JP2002522041A - 腫瘍壊死因子γ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒトＴＮＦγ−αおよびＴＮＦγ−βのポリペプチドならびにこのようなポリペプチドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）そして組換え技術によりこのようなポリペプチドを生成する手順が開示される。このようなポリペプチドを利用して、例えば、腫瘍または癌において、細胞増殖を阻害する方法、創傷治癒を促進する方法、感染に対する抵抗性を提供する方法、炎症活性を誘導する方法、ならびに特定の細胞型の増殖を刺激して、疾患（例えば、再狭窄）を処置する方法も開示される。ＴＮＦγ−αの核酸配列およびＴＮＦγ−βの核酸配列における変異、またはＴＮＦγ−αおよびＴＮＦγ−βのポリペプチドの過剰発現を検出するための診断方法もまた開示される。このようなポリペプチドに対するアンタゴニストならびに悪液質、敗血症性ショック、大脳マラリア、炎症、関節炎および移植片拒絶に対する治療剤としてのそれらの使用もまた開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は新しく同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドに
よってコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドの使用、ならびにそのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生成に
関する。より詳細には、本発明のポリペプチドは腫瘍壊死因子ファミリーの新し
いメンバーとして同定されており、そして本明細書中以後において「ＴＮＦ−γ
−α」として言及されている。本発明はまた本明細書中以後において「ＴＮＦ−
γ−β」として言及されているＴＮＦ−γ−αをコードする遺伝子のスプライス
改変体によりコードされるタンパク質に関する。本発明はまたそのようなポリペ
プチドの作用を阻害することにも関する。

【０００２】 （発明の背景） ヒト腫瘍壊死因子−ａ（ＴＮＦ−ａ）およびｂ（ＴＮＦ−ｂまたはリンホトキ
シン）はポリペプチドメディエイターの広範なクラスの関連するメンバーであり
、これらは総称してサイトカインとよばれるインターフェロン、インターロイキ
ンおよび増殖因子を包含する（Ｂｅｕｔｌｅｒ、Ｂ．およびＣｅｒａｍｉ、Ａ．
、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｍｕｎｏｌ．、７：６２５−６５５（１９８９））
。

【０００３】 腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−ａおよびＴＮＦ−ｂ）は本来はその抗腫瘍活性の結果
として発見されたが、現在は免疫調節および炎症の際に重要な役割を果たしてい
る多面発現的サイトカインとして認識されている。現在まで、既知の８つのＴＮ
Ｆ関連サイトカインファミリー（ＴＮＦ−ａ，ＴＮＦ−ｂ（リンフォトキシン（
ＬＴ）−ａ），ＬＴ−ｂ，ならびにＦａｓに対するリガンド、ＣＤ３０に対する
リガンド、ＣＤ２７に対するリガンド、ＣＤ４０に対するリガンドおよび４−１
ＢＢレセプターに対するリガンド）が存在する。ＴＮＦ−ｂ以外のこれらのタン
パク質は保存されたＣ末端配列およびしばしばメンブレンアンカーとして使用さ
れる可変性Ｎ末端を有する。ＴＮＦレセプターに結合するときＴＮＦ−ａおよび
ＴＮＦ−ｂは両方ともホモトリマーとして機能する。

【０００４】 ＴＮＦは単球、繊維芽細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）および優
性的に活性化されたマクロファージを包含する多数の細胞型によって生成される
。ＴＮＦ−ａは急速な腫瘍壊死、免疫刺激、自己免疫疾患、移植片拒絶、寄生虫
に対する抵抗性、抗ウイルス応答の生成、敗血性ショック、成長調節、血管の内
皮効果および代謝性効果において役割を有することが報告されている。ＴＮＦ−
ａはまた内皮細胞が、細胞増殖を促進するＰＡＩ−１，ＩＬ−１，ＧＭ−ＣＳＦ
およびＩＬ−６を包含するさまざまな因子を分泌するのを誘発する。さらに、Ｔ
ＮＦ−ａは、Ｅ‐Ｓｅｌｅｃｔｉｎ，ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１のような
さまざまな細胞接着分子を上方制御する。ＴＮＦ−ａおよびＦａｓリガンドはま
た、プログラムされた細胞死を誘導することが示されている。

【０００５】 ＴＮＦまたはＬＴにより媒介される様々な細胞性応答の誘導における最初の段
階は特異的細胞表面レセプターへの結合である。およそ５５ＫＤａ（ＴＮＦ−Ｒ
１）および７５−ＫＤａ（ＴＮＦ−Ｒ２）の２つの異なるＴＮＦレセプターが同
定されており、（Ｈｏｈｍａｎ、Ｈ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６
４：１４９２７〜１４９３４（１９８９））そして、両方のレセプター型に対応
するヒトおよびマウスのｃＤＮＡが単離され、そして特徴づけられている（Ｌｏ
ｅｔｓｃｈｅｒ、Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ、６１：３５１（１９９０））。両方のＴＮ
Ｆ−Ｒは細胞外領域、膜貫通領域、および細胞内領域を含有する細胞表面レセプ
ターの代表的な構造を共有している。

【０００６】 内皮、これは生理的条件下ではほとんど静止状態にある組織（Ｄｅｎｅｋａｍ
ｐ、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓ．Ｒｅｖ．９：２６７〜２８２（１９９０）
）であるが、血管の恒常性および透過性の維持に不可欠な役割を果たす。内皮細
胞は活発に、炎症、細胞接着、血液凝固、血栓症、繊維素溶解、および新脈管形
成に関与している。新脈管形成の間、内皮細胞は増殖し、支質に侵入し、新脈血
管形成刺激物質の供給源例えば、癌細胞に向かって移動し、脈管周囲細胞および
支質細胞と相互作用し、そして最終的に、腫瘍組織と循環系を連結する毛細血管
を形成する（Ｆｏｌｋｍａｎ、Ｊ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１：２７〜３１（１
９９５））。新脈管形成を調節する複雑なメカニズムはまだ十分に理解されては
いないが、このプロセスの開始または終結が陽性因子および陰性因子の間の平衡
の結果であることが明らかになりつつある。

【０００７】 しばしば腫瘍組織にて顕著に上方制御される、多数の新脈管形成因子が記載さ
れてきている。これらはＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２のようないくつかの繊維芽細胞
増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーのメンバーおよび血管内皮細胞増殖因子（ＶＧＥ
Ｆ）ファミリーのメンバーおよびこれらすべての分子に対するレセプターを包含
している（Ｇｉｍｅｎｅｚ〜Ｇａｌｌｅｇｏ、Ｇ、ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０：
１３８５〜１３８８（１９８５）；Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒｅｒ、Ｌ、ら、Ｎａｔｕ
ｒｅ３２５：２５７〜２５９（１９８７）；Ｌｅｕｎｇ、Ｄ．Ｗ．、ら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ２４６：１３０６〜１３０９（１９８９）；Ｂｕｒｒｕｓ、Ｌ．Ｗ．ａ
ｎｄ Ｏｌｗｉｎ、Ｂ．Ｂ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１８６４７〜１
８６５３（１９８９）；Ｗｅｎｎｓｔｒｏｍ、Ｓ．、ら、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃ
ｔｏｒｓ ４：１９７〜２０８（１９９１）；Ｔｅｒｍａｎ、Ｂ．Ｉ．、ら、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１８７：１５７９〜１５８
６（１９９２）；ｄｅ Ｖｒｉｅｓ、Ｃ．、ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：９８
９〜９９１（１９９２））。同様に、トロンボスポンジン、アンジオスタチン（
ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、エンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）および血
小板第４因子を包含するいくつかの新脈管形成のインヒビターもまた報告されて
きている（Ｇｏｏｄ、Ｄ．ｊ．、ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８７：６６２３〜６６２８（１９９０）；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ、Ｍ．Ｓ．
、ら、Ｃｅｌｌ ７９：３１５〜３２８（１９９４）；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ、Ｍ．
Ｓ．、ら、Ｃｅｌｌ ８８：２７７〜２８５（１９９７）；Ｍａｉｏｎｅ、Ｔ．
Ｅ．、ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：７７〜７９（１９９０））。通常の新脈管
形成は必要とされるとき敏速に活性化され、そしてもはや要求されないときには
迅速に終結される。しかしながら、病的な新脈管形成はいったん開始されるとし
ばしば延長され、そしてしばしば停止が困難になる。このことは病的な新脈管形
成プロセスにおいて、通常は機能する陰性調節メカニズムが欠損または抑制され
ていることを示し得る。内皮細胞は新脈管形成プロセスを抑制するために、また
は成熟した脈管構造の静止状態を維持するために自己分泌因子を生成し得ると考
えられる。

【０００８】 本発明のポリペプチドは構造的、アミノ酸配列ホモロジーおよび機能的類似度
に基づくＴＮＦファミリーの新規のメンバーとして同定されており、例えば、Ｔ
ＮＦ−γは前炎症性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）タンパク質である。
さらに、本発明のＴＮＦ−γポリペプチドは新脈管形成および内皮細胞増殖の陰
性制御因子である。そのような調節の妨害は新脈管形成、血流遮断、腫瘍転移、
細胞性移動、および多くの組織の癌に関係する疾患に関与し得るので、この様式
で機能するポリペプチドの必要性が存在する。そのため、このような障害の検出
、防止、改善、または矯正において役割を果たし得るこのようなヒトポリペプチ
ドの同定および特徴づけの必要性が存在する。

【０００９】 （発明の要旨） 本発明の１つの局面に従って、ＴＮＦ-γ−αである新規成熟ポリペプチドお
よびＴＮＦ-γ−βである新規成熟ポリペプチドならびに生物学的活性および診
断的または治療的に有用なフラグメント、類似体（アナログ）、およびそれの誘
導体が提供される。

【００１０】 本発明の別の局面に従って、ｍＲＮＡｓ、ＤＮＡｓ、ｃＤＮＡｓ、ゲノムＤＮ
Ａｓを包含する、ヒトＴＮＦ-γ−αまたはヒトＴＮＦ-γ−βをコードする単離
された核酸分子ならびにその類似体および生物学的に活性なフラグメントおよび
誘導体または診断的もしくは治療的に有効なフラグメントおよび誘導体が提供さ
れる。

【００１１】 本発明は、配列番号２にて示される完全アミノ酸配列または１９９４年１０月
２６日、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
（‘‘ＡＴＣＣ’’）にてＡＴＣＣ受託番号７５９２７としてプラスミドＤＮＡ
として寄託されているｃＤＮＡクローンＨＵＶＥＯ９１によりコードされる完全
アミノ酸配列を有するＴＮＦ-γ−αポリペプチドの少なくとも一部をコードす
るポリヌクレオチドを包含する単離された核酸分子を提供する。ＡＴＣＣは１０
８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ
２０１１０−２２０９，ＵＳＡに位置する。寄託されたＴＮＦ-γ−αクロー
ンの配列決定により決定されるヌクレオチド配列（これは図１Ａおよび１Ｂ（配
列番号１）にて示される）は、１７４アミノ酸残基の完全ポリペプチドをコード
するオープンリーディングフレームを含むこれは、ヌクレオチドポジション７８
３〜７８５にてＮ末端メチオニンをコードする開始コドンおよび約２０１３２Ｄ
ａの推定分子量を含有する。

【００１２】 本発明はまた、配列番号２０にて示される完全アミノ酸配列または１９９８年
７月９日に、ＡＴＣＣ受託番号２０３０５５としてプラスミドＤＮＡとして寄託
されているｃＤＮＡクローンＨＥＭＣＺ５１によりコードされる完全アミノ酸配
列を有するＴＮＦ-γ−βポリペプチドの少なくとも一部をコードするポリヌク
レオチドを包含する単離された核酸分子を提供する。寄託されたＴＮＦ-γ−β
クローンの配列決定により決定されるヌクレオチド配列（これは図２０Ａおよび
Ｂ（配列番号２０）にて示される）は、ヌクレオチドポジション１〜３にてＮ末
端メチオニンをコードする開始コドンおよび約２８０８９Ｄａの推定分子量を含
有する、２５１アミノ酸残基の完全ポリペプチドをコードするオープンリーディ
ングフレームを含む。

【００１３】 従って、１つの実施態様において、本発明は、以下からなるグループより選択
されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含有する単離された核酸分
子を提供する：（ａ）配列番号２の完全アミノ酸配列を有するＴＮＦ-γ−αポ
リペプチドをコードする、ヌクレオチド配列（すなわち、配列番号２の２７位〜
１４７位）、（ｂ）Ｎ末端メチオニンを除く配列番号２の完全アミノ酸配列（す
なわち、配列番号２の２６位〜１４７位）を有するＴＮＦ-γ−αポリペプチド
をコードする、ヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号２の１位〜１４７位として示
される配列番号２のアミノ酸配列を有する成熟ＴＮＦ-γ−αポリペプチドをコ
ードする、ヌクレオチド配列；（ｄ）ＡＴＣＣ受託番号７５９２７中に包含され
るｃＤＮＡクローンＨＵＶＥＯ９１によりコードされる完全アミノ酸配列を有す
るＴＮＦ-γ−αポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列；（ｅ）ＡＴＣ
Ｃ受託番号７５９２７中に包含されるｃＤＮＡクローンＨＵＶＥＯ９１によりコ
ードされるＮ末端メチオニンを除く完全アミノ酸配列を有するＴＮＦ-γ−αポ
リペプチドをコードする、ヌクレオチド配列；（ｆ）ＡＴＣＣ受託番号７５９２
７中に包含されるｃＤＮＡクローンＨＵＶＥＯ９１によりコードされるアミノ酸
配列を有する成熟ＴＮＦ−γ−αポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列
；および（ｇ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）
のヌクレオチド配列のいずれかに相補的な、ヌクレオチド配列。

【００１４】 別の実施態様において、本発明は、以下からなるグループより選択されるヌク
レオチド配列を有するポリヌクレオチドを含有する単離された核酸分子を提供す
る：（ａ）配列番号２０の完全アミノ酸配列を有するＴＮＦ−γ−βポリペプチ
ドをコードする、ヌクレオチド配列（すなわち、配列番号２０の１位〜２５１位
）（ｂ）Ｎ末端メチオニンを除く配列番号２０の完全アミノ酸配列（すなわち、
配列番号２０の２位〜２５１位）を有するＴＮＦ−γ−αポリペプチドをコード
する、ヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号２０の６２位〜２５１位として示され
る配列番号２０のアミノ酸配列を有する成熟ＴＮＦ−γ−αポリペプチドをコー
ドする、ヌクレオチド配列；（ｄ）ＡＴＣＣ受託番号２０３０５５中に包含され
るｃＤＮＡクローンＨＵＶＥＯ９１によりコードされる完全アミノ酸配列を有す
るＴＮＦ−γ−αポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列；（ｅ）ＡＴＣ
Ｃ受託番号２０３０５５中に包含されるｃＤＮＡクローンＨＵＶＥＯ９１により
コードされるＮ末端メチオニンを除く完全アミノ酸配列を有するＴＮＦ−γ−α
ポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列；（ｆ）ＡＴＣＣ受託番号２０３
０５５中に包含されるｃＤＮＡクローンＨＵＶＥＯ９１によりコードされるアミ
ノ酸配列を有する成熟ＴＮＦ−γ−αポリペプチドをコードする、ヌクレオチド
配列；および（ｇ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（
ｆ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的な、ヌクレオチド配列。

【００１５】 本発明のさらなる実施態様には、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（
ｅ）、（ｆ）、または（ｇ）のいずれかのヌクレオチド配列に、少なくとも９０
％同一、およびより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％また
は９９％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、あるいは上記の（
ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、または（ｇ）のポリヌクレオ
チドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする
ポリヌクレオチド、それらのフラグメント（例えば、本発明で記載されるフラグ
メントのような）またはそれに対する相補鎖を含む、単離された核酸分子が含ま
れる。ハイブリダイズするこのポリヌクレオチドは、Ａ残基のみまたはＴ残基の
みからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェントな
ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしない。本発明のさらなる核酸
実施態様は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）の
アミノ酸配列を有するＴＮＦ−γポリペプチドのエピトープ保有部分（すなわち
フラグメント）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、単離され
た核酸分子に関する。本発明のさらなる実施態様は、少なくとも１つのアミノ酸
置換を含むが、５０以下のアミノ酸置換であり、なおさらに好ましくは４０以下
のアミノ酸置換であり、なおより好ましくは３０以下のアミノ酸置換であり、そ
してなおさらにより好ましくは２０以下のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有
するＴＮＦ−γポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含
む、単離された核酸分子に関する。当然ながら、漸増する好適度の順番で、１０
、９、８、７、６、５、４、３、２または１以下のアミノ酸置換を含むアミノ酸
配列を有することは、ＴＮＦ-γポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリ
ヌクレオチドにとって非常に好ましい。保存的置換が好ましい。

【００１６】 本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、およびこ
の組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこのようなベクターおよび宿主細胞
を作製する方法、および組換え技術によるＴＮＦ-γポリペプチドまたはペプチ
ドの産生のためにこれらを用いる方法に関する。

【００１７】 本発明のさらなる局面に従って、前記タンパク質の発現と続いて起こる前記タ
ンパク質の回収を促進する条件下において、ヒトＴＮＦ-γ核酸配列を含む組換
え原核および／または真核宿主細胞の培養工程を包含する組換え技術によってそ
のようなポリペプチドを生成するためのプロセスが提供される。

【００１８】 本発明は、さらに以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含有する単離
されたＴＮＦ-γポリペプチドを提供する：（ａ）配列番号２に示される完全ア
ミノ酸配列を有する完全長ＴＮＦ-γ−αポリペプチドのアミノ酸配列（すなわ
ち、配列番号２の２７位〜１４７位）；（ｂ）Ｎ末端メチオニンを除く配列番号
２に示される完全アミノ酸配列（すなわち、配列番号２の２６位〜１４７位）を
有する全長ＴＮＦ-γ−αのアミノ酸配列；（ｃ）配列番号２の１位〜１４７位
のアミノ酸配列を有する推定成熟ＴＮＦ−γ−αポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｄ）ＡＴＣＣ受託番号７５９２７中に包含されるｃＤＮＡクローンＨＵＶＥＯ
９１によりコードされる完全アミノ酸配列；（ｅ）ＡＴＣＣ受託番号７５９２７
中に包含されるｃＤＮＡクローンＨＵＶＥＯ９１によりコードされるＮ末端メチ
オニンを除く完全アミノ酸配列；（ｆ）ＡＴＣＣ受託番号７５９２７中に包含さ
れるｃＤＮＡクローンＨＵＶＥＯ９１によりコードされる予想される成熟ＴＮＦ
−γポリペプチドの完全アミノ酸配列；および（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、
（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）のポリペプチドのフラグメント。本発明のポリペ
プチドはまた上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、または（
ｇ）にて記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一
、より好ましくは少なくとも９０％の同一、そしてさらにより好ましくは９５％
、９６％、９７％、９８％、または９９％同一を有するポリペプチドならびに上
記ポリペプチドに対して少なくとも９０％アミノ酸配列類似性、およびより好ま
しくは９５％類似性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。本発明
のさらなる実施態様は上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、
または（ｇ）にて記載されるアミノ酸配列を有するＴＮＦ−γポリペプチドのエ
ピトープ保有部分のアミノ酸配列を包含するポリペプチドに関する。本発明のＴ
ＮＦ−γポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を有するペプチドま
たはポリペプチドは少なくとも６個または７個、好ましくは少なくとも９個、そ
してより好ましくは少なくとも約３０個から約５０個アミノ酸を有するそのよう
なポリペプチドの部分を含むが、上記の本発明のポリペプチドの全アミノ酸配列
までおよびこれを含む任意の長さのエピトープ保有ポリペプチドもまた、本発明
に含まれる。

【００１９】 本発明は、さらに以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含有する単離
されたＴＮＦ−γポリペプチドを提供する：（ａ）配列番号２０に示される完全
アミノ酸配列を有する全長ＴＮＦ−γ−αポリペプチドのアミノ酸配列（すなわ
ち、配列番号２０の１位〜２５１位）；（ｂ）Ｎ末端メチオニンを除く配列番号
２０に示される完全アミノ酸配列（すなわち、配列番号２０の２位〜２５１位）
を有する全長ＴＮＦ−γ−αペプチドのアミノ酸配列；（ｃ）配列番号２０の６
２位〜２５１位にてアミノ酸配列を有する推定成熟ＴＮＦ−γ−αポリペプチド
のアミノ酸配列；（ｄ）ＡＴＣＣ受託番号２０３０５５中に包含されるｃＤＮＡ
クローンＨＥＭＣＺ５６によりコードされる完全アミノ酸配列；（ｅ）ＡＴＣＣ
受託番号２０３０５５中に包含されるｃＤＮＡクローンＨＥＭＣＺ５６によりコ
ードされるＮ末端メチオニンを除く完全アミノ酸配列；（ｆ）ＡＴＣＣ受託番号
２０３０５５中に包含されるｃＤＮＡクローンによりコードされる推定成熟ＴＮ
Ｆ−γポリペプチドの完全アミノ酸配列；および（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）
、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）のポリペプチドのフラグメント。本発明のポリ
ペプチドはまた上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、または
（ｇ）にて記載されるそれらに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一、よ
り好ましくは少なくとも９０％の同一、そしてさらにより好ましくは９５％、９
６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有するポリペプチドおよび上記そ
れらに対して少なくとも９０％アミノ酸配列類似性、およびより好ましくは９５
％類似性を有するポリペプチドを含む。本発明のさらなる実施態様は上記（ａ）
、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、または（ｇ）にて記載されるアミ
ノ酸配列を有するＴＮＦ−γポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列
を包含するポリペプチドに関する。本発明のＴＮＦ−γポリペプチドのエピトー
プ保有部分のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドは少なくとも６
個または７個、好ましくは少なくとも９個、そしてより好ましくは約３０個から
約５０個アミノ酸を有するそのようなポリペプチドの部分を含むが、上記の本発
明のポリペプチドの全アミノ酸配列までおよびこれを含む任意の長さのエピトー
プ保有ポリペプチドもまた、本発明に含まれる。

【００２０】 本発明のさらなる実施態様は、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むが、５０
以下のアミノ酸置換であり、なおさらに好ましくは４０以下のアミノ酸置換であ
り、なおより好ましくは３０以下のアミノ酸置換であり、そしてなおさらにより
好ましくは２０以下のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有するＴＮＦ-γポリ
ペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。当然ながら、漸増する好
適度の順番で、少なくとも１つであるが、１０、９、８、７、６、５、４、３、
２または１以下のアミノ酸置換を含む、ＴＮＦ-γポリペプチドのアミノ酸配列
を含むアミノ酸配列を有することが、ペプチドまたはポリペプチドにとって非常
に好ましい。特定の実施態様において、図１Ａおよび１Ｂ、図２０ＡおよびＢ、
のアミノ酸配列またはそれについてのフラグメント（例えば、細胞外ドメインお
よび／または本発明に記載される他のフラグメント）中の付加、置換、および／
または欠失の数は、１〜５、５〜１０、５〜２５、５〜５０、１０〜５０または
５０〜１５０であり、保存的アミノ酸置換が好ましい。

【００２１】 別の実施態様において、本発明は、上記のアミノ酸配列を有するＴＮＦ-γポ
リペプチドに特異的に結合する、単離された抗体を提供する。本発明はさらに、
本明細書中に記載される通りのアミノ酸配列を有するＴＮＦ-γポリペプチドに
特異的に結合する抗体を単離するための方法を提供する。このような抗体は、下
記のように診察的または治療的に有用である。

【００２２】 本発明のまたさらなる局面に従って、本発明のポリヌクレオチドおよび／また
はポリペプチドを利用してアゴニストおよびアンタゴニストについて、および治
療目的についてスクリーニングするプロセスを提供するが、これは、創傷治癒、
腫瘍増殖の阻害、寄生虫、細菌、およびウイルスに対する耐性の提供、炎症性活
性の誘導、内皮細胞および特定の造血性細胞の増殖の誘導、再狭窄の治療、なら
びに特定の自己免疫疾患の防止が挙げられるが、これらに限定されない。

【００２３】 本発明のまたさらなる局面に従って、ヒトＴＮＦ-γ配列に特異的にハイブリ
ダイズする十分な長さの核酸分子を包含する、核酸プローブも提供する。

【００２４】 本発明の別の局面に従って、ＴＮＦ-γを模倣し、そしてＴＮＦ-γレセプター
に結合してＴＮＦ-γ型応答を誘発するＴＮＦ-γアゴニストを提供する。

【００２５】 本発明のまた別の局面に従って、そのようなポリペプチドに対するアンタゴニ
ストを提供し、これを使用し、そのようなポリペプチドの作用、例えば、敗血性
症ショックの防止、炎症、大脳マラリア、ＨＩＶウイルスの活性化、移植片拒絶
、骨吸収、および悪液質を阻害し得る。

【００２６】 本発明のなお別の局面に従って、ＴＮＦ-γポリペプチドおよびそのようなポ
リペプチドをコードする核酸配列の過小発現および過剰発現に関係する疾患を検
出する診断的アッセイを提供する。

【００２７】 本発明のさらなる局面において、ＴＮＦ-γを使用し、脈管形成増加またはＲ
Ａにてしばしば観察される骨および軟骨中のパンヌス侵入を維持するために要求
される内皮細胞増殖増加を阻害することにより慢性関節リュウマチ（ＲＡ）を処
置し得る。

【００２８】 また別の局面において、ＴＮＦ-γは、ウイルスレセプターまたはコレセプタ
ーとしても機能する細胞表面タンパク質に結合し得る。従って、ＴＮＦ-γ、ま
たはそれのアゴニストまたはアンタゴニストを使用して、ＴＮＦ-γレセプター
またはＴＮＦ-γコレセプターとのウイルスの結合または相互作用のレベルにお
いて、またはウイルスの内部移行または細胞内侵入のプロセスの間、ウイルス伝
染力を調節し得る。

【００２９】 本発明のすべての局面に従って、用語「「ＴＮＦ-γ」」はＴＮＦ-γ−αおよ
び／またはＴＮＦ-γ−βをいう。

【００３０】 本発明のこれらのおよび他の局面は本明細書における教示から当業者に対して
明らかである。

【００３１】 （詳細な説明） 本発明は、クローニングされたｃＤＮＡ（ＨＵＶＥ０９１）の配列決定により
決定された、図１ＡおよびＢ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）に示されるアミノ酸配
列を有するＴＮＦ−γ−αポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単
離された核酸分子を提供する。図２Ａ〜２Ｃに示されるように、本発明のＴＮＦ
−γ−αポリヌクレオチドは、ヒトＴＮＦ−α（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、Ｔ
ＮＦ−β（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ヒトリンホトキシン−β（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：５）およびＦＡＳリガンド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）と配列相同性を
共有する。本発明のＴＮＦ−γ−αは、抗腫瘍サイトカイン様分子として、骨お
よび軟骨におけるパンヌスの浸潤と関連する脈管形成および／または内皮細胞の
増殖の阻害による関節炎の処置として、ＮＦ−ｋＢおよびｃ−Ｊｕｎキナーゼ（
ＪＮＫ）のインデューサー（細胞接着のインデューサー）として、およびインデ
ューサーアポトーシスとして、少なくとも脈管形成の阻害において機能する（実
施例、特に実施例１２〜１５を参照のこと）。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示され
るヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡクローン（ＨＵＶＥ０９１）（これは、Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１２３０１
Ｐａｒｋ Ｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ ２
０８５２に１９９４年１０月２６日に寄託され、そして受託番号７５９２７を与
えられた）の配列決定により得られた。寄託されたプラスミドは、ｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ
、ＣＡ）中に含まれる。クローンＨＵＶＥＯ９１によりコードされるタンパク質
のさらなる特徴は、同時係属米国仮出願番号６０/０７４，０４７（１９９８年
２月９日に出願）（その全開示は、参考として本明細書中に援用される）に提示
される。

【００３２】 本発明はまた、クローニングされたｃＤＮＡ（ＨＥＭＣＺ５６）の配列決定に
より決定された、図２０ＡおよびＢ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）に示されるア
ミノ酸配列を有するＴＮＦ−γ−βポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）を含む単離された核酸分子を提供する。このＴＮ
Ｆ−γ−βポリペプチドは、本明細書中に開示されるＴＮＦ−γ−αポリペプチ
ドのスプライシング改変体である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示されるヌクレ
オチド配列は、ｃＤＮＡクローン（ＨＥＭＣＺ５６）（これは、Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１ Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２
０１１０〜２２０９に１９９８年７月９日に寄託され、そして受託番号２０３０
５５を与えられた）の配列決定により得られた。寄託されたプラスミドは、ｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊ
ｏｌｌａ、ＣＡ）中に含まれる。

【００３３】 （核酸分子） 他に示されない限り、本明細書中でＤＮＡ分子の配列決定により決定された全
てのヌクレオチド配列は、自動ＤＮＡシークエンサー（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡのＭｏｄｅｌ
３７３）を使用して決定され、そして本明細書中で決定されたＤＮＡ分子によ
りコードされるポリペプチドの全てのアミノ酸配列は、上記のように決定された
ＤＮＡ配列の翻訳によって推定された。従って、この自動化アプローチにより決
定されたいずれかのＤＮＡ配列については当該分野で公知であるように、本明細
書中で決定された任意のヌクレオチド配列は、いくつかの間違いを含み得る。自
動化により決定されたヌクレオチド配列は、配列決定されたＤＮＡ分子の実際の
ヌクレオチド配列に対して、代表的には少なくとも約９０％同一、より代表的に
は少なくとも約９５％〜少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、当
該分野において周知の手動のＤＮＡ配列決定法を含む他のアプローチによって、
より正確に決定され得る。当該分野において公知のように、実際の配列と比較し
て、決定されたヌクレオチド配列中の１個の挿入または欠失は、ヌクレオチド配
列の翻訳においてフレームシフトを引き起こし、その結果、決定されたヌクレオ
チド配列によってコードされる推定アミノ酸配列は、このような挿入または欠失
の位置で始まる、配列決定されたＤＮＡ分子によって実際にコードされるアミノ
酸配列とは完全に異なる。

【００３４】 核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」により、ＤＮＡ分子
またはポリヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドの配列）ならびにＲＮＡ分
子またはポリヌクレオチド（リボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＵ）の対応す
る配列）が意図され、ここでは、特定のデオキシリボヌクレオチド配列中の各チ
ミジンデオキシリボヌクレオチド（Ｔ）が、リボヌクレオチドウリジン（Ｕ）に
よって置換されている。

【００３５】 本明細書中に提供される情報（例えば、図１ＡおよびＢ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１）におけるヌクレオチド配列、または図２０ＡおよびＢ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１９）におけるヌクレオチド配列）を使用して、ＴＮＦ−γ−αまたはＴＮ
Ｆ−γ−βポリペプチドをコードする本発明の核酸分子（すなわち、ポリヌクレ
オチド）が、例えば、開始物質としてｍＲＮＡを用いるｃＤＮＡをクローニング
するための手順のような、標準的なクローニングおよびスクリーニング手順を使
用して得られ得る。例えば、ＴＮＦ−γ−αポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドは、例えば、ヒト腎臓および臍帯静脈内皮細胞のようなＴＮＦ−γ−α
を発現する任意の細胞または組織の供給源から慣用的に得られ得る。本発明の例
示において、図１ＡおよびＢ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に記載される核酸分子
は、ヒト臍帯静脈内皮細胞に由来するｃＤＮＡライブラリー中にて発見された。
ＴＮＦ−γ−αに対応するｃＤＮＡクローン（クローンＨＵＶＥ０９１）は、１
７４アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含
み、ここでこのタンパク質は、最初のおよそ２７アミノ酸残基が推定リーダー配
列であり、その結果、この成熟タンパク質は、１４７のアミノ酸を含む。このタ
ンパク質は、ウサギＴＮＦ−ａ（Ｉｔｏ，Ｈ．ら、ＤＮＡ ５：１５７〜１６５
（１９８６）；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１２８４６；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７
）に対してＣ末端で、１１１のアミノ酸ストレッチにわたって３８％同一性およ
び５８％類似性の最高の程度の相同性を示す。ＴＮＦファミリーのメンバーの間
で保存された配列もまた、ＴＮＦ−γ中で保存される（図２Ａ〜２Ｃを参照のこ
と）。影を付した文字は、保存されたアミノ酸残基を示す。ＴＮＦ−γ ｍＲＮ
Ａは、図３ＢのＲＮＡブロット分析において示されるように、ヒト臍帯静脈内皮
細胞において特異的に発現される。

【００３６】 さらに、ＴＮＦ−γ−βポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、誘導
性および休止期の内皮細胞、臍帯静脈、扁桃、ならびにいくつかの他の細胞型お
よび組織型から慣用的に得られ得る。本発明の例示において、図２０Ａおよびｂ
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）において記載された核酸分子は、誘導された内皮
細胞に由来するｃＤＮＡライブラリー中に発見された。ＴＮＦ−γ−αに対応す
るｃＤＮＡクローン（ＨＥＭＣＺ５６）は、２５１アミノ酸残基のタンパク質を
コードするオープンリーディングフレームを含み、ここでこの残基のうち初めの
およそ３５アミノ酸残基は、推定細胞内ドメインであり、そしてアミノ酸３６〜
６１は、推定膜貫通ドメインであり、そしてアミノ酸残基６２〜２５１は、推定
細胞外ドメインである。

【００３７】 細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを構成するアミノ酸残
基は、コンピューター分析によって推定されている。従って、当業者が理解する
ように、これらのドメインを構成しているアミノ酸残基は、各ドメインを規定す
るために使用される基準に依存して、非常にわずかであり得る（例えば、約１〜
約１５程度のアミノ酸残基）。

【００３８】 本発明の局面に従うと、図１ＡおよびＢ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の推定ア
ミノ酸配列を有する成熟ポリペプチド、または１９９４年１０月２６日にＡＴＣ
Ｃ受託番号７５９２７として寄託された、ＨＵＶＥＯ９１と命名されたクローン
のｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸（
ポリヌクレオチド）が提供される。

【００３９】 さらに、本発明の別の局面に従うと、図２０ＡおよびＢ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：２０）の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチド、または１９９８年７月
９日にＡＴＣＣ受託番号２０３０５５として寄託された、ＨＥＭＣＺ５６と命名
されたクローンのｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードする単
離された核酸（ポリヌクレオチド）が提供される。

【００４０】 「単離された」核酸分子またはポリヌクレオチドによって、そのネイティブな
環境から取り出されている分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が意図される。例えば、
ベクター中に含まれる組換えＤＮＡ分子（ポリヌクレオチド）は、本発明の目的
のために単離されたとみなされる。さらに、単離されたＤＮＡ分子（ポリヌクレ
オチド）の例には、異種宿主細胞中で維持された組換えＤＮＡ分子または溶液中
で（部分的または実質的に）精製された分子が挙げられる。単離されたＲＮＡ分
子（ポリヌクレオチド）には、本発明のＤＮＡ分子（ポリヌクレオチド）のイン
ビボまたはインビトロでのＲＮＡ転写物が挙げられる。本発明に従う単離された
核酸分子またはポリヌクレオチドにはさらに、合成的に生成されたような分子が
挙げられる。

【００４１】 本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態（このＤＮＡ
は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを含む）であり得る。このＤＮ
Ａは、二本鎖でも一本鎖でもよく、そしてこの場合、一本鎖は、コーディング鎖
でも非コーディング（アンチセンス）鎖でもよい。

【００４２】 本発明の単離された核酸分子は、成熟ＴＮＦ−γ−αポリペプチドをコードす
る、図１ＡおよびＢ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に示されるポリヌクレオチド配
列、成熟ＴＮＦ−γ−βポリペプチドをコードする、図２０ＡおよびＢ（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１９）に示されるポリヌクレオチド配列、成熟ＴＮＦ−γ−αポ
リペプチドをコードする、ＡＴＣＣ受託番号７５９２７として寄託された寄託ク
ローン（ＨＵＶＥ０９１）中に含まれるポリヌクレオチド配列、成熟ＴＮＦ−γ
−βポリペプチドをコードする、ＡＴＣＣ受託番号２０３０５５として寄託され
た寄託クローン（ＨＥＭＣＺ５６）中に含まれるポリヌクレオチド配列、ならび
に上記のものとは異なる配列を含むが、遺伝コードの縮重に起因して、図１Ａお
よびＢ、図２０ＡおよびＢ、または寄託されたｃＤＮＡのＤＮＡと同じ成熟ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を包含する。当然、遺伝コードは、
当該分野において周知である。従って、このような縮重改変体を作製することは
、当業者に慣用的である。

【００４３】 完全なＴＮＦ−γ−αタンパク質のアミノ酸配列は、図１ＡおよびＢ（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２）に示されるように、リーダー配列および成熟タンパク質を含
む。より詳細には、本発明は、ＴＮＦ−γ−αタンパク質の成熟形態をコードす
る核酸分子を提供する。従って、シグナル仮説に従うと、一旦、粗面小胞体を横
切る成長中のタンパク質鎖の輸送が開始されると、哺乳動物細胞により分泌され
るタンパク質は、このタンパク質の分泌された「成熟」形態を生じるために、完
全なポリペプチドから切断される、シグナル配列または分泌リーダー配列を有す
る。ほとんどの哺乳動物細胞および昆虫細胞でさえも、同じ特異性で分泌された
タンパク質を切断する。しかし、いくつかの場合、分泌されたタンパク質の切断
は、完全には、均一ではなく、このことは、このタンパク質の２以上の成熟種を
生じる。さらに、分泌されたタンパク質の切断特異性は、最終的には、完全なタ
ンパク質の一次構造によって決定される（すなわち、これは、このポリペプチド
のアミノ酸配列に固有である）ことが長い間知られている。従って、本発明は、
ＡＴＣＣ受託番号７５２９７に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるア
ミノ酸配列を有する成熟ＴＮＦ−γ−αポリペプチドをコードするヌクレオチド
配列を提供する。「ＡＴＣＣ受託番号７５９２７のｃＤＮＡクローンによりコー
ドされるアミノ酸配列を有する成熟ＴＮＦ−γ−αポリペプチド」によって、寄
託されたクローンのヒトＤＮＡ配列によってコードされる完全なオープンリーデ
ィングフレームの、哺乳動物細胞（例えば、以下に記載されるようなＣＯＳ細胞
）中の発現によって産生されるＴＮＦ−γ−αタンパク質の成熟形態が意味され
る。

【００４４】 図２０ＡおよびＢの成熟ポリペプチドまたは寄託されたｃＤＮＡ（ＨＥＭＣＺ
５６）によりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、
以下を含み得るがこれらに限定されない：成熟ポリペプチドのコーディング鎖の
み；成熟ポリペプチドのコーディング配列およびさらなるコーディング配列（例
えば、リーダー配列もしくは分泌配列または膜貫通配列またはプロタンパク質配
列）；成熟ポリペプチドのコーディング配列（および必要に応じて、さらなるコ
ーディング配列）ならびに非コーディング配列（例えば、イントロンまたは成熟
ポリペプチドのコーディング配列の５’および／または３’の非コーディング配
列）。

【００４５】 本発明はまた、ポリペプチドを含み、ここで成熟ポリペプチドのコーディング
配列は、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を補助するポリヌクレオ
チド配列（例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列と
して機能するリーダー配列）に対して同じリーディングフレーム内に融合され得
る。リーダー配列を有するポリペプチドは、プレタンパク質であり、そして宿主
細胞により切断されてこのポリペプチドの成熟形態を形成するリーダー配列を有
し得る。このポリヌクレオチドはまた、成熟タンパク質およびさらなる５’アミ
ノ酸残基であるプロタンパク質をコードし得る。プロ配列を有する成熟タンパク
質は、プロタンパク質であり、そしてこのタンパク質の不活性形態である。一旦
、プロ配列が切断されると、活性成熟タンパク質が残る。

【００４６】 従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、またはプロ
配列を有するタンパク質、あるいはプロ配列およびプレ配列（リーダー配列）の
両方を有するタンパク質をコードし得る。

【００４７】 本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリヌクレオチドの精製を可能に
するマーカー配列にインフレーム（ｉｎ ｆｒａｍｅ）で融合されたコーディン
グ配列を有し得る。このマーカー配列は、ｐＱＥ−９ベクターにより供給される
ヘキサヒスチジンタグであり得、細菌宿主の場合にはマーカーに融合された成熟
ポリペプチドの精製を提供するか、あるいは例えば、マーカー配列は、哺乳動物
宿主（例えば、ＣＯＳ−７細胞）が使用される場合、にはヘマグルチニン（ＨＡ
）タグであり得る。ＨＡタグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由
来するエピトープに対応する（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ、３７：７６７
（１９８４））。

【００４８】 従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチ
ドのコーディング配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコーディ
ング配列および／または非コーディング配列を含むポリヌクレオチドを包含する
。

【００４９】 本発明はさらに、図１ＡおよびＢ、図２０ＡおよびＢの推定アミノ酸配列を有
するポリペプチド、ならびに寄託されたクローンのｃＤＮＡによりコードされる
ポリペプチドの、フラグメント（すなわち、部分）、アナログおよび誘導体をコ
ードする、本明細書中上記のポリヌクレオチドの改変体に関する。このポリヌク
レオチドの改変体は、このポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子改変体
またはこのポリヌクレオチドの天然には存在しない改変体であり得る。

【００５０】 従って、本発明は、図１ＡおよびＢに示されるのと同じ成熟ポリペプチド、ま
たは寄託されたクローンＨＵＶＥＯ９１のｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリヌクレオチド
の改変体（この改変体は、図１ＡおよびＢのポリペプチド、または寄託されたク
ローンＨＵＶＥＯ９１のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメン
ト、誘導体もしくはアナログをコードする）を包含する。このようなヌクレオチ
ド改変体は、欠失改変体、置換改変体および付加改変体または挿入改変体を含む
。

【００５１】 さらに、本発明は、図２０ＡおよびＢに示されるのと同じ成熟ポリペプチド、
または寄託されたクローンＨＥＭＣＺ５６のｃＤＮＡによりコードされる成熟ポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリヌクレオチ
ドの改変体（この改変体は、図２０ＡおよびＢのポリペプチド、または寄託され
たクローンＨＥＭＣＺ５６のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグ
メント、誘導体もしくはアナログをコードする）を包含する。このようなヌクレ
オチド改変体は、欠失改変体、置換改変体および付加改変体または挿入改変体を
含む。

【００５２】 本明細書中上記のように、ポリヌクレオチドは、図１Ａおよび１Ｂに示される
コーディング配列、または寄託されたクローンＨＵＶＥＯ９１のコーディング配
列の天然に存在する対立遺伝子改変体であるコーディング配列を有し得る。ある
いは、ポリヌクレオチドは、図２０ＡおよびＢに示されるコーディング配列、ま
たは寄託されたクローンＨＥＭＣＺ５６のコーディング配列の天然に存在する対
立遺伝子改変体であるコーディング配列を有し得る。当該分野において公知であ
るように、対立遺伝子改変体は、１以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加
を有し得るポリヌクレオチド配列の代替形態であり、コードされたポリペプチド
の機能を実質的に変化させない。

【００５３】 本発明はさらに、本明細書中に記載される単離された核酸分子のフラグメント
に関する。寄託されたｃＤＮＡ（ＨＵＶＥＯ９１およびＨＥＭＣＺ５６）のヌク
レオチド配列、または図１ＡおよびＢ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、図２０Ａお
よびＢ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）に示されるヌクレオチド配列、あるいはこ
れらに対する相補鎖を有する単離された核酸配列のフラグメントによって、少な
くとも１５ｎｔ、およびより好ましくは少なくとも２０ｎｔ、なおより好ましく
は少なくとも３０ｎｔ、およびさらにより好ましくは、少なくとも４０、５０、
１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、または５００ｎｔの長さの
フラグメントが意図される。これらのフラグメントは、本明細書中に議論される
診断用プローブおよびプライマーを含むがこれらに限定されない多くの使用を有
する。当然、寄託されたｃＤＮＡクローンＨＵＶＥＯ９１のヌクレオチド配列、
寄託されたｃＤＮＡクローンＨＥＭＣＺ５６、図１ＡおよびＢ（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１）に示されたヌクレオチド配列、または図２０ＡおよびＢ（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：２０）に示されるヌクレオチド配列の全てではないにしてもほとんど
に対応するフラグメントのような、５０〜１５００ｎｔのより大きな長さのフラ
グメントもまた、本発明に従って有用である。例えば、少なくとも２０ｎｔの長
さのフラグメントによって、寄託されたｃＤＮＡクローン（ＨＵＶＥＯ９１およ
びＨＥＭＣＺ５６）のヌクレオチド配列、図１ＡおよびＢ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１）に示されるヌクレオチド配列、または図２０ＡおよびＢに示されるヌクレ
オチド配列に由来する２０以上の連続する塩基を含むフラグメントが意図される
。

【００５４】 特定の実施態様において、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、機能活
性を実証するポリペプチドをコードする。「機能活性」を実証するポリペプチド
によって、完全または成熟ＴＮＦ−γポリペプチドと関連する、１以上の既知の
機能活性を示し得るポリペプチドを意図する。このような機能活性には、生物学
的活性（（例えば、脈管形成の阻害、内皮細胞増殖の阻害、ＮＦ−ｋＢおよびｃ
−Ｊｕｎキナーゼ（ＪＮＫ）の阻害、細胞接着の誘導、ならびにアポトーシスの
誘導（実施例、特に実施例１２〜１５を参照のこと））、抗原性［抗ＴＮＦ−γ
抗体に結合する（すなわち、結合のためにＴＮＦ−γポリペプチドと競合する）
能力］、免疫原性（ＴＮＦ−γポリペプチドに結合する抗体を作製する能力）、
他のＴＮＦ−γポリペプチドを有するポリマーを形成する能力、ならびにＴＮＦ
−γポリペプチドに対するレセプターまたはリガンド（例えば、ＤＲ３）に結合
する能力）を含むがこれらに限定されない。

【００５５】 本発明はまた、以下の関連ｃＤＮＡクローンから決定されている、ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：１の広範なフラグメントに関連するヌクレオチド配列を有する核酸分
子を提供する：

【００５６】

【化１】

【００５７】 本発明はまた、以下の関連ｃＤＮＡクローンから決定されている、ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：１９の広範なフラグメントに関連するヌクレオチド配列を有する核酸
分子を提供する：

