と呼ばれる方法を利用して薬剤応答を予言する遺伝子
を同定することができる。例えば、薬剤（例えば、本発明のＣＳＡＰＫ分子又は
ＣＳＡＰＫモジュレーター）を投与された動物の遺伝子発現は毒性に関する遺伝
子経路（ｇｅｎｅ ｐａｔｈｗａｙ）がターンオンされた（ｔｕｒｎｅｄ ｏｎ
）かどうかの指示を与えることができる。
【０２２６】 上記薬理ゲノミックスアプローチの１つより多くから発生した情報を使用して
個体の予防的及び治療的処置のための適当な投与量及び処置養生法を決定するこ
とができる。この知識は、投薬又は薬剤選択に適用されるとき、不利な反応又は
治療の失敗を回避することができ、かくしてＣＳＡＰＫ分子又はＣＳＡＰＫ モジュレーター、例えば本明細書で記載の例示的スクリーニングアッセイの１つ
により同定されたモジュレーターで被験者を処置するとき治療効率又は予防効率
を高めることができる。
【０２２７】 本発明を下記の実施例により更に説明するがこれらの実施例は本発明を限定す
るものとみなすべきではない。本願全体にわたり引用されたすべての参考文献、
特許及び公開特許出願の内容、並びに図面及び配列リストは参照により本明細書
に加入される。
【０２２８】
【実施例】
実施例１：ヒトＣＳＡＰＫｃＤＮＡの同定及び特徴付け この実施例では、ヒトＣＳＡＰＫ−１、ＣＳＡＰＫ−２、ＣＳＡＰＫ−３、Ｃ
ＳＡＰＫ−４及びＣＳＡＰＫ−５をコードしている遺伝子（それぞれ、ｐｊｃｈ
ｒｂ０１４ｇ０５、ｐｊｃｈｒｂ０８６ｇ０１、ｐｊｌｈｂａ１９１ａ０８、ｐ
ｊｃｈｒｂ００２ｄ０４、及びｐｊｃｈｒｂ１５５ａ０１とも呼ばれる）の同定
及び特徴付けを述べる。ＣＳＡＰＫ−２の４つのスプライス変異体（ｓｐｌｉｃ
ｅ ｖａｒｉａｎｔｓ）も同定され、これらは本明細書ではＣＳＡＰＫ−２ａ、
ＣＳＡＰＫ−２ｂ、ＣＳＡＰＫ−２ｃ及びＣＳＡＰＫ−２ｄと呼ばれる。
【０２２９】 ヒトＣＳＡＰＫｃＤＮＡの単離 本発明は、少なくとも部分的に、ＣＳＡＰＫファミリーの５つのヒト遺伝子コ
ード化メンバーの発見に基づいている。ヒトＣＳＡＰＫファミリーメンバーは虚
血起源及び特発性（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ）起源のうっ血性心不全にかかってい
る被験者から得られた組織から製造されたｃＤＮＡライブラリーから単離された
。簡単に言えば、心臓組織サンプルは、うっ血性心不全にかかっている患者のバ
イオプシーから得られた。ｍＲＮＡを心臓組織から単離し、そして既知の方法［
例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ
ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：１９８９）に記載の｝を使用してそれからｃＤ
ＮＡライブラリーを調製した。既知のキナーゼとの比較及び／又はキナーゼのタ
ンパク質モチーフのための配列の検査を含む公開タンパク質テータベースにおけ
る相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｓ）との比較に続いて正のクローン（ｐｏｓｉｔｉｖ
ｅ ｃｌｏｎｅｓ）を単離した。
【０２３０】 正のクローンの配列が決定されそしてオープンリーディングフレームを含有す
ることが見いだされた。ヒトＣＳＡＰＫ−１タンパク質をコードしているヌクレ
オチド配列が図１に示されておりそして配列番号１として示される。この核酸に
よりコードされたタンパク質は約３０２個のアミノ酸を含有して成り、図１に示
されそして配列番号２として示されたアミノ酸配列を有している。配列番号１の
コード化領域（オープンリーディングフレーム）は配列番号３として示される。
ヒトＣＳＡＰＫ−１の全コード化領域を含有して成るクローンは２０１１０−２
２０９バージニア州、マナッサス、ユニバーシティブールバード１０８０１のア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣR）に１９９８年１０
月２７日に寄託され、そして受託番号、２０３３０８を割り当てられている。
【０２３１】 ヒトＣＳＡＰＫ−２タンパク質をコードしているヌクレオチド配列が図２に示
されておりそして配列番号４として示される。この核酸によりコードされたタン
パク質は約４５５個のアミノ酸を含有して成り、図２に示されそして配列番号５
として示されたアミノ酸配列を有している。配列番号４のコード化領域（オープ
ンリーディングフレーム）は配列番号６として示される。ヒトＣＳＡＰＫ−２の
全コード化領域を含有して成るクローンは２０１１０−２２０９バージニア州、
マナッサス、ユニバーシティブールバード１０８０１のアメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション（ＡＴＣＣR）に１９９８年１０月２７日に寄託され、
そして受託番号、２０３３０６を割り当てられている。
【０２３２】 ＣＳＡＰＫ−２の４つのスプライス変異体も同定された。これらの変異体は図
７（ｃＤＮＡについて）及び図８（タンパク質について）に略図で示される。開
始メチオニン及びフレーム内停止コドン（ｉｎ−ｆｒａｍｅ ｓｔｏｐ ｃｏｄ
ｏｎｓ）が、頂部に示されたＣＳＡＰＫ−２クローンに関して各スプライス変異
体クローンについて示される。二重特異性キナーゼ触媒ドメインも示される。
ＣＳＡＰＫ−２ａ（クローン１．１）ヌクレオチド配列（クローンｚｃｈｒ８６
ＳＡ００４及びｊｃｈｒｂ０８６ｇ０１の一部を含む）が図９に示されておりそ
