JP2002522506A - インスリン様増殖因子−i受容体に向けられるオリゴヌクレオチドを用いた腫瘍の処置 - Google Patents
インスリン様増殖因子−i受容体に向けられるオリゴヌクレオチドを用いた腫瘍の処置Info
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
腫瘍増殖に対する抵抗性または該増殖の後退を誘導する方法であって、腫瘍細胞を、in vitroまたはex vivoで、一定の期間、アポトーシス促進剤を補った培養に置き、該腫瘍細胞を拡散チャンバーに移し、それにより細胞含有チャンバーを産生し、該チャンバーを治療的に有効な時間、ヒトに挿入し、それにより腫瘍増殖に対する抵抗性または該増殖の後退を誘導することを含む、前記方法。
Description
【0001】発明の分野 本出願は、IGF−IRに向けられるオリゴヌクレオチドで処置した腫瘍細胞
を含む移植拡散チャンバーを用い、ヒトにおいて、腫瘍増殖に対する抵抗性また
は腫瘍増殖の後退を誘導することに関する。発明の背景 哺乳動物において、腫瘍を処置する伝統的な方法には、例えば腫瘍の外科的除
去、毒性処置剤または同系組織試料の注入または移植、化学療法、および放射線
照射などの方法が含まれる。これらの方法各々の最終的な目的は、存在する腫瘍
の増殖を減少させ、好ましくは腫瘍増殖を完全な後退の時点まで停止させること
、および/または将来の腫瘍増殖に対する抵抗性を誘導することである。これら
の方法は、腫瘍細胞と共に、非腫瘍細胞に対しても多くの影響を有する。
を含む移植拡散チャンバーを用い、ヒトにおいて、腫瘍増殖に対する抵抗性また
は腫瘍増殖の後退を誘導することに関する。発明の背景 哺乳動物において、腫瘍を処置する伝統的な方法には、例えば腫瘍の外科的除
去、毒性処置剤または同系組織試料の注入または移植、化学療法、および放射線
照射などの方法が含まれる。これらの方法各々の最終的な目的は、存在する腫瘍
の増殖を減少させ、好ましくは腫瘍増殖を完全な後退の時点まで停止させること
、および/または将来の腫瘍増殖に対する抵抗性を誘導することである。これら
の方法は、腫瘍細胞と共に、非腫瘍細胞に対しても多くの影響を有する。
【0002】 腫瘍および他の新生物形成組織は、自発的にまたは処置に反応し、アポトーシ
スを経験することが知られる。例には、いくつかの種類の白血病、非ホジキンリ
ンパ腫、前立腺腫瘍、膵臓癌、基底および扁平上皮細胞癌腫、乳腺腫瘍、乳癌、
および脂肪パッド肉腫が含まれる。いくつかの抗癌薬剤が標的細胞においてアポ
トーシスを誘導することが示されてきている。Buttyanら, Mol.
Cell. Biol., 1989, 9, 3473−3481;Kauf
mann, Cancer Res., 1989, 49, 5870−58
78;およびBarryら, Biochem. Pharmacol., 1
990, 40, 2353−2362、前記文献はすべて本明細書に完全に援
用される。高体温、低体温、虚血並びに放射線照射、毒素、および化学薬品への
曝露を含む、特定の穏やかな不利な条件は、傷害を受けた細胞のプログラム細胞
死による死を生じる可能性がある。これらの処置の多くはまた、より高い用量で
壊死も生じるであろうことから、細胞に対する穏やかな損傷は、おそらく突然変
異の遺伝を妨げるため、細胞自殺を誘導する可能性がある一方、厳しい条件に対
する曝露は、壊死により、直接細胞死を導くことが示唆されることに注目すべき
である。しかし、死の過程は、迅速であり、そして炎症の量が減少するため、観
察することが困難である。これらの理由のため、アポトーシスの定量化はしばし
ば困難である。アポトーシスの組織学的に可視である段階の持続期間(正常ラッ
ト肝臓では3時間)を測定する方法およびアポトーシスによる細胞損失率を計算
する式が、Burschら, Carcinogenesis, 1990,
11, 847−853に示される。
スを経験することが知られる。例には、いくつかの種類の白血病、非ホジキンリ
ンパ腫、前立腺腫瘍、膵臓癌、基底および扁平上皮細胞癌腫、乳腺腫瘍、乳癌、
および脂肪パッド肉腫が含まれる。いくつかの抗癌薬剤が標的細胞においてアポ
トーシスを誘導することが示されてきている。Buttyanら, Mol.
Cell. Biol., 1989, 9, 3473−3481;Kauf
mann, Cancer Res., 1989, 49, 5870−58
78;およびBarryら, Biochem. Pharmacol., 1
990, 40, 2353−2362、前記文献はすべて本明細書に完全に援
用される。高体温、低体温、虚血並びに放射線照射、毒素、および化学薬品への
曝露を含む、特定の穏やかな不利な条件は、傷害を受けた細胞のプログラム細胞
死による死を生じる可能性がある。これらの処置の多くはまた、より高い用量で
壊死も生じるであろうことから、細胞に対する穏やかな損傷は、おそらく突然変
異の遺伝を妨げるため、細胞自殺を誘導する可能性がある一方、厳しい条件に対
する曝露は、壊死により、直接細胞死を導くことが示唆されることに注目すべき
である。しかし、死の過程は、迅速であり、そして炎症の量が減少するため、観
察することが困難である。これらの理由のため、アポトーシスの定量化はしばし
ば困難である。アポトーシスの組織学的に可視である段階の持続期間(正常ラッ
ト肝臓では3時間)を測定する方法およびアポトーシスによる細胞損失率を計算
する式が、Burschら, Carcinogenesis, 1990,
11, 847−853に示される。
【0003】 増殖因子およびその受容体が、形質転換表現型の確立および維持に必須の役割
を果たす証拠もまた、急速に集積している。増殖因子が形質転換表現型の確立お
よび維持に必須の役割を果たすことは、よく証明されている。IGF−IR遺伝
子を標的化し破壊したマウス胚細胞は、野生型同腹マウスから生成された胚細胞
を容易に形質転換する、SV40 T抗原および/または活性化Ha−rasオ
ンコジーンにより形質転換することが不可能である。Sellら, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 112
17−11221;Sellら, Mol. Cell. Biol., 19
94, 14, 3604−3612;Valentinisら, Oncog
ene, 1994, 9, 825−831;およびCoppolaら, M
ol. Cell. Biol., 1994, 14, 4588−4595
。C6ラット神経膠芽腫細胞における、IGF−IR RNAに対するアンチセ
ンスRNAの発現は、同系ラットにおいて腫瘍形成を停止するだけでなく、確立
された野生型腫瘍の完全な後退も引き起こす。Resnicoffら, Can
cer Res., 1994a, 54, 2218−2222およびRes
nicoffら, Cancer Res., 1994b, 54, 484
8−4850。この知見に関連し、やはり、IGF−I(およびPDGF)がc
−myc誘導アポトーシスから細胞を保護するという、Harringtonら
(EMBO J., 1994, 13, 3286−3295)による報告も
ある。腫瘍における細胞死率の減少は、もちろん、腫瘍増殖の重要な機構である
可能性がある。Baserga, The Biology of Cell
Reproduction, Harvard University Pre
ss,マサチューセッツ州ケンブリッジ, 1985。IGF−IR RNAに
対するアンチセンスRNAを発現している細胞またはIGF−IR RNAに対
するアンチセンスオリゴヌクレオチドと共にプレインキュベーションした細胞は
、同系またはヌードマウスいずれかに注入した際、その腫瘍形成性を完全に失う
。Resnicoffら、1994a、1994b。注入細胞は、アポトーシス
、または少なくとも何らかの型の細胞死を経験すると疑われた。しかし、死につ
つある細胞は、特にin vivoでは迅速に消滅し、そして調べる対象が消失
するため、明らかにするのが非常に困難である。
を果たす証拠もまた、急速に集積している。増殖因子が形質転換表現型の確立お
よび維持に必須の役割を果たすことは、よく証明されている。IGF−IR遺伝
子を標的化し破壊したマウス胚細胞は、野生型同腹マウスから生成された胚細胞
を容易に形質転換する、SV40 T抗原および/または活性化Ha−rasオ
ンコジーンにより形質転換することが不可能である。Sellら, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 112
17−11221;Sellら, Mol. Cell. Biol., 19
94, 14, 3604−3612;Valentinisら, Oncog
ene, 1994, 9, 825−831;およびCoppolaら, M
ol. Cell. Biol., 1994, 14, 4588−4595
。C6ラット神経膠芽腫細胞における、IGF−IR RNAに対するアンチセ
ンスRNAの発現は、同系ラットにおいて腫瘍形成を停止するだけでなく、確立
された野生型腫瘍の完全な後退も引き起こす。Resnicoffら, Can
cer Res., 1994a, 54, 2218−2222およびRes
nicoffら, Cancer Res., 1994b, 54, 484
8−4850。この知見に関連し、やはり、IGF−I(およびPDGF)がc
−myc誘導アポトーシスから細胞を保護するという、Harringtonら
(EMBO J., 1994, 13, 3286−3295)による報告も
ある。腫瘍における細胞死率の減少は、もちろん、腫瘍増殖の重要な機構である
可能性がある。Baserga, The Biology of Cell
Reproduction, Harvard University Pre
ss,マサチューセッツ州ケンブリッジ, 1985。IGF−IR RNAに
対するアンチセンスRNAを発現している細胞またはIGF−IR RNAに対
するアンチセンスオリゴヌクレオチドと共にプレインキュベーションした細胞は
、同系またはヌードマウスいずれかに注入した際、その腫瘍形成性を完全に失う
。Resnicoffら、1994a、1994b。注入細胞は、アポトーシス
、または少なくとも何らかの型の細胞死を経験すると疑われた。しかし、死につ
つある細胞は、特にin vivoでは迅速に消滅し、そして調べる対象が消失
するため、明らかにするのが非常に困難である。
【0004】 細胞増殖の調節におけるIGF−IRの重要性もまた、かなりの証拠により支
持される:1)培養中の多くの細胞種が、IGF−Iにより増殖するよう刺激さ
れ(Goldringら, Crit. Rev. Eukaryot. Ge
ne Expr., 1991, 1, 301−326およびBaserga
ら, Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr.,
1993, 3, 47−61)、そしてこれらの細胞種には、ヒト二倍体線維
芽細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、Tリンパ球、骨髄細胞、軟骨細胞、骨芽細胞と
共に骨髄の幹細胞が含まれる;2)IGF−IRの機能の妨害は、細胞増殖の阻
害につながる――これはIGF−IR RNAに対するアンチセンス発現ベクタ
ーまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを用い、立証されてきている;アンチ
センス戦略は、いくつかの正常細胞種およびヒト腫瘍細胞株において、細胞増殖
を阻害するのに成功した(Basergaら、1994、上記);そして3)増
殖はまた、IGF−Iのペプチド類似体(analogue)(Pietrzk
owskiら, Cell Growth & Diff., 1992a,
3, 199−205およびPietrzkowskiら, Mol. Cel
l. Biol., 1992b, 12, 3883−3889)、またはI
GF−I RNAに対するアンチセンスRNAを発現するベクター(Troja
nら、1993、上記)を用いても阻害することが可能である。IGFオートク
リンまたはパラクリンループはまた、他の増殖因子、ホルモン類(例えば成長ホ
ルモンおよびエストロゲン類)、およびSV40 T抗原およびc−mybなど
のオンコジーンの増殖促進効果に、そしてWT1の場合のように、腫瘍抑制にも
関与している。Basergaら、1994、上記。腫瘍増殖に対する抵抗性の
誘導はまた、例えば、本明細書に完全に援用される米国特許第5,714,17
0号にも開示される。腫瘍におけるIGF−IRの役割の概説は、本明細書に完
全に援用される、Basergaら, Vitamins and Hormo
nes, 1997, 53, 65−98に提供される。
持される:1)培養中の多くの細胞種が、IGF−Iにより増殖するよう刺激さ
れ(Goldringら, Crit. Rev. Eukaryot. Ge
ne Expr., 1991, 1, 301−326およびBaserga
ら, Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr.,
1993, 3, 47−61)、そしてこれらの細胞種には、ヒト二倍体線維
芽細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、Tリンパ球、骨髄細胞、軟骨細胞、骨芽細胞と
共に骨髄の幹細胞が含まれる;2)IGF−IRの機能の妨害は、細胞増殖の阻
害につながる――これはIGF−IR RNAに対するアンチセンス発現ベクタ
ーまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを用い、立証されてきている;アンチ
センス戦略は、いくつかの正常細胞種およびヒト腫瘍細胞株において、細胞増殖
を阻害するのに成功した(Basergaら、1994、上記);そして3)増
殖はまた、IGF−Iのペプチド類似体(analogue)(Pietrzk
owskiら, Cell Growth & Diff., 1992a,
3, 199−205およびPietrzkowskiら, Mol. Cel
l. Biol., 1992b, 12, 3883−3889)、またはI
GF−I RNAに対するアンチセンスRNAを発現するベクター(Troja
nら、1993、上記)を用いても阻害することが可能である。IGFオートク
リンまたはパラクリンループはまた、他の増殖因子、ホルモン類(例えば成長ホ
ルモンおよびエストロゲン類)、およびSV40 T抗原およびc−mybなど
のオンコジーンの増殖促進効果に、そしてWT1の場合のように、腫瘍抑制にも
関与している。Basergaら、1994、上記。腫瘍増殖に対する抵抗性の
誘導はまた、例えば、本明細書に完全に援用される米国特許第5,714,17
0号にも開示される。腫瘍におけるIGF−IRの役割の概説は、本明細書に完
全に援用される、Basergaら, Vitamins and Hormo
nes, 1997, 53, 65−98に提供される。
【0005】 例えば増殖因子および増殖因子受容体などの剤を、形質転換表現型を維持する
または抑制する能力に関し、試験することは、依然として困難である。腫瘍抑制
能力の正確な評価を得るため、試験はin vivoで行わなければならない。
本発明は、患者に対し顕著に減少した副作用で、腫瘍増殖に対する抵抗性または
該増殖の後退を誘導する方法を提供する。発明の概説 本発明は、ヒトにおいて、腫瘍増殖に対する抵抗性を誘導する方法であって、
腫瘍細胞を、in vitroまたはex vivoで、IGF−IRに相補的
なオリゴヌクレオチドと接触させ、そして処置した腫瘍細胞を含む拡散チャンバ
ーを、該ヒトの直筋鞘内に、治療的に有効な時間、移植し、それにより腫瘍増殖
に対する抵抗性を誘導することを含む、前記方法に関する。
または抑制する能力に関し、試験することは、依然として困難である。腫瘍抑制
能力の正確な評価を得るため、試験はin vivoで行わなければならない。
本発明は、患者に対し顕著に減少した副作用で、腫瘍増殖に対する抵抗性または
該増殖の後退を誘導する方法を提供する。発明の概説 本発明は、ヒトにおいて、腫瘍増殖に対する抵抗性を誘導する方法であって、
腫瘍細胞を、in vitroまたはex vivoで、IGF−IRに相補的
なオリゴヌクレオチドと接触させ、そして処置した腫瘍細胞を含む拡散チャンバ
ーを、該ヒトの直筋鞘内に、治療的に有効な時間、移植し、それにより腫瘍増殖
に対する抵抗性を誘導することを含む、前記方法に関する。
【0006】 本発明はまた、ヒトにおいて、腫瘍の後退を誘導する方法であって、腫瘍細胞
を、in vitroまたはex vivoで、IGF−IRに相補的なオリゴ
ヌクレオチドと接触させ、そして処置した腫瘍細胞を含む拡散チャンバーを、該
ヒトの直筋鞘内に、治療的に有効な時間、移植し、それにより該腫瘍の後退を誘
導することを含む、前記方法に関する。発明の好ましい態様の説明 本発明は、一部、ヒトにおいて、腫瘍増殖に対する抵抗性を誘導する、または
腫瘍の後退を誘導する方法であって、腫瘍細胞を、in vitroまたはex
vivoで、アポトーシス促進剤(pro−apoptotic agent
)で処置し、処置した腫瘍細胞を拡散チャンバーに入れ、それにより腫瘍細胞含
有拡散チャンバーを産生し、そして腫瘍細胞含有拡散チャンバーを、該ヒトの直
筋鞘内に、治療的に有効な時間、挿入しまたは移植し、それにより腫瘍増殖に対
する抵抗性を誘導する、または該腫瘍の後退を誘導することを含む、前記方法に
関する。
を、in vitroまたはex vivoで、IGF−IRに相補的なオリゴ
ヌクレオチドと接触させ、そして処置した腫瘍細胞を含む拡散チャンバーを、該
ヒトの直筋鞘内に、治療的に有効な時間、移植し、それにより該腫瘍の後退を誘
導することを含む、前記方法に関する。発明の好ましい態様の説明 本発明は、一部、ヒトにおいて、腫瘍増殖に対する抵抗性を誘導する、または
