JP2002522506A - インスリン様増殖因子−ｉ受容体に向けられるオリゴヌクレオチドを用いた腫瘍の処置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 腫瘍増殖に対する抵抗性または該増殖の後退を誘導する方法であって、腫瘍細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで、一定の期間、アポトーシス促進剤を補った培養に置き、該腫瘍細胞を拡散チャンバーに移し、それにより細胞含有チャンバーを産生し、該チャンバーを治療的に有効な時間、ヒトに挿入し、それにより腫瘍増殖に対する抵抗性または該増殖の後退を誘導することを含む、前記方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野 本出願は、ＩＧＦ−ＩＲに向けられるオリゴヌクレオチドで処置した腫瘍細胞
を含む移植拡散チャンバーを用い、ヒトにおいて、腫瘍増殖に対する抵抗性また
は腫瘍増殖の後退を誘導することに関する。発明の背景 哺乳動物において、腫瘍を処置する伝統的な方法には、例えば腫瘍の外科的除
去、毒性処置剤または同系組織試料の注入または移植、化学療法、および放射線
照射などの方法が含まれる。これらの方法各々の最終的な目的は、存在する腫瘍
の増殖を減少させ、好ましくは腫瘍増殖を完全な後退の時点まで停止させること
、および／または将来の腫瘍増殖に対する抵抗性を誘導することである。これら
の方法は、腫瘍細胞と共に、非腫瘍細胞に対しても多くの影響を有する。

【０００２】 腫瘍および他の新生物形成組織は、自発的にまたは処置に反応し、アポトーシ
スを経験することが知られる。例には、いくつかの種類の白血病、非ホジキンリ
ンパ腫、前立腺腫瘍、膵臓癌、基底および扁平上皮細胞癌腫、乳腺腫瘍、乳癌、
および脂肪パッド肉腫が含まれる。いくつかの抗癌薬剤が標的細胞においてアポ
トーシスを誘導することが示されてきている。Ｂｕｔｔｙａｎら， Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １９８９， ９， ３４７３−３４８１；Ｋａｕｆ
ｍａｎｎ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， １９８９， ４９， ５８７０−５８
７８；およびＢａｒｒｙら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， １
９９０， ４０， ２３５３−２３６２、前記文献はすべて本明細書に完全に援
用される。高体温、低体温、虚血並びに放射線照射、毒素、および化学薬品への
曝露を含む、特定の穏やかな不利な条件は、傷害を受けた細胞のプログラム細胞
死による死を生じる可能性がある。これらの処置の多くはまた、より高い用量で
壊死も生じるであろうことから、細胞に対する穏やかな損傷は、おそらく突然変
異の遺伝を妨げるため、細胞自殺を誘導する可能性がある一方、厳しい条件に対
する曝露は、壊死により、直接細胞死を導くことが示唆されることに注目すべき
である。しかし、死の過程は、迅速であり、そして炎症の量が減少するため、観
察することが困難である。これらの理由のため、アポトーシスの定量化はしばし
ば困難である。アポトーシスの組織学的に可視である段階の持続期間（正常ラッ
ト肝臓では３時間）を測定する方法およびアポトーシスによる細胞損失率を計算
する式が、Ｂｕｒｓｃｈら， Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ， １９９０，
１１， ８４７−８５３に示される。

【０００３】 増殖因子およびその受容体が、形質転換表現型の確立および維持に必須の役割
を果たす証拠もまた、急速に集積している。増殖因子が形質転換表現型の確立お
よび維持に必須の役割を果たすことは、よく証明されている。ＩＧＦ−ＩＲ遺伝
子を標的化し破壊したマウス胚細胞は、野生型同腹マウスから生成された胚細胞
を容易に形質転換する、ＳＶ４０ Ｔ抗原および／または活性化Ｈａ−ｒａｓオ
ンコジーンにより形質転換することが不可能である。Ｓｅｌｌら， Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９９３， ９０， １１２
１７−１１２２１；Ｓｅｌｌら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １９
９４， １４， ３６０４−３６１２；Ｖａｌｅｎｔｉｎｉｓら， Ｏｎｃｏｇ
ｅｎｅ， １９９４， ９， ８２５−８３１；およびＣｏｐｐｏｌａら， Ｍ
ｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １９９４， １４， ４５８８−４５９５
。Ｃ６ラット神経膠芽腫細胞における、ＩＧＦ−ＩＲ ＲＮＡに対するアンチセ
ンスＲＮＡの発現は、同系ラットにおいて腫瘍形成を停止するだけでなく、確立
された野生型腫瘍の完全な後退も引き起こす。Ｒｅｓｎｉｃｏｆｆら， Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｒｅｓ．， １９９４ａ， ５４， ２２１８−２２２２およびＲｅｓ
ｎｉｃｏｆｆら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， １９９４ｂ， ５４， ４８４
８−４８５０。この知見に関連し、やはり、ＩＧＦ−Ｉ（およびＰＤＧＦ）がｃ
−ｍｙｃ誘導アポトーシスから細胞を保護するという、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら
（ＥＭＢＯ Ｊ．， １９９４， １３， ３２８６−３２９５）による報告も
ある。腫瘍における細胞死率の減少は、もちろん、腫瘍増殖の重要な機構である
可能性がある。Ｂａｓｅｒｇａ， Ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ
Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅ
ｓｓ，マサチューセッツ州ケンブリッジ， １９８５。ＩＧＦ−ＩＲ ＲＮＡに
対するアンチセンスＲＮＡを発現している細胞またはＩＧＦ−ＩＲ ＲＮＡに対
するアンチセンスオリゴヌクレオチドと共にプレインキュベーションした細胞は
、同系またはヌードマウスいずれかに注入した際、その腫瘍形成性を完全に失う
。Ｒｅｓｎｉｃｏｆｆら、１９９４ａ、１９９４ｂ。注入細胞は、アポトーシス
、または少なくとも何らかの型の細胞死を経験すると疑われた。しかし、死につ
つある細胞は、特にｉｎ ｖｉｖｏでは迅速に消滅し、そして調べる対象が消失
するため、明らかにするのが非常に困難である。

【０００４】 細胞増殖の調節におけるＩＧＦ−ＩＲの重要性もまた、かなりの証拠により支
持される：１）培養中の多くの細胞種が、ＩＧＦ−Ｉにより増殖するよう刺激さ
れ（Ｇｏｌｄｒｉｎｇら， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｅｕｋａｒｙｏｔ． Ｇｅ
ｎｅ Ｅｘｐｒ．， １９９１， １， ３０１−３２６およびＢａｓｅｒｇａ
ら， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｅｕｋａｒｙｏｔ． Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ．，
１９９３， ３， ４７−６１）、そしてこれらの細胞種には、ヒト二倍体線維
芽細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、Ｔリンパ球、骨髄細胞、軟骨細胞、骨芽細胞と
共に骨髄の幹細胞が含まれる；２）ＩＧＦ−ＩＲの機能の妨害は、細胞増殖の阻
害につながる――これはＩＧＦ−ＩＲ ＲＮＡに対するアンチセンス発現ベクタ
ーまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを用い、立証されてきている；アンチ
センス戦略は、いくつかの正常細胞種およびヒト腫瘍細胞株において、細胞増殖
を阻害するのに成功した（Ｂａｓｅｒｇａら、１９９４、上記）；そして３）増
殖はまた、ＩＧＦ−Ｉのペプチド類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）（Ｐｉｅｔｒｚｋ
ｏｗｓｋｉら， Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆ．， １９９２ａ，
３， １９９−２０５およびＰｉｅｔｒｚｋｏｗｓｋｉら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌ
ｌ． Ｂｉｏｌ．， １９９２ｂ， １２， ３８８３−３８８９）、またはＩ
ＧＦ−Ｉ ＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡを発現するベクター（Ｔｒｏｊａ
ｎら、１９９３、上記）を用いても阻害することが可能である。ＩＧＦオートク
リンまたはパラクリンループはまた、他の増殖因子、ホルモン類（例えば成長ホ
ルモンおよびエストロゲン類）、およびＳＶ４０ Ｔ抗原およびｃ−ｍｙｂなど
のオンコジーンの増殖促進効果に、そしてＷＴ１の場合のように、腫瘍抑制にも
関与している。Ｂａｓｅｒｇａら、１９９４、上記。腫瘍増殖に対する抵抗性の
誘導はまた、例えば、本明細書に完全に援用される米国特許第５，７１４，１７
０号にも開示される。腫瘍におけるＩＧＦ−ＩＲの役割の概説は、本明細書に完
全に援用される、Ｂａｓｅｒｇａら， Ｖｉｔａｍｉｎｓ ａｎｄ Ｈｏｒｍｏ
ｎｅｓ， １９９７， ５３， ６５−９８に提供される。

【０００５】 例えば増殖因子および増殖因子受容体などの剤を、形質転換表現型を維持する
または抑制する能力に関し、試験することは、依然として困難である。腫瘍抑制
能力の正確な評価を得るため、試験はｉｎ ｖｉｖｏで行わなければならない。
本発明は、患者に対し顕著に減少した副作用で、腫瘍増殖に対する抵抗性または
該増殖の後退を誘導する方法を提供する。発明の概説 本発明は、ヒトにおいて、腫瘍増殖に対する抵抗性を誘導する方法であって、
腫瘍細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで、ＩＧＦ−ＩＲに相補的
なオリゴヌクレオチドと接触させ、そして処置した腫瘍細胞を含む拡散チャンバ
ーを、該ヒトの直筋鞘内に、治療的に有効な時間、移植し、それにより腫瘍増殖
に対する抵抗性を誘導することを含む、前記方法に関する。

【０００６】 本発明はまた、ヒトにおいて、腫瘍の後退を誘導する方法であって、腫瘍細胞
を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで、ＩＧＦ−ＩＲに相補的なオリゴ
ヌクレオチドと接触させ、そして処置した腫瘍細胞を含む拡散チャンバーを、該
ヒトの直筋鞘内に、治療的に有効な時間、移植し、それにより該腫瘍の後退を誘
導することを含む、前記方法に関する。発明の好ましい態様の説明 本発明は、一部、ヒトにおいて、腫瘍増殖に対する抵抗性を誘導する、または
腫瘍の後退を誘導する方法であって、腫瘍細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ
ｖｉｖｏで、アポトーシス促進剤（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ａｇｅｎｔ
）で処置し、処置した腫瘍細胞を拡散チャンバーに入れ、それにより腫瘍細胞含
有拡散チャンバーを産生し、そして腫瘍細胞含有拡散チャンバーを、該ヒトの直
筋鞘内に、治療的に有効な時間、挿入しまたは移植し、それにより腫瘍増殖に対
する抵抗性を誘導する、または該腫瘍の後退を誘導することを含む、前記方法に
関する。