して配列番号１６として示される。
【０２３３】 ＣＳＡＰＫ−２ｂ（クローン２）ヌクレオチド配列（クローンｊｔｈｒｃ１６
９ｆ０３及びｊｔｈｒｃ０８９ｄ０５及びｊｃｈｒｂ０８６ｇ０１の一部を含む
）が図１０に示されておりそして配列番号１７として示される。このクローンは
同定され及び／又は肺動脈平滑筋（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｓｍｏ
ｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ）において発現される。
【０２３４】 ＣＳＡＰＫ−２ｃ（クローン３）ヌクレオチド配列（クローンｊｔｈｖｂ０２
５ｃ０５、ｊｃｈｒｂ１１６ｂ０８、ｊｔｈｋａ１４２ｄｆ１及びｊｃｈｒｂ０
８６ｇ０１の一部を含む）が図１１に示されておりそして配列番号１８として示
される。このクローンは同定されており及び／又は哺乳動物上皮細胞及び角化細
胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ）において発現される。
【０２３５】 ＣＳＡＰＫ−２ｄ（クローン４）ヌクレオチド配列（クローンｊｏｈｎｃ０５
１ａ０１及びｊｃｈｒｂ０８６ｇ０１の一部を含む）が図１２に示されておりそ
して配列番号１９として示される。このクローンは同定されており及び／又は結
腸乃至肝臓転移組織（ｃｏｌｏｎ ｔｏ ｌｉｖｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ
ｔｉｓｓｕｅｓ）において発現される。
【０２３６】 ヒトＣＳＡＰＫ−３タンパク質をコードしているヌクレオチド配列が図３に示
されておりそして配列番号７として示される。この核酸によりコードされたタン
パク質は約５８１個のアミノ酸を含有して成り、図３に示されそして配列番号８
として示されたアミノ酸配列を有している。配列番号７のコード化領域（オープ
ンリーディングフレーム）は配列番号９として示される。ヒトＣＳＡＰＫ−３の
全コード化領域を含有して成るクローンは２０１１０−２２０９バージニア州、
マナッサス、ユニバーシティブールバード１０８０１のアメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション（ＡＴＣＣR）に１９９８年１０月２７日に寄託され、
そして受託番号、２０３３０９を割り当てられている。
【０２３７】 ヒトＣＳＡＰＫ−４タンパク質をコードしているヌクレオチド配列が図４に示
されておりそして配列番号１０として示される。この核酸によりコード化された
タンパク質は約１６０個のアミノ酸を含有して成り、図４に示されそして配列番
号１１として示されたアミノ酸配列を有している。配列番号１０のコード化領域
（オープンリーディングフレーム）は配列番号１２として示される。ヒトＣＳＡ
ＰＫ−４の全コード化領域を含有して成るクローンは２０１１０−２２０９バー
ジニア州、マナッサス、ユニバーシティブールバード１０８０１のアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣR）に１９９８年１０月２７日に
寄託され、そして受託番号、２０３３０７を割り当てられている。
【０２３８】 ヒトＣＳＡＰＫ−５タンパク質をコードしているヌクレオチド配列が図５に示
されておりそして配列番号１３として示される。この核酸によりコードされたタ
ンパク質は約４４４個のアミノ酸を含有して成り、図５に示されそして配列番号
１４として示されたアミノ酸配列を有している。配列番号１３のコード化領域（
オープンリーディングフレーム）は配列番号１５として示される。ヒトＣＳＡＰ
Ｋ−５の全コード化領域を含有して成るクローンは２０１１０−２２０９バージ
ニア州、マナッサス、ユニバーシティブールバード１０８０１のアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣR）に１９９８年１０月２７日に寄
託され、そして受託番号、２０３３０５を割り当てられている。
【０２３９】 ヒトＣＳＡＰＫ分子の分析 ヒトＣＳＡＰＫ−１のヌクレオチド配列の、１００のスコア及び１２の語長を
使用する、ＢＬＡＳＴＩＮ１．４．９サーチ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．
（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３）は、ＣＳＡＰＫ−１がヒ
トプロティンキナーゼＨＰＫ−１コード化配列（受託番号、Ｖ２３８３１）に類
似していることを示した。この核酸分子はヌクレオチド３８８〜１２１４にわた
ってＣＳＡＰＫ−１と約７０％同一である。
【０２４０】 ＣＳＡＰＫ−２は、セリン／トレオニンキナーゼのためのヒトＭＳＴｍＲＮＡ
（受託番号、Ｚ４８６１５）に類似している。この核酸分子はヌクレオチド４８
２〜８０５にわたってＣＳＡＰＫ−２と約５４％同一である。
【０２４１】 ＣＳＡＰＫ−３はヒトｃＤＮＡクローンＩＭＡＧＥ：１２５７３２７（受託番
号、ＡＡ７４６６５３）に類似している。この核酸分子は、ヌクレオチド２０６
８〜２４３０にわたってＣＳＡＰＫ−３と約９９％同一である。
【０２４２】 ＣＳＡＰＫ−４はハツカネズミ（Ｍｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ｃＤＮＡクローン
９０２１９３（受託番号、ＡＡ５１６８００）に類似している。この核酸分子は