腫瘍の後退を誘導する方法であって、腫瘍細胞を、in vitroまたはex
vivoで、アポトーシス促進剤(pro−apoptotic agent
)で処置し、処置した腫瘍細胞を拡散チャンバーに入れ、それにより腫瘍細胞含
有拡散チャンバーを産生し、そして腫瘍細胞含有拡散チャンバーを、該ヒトの直
筋鞘内に、治療的に有効な時間、挿入しまたは移植し、それにより腫瘍増殖に対
する抵抗性を誘導する、または該腫瘍の後退を誘導することを含む、前記方法に
関する。
【0007】 本発明の重要な利点は、腫瘍細胞に対する毒性の処置、例えば放射線照射また
は化学療法化合物などでの処置が、in vitroまたはex vivoで行
われ、それにより患者に対する毒性が避けられることである。さらに、腫瘍細胞
を拡散チャンバー中の培養に置き、そしてチャンバーを患者に直接移植し、した
がって患者内に直接腫瘍細胞を注入することに関連する可能性がある、腫瘍細胞
の物理的伝搬(spread)の可能性を避けることが可能である。
は化学療法化合物などでの処置が、in vitroまたはex vivoで行
われ、それにより患者に対する毒性が避けられることである。さらに、腫瘍細胞
を拡散チャンバー中の培養に置き、そしてチャンバーを患者に直接移植し、した
がって患者内に直接腫瘍細胞を注入することに関連する可能性がある、腫瘍細胞
の物理的伝搬(spread)の可能性を避けることが可能である。
【0008】 本発明の方法で処置可能なヒト腫瘍は、ヒト患者における原発性または続発性
、良性、悪性、転移性、または微小転移性腫瘍であってもよい。ヒト患者は、癌
と診断される個人、癌を有すると診断されたことがあり、そして現在癌を含まな
い個人、または癌を有すると疑われる個人である。本発明の方法で治療可能な腫
瘍には、限定されるわけではないが、黒色腫、前立腺、卵巣、乳腺、膵臓、肺、
結腸、および平滑筋腫瘍と共に、神経膠芽腫、骨髄幹細胞、造血細胞、骨芽細胞
、上皮細胞、線維芽細胞由来の細胞と共に、アポトーシスを経験し、そして腫瘍
細胞に対する抵抗性または該細胞の後退を誘導するいかなる他の腫瘍細胞であっ
てもよいものが含まれる。
、良性、悪性、転移性、または微小転移性腫瘍であってもよい。ヒト患者は、癌
と診断される個人、癌を有すると診断されたことがあり、そして現在癌を含まな
い個人、または癌を有すると疑われる個人である。本発明の方法で治療可能な腫
瘍には、限定されるわけではないが、黒色腫、前立腺、卵巣、乳腺、膵臓、肺、
結腸、および平滑筋腫瘍と共に、神経膠芽腫、骨髄幹細胞、造血細胞、骨芽細胞
、上皮細胞、線維芽細胞由来の細胞と共に、アポトーシスを経験し、そして腫瘍
細胞に対する抵抗性または該細胞の後退を誘導するいかなる他の腫瘍細胞であっ
てもよいものが含まれる。
【0009】 本明細書において、拡散チャンバー内にある細胞に適用されるような、「腫瘍
細胞(単数又は複数)」、「腫瘍(単数又は複数)」、および「癌細胞(単数又
は複数)」という用語は、本出願全体で交換可能に用いられ、そして限定される
わけではないが、自家移植片、同種異系移植片、同系の、非同系の、および異種
移植片と共に、それらに由来する細胞を含む。腫瘍細胞には、アポトーシスの際
、腫瘍増殖に対する抵抗性を誘導する、または腫瘍の後退を誘導する、いかなる
種類の細胞も含まれ、限定されるわけではないが、天然発生腫瘍細胞または腫瘍
細胞株が含まれる。腫瘍細胞には、限定されるわけではないが、黒色腫、前立腺
、卵巣、乳腺、膵臓、肺、結腸、および平滑筋腫瘍と共に、神経膠芽腫、骨髄幹
細胞、造血細胞、骨芽細胞、上皮細胞、線維芽細胞由来の細胞と共に、アポトー
シスを経験し、そして腫瘍細胞に対する抵抗性または該細胞の後退を誘導するい
かなる他の腫瘍細胞であってもよいものが含まれる。腫瘍細胞株には、限定され
るわけではないが、C6ラット神経膠芽腫細胞株、FO−1ヒト黒色腫細胞株、
BA 1112ラット横紋筋肉腫細胞株、B1792−F10マウス黒色腫、B
16マウス黒色腫、およびCaOV−3ヒト卵巣癌腫が含まれる。腫瘍性組織、
腫瘍、または腫瘍細胞はまた、拡散チャンバーが挿入されるであろうヒト患者か
ら、またはin vitroで培養されている別の供給源から切除してもよい。
細胞(単数又は複数)」、「腫瘍(単数又は複数)」、および「癌細胞(単数又
は複数)」という用語は、本出願全体で交換可能に用いられ、そして限定される
わけではないが、自家移植片、同種異系移植片、同系の、非同系の、および異種
移植片と共に、それらに由来する細胞を含む。腫瘍細胞には、アポトーシスの際
、腫瘍増殖に対する抵抗性を誘導する、または腫瘍の後退を誘導する、いかなる
種類の細胞も含まれ、限定されるわけではないが、天然発生腫瘍細胞または腫瘍
細胞株が含まれる。腫瘍細胞には、限定されるわけではないが、黒色腫、前立腺
、卵巣、乳腺、膵臓、肺、結腸、および平滑筋腫瘍と共に、神経膠芽腫、骨髄幹
細胞、造血細胞、骨芽細胞、上皮細胞、線維芽細胞由来の細胞と共に、アポトー
シスを経験し、そして腫瘍細胞に対する抵抗性または該細胞の後退を誘導するい
かなる他の腫瘍細胞であってもよいものが含まれる。腫瘍細胞株には、限定され
るわけではないが、C6ラット神経膠芽腫細胞株、FO−1ヒト黒色腫細胞株、
BA 1112ラット横紋筋肉腫細胞株、B1792−F10マウス黒色腫、B
16マウス黒色腫、およびCaOV−3ヒト卵巣癌腫が含まれる。腫瘍性組織、
腫瘍、または腫瘍細胞はまた、拡散チャンバーが挿入されるであろうヒト患者か
ら、またはin vitroで培養されている別の供給源から切除してもよい。
【0010】 本発明の方法で用いられる腫瘍細胞は、in vitroまたはex viv
oで、アポトーシス促進剤を補った培地中で培養され、そして続いて拡散チャン
バーに移される。あるいは、腫瘍細胞をまず、拡散チャンバー中で培養し、そし
てその中でアポトーシス促進剤で処置してもよい。好ましくは、拡散チャンバー
は、抵抗性または後退が誘導される腫瘍と同じ種類のものに由来する腫瘍細胞を
含む。あるいは、拡散チャンバーに入れられる腫瘍細胞は、抵抗性または後退が
誘導される腫瘍と異なる種類のものである。
oで、アポトーシス促進剤を補った培地中で培養され、そして続いて拡散チャン
バーに移される。あるいは、腫瘍細胞をまず、拡散チャンバー中で培養し、そし
てその中でアポトーシス促進剤で処置してもよい。好ましくは、拡散チャンバー
は、抵抗性または後退が誘導される腫瘍と同じ種類のものに由来する腫瘍細胞を
含む。あるいは、拡散チャンバーに入れられる腫瘍細胞は、抵抗性または後退が
誘導される腫瘍と異なる種類のものである。
【0011】 腫瘍細胞をin vitroまたはex vivoで培養し、そして一定の期
間、好ましくは3ないし48時間、より好ましくは24時間、アポトーシス促進
剤を補う。in vitroまたはex vivoで培養する前に、腫瘍細胞を
トリプシンで穏やかに解離させ、そして続いてヒトに移植する前に洗浄してもよ
い。in vitroまたはex vivoの腫瘍細胞の培地に補うアポトーシ
ス促進剤は、好ましくは、in vivoで細胞死を誘導する剤である。本発明
の目的のためのアポトーシス促進剤は、細胞死が腫瘍増殖阻害効果または腫瘍後
退効果、すなわち拡散チャンバーが移植されるヒトにおいて、腫瘍または複数の
腫瘍または腫瘍細胞に対する抵抗性効果または後退効果を有するように、in
vivoで拡散チャンバー中の腫瘍細胞の死を引き起こす剤である。こうしたア
ポトーシス促進剤には、限定されるわけではないが、核酸分子、タンパク質また
はペプチド、非タンパク質または非ポリヌクレオチド化合物、および物理的条件
が含まれる。
間、好ましくは3ないし48時間、より好ましくは24時間、アポトーシス促進
剤を補う。in vitroまたはex vivoで培養する前に、腫瘍細胞を
トリプシンで穏やかに解離させ、そして続いてヒトに移植する前に洗浄してもよ
い。in vitroまたはex vivoの腫瘍細胞の培地に補うアポトーシ
ス促進剤は、好ましくは、in vivoで細胞死を誘導する剤である。本発明
の目的のためのアポトーシス促進剤は、細胞死が腫瘍増殖阻害効果または腫瘍後
退効果、すなわち拡散チャンバーが移植されるヒトにおいて、腫瘍または複数の
腫瘍または腫瘍細胞に対する抵抗性効果または後退効果を有するように、in
vivoで拡散チャンバー中の腫瘍細胞の死を引き起こす剤である。こうしたア
ポトーシス促進剤には、限定されるわけではないが、核酸分子、タンパク質また
はペプチド、非タンパク質または非ポリヌクレオチド化合物、および物理的条件
が含まれる。
【0012】 本発明の方法に用いられるアポトーシス促進剤は、in vivoまたはex
vivoで拡散チャンバー中の腫瘍細胞の細胞死、またはアポトーシスを誘導
する。本発明の目的のためのアポトーシスは、細胞死と定義され、そして限定さ
れるわけではないが、原発性および転移性腫瘍の後退を含む。アポトーシスはプ
ログラムされた細胞死であり、多数の生理学的および病理学的過程に必須の役割
を果たす広範な現象である。対照的に、壊死は偶発的な細胞死であり、多様な有
害な条件および毒性物質に対する細胞の反応である。アポトーシスは、壊死とは
形態学的に異なり、多様な条件下で、多くの異なる組織で起こる、細胞死の自発
的な型である。この種の細胞死は、典型的には、発生する細胞が散在しており、
そして非常に迅速に進行するため、観察するのが困難である。
vivoで拡散チャンバー中の腫瘍細胞の細胞死、またはアポトーシスを誘導
する。本発明の目的のためのアポトーシスは、細胞死と定義され、そして限定さ
れるわけではないが、原発性および転移性腫瘍の後退を含む。アポトーシスはプ
ログラムされた細胞死であり、多数の生理学的および病理学的過程に必須の役割
を果たす広範な現象である。対照的に、壊死は偶発的な細胞死であり、多様な有
害な条件および毒性物質に対する細胞の反応である。アポトーシスは、壊死とは
形態学的に異なり、多様な条件下で、多くの異なる組織で起こる、細胞死の自発
的な型である。この種の細胞死は、典型的には、発生する細胞が散在しており、
そして非常に迅速に進行するため、観察するのが困難である。
【0013】 in vivoで腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するアポトーシス促進剤、ま
たはアポトーシス誘導剤には、例えば核酸分子が含まれる。本発明の1つの態様
において、核酸分子は増殖因子または増殖因子受容体、例えばIGF−IRなど
のDNAまたはRNAに対して向けられるオリゴヌクレオチドである。最も好ま
しくは、オリゴヌクレオチドはIGF−IRのDNAまたはRNAに対して向け
られる。オリゴヌクレオチドは、IGF−IR DNAまたはRNAのいかなる
部分に向けられてもよい。好ましくは、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
は、限定されるわけではないが、RNAまたはDNAいずれかを含む、IGF−
IR(配列番号1)のコドン1−309に相補的なヌクレオチド配列を含む。ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、コドン1−309の一部に相補的なヌク
レオチド配列を含んでもよい。さらに、コドン1ないし309に相補的なオリゴ
ヌクレオチドのヌクレオチド配列内のミスマッチもまた、本発明の範囲内である
。DNAまたはRNAを含むIGF−IRシグナル配列(配列番号2)のヌクレ
オチド−29ないし−24に相補的なオリゴヌクレオチドもまた、本発明の範囲
内である。IGF−IRのシグナル配列は30アミノ酸配列である。本定義によ
り意図されるのは、30アミノ酸シグナル配列に相補的なオリゴヌクレオチドで
ある。あるいは、配列番号2内のオリゴヌクレオチドの断片もまた、意図される
。本発明のさらなるオリゴヌクレオチドには、限定されるわけではないが、以下
のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドが含まれる:GGACCCTCC
TCCGGAGCC(配列番号3)、CCGGAGCCAGACTTCAT(配
列番号4)、CTGCTCCTCCTCTAGGATGA(配列番号5)、CC
CTCCTCCGGAGCC(配列番号6)、TACTTCAGACCGAGG
CC(配列番号7)、CCGAGGCCTCCTCCCAGG(配列番号8)、
およびTCCTCCGGAGCCAGACTT(配列番号9)。本発明のオリゴ
ヌクレオチドは、約10ないし約50ヌクレオチド、より好ましくは約14ない
し約25ヌクレオチド、そして最も好ましくは約17ないし約20ヌクレオチド
を含んでもよい。
たはアポトーシス誘導剤には、例えば核酸分子が含まれる。本発明の1つの態様
において、核酸分子は増殖因子または増殖因子受容体、例えばIGF−IRなど
のDNAまたはRNAに対して向けられるオリゴヌクレオチドである。最も好ま
しくは、オリゴヌクレオチドはIGF−IRのDNAまたはRNAに対して向け
られる。オリゴヌクレオチドは、IGF−IR DNAまたはRNAのいかなる
部分に向けられてもよい。好ましくは、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
は、限定されるわけではないが、RNAまたはDNAいずれかを含む、IGF−
IR(配列番号1)のコドン1−309に相補的なヌクレオチド配列を含む。ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、コドン1−309の一部に相補的なヌク
レオチド配列を含んでもよい。さらに、コドン1ないし309に相補的なオリゴ
ヌクレオチドのヌクレオチド配列内のミスマッチもまた、本発明の範囲内である
。DNAまたはRNAを含むIGF−IRシグナル配列(配列番号2)のヌクレ
オチド−29ないし−24に相補的なオリゴヌクレオチドもまた、本発明の範囲
内である。IGF−IRのシグナル配列は30アミノ酸配列である。本定義によ
り意図されるのは、30アミノ酸シグナル配列に相補的なオリゴヌクレオチドで
ある。あるいは、配列番号2内のオリゴヌクレオチドの断片もまた、意図される
。本発明のさらなるオリゴヌクレオチドには、限定されるわけではないが、以下
のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドが含まれる:GGACCCTCC
TCCGGAGCC(配列番号3)、CCGGAGCCAGACTTCAT(配
列番号4)、CTGCTCCTCCTCTAGGATGA(配列番号5)、CC
CTCCTCCGGAGCC(配列番号6)、TACTTCAGACCGAGG
CC(配列番号7)、CCGAGGCCTCCTCCCAGG(配列番号8)、
およびTCCTCCGGAGCCAGACTT(配列番号9)。本発明のオリゴ
ヌクレオチドは、約10ないし約50ヌクレオチド、より好ましくは約14ない
し約25ヌクレオチド、そして最も好ましくは約17ないし約20ヌクレオチド
を含んでもよい。
【0014】 本発明の別の好ましい態様において、核酸分子は、増殖因子または増殖因子受
容体のDNAまたはRNA、例えば配列番号1−9などに対して向けられるオリ
ゴヌクレオチドを産生するベクターである。IGF−IR RNAまたはDNA
の一部に相補的な核酸分子を、適切な搬送ビヒクル、例えば発現プラスミド、コ
スミド、YACベクター、およびそれらに匹敵するものなどに挿入する。核酸を
腫瘍細胞に導入するのに、ほとんどいかなる搬送ビヒクルを用いてもよい。組換
え核酸分子(または組換えベクター)には、例えばプラスミドDNAベクター、
cDNA含有リポソーム、人工ウイルス、ナノ粒子、およびそれらに匹敵するも
のが含まれる。オリゴヌクレオチドを発現するベクターを直接腫瘍細胞に注入し
てもよいこともまた、予期される。
容体のDNAまたはRNA、例えば配列番号1−9などに対して向けられるオリ
ゴヌクレオチドを産生するベクターである。IGF−IR RNAまたはDNA
の一部に相補的な核酸分子を、適切な搬送ビヒクル、例えば発現プラスミド、コ
スミド、YACベクター、およびそれらに匹敵するものなどに挿入する。核酸を
腫瘍細胞に導入するのに、ほとんどいかなる搬送ビヒクルを用いてもよい。組換
え核酸分子(または組換えベクター)には、例えばプラスミドDNAベクター、
cDNA含有リポソーム、人工ウイルス、ナノ粒子、およびそれらに匹敵するも
のが含まれる。オリゴヌクレオチドを発現するベクターを直接腫瘍細胞に注入し
てもよいこともまた、予期される。
【0015】 本発明の組換え核酸分子の制御要素は、哺乳動物腫瘍細胞、好ましくはヒト腫
瘍細胞での発現を指示することが可能である。制御要素には、プロモーターおよ
びポリアデニル化シグナルが含まれる。さらに、他の要素、例えばコザック(K
ozak)領域もまた、組換え核酸分子に含まれてもよい。本発明の実施に有用
なポリアデニル化シグナルの例には、限定されるわけではないが、SV40ポリ
アデニル化シグナルおよびLTRポリアデニル化シグナルが含まれる。特に、S
V40ポリアデニル化シグナルと称される、pCEP4プラスミド(Invit
rogen、カリフォルニア州サンディエゴ)中のSV40ポリアデニル化シグ
ナルを用いてもよい。
瘍細胞での発現を指示することが可能である。制御要素には、プロモーターおよ
びポリアデニル化シグナルが含まれる。さらに、他の要素、例えばコザック(K
ozak)領域もまた、組換え核酸分子に含まれてもよい。本発明の実施に有用
なポリアデニル化シグナルの例には、限定されるわけではないが、SV40ポリ
アデニル化シグナルおよびLTRポリアデニル化シグナルが含まれる。特に、S
V40ポリアデニル化シグナルと称される、pCEP4プラスミド(Invit
rogen、カリフォルニア州サンディエゴ)中のSV40ポリアデニル化シグ
ナルを用いてもよい。
【0016】 本発明の組換え核酸分子を構築するのに有用なプロモーターは、恒常的でもま
たは誘導性でもよい。恒常的プロモーターは、細胞増殖のすべての条件下で発現
される。恒常的プロモーターの例には、以下の遺伝子のプロモーターが含まれる
:ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)、アデノシン
デアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、β−アクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグ
ロビン、ヒト筋肉クレアチン、および他のもの。さらに、多くのウイルスプロモ
ーターは、真核細胞において恒常的に機能し、そしてこれらには、限定されるわ
けではないが、SV40の初期および後期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイル
ス(MMTV)プロモーター、モロニー(Maloney)白血病ウイルス、ヒ
ト免疫不全ウイルス(HIV)、サイトメガロウイルス(CMV)極初期プロモ
ーター、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV
)、および他のレトロウイルスの末端反復配列(LTR)、並びに単純疱疹ウイ
ルスのチミジンキナーゼプロモーターが含まれる。他のプロモーターは、一般の
当業者に知られる。
たは誘導性でもよい。恒常的プロモーターは、細胞増殖のすべての条件下で発現
される。恒常的プロモーターの例には、以下の遺伝子のプロモーターが含まれる
:ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)、アデノシン
デアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、β−アクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグ
ロビン、ヒト筋肉クレアチン、および他のもの。さらに、多くのウイルスプロモ
ーターは、真核細胞において恒常的に機能し、そしてこれらには、限定されるわ
けではないが、SV40の初期および後期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイル
ス(MMTV)プロモーター、モロニー(Maloney)白血病ウイルス、ヒ
ト免疫不全ウイルス(HIV)、サイトメガロウイルス(CMV)極初期プロモ
ーター、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV
)、および他のレトロウイルスの末端反復配列(LTR)、並びに単純疱疹ウイ
ルスのチミジンキナーゼプロモーターが含まれる。他のプロモーターは、一般の
当業者に知られる。
【0017】 誘導性プロモーターは、誘導剤の存在下で発現する。例えば、メタロチオネイ
ンプロモーターは特定の金属イオンの存在下で転写を促進する(増加させる)よ
う誘導され、ショウジョウバエ(Drosophila)HSP70も同様であ
る。他の誘導性プロモーターは、一般の当業者に知られる。
ンプロモーターは特定の金属イオンの存在下で転写を促進する(増加させる)よ
う誘導され、ショウジョウバエ(Drosophila)HSP70も同様であ
る。他の誘導性プロモーターは、一般の当業者に知られる。
【0018】 本発明のオリゴヌクレオチドを含む組換え核酸分子を、腫瘍細胞に導入し、ま
たは例えばトランスフェクションまたは形質導入法により、腫瘍細胞に「接触」
させてもよい。トランスフェクションは、添加された核酸分子の取り込みによる
、細胞による新規遺伝的物質の獲得を指す。トランスフェクションは、物理的ま
たは化学的方法により、起こる可能性がある。多くのトランスフェクション技術
が一般の当業者に知られ:リン酸カルシウムDNA共沈澱;DEAE−デキスト
ランDNAトランスフェクション;エレクトロポレーション;裸の(naked
)プラスミド吸着;および陽イオン性リポソーム仲介トランスフェクションが含
まれる。形質導入は、DNAまたはRNAウイルスを用い、細胞内に核酸を運搬
する方法を指す。形質導入剤として使用するのに適したウイルスベクターには、
限定されるわけではないが、レトロウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベク
ター、ワクシニアウイルス、およびセムリキ森林ウイルス(Semliki F
orest virus)ベクターが含まれる。
たは例えばトランスフェクションまたは形質導入法により、腫瘍細胞に「接触」
させてもよい。トランスフェクションは、添加された核酸分子の取り込みによる
、細胞による新規遺伝的物質の獲得を指す。トランスフェクションは、物理的ま
たは化学的方法により、起こる可能性がある。多くのトランスフェクション技術
が一般の当業者に知られ:リン酸カルシウムDNA共沈澱;DEAE−デキスト
ランDNAトランスフェクション;エレクトロポレーション;裸の(naked
)プラスミド吸着;および陽イオン性リポソーム仲介トランスフェクションが含
まれる。形質導入は、DNAまたはRNAウイルスを用い、細胞内に核酸を運搬
する方法を指す。形質導入剤として使用するのに適したウイルスベクターには、
限定されるわけではないが、レトロウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベク
ター、ワクシニアウイルス、およびセムリキ森林ウイルス(Semliki F
orest virus)ベクターが含まれる。
【0019】 本発明の好ましい態様において、例えば、どちらも本明細書に援用される、R
esnicoffら(1994a、1994b、上記)に記載される、IGF−
IRのDNAまたはRNAに向けられるオリゴヌクレオチドを含む組換えベクタ
ーを用いる。簡潔には、プラスミドHSP/IGF−IR ASは、ショウジョ
ウバエHSP70プロモーターの調節下に、IGF−IR RNAに向けられる
長さ309 bpのアンチセンス転写物を発現する。B型肝炎ポリアデニル化シ
グナル配列およびSV40プロモーターの調節下のネオマイシン耐性遺伝子が、
309 bpのIGF−IR断片の3’末端に存在する。当業者は、本明細書に
記載される本発明のオリゴヌクレオチドのいずれを産生する、さらなるベクター
も容易に調製することが可能である。
esnicoffら(1994a、1994b、上記)に記載される、IGF−
IRのDNAまたはRNAに向けられるオリゴヌクレオチドを含む組換えベクタ
ーを用いる。簡潔には、プラスミドHSP/IGF−IR ASは、ショウジョ
ウバエHSP70プロモーターの調節下に、IGF−IR RNAに向けられる
長さ309 bpのアンチセンス転写物を発現する。B型肝炎ポリアデニル化シ
グナル配列およびSV40プロモーターの調節下のネオマイシン耐性遺伝子が、
309 bpのIGF−IR断片の3’末端に存在する。当業者は、本明細書に
記載される本発明のオリゴヌクレオチドのいずれを産生する、さらなるベクター
も容易に調製することが可能である。
【0020】 本発明の他の態様において、アポトーシス促進剤は、タンパク質またはペプチ
ド、例えばIGF−IRの関連優性ネガティブ突然変異体およびMHCクラスI
ペプチドなどを含む。IGF−IRの優性ネガティブ突然変異体には、例えば、
本明細書に援用されるD’Ambrosioら, Cancer Res.,
1996, 56, 4013−4020に記載される可溶性IGF−IR、お
よびミリスチン化C末端のIGF−IR(MyCF)が含まれる。MHCクラス
I関連ペプチドには、例えば、黒色腫特異的CTL株に認識されるTyr−Le
u−Glu−Pro−Gly−Pro−Val−Thr−Ala(配列番号10
)(Coxら, Science, 1994, 264, 716−719)
、gp100由来であり、そしてヒト黒色腫の後退に関与するLeu−Leu−
Asp−Gly−Thr−Ala−Thr−Leu−Arg−Leu(配列番号
11)(Kawakamiら, Proc. Natl. Acad. Sci
. USA, 1994, 91, 6458−6462)、およびコネキシン
37に由来し、そしてネズミ肺癌腫に対しCTL反応を誘導するPhe−Glu
−Cys−Asn−Thr−Ala−Gln−Pro−Gly(配列番号12)
(Mandelbolmら, Nature, 1994, 369, 67−
71)、およびTyr−Leu−Arg−Pro−Gly−Pro−Val−T
hr−Ala(配列番号15)が含まれる。さらに、上に同定されるペプチドの
反転D−アミノ酸類似体、例えば、Ala−Thr−Val−Pro−Gly−
Pro−Glu−Leu−Tyr(配列番号13)およびLeu−Arg−Le
u−Thr−Ala−Thr−Gly−Asp−Leu−Leu(配列番号14
)もまた、活性がある。アミノ酸置換もまた、本発明に意図される。本発明のペ
プチドは、当業者に周知であるように、合成で作成してもよい。
ド、例えばIGF−IRの関連優性ネガティブ突然変異体およびMHCクラスI
ペプチドなどを含む。IGF−IRの優性ネガティブ突然変異体には、例えば、
本明細書に援用されるD’Ambrosioら, Cancer Res.,
1996, 56, 4013−4020に記載される可溶性IGF−IR、お
よびミリスチン化C末端のIGF−IR(MyCF)が含まれる。MHCクラス
I関連ペプチドには、例えば、黒色腫特異的CTL株に認識されるTyr−Le
u−Glu−Pro−Gly−Pro−Val−Thr−Ala(配列番号10
)(Coxら, Science, 1994, 264, 716−719)
、gp100由来であり、そしてヒト黒色腫の後退に関与するLeu−Leu−
Asp−Gly−Thr−Ala−Thr−Leu−Arg−Leu(配列番号
11)(Kawakamiら, Proc. Natl. Acad. Sci
. USA, 1994, 91, 6458−6462)、およびコネキシン
37に由来し、そしてネズミ肺癌腫に対しCTL反応を誘導するPhe−Glu
−Cys−Asn−Thr−Ala−Gln−Pro−Gly(配列番号12)
(Mandelbolmら, Nature, 1994, 369, 67−
71)、およびTyr−Leu−Arg−Pro−Gly−Pro−Val−T
hr−Ala(配列番号15)が含まれる。さらに、上に同定されるペプチドの
反転D−アミノ酸類似体、例えば、Ala−Thr−Val−Pro−Gly−
Pro−Glu−Leu−Tyr(配列番号13)およびLeu−Arg−Le
u−Thr−Ala−Thr−Gly−Asp−Leu−Leu(配列番号14
)もまた、活性がある。アミノ酸置換もまた、本発明に意図される。本発明のペ
プチドは、当業者に周知であるように、合成で作成してもよい。
【0021】 本発明の他の態様において、アポトーシス促進剤は、非タンパク質または非ポ
リヌクレオチド化合物、例えば化学療法化合物または合成化学化合物などを含む
。好ましくは、化学療法化合物は、例えば、エトポシド、シスプラチン、カンプ
トセシン、および腫瘍壊死因子アルファ(TNF−α)を含む。
リヌクレオチド化合物、例えば化学療法化合物または合成化学化合物などを含む
。好ましくは、化学療法化合物は、例えば、エトポシド、シスプラチン、カンプ
トセシン、および腫瘍壊死因子アルファ(TNF−α)を含む。
【0022】 本発明の他の態様において、アポトーシス促進剤は、物理的条件、例えば高体
温、低体温、虚血、およびイオン化放射線照射などを含む。腫瘍細胞がこうした
条件に曝露される態様において、本発明の目的のための条件は、剤、アポトーシ
ス誘導剤として定義される。
温、低体温、虚血、およびイオン化放射線照射などを含む。腫瘍細胞がこうした
条件に曝露される態様において、本発明の目的のための条件は、剤、アポトーシ
ス誘導剤として定義される。
【0023】 アポトーシス促進剤またはアポトーシス誘導剤の治療的に有効な用量は、薬剤
単独のものと同程度であろうし;投薬量は、患者の体重、および臨床的条件に関
連して設定されるであろう。培地に対する活性成分の相対的な比率は、当然、化
合物の化学的性質、可溶性、および安定性と共に、意図される投薬量に応じるで
あろう。培地もまた、薬学的に許容しうる。本発明のアポトーシス誘導剤は、単
独で、または他のアポトーシス誘導剤と組み合わせて用いてもよい。好ましくは
、アポトーシス促進剤、約10μg/107細胞および100 mg/107細胞
の間の量を用い、in vitroまたはex vivoで腫瘍細胞を処置する
。より好ましくは、アポトーシス促進剤、約100μg/107細胞および10
mg/107細胞の間の量を用いる。より好ましくは、アポトーシス促進剤、
約1 mg/107細胞および5 mg/107細胞の間の量を用いる。最も好ま
しくは、アポトーシス促進剤、約2 mg/107細胞を用いる。
単独のものと同程度であろうし;投薬量は、患者の体重、および臨床的条件に関
連して設定されるであろう。培地に対する活性成分の相対的な比率は、当然、化
合物の化学的性質、可溶性、および安定性と共に、意図される投薬量に応じるで
あろう。培地もまた、薬学的に許容しうる。本発明のアポトーシス誘導剤は、単
独で、または他のアポトーシス誘導剤と組み合わせて用いてもよい。好ましくは
、アポトーシス促進剤、約10μg/107細胞および100 mg/107細胞
の間の量を用い、in vitroまたはex vivoで腫瘍細胞を処置する
。より好ましくは、アポトーシス促進剤、約100μg/107細胞および10
mg/107細胞の間の量を用いる。より好ましくは、アポトーシス促進剤、
約1 mg/107細胞および5 mg/107細胞の間の量を用いる。最も好ま
しくは、アポトーシス促進剤、約2 mg/107細胞を用いる。
【0024】 本発明は、細胞が含まれる拡散チャンバーを使用する。細胞は、拡散チャンバ
ー上にはめ込んだフィルターに不浸透であり;チャンバーから出ることもまたは
チャンバーに入ることもできない。拡散チャンバー上のフィルターは、直径約0
.25μmまたはそれより小さい範囲の大きさの、好ましくは約0.1μmの孔
を有する。Langeら, J. Immunol., 1994, 153,
205−211およびLanzaら, Transplantation,
1994, 57, 1371−1375、前記参考文献は共に、本明細書に完
全に援用される。したがって、細胞死またはアポトーシスは、定量的に測定する
ことが可能である。拡散チャンバーの使用は、他の細胞株に拡張することが可能
であり、非同系であっても、そして異なる種由来であってもよい。これは細胞死
が起こる速度は約24時間であり、いかなる免疫反応が確立されるよりはるかに
前であるためである。
ー上にはめ込んだフィルターに不浸透であり;チャンバーから出ることもまたは
チャンバーに入ることもできない。拡散チャンバー上のフィルターは、直径約0
.25μmまたはそれより小さい範囲の大きさの、好ましくは約0.1μmの孔
を有する。Langeら, J. Immunol., 1994, 153,
205−211およびLanzaら, Transplantation,
1994, 57, 1371−1375、前記参考文献は共に、本明細書に完
全に援用される。したがって、細胞死またはアポトーシスは、定量的に測定する
ことが可能である。拡散チャンバーの使用は、他の細胞株に拡張することが可能
であり、非同系であっても、そして異なる種由来であってもよい。これは細胞死
が起こる速度は約24時間であり、いかなる免疫反応が確立されるよりはるかに
前であるためである。
【0025】 本発明に有用な拡散チャンバーは、チャンバーおよび移植される患者の間の細
胞の通過を可能にしないが、チャンバーおよび患者の間の因子の交換および通過
を可能にする、いかなるチャンバーも含む。チャンバーは、汚染なしにそして患
者を傷つけることなく、内容物の多数のそして連続した試料採取を可能にし、し
たがって患者に行われる移植処置の数を有意に減少させる。好ましい拡散チャン
バーは、例えば、米国特許第5,714,170号に記載される。代表的な拡散
チャンバーは、2つの端、第一の端および第二の端を有する、チャンバー・バレ
ル(barrel)を含む。バレルは、非毒性手段により共に固定されている、
1つまたはそれ以上の輪で構成されてもよい。チャンバーには、各端でフィルタ
ー、第一のフィルターおよび第二のフィルターをはめ込む。フィルターは、因子
がチャンバーおよび患者の間を通過することが可能であるように、因子に対し透
過性である。フィルター孔サイズは、約0.25μmまたはそれ以下であっても
よく、好ましくは約0.1μmである。フィルターはプラスチック、テフロン( 登録商標)、ポリエステル、または強靭で、柔軟であり、そして化学処理に耐え ることが可能であるいかなる不活性物質で出来ていてもよい。フィルターは、や はりより強いシールを提供することが可能であるゴムガスケットの位置に固定し てもよい。チャンバーのバレル部分上に、開口部が提供され、該開口部は、チャ ンバーが移植された後、患者の体の外部からアクセスされるキャップにより覆わ れており、したがって拡散チャンバーに補充することを可能にしてもよい。該キ ャップは、セルフシールゴムのねじ込み(screw−on)式で、そして開口 部にはめ込まれてもよい。チャンバー内容物の試料採取は、患者の体の外部のキ ャップをはずし、そして通常の注射針およびシリンジを挿入することにより、開 口部にアクセスすることにより、行ってもよい。チャンバーは、いかなる物質、 例えば、限定されるわけではないが、プラスチック、テフロン、ルサイト(lu cite)、チタン、またはヒトに非毒性であり、そしてよく寛容されるいかな る不活性物質で出来ていてもよい。さらに、チャンバーは、滅菌に耐えることが 可能でなければならない。拡散チャンバーは、好ましくは、0.1μmの孔サイ ズの親水性Durapore膜(Millipore、マサチューセッツ州ベッ ドフォード)を持つ、14 mm ルサイト輪で構築される。拡散チャンバーは 、好ましくは、使用前に酸化エチレンで滅菌される。
胞の通過を可能にしないが、チャンバーおよび患者の間の因子の交換および通過
を可能にする、いかなるチャンバーも含む。チャンバーは、汚染なしにそして患
者を傷つけることなく、内容物の多数のそして連続した試料採取を可能にし、し