【０００７】 本発明の重要な利点は、腫瘍細胞に対する毒性の処置、例えば放射線照射また
は化学療法化合物などでの処置が、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで行
われ、それにより患者に対する毒性が避けられることである。さらに、腫瘍細胞
を拡散チャンバー中の培養に置き、そしてチャンバーを患者に直接移植し、した
がって患者内に直接腫瘍細胞を注入することに関連する可能性がある、腫瘍細胞
の物理的伝搬（ｓｐｒｅａｄ）の可能性を避けることが可能である。

【０００８】 本発明の方法で処置可能なヒト腫瘍は、ヒト患者における原発性または続発性
、良性、悪性、転移性、または微小転移性腫瘍であってもよい。ヒト患者は、癌
と診断される個人、癌を有すると診断されたことがあり、そして現在癌を含まな
い個人、または癌を有すると疑われる個人である。本発明の方法で治療可能な腫
瘍には、限定されるわけではないが、黒色腫、前立腺、卵巣、乳腺、膵臓、肺、
結腸、および平滑筋腫瘍と共に、神経膠芽腫、骨髄幹細胞、造血細胞、骨芽細胞
、上皮細胞、線維芽細胞由来の細胞と共に、アポトーシスを経験し、そして腫瘍
細胞に対する抵抗性または該細胞の後退を誘導するいかなる他の腫瘍細胞であっ
てもよいものが含まれる。

【０００９】 本明細書において、拡散チャンバー内にある細胞に適用されるような、「腫瘍
細胞（単数又は複数）」、「腫瘍（単数又は複数）」、および「癌細胞（単数又
は複数）」という用語は、本出願全体で交換可能に用いられ、そして限定される
わけではないが、自家移植片、同種異系移植片、同系の、非同系の、および異種
移植片と共に、それらに由来する細胞を含む。腫瘍細胞には、アポトーシスの際
、腫瘍増殖に対する抵抗性を誘導する、または腫瘍の後退を誘導する、いかなる
種類の細胞も含まれ、限定されるわけではないが、天然発生腫瘍細胞または腫瘍
細胞株が含まれる。腫瘍細胞には、限定されるわけではないが、黒色腫、前立腺
、卵巣、乳腺、膵臓、肺、結腸、および平滑筋腫瘍と共に、神経膠芽腫、骨髄幹
細胞、造血細胞、骨芽細胞、上皮細胞、線維芽細胞由来の細胞と共に、アポトー
シスを経験し、そして腫瘍細胞に対する抵抗性または該細胞の後退を誘導するい
かなる他の腫瘍細胞であってもよいものが含まれる。腫瘍細胞株には、限定され
るわけではないが、Ｃ６ラット神経膠芽腫細胞株、ＦＯ−１ヒト黒色腫細胞株、
ＢＡ １１１２ラット横紋筋肉腫細胞株、Ｂ１７９２−Ｆ１０マウス黒色腫、Ｂ
１６マウス黒色腫、およびＣａＯＶ−３ヒト卵巣癌腫が含まれる。腫瘍性組織、
腫瘍、または腫瘍細胞はまた、拡散チャンバーが挿入されるであろうヒト患者か
ら、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されている別の供給源から切除してもよい。

【００１０】 本発明の方法で用いられる腫瘍細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖ
ｏで、アポトーシス促進剤を補った培地中で培養され、そして続いて拡散チャン
バーに移される。あるいは、腫瘍細胞をまず、拡散チャンバー中で培養し、そし
てその中でアポトーシス促進剤で処置してもよい。好ましくは、拡散チャンバー
は、抵抗性または後退が誘導される腫瘍と同じ種類のものに由来する腫瘍細胞を
含む。あるいは、拡散チャンバーに入れられる腫瘍細胞は、抵抗性または後退が
誘導される腫瘍と異なる種類のものである。

【００１１】 腫瘍細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで培養し、そして一定の期
間、好ましくは３ないし４８時間、より好ましくは２４時間、アポトーシス促進
剤を補う。ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで培養する前に、腫瘍細胞を
トリプシンで穏やかに解離させ、そして続いてヒトに移植する前に洗浄してもよ
い。ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの腫瘍細胞の培地に補うアポトーシ
ス促進剤は、好ましくは、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞死を誘導する剤である。本発明
の目的のためのアポトーシス促進剤は、細胞死が腫瘍増殖阻害効果または腫瘍後
退効果、すなわち拡散チャンバーが移植されるヒトにおいて、腫瘍または複数の
腫瘍または腫瘍細胞に対する抵抗性効果または後退効果を有するように、ｉｎ
ｖｉｖｏで拡散チャンバー中の腫瘍細胞の死を引き起こす剤である。こうしたア
ポトーシス促進剤には、限定されるわけではないが、核酸分子、タンパク質また
はペプチド、非タンパク質または非ポリヌクレオチド化合物、および物理的条件
が含まれる。

【００１２】 本発明の方法に用いられるアポトーシス促進剤は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ
ｖｉｖｏで拡散チャンバー中の腫瘍細胞の細胞死、またはアポトーシスを誘導
する。本発明の目的のためのアポトーシスは、細胞死と定義され、そして限定さ
れるわけではないが、原発性および転移性腫瘍の後退を含む。アポトーシスはプ
ログラムされた細胞死であり、多数の生理学的および病理学的過程に必須の役割
を果たす広範な現象である。対照的に、壊死は偶発的な細胞死であり、多様な有
害な条件および毒性物質に対する細胞の反応である。アポトーシスは、壊死とは
形態学的に異なり、多様な条件下で、多くの異なる組織で起こる、細胞死の自発
的な型である。この種の細胞死は、典型的には、発生する細胞が散在しており、
そして非常に迅速に進行するため、観察するのが困難である。

【００１３】 ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するアポトーシス促進剤、ま
たはアポトーシス誘導剤には、例えば核酸分子が含まれる。本発明の１つの態様
において、核酸分子は増殖因子または増殖因子受容体、例えばＩＧＦ−ＩＲなど
のＤＮＡまたはＲＮＡに対して向けられるオリゴヌクレオチドである。最も好ま
しくは、オリゴヌクレオチドはＩＧＦ−ＩＲのＤＮＡまたはＲＮＡに対して向け
られる。オリゴヌクレオチドは、ＩＧＦ−ＩＲ ＤＮＡまたはＲＮＡのいかなる
部分に向けられてもよい。好ましくは、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
は、限定されるわけではないが、ＲＮＡまたはＤＮＡいずれかを含む、ＩＧＦ−
ＩＲ（配列番号１）のコドン１−３０９に相補的なヌクレオチド配列を含む。ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、コドン１−３０９の一部に相補的なヌク
レオチド配列を含んでもよい。さらに、コドン１ないし３０９に相補的なオリゴ
ヌクレオチドのヌクレオチド配列内のミスマッチもまた、本発明の範囲内である
。ＤＮＡまたはＲＮＡを含むＩＧＦ−ＩＲシグナル配列（配列番号２）のヌクレ
オチド−２９ないし−２４に相補的なオリゴヌクレオチドもまた、本発明の範囲
内である。ＩＧＦ−ＩＲのシグナル配列は３０アミノ酸配列である。本定義によ
り意図されるのは、３０アミノ酸シグナル配列に相補的なオリゴヌクレオチドで
ある。あるいは、配列番号２内のオリゴヌクレオチドの断片もまた、意図される
。本発明のさらなるオリゴヌクレオチドには、限定されるわけではないが、以下
のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドが含まれる：ＧＧＡＣＣＣＴＣＣ
ＴＣＣＧＧＡＧＣＣ（配列番号３）、ＣＣＧＧＡＧＣＣＡＧＡＣＴＴＣＡＴ（配
列番号４）、ＣＴＧＣＴＣＣＴＣＣＴＣＴＡＧＧＡＴＧＡ（配列番号５）、ＣＣ
ＣＴＣＣＴＣＣＧＧＡＧＣＣ（配列番号６）、ＴＡＣＴＴＣＡＧＡＣＣＧＡＧＧ
ＣＣ（配列番号７）、ＣＣＧＡＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＧ（配列番号８）、
およびＴＣＣＴＣＣＧＧＡＧＣＣＡＧＡＣＴＴ（配列番号９）。本発明のオリゴ
ヌクレオチドは、約１０ないし約５０ヌクレオチド、より好ましくは約１４ない
し約２５ヌクレオチド、そして最も好ましくは約１７ないし約２０ヌクレオチド
を含んでもよい。

【００１４】 本発明の別の好ましい態様において、核酸分子は、増殖因子または増殖因子受
容体のＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば配列番号１−９などに対して向けられるオリ
ゴヌクレオチドを産生するベクターである。ＩＧＦ−ＩＲ ＲＮＡまたはＤＮＡ
の一部に相補的な核酸分子を、適切な搬送ビヒクル、例えば発現プラスミド、コ
スミド、ＹＡＣベクター、およびそれらに匹敵するものなどに挿入する。核酸を
腫瘍細胞に導入するのに、ほとんどいかなる搬送ビヒクルを用いてもよい。組換
え核酸分子（または組換えベクター）には、例えばプラスミドＤＮＡベクター、
ｃＤＮＡ含有リポソーム、人工ウイルス、ナノ粒子、およびそれらに匹敵するも
のが含まれる。オリゴヌクレオチドを発現するベクターを直接腫瘍細胞に注入し
てもよいこともまた、予期される。

【００１５】 本発明の組換え核酸分子の制御要素は、哺乳動物腫瘍細胞、好ましくはヒト腫
瘍細胞での発現を指示することが可能である。制御要素には、プロモーターおよ
びポリアデニル化シグナルが含まれる。さらに、他の要素、例えばコザック（Ｋ
ｏｚａｋ）領域もまた、組換え核酸分子に含まれてもよい。本発明の実施に有用
なポリアデニル化シグナルの例には、限定されるわけではないが、ＳＶ４０ポリ
アデニル化シグナルおよびＬＴＲポリアデニル化シグナルが含まれる。特に、Ｓ
Ｖ４０ポリアデニル化シグナルと称される、ｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）中のＳＶ４０ポリアデニル化シグ
ナルを用いてもよい。

【００１６】 本発明の組換え核酸分子を構築するのに有用なプロモーターは、恒常的でもま
たは誘導性でもよい。恒常的プロモーターは、細胞増殖のすべての条件下で発現
される。恒常的プロモーターの例には、以下の遺伝子のプロモーターが含まれる
：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシン
デアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、β−アクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグ
ロビン、ヒト筋肉クレアチン、および他のもの。さらに、多くのウイルスプロモ
ーターは、真核細胞において恒常的に機能し、そしてこれらには、限定されるわ
けではないが、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイル
ス（ＭＭＴＶ）プロモーター、モロニー（Ｍａｌｏｎｅｙ）白血病ウイルス、ヒ
ト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）極初期プロモ
ーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ
）、および他のレトロウイルスの末端反復配列（ＬＴＲ）、並びに単純疱疹ウイ
ルスのチミジンキナーゼプロモーターが含まれる。他のプロモーターは、一般の
当業者に知られる。