、ヌクレオチド３２１〜７５５にわたってＣＳＡＰＫ−４と約８６％同一である
。
【０２４３】 ＣＳＡＰＫ−５は、ＫＩＡＡ０５５１タンパク質のための注釈のない（ｎｏｎ
ａｎｎｏｔａｔｅｄ）ヒトｍＲＮＡ（受託番号、ＡＢ０１１１２３）に類似し
ている。この核酸分子は、ヌクレオチド１〜１３３３にわたってＣＳＡＰＫ−５
と約１００％同一である。
【０２４４】 ＣＳＡＰＫｍＲＮＡの組織分布 この実施例はノーザンブロットハイブリダイゼーションにより決定されたＣＳ
ＡＰＫｍＲＮＡの組織分布を説明する。
【０２４５】 種々のＲＮＡサンプルでのノーザンブロットハイブリダイゼーションを標準条
件下に行い、そしてストリンジェント条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔ
ｉｏｎｓ）、即ち６５℃で０．２Ｘ ＳＳＣ、の下に洗浄した。ＤＮＡプローブ
を、供給会社の教示に従ってプライム−イット キット（Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔ ｋ
ｉｔ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して32Ｐ−ｄ
ＣＴＰで放射能標識した。ヒトｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔ
ｏ，ＣＡからのＭｕｌｔｉ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｉ及びＭｕｌｔ
ｉ Ｔｉｓｓｕｅ ＮｏｒｔｈｅｒｎＩＩ）を含むフィルターをエクスプレスハ
イブ（ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ）ハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
）においてプロービングし（ｐｒｏｂｅｄ）そして製造会社の推奨に従って高い
ストリンジェンシーで洗浄した。
【０２４６】 ＣＳＡＰＫ−１メッセージは主として心臓、骨格筋又は胎盤で検出された。Ｃ
ＳＡＰＫ−２メッセージは、主として筋肉、例えば骨格筋又は心筋で検出された
。ＣＳＡＰＫ−３メッセージは主として心臓、骨格筋、脳、胎盤、肺、肝臓、腎
臓及び膵臓で検出された。ＣＳＡＰＫ−４メッセージは主として骨格筋で検出さ
れた。
【０２４７】 実施例２：バクテリア細胞における組換えタンパク質の発現 この実施例では、ＣＳＡＰＫを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で組換えグルタチオ
ン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合ポリペプチドとして発現させ、この
融合ポリペプチドを単離しそして特徴付ける。特定的には、ＣＳＡＰＫをＧＳＴ
に融合させ、この融合ポリペプチドを大腸菌、例えばＰＥＢ１９９株中で発現さ
せる。ＰＥＢ１９９中でのＧＳＴ−ＣＳＡＰＫ融合タンパク質の発現はＩＰＴＧ
により誘導される。組換え融合ポリペプチドを、グルタチオンビーズ上でのアフ
ィニティクロマトグラフィーにより、誘導されたＰＥＢ１９９株の粗バクテリア
溶解物（ｃｒｕｄｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｙｓａｔｅｓ）から精製する。バ
クテリア溶解物から精製されたポリペプチドのポリアクリルアミドゲル電気泳動
分析を使用して、得られる融合ポリペプチドの分子量を決定する。
【０２４８】 実施例３：ＣＯＳ細胞中での組換えＣＳＡＰＫタンパク質の発現 ＣＯＳ細胞中でＣＳＡＰＫ遺伝子を発現するために、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によるｐｃＤＮＡ／Ａｍ
ｐベクターを使用する。このベクターはＳＶ４０複製起点、アンピシリン耐性遺
伝子、大腸菌複製起点、ＣＭＶプロモーター、それに続くポリリンカー領域及び
ＳＶ４０イントロン及びポリアデニル化部位を含む。全体のＣＳＡＰＫタンパク
質をコードする断片及び該断片のその３'末端にフレーム内で融合した（ｆｕｓ
ｅｄ ｉｎ−ｆｒａｍｅ）ＨＡタグ（ＨＡ−ｔａｇ）（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．（１９８４）Ｃｅｌｌ ３７：７６）又はＦＬＡＧタグ（ＦＬＡＧ ｔａｇ
）をベクターのポリリンカー領域にクローニングし、それにより組換えタンパク
質の発現をＣＭＶプロモーターの制御下に置く。
【０２４９】 このプラスミドを構築するために、ＣＳＡＰＫ ＤＮＡ配列を２つのプライマ
ーを使用してＰＣＲにより増幅する。５'プライマーは重要な制限部位、それに
続く、開始コドンから出発するＣＳＡＰＫコード化配列の約２０ヌクレオチドを
含み、３'末端配列は重要な他の制限部位に対して相補的な配列、翻訳停止コド
ン、ＨＡタグもしくはＦＬＡＧタグ及びＣＳＡＰＫコード化配列の最後の２０ヌ
クレオチドを含む。ＰＣＲ増幅された断片及びｐＣＤＮＡ／Ａｍｐベクターを適
当な制限酵素で消化し、そしてこのベクターをＣＩＡＰ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ
ａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を使用して脱リン酸化する（
ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ）。好ましくは、選ばれた２つの制限部位は