たがって患者に行われる移植処置の数を有意に減少させる。好ましい拡散チャン
バーは、例えば、米国特許第5,714,170号に記載される。代表的な拡散
チャンバーは、2つの端、第一の端および第二の端を有する、チャンバー・バレ
ル(barrel)を含む。バレルは、非毒性手段により共に固定されている、
1つまたはそれ以上の輪で構成されてもよい。チャンバーには、各端でフィルタ
ー、第一のフィルターおよび第二のフィルターをはめ込む。フィルターは、因子
がチャンバーおよび患者の間を通過することが可能であるように、因子に対し透
過性である。フィルター孔サイズは、約0.25μmまたはそれ以下であっても
よく、好ましくは約0.1μmである。フィルターはプラスチック、テフロン( 登録商標)、ポリエステル、または強靭で、柔軟であり、そして化学処理に耐え ることが可能であるいかなる不活性物質で出来ていてもよい。フィルターは、や はりより強いシールを提供することが可能であるゴムガスケットの位置に固定し てもよい。チャンバーのバレル部分上に、開口部が提供され、該開口部は、チャ ンバーが移植された後、患者の体の外部からアクセスされるキャップにより覆わ れており、したがって拡散チャンバーに補充することを可能にしてもよい。該キ ャップは、セルフシールゴムのねじ込み(screw−on)式で、そして開口 部にはめ込まれてもよい。チャンバー内容物の試料採取は、患者の体の外部のキ ャップをはずし、そして通常の注射針およびシリンジを挿入することにより、開 口部にアクセスすることにより、行ってもよい。チャンバーは、いかなる物質、 例えば、限定されるわけではないが、プラスチック、テフロン、ルサイト(lu cite)、チタン、またはヒトに非毒性であり、そしてよく寛容されるいかな る不活性物質で出来ていてもよい。さらに、チャンバーは、滅菌に耐えることが 可能でなければならない。拡散チャンバーは、好ましくは、0.1μmの孔サイ ズの親水性Durapore膜(Millipore、マサチューセッツ州ベッ ドフォード)を持つ、14 mm ルサイト輪で構築される。拡散チャンバーは 、好ましくは、使用前に酸化エチレンで滅菌される。
【0026】 腫瘍細胞は、多様な量で拡散チャンバーに入れてもよい。好ましくは、約1
x 104ないし約5 x 106細胞を拡散チャンバーに入れてもよい。より好
ましくは、約1 x 105ないし約1.5 x 106細胞を拡散チャンバーに
入れてもよい。より好ましくは、約5 x 105ないし約1 x 106細胞を
拡散チャンバーに入れてもよい。最も好ましくは、約1 x 106細胞を拡散
チャンバーに入れる。細胞は培地を含む拡散チャンバーに入れる。癌細胞の増殖
を支持し、そしてヒトに適合する、当業者に知られるいかなる培地を用いてもよ
いことが予期される。
x 104ないし約5 x 106細胞を拡散チャンバーに入れてもよい。より好
ましくは、約1 x 105ないし約1.5 x 106細胞を拡散チャンバーに
入れてもよい。より好ましくは、約5 x 105ないし約1 x 106細胞を
拡散チャンバーに入れてもよい。最も好ましくは、約1 x 106細胞を拡散
チャンバーに入れる。細胞は培地を含む拡散チャンバーに入れる。癌細胞の増殖
を支持し、そしてヒトに適合する、当業者に知られるいかなる培地を用いてもよ
いことが予期される。
【0027】 拡散チャンバーは、以下の限定されない方法で、ヒトに移植してもよい:例え
ば、皮下、腹腔内、頭蓋内、または直筋鞘内。最も好ましくは、単数または複数
の拡散チャンバーは、優れたリンパ液のドレナージおよび/または血管供給を有
する、体の受容部位、例えば直筋鞘に移植される。チャンバーは、望ましい場合
、移植後約24ないし約30時間後に除去してもよい。あるいは、拡散チャンバ
ーを処置のため再度使用し、そして処置後、空にすることが可能であるように、
補充可能なチャンバーを使用してもよい。さらに、好ましくは5および20の間
の複数の拡散チャンバーを、単一の患者で用いてもよい。
ば、皮下、腹腔内、頭蓋内、または直筋鞘内。最も好ましくは、単数または複数
の拡散チャンバーは、優れたリンパ液のドレナージおよび/または血管供給を有
する、体の受容部位、例えば直筋鞘に移植される。チャンバーは、望ましい場合
、移植後約24ないし約30時間後に除去してもよい。あるいは、拡散チャンバ
ーを処置のため再度使用し、そして処置後、空にすることが可能であるように、
補充可能なチャンバーを使用してもよい。さらに、好ましくは5および20の間
の複数の拡散チャンバーを、単一の患者で用いてもよい。
【0028】 ヒトにおいて、本発明を実行するための臨床的に証明された外科処置は、アポ
トーシス促進剤、例えばIGF−IRアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し
た腫瘍細胞を、懸濁物として含む拡散チャンバーの移植を伴う。好ましい方法は
、いくつかの外科的および/またはin vitro組織プロセシング目的を伴
う:1)IGF−IRアンチセンスオリゴヌクレオチドでのex−vivo腫瘍
細胞処置のため、フィブリノーゲンおよび壊死を含まない、生存腫瘍組織を腫瘍
床(bed)から採取し;2)手術による過剰なまたは許容されない病的状態(
morbidity)、特に処置に関連する手術後神経学的欠損を避け;3)画
像指示組織選択を用い、これらの始めの二つの目的を達成し;4)画像指示外科
的切除を用い、腫瘍の切除を最大にし、そして残った腫瘍負荷(burden)
を最小にし、それにより移植後期間中の、自己腫瘍拒絶に関連する、または腫瘍
細胞に対する直接のそして細胞傷害性効果に関連するいかなる炎症過程も最小に
し;5)生物学的反応の生成のための自己受容部位を選択しそして生成し;6)
自己由来処置腫瘍細胞の再移植に際し、望ましい生物学的反応を20時間以内に
生成するため、in vitroでヒト組織外植片(explant)をプロセ
シングし;7)先に言及した6つの外科的目的の代わりに、腫瘍細胞の移植に際
し、望ましい生物学的反応を約20時間以内に生成するため、樹立された細胞株
由来の自己、同種、または異種(xenographic)細胞をプロセシング
し;そして8)上記の細胞調製すべてのための特定の移植プロトコルを設計し、
腫瘍増殖に対する抵抗性または該増殖の後退を生成する。
トーシス促進剤、例えばIGF−IRアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し
た腫瘍細胞を、懸濁物として含む拡散チャンバーの移植を伴う。好ましい方法は
、いくつかの外科的および/またはin vitro組織プロセシング目的を伴
う:1)IGF−IRアンチセンスオリゴヌクレオチドでのex−vivo腫瘍
細胞処置のため、フィブリノーゲンおよび壊死を含まない、生存腫瘍組織を腫瘍
床(bed)から採取し;2)手術による過剰なまたは許容されない病的状態(
morbidity)、特に処置に関連する手術後神経学的欠損を避け;3)画
像指示組織選択を用い、これらの始めの二つの目的を達成し;4)画像指示外科
的切除を用い、腫瘍の切除を最大にし、そして残った腫瘍負荷(burden)
を最小にし、それにより移植後期間中の、自己腫瘍拒絶に関連する、または腫瘍
細胞に対する直接のそして細胞傷害性効果に関連するいかなる炎症過程も最小に
し;5)生物学的反応の生成のための自己受容部位を選択しそして生成し;6)
自己由来処置腫瘍細胞の再移植に際し、望ましい生物学的反応を20時間以内に
生成するため、in vitroでヒト組織外植片(explant)をプロセ
シングし;7)先に言及した6つの外科的目的の代わりに、腫瘍細胞の移植に際
し、望ましい生物学的反応を約20時間以内に生成するため、樹立された細胞株
由来の自己、同種、または異種(xenographic)細胞をプロセシング
し;そして8)上記の細胞調製すべてのための特定の移植プロトコルを設計し、
腫瘍増殖に対する抵抗性または該増殖の後退を生成する。
【0029】 成功した臨床試験は、神経膠腫として知られるヒト脳腫瘍に、本発明を適用し
てきている。特定の腫瘍、例えば脳幹神経膠腫、または深部、および/または多
発性脳転移は、外科的に接近不能であり、そしていかなる組織もこれらの患者か
ら安全に採取することが不可能である。腫瘍が外科的に接近不能な症例では、同
種(ヒトであるが宿主でない)細胞株、異種(非ヒト)樹立細胞株、または同種
ヒト初代細胞培養を供給源として利用し、腫瘍増殖に対する抵抗性または該増殖
の後退を誘導してもよい。深部静脈血栓症の合併症を避けるまたは予防するため
、本発明を実行するのに、低分子量ヘパリンの予防的使用が推奨される。以下の
実施例は例示のためであり、本発明を限定することを意図しない。
てきている。特定の腫瘍、例えば脳幹神経膠腫、または深部、および/または多
発性脳転移は、外科的に接近不能であり、そしていかなる組織もこれらの患者か
ら安全に採取することが不可能である。腫瘍が外科的に接近不能な症例では、同
種(ヒトであるが宿主でない)細胞株、異種(非ヒト)樹立細胞株、または同種
ヒト初代細胞培養を供給源として利用し、腫瘍増殖に対する抵抗性または該増殖
の後退を誘導してもよい。深部静脈血栓症の合併症を避けるまたは予防するため
、本発明を実行するのに、低分子量ヘパリンの予防的使用が推奨される。以下の
実施例は例示のためであり、本発明を限定することを意図しない。
【0030】
実施例1:一般的な移植プロトコル 腫瘍増殖に対する抵抗性または該増殖の後退を誘導するため、アンチセンスI
GF−IRオリゴヌクレオチドで処置した、採取した腫瘍細胞の自己移植片また
は樹立された自己、同種、または異種細胞株いずれかを含む、拡散チャンバーを
ヒトに移植する。こうした腫瘍細胞はすべて、ex vivoで、IGF−IR
アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置されている。IGF−IRアンチセンス
を使用し、in vitroで宿主腫瘍細胞外植片中のIGF−IRを標的とし
、そして腫瘍細胞がin vivoでアポトーシスを経験するようにする。標的
化した、あらかじめ処置した細胞は、in vivoでアポトーシスを経験する
ようになり、そして続いて生物学的反応修飾因子を生成し、該因子は腫瘍増殖に
対する抵抗性または該増殖の後退を誘導する。
GF−IRオリゴヌクレオチドで処置した、採取した腫瘍細胞の自己移植片また
は樹立された自己、同種、または異種細胞株いずれかを含む、拡散チャンバーを
ヒトに移植する。こうした腫瘍細胞はすべて、ex vivoで、IGF−IR
アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置されている。IGF−IRアンチセンス
を使用し、in vitroで宿主腫瘍細胞外植片中のIGF−IRを標的とし
、そして腫瘍細胞がin vivoでアポトーシスを経験するようにする。標的
化した、あらかじめ処置した細胞は、in vivoでアポトーシスを経験する
ようになり、そして続いて生物学的反応修飾因子を生成し、該因子は腫瘍増殖に
対する抵抗性または該増殖の後退を誘導する。
【0031】 好ましい態様は、in vitroに続き、in vivo法を伴う併合法を
含む。まず、本方法はin vitroで腫瘍細胞中のIGF−IRを標的とす
る。IGF−IRレベルが減少した腫瘍細胞を拡散チャンバーに被包し、そして
in vivoで患者に移植する(すなわち、皮下、直筋鞘内、頭蓋内、または
移植のため供しうると見なされるいかなる他の宿主部位にも)。IGF−IRレ
ベルが減少した細胞は、拡散チャンバー内でアポトーシスを経験し、そして宿主
患者におけるヒト悪性脳腫瘍の除去を引き起こすと考えられる、拡散可能な生物
学的反応修正因子を放出する。
含む。まず、本方法はin vitroで腫瘍細胞中のIGF−IRを標的とす
る。IGF−IRレベルが減少した腫瘍細胞を拡散チャンバーに被包し、そして
in vivoで患者に移植する(すなわち、皮下、直筋鞘内、頭蓋内、または
移植のため供しうると見なされるいかなる他の宿主部位にも)。IGF−IRレ
ベルが減少した細胞は、拡散チャンバー内でアポトーシスを経験し、そして宿主
患者におけるヒト悪性脳腫瘍の除去を引き起こすと考えられる、拡散可能な生物
学的反応修正因子を放出する。
【0032】 好ましくは、2つの外科的プロトコルの1つを利用し、原発性および転移性脳
腫瘍に関し、本発明を実行する。好ましいプロトコルにおいて、腫瘍切除および
自己細胞移植に開頭術(craniotomy)を使用する。別のプロトコルは
、開頭術を利用しないが、患者において、自己細胞株、同種細胞株、または異種
細胞株の移植を必要とする。
腫瘍に関し、本発明を実行する。好ましいプロトコルにおいて、腫瘍切除および
自己細胞移植に開頭術(craniotomy)を使用する。別のプロトコルは
、開頭術を利用しないが、患者において、自己細胞株、同種細胞株、または異種
細胞株の移植を必要とする。
【0033】 まず、神経膠腫に関しては、外科的方法を利用し、自己組織を採取する。IG
F−IRアンチセンスDNAでのex vivo腫瘍細胞処置のため、生存腫瘍
組織を腫瘍床から採取する(0.5ないし2グラムの間を目標とする;最低50
0 mgが通常適切である)。手術による過剰なまたは許容されない病的状態、
特に処置に関連する手術後神経学的欠損を避けるのが、本プロトコルの目的であ
る。画像指示組織選択を利用し、生存腫瘍組織の採取を達成し、そして手術によ
る過剰なまたは許容されない病的状態を避ける。外科的切除もまた、画像指示に
より、腫瘍の切除を最大にし、残った腫瘍負荷を最小にし、そしてそれに続く、
移植後期間中の、自己腫瘍拒絶に関連する、いかなる炎症過程も最小にする。自
己受容部位は、該受容部位が拡散チャンバーの移植および生物学的修飾因子の拡
散に適切であるように選択する。ヒト組織外植片をin vitroでプロセシ
ングし、自己由来処置腫瘍細胞の再移植に際し、望ましい生物学的反応を生成す
る。再移植プロトコルは、ヒトにおいて生物学的反応修飾因子誘発を生成するよ
う設計される。
F−IRアンチセンスDNAでのex vivo腫瘍細胞処置のため、生存腫瘍
組織を腫瘍床から採取する(0.5ないし2グラムの間を目標とする;最低50
0 mgが通常適切である)。手術による過剰なまたは許容されない病的状態、
特に処置に関連する手術後神経学的欠損を避けるのが、本プロトコルの目的であ
る。画像指示組織選択を利用し、生存腫瘍組織の採取を達成し、そして手術によ
る過剰なまたは許容されない病的状態を避ける。外科的切除もまた、画像指示に
より、腫瘍の切除を最大にし、残った腫瘍負荷を最小にし、そしてそれに続く、
移植後期間中の、自己腫瘍拒絶に関連する、いかなる炎症過程も最小にする。自
己受容部位は、該受容部位が拡散チャンバーの移植および生物学的修飾因子の拡
散に適切であるように選択する。ヒト組織外植片をin vitroでプロセシ
ングし、自己由来処置腫瘍細胞の再移植に際し、望ましい生物学的反応を生成す
る。再移植プロトコルは、ヒトにおいて生物学的反応修飾因子誘発を生成するよ
う設計される。
【0034】 患者はまず、頭皮上に標準座標を配置し、開頭術に備える。これらの標準は、
MRIに基づく術中画像ガイダンスのための表面登録(registratio
n)ポイントとして役立つであろう。患者をその後、MRIスキャナーに連れて
行き、ここでガドリニウムを注入し、そして3つの直交平面すべての画像セット
を得る。得られた画像セットは、手術室で利用される、術中画像ガイダンスコン
ピューターソフトウェアに適している。ガドリニウムまたは類似の造影剤の使用
は、生存受容腫瘍組織細胞を位置決定する組織平面マーカーを生成するのに役立
つ。生存腫瘍平面の画像指示位置決定は、プロセシングのための細胞採取の成功
の鍵である。
MRIに基づく術中画像ガイダンスのための表面登録(registratio
n)ポイントとして役立つであろう。患者をその後、MRIスキャナーに連れて
行き、ここでガドリニウムを注入し、そして3つの直交平面すべての画像セット
を得る。得られた画像セットは、手術室で利用される、術中画像ガイダンスコン
ピューターソフトウェアに適している。ガドリニウムまたは類似の造影剤の使用
は、生存受容腫瘍組織細胞を位置決定する組織平面マーカーを生成するのに役立
つ。生存腫瘍平面の画像指示位置決定は、プロセシングのための細胞採取の成功
の鍵である。
【0035】 画像化期が完了したら、患者を手術室に連れて行き、そして開頭術に備える。
予防的抗生物質を静脈内注入し、ラシックスと共にステロイド類およびマンニト
ールを含む、脳浮腫を最小にする剤も同様に注入する。3点頭部ピン固定内に頭
を固定し、そして、赤外カメラに対する参照ブロック(reference b
lock)の方向に注意し、赤外LED参照ブロックを頭部ピン固定装置に適用
する。参照ブロックは、カメラへの接続が妨害されないよう、そして手術アクセ
スが妨害されないように、手術野から十分な距離をとるよう、配置する。その後
、枠なしの観察ワンド(viewing wand)を、許容しうる(1.5
mm以下)登録エラーが得られるまで登録する。標準マーカーを除き、そして4
0の頭皮ポイントを登録し、手術野全体に渡る正確な登録を確実にする。3つの
直交平面すべてで、頭皮上にワンドを移動させることにより、登録をコンピュー
タースクリーン上でチェックする。
予防的抗生物質を静脈内注入し、ラシックスと共にステロイド類およびマンニト
ールを含む、脳浮腫を最小にする剤も同様に注入する。3点頭部ピン固定内に頭
を固定し、そして、赤外カメラに対する参照ブロック(reference b
lock)の方向に注意し、赤外LED参照ブロックを頭部ピン固定装置に適用
する。参照ブロックは、カメラへの接続が妨害されないよう、そして手術アクセ
スが妨害されないように、手術野から十分な距離をとるよう、配置する。その後
、枠なしの観察ワンド(viewing wand)を、許容しうる(1.5
mm以下)登録エラーが得られるまで登録する。標準マーカーを除き、そして4
0の頭皮ポイントを登録し、手術野全体に渡る正確な登録を確実にする。3つの
直交平面すべてで、頭皮上にワンドを移動させることにより、登録をコンピュー