【００１７】 誘導性プロモーターは、誘導剤の存在下で発現する。例えば、メタロチオネイ
ンプロモーターは特定の金属イオンの存在下で転写を促進する（増加させる）よ
う誘導され、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ＨＳＰ７０も同様であ
る。他の誘導性プロモーターは、一般の当業者に知られる。

【００１８】 本発明のオリゴヌクレオチドを含む組換え核酸分子を、腫瘍細胞に導入し、ま
たは例えばトランスフェクションまたは形質導入法により、腫瘍細胞に「接触」
させてもよい。トランスフェクションは、添加された核酸分子の取り込みによる
、細胞による新規遺伝的物質の獲得を指す。トランスフェクションは、物理的ま
たは化学的方法により、起こる可能性がある。多くのトランスフェクション技術
が一般の当業者に知られ：リン酸カルシウムＤＮＡ共沈澱；ＤＥＡＥ−デキスト
ランＤＮＡトランスフェクション；エレクトロポレーション；裸の（ｎａｋｅｄ
）プラスミド吸着；および陽イオン性リポソーム仲介トランスフェクションが含
まれる。形質導入は、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスを用い、細胞内に核酸を運搬
する方法を指す。形質導入剤として使用するのに適したウイルスベクターには、
限定されるわけではないが、レトロウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベク
ター、ワクシニアウイルス、およびセムリキ森林ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆ
ｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）ベクターが含まれる。

【００１９】 本発明の好ましい態様において、例えば、どちらも本明細書に援用される、Ｒ
ｅｓｎｉｃｏｆｆら（１９９４ａ、１９９４ｂ、上記）に記載される、ＩＧＦ−
ＩＲのＤＮＡまたはＲＮＡに向けられるオリゴヌクレオチドを含む組換えベクタ
ーを用いる。簡潔には、プラスミドＨＳＰ／ＩＧＦ−ＩＲ ＡＳは、ショウジョ
ウバエＨＳＰ７０プロモーターの調節下に、ＩＧＦ−ＩＲ ＲＮＡに向けられる
長さ３０９ ｂｐのアンチセンス転写物を発現する。Ｂ型肝炎ポリアデニル化シ
グナル配列およびＳＶ４０プロモーターの調節下のネオマイシン耐性遺伝子が、
３０９ ｂｐのＩＧＦ−ＩＲ断片の３’末端に存在する。当業者は、本明細書に
記載される本発明のオリゴヌクレオチドのいずれを産生する、さらなるベクター
も容易に調製することが可能である。

【００２０】 本発明の他の態様において、アポトーシス促進剤は、タンパク質またはペプチ
ド、例えばＩＧＦ−ＩＲの関連優性ネガティブ突然変異体およびＭＨＣクラスＩ
ペプチドなどを含む。ＩＧＦ−ＩＲの優性ネガティブ突然変異体には、例えば、
本明細書に援用されるＤ’Ａｍｂｒｏｓｉｏら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，
１９９６， ５６， ４０１３−４０２０に記載される可溶性ＩＧＦ−ＩＲ、お
よびミリスチン化Ｃ末端のＩＧＦ−ＩＲ（ＭｙＣＦ）が含まれる。ＭＨＣクラス
Ｉ関連ペプチドには、例えば、黒色腫特異的ＣＴＬ株に認識されるＴｙｒ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｌａ（配列番号１０
）（Ｃｏｘら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９４， ２６４， ７１６−７１９）
、ｇｐ１００由来であり、そしてヒト黒色腫の後退に関与するＬｅｕ−Ｌｅｕ−
Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号
１１）（Ｋａｗａｋａｍｉら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ
． ＵＳＡ， １９９４， ９１， ６４５８−６４６２）、およびコネキシン
３７に由来し、そしてネズミ肺癌腫に対しＣＴＬ反応を誘導するＰｈｅ−Ｇｌｕ
−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１２）
（Ｍａｎｄｅｌｂｏｌｍら， Ｎａｔｕｒｅ， １９９４， ３６９， ６７−
７１）、およびＴｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔ
ｈｒ−Ａｌａ（配列番号１５）が含まれる。さらに、上に同定されるペプチドの
反転Ｄ−アミノ酸類似体、例えば、Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−
Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（配列番号１３）およびＬｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅ
ｕ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ（配列番号１４
）もまた、活性がある。アミノ酸置換もまた、本発明に意図される。本発明のペ
プチドは、当業者に周知であるように、合成で作成してもよい。

【００２１】 本発明の他の態様において、アポトーシス促進剤は、非タンパク質または非ポ
リヌクレオチド化合物、例えば化学療法化合物または合成化学化合物などを含む
。好ましくは、化学療法化合物は、例えば、エトポシド、シスプラチン、カンプ
トセシン、および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）を含む。

【００２２】 本発明の他の態様において、アポトーシス促進剤は、物理的条件、例えば高体
温、低体温、虚血、およびイオン化放射線照射などを含む。腫瘍細胞がこうした
条件に曝露される態様において、本発明の目的のための条件は、剤、アポトーシ
ス誘導剤として定義される。

【００２３】 アポトーシス促進剤またはアポトーシス誘導剤の治療的に有効な用量は、薬剤
単独のものと同程度であろうし；投薬量は、患者の体重、および臨床的条件に関
連して設定されるであろう。培地に対する活性成分の相対的な比率は、当然、化
合物の化学的性質、可溶性、および安定性と共に、意図される投薬量に応じるで
あろう。培地もまた、薬学的に許容しうる。本発明のアポトーシス誘導剤は、単
独で、または他のアポトーシス誘導剤と組み合わせて用いてもよい。好ましくは
、アポトーシス促進剤、約１０μｇ／１０⁷細胞および１００ ｍｇ／１０⁷細胞
の間の量を用い、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで腫瘍細胞を処置する
。より好ましくは、アポトーシス促進剤、約１００μｇ／１０⁷細胞および１０
ｍｇ／１０⁷細胞の間の量を用いる。より好ましくは、アポトーシス促進剤、
約１ ｍｇ／１０⁷細胞および５ ｍｇ／１０⁷細胞の間の量を用いる。最も好ま
しくは、アポトーシス促進剤、約２ ｍｇ／１０⁷細胞を用いる。

【００２４】 本発明は、細胞が含まれる拡散チャンバーを使用する。細胞は、拡散チャンバ
ー上にはめ込んだフィルターに不浸透であり；チャンバーから出ることもまたは
チャンバーに入ることもできない。拡散チャンバー上のフィルターは、直径約０
．２５μｍまたはそれより小さい範囲の大きさの、好ましくは約０．１μｍの孔
を有する。Ｌａｎｇｅら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９９４， １５３，
２０５−２１１およびＬａｎｚａら， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，
１９９４， ５７， １３７１−１３７５、前記参考文献は共に、本明細書に完
全に援用される。したがって、細胞死またはアポトーシスは、定量的に測定する
ことが可能である。拡散チャンバーの使用は、他の細胞株に拡張することが可能
であり、非同系であっても、そして異なる種由来であってもよい。これは細胞死
が起こる速度は約２４時間であり、いかなる免疫反応が確立されるよりはるかに
前であるためである。

【００２５】 本発明に有用な拡散チャンバーは、チャンバーおよび移植される患者の間の細
胞の通過を可能にしないが、チャンバーおよび患者の間の因子の交換および通過
を可能にする、いかなるチャンバーも含む。チャンバーは、汚染なしにそして患
者を傷つけることなく、内容物の多数のそして連続した試料採取を可能にし、し
たがって患者に行われる移植処置の数を有意に減少させる。好ましい拡散チャン
バーは、例えば、米国特許第５，７１４，１７０号に記載される。代表的な拡散
チャンバーは、２つの端、第一の端および第二の端を有する、チャンバー・バレ
ル（ｂａｒｒｅｌ）を含む。バレルは、非毒性手段により共に固定されている、
１つまたはそれ以上の輪で構成されてもよい。チャンバーには、各端でフィルタ
ー、第一のフィルターおよび第二のフィルターをはめ込む。フィルターは、因子
がチャンバーおよび患者の間を通過することが可能であるように、因子に対し透
過性である。フィルター孔サイズは、約０．２５μｍまたはそれ以下であっても
よく、好ましくは約０．１μｍである。フィルターはプラスチック、テフロン（ 登録商標）、ポリエステル、または強靭で、柔軟であり、そして化学処理に耐え ることが可能であるいかなる不活性物質で出来ていてもよい。フィルターは、や はりより強いシールを提供することが可能であるゴムガスケットの位置に固定し てもよい。チャンバーのバレル部分上に、開口部が提供され、該開口部は、チャ ンバーが移植された後、患者の体の外部からアクセスされるキャップにより覆わ れており、したがって拡散チャンバーに補充することを可能にしてもよい。該キ ャップは、セルフシールゴムのねじ込み（ｓｃｒｅｗ−ｏｎ）式で、そして開口 部にはめ込まれてもよい。チャンバー内容物の試料採取は、患者の体の外部のキ ャップをはずし、そして通常の注射針およびシリンジを挿入することにより、開 口部にアクセスすることにより、行ってもよい。チャンバーは、いかなる物質、 例えば、限定されるわけではないが、プラスチック、テフロン、ルサイト（ｌｕ ｃｉｔｅ）、チタン、またはヒトに非毒性であり、そしてよく寛容されるいかな る不活性物質で出来ていてもよい。さらに、チャンバーは、滅菌に耐えることが 可能でなければならない。拡散チャンバーは、好ましくは、０．１μｍの孔サイ ズの親水性Ｄｕｒａｐｏｒｅ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ベッ ドフォード）を持つ、１４ ｍｍ ルサイト輪で構築される。拡散チャンバーは 、好ましくは、使用前に酸化エチレンで滅菌される。

【００２６】 腫瘍細胞は、多様な量で拡散チャンバーに入れてもよい。好ましくは、約１
ｘ １０⁴ないし約５ ｘ １０⁶細胞を拡散チャンバーに入れてもよい。より好
ましくは、約１ ｘ １０⁵ないし約１．５ ｘ １０⁶細胞を拡散チャンバーに
入れてもよい。より好ましくは、約５ ｘ １０⁵ないし約１ ｘ １０⁶細胞を
拡散チャンバーに入れてもよい。最も好ましくは、約１ ｘ １０⁶細胞を拡散
チャンバーに入れる。細胞は培地を含む拡散チャンバーに入れる。癌細胞の増殖
を支持し、そしてヒトに適合する、当業者に知られるいかなる培地を用いてもよ
いことが予期される。

【００２７】 拡散チャンバーは、以下の限定されない方法で、ヒトに移植してもよい：例え
ば、皮下、腹腔内、頭蓋内、または直筋鞘内。最も好ましくは、単数または複数
の拡散チャンバーは、優れたリンパ液のドレナージおよび／または血管供給を有
する、体の受容部位、例えば直筋鞘に移植される。チャンバーは、望ましい場合
、移植後約２４ないし約３０時間後に除去してもよい。あるいは、拡散チャンバ
ーを処置のため再度使用し、そして処置後、空にすることが可能であるように、
補充可能なチャンバーを使用してもよい。さらに、好ましくは５および２０の間
の複数の拡散チャンバーを、単一の患者で用いてもよい。