【００５８】

【化２】

【００５９】 特定の実施態様において、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、好まし
くは上記のｃＤＮＡクローンから決定されたヌクレオチド配列を除く、ヌクレオ
チド残基１〜２４４２のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の、少なくとも３０ヌクレオチ
ド、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチドの任意の部分を含むポリヌクレオチ
ドを含むか、あるいはそれらからなる。本発明のＴＮＦ−γ−αポリヌクレオチ
ドの代表的な使用は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の以下のヌクレオチド、それらに
対する相補的なポリヌクレオチド鎖、または寄託されたクローンＨＵＶＥＯ９１
内に含まれるｃＤＮＡを含むか、あるいはそれらからなるフラグメントを包含す
る：

【００６０】

【数１】

【００６１】 さらなる特定の実施態様において、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは
、好ましくは上記のｃＤＮＡクローンから決定されたヌクレオチド配列（すなわ
ち、２５頁の表）を除く、ヌクレオチド残基１〜１１１６のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１９の、少なくとも３０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチ
ドの任意の部分を含むポリヌクレオチドを含むか、あるいはそれらからなる。

【００６２】 本発明の好ましい実施態様は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の以下の残基のアミノ
酸配列を含むか、あるいはそれらからなるポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドを包含する：

【００６３】

【数２】

【００６４】 これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、提供される。

【００６５】 本発明のＴＮＦ−γ−βポリヌクレオチドの代表的な例は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１９の以下のヌクレオチド、それらに対する相補的なポリヌクレオチド鎖、
または寄託されたクローンＨＥＭＣＺ５６内に含まれるｃＤＮＡを含むか、ある
いはそれらからなるフラグメントを包含する：

【００６６】

【数３】

【００６７】 本発明の好ましい核酸フラグメントはまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の、ＴＮ
Ｆ−γ−α（例えば、図１Ａおよび図１Ｂの説明文に記載される）の１以上の以
下のドメインをコードする核酸分子を包含する：

【００６８】

【化３】

【００６９】 本発明の特に好ましいポリヌクレオチドの中には、ＴＮＦ−γの構造的または
機能的属性をコードすることにより特徴づけられるポリヌクレオチドがある。こ
のようなポリヌクレオチドは、ＴＮＦ−γのαヘリックスおよびαヘリックス形
成領域（「α領域」）、βシートおよびβシート形成領域（「β領域」）、ター
ンおよびターン形成領域（「ターン領域」）、コイルまたはコイル形成領域（「
コイル領域」）、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、
表面形成領域、および高抗原性指数領域（すなわち、３つ以上の連続するアミノ
酸残基の抗原性領域を有し、これらの各々は、１．５以上の抗原性指数を有する
）を含むアミノ酸残基をコードする。特定の好ましい領域は、図１７に示される
領域であり、そしてこれらの領域としては、同定されたコンピュータープログラ
ムのデフォルトパラメーターを使用して、図１に示されるアミノ酸配列（配列番
号２）の分析により同定された、前述の型の領域が挙げられるが、これらに限定
されない。このような好ましい領域としては、以下が挙げられる：Ｇａｒｎｉｅ
ｒ−Ｒｏｂｓｏｎのα領域、β領域、ターン領域、およびコイル領域、Ｃｈｏｕ
−Ｆａｓｍａｎのα領域、β領域、およびコイル領域、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔ
ｔｌｅ領域および疎水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ αおよびβ両親媒性領域、
Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ可撓性領域、Ｅｍｉｎｉ表面形成領域、ならびに
高い抗原性指数のＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ領域。

【００７０】 ＴＮＦ−γ−α（図１７）についての上記のような様式で、ＴＮＦ−γ−βを
表すデータは、図２０Ａおよび２０Ｂならびに配列番号２０に示されるアミノ酸
配列を用いて容易に調製され得る。このようにして、上記に列挙したＴＮＦ−γ
の上記の構造的または機能的属性の各々（すなわち、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓ
ｏｎのα領域、β領域、ターン領域、およびコイル領域、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａ
ｎのα領域、β領域、およびコイル領域、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ親水性
領域および疎水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ αおよびβ両親媒性領域、Ｋａｒ
ｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ可撓性領域、Ｅｍｉｎｉ表面形成領域、ならびに高い抗
原性指数のＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ領域など）は、ＴＮＦ−γ−αおよびＴＮ
Ｆ−γ−βに対して等しく十分に適用される。

【００７１】 これらの点で特定の好ましい領域は、図１７に記載されるが、図１７に示され
るデータの表示を使用してもまた、示されるか、または同定され得る。図１７を
作成するために使用されるＤＮＡ＊ＳＴＡＲコンピューターアルゴリズム（もと
もとのデフォルトパラメーターで設定）は、このような表形式で図１７における
データを容易に提示する。図１７におけるデータの表形式を使用して、好ましい
領域の特定の境界を決定し得る。

【００７２】 図１７に示される上記の好ましい領域としては、図１Ａおよび１Ｂに示される
アミノ酸配列の分析により同定される、上記の型の領域が挙げられるが、それら
に限定されない。図１７に示されるように、このような好ましい領域としては、
Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎのα領域、β領域、ターン領域、およびコイル領
域、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎのα領域、β領域、およびコイル領域、Ｋｙｔｅ−
Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ親水性領域および疎水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ αおよ
びβ両親媒性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ可撓性領域、Ｅｍｉｎｉ表面
形成領域、ならびに高い抗原性指数のＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ領域が挙げられ
る。

【００７３】 これらの点で非常に好ましいフラグメントの中には、上記のいくつか（例えば
、１、２、３または４）の特徴のようないくつかの構造的特徴を組み合わせるＴ
ＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−βの領域を含むフラグメントがある。

【００７４】 本発明のさらなる好ましい核酸フラグメントとしては、ＴＮＦ−γポリペプチ
ドの１つ以上のエピトープ保有部分をコードする核酸分子が挙げられる。具体的
には、このような本発明の核酸フラグメントは、以下をコードする核酸分子を含
んでいる：配列番号２におけるほぼＴｈｒ−２４〜ほぼＡｓｎ−３２由来のアミ
ノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２におけるほぼＩｌｅ−３７〜ほぼＩｌ
ｅ−４５に由来するアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２におけるほぼ
Ｍｅｔ−５４〜ほぼＡｒｇ−６２に由来するアミノ酸残基を含むポリペプチド；
配列番号２におけるほぼＧｌｎ−６３〜ほぼＡｓｐ−７１に由来するアミノ酸残
基を含むポリペプチド；配列番号２におけるほぼＧｌｕ−５７〜ほぼＧｌｙ−６
５に由来するアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２におけるほぼＶａｌ
−８０〜ほぼＴｈｒ−８８に由来するアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番
号２におけるほぼＬｅｕ−１１６〜ほぼＶａｌ−１２４に由来するアミノ酸残基
を含むポリペプチド；および配列番号２におけるほぼＡｓｐ−１３３〜ほぼＰｈ
ｅ−１４１に由来するアミノ酸残基を含むポリペプチド。これらのポリペプチド
フラグメントは、上記の図１７に示されるようなＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原
性指数の分析により、ＴＮＦ−γタンパク質の抗原性エピトープを保有すること
が決定される。ＴＮＦ−γの他のこのようなエピトープ保有部分を決定するため
の方法は、以下に詳細に記載される。

【００７５】 ＴＮＦ−γ−β配列の抗原性エピトープを保有するポリペプチドフラグメント
は、図１７に示されるようにＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指数の上記の分析
を用いて当業者により容易に決定され得る。ＴＮＦ−γ−βの他のこのようなエ
ピトープ保有部分を決定するための方法は、以下に詳細に記載される。

【００７６】 本発明の別の実施態様は、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーシ
ョン条件下で、例えば、ＡＴＣＣ受託番号第７５９２７号に含まれるｃＤＮＡク
ローン、ＡＴＣＣ受託番号第２０３０５５号に含まれるｃＤＮＡクローンまたは
本明細書中に記載されるＴＮＦ−γポリヌクレオチドフラグメントのような本発
明のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列の一部にハイブリダイズするポリ
ヌクレオチドに関する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」に
より、以下を含む溶液：５０％ ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ
７．６）、５×デンハルト溶液、１０％ 硫酸デキストラン、および２０μｇ／
ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡ中で４２℃で一晩のインキュベーション、次いで、
約６５℃での０．１×ＳＳＣ中でのフィルターの洗浄が意図される。ポリヌクレ
オチドの「一部分」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、少なくと
も１５ヌクレオチド（ｎｔ）、およびより好ましくは、少なくとも２０ｎｔ、な
おより好ましくは、少なくとも３０ｎｔ、およびさらにより好ましくは３０〜７
０ｎｔ、または８０〜１５０ｎｔ、あるいは全長の参照ポリヌクレオチドにハイ
ブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図され
る。これらは、上記でそして以下でより詳細に議論されるように、診断プローブ
およびプライマーとして有用である。もちろん、ポリＡ配列（例えば、配列番号
１または配列番号１９に示されるＴＮＦ−γ ｃＤＮＡの３’末端ポリトラクト
）に対して、またはＴ（もしくはＵ）残基の相補的なストレッチに対してのみハ
イブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部分にハイブリダイズ
させるために使用される、本発明のポリヌクレオチドには含まれない。なぜなら
、このようなポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチまたはそれらの相補物
を含む任意の核酸分子（例えば、プライマーとしてオリゴｄＴを使用して生成さ
れた実質的に任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）にハイブリダイズするからである
。

【００７７】 好ましい実施態様において、本明細書中に開示された参照ポリヌクレオチドに
対してハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１
）ならびに／もしくは図２０Ａおよび２０Ｂ（配列番号１９）、または寄託物中
に含まれるｃＤＮＡに示されるポリヌクレオチド配列によりコードされる成熟ポ
リペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性のいずれかを保持するポリペ
プチドをコードする。

【００７８】 代替的な実施態様は、参照ポリヌクレオチド（すなわち、本明細書中に開示さ
れるポリヌクレオチド配列）に対してハイブリダイズするポリヌクレオチドに関
するが、生物学的活性は保持しない。これらのポリヌクレオチドは生物学的活性
を保持しないが、それらは、例えば、配列番号１のポリヌクレオチドについての
プローブとして、ポリヌクレオチドの収集のために、診断プローブとして、そし
てＰＣＲプライマーとしてのような用途を有する。

【００７９】 本発明はさらに、ＴＮＦ−γタンパク質の一部、アナログまたは誘導体をコー
ドする、本発明の核酸分子の改変体に関する。改変体は、天然に存在し得る（例
えば、天然の対立遺伝子改変体）。「対立遺伝子改変体」により、生物の染色体
上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代替の形態の１つが意味され
る（Ｇｅｎｅ ＩＩ、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ
，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。天然に存在しない改変体は、当該分野で公
知の変異誘発技術を用いて生成され得る。

【００８０】 このような改変体としては、本明細書中に記載のポリヌクレオチド配列（フラ
グメントを含む）のヌクレオチド置換、欠失、または付加により生成される改変
体が挙げられる。この置換、欠失または付加は、１つ以上のヌクレオチドを含み
得る。改変体は、コード領域、非コード領域、またはその両方において改変され
得る。コード領域における改変は、保存的アミノ酸または非保存的アミノ酸の置
換、欠失または付加を生成し得る。これらの中で特に好ましいのは、サイレント
な置換、付加および欠失である。これらは、ＴＮＦ−γタンパク質またはその一
部分の特性および活性を改変しない。また、この点において特に好ましいのは、
保存的置換である。

【００８１】 本発明のさらなる実施態様は、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配
列を有するポリヌクレオチドに対して、少なくとも７０％または少なくとも８０
％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、そしてなおより好ましくは少な
くとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なポリヌクレオチド配
列を含む、単離された核酸分子に関する：（ａ）配列番号２における完全アミノ
酸配列を有するＴＮＦ−γ−αポリペプチド（すなわち配列番号２の−２７位〜
１４７位）をコードするヌクレオチド配列；（ｂ）Ｎ末端メチオニンを除く配列
番号２における完全アミノ酸配列を有するＴＮＦ−γ−αポリペプチド（すなわ
ち配列番号２の−２６位〜１４７位）をコードするヌクレオチド配列；（ｃ）配
列番号２の１位〜１４７位として示される配列番号２におけるアミノ酸配列を有
する成熟ＴＮＦ−γ−αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）配
列番号２の１位〜１４７位として示される配列番号２におけるアミノ酸配列を有
するＴＮＦ−γ−αポリペプチドの細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配
列；（ｅ）ＡＴＣＣ受託番号第７５９２７号に含まれるｃＤＮＡクローンＨＵＶ
ＥＯ９１によりコードされる完全アミノ酸配列を有するＴＮＦ−γ−αポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）ＡＴＣＣ受託番号第７５９２７号に
含まれるｃＤＮＡクローンＨＵＶＥＯ９１によりコードされる、Ｎ末端メチオニ
ンを除く完全アミノ酸配列を有するＴＮＦ−γ−αポリペプチドをコードするヌ
クレオチド配列；（ｇ）ＡＴＣＣ受託番号第７５９２７号に含まれるｃＤＮＡク
ローンＨＵＶＥＯ９１によりコードされるアミノ酸配列を有する成熟ＴＮＦ−γ
−αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｈ）ＡＴＣＣ受託番号第７
５９２７号に含まれるｃＤＮＡクローンＨＵＶＥＯ９１によりコードされるアミ
ノ酸配列を有するＴＮＦ−γ−αポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌ
クレオチド配列；（ｉ）本明細書中に記載されるポリペプチドフラグメントをコ
ードするヌクレオチド配列；ならびに（ｊ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（
ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）におけるヌクレオチド配列
のいずれかに対して相補的なヌクレオチド配列。本発明のポリペプチドはまた、
上記のａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ
）または（ｊ）に記載されるポリペプチドに対して、少なくとも８０％同一、よ
り好ましくは少なくとも９０％同一、そしてなおより好ましくは９５％、９６％
、９７％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチド、なら
びに上記のポリペプチドに対して少なくとも９０％類似性、そしてより好ましく
は少なくとも９５％類似性のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。

【００８２】 本発明のさらなる実施態様は、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配
列を有するポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％または少なくとも８０％
同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、そしてなおより好ましくは少なく
とも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なポリヌクレオチド配列
を含む、単離された核酸分子に関する：（ａ）配列番号２０における完全アミノ
酸配列を有するＴＮＦ−γ−βポリペプチド（すなわち配列番号２０の１位〜２
５１位）をコードするヌクレオチド配列；（ｂ）Ｎ末端メチオニンを除く配列番
号２０における完全アミノ酸配列を有するＴＮＦ−γ−βポリペプチド（すなわ
ち配列番号２０の２位〜２５１位）をコードするヌクレオチド配列；（ｃ）配列
番号２０の６２位〜２５１位として示される配列番号２０におけるアミノ酸配列
を有する成熟ＴＮＦ−γ−βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｄ
）配列番号２０の１位〜３５位として示される配列番号２０におけるアミノ酸配
列を有するＴＮＦ−γ−βポリペプチドの細胞内ドメインをコードするヌクレオ
チド配列；（ｅ）配列番号２０の６２位〜２５１位として示される配列番号２０
におけるアミノ酸配列を有するＴＮＦ−γ−βポリペプチドの細胞外ドメインを
コードするヌクレオチド配列；（ｆ）ＡＴＣＣ受託番号第２０３０５５号に含ま
れるｃＤＮＡクローンＨＥＭＣＺ５６によりコードされる、完全アミノ酸配列を
有するＴＮＦ−γ−βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｇ）ＡＴ
ＣＣ受託番号第２０３０５５号に含まれるｃＤＮＡクローンＨＥＭＣＺ５６によ
りコードされるＮ末端メチオニンを除く完全アミノ酸配列を有するＴＮＦ−γ−
βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｈ）ＡＴＣＣ受託番号第２０
３０５５号に含まれるｃＤＮＡクローンＨＥＭＣＺ５６によりコードされるアミ
ノ酸配列を有する成熟ＴＮＦ−γ−βポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列；（ｉ）ＡＴＣＣ受託番号第２０３０５５号に含まれるｃＤＮＡクローンＨＥ
ＭＣＺ５６によりコードされるアミノ酸配列を有するＴＮＦ−γ−βポリペプチ
ドの細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列；（ｊ）ＡＴＣＣ受託番号第
２０３０５５号に含まれるｃＤＮＡクローンＨＥＭＣＺ５６によりコードされる
アミノ酸配列を有するＴＮＦ−γ−βポリペプチドの細胞外ドメインをコードす
るヌクレオチド配列；ならびに（ｋ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、
（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）または（ｊ）におけるヌクレオチド配
列のいずれかに対して相補的なヌクレオチド配列。本発明のポリペプチドはまた
、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、
（ｉ）、（ｊ）または（ｋ）に記載されるポリペプチドに対して、少なくとも８
０％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、そしてなおより好ましくは９
５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列を有するポリペ
プチド、ならびに上記のポリペプチドに対して少なくとも９０％類似性、そして
より好ましくは少なくとも９５％類似性のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
含む。

【００８３】 例えば、本発明の参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％「同一」な
ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにより、このポリヌクレオチドのヌ
クレオチド配列がＴＮＦ−γポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の
各１００ヌクレオチドにつき５つまでの点変異を含み得ることを除いて、このポ
リヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列に対して同一であることが意図さ
れる。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一なヌ
クレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列における「ヌ
クレオチドの５％までが欠失され得るか、または別のヌクレオチドと置換され得
るか、あるいは、参照配列の総ヌクレオチドの５％までのヌクレオチド配列の数
が参照配列へ挿入され得る。参照（問い合わせ）配列は、図１Ａおよび１Ｂ（配
列番号１）ならびに図２０ＡおよびＢ（配列番号１９）に示されるヌクレオチド
配列全体、または本明細書中に開示される任意のフラグメントであり得る。

【００８４】 実際問題として、任意の特定の核酸分子が、例えば、図１ＡおよびＢ（配列番
号１）、図２０ＡおよびＢ（配列番号１９）に示されるヌクレオチド配列に対し
て、あるいは寄託されたｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列に対して、少なく
とも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同
一であるか否かは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ
Ｕｎｉｘ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，
Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）のような公知のコンピュータープログラム
を用いて従来通り決定される得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、２つの配列の間の相同性
の最も良好なセグメントを見いだすために、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍ
ａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２
：４８２−４８９（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムを使用する。特定の
配列が、例えば、本発明に従う参照配列に対して９５％同一であるか否かを決定
するためにＢｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列整列プログラムを使用する場合
、パラメーターは、もちろん、同一性の割合が参照ヌクレオチド配列の全長に対
して計算され、そして参照ヌクレオチド配列におけるヌクレオチド総数の５％ま
での相同性におけるギャップが許容されるように設定される。

【００８５】 特定の実施態様において、参照（問い合わせ）配列（本発明の配列）と対照配
列との間の同一性（全体的な配列の整列とも言われる）はまた、Ｂｒｕｔｌａｇ
ら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のア
ルゴリズムに基づいて、ＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを用いて決定さ
れる。ＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用され、同一性パーセントを計
算する好ましいパラメーターは、Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌ
ｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌ
ｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃ
ｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ
Ｐｅｎａｌｔｙ ０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象ヌク
レオチド配列の長さ（どちらがより短くても）である。この実施態様に従って、
対象配列が、内部欠失ではなく、５’欠失または３’欠失が原因で問い合わせ配
列より短い場合、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、同一性を計算する場合に対照配列
の５’および３’短縮を説明しないという事実を考慮するために、手動での訂正
が結果に対して行われる。問い合わせ配列に対して５’または３’末端で短縮さ
れた対象配列については、問い合わせ配列の総塩基の％として、一致／整列され
ない対象配列の５’および３’である問い合わせ配列の塩基数を計算することに
より同一性％が訂正される。ヌクレオチドが一致／整列されるか否かの決定は、
ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果により決定される。次いで、この割合は、同一性％
から差し引かれ、特定のパラメーターを用いて上記のＦＡＳＴＤＢプログラムに
より計算されて、最終的な同一性％スコアに達する。この訂正されたスコアは、
この実施態様の目的に使用される。ＦＡＳＴＤＢ整列により提示される用に、対
象配列の５’および３’塩基の外側の塩基のみ（問い合わせ配列と一致／整列さ
れない）が、同一性％スコアを手動で調節する目的で計算される。例えば、９０
塩基の対象配列は、１００塩基の問い合わせ配列と整列されて、同一性％が決定
される。欠失は、対象配列の５’末端で生じ、それゆえ、ＦＡＳＴＤＢ整列は、
５’末端で最初の１０塩基の一致／整列を示さない。１０の対形成していない塩
基は、配列の１０％（一致しない５’末端および３’末端での塩基数／問い合わ
せ配列における総塩基数）を示すために、ＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算さ
れた同一性％スコアから１０％が差し引かれる。残りの９０塩基が完全に一致し
た場合、最終的な同一性％は９０％である。別の例では、９０塩基の対象配列が
１００塩基対の問い合わせ配列と比較される。このとき、欠失は内部欠失であり
、その結果、それらは、問い合わせ配列と一致／整列しない対象配列の５’また
は３’上に塩基を有さない。この場合、ＦＡＳＴＤＢにより計算される同一性パ
ーセントは、手動で訂正されない。もう一度、問い合わせ配列と一致／整列され
ない対象配列の５’および３’の塩基のみが手動で訂正される。他の手動の訂正
は、この実施態様の目的のためには全くなされない。

【００８６】 さらなる実施態様において、本発明は、配列番号２のポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも
９０％の同一性、そしてより好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポリ
ヌクレオチド、ならびにそのフラグメント（これらのフラグメントは、少なくと
も３０塩基、そして好ましくは少なくとも５０塩基を有する）に関し、そしてこ
のようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに関する。

【００８７】 さらなる実施態様において、本発明は、配列番号２０のポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくと
も９０％の同一性、およびより好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポ
リヌクレオチド、ならびにそれらのフラグメント（これらのフラグメントは、少
なくとも３０塩基、そして好ましくは少なくとも５０塩基を有する）に関し、そ
してこのようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに関する。

【００８８】 本出願は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）、図２０Ａおよび２０Ｂ（配列番
号１９）に示されるポリヌクレオチド配列に対して、または寄託されたｃＤＮＡ
クローンの核酸配列に対して、それらがＴＮＦ−γの機能的活性を有するポリペ
プチドをコードするか否かに関係なく、少なくとも７０％、８０％、９０％、９
５％、９６％、９７％、９８％または９９％の核酸分子、あるいはそのフラグメ
ントに関する。これは、特定の核酸分子がＴＮＦ−γの機能的活性を有するポリ
ペプチドをコードしない場合ですら、当業者はどのようにこの核酸分子を使用す
るか（例えば、ハイブリダイゼーションプローブとしてまたはポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）プライマーとして）をなお知っているためである。ＴＮＦ−γの
機能的活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用として
は、特に、（１）ｃＤＮＡライブラリー中のＴＮＦ−γ遺伝子またはその対立遺
伝子改変体を単離すること；（２）Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓ
ｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｐｅ
ｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）に記載されるような、ＴＮＦ
−γ遺伝子の正確な染色体位置を提供するための、分裂中期染色体（ｍｅｔａｐ
ｈａｓｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｓｐｒｅａｄ）に対するインサイチュハイ
ブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）；および（３）特定の組織におけるＴ
ＮＦ−γ ｍＲＮＡ発現を検出するためのノザンブロット分析が挙げられる。

【００８９】 しかし、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）、図２０Ａおよび２０Ｂ（配列番号
１９）に示される核酸配列に対して、または寄託されたｃＤＮＡクローンの核酸
配列に対して、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、
９８％または９９％同一な配列を有する核酸分子、あるいはそのフラグメントが
好ましい。これは、事実、ＴＮＦ−γの機能的活性を有するポリペプチドをコー
ドする。「ＴＮＦ−γの機能的活性を有するポリペプチド」によって、特定のイ
ムノアッセイおよび／または生物学的アッセイにおいて測定されるように、本発
明のＴＮＦ−γポリペプチド（全長タンパク質または好ましくは成熟タンパク質
のいずれか）の活性と類似する活性（しかし、同一である必要はない）を示すポ
リペプチドが意図される。例えば、ＴＮＦ−γ活性は、実施例７において記載さ
れるようにアポトーシスアッセイを用いて、ＴＮＦ−γが実施例９において詳細
に記載されるようにＡＢＡＥ細胞の培養物において毛細管様管構造形成のＦＧＦ
−２誘導形成を阻害する相対的能力を決定することによって、または実施例１０
に記載されるように漿尿膜（ＣＡＭ）脈管形成アッセイにおいて、実施例１２に
記載されるように、細胞ＮＦ−κＢおよびｃ−Ｊｕｎキナーゼ（ＪＮＫ）の活性
化に対するその効果によって、そして残りの実施例および当該分野において記載
されるいくつかのさらなる方法において測定され得る。

【００９０】 もちろん、遺伝コードの縮重に起因して、当業者は、寄託されたｃＤＮＡクロ
ーンの核酸配列、もしくは図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）、図２０Ａおよび２
０Ｂ（配列番号１９）に示される核酸配列、またはそれらのフラグメントに対し
て、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％また
は９９％同一な配列を有する多くの核酸分子が「ＴＮＦ−γ活性」を有するポリ
ペプチドをコードすることを直ちに認識する。事実、これらのヌクレオチド配列
の縮重改変体は全て、同じポリペプチドをコードするので、多くの場合において
、これは、上記のアッセイを行うことなく、なお当業者に明らかである。縮重改
変体ではないこのような核酸分子については、妥当な数がまたＴＮＦ−γ活性を
有するポリペプチドをコードすることは当該分野でさらに認識される。このこと
は、当業者が、タンパク質機能をあまり有意にもたらすようではないまたはもた
らさないようであるかのいずれかであるアミノ酸置換（例えば、１つの脂肪族ア
ミノ酸を第２の脂肪族アミノ酸と置換すること）を十分認識しているためである
。例えば、どのように表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製するかに関す
るガイダンスは、Ｊ．Ｕ．Ｂｏｗｉｅら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ
Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎ
ｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に提供される。ここで、著者ら
は、タンパク質がアミノ酸置換に驚くほど許容性であることを示す。

【００９１】 本発明のさらなる実施態様は、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むア
ミノ酸配列を有する（しかし、５０の保存的アミノ酸置換を超えない、なおより
好ましくは、４０の保存的アミノ酸置換を超えない、さらにより好ましくは、３
０の保存的アミノ酸置換を超えない、そしてさらになおより好ましくは、２０の
保存的アミノ酸置換、１０〜２０の保存的アミノ酸置換、５〜１０の保存的アミ
ノ酸置換、１〜５の保存的アミノ酸置換、３〜５の保存的アミノ酸置換、または
１〜３の保存的アミノ酸置換を超えない）ＴＮＦ−γポリペプチド（例えば、本
明細書中に記載のＴＮＦ−γポリペプチドフラグメント）のアミノ酸配列をコー
ドするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子に関する。もちろん、常に
漸増している優先度のために、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１
を超えない保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有することは、ＴＮＦ−γ
ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドについて非常に好ま
しい。

【００９２】 （ポリヌクレオチドアッセイ） 本発明はまた、相補的なポリヌクレオチドを検出するためのＴＮＦ−γポリヌ
クレオチド（例えば、変異したＴＮＦ−γ−αまたはＴＮＦ−γ−βの存在に関
連した疾患あるいは疾患に対する感受性を検出するための診断試薬としてのよう
な）の使用を包含する。例えば、異常な細胞増殖（例えば、腫瘍および癌）のよ
うなこのような疾患は、ＴＮＦ−γ−αまたはＴＮＦ−γ−βの過少発現に関す
る。

【００９３】 ヒトＴＮＦ−γ遺伝子における変異を保有する個体は、種々の技術により、Ｄ
ＮＡレベルで検出され得る。診断のための核酸は、患者の細胞（例えば、血液、
尿、唾液、組織生検および剖検材料）から得られ得る。ゲノムＤＮＡは、検出の
ために直接使用され得るか、または分析の前に、ＰＣＲを用いることにより酵素
的に増幅され得る（Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３２４：１６３−１６６（１
９８６））。ＲＮＡまたはｃＤＮＡはまた同じ目的のために使用され得る。例と
して、ＴＮＦ−γ−αまたはＴＮＦ−γ−βをコードする核酸に相補的なＰＣＲ
プライマーを使用して、ＴＮＦ−γの変異を同定および分析し得る。例えば、欠
失および挿入は、正常な遺伝子型と比較した際に、増幅産物のサイズの変化によ
り検出され得る。点変異は、放射性標識されたＴＮＦ−γ ＲＮＡまたは代替的
に、放射性標識されたＴＮＦ−γアンチセンスＤＮＡ配列に対して、増幅された
ＤＮＡがハイブリダイズすることにより同定され得る。完全に一致した配列は、
ＲＮａｓｅ Ａ消化または融解点の差異により一致しなかった二重鎖から区別さ
れ得る。

【００９４】 ＤＮＡ配列の差異に基づく遺伝子試験は、変性剤を含むか、または含まないゲ
ルにおけるＤＮＡフラグメントの電気泳動移動度における変化の検出により達成
され得る。小さな配列の欠失および挿入は、高い分解能のゲル電気泳動により可
視化され得る。異なる配列のＤＮＡフラグメントは、異なるＤＮＡフラグメント
の移動度が、それらの特異的な融解点または部分融解点により異なる位置で、ゲ
ルにおいて遅延される、変性ホルムアミド勾配ゲルにおいて区別され得る（例え
ば、Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０：１２４２（１９８５）を参照のこ
と）。

【００９５】 特定の位置での配列変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、ＲＮａ
ｓｅおよびＳ１保護、または化学切断方法）により明らかにされ得る（例えば、
Ｃｏｔｔｏｎら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９７−４４０１（１９８５））
。

【００９６】 従って、特定のＤＮＡ配列の検出は、例えば、ハイブリダイゼーション、ＲＮ
ａｓｅ保護、化学切断、直接ＤＮＡ配列決定または制限酵素の使用（例えば、制
限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ））、およびゲノムＤＮＡのサザンブロッティ
ングのような方法により達成され得る。

【００９７】 より簡便なゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定に加えて、変異はまた、インサ
イチュ分析により検出され得る。

【００９８】 本明細書中に参照される寄託物は、特許手続の目的のために、Ｂｕｄａｐｅｓ
ｔ Ｔｒｅａｔｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｏｇｎ
ｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉ
ｓｍｓの条件下で維持される。これらの寄託物は、単に当業者に便利なように提
供され、そして寄託物が、米国特許法第１１２条において要求されるという承認
ではない。寄託された物質に含まれるポリヌクレオチドの配列、およびそれによ
りコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用さ
れ、そして本明細書中の配列のいずれかの記載との任意の矛盾する事象において
制御される。ライセンスは、寄託された物質を作製、使用または販売するために
必要とされ得、そしてそのようなライセンスは本明細書により付与されない。

【００９９】 （ベクターおよび宿主細胞） 本発明はまた、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター、組換え
ベクターで遺伝子操作された宿主細胞、またはそうでなければ本発明のポリペプ
チドを産生するように操作された宿主細胞、および組換え技術による本発明のポ
リペプチドの産生に関する。

【０１００】 宿主細胞は、一般的に、本発明のベクター（これは、例えば、クローニングベ
クターまたは発現ベクターであり得る）で操作される（形質導入されるかまたは
形質転換されるかまたはトランスフェクトされる）。このベクターは、例えば、
プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細
胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択またはＴＮＦ−γ遺伝子の増幅
に適切なように改変された従来の栄養培地において培養され得る。温度、ｐＨな
どのような培養条件は、発現について選択された宿主細胞を用いて以前に使用さ
れた培養条件であり、そして当業者に明らかである。

【０１０１】 本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを産生するため
に使用され得る。従って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現す
るための種々の発現ベクターのいずれか１つに含まれ得る。このようなベクター
には、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列および合成ＤＮＡの配列（例えば
、ＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵
母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせ由来のベクター、
ウイルスＤＮＡ（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、家禽ポックス
ウイルスおよび仮性狂犬病））が含まれる。しかし、宿主において複製可能であ
り、そして生存可能である限り、任意の他のベクターも使用され得る。

【０１０２】 適切なＤＮＡ配列は、種々の手順によりベクター中に挿入され得る。一般的に
、ＤＮＡ配列は、当該分野において公知の手順により、適切な制限エンドヌクレ
アーゼ部位に挿入される。このような手順および他のものは、当業者の範囲内で
あると見なされる。

【０１０３】 発現ベクターにおけるＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡの合成を指向する適切な発現制
御配列（プロモーター）と作動可能に連結される。このようなプロモーターの代
表的な例として、以下が挙げられ得る：ＬＴＲのプロモーターまたはＳＶ４０プ
ロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃまたはｔｒｐ、ファージλ Ｐプロモーター
、および原核生物細胞もしくは真核生物細胞またはそれらのウイルスにおいて遺
伝子の発現を制御することが公知の他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻
訳の開始のためのリボゾーム結合部位、および転写ターミネーターを含む。ベク
ターはまた、発現を増幅するために適切な配列を含み得る。

【０１０４】 さらに、発現ベクターは、好ましくは１つ以上の選択マーカー遺伝子（例えば
、真核生物細胞培養のためのジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性、あ
るいは例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性
）を含み、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型の特徴を提供する。

【０１０５】 上記のような適切なＤＮＡ配列を含むベクターおよび適切なプロモーターまた
は制御配列は、宿主がタンパク質を発現することを可能にするために適切な宿主
を形質転換するために使用され得る。

【０１０６】 適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられ得る：Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのよう
な細菌細胞；酵母細胞のような真菌細胞；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳ
ｆ９のような昆虫細胞；ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、またはＢｏｗｅｓ黒色腫細胞
のような動物細胞、アデノウイルス、植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明
細書中の教示から当業者の範囲内であると見なされる。

【０１０７】 より詳細には、本発明はまた、上に広範に記載されるように一つ以上の配列を
含む組換え構築物を含む。この構築物は、正方向または逆方向で、本発明の配列
が挿入されたベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）を含む。
この実施態様の好ましい局面において、この構築物は、例えば、この配列と作動
可能に連結されたプロモーターを含む調節配列をさらに含む。多数の適切なベク
ターおよびプロモーターが当業者に公知であり、そして市販されている。以下の
ベクターが、例示のために提供される。細菌：ｐＨＥ４−５（ＡＴＣＣ受託番号
２０９３１１；およびその変形）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉ
ａｇｅｎ）、ｐＢＳ、ｐＤ１０、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、Ｂ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１
８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３
−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
真核生物：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）。しかし、任意の他のプラスミドまたはベクターは、それらが
宿主において複製可能かつ生存可能である限り使用され得る。

【０１０８】 プロモーター領域は、選択マーカーを有するＣＡＴ（クロラムフェニコールト
ランスフェラーゼ）ベクターまたは他のベクターを用いて任意の所望の遺伝子か
ら選択され得る。２つの適切なベクターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７で
ある。特定の名づけられた細菌プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ
７、ｇｐｔ、λ Ｐ、Ｐおよびｔｒｐが含まれる。真核生物プロモーターは、以
下を含む：ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、
ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、レトロウイルス由来の
ＬＴＲ、およびマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター。適切なベクターおよ
びプロモーターの選択は、十分に当該分野の通常のレベル内である。

【０１０９】 さらなる実施態様において、本発明は、上記の構築物を含む宿主細胞に関する
。この宿主細胞は、高等真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核
生物細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、あるいは宿主細胞は、原核生物細
胞（例えば、細菌細胞）であり得る。宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カル
シウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクショ
ン、またはエレクトロポレーションにより達成され得る（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．、Ｄ
ｉｂｎｅｒ，Ｍ．、Ｂａｔｔｅｙ，Ｉ．、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。

【０１１０】 本明細書中に議論されるベクター構築物を含む宿主細胞を包含することに加え
て、本発明はまた、脊椎動物起源（特に哺乳動物起源）の初代の宿主細胞、二次
的な宿主細胞および不死化された宿主細胞を含む。これらの細胞は、内因性遺伝
物質（例えば、ＴＮＦ−γコード配列）を欠失または置換するように、および／
または本発明のＴＮＦ−γポリヌクレオチドと作動可能に連結された遺伝物質（
例えば、異種ポリヌクレオチド配列）を含むように操作されており、そして内因
性ＴＮＦ−γポリヌクレオチドを活性化、変化、および増幅する。例えば、当該
分野で公知の技術を使用して、異種制御領域配列（例えば、プロモーターおよび
／またはエンハンサー）および相同組換えを介した内因性ＴＮＦ−γポリヌクレ
オチド配列を作動可能に連結し得る（例えば、１９９７年６月２４日発行の米国
特許第５，６４１，６７０号；１９９６年９月２６日公開の国際公開ＷＯ９６／
２９４１１；１９９４年８月４日公開の国際公開ＷＯ９４／１２６５０；Ｋｏｌ
ｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−
８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４
３５−４３８（１９８９）、これらの開示の各々は、その全体が参考として参照
される）。

【０１１１】 宿主細胞中のこの構築物を従来の様式で使用して、組換え配列によりコードさ
れる遺伝子産物を産生する。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプチ
ド合成機により合成的に産生され得る。

【０１１２】 成熟タンパク質が、適切なプロモーターの制御下で哺乳動物細胞、酵母、細菌
、または他の細胞において発現され得る。細胞を含まない翻訳系もまた利用して
、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを使用してそのようなタンパク質を産
生し得る。原核生物宿主および真核生物宿主で用いる適切なクローニングベクタ
ーおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、（１９８９）（この開示は、本明細書中に参
考として援用される）に記載されている。

【０１１３】 高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベク
ターへのエンハンサー配列の挿入により増加される。エンハンサーは、その転写
を増加するためにプロモーター上で作用する、通常、約１０〜３００ｂｐのＤＮ
Ａのｃｉｓ作用性のエレメントである。例としては、１００〜２７０ｂｐの複製
起点の後側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエ
ンハンサー、複製起点の後側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルス
エンハンサーが挙げられる。

【０１１４】 一般的に、組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能にする複製起点
および選択マーカー（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子およびＳ
．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＲＰ１遺伝子）ならびに下流の構造配列の転写を指
向する高発現遺伝子に由来するプロモーターを含む。このようなプロモーターは
、例えば、とりわけ３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ａ−因子、酸
性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質のような糖分解酵素をコードす
るオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳の開始配列および終結配列、お
よび好ましくは細胞周辺腔または細胞外の培地中への翻訳されたタンパク質の分
泌を指向し得るリーダー配列と適切な段階で構築される。必要に応じて、異種配
列は、所望の特性（例えば、安定化、または発現された組換え産物の精製の単純
化）を与えるＮ末端識別ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。

【０１１５】 細菌を使用するための有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターを用いて
読むことが可能な段階（ｏｐｅｒａｂｌｅ ｒｅａｄｉｎｇ ｐｈａｓｅ）にお
いて適切な翻訳の開始および終結のシグナルとともに所望のタンパク質をコード
する構造ＤＮＡ配列を挿入することにより構築される。ベクターは、一つ以上の
表現型選択マーカー、およびベクターの保持を保証し、そして必要であれば、宿
主中での増幅を提供する複製起点を含む。形質転換に適切な真核生物宿主は、Ｅ
．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔ
ｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の種々の種が含まれるが、選
択のために他の宿主もまた利用され得る。

【０１１６】 限定することなく、代表的な例として、細菌を使用するための有用な発現ベク
ターは、周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺
伝的エレメントを含む市販のプラスミド由来の選択マーカーおよび細菌の複製起
点を含み得る。このような市販のベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄ
ｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ
、ＵＳＡ）を含む。これらのｐＢＲ３２２の「骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）」部分
は、適切なプロモーターおよび発現される構造配列と組み合わされる。

【０１１７】 適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度までの宿主株の増殖に続いて、
選択されたプロモーターは、適切な手段（例えば、温度シフト、または化学誘導
）により誘導され、そして細胞は、さらなる期間培養される。代表的に、細胞は
、遠心分離により回収し、物理的手段または科学的手段により破壊し、そして得
られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。

【０１１８】 タンパク質の発現に使用される微生物細胞は、任意の簡便な方法（凍結−解凍
のサイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む）により
破壊され得、このような方法は当業者に周知である。

【０１１９】 種々の哺乳動物細胞培養系もまた使用され、組換えタンパク質を発現し得る。
哺乳動物発現系の例は、サルの腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株（Ｇｌｕｚｍａｎ
（Ｃｅｌｌ ２３：１７５（１９８１））により記載される）、および適合可能
なベクターを発現し得る他の細胞株（例えば、Ｃ１２７細胞株、３Ｔ３細胞株、
ＣＨＯ細胞株、ＨｅＬａ細胞株、およびＢＨＫ細胞株）を含む。哺乳動物発現ベ
クターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサーを含み、そして任
意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよび
アクセプター部位、転写終結配列、および５’隣接非転写配列もまた含む。ＳＶ
４０スプライス部位およびポリアデニル化部位に由来するＤＮＡ配列を使用して
、要求される非転写エレメントを提供し得る。

【０１２０】 ＴＮＦ−γポリペプチドは、組換え細胞培養物から硫酸アンモニウムまたはエ
タノール沈殿、酸抽出、アニオンもしくはカチオン交換クロマトグラフィー、ホ
スホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフ
ィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよ
びレクチンクロマトグラフィーを含む方法により、回収および精製され得る。タ
ンパク質を再び折り畳む工程は、必要であれば、成熟タンパク質の完全なコンフ
ィギュレーションに使用され得る。最終的に、高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）が、最後の精製段階において使用され得る。

【０１２１】 本発明のポリペプチドは、天然の精製産物、または化学合成手順の産物であり
得るか、あるいは原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、培養物中の細菌細
胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞）から組換え技術
により産生され得る。組換え産物手順において使用される宿主に依存して、本発
明のポリペプチドは、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化であり得
る。本発明のポリペプチドはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基を含み得る。

【０１２２】 本発明は、ＴＮＦ−γ−αポリペプチドおよびＴＮＦ−γ−βポリペプチドを
含み、これらは、例えば、以下により翻訳の間または翻訳後に差示的に修飾され
る：グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック
基による誘導体化、タンパク質分解性切断、抗体分子または他の細胞リガンドへ
の連結など。任意の多くの化学修飾は、以下を含むがそれらに限定されない公知
の技術により実行され得る：臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイ
ン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ₄による特異的な化学切断；アセチル化、ホル
ミル化、酸化、還元；ツニカマイシン（ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ）の存在下での
代謝合成など。

【０１２３】 さらに、本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の技術を用いて化学的に合
成され得る。例えば、本発明のＴＮＦ−γ−αポリペプチドおよびＴＮＦ−γ−
βポリペプチドのフラグメントに対応するペプチドは、ペプチド合成装置の使用
により合成され得る。さらに、所望であれば、非古典的アミノ酸または化学アミ
ノ酸アナログが、ｌａｔｓ配列への置換または付加として導入され得る。非古典
的アミノ酸は、以下を含むがそれらに限定されない：通常のアミノ酸のＤ−アイ
ソマー、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ
、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、
２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノ
ルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、シ
ステイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シ
クロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フルオロ−アミノ酸、ｂ−メチルアミノ
酸のようなデザイナー（ｄｅｓｉｇｎｅｒ）アミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸、
Ｎａ−メチルアミノ酸およびアミノ酸アナログ一般。さらに、このアミノ酸は、
Ｄ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得る。

【０１２４】 少なくとも１５のＴＮＦ−γ−α発現構築物が、本明細書中の発明者により生
成され、いくつかの大きさのそしていくつかの系においてＴＮＦ−γポリペプチ
ドの産生を促進する。これらのうち、４つが、全長ＴＮＦ−γポリペプチドをコ
ードする構築物であった。全長構築物は：（ｉ）ｐＱＥＴＮＦｇ−２７／１４７
、（ｉｉ）ｐＱＥ７０ＴＮＦｇ、（ｉｉｉ）ｐＣ１ＴＮＦｇ、およびｐｃＤＮＡ
３ＴＮＦｇである。挙げられた第一の発現構築物（ｐＱＥ９ＴＮＦｇ−２７／１
４７）の場合において、この構築物は、実施例１の方法に従うＮ末端６ヒスチジ
ンアミノ酸タグを有する全長ＴＮＦ−γ−αポリペプチドを産生するために使用
された。ヒスチジンタグを欠失する全長ＴＮＦ−γ−αポリペプチドを、基本的
に実施例１において行なったように、ｐＱＥ７０ＴＮＦｇ構築物を用いることに
より細菌において産生した。さらに、ヒスチジンタグを欠失する全長ＴＮＦ−γ
−αポリペプチドを、実施例３の方法に従って、ｐＣ１ＴＮＦｇ構築物またはｐ
ｃＤＮＡ３ＴＮＦｇ構築物のいずれかを用いることにより哺乳動物細胞において
産生した。さらに、成熟ＴＮＦ−γ−αポリペプチドは、ｐｃＤＮＡ３／ＩＬ６
ＴＮＦｇ−１／１４９と命名された構築物由来のインターロイキン（ＩＬ）−６
シグナルポリペプチドの指示下で哺乳動物細胞から産生および分泌された（実施
例１１を参照のこと）。

【０１２５】 残存するＴＮＦ−γ−α発現構築物は、細菌系、バキュロウイルス系、および
哺乳動物系から種々のＴＮＦ−γムテインを発現するために使用された。４つの
Ｎ末端欠失変異が、ｐＱＥ６０細菌発現ベクターを用いて生成された。これらの
Ｎ末端欠失変異構築物は：（ｉ）ｐＱＥ６０ＴＮＦｇ−３／１４７（可能な成熟
ＴＮＦ−γポリペプチドを表す；この構築物により発現されるポリペプチドは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０のＴＮＦ−γ−βのアミノ酸残基１０７〜２５１と同
一である）；（ｉｉ）ｐＱＥ６０ＴＮＦｇ１２／１４７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
２のアミノ酸残基１２〜１４７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０の残基１１６〜
２５１を表す）、（ｉｉｉ）ｐＱＥ６０ＴＮＦｇ２２／１４７（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：２０のアミノ酸残基２２〜１４７および残基１２６〜２５１を表す）、お
よび（ｉｖ）ｐＱＥ６０ＴＮＦｇ２８／１４７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０のア
ミノ酸残基２８〜１４７および残基１３２〜２５１を表す）である。これらの発
現構築物の各々を使用して、細菌系において全長ＴＮＦ−γ−αポリペプチドに
関しては、それぞれ２５アミノ酸、３９アミノ酸、４９アミノ酸および５５アミ
ノ酸のＮ末端欠失を、または全長ＴＮＦ−γ−βポリペプチドに関しては、それ
ぞれ１０６アミノ酸、１１５アミノ酸、１２５アミノ酸および１３１アミノ酸の
Ｎ末端欠失を示すＴＮＦ−γポリペプチドを産生し得る。