異なっており、それによりＣＳＡＰＫ遺伝子は正しい方位（ｏｒｉｅｎｔａｔｉ
ｏｎ）において挿入される。連結反応混合物（ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒ
ｅ）を大腸菌細胞（カリフォルニア州、Ｌａ ＪｏｌｌａのＳｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能な株ＨＢ１０１、ＤＨ５ａ、
ＳＵＲＥを使用することができる）中に形質転換させ、形質転換された培養物を
アンピシリン培地プレート上で平板培養し（ｐｌａｔｅｄ）、耐性コロニーを選
ぶ。プラスミドＤＮＡを形質転換体から単離しそして正しい断片の存在について
制限分析により検査する。
【０２５０】 次いで、ＣＯＳ細胞を、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈法、Ｄ
ＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション又はエレク
トロポレーションを使用してＣＳＡＰＫ−ｐｃＤＮＡ／ＡｍｐプラスミドＤＮＡ
でトランスフェクションする。宿主細胞をトランスフェクションするための他の
適当な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ．ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，
１９８９に見いだすことができる。ＣＳＡＰＫポリペプチドの発現は、放射能標
識（マサチューセッツ州、ボストンのＮＥＮから入手可能な35Ｓ−メチオニン又
は35Ｓ−システイン）により及びＨＡ特異的モノクローナル抗体を使用して免疫
沈降法（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ． ａ
ｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐ
ｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）により検
出される。簡単に言えば、細胞を35Ｓ−メチオニン（又は35Ｓ−システイン）で
８時間標識する。次いで培養培地を集め、細胞を洗剤（ＲＩＰＡ緩衝剤、１５０
ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳ、０．５％ＤＯＣ、５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５）を使用して溶解させる。細胞溶解物及び培養培地の両
方をＨＡ特異的モノクローナル抗体で沈殿させる。次いで沈殿したポリペプチド
をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。
【０２５１】 別法として、ＣＳＡＰＫコード化配列を含むＤＮＡを適当な制限部位を使用し
てｐＣＤＮＡ／Ａｍｐベクターのポリリンカーに直接クローニングする。得られ
るプラスミドを上記した方法でＣＯＳ細胞中にトランスフェクションし、そして
放射能標識及びＣＳＡＰＫ特異的モノクローナル抗体を使用する免疫沈降法によ
りＣＳＡＰＫポリペプチドの発現を検出する。
【０２５２】 実施例４：ＣＳＡＰＫ−２（ＭＬＫ）の染色体マッピング ＣＳＡＰＫ−２（ＭＬＫ）遺伝子を染色体マッピングするために、ｊｃｈｒｂ
０８６ｇ０１（ＣＳＡＰＫ−２）の配列に基づいて下記のプライマー：フォーワ
ード（Ｆｏｒｗａｒｄ）−５'−ＧＴＣＣＧＧＴＧＧＡＡＧＴＡＴＡＡＴＡＣＴ
ＴＴＧＴＣ−３'（配列番号２０）及びリバース（Ｒｅｖｅｒｓｅ）−５'−ＣＴ
ＡＴＴＴＴＧＡＧＧＡＧＣＴＴＣＴＴＴＡＣＡＧＣＣ−３'（配列番号２１）を
デザインした。これらのプライマー及びＰＣＲを使用して、ヒト対照細胞系ＤＮ
Ａ（ｈｕｍａｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ＤＮＡ）及び対照ハム
スター細胞系ＤＮＡ（ｃｏｎｔｒｏｌ ｈａｍｓｔｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ
ＤＮＡ）から１８５ｂｐ生成物を増幅した。次いで、これらのプライマーを使用
してジェネブリッジ ４ ラディエーションハイブリッドパネル（Ｇｅｎｅｂｒ
ｉｄｇｅ ４ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｈｙｂｒｉｄ Ｐａｎｅｌ）からの重複し
ている（ｉｎ ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）９３ＤＮＡｓを増幅した。
【０２５３】 ５μｌのテンプレートＤＮＡ（１０ｎｇ／μｌ）、１．５μｌの１０Ｘ Ｐｅ
ｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＰＣＲ緩衝液、１．２μｌのＰｈａｒｍａｃｉａ ｄＮ
ＴＰ混合物（２．５ｍＭ）、１．１５μｌのフォーワードプライマー６．６μＭ
、１．１５μｌのリバースプライマー６．６μモＭ、５μｌのＧｉｂｃｏ／ＢＲ
Ｌ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ（０５Ｕ／μｌ）［ホットスタート（Ｈｏｔ Ｓ
ｔａｒｔ）］を使用し、反応混合物を１０分間９５℃に付し、続いて９４℃で４
０分間、５５℃で４０分間、７２℃で４０分間の３５サイクルに付し、次いで５