【００２８】 ヒトにおいて、本発明を実行するための臨床的に証明された外科処置は、アポ
トーシス促進剤、例えばＩＧＦ−ＩＲアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し
た腫瘍細胞を、懸濁物として含む拡散チャンバーの移植を伴う。好ましい方法は
、いくつかの外科的および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ組織プロセシング目的を伴
う：１）ＩＧＦ−ＩＲアンチセンスオリゴヌクレオチドでのｅｘ−ｖｉｖｏ腫瘍
細胞処置のため、フィブリノーゲンおよび壊死を含まない、生存腫瘍組織を腫瘍
床（ｂｅｄ）から採取し；２）手術による過剰なまたは許容されない病的状態（
ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ）、特に処置に関連する手術後神経学的欠損を避け；３）画
像指示組織選択を用い、これらの始めの二つの目的を達成し；４）画像指示外科
的切除を用い、腫瘍の切除を最大にし、そして残った腫瘍負荷（ｂｕｒｄｅｎ）
を最小にし、それにより移植後期間中の、自己腫瘍拒絶に関連する、または腫瘍
細胞に対する直接のそして細胞傷害性効果に関連するいかなる炎症過程も最小に
し；５）生物学的反応の生成のための自己受容部位を選択しそして生成し；６）
自己由来処置腫瘍細胞の再移植に際し、望ましい生物学的反応を２０時間以内に
生成するため、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト組織外植片（ｅｘｐｌａｎｔ）をプロセ
シングし；７）先に言及した６つの外科的目的の代わりに、腫瘍細胞の移植に際
し、望ましい生物学的反応を約２０時間以内に生成するため、樹立された細胞株
由来の自己、同種、または異種（ｘｅｎｏｇｒａｐｈｉｃ）細胞をプロセシング
し；そして８）上記の細胞調製すべてのための特定の移植プロトコルを設計し、
腫瘍増殖に対する抵抗性または該増殖の後退を生成する。

【００２９】 成功した臨床試験は、神経膠腫として知られるヒト脳腫瘍に、本発明を適用し
てきている。特定の腫瘍、例えば脳幹神経膠腫、または深部、および／または多
発性脳転移は、外科的に接近不能であり、そしていかなる組織もこれらの患者か
ら安全に採取することが不可能である。腫瘍が外科的に接近不能な症例では、同
種（ヒトであるが宿主でない）細胞株、異種（非ヒト）樹立細胞株、または同種
ヒト初代細胞培養を供給源として利用し、腫瘍増殖に対する抵抗性または該増殖
の後退を誘導してもよい。深部静脈血栓症の合併症を避けるまたは予防するため
、本発明を実行するのに、低分子量ヘパリンの予防的使用が推奨される。以下の
実施例は例示のためであり、本発明を限定することを意図しない。

【００３０】

【実施例】

実施例１：一般的な移植プロトコル 腫瘍増殖に対する抵抗性または該増殖の後退を誘導するため、アンチセンスＩ
ＧＦ−ＩＲオリゴヌクレオチドで処置した、採取した腫瘍細胞の自己移植片また
は樹立された自己、同種、または異種細胞株いずれかを含む、拡散チャンバーを
ヒトに移植する。こうした腫瘍細胞はすべて、ｅｘ ｖｉｖｏで、ＩＧＦ−ＩＲ
アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置されている。ＩＧＦ−ＩＲアンチセンス
を使用し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで宿主腫瘍細胞外植片中のＩＧＦ−ＩＲを標的とし
、そして腫瘍細胞がｉｎ ｖｉｖｏでアポトーシスを経験するようにする。標的
化した、あらかじめ処置した細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏでアポトーシスを経験する
ようになり、そして続いて生物学的反応修飾因子を生成し、該因子は腫瘍増殖に
対する抵抗性または該増殖の後退を誘導する。

【００３１】 好ましい態様は、ｉｎ ｖｉｔｒｏに続き、ｉｎ ｖｉｖｏ法を伴う併合法を
含む。まず、本方法はｉｎ ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞中のＩＧＦ−ＩＲを標的とす
る。ＩＧＦ−ＩＲレベルが減少した腫瘍細胞を拡散チャンバーに被包し、そして
ｉｎ ｖｉｖｏで患者に移植する（すなわち、皮下、直筋鞘内、頭蓋内、または
移植のため供しうると見なされるいかなる他の宿主部位にも）。ＩＧＦ−ＩＲレ
ベルが減少した細胞は、拡散チャンバー内でアポトーシスを経験し、そして宿主
患者におけるヒト悪性脳腫瘍の除去を引き起こすと考えられる、拡散可能な生物
学的反応修正因子を放出する。

【００３２】 好ましくは、２つの外科的プロトコルの１つを利用し、原発性および転移性脳
腫瘍に関し、本発明を実行する。好ましいプロトコルにおいて、腫瘍切除および
自己細胞移植に開頭術（ｃｒａｎｉｏｔｏｍｙ）を使用する。別のプロトコルは
、開頭術を利用しないが、患者において、自己細胞株、同種細胞株、または異種
細胞株の移植を必要とする。

【００３３】 まず、神経膠腫に関しては、外科的方法を利用し、自己組織を採取する。ＩＧ
Ｆ−ＩＲアンチセンスＤＮＡでのｅｘ ｖｉｖｏ腫瘍細胞処置のため、生存腫瘍
組織を腫瘍床から採取する（０．５ないし２グラムの間を目標とする；最低５０
０ ｍｇが通常適切である）。手術による過剰なまたは許容されない病的状態、
特に処置に関連する手術後神経学的欠損を避けるのが、本プロトコルの目的であ
る。画像指示組織選択を利用し、生存腫瘍組織の採取を達成し、そして手術によ
る過剰なまたは許容されない病的状態を避ける。外科的切除もまた、画像指示に
より、腫瘍の切除を最大にし、残った腫瘍負荷を最小にし、そしてそれに続く、
移植後期間中の、自己腫瘍拒絶に関連する、いかなる炎症過程も最小にする。自
己受容部位は、該受容部位が拡散チャンバーの移植および生物学的修飾因子の拡
散に適切であるように選択する。ヒト組織外植片をｉｎ ｖｉｔｒｏでプロセシ
ングし、自己由来処置腫瘍細胞の再移植に際し、望ましい生物学的反応を生成す
る。再移植プロトコルは、ヒトにおいて生物学的反応修飾因子誘発を生成するよ
う設計される。

【００３４】 患者はまず、頭皮上に標準座標を配置し、開頭術に備える。これらの標準は、
ＭＲＩに基づく術中画像ガイダンスのための表面登録（ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏ
ｎ）ポイントとして役立つであろう。患者をその後、ＭＲＩスキャナーに連れて
行き、ここでガドリニウムを注入し、そして３つの直交平面すべての画像セット
を得る。得られた画像セットは、手術室で利用される、術中画像ガイダンスコン
ピューターソフトウェアに適している。ガドリニウムまたは類似の造影剤の使用
は、生存受容腫瘍組織細胞を位置決定する組織平面マーカーを生成するのに役立
つ。生存腫瘍平面の画像指示位置決定は、プロセシングのための細胞採取の成功
の鍵である。

【００３５】 画像化期が完了したら、患者を手術室に連れて行き、そして開頭術に備える。
予防的抗生物質を静脈内注入し、ラシックスと共にステロイド類およびマンニト
ールを含む、脳浮腫を最小にする剤も同様に注入する。３点頭部ピン固定内に頭
を固定し、そして、赤外カメラに対する参照ブロック（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｂ
ｌｏｃｋ）の方向に注意し、赤外ＬＥＤ参照ブロックを頭部ピン固定装置に適用
する。参照ブロックは、カメラへの接続が妨害されないよう、そして手術アクセ
スが妨害されないように、手術野から十分な距離をとるよう、配置する。その後
、枠なしの観察ワンド（ｖｉｅｗｉｎｇ ｗａｎｄ）を、許容しうる（１．５
ｍｍ以下）登録エラーが得られるまで登録する。標準マーカーを除き、そして４
０の頭皮ポイントを登録し、手術野全体に渡る正確な登録を確実にする。３つの
直交平面すべてで、頭皮上にワンドを移動させることにより、登録をコンピュー
タースクリーン上でチェックする。

【００３６】 開頭術前に、好ましくは、移植の好ましい部位（例えば腹部）を検査しそして
準備する。例えば、好ましい様式には、臍のすぐ上外側の切開が含まれるであろ
う。上に示される他の部位もまた、許容しうるであろう。本症例においては、１
％リドカインの浸潤後、＃１０の刃で４ ｃｍの横行切開を作成する。傷の端は
、自己保持開創器で開創し、ポケット準備中の組織縁破壊を最小にする。Ｍｅｔ
ｚｅｎｂａｕｍはさみで鋭い切開を行い、そして電気焼灼器（ｅｌｅｃｔｒｏｃ
ａｕｔｅｒｙ）を用い止血に細心の注意を払い、直筋鞘を暴露する。歯状突起の
ある鉗子およびＭｅｔｚｅｎｂａｕｍはさみを利用し、直筋鞘を皮膚切開と平行
に切開し、それにより腹直筋を暴露する。直筋および鞘の間の傷の頭部および尾
部の広がりにおいて、鈍い指での切開を利用し、一連の相互連絡ポケットを確立
し、各々のチャンバーが直径１．８ ｃｍの、１０までの拡散チャンバーの続く
移植を可能にする。直筋鞘下トンネル作成後、通常の生理食塩水中のバシトラシ
ン溶液で傷を多量に灌注し、走行３−０ナイロン縫合を用い一層で閉じ、そして
適切に包帯を巻く（ｄｒｅｓｓ）。受容ポケットがまず形成されたら、必要な場
合、正確な頭皮および骨フラップを明示するためワンドを用い、開頭術を行い、
そして標準的な滅菌技術を利用し、手術のため手術野を準備する。

【００３７】 １％リドカインの浸潤後、頭皮を＃１０メス刃で切開し、そして頭皮をタオル
クリップで反転させる。必要な場合、どんぐり状のＭｉｄａｓ Ｒｅｘ切開ツー
ルの後、踏み板を備えたＢ−１切開装置の組み合わせを用い、骨板（ｂｏｎｅ
ｐｌａｔｅ）を除く。あらかじめ存在している骨板は、適切なように除く。硬膜
を開く前に、腫瘍切除中の観察ワンドの登録ポイントとして役立つ、４つの末梢
骨標準をＢ−１切開装置で作成する。その後、好ましくは十字方式で、＃１５メ
ス刃およびＧｅｒａｌｄ鉗子を利用し、硬膜を開き、それにより皮質表面を暴露
する。