タースクリーン上でチェックする。
【0036】 開頭術前に、好ましくは、移植の好ましい部位(例えば腹部)を検査しそして
準備する。例えば、好ましい様式には、臍のすぐ上外側の切開が含まれるであろ
う。上に示される他の部位もまた、許容しうるであろう。本症例においては、1
%リドカインの浸潤後、#10の刃で4 cmの横行切開を作成する。傷の端は
、自己保持開創器で開創し、ポケット準備中の組織縁破壊を最小にする。Met
zenbaumはさみで鋭い切開を行い、そして電気焼灼器(electroc
autery)を用い止血に細心の注意を払い、直筋鞘を暴露する。歯状突起の
ある鉗子およびMetzenbaumはさみを利用し、直筋鞘を皮膚切開と平行
に切開し、それにより腹直筋を暴露する。直筋および鞘の間の傷の頭部および尾
部の広がりにおいて、鈍い指での切開を利用し、一連の相互連絡ポケットを確立
し、各々のチャンバーが直径1.8 cmの、10までの拡散チャンバーの続く
移植を可能にする。直筋鞘下トンネル作成後、通常の生理食塩水中のバシトラシ
ン溶液で傷を多量に灌注し、走行3−0ナイロン縫合を用い一層で閉じ、そして
適切に包帯を巻く(dress)。受容ポケットがまず形成されたら、必要な場
合、正確な頭皮および骨フラップを明示するためワンドを用い、開頭術を行い、
そして標準的な滅菌技術を利用し、手術のため手術野を準備する。
準備する。例えば、好ましい様式には、臍のすぐ上外側の切開が含まれるであろ
う。上に示される他の部位もまた、許容しうるであろう。本症例においては、1
%リドカインの浸潤後、#10の刃で4 cmの横行切開を作成する。傷の端は
、自己保持開創器で開創し、ポケット準備中の組織縁破壊を最小にする。Met
zenbaumはさみで鋭い切開を行い、そして電気焼灼器(electroc
autery)を用い止血に細心の注意を払い、直筋鞘を暴露する。歯状突起の
ある鉗子およびMetzenbaumはさみを利用し、直筋鞘を皮膚切開と平行
に切開し、それにより腹直筋を暴露する。直筋および鞘の間の傷の頭部および尾
部の広がりにおいて、鈍い指での切開を利用し、一連の相互連絡ポケットを確立
し、各々のチャンバーが直径1.8 cmの、10までの拡散チャンバーの続く
移植を可能にする。直筋鞘下トンネル作成後、通常の生理食塩水中のバシトラシ
ン溶液で傷を多量に灌注し、走行3−0ナイロン縫合を用い一層で閉じ、そして
適切に包帯を巻く(dress)。受容ポケットがまず形成されたら、必要な場
合、正確な頭皮および骨フラップを明示するためワンドを用い、開頭術を行い、
そして標準的な滅菌技術を利用し、手術のため手術野を準備する。
【0037】 1%リドカインの浸潤後、頭皮を#10メス刃で切開し、そして頭皮をタオル
クリップで反転させる。必要な場合、どんぐり状のMidas Rex切開ツー
ルの後、踏み板を備えたB−1切開装置の組み合わせを用い、骨板(bone
plate)を除く。あらかじめ存在している骨板は、適切なように除く。硬膜
を開く前に、腫瘍切除中の観察ワンドの登録ポイントとして役立つ、4つの末梢
骨標準をB−1切開装置で作成する。その後、好ましくは十字方式で、#15メ
ス刃およびGerald鉗子を利用し、硬膜を開き、それにより皮質表面を暴露
する。
クリップで反転させる。必要な場合、どんぐり状のMidas Rex切開ツー
ルの後、踏み板を備えたB−1切開装置の組み合わせを用い、骨板(bone
plate)を除く。あらかじめ存在している骨板は、適切なように除く。硬膜
を開く前に、腫瘍切除中の観察ワンドの登録ポイントとして役立つ、4つの末梢
骨標準をB−1切開装置で作成する。その後、好ましくは十字方式で、#15メ
ス刃およびGerald鉗子を利用し、硬膜を開き、それにより皮質表面を暴露
する。
【0038】 その後、術中画像ガイダンスを利用し、腫瘍試料切除を進める。コンピュータ
ーモニターは、分割スクリーン上に各直交平面を示すと共に、観察ワンドに対す
る正しい角度の軸を特徴とする4つの視野を示す。二極性電気焼灼器および#9
または#11 Fraizier吸引装置を用い、腫瘍床の正確な試料採取を指
示するため、各ポイントでワンドを利用し、皮質切除術(cortisecto
my)を行う。生存腫瘍床縁は、コントラスト増強(contrast enh
ancement)の領域としてモニター上に映し出される。生存腫瘍組織が登
録され、そしてオリゴヌクレオチド前処置に許容しうると臨床的に判断されたら
(壊死破片の採取、炎症性反応、およびフィブリノーゲンが減少している)、刺
し込まれた腫瘍鉗子を利用し、凍結切片組織病理学的確認のため、組織を採取す
る。生存新生物形成組織が確認されたら、好ましくは最低500 mgの腫瘍組
織を採取する。続く有効な脱凝集および生存細胞培養の成功を改善するため、ク
ロットおよび壊死破片を含まない生存組織を採取するのに、最善の努力を行う。
ーモニターは、分割スクリーン上に各直交平面を示すと共に、観察ワンドに対す
る正しい角度の軸を特徴とする4つの視野を示す。二極性電気焼灼器および#9
または#11 Fraizier吸引装置を用い、腫瘍床の正確な試料採取を指
示するため、各ポイントでワンドを利用し、皮質切除術(cortisecto
my)を行う。生存腫瘍床縁は、コントラスト増強(contrast enh
ancement)の領域としてモニター上に映し出される。生存腫瘍組織が登
録され、そしてオリゴヌクレオチド前処置に許容しうると臨床的に判断されたら
(壊死破片の採取、炎症性反応、およびフィブリノーゲンが減少している)、刺
し込まれた腫瘍鉗子を利用し、凍結切片組織病理学的確認のため、組織を採取す
る。生存新生物形成組織が確認されたら、好ましくは最低500 mgの腫瘍組
織を採取する。続く有効な脱凝集および生存細胞培養の成功を改善するため、ク
ロットおよび壊死破片を含まない生存組織を採取するのに、最善の努力を行う。
【0039】 試料採取後、画像ガイダンスを利用し、総切除または総切除に近いと判断され
る切除が達成されるまで、さらなる腫瘍減少(debulking)を行う。積
極的な切除は、自己腫瘍拒絶に派生するいかなる移植後炎症も最小にするために
重要であると判断される。
る切除が達成されるまで、さらなる腫瘍減少(debulking)を行う。積
極的な切除は、自己腫瘍拒絶に派生するいかなる移植後炎症も最小にするために
重要であると判断される。
【0040】 有効な量の組織が得られ、そして適切な切除が行われたと満足された場合、い
かなる残った出血に関しても切除腔を点検する。出血はまず、トロンビンに浸し
た綿球で調節する。続いて出血は、二極性電気焼灼器で調節する。適切な止血が
達成されたら、切除腔にトロンビンに浸したサージセル(surgicel)を
並べる。硬膜は、4−0中断および走行縫合で閉じ、そして骨板をチタンプレー
ト系で再添付する。頭皮を2層で:帽状腱膜は2−0ビクリル(vicryl)
中断包埋縫合で、そして頭皮は3−0ナイロンまたはステープルいずれかで閉じ
る。
かなる残った出血に関しても切除腔を点検する。出血はまず、トロンビンに浸し
た綿球で調節する。続いて出血は、二極性電気焼灼器で調節する。適切な止血が
達成されたら、切除腔にトロンビンに浸したサージセル(surgicel)を
並べる。硬膜は、4−0中断および走行縫合で閉じ、そして骨板をチタンプレー
ト系で再添付する。頭皮を2層で:帽状腱膜は2−0ビクリル(vicryl)
中断包埋縫合で、そして頭皮は3−0ナイロンまたはステープルいずれかで閉じ
る。
【0041】 細胞の調製およびIGF−IRアンチセンスDNAでの細胞のインキュベーシ
ョン、第1日および第2日 手術室で採取した腫瘍組織試料を、ex vivoプロセシングのためすぐに
送る。無菌条件下で、生存腫瘍縁組織を、まずメスで穏やかに脱凝集する。コラ
ゲナーゼおよびプロテアーゼ処理で脱凝集を完了する。一連の次第に減少する内
径の注射針を通過させた後、単細胞懸濁物を得る。最後に細胞を洗浄し、そして
10%血清(例えばウシ胎児(calfまたはbovine))を補った培地中
に蒔く。
ョン、第1日および第2日 手術室で採取した腫瘍組織試料を、ex vivoプロセシングのためすぐに
送る。無菌条件下で、生存腫瘍縁組織を、まずメスで穏やかに脱凝集する。コラ
ゲナーゼおよびプロテアーゼ処理で脱凝集を完了する。一連の次第に減少する内
径の注射針を通過させた後、単細胞懸濁物を得る。最後に細胞を洗浄し、そして
10%血清(例えばウシ胎児(calfまたはbovine))を補った培地中
に蒔く。
【0042】 細胞を、4ないし6時間、付着させる。細胞を注意深く洗浄し、そして血清に
存在するヌクレアーゼへの曝露を避けるため、最終体積20 mlの血清不含培
地中で2 mgまでのIGF−IRアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置する
。オリゴヌクレオチド処置は、最低6時間から最大10時間の範囲である。オリ
ゴヌクレオチド処置用量は、1 x 107細胞に関し、確立されている。より
多くの細胞には、相対的により多くのオリゴヌクレオチドを利用してもよい。例
えば1800万の細胞には、血清不含培地36 ml中で、3.6 mgまでの
IGF−IRを用いる。
存在するヌクレアーゼへの曝露を避けるため、最終体積20 mlの血清不含培
地中で2 mgまでのIGF−IRアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置する
。オリゴヌクレオチド処置は、最低6時間から最大10時間の範囲である。オリ
ゴヌクレオチド処置用量は、1 x 107細胞に関し、確立されている。より
多くの細胞には、相対的により多くのオリゴヌクレオチドを利用してもよい。例
えば1800万の細胞には、血清不含培地36 ml中で、3.6 mgまでの
IGF−IRを用いる。
【0043】 一晩処置した後、細胞を採取し、そして注意深く洗浄する。細胞をリン酸緩衝
生理食塩水(カルシウムおよびマグネシウム不含)に再懸濁し、そして200μ
l/チャンバーの体積および1 x 106細胞/チャンバーの密度で拡散チャ
ンバーに入れる。この体積/濃度関係は、低酸素症による細胞死を避けるために
重要である。1つの態様において、FDA規定に従うため、移植直前にチャンバ
ーを5 Gyで放射線照射する。別の好ましい態様は、放射線照射を含まない。
チャンバーは外径1.4 cmおよび高さ0.8 cmの小さいルサイト輪から
なり、両端に親水性膜を持つ。膜は0.1μmの排除制限を有し、これにより損
なわれていない細胞の出入りが妨げられ、そして可溶性因子の拡散が可能になる
。
生理食塩水(カルシウムおよびマグネシウム不含)に再懸濁し、そして200μ
l/チャンバーの体積および1 x 106細胞/チャンバーの密度で拡散チャ
ンバーに入れる。この体積/濃度関係は、低酸素症による細胞死を避けるために
重要である。1つの態様において、FDA規定に従うため、移植直前にチャンバ
ーを5 Gyで放射線照射する。別の好ましい態様は、放射線照射を含まない。
チャンバーは外径1.4 cmおよび高さ0.8 cmの小さいルサイト輪から
なり、両端に親水性膜を持つ。膜は0.1μmの排除制限を有し、これにより損
なわれていない細胞の出入りが妨げられ、そして可溶性因子の拡散が可能になる
。
【0044】 拡散チャンバーの外科的移植、第2日 術後2日目、腹部受容部位を拡散チャンバー移植のため準備する。自己腫瘍細
胞の採取に対する本処置のタイミングは、明らかでなくそして重要である。標的
とするIGF−IRを持つ腫瘍細胞は、足場(anchorage)独立条件下
、例えばin vivoで、アポトーシスを経験するようになっている。アンチ
センスIGF−IRオリゴヌクレオチドで処置した腫瘍細胞が患者の直筋鞘(r
ectal sheath)内への移植前に拡散チャンバーにおいてアポトーシ
スを経験する状態を避けるため、腫瘍細胞の採取および拡散チャンバーの移植の
間に、1時間の時間幅(最大)が確立されてきている。細胞採取、および生物学
的シグナルを生成する自己由来処置腫瘍細胞の再移植の間の時間幅は、誘発プロ
セスのピークがin vivoで起こるためには、好ましくは1時間を超えては
ならない。好ましくは、細胞採取およびあらかじめ処置した細胞の再移植は、可
能な限り狭い時間幅内で行われる。
胞の採取に対する本処置のタイミングは、明らかでなくそして重要である。標的
とするIGF−IRを持つ腫瘍細胞は、足場(anchorage)独立条件下
、例えばin vivoで、アポトーシスを経験するようになっている。アンチ
センスIGF−IRオリゴヌクレオチドで処置した腫瘍細胞が患者の直筋鞘(r
ectal sheath)内への移植前に拡散チャンバーにおいてアポトーシ
スを経験する状態を避けるため、腫瘍細胞の採取および拡散チャンバーの移植の
間に、1時間の時間幅(最大)が確立されてきている。細胞採取、および生物学
的シグナルを生成する自己由来処置腫瘍細胞の再移植の間の時間幅は、誘発プロ
セスのピークがin vivoで起こるためには、好ましくは1時間を超えては
ならない。好ましくは、細胞採取およびあらかじめ処置した細胞の再移植は、可
能な限り狭い時間幅内で行われる。
【0045】 病床で、患者を処置に備える;患者を10 mgのVersedで鎮静し、そ
して傷感染予防のため1 gのAncef抗生物質を注入する。先に準備した腹
部受容部位を、標準的な滅菌技術を用い、暴露し、そして0.5%Sensor
caineを腹部切開に注射する。Metzenbaumはさみを利用し、受容
部位を開き、それにより前日に切開した直筋鞘を暴露する。フィブリンはシグナ
ル生成に干渉し、そしてそれにより処置の有効性を減少させる可能性があるため
、過剰な残った出血またはフィブリン性滲出物の存在は回避するべきである。再
び、持ち運び可能な熱焼灼装置を用い、小さいものであっても、いかなる出血源
も調節するよう、注意を払う。いかなる残ったフィブリン成分も、通常の生理食
塩水中のバシトラシン溶液で多量に灌注し、除く。各々体積200μlの腫瘍細
胞懸濁物を含む、10までの滅菌拡散チャンバーを、先に記載した直筋鞘ポケッ
トに移植する。生物学的線量測定(dosimetry)は、最大1 x 10 7 細胞のための10のチャンバー中の1 x 106細胞/チャンバーの移植を含
む。すべての症例で、広い膜の側が腹直筋に対し水平になるように、拡散チャン
バーを移植する。チャンバーの方向は、誘発シグナルの生物学的に有効な伝達に
重要である。受容部位としての腹直筋を含む、本方式の選択は、この領域のリン
パドレナージが鼠径部リンパ節を介し、大動脈周囲の節に進み、続いて胸管に排
出されるため、重要である。このドレナージ経路は、形質導入細胞由来の拡散可
能物質が、移植部位からおよそ3センチメートルである局所リンパ節を介し、末
梢リンパ組織と出会うことを可能にする。
して傷感染予防のため1 gのAncef抗生物質を注入する。先に準備した腹
部受容部位を、標準的な滅菌技術を用い、暴露し、そして0.5%Sensor
caineを腹部切開に注射する。Metzenbaumはさみを利用し、受容
部位を開き、それにより前日に切開した直筋鞘を暴露する。フィブリンはシグナ
ル生成に干渉し、そしてそれにより処置の有効性を減少させる可能性があるため
、過剰な残った出血またはフィブリン性滲出物の存在は回避するべきである。再
び、持ち運び可能な熱焼灼装置を用い、小さいものであっても、いかなる出血源
も調節するよう、注意を払う。いかなる残ったフィブリン成分も、通常の生理食
塩水中のバシトラシン溶液で多量に灌注し、除く。各々体積200μlの腫瘍細
胞懸濁物を含む、10までの滅菌拡散チャンバーを、先に記載した直筋鞘ポケッ
トに移植する。生物学的線量測定(dosimetry)は、最大1 x 10 7 細胞のための10のチャンバー中の1 x 106細胞/チャンバーの移植を含
む。すべての症例で、広い膜の側が腹直筋に対し水平になるように、拡散チャン
バーを移植する。チャンバーの方向は、誘発シグナルの生物学的に有効な伝達に
重要である。受容部位としての腹直筋を含む、本方式の選択は、この領域のリン
パドレナージが鼠径部リンパ節を介し、大動脈周囲の節に進み、続いて胸管に排
出されるため、重要である。このドレナージ経路は、形質導入細胞由来の拡散可
能物質が、移植部位からおよそ3センチメートルである局所リンパ節を介し、末
梢リンパ組織と出会うことを可能にする。
【0046】 直筋鞘は、拡散チャンバーを水平方向に固定するため、2−0ビクリル中断縫
合で、再近置する。受容部位を走行3−0ナイロン連動(interlock)
縫合で閉じ、そして適切に包帯を巻く。
合で、再近置する。受容部位を走行3−0ナイロン連動(interlock)
縫合で閉じ、そして適切に包帯を巻く。
【0047】 本プロトコルで、最初の4人の患者を処置した際、高頻度で、おそらく本処置
に起因すると考えられる深部静脈血栓症が発生した。したがって、本プロトコル
に加え、低分子量ヘパリン(分画化ヘパリンまたはLOVENOX(登録商標)
)を1日40 mg、皮下注射で使用する。LOVENOX(登録商標)は、3
ヶ月間、毎日皮下注射として続ける。
に起因すると考えられる深部静脈血栓症が発生した。したがって、本プロトコル
に加え、低分子量ヘパリン(分画化ヘパリンまたはLOVENOX(登録商標)
)を1日40 mg、皮下注射で使用する。LOVENOX(登録商標)は、3
ヶ月間、毎日皮下注射として続ける。
【0048】 拡散チャンバーの外科的除去、第3日 病床で、患者を拡散チャンバーの外科的除去法のため備える。患者を10 m
gのVersedで鎮静し、そして傷感染予防のため1 gのAncef抗生物
質を注入する。先に準備した腹部受容部位を、標準的な滅菌法を用い、暴露し、
そして準備する。該部位を覆い、そして0.5%Sensorcaineを腹部
切開に注射する。Metzenbaumはさみを利用し、傷を開き、それにより
前日に病床で大まかに近置した直筋鞘を暴露する。滅菌拡散チャンバーを直筋鞘
ポケットから回収し、そして実験室に持ちかえり注意深く検査する。特に、膜の
完全性を点検し、そしてフィブリノーゲンの存在に関し、各チャンバーの内容物