分間７２℃に付すことによりＰＣＲ反応を行った。
【０２５４】 ＰＣＲ反応の生成物を２％アガロースゲルに通し、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ（１Ｘ
ＴＢＥ中１：１０，０００希釈率）で後染色し（ｐｏｓｔ−ｓｔａｉｎｅｄ）、
そしてモレキュラー・ダイナミミックス５９５・フルオリメイガー（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ５９５ Ｆｌｕｏｒｉｍａｇｅｒ）で走査した。
【０２５５】 下記は上記９３ジェネブリッジ ４ ハイブリッドＤＮＡｓについてのベクタ
ーデータである。これらは順に１〜９３である。「１」はポジティブな結果であ
り、「-」はネガテイブな結果であり、「？」はあいまいな結果である。
【０２５６】
【数１】
【０２５７】 ＲＨ連結（ＲＨ ｌｉｎｋａｇｅ）分析はマップ・マネージャーＱＴｂ２７・ソ
フトウエア・パッケージ（Ｍａｐ Ｍａｎａｇｅｒ ＱＴｂ２７ ｓｏｆｔｗａ
ｒｅ ｐａｃｋａｇｅ）を使用して行った。
【０２５８】 クローンｊｃｈｒｂ０８６ｇ０１（ＣＳＡＰＫ−２又はＭＬＫ）は、ヒト染色
体２、ホワイトヘッド・インスティテュート・フレームワーク・マーカーＷＩ−
５５３８（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｍ
ａｒｋｅｒ ＷＩ−５５３８）に対する１６．５ｃＲ3000テロメリック（ｔｅｌ
ｏｍｅｒｉｃ）及びホワイトヘッド・インスティテュート・フレームワーク・マ
ーカーＷＩ−５５５５の１６．５ｃＲ3000セントロメリック（ｃｅｎｔｒｏｍｅ
ｒｉｃ）にマッピングすることが見いだされた。連結（ｌｉｎｋａｇｅ）につい
てのＬＯＤスコアはＷＩ−５５３８及びＷＩ−５５５５の両方について１５．３
であった。この領域は細胞遺伝学的位置（ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ｌｏｃａｔ
ｉｏｎ）２ｑ２３−３１に相当する。
【０２５９】 実施例５：ＣＳＡＰＫ−２（ＭＬＫ））トランスジェニック動物の発生 Ｎ−末端Ｈｉｓ−タグ付きＭＬＫ（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｈｉｓ−ｔａｇｇ
ｅｄ ＭＬＫ）（ＣＳＡＰＫ−２）ｃＤＮＡを、当該技術分野で知られた技術を
使用して心臓特異的α−ミオシンＨ鎖プロモーター（ｃａｒｄｉａｃ−ｓｐｅｃ
ｉｆｉｃ α−ｍｙｏｓｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｐｒｏｍｏｔｏｒ）及
びヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列に連結させた（図６参照）。こ
の構築物を受精マウス卵の雄性前核（ｍａｌｅ ｐｒｏｎｕｃｌｅｕｓ）にマイ
クロインジェクションし、次いでこれを偽妊娠養母（ｐｓｅｕｄｏｐｒｅｇｎａ
ｎｔ ｆｏｓｔｅｒ ｍｏｔｈｅｒ）に移植した。サザンブロット分析によりト
ランスジェニック動物が同定され、そして始祖マウス（ｆｏｕｎｄｅｒ ｍｉｃ
ｅ）を個々の系（ｌｉｎｅ）の増殖のために非トランスジェニック群と交配させ
た（ｂｒｅｄ）。
【０２６０】 均等物 当業者は、本明細書に記載された特定の態様に対する多くの均等物をルーチン
な実験により認識するか又は確認することができるであろう。このような均等物
は特許請求の範囲により包含されることを意図する。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒトＣＳＡＰＫ−１のｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を描く。ヌクレオ
チド配列は配列番号１の核酸１ないし４１３７に対応する。アミノ酸配列は配列
番号２のアミノ酸１ないし３０２に相当する。ヒトＣＳＡＰＫ−１遺伝子の５’
および３’非翻訳領域を伴わないコーディング領域を配列番号３に示す。
【図２】 ヒトＣＳＡＰＫ−２のｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を描く。ヌクレオ
チド配列は配列番号４の核酸１ないし２１２０に対応する。アミノ酸配列は配列
番号５のアミノ酸１ないし４５５に対応する。ヒトＣＳＡＰＫ−２遺伝子の５’
および３’非翻訳領域を伴わないコーディング領域を配列番号６に示す。
【図３】 ヒトＣＳＡＰＫ−３のｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を描く。ヌクレオ
チド配列は配列番号７の核酸１ないし２４５４に対応する。アミノ酸配列は配列
番号８のアミノ酸１ないし５８１に対応する。ヒトＣＳＡＰＫ−３遺伝子の５’
および３’非翻訳領域を伴わないコーディング領域を配列番号９に示す。
【図４】 ヒトＣＳＡＰＫ−４のｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を描く。ヌクレオ
チド配列は配列番号１０の核酸１ないし１８６４に対応する。アミノ酸配列は配
列番号１１のアミノ酸１ないし１６０に対応する。ヒトＣＳＡＰＫ−４遺伝子の
５’および３’非翻訳領域を伴わないコーディング領域を配列番号１２に示す。
【図５】 ヒトＣＳＡＰＫ−５のｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を描く。ヌクレオ