【００３８】 その後、術中画像ガイダンスを利用し、腫瘍試料切除を進める。コンピュータ
ーモニターは、分割スクリーン上に各直交平面を示すと共に、観察ワンドに対す
る正しい角度の軸を特徴とする４つの視野を示す。二極性電気焼灼器および＃９
または＃１１ Ｆｒａｉｚｉｅｒ吸引装置を用い、腫瘍床の正確な試料採取を指
示するため、各ポイントでワンドを利用し、皮質切除術（ｃｏｒｔｉｓｅｃｔｏ
ｍｙ）を行う。生存腫瘍床縁は、コントラスト増強（ｃｏｎｔｒａｓｔ ｅｎｈ
ａｎｃｅｍｅｎｔ）の領域としてモニター上に映し出される。生存腫瘍組織が登
録され、そしてオリゴヌクレオチド前処置に許容しうると臨床的に判断されたら
（壊死破片の採取、炎症性反応、およびフィブリノーゲンが減少している）、刺
し込まれた腫瘍鉗子を利用し、凍結切片組織病理学的確認のため、組織を採取す
る。生存新生物形成組織が確認されたら、好ましくは最低５００ ｍｇの腫瘍組
織を採取する。続く有効な脱凝集および生存細胞培養の成功を改善するため、ク
ロットおよび壊死破片を含まない生存組織を採取するのに、最善の努力を行う。

【００３９】 試料採取後、画像ガイダンスを利用し、総切除または総切除に近いと判断され
る切除が達成されるまで、さらなる腫瘍減少（ｄｅｂｕｌｋｉｎｇ）を行う。積
極的な切除は、自己腫瘍拒絶に派生するいかなる移植後炎症も最小にするために
重要であると判断される。

【００４０】 有効な量の組織が得られ、そして適切な切除が行われたと満足された場合、い
かなる残った出血に関しても切除腔を点検する。出血はまず、トロンビンに浸し
た綿球で調節する。続いて出血は、二極性電気焼灼器で調節する。適切な止血が
達成されたら、切除腔にトロンビンに浸したサージセル（ｓｕｒｇｉｃｅｌ）を
並べる。硬膜は、４−０中断および走行縫合で閉じ、そして骨板をチタンプレー
ト系で再添付する。頭皮を２層で：帽状腱膜は２−０ビクリル（ｖｉｃｒｙｌ）
中断包埋縫合で、そして頭皮は３−０ナイロンまたはステープルいずれかで閉じ
る。

【００４１】 細胞の調製およびＩＧＦ−ＩＲアンチセンスＤＮＡでの細胞のインキュベーシ
ョン、第１日および第２日 手術室で採取した腫瘍組織試料を、ｅｘ ｖｉｖｏプロセシングのためすぐに
送る。無菌条件下で、生存腫瘍縁組織を、まずメスで穏やかに脱凝集する。コラ
ゲナーゼおよびプロテアーゼ処理で脱凝集を完了する。一連の次第に減少する内
径の注射針を通過させた後、単細胞懸濁物を得る。最後に細胞を洗浄し、そして
１０％血清（例えばウシ胎児（ｃａｌｆまたはｂｏｖｉｎｅ））を補った培地中
に蒔く。

【００４２】 細胞を、４ないし６時間、付着させる。細胞を注意深く洗浄し、そして血清に
存在するヌクレアーゼへの曝露を避けるため、最終体積２０ ｍｌの血清不含培
地中で２ ｍｇまでのＩＧＦ−ＩＲアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置する
。オリゴヌクレオチド処置は、最低６時間から最大１０時間の範囲である。オリ
ゴヌクレオチド処置用量は、１ ｘ １０⁷細胞に関し、確立されている。より
多くの細胞には、相対的により多くのオリゴヌクレオチドを利用してもよい。例
えば１８００万の細胞には、血清不含培地３６ ｍｌ中で、３．６ ｍｇまでの
ＩＧＦ−ＩＲを用いる。

【００４３】 一晩処置した後、細胞を採取し、そして注意深く洗浄する。細胞をリン酸緩衝
生理食塩水（カルシウムおよびマグネシウム不含）に再懸濁し、そして２００μ
ｌ／チャンバーの体積および１ ｘ １０⁶細胞／チャンバーの密度で拡散チャ
ンバーに入れる。この体積／濃度関係は、低酸素症による細胞死を避けるために
重要である。１つの態様において、ＦＤＡ規定に従うため、移植直前にチャンバ
ーを５ Ｇｙで放射線照射する。別の好ましい態様は、放射線照射を含まない。
チャンバーは外径１．４ ｃｍおよび高さ０．８ ｃｍの小さいルサイト輪から
なり、両端に親水性膜を持つ。膜は０．１μｍの排除制限を有し、これにより損
なわれていない細胞の出入りが妨げられ、そして可溶性因子の拡散が可能になる
。

【００４４】 拡散チャンバーの外科的移植、第２日 術後２日目、腹部受容部位を拡散チャンバー移植のため準備する。自己腫瘍細
胞の採取に対する本処置のタイミングは、明らかでなくそして重要である。標的
とするＩＧＦ−ＩＲを持つ腫瘍細胞は、足場（ａｎｃｈｏｒａｇｅ）独立条件下
、例えばｉｎ ｖｉｖｏで、アポトーシスを経験するようになっている。アンチ
センスＩＧＦ−ＩＲオリゴヌクレオチドで処置した腫瘍細胞が患者の直筋鞘（ｒ
ｅｃｔａｌ ｓｈｅａｔｈ）内への移植前に拡散チャンバーにおいてアポトーシ
スを経験する状態を避けるため、腫瘍細胞の採取および拡散チャンバーの移植の
間に、１時間の時間幅（最大）が確立されてきている。細胞採取、および生物学
的シグナルを生成する自己由来処置腫瘍細胞の再移植の間の時間幅は、誘発プロ
セスのピークがｉｎ ｖｉｖｏで起こるためには、好ましくは１時間を超えては
ならない。好ましくは、細胞採取およびあらかじめ処置した細胞の再移植は、可
能な限り狭い時間幅内で行われる。

【００４５】 病床で、患者を処置に備える；患者を１０ ｍｇのＶｅｒｓｅｄで鎮静し、そ
して傷感染予防のため１ ｇのＡｎｃｅｆ抗生物質を注入する。先に準備した腹
部受容部位を、標準的な滅菌技術を用い、暴露し、そして０．５％Ｓｅｎｓｏｒ
ｃａｉｎｅを腹部切開に注射する。Ｍｅｔｚｅｎｂａｕｍはさみを利用し、受容
部位を開き、それにより前日に切開した直筋鞘を暴露する。フィブリンはシグナ
ル生成に干渉し、そしてそれにより処置の有効性を減少させる可能性があるため
、過剰な残った出血またはフィブリン性滲出物の存在は回避するべきである。再
び、持ち運び可能な熱焼灼装置を用い、小さいものであっても、いかなる出血源
も調節するよう、注意を払う。いかなる残ったフィブリン成分も、通常の生理食
塩水中のバシトラシン溶液で多量に灌注し、除く。各々体積２００μｌの腫瘍細
胞懸濁物を含む、１０までの滅菌拡散チャンバーを、先に記載した直筋鞘ポケッ
トに移植する。生物学的線量測定（ｄｏｓｉｍｅｔｒｙ）は、最大１ ｘ １０ ⁷ 細胞のための１０のチャンバー中の１ ｘ １０⁶細胞／チャンバーの移植を含
む。すべての症例で、広い膜の側が腹直筋に対し水平になるように、拡散チャン
バーを移植する。チャンバーの方向は、誘発シグナルの生物学的に有効な伝達に
重要である。受容部位としての腹直筋を含む、本方式の選択は、この領域のリン
パドレナージが鼠径部リンパ節を介し、大動脈周囲の節に進み、続いて胸管に排
出されるため、重要である。このドレナージ経路は、形質導入細胞由来の拡散可
能物質が、移植部位からおよそ３センチメートルである局所リンパ節を介し、末
梢リンパ組織と出会うことを可能にする。

【００４６】 直筋鞘は、拡散チャンバーを水平方向に固定するため、２−０ビクリル中断縫
合で、再近置する。受容部位を走行３−０ナイロン連動（ｉｎｔｅｒｌｏｃｋ）
縫合で閉じ、そして適切に包帯を巻く。

【００４７】 本プロトコルで、最初の４人の患者を処置した際、高頻度で、おそらく本処置
に起因すると考えられる深部静脈血栓症が発生した。したがって、本プロトコル
に加え、低分子量ヘパリン（分画化ヘパリンまたはＬＯＶＥＮＯＸ（登録商標）
）を１日４０ ｍｇ、皮下注射で使用する。ＬＯＶＥＮＯＸ（登録商標）は、３
ヶ月間、毎日皮下注射として続ける。

【００４８】 拡散チャンバーの外科的除去、第３日 病床で、患者を拡散チャンバーの外科的除去法のため備える。患者を１０ ｍ
ｇのＶｅｒｓｅｄで鎮静し、そして傷感染予防のため１ ｇのＡｎｃｅｆ抗生物
質を注入する。先に準備した腹部受容部位を、標準的な滅菌法を用い、暴露し、
そして準備する。該部位を覆い、そして０．５％Ｓｅｎｓｏｒｃａｉｎｅを腹部
切開に注射する。Ｍｅｔｚｅｎｂａｕｍはさみを利用し、傷を開き、それにより
前日に病床で大まかに近置した直筋鞘を暴露する。滅菌拡散チャンバーを直筋鞘
ポケットから回収し、そして実験室に持ちかえり注意深く検査する。特に、膜の
完全性を点検し、そしてフィブリノーゲンの存在に関し、各チャンバーの内容物
を注意深く観察する。各チャンバーから回収した体積を測定し、そしてこの体積
は、元来記録された体積と同一でなければならない。各チャンバーの細胞内容物
を注意深く検査し、そして生存する細胞回収の率を定量化する。２−０ビクリル
中断縫合で直筋鞘を再近置し、そして２−０ビクリル中断水平さし縫い縫合で皮
下組織を再近置する。３−０ナイロンを利用した中断垂直さし縫い縫合で皮膚を
再近置し、そしてその後、傷に適切に包帯を巻く。

【００４９】 実施例２：自己由来細胞株、同種細胞株、または異種細胞株の移植 本プロトコルのための外科的候補は、腫瘍除去のための開頭術の候補ではない
。本群の患者の例には、これらの腫瘍が危険な位置にあるため、しばしば生検な
しにＸ線撮影により診断される腫瘍である、脳幹神経膠腫の患者が含まれるであ
ろう。利用される外科的範例は、第２日および第３日に関し記載されるものと同
じである。