を注意深く観察する。各チャンバーから回収した体積を測定し、そしてこの体積
は、元来記録された体積と同一でなければならない。各チャンバーの細胞内容物
を注意深く検査し、そして生存する細胞回収の率を定量化する。2−0ビクリル
中断縫合で直筋鞘を再近置し、そして2−0ビクリル中断水平さし縫い縫合で皮
下組織を再近置する。3−0ナイロンを利用した中断垂直さし縫い縫合で皮膚を
再近置し、そしてその後、傷に適切に包帯を巻く。
gのVersedで鎮静し、そして傷感染予防のため1 gのAncef抗生物
質を注入する。先に準備した腹部受容部位を、標準的な滅菌法を用い、暴露し、
そして準備する。該部位を覆い、そして0.5%Sensorcaineを腹部
切開に注射する。Metzenbaumはさみを利用し、傷を開き、それにより
前日に病床で大まかに近置した直筋鞘を暴露する。滅菌拡散チャンバーを直筋鞘
ポケットから回収し、そして実験室に持ちかえり注意深く検査する。特に、膜の
完全性を点検し、そしてフィブリノーゲンの存在に関し、各チャンバーの内容物
を注意深く観察する。各チャンバーから回収した体積を測定し、そしてこの体積
は、元来記録された体積と同一でなければならない。各チャンバーの細胞内容物
を注意深く検査し、そして生存する細胞回収の率を定量化する。2−0ビクリル
中断縫合で直筋鞘を再近置し、そして2−0ビクリル中断水平さし縫い縫合で皮
下組織を再近置する。3−0ナイロンを利用した中断垂直さし縫い縫合で皮膚を
再近置し、そしてその後、傷に適切に包帯を巻く。
【0049】 実施例2:自己由来細胞株、同種細胞株、または異種細胞株の移植 本プロトコルのための外科的候補は、腫瘍除去のための開頭術の候補ではない
。本群の患者の例には、これらの腫瘍が危険な位置にあるため、しばしば生検な
しにX線撮影により診断される腫瘍である、脳幹神経膠腫の患者が含まれるであ
ろう。利用される外科的範例は、第2日および第3日に関し記載されるものと同
じである。
。本群の患者の例には、これらの腫瘍が危険な位置にあるため、しばしば生検な
しにX線撮影により診断される腫瘍である、脳幹神経膠腫の患者が含まれるであ
ろう。利用される外科的範例は、第2日および第3日に関し記載されるものと同
じである。
【0050】 第1日 第1日目、適切な細胞株を選択し、そして新たに採取された自己組織に関する
ものと同じ指定にしたがい、前処置する。in vitroインキュベーション
期間およびオリゴヌクレオチドの用量もまた、上に詳細に記載される採取自己試
料に関するものと同じままであろう。
ものと同じ指定にしたがい、前処置する。in vitroインキュベーション
期間およびオリゴヌクレオチドの用量もまた、上に詳細に記載される採取自己試
料に関するものと同じままであろう。
【0051】 両群に関する移植後監視 チャンバーの除去後、患者の監視が始まる。標準的な開頭術後患者に日常的で
あるように、日常的な生命徴候および一連の神経学的検査を進める。術後第1週
および第2週にそしてその後は毎月、ガドリニウムを用いたおよび用いないMR
Iスキャンを行う。
あるように、日常的な生命徴候および一連の神経学的検査を進める。術後第1週
および第2週にそしてその後は毎月、ガドリニウムを用いたおよび用いないMR
Iスキャンを行う。
【0052】 方法のさらなる詳細 本発明の好ましい態様において、12の好ましい段階を行う。画像ガイド開頭
術(1)は腫瘍を切除するために行う。腫瘍を除去し、そしてリン酸緩衝生理食
塩水に入れる(2)。続いて、腫瘍組織をペトリ皿に移し、ここで、メスを用い
腫瘍を細かい破片に細分する(3)。酵素的消化により脱凝集を続け、そして単
細胞をT−25組織培養フラスコに蒔く;4−6時間後、細胞が付着したら、最
終体積20 mlの血清不含培地中でのIGF−IRに対するアンチセンスDN
A 2 mgと、最低6時間インキュベーションする(4)。その後、細胞を剥
がし、そして15 mlの円錐試験管に移し、何回か洗浄する(5)。次に、細
胞を拡散チャンバーに被包する(6)。移植前に、拡散チャンバーに被包した細
胞を5 Gyの放射線で放射線照射する(7)。拡散チャンバーに被包した細胞
を、患者の直筋鞘に外科的に移植し(8)、そしてアポトーシスが20時間以内
にin vivoで起こる。その後、チャンバーを患者の直筋鞘から除き、そし
て傷を永久的に閉じる(9)。チャンバーを開き、そして細胞を回収する(9)
。続いて、細胞をエッペンドルフチューブに移す(10)。次に細胞を洗浄し(
11)、そして拡散チャンバーから回収した細胞を、トリパンブルー排除により
生存度に関し解析し、そして血球計算板で定量化する(12)。
術(1)は腫瘍を切除するために行う。腫瘍を除去し、そしてリン酸緩衝生理食
塩水に入れる(2)。続いて、腫瘍組織をペトリ皿に移し、ここで、メスを用い
腫瘍を細かい破片に細分する(3)。酵素的消化により脱凝集を続け、そして単
細胞をT−25組織培養フラスコに蒔く;4−6時間後、細胞が付着したら、最
終体積20 mlの血清不含培地中でのIGF−IRに対するアンチセンスDN
A 2 mgと、最低6時間インキュベーションする(4)。その後、細胞を剥
がし、そして15 mlの円錐試験管に移し、何回か洗浄する(5)。次に、細
胞を拡散チャンバーに被包する(6)。移植前に、拡散チャンバーに被包した細
胞を5 Gyの放射線で放射線照射する(7)。拡散チャンバーに被包した細胞
を、患者の直筋鞘に外科的に移植し(8)、そしてアポトーシスが20時間以内
にin vivoで起こる。その後、チャンバーを患者の直筋鞘から除き、そし
て傷を永久的に閉じる(9)。チャンバーを開き、そして細胞を回収する(9)
。続いて、細胞をエッペンドルフチューブに移す(10)。次に細胞を洗浄し(
11)、そして拡散チャンバーから回収した細胞を、トリパンブルー排除により
生存度に関し解析し、そして血球計算板で定量化する(12)。
【0053】 処置の第1日の詳細は以下の通りである。手術室で採取した腫瘍組織を50
ccの円錐試験管に入れ、BL−2施設に運ぶ。BL−2施設において、腫瘍を
洗浄し、赤血球を除き、そしてペトリ皿に移し、そしてPBS中でメスで細かく
刻む(1)。細胞を15 mlの試験管に移し、そしてPBS中で洗浄する(2
)。その後、細胞をペトリ皿に移し、そして酵素消化を繰り返し、解離させる(
3)。次に、細胞を15 mlの円錐試験管に移し、そして洗浄する(4)。細
胞をT−25組織培養フラスコに入れ、そして付着させる(5)。
ccの円錐試験管に入れ、BL−2施設に運ぶ。BL−2施設において、腫瘍を
洗浄し、赤血球を除き、そしてペトリ皿に移し、そしてPBS中でメスで細かく
刻む(1)。細胞を15 mlの試験管に移し、そしてPBS中で洗浄する(2
)。その後、細胞をペトリ皿に移し、そして酵素消化を繰り返し、解離させる(
3)。次に、細胞を15 mlの円錐試験管に移し、そして洗浄する(4)。細
胞をT−25組織培養フラスコに入れ、そして付着させる(5)。
【0054】 IGF−IRアンチセンスDNAを、最終体積20 mlの血清不含培地中の
2 mgのIGF−IRアンチセンスDNAの、最低6時間のインキュベーショ
ン培地に添加する前に、付着させることが必要である。第2日目、細胞をトリプ
シンで剥がし;そして細胞を15 mlの円錐試験管に移し、そして注意深く洗
浄する(1)。10%血清を補った培地を添加することによりトリプシンの効果
を停止し;200μl中に懸濁した106細胞を各拡散チャンバーに装填し、そ
して拡散チャンバーをその後、5 Gyの放射線で放射線照射する(2)。
2 mgのIGF−IRアンチセンスDNAの、最低6時間のインキュベーショ
ン培地に添加する前に、付着させることが必要である。第2日目、細胞をトリプ
シンで剥がし;そして細胞を15 mlの円錐試験管に移し、そして注意深く洗
浄する(1)。10%血清を補った培地を添加することによりトリプシンの効果
を停止し;200μl中に懸濁した106細胞を各拡散チャンバーに装填し、そ
して拡散チャンバーをその後、5 Gyの放射線で放射線照射する(2)。
【0055】 第3日目、拡散チャンバーを患者の腹部から採取する。各拡散チャンバーを開
き、そして細胞内容物をエッペンドルフピペットで除く(1)。細胞をその後、
1 mlエッペンドルフチューブに移し、そして洗浄する(2)。細胞を血球計
算板中で計数する(3)。拡散チャンバーから回収した細胞をT−25組織培養
フラスコに再度蒔き、生存度を評価する(4)。
き、そして細胞内容物をエッペンドルフピペットで除く(1)。細胞をその後、
1 mlエッペンドルフチューブに移し、そして洗浄する(2)。細胞を血球計
算板中で計数する(3)。拡散チャンバーから回収した細胞をT−25組織培養
フラスコに再度蒔き、生存度を評価する(4)。
【0056】 第1相研究に参加した患者における観察 第1相研究に参加した12人の患者における観察を提示する。上述のように、
各患者に関し、開頭術を行い、そして腹部受容部位をチャンバー移植のため、準
備した。手術で切除した腫瘍を、BL−2施設で脱凝集し、そして培養で付着し
た細胞を、IGF−IRアンチセンスオリゴヌクレオチドと一晩インキュベーシ
ョンした。手術24時間以内に、107までの処置細胞を拡散チャンバーに被包
し、非致死的に放射線照射し、そしてさらに24時間の期間、移植した。チャン
バー回収後、一連のMRIおよび臨床検査で患者を追跡した。
各患者に関し、開頭術を行い、そして腹部受容部位をチャンバー移植のため、準
備した。手術で切除した腫瘍を、BL−2施設で脱凝集し、そして培養で付着し
た細胞を、IGF−IRアンチセンスオリゴヌクレオチドと一晩インキュベーシ
ョンした。手術24時間以内に、107までの処置細胞を拡散チャンバーに被包
し、非致死的に放射線照射し、そしてさらに24時間の期間、移植した。チャン
バー回収後、一連のMRIおよび臨床検査で患者を追跡した。
【0057】 アンチセンス処置後、処置細胞のIGF−IRレベルは、ウェスタンブロッテ
ィングにより測定されるように、10%以下に落ちた。24時間の移植後、アン
チセンス処置細胞の2%未満しか回収できなかった。追跡調査では、10の評価
可能な患者のうち6人が部分的なまたは完全なX線および臨床的反応を示した。
同情的な(compassionate)再処置反応を含めると、8つの処置反
応が観察された。最初の4人の患者における深部静脈血栓症のほかは、他の処置
関連副作用は見られなかった。
ィングにより測定されるように、10%以下に落ちた。24時間の移植後、アン
チセンス処置細胞の2%未満しか回収できなかった。追跡調査では、10の評価
可能な患者のうち6人が部分的なまたは完全なX線および臨床的反応を示した。
同情的な(compassionate)再処置反応を含めると、8つの処置反
応が観察された。最初の4人の患者における深部静脈血栓症のほかは、他の処置
関連副作用は見られなかった。
【0058】 本処置はよく寛容され、そして高い率のX線および臨床的反応を得た。さらに
、処置後腫瘍試料の組織学的観察は、処置関連効果を支持した。これらのデータ
は、本範例を利用し、非毒性全身性処置効果が達成されることを示す。
、処置後腫瘍試料の組織学的観察は、処置関連効果を支持した。これらのデータ
は、本範例を利用し、非毒性全身性処置効果が達成されることを示す。
【0059】 患者および方法 本プロトコルは、FDAおよびThomas Jefferson Univ
ersityの施設再検討委員会(Institutional Review
Board)により再検討され、そして認可された。WHO III度または
IV度の神経膠腫と診断され、放射線療法を含む、慣用的な療法に失敗した患者
が登録された。総数12の成人患者、9人の男性および3人の女性(年齢32な
いし68歳、図1)が登録された。4人の患者は、未分化神経膠星状細胞腫を有
し、そして8人は神経膠芽腫を有し、そして各群の1人の患者は、多病巣性の疾
患を有した。最初の診断および本処置の介入の間の平均時間間隔は、122週だ
った。腫瘍再発は、9人の患者で臨床的症状と関連し、そしてすべての12の患
者で監視MRIにより立証された。
ersityの施設再検討委員会(Institutional Review
Board)により再検討され、そして認可された。WHO III度または
IV度の神経膠腫と診断され、放射線療法を含む、慣用的な療法に失敗した患者
が登録された。総数12の成人患者、9人の男性および3人の女性(年齢32な
いし68歳、図1)が登録された。4人の患者は、未分化神経膠星状細胞腫を有
し、そして8人は神経膠芽腫を有し、そして各群の1人の患者は、多病巣性の疾
患を有した。最初の診断および本処置の介入の間の平均時間間隔は、122週だ
った。腫瘍再発は、9人の患者で臨床的症状と関連し、そしてすべての12の患
者で監視MRIにより立証された。
【0060】 すべての患者は、先に記載されるように、MRIに基づく画像ガイド腫瘍切除
を経験した。必要な場合、流暢な(eloquent)皮質の機能を保持するた
め、術中発語および/または運動皮質記録(motor corticogra
phy)を行った。開頭術前に、チャンバー移植のための腹部受容部位を準備し
、直筋鞘を分割し、そして直筋および鞘の間に相互連絡ポケットを確立した。
を経験した。必要な場合、流暢な(eloquent)皮質の機能を保持するた
め、術中発語および/または運動皮質記録(motor corticogra
phy)を行った。開頭術前に、チャンバー移植のための腹部受容部位を準備し
、直筋鞘を分割し、そして直筋および鞘の間に相互連絡ポケットを確立した。
【0061】 画像ガイド切除中、生存腫瘍組織を凍結切片により確認し、そして続く脱凝集
および処置のため、BL−2施設に送った。腫瘍試料を、無菌条件下で、まずメ
スでそしてその後酵素消化で穏やかに脱凝集させた。細胞を完全培地(10%ウ
シ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびグルタミンを補ったDM
EM)中に蒔いた。細胞が付着したら、注意深く洗浄し、そして血清不含培地(
1μM 硫酸鉄および0.1% BSAフラクションVを補ったDMEM)に移
し、そしてIGF−IRアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置した。IGF−
IR RNAを標的とし、そして開始メチオニンから6ヌクレオチド下流で始ま
る、18量体のホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド(GGACCC
TCCTCCGGAGCC;配列番号3)を用いた。本アンチセンスオリゴデオ
キシヌクレオチドは、Lynx Therapeutics(カリフォルニア州
ヘイワード)により合成された、ロット#LR4437−002Aであり、本明
細書に他に記載されるのと同じロットである。2 mgアンチセンス/107細
胞の用量を用いた最低6時間のインキュベーションの後、細胞を採取し、カルシ
ウムおよびマグネシウム不含PBSで注意深く洗浄し、そして106細胞/20
0μl/チャンバーの密度で拡散チャンバーに入れた。チャンバーは、0.1m
の孔サイズの親水性膜を両端に持つ、小さなルサイト輪(直径1.4 cm)で
ある。これらは可溶性因子(例えば栄養素またはペプチド)の通過を可能にし、
損なわれていない(intact)細胞の出入りを妨げる。
および処置のため、BL−2施設に送った。腫瘍試料を、無菌条件下で、まずメ
スでそしてその後酵素消化で穏やかに脱凝集させた。細胞を完全培地(10%ウ
シ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびグルタミンを補ったDM
EM)中に蒔いた。細胞が付着したら、注意深く洗浄し、そして血清不含培地(
1μM 硫酸鉄および0.1% BSAフラクションVを補ったDMEM)に移
し、そしてIGF−IRアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置した。IGF−
IR RNAを標的とし、そして開始メチオニンから6ヌクレオチド下流で始ま
る、18量体のホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド(GGACCC
TCCTCCGGAGCC;配列番号3)を用いた。本アンチセンスオリゴデオ
キシヌクレオチドは、Lynx Therapeutics(カリフォルニア州
ヘイワード)により合成された、ロット#LR4437−002Aであり、本明
細書に他に記載されるのと同じロットである。2 mgアンチセンス/107細
胞の用量を用いた最低6時間のインキュベーションの後、細胞を採取し、カルシ
ウムおよびマグネシウム不含PBSで注意深く洗浄し、そして106細胞/20
0μl/チャンバーの密度で拡散チャンバーに入れた。チャンバーは、0.1m
の孔サイズの親水性膜を両端に持つ、小さなルサイト輪(直径1.4 cm)で
ある。これらは可溶性因子(例えば栄養素またはペプチド)の通過を可能にし、
損なわれていない(intact)細胞の出入りを妨げる。
【0062】 開頭術後の最初の日、拡散チャンバー移植のため、腹部受容部位を病床で開い
た。受容部位が開かれるのと同時に、ex vivoで、IGF−IRアンチセ
ンスデオキシオリゴヌクレオチドで処置した腫瘍細胞が剥がれ、チャンバーに被
包され、そして非致死的に放射線照射(5 Gy)されるように、時間幅を選択
した。局所麻酔および抗生物質予防処置後、直筋鞘ポケットを暴露し、そして1
0までの滅菌拡散チャンバーを移植した。
た。受容部位が開かれるのと同時に、ex vivoで、IGF−IRアンチセ
ンスデオキシオリゴヌクレオチドで処置した腫瘍細胞が剥がれ、チャンバーに被
包され、そして非致死的に放射線照射(5 Gy)されるように、時間幅を選択
した。局所麻酔および抗生物質予防処置後、直筋鞘ポケットを暴露し、そして1
0までの滅菌拡散チャンバーを移植した。
【0063】 開頭術後の2日目、拡散チャンバーを直筋鞘ポケットから回収し、そして傷を
閉じた。回収後の解析のため、チャンバーをBL−2施設に運んだ。移植後監視
には、いくつかの臨床およびMRI検査を含んだ。