【０１２６】 さらなるＮ末端欠失変異細菌発現構築物を生成した。ｐＨＥ４ ＶＥＧＩ Ｔ
３０−Ｌ１７４と命名された構築物を、図１Ａおよび１Ｂに示されるＴＮＦ−γ
−α配列のアミノ酸スレオニン３０からロイシン１７４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
２の残基スレオニン３からロイシン１４７）（これは、図２０Ａおよび２０Ｂに
おいて示されるＴＮＦ−γ−β配列のアミノ酸残基スレオニン１０７からロイシ
ン２５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０の残基スレオニン１０７からロイシン２５
１）に正確に対応する）を発現する細菌発現ベクターｐＨＥ４を用いて生成した
。さらなる生成された細菌発現構築物は、ｐＱＥ９．ＶＥＧＩ．ｈｉｓ．Ｔ２８
−Ｌ１７４、ｐＨＥ４．ＶＥＧＩ．Ｔ２８−Ｌ１７４、ｐＨＥ４．ＶＥＧＩ．Ｔ
５１−Ｌ１７４およびｐＨＥ４．ＶＥＧＩ．Ｔ５８−Ｌ１７４を含む。これらの
構築物は、ｐＱＥ９細菌発現ベクター、またはｐＨＥ４細菌発現ベクターのいず
れかに基づく。この構築物の命名は、発現ベクター、遺伝子名、およびこの構築
物により発現されるアミノ酸残基を示す（例えば、ｐＱＥ９．ＶＥＧＩ．Ｔ２８
−Ｌ１７４は、ｐＱＥ９細菌発現ベクターが使用され、ＴＮＦ−γ−αポリペプ
チドのアミノ酸スレオニン（Ｔ）−２８からロイシン（Ｌ）−１７４を発現する
ことを示す（ＶＥＧＩはＴＮＦ−γ−αについての研究名である））。

【０１２７】 哺乳動物系から分泌成熟ＴＮＦ−γポリペプチドを産生するために使用され得
るＴＮＦ−γ発現構築物が生成された。この構築物はｐＣ１／ＩＬ６ＴＮＦｇ−
３／１４７と命名された。これは、成熟ＴＮＦ−γ配列に融合されたヒトＩＬ−
６遺伝子に由来するシグナルペプチドをコードする。同様の構築物が生成され、
これはｐＣ４哺乳動物発現ベクターの状況下において、ＴＮＦ−γ−αのアミノ
酸１２−１４９のアミノ末端（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２；すなわち、ＴＮＦ−γ
−β（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）のアミノ酸１１６−２５１）に融合されたＣ
Ｋ−ｂ８シグナルペプチド（公開されたＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９
０５８；１９９５年６月２３日出願において開示されるＣＫ−ｂ８配列のアミノ
酸−２１から−１）を含む。この構築物は、ｐＣ４／ＣＫ−ｂ８ ＴＮＦ−ｇ１
２／１４７と命名された。ＴＮＦ−γカルボキシ末端でヒトＩｇＧ Ｆｃ領域に
融合されたＴＮＦ−γのアミノ酸１２−１４７を発現するために使用され得るこ
の構築物の変異体を生成した。この融合タンパク質はまた、ＣＫ−ｂ８シグナル
ペプチドの指示下で分泌され、そしてｐＣ４／ＣＫ−ｂ８ＴＮＦｇ１２／１４７
／Ｆｃと命名された。融合分子のヒトＦｃ部分の配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
８に示される。当業者に公知の他の配列が使用され得る。

【０１２８】 ＴＮＦ−γ−αのアミノ酸−３から１４７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２；ＴＮＦ
−γ−β（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）のアミノ酸残基１０２〜２５１に対応す
る）は、ｐＡ２ＧＰＴＮＦｇ−３／１４７と命名された構築物を用いることによ
りバキュロウイルス系から発現および分泌され得る。この発現構築物は、そのア
ミノ末端でバキュロウイルスＧＰシグナルペプチドに融合された成熟ＴＮＦ−γ
コード配列をコードする。

【０１２９】 ２つのレトロウイルスＴＮＦ−γ発現構築物もまた生成された。これらの内の
第１のものは、ｐＧ１ＳａｍＥＮ／ＴＮＦｇ−３／１４９と命名された。この発
現構築物を使用して、哺乳動物系から全長ＴＮＦ−γタンパク質を産生し得る。
ＣＫ−ｂ８シグナルペプチドの指示下で、哺乳動物系から成熟ＴＮＦ−γタンパ
ク質を産生および分泌するために使用され得る関連構築物（ｐＧ１ＳａｍＥＮ／
ＣＫ−ｂ８ＴＮＦｇ１２／１４９）を生成した。

【０１３０】 本発明のさらなるポリペプチドは、上記のポリペプチドに対して、少なくとも
９０％の類似性、より好ましくは少なくとも９５％の類似性、およびなおより好
ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％の類似性を有するポリ
ペプチドを含む。本発明のポリペプチドはまた、寄託されたｃＤＮＡによりコー
ドされるポリペプチドに対して、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のポリペプチド
に対して少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％もしくは９５
％同一、なおより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％
同一であるポリペプチドを含み、そしてまた少なくとも３０アミノ酸、およびよ
り好ましくは少なくとも５０アミノ酸を有するそのようなポリペプチドの部分を
含む。

【０１３１】 （ポリペプチドおよびフラグメント） 本発明は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有するか、
または寄託されたｃＤＮＡ ＨＵＶＥＯ９１によりコードされるアミノ酸配列を
有する単離されたＴＮＦ−γ−αポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチ
ドのフラグメント、アナログおよび誘導体にさらに関する。

【０１３２】 本発明はまた、図２０Ａおよび２０Ｂ（配列番号２０）の推定アミノ酸配列を
有するか、または寄託されたｃＤＮＡ ＨＥＭＣＺ５６によりコードされるアミ
ノ酸配列を有するＴＮＦ−γ−βポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチ
ドのフラグメント、アナログおよび誘導体に関する。

【０１３３】 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離された形態
で提供され、そして好ましくは、ほぼ完全（例えば、＞９０％純粋）〜完全（例
えば、＞９９％純粋）な均一性の範囲内の点に精製されている。用語「単離され
た」とは、物質がその元来の環境（例えば、それが天然に存在する場合の天然の
環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生存動物中に存在する天
然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然
の系に同時に存在する物質のいくつかまたは全てから分離された、その同じポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。組換え宿主細胞から部分
的または実質的に精製されているポリペプチドもまた、「単離されたポリペプチ
ド」を意味する。例えば、ＴＮＦ−γポリペプチドの組換え産生されたバージョ
ンは、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ（Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０（１９８
８））によって記載される一段階方法によって実質的に精製され得る。このよう
なポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、そして／またはこのようなポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であり得、そしてさらに、この
ようなベクターまたは組成物はその天然の環境の一部ではないという点で単離さ
れている。本発明に従う単離されたポリペプチドおよびポリヌクレオチドはまた
、天然または合成的に生成されたこのような分子を含む。本発明のポリペプチド
およびポリヌクレオチドはまた、タンパク質精製の分野で周知の方法において、
本発明の抗ＴＮＦ−γ抗体を使用して、天然または組換え供給源から精製され得
る。

【０１３４】 図１Ａおよび１Ｂまたは図２０Ａおよび２０Ｂのポリペプチド、ならびに寄託
されたｃＤＮＡによってコードされるこれらのポリペプチドに対して言及する場
合、用語「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」とは、ＴＮＦ−γの
機能的活性を保持する、すなわち、図１ＡおよびＢ（配列番号２）、図２０Ａお
よびＢ（配列番号２０）に開示される、および／または寄託されたクローン（Ｈ
ＵＶＥＯ９１およびＨＥＭＣＺ５６）の１つもしくは両方にコードされる、全長
および／または成熟ＴＮＦ−γポリペプチドに関連する１以上の機能的活性を提
示する、ポリペプチドを意味する。１つの例として、所望の免疫原性または抗原
性を有する、このようなフラグメント、誘導体またはアナログは、例えば、イム
ノアッセイにおいて、免疫のため、ＴＮＦ−γ活性の阻害のためなどに使用され
得る。従って、本発明の特定の実施態様は、図１ＡおよびＢ（配列番号２）、図
２０ＡおよびＢ（配列番号２０）に開示される、および／または寄託されたクロ
ーン（ＨＵＶＥＯ９１およびＨＥＭＣＺ５６）の１つもしくは両方にコードされ
るＴＮＦ−γポリペプチド配列に特異的に結合する抗体によって結合され得る、
ＴＮＦ−γフラグメントに関する。

【０１３５】 別の例として、ＴＮＦ−γの生物学的活性を有するＴＮＦ−γのフラグメント
、誘導体またはアナログ（例えば、成熟ＴＮＦ−γ−αポリペプチドまたはＴＮ
Ｆ−γ−βポリペプチドの細胞外ドメイン）が、提供される。目的の所望のＴＮ
Ｆ−γ特性（例えば、細胞増殖阻害、腫瘍阻害、血管形成阻害、血管形成の阻害
および／または骨および軟骨中のパンヌスの侵襲に関連する内皮細胞増殖による
抗関節炎、ＮＦ−κＢおよびｃ−Ｊｕｎキナーゼ（ＪＮＫ）の誘導物質、細胞接
着の誘導物質、ならびにアポトーシスの誘導物質として（実施例（特に実施例１
２〜１５）を参照のこと））を保持する、あるいは欠失する、ＴＮＦ−γのフラ
グメント、誘導体およびアナログは、このような特性およびその生理学的相関の
、それぞれ、誘導物質またはインヒビターとして使用され得る。

【０１３６】 本発明のポリペプチドは、膜貫通領域ならびに細胞内領域および細胞外領域を
有する膜結合レセプターとして存在し得るか、またはこれらは、膜貫通ドメイン
を欠失する可溶化形態で存在し得る。このような形態のＴＮＦ−γの１例は、膜
貫通ドメイン、細胞内ドメインおよび細胞外ドメインを含む、図２０ＡおよびＢ
に示されるＴＮＦ−γ−βポリペプチド配列（配列番号２０）である。

【０１３７】 ＴＮＦ−γポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列は、タンパク質の構造また
は機能への有意な影響なく変化され得ることが当該分野において認識される。配
列においてこのような差異が意図される場合、活性を決定するタンパク質上に重
要な領域が存在することが思い出されるべきである。従って、本発明は、実質的
なＴＮＦ−γポリペプチド活性を示すか、または本明細書中に開示されるポリペ
プチドフラグメントのようなＴＮＦ−γタンパク質の領域を含むＴＮＦ−γポリ
ペプチドの改変体をさらに含む。このような変異体は、活性にほとんど影響しな
いような当該分野で公知の一般的規則に従って選択される欠失、挿入、反転、反
復および型置換を含む。例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製す
る方法に関するガイダンスが提供され、ここで、著者らは、アミノ酸配列の変化
の耐性を研究するために２つの主なアプローチが存在することを示す（Ｂｏｗｉ
ｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６〜１３１０（１９９０））。第一の方
法は、進化のプロセスに依存する。進化のプロセスでは、変異は、天然の選択に
より受容されるかまたは拒絶されるかのいずれかである。第二のアプローチは、
クローニングした遺伝子の特定の位置にアミノ酸変化を導入するための遺伝子工
学、および機能性を維持する配列を同定するための選択またはスクリーニングを
用いる。著者らが言及するように、これらの研究は、タンパク質がアミノ酸置換
に驚くほど耐性であることを示した。著者らはさらに、どのアミノ酸変化がタン
パク質の特定の位置で許容されるようであるかを示す。例えば、ほとんどの埋没
アミノ酸残基は、非極性の側鎖を必要とするが、一方、表面側鎖のわずかな特徴
が一般に保存される。他のこのような表現型的にサイレントな置換は、Ｂｏｗｉ
ｅおよび共同研究者（前出）、およびそれに引用される参考文献に記載される。
代表的に、保存的置換とみられるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ
およびＩｌｅの中の１つのアミノ酸と別のアミノ酸との置換；ヒドロキシル残基
ＳｅｒおよびＴｈｒの相互交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残
基ＡｓｎとＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに
芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの中での置換である。

【０１３８】 従って、配列番号２または配列番号２０のポリペプチドのフラグメント、誘導
体もしくはアナログ、または寄託されたｃＤＮＡによりコードされるフラグメン
ト、誘導体もしくはアナログは、（ｉ）アミノ酸残基の１つ以上が保存アミノ酸
残基もしくは非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換された
ものであっても良いし、そしてこのような置換されたアミノ酸残基は、遺伝子コ
ードによりコードされたものであっても、もしくはそうでなくてもよく、または
（ｉｉ）アミノ酸残基の１つ以上が置換基を含むものであってもよく、または（
ｉｉｉ）ＴＮＦ−γポリペプチドの成熟形態が、ポリペプチドの半減期を延長す
る化合物のような別の化合物（例えば、ポリエチレングリコール）と融合された
ものでもよく、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸がポリペプチドの上記の形態（
例えば、ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチドまたはリーダー配列もしくは分泌配列、
または上記の形態のポリペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製に使用され
る配列）と融合されたものでもよい。このようなフラグメント、誘導体およびア
ナログは、本明細書における教示から当業者の範囲内であるとみなされる。

【０１３９】 従って、本発明のＴＮＦ−γは、天然の変異体かまたは人為操作のいずれかに
より、１つ以上のアミノ酸置換、欠失または付加を含んでも良い。示されるよう
に、変化は好ましくはわずかな性質の変化、例えば、タンパク質の折り畳みまた
は活性に有意に影響しない保存的アミノ酸置換である（表１を参照のこと）。

【０１４０】

【表１】

【０１４１】 本発明の実施態様は、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むが、本明細
書中に記載のＴＮＦ−γポリヌクレオチド配列と比較して、５０以下の保存的ア
ミノ酸置換であり、なおさらに好ましくは４０以下の保存的アミノ酸置換であり
、なおより好ましくは３０以下の保存的アミノ酸置換であり、そしてなおさらに
より好ましくは２０以下の保存的アミノ酸置換であるアミノ酸配列を有する、本
明細書中に記載のＴＮＦ−γポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドに
関する。当然ながら、漸増する好適度の順番で、少なくとも１つであるが、１０
、９、８、７、６、５、４、３、２または１以下の保存的アミノ酸置換を含む、
ＴＮＦ−γポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有することが、ペ
プチドまたはポリペプチドにとって非常に好ましい。

【０１４２】 さらに特定の実施態様において、図１ＡおよびＢ（配列番号２）、図２０Ａお
よびＢ（配列番号２０）のアミノ酸配列、寄託されたクローンによってコードさ
れるポリペプチド配列および／または本明細書中に記載の任意のポリペプチドフ
ラグメント（例えば、細胞外ドメインまたは細胞内ドメイン）における置換、付
加または欠失の数は、７５、７０、６０、５０、４０、３５、３０、２５、２０
、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、あるいは１５０〜５０、
１００〜５０、５０〜２０、３０〜２０、２０〜１５、２０〜１０、１５〜１０
、１０〜１、５〜１０、１〜５、１〜３または１〜２である。

【０１４３】 ＴＮＦ−γポリペプチドの特徴を改善または改変するため、タンパク質工学が
使用され得る。当業者に公知の組換えＤＮＡ技術が、単一かもしくは複数のアミ
ノ酸置換、欠失、付加または融合タンパク質を含む新規の変異タンパク質、すな
わちムテインを生成するために使用され得る。このような改変されたポリペプチ
ドは、例えば、増強した活性または増加した安定性を示し得る。さらに、それら
は、より高い収率で精製され得、そして少なくとも特定の精製条件および貯蔵状
態下で、対応する天然のポリペプチドより良好な溶解性を示し得る。

【０１４４】 従って、本発明はまた、選択された宿主細胞において、発現、スケールアップ
などにより良好に適したＴＮＦ−γポリペプチドを生成するために、欠失、付加
または置換された１以上のアミノ酸残基を有する、ＴＮＦ−γの誘導体およびア
ナログを包含する。例えば、システイン残基は、ジスルフィド架橋を除去するた
めに欠失され得るか、または別のアミノ酸残基で置換され得る；Ｎ結合型グリコ
シル化部位は、例えば、Ｎ結合部位を高グリコシル化する（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃ
ｏｓｙｌａｔｅ）ことが公知である酵母宿主から、より容易に回収および精製さ
れる均質な産物の発現を達成するために、改変または除去され得る。この目的の
ために、本発明のＴＮＦ−γポリペプチドの任意の１以上のグリコシル化認識配
列上の第１または第３のアミノ酸位置の１つあるいは両方での種々のアミノ酸置
換、および／または任意の１以上のこのような認識配列の第２位でのアミノ酸欠
失は、その改変トリペプチド配列でのＴＮＦ−γポリペプチドのグリコシル化を
妨げる（例えば、Ｍｉｙａｊｉｍｏら、ＥＭＢＯ Ｊ ５（６）：１１９３−１
１９７を参照のこと）。

【０１４５】 本発明のＴＮＦ−γタンパク質中の、機能に必須である、アミノ酸は、当該分
野で公知の方法（例えば、部位特異的変異誘発、またはアラニンスキャンニング
変異誘発）により同定され得る（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１〜１０８５（１９８９））。後者の手順は、分子
中のあらゆる残基に単一アラニン変異を誘導する。次いで、得られる変異分子は
、レセプター結合活性またはインビトロ増殖活性のような生物学的活性について
試験される。

【０１４６】 高度に所望される改善した特徴（例えば、少ない凝集）を有するタンパク質を
生成し得る、他の荷電したアミノ酸または中性のアミノ酸での荷電したアミノ酸
の置換が、特定の関心事である。凝集は、薬学的処方物を調製する場合、活性を
減じるのみでなく、問題でもあり得る。なぜなら、凝集物は免疫原性であり得る
からである（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３
３１〜３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６：８３
８〜８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ
ｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０：３０７〜３７
７（１９９３））。

【０１４７】 ＴＮＦ−γは、ＴＮＦ関連タンパク質ファミリーのメンバーであることから、
ＴＮＦ−γの生物学的活性を完全に除去するよりむしろ調節するために、好まし
くは、付加、置換または欠失が、保存されたＴＮＦ様ドメイン中のアミノ酸をコ
ードする配列、すなわち、配列番号２の１７〜１４７位または配列番号２０の１
２１〜２５１位において、より好ましくは、ＴＮＦ関連タンパク質ファミリー（
図２Ａ〜２Ｃを参照のこと）の全てのメンバーにおいて保存されていないこれら
の領域内の残基において作製される。上記ＴＮＦ−γ改変体をコードする核酸配
列を含む単離されたポリヌクレオチドもまた、本発明の部分を形成する。

【０１４８】 ＴＮＦ−γポリペプチドのいくつかのアミノ酸は、ＴＮＦ関連タンパク質ファ
ミリーの公知のメンバーにわたって高度に保存される。チロシン−１５（配列番
号２中の数として）、ロイシン−３５、グリシン−４１、チロシン−４３、チロ
シン−４６、グルタミン−４８、ロイシン−９０、ロイシン−１１６、グリシン
−１１９、アスパラギン酸−１２０、フェニルアラニン−１４１、フェニルアラ
ニン−１４２およびロイシン−１４７のような残基においてＴＮＦ−γにおける
特異的変異を作製することによって、生物学的活性に対する顕著な効果が観察さ
れるようである。これらの同一のアミノ酸残基は、もちろん、配列番号２０に示
されるＴＮＦ−γ−βの対応する位置において存在する。

【０１４９】 本発明はまた、上記のＴＮＦ−γポリペプチドのフラグメントを包含する。本
発明のポリペプチドフラグメントは、配列番号２に含まれるアミノ酸配列を含む
ポリペプチド、寄託されたクローン（ＨＵＶＥＯ９１）中に含まれるｃＤＮＡに
よってコードされるポリペプチド、あるいは寄託されたクローン中に含まれるヌ
クレオチド配列（図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）および／または図２０Ａおよ
び２０Ｂ（配列番号１９）に示される）またはその相補鎖にハイブリダイズする
（例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）核酸によって
コードされるポリペプチドを含む。

【０１５０】 ポリペプチドフラグメントは、「自立構造（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」
であり得るか、またはフラグメントが部分または領域を形成するより大きなポリ
ぺプチド内に、最も好ましくは単一の連続した領域として、含まれ得る。本発明
のポリぺプチドフラグメントの代表的な例には、例えば、配列番号２および／ま
たは配列番号２０のアミノ酸残基約１〜２０、２１〜４０、４１〜６０、６１〜
８３、８４〜１００、１０１〜１２０、１２１〜１４０、１４１〜１６０、１６
０〜１６７、１６１〜１７４、１６１〜１８０、１８１〜２００、２０１〜２２
０、２２１〜２４０、２４１〜２５１を含むか、あるいは構成されるフラグメン
トが含まれる。さらに、ポリぺプチドフラグメントは、少なくとも約２０、３０
、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１
４０、または１５０アミノ酸の長さであり得る。この状況において、「約」は、
具体的に列挙される範囲、いずれかの末端または両方の末端で、いくつかの（す
なわち、５、４、３、２、または１個）アミノ酸だけより大きなまたはより小さ
な範囲を含む。

【０１５１】 他の実施態様において、本発明のフラグメントまたはポリペプチド（すなわち
、本明細書中に記載されるフラグメントまたはポリペプチド）は、２５０、２２
５、２００、１８５、１７５、１７０、１６５、１６０、１５５、１５０、１４
５、１４０、１３５、１３０、１２５、１２０、１１５、１１０、１０５、１０
０、９０、８０、７５、６０、５０、４０、３０または２５アミノ酸残基長より
長くない。

【０１５２】 さらに好ましい実施態様は、ＴＮＦ−γ−αの成熟ドメイン（配列番号２のア
ミノ酸残基１〜１４７）、ＴＮＦ−γ−βの細胞内ドメイン（配列番号２０のア
ミノ酸残基１〜３５）、ＴＮＦ−γ−βの膜貫通ドメイン（配列番号２０のアミ
ノ酸残基３６〜６１）、および／またはＴＮＦ−γ−βの細胞外ドメイン（配列
番号２０のアミノ酸残基６２〜２５１）を含む、あるいはこれらから構成される
ポリペプチドフラグメントを包含する。

【０１５３】 特定の実施態様において、本発明のポリペプチドフラグメントは、配列番号２
のアミノ酸残基ロイシン−３５〜バリン−４９、トリプトファン−１０４〜ロイ
シン−１１６、グリシン−１１９〜セリン−１２７、リジン−１３９〜ロイシン
−１４７を含むか、あるいはこれらから構成される。これらのドメインは、図２
Ａ、２Ｂおよび２Ｃに示されるＴＮＦファミリーメンバーポリペプチドの比較に
よって同定される、高度に同一性の領域である。

【０１５４】 とりわけ、本発明の特に好ましいフラグメントは、ＴＮＦ−γの構造的なまた
は機能的属性により特徴付けられるフラグメントである。このようなフラグメン
トは、ＴＮＦ−γのαヘリックス領域およびαヘリックス形成領域（「α領域」
）、βシート領域およびβシート形成領域（「β領域」）、ターン領域およびタ
ーン形成領域（「ターン領域」）、コイル領域およびコイル形成領域（「コイル
領域」）、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、表面形
成領域および高抗原性指標領域（すなわち、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆプログラ
ムのデフォルトパラメーターを使用して同定される場合、１．５以上の抗原性指
数を有するアミノ酸残基からなるポリペプチドの領域）を含むアミノ酸残基を含
む。特定の好ましい領域は、図１７に開示される領域であり、そして図１Ａおよ
びＢに示されるアミノ酸配列の分析によって同定される上記の型の領域を含むが
、これらに限定されない。このような好ましい領域は、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂ
ｓｏｎの推定α領域、β領域、ターン領域およびコイル領域；Ｃｈｏｕ−Ｆａｓ
ｍａｎの推定α領域、β領域、ターン領域およびコイル領域；Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏ
ｌｉｔｔｌｅの推定親水性領域、および疎水性領域；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇのα両
親媒性領域およびβ両親媒性領域；Ｅｍｉｎｉ表面形成領域；ならびにＪａｍｅ
ｓｏｎ−Ｗｏｌｆ高抗原性指標領域（これらのコンピュータープログラムのデフ
ォルトパラメーターを使用して予測されるような）を含む。これらのポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。

【０１５５】 さらに、本発明のアナログは、活性な成熟ポリペプチドを生成するためのプロ
タンパク質部分の切断によって活性化され得る、プロタンパク質を含む。

【０１５６】 別の実施態様において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部
分を含む、あるいはそれらで構成されるＴＮＦ−γポリペプチド（例えば、フラ
グメント）を提供する。このポリペプチド部分のエピトープは、本発明のポリペ
プチドの免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープである。「免疫原性エピト
ープ」は、タンパク質全体が免疫原である場合、抗体応答を誘発するタンパク質
の一部と定義される。他方、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域は、「抗原
性エピトープ」と定義される。タンパク質の免疫原性エピトープの数は、一般に
、抗原性エピトープの数よりも少ない（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２（１９８３）を
参照のこと）。

【０１５７】 抗原性エピトープを有するペプチドまたはポリペプチド（すなわち、抗体が結
合し得るタンパク質分子の領域を含むもの）の選択に関して、比較的短い合成ペ
プチド（タンパク質配列の部分を模倣する）が、その部分的に模倣されたタンパ
ク質と反応する抗血清を慣用的に惹起し得ることは当該分野において周知である
（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ、Ｊ．Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１９：６６０
−６６６（１９８３）を参照のこと）。タンパク質反応性の血清を誘発し得るペ
プチドは、しばしば、タンパク質の一次配列において示され、単純な化学的規則
のセットによって特徴付けられ得、そしてインタクトなタンパク質の免疫優性領
域（すなわち、免疫原性エピトープ）にも、アミノ末端もしくはカルボキシル末
端にも拘束されない。従って、本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポ
リペプチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体（モノクローナル
抗体を含む）を惹起するために有用である（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７７８（１９８４）を参照のこと）。

【０１５８】 本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、好ましくは、
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれる、少なくとも７つの、より好
ましくは少なくとも９つの、そして最も好ましくは約１５〜約３０の間のアミノ
酸の配列を含む。ＴＮＦ−γ特異的抗体を生成するために使用され得る抗原性の
ポリペプチドまたはペプチドの非限定的な例としては、以下が挙げられる：配列
番号２のおよそＴｈｒ−２４からおよそＡｓｎ−３２のアミノ酸残基を含むポリ
ペプチド；配列番号２のおよそＩｌｅ−３７からおよそＩｌｅ−４５のアミノ酸
残基を含むポリペプチド；配列番号２のおよそＭｅｔ−５４からおよそＡｒｇ−
６２のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２のおよそＧｌｎ−６３から
およそＡｓｐ−７１のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２のおよそＧ
ｌｕ−５７からおよそＧｌｙ−６５のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番
号２のおよびＶａｌ−８０からおよそＴｈｒ−８８のアミノ酸残基を含むポリペ
プチド；配列番号２のおよそＬｅｕ−１１６からおよそＶａｌ−１２４のアミノ
酸残基を含むポリペプチド；および配列番号２のおよそＡｓｐ−１３３からおよ
そＰｈｅ−１４１のアミノ酸残基を含むポリペプチド。これらのポリペプチドフ
ラグメントは、上記の図１７において示されるように、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌ
ｆ抗原性指数の分析によって、ＴＮＦ−γタンパク質の抗原性エピトープを有す
ると決定されている。

【０１５９】 当業者は、上記に記載されるようにデフォルトパラメーターを使用して、そし
て高い抗原性指標を有する領域を選択する、ＴＮＦ−γ−βポリペプチド配列（
配列番号２０）のＤＮＡ^*ＳＴＡＲ分析を通して作成されたデータを使用するこ
とにより、ＴＮＦ−γ−βに対する抗原性領域を容易に決定し得る。

【０１６０】 別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分を
含む、ペプチドおよびポリペプチドを提供する。これらのエピトープは、本発明
のポリペプチドの免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープである。「免疫原
性エピトープ」は、本発明のポリペプチド全体またはそのフラグメントが免疫原
である場合に、インビボで抗体応答を誘発するタンパク質の一部として定義され
る。他方、抗体が結合し得るポリペプチドの領域は、「抗原決定基」または「抗
原性エピトープ」として定義される。一般的に、タンパク質のインビボでの免疫
原性エピトープの数は、抗原性エピトープの数よりも少ない。例えば、Ｇｅｙｓ
ｅｎら、（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：
３９９８−４００２を参照のこと。しかし、抗体は、任意の抗原性エピトープに
対して、それが免疫原性エピトープであるか否かに関わらず、ファージディスプ
レイのような方法を使用することにより作製され得る。例えば、Ｐｅｔｅｒｓｅ
ｎ Ｇら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４９：４２５−４３１を
参照のこと。従って、免疫原性エピトープおよび抗原性エピトープの両方が、本
発明に含まれる。

【０１６１】 免疫原性エピトープを含む例示されたアミノ酸配列のリストは、上記に記載さ
れる。免疫原性エピトープのリストが、ＪａｍｅｓｏｎおよびＷｏｌｆ（１９８
８）Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１８１−１８６（この参考文献は
、その全体が参考として本明細書中に援用される）のアルゴリズムを使用して、
最も高度な抗原性を有すると予測されるエピトープを含むアミノ酸残基のみを列
挙することに留意する。このＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性分析は、デフォル
トパラメーター（Ｖｅｒｓｉｏｎ３．１１ ｆｏｒ Ｐｏｗｅｒ ＭａｃＩｎｔ
ｏｓｈ，ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、１２２８ Ｓｏｕｔｈ Ｐａｒｋ Ｓｔｒ
ｅｅｔ Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用する、コンピュータープログラムＰＲＯ
ＴＥＡＮを使用して実行された。免疫原性エピトープの上記のリストに列挙され
ないポリペプチドの部分は、非免疫原性とはみなされない。上記に列挙された免
疫原性エピトープは、例示されたリストであり、排他的リストではない。なぜな
ら、他の免疫原性エピトープは、使用された特定のアルゴリズムによって、この
ように単に認識されないだけであるからである。他の免疫原性エピトープを含む
アミノ酸残基は、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析に類似のアルゴリズムを使用し
て、または当該分野で公知の方法を使用して抗原性応答についてインビボで試験
することによって、慣用的に決定され得る。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、前出；米
国特許第４，７０８，７８１号；同第５，１９４，３９２号；同第４，４３３，
０９２号；および同第５，４８０，９７１号（これらの参考文献は、それらの全
体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。

【０１６２】 上記に列挙されたアミノ酸配列が、免疫原性エピトープを含むことを特に留意
する。免疫原性エピトープのリストは、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析によって
決定される免疫原性エピトープの重要な残基のみを列挙する。従って、Ｎ末端、
Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端の両方のいずれかの上のさらなる隣接残基は
、上記に列挙された配列に付加され、本発明のエピトープ保有ポリペプチドを生
成し得る。従って、上記に列挙された免疫原性エピトープは、さらなるＮ末端ア
ミノ酸残基またはＣ末端アミノ酸残基を含み得る。さらなる隣接アミノ酸残基は
、本発明のポリペプチド由来の連続する隣接Ｎ末端配列および／またはＣ末端配
列、異種ポリペプチド配列であり得るか、または本発明のポリペプチド由来の連
続する隣接配列および異種ポリペプチド配列の両方を含み得る。

【０１６３】 免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含む本発明のポリペプチドは、
少なくとも７アミノ酸残基長である。「少なくとも」とは、免疫原性エピトープ
または抗原性エピトープを含む本発明のポリペプチドが、７アミノ酸残基長であ
り得るか、または７アミノ酸と本発明の全長ポリペプチドのアミノ酸残基数との
間の任意の整数であり得ることを意味する。免疫原性エピトープまたは抗原性エ
ピトープを含む好ましいポリペプチドは、少なくとも、１０、１５、２０、２５
、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５
、９０、９５または１００アミノ酸残基長である。しかし、７と全長ポリペプチ
ドのアミノ酸残基数との間の各整数および全ての整数が、本発明に含まれること
に留意する。

【０１６４】 免疫エピトープ保有フラグメントおよび抗原性エピトープ保有フラグメントは
、上記に記載のように、連続するアミノ酸残基数に特定され得るか、または配列
番号２のアミノ酸配列上のこれらのフラグメントのＮ末端位置およびＣ末端位置
によってさらに特定されるかのいずれかであり得る。例えば、少なくとも７また
は少なくとも１５の連続するアミノ酸残基長のフラグメントが、配列番号２のア
ミノ酸配列を占有し得るＮ末端位置およびＣ末端位置の全ての組み合わせが、本
発明に含まれる。さらに、「少なくとも７つの連続するアミノ酸残基長」とは、
７アミノ酸残基長、または７アミノ酸と本発明の全長ポリペプチドのアミノ酸残
基数との間の任意の整数を意味する。詳細には、７と全長ポリペプチドのアミノ
酸残基数との間の各整数および全ての整数が、本発明に含まれる。さらに、免疫
エピトープおよび抗原性エピトープ保有フラグメントは、本明細書中に記載の技
術を使用することによってＴＮＦ−γ−βについてと同様に特定され得る。

【０１６５】 本発明の免疫原性エピトープ保有ポリペプチドおよび抗原性エピトープ保有ポ
リペプチドは、例えば、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体を作製す
るため、およびイムノアッセイにおいて本発明のポリペプチドを検出するために
有用である。抗体は、例えば、本発明のポリペプチドのアフィニティー精製にお
いて有用である。抗体はまた、当該分野で公知の方法を使用する本発明のポリペ
プチドに特異的な、種々の定性的または定量的イムノアッセイにおいて慣用的に
使用され得る。例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；第２版、１９８８）を参照のこと。

【０１６６】 本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、当該分野で公知の合成方法および組
換え方法を含むポリペプチドを作製するための、任意の従来の手段によって生成
され得る。例えば、エピトープ保有ペプチドは、公知の化学合成方法を使用して
合成され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎは、多数のペプチド（例えば、ＨＡ１
ポリペプチドのセグメントの単一のアミノ酸改変体を提示する、１０〜２０ｍｇ
の、２４８の別々の、そして１３残基の異なるペプチド）の合成のための単純な
方法を記載し、これらの全てのペプチドは、４週間未満で調製および特徴付けら
れる（ＥＬＩＳＡ型結合研究によって）（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５
））。この「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＭＰＳ）」プロセスは、さらに、Ｈｏｕｇｈｔｅｎおよ
び共同研究者（１９８６）の米国特許第４，６３１，２１１号に記載されている
。この手順において、種々のペプチドの固相合成のための個々の樹脂は、別々の
溶媒透過性パケットに含まれ、固相法に関連する多くの同一の反復工程の最適な
使用を可能にする。完全な手動手順は、５００〜１０００以上の合成が同時に実
行されるのを可能にする（Ｈｏｕｇｈｔｅｎら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：５１３１−５１３５の５１３４）。

【０１６７】 本発明のエピトープ保有ポリペプチドを使用して、インビボ免疫、インビトロ
免疫、およびファージディスプレイ法を含むが、これらに限定されない当該分野
で周知の方法に従って、抗体を誘導する。例えば、Ｓｕｔｔｃｌｉｆｆｅら、前
出；Ｗｉｌｓｏｎら、前出、およびＢｉｔｔｌｅ Ｆ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖ
ｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと。インビボ免疫
化を使用する場合、動物を遊離のペプチドで免疫し得るが；しかし、抗ペプチド
抗体力価は、高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ｋ
ｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍａｃｙａｎｉｎ）（ＫＬＨ）または破傷風
トキソイド）にこのペプチドを結合させることによってブーストされ得る。例え
ば、システイン残基を含むペプチドは、−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを使用してキャリアに結
合され得、一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒドのようなより一般的な連
結剤を使用してキャリアに結合され得る。動物（例えば、ウサギ、ラットおよび
マウス）は、遊離ペプチドまたはキャリア結合ペプチドのいずれかで、例えば、
約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質、およびＦｒｅｕｎｄ’ｓア
ジュバントを含むエマルジョンの腹腔内注射および／または皮内注射によって免
疫される。例えば、約２週間間隔での、数回の追加免疫注射が、例えば、固体表
面に吸着された遊離ペプチドを使用するＥＬＩＳＡアッセイによって検出され得
る、有用な力価の抗ペプチド抗体を提供するために必要とされ得る。免疫化され
た動物由来の血清中の抗ペプチド抗体の力価は、例えば、当該分野で周知の方法
に従う固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出による、抗
ペプチド抗体の選択によって増加され得る。

【０１６８】 当業者は、免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含む本発明のポリペ
プチドは、異種ポリペプチド配列に融合され得ることを理解し、そして上記され
る。例えば、本発明のポリペプチドは、イムノグロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、Ｉ
ｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメインまたはその部分（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ドメ
イン全体およびその部分の両方を含むこれらの任意の組み合わせ）と融合され得
、キメラポリペプチドを生じる。これらの融合タンパク質は、精製を容易にし、
そしてインビボでの増加された半減期を示す。これは、例えば、ヒトＣＤ４ポリ
ペプチドの第１の２つのドメインおよび哺乳動物イムノグロブリンの重鎖または
軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について示されてい
る。例えば、ＥＰＡ０，３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら（１９８８）
Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６を参照のこと。ＩｇＧ部分に起因するジスル
フィド連結二量体構造を有する融合タンパク質はまた、単量体ポリペプチドまた
はそのフラグメント単独より、他の分子を結合および中和するにおいてより効率
的であり得る。例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４を参照のこと。上記エピトープをコードす
る核酸はまた、発現されたポリペプチドの検出および精製を補助するために、エ
ピトープタグとして目的の遺伝子と組換えられ得る。

【０１６９】 本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、任意の従来の手段に
よって産生され得る（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、Ｒ．Ａ．（１９８５）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５；および
Ｈｏｕｇｈｔｅｎら（１９８６）への米国特許第４，６３１，２１１号を参照の
こと）。

【０１７０】 本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、当該分野で周知の方
法に従って抗体を誘導することを含むがこれらに限定されない使用を有する（例
えば、Ｓｕｔｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら、前出；Ｃｈｏｗ、Ｍ．
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：９１０−９１４；
およびＢｉｔｔｌｅ Ｆ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−
２３５４（１９８５）を参照のこと）。本発明の免疫原性エピトープ保有ペプチ
ド（すなわち、そのタンパク質全体が免疫原である場合、抗体応答を誘発するタ
ンパク質のその部分）は、当該分野で公知の方法に従って同定される（例えば、
Ｇｅｙｓｅｎら（前出）を参照のこと）。さらになお、Ｇｅｙｓｅｎに発行され
た米国特許第５，１９４，３９２号は、モノマー（アミノ酸または他の化合物）
の配列（これは、目的の抗体の特定のパラトープ（抗原結合部位）に相補的なエ
ピトープの位相学的等価物（すなわち、「ミモトープ」）である）を検出または
決定する一般的な方法を記載する。より一般的には、Ｇｅｙｓｅｎに発行された
米国特許第４，４３３，０９２号は、目的の特定のレセプター（例えば、ＤＲ３
）のリガンド結合部位に相補的なリガンドの位相学的等価物であるモノマーの配
列を検出または決定する方法を記載する。同様に、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、Ｒ．Ａ．
および同僚に発行された米国特許第５，４８０，９７１号（過アルキル化された
オリゴペプチドの混合物について）は、直鎖状のＣ１−Ｃ７−アルキル過アルキ
ル化されたオリゴペプチドならびにそのようなペプチドのセットおよびライブラ
リー、ならびに目的のアクセプター分子に優先的に結合する過アルキル化された
オリゴペプチドの配列を決定するためにそのようなオリゴペプチドセットおよび
ライブラリーを用いるための方法を開示する。従って、本発明のエピトープ保有
ペプチドの非ペプチドアナログもまた、これらの方法によって慣用的に作製され
得る。

【０１７１】 当業者が理解するように、上記の、本発明のＴＮＦ−γ−αポリペプチドおよ
び／またはＴＮＦ−γ−βポリペプチドならびにそれらのエピトープ保有フラグ
メントが、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常ドメインの部分と合わせられ得、キ
メラポリペプチドを生じる。これらの融合タンパク質は、精製を容易にし、そし
てインビボでの半減期の延長を示す。これは、例えば、ヒトＣＤ４ポリペプチド
の最初の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖もしくは軽鎖の定
常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について示されている（ＥＰ
Ａ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４
−８６（１９８８））。ＩｇＧ部分に起因してジスルフィド結合の二量体構造を
有する融合タンパク質はまた、モノマー性ＴＮＦ−γタンパク質またはタンパク
質フラグメント単独より他の分子を結合および中和するにおいてより効率的であ
り得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８
−３９６４（１９９５））。例として、このようなＴＮＦ−γ−Ｆｃ融合物が、
上記のように本明細書中で産生された。

【０１７２】 本発明のＴＮＦ−γポリペプチドのフラグメント（すなわち、部分）は、全長
ポリペプチドを産生するための中間体を含むがそれに限定されない用途を有し得
る。

【０１７３】 膜結合タンパク質の細胞外ドメインまたは分泌タンパク質の成熟形態を含む多
数のタンパク質について、生物学的機能の実質的な損失なしに、１つ以上のアミ
ノ酸が、Ｎ末端またはＣ末端から欠失され得ることは当該分野で公知である。例
えば、Ｒｏｎおよび同僚（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：２９８４〜２９
８８（１９９３））は、改変したＫＧＦタンパク質が、３、８、または２７のア
ミノ末端のアミノ酸残基を損失した場合でさえ、ヘパリン結合活性を有すること
を報告した。さらに、何人かの研究者は、２、４、または７のＮ末端アミノ酸が
除去されたＴＮＦ−ａムテインが、天然に存在するＴＮＦ−ａポリペプチドと比
較した場合に、機能的活性において２〜３倍の増加を示すことを報告する（Ｃｒ
ｅａｓｅｙ，Ａ．Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：１４５−１４９（１９
８７）；Ｓｉｄｈｕ，Ｒ．Ｓ．およびＢｏｌｌｏｎ，Ａ．Ｐ．Ａｎｔｉｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓ．９：１５６９−１５７６（１９８９）；Ｋａｍｉｊｏ，Ｒ．ら、
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６０：８２０−８２７
（１９８９））。さらに、タンパク質のＮ末端またはＣ末端からの１つ以上のア
ミノ酸の欠失が、そのタンパク質の１つ以上の生物学的機能の改変または損失を
生じる場合でさえ、他のＴＮＦ−γの機能的活性はなお保持され得る。

【０１７４】 本発明の場合、本発明のタンパク質は、ＴＮＦポリペプチドファミリーのメン
バーであるので、配列番号２の３５位のロイシン残基（これは、配列番号２０の
１３４位のロイシン残基に正確に対応する）までのＮ末端アミノ酸の欠失は、多
くの型の造血細胞および内皮細胞の増殖および分化の調節のようないくつかの生
物学的活性を保持し得る。配列番号２のロイシン−３６残基（配列番号２０のロ
イシン−１３５に対応する）を含むさらなるＮ末端欠失を有するポリペプチドは
、このような生物学的活性を保持するとは予期されない。なぜなら、この残基は
、ＴＮＦ関連ポリペプチドにおいて、生物学的活性に必要である保存性ドメイン
の始めにあることが公知であるからである。

【０１７５】 しかし、全長ＴＮＦ−γポリペプチドのＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠
失が、そのポリペプチドの１つ以上の生物学的機能の改変または損失を生じる場
合でさえ、他の生物学的活性はなお保持され得る。従って、短縮したタンパク質
が全長または成熟形態のポリペプチドを認識する抗体を誘導し、そして／または
結合する能力は、全長または成熟型のポリペプチドの大部分より少ない残基がＮ
末端から除去される場合は、一般に保持される。完全なポリペプチドのＮ末端残
基を欠失する特定のポリペプチドがこのような免疫学的活性を保持するか否かは
、本明細書に記載される慣用的方法、およびそうでなければ当該分野で公知の慣
用的方法により、容易に決定され得る。

【０１７６】 従って、本発明は、配列番号２に示されるＴＮＦ−γ−αのアミノ酸配列のア
ミノ末端から１つ以上の残基が欠失された（３５位のロイシン残基まで）ポリペ
プチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに
提供する。詳細には、本発明は、配列番号２の残基ｎ¹〜１４９のアミノ酸配列
を含むポリペプチドを提供する。ここでｎ¹は−２７〜３５の範囲の整数であり
、そして３５は、多くの型の造血細胞および内皮細胞の増殖および分化の調節に
必要と考えられる完全なＴＮＦ−γポリペプチド（配列番号２に示される）のＮ
末端からの最初の残基位置である。

【０１７７】 特定の実施態様において、本発明は、配列番号２の残基：

【０１７８】

【数４】

【０１７９】 のアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらのアミノ酸配列からなるポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドを提供する。これらのポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。

【０１８０】 従って、本発明は、配列番号２０に示されるＴＮＦ−γ−βのアミノ酸配列の
アミノ末端から１つ以上の残基が欠失された（１３４位のロイシン残基まで）ポ
リペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさ
らに提供する。詳細には、本発明は、配列番号２０の残基ｎ²〜２５１のアミノ
酸配列を含むポリペプチドを提供する。ここでｎ²は１〜１３４の範囲の整数で
あり、そして１３５は、ＴＮＦ−γ−βポリペプチドの、多くの型の造血細胞お
よび内皮細胞の活性の増殖および分化の調節に必要と考えられる完全なＴＮＦ−
γポリペプチド（配列番号２０に示される）のＮ末端からの最初の残基位置であ
る。

【０１８１】 特定の実施態様において、本発明は、配列番号２０の残基：

【０１８２】

【数５】

【０１８３】 のアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらのアミノ酸配列からなるポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドを提供する。これらのポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。