チド配列は配列番号１３の核酸１ないし１３３３に対応する。アミノ酸配列は配
列番号１４のアミノ酸１ないし４４４に対応する。ヒトＣＳＡＰＫ−５遺伝子の
５’および３’非翻訳領域を伴わないコーディング領域を配列番号１５に示す。
【図６】 ＭＬＫ（ＣＳＡＰＫ−２）トランスジェニック動物を創製するのに使用された
ＭＬＫ（ＣＳＡＰＫ−２）過剰発現構築物の略図を描く。
【図７】 ＭＬＫ（ＣＳＡＰＫ−２）のｃＤＮＡのスプライス変異体の略図である。
【図８】 ＭＬＫ（ＣＳＡＰＫ−２）のスプライス変異体から生じるタンパク質の略図で
ある。
【図９】 ヒトスプライス変異体ＣＳＡＰＫ−２ａのｃＤＮＡ配列を描く。該ヌクレオチ
ド配列は配列番号１６の核酸１ないし２１９４に対応する。
【図１０】 ヒトスプライス変異体ＣＳＡＰＫ−２ｂのｃＤＮＡ配列を描く。該ヌクレオチ
ド配列は配列番号１７の核酸１ないし２２５４に対応する。
【図１１】 ヒトスプライス変異体ＣＳＡＰＫ−２ｃのｃＤＮＡ配列を描く。該ヌクレオチ
ド配列は配列番号１８の核酸１ないし２２７２に対応する。
【図１２】 ヒトスプライス変異体ＣＳＡＰＫ−２ｄのｃＤＮＡ配列を描く。該ヌクレオチ
ド配列は配列番号１９の核酸１ないし２０６９に対応する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｚ ４Ｈ０４５ 9/12 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 Ｍ 33/53 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，Ｊ Ｐ，ＵＳ Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 AA40 BB20 CB01 DA12 DA13 DA14 DA20 DA36 DA77 FB01 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA10 BA44 CA04 CA09 CA11 DA01 DA02 DA05 DA11 EA01 EA02 EA03 EA04 GA11 HA01 HA03 HA12 HA15 4B050 CC01 CC03 DD11 LL01 LL03 4B063 QA01 QA19 QQ01 QQ27 QQ42 QQ52 QR08 QR32 QR42 QR55 QR57 QR59 QR62 QS05 QS25 QS34 QS36 QX02 4B065 AA01X AA57X AA87X AA93Y AB01 BA02 CA29 CA44 CA46 4H045 AA11 CA40 DA76 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (26)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含んで成る
    核酸分子； （ｂ）配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子； （ｃ）配列番号４に示されるヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子； （ｄ）配列番号６に示されるヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子； （ｅ）配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子； （ｆ）配列番号９に示されるヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子； （ｇ）配列番号１０に示されるヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子； （ｈ）配列番号１２に示されるヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子； （ｉ）配列番号１３に示されるヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子； （ｊ）配列番号１５に示されるヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子； （ｋ）配列番号１６に示されるヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子； （ｌ）配列番号１７に示されるヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子； （ｍ）配列番号１８に示されるヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子；および
    （ｎ）配列番号１９に示されるヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子 より成る群から選択される単離された核酸分子。
  2. 【請求項２】 （ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリ
    ペプチドをコードする核酸分子； （ｂ）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードす
    る核酸分子； （ｃ）配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードす
    る核酸分子； （ｄ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコード
    する核酸分子；および （ｅ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコード
    する核酸分子 より成る群から選択される単離された核酸分子。
  3. 【請求項３】 （ａ）受託番号２０３３０５としてＡＴＣＣ（商標）に寄託
    されたプラスミド中に含有されるヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子； （ｂ）受託番号２０３３０６としてＡＴＣＣ（商標）に寄託されたプラスミド中
    に含有されるヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子； （ｃ）受託番号２０３３０７としてＡＴＣＣ（商標）に寄託されたプラスミド中
    に含有されるヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子； （ｄ）受託番号２０３３０８としてＡＴＣＣ（商標）に寄託されたプラスミド中
    に含有されるヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子；および （ｅ）受託番号２０３３０９としてＡＴＣＣ（商標）に寄託されたプラスミド中
    に含有されるヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子 より成る群から選択される単離された核酸分子。
  4. 【請求項４】 （ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド
    の天然に存在する対立遺伝子変異体をコードする核酸分子（ここで、該核酸分子
    が、ストリンジェントな条件下で配列番号１もしくは３を含んで成る核酸分子に
    ハイブリダイズする）； （ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドの天然に存在する対
    立遺伝子変異体をコードする核酸分子（ここで、該核酸分子が、ストリンジェン
    トな条件下で配列番号４、６、１６、１７、１８もしくは１９を含んで成る核酸
    分子にハイブリダイズする）； （ｃ）配列番号８のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドの天然に存在する対
    立遺伝子変異体をコードする核酸分子（ここで、該核酸分子が、ストリンジェン
    トな条件下で配列番号７もしくは９を含んで成る核酸分子にハイブリダイズする
    ）； （ｄ）配列番号１１のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドの天然に存在する
    対立遺伝子変異体をコードする核酸分子（ここで、該核酸分子が、ストリンジェ
    ントな条件下で配列番号１０もしくは１２を含んで成る核酸分子にハイブリダイ
    ズする）；および （ｅ）配列番号１４のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドの天然に存在する
    対立遺伝子変異体をコードする核酸分子（ここで、該核酸分子が、ストリンジェ
    ントな条件下で配列番号１３もしくは１５を含んで成る核酸分子にハイブリダイ
    ズする）； より成る群から選択される単離された核酸分子。
  5. 【請求項５】 ａ）配列番号１、３、４、６、７、９、１０、１２、１５、
    １６、１７、１８もしくは１９のヌクレオチド配列またはその相補物に最低６０
    ％相同であるヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子； ｂ）配列番号１、３、４、６、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、
    １８もしくは１９のヌクレオチド配列またはその相補物を含んで成る核酸の最低
    ２００ヌクレオチドのフラグメントを含んで成る核酸分子； ｃ）配列番号２、５、８、１１もしくは１４のアミノ酸配列に最低約６０％相同
    なアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードする核酸分子；および ｄ）配列番号２、５、８、１１もしくは１４のアミノ酸配列を含んで成るポリペ
    プチドのフラグメントをコードする核酸分子（ここで、該フラグメントが、配列
    番号２、５、８、１１もしくは１４のアミノ酸配列の最低１５の連続するアミノ
    酸残基を含んで成る） より成る群から選択される単離された核酸分子。
  6. 【請求項６】 ストリンジェントな条件下で、請求項１、２、３、４もしく
    は５のいずれか１つに記載の核酸分子にハイブリダイズする単離された核酸分子
    。
  7. 【請求項７】 請求項１、２、３、４もしくは５のいずれか１つに記載の核
    酸分子のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含んで成る単離さ
    れた核酸分子。
  8. 【請求項８】 請求項１、２、３、４もしくは５のいずれか１つに記載の核