【００５０】 第１日 第１日目、適切な細胞株を選択し、そして新たに採取された自己組織に関する
ものと同じ指定にしたがい、前処置する。ｉｎ ｖｉｔｒｏインキュベーション
期間およびオリゴヌクレオチドの用量もまた、上に詳細に記載される採取自己試
料に関するものと同じままであろう。

【００５１】 両群に関する移植後監視 チャンバーの除去後、患者の監視が始まる。標準的な開頭術後患者に日常的で
あるように、日常的な生命徴候および一連の神経学的検査を進める。術後第１週
および第２週にそしてその後は毎月、ガドリニウムを用いたおよび用いないＭＲ
Ｉスキャンを行う。

【００５２】 方法のさらなる詳細 本発明の好ましい態様において、１２の好ましい段階を行う。画像ガイド開頭
術（１）は腫瘍を切除するために行う。腫瘍を除去し、そしてリン酸緩衝生理食
塩水に入れる（２）。続いて、腫瘍組織をペトリ皿に移し、ここで、メスを用い
腫瘍を細かい破片に細分する（３）。酵素的消化により脱凝集を続け、そして単
細胞をＴ−２５組織培養フラスコに蒔く；４−６時間後、細胞が付着したら、最
終体積２０ ｍｌの血清不含培地中でのＩＧＦ−ＩＲに対するアンチセンスＤＮ
Ａ ２ ｍｇと、最低６時間インキュベーションする（４）。その後、細胞を剥
がし、そして１５ ｍｌの円錐試験管に移し、何回か洗浄する（５）。次に、細
胞を拡散チャンバーに被包する（６）。移植前に、拡散チャンバーに被包した細
胞を５ Ｇｙの放射線で放射線照射する（７）。拡散チャンバーに被包した細胞
を、患者の直筋鞘に外科的に移植し（８）、そしてアポトーシスが２０時間以内
にｉｎ ｖｉｖｏで起こる。その後、チャンバーを患者の直筋鞘から除き、そし
て傷を永久的に閉じる（９）。チャンバーを開き、そして細胞を回収する（９）
。続いて、細胞をエッペンドルフチューブに移す（１０）。次に細胞を洗浄し（
１１）、そして拡散チャンバーから回収した細胞を、トリパンブルー排除により
生存度に関し解析し、そして血球計算板で定量化する（１２）。

【００５３】 処置の第１日の詳細は以下の通りである。手術室で採取した腫瘍組織を５０
ｃｃの円錐試験管に入れ、ＢＬ−２施設に運ぶ。ＢＬ−２施設において、腫瘍を
洗浄し、赤血球を除き、そしてペトリ皿に移し、そしてＰＢＳ中でメスで細かく
刻む（１）。細胞を１５ ｍｌの試験管に移し、そしてＰＢＳ中で洗浄する（２
）。その後、細胞をペトリ皿に移し、そして酵素消化を繰り返し、解離させる（
３）。次に、細胞を１５ ｍｌの円錐試験管に移し、そして洗浄する（４）。細
胞をＴ−２５組織培養フラスコに入れ、そして付着させる（５）。

【００５４】 ＩＧＦ−ＩＲアンチセンスＤＮＡを、最終体積２０ ｍｌの血清不含培地中の
２ ｍｇのＩＧＦ−ＩＲアンチセンスＤＮＡの、最低６時間のインキュベーショ
ン培地に添加する前に、付着させることが必要である。第２日目、細胞をトリプ
シンで剥がし；そして細胞を１５ ｍｌの円錐試験管に移し、そして注意深く洗
浄する（１）。１０％血清を補った培地を添加することによりトリプシンの効果
を停止し；２００μｌ中に懸濁した１０⁶細胞を各拡散チャンバーに装填し、そ
して拡散チャンバーをその後、５ Ｇｙの放射線で放射線照射する（２）。

【００５５】 第３日目、拡散チャンバーを患者の腹部から採取する。各拡散チャンバーを開
き、そして細胞内容物をエッペンドルフピペットで除く（１）。細胞をその後、
１ ｍｌエッペンドルフチューブに移し、そして洗浄する（２）。細胞を血球計
算板中で計数する（３）。拡散チャンバーから回収した細胞をＴ−２５組織培養
フラスコに再度蒔き、生存度を評価する（４）。

【００５６】 第１相研究に参加した患者における観察 第１相研究に参加した１２人の患者における観察を提示する。上述のように、
各患者に関し、開頭術を行い、そして腹部受容部位をチャンバー移植のため、準
備した。手術で切除した腫瘍を、ＢＬ−２施設で脱凝集し、そして培養で付着し
た細胞を、ＩＧＦ−ＩＲアンチセンスオリゴヌクレオチドと一晩インキュベーシ
ョンした。手術２４時間以内に、１０⁷までの処置細胞を拡散チャンバーに被包
し、非致死的に放射線照射し、そしてさらに２４時間の期間、移植した。チャン
バー回収後、一連のＭＲＩおよび臨床検査で患者を追跡した。

【００５７】 アンチセンス処置後、処置細胞のＩＧＦ−ＩＲレベルは、ウェスタンブロッテ
ィングにより測定されるように、１０％以下に落ちた。２４時間の移植後、アン
チセンス処置細胞の２％未満しか回収できなかった。追跡調査では、１０の評価
可能な患者のうち６人が部分的なまたは完全なＸ線および臨床的反応を示した。
同情的な（ｃｏｍｐａｓｓｉｏｎａｔｅ）再処置反応を含めると、８つの処置反
応が観察された。最初の４人の患者における深部静脈血栓症のほかは、他の処置
関連副作用は見られなかった。

【００５８】 本処置はよく寛容され、そして高い率のＸ線および臨床的反応を得た。さらに
、処置後腫瘍試料の組織学的観察は、処置関連効果を支持した。これらのデータ
は、本範例を利用し、非毒性全身性処置効果が達成されることを示す。

【００５９】 患者および方法 本プロトコルは、ＦＤＡおよびＴｈｏｍａｓ Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙの施設再検討委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ
Ｂｏａｒｄ）により再検討され、そして認可された。ＷＨＯ ＩＩＩ度または
ＩＶ度の神経膠腫と診断され、放射線療法を含む、慣用的な療法に失敗した患者
が登録された。総数１２の成人患者、９人の男性および３人の女性（年齢３２な
いし６８歳、図１）が登録された。４人の患者は、未分化神経膠星状細胞腫を有
し、そして８人は神経膠芽腫を有し、そして各群の１人の患者は、多病巣性の疾
患を有した。最初の診断および本処置の介入の間の平均時間間隔は、１２２週だ
った。腫瘍再発は、９人の患者で臨床的症状と関連し、そしてすべての１２の患
者で監視ＭＲＩにより立証された。

【００６０】 すべての患者は、先に記載されるように、ＭＲＩに基づく画像ガイド腫瘍切除
を経験した。必要な場合、流暢な（ｅｌｏｑｕｅｎｔ）皮質の機能を保持するた
め、術中発語および／または運動皮質記録（ｍｏｔｏｒ ｃｏｒｔｉｃｏｇｒａ
ｐｈｙ）を行った。開頭術前に、チャンバー移植のための腹部受容部位を準備し
、直筋鞘を分割し、そして直筋および鞘の間に相互連絡ポケットを確立した。

【００６１】 画像ガイド切除中、生存腫瘍組織を凍結切片により確認し、そして続く脱凝集
および処置のため、ＢＬ−２施設に送った。腫瘍試料を、無菌条件下で、まずメ
スでそしてその後酵素消化で穏やかに脱凝集させた。細胞を完全培地（１０％ウ
シ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびグルタミンを補ったＤＭ
ＥＭ）中に蒔いた。細胞が付着したら、注意深く洗浄し、そして血清不含培地（
１μＭ 硫酸鉄および０．１％ ＢＳＡフラクションＶを補ったＤＭＥＭ）に移
し、そしてＩＧＦ−ＩＲアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置した。ＩＧＦ−
ＩＲ ＲＮＡを標的とし、そして開始メチオニンから６ヌクレオチド下流で始ま
る、１８量体のホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（ＧＧＡＣＣＣ
ＴＣＣＴＣＣＧＧＡＧＣＣ；配列番号３）を用いた。本アンチセンスオリゴデオ
キシヌクレオチドは、Ｌｙｎｘ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（カリフォルニア州
ヘイワード）により合成された、ロット＃ＬＲ４４３７−００２Ａであり、本明
細書に他に記載されるのと同じロットである。２ ｍｇアンチセンス／１０⁷細
胞の用量を用いた最低６時間のインキュベーションの後、細胞を採取し、カルシ
ウムおよびマグネシウム不含ＰＢＳで注意深く洗浄し、そして１０⁶細胞／２０
０μｌ／チャンバーの密度で拡散チャンバーに入れた。チャンバーは、０．１ｍ
の孔サイズの親水性膜を両端に持つ、小さなルサイト輪（直径１．４ ｃｍ）で
ある。これらは可溶性因子（例えば栄養素またはペプチド）の通過を可能にし、
損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）細胞の出入りを妨げる。

【００６２】 開頭術後の最初の日、拡散チャンバー移植のため、腹部受容部位を病床で開い
た。受容部位が開かれるのと同時に、ｅｘ ｖｉｖｏで、ＩＧＦ−ＩＲアンチセ
ンスデオキシオリゴヌクレオチドで処置した腫瘍細胞が剥がれ、チャンバーに被
包され、そして非致死的に放射線照射（５ Ｇｙ）されるように、時間幅を選択
した。局所麻酔および抗生物質予防処置後、直筋鞘ポケットを暴露し、そして１
０までの滅菌拡散チャンバーを移植した。

【００６３】 開頭術後の２日目、拡散チャンバーを直筋鞘ポケットから回収し、そして傷を
閉じた。回収後の解析のため、チャンバーをＢＬ−２施設に運んだ。移植後監視
には、いくつかの臨床およびＭＲＩ検査を含んだ。

【００６４】 同情的（ｃｏｍｐａｓｓｉｏｎａｔｅ）再処置 抗腫瘍効果が観察されたため、ＩＧＦ−ＩＲアンチセンスでの最初の処置に失
敗した３人の患者を、より高い生物学的用量で再処置した。ＦＤＡの認可を受け
、許容しうるチャンバー数を１０⁶細胞／チャンバーの２０のチャンバーに増や
し、そしてｅｘ ｖｉｖｏインキュベーション中、２ ｍｇ ／１０⁷細胞でア
ンチセンス用量を維持した。

【００６５】 処置範例の有効性、特異性、および生物学的安全性：チャンバー移植前のｅｘ
ｖｉｖｏ評価 アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの生物学的活性を調節するため、Ｉ
ＧＦ−１Ｒ標的化の有効性および特異性を両方評価した。ＩＧＦ−１Ｒ標的化に
対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの有効性は、ウェスタンブロッ
ティングによりタンパク質レベルでＩＧＦ−１Ｒ発現に対する影響を測定するこ
とにより、決定した（図２、上のパネルを参照されたい）。過剰な組織が入手可
能な場合、試料（Ｎ＝６）を解析し、そしてＩＧＦ−１Ｒアンチセンス処置後、
ＩＧＦ−１Ｒの存在はＩＧＦ−１Ｒレベルの９０％以上の減少を伴うことが明ら
かになった（図２、上のパネル）。アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド標
的化の特異性は、細胞表面での他のチロシンキナーゼ受容体、例えばフォーカル
アドヒージョンキナーゼの発現に対する影響を除外することにより、決定した（
図２、下のパネルを参照されたい）。