【０１８４】 上記のように、ポリペプチドのＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、そ
のポリペプチドの１つ以上の生物学的機能の改変または損失を生じる場合でさえ
、他の生物学的活性はなお保持され得る。従って、短縮したＴＮＦ−γ−αムテ
インが全長または成熟形態のポリペプチドを認識する抗体を誘導し、そして／ま
たは結合する能力は、全長または成熟型のポリペプチドの大部分より少ない残基
がＮ末端から除去される場合は、一般に保持される。完全なタンパク質のＮ末端
残基を欠失する特定のポリペプチドがこのような免疫学的活性を保持するか否か
は、本明細書に記載される慣用的方法、およびそうでなければ当該分野で公知の
慣用的方法により、容易に決定され得る。多くの欠失したＮ末端アミノ酸残基を
有するＴＮＦ−γ−αムテインが、いくつかの生物学的活性または免疫学的活性
を保持し得ることはないことはない。実際、６まで少ないＴＮＦ−γ−αアミノ
酸残基からなるペプチドは、しばしば免疫応答を惹起し得る。

【０１８５】 従って、本発明はさらに、図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）に示されるＴＮ
Ｆ−γ−αの推定成熟アミノ酸配列のアミノ末端から１つ以上の残基が欠失され
た（図１Ａおよび図１Ｂに示される配列の１６９位（これは、配列番号２の１４
２位に相当する）のフェニルアラニン残基まで）ポリペプチド、およびこのよう
なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。詳細には、本
発明は、図１Ａおよび図１Ｂに示される配列の残基ｎ³〜１７４のアミノ酸配列
（配列番号２のｎ³〜１４７）を含むポリペプチドを提供する。ここでｎ³は１〜
１６９の範囲の整数であり、そして１７０は、ＴＮＦ−γ−αポリペプチドの、
少なくとも免疫原性活性に必要と考えられる完全なＴＮＦ−γ−αポリペプチド
のＮ末端からの最初の残基位置である。

【０１８６】 より詳細には、本発明は、図１Ａおよび図１Ｂに示されるＴＮＦ−γ−α配列
の残基：

【０１８７】

【化４】

【０１８８】 のアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらのアミノ酸配列からなるポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドを提供する（図１Ａおよび図１Ｂに示されるＴＮ
Ｆ−γ−αアミノ酸配列は、配列番号２の配列と同一であるが、しかし、番号付
けの仕組みが２つの間で異なり；この場合の上記のアミノ酸残基の番号付けは、
図１Ａおよび図１Ｂの番号付けを反映する）。これらのポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。

【０１８９】 従って、本発明はさらに、配列番号２０に示されるＴＮＦ−γ−βの推定成熟
アミノ酸配列のアミノ末端から１つ以上の残基が欠失された（２４６位のフェニ
ルアラニン残基まで）ポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドをさらに提供する。詳細には、本発明は、配列番号２０の残
基ｎ⁴〜２５１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。ここでｎ⁴は２〜
２４６の範囲の整数であり、そして２４７は、ＴＮＦ−γ−βタンパク質の、少
なくとも免疫原性活性に必要と考えられる完全なＴＮＦ−γ−βポリペプチドの
Ｎ末端からの最初の残基位置である。

【０１９０】 より詳細には、本発明は、配列番号２０に示されるＴＮＦ−γ−β配列の残基
：

【０１９１】

【化５】

【０１９２】 のアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらのアミノ酸配列からなるポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドを提供する。これらのポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。

【０１９３】 同様に、生物学的に機能的なＣ末端欠失ムテインの多数の例が公知である。例
えば、インターフェロンγは、タンパク質のカルボキシ末端から８〜１０アミノ
酸残基を欠失することにより１０倍までより高い活性を示す（Ｄｏｅｂｅｌｉら
、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９〜２１６（１９８８））。さら
に、何人かの研究者は、２まで少ないアミノ酸をＣ末端から除去した生物学的に
不活性なＴＮＦ−ａムテインを報告する（Ｃａｒｌｉｎｏ，Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：９５８−９６１（１９８７）；Ｃｒｅａｓｅｙ，Ａ
．Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：１４５−１４９（１９８７）；Ｓｉｄ
ｈｕ，Ｒ．Ｓ．およびＢｏｌｌｏｎ，Ａ．Ｐ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．
９：１５６９−１５７６（１９８９）Ｇａｓｅ，Ｋ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
７１：３６８−３７１（１９９０））。

【０１９４】 本発明の場合、本発明のタンパク質は、ＴＮＦポリペプチドファミリーのメン
バーであるので、配列番号２の１４６位のロイシン残基（これは、配列番号２０
の２５０位のロイシンに対応する）までのＣ末端アミノ酸の欠失は、多くの型の
造血細胞および内皮細胞の増殖および分化の調節のようないくつかの生物学的活
性を保持し得る。配列番号２の１４６位のロイシン残基（または配列番号２０の
２５０位のロイシン残基）を含むさらなるＣ末端欠失を有するポリペプチドは、
このような生物学的活性を保持するとは予期されない。なぜなら、この残基は、
ＴＮＦ関連ポリペプチドにおいて、生物学的活性に必要である保存性ドメインの
始めにあることが公知であるからである。

【０１９５】 しかし、タンパク質のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、そのタンパ
ク質の１つ以上の生物学的機能の改変または損失を生じる場合でさえ、他の生物
学的活性はなお保持され得る。従って、短縮したタンパク質が完全または成熟形
態のタンパク質を認識する抗体を誘導し、そして／または結合する能力は、完全
または成熟タンパク質の大部分より少ない残基がＣ末端から除去される場合は、
一般に保持される。完全なタンパク質のＣ末端残基を欠失する特定のポリペプチ
ドがこのような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書に記載される慣用的
方法、およびそうでなければ当該分野で公知の慣用的方法により、容易に決定さ
れ得る。

【０１９６】 さらなる実施態様において、本発明は、配列番号２に示されるＴＮＦ−γ−α
のアミノ酸配列のカルボキシ末端から１つ以上の残基が欠失された（配列番号２
の１４６位のロイシン残基まで）ポリペプチド、およびこのようなポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。詳細には、本発明は、配列番
号２のアミノ酸配列の残基−２７〜ｍ¹のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提
供する。ここでｍ¹は１４６〜１４６の範囲の任意の整数であり、そして残基１
４６は、ＴＮＦ−γ−αポリペプチドによる、多くの型の造血細胞および内皮細
胞の増殖および分化の調節に必要と考えられる完全なＴＮＦ−γ−αポリペプチ
ド（配列番号２に示される）のＣ末端からの最初の残基位置である。

【０１９７】 より詳細には、本発明は、配列番号２の残基−２７〜１４６および−２７〜１
４７のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供
する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含
まれる。

【０１９８】 本発明はまた、配列番号２０に示されるＴＮＦ−γ−βのアミノ酸配列のカル
ボキシ末端から１つ以上の残基が除去された（配列番号２０の２５０位のロイシ
ン残基まで）ポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドをさらに提供する。詳細には、本発明は、配列番号２０のアミノ酸配
列の残基１〜ｍ²のアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。ここでｍ²は
２５０〜２５１の範囲の任意の整数であり、そして残基２４９は、多くの型の造
血細胞および内皮細胞の増殖および分化の調節に必要と考えられる完全なＴＮＦ
−γ−βポリペプチド（配列番号２０に示される）のＣ末端からの最初の残基位
置である。

【０１９９】 より詳細には、本発明は、配列番号２０の残基１〜２５０および１〜２５１の
アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、提供される。

【０２００】 本発明はまた、ＴＮＦ−γ−αのアミノ末端およびカルボキシ末端の両方から
欠失した１つ以上のアミノ酸を含むか、または代替的にはそれからなるポリペプ
チドフラグメント（一般に、配列番号２の残基ｎ¹〜ｍ¹を有すると記載され得、
ここでｎおよびｍは、上記のような整数である）を提供する。本発明はさらに、
ＴＮＦ−γ−βのアミノ末端およびカルボキシ末端の両方から１つ以上のアミノ
酸が欠失されたポリペプチド（一般に、配列番号２０の残基ｎ²〜ｍ²を有すると
記載され得、ここでｎ²およびｍ²は、上記のような整数である）を提供する。

【０２０１】 上記のように、ポリペプチドのＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、そ
のポリペプチドの１つ以上の生物学的機能の改変または損失を生じる場合でさえ
、他の生物学的活性はなお保持され得る。従って、短縮したＴＮＦ−γ−αムテ
インが全長または成熟ポリペプチドを認識する抗体を誘導し、そして／または結
合する能力は、完全または成熟ポリペプチドの大部分より少ない残基がＣ末端か
ら除去される場合は、一般に保持される。全長ポリペプチドのＣ末端残基を欠失
する特定のポリペプチドがこのような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細
書に記載される慣用的方法、およびそうでなければ当該分野で公知の慣用的方法
により、容易に決定され得る。多くの欠失したＣ末端アミノ酸残基を有するＴＮ
Ｆ−γ−αムテインが、いくつかの生物学的活性または免疫学的活性を保持し得
ることはないことはない。実際、６まで少ないＴＮＦ−γ−αアミノ酸残基から
なるペプチドは、しばしば免疫応答を惹起し得る。

【０２０２】 従って、本発明はさらに、図１Ａおよび図１Ｂ（または配列番号２）に示され
るＴＮＦ−γ−αのアミノ酸配列のカルボキシ末端から１つ以上の残基が欠失さ
れた（図１Ａおよび図１Ｂに示される配列の６位（または、配列番号２の−２２
位）のセリン残基まで）ポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドをさらに提供する。詳細には、本発明は、配列番号２の残
基１〜ｍ³のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。ここでｍ³は６〜１７
４の範囲の整数であり、そして６は、ＴＮＦ−γ−αポリペプチドの、少なくと
も免疫原性活性に必要と考えられる完全なＴＮＦ−γ−αポリペプチドのＣ末端
からの最初の残基位置である。

【０２０３】 より詳細には、本発明は、図１Ａおよび図１Ｂに示されるＴＮＦ−γ−α配列
の配列の残基：

【０２０４】

【化６】

【０２０５】 のアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらのアミノ酸配列からなるポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドを提供する（図１Ａおよび図１Ｂに示されるＴＮ
Ｆ−γ−αアミノ酸配列は、配列番号２の配列と同一であるが、しかし、番号付
けの仕組みが２つの間で異なり；この場合の上記のアミノ酸残基の番号付けは、
図１Ａおよび図１Ｂの番号付けを反映する）。これらのポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドもまた、提供される。

【０２０６】 本発明はまた、ＴＮＦ−γ−αポリペプチドのアミノ末端およびカルボキシ末
端の両方から１つ以上のアミノ酸が欠失されたポリペプチド（一般に、配列番号
２の残基ｎ³〜ｍ³を有すると記載され得、ここでｎ³およびｍ³は、上記のような
整数である）を提供する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
もまた、本発明に含まれる。

【０２０７】 本発明はさらに、配列番号２０に示されるＴＮＦ−γ−βのアミノ酸配列のカ
ルボキシ末端から１つ以上の残基が欠失された（６位のグリシン残基まで）ポリ
ペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさら
に提供する。詳細には、本発明は、配列番号２０の残基１〜ｍ⁴のアミノ酸配列
を含むポリペプチドを提供する。ここでｍ⁴は６〜２５０の範囲の整数であり、
そして６は、ＴＮＦ−γ−βタンパク質の、少なくとも免疫原性活性に必要と考
えられる完全なＴＮＦ−γ−βポリペプチドのＣ末端からの最初の残基位置であ
る。

【０２０８】 より詳細には、本発明は、配列番号２０に示されるＴＮＦ−γ−β配列の配列
の残基：

【０２０９】

【化７】

【０２１０】 のアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらのアミノ酸配列からなるポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドを提供する。これらのポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドもまた、提供される。

【０２１１】 本発明はまた、配列番号２０の残基ｎ⁴−ｍ⁴（ここで、ｎ⁴およびｍ⁴は、上記
のような整数である）を有すると一般的に記載され得るＴＮＦ−γ−βポリペプ
チドの、アミノ末端およびカルボキシル末端の両方を欠失した１つ以上のアミノ
酸を有するポリペプチドを提供する。これらのポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドもまた、本発明に包含される。

【０２１２】 本発明のさらなる実施態様は、一般式ｍ^x−ｎ^xによって記載されるアミノ酸（
ここで、ｍおよびｎは、これらの記号についてそれぞれ上記に明記されるアミノ
酸残基の任意の１つに対応し、そしてｘは任意の整数を表す）を含むか、あるい
はこのアミノ酸からなるポリペプチドフラグメントに関する。これらのポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に包含される。

【０２１３】 本発明の特定の実施例は、ＡＴＣＣ受託番号７５９２７に含まれるｃＤＮＡク
ローンによってコードされる完全ＴＮＦ−γ−αアミノ酸配列の一部からなるポ
リペプチドをコードするヌクレオチド配列に関する。ここで、この部分は、ＡＴ
ＣＣ受託番号７５９２７に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全
アミノ酸配列のアミノ末端から１〜約６２アミノ酸を除外するか、またはＡＴＣ
Ｃ受託番号７５９２７に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全ア
ミノ酸配列の、カルボキシ末端から約１アミノ酸を除外するか、あるいは上記の
アミノ酸末端欠失およびカルボキシ末端欠失の任意の組み合わせを除外する。上
記の欠失変異ポリペプチド形態のすべてをコードするポリヌクレオチドもまた、
提供される。

【０２１４】 別の実施態様において、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号２０３０５５に含まれる
ｃＤＮＡクローンによってコードされる完全ＴＮＦ−γ−βアミノ酸配列の一部
からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に関する。ここで、この部
分は、ＡＴＣＣ受託番号２０３０５５に含まれるｃＤＮＡクローンによってコー
ドされる完全アミノ酸配列のアミノ酸末端から１〜約１３４アミノ酸を除外する
か、またはＡＴＣＣ受託番号２０３０５５に含まれるｃＤＮＡクローンによって
コードされる完全アミノ酸配列のアミノ末端から多くのアミノ酸を除外するか（
ここで、この数は、１〜１３４の任意の整数から選択される）、またはＡＴＣＣ
受託番号２０３０５５に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全ア
ミノ酸配列のカルボキシ末端から約１アミノ酸を除外するか、あるいは上記のア
ミノ酸末端欠失およびカルボキシ末端欠失の任意の組み合わせを除外する。上記
のポリペプチドのすべてをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に包含さ
れる。

【０２１５】 本発明はさらに、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離さ
れたＴＮＦ−γポリペプチドを提供する：（ａ）配列番号２に示される完全アミ
ノ酸配列を有する全長ＴＮＦ−γ−αポリペプチドのアミノ酸配列（すなわち、
配列番号２の−２７位〜１４７位）；（ｂ）Ｎ末端メチオニンを除いて、配列番
号２に示される完全アミノ酸配列を有する全長ＴＮＦ−γ−αポリペプチドのア
ミノ酸配列（すなわち、配列番号２の−２６位〜１４７位）；（ｃ）配列番号２
における１位〜１４７位のアミノ酸配列を有する推定成熟ＴＮＦ−γ−αポリペ
プチドのアミノ酸配列；（ｄ）ＡＴＣＣ受託番号７５９２７に含まれるｃＤＮＡ
クローンＨＵＶＥＯ９１によってコードされる完全アミノ酸配列；（ｅ）ＡＴＣ
Ｃ受託番号７５９２７に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるＮ末端
メチオニンを除く完全アミノ酸配列、および（ｆ）ＡＴＣＣ受託番号７５９２７
に含まれるｃＤＮＡクローンＨＵＶＯＥ９１によってコードされる推定成熟ＴＮ
Ｆ−γポリペプチドの完全アミノ酸配列。本発明のポリペプチドはまた、上記の
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、もしくは（ｆ）に記載されるアミノ
酸配列、または本明細書中に記載されるようなそれらのフラグメントに対して少
なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％
同一、そしてさらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、または９
９％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。

【０２１６】 本発明はさらに、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離さ
れたＴＮＦ−γポリペプチドを提供する：（ａ）配列番号２０に示される完全ア
ミノ酸配列を有する全長ＴＮＦ−γ−βポリペプチドのアミノ酸配列（すなわち
、配列番号２０の１位〜２５１位）；（ｂ）Ｎ末端メチオニンを除いて、配列番
号２０に示される完全アミノ酸配列を有する全長ＴＮＦ−γ−βポリペプチドの
アミノ酸配列（すなわち、配列番号２０の２位〜２５１位）；（ｃ）配列番号２
０における６２位〜２５１位のアミノ酸配列を有する推定成熟ＴＮＦ−γ−βポ
リペプチドのアミノ酸配列；（ｄ）ＡＴＣＣ受託番号２０３０５５に含まれるｃ
ＤＮＡクローンＨＥＭＣＺ５６によってコードされる完全アミノ酸配列；（ｅ）
ＡＴＣＣ受託番号２０３０５５に含まれるｃＤＮＡクローンＨＥＭＣＺ５６によ
ってコードされるＮ末端メチオニンを除く完全アミノ酸配列；および（ｆ）ＡＴ
ＣＣ受託番号２０３０５５に含まれるｃＤＮＡクローンＨＥＭＣＺ５６によって
コードされる推定成熟ＴＮＦ−γポリペプチドの完全アミノ酸配列。本発明のポ
リペプチドはまた、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、もしくは
（ｆ）に記載されるアミノ酸配列、または本明細書中に記載されるようなそれら
のフラグメントに対して少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、より好
ましくは少なくとも９０％同一、そしてさらにより好ましくは９５％、９６％、
９７％、９８％、または９９％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む
。特定の実施態様において、これらのポリペプチドは、少なくとも１０アミノ酸
、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸
、少なくとも３０アミノ酸、そしてより好ましくは少なくとも５０アミノ酸であ
る。

【０２１７】 ＴＮＦ−γポリペプチドの参照アミノ酸配列に対して、少なくとも例えば、９
５％「同一」なアミノ酸配列を有するポリペプチドによって、このポリペプチド
配列がＴＮＦ−γポリペプチドの参照（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）アミノ酸配列の１
００アミノ酸につき５つまでのアミノ酸の変化を含み得ることを除いて、このポ
リペプチドのアミノ酸配列が、この参照配列に同一であることが意図される。換
言すれば、参照アミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有
するポリヌクレオチドを得るために、参照配列のアミノ酸残基の５％までが、欠
失、もしくは別のヌクレオチドで置換され得るか、または参照配列の総アミノ酸
残基の５％までの多くのアミノ酸が、この参照配列内に挿入され得る。これらの
参照配列の変化は、参照アミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端の位
置、またはこれらの末端の位置間の任意の場所で、参照配列内の残基の中で個々
に、もしくは参照配列内の１つ以上の連続した群のいずれかで分散して生じ得る
。

【０２１８】 実際問題として、任意の特定のポリぺプチドが、例えば、図１ＡおよびＢ（配
列番号２）に示されるアミノ酸配列、寄託されたｃＤＮＡクローンＨＵＶＥＯ９
１によってコードされるアミノ酸配列、またはそれらのフラグメントに対して少
なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか
否かは、公知のコンピュータープログラム（例えば、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム
（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ
、Ｕｎｉｘ用バージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ
、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ５３７１１））を使用して従来的に決定
され得る。特定の配列が、本発明による参照配列に対して例えば９５％同一であ
るか否かを決定するために、Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列整列プログラ
ムを使用する場合、パラメーターは、当然、参照アミノ酸配列の全長にわたって
同一性のパーセントが計算され、そして参照配列内のアミノ酸残基の総数の５％
までの相同性におけるギャップが許容されるように設定される。

【０２１９】 特定の実施態様において、参照（問い合わせ（ｑｕｅｒｙ））配列（本発明の
配列）と対象配列（ｓｕｂｊｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）との間の同一性はまた
、全体的な配列整列ともいわれ、これはＢｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．
Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡ
ＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定される。ＦＡＳＴＤＢアミノ
酸整列において使用される好ましいパラメーターは以下の通りである：Ｍａｔｒ
ｉｘ＝ＰＡＭ ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝
１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇ
ｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ
Ｓｉｚｅ＝配列長、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａ
ｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象アミノ酸配列の
長さ（どちらかより短い方）。この実施態様に従って、対象配列が、内部欠失が
理由ではなくＮ末端またはＣ末端の欠失に起因して問い合わせ配列より短い場合
、ＦＡＳＴＤＢプログラムは、全体的パーセント同一性を計算する場合に対象配
列のＮ末端およびＣ末端の短縮を考慮しないという事実を考慮するために、結果
に対して手動の補正がなされる。問い合わせ配列に対して、Ｎ末端またはＣ末端
で短縮化された対象配列について、パーセント同一性は、問い合わせ配列の総塩
基のパーセントとして、対応する対象残基と整合／整列されない対象配列のＮ末
端およびＣ末端である問い合わせ配列の残基の数を計算することによって補正さ
れる。残基が整合／整列されるか否かの決定は、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメン
トの結果によって決定される。次いで、このパーセントは、パーセント同一性か
ら差し引かれ、特定のパラメーターを用いて上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによ
って算定されて、最終的なパーセント同一性のスコアに達する。この最終的なパ
ーセント同一性のスコアが、この実施態様の目的に使用されるものである。問い
合わせ配列と整合／整列されていない、対象配列のＮ末端およびＣ末端に対する
残基のみが、パーセント同一性のスコアを手動で調整するために考慮される。す
なわち、対象配列の最も遠いＮ末端残基およびＣ末端残基の外側に位置付けられ
た問い合わせ残基のみである。

【０２２０】 例えば、９０アミノ酸残基の対象配列は、パーセント同一性を決定するために
１００残基の問い合わせ配列に整列される。欠失は対象配列のＮ末端で生じ、従
って、ＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端で最初の１０残基の整合／整列を示さない。
１０個の不対合残基は、配列の１０％（（整合していないＮ末端およびＣ末端の
残基の数）／（問い合わせ配列の残基の総数））を表し、そのため１０％は、Ｆ
ＡＳＴＤＢプログラムによって算定されるパーセント同一性のスコアから差し引
かれる。残りの９０残基が完全に整合する場合は、最終的なパーセント同一性は
９０％である。別の例において、９０残基の対象配列は、１００残基の問い合わ
せ配列と比較される。この場合、欠失は内部欠失であり、その結果、問い合わせ
（配列）と整合／整列しない対象配列のＮ末端またはＣ末端には残基がない。こ
の場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定されるパーセント同一性は手動で補正されな
い。重ねて、ＦＡＳＴＤＢアラインメントで提示されるような、問い合わせ配列
と整合／整列しない対象配列のＮ末端またはＣ末端の外側に位置付けられる残基
のみが手動で補正される。他の手動の補正は、この実施態様の目的ではなされな
い。

【０２２１】 本発明のポリペプチドとしては、配列番号２のポリペプチド（特に、成熟ポリ
ペプチド）、ならびに配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも７０％類似
性（好ましくは、少なくとも７０％同一性）、そしてより好ましくは配列番号２
のポリペプチドに対して少なくとも９０％類似性（より好ましくは、少なくとも
９０％同一性）、そしてさらにより好ましくは配列番号２のポリペプチドに対し
て少なくとも９５％類似性（さらにより好ましくは、少なくとも９５％同一性）
を有するポリペプチドが挙げられる。そしてまた、そのようなポリペプチドの部
分も挙げられ、このようなポリペプチドの部分は、一般的に、少なくとも３０ア
ミノ酸、およびより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を含む。

【０２２２】 本発明のポリペプチドとしてはまた、配列番号２０のポリペプチド（特に、ポ
リペプチドの細胞外ドメイン）、ならびに配列番号２０のポリペプチドに対して
少なくとも７０％類似性（好ましくは、少なくとも７０％同一性）、そしてより
好ましくは配列番号２０のポリペプチドに対して少なくとも９０％類似性（より
好ましくは、少なくとも９０％同一性）、そしてさらにより好ましくは配列番号
２０のポリペプチドに対して少なくとも９５％類似性（さらにより好ましくは、
少なくとも９５％同一性）を有するポリペプチドが挙げられる。そしてまた、そ
のようなポリペプチドの部分も挙げられ、このようなポリペプチドの部分は、一
般的に、少なくとも３０アミノ酸、およびより好ましくは少なくとも５０アミノ
酸を含む。

【０２２３】 本発明のさらなるポリペプチドとしては、本明細書中に記載されるこれらのポ
リペプチドに対して少なくとも７０％類似性、少なくとも９０％類似性、より好
ましくは少なくとも９５％類似性、およびさらにより好ましくは少なくとも９６
％、９７％、９８％、または９９％類似性を有するポリペプチドが挙げられる。
本発明のポリペプチドとしてはまた、本明細書中に開示されるポリペプチドに対
して少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも
９０％または９５％同一、さらにより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９
８％、または９９％同一なポリペプチドが挙げられる。特定の実施態様において
、このようなポリペプチドは、少なくとも３０アミノ酸、およびより好ましくは
少なくとも５０アミノ酸を含む。

【０２２４】 当該分野において公知のように、２つのポリペプチド間の「類似性」は、１つ
のポリペプチドの、第２のポリペプチドの配列に対するアミノ酸配列およびその
保存的アミノ酸置換を比較することによって決定される。２つのポリペプチドに
ついての「％類似性」とは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｕｎｉｘ用バージョン
８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄ
ｉｓｏｎ、ＷＩ５３７１１）および類似性を決定するためのデフォルト設定を使
用して、２つのポリペプチドのアミノ酸配列を比較することによって産出される
類似性スコアを意図する。Ｂｅｓｔｆｉｔは、２つの配列間の最高の類似性のセ
グメントを見出すために、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所的相同性ア
ルゴリズム（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃ
ｓ ２：４８２−４８９、１９８１）を使用する。

【０２２５】 本発明のＴＮＦ−γ−αおよびＴＮＦ−γ−βポリペプチドは、単量体または
多量体（すなわち、二量体、三量体、四量体、およびより高次の多量体）であり
得る。特定の実施態様において、本発明のポリペプチドは、単量体、二量体、三
量体、または四量体である。さらなる実施態様において、本発明の多量体は、少
なくとも二量体、少なくとも三量体、または少なくとも四量体である。

【０２２６】 本発明によって包含される多量体は、ホモマーまたはヘテロマーであり得る。
本明細書中で使用される場合、用語ホモマーは、本発明のＴＮＦ−γ−αポリペ
プチドおよび／またはＴＮＦ−γ−βポリペプチドのみを含む多量体をいう（本
明細書中で記載されるような、ＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−βの
フラグメント、改変体、および融合タンパク質を含む）。これらのホモマーは、
同一または異なるアミノ酸配列を有するＴＮＦ−γ−αポリペプチドおよびＴＮ
Ｆ−γ−βポリペプチドを含み得る。特定の実施態様において、本発明のモノマ
ーは、同一のアミノ酸配列を有するＴＮＦ−γ−αポリペプチドおよび／または
ＴＮＦ−γ−βポリペプチドのみを含む多量体である。別の特定の実施態様にお
いて、本発明のホモマーは、異なるアミノ酸配列を有するＴＮＦ−γ−αポリペ
プチドおよびＴＮＦ−γ−βポリペプチドを含む多量体である。特定の実施態様
において、本発明の多量体は、ホモ二量体（例えば、同一または異なるアミノ酸
配列を有するＴＮＦ−γ−αポリペプチドを含む）であるか、またはホモ三量体
（例えば、同一または異なるアミノ酸配列を有するＴＮＦ−γ−αポリペプチド
を含む）である。さらなる実施態様において、本発明のホモマーの多量体は、少
なくともホモ二量体、少なくともホモ三量体、または少なくともホモ四量体であ
る。

【０２２７】 本明細書中で使用される場合、用語へテロマーは、本発明のＴＮＦ−γ−αポ
リペプチドおよびＴＮＦ−γ−βポリペプチドに加えて、異種のポリペプチド（
すなわち、異なるタンパク質のポリペプチド）を含む多量体をいう。特定の実施
態様において、本発明の多量体は、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、またはヘテロ
四量体である。さらなる実施態様において、本発明のホモマーの多量体は、少な
くともホモ二量体、少なくともホモ三量体、または少なくともホモ四量体である
。

【０２２８】 本発明の多量体は、疎水結合、親水結合、イオン結合、および／または共有結
合の結果であり得る。従って、１つの実施態様において、例えば、ホモ二量体ま
たはホモ三量体のような本発明の多量体は、本発明のポリペプチドが溶液中にお
いて互いに接触した場合に形成される。別の実施態様において、例えば、ヘテロ
三量体またはヘテロ四量体のような本発明のヘテロ多量体は、本発明のポリペプ
チドが溶液中において本発明のポリペプチドに対する抗体（本発明の融合タンパ
ク質における異種ポリペプチド配列に対する抗体を含む）に接触した場合に形成
される。他の実施態様において、本発明の多量体は、本発明のＴＮＦ−γ−αポ
リペプチドおよびＴＮＦ−γ−βポリペプチドとの共有結合性相互作用、および
／またはそれらの間の共有結合性相互作用によって形成される。このような共有
結合性相互作用は、配列番号 または配列番号 に引用されるアミノ酸
残基に対応する１つ以上のアミノ酸残基、またはクローン によってコード
される１つ以上のアミノ酸残基に対応する１つ以上のアミノ酸残基に関与し得る
。あるいは、このような共有結合性相互作用は、例えば、ＴＮＦ−γ−α−Ｆｃ
融合タンパク質（本明細書中で記載されるような）に含まれる異種配列のような
、ＴＮＦ−γ−α融合タンパク質およびＴＮＦ−γ−β融合タンパク質の異種ポ
リペプチド配列、および、例えば、共有結合した多量体を形成し得るオステオプ
ロテゲリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）のような別のＴＮＦリガンド／
レセプターメンバー由来の異種ポリペプチド配列との融合物に含まれる異種配列
に含まれる１つ以上のアミノ酸残基に関与し得る。

【０２２９】 本発明はまた、全長ＴＮＧ−γポリペプチド、またはそのフラグメント、改変
体、誘導体、もしくはアナログが無関係のタンパク質に融合されている融合タン
パク質を包含する。本発明の融合タンパク質は、ＴＮＦ−γポリペプチド（また
は、フラグメント、改変体、誘導体、またはアナログ）と異種配列との直接的融
合物として構築され得るか、またはこのタンパク質の２つの部分の間に挿入され
る１つ以上のアミノ酸を有するスペーサーまたはアダプター領域と共に構築され
得る。必要に応じて、スペーサー領域は、プロテアーゼ切断部位をコードし得る
。この融合の正確な部位は重要ではなく、そして同種配列および／または異種配
列の結合特徴および／または生物学的活性を最大化するために、当業者によって
慣用的に変動され得る。本発明の融合タンパク質は、本明細書中に開示されるＴ
ＮＦ−γヌクレオチド配列またはＴＮＦ−γポリペプチド配列に基づいて、慣用
的に設計され得る。例えば、当業者が理解するように、本明細書中に記載される
ＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−βのポリペプチドおよびそれらのフ
ラグメント（エピトープ保有フラグメントを含む）は、免疫グロブリン（ＩｇＧ
）の定常ドメインの部分と結合され得、キメラ（融合）ポリペプチドを生じる。
これらの融合タンパク質は、精製を容易にし、そしてインビボでの半減期の増大
を示す。これは、例えば、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメインおよ
び哺乳動物免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからな
るキメラタンパク質について示されている（ＥＰ Ａ ３９４，８２７；Ｔｒａ
ｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８））。ジスル
フィド結合した二量体構造（ＩｇＧ部分に起因する）を有する融合タンパク質は
また、単量体ＴＮＦ−γタンパク質またはタンパク質フラグメント単独より、他
の分子を結合し、そしてそれを中和する際により効率的であり得る（Ｆｏｕｎｔ
ｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４（１９９
５））。例として、１つのそのようなＴＮＦ−γ−Ｆｃ融合物は、上記のように
本明細書中で生成された。他の実施態様において、全長ＴＮＦ−γポリペプチド
またはそのフラグメント、改変体、誘導体、もしくはアナログは、例えば、オス
テオプロテグリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｒｉｎ）の二量体化ドメインのよう
な多量体形態を形成し得る１つ以上の他の異種ポリペプチド配列に融合する（例
えば、ＥＰ ０ ７２１ ９８３、米国特許第５，４７８，９２５号、および国
際公開番号ＷＯ９８／４９３０５（これらの各々は、その全体において本明細書
中で参考として援用される）を参照のこと）。本発明によって包含されるＴＮＦ
−γ融合タンパク質のさらなる例としては、融合タンパク質が細胞表面上に提示
されることを可能にする任意のアミノ酸配列へのＴＮＦ−γポリペプチド配列の
融合物；またはマーカー機能を提供する酵素、蛍光タンパク質、または発光タン
パク質への融合物が挙げられるが、これらに限定されない。

【０２３０】 キメラＯＰＧポリペプチドの改変は本発明によって包含され、そしてこれには
、翻訳後改変（例えば、Ｎ結合型糖鎖またはＯ結合型糖鎖、Ｎ末端またはＣ末端
のプロセシング）、アミノ酸骨格への化学的部分の付着、Ｎ結合型糖鎖またはＯ
結合型糖鎖の化学的改変、および原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メ
チオニン残基の付加が挙げられる。ポリペプチドはまた、タンパク質の検出およ
び単離を可能にするために、酵素標識、蛍光標識、アイソトープ標識、またはア
フィニティ標識のような検出可能な標識で改変され得る。

【０２３１】 可溶性、安定性、およびポリペプチドの循環時間の増大、または免疫原性の減
少のようなさらなる利点を提供し得る化学的に改変されたＯＰＧの誘導体もまた
、本発明によって提供される（米国特許第４，１７９，３３７号を参照のこと）
。誘導体化のための化学的部分は、水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリ
コール、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシ
メチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなど）から選択され得
る。ポリペプチドは、分子内の無作為な位置または分子内の予め決められた位置
で改変され得、そしてこれは、１つ、２つ、３つまたはそれ以上の付着された化
学的部分を含み得る。

【０２３２】 ポリマーは任意の分子量であり得、そして分枝または非分枝であり得る。ポリ
エチレングリコールについて、取り扱いおよび操作における容易さのために好ま
しい分子量は、約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａの間である（用語「約」は、ポリエ
チレングリコールの調製において、いくつかの分子は示された分子量よりも大き
く、いくつかは小さいことを示す）。他のサイズは、所望される治療プロフィー
ル（例えば、所望される徐放の持続期間、もしあれば生物学的活性に対する効果
、取り扱いの容易さ、抗原性の程度または欠如、および治療用タンパク質または
アナログへのポリエチレングリコールの他の公知の効果）に依存して使用され得
る。

【０２３３】 ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、タンパク質の機能
的ドメインまたは抗原性ドメインに対する効果について考慮されるタンパク質に
付着されるべきである。当業者に利用可能な多くの付着方法（例えば、ＥＰ ０
４０１ ３８４（本明細書中で参考として援用される）（Ｇ−ＣＳＦへのＰＥＧ
カップリング）が存在する。Ｍａｌｉｋら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１
０２８−１０３５（１９９２）（塩化トレシル（ｔｒｅｓｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄ
ｅ）を用いるＧＭ−ＣＳＦのペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）を報告する）もま
た参照のこと。例えば、ポリエチレングリコールは、反応基（例えば、遊離のア
ミノ基またはカルボキシル基）を介して、アミノ酸残基を通して共有結合し得る
。反応基とは、活性化されたポリエチレングリコール分子が結合し得る基である
。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基としては、リジン残基、およびＮ末端アミ
ノ酸残基が挙げられ得；遊離カルボキシル基を有するアミノ酸残基としては、ア
スパラギン酸残基、グルタミン酸残基、およびＣ末端アミノ酸残基が挙げられ得
る。スルフヒドリル基もまた、ポリエチレングリコール分子を付着するための活
性基として使用され得る。治療目的のために好ましいのは、Ｎ末端またはリジン
基での付着のようなアミノ基での付着である。

【０２３４】 Ｎ末端で化学的に改変されたタンパク質が、特に所望され得る。本発明の組成
物の例証としてポリエチレングリコールを使用して、種々のポリエチレングリコ
ール分子から（分子量、枝分かれなどによる）、反応混合物におけるタンパク質
（またはペプチド）分子に対するポリエチレングリコール分子の比率、実施され
るペグ化反応の型、および選択されたＮ末端ペグ化タンパク質を獲得する方法が
選択され得る。Ｎ末端ペグ化調製物を獲得する方法（すなわち、必要であれば、
他のモノペグ化部分からこの部分を分離すること）は、ペグ化タンパク質分子の
集団からＮ末端ペグ化物質を精製することによるものであり得る。Ｎ末端改変で
化学的に改変された選択的タンパク質は、特定のタンパク質における誘導体化に
ついて利用可能な主要なアミノ基（リジン 対 Ｎ末端）の異なる型の差示的な
反応性を活用する還元的アルキル化によって達成され得る。適切な反応条件下に
おいて、ポリマーを含むカルボニル基によるＮ末端でのタンパク質の実質的に選
択性の誘導体化が達成される。

【０２３５】 本発明のポリペプチドは、当該分野において周知の方法を使用して、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥゲルまたは分子ふるいゲル濾過カラムにおける分子量マーカーが挙げら
れるがこれに限定されない用途を有する。

【０２３６】 （機能的活性） ＴＮＦ−γポリペプチド、ならびにそのフラグメント、改変体、誘導体、およ
びアナログの機能的活性は、種々の方法によってアッセイされ得る。

【０２３７】 例えば、抗ＴＮＦ−γ抗体への結合について全長ＴＮＦ−γポリペプチドと結
合するか、またはこれと競合する能力についてアッセイされる１つの実施態様に
おいては、以下を含むがこれらに限定されない、当該分野において公知の種々の
イムノアッセイが使用され得る：ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合
免疫吸着検定法）、「サンドウィッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリッ
クアッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュイムノアッセ
イ（例えば、金コロイド、酵素、またはラジオアイソトープ標識を使用する）、
ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血
球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセ
イ、および免疫電気泳動アッセイなどのような技術を使用する競合的および非競
合的アッセイ系。１つの実施態様において、抗体結合は、一次抗体上の標識を検
出することによって検出される。別の実施態様において、一次抗体は、この一次
抗体に対する二次抗体または試薬の結合を検出することによって検出される。さ
らなる実施態様において、二次抗体が標識される。イムノアッセイにおける結合
を検出するための多くの手段が当該分野において公知であり、そしてこれらは本
発明の範囲内である。

【０２３８】 ＴＮＦリガンドが同定される別の実施態様において、結合は、例えば、当該分
野において周知の手段によってアッセイされ得る。別の実施態様において、ＴＮ
Ｆ−γのその基質への結合の生理学的相関（シグナル伝達）が、アッセイされ得
る。

【０２３９】 さらに、本明細書中に記載されるアッセイ（実施例５、６、および９〜１５を
参照のこと）およびさもなければ当該分野において公知のアッセイは、ＴＮＦ−
γポリペプチド、ならびにそのフラグメント、改変体、誘導体、およびアナログ
が、ＴＮＦ−γに関連した生物学的活性を誘発する（例えば、インビトロまたは
インビボにおける細胞増殖、腫瘍形成、新脈管形成、ＮＦ−κＢ活性化、および
細胞接着を阻害するか、または代替的には促進する）能力を測定するために、慣
用的に適用され得る。

【０２４０】 他の方法は当業者に公知であり、そして本発明の範囲内である。

【０２４１】 （抗体） 本発明はさらに、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体およびＴ細胞
抗原レセプター（ＴＣＲ）に関する。本発明の抗体は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、Ｉｇ
Ｇ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含
む）、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭおよびＩｇＹを含む。本明細書中で使用され
る場合、用語「抗体」（Ａｂ）は、単鎖の全抗体およびその抗原結合フラグメン
トを含む全抗体を含むことを意味する。最も好ましくは、この抗体は、本発明の
ヒト抗原結合抗体フラグメントであり、これには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（
ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ
ｓ（ｓｄＦｖ）およびＶ_LまたはＶ_Hドメインのいずれかを含むフラグメントが挙
げられるがこれらに限定されない。この抗体は、鳥類および哺乳動物を含む任意
の動物起源であり得る。好ましくは、この抗体は、ヒト、マウス、ウサギ、ヤギ
、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリである。

【０２４２】 単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を単独で、または以下
の全体もしくは部分と組み合わせて含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およ
びＣＨ３ドメイン。本発明には、可変領域ならびにヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２
およびＣＨ３ドメインの任意の組み合わせもまた含まれる。本発明はさらに、本
発明のポリペプチドに特異的に結合するキメラ抗体、ヒト化抗体、ならびにヒト
モノクローナル抗体およびヒトポリクローナル抗体を含む。本発明はさらに、本
発明の抗体に対して抗イディオタイプである抗体を含む。

【０２４３】 本発明の抗体は、単一抗原特異的、二抗原特異的、三抗原特異的であり得るか
、またはより多い複数特異性の抗体であり得る。複数特異的な抗体は、本発明の
ポリペプチドの異なるエピトープについて特異的であり得るか、または本発明の
ポリペプチドおよび異種の組成物（例えば、異種ポリペプチドもしくは固体支持
体物質）の両方に特異的であり得る。例えば、ＷＯ ９３／１７７１５；ＷＯ９
２／０８８０２；ＷＯ ９１／００３６０；ＷＯ ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔ
Ａら、（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０〜６９；米国特許第５
，５７３，９２０号、同第４，４７４，８９３号、同第５，６０１，８１９号、
同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，Ｓ
．Ａ．ら、（１９９２）Ｊ．Ｉｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７〜１５５３を参照
のこと。

【０２４４】 本発明の抗体は、抗体により認識されるかまたは特異的に結合される本発明の
ポリペプチドのエピトープまたは部分に関して、記載されるかまたは特定され得
る。このエピトープまたはポリペプチド部分は、本明細書において記載されるよ
うに、例えば、Ｎ末端位置およびＣ末端位置によって、近接するアミノ酸残基の
サイズによって特定され得るか、または表および図に列挙され得る。本発明の任
意のエピトープまたはポリペプチドに特異的に結合する抗体はまた、除外され得
る。従って、本発明は、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体を含み、
そしてこの同じ抗体の除外を許容する。

【０２４５】 本発明の抗体はまた、その交差反応性について記載されるか、または特定され
得る。本発明のポリペプチドのいかなる他のアナログ、オルトログ（ｏｒｔｈｏ
ｌｏｇ）またはホモログにも結合しない抗体が含まれる。本発明には、本発明の
ポリペプチドに対して９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５
％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、および５０％未満
の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書において記載された方法を用い
て計算される）を有するポリペプチドを結合しない抗体もまた含まれる。本発明
には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（本明細書において記
載される）で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド
によりコードされるポリペプチドにのみ結合する抗体がさらに含まれる。本発明
の抗体はまた、その結合親和性について記載または特定され得る。好ましい結合
親和性としては、５×１０^-6Ｍ、１０^-6Ｍ、５×１０^-7Ｍ、１０^-7Ｍ、５×１０ ^-8 Ｍ、１０^-8Ｍ、５×１０^-9Ｍ、１０^-9Ｍ、５×１０^-10Ｍ、１０^-10Ｍ、５×１
０^-11Ｍ、１０^-11Ｍ、５×１０^-12Ｍ、１０^-12Ｍ、５×１０^-13Ｍ、１０^-13Ｍ、
５×１０^-14Ｍ、１０^-14Ｍ、５×１０^-15Ｍ、および１０^-15Ｍ未満の解離定数（
すなわちＫｄ）を有する親和性が挙げられる。

【０２４６】 本発明の抗体は、インビトロおよびインビボにおける診断方法ならびに治療方
法の両方を含む、本発明のポリペプチドを、精製、検出および標的化するための
当該分野で公知の方法を含むが、これらに限定されない用途を有する。例えば、
この抗体は、生物学的サンプルにおいて本発明のポリペプチドのレベルを定性的
および定量的に測定するためのイムノアッセイにおける用途を有する。例えば、
Ｈａｒｌｏｗら，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵ
ＡＬ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒ
ｅｓｓ，第２版，１９８８）（全体が参考として援用されている）を参照のこと
。

【０２４７】 本発明の抗体は、単独、または他の組成物との組み合わせのいずれかで用いら
れ得る。この抗体は、さらに、Ｎ末端またはＣ末端で異種のポリペプチドに組換
え的に融合され得るか、またはポリペプチドもしくは他の組成物に化学結合（共
有結合および非共有結合を含む）され得る。例えば、本発明の抗体は、検出アッ
セイにおける標識として有用な分子およびエフェクター分子（例えば、異種のポ
リペプチド、薬物または毒素）に組換え的に融合または結合され得る。例えば、
ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特
許第５，３１４，９９５号；および欧州特許第０３９６３８７号を参照のこと。

【０２４８】 本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法により調製され得る。例
えば、本発明のポリペプチドまたはその抗原性フラグメントは、ポリクローナル
抗体を含む血清の産生を誘導するために動物に投与され得る。モノクローナル抗
体は、ハイブリドーマ技術および組換え技術の使用を含む当該分野で公知の広範
な技術を用いて調製され得る。例えば、Ｈａｒｌｏｗら、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ
：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅ
ｒｌｉｎｇら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ Ｔ−Ｃ
ＥＬＬ ＨＹＢＲＩＤＯＭＡＳ ５６３〜６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．
，１９８１）（これらの参考文献は、その全体が参考として援用される）を参照
のこと。

【０２４９】 ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、パパイン（Ｆａｂフラグメント
作製のため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメント作製のため）のよう
な酵素を用いて、タンパク質分解切断により作製され得る。