    酸分子および異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離
    された核酸分子。
  9. 【請求項９】 請求項１、２、３、４もしくは５のいずれか１つに記載の核
    酸分子を含んで成るベクター。
  10. 【請求項１０】 発現ベクターである、請求項９記載のベクター。
  11. 【請求項１１】 請求項９記載のベクターでトランスフェクションされた宿
    主細胞。
  12. 【請求項１２】 請求項９記載のベクターでトランスフェクションされた宿
    主細胞を適切な培地中で培養してそれによりポリペプチドを産生させることを含
    んで成る、ポリペプチドの製造方法。
  13. 【請求項１３】 ａ）配列番号２、５、８、１１もしくは１４のアミノ酸配
    列を含んで成るポリペプチドのフラグメント（ここで、該フラグメントは、配列
    番号２、５、８、１１もしくは１４の最低１５の連続するアミノ酸を含んで成る
    ）； ｂ）配列番号２、５、８、１１もしくは１４のアミノ酸配列を含んで成るポリペ
    プチドの天然に存在する対立遺伝子変異体（ここで、該ポリペプチドは、ストリ
    ンジェントな条件下で配列番号１、３、４、６、７、９、１０、１２、１３、１
    ５、１６、１７、１８もしくは１９を含んで成る核酸分子にハイブリダイズする
    核酸分子によりコードされる）； ｃ）配列番号１、３、４、６、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、
    １８もしくは１９のヌクレオチド配列を含んで成る核酸に最低６０％相同である
    ヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子によりコードされるポリペプチド； ｄ）配列番号２、５、８、１１もしくは１４のアミノ酸配列に最低６０％相同で
    あるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド より成る群から選択される単離されたポリペプチド。
  14. 【請求項１４】 配列番号２、５、８、１１もしくは１４のアミノ酸配列を
    含んで成る、請求項１３記載の単離されたポリペプチド。
  15. 【請求項１５】 異種アミノ酸配列をさらに含んで成る、請求項１３記載の
    ポリペプチド。
  16. 【請求項１６】 請求項１３記載のポリペプチドに選択的に結合する抗体。
  17. 【請求項１７】 ａ）請求項１３記載のポリペプチドに選択的に結合する化
    合物とサンプルを接触させること；および ｂ）該化合物がサンプル中のポリペプチドに結合するかどうかを測定して、それ
    によりサンプル中の請求項１３記載のポリペプチドの存在を検出すること を含んで成る、サンプル中の請求項１３記載のポリペプチドの存在の検出方法。
  18. 【請求項１８】 ポリペプチドに結合する化合物が抗体である、請求項１７
    記載の方法。
  19. 【請求項１９】 請求項１３のポリペプチドに選択的に結合する化合物およ
    び使用説明書を含んで成るキット。
  20. 【請求項２０】 ａ）請求項１、２、３、４もしくは５のいずれか１つに記
    載の核酸分子に選択的にハイブリダイズする核酸プローブもしくはプライマーと
    サンプルを接触させること；および ｂ）核酸プローブもしくはプライマーがサンプル中の核酸分子に結合するかどう
    かを測定して、それによりサンプル中の請求項１、２、３、４もしくは５のいず
    れか１つに記載の核酸分子の存在を検出すること を含んで成る、サンプル中の請求項１、２、３、４もしくは５のいずれか１つの
    核酸分子の存在の検出方法。
  21. 【請求項２１】 サンプルがｍＲＮＡ分子を含んで成り、そして核酸プロー
    ブと接触される、請求項２０記載の方法。
  22. 【請求項２２】 請求項１、２、３、４もしくは５のいずれか１つの核酸分
    子に選択的にハイブリダイズする化合物および使用説明書を含んで成るキット。
  23. 【請求項２３】 ａ）請求項１３記載のポリペプチド、もしくはポリペプチ
    ドを発現する細胞を試験化合物と接触させること；および ｂ）ポリペプチドが試験化合物に結合するかどうかを測定すること を含んで成る、請求項１３記載のポリペプチドに結合する化合物の同定方法。
  24. 【請求項２４】 ポリペプチドへの試験化合物の結合が、 ａ）試験化合物／ポリペプチドの結合の直接検出による結合の検出； ｂ）競争結合アッセイを使用する結合の検出；および ｃ）ＣＳＡＰＫ活性のアッセイを使用する結合の検出 より成る群から選択される方法により検出される、請求項２３記載の方法。
  25. 【請求項２５】 ポリペプチド、もしくはポリペプチドを発現する細胞を、
    ポリペプチドの活性を調節するのに十分な濃度の、請求項１３記載のポリペプチ
    ドに結合する化合物と接触させることを含んで成る、請求項１３記載のポリペプ
    チドの活性の調節方法。
  26. 【請求項２６】 ａ）請求項１３記載のポリペプチドを試験化合物と接触さ
    せること；および ｂ）ポリペプチドの活性に対する試験化合物の影響を測定して、それによりポリ
    ペプチドの活性を調節する化合物を同定すること を含んで成る、請求項１３記載のポリペプチドの活性を調節する化合物の同定方
    法。
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