閉じた。回収後の解析のため、チャンバーをBL−2施設に運んだ。移植後監視
には、いくつかの臨床およびMRI検査を含んだ。
【0064】 同情的(compassionate)再処置 抗腫瘍効果が観察されたため、IGF−IRアンチセンスでの最初の処置に失
敗した3人の患者を、より高い生物学的用量で再処置した。FDAの認可を受け
、許容しうるチャンバー数を106細胞/チャンバーの20のチャンバーに増や
し、そしてex vivoインキュベーション中、2 mg /107細胞でア
ンチセンス用量を維持した。
敗した3人の患者を、より高い生物学的用量で再処置した。FDAの認可を受け
、許容しうるチャンバー数を106細胞/チャンバーの20のチャンバーに増や
し、そしてex vivoインキュベーション中、2 mg /107細胞でア
ンチセンス用量を維持した。
【0065】 処置範例の有効性、特異性、および生物学的安全性:チャンバー移植前のex
vivo評価 アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの生物学的活性を調節するため、I
GF−1R標的化の有効性および特異性を両方評価した。IGF−1R標的化に
対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの有効性は、ウェスタンブロッ
ティングによりタンパク質レベルでIGF−1R発現に対する影響を測定するこ
とにより、決定した(図2、上のパネルを参照されたい)。過剰な組織が入手可
能な場合、試料(N=6)を解析し、そしてIGF−1Rアンチセンス処置後、
IGF−1Rの存在はIGF−1Rレベルの90%以上の減少を伴うことが明ら
かになった(図2、上のパネル)。アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド標
的化の特異性は、細胞表面での他のチロシンキナーゼ受容体、例えばフォーカル
アドヒージョンキナーゼの発現に対する影響を除外することにより、決定した(
図2、下のパネルを参照されたい)。
vivo評価 アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの生物学的活性を調節するため、I
GF−1R標的化の有効性および特異性を両方評価した。IGF−1R標的化に
対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの有効性は、ウェスタンブロッ
ティングによりタンパク質レベルでIGF−1R発現に対する影響を測定するこ
とにより、決定した(図2、上のパネルを参照されたい)。過剰な組織が入手可
能な場合、試料(N=6)を解析し、そしてIGF−1Rアンチセンス処置後、
IGF−1Rの存在はIGF−1Rレベルの90%以上の減少を伴うことが明ら
かになった(図2、上のパネル)。アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド標
的化の特異性は、細胞表面での他のチロシンキナーゼ受容体、例えばフォーカル
アドヒージョンキナーゼの発現に対する影響を除外することにより、決定した(
図2、下のパネルを参照されたい)。
【0066】 移植前の自己腫瘍細胞に外来(adventitious)剤が存在しないこ
とは、Gram(Fisher Diagnostics)およびマイコプラズ
マ染色キット(Sigma Chemicals)を含む、商業的に入手可能な
キットの使用により、確認した。
とは、Gram(Fisher Diagnostics)およびマイコプラズ
マ染色キット(Sigma Chemicals)を含む、商業的に入手可能な
キットの使用により、確認した。
【0067】 チャンバー回収後のex vivo評価 拡散チャンバーの完全性は、移植前および後の体積を測定することにより、決
定した。各チャンバーに最初に装填した体積は200 mlであり、そして14
6の移植チャンバーの各々から回収した体積は198±2 mlであった。拡散
チャンバーの移植24時間後に測定した細胞回収は、最初に移植した細胞数の2
%未満であった。チャンバーから回収した細胞を注意深く顕微鏡解析すると、腫
瘍細胞のみ(そしてトリパンブルー染色により示されるように、ほとんど非生存
)を回収することが可能であったことが示された。リンパ球、単球、マクロファ
ージ、または樹状細胞を含む他のいかなる細胞種も同定できなかった。また、腹
部受容部位から得られた試料中のGFAP陽性細胞(神経膠腫細胞のマーカー)
の存在も除外された。
定した。各チャンバーに最初に装填した体積は200 mlであり、そして14
6の移植チャンバーの各々から回収した体積は198±2 mlであった。拡散
チャンバーの移植24時間後に測定した細胞回収は、最初に移植した細胞数の2
%未満であった。チャンバーから回収した細胞を注意深く顕微鏡解析すると、腫
瘍細胞のみ(そしてトリパンブルー染色により示されるように、ほとんど非生存
)を回収することが可能であったことが示された。リンパ球、単球、マクロファ
ージ、または樹状細胞を含む他のいかなる細胞種も同定できなかった。また、腹
部受容部位から得られた試料中のGFAP陽性細胞(神経膠腫細胞のマーカー)
の存在も除外された。
【0068】 エノキサパリン(enoxaparin)予防処置 最初の4人の患者でDVTが予測された率より高い率で見られたことに基づき
、続くすべての患者に、DVT予防処方計画を確立した。開頭術後の最初の日、
エノキサパリン予防処置の3ヶ月処方計画を開始し、該計画には、毎日40 m
gの皮下注射を伴った。エノキサパリン処置の12週間の過程の直前および完了
後に、非侵襲ドップラー研究を行った。
、続くすべての患者に、DVT予防処方計画を確立した。開頭術後の最初の日、
エノキサパリン予防処置の3ヶ月処方計画を開始し、該計画には、毎日40 m
gの皮下注射を伴った。エノキサパリン処置の12週間の過程の直前および完了
後に、非侵襲ドップラー研究を行った。
【0069】 反応評価 すべての患者は、矢状(sagittal)、軸性(axial)、前頭(c
oronal)面における、T1およびT2加重コントラスト前画像およびT1
加重コントラスト後画像からなる標準的脳画像化プロトコルを用い、一連のMR
I評価を受けた。MRIスキャンは、処置開始時に残っている腫瘍を立証するた
め、48時間以内に得た。疾患の進行、後退または安定性は、以下を含む一連の
研究の間の7つの画像特性の評価における変化により、決定した:(1)局所質
量(mass)効果;(2)T2加重異常の大きさ(例えば浮腫、腫瘍、放射線
変化);(3)増強領域の大きさ;(4)増強の特性(例えば小結節形成(no
dularity)の進行または後退);(5)増強領域の強度;(6)深部白
質路の侵襲;および(7)遠位進行。X線評価は、一連の研究比較可能画像が評
価される際、これらの特性のいずれにおける変化も評価することにより、行った
。各画像特性は、増加、減少または変化なしとして評価した。すべての症例で、
MRI比較は、各患者に関し、1人の神経放射線学者により、行った。最初の比
較は、処置直後に行ったMRI研究および療法の開始からおよそ4週間後に行っ
た追跡検査の間の変化を評価した。続く比較は、2ヶ月間隔、そして後には3ヶ
月間隔の変化を評価した。
oronal)面における、T1およびT2加重コントラスト前画像およびT1
加重コントラスト後画像からなる標準的脳画像化プロトコルを用い、一連のMR
I評価を受けた。MRIスキャンは、処置開始時に残っている腫瘍を立証するた
め、48時間以内に得た。疾患の進行、後退または安定性は、以下を含む一連の
研究の間の7つの画像特性の評価における変化により、決定した:(1)局所質
量(mass)効果;(2)T2加重異常の大きさ(例えば浮腫、腫瘍、放射線
変化);(3)増強領域の大きさ;(4)増強の特性(例えば小結節形成(no
dularity)の進行または後退);(5)増強領域の強度;(6)深部白
質路の侵襲;および(7)遠位進行。X線評価は、一連の研究比較可能画像が評
価される際、これらの特性のいずれにおける変化も評価することにより、行った
。各画像特性は、増加、減少または変化なしとして評価した。すべての症例で、
MRI比較は、各患者に関し、1人の神経放射線学者により、行った。最初の比
較は、処置直後に行ったMRI研究および療法の開始からおよそ4週間後に行っ
た追跡検査の間の変化を評価した。続く比較は、2ヶ月間隔、そして後には3ヶ
月間隔の変化を評価した。
【0070】 一連の臨床検査は、神経外科医および神経学者により、独立に行った。成果状
態は、Karnofsky成果スケール(KPS)にしたがって評価した。 反応は、処置後、以下の規準を利用し、評価した: 完全反応:一連の研究の間のすべての評価可能な画像特性の、完全な消解(r
esolution)までの、または術後および/または放射線変化と矛盾しな
い特徴を持つ安定した画像までの改善が、神経学的および全身性身体検査の改善
または安定と共に、コルチコステロイド投薬なしに、少なくとも1ヶ月続くもの
。
態は、Karnofsky成果スケール(KPS)にしたがって評価した。 反応は、処置後、以下の規準を利用し、評価した: 完全反応:一連の研究の間のすべての評価可能な画像特性の、完全な消解(r
esolution)までの、または術後および/または放射線変化と矛盾しな
い特徴を持つ安定した画像までの改善が、神経学的および全身性身体検査の改善
または安定と共に、コルチコステロイド投薬なしに、少なくとも1ヶ月続くもの
。
【0071】 部分反応:2つまたはそれ以上の評価可能な画像特性の改善が、神経学的およ
び身体検査の改善または安定と共に、安定したまたは減少したコルチコステロイ
ド用量で、少なくとも1ヶ月続くもの。
び身体検査の改善または安定と共に、安定したまたは減少したコルチコステロイ
ド用量で、少なくとも1ヶ月続くもの。
【0072】 安定疾患:一連の研究の間の画像特性にいかなる有意な変化もなく、神経学的
および身体検査の改善または安定と共に、安定したまたは減少したコルチコステ
ロイド用量で、少なくとも1ヶ月続くもの。
および身体検査の改善または安定と共に、安定したまたは減少したコルチコステ
ロイド用量で、少なくとも1ヶ月続くもの。
【0073】 進行性疾患:一連の研究の間の画像特性の増加が、神経学的および身体検査の
悪化、および安定したまたは増加するコルチコステロイド用量を伴うもの。 結果 開頭術で採取した腫瘍細胞を利用し、手術可能な悪性神経膠腫を持つ12人の
患者を安全に処置し、平均追跡調査は67±7週間(40ないし100週間の範
囲)であった。3症例における同情的再処置を例外とし、これらの患者は、適切
な支持的内科的および/または外科的療法を除き、研究下で、いかなる他の処置
も受けなかった。いかなる処置関連毒性も同定されず、そして臨床検査は、完全
血液計測、肝機能研究、CD4+およびCD8+計数、ANA、アンチ−ssD
NAおよびアンチdsDNA抗体検査が正常であり、これを支持した。
悪化、および安定したまたは増加するコルチコステロイド用量を伴うもの。 結果 開頭術で採取した腫瘍細胞を利用し、手術可能な悪性神経膠腫を持つ12人の
患者を安全に処置し、平均追跡調査は67±7週間(40ないし100週間の範
囲)であった。3症例における同情的再処置を例外とし、これらの患者は、適切
な支持的内科的および/または外科的療法を除き、研究下で、いかなる他の処置
も受けなかった。いかなる処置関連毒性も同定されず、そして臨床検査は、完全
血液計測、肝機能研究、CD4+およびCD8+計数、ANA、アンチ−ssD
NAおよびアンチdsDNA抗体検査が正常であり、これを支持した。
【0074】 生物学的安全性 12症例すべてで、移植前に細胞を評価し、そして外来剤を含まないことを見
出し、そして移植後の期間、傷感染のいかなる臨床的徴候もなかった(N=12
)。評価可能な場合、移植部位で、いかなる神経膠腫瘍分散(seeding)
も同定されなかった(N=6)。総数156の拡散チャンバーを移植し(図3A
および3B)、そして回収時、いかなる膜破壊も見られなかった。自己腫瘍細胞
のみを回収し、そしてすべての症例で、トリパンブルー染色により評価されるよ
うに、回収細胞の2%未満が生存可能であった。
出し、そして移植後の期間、傷感染のいかなる臨床的徴候もなかった(N=12
)。評価可能な場合、移植部位で、いかなる神経膠腫瘍分散(seeding)
も同定されなかった(N=6)。総数156の拡散チャンバーを移植し(図3A
および3B)、そして回収時、いかなる膜破壊も見られなかった。自己腫瘍細胞
のみを回収し、そしてすべての症例で、トリパンブルー染色により評価されるよ
うに、回収細胞の2%未満が生存可能であった。
【0075】 これまでに見られた唯一の処置関連合併症は、最初の4人の患者における深部
静脈血栓症(DVT)の高発生である(患者1−4;図3Aを参照されたい)。
続いて、以後処置されるすべての患者のプロトコルにおいて、分画化低分子量ヘ
パリン(エノキサパリン)を利用した予防処方計画を開始し;後の10人の患者
のうち8人でDVTが発生しなかった。同情的処置で再処置したどちらの患者に
もDVTが発生し、1人はエノキサパリン投与中であり、もう1人は、エノキサ
パリンの自己中断後であった。
静脈血栓症(DVT)の高発生である(患者1−4;図3Aを参照されたい)。
続いて、以後処置されるすべての患者のプロトコルにおいて、分画化低分子量ヘ
パリン(エノキサパリン)を利用した予防処方計画を開始し;後の10人の患者
のうち8人でDVTが発生しなかった。同情的処置で再処置したどちらの患者に
もDVTが発生し、1人はエノキサパリン投与中であり、もう1人は、エノキサ
パリンの自己中断後であった。
【0076】 処置反応:臨床およびX線観察 一度処置した4人の患者および二度処置したさらなる3人の患者で、安全性に
加え、抗腫瘍効果を観察し、該患者はすべて、臨床的に改善したかまたは安定し
た。すべての症例で、X線的改善は、切除腔を越え、そして同側全体に、そして
適用可能な場合、対側半球に拡張し、そしてすべての反応は、失敗と判断された
以前の慣用的な処置後、少なくとも2ヶ月後に起こった。さらなる2人の患者は
、臨床的に改善し、1人は完全なX線および臨床的反応を維持した。同じ時間間
隔における一致処置で処置した症例コントロール群を同定し、そして匹敵する抗
腫瘍効果は観察されなかった。本シリーズにおいて、X線的改善は、14週まで
に起こり、8週(患者7)ないし14週(患者2)の範囲の間隔があり、一方、
コントロール症例は、コントラスト増強により特徴付けられる持続する腫瘍を常
に示した。代表的な試験反応および症例コントロールは図4および5に示され、
そしてすべての症例は図3Aおよび3Bに要約される。図4に示されるように、
増強および質量効果の欠失が試験症例で観察され、対応する症例コントロールで
はコントラスト増強の持続が見られた。該試験症例では、患者はX線的改善と一
致する臨床的改善を有した。図5に示されるように、同側三角の回復(rest
itution)を伴う、増強および質量効果の欠失が試験症例で観察されたが
、対応する症例コントロールではコントラスト増強の持続および三角の抹消(e
ffacement)が見られた。試験症例において、患者は、臨床的改善を有
し、すべての病的状態前活性に戻り、これはX線的改善と一致した。この患者は
対側右前頭極(frontopolar)領域における再発疾患に屈し、そして
検死体は、再発部位に活性腫瘍を有したが、原発部位には散在する腫瘍細胞しか
なかった。
加え、抗腫瘍効果を観察し、該患者はすべて、臨床的に改善したかまたは安定し
た。すべての症例で、X線的改善は、切除腔を越え、そして同側全体に、そして
適用可能な場合、対側半球に拡張し、そしてすべての反応は、失敗と判断された
以前の慣用的な処置後、少なくとも2ヶ月後に起こった。さらなる2人の患者は
、臨床的に改善し、1人は完全なX線および臨床的反応を維持した。同じ時間間
隔における一致処置で処置した症例コントロール群を同定し、そして匹敵する抗
腫瘍効果は観察されなかった。本シリーズにおいて、X線的改善は、14週まで
に起こり、8週(患者7)ないし14週(患者2)の範囲の間隔があり、一方、
コントロール症例は、コントラスト増強により特徴付けられる持続する腫瘍を常
に示した。代表的な試験反応および症例コントロールは図4および5に示され、
そしてすべての症例は図3Aおよび3Bに要約される。図4に示されるように、
増強および質量効果の欠失が試験症例で観察され、対応する症例コントロールで
はコントラスト増強の持続が見られた。該試験症例では、患者はX線的改善と一
致する臨床的改善を有した。図5に示されるように、同側三角の回復(rest
itution)を伴う、増強および質量効果の欠失が試験症例で観察されたが
、対応する症例コントロールではコントラスト増強の持続および三角の抹消(e
ffacement)が見られた。試験症例において、患者は、臨床的改善を有
し、すべての病的状態前活性に戻り、これはX線的改善と一致した。この患者は
対側右前頭極(frontopolar)領域における再発疾患に屈し、そして
検死体は、再発部位に活性腫瘍を有したが、原発部位には散在する腫瘍細胞しか
なかった。
【0077】 最初にいくつかのX線的改善があったにもかかわらず、悪化した3人の患者で
は同情的再処置がFDAおよびIRBより承諾された。再処置後、外科的切除か
ら離れた小結節の増強のさらなるX線的欠失が、臨床的改善または安定化いずれ
かを伴い、3人すべてで起こった。
は同情的再処置がFDAおよびIRBより承諾された。再処置後、外科的切除か
ら離れた小結節の増強のさらなるX線的欠失が、臨床的改善または安定化いずれ
かを伴い、3人すべてで起こった。
【0078】 9つの症例の一連の腫瘍組織を処置前および後に解析した。これらの観察は、
図3Aおよび3Bに要約される。12症例のうち11では、処置時、生存する腫
瘍のみが観察され、線維性壊死として反映される放射線変化の徴候はなかった。
以前GLIADEL(登録商標)移植した2つの症例では、オブラート破片に隣
接し、生存腫瘍細胞が観察された。