【０２５０】 あるいは、本発明の抗体は、当該分野で公知の方法を用いる組換えＤＮＡ技術
の適用、または合成化学により作製され得る。例えば、本発明の抗体は、当該分
野で公知の種々のファージディスプレイ方法を用いて調製され得る。ファージデ
ィスプレイ方法において、機能的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌク
レオチド配列を保有するファージ粒子の表面に提示される。所望の結合特性を有
するファージは、抗原（代表的には、固体表面またはビーズに結合または捕捉さ
れた抗原）を用いて直接的に選択することにより、レパートリー抗体ライブラリ
ーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から
選択される。これらの方法において用いられるファージは、代表的には、ファー
ジ遺伝子ＩＩＩタンパク質またはファージ遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれか
に組換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化Ｆｖの抗体ドメ
インを有するｆｄおよびＭ１３を含む糸状ファージである。本発明の抗体を作製
するために用いられ得るファージディスプレイ方法の例としては、以下に開示さ
れる方法が挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｕ．ら、（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１〜５０；Ａｍｅｓ，Ｒ．Ｓ．ら、（１９
９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７〜１８６；Ｋｅｔ
ｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ら、（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．２４：９５２〜９５８；Ｐｅｒｓｉｃ，Ｌ．ら、（１９９７）Ｇｅｎｅ １８
７ ９〜１８；Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．ら、（１９９４）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉ
ｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１〜２８０；ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１
３４；ＷＯ ９０／０２８０９；ＷＯ ９１／１０７３７；ＷＯ ９２／０１０
４７；ＷＯ ９２／１８６１９；ＷＯ ９３／１１２３６；ＷＯ ９５／１５９
８２；ＷＯ ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号、同
第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７
号、同第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，８２１，
０４７号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５
１６，６３７号、同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２７号および
同第５，７３３，７４３号（これらの参考文献は、その全体が参考として援用さ
れる）。

【０２５１】 上記参考文献に記載されているように、ファージ選択後、ファージ由来の領域
をコードする抗体は、ヒト抗体を含む全抗体または任意の他の所望の抗原結合フ
ラグメントを作製するために単離および使用され得、そして哺乳動物細胞、昆虫
細胞、植物細胞、酵母および細菌を含む任意の所望の宿主において発現され得る
。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換え的に作
製するための技術はまた、以下に開示される方法ような当該分野で公知の方法を
利用して用いられ得る：ＷＯ ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘ，Ｒ．Ｌ．
ら、（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４〜８６９；
およびＳａｗａｉ，Ｈ．ら、（１９９５）ＡＪＲＩ ３４：２６〜３４；および
Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ら、（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１〜１０
４３（これらの参考文献は、その全体が参考として援用される）。

【０２５２】 単鎖のＦｖおよび抗体を作製するために用いられ得る技術の例としては、米国
特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら
、（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６〜
８８；Ｓｈｕ，Ｌ．ら、（１９９３）ＰＮＡＳ ９０：７９９５〜７９９９；お
よびＳｋｅｒｒａ，Ａ．ら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８〜
１０４０に記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボ使用およ
びインビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化
抗体またはヒト抗体の使用が好適であり得る。キメラ抗体を作製するための方法
は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：
２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．Ｄ．ら、（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１〜２０２；および米国特許第５，８０
７，７１５号を参照のこと。抗体は、以下に挙げられる種々の技術を用いてヒト
化され得る：ＣＤＲ−移植術（欧州特許第０ ２３９ ４００号；ＷＯ ９１／
０９９６７；米国特許第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号
）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェイシング（ｒｅｓｕ
ｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第０ ５９２ １０６号；欧州特許第０ ５１９
５９６号；Ｐａｄｌａｎ Ｅ．Ａ．（１９９１）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９〜４９８； Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ Ｇ
．Ｍ．ら、（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：
８０５〜８１４；Ｒｏｇｕｓｋａ Ｍ．Ａ．ら、（１９９４）ＰＮＡＳ ９１：
９６９〜９７３）、およびチェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌ
ｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）。ヒト抗体は、上記のファージデ
ィスプレイ方法を含む当該分野で公知の種々の方法により作製され得る。米国特
許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号、同第５，５４５，８０
６号および同第５，８１４，３１８号；ならびにＷＯ ９８／４６６４５（これ
らの参考文献はその全体が参考として援用される）もまた参照のこと。

【０２５３】 さらに、本発明には、本発明のポリペプチドに組換え的に融合または化学結合
（共有結合および非共有結合の両方を含む）した抗体が含まれる。この抗体は、
本発明のポリペプチド以外の抗原に特異的であり得る。例えば、抗体は、本発明
のポリペプチドを特定の細胞表面レセプターに特異的な抗体に融合または結合す
ることにより、インビトロまたはインビボのいずれかで本発明のポリペプチドを
特定の細胞型へ標的化するために用いられ得る。本発明のポリペプチドに対して
融合または結合された抗体はまた、当該分野で公知の方法を用いてインビトロイ
ムノアッセイおよび精製方法において用いられ得る。例えば、Ｈａｒｂｏｒら、
前出、およびＷＯ ９３／２１２３２；欧州特許第０ ４３９ ０９５号；Ｎａ
ｒａｍｕｒａ，Ｍ．ら、（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：９１〜
９９；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．Ｏ．ら、（１９
９２）ＰＮＡＳ ８９：１４２８〜１４３２；Ｆｅｌｌ，Ｈ．Ｐ．ら、（１９９
１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６〜２４５２（これらの参考文献は、
その全体が参考として援用される）を参照のこと。

【０２５４】 本発明は、可変領域以外の抗体ドメインと融合されたか、または結合体化され
た本発明のポリペプチドを含む組成物をさらに含む。例えば、本発明のポリペプ
チドは、抗体のＦｃ領域またはその部分と融合され得るか、またはそれに結合さ
れ得る。本発明のポリペプチドに融合した抗体部分は、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメ
イン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインまたは完全なドメインまたはその
部分の任意の組み合わせを含み得る。本発明のポリペプチドは、当該分野で公知
の方法を用いて、ポリペプチドのインビボでの半減期を増大するか、またはイム
ノアッセイにおける使用のために上記の抗体部分に融合され得る。このポリペプ
チドはまた、上記の抗体部分に融合されるか、または結合されて、マルチマーを
形成し得る。例えば、本発明のポリペプチドに融合されたＦｃ部分は、Ｆｃ部分
の間のジスルフィド結合によってダイマーを形成し得る。より高度なマルチマー
形態は、ＩｇＡおよびＩｇＭの部分にポリペプチドを融合することにより作製さ
れ得る。本発明のポリペプチドを抗体部分に融合または結合するための方法は、
当該分野で公知である。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号、同第５，６
２２，９２９号、同第５，３５９，０４６号、同第５，３４９，０５３号、同第
５，４４７，８５１号、同第５，１１２，９４６号；ＥＰ ０ ３０７ ４３４
号、ＥＰ ０ ３６７ １６６号；ＷＯ９６／０４３８８号、ＷＯ９１／０６５
７０号；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ，Ａ．ら、（１９９１）ＰＮＡＳ ８８：１０５３
５−１０５３９；Ｚｈｅｎｇ，Ｘ．Ｘ．ら、（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１５４：５５９０−５６００；ならびにＶｉｌ，Ｈ．ら、（１９９２）ＰＮＡＳ
８９：１１３３７−１１３４１（上記の参考文献は、その全体が参考として援
用される）を参照のこと。

【０２５５】 本発明はさらに、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストと
して作用する抗体に関する。例えば、本発明は、本発明のポリペプチドとのレセ
プター／リガンド相互作用を、部分的にまたは完全にのいずれかで、破壊する抗
体を含む。レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の両方が含まれる。
リガンド結合を阻止しないが、レセプター活性化を阻止するレセプター特異的抗
体が含まれる。レセプター活性化（すなわち、シグナル伝達）は、本明細書中に
記載の技術、そうでなければ、当該分野で公知の技術により決定され得る。リガ
ンド結合およびレセプター活性化を両方とも阻止するレセプター特異的抗体もま
た含まれる。同様に、リガンドを結合し、そしてリガンドのレセプターへの結合
を阻止する中和抗体、ならびにリガンドに結合し、それによってレセプター活性
化を阻止するが、リガンドがレセプターに結合することを阻止しない抗体が含ま
れる。レセプターを活性化する抗体がさらに含まれる。これらの抗体は、リガン
ド媒介レセプター活性化により影響を及ぼされる全ての生物学的活性か、または
全てには満たない生物学的活性のいずれかに対するアゴニストとして作用し得る
。この抗体は、本明細書中に開示される比活性を含む生物学的活性に対するアゴ
ニストまたはアンタゴニストとして特定され得る。上記の抗体アゴニストは、当
該分野で公知の方法を使用して作製され得る。例えば、ＷＯ９６／４０２８１；
米国特許第５，８１１，０９７号；Ｄｅｎｇ，Ｂ．ら、（１９９８）Ｂｌｏｏｄ
９２（６）：１９８１−１９８８；Ｃｈｅｎ，Ｚ．ら、（１９９８）Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６８−３６７８；Ｈａｒｒｏｐ，Ｊ．Ａ．ら
、（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６−１７９４；Ｚｈ
ｕ，Ｚ．ら、（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ：５８（１５）：３２０９−３
２１４；Ｙｏｏｎ，Ｄ．Ｙ．ら、（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（７
）：３１７０−３１７９；Ｐｒａｔ，Ｍ．ら、（１９９８）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃ
ｉ．１１１（Ｐｔ２）：２３７−２４７；Ｐｉｔａｒｄ，Ｖ．ら、（１９９７）
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０５（２）：１７７−１９０；Ｌｉａ
ｕｔａｒｄ，Ｊ．ら、（１９９７）Ｃｙｔｏｋｉｎｄｅ ９（４）：２３３−２
４１；Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｎ．Ｇ．ら、（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
７２（１７）：１１２９５−１１３０１；Ｔａｒｙｍａｎ，Ｒ．Ｅ．ら、（１９
９５）Ｎｅｕｒｏｎ １４（４）：７５５−７６２；Ｍｕｌｌｅｒ，Ｙ．Ａ．ら
、（１９９８）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６（９）：１１５３−１１６７；Ｂａｒｔ
ｕｎｅｋ，Ｐ．ら、（１９９６）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ８（１）：１４−２０（上
記の文献は、その全体が参考として援用される）を参照のこと。

【０２５６】 （トランスジェニック） 本発明のポリペプチドはまた、トランスジェニック動物において発現され得る
。任意の種の動物（マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、
マイクロピッグ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ヤギ、ヒツジ、ウシ、および非ヒト霊
長類（例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジー）を含むがこれらに限定されな
い）が、トランスジェニック動物を生成するために使用され得る。特定の実施態
様において、本明細書中に記載された技術、またはさもなくば当該分野で公知の
技術が、遺伝子治療プロトコールの一部として、ヒトにおいて本発明のポリペプ
チドを発現するために使用される。

【０２５７】 当該分野で公知の任意の技術が、導入遺伝子（すなわち、本発明のポリヌクレ
オチド）を動物に導入して、トランスジェニック動物の創始（ｆｏｕｎｄｅｒ）
系統を産生するために使用され得る。このような技術には、以下が含まれるがこ
れらに限定されない：前核マイクロインジェクション（（以下の参考文献の各々
は、本明細書中で参考として援用される）Ｐａｔｅｒｓｏｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：６９１−６９８（１９９４）；
Ｃａｒｖｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１１：１２６３−１２７
０（１９９３）；Ｗｒｉｇｈｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：８
３０−８３４（１９９１）；およびＨｏｐｐｅら、米国特許第４，８７３，１９
１号（１９８９））；生殖系列へのレトロウイルス媒介遺伝子移入（（以下の参
考文献は、本明細書中で参考として援用される）Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：６１４８−６１５
２（１９８５））、胚盤胞または胚；胚性幹細胞への遺伝子ターゲッティング（
（以下の参考文献の各々は、本明細書中で参考として援用される）Ｔｈｏｍｐｓ
ｏｎら、Ｃｅｌｌ ５６：３１３−３２１（１９８９））；細胞または胚のエレ
クトロポレーション（Ｌｏ、１９８３、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８
０３−１８１４（１９８３））；遺伝子銃を用いる本発明のポリヌクレオチドの
導入（（以下の参考文献は、本明細書中で参考として援用される）例えば、Ｕｌ
ｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５（１９９３）を参照のこと））；
胚性多能性幹細胞に核酸構築物を導入することおよび胚盤胞にこの幹細胞を移入
しなおすこと；ならびに精子媒介遺伝子移入（（以下の参考文献は、本明細書中
で参考として援用される）Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ ５７：７１７−７
２３（１９８９））など。このような技術の概説としては、Ｇｏｒｄｏｎ、「Ｔ
ｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ」、Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１
５：１７１−２２９（１９８９）を参照のこと。これは、本明細書中でその全体
が参考として援用される。

【０２５８】 当該分野において公知である任意の技術が、本発明のポリヌクレオチドを含む
トランスジェニッククローンを産生するために使用され得る（例えば、静止期に
誘導される、培養した胚細胞、胎児細胞、または成体細胞由来の核の、除核した
卵母細胞への核移入）（（以下の参考文献の各々は、本明細書中で参考として援
用される）Ｃａｍｐｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３８０：６４−６６（１９９６）
；Ｗｉｌｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３（１９９７））。

【０２５９】 本発明は、動物の細胞の全ての中に導入遺伝子を有するトランスジェニック動
物、ならびに、動物の細胞の全ての中ではないが、いくつかの細胞中に導入遺伝
子を有する動物（すなわち、モザイク動物またはキメラ動物）を提供する。この
導入遺伝子は、単一の導入遺伝子として、またはコンカテマー（例えば、頭−頭
タンデムまたは頭−尾タンデム）のような複数のコピーとして組み込まれ得る。
この導入遺伝子はまた、例えば、Ｌａｓｋｏら（（以下の参考文献は、本明細書
中で参考として援用される）Ｌａｓｋｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３６（１９９２））の教示に従って、特定
の細胞型中に選択的に導入され得るか、または特定の細胞型中で活性化され得る
。このような細胞型特異的な活性化に必要とされる調節配列は、目的の特定の細
胞型に依存し、そして当業者に明らかである。ポリヌクレオチド導入遺伝子が、
内因性遺伝子の染色体部位に組み込まれることが所望される場合、遺伝子ターゲ
ッティングが好ましい。手短には、このような技術が利用される場合、内因性遺
伝子に相同な、いくつかのヌクレオチド配列を含むベクターが、染色体配列との
相同組換えを介する、内因性遺伝子のヌクレオチド配列への組み込み、および内
因性遺伝子のヌクレオチド配列の機能の破壊の目的のために設計される。この導
入遺伝子はまた、特定の細胞型に選択的に導入され得、このようにして、例えば
、Ｇｕら（（以下の参考文献は、本明細書中で参考として援用される）Ｇｕら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：１０３−１０６（１９９４））の教示に従って、その
細胞型においてのみ内因性遺伝子を不活性化する。このような細胞型特異的不活
性化のために必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そして当
業者に明白である。

【０２６０】 一旦トランスジェニック動物が作製されると、組換え遺伝子の発現は標準的な
技術を利用してアッセイされ得る。最初のスクリーニングは、導入遺伝子の組み
込みが起こったことを確認するために動物組織を分析するためのサザンブロット
分析またはＰＣＲ技術によって達成され得る。トランスジェニック動物の組織に
おける導入遺伝子のｍＲＮＡ発現のレベルはまた、その動物から得られた組織サ
ンプルのノーザンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析、な
らびに逆転写酵素ＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）を含むが，これらに限定されない技術
を用いて評価され得る。トランスジェニック遺伝子発現組織のサンプルはまた、
導入遺伝子産物に特異的な抗体を使用して、免疫細胞化学的にまたは免疫組織化
学的に評価され得る。

【０２６１】 一旦創始動物（ｆｏｕｎｄｅｒ ａｎｉｍａｌ）が産生されると、この動物は
交配されるか、同系交配されるか、異系交配されるか、または交雑されて、特定
の動物の群体を生成し得る。このような交配のストラテジーの例は、以下を含む
がこれらに限定されない：分離系統を確立するための、１より多い組み込み部位
を有する創始動物の異系交配；各々の導入遺伝子の相加的な発現の効果のための
、高レベルで導入遺伝子を発現する複合トランスジェニック体（ｃｏｍｐｏｕｎ
ｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）を作製するための分離系統の同系交配；発現を増大
させ、かつＤＮＡ分析による動物のスクリーニングの必要性を排除するために、
ヘテロ接合性トランスジェニック動物を交配して、所定の組み込み部位について
ホモ接合性の動物を産生すること；別個のホモ接合性系統を交配して、複合ヘテ
ロ接合性またはホモ接合性系統を生成すること；および、繁殖して、目的の実験
モデルについて適切である別個のバックグラウンド上に導入遺伝子を配置するこ
と。

【０２６２】 本発明のトランスジェニック動物および「ノックアウト」動物は、以下を含む
が、それらに限定されない用途を有する：ＴＮＦ−γ−αポリペプチドおよび／
またはＴＮＦ−γ−βポリペプチドの生物学的機能を作り出す上で有用な動物モ
デル系、異常なＴＮＦ−γ−α発現および／またはＴＮＦ−γ−β発現に関連す
る状態および／または障害を研究すること；ならびに、このような状態および／
または障害を改善する際に有効な化合物についてスクリーニングすること。

【０２６３】 内因性遺伝子発現もまた、標的化された相同組換えを使用して遺伝子および／
またはそのプロモーターを不活性化あるいは「ノックアウトする」ことによって
減少し得る（（以下の参考文献の各々は、本明細書中で参考として援用される）
例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３１７：２３０−２３４（１９８
５）；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ ５１：５０３−５１２
（１９８７）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ５：３１３−３２１（１９８９
）を参照のこと；これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用され
る）。例えば、変異体である、本発明の非機能的なポリヌクレオチド（すなわち
、完全に関連のないＤＮＡ配列）（これは、内因性ポリヌクレオチド配列（この
遺伝子のコード領域または調節領域のいずれか）と相同性のＤＮＡに隣接される
）を、選択マーカーおよび／またはネガティブ選択マーカーを用いてまたは用い
ずに使用して、インビボで本発明のポリペプチドを発現する細胞をトランスフェ
クトし得る。別の実施態様において、当該分野で公知の技術を、目的の遺伝子を
含むが、発現しない細胞中でノックアウトを作製するために使用する。標的化さ
れた相同性組換えを介した、このＤＮＡ構築物の挿入は、標的化された遺伝子の
不活性化を生じる。このようなアプローチは、胚性幹細胞に対する改変が、不活
性な標的化された遺伝子を有する動物の子孫を作製するために使用され得る、研
究および農業分野に特に適する（（以下の参考文献の各々は、本明細書中で参考
として援用される）例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ １９８７お
よびＴｈｏｍｐｓｏｎ １９８９、前出を参照のこと）。しかし、このアプロー
チは、当業者に明白な適切なウイルスベクターを使用して、組換えＤＮＡ構築物
がインビボで必要とされる部位に直接投与されるか、または標的化される場合、
ヒトにおける使用に慣用的に適合され得る。

【０２６４】 本発明のさらなる実施態様において、本発明のポリペプチドを発現するために
遺伝子操作される細胞、あるいは本発明のポリペプチドを発現しないように遺伝
子操作された細胞（例えば、ノックアウト）は、インビボで患者に投与される。
このような細胞は、患者（すなわち、ヒトを含む動物）またはＭＨＣ適合性ドナ
ーから入手され得、そして線維芽細胞、骨髄細胞、血球（例えば、リンパ球）、
脂肪細胞、筋細胞、内皮細胞などを含み得るが、それらに限定されない。この細
胞を、組換えＤＮＡ技術を使用してインビトロで遺伝子操作して、例えば、形質
導入（ウイルスベクター、および好ましくは細胞ゲノム中に導入遺伝子を組み込
むベクターを使用する）、またはトランスフェクション手順（プラスミド、コス
ミド、ＹＡＣ、裸のＤＮＡ、エレクトロポレーション、リポソームなどの使用を
含むが、これらに限定されない）によって、細胞中に本発明のポリペプチドのコ
ード配列を導入するか、あるいは本発明のポリペプチドに関連するコード配列お
よび／または内因性の調節配列を破壊する。本発明のポリペプチドのコード配列
を、強力な構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターまたはプロモーター
／エンハンサーの制御下に配置し、本発明のポリペプチドの発現および好ましく
は分泌を達成し得る。本発明のポリペプチドを発現、および好ましくは分泌する
操作された細胞を、患者に全身的（例えば、循環中、または腹腔内）に導入し得
る。あるいは、この細胞をマトリックスに組み込み得、そして身体に移植し得る
（例えば、遺伝的に操作した線維芽細胞を皮膚移植片の一部として移植し得る；
遺伝的に操作した内皮細胞をリンパ移植片または脈管移植片の一部として移植し
得る）（（以下の参考文献の各々は、本明細書中で参考として援用される）例え
ば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４９号；およびＭｕｌｌｉ
ｇａｎおよびＷｉｌｓｏｎ、米国特許第５，４６０，９５９号を参照のこと。こ
れらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。

【０２６５】 投与される細胞が非自己または非ＭＨＣ適合性細胞である場合、それらを、こ
の導入細胞に対する宿主免疫応答の発生を阻止する周知の技術を使用して投与し
得る。例えば、この細胞をカプセル型形態で導入し得、この形態は、構成成分の
近接した細胞外環境との交換を可能とするが、導入細胞が宿主免疫系によって認
識されることは可能としない。

【０２６６】 （免疫系関連障害および循環器系関連障害） （診断） 本発明者らは、ＴＮＦ−γが、ヒト臍静脈内皮細胞、誘導された内皮細胞、マ
クロファージ、および黒質組織において発現されることを発見した。多くの免疫
系関連障害および循環器系関連障害について、「標準的な」ＴＮＦ−γ−αおよ
び／またはＴＮＦ−γ−βの遺伝子発現レベル（すなわち、免疫系障害および循
環器系障害を有さない個体由来の免疫系組織および循環器系組織または体液中の
ＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−βの発現レベル）に対して、実質的
に変化した（増加したまたは低下した）レベルのＴＮＦ−γ−αおよび／または
ＴＮＦ−γ−βの遺伝子発現が、このような障害を有する個体から採取された免
疫系組織および循環器系組織もしくは他の細胞、あるいは体液（例えば、血清、
血漿、尿、滑液、または髄液）の中で検出され得る。従って、本発明は、免疫系
障害および循環器系障害の診断の間に有用な診断方法を提供する。この診断は、
個体由来の免疫系組織および循環器系組織もしくは他の細胞あるいは体液におけ
る、ＴＮＦ−γ−αタンパク質および／またはＴＮＦ−γ−βタンパク質をコー
ドする遺伝子の発現レベルを測定し、そして標準的なＴＮＦ−γ−αおよび／ま
たはＴＮＦ−γ−β遺伝子発現レベルと測定された遺伝子発現レベルとを比較し
、それによって標準と比較された遺伝子発現レベルにおける増加または低下が、
免疫系障害および循環器系障害を示すことを含む。

【０２６７】 詳細には、免疫系および循環系の癌を有する哺乳動物において特定組織が、対
応する「標準」レベルと比較した場合、有意に低下したレベルのＴＮＦ−γ−α
タンパク質および／またはＴＮＦ−γ−βタンパク質、ならびにＴＮＦ−γ−α
タンパク質および／またはＴＮＦ−γ−βタンパク質をコードするｍＲＮＡを発
現すると考えられる。さらに、増大したレベルのＴＮＦ−γ−αタンパク質およ
び／またはＴＮＦ−γ−βタンパク質は、この癌を有さない同種の哺乳動物由来
の血清と比較した場合、このような癌を有する哺乳動物有する哺乳動物由来の特
定の体液（例えば、血清、血漿、尿、および髄液）の中で検出され得ると考えら
れる。

【０２６８】 従って、本発明は、これらの系の癌を含む、免疫系障害および循環器系障害の
診断の間に有用である診断方法を提供する。この診断は、個体由来の免疫系組織
および循環器系組織もしくは他の細胞あるいは体液における、ＴＮＦ−γ−αタ
ンパク質および／またはＴＮＦ−γ−βタンパク質をコードする遺伝子の発現レ
ベルを測定し、そして標準的なＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−β遺
伝子発現レベルと測定された遺伝子発現レベルとを比較し、それによって標準と
比較された遺伝子発現レベルにおける増加または低下が免疫系障害および循環器
系障害を示すことを含む。

【０２６９】 免疫系および循環器系における障害の診断（腫瘍の診断を含む）が、従来の方
法に従って既になされている場合、本発明は、予後の指標として有用であり、そ
れによって抑制されたＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−β遺伝子発現
を示す患者は、標準レベルに近いレベルでこの遺伝子を発現する患者に比べ、よ
り悪い臨床結果を被る。

【０２７０】 「ＴＮＦ−γ−α−および／またはＴＮＦ−γ−βタンパク質をコードする遺
伝子の発現レベルをアッセイする」とは、第一の生物学的サンプル中のＴＮＦ−
γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−βタンパク質のレベルあるいはＴＮＦ−γ−
βタンパク質および／またはＴＮＦ−γ−βタンパク質をコードするｍＲＮＡの
レベルを、直接的に（例えば、絶対的なタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベル
を決定または概算することにより）または相対的に（例えば、第２の生物学的サ
ンプル中のＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−βのタンパク質レベルま
たはｍＲＮＡレベルに対して比較することにより）、定性的または定量的に測定
または概算することを意図する。好ましくは、第一の生物学的サンプル中のＴＮ
Ｆ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−βのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレ
ベルが測定または概算され、標準的なＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ
−βタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルに対して比較される。この標準は、
障害を有しない個体から得られた第二の生物学的サンプルから採取されるか、ま
たは免疫系および循環系の障害を有しない個体の集団からのレベルを平均するこ
とにより決定される。当該分野で理解されるように、標準的ＴＮＦ−γ−αおよ
び／またはＴＮＦ−γ−βのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルが一旦分か
れば、それは、比較のための標準として繰り返し用いられ得る。

【０２７１】 「生物学的サンプル」とは、個体から得られる任意の生物学的サンプル、体液
、細胞株、組織培養物、またはＴＮＦ−γ−αおよび／もしくはＴＮＦ−γ−β
タンパク質もしくはｍＲＮＡを含む他の供給源が意図される。示されるように、
生物学的サンプルは、遊離ＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−βタンパ
ク質、を含む体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液、および髄液）、免疫系組織
もしくは循環系組織、ならびに完全もしくは成熟したＴＮＦ−γ−αおよび／も
しくはＴＮＦ−γ−βまたはＴＮＦ−γ−αおよび／もしくはＴＮＦ−γ−βレ
セプターを発現することが見出された他の組織供給源を包含する。哺乳動物から
組織生検および体液を得るための方法は、当該分野で周知である。生物学的サン
プルはｍＲＮＡを含むことが意図される場合、組織生検が好ましい供給源である
。

【０２７２】 全細胞ＲＮＡは、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（Ａｎａｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９（１９８７））により記載される一段階
グアニジウム−チオシアネート−フェノール−クロロホルム方法のような任意の
標準的な技術を用いて生物学的サンプルから単離され得る。次いで、ＴＮＦ−γ
−αおよび／またはＴＮＦ−γ−βタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルが
、任意の適切な方法を用いてアッセイされる。これらは、ノーザンブロット分析
、Ｓ１ヌクレアーゼマッピング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメラー
ゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応と組み合
わせた逆転写（ＲＴ−ＬＣＲ）を包含する。

【０２７３】 生物学的サンプル中のＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−βタンパク
質レベルをアッセイすることは、抗体に基づく技術を用いて生じ得る。例えば、
組織におけるＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−βタンパク質発現は、
古典的な免疫組織学的方法（Ｊａｌｋａｎｅｎ、Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ、Ｍ．ら、Ｊ．Ｃ
ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７））を用いて研究さ
れ得る。ＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−βタンパク質遺伝子発現を
検出するために有用な他の抗体に基づく方法は、免疫アッセイ（例えば、酵素結
合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）および放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ））を包含する
。適切な抗体アッセイ標識は、当該分野で公知であり、そして酵素レベル（例え
ば、グルコースオキシダーゼ）および放射性同位元素（例えば、ヨウ素（¹²⁵Ｉ
、¹²¹Ｉ）、炭素（¹⁴Ｃ）、硫黄（³⁵Ｓ）、トリチウム（³Ｈ）、インジウム（^{11 2} Ｉｎ）、およびテクネチウム（^99mＴｃ）、および蛍光標識（例えば、フルオレ
セインおよびローダミン）、およびビオチンを包含する。

【０２７４】 個体から得られた生物学的サンプル中のＴＮＦ−γ−αおよび／もしくはＴＮ
Ｆ−γ−βタンパク質レベルをアッセイすることに加えて、ＴＮＦ−γ−αおよ
び／もしくはＴＮＦ−γ−βタンパク質もまた、イメージングによってインビボ
で検出され得る。ＴＮＦ−γ−αおよび／もしくはＴＮＦ−γ−βタンパク質を
インビボでイメージングするための抗体レベルまたはマーカーは、Ｘ線撮影、Ｎ
ＭＲもしくはＥＳＲにより検出可能なものを包含する。Ｘ線撮影のために、適切
な標識としては、検出可能な放射線を放射するが、被験体に対して有害でない放
射線同位元素（例えば、バリウムまたはセシウム）が挙げられる。ＮＭＲおよび
ＥＳＲのための適切なマーカーは、検出可能な特徴的なスピンを有するマーカー
（例えば、重水素）を包含し、これらは、関連のハイブリドーマについて栄養素
の標識化により抗体に取り込まれ得る。

【０２７５】 適切な検出可能イメージング部分（例えば、放射性同位元素（例えば、¹³¹Ｉ
、¹¹²Ｉｎ、^99mＴｃ）、放射線不透過性物質、または核磁気共鳴により検出可能
な材料）で標識されたＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−βの抗体また
は抗体フラグメントが、免疫系障害について試験されるべき哺乳動物に（例えば
、非経口で、皮下で、もしくは腹腔内で）導入される。被験体およびイメージン
グシステムの大きさが、診断画像を生じるのに必要とされるイメージング部分の
量を決定することは、当該分野で理解される。放射線同位元素部分の場合、ヒト
被験体については、注入される放射能の量は、通常、約５〜２０ミリキュリーの ^99m Ｔｃの範囲であり得る。標識された抗体または抗体フラグメントは、次いで
、ＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−βタンパク質を含む細胞の位置に
優先的に蓄積する。インビボ腫瘍イメージングは、Ｂｕｒｃｈｉｅｌおよび共同
研究者により記載される（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ： Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、Ｂｕｒｃｈｉｅ
ｌ、Ｓ．Ｗ．およびＲｈｏｄｅｓ、Ｂ．Ａ．編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈ
ｉｎｇｔ Ｉｎｃ．（１９８２）の１３章）。

【０２７６】 （処置） 上述のように、ＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−βのポリヌクレオ
チドおよびポリペプチドは、ＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−β活性
の異常に高いまたは低い発現を包含する状態の診断のために有用である。ＴＮＦ
−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−βがＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ
−γ−βにより調節された活性と同程度に発現される細胞および組織が与えられ
ると、標準的または「正常な」レベルに比較された個体におけるＴＮＦ−γ−α
および／またはＴＮＦ−γ−βの実質的に変化した（増加または低下した）発現
レベルは、ＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−βが発現されるか、なら
びに／あるいは活性である体系に関連した病理学的状態を生じる。

【０２７７】 特定の細胞機能に加えて、細胞レセプター分子もまた、しばしば、可能な宿主
細胞への進入を開始する手段としてのウイルスにより開発され得ることもまた、
当該分野で周知である。例えば、細胞ケモカインレセプターＣＣＲ５は、細胞ケ
モカインレセプターとしてのみならず、マクロファージ向性ヒト免疫不全ウイル
ス（ＨＩＶ）−１のレセプターとしても機能することが、Ｗｕおよび共同研究者
ら（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１６８１−１６９１（１９９７））により近
年発見された。さらに、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１ａ、およびＭＩＴ−１ｂ（こ
れらは、細胞ケモカインレセプターＣＣＲのアゴニストである）は、感受性細胞
株への種々の株のＨＩＶ−１の侵入を阻害する（Ｃｏｃｃｈｉ，Ｆ．ら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２７０：１８１１−１８１５（１９９５））。従って、本発明はまた
、ＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−βレセプターとのウイルス粒子の
相互作用をブロックまたは破壊するために、そして結果としてウイルス感染の開
始もしくは継続をブロックするために、ＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−
γ−βの予防または治療的投与によって、ウイルスに曝露されたまたはウイルス
に感染した個体を処置する方法を提供する。

【０２７８】 本発明のＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−βは、ＴＮＦ−γ−αお
よび／またはＴＮＦ−γ−βレセプターに結合し、そして、そのこと自体で、免
疫向性および内皮細胞向性ウイルス感染をブロックすると思われる。本発明をコ
ードするｃＤＮＡの発現パターンは、この分子が、内皮細胞において主に発現さ
れ、そして造血組織を選択することを示唆する。一緒に考慮された場合、これら
の所見は、ＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−βのアゴニストおよびア
ンタゴニスト（レセプターを包含する）は、免疫向性ウイルス感染の感染性をブ
ロックするかまたはそうでなければ調節する方法として有用であり得ることを示
唆する。ヒトに感染し、そして造血系の細胞に感染し得るウイルスの非限定的な
例は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ヒトＴ細胞リンパ向性（ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐ
ｉｃ）ウイルス（ＨＴＬＶ）−Ｉ、およびＨＴＬＶ−ＩＩ、ならびに他のＤＮＡ
およびＲＮＡウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）−１、ＨＳＶ
−２、ＨＳＶ−６、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバールウイ
ルス（ＥＢＶ）、リスザルヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓａｍｉｒｉｉ）
、アデノウイルス、ライノウイルス、インフルエンザウイルス、レオウイルスな
どを包含する。

【０２７９】 本発明のＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−β、またはそれらのアゴ
ニストもしくはアンタゴニストが、ウイルス感染を予防的もしくは治療的にブロ
ックする能力は、当業者によって容易に試験され得る。例えば、Ｓｉｍｍｏｎｓ
および共同研究者ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：２７６−２７９（１９９７））
、およびＡｒｅｎｚａｎａ−Ｓｅｉｓｄｅｄｏｓおよび共同研究者ら（Ｎａｔｕ
ｒｅ ３８３：４００（１９９６））は各々、培養末梢血単核細胞において、Ｃ
ＣＲ５ケモカインレセプターのアンタゴニストおよびＣＣケモカインＲＡＮＴＥ
ＳのアンタゴニストのそれぞれによるＨＩＶ−１感染の抑制を観察する方法を概
説する。上述の両場合において、細胞は培養され、そしてウイルスであるＨＩＶ
−１に感染される。その直後に、ＣＣケモカインまたはそのレセプターのアゴニ
ストまたはアンタゴニストが培養培地に添加される。ケモカインまたは細胞レセ
プターのアゴニストまたはアンタゴニストの能力の証拠は、感染後３、６、９日
目のウイルス感染の相対的な成功を評価することにより決定される。

【０２８０】 本発明の単離されたＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−β、あるいは
それらのアゴニストまたはアンタゴニストの量を含む薬学的組成物の、ウイルス
に感染したかまたはウイルス感染の危険性のある個体への投与は、以下に記載の
ように実施される。

【０２８１】 本発明はまた、哺乳動物（好ましくは、ヒト）における種々の免疫系関連障害
および循環系関連障害の診断または処置のために有用である。このような障害は
、腫瘍（ヒト腫瘍の完全でない列挙には、乳癌、結腸癌、心臓腫瘍、膵臓癌、黒
色種、網膜芽腫、神経膠芽腫、肺癌、腸癌、精巣癌、胃癌、神経芽腫、粘液腫、
筋腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、腺腫などが含まれる）およ
び腫瘍転移、細菌、ウイルスもしくは他の寄生生物による感染、免疫不全、炎症
性疾患、リンパ節症、自己免疫疾患、対宿主性移植片病、ならびに免疫系および
循環系細胞機能の任意の機能障害（ｄｉｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）（自己免疫、
関節炎、白血病、リンパ腫、免疫抑制、免疫、体液性免疫、炎症性腸疾患、骨髄
抑制などを包含するが、これらに限定されない）を包含する。

【０２８２】 ＴＮＦ−γは、細胞ＮＦ−ｋＢおよびｃ−ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）
の活性化を誘導することが示されているので、それはまた、このような細胞性お
よび免疫性全身障害（例えば、腫瘍および腫瘍転移、細菌、ウイルスもしくは他
の寄生生物による感染、免疫不全、炎症性疾患、リンパ節症、自己免疫疾患、対
宿主性移植片病、ならびに免疫系および循環系細胞機能の任意の機能障害（ｄｉ
ｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）（自己免疫、関節炎、白血病、リンパ腫、免疫抑制、
炎症性腸疾患、骨髄抑制、および関連続発症）を治療的に調節することにおいて
有用である。

【０２８３】 ＴＮＦ−γ−αおよびＴＮＦ−γ−βがＴＮＦスーパーファミリーに属するの
で、それらはまた、新脈管形成を調節する。さらに、ＴＮＦ−γ−αおよび／ま
たはＴＮＦ−γ−βは、免疫細胞機能を阻害するので、広範な抗炎症活性を有す
る。ＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−βは、宿主防御細胞（例えば、
細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージ）の侵入および活性化を刺激することに
より、および腫瘍の新脈管形成を阻害することにより固形腫瘍を処置するための
抗血管新生剤として使用され得る。当業者は、血管増殖が望まれない他の非癌指
標を認識する。当業者はまた、耐性の慢性および急性感染に対する宿主防御（例
えば、殺菌性白血球の誘引および活性化を介する筋細菌（ｍｙｏｂａｃｔｅｒｉ
ａｌ）感染に対する宿主防御を増強するために使用され得る。ＴＮＦ−γ−αお
よび／またはＴＮＦ−γ−βは、Ｔ細胞媒介自己免疫疾患およびリンパ球白血病
の処置のためにＩＬ−２生合成の阻害によりＴ細胞増殖を阻害するために使用さ
れ得る。ＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−βはまた、細胞破片を除去
する炎症細胞および結合組織を促進する炎症細胞の両方の補充を介して、創傷治
癒を刺激するために用いられ得る。この同じ様式で、ＴＮＦ−γ−αおよび／ま
たはＴＮＦ−γ−βはまた、他の線維症障害（肝硬変、変形性関節症、および肺
線維症を含む）を処置するために使用され得る。ＴＮＦ−γ−αおよび／または
ＴＮＦ−γ−βはまた、住血吸虫症、旋毛虫症、および回虫症におけるような、
組織を浸潤する寄生生物の幼虫を殺傷する特有の機能を有する好酸球の存在を増
大させる。ＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−βはまた、種々の造血前
駆細胞の活性化および分化を調節することにより（例えば、化学療法後に骨髄か
ら成熟白血球を放出させるため、すなわち、幹細胞動員において）、造血を調節
するために使用され得る。ＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−βはまた
、敗血症を処置するために使用され得る。

【０２８４】 同様の様式で、ＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−βは、慢性関節リ
ウマチ（ＲＡ）でしばしば観察されるように、骨および軟骨における浸潤するパ
ンヌスを持続するために必要とされる、新脈管形成の増加または内皮細胞増殖の
増加を阻害することによってＲＡを処置するために使用され得る。内皮細胞増殖
は、変形性関節症（ＯＡ）を有する患者または非罹患個体に比較して、ＲＡ患者
の滑液中で増加される。新生血管形成は、骨および軟骨への浸潤パンヌスの量の
増加を維持するために必要とされる。新脈管形成の阻害は、動物モデルにおける
早期および慢性の関節炎の両方の重症度の有意な減少に関連する。

【０２８５】 本発明のＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−βタンパク質は、ＴＮＦ
ファミリーのメンバーであるので、このタンパク質の成熟分泌型が、タンパク質
分解切断によってＴＮＦ−γを発現する細胞から、可溶性形態で放出され得るこ
ともまた、当業者に理解される。従って、ＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ
−γ−βの成熟形態または可溶性細胞外ドメインは、外因性供給源から個体の細
胞、組織、または身体へ添加される場合、タンパク質は、その個体のその標的細
胞にその生理学的活性を及ぼす。また、このＩＩ型膜貫通タンパク質を発現する
細胞は、個体の細胞、組織、または身体へ添加され得、そしてこれらの添加され
た細胞は、ＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−βのレセプターを発現す
る細胞に結合し、それにより、ＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−βを
発現する細胞は、レセプターが保有する標的細胞上に作用（例えば、内皮細胞増
殖および調節の調節）を引き起こし得る。

【０２８６】 従って、個体におけるＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−β活性の標
準的または正常レベルの減少により引き起こされる状態（特に、免疫系および循
環系の障害）は、ＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−βポリペプチド（
成熟タンパク質の形態）の投与により処置され得る。従って、本発明はまた、Ｔ
ＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−β活性のレベルの増大を必要とする個
体の処置の方法であって、本発明の単離されたＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴ
ＮＦ−γ−βポリペプチド、特に、本発明のＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮ
Ｆ−γ−βの成熟形態を、このような個体においてＴＮＦ−γ−αおよび／また
はＴＮＦ−γ−β活性レベルを増大させるのに有効な量で含む薬学的組成物を、
このような個体に投与する工程を包含する、方法を提供する。

【０２８７】 本発明のＴＮＦ−γ−αおよび／またはＴＮＦ−γ−βポリペプチドは、腫瘍
細胞増殖または新形成を阻害するために使用され得る。ＴＮＦ−γ−αおよび／
またはＴＮＦ−γ−βポリペプチドは、膜小胞形成（ｚｅｉｏｓｉｓ）、細胞質
の濃縮、および内因性エンドヌクレアーゼの活性化により特徴付けられるアポト
ーシスによる腫瘍破壊を担い得る（図１２）。表１に示されるように、ＴＮＦ−
γは、異常な細胞増殖および調節を有する試験される細胞株（例えば、線維肉腫
細胞株および癌腫細胞株）について、強い細胞傷害性活性を有する。これはまた
、図７Ａ、７Ｂ、および８中で例示される。ここでは、ＴＮＦ−γが、Ｌ９２９
およびＷＥＨＩ １６４細胞の増殖を細胞傷害性活性によって阻害する能力を有
することが示されている。ＷＥＨＩ １６４細胞は、マウス線維肉腫細胞である
。ＴＮＦ−γを投与する好ましい方法は、腫瘍への直接の注入によることである
。

【０２８８】 ＴＮＦ−γの細胞接着活性は、創傷治癒のために使用され得る。表１および図
９において示されるように、ＴＮＦ−γは、ＴＮＦ−γが創傷治癒において役割
を果たすことの指標である、強い内皮細胞増殖効果を有する。ＴＮＦ−γの細胞
接着効果もまた、創傷治癒において役割を果たす。

【０２８９】 ＴＮＦ−γはまた、増殖促進活性を必要とする疾患（例えば、再狭窄）を処置
するために使用され得る。上述したように、ＴＮＦ−γは、内皮細胞増殖に対し
て強い増殖効果を有することが示される。従って、ＴＮＦ−γはまた、造血およ
び内皮細胞発達を調節するために使用され得る。

【０２９０】 ＴＮＦ−γポリペプチドは、Ｔ細胞の活性化を刺激する能力によって、免疫応
答の重要な媒介因子である。従って、このポリペプチドは、種々の寄生生物感染
、細菌感染、およびウイルス感染に対する免疫応答を刺激するために使用され得
る。ＴＮＦ−γは、ウイルス感染細胞を溶解し得、そして従って、ＨＩＶ感染細
胞を阻止するために使用され得る。

【０２９１】 ＴＮＦ−γポリペプチドはまた、Ｔ細胞増殖応答を増強することにより、自己
免疫疾患（例えば、Ｉ型糖尿病）を処置するために使用され得る。

【０２９２】

【表２】

【０２９３】 ＴＮＦ−γは、内皮細胞（例えば、大動脈内皮細胞）の増殖を阻害するために
使用され得る。図１０において例示されるように、１０μｇ／ｍｌまでの濃度で
は、ＴＮＦ−γは、ヒト乳癌細胞の増殖に対して見かけ上、効果を有さないが、
内皮細胞の増殖をほぼ完全に阻害し得る。結果として、ＴＮＦ−γは、内皮細胞
増殖の阻害が有利である疾患および障害を処置するために使用され得る。内皮細
胞の増殖の阻害は、腫瘍の増殖を支持するための新規な血管の生成に依存する多
くのタイプの癌の処置において所望であり得る。ＴＮＦ−γは、血管の主要細胞
成分である内皮細胞の増殖を阻害することによってこのような腫瘍の増殖を阻害
するために使用され得る。ＴＮＦ−γがこの様式で有効に使用される能力の証拠
は、図１６Ａおよび１６Ｂに示される。これらの実験は、以下により詳細に議論
される。

【０２９４】 特に、ＴＮＦ−γが、内皮細胞がすでに増殖し始めた場合の内皮細胞増殖を調
節するために使用され得る。このような状況は、新脈管形成が、上記のように腫
瘍支持機構として存在する場合、生じ得る。内因性ＴＮＦ−γ発現が、内皮細胞
の培養物の増殖では減少するので、内因性ＴＮＦ−γの発現が静止内皮細胞培養
物では増強される（図４）。結果として、例えば、癌状態の腫瘍の大きさの増大
の間に、本発明のＴＮＦ−γを使用して、増殖性内皮細胞の培養における細胞増
殖の速度を低下させることが好ましいことであり得る。

【０２９５】 本発明のＴＮＦ−γは、インビトロで内皮細胞により形成された毛管様管構造
物の形成を低減させるために使用されている。図１４に示されるように、本発明
のＴＮＦ−γは、ＦＧＦ−２のような血管形成因子に応じて毛管様管構造物に組
織化された内皮細胞の形成を阻害するために使用され得る。さらに、本発明の単
離されたＴＮＦ−γもまた、図１５に示されるように、改変されたニワトリ胚絨
毛尿膜（ＣＡＭ）における毛細血管への内皮細胞の増殖および編成を阻害するた
めに使用される。結果として、本発明ＴＮＦ−γは、インビトロで内皮細胞から
毛細管または毛管様構造物の形成を阻害するために使用され得る。

【０２９６】 本発明のＴＮＦ−γは、抗癌剤として使用され得る。図１６に示されるように
、ＴＮＦ−γは、異種移植片腫瘍モデルにおけるヒト乳癌細胞の増殖を阻害する
ために使用される。これらの細胞の高い腫瘍原性に関わらず、本発明のＴＮＦ−
γでの処置は、異種移植片腫瘍の増殖の顕著な阻害を生じた。本発明のＴＮＦ−
γまたはそれらの変異タンパク質は、多数の癌（乳癌、結腸癌、心臓腫瘍、膵臓
癌、黒色腫、網膜芽腫、神経膠芽腫、肺癌、腸癌、精巣癌、胃癌、神経芽腫、粘
液腫、筋腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、腺腫などを含むが、
これらに限定されない）を処置するために使用され得る。