【００６６】 移植前の自己腫瘍細胞に外来（ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ）剤が存在しないこ
とは、Ｇｒａｍ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）およびマイコプラズ
マ染色キット（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含む、商業的に入手可能な
キットの使用により、確認した。

【００６７】 チャンバー回収後のｅｘ ｖｉｖｏ評価 拡散チャンバーの完全性は、移植前および後の体積を測定することにより、決
定した。各チャンバーに最初に装填した体積は２００ ｍｌであり、そして１４
６の移植チャンバーの各々から回収した体積は１９８±２ ｍｌであった。拡散
チャンバーの移植２４時間後に測定した細胞回収は、最初に移植した細胞数の２
％未満であった。チャンバーから回収した細胞を注意深く顕微鏡解析すると、腫
瘍細胞のみ（そしてトリパンブルー染色により示されるように、ほとんど非生存
）を回収することが可能であったことが示された。リンパ球、単球、マクロファ
ージ、または樹状細胞を含む他のいかなる細胞種も同定できなかった。また、腹
部受容部位から得られた試料中のＧＦＡＰ陽性細胞（神経膠腫細胞のマーカー）
の存在も除外された。

【００６８】 エノキサパリン（ｅｎｏｘａｐａｒｉｎ）予防処置 最初の４人の患者でＤＶＴが予測された率より高い率で見られたことに基づき
、続くすべての患者に、ＤＶＴ予防処方計画を確立した。開頭術後の最初の日、
エノキサパリン予防処置の３ヶ月処方計画を開始し、該計画には、毎日４０ ｍ
ｇの皮下注射を伴った。エノキサパリン処置の１２週間の過程の直前および完了
後に、非侵襲ドップラー研究を行った。

【００６９】 反応評価 すべての患者は、矢状（ｓａｇｉｔｔａｌ）、軸性（ａｘｉａｌ）、前頭（ｃ
ｏｒｏｎａｌ）面における、Ｔ１およびＴ２加重コントラスト前画像およびＴ１
加重コントラスト後画像からなる標準的脳画像化プロトコルを用い、一連のＭＲ
Ｉ評価を受けた。ＭＲＩスキャンは、処置開始時に残っている腫瘍を立証するた
め、４８時間以内に得た。疾患の進行、後退または安定性は、以下を含む一連の
研究の間の７つの画像特性の評価における変化により、決定した：（１）局所質
量（ｍａｓｓ）効果；（２）Ｔ２加重異常の大きさ（例えば浮腫、腫瘍、放射線
変化）；（３）増強領域の大きさ；（４）増強の特性（例えば小結節形成（ｎｏ
ｄｕｌａｒｉｔｙ）の進行または後退）；（５）増強領域の強度；（６）深部白
質路の侵襲；および（７）遠位進行。Ｘ線評価は、一連の研究比較可能画像が評
価される際、これらの特性のいずれにおける変化も評価することにより、行った
。各画像特性は、増加、減少または変化なしとして評価した。すべての症例で、
ＭＲＩ比較は、各患者に関し、１人の神経放射線学者により、行った。最初の比
較は、処置直後に行ったＭＲＩ研究および療法の開始からおよそ４週間後に行っ
た追跡検査の間の変化を評価した。続く比較は、２ヶ月間隔、そして後には３ヶ
月間隔の変化を評価した。

【００７０】 一連の臨床検査は、神経外科医および神経学者により、独立に行った。成果状
態は、Ｋａｒｎｏｆｓｋｙ成果スケール（ＫＰＳ）にしたがって評価した。 反応は、処置後、以下の規準を利用し、評価した： 完全反応：一連の研究の間のすべての評価可能な画像特性の、完全な消解（ｒ
ｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）までの、または術後および／または放射線変化と矛盾しな
い特徴を持つ安定した画像までの改善が、神経学的および全身性身体検査の改善
または安定と共に、コルチコステロイド投薬なしに、少なくとも１ヶ月続くもの
。

【００７１】 部分反応：２つまたはそれ以上の評価可能な画像特性の改善が、神経学的およ
び身体検査の改善または安定と共に、安定したまたは減少したコルチコステロイ
ド用量で、少なくとも１ヶ月続くもの。

【００７２】 安定疾患：一連の研究の間の画像特性にいかなる有意な変化もなく、神経学的
および身体検査の改善または安定と共に、安定したまたは減少したコルチコステ
ロイド用量で、少なくとも１ヶ月続くもの。

【００７３】 進行性疾患：一連の研究の間の画像特性の増加が、神経学的および身体検査の
悪化、および安定したまたは増加するコルチコステロイド用量を伴うもの。 結果 開頭術で採取した腫瘍細胞を利用し、手術可能な悪性神経膠腫を持つ１２人の
患者を安全に処置し、平均追跡調査は６７±７週間（４０ないし１００週間の範
囲）であった。３症例における同情的再処置を例外とし、これらの患者は、適切
な支持的内科的および／または外科的療法を除き、研究下で、いかなる他の処置
も受けなかった。いかなる処置関連毒性も同定されず、そして臨床検査は、完全
血液計測、肝機能研究、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋計数、ＡＮＡ、アンチ−ｓｓＤ
ＮＡおよびアンチｄｓＤＮＡ抗体検査が正常であり、これを支持した。

【００７４】 生物学的安全性 １２症例すべてで、移植前に細胞を評価し、そして外来剤を含まないことを見
出し、そして移植後の期間、傷感染のいかなる臨床的徴候もなかった（Ｎ＝１２
）。評価可能な場合、移植部位で、いかなる神経膠腫瘍分散（ｓｅｅｄｉｎｇ）
も同定されなかった（Ｎ＝６）。総数１５６の拡散チャンバーを移植し（図３Ａ
および３Ｂ）、そして回収時、いかなる膜破壊も見られなかった。自己腫瘍細胞
のみを回収し、そしてすべての症例で、トリパンブルー染色により評価されるよ
うに、回収細胞の２％未満が生存可能であった。

【００７５】 これまでに見られた唯一の処置関連合併症は、最初の４人の患者における深部
静脈血栓症（ＤＶＴ）の高発生である（患者１−４；図３Ａを参照されたい）。
続いて、以後処置されるすべての患者のプロトコルにおいて、分画化低分子量ヘ
パリン（エノキサパリン）を利用した予防処方計画を開始し；後の１０人の患者
のうち８人でＤＶＴが発生しなかった。同情的処置で再処置したどちらの患者に
もＤＶＴが発生し、１人はエノキサパリン投与中であり、もう１人は、エノキサ
パリンの自己中断後であった。

【００７６】 処置反応：臨床およびＸ線観察 一度処置した４人の患者および二度処置したさらなる３人の患者で、安全性に
加え、抗腫瘍効果を観察し、該患者はすべて、臨床的に改善したかまたは安定し
た。すべての症例で、Ｘ線的改善は、切除腔を越え、そして同側全体に、そして
適用可能な場合、対側半球に拡張し、そしてすべての反応は、失敗と判断された
以前の慣用的な処置後、少なくとも２ヶ月後に起こった。さらなる２人の患者は
、臨床的に改善し、１人は完全なＸ線および臨床的反応を維持した。同じ時間間
隔における一致処置で処置した症例コントロール群を同定し、そして匹敵する抗
腫瘍効果は観察されなかった。本シリーズにおいて、Ｘ線的改善は、１４週まで
に起こり、８週（患者７）ないし１４週（患者２）の範囲の間隔があり、一方、
コントロール症例は、コントラスト増強により特徴付けられる持続する腫瘍を常
に示した。代表的な試験反応および症例コントロールは図４および５に示され、
そしてすべての症例は図３Ａおよび３Ｂに要約される。図４に示されるように、
増強および質量効果の欠失が試験症例で観察され、対応する症例コントロールで
はコントラスト増強の持続が見られた。該試験症例では、患者はＸ線的改善と一
致する臨床的改善を有した。図５に示されるように、同側三角の回復（ｒｅｓｔ
ｉｔｕｔｉｏｎ）を伴う、増強および質量効果の欠失が試験症例で観察されたが
、対応する症例コントロールではコントラスト増強の持続および三角の抹消（ｅ
ｆｆａｃｅｍｅｎｔ）が見られた。試験症例において、患者は、臨床的改善を有
し、すべての病的状態前活性に戻り、これはＸ線的改善と一致した。この患者は
対側右前頭極（ｆｒｏｎｔｏｐｏｌａｒ）領域における再発疾患に屈し、そして
検死体は、再発部位に活性腫瘍を有したが、原発部位には散在する腫瘍細胞しか
なかった。

【００７７】 最初にいくつかのＸ線的改善があったにもかかわらず、悪化した３人の患者で
は同情的再処置がＦＤＡおよびＩＲＢより承諾された。再処置後、外科的切除か
ら離れた小結節の増強のさらなるＸ線的欠失が、臨床的改善または安定化いずれ
かを伴い、３人すべてで起こった。

【００７８】 ９つの症例の一連の腫瘍組織を処置前および後に解析した。これらの観察は、
図３Ａおよび３Ｂに要約される。１２症例のうち１１では、処置時、生存する腫
瘍のみが観察され、線維性壊死として反映される放射線変化の徴候はなかった。
以前ＧＬＩＡＤＥＬ（登録商標）移植した２つの症例では、オブラート破片に隣
接し、生存腫瘍細胞が観察された。

【００７９】 処置反応：組織病理学的観察 すべての死後検査およびすべての療法後外科的生検で、残った生存腫瘍細胞を
同定した。元来の腫瘍部位が上皮細胞増殖を失った（患者１）、腫瘍細胞数およ
び多形性を失った（患者７）、または壊死の広い領域を得た（再処置後の患者８
）、個々の症例を観察した。腫瘍関連血管のみに限定される微小血栓を、療法後
組織が入手可能な１０の症例のうち、６つで同定した。やはり、多様な度合いの
腫瘍血管周辺リンパ球浸潤を、処置前腫瘍においてリンパ球浸潤が観察されなか
った４つの症例で同定した。同定可能な腫瘍細胞を含まない脳切片において、炎
症、脈管炎、出血、壊死、脱髄、または血管血栓症は同定されなかった。