図3Aおよび3Bに要約される。12症例のうち11では、処置時、生存する腫
瘍のみが観察され、線維性壊死として反映される放射線変化の徴候はなかった。
以前GLIADEL(登録商標)移植した2つの症例では、オブラート破片に隣
接し、生存腫瘍細胞が観察された。
【0079】 処置反応:組織病理学的観察 すべての死後検査およびすべての療法後外科的生検で、残った生存腫瘍細胞を
同定した。元来の腫瘍部位が上皮細胞増殖を失った(患者1)、腫瘍細胞数およ
び多形性を失った(患者7)、または壊死の広い領域を得た(再処置後の患者8
)、個々の症例を観察した。腫瘍関連血管のみに限定される微小血栓を、療法後
組織が入手可能な10の症例のうち、6つで同定した。やはり、多様な度合いの
腫瘍血管周辺リンパ球浸潤を、処置前腫瘍においてリンパ球浸潤が観察されなか
った4つの症例で同定した。同定可能な腫瘍細胞を含まない脳切片において、炎
症、脈管炎、出血、壊死、脱髄、または血管血栓症は同定されなかった。
同定した。元来の腫瘍部位が上皮細胞増殖を失った(患者1)、腫瘍細胞数およ
び多形性を失った(患者7)、または壊死の広い領域を得た(再処置後の患者8
)、個々の症例を観察した。腫瘍関連血管のみに限定される微小血栓を、療法後
組織が入手可能な10の症例のうち、6つで同定した。やはり、多様な度合いの
腫瘍血管周辺リンパ球浸潤を、処置前腫瘍においてリンパ球浸潤が観察されなか
った4つの症例で同定した。同定可能な腫瘍細胞を含まない脳切片において、炎
症、脈管炎、出血、壊死、脱髄、または血管血栓症は同定されなかった。
【0080】 概要 予防的抗凝固の開始を誘発したDVTの高発生以外は、本方法による全身毒性
は認められなかった。X線および臨床的反応が立証され、そしてこれらの反応は
、外科的介入またはステロイド用量の上昇のいずれにも起因するとは考えられな
かった。すべての症例で、X線的改善は切除腔から離れているか、またはいかな
るさらなる治療介入もなしに、残った腫瘍切除腔における連続するX線的改善に
相当した。ステロイド用量は、臨床的改善の期間中、変化しないかまたは漸減す
るかいずれかであった。
は認められなかった。X線および臨床的反応が立証され、そしてこれらの反応は
、外科的介入またはステロイド用量の上昇のいずれにも起因するとは考えられな
かった。すべての症例で、X線的改善は切除腔から離れているか、またはいかな
るさらなる治療介入もなしに、残った腫瘍切除腔における連続するX線的改善に
相当した。ステロイド用量は、臨床的改善の期間中、変化しないかまたは漸減す
るかいずれかであった。
【0081】 患者2および3のMRIスキャン上の増強の欠失に対応する腫瘍の病理学的検
査は、腫瘍血管の血栓症を立証した。患者2は、全腫瘍の驚くべき増強の欠失を
示し、そして病理学的検査により、死後標本において、内皮増殖が完全に失われ
ていることが明らかになった。内皮増殖は、患者2由来の治療前腫瘍生検標本に
おいて、広く同定された。これらの知見は、放射線学的反応は、本処置に起因す
ると考えられる腫瘍血管系の欠失に関連する可能性を高める。
査は、腫瘍血管の血栓症を立証した。患者2は、全腫瘍の驚くべき増強の欠失を
示し、そして病理学的検査により、死後標本において、内皮増殖が完全に失われ
ていることが明らかになった。内皮増殖は、患者2由来の治療前腫瘍生検標本に
おいて、広く同定された。これらの知見は、放射線学的反応は、本処置に起因す
ると考えられる腫瘍血管系の欠失に関連する可能性を高める。
【0082】 毒性が明らかでなく、そして反応が優れているため、本処置は、神経膠腫の生
物学的処置として顕著な療法的利点を生じるようである。本明細書に記載される
反応は、アンチセンス処置腫瘍細胞を、0.1 m孔サイズの親水性膜で構築さ
れる拡散チャンバー内に被包した際、得られた。この排除制限は、細胞を排除し
、そしてアンチセンス処置細胞から放出される可溶性因子が、これらの反応を誘
発するのに責任がある可能性があることを示唆する。
物学的処置として顕著な療法的利点を生じるようである。本明細書に記載される
反応は、アンチセンス処置腫瘍細胞を、0.1 m孔サイズの親水性膜で構築さ
れる拡散チャンバー内に被包した際、得られた。この排除制限は、細胞を排除し
、そしてアンチセンス処置細胞から放出される可溶性因子が、これらの反応を誘
発するのに責任がある可能性があることを示唆する。
【0083】 いくつかの研究は、リンパ球浸潤(LI)が、神経膠腫のかなり一般的な組織
学的特徴であると立証してきているが、LIを処置に対し反応する可能性がある
ものとして評価しているものはほとんどない。200人の患者のこうした研究の
1つにおいて、28の証拠提出された症例由来の組織学的標本のLIを、放射線
療法などの介入処置前および後に得られた連続生検において、LI変化に関し再
点検した。本シリーズにおいて11人の患者は、最初の生検でLIを示し、続く
生検で多様なレベルのLIを示した。17の症例のうち16で、最初の生検でL
Iが存在せず、続く生検すべてに渡り、存在しないままであったことが明らかに
なった。このシリーズでは、処置後腫瘍組織で新たに同定されるLIがはるかに
高い頻度であり、これにより本研究の結果と比較し、処置関連効果が示唆される
。以前の研究では、血管周辺LIおよび予後の間に好ましい相関が見出されてき
ている。本シリーズにおいて、血管周辺LIを持つ4人の患者のうち3人で、処
置後、臨床およびX線的改善が明示された。
学的特徴であると立証してきているが、LIを処置に対し反応する可能性がある
ものとして評価しているものはほとんどない。200人の患者のこうした研究の
1つにおいて、28の証拠提出された症例由来の組織学的標本のLIを、放射線
療法などの介入処置前および後に得られた連続生検において、LI変化に関し再
点検した。本シリーズにおいて11人の患者は、最初の生検でLIを示し、続く
生検で多様なレベルのLIを示した。17の症例のうち16で、最初の生検でL
Iが存在せず、続く生検すべてに渡り、存在しないままであったことが明らかに
なった。このシリーズでは、処置後腫瘍組織で新たに同定されるLIがはるかに
高い頻度であり、これにより本研究の結果と比較し、処置関連効果が示唆される
。以前の研究では、血管周辺LIおよび予後の間に好ましい相関が見出されてき
ている。本シリーズにおいて、血管周辺LIを持つ4人の患者のうち3人で、処
置後、臨床およびX線的改善が明示された。
【0084】 選択的腫瘍血管血栓症は、免疫仲介過程と独立した機構に相当する可能性があ
る。腫瘍血管血栓症は、処置した6人の評価可能患者のうち6人で観察され、そ
して選択的腫瘍血管血栓症の異なる機構は不明のままであるが、本反応は、これ
らの患者すべてにおいて、明らかな腫瘍後退と関連付けられ、そして臨床的改善
と関連付けられてきている。同様の腫瘍後退は、動物モデルにおいて、腫瘍血管
系の選択的閉塞後、観察されてきている。
る。腫瘍血管血栓症は、処置した6人の評価可能患者のうち6人で観察され、そ
して選択的腫瘍血管血栓症の異なる機構は不明のままであるが、本反応は、これ
らの患者すべてにおいて、明らかな腫瘍後退と関連付けられ、そして臨床的改善
と関連付けられてきている。同様の腫瘍後退は、動物モデルにおいて、腫瘍血管
系の選択的閉塞後、観察されてきている。
【0085】 脳腫瘍患者におけるDVTの期待される発生率は約40%である。エノキサパ
リン前コーホートでは、発生率は100%または保証エノキサパリン予防の2.
5倍であった。エノキサパリン処置後、発生率は20%、または期待される発生
率の半分に落ち、そしてすべての症例でいかなる関連する出血も伴わなかった。
これらの知見は、神経外科患者における、安全でそして有効なエノキサパリン投
与と一致する。最近の報告は、前向き無作為試験におけるエノキサパリンの抗血
栓有効性を概説し、そして1つの研究において、研究期間中の癌関連死亡率がよ
り低い発生率であったことが示された。この後向き観察にもかかわらず、エノキ
サパリンに派生する腫瘍溶解効果は、反応がエノキサパリン処置が提供されない
最初の4人の患者のうち3人で観察されたため、除外することが可能である。
リン前コーホートでは、発生率は100%または保証エノキサパリン予防の2.
5倍であった。エノキサパリン処置後、発生率は20%、または期待される発生
率の半分に落ち、そしてすべての症例でいかなる関連する出血も伴わなかった。
これらの知見は、神経外科患者における、安全でそして有効なエノキサパリン投
与と一致する。最近の報告は、前向き無作為試験におけるエノキサパリンの抗血
栓有効性を概説し、そして1つの研究において、研究期間中の癌関連死亡率がよ
り低い発生率であったことが示された。この後向き観察にもかかわらず、エノキ
サパリンに派生する腫瘍溶解効果は、反応がエノキサパリン処置が提供されない
最初の4人の患者のうち3人で観察されたため、除外することが可能である。
【配列表】
【図1】 図1は、臨床試験に登録した患者をまとめた表を示す。
【図2】 図2は、ポリクローナル抗体、抗IGF−IR βサブユニット
で免疫染色し(上の矢印)、その後、フォーカルアドヒージョンキナーゼに対す
るモノクローナル抗体で再染色した(下の矢印)ウェスタンブロットを示す。レ
ーン1:T98G神経膠芽腫細胞;2:処置前の患者1;3:患者1+1 mg
のLR 4437−002A(IGF−IRアンチセンスオリゴヌクレオチド)
;4:患者1+2 mgのLR 4437−002A;5:C6ラット神経膠芽
腫細胞;6:T98Gヒト神経膠芽腫細胞;7:処置前の患者8;8:患者8+
2 mgのLR 4437−002A;9:T98Gヒト神経膠芽腫細胞;10
:処置前の患者9;11:患者9+2 mgのLR 4437−002A;12
:処置前の患者10;13:患者10+2 mgのLR 4437−002A;
および14:T98Gヒト神経膠芽腫細胞。
で免疫染色し(上の矢印)、その後、フォーカルアドヒージョンキナーゼに対す
るモノクローナル抗体で再染色した(下の矢印)ウェスタンブロットを示す。レ
ーン1:T98G神経膠芽腫細胞;2:処置前の患者1;3:患者1+1 mg
のLR 4437−002A(IGF−IRアンチセンスオリゴヌクレオチド)
;4:患者1+2 mgのLR 4437−002A;5:C6ラット神経膠芽
腫細胞;6:T98Gヒト神経膠芽腫細胞;7:処置前の患者8;8:患者8+
2 mgのLR 4437−002A;9:T98Gヒト神経膠芽腫細胞;10
:処置前の患者9;11:患者9+2 mgのLR 4437−002A;12
:処置前の患者10;13:患者10+2 mgのLR 4437−002A;
および14:T98Gヒト神経膠芽腫細胞。
【図3】 図3Aおよび3Bは、臨床試験に登録した患者の処置後解析を示
す表を示す。
す表を示す。
【図4】 図4は、元々、優性左側頭葉に由来する悪性神経膠腫と診断され
、ロベクトミーおよび放射線照射療法を受けたが失敗し、そして深部灰白質およ
び同側前頭葉に進行した患者の試験症例(患者1、a−c)および症例コントロ
ール(d−f)のMRIスキャンを示す。失敗した際、病理により、両方の症例
で放射線照射壊死の徴候を伴わない生存腫瘍が明らかになった(0時点)。試験
症例は、画像ガイド再切除およびIGF−IRアンチセンス処置を受け、そして
症例コントロールは、画像ガイド再切除およびGLIADEL(登録商標)移植
を受けた。白い楕円内の数は、処置後の週を示す。
、ロベクトミーおよび放射線照射療法を受けたが失敗し、そして深部灰白質およ
び同側前頭葉に進行した患者の試験症例(患者1、a−c)および症例コントロ
ール(d−f)のMRIスキャンを示す。失敗した際、病理により、両方の症例
で放射線照射壊死の徴候を伴わない生存腫瘍が明らかになった(0時点)。試験
症例は、画像ガイド再切除およびIGF−IRアンチセンス処置を受け、そして
症例コントロールは、画像ガイド再切除およびGLIADEL(登録商標)移植
を受けた。白い楕円内の数は、処置後の週を示す。
【図5】 図5は、元々、優性左後部側頭−頭頂領域に由来する悪性神経膠
腫と診断され、どちらも軽度の受容失語症を伴い、切除および放射線照射療法を
受けたが失敗し、そして同側深部灰白質および前頭葉に進行した患者の試験症例
(患者7、a−c)および症例コントロール(d−f)のMRIスキャンを示す
。失敗した際、病理により、両方の症例で放射線照射壊死の徴候を伴わない生存
腫瘍が明らかになった(0時点)。試験症例は、画像ガイド再切除およびIGF
−IRアンチセンス処置を受け、そして症例コントロールは、画像ガイド再切除
およびGLIADEL(登録商標)移植を受けた。白い楕円内の数は、処置後の
週を示す。
腫と診断され、どちらも軽度の受容失語症を伴い、切除および放射線照射療法を
受けたが失敗し、そして同側深部灰白質および前頭葉に進行した患者の試験症例
(患者7、a−c)および症例コントロール(d−f)のMRIスキャンを示す
。失敗した際、病理により、両方の症例で放射線照射壊死の徴候を伴わない生存
腫瘍が明らかになった(0時点)。試験症例は、画像ガイド再切除およびIGF
−IRアンチセンス処置を受け、そして症例コントロールは、画像ガイド再切除
およびGLIADEL(登録商標)移植を受けた。白い楕円内の数は、処置後の
週を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) // A61K 35/12 C12N 15/00 ZNAA (C12N 5/10 5/00 B C12R 1:91) (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,UG,ZW),E A(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ ,TM),AE,AL,AM,AT,AU,AZ,BA ,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,CR, CU,CZ,DE,DK,DM,EE,ES,FI,G B,GD,GE,GH,GM,HR,HU,ID,IL ,IN,IS,JP,KE,KG,KP,KR,KZ, LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MD,M G,MK,MN,MW,MX,NO,NZ,PL,PT ,RO,RU,SD,SE,SG,SI,SK,SL, TJ,TM,TR,TT,UA,UG,UZ,VN,Y U,ZA,ZW (72)発明者 バサーガ,レナート・エル アメリカ合衆国ペンシルバニア州19115, アードモア,ブレダイン・ロード 125 (72)発明者 レスニコフ,マリアナ アメリカ合衆国ペンシルバニア州19102, フィラデルフィア,ロカスト・ストリート 1500,アパートメント 2617 (72)発明者 エイブラハム,デイヴィッド アメリカ合衆国ペンシルバニア州19096, ワインウッド,サーリ・レイン 1419 Fターム(参考) 4B024 AA01 BA02 BA63 CA04 DA03 EA02 EA04 GA11 HA17 4B065 AA93X AA99Y AB01 AC20 BA02 BD13 CA44 4C084 AA13 NA14 ZB261 ZC412 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB26 ZC41 4C087 AA01 AA02 BB63 NA14 ZB26 ZC41
Claims (14)
- 【請求項1】 ヒトにおいて、腫瘍増殖に対する抵抗性を誘導する方法で
あって: (a)腫瘍細胞を、in vitroまたはex vivoで、IGF−IRに
相補的なオリゴヌクレオチドと接触させ;そして (b)前記の処置した腫瘍細胞を含む拡散チャンバー(diffusion c
hamber)を、前記ヒトの直筋鞘(rectus sheath)内に、治
療的に有効な時間、移植し、それにより腫瘍増殖に対する抵抗性を誘導する ことを含む、前記方法。 - 【請求項2】 前記の治療的に有効な時間が、前記拡散チャンバーにおけ
る前記腫瘍細胞の死を可能にし、そして前記ヒトにおける前記腫瘍増殖の抵抗性
を可能にする、請求項1の方法。 - 【請求項3】 前記腫瘍細胞が前記ヒトから切除される、請求項1の方法
。 - 【請求項4】 前記腫瘍細胞が、自家移植片、同種異系移植片、同系の、
非同系の、および異種移植片からなる群由来の細胞より選択される、請求項1の
方法。 - 【請求項5】 前記腫瘍細胞が、神経膠芽腫(glioblastoma
)、膵臓、黒色腫、前立腺、卵巣、乳腺、肺、結腸、および平滑筋からなる群よ
り選択される、請求項1の方法。 - 【請求項6】 前記オリゴヌクレオチドが配列番号3を含む、請求項1の
方法。 - 【請求項7】 前記オリゴヌクレオチドがベクターにより産生される、請
求項7の方法。 - 【請求項8】 ヒトにおいて、腫瘍の後退を誘導する方法であって: (a)腫瘍細胞を、in vitroまたはex vivoで、IGF−IRに
相補的なオリゴヌクレオチドと接触させ;そして (b)前記の処置した腫瘍細胞を含む拡散チャンバーを、前記ヒトの直筋鞘内に
、治療的に有効な時間、移植し、それにより前記腫瘍の後退を誘導する ことを含む、前記方法。 - 【請求項9】 前記の治療的に有効な時間が、前記拡散チャンバーにおけ
る前記腫瘍細胞の死を可能にし、そして前記ヒトにおける前記腫瘍の後退を可能
にする、請求項8の方法。 - 【請求項10】 前記腫瘍細胞が前記ヒトから切除される、請求項8の方
法。 - 【請求項11】 前記腫瘍細胞が、自家移植片、同種異系移植片、同系の
、非同系の、および異種移植片からなる群由来の細胞より選択される、請求項8
の方法。 - 【請求項12】 前記腫瘍細胞が、神経膠芽腫、膵臓、黒色腫、前立腺、
卵巣、乳腺、肺、結腸、および平滑筋からなる群より選択される、請求項8の方
法。 - 【請求項13】 前記オリゴヌクレオチドが配列番号3を含む、請求項8
の方法。 - 【請求項14】 前記オリゴヌクレオチドがベクターにより産生される、
請求項13の方法。
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