【０２９７】 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ヒト疾患の処置および診断
の発見のための研究試薬および材料として使用され得る。

【０２９８】 本発明は、ＴＮＦ−γのためのレセプターの同定のための方法を提供する。レ
セプターをコードする遺伝子は、当業者に公知の多数の方法（例えば、リガンド
パンニングおよびＦＡＣＳ選別）によって同定され得る（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ．，１（２）、第５章、
（１９９１））。好ましくは、発現クローニングは、ポリアデニル化ＲＮＡがＴ
ＮＦ−γに応答性である細胞から調製され、このＲＮＡから作製されるｃＤＮＡ
ライブラリーがプールに分割され、そしてＴＮＦ−γに応答しないＣＯＳ細胞ま
たは他の細胞をトランスフェクトするために使用される。スライドガラス上で増
殖したトランスフェクト細胞が、標識化ＴＮＦ−γに曝露される。ＴＮＦ−γ細
胞は、ヨード化または部位特異的タンパク質キナーゼのための認識部位の含有を
含む、種々の手段によって標識され得る。固定化およびインキュベーション後、
スライドは、オートラジオグラフィー分析に供される。陽性のプールが同定され
、そしてサブプールが調製され、そして繰り返しサブプーリングおよび再スクリ
ーニングプロセスを用いて再トランスフェクトされ得、最終的に、推定レセプタ
ーをコードする単一クローンを生じる。

【０２９９】 レセプター同定のための代替のアプローチとして、標識化ＴＮＦ−γは、レセ
プター分子を発現する細胞膜または抽出調製物と光親和性結合され得る。架橋材
料は、ＰＡＧＥによって分離され、そしてＸ線フィルムに露出される。ＴＮＦ−
γレセプターを含有する標識化複合体が切り出され得、ペプチドフラグメントに
分解され得、そしてタンパク質微小配列決定に供され得る。微小配列決定から得
られるアミノ酸は、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するためにｃＤＮ
Ａライブラリーをスクリーニングするための１セットの縮重オリゴヌクレオチド
プローブを設計するために使用され得る。

【０３００】 ＴＮＦ−γは、２つの可溶性ＴＮＦレセプター（ｓＴＮＦ−ＲＩ（ｐ５５）お
よびｓＴＮＦ−ＲＩＩ（ｐ７５））に有意に結合しない。従って、ＴＮＦ−γは
、公知のＴＮＦタンパク質を包括し、そしてこれにさらなる活性を有し得る（図
１３を参照のこと）。

【０３０１】 （処方） ＴＮＦ−γポリペプチド組成物は処方され、そして個々の患者の臨床状態（特
に、ＴＮＦ−γポリペプチド単独での処置の副作用）、ＴＮＦ−γポリペプチド
組成物の送達部位、投与の方法、投与のスケジューリング、および実施者に公知
の他の要因を考慮して、良好な医療規則と一致した様式で投薬され得る。本明細
書中の目的のためのＴＮＦ−γポリペプチドの「有効量」は、このような考慮に
よって決定される。

【０３０２】 アンタゴニストは、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、本明細書中これ以
降に記載のような）を有する組成物中で使用され得る。

【０３０３】 本発明のＴＮＦ−γポリペプチドおよびアゴニストおよびアンタゴニストは、
適切な薬学的キャリアと組み合わせて使用され得る。このような組成物は、治療
有効量の化合物、および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。この
ようなキャリアは、生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノー
ル、およびそれらの組み合わせを包含するが、これらに限定されない。この処方
は、投与様式に適合すべきである。

【０３０４】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の成分の１つ以上が充填された１つ以上
の容器を含む製薬パック（ｐａｃｋ）またはキットを提供する。このような容器
と共に、薬剤または生物学的製品の製造、使用または販売を管理する政府機関に
より規定される様式の注意書が付属し得る。このような注意書は、ヒトへの投与
についての製造、使用、または販売の機関による認可を反映している。さらに、
本発明の薬学的組成物は、他の治療学的化合物と共に用いられ得る。

【０３０５】 薬学的組成物は、局所、静脈内、腹腔内、筋内、皮下、鼻内、または皮内経路
によってのような便宜上の様式で投与され得る。薬学的組成物は、特定の徴候の
処置および／または予防に有効である量で投与される。一般に、それらは、少な
くとも約１０ ｇ／ｋｇ体重の量で投与され、そしてほとんどの場合、それらは
、一日当たり約８ｍｇ／ｋｇ体重を超えない量で投与される。ほとんどの場合、
投薬量は、投与経路、徴候などを考慮して、１日当たり約１０ ｇ／ｋｇから約
１ｍｇ／ｋｇ体重である。

【０３０６】 （遺伝子治療） ＴＮＦ−γポリペプチドならびにポリペプチドであるアゴニストおよびアンタ
ゴニストはまた、そのようなポリペプチドのインビボでの発現によって、本発明
に従って使用され得る。これは、しばしば「遺伝子治療」として呼ばれる。

【０３０７】 従って、例えば、患者由来の細胞は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を用いてエキソビボで操作され得る。その操作され
た細胞は次いで、そのポリペプチドで処置されるべき患者に提供される。そのよ
うな方法は、当該分野において周知であり、そして本明細書中の教示から明らか
である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレト
ロウイルス粒子の使用により操作され得る。

【０３０８】 同様に、細胞は、例えば当該分野で公知の手順によって、インビボでのポリペ
プチドの発現のために、インビボで操作され得る。例えば、本発明のポリペプチ
ドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を産生するための産生細胞は、
インビボでの細胞の操作およびそのポリペプチドのインビボでの発現のために患
者に投与され得る。そのような方法による、本発明のポリペプチドを投与するた
めのこれらおよび他の方法は、本発明の教示から当業者に明らかであるべきであ
る。例えば、細胞操作のための発現ビヒクルは、レトロウイルス、例えば、適切
な送達ビヒクルと組み合せた後インビボで細胞を操作するために使用され得るア
デノウイルス以外であり得る。

【０３０９】 本明細書中で上述したレトロウイルスプラスミドベクターが由来し得るレトロ
ウイルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、レトロ
ウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）、ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白
血症ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイ
ルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスが挙げられるが、これらに
限定されない。１つの実施態様において、レトロウイルスプラスミドベクターは
、モロニーマウス白血病ウイルス由来である。

【０３１０】 このベクターは、１つ以上のプロモーターを含む。使用され得る適切なプロモ
ーターとしては、レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびＭｉｌ
ｌｅｒおよび同僚（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０−９９０（１９８
９））により記載されるヒトサイトメガウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、また
は任意の他のプロモーター（例えば、ヒストンプロモーター、ｐｏｌＩＩＩプロ
モーター、およびｂ−アクチンプロモーターを含むがこれらに限定されない真核
生物細胞プロモーターのような細胞性プロモーター）が、挙げられるがこれらに
限定されない。使用され得る他のウイルスプロモーターとしては、アデノウイル
スプロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、およびＢ１９パルボ
ウイルスプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。適切なプロモー
ターの選択は、本明細書に含まれる教示から当業者に理解される。

【０３１１】 本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、適切なプロモーターの制御下
である。使用され得る適切なプロモーターとしては、アデノウイルス主要後期プ
ロモーターのようなアデノウイルスプロモーター；またはサイトメガウイルス（
ＣＭＶ）プロモーターのような異種プロモーター；ＲＳウイルス（ＲＳＶ）プロ
モーター；ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーターのような誘導性
プロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩ
プロモーター；ヒトグロビンプロモーター；単純ヘルペスチミジンキナーゼプロ
モーターのようなウイルスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴ
Ｒ（本明細書中で上記の改変されたレトロウイルスＬＴＲを含む）；ｂ−アクチ
ンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモーターが挙げられるがこれらに
限定されない。このプロモーターはまた、このポリペプチドをコードする遺伝子
を制御する天然のプロモーターであり得る。

【０３１２】 レトロウイルスプラスミドベクターを使用して、パッケージング細胞株を形質
導入し産生細胞株を形成する。トランスフェクトされ得るパッケージング細胞の
例としては、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ｂ−２、ｂ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−
１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＣＲＥ、ｂ−ＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、Ｇ
Ｐ＋ｅｎｖＡｍ１２、およびＤＡＮ細胞株（Ｍｉｌｌｅｒ（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎ
ｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５〜１４（１９９０）により記載される、これはその
全体において参考として本明細書中で援用される）が挙げられるがこれらに限定
されない。このベクターは、当該分野において公知の任意の手段によりパッケー
ジング細胞に形質導入し得る。そのような手段には、エレクトロポレーション、
リポソームの使用、およびＣａＰＯ₄沈殿が含まれるが、これらに限定されない
。代替的には、レトロウイルスプラスミドベクターは、リポソーム中にカプセル
化され得るかまたは脂質に結合され得、次いで宿主に投与される。

【０３１３】 この産生細胞株は、このポリペプチドをコードする核酸配列を含む感染性レト
ロウイルスベクター粒子を産生する。次いで、そのようなレトロウイルスベクタ
ー粒子は、インビトロまたはインビボのいずれかで真核生物細胞に形質導入する
ために使用され得る。形質導入された真核生物細胞は、このポリペプチドをコー
ドする核酸配列を発現する。形質導入され得る真核生物細胞としては、胚幹細胞
、胚癌腫細胞、および造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサ
イト、内皮細胞、および気管支上皮細胞が挙げられるがこれらに限定されない。

【０３１４】 （アゴニストおよびアンタゴニスト−アッセイおよび分子） 本発明はまた、ＴＮＦ−γを模倣する（アゴニスト）か、またはＴＮＦ−γの
影響を妨げる（アンタゴニスト）化合物を同定するための、化合物のスクリーニ
ング方法に関する。そのような方法の例は、ＴＮＦ−γが同時分裂促進因子（ｃ
ｏｍｉｔｏｇｅｎ）Ｃｏｎ Ａの存在下でヒト内皮細胞の増殖を有意に刺激する
能力を利用する。内皮細胞が得られ、そして２ｇ／ｍｌのＣｏｎ−Ａ（Ｃａｌｂ
ｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）の存在下で、９６ウェル平底培養プレ
ート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）中の、１０％熱不活性化胎仔
ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｓ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、１％Ｌ−グルタミ
ン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．１％
ゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎ
ｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を補充したＲＰＭＩ １６４０中で培養される。Ｃｏ
ｎ−Ａおよびスクリーニングされる化合物が、最終容量０．２ｍｌまで添加され
る。３７℃にて６０時間後、培養物は、［³Ｈ］チミジン（５ Ｃｉ／ｍｍｏｌ
；１ Ｃｉ＝３７ＢＧｑ；ＮＥＮ）の１ Ｃｉを用いて１２〜１８時間パルスさ
れ、そしてガラス繊維フィルター上に採集される（ＰｈＤ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡ）。三連の培養物の平均［ ³ Ｈ］チミジン取り込み（ｃｐｍ）は、液体シンチレーションカウンター（Ｂｅ
ｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を用いて決定され
る。有意な［³Ｈ］−チミジン取り込みは、内皮細胞増殖の刺激を示す。

【０３１５】 あるいは、ＴＮＦ−γおよびレセプターの相互作用後の公知のセカンドメッセ
ンジャー系の応答が測定され、そして化合物の存在または非存在において比較さ
れる。そのようなセカンドメッセンジャー系としては、ｃＡＭＰグアニル酸シク
ラーゼ、イオンチャンネルまたはホスホイノシチド加水分解が挙げられるが、こ
れらに限定されない。

【０３１６】 アンタゴニストについてアッセイするために、上記のアッセイが実施されるが
、このアッセイにおいて、ＴＮＦ−γは、スクリーニングされる化合物とともに
添加され、そしてその化合物がＴＮＦ−γの存在下で［³Ｈ］チミジンの取り込
みを阻害する能力は、その化合物がＴＮＦ−γに対するアンタゴニストであるこ
とを示す。あるいは、ＴＮＦ−γアンタゴニストは、競合阻害アッセイに適切な
条件下で膜結合ＴＮＦ−γレセプターまたは組換えレセプターと、ＴＮＦ−γお
よび潜在的アンタゴニストを組合わせることによって検出され得る。ＴＮＦ−γ
は、例えば放射能により標識され得、その結果レセプターに結合されたＴＮＦ−
γ分子の数が、潜在的アンタゴニストの有効性を決定し得る。

【０３１７】 あるいは、ＴＮＦ−γレセプターを発現する哺乳動物細胞または膜調製物は、
この化合物の存在下で標識化ＴＮＦ−γとインキュベートされる。次いで、この
化合物がこの相互作用を増強または阻害する能力が、測定され得る。

【０３１８】 この実施態様の別の局面において、本発明は、レセプタータンパク質、または
ＴＮＦ−γポリペプチドに特異的に結合する他のリガンド結合タンパク質（例え
ば、ＤＲ３）を同定するための方法を提供する。例えば、細胞区画（例えば、膜
またはそれらの調製物）は、ＴＮＦ−γを結合する分子を発現する細胞から調製
され得る。この調製物は、標識化ＴＮＦ−γとともにインキュベートされ、そし
てレセプターまたは他の結合タンパク質に結合したＴＮＦ−γの複合体が、そし
て当該分野で公知の慣用的方法に従って単離され、そして特徴付けされる。ある
いは、ＴＮＦ−γポリペプチドは、固体支持体に結合され得、その結果、細胞か
ら可溶化した結合分子がカラムに結合し、次いで溶出し、そして慣用的方法に従
って、特徴付ける。

【０３１９】 アゴニストまたはアンタゴニストについての本発明のアッセイにおいて、細胞
区画（例えば、膜またはその調製物）が、ＴＮＦ−γを結合する分子（例えば、
ＴＮＦ−γによって調節されるシグナル伝達経路または調節経路の分子）を発現
する細胞から調製され得る。この調製物は、ＴＮＦ−γアゴニストもしくはアン
タゴニストであり得る候補分子の非存在または存在下で標識化ＴＮＦ−γと共に
インキュベートされる。候補分子が結合分子を結合する能力は、標識化リガンド
の結合の減少に反映される。余計に、すなわちＴＮＦ−γ結合分子の結合に対す
るＴＮＦ−γの影響を誘導することなく結合する分子は、良好なアンタゴニスト
であるようである。良く結合し、かつＴＮＦ−γと同じかまたは密接に関連する
効果を誘発する分子は、アゴニストである。

【０３２０】 潜在的なアゴニストおよびアンタゴニストのＴＮＦ−γ様効果は、例えば、候
補分子と細胞もしくは適切な細胞調製物との相互作用の後のセカンドメッセンジ
ャー系の活性を決定すること、ならびにこの効果をＴＮＦ−γもしくはＴＮＦ−
γと同じ効果を誘発する分子の効果と比較することによって、測定され得る。こ
の点において有用であり得るセカンドメッセンジャー系は、ＡＭＰグアニル酸シ
クラーゼ、イオンチャンネルまたはホスホイノシチド加水分解セカンドメッセン
ジャー系を含むが、これらに限定されない。

【０３２１】 ＴＮＦ−γアンタゴニストについてのアッセイの別の例は、ＴＮＦ−γおよび
潜在的アンタゴニストを、膜結合ＴＮＦ−γレセプター分子または組換えＴＮＦ
−γレセプター分子と、競合阻害アッセイに適切な条件下で組合わせる競合アッ
セイである。ＴＮＦ−γは、例えば放射能により標識され得、その結果レセプタ
ー分子に結合したＴＮＦ−γ分子の数が正確に決定され、潜在的アンタゴニスト
の有効性を評価し得る。

【０３２２】 潜在的アンタゴニストは、本発明のポリペプチドに結合しそれによってその活
性を阻害または失効させる有機低分子、ペプチド、ポリペプチド、および抗体を
含む。潜在的なアンタゴニストはまた、結合分子（例えば、レセプター分子）上
で、ＴＮＦ−γ誘導化活性を誘導することなく結合部位と結合し、それによって
ＴＮＦ−γを結合から除去することによってＴＮＦ−γの作用を妨げる有機低分
子、ペプチド、密接に関連したタンパク質もしくは抗体のようなポリペプチドで
あり得る。

【０３２３】 他の潜在的なアンタゴニストは、アンチセンス分子を含む。アンチセンス技術
を使用して、アンチセンスＤＮＡもしくはアンチセンスＲＮＡまたは三重らせん
形成を通じて遺伝子発現を制御し得る。アンチセンス技術は、多くの研究（例え
ば、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；「Ｏｌ
ｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈ
ｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、ＣＲＣ Ｐｒｅｓ
ｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ（１９８８））において議論されている。三重
らせん形成も同じく多くの研究（例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２４１：４５６（１９８８）；Ｄａｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５
１：１３６０（１９９１））において議論されている。この方法は、相補的なＤ
ＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づく。例えば、本発明の成熟
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’コード部分を用いて、約１０
〜４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計し得る。Ｄ
ＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように
設計され、それ故ＴＮＦ−γの転写および産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡオ
リゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡにインビボでハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ
分子のＴＮＦ−γポリペプチドへの翻訳を妨げる。上記のオリゴヌクレオチドは
また細胞に送達され得、その結果アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがインビボで
発現されてＴＮＦ−γタンパク質の産生を阻害し得る。

【０３２４】 ＴＮＦ−γに特異的な抗体は、ＴＮＦ−γへの結合およびそのレセプターへの
結合を妨げることによってアンタゴニストとして使用され得る。モノクローナル
抗体は、この点において特に有効である。しかし、ＴＮＦ−γレセプターに特異
的な抗体は、そのレセプターとの相互作用に対するＴＮＦ−γの効果を拮抗する
傾向のある異なる細胞応答を媒介し得る。

【０３２５】 潜在的なＴＮＦ−γアンタゴニストはまた、ＴＮＦ−γレセプターと結合し、
そしてそのレセプターを天然のリガンドから効率良く妨げるためのセカンドメッ
センジャー応答を誘発しないＴＮＦ−γ変異体を含む。特に設計されたオリゴヌ
クレオチドおよび低分子はまた、ＴＮＦ−γレセプター（例えば、ＤＲ３）に結
合し得、そしてＴＮＦ−γからは妨げ得る。低分子の例としては、小さいペプチ
ドまたはペプチド様分子を含むが、これらに限定されない。

【０３２６】 別の潜在的なＴＮＦ−γアンタゴニストは、ＴＮＦ−γに結合し、膜結合ＴＮ
Ｆ−γレセプターとの相互作用を妨げるＴＮＦ−γレセプターの可溶形態である
。このように、このレセプターは、ＴＮＦ−γにより刺激されない。

【０３２７】 別の潜在的なＴＮＦ−γアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製さ
れるアンチセンス構築物である。アンチセンス技術を用いて、三重らせん形成、
またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡによる（これらの両方法は、ポリヌク
レオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく）遺伝子発現を制御し得る。例
えば、ポリヌクレオチド配列の５’コード部分（これは本発明の成熟ポリペプチ
ドをコードする）を使用して、約１０〜４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡ
オリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する
遺伝子の領域と相補的であるように設計され（三重らせん−Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌ
．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ、２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ、２５１：１３６０（１９９１））、これによってＴＮＦ−γの転写および産
生を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡにインビボで
ハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のＴＮＦ−γポリペプチドへの翻訳を妨
げる（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、５６：５６０（
１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓ
ｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｃ
ＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ（１９８８））。上記のオリゴ
ヌクレオチドはまた細胞に送達され得、その結果アンチセンスＲＮＡまたはＤＮ
Ａがインビボで発現されてＴＮＦ−γの産生を阻害し得る。

【０３２８】 ＴＮＦ−アンタゴニストはまた、悪液質（これは、ＴＮＦ−γにより抑制され
るリポタンパク質リパーゼの全身性不全から生じる脂質清澄化欠損である）を処
置するために用いられ得る。ＴＮＦ−γアンタゴニストはまた、大脳マラリアを
処置するために用いられ、ここでは、ＴＮＦ−γは、病的役割を果すようである
。このアンタゴニストはまた使用されて、滑膜細胞中のＩＬ−１のような炎症性
サイトカインの産生を誘導させるＴＮＦ−γを阻害することによって慢性関節リ
ウマチを処置し得る。関節炎を処置する場合、ＴＮＦ−γは、好ましくは関節内
に注射される。

【０３２９】 ＴＮＦ−γアンタゴニストはまた、ＴＮＦ−γによる移植片の存在において免
疫系の刺激を妨げることによて移植片拒絶を妨げるために使用され得る。

【０３３０】 ＴＮＦ−γアンタゴニストはまた、骨粗鬆症を処置するために使用され得る。
なぜならば、ＴＮＦ−γは、骨吸収を誘導し得るからである。

【０３３１】 ＴＮＦ−γに対するアンタゴニストもまた、抗炎症剤として使用され得る。ま
ぜならば、ＴＮＦ−γは、増強された炎症性応答を媒介するからである。

【０３３２】 このアンタゴニストはまた、内毒素ショック（敗血症性ショックとしてもまた
いわれる）を処置するために使用され得る。この臨界状態は、細菌感染または他
の型の感染に対する過大応答から生じる。この応答は、ショックおよび組織損傷
を引き起こすＴＮＦ−γのレベルの上昇をもたらす。

【０３３３】 本発明はまた、種々の組織におけるＴＮＦ−γタンパク質のレベルの変化を検
出するための診断アッセイに関する。なぜならば、正常なコントロール組織サン
プルと比較したタンパク質の過剰発現は、疾患（例えば、腫瘍および大脳マラリ
ア）の存在または疾患に対する感受性を検出し得る。宿主由来のサンプルにおけ
るＴＮＦ−γタンパク質のレベルを検出するために使用されるアッセイは当業者
に周知であり、そしてラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブ
ロット分析、ＥＬＩＳＡアッセイおよび「サンドイッチ」アッセイを包含する。
ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１（２）、第６章（１９９１））は、ＴＮＦ−
γ抗原、好ましくはモノクローナル抗体に特異的な抗体を調製する工程を最初に
含む。さらに、レポーター抗体が、モノクローナル抗体に対して調製される。レ
ポーター抗体に、検出可能な試薬（例えば、放射能、蛍光またはこの実施例にお
いて西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素）が結合される。サンプルは、宿主から除
去されて、そしてサンプル中でタンパク質を結合する固体支持体（例えば、ポリ
スチレンディッシュ）上でインキュベートされる。次いで、ディッシュ上の任意
の遊離タンパク質結合部位は、ＢＳＡのような非特異的タンパク質とインキュベ
ートすることによって被膜される。次に、モノクローナル抗体は、モノクローナ
ル抗体が、ポリスチレンディッシュに結合した任意のＴＮＦ−γタンパク質に結
合する時間の間、ディッシュ中でインキュベートされる。全ての未結合モノクロ
ーナル抗体は、緩衝液で洗浄される。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したレ
ポーター抗体は、ここで、ディッシュ中に配置され、その結果レポーター抗体の
、ＴＮＦ−γに結合した任意のモノクローナル抗体への結合を生じる。次いで、
未結合のレポーター抗体は洗浄される。次いで、ペルオキシダーゼ基質は、ディ
ッシュに添加され、そして所定の期間に発色した色の量が、標準曲線と比較した
場合、患者サンプルの所定の容量に存在するＴＮＦ−γタンパク質の量の測定値
である。

【０３３４】 競合アッセイが用いられ得、ここで、ＴＮＦ−γに特異的な抗体は、固体支持
体および標識化ＴＮＦ−γに付着し、そして宿主由来のサンプルは、固体支持体
を通過し、そして例えば液体シンチレーションクロマトグラフィーにより検出さ
れた標識の量は、サンプル中のＴＮＦ−γの量に相関し得る。

【０３３５】 「サンドイッチ」アッセイは、ＥＬＩＳＡアッセイと類似している。「サンド
イッチ」アッセイにおいて、ＴＮＦ−γは、固体支持体を通過しそして固体支持
体に付着した抗体に結合する。次いで、第二の抗体は、ＴＮＦ−γに結合される
。標識されかつ第二の抗体に特異的な第三の抗体は、固体支持体を通過し、そし
て第二の抗体に結合し、次いで含量が定量され得る。

【０３３６】 （遺伝子マッピング） 本発明の配列はまた、染色体同定にも有用である。この配列は、個々のヒト染
色体上の特定の位置に対して特異的に標的化され、そしてハイブリダイズし得る
。さらに、染色体上の特定の部位を同定することについて現在、必要性がある。
実際の配列データ（反復多型性）に基づく薬剤を標識する染色体は、染色体位置
を標識するのに現在利用可能である。本発明に従う染色体へのＤＮＡのマッピン
グは、疾患と関連する遺伝子と配列との相関付けにおける重要な第一の段階であ
る。

【０３３７】 簡単に言うと、配列は、ｃＤＮＡからのＰＣＲプライマー（好ましくは１５〜
２５ｂｐ）を調製することによって染色体へマッピングされ得る。この配列の３
’未翻訳領域のコンピューター分析を用いて、ゲノムＤＮＡにおいて１つより多
くのエキソンにわたらないプライマーを迅速に選択し、従って増幅プロセスを複
雑にする。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイ
ブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用される。このプライマーに対応するヒト
遺伝子を含むハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを生じる。

【０３３８】 体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定のＤＮＡを特定の染色体に割
り当てるための迅速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーとともに
本発明を用いて、部分局在化は、類似した様式で特定の染色体または大きなゲノ
ムクローンのプールからのフラグメントのパネルを用いて達成され得る。染色体
にマッピングするために同様に使用され得る他のマッピング戦略としては、イン
サイチュハイブリダイゼーション、標識化フローソーティングされた染色体を用
いたプレスクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築する
ためのハイブリダイゼーションによる前選択を含む。

【０３３９】 分裂中期の染色体伸長へのｃＤＮＡクローンの蛍光インサイチュハイブリダイ
ゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて、１つの工程で正確な染色体位置を提供し得る
。この技術は、５０または６０塩基の短さのｃＤＮＡとともに使用される。この
技術の総説については、Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：
ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏ
ｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと。

【０３４０】 一旦配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上でのこの配列の
物理的な位置は、遺伝子地図データと相関し得る。そのようなデータが、例えば
、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ、Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ
Ｍａｎ（Ｊｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅｌｃｈ Ｍ
ｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙを通じてオンラインで入手可能である）において
見出される。次いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の
関係が、連鎖分析により同定される（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）。

【０３４１】 次に、罹患した個体と罹患していない個体との間のｃＤＮＡまたはゲノム配列
における差異を決定することが必要である。変異が罹患した個体のいくつかもし
くは全てに観察されるが、正常な個体には全く見られない場合、この変異は、疾
患の作因であるようである。

【０３４２】 物理的マッピングおよび遺伝子マッピング技術の現在の解像度によると、疾患
と関連する染色体領域に正確に位置されるｃＤＮＡは、５０〜５００の潜在的な
原因的遺伝子のうちの１つであり得る（これは、１メガベースのマッピング解像
度および２０ｋｂ当たり１遺伝子を仮定する）。

【０３４３】 上記の技術の利用により、ＴＮＦ−γの染色体位置が、非常に高い信頼性で９
ｑ３２と決定された。以前の染色体マッピング研究は、第９染色体のこの領域に
おける遺伝子座に、いくつかの発生的欠損を関連付けている。

【０３４４】 （実施例） 本発明は、以下の実施例に関してさらに記載される；しかし、本発明は、この
ような実施例に限定されないことが理解されるべきである。他に特定して言及さ
れない限り、すべての部分または量は、重量である。

【０３４５】 以下の実施例の理解を容易にするために、特定の頻出する方法および／または
用語を記載する。

【０３４６】 「プラスミド」とは、大文字および／もしくは数字の後および／もしくは前の
小文字ｐによって示される。本明細書中の開始プラスミドは、他に言及されない
限り、市販されているか、制限なく公的に利用可能であるか、または公開されて
いる手順に従って市販のプラスミドから構築され得る。さらに、記載されるプラ
スミドと等価のプラスミドが、当該分野において公知であり、そして当業者に明
らかである。

【０３４７】 ＤＮＡの「消化」とは、ＤＮＡにおける特定の配列にてのみ作用する制限酵素
を用いたＤＮＡの触媒分解切断をいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素
は市販されており、そしてそれらの反応条件、補因子、および他の必要条件が、
当業者に公知であるように使用された。分析目的のために、代表的には１μｇの
プラスミドまたはＤＮＡフラグメントを、約２０μｌの緩衝溶液中に約２単位の
酵素とともに使用する。プラスミド構築のためにＤＮＡフラグメントを単離する
目的のために、代表的には、５〜５０μｇのＤＮＡを、より大きな容量中に２０
〜２５０単位の酵素を用いて消化する。適切な緩衝液および特定の制限酵素のた
めの基質の量は、製造業者により特定されている。３７℃で約１時間のインキュ
ベーション時間を通常使用するが、供給業者の説明書に従って変化し得る。消化
の後、反応をポリアクリルアミドゲル上で直接的に電気泳動し、所望のフラグメ
ントを単離する。

【０３４８】 切断されたフラグメントのサイズ分離を、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．ら、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、８：４０５７（１９８０）により記載される８
％ポリアクリルアミドゲルを用いて実行する。

【０３４９】 「オリゴヌクレオチド」とは、一本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは化学的
に合成され得る２つの相補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいう。
そのような合成オリゴヌクレオチドは、５’リン酸を有さず、従って、キナーゼ
の存在下でＡＴＰを用いてリン酸を付加しないと別のオリゴヌクレオチドと結合
しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸していないフラグメントに結合す
る。

【０３５０】 「連結」とは、２本鎖の核酸フラグメント間でホスホジエステル結合を形成す
るプロセスをいう（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら、同書、１４６頁）。他に提供さ
れなければ、連結は、（連結されるべきＤＮＡフラグメントとほぼ等しいモル量
の０．５μｇ当たり１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）で公知の緩
衝液および条件を用いて達成され得る。

【０３５１】 他に言及することがない限り、形質転換は、Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．およびＶａｎ
ｄｅｒ Ｅｂ，Ａ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６〜４５７（１９７３）
の方法に記載されるように実施した。

【０３５２】 （実施例１：ＴＮＦ−γの細菌性発現および精製） 全長ＴＮＦ−γ ＯＲＦをコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ寄託番号第７５９
２７号）を、ＴＮＦ−γタンパク質の５’配列および３’配列に対応するＰＣＲ
オリゴヌクレオチドプライマーを用いてまず増幅した。ＴＮＦ−γに対応するさ
らなるヌクレオチドを、それぞれ５’配列および３’配列に付加した。５’オリ
ゴヌクレオチドプライマーを配列番号１３に示し、そして配列５’−ＧＣＧ Ｃ
ＧＧ ＡＴＣ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＡＧ ＡＣＧ ＣＴＴ ＴＴＴ ＡＡＧ Ｃ
ＡＡ ＡＧＴ Ｃ−３’（これは、Ｂａｍ ＨＩ制限酵素部位、続いて開始メチ
オニンコドンから開始されるＴＮＦ−γコード配列の第一の２４ヌクレオチドを
含む）を有する。３’配列５’−ＣＧＣ ＧＴＣ ＴＡＧ ＡＣＴ ＡＴＡ Ｇ
ＴＡ ＡＧＡ ＡＧＧ ＣＴＣ ＣＡＡ ＡＧＡ ＡＧＧ−３’（配列番号１４
）は、Ｘｂａ Ｉ部位に対して相補的な配列およびＴＮＦ−γの２２ヌクレオチ
ドを含む。制限酵素部位は、細菌性発現ベクターｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）に
おける制限酵素部位に対応する。次いで、ｑＱＥ−９をＢａｍ ＨＩおよびＸｂ
ａ Ｉで消化した。増幅した配列をｐＱＥ−９中にライゲートし、そしてヒスチ
ジンタグおよびＲＢＳをコードする配列とインフレームに挿入した。次いで、こ
のライゲーション混合物を使用して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）に記載され
る手順により、商標Ｍ１５／ｒｅｐ４の下でＱｉａｇｅｎより入手可能なＥ．ｃ
ｏｌｉ鎖を形質転換した。Ｍ１５／ｒｅｐ４は、複数のプラスミドｐＲＥＰ４の
複製を含み、このプラスミドは、ｌａｃＩリプレッサーを発現し、かつまたカナ
マイシン耐性（Ｋａｎ^r）を付与する。形質転換体を、それらがＬＢプレート上
で増殖する能力によって同定し、そしてアンピシリン／カナマイシン耐性コロニ
ーを選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、そして制限分析により確認した。所
望の構築物を含むクローンを、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）およびＫａｎ（２５
μｇ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地の液体培地で一晩（Ｏ／Ｎ）増殖させた
。このＯ／Ｎ培養物を用いて、１：１００から１：２５０の比で大きな培養物を
接種した。この細胞を、０．４と０．６との間の吸光度６００（Ｏ．Ｄ．₆₀₀）
まで増殖させた。次いで、ＩＰＴＧ（「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピ
ラノシド」）を最終濃度１ｍＭまで添加した。ＩＰＴＧは、ｌａｃＩリプレッサ
ーを不活化することにより、Ｐ／Ｏをクリアにし、遺伝子発現の増大をもたらす
ことを誘導する。細胞をもう３〜４時間増殖させた。次いで細胞を遠心分離によ
り採集した。この細胞ペレットを、カオトロピズム剤６ＭグアニジンＨＣｌ中に
溶解した（２．５Ｍ以上のグアニジンＨＣｌ濃度が、より高い純度の回収された
組換えタンパク質を生じることが経験的に見出された）。明澄化の後、６−Ｈｉ
ｓタグを含むタンパク質によってしっかりと結合させる条件下でニッケルキレー
トカラム上でのクロマトグラフィーにより、この溶液から可溶化ＴＮＦ−γを精
製した（Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ４１１
：１７７〜１８４（１９８４））。ＴＮＦ−γをニッケルキレートカラム上での
２回目の実行によりさらに精製した。ＴＮＦ−γ（９０％純粋）を、６Ｍグアニ
ジンＨＣｌ ｐＨ５．０中でカラムから溶出し、そして再生の目的のためにＰＢ
Ｓ緩衝液中で透析した。この発現産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動し、そ
してその結果を図５に示し得る。ここで、「Ｍ」と標識されたレーンは、分子量
マーカーである；レーン１は、誘導化細胞溶解物；レーン２は、未誘導化細胞溶
解物；レーン３は、２回のニッケルキレートカラム精製後のＴＮＦ−γタンパク
質；レーン４は、１回のカラム精製後のＴＮＦ−γタンパク質である。

【０３５３】 当業者は、ｐＱＥ−９以外の細菌性発現ベクターはまたＴＮＦ−γを発現する
ために使用され得ることを理解する。そのような１つの好ましい細菌性発現ベク
ターは、ｐＨＥ４−５である。ｐＨＥ４−５は、ｐＨＥ４−５／ＭＰＩＦＤ２３
プラスミドＤＮＡ（この構築物は、無関係のＯＲＦをコードする無関係の挿入片
を含む）として得られ得る。ｐＨＥ４−５／ＭＰＩＦＤ２３プラスミドを、アメ
リカンタイプカルチャーコレクション、１２３０１ Ｐａｒｋ Ｌａｗｎ Ｄｒ
ｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２、１９９７年９月
３０日（登録番号第２０９３１１号）に寄託した。無関係のＭＰＩＦ ＯＲＦ挿
入片に隣接するＮｄｅ ＩおよびＡｓｐ７１８の制限部位を用いて、当業者は、
ｐＨＥ４−５／ＭＰＩＦＤ２３プラスミド中の無関係のＯＲＦを、本発明のＴＮ
Ｆ−γＯＲＦまたはその改変体と置換するために、現在の分子生物学的技術を容
易に使用し得る。

【０３５４】 （実施例２：バキュロウイルス発現系を使用するＴＮＦ−γのクローニングお
よび発現） 全長ＴＮＦ−γタンパク質をコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ第７５９２７号
）を、この遺伝子の５’配列および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチ
ドプライマーを用いて増幅した：５’プライマーは、配列：

【０３５５】

【化８】

【０３５６】 （配列番号１５）を有し、そしてＢａｍ ＨＩ制限酵素部位（太字）、続いて２
４ヌクレオチドのＴＮＦ−γ遺伝子（翻訳開始コドン「ＡＴＧ」に下線を付す）
を含む。３’プライマーは、配列：５’−ＣＧＣ ＧＴＣ ＴＡＧ ＡＣＴ Ａ
ＴＡ ＧＴＡ ＡＧＡ ＡＧＧ ＣＴＣ ＣＡＡ ＡＧＡ ＡＧＧ−３’（配列
番号１６）を有し、そして制限エンドヌクレアーゼＸｂａ Ｉの切断部位および
ＴＮＦ−γ遺伝子の３’非翻訳配列に相補的な２２ヌクレオチドを含む。増幅し
た遺伝子を、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．
、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａ．）を使用して１％アガロースゲルから単離した。次
いで、このフラグメントを、エンドヌクレアーゼＢａｍ ＨＩおよびＸｂａ Ｉ
で消化し、次いで１％アガロースゲル上で再度精製した。このフラグメントをＦ
２と名付けた。

【０３５７】 ベクターｐＡ２（下記に考察される、ｐＶＬ９４１ベクターの改変形）を、バ
キュロウイルス発現系を使用するＴＮＦ−γタンパク質の発現のために使用した
（概説として、Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．、１９８
７、Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕ
ｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｒ
ｏｃｅｄｕｒｅｓ、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅ
ｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５を参照のこと）
。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角
体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、それに続い
て、制限エンドヌクレアーゼＢａｍ ＨＩおよびＸｂａ Ｉの認識部位を含む。
シミアンウイルスＳＶ４０のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化の
ために用いる。組換えウイルスの容易な選択のために、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβ−
ガラクトシダーゼ遺伝子をポリヘドリンプロモーターと同方向に挿入し、ポリヘ
ドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを続けた。ポリヘドリン配列を、同時ト
ランスフェクトされた野生型ウイルスＤＮＡの細胞媒介性相同組換えのためにウ
イルス配列によって両側に隣接させた。多くの他のバキュロウイルスベクター、
例えば、ｐＲＧ１、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１およびｐＡｃＩＭ１を、ｐＡ２
の代わりに使用し得る（Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖ．Ａ．およびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ
．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７０：３１〜３９）。

【０３５８】 当該分野で公知の手順を用いて、このプラスミドを制限酵素Ｂａｍ ＨＩおよ
びＸｂａ Ｉで消化し、次いで、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化し
た。次いで、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．
，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）を用いて、ＤＮＡを１％アガロースゲルから単離し
た。このベクターＤＮＡを、本明細書中でＶ２と命名した。

【０３５９】 フラグメントＦ２および脱リン酸化プラスミドＶ２を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
で連結した。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１ ｂｌｕｅ細胞を形質転換した。ク
ローン化フラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定により確認した。

【０３６０】 ５μｇのプラスミドｐＢａｃ ＴＮＦ−γを、リポフェクション法（Ｆｅｌｇ
ｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３−
７４１７（１９８７））を用いて、１．０μｇの市販の線状化バキュロウイルス
（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ」，Ｐｈａｒｍｉ
ｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）とともに同時トランスフェクトした。

【０３６１】 １μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄウイルスＤＮＡおよび５μｇのプラスミドｐＢ
ａｃ ＴＮＦ−γを、５０μｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含むマイクロタ
イタープレートの無菌ウェル中で混合した。その後、１０μｌのリポフェクチン
および９０μｌのグレース培地を添加し、混合し、そして室温にて１５分間イン
キュベートした。次いで、そのトランスフェクション混合物を、無血清グレース
培地１ｍｌを有する３５ｍｍ組織培養プレート内に播種されたＳｆ９昆虫細胞（
ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下した。このプレートを前後に揺り動かして
、新たに添加した溶液を混合した。次いでプレートを、２７℃で５時間インキュ
ベートした。５時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そし
て１０％ウシ胎仔血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加した。プレー
トをインキュベーターに戻し、そして２７℃で４日間培養を続けた。

【０３６２】 ４日後、上清を回収し、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）に記
載されるようにプラークアッセイを行った。改変形として、青く染色されたプラ
ークの容易な単離を可能にする、「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を有するアガロースゲ
ルを用いた。（「プラークアッセイ」の詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、９〜１０頁により配
布される昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学の使用者ガイドにおいても見い
出され得る）。

【０３６３】 連続希釈の４日後、このウイルスを細胞に添加し、青く染色されたプラークを
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆピペットのチップで拾った。次いで、組換えウイルスを含む
寒天を、２００μｌのグレース培地を含むＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中に再懸
濁した。寒天を、短時間の遠心分離により除去し、そして組換えバキュロウイル
スを含む上清を、３５ｍｍディッシュに播種された昆虫Ｓｆ９細胞に感染させる
ために用いた。４日後、これらの培養ディッシュの上清を回収し、次いでそれら
を４℃で保存した。

【０３６４】 Ｓｆ９細胞を、１０％熱非働化ＦＢＳを補充したグレース培地中で増殖させた
。細胞を、感染多重度（ＭＯＩ）２の組換えバキュロウイルスＶ−ＴＮＦ−γで
感染させた。６時間後、その培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステイン
を除いたＳＦ９００ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ
．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）に置き換えた。４２時間後、５μＣｉの［³⁵Ｓ
］−メチオニンおよび５μＣｉの［³⁵Ｓ］−システイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を
添加した。細胞をさらに１６時間インキュベートし、次いで細胞を遠心分離によ
り収集し、そして標識されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオ
グラフィーにより可視化した。図６は、レーン１および３がＴＮＦ−γ培養物の
培地およびコントロール培養物の培地であり、そしてレーン２および４がＴＮＦ
−γの細胞溶解物およびコントロール培養物の細胞溶解物である、ゲルを例示す
る。

【０３６５】 （実施例３：ＣＯＳ細胞における組換えＴＮＦ−γの発現） プラスミドＴＮＦ−γ−ＨＡの発現は、以下を含むベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａ
ｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来する：（１）ＳＶ４０複製起点；（２）ア
ンピシリン耐性遺伝子；（３）Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点；（４）ＣＭＶプロモータ
ー、続いてポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロン、およびポリアデニル化部位
。ＴＮＦ−γ前駆体全体をコードするＤＮＡフラグメントおよびその３’末端に
インフレームで融合した赤血球凝集素抗原（ＨＡ）タグを、このベクターのポリ
リンカー領域にクローン化した。従って、この組換えタンパク質発現は、ＣＭＶ
プロモーターの指向下である。このＨＡタグは、以前に記載されたインフルエン
ザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープ（Ｉ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｈ．Ｎｉｍａ
ｎ、Ｒ．Ｈｅｉｇｈｔｅｎ、Ａ．Ｃｈｅｒｅｎｓｏｎ、Ｍ．Ｃｏｎｎｏｌｙ、お
よびＲ．Ｌｅｒｎｅｒ、１９８４、Ｃｅｌｌ ３７：７６７）に対応する。本発
明者らの標的タンパク質へのＨＡタグの融合は、このＨＡエピトープを認識する
抗体を用いる組換えタンパク質の簡単な検出を可能にする。

【０３６６】 プラスミド構築ストラテジーは以下のように記載される：ＴＮＦ−γをコード
するＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ＃７５９２７）を、クローン化したもとのＥＳＴに対
して以下の２つのプライマーを使用するＰＣＲにより構築した：５’プライマー
（配列番号１５）は、Ｂａｍ ＨＩ部位、続いて開始コドンから始まる２４ヌク
レオチドのＴＮＦ−γコード配列を含み；３’配列５’−ＣＧＣ ＴＣＴ ＡＧ
Ａ ＴＣＡ ＡＧＣ ＧＴＡ ＧＴＣ ＴＧＧ ＧＡＣ ＧＴＣ ＧＴＡ ＴＧ
Ｇ ＡＴＡ ＧＴＡ ＡＧＡ ＡＧＧ ＣＴＣ ＣＡＡ ＡＧ−３’（配列番号
１７）は、Ｘｂａ Ｉ部位、翻訳終止コドン、ＨＡタグそして最後に１８ヌクレ
オチドのＴＮＦ−γコード配列（終止コドンを含まない）に、相補的な配列を含
む。従って、ＰＣＲ産物は、Ｂａｍ ＨＩ部位、ＴＮＦ−γコード配列、続いて
、インフレームに融合されたＨＡタグ、このＨＡタグの隣りに翻訳終結終止コド
ン、そしてＸｂａ Ｉ部位を含んだ。このＰＣＲ増幅したＤＮＡフラグメントお
よびベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐを、Ｂａｍ ＨＩおよびＸｂａ Ｉ制限酵素
で消化し、そして連結した。この連結混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＳＵＲＥ（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１１０９９ Ｎｏｒｔｈ
Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ ９２０３７
から入手可能）に形質転換した。この形質転換した培養物を、アンピシリン培地
プレート上にプレーティングし、そして耐性コロニーを選択した。プラスミドＤ
ＮＡを形質転換体から単離し、制限分析によって正確なフラグメントの存在につ
いて試験した。組換えＴＮＦ−γの発現について、ＣＯＳ細胞を、ＤＥＡＥ−Ｄ
ＥＸＴＲＡＮ法によってこの発現ベクターでトランスフェクトした。（Ｊ．Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、（１９８９））。ＴＮＦ−γ
ＨＡタンパク質の発現を、放射標識および免疫沈降法によって検出した。（Ｅ
．Ｈａｒｌｏｗ、Ｄ．Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））。細胞を、トランスフェクションの２日後に
、８時間、［³⁵Ｓ］−Ｓ−システインで標識した。次いで、培養培地を回収し、
そして細胞を、界面活性剤（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｎ
Ｐ−４０、０．１％ ＳＤＳ、１％ ＮＰ−４０、０．５％ ＤＯＣ、５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ、ｐＨ ７．５；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、同書３７：７６７（１９８
４））で溶解した。細胞溶解物および培養培地の両方を、ＨＡ特異的モノクロー
ナル抗体で沈降させた。次いで、沈降されたタンパク質を、１５％ ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥゲル上で分析した。