【００８０】 概要 予防的抗凝固の開始を誘発したＤＶＴの高発生以外は、本方法による全身毒性
は認められなかった。Ｘ線および臨床的反応が立証され、そしてこれらの反応は
、外科的介入またはステロイド用量の上昇のいずれにも起因するとは考えられな
かった。すべての症例で、Ｘ線的改善は切除腔から離れているか、またはいかな
るさらなる治療介入もなしに、残った腫瘍切除腔における連続するＸ線的改善に
相当した。ステロイド用量は、臨床的改善の期間中、変化しないかまたは漸減す
るかいずれかであった。

【００８１】 患者２および３のＭＲＩスキャン上の増強の欠失に対応する腫瘍の病理学的検
査は、腫瘍血管の血栓症を立証した。患者２は、全腫瘍の驚くべき増強の欠失を
示し、そして病理学的検査により、死後標本において、内皮増殖が完全に失われ
ていることが明らかになった。内皮増殖は、患者２由来の治療前腫瘍生検標本に
おいて、広く同定された。これらの知見は、放射線学的反応は、本処置に起因す
ると考えられる腫瘍血管系の欠失に関連する可能性を高める。

【００８２】 毒性が明らかでなく、そして反応が優れているため、本処置は、神経膠腫の生
物学的処置として顕著な療法的利点を生じるようである。本明細書に記載される
反応は、アンチセンス処置腫瘍細胞を、０．１ ｍ孔サイズの親水性膜で構築さ
れる拡散チャンバー内に被包した際、得られた。この排除制限は、細胞を排除し
、そしてアンチセンス処置細胞から放出される可溶性因子が、これらの反応を誘
発するのに責任がある可能性があることを示唆する。

【００８３】 いくつかの研究は、リンパ球浸潤（ＬＩ）が、神経膠腫のかなり一般的な組織
学的特徴であると立証してきているが、ＬＩを処置に対し反応する可能性がある
ものとして評価しているものはほとんどない。２００人の患者のこうした研究の
１つにおいて、２８の証拠提出された症例由来の組織学的標本のＬＩを、放射線
療法などの介入処置前および後に得られた連続生検において、ＬＩ変化に関し再
点検した。本シリーズにおいて１１人の患者は、最初の生検でＬＩを示し、続く
生検で多様なレベルのＬＩを示した。１７の症例のうち１６で、最初の生検でＬ
Ｉが存在せず、続く生検すべてに渡り、存在しないままであったことが明らかに
なった。このシリーズでは、処置後腫瘍組織で新たに同定されるＬＩがはるかに
高い頻度であり、これにより本研究の結果と比較し、処置関連効果が示唆される
。以前の研究では、血管周辺ＬＩおよび予後の間に好ましい相関が見出されてき
ている。本シリーズにおいて、血管周辺ＬＩを持つ４人の患者のうち３人で、処
置後、臨床およびＸ線的改善が明示された。

【００８４】 選択的腫瘍血管血栓症は、免疫仲介過程と独立した機構に相当する可能性があ
る。腫瘍血管血栓症は、処置した６人の評価可能患者のうち６人で観察され、そ
して選択的腫瘍血管血栓症の異なる機構は不明のままであるが、本反応は、これ
らの患者すべてにおいて、明らかな腫瘍後退と関連付けられ、そして臨床的改善
と関連付けられてきている。同様の腫瘍後退は、動物モデルにおいて、腫瘍血管
系の選択的閉塞後、観察されてきている。

【００８５】 脳腫瘍患者におけるＤＶＴの期待される発生率は約４０％である。エノキサパ
リン前コーホートでは、発生率は１００％または保証エノキサパリン予防の２．
５倍であった。エノキサパリン処置後、発生率は２０％、または期待される発生
率の半分に落ち、そしてすべての症例でいかなる関連する出血も伴わなかった。
これらの知見は、神経外科患者における、安全でそして有効なエノキサパリン投
与と一致する。最近の報告は、前向き無作為試験におけるエノキサパリンの抗血
栓有効性を概説し、そして１つの研究において、研究期間中の癌関連死亡率がよ
り低い発生率であったことが示された。この後向き観察にもかかわらず、エノキ
サパリンに派生する腫瘍溶解効果は、反応がエノキサパリン処置が提供されない
最初の４人の患者のうち３人で観察されたため、除外することが可能である。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、臨床試験に登録した患者をまとめた表を示す。

【図２】 図２は、ポリクローナル抗体、抗ＩＧＦ−ＩＲ βサブユニット
で免疫染色し（上の矢印）、その後、フォーカルアドヒージョンキナーゼに対す
るモノクローナル抗体で再染色した（下の矢印）ウェスタンブロットを示す。レ
ーン１：Ｔ９８Ｇ神経膠芽腫細胞；２：処置前の患者１；３：患者１＋１ ｍｇ
のＬＲ ４４３７−００２Ａ（ＩＧＦ−ＩＲアンチセンスオリゴヌクレオチド）
；４：患者１＋２ ｍｇのＬＲ ４４３７−００２Ａ；５：Ｃ６ラット神経膠芽
腫細胞；６：Ｔ９８Ｇヒト神経膠芽腫細胞；７：処置前の患者８；８：患者８＋
２ ｍｇのＬＲ ４４３７−００２Ａ；９：Ｔ９８Ｇヒト神経膠芽腫細胞；１０
：処置前の患者９；１１：患者９＋２ ｍｇのＬＲ ４４３７−００２Ａ；１２
：処置前の患者１０；１３：患者１０＋２ ｍｇのＬＲ ４４３７−００２Ａ；
および１４：Ｔ９８Ｇヒト神経膠芽腫細胞。

【図３】 図３Ａおよび３Ｂは、臨床試験に登録した患者の処置後解析を示
す表を示す。

【図４】 図４は、元々、優性左側頭葉に由来する悪性神経膠腫と診断され
、ロベクトミーおよび放射線照射療法を受けたが失敗し、そして深部灰白質およ
び同側前頭葉に進行した患者の試験症例（患者１、ａ−ｃ）および症例コントロ
ール（ｄ−ｆ）のＭＲＩスキャンを示す。失敗した際、病理により、両方の症例
で放射線照射壊死の徴候を伴わない生存腫瘍が明らかになった（０時点）。試験
症例は、画像ガイド再切除およびＩＧＦ−ＩＲアンチセンス処置を受け、そして
症例コントロールは、画像ガイド再切除およびＧＬＩＡＤＥＬ（登録商標）移植
を受けた。白い楕円内の数は、処置後の週を示す。

【図５】 図５は、元々、優性左後部側頭−頭頂領域に由来する悪性神経膠
腫と診断され、どちらも軽度の受容失語症を伴い、切除および放射線照射療法を
受けたが失敗し、そして同側深部灰白質および前頭葉に進行した患者の試験症例
（患者７、ａ−ｃ）および症例コントロール（ｄ−ｆ）のＭＲＩスキャンを示す
。失敗した際、病理により、両方の症例で放射線照射壊死の徴候を伴わない生存
腫瘍が明らかになった（０時点）。試験症例は、画像ガイド再切除およびＩＧＦ
−ＩＲアンチセンス処置を受け、そして症例コントロールは、画像ガイド再切除
およびＧＬＩＡＤＥＬ（登録商標）移植を受けた。白い楕円内の数は、処置後の
週を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ａ６１Ｋ 35/12 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ Ｕ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 バサーガ，レナート・エル アメリカ合衆国ペンシルバニア州19115， アードモア，ブレダイン・ロード 125 (72)発明者 レスニコフ，マリアナ アメリカ合衆国ペンシルバニア州19102， フィラデルフィア，ロカスト・ストリート 1500，アパートメント 2617 (72)発明者 エイブラハム，デイヴィッド アメリカ合衆国ペンシルバニア州19096， ワインウッド，サーリ・レイン 1419 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA02 BA63 CA04 DA03 EA02 EA04 GA11 HA17 4B065 AA93X AA99Y AB01 AC20 BA02 BD13 CA44 4C084 AA13 NA14 ZB261 ZC412 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB26 ZC41 4C087 AA01 AA02 BB63 NA14 ZB26 ZC41

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトにおいて、腫瘍増殖に対する抵抗性を誘導する方法で
   あって： （ａ）腫瘍細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで、ＩＧＦ−ＩＲに
   相補的なオリゴヌクレオチドと接触させ；そして （ｂ）前記の処置した腫瘍細胞を含む拡散チャンバー（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｃ
   ｈａｍｂｅｒ）を、前記ヒトの直筋鞘（ｒｅｃｔｕｓ ｓｈｅａｔｈ）内に、治
   療的に有効な時間、移植し、それにより腫瘍増殖に対する抵抗性を誘導する ことを含む、前記方法。
2. 【請求項２】 前記の治療的に有効な時間が、前記拡散チャンバーにおけ
   る前記腫瘍細胞の死を可能にし、そして前記ヒトにおける前記腫瘍増殖の抵抗性
   を可能にする、請求項１の方法。
3. 【請求項３】 前記腫瘍細胞が前記ヒトから切除される、請求項１の方法
   。
4. 【請求項４】 前記腫瘍細胞が、自家移植片、同種異系移植片、同系の、
   非同系の、および異種移植片からなる群由来の細胞より選択される、請求項１の
   方法。
5. 【請求項５】 前記腫瘍細胞が、神経膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ
   ）、膵臓、黒色腫、前立腺、卵巣、乳腺、肺、結腸、および平滑筋からなる群よ
   り選択される、請求項１の方法。
6. 【請求項６】 前記オリゴヌクレオチドが配列番号３を含む、請求項１の
   方法。
7. 【請求項７】 前記オリゴヌクレオチドがベクターにより産生される、請
   求項７の方法。
8. 【請求項８】 ヒトにおいて、腫瘍の後退を誘導する方法であって： （ａ）腫瘍細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで、ＩＧＦ−ＩＲに
   相補的なオリゴヌクレオチドと接触させ；そして （ｂ）前記の処置した腫瘍細胞を含む拡散チャンバーを、前記ヒトの直筋鞘内に
   、治療的に有効な時間、移植し、それにより前記腫瘍の後退を誘導する ことを含む、前記方法。
9. 【請求項９】 前記の治療的に有効な時間が、前記拡散チャンバーにおけ
   る前記腫瘍細胞の死を可能にし、そして前記ヒトにおける前記腫瘍の後退を可能
   にする、請求項８の方法。
10. 【請求項１０】 前記腫瘍細胞が前記ヒトから切除される、請求項８の方
    法。
11. 【請求項１１】 前記腫瘍細胞が、自家移植片、同種異系移植片、同系の
    、非同系の、および異種移植片からなる群由来の細胞より選択される、請求項８
    の方法。
12. 【請求項１２】 前記腫瘍細胞が、神経膠芽腫、膵臓、黒色腫、前立腺、
    卵巣、乳腺、肺、結腸、および平滑筋からなる群より選択される、請求項８の方
    法。
13. 【請求項１３】 前記オリゴヌクレオチドが配列番号３を含む、請求項８
    の方法。
14. 【請求項１４】 前記オリゴヌクレオチドがベクターにより産生される、
    請求項１３の方法。