【０３６７】 （実施例４：ヒト組織におけるＴＮＦ−γの発現パターン） ＲＮＡブロット分析を実行して、ヒト組織におけるＴＮＦ−γの発現レベルを
試験した。総細胞ＲＮＡサンプルを、ＲＮＡｚｏｌ^TMＢシステム（Ｂｉｏｔｅｃ
ｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．６０２３ Ｓｏｕｔｈ Ｌｏｏｐ Ｅ
ａｓｔ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ ７７０３３）を用いて単離した。特定の各ヒト
組織から単離された約２μｇ（図３ＡのＲＮＡブロット用）の総ＲＮＡを、１％
アガロース−ホルムアルデヒドゲル上で分離し、そしてナイロンフィルター上に
ブロットした（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＭａｎｉａｔｉｓ、
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｐｒｅｓｓ（１９８９））。標識反応をＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｐｒｉｍｅ−
Ｉｔキットに従って５０ｎｇのＴＮＦ−γ ｃＤＮＡを用いて行い、［³²Ｐ］標
識ＴＮＦ−γ ｃＤＮＡを生成した。この標識ＤＮＡをＳｅｌｅｃｔ−Ｇ−５０
カラム（５ Ｐｒｉｍｅ−３ Ｐｒｉｍｅ，Ｉｎｃ．５６０３ Ａｒａｐａｈｏ
ｅ Ｒｏａｄ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ ８０３０３）で精製した。次いで、この
フィルターを、１，０００，０００ｃｐｍ／ｍｌの放射活性標識した全長ＴＮＦ
−γ遺伝子を用いて、０．５Ｍ ＮａＰＯ₄、ｐＨ７．４および７％ ＳＤＳ中
で６５℃で一晩ハイブリダイズさせた。室温で２回および６０℃で２回、０．５
×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳで洗浄した後、次にＸ線フィルムをこのブロットに
−７０℃で一晩、増感スクリーンを用いて曝露させた。ＴＮＦ−γについてのメ
ッセンジャー（ｍｅｓｓａｇｅ）ＲＮＡは、腎臓において豊富である。

【０３６８】 同じ反応を行って、図３Ｂに示される結果を得た。ただし、示される組織から
単離した１０μｇのポリＡ ＲＮＡを使用したことを除く。この実験において、
ＴＮＦ−γをコードするメッセンジャーＲＮＡは、ＨＵＶＥＣ細胞において優勢
に発現される（図３Ｂ；レーン９）が、試験される他の細胞株では発現されない
；例えば、レーン１はＣＡＭＡ１（乳癌）；レーン２はＡＮ３ＣＡ（子宮癌）；
レーン３はＳＫ．ＵＴ．１（子宮癌）；レーン４はＭＧ６３（骨芽細胞腫）；レ
ーン５はＨＯＳ（骨芽細胞腫）；レーン６はＭＣＦ７（乳癌）；レーン７はＯＶ
ＣＡＲ−３（卵巣癌）；レーン８はＣＡＯＶ−３（卵巣癌）；レーン１０はＡＯ
ＳＭＩＣ（平滑筋）；およびレーン１１は包皮線維芽細胞である。

【０３６９】 ノーザンブロット分析もまた行って、ＨＵＶＥＣ細胞培養物の増殖状態に対す
るＴＮＦ−γ ＲＮＡの相対的発現レベルを決定した。これらの実験において、
ＨＵＶＥＣ細胞から単離された同量の総ＲＮＡ（１５μｇ）を、電気泳動によっ
て分離し、そして上記のようにブロットした。播種後１、２、３、４、６および
７日目に培養物からＲＮＡを単離した。図４に示されるように、ＴＮＦ−γ Ｒ
ＮＡ（標識された「ＶＥＧＩ」）のみが、新規に播種された培養物において低レ
ベルで観察された（１、２、および３日目）。しかし、ＴＮＦ−γ ＲＮＡの発
現は、その培養物中のＨＵＶＥＣ細胞がコンフルエンスに達し始めた時に明らか
であった（４、６、および７日目）。これらの実験は、ＴＮＦ−γの発現が、培
養物または組織中の細胞が非増殖または低減した増殖の休止状態に達し始める場
合に増加することを示す。

【０３７０】 （実施例５：組換えＴＮＦ−γが、ＷＥＨＩ １６４、ＡＢＡＥ、およびＬ９
２９細胞の増殖を阻害し、そしてＨＬ−６０細胞における細胞付着を誘導する能
力） 付着標的細胞を、ＰＢＳ中でのトリプシン処理によって集密的な培養物から調
製し、そして非付着標的細胞を、定常状態培養物から収集し、そして培地で１回
洗浄した。標的細胞を、１０％ＦＣＳを含む培地中３×１０⁵細胞／ｍｌで懸濁
した。０．１ｍｌアリコートを、細胞（ＷＥＨＩ １６４およびＬ９２９）の連
続希釈した試験サンプル０．１ｍｌを含む９６ウェル平底マイクロタイタープレ
ートに分注した。７０時間インキュベーションを続けた。ＴＮＦ−ａ、ＴＮＦ−
ｂおよび細菌によって生成されたＴＮＦ−γを、濃度０．５μｇ／ｍｌで添加し
た。細胞傷害性活性および増殖活性を、各ウェルへの２０μｌのＭＴＳおよびフ
ェナジンメトスルフェート（ＰＭＳ）溶液の添加によって実施するＭＴＳアッセ
イを使用して定量した。３時間のインキュベーションの後、４９２ｎｍのＯＤを
、ＥＬＩＳＡプレートリーダーによって測定した。ＯＤ₄₉₂は、このウェルにお
ける生細胞の数に比例する。細胞傷害性の割合を、以下のように計算した：細胞
傷害性％＝（１００−ＯＤ実験／ＯＤコントロール）×１００。７２時間後に写真を撮 影した。図７Ａおよび図８によって示すように、ＴＮＦ−γが、黒くて丸い細胞
（殺傷された細胞を示す）として現れた形態学変化を誘導した。

【０３７１】 図７Ｂのグラフにおいて、このアッセイを上記のように実施したが、しかし、
漸増量のＴＮＦ−ａ、ＹＮＦ−ｂおよびＴＮＦ−γを培養物に添加した。この結
果は、ＴＮＦ−γは、内皮細胞株ＷＥＨＩ １６４の増殖の用量依存性インヒビ
ターであるが、線維芽細胞細胞株Ｌ９２９の用量依存性インヒビターではないこ
とを示す（図８および図９）。

【０３７２】 配列番号２に示される完全ＴＮＦ−γアミノ酸配列のアミノ酸１２〜１４７か
らなる短縮形態のＴＮＦ−γポリペプチド（ＴＮＦ−γ₁₂〜₁₄₇と名付けた）も
また、内皮細胞増殖に対するＴＮＦ−γの効果を試験するために使用した。ＴＮ
Ｆ−γ₁₂〜₁₄₇による成体ウシ大動脈内皮（ＡＢＡＥ）細胞の処理は、ＡＢＡＥ
培養物において細胞の増殖のほぼ完全な阻害を生じたが、乳癌細胞株ＭＤＡ−Ｍ
Ｂ−４３５またはＭＤＡ−ＭＢ−２３１における細胞の増殖の阻害は生じなかっ
た（図１０：ＴＮＦ−γはこの図では「ＶＥＧＩ」と名付けられる）。内皮細胞
の増殖のほぼ完全な阻害が、１０μｇ／ｍｌのＴＮＦ−γ₃₉〜₁₄₇で達成され、
最大半減阻害濃度値（ＩＣ５０）は約１μｇ／ｍｌ（約７０ｎＭ）であった。

【０３７３】 ＴＮＦ−γの付着能力を試験するために、ＨＬ−６０細胞を使用し、そして細
胞付着および細胞間接触を、顕微鏡下の観察により測定し、そして２人の独立し
た調査員により主観的に計数した。図１１は、ＴＮＦ−γが細胞付着を誘導する
能力を示す。ＴＮＦ−γで処理しなかった培養物は、培養皿中に広がった細胞を
含んだ。しかし、ＴＮＦ−γで処理した培養物は、明らかにともに凝集された細
胞を含んだ。

【０３７４】 （実施例６：ＴＮＦ−γのアポトーシス能力の測定） 第１のインキュベーション工程において、抗ヒストン抗体を、吸着によってマ
イクロタイタープレートモジュールの壁に固定した。続いて、この壁上の非特異
的結合部位を、インキュベーション緩衝液（例えば、ブロッキング溶液）での処
理によって飽和させた。第２のインキュベーション工程の間に、ＴＮＦ−ａ、Ｔ
ＮＦ−ｂまたは細菌によって生成されたＴＮＦ−γで処理したＷＥＨＩ １６４
細胞サンプルに含まれるヌクレオソームは、そのヒストン成分を介して、固定さ
れた抗ヒストン抗体に結合した。第３のインキュベーション工程において、抗Ｄ
ＮＡペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）は、ヌクレオソームのＤＮＡ成分と反応した。
未結合のペルオキシダーゼ結合体の全てを洗浄工程によって除去した後、免疫複
合体に保持されるペルオキシダーゼの量を、基質ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−
ジ−［３−エチルベンズチアゾリンスルホネート］）を使用して分光光学的に決
定した。抗ヒストン抗体は、このサンプル由来のヒストンＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ
、Ｈ３、およびＨ４と反応した。抗ＤＮＡ ＰＯＤ抗体は、一本鎖および二本鎖
のＤＮＡに結合した。従って、このＥＬＩＳＡにより、モノヌクレオソームおよ
びオリゴヌクレオソームの検出が可能になった。そしてこのＥＬＩＳＡを、アポ
トーシス細胞死を測定するために適用し得る。細胞死のレベルを、４０５ｎｍお
よび４９０ｎｍで観察される吸光度の比（Ａ₄₀₅／Ａ₄₉₀）によって示される細胞
質性ヒストン結合ＤＮＡフラグメントの量によって測定した。これらの実験の結
果を、図１２に示す（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃａｔａｌｏ
ｇｕｅ、０９９０ Ｃ ９３ ２ １５４１１７０を参照のこと）。

【０３７５】 図１２に示すように、ＷＥＨＩ １６４細胞を誘導して、漸増する量のＴＮＦ
−γの存在下で漸増する高レベルのアポトーシスを受けさせ、細胞死を生じた。
この効果はまた、漸増量のコントロールＴＮＦ−ｂまたは分析した任意のレベル
のコントロールＴＮＦ−ａの存在下でも観察された。

【０３７６】 （実施例７：ＴＮＦ−γを使用するレセプター結合アッセイ） ＴＮＦ−ａおよび細菌によって生成されたＴＮＦ−γを、組換えタンパク質の
末端に融合した６−Ｈｉｓタグを使用して、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマ
トグラフィーによって精製した。いずれかのタンパク質１μｇ／ウェルを、ニッ
ケルキレートでコートした９６ウェルプレート（Ｘｅｎｏｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．
）に添加し、そして２時間インキュベートした。３回洗浄した後、１００ｎｇの
ヒト可溶性ＴＮＦレセプター（詳細には、ｓＴＮＦ ＲＩまたはｓＴＮＦ ＲＩ
Ｉ）を、各ウェルに添加し、そして２時間インキュベートした。次いで、このプ
レート３回洗浄し、そしてｓＴＮＦ ＲＩまたはｓＴＮＦ ＲＩＩのいずれかに
対して惹起されたアルカリホスファターゼ標識したポリクローナル抗体を、総容
量２００μｌに添加した。次いで、基質溶液のアリコート（２００μｌ）を、各
ウェルに添加し、そしてこのプレートをさらに２時間インキュベートした。次い
で、そのＯＤをＥＬＩＳＡリーダーを使用して（４５０ｎｍの試験波長および５
９０ｎｍの補正波長で）測定した。図１３に示す結果は、ＴＮＦ−γは、ＴＮＦ
−ａを用いて観察されたコントロール結合と比較して、ｓＴＮＦレセプターに有
意に結合しないことを示す。

【０３７７】 （実施例８：遺伝子治療を介する発現） 線維芽細胞を、皮膚生検によって被験体から得る。得られた組織を、組織培養
培地に配置し、そして小片に分離させる。この組織の小塊を、組織培養フラスコ
の濡れた表面上に配置する（各フラスコに約１０片を配置する）。このフラスコ
を逆さまにし、きつく閉じ、そして室温で一晩放置する。室温で２４時間後、こ
のフラスコを反転させると、組織塊はフラスコの底に固定されたままである。こ
の時点で、新鮮な培地を添加する（例えば、１０％ ＦＢＳ、ペニシリン、およ
びストレプトマイシンを補充した、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地）。次いで、この培
養物を、３７℃で約１週間インキュベートする。この時点で、新鮮な培地を添加
し、続いて２〜３日ごとに換える。さらに２週間の培養の後、線維芽細胞の単層
が現れる。この単層をトリプシン処理し、そしてより大きなフラスコにスケール
アップする。

【０３７８】 ｐＭＶ−７（Ｋｉｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ、７：２１９〜２
５（１９８８））は、モロニ−マウス肉腫ウイルスの長末端反復に隣接している
。これを、Ｅｃｏ ＲＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、続いて仔ウシ腸ホス
ファターゼで処理する。この線状ベクターをアガロースゲル上で分画し、そして
ガラスビーズを使用して精製する。

【０３７９】 本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、それぞれが５’および３’の
末端配列に対応するＰＣＲプライマーを使用して増幅する。５’プライマーはＥ
ｃｏ ＲＩ部位を含み、そして３’プライマーは、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位を含む
。等量のモロニ−マウス肉腫ウイルス線状骨格および増幅したＥｃｏ ＲＩおよ
びＨｉｎｄ ＩＩＩフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下でともに添
加する。得られた混合物を、この２つのフラグメントの連結に適切な条件下で維
持する。この連結混合物を使用して、細菌ＨＢ１０１を形質転換し、次いで、こ
のベクターが適切に挿入された目的の遺伝子を有したことを確認する目的のため
にカナマイシン含有寒天上にプレーティングする。

【０３８０】 両栄養性ｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を、１０％仔ウ
シ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イ
ーグル培地（ＤＭＥＭ）中で集密的な密度まで組織培養において増殖させる。次
いで、この遺伝子を含むＭＳＶベクターを、この培地に加え、そしてこのパッケ
ージング細胞をこのベクターで形質導入する。ここで、このパッケージング細胞
は、この遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を生成する（このパッケージング細胞
は、ここで、プロデューサー細胞と呼ばれる）。

【０３８１】 新鮮な培地をこの形質導入されたトランスデューサ−細胞に添加し、続いて、
この培地を集密的なプロデューサー細胞の１０ｃｍプレートから収集する。この
感染性ウイルス粒子を含む使用済み培地を、ミリポアフィルターに通して濾過し
て分離したプロデューサー細胞を除去する。次いで、この培地を使用して、線維
芽細胞を感染させる。培地を線維芽細胞の集密が足りない（ｓｕｂ−ｃｏｎｆｌ
ｕｅｎｔ）プレートから除去し、そしてプロデューサー細胞からの培地で素早く
置換する。この培地を除去し、そして新鮮な培地で置換する。ウイルスの力価が
高い場合、事実上全ての線維芽細胞が感染され、そして選択を必要としない。こ
の力価が非常に低い場合、選択マーカー（例えば、ｎｅｏまたはｈｉｓ）を有す
るレトロウイルスベクターを使用することが必要であり得る。

【０３８２】 次いで、この操作された線維芽細胞を、宿主に、単独でか、またはサイトデッ
クス３マイクロキャリアビーズ上で集密になるまで増殖させた後にのいずれかで
、注入する。このとき、この線維芽細胞はこのタンパク質産物を生成する。

【０３８３】 （実施例９：インビトロ脈管形成アッセイ） このアッセイを使用して、ＴＮＦ−γ₁₂〜₁₄₇が成体ウシ大動脈内皮（ＡＢＡ
Ｅ）細胞の培養物において毛細管様の管状構造のＦＧＦ−２誘導形成を阻害する
相対的能力を決定した。３次元コラーゲンゲルプレート（２４ウェル）を、０．
７ｍｇ／ｍｌのラット尾Ｉ型コラーゲン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
Ｌａｂｗａｒｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）の冷えた０．５ｍｌの溶液を１×Ｄ
ＭＥＭを含む各ウェルに添加し、ＮａＨＣＯ₃で中性ｐＨに調節することによっ
て調製した。コラーゲンゲルの形成（厚さ約１〜２ｍｍ）後、ＡＢＡＥ細胞を５
×１０⁴細胞／ウェルで播種した。この培養物を、加湿した５％ＣＯ₂インキュベ
ーターにおいて３７℃で、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）を補充した１０％仔ウシ血
清（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）を含むＤＭＥＭ中で維持して、この培
養物を集密的にした。次いで、この培地を、２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２を含む
新鮮な培地で置換した。ＡＢＡＥ培養物における毛細管様管状構造のＦＧＦ−２
誘導形成のインヒビターとしてのＴＮＦ−γ₁₂〜₁₄₇の効果を、この培養培地に
０．１μｇ／ｍｌ、０．３μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌまたは１０
μｇ／ｍｌのＴＮＦ−γ₁₂〜₁₄₇を補充することによって分析した。次いで、全
ての培養物を、３７℃でさらに４８時間維持し、次いで、冷メタノール（−２０
℃）での固定によって停止した。

【０３８４】 ＡＢＡＥ細胞により形成された毛細管様構造の量を、Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｃ
２４００ビデオカメラおよびＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｈｏｐ顕微鏡で補助したＫ
ｏｔｒｏｎ ＩＢＡＳ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用することによって
分析した。この毛細管様構造の量を、測定した総領域に対する白い領域のパーセ
ンテージとして測定した。コントロールとして、脈管形成因子ＦＧＦ−２がイン
ビトロ脈管形成を刺激することについてのＥＣ₅₀値は、約５ｎｇ／ｍｌであった
。さらなるコントロールとして、最大刺激効果が、ＦＧＦ−２ １０ｎｇ／ｍｌ
で観察された。

【０３８５】 図１４に示されるように（ＴＮＦ−γを「ＶＥＧＩ」と名付ける）、ＡＢＡＥ
培養物におけるＦＧＦ−２誘導管形成の観察可能な阻害が、（ＶＥＧＩとして標
識された）ＴＮＦ−γ₁₂〜₁₄₇ １μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、および１０μｇ
／ｍｌの添加によって観察された。ＦＧＦ−２誘導管形成の阻害についてのＩＣ
５０値は、約１μｇ／ｍｌであり、これは、内皮細胞増殖のインヒビターについ
て観察されたものと類似していた（実施例５を参照のこと）。

【０３８６】 （実施例１０：ニワトリ胚絨毛尿膜（ＣＡＭ）脈管形成アッセイ） ＣＡＭアッセイを、本質的には、Ｎｇｕｙｅｎおよび同僚（Ｍｉｃｒｏｖａｓ
ｃ．Ｒｅｓ．４７：３１〜４０（１９９４））、ならびにＩｒｕｅｌａ−Ａｒｉ
ｓｐｅおよびＤｖｏｒａｋ（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７８：６７２〜６
７７（１９９７））に記載されるように実行した。この方法は、絨毛尿膜（ＣＡ
Ｍ）上に直接配置されたコラーゲンゲルペレットへの新規な毛細血管の成長に基
く。脈管形成因子ＦＧＦ−２（１００ｎｇ）またはＶＥＧＦ（２５０ｎｇ）をコ
ラーゲンゲルペレットに埋め込み、そしてＣＡＭと接触するように配置した。こ
のゲル中での脈管形成の定量を、このゲルペレットの配置の２４時間後に、Ｎｉ
ｋｏｎ蛍光顕微鏡を使用して実行した。その画像を、ＣＣＤ Ｓｏｎｙカメラを
使用してＰｏｗｅｒ ＰＣ １００ＡＶに移した。蛍光強度を、ＮＨ Ｉｍａｇ
ｅ １．６１ソフトウェアで評価した。ポジティブコントロール（これは脈管形
成因子のみを含んだ）についての蛍光強度を最大脈管形成応答と見なし、そして
自由裁量により１００に設定した。このアッセイの可変性に起因して、２０％を
超える阻害を有意であると見なした。

【０３８７】 ＦＧＦ−２誘導脈管形成またはＶＥＧＦ誘導脈管形成に対するＴＮＦ−γの効
果の実験的決定として、細菌により生成されたＴＮＦ−γ（２５０ｎｇ）を、Ｆ
ＧＦ−２（１００ｎｇ）またはＶＥＧＦ（２５０ｎｇ）のいずれかと混合し、そ
してコラーゲンゲルペレットに埋めた。次いで、このペレットを上記のようにＣ
ＡＭと接触させて配置した。図１５（ＴＮＦ−γを「ＶＥＧＩ」と名付ける）に
示すように、ＴＮＦ−γは、コラーゲンゲルへの新規な毛細管の成長を顕著に阻
害した。

【０３８８】 （実施例１１：インビボ腫瘍形成性アッセイ） 脈管形成に対するＴＮＦ−γの潜在的効果のインビボ分析を、異種移植片腫瘍
モデルを使用して実施した。この実験アプローチにおいて、１，０００，０００
個のヒト乳癌腫細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＭＤＡ−ＭＢ−４３５）を雌
性ヌードマウスの乳房脂肪パッドに、単独でか、またはＴＮＦ−γでトランスフ
ェクトしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞もしくはＣＨＯ−ベクタ
ー（５×１０⁶細胞／マウス）のみでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞と混合し
てかのいずれかで注射した。これらの実験において発現されたＴＮＦ−γポリペ
プチドは、配列番号２として示されＮ末端の２２アミノ酸を除くポリペプチドか
らなった。このＴＮＦ−γムテインのＮ末端の２２アミノ酸を、ヒトインターロ
イキン−６の分泌シグナルペプチド（Ｈｉｒａｎｏ，Ｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３２
４：７３〜７６（１９８６））によって置換した。

【０３８９】 ヒト乳癌腫細胞と、ＴＮＦ−γを発現するＣＨＯ細胞またはベクターでトラン
スフェクトされたＣＨＯ細胞のいずれかとで同時注射したマウスを、次にランダ
ム化し、そして腫瘍を毎週２回測定した。腫瘍サイズを、カリパスを用いて垂線
直径を測定することにより評価し、そして２次元でのこの直径の測定値を掛ける
ことによって計算した。データを図１６Ａおよび１６Ｂに、各群における６匹の
マウスの平均＋／−標準偏差として示す。

【０３９０】 図１６Ａおよび１６Ｂに示される結果（ここでＴＮＦ−γを「ＶＥＧＩ」と名
付ける）は、それぞれ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５の異
種移植片腫瘍のサイズ（ｍｍ²）を時間（接種後の日数）の関数として示す。腫
瘍を、０日目に始め、そして約５日間隔で約２８日にわたって測定した。各場合
において、ＴＮＦ−γを発現するＣＨＯ細胞で同時注入した乳癌腫細胞から得ら
れた腫瘍（図１６Ａおよび１６Ｂにおいて黒丸により示される）は、ベクターの
みのＣＨＯ細胞で同時注入された乳癌腫細胞から得られた腫瘍（図１６Ａおよび
１６Ｂにおいて白丸により示される）よりもサイズが有意に小さいままであった
。

【０３９１】 （実施例１２：ＴＮＦ−γによるＮＦ−κＢおよびｃ−Ｊｕｎキナーゼ（ＪＮ
Ｋ）の誘導） 細胞のＮＦ−κＢの活性化の前に、リン酸化，ユビキチン化、およびＩκＢａ
と呼ばれる内因性ＮＦ−κＢインヒビター分子の最終分解が起こる。このインヒ
ビターの分解により、ＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットが転写調節因子として作
用し得る核に転位することが可能になる。この理由のために、電気泳動移動シフ
ト分析（ＥＭＳＡ）が、培養した細胞のＴＮＦ−γでの処理により細胞のＮＦ−
κＢの活性化を分析するための適切な方法である。

【０３９２】 これらの分析において、細胞（２×１０⁶／ｍｌ）を、種々の濃度（０．１〜
１．０μｇ／ｍｌ）の細菌により生成したＴＮＦ−γで、３７℃で１２時間処理
した。次いで、核抽出物を、この培養した細胞から調製し、そしてＥＭＳＡを、
当該分野で周知であり、そして本質的に記載される（Ｓｉｎｇｈ，Ｓ．およびＡ
ｇｇａｒｗａｌ，Ｂ．Ｂ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１０６３１〜１
０６３６（１９９５））ように実施した。

【０３９３】 ＴＮＦ−γでＵ−９３７細胞を１２時間処理することにより、ＮＦ−κＢのｐ
６５サブユニットによるＤＮＡ結合の増加が生じた。ｐ６５によるＤＮＡ結合の
ピークの活性化が、Ｕ−９３７細胞を１μｇ／ｍｌのＴＮＦ−γで１２時間処理
した時に観察された。しかし、０．２μｇ／ｍｌ程度の少しのＴＮＦ−γでの１
２時間のＵ−９３７の処理は、ｐ６５のＤＮＡ結合の観察可能な増加を生じた。
ＴＮＦ−γが、Ｕ−９３７細胞における処理の開始の３０分〜１８時間後に、基
底レベルを超えてｐ６５のＤＮＡ結合を活性化することを観察した。

【０３９４】 これらの実験を、ＴＮＦ−γでの処理に応答してのＵ−９３７細胞におけるＩ
κＢａについての分解プロフィールを決定することによって仕上げた。ＩκＢａ
分解の時間経過を、ウェスタンブロット分析により決定した。ウェスタンブロッ
トは、当業者に周知であり、そしてＳｉｎｇｈおよびＡｇｇａｒｗａｌ（Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２４９９５〜２５０００（１９９５））により記載
された技術である。ＩκＢａは、Ｕ−９３７細胞を０．１〜１．０μｇ／ｍｌの
ＴＮＦ−γで１２時間処理した場合に、完全に分解された。

【０３９５】 ｃ−Ｊｕｎキナーゼ（ＪＮＫ）と名付けられた細胞性キナーゼは、細胞活性化
における初期事象である。ＴＮＦ−γによるＪＮＫの活性化を、ＴＮＦ−γでの
処理に対する細胞の反応を決定するさらなる方法として分析した。このＪＮＫキ
ナーゼ活性化アッセイは、当業者に周知であり、そしてＤｅｒｉｊａｒｄおよび
同僚（Ｃｅｌｌ ７６：１０２５〜１０２９）によって記載されている。０．１
〜３．０μｇ／ｍｌのＴＮＦ−γでのＵ−９３７細胞の１２時間の処理の後、こ
の細胞を収集し、そしてＪＮＫキナーゼ活性についてアッセイした。６時間およ
び１２時間までに、ＪＮＫ活性は、それぞれ２倍および３．６倍に増加した。

【０３９６】 （実施例１３：ラットにおけるアジュバント誘導性関節炎の処置におけるＴＮ
Ｆ−γの効果） 慢性関節リウマチ（ＲＡ）を処置するためのＴＮＦ−γの使用の分析を、ラッ
トにおけるアジュバント誘導性関節炎（ＡＩＡ）のモデルの使用によって行い得
る。ＡＩＡは十分特徴付けられており、そして当業者に周知の慢性関節リウマチ
の再現可能な動物モデルである（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ
．１５：３７９（１９５６）；Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｗｏｏｄ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ
Ｒｅｕｍ．２：４４０（１９５９））。ＴＮＦ−γは、脈管形成における増加
またはＲＡのこの動物モデルにおいて観察される骨および軟骨における侵入パン
ヌスを持続させるために必要とされる内皮細胞増殖における増加を阻害する予測
される。ＬｅｗｉｓラットおよびＢＢラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌ
ａｂ，Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｓｓａｃ
ｈｕｓｅｔｔｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡか
ら入手可能）を、これらの実験におけるアジュバント誘導性関節炎についての一
般的な株および応答性株として使用する。

【０３９７】 関節炎状態の開始を、０．１ｍｌのアジュバント（５ｍｇ／ｍｌ）の尾の基部
（ｂａｓｅ）への皮内注射によって誘導する。５〜６匹のラットの群に、０．１
〜１．０ｍｇ／ｋｇのＴＮＦ−γまたはビヒクルのいずれかを、アジュバントの
注射の２０日後に関節内に与える。この時点で、急性炎症は最大レベルに達し、
そして慢性パンヌスの形成がちょうど始まる。パンヌスの形成に対するＴＮＦ−
γの効果を、本質的にＴａｕｒｏｇおよび共同研究者（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１
６２：９６２（１９８５））によって記載される通りのアジュバント投与（ｃｈ
ａｌｌｅｎｇｅ）の１５日後以降に毎週１回、放射線学的に分析した。簡単に述
べると、ラットを、エーテルまたは抱水クロラールで麻酔し、そして方の後肢が
ともにＸ線にあらたるように配置する。Ｘ線フィルムを、骨膜反応、骨侵食、関
節空間の狭小化および破壊について、０〜３の計数システムを使用して盲目的に
試験する。ビヒクルで処置したラットにおいて有意な量の関節損傷が存在する場
合、この動物を屠殺する。この時点で、その足を、組織損傷の相対的程度および
ＴＮＦ−γがこれらの関節に対して誘発した治療効果について、組織学的に評価
した。

【０３９８】 最後に、ＴＮＦ−γ処置した動物およびビヒクル処置した動物を１週あたり２
回の臨床的評価し、後足の体積を、体積測定計（ｐｌｅｔｈｙｓｍｏｍｅｔｏｒ
）システムおよび体重を用いて評価する。

【０３９９】 （実施例１４：ＤＲ３リガンド（ＴＮＦ−γ）は２つの異なる形態で存在する
新規な抗腫瘍サイトカインでありそして異なる組織および細胞において示差的に
発現される） （背景） ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）スーパーファミリーメンバーは、細胞活性化、増殖、
分化、アポトーシス、細胞傷害性、および免疫調節において非常に重要な役割を
果たす。ＴＮＦリガンドおよびレセプタースーパーファミリーのメンバーは、し
ばしば、様々なヒト癌細胞および／または活性化リンパ球において過剰発現され
、それらの細胞外接近性は、それらを、特異的抗腫瘍治療および免疫調節治療の
ための優れた可能性のある標的にする。過去数年にわたり、ＴＮＦレセプターお
よびリガンドスーパーファミリーに属する分子のリストは、迅速に成長した。サ
イトカインのＴＮＦリガンドファミリーは、１３を超えるＩＩ型膜貫通タンパク
質（ＴＮＦ−ｂを除く）からなり、ＴＮＦレセプタースーパーファミリーは、１
８を超えるＩ型膜貫通タンパク質（分泌タンパク質であるＯＰＧ（ＯＣＩＦまた
はＴＲ１としてもまた公知）、およびＧＰ１結合型細胞表面分子であるＴＲＩＤ
／ＤｃＲ１／ＴＲＩＡＬ−Ｒ３を除く）からなる。

【０４００】 アポトーシスに関与するいくつかのＴＮＦレセプタースーパーファミリーメン
バーならびにいくつかの細胞内シグナルトランスデューサーは、「死ドメイン」
といわれるアミノ酸のストレッチ（約６０〜８０アミノ酸長）を含む。これらの
死ドメイン含有レセプター（例えば、ＴＮＦＲ１、Ｆａｓ／Ａｐｏ−１／ＣＤ９
５、ＤＲ３（Ｗｓ１、Ａｐｏ３、ＴＲＡＭＰまたはＬＡＲＤとしてもまた公知）
、ＤＲ４、ＤＲ５、またはＴＲＡＩＬ−Ｒ２）は、それらのリガンドによる活性
化によって、死ドメインを通じて細胞死を媒介する様々なタンパク質を補充する
。これらのタンパク質は、次には、それらの死ドメインまたは死エフェクタード
メインを介して他のタンパク質を補助有して、死シグナルを変換する。ＴＮＦＲ
１はほとんどの組織および細胞型において発現され、そして３つの主要な型のシ
グナルの変換に関与する：転写因子ＮＦ−κＢ、ｃ−ｊｕｎ Ｎ末端タンパク質
キナーゼおよびアポトーシスの活性化。一方、Ｆａｓは、リンパ球、肝臓、心臓
、肺、腎臓、および卵巣で発現される。対照的に、ＤＲ３は、脾臓、胸腺、およ
び末梢血リンパ球において主に発現される。ＤＲ３についてのリガンドは、まだ
同定されていない。ＤＲ３は、ＴＲＡＤＤと相互作用し、通常はＲＩＰとごく弱
く会合するが、ＴＲＡＤＤが過剰発現される場合、強力に会合する。ＴＲＡＤＤ
の存在下では、ＤＲ３はまた、ＦＡＤＤと強力に会合する。これらの結果は、Ｄ
Ｒ−３誘導性アポトーシスの機構が、ＦａｓおよびＴＮＦＲ１によって誘導され
る機構と類似であることを示唆する。ＴＮＦＲ１と同様に、ＤＲ３もまた、ＮＦ
−κＢを活性化する。

【０４０１】 本発明者らは、いくつかの検索ストラテジーを使用して、いくつかの新規なＴ
ＮＦレセプターおよびリガンドスーパーファミリーのメンバーを同定した。１つ
の新規なＴＮＦ様リガンドであるＴＮＦ−γを、内皮細胞において優先して発現
させた。ＴＮＦ−γはＴＮＦといくつかの活性を共有するが、ＴＮＦＲ１および
ＴＮＦＲ２に結合せず、このことはＴＮＦ−γが個別のレセプターに結合するこ
とを示す。ここで、本発明者らは、ＴＮＦ−γはいくつかのレセプター−リガン
ド結合アッセイにおいてＤＲ３に結合することを示す。興味深いことに、ＴＮＦ
−γは、異なる細胞および組織において示差的に発現される２つの異なる形態で
存在する。

【０４０２】 （結果および考察） 本発明者らは、６２０を超えるｃＤＮＡライブラリー由来の１５０万を超える
ＥＳＴを含むＨＧＳデータベースから、いくつかの新規なＴＮＦレセプターおよ
びリガンドスーパーファミリーのメンバーを同定した。内皮細胞ライブラリーに
おいて主に発現される１つの新規なＴＮＦ様リガンドは、ＴＮＦファミリーの他
のメンバーに２０〜３０％の配列相同性を示した。このタンパク質を、ＴＮＦ−
γ−α（または、血管内皮由来腫瘍増殖インヒビターα：Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅ
ｎｄｏｔｈｅｒｉａｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ Ｉｎｈｉ
ｂｉｔｏｒ ａｌｐｈａにちなんでＶＥＧＩａ）と命名した。続くデータベース
分析およびライブラリースクリーニングは、ＴＮＦ−γ−αの新規なスプライシ
ング改変体を同定し、ＴＮＦ−γ−β（またはＶＥＧＩｂ）と命名した。このア
イソフォームは、ＴＮＦａおよびＩＬ−１誘導性の内皮細胞、単球ならびに活性
化Ｔ細胞のｃＤＮＡライブラリーにおいて主に見出された。ＴＮＦ−γ−αにつ
いてのｃＤＮＡは１７４のアミノ酸残基をコードし、そしてＴＮＦ−γ−βにつ
いてのｃＤＮＡは２５１のアミノ酸をコードする。両方のタンパク質は、ＩＩ型
膜貫通タンパク質の特徴を有する。これらは、そのＮ末端のみで異なり、このＮ
末端は、細胞内ドメインおよび膜貫通ドメインに対応する（図１８Ａ〜Ｄおよび
１９）。

【０４０３】 組換えＴＮＦ−γは、いくつかの細胞株（例えば、ウシ肺動脈内皮細胞および
成体ウシ大動脈内皮細胞）においてアポトーシスを誘導する。（ウシ肺動脈内皮
細胞を、様々な濃度のＴＮＦ−γとともに４８時間インキュベートする。このア
ポトーシスを、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２蛍光色素（１０ｍｇ／ｍｌ）を用いて
核染色することによって評価した。）ＴＮＦ−γはまた、核因子κＢ（ＮＦ−κ
Ｂ）およびｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）の活性化を誘導し、インビト
ロでの脈管形成を阻害する。（Ｕ９３７細胞を、０．２ｍｇのレポータープラス
ミド（ＮＦ−κＢ−ＳＥＡＰ）を用いてリポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａ
ｍｉｎｅ）（製造業者の指示に従う）を使用してトランスフェクトした。トラン
スフェクトしたＵ９３７細胞を収集し、そして様々な濃度のＴＮＦ−γとともに
９６ウェルプレートに添加した（２００ｍｌ／ウェル）。３７℃にて７２時間の
インキュベーションの後、ＮＦ−κＢ活性を、４５０ｎｍの吸光度にてルミノメ
ーターを用いて測定した）。

【０４０４】 新規なレセプターおよびリガンド対を同定するために、いくつかのレセプター
−リガンド結合アッセイを確立した。全体の外部ドメインを含む組換え可溶性Ｔ
ＮＦ−γは、ＢＩＡｃｏｒｅチップに固定されたＤＲ３−Ｆｃ融合タンパク質に
結合し、精製したＤＲ３−Ｆｃもまた、ＴＮＦγが固定されたＢＩＡｃｏｒｅチ
ップに結合する。（精製したＤＲ３−ＦｃまたはＴＮＦ−γを、ＴＮＦ−γまた
はＤＲ３−Ｆｃで誘導体化したＢＩＡｃｏｒｅ装置フローセルにおいて分析した
。示したデータは、ＴＮＦ−γの固定化したＤＲ３−Ｆｃレセプターへの結合後
、またはＤＲ３−Ｆｃの固定化したＴＮＦ−γへの結合の後の、プロットの正味
の結合（オフ速度）領域を示し、これは、時間に対する相対質量単位（ＲＵ）に
おいて測定する。結合条件を、拡散を制限した条件下で高レセプターチップ密度
で行う。）免疫沈降技術を使用して、組換えＴＮＦ−γは、ＤＲ３−Ｆｃによっ
て免疫共沈したが、ＬＴｂＲ−Ｆｃ免疫付着物（ｉｍｍｕｎｏａｄｅｈｅｓｉｏ
ｎ）によってはしなかった。（Ｆｃ−ＤＲ３細胞外ドメインまたはＦｃ単独およ
び対応するリガンドを調製し、そして結合アッセイを、他の場所に記載の通りに
行った。それぞれのＦｃ融合物を、プロテインＧ−セファロースで沈殿させ、そ
して共沈した可溶性リガンドを、抗ＴＮＦ−γ抗体を用いてイムノブロッティン
グすることによって検出した。ブロッティングおよび検出を、ＢＭ Ｃｈｅｍｉ
ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇキットプロトコ
ルに記載される通りに行った）。

【０４０５】 ＤＲ３とＴＮＦ−γとの間の相互作用をさらに実証するために、本発明者らは
、いくつかの細胞株を、組換え可溶性ＴＮＦ−γに対するポリクローナル抗体を
用いてＴＮＦ−γの細胞表面発現についてスクリーニングした。ノーザンブロッ
ト分析と一致して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびヒト臍静脈内皮細胞（Ｈ
ＵＶＥＣ）は、ＴＮＦ−γに対する抗体を用いる免疫染色によれば細胞表面上に
ＴＮＦ−γを発現する。（細胞を、トリプシン処理または吸引によって収集し、
そして１５００〜２０００ｒｐｍにて５分間遠心分離した。細胞ペレットを再懸
濁し、そして５ｍｌの氷冷ＰＢＳ中で２回洗浄した。この細胞を、細胞表面上に
おけるＴＮＦ−γの発現を検出するためのＴＮＦ−γに対する抗体（１０ｍｇ／
ｍｌ）とともに、結合緩衝液（１０％ ＢＳＡ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７
．２、０．０２％ ＮａＮ３を含むＨＢＳＳ）におけるレセプターおよびリガン
ド結合についてＤＲ３−ＦｃまたはＬＴｂＲ−Ｆｃ（１０ｍｇ／ｍｌ）を用いて
、４０℃にて３０分間インキュベートした。精製したヒトＩｇＧ（２５ｍｇ／ｍ
ｌ）を、コントロールとして使用した。次いで、細胞を洗浄し、ヤギ抗ウサギＩ
ｇＧまたはヤギ抗ヒトＩｇＧに結合体化したフィコエリトリン（ＰＥ）２０ｍｇ
／ｍｌで染色した。蛍光を、ＦＡＣｓｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏ
ｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって分析し
た。）ＴＮＦ−γでトランスフェクトした２つの腫瘍細胞株（ＭＣ−３８／ＴＮ
Ｆ−γおよびＭＤＡ−２３１／ＴＮＦ−γ）もまた、細胞表面上でＴＮＦ−γを
発現する。ＦＡＣＳ分析は、ＭＣ−３８／ＴＮＦ−γ細胞をＤＲ３−Ｆｃに暴露
した後にほとんどの集団においてシフトがこのとき存在することを示した。この
ことは、ＴＮＦ−γとＤＲ３との間の細胞表面結合を示す。同様に、ＴＮＦ−γ
でトランスフェクトしたＭＤＡ−２３１細胞におけるシフトが観察された。さら
に、ＤＲ３−Ｆｃタンパク質もまた、ＨＵＶＥＣ細胞およびＰＢＭＣに結合する
。ＤＲ３発現およびＰＢＭＣに対するＴＮＦ−γ結合がＰＨＡでの延長した刺激
の後に減少することは、注目すべきである。予測したように、ＤＲ３−Ｆｃは、
用量依存性様式において活性化された、ＴＮＦ−γ誘導性ＮＦ−κＢを阻害する
。（Ｕ９３７細胞を、０．２ｍｇのレセプタープラスミド（ＮＦ−κＢ−ＳＥＡ
Ｐ）とともにリポフェクタミン（製造業者の指示に従う）を使用してトランスフ
ェクトした。トランスフェクトしたＵ９３７細胞を収集し、そして様々な濃度の
ＤＲ３−Ｆｃレセプターおよび１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−γを有する９６ウェ
ルプレートに添加した（２００ｍｌ／ウェル）。３７℃にて７２時間のインキュ
ベーションの後に、ＮＦ−κＢ活性を、ルミノメーターを用いて４５０ｎｍの吸
光度にて測定した）。

【０４０６】 ＴＮＦ−γは、バンド９ｑ３２内の染色体位置に位置する。この染色体位置は
ＣＤ３０Ｌ（９ｑ３３）に近接するが、第６染色体上のＭＨＣ複合体内に強固に
連結されるＴＮＦα、ＬＴαおよびＬＴβについての遺伝子とは異なる。興味深
いことに、ＴＮＦ−γレセプター、ＤＲ３は、第１染色体のロングアームの領域
ｐ３６．２に割り当てられた。ＤＲ３は、ＣＤ３０、ＴＮＦＲ２およびＯＸ４０
がマッピングされている領域に位置決定される。

【０４０７】 アポトーシスおよび免疫の調節におけるＴＮＦ−γおよびＤＲ３の役割、なら
びにＤＲ３のＴＮＦ−γとの相互作用に一致して、ＴＮＦ−γの局所産生は、同
系ＭＣ−３８マウス結腸癌モデルにおいてインビボにて完全な腫瘍抑制をもたら
した。同じ動物モデルにおいて、可溶性ＤＲ３（これは、ＴＮＦ−γの機能をブ
ロックし得る）の局所産生は、腫瘍増殖を促進する。（全長ＴＮＦ−γおよびＤ
Ｒ３の細胞外ドメインを、それぞれ、ｐｃＤＮＡ３発現ベクターにクローニング
し、そしてＭＣＡ３８細胞にトランスフェクトした。選択およびクローニングの
後、各構築物からの３つのクローンを、腫瘍原性研究のために拾った。ＴＮＦ−
γまたはＤＲ３細胞外ドメインを発現するＭＣＡ３８細胞（１×１０⁶細胞／マ
ウス）を、Ｃ５７ＢＬ６／６マウスに注入した。その腫瘍サイズを、カリパスを
用いて垂直直径を測定することによって評価し、そして２次元における直径の測
定値を乗算することによって計算した。データを、各群の６匹のマウスの平均±
ＳＤとして表す。）ほとんどの免疫細胞および癌細胞は、１つより多くのＴＮＦ
レセプター（１つより多い死レセプターでさえ）およびリガンドスーパーファミ
リーメンバーを発現し得ることは明白である。１つのリガンドについての複数の
レセプターまたは１つのレセプターについての複数のリガンドの存在、ならびに
レセプターまたはリガンドの複数のスプライシング改変形態は、アポトーシスお
よび免疫機能の調節における予測しなかった複雑性を示唆する。これらのレセプ
ターおよびリガンドは、機能的に余分であるようであるが、それらの発現パター
ンは異なり、このことは、個別の組織または細胞が特定の機能に特異的に関与す
ることを示唆する。さらに、これらのリガンドおよびレセプターの発現は、組織
内の個々の細胞型のレベルで異なり得、そして同じ細胞型における発現レベルも
また異なり得る。

【０４０８】 遺伝子の１０％が選択的スプライシングされ得るが、多くの場合、生成される
タンパク質の機能は不明瞭なままであると見積もられる。ＴＮＦ−γの２つのス
プライシング改変体の潜在的な機能的重要性を試験するために、ＰＣＲ分析を、
１００を超えるｃＤＮＡライブラリーにおいて行った。これらの結果を以下の表
に示す：

【０４０９】

【表３】

【０４１０】 この表に示したように、ＤＲ３および２つの形態のＴＮＦ−γは、異なる組織
および細胞において示差的に発現される。試験したライブラリーにおいて、ＤＲ
３は、ほとんどの組織において、活性化Ｔ細胞、単球、樹状細胞、ＴＨ２細胞、
およびいくつかの他の細胞株（例えば、Ｕ９３７、ＨｅＬａ）ならびに腫瘍組織
（例えば、肝細胞腫瘍およびホジキンリンパ腫）において、発現されることが見
出された。ＤＲ３の発現は、３０ｎＭの合成アンドロゲンで処置したＬＮＣＡＰ
前立腺癌腫細胞株において増加した。ＴＮＦ−γ−αは、いくつかの組織または
細胞（例えば、胎児脳、胎児心臓、脂肪、腎臓皮質、嗅上皮、膵臓癌腫およびＨ
ＵＶＥＣ）においてのみ発現される。対照的に、ＴＮＦ−γ−βは、ずっと広い
発現パターンを有する。細胞レベルでは、内皮細胞、活性化Ｔ細胞、単球、ケラ
チノサイト、ＨｅＬａおよびＪｕｒｋａｔ細胞のみが、ＴＮＦ−γ−βを発現す
る。ＨＵＶＥＣ、胎児脳、および胎児心臓のｃＤＮＡライブラリーのみが、両形
態のＴＮＦ−γおよびＤＲ３を発現する。ＴＮＦ−γ−α、ＴＮＦ−γ−β、お
よびＤＲ３は、休止Ｔ細胞または初期段階の活性化Ｔ細胞（１２時間）において
は発現されない。ＤＲ３は、１６時間で検出可能になり、そしてＤＲ３およびＴ
ＮＦ−γ−βは両方ともＰＨＡ刺激後２４時間でＴ細胞において検出可能になる
。活性化Ｔ細胞におけるＤＲ３および次いでＴＮＦ−γ−βの時間依存性誘導は
、ＤＲ３およびＴＮＦ−γが活性化誘導性アポトーシスにおいて重要な役割を果
たし得ることを示唆する。

【０４１１】 ノーザンブロットおよびｃＤＮＡデータベース分析は、ＤＲ３発現が主に、高
含量のリンパ球を有する組織において見出されたこと、ＴＮＦ−γが主に、内皮
細胞、単球および活性化Ｔ細胞において発現されたことを示した。従って、ＤＲ
３およびＴＮＦ−γは、活性化誘導性アポトーシスおよびリンパ球のネガティブ
選択に関与し得る。ＤＲ３、ＴＮＦ−γ−α、およびＴＮＦ−γ−βの異なる細
胞および組織による発現パターン。ＤＲ３またはＴＮＦ−γの異なるスプライシ
ング改変体形態の発現は、ＤＲ３媒介性アポトーシスからの感受性と保護との間
の平衡を設定するようである。アポトーシスとなる経路は高度に調節されたプロ
セスであり、そして一連のタンパク質を含むことは明らかである。

【０４１２】 ＤＲ３についての別のリガンド（Ａｐｏ３Ｌと命名された）が近年記載されて
おり、これはまた、Ｔｗｅａｋとして公開された。ＴＮＦ−γとは異なり、Ａｐ
ｏ−３Ｌ／Ｔｗｅａｋは、広範な種々の組織において発現された。これらの２つ
のＤＲ３リガンド間の相互作用および機能的重要性は、調査されるべきである。

【０４１３】 （結論） ＴＮＦスーパーファミリーの一対の新規なレセプターおよびリガンドであるＤ
Ｒ３およびＴＮＦ−γが同定された。ＴＮＦファミリーの他のリガンドとは異な
り、ＴＮＦ−γは、２つの異なる形態で存在し、そして異なる細胞および組織で
示差的に発現される。ＤＲ３の機能を調節するための機構の１つは、ＤＲ３の選
択的スプライシングを通してであることが示唆されている。選択的プレｍＲＮＡ
スプライシングは、ＤＲ３の少なくとも１１のアイソフォームを生成し、免疫応
答を形成するのを補助し得る一定範囲の機能的結果を提供する。本発明者らのデ
ータは、ＤＲ３の機能もまた、そのリガンドであるＴＮＦ−γの選択的スプライ
シングおよび示差的発現によって調節され得ることを示唆した。これらの発見は
、本発明者らがアポトーシスおよびＴＮＦレセプタースーパーファミリーの機能
の調節をどのように考えるか対して大きな影響を与える。示差的に発現された２
つのＤＲ３リガンド改変体の同定は、腫瘍のアポトーシス、免疫応答および免疫
監視機構を選択的に調節する可能性を誘起した。示差的に発現された２つのＴＮ
Ｆ−γの生理学的機能および病理学的機能のさらなる特徴付けは、ＴＮＦレセプ
ターおよびリガンドスーパーファミリーの生物学的活性および生理学的機能なら
びに治療的適用への新たな洞察を提供し得る。これらの遺伝子の役割および機構
を理解することは、本発明者らが、種々の生理学的条件および病理学的条件にお
けるアポトーシスおよび細胞増殖を調節する方法を開発することを可能にするは
ずである。

【０４１４】 （材料および方法） （アポトーシスアッセイ） ウシ肺動脈内皮細胞（ＢＰＡＥＣ）を、様々な濃度のＴＮＦ−γとともに４８
時間インキュベートした。アポトーシスを、形態学的に、およびＨｏｅｃｈｓｔ
３３３４２蛍光色素（１０ｍｇ／ｍｌ）を用いる核染色によって、３連で評価し
た。生存およびアポトーシス細胞を、４つのランダムな視野でスコアリングし、
約１，０００細胞を計数した。ＤＮＡ断片化を、以前に記載のように分析した。

【０４１５】 （ＢＩＡｃｏｒｅレセプター−リガンド結合アッセイ） 組換えレセプターＤＲ３−Ｆｃ融合タンパク質および組換えＴＮＦ−γの生成
は、先行論文に記載された。精製したＴＮＦ−γまたはＤＲ３−Ｆｃを、ＢＩＡ
ｃｏｒｅ上にそれぞれ固定した。精製したＤＲ３−ＦｃまたはＴＮＦ−γを、Ｔ
ＮＦ−γまたはＤＲ３−Ｆｃで誘導体化したＢＩＡｃｏｒｅ装置フローセルにお
いて分析した。ＴＮＦ−γの固定化したＤＲ３−Ｆｃレセプターへの結合後、ま
たはＤＲ３−Ｆｃの固定化したＴＮＦ−γへの結合の後の、プロットの正味の結
合（オフ速度）領域を、時間に対する相対質量単位（ＲＵ）において測定した。
結合条件を、拡散を制限した条件下で高レセプターチップ密度で行った。

【０４１６】 （免疫共沈およびウエスタンブロット分析） ＴＮＦ−γに対するポリクローナル抗血清を、以前に記載（Ｎｉ，Ｊ．ら、Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０８５３−１０８５８、（１９９７））の通
りに、ウサギにおいて調製した。Ｆｃ−ＤＲ３細胞外ドメインまたはＦｃ単独お
よび対応するリガンドを調製し、そして結合アッセイを、他の場所に記載の通り
に行った。それぞれのＦｃ融合物を、プロテインＧ−セファロースで沈殿させ、
そして共沈した可溶性リガンドを、抗ＴＮＦ−γ抗体を用いてイムノブロッティ
ングすることによって検出した。このサンプルを、ゲル（ＮＯＶＥＸ Ｐｒｅ−
Ｃａｓｔ Ｇｅｌｓ）（４〜２０％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｇｅｌ）にロー
ドした。ブロッティングおよび検出を、ＢＭ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎ
ｃｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇキットプロトコルに記載される通りに
行った。

【０４１７】 （ＦＡＣＳ分析） 細胞を、トリプシン処理または吸引によって収集し、そして１５００〜２００
０ｒｐｍにて５分間遠心分離した。細胞ペレットを再懸濁し、そして５ｍｌの氷
冷ＰＢＳ中で２回洗浄した。この細胞を、細胞表面上におけるＴＮＦ−γの発現
を検出するためのＴＮＦ−γに対する抗体（１０ｍｇ／ｍｌ）とともに、結合緩
衝液（１０％ ＢＳＡ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、０．０２％ Ｎａ
Ｎ３を含むＨＢＳＳ）におけるレセプターおよびリガンド結合についてＤＲ３−
ＦｃまたはＬＴｂＲ−Ｆｃ（１０ｍｇ／ｍｌ）を用いて、４０℃にて３０分間イ
ンキュベートした。精製したヒトＩｇＧ（２５ｍｇ／ｍｌ）を、コントロールと
して使用した。次いで、細胞を洗浄し、ヤギ抗ウサギＩｇＧまたはヤギ抗ヒトＩ
ｇＧに結合体化したフィコエリトリン（ＰＥ）２０ｍｇ／ｍｌで染色した。蛍光
を、ＦＡＣｓｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって分析した。

【０４１８】 （ＮＦ−κＢ−ＳＥＡＰ（分泌されたアルカリホスファターゼ）レポーターア
ッセイ） Ｕ９３７細胞を、０．２ｍｇのレポータープラスミド（ＮＦ−κＢ−ＳＥＡＰ
）を用いてリポフェクタミン（製造業者の指示に従う）を使用してトランスフェ
クトした。トランスフェクトしたＵ９３７細胞を収集し、そして様々な濃度の活
性なＴＮＦ−γまたは不活性な（煮沸した）ＴＮＦ−γとともに、あるいは様々
な濃度のＤＲ３−Ｆｃレセプターおよび１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−γと組み合
わせて、９６ウェルプレートに添加した（２００ｍｌ／ウェル）。３７℃にて７
２時間のインキュベーションの後、ＮＦ−κＢ活性を、４５０ｎｍの吸光度にて
ルミノメーターを用いて測定した。

【０４１９】 （ｃＤＮＡライブラリーの大きなコレクションにおけるＰＣＲおよびｃＤＮＡ
データベースを用いる組織および細胞分布分析） ＤＲ３、ＴＮＦ−γ−αおよびＴＮＦ−γ−βの組織分布を研究するために、
２つの遺伝子特異的プライマーを、各遺伝子について合成した。１００を超える
ｃＤＮＡライブラリーを試験し、そして陽性の予測したサイズのシグナルを生じ
たライブラリーを、＋として示す。

【０４２０】 （インビボ腫瘍原性アッセイ） 全長ＴＮＦ−γおよびＤＲ３の細胞外ドメインを、それぞれ、ｐｃＤＮＡ３発
現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニング
し、そしてＭＣＡ３８細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション、Ｇ
４１８選択およびクローニングに続いて、各構築物からの３つのクローンを、腫
瘍原性研究のために拾った。ＴＮＦ−γおよびＤＲ３のＭＣＡ３８細胞における
発現を、ノーザン分析によって確認した。ＴＮＦ−γまたはＤＲ３細胞外ドメイ
ンを発現するＭＣＡ３８細胞（１×１０⁶細胞／マウス）を、Ｃ５７ＢＬ６／６
マウスに注入した。次いで、マウスを無作為化し、そして腫瘍を毎週２回測定し
た。その腫瘍サイズを、カリパスを用いて垂直直径を測定することによって評価
し、そして２次元における直径の測定値を乗算することによって計算した。デー
タを、各群の６匹のマウスの平均±ＳＤとして表す。

【０４２１】 （実施例１５：ＴＮＦ−γ−α（ＴＮＦサイトカインファミリーの新規なメン
バー）は内皮細胞アポトーシスをもたらす） （背景） ＴＮＦ−γ−αは、２２ｋＤの分子量を有する新規なタンパク質でありこれは
、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＨＧＳ）ｃＤＮＡデータベー
スを検索することによって、最近同定された（Ｔａｎ，Ｋ．Ｂ．ら、Ｇｅｎｅ２
０４：３５−４６（１９９７））。ＴＮＦ−γ−αは、ＩＩ型膜タンパク質であ
り、そしてヒト腫瘍壊死因子ａ（ＴＮＦａ）と約３０％の配列相同性を示す。Ｔ
ＮＦファミリーのこの新たに同定されたメンバーは、内皮細胞ならびに腎臓、肺
および前立腺において豊富に発現されることが実証されている。ＨＬ−６０細胞
およびＴＨＰ１細胞におけるＴＮＦ−γ−α発現は、ＰＭＡ処置によって誘導さ
れた。照射ハイブリッドマッピングは、ＴＮＦ−γ遺伝子を染色体９ｑ３２上（
ＣＤ３０Ｌ付近）に位置決定した。内皮細胞におけるその過剰発現のために、Ｔ
ＮＦ−γ−αは、おそらく、血管機能において役割を果たすことが示唆されてい
る（Ｔａｎ，Ｋ．Ｂ．ら、Ｇｅｎｅ２０４：３５−４６）。本研究は、ＴＮＦ−
γ−αが内皮細胞のアポトーシス（様々な炎症性障害および心血管不全に寄与す
る内皮細胞損傷の１つの原因であると示唆されている現象）を誘導するか否かを
探求するために着手された（Ｂｒｙａｎｔ，Ｄ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ９
７：１３７５−１３８１（１９９８）。この可能性を試験するために、本発明者
らは、ウシ肺大動脈内皮細胞（ＢＰＡＥＣ）を使用した。これに対する、ＴＮＦ
ａ誘導性アポトーシスが実証されている（Ｐｏｌｕｎｏｖｓｋｙ，Ｖ．Ａ．ら、
Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２１４：５８４−５９４（１９９４））。アポトー
シスを、形態学的特徴（超微細構造を含む）および生化学的特徴（ＤＮＡ断片化
）に基づいて検出した。さらに、本発明者らは、ストレスキナーゼ、ストレス活
性化プロテインキナーゼ（ＳＡＰＫ／ＪＮＫ）およびｐ３８マイトジェン活性化
プロテインキナーゼ（ｐ３８ ＭＡＰＫ）、ならびにカスパーゼｓの活性に対す
るＴＮＦ−γ−αの効果を研究した。両方のシグナル伝達経路は、プログラムさ
れた細胞死に関与すると考えられている（Ｘｉａ，Ｚ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７
０：１３２６−１３３１（１９９５））。ＴＮＦ−γ−αに刺激されたＢＰＡＥ
ＣにおけるＦａｓの発現およびＢｃｌ−２の発現もまた、Ｆａｓの細胞死促進効
果およびＢｃｌ−２の抗アポトーシス効果に照らして決定した（Ｎａｇａｔａ，
Ｓ．およびＧｏｌｓｔｅｉｎ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：１４４９−１４５６
（１９９５））。

【０４２２】 （材料および方法） （材料） ＴＮＦ−γ−αタンパク質（２２ｋＤ）は、ＨＧＳにより提供された。Ａｃ−
ＹＶＡＤ−ＡＭＣおよびＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣを、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐ
ｔｉｄｅ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。ＺＶＡＤ−ｆｍ
ｋおよびＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯをそれぞれ、Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ（
Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびＰｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ
ｎａｌ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ，ＵＳＡ）から入手した。Ａｃ−ＤＱＭＤ
−ＡＭＣ、Ａｃ−ＬＥＥＤ−ＡＭＣ、Ａｃ−ＶＥＴＤ−ＡＭＣおよび抗ｐ３８
ＭＡＰＫ ｍＡｂは、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ（ＳＢ）Ｐｈａｒ
ｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ）に
より提供された。Ａｃ−ＩＥＴＤ−ＡＭＣおよびマウス抗ヒトＪＮＫ ｍＡｂを
それぞれ、Ｂｉｏｍｏｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｏ
ｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ，ＵＳＡ）およびＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ
（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。マウス可溶性ＴＮＦレセ
プター１（ｓＴＮＦＲ１）およびＴＮＦレセプター２（ｓＴＮＦＲ２）を、Ｒ＆
Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）から入手した。

【０４２３】 （細胞培養） ＢＰＡＥＣを、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）から入手した。この細胞を、１
０％熱非働化ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中で、５％ ＣＯ₂／８５％空気の加湿
環境において３７℃にて、以前（Ｙｕｅ，Ｔ．Ｌ．ら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃ
ｏｌ．５１：９５１−９６２（１９９７））に記載されたように増殖させた。サ
ブコンフルエントな密度で細胞を用いた。実験の前に、この培地を、２％ ＦＣ
Ｓを含むＤＭＥＭに変えた。１７〜２０継代からのＢＰＡＥＣを、全ての研究に
おいて用いた。

【０４２４】 （形態学的評価およびアポトーシスの定量） アポトーシスを受けている細胞を定量するために、細胞の単層を固定し、そし
てＨｏｅｃｈｓｔ ３３３２４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅ，Ｅｕｇｅｎ
ｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）で以前（Ｙｕｅ，Ｔ．Ｌ．ら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ
．５１：９５１−９６２（１９９７））に記載されたように染色した。アポトー
シスの形態学的特徴（細胞の縮小、クロマチン凝縮、水疱形成（ｂｌｅｂｂｉｎ
ｇ）および断片化）を、蛍光顕微鏡法によってモニターした。透過型電子顕微鏡
研究を、以前に（Ｙｕｅ，Ｔ．Ｌ．ら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５１：９
５１−９６２（１９９７））報告されたように行った。

【０４２５】 （ＤＮＡ断片化分析） （ａ）ＤＮＡラダー：ビヒクルまたはＴＮＦ−γ−αで処理した細胞を、１０
０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２．５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌプロテインキナーゼＫを含有
する溶解緩衝液中で溶解した。溶解産物を、５５℃にて１６時間インキュベート
した。インキュベーション後、溶解産物を、フェノ／クロロホルム／ソアミルア
ルコール（ｐｈｅｎｏ／ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／ｓｏａｍｙｌ）アルコールで３
回穏やかに抽出し、エタノール中で沈澱させ、ＤＮＡｓｅを含まないＲＮＡｓｅ
で処理し、再抽出し、そして以前に記載されたように再度沈澱させた。ＤＮＡ電
気泳動を、臭化エチジウムを含有する１．８％アガロースゲル中で実施し、そし
てＤＮＡ断片化を、紫外光の下で可視化した。

【０４２６】 （ｂ）インサイチュ末端標識（ＴＵＮＥＬ）：ＢＰＡＥＣを、２チャンバース
ライド（Ｎｕｎｃ）中で培養し、そしてＴＮＦ−γ−αで８〜２４時間処理した
。アポトーシス細胞のインサイチュ検出を、ＡｐｏｐＴａｇインサイチュアポト
ーシス検出キット（Ｏｎｃｏｒ）とともに末端デオキシリボヌクレオチドトラン
スフェラーゼ媒介ｄＵＴＰニック末端標識を製造業者の推奨に従って用いること
により行った。

【０４２７】 （ストレス活性化プロテインキナーゼ（ＳＡＪＰＫ／ＪＮＫ）アッセイ） ＳＡＰＫ活性を、以前に（Ｙｕｃ，Ｔ．Ｌ．ら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ
．５１：９５１−９６２（１９９７））記載されたようにグルタチオン−Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ ４Ｂに結合したとしてＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ₍₁〜₈₁₎を用いて測定
した。手短には、細胞を、ビヒクルまたはＴＮＦ−γ−αで処理し、洗浄し、そ
して溶解緩衝液中で溶解した。核を含まない上清を、タンパク質含量について正
規化し、そして抗ＳＡＰＫ抗体結合体化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズを用いて免疫
沈降した。混合物を、４℃にて３時間回転させた。ＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ₍₁〜₈₁₎
、１０μＣ［ｇ−³²Ｐ］−ＡＴＰ、１２５μＭ ＡＴＰおよび１００ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌを含有するリン酸化緩衝液を、アッセイ緩衝液中のＳＡＰＫ結合ビーズに添
加した。反応を、３０℃にて２０分後にタンパク質ローディング緩衝液の添加に
よって終了させ、そして９０℃にて３分間加熱した。リン酸化したタンパク質を
、１０％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＡ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍ
ｉｄｅ ｇｅｌ）電気泳動において分離し、続いてオートラジオグラフィーを行
った。バンドの強度を、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｙｕｃ，Ｔ．Ｌ．ら，
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．３０：４９５−５０７（１９９８））
によって定量した。

【０４２８】 （ｐ３８ ＭＡＰＫアッセイ） 上記のように調製した細胞溶解産物を、プロテインＡアガロースに結合させた
抗ｐ３８ ＭＡＰＫ抗体を４℃にて４時間用いて免疫沈降させた。このビーズを
以前に（Ｋｕｍａｒ，Ｓ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３０８６
４−３０８６９（１９９６））記載されたように溶解緩衝液で洗浄し、次いでキ
ナーゼ緩衝液で洗浄した。免疫複合体キナーゼアッセイを、２μｇのＧＳＴ−Ａ
ＴＦ２および５０μＭ［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ（２０ Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含有する
２５μｌのキナーゼ緩衝液の添加によって開始した。リン酸化した産物をＳＤＳ
−ＰＡＧＥ（ＳＤＡ−ＰＡＧＥ）により分離し、そしてＰｈｏｓｐｈｏｒｉｍａ
ｇｅによって可視化した。

【０４２９】 （ＢＰＡＥＣにおけるｃ−ＪＵＮの優性妨害変異体のインビトロトランスフェ
クション） 細胞を、２チャンバースライド中にプレートした。細胞を、Ｃａｌｐｈｏｓ
Ｍａｘｉｍｉｚｅｒ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）
を製造業者の推奨に従って用いて空のクローニングベクターｐＣＤＮＡ１（コン
トロール）または優性妨害ｃ−Ｊｕｎ変異体ｐｃＤＮＡ−ＦｉｇΔ１６９（Ｘｉ
ａ，Ｚ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：１３２６−１３３１（１９９５））のい
ずれか１μｇ／ｍｌと一緒に、トランスフェクトした細胞の蛍光マーカーとして
の０．５μｇ／ｍｌのＰｅｇｆｐ−ｃ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｌｉ，Ｙ．およ
びＨｏｒｗｉｔｚ，Ｍ．Ｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１０２６−１
０２８）で同時トランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を、完全
培地中で２４時間回復させた。細胞をＴＮＦ−γ−αで処理し、そしてアポトー
シス細胞の数を、「方法」に記載されるような固定後の核染色によって評価した
。

【０４３０】 （捕捉活性アッセイ） 細胞を、ＴＮＦ−γ−αのビヒクルで処理した。カスパーゼ活性アッセイを、
以前に（Ｙｕｃ，Ｔ．Ｌ．ら、前出）報告されたように行った。手短には、細胞
を収集し、そして２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０％スクロース、０．
１％ ＣＨＡＰＳ、２ｍＭ ＤＤＴ、５ｍＭ ＰＭＳＦ、および１μＭペプスタ
チンＡを含有する緩衝液中に懸濁した。この懸濁液を、２５ゲージの針に１０回
通して細胞を破壊した。ホモジネートを１００，０００×ｇにて１時間遠心分離
し、そして明澄化した溶解産物を、酵素アッセイのために用いた。細胞抽出物（
５〜２０μｇのタンパク質）をアッセイ緩衝物（表２）中に希釈し、そして３０
℃にて１０分間プレインキュベーションした後に基質を添加した。遊離された７
−アミノ−４−メチルクマリン（７−ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｃｍａ
ｒｉｎ）（ＡＭＣ）のレベルを、Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ−４０００蛍光プレートリ
ーダー（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてそれぞれ３６
０ｎｍおよび４６０ｎｍの励起波長および発光波長で測定した。

【０４３１】 （Ｆａｓ、Ｂｃｌ−２およびカスパーゼ−３発現についての免疫組織化学的分
析） 細胞を、２チャンバースライドにおいて培養した。ビヒクルまたはＴＮＦ−γ
−αでの処理後、細胞を、４％パラホルムアルデヒドを用いて４℃にて３０分間
固定し、次いで冷ＰＢＳに交換した。細胞を、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１
００で４℃にて４０分間処理し、冷ＰＢＳ中で洗浄し、次いで非特異的免疫グロ
ブリン結合部位を、正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
を室温にて１時間用いてブロックした。細胞サンプルを、一次抗体マウス抗ヒト
Ｆａｓ（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、マウス抗ヒトＢｃｌ
−２（ＤＡＫＯ）またはウサギ抗ヒトＣＰＰ３２ｐ１７ペプチドポリクローナル
抗血清（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ）とともに室温にて１時間イン
キュベートした。ネガティブコントロールとして、細胞サンプルを、一次抗体の
代わりに非免疫ＩｇＧ（Ｂｃｌ−２およびＣＰＰ３２について）またはＩｇＭ（
Ｆａｓについて）とともにインキュベートした。一次抗体とのインキュベーショ
ン後、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いでフルオレセインイソチオシアネートに結合
体化した二次抗体とともに３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、Ｖｅｅ
ｔａｓｈｉｅｌｄマウンティング媒体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ）で処理し、そして蛍光顕微鏡法（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７０）により観察し
た。

【０４３２】 （統計分析） 全ての値を、独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として示す。統計的評価を、
１元分散分析を用いることにより行った。ｐ＜０．０５の値を有する差を、有意
とみなした。

【０４３３】 （結果） （ＴＮＦ−γ−αは、ＢＰＡＥＣにおいてアポトーシスを誘導する） ＢＰＡＥＣをＴＮＦ−γ−αに暴露した場合、細胞は、縮小し、そしてその隣
接細胞から収縮し、そして細胞質が濃縮された。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３２４で
染色され、そして蛍光顕微鏡法により評価された細胞は、断片化された核の濃縮
クロマチンおよび原形質膜の水疱形成を示した。透過型電子顕微鏡を用いた研究
は、ＴＮＦ−γ−αで処理されたＢＰＡＥＣが、アポトーシスに特有の形態学的
変化（クロマチン濃縮およびアポトーシス体の出現を含む）を受けている多くの
細胞を含むことを示した。オリゴヌクレオソーム長断片化へのＤＮＡの特徴的分
解は、細胞をＴＮＦ−γ−α（３０〜３００ｎｇ／ｍｌ）に２４時間暴露した場
合に観察された。インサイチュでのＤＮＡフラグメントは、ＴＵＮＥＬ法を用い
ることによりさらに可視化された。ＴＮＦ−γ−αで処理したかなりの部分の内
皮細胞が、ポジティブ染色を示した；ビヒクルで処理した培養物においては、ポ
ジティブに染色された細胞は観察されなかった。

【０４３４】 ＴＮＦ−γ−αで誘導された内皮細胞アポトーシスは、時間依存性および濃度
依存性のプロセスであり、７２ｎｇ／ｍｌのＥＣ₃₀を有した。アポトーシスの形
態学的変化を有する細胞数の有意な増加は、ＴＮＦ−γ−αへの細胞暴露の６〜
８時間後に明らかであった。類似の条件下では、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−ａは
、１６．７±３．２％（ｎ＝４）によってＰＥＡＰＣにおいてアポトーシスを誘
導した。

【０４３５】 （ＢＰＡＥＣにおけるＴＮＦ−γ−α誘導アポトーシスに対するｓＴＮＦＲ１
およびｓＴＮＦＲ２の効果） ｓＴＮＦＲ１もｓＴＮＦＲ２も、ＢＰＡＥＣにおけるＴＮＦ−γ−α誘導アポ
トーシスに対して効果を示さなかった。同じ条件下で、ＢＰＡＨＣにおいてＴＮ
Ｆ−ａで誘導されるアポトーシスは、ｓＴＮＦＲ１によって有意に低減された。

【０４３６】 ＴＮＦ−γ−αによる内皮細胞におけるＦａｓおよびＢｃｌ−２の発現調節。
Ｆａｓタンパク質およびＢｃｌ−２タンパク質の免疫細胞化学的分析を、ＴＮＦ
−γ−αでの処理の８時間後および２４時間後に決定した。ＢＰＡＥＣにおける
Ｆａｓの基底レベルは、検出不可能であった。しかし、Ｆａｓレセプターを発現
する有意な数の細胞が、刺激の８時間後および２４時間後に検出された。マウス
ＩｇＭで一次抗体を置き換えた場合、ポジティブなＦａｓ免疫活性は検出されな
かった。対照的に、Ｂｃｌ−２発現は、未刺激細胞ＢＰＡＥＣでもＴＮＦ−γ−
α処理ＢＰＡＥＣでも検出されなかった。

【０４３７】 （ＳＡＰＫ／ＪＮＫおよびｐ−３８ ＭＡＰＫの活性化） ＢＰＡＥＣにおけるＳＡＰＫ／ＪＮＫ活性に対するＴＮＦ−γ−αの効果に関
して、ＴＮＦ−γ−αに対する内皮細胞の暴露は、ＳＡＰＫ／ＪＮＫの迅速な活
性化を誘導した。ＳＡＰＫ／ＪＮＫ活性における有意な増加は、刺激の２０分後
に検出され、４０分でピークとなり、次いで６０分後に基底レベルに戻った。内
皮細胞におけるＳＡＰＫ／ＪＮＫのＴＮＦ−γ−αにより誘導された活性化は、
濃度依存性プロセスである。ＳＡＰＫ／ＪＮＫ活性のいくつかの基底活性は、そ
れぞれ、５０ｎｇ／ｍｌおよび３００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−γ−αの存在下で基
底レベルの５．６±１．４倍（ｐ＜０．０５、ｎ＝４）および９．１±１．８倍
（ｐ＜０．０１、ｎ＝６）増加した。ＴＮＦ−γ−αは、ＢＰＡＥＣにおいてｐ
３８ ＭＡＰＫを活性化し、ＳＡＰＫ／ＪＮＫと類似の時間経過であったがより
少ない程度であった。ｐ３８ ＭＡＫＰ活性のピークは、それぞれ、１００ｎｇ
／ｍｌおよび３００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−γ−αの存在下で基底レベルの３．１
±０．５倍および３．８±０．４倍増加した。

【０４３８】 （ＢＰＡＥＣにおけるｃ−ＪＵＮの優性妨害変異体の発現によるか、またはｐ
３８ ＭＡＰＫインヒビターＳＢ２０３５８０による、ＴＮＦ−γ−α誘導アポ
トーシスに対する効果） ＢＰＡＥＣにおけるＴＮＦ−γ−α誘導アポトーシスにおけるＳＡＰＫ／ＪＮ
Ｋの役割を調査するために、本発明者らは、ＢＰＡＥＣをｃ−ＪＵＮの優性妨害
変異体ｐＣＤＮＡ１−ＦｌａｇΔ１６９でトランスフェクトした。ｐＣＤＮＡ１
−ＦｌａｇΔ１６９では、ＪＮＫ結合部位（Ｘｉａ，Ｚ．ら、前出）を含むＮＨ
２末端トランス活性化ドメインが欠失している。ＢＰＡＥＣにおける優性妨害ｃ
−ＪＵＮ構築物の発現は、ＴＮＦ−γ−α誘導性アポトーシスを６２．８％（ｐ
＜０．０５）低減させた。ＢＰＡＥＣにおけるＴＮＦ−γ−α誘導性アポトーシ
スはまた、特異的ｐ３８ ＭＡＰＫインヒビターＳＢ２０３５８０によって濃度
依存性様式で減弱された。３μＭおよび１０μＭのＳＢ２０３５８０の存在下で
は、ＴＮＦ−γ−α誘導性ＢＰＡＥＣアポトーシスは、それぞれ、３３％（ｐ＜
０．０５）および５１％（ｐ＜０．０１）低減された。ＳＢ２０３５８０の濃度
が増加した場合、さらなる阻害は観察されなかった。

【０４３９】 （ＴＮＦ−γ−αによる、ＢＰＡＥＣにおけるカスパーゼの活性化） ＴＮＦ−γ−α誘導性ＢＰＡＥＣアポトーシスは、ＴＮＦ−γ−α処理の１時
間前に培養培地に添加された、カスパーゼの不可逆的細胞透過性インヒビターで
あるＺＶＡＤ−ｆｍｋ（Ｊｏｃｏｂｓｏｎ，Ｎ．Ｌ．ら，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．
１３３：１０４１−１０５１（１９９６））により減弱された。同じ条件下では
、カスパーゼ−１の比較的特異的なインヒビターであるＡｃ−ＹＹＡＤ−ＣＨＯ
（Ｔｈｏｒｂｅｒｒｙ，Ｎ．Ａ．ら，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ）３５６：７６８
−７７４（１９９２））の添加は、１００μＭまでは、ＢＰＡＥＣレスキューの
増強において効果を示さなかった。いずれのカスパーゼファミリーのメンバーが
内皮細胞におけるＴＮＦ−γ−α誘導性アポトーシスプロセスにおいて活性化さ
れるかをさらに決定するために、本発明者らは、細胞抽出物をタンパク質分解（
ｐｒｏｔｏｃｏｌｙｔｉｃ）活性について調べた。ＡＭＣ形成の相対速度を、以
前に（Ｙｕｃ，Ｔ．Ｌ．ら，前出）記載されたように最適条件下でカスパーゼ１
、３、４、７または８に比較的特異的である一連の規定のペプチド配列改変体を
用いて測定した。類似の結果が、３回の反復実験から観察された。ＴＮＦ−γ−
α処理ＢＰＡＥＣからの細胞抽出物は、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣに対して非常に
活性であり、そしてＡｃ−ＤＱＭＤ−ＡＭＣに対してより低い程度で活性であっ
たが、カスパーゼ１、４および８についてより特異的である残りの３つの基質に
対しては活性でなかった。タンパク質分解活性は、細胞をＴＮＦ−γ−αで処理
した６時間後に現れ、２４時間でピークとなり、そして４８時間以内に徐々に基
底レベルに戻った。ＴＮＦ−γ−α細胞処理細胞抽出物と組換えカスパーゼ−３
とによる４つの基質の加水分解速度の相対速度を比較した。４つの基質の２つの
酵素供給源の相対速度は非常に類似した。

【０４４０】 カスパーゼ−３が、ＢＰＡＥＣにおいてＴＮＦ−γ−αによって活性化される
ことをさらに確認するために、その酵素的に活性な形態である１７−ｋＤサブユ
ニットの免疫細胞化学的検出を行った。抗体を、ｐ１７サブユニットのＣ末端部
分からのペプチドに対して惹起させた。「ｐ−１０」サブユニットと「ｐ−２０
」サブユニットとの間に特異的切断が存在するならば、ネオエピトープ（ｎｅｏ
ｅｐｉｔｏｐｅ）抗体のみが、カスパーゼ−３に結合する。このネオエピトープ
抗体を用いて、プロセシングされたカスパーゼ−３のみが検出され、プロ酵素は
検出されない（Ｙｕｃ，Ｔ．Ｌ．ら、前出）。カスパーゼ−３の１７ｋＤサブユ
ニットは、ＴＮＦ−γ−α処理されたＢＰＡＥＣで検出されたがビヒクルで処理
されたＢＰＡＥＣでは検出されず、そして細胞内の断片化した核とともに局在し
た。

【０４４１】 （考察） 本研究において提示される研究は、ＴＮＦ−γ−α、新規なＴＮＦ様サイトカ
インおよびＩＩ型膜貫通タンパク質が、形態学的および生化学的基準によって反
映されるように、培養された内皮細胞において強力なアポトーシスを誘導するこ
とを実証する。本発明者らの実験条件下では、自発的ＢＰＡＥＣ死は、約２％〜
約４％であった。これは、以前の観察と一致する（Ｐｏｌｕｎｏｖｓｋｙ，Ｖ．
Ａ．ら、前出）。ＴＮＦ−γ−αの効果は濃度依存性であり、ＥＣ₈₀値は７２ｎ
ｇ／ｍｌ（３．５ｎＭ）であり、そして有意な数のアポトーシス細胞が処理の６
〜８時間後に検出された。さらに、プロアポトーシス遺伝子Ｆａｓの発現は、Ｔ
ＮＦ−γ−α処理ＢＰＡＥＣにおいて実証された。このことは、以前に（Ｙｕｃ
，Ｔ．Ｌ．ら、前出）報告されたアポトーシス内皮細胞において観察されたこと
と一致する。

【０４４２】 レセプター媒介ＴＮＦ−γ−α活性は、未だ同定されていない。ＴＮＦ−γ−
αが別個のレセプターを介して作用するか否かを調べるために、本発明者らは、
ＢＰＡＥＣにおけるＴＮＦ−γ−α誘導性アポトーシスに対するｓＴＮＦＲ１お
よびｓＴＮＦＲ２の効果を試験した。これらの２つのＴＮＦＲは、応答性細胞株
に対する細胞表面のＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２媒介性ＴＮＦ生物活性をブロッ
クすることが以前に示されている（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓからのデータ）。ｓ
ＴＮＦＲ１もｓＴＮＦＲ２も、ＢＰＡＥＣに対するＴＮＦ−γ−αの効果を阻害
しなかった。対照的に、ＢＰＡＥＣにおけるＴＮＦａ誘導性アポトーシスは、ｓ
ＴＮＦ１によって有意に減少した。この結果は、ＴＮＦ−γ−α誘導性細胞死が
、ｓＴＮＦＲ１からもＴＮＦＲ２からも独立していることを明らかに示唆する。

【０４４３】 ＴＮＦファミリーのメンバーについての近年の研究努力は、ＴＮＦａおよびＦ
ａｓが、ストレスプロテインキナーゼＳＡＰＫ／ＪＮＫおよびｐ３８ ＭＡＰＫ
を種々の細胞型において活性化することを示した（Ｓｌｕｓｓ，Ｈ．Ｋ．ら，Ｃ
ｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４：８３７６−８３８４（１９９４））が、ＳＡＰＫおよ
びｐ３８ ＭＡＰＫに対するこのファミリーの他のメンバーの効果は、十分には
研究されていない。さらに、ＴＮＦａまたはＦａｓ媒介細胞死におけるＳＡＰＫ
／ＪＮＫおよびｐ３８ ＭＡＰＫの役割に関する論争が報告されている。例えば
、ＴＮＦａ誘導性アポトーシスは、Ｕ９３７細胞におけるＪＮＫ活性に依存する
（Ｖｅｒｊｅｉｊ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ）３８０：７５−７９（１
９９５）；Ｚａｎｋｅ，Ｂ．Ｗ．ら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：６０６−６１３
（１９９６））が、線維芽細胞におけるＪＮＫ活性には依存しない（Ｒｅｉｎｈ
ａｒｄ，Ｃ．ら，ＥＭＢＯ Ｊ．１６：１０８０−１０９２（１９９７））。こ
のことは、ＪＮＫ活性化の結果が、細胞型によってかなり異なることを示す。Ｆ
ａｓ媒介ＪＮＫ活性化は、ＴＮＦａの反応速度とは異なる反応速度で生じる。こ
のことは、ＴＮＦａおよびＦａｓが、異なる機構を介してＪＮＫを活性化する可
能性が最も高いことを示唆する（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｄ．Ｌ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．２６：９８９−９９４（１９９６））。さらに、Ｊｕｏらは、特異
的ｐ３８ ＭＡＰＫインヒビターによるｐ３８ ＭＡＰＫの遮断が、Ｊｕｒｋａ
ｔ細胞におけるＦａｓ媒介性アポトーシスに影響を与えないことを近年報告した
（Ｊｕｏ，Ｐ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７：２４−３５（１９９７
））。それゆえ、本発明者らは、ＴＮＦ−γ−αかＪＮＫおよびｐ３８ ＭＡＰ
Ｋを活性化するか否かを見出すこと、およびＢＰＡＥＣにおけるＴＮＦ−γ−α
媒介アポトーシスにおけるこの活性化の役割が何であるかに興味を抱いた。本調
査は、ＪＮＫおよびｐ３８ ＭＡＰＫの両方が、ＴＮＦａ活性化Ｕ９３７におい
て観察されたのと類似の様式でＴＮＦ−γ−αによって迅速に活性化されたこと
を明らかに実証する。さらに、ＢＰＡＥＣにおけるｃ−ＪＵＮの優性妨害変異体
の発現は、ＴＮＦ−γ−α誘導性細胞死を低減させた。このことは、ＢＰＡＥＣ
におけるＴＮＦ−γ−α誘導性アポトーシスが、ＪＮＫ活性と依存したことを示
す。ＢＰＡＥＣにおけるＴＮＦ−γ−α媒介アポトーシスにおけるｐ３８ ＭＡ
ＰＫの潜在的関与に取り組むために、特異的ｐ３８ ＭＡＰＫインヒビターＳＢ
２０３５８０を試験した。このインヒビターは、試験した種々のキナーゼ（ＪＮ
ＫおよびＥＲＫ−１を含む）に対して影響を与えることなく、ｐ３８ ＭＡＰＫ
活性をインビトロで特異的に阻害することが示された（Ｃｕｅｎｄａ，Ａ．ら、
ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３６４：２２９−２３３（１９９５））。ＢＰＡＥＣにお
けるＴＮＦ−γ−α誘導性アポトーシスはもまた、ＳＢ２０３５８０によって濃
度依存性様式で低減された。このことは、ｐ３８ ＭＡＰＫシグナル伝達経路が
、ＴＮＦ−γ−α媒介ＢＰＡＥＣアポトーシスに関与することを示す。この効果
は、ＳＢ２０３５８０が防御効果を有さなかったＪｕｒｋａｔ細胞におけるＦａ
ｓ媒介性アポトーシスにおいて観察されたこととは異なる（Ｊｕｏ，Ｐ．ら、前
出）。さらに、ＴＮＦ−γ−α誘導性ｐ３８ ＭＡＰＬ活性化は、ｐ３８ ＭＡ
ＰＫ活性化のピークがＦａｓによる刺激の２〜４時間後に見られたＪｕｒｋａｔ
細胞において観察された反応速度よりも速い、ＢＰＡＥＣにおける絶対必要なよ
り速い反応速度について生じる。このことは、ＴＮＦ−γ−αおよびＦａｓが、
異なる結果を有する異なる機構を通してｐ３８ ＭＡＰＫを活性化する可能性が
最も高いことを示す。本発明者らのデータは、ＴＮＦファミリーの異なるメンバ
ーが、細胞死を媒介する異なるシグナル伝達経路を有し得るかまたは異なる細胞
型において異なる効果を有し得ることをさらに示唆する。

【０４４４】 近年の研究は、カスパーゼファミリーのメンバーについての、アポトーシスの
エフェクターとしての中心的な役割を支持した（Ｋｕｍａｒ，Ｓ．Ｍ．ら、前出
）。しかし、内皮細胞アポトーシスにおけるカスパーゼの役割は、十分には探究
されていない。カスパーゼファミリーの２つの特有の特徴が解明されている；こ
れらは、その標的タンパク質を特定のアスパラギン酸の後ろで切断し、一緒にな
ってこの酵素の活性部位を形成する２つのサブユニットをもたらす（Ｎｉｃｈｏ
ｌｓｏｎ，Ｄ．Ｗ．ら，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ）３７６：３７−４３（１９９
５）；Ｋｕｍａｒ，Ｓ．Ｍ．ら、前出）。カスパーゼファミリーの中でも、カス
パーゼ−３（ＣＰＰ３２）は、アポトーシスの間のタンパク質分解性カスケード
の中心的成分と考えられており、そしてこのファミリーにおいて重要な役割を果
たす（Ｗａｎｇ，Ｘ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１５：１０１２−１０２０（１９９６）
；Ｗｏｏ，Ｍ．ら，Ｇｅｎｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２：８０６−８１９
（１９９８））。ＴＮＦ−γ−α誘導性ＢＰＡＥＣアポトーシスは、ＺＶＡＤ−
ｆｍｋによって阻害された。このことは、アポトーシスについてこのエフェクタ
ー経路におけるカスパーゼファミリーの潜在的役割を示す。どのカスパーゼファ
ミリーのメンバーが関与するかを決定するために、本発明者らは、カスパーゼ１
、３、４、７および８について比較的特異的である６つの異なる基質からのＡＭ
Ｃ形成の相対速度を測定することにより、ＴＮＦ−γ−α活性化ＢＰＡＥＣから
の抽出物におけるタンパク質分解活性の基質特異性を調べた（Ｔａｌａｎｉａｎ
，Ｒ．Ｖ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：９６７７−９６８２（１９９
７））。ＴＮＦ−γ−αでのＢＰＡＥＣの処理は、主にＤＥＶＤ−ＡＭＣに対す
る、そしてある程度のＤＱＭＤ−ＡＭＣに対する、タンパク質分解活性（ｐｒｏ
ｔｃｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）における有意な増加をもたらした。ＤＥ
ＶＤ−ＡＭＣおよびＤＱＭＤ−ＡＭＣの両方は、カスパーゼ−３について比較的
特異性を示す（Ｋｕｍａｒ，Ｓ．Ｍ．ら、前出）。Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＡＭＣ、Ｌ
ＥＥＤ−ＡＭＣまたはＶＥＴＤ−ＡＭＣを基質として用いた場合、ＴＮＦ−γ−
α活性化細胞抽出物におけるタンパク質分解活性（ｐｒｏｔｃｏｌｙｔｉｃ ａ
ｃｔｉｖｉｔｙ）における誘導は存在しなかった。このことは、カスパーゼ１、
４および８が関与しないかもしれないことを示す。さらに、ＴＮＦ−γ−α処理
ＢＰＡＥＣからの抽出物と組換えカスパーゼ−３との基質特異性の比較は、類似
のパターンを示した。このことは、カスパーゼ−３が、ＴＮＦ−γ−αによって
活性化されるカスパーゼファミリーの主なメンバーであり得ることをさらに示唆
する。さらに、免疫細胞化学的研究によって、ＴＮＦ−γ−α処理ＢＰＡＥＣ中
に活性形態のカスパーゼ−３が検出された。複数のカスパーゼホモログが、ＨＬ
−６０細胞におけるエトポシド誘導性アポトーシスにおいて細胞質および核の両
方に見出されることが報告された（Ｍａｒｔｉｎｓ，Ｉ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：７４２１−７４３０（１９９７））。興味深いこ
とに、ＴＮＦ−γ−α誘導性アポトーシスＢＰＡＥＣにおいては、カスパーゼ−
３の免疫反応性１７ｋＤサブユニットが、断片化した核のみに局在した。このこ
とは、ＴＮＦ−γ−α誘導性アポトーシスにおけるカスパーゼ−３の役割をさら
に示す。この活性カスパーゼ−３が核へと輸送されるか、または不活性なカスパ
ーゼ−３が既に核に存在していてＴＮＦ−γ−αによって促進される活性化を待
っているのかは、さらに調査する必要がある。まとめて考えると、これらの結果
は、カスパーゼ−３が、ＴＮＦ−γ−α誘導性細胞アポトーシスによって活性化
されたことを示唆する。しかし、本発明者らの結果は、ＴＮＦ−γ−α誘導性ア
ポトーシスを媒介する際に、このファミリーの他のメンバー、特にカスパーゼ−
３に密接に関連するメンバー（例えば、カスパーゼ−７）を排除できない。さら
に、ＺＶＡＤ−ｆｍｋは、ＢＰＡＥＣにおけるＴＮＦ−γ−α誘導性アポトーシ
スを阻害する際に、より初期の時点（１４時間）と比較して、より後の時点（３
０時間）ではあまり効果がなかった。このことは、ネガティブフィードバック機
構のカスパーゼ依存性が、ＴＮＦ−γ−α誘導性ＢＰＡＥＣアポトーシスの、よ
り後の相に存在し得ることを示唆する。

【０４４５】 まとめると、本研究は、ＴＮＦサイトカインファミリーの新規のメンバーであ
るＴＮＦ−γ−αが、内皮細胞アポトーシスを引き起こすことを実証した。ＴＮ
Ｆ−γ−αは、ＴＮＦレセプター１ともＴＮＦレセプター２とも異なるレセプタ
ーを介して作用するようである。ＴＮＦ−γ−αの効果は、ストレスタンパク質
キナーゼＳＡＰＫ／ＪＮＫおよびｐ３８ ＭＡＰＫ、ならびにカスパーゼ（主に
カスパーゼ−３様プロテアーゼ）の活性化を介してである。アポトーシス性のプ
ログラムされた細胞死は、種々の炎症性障害および心臓血管損傷に寄与する内皮
細胞損傷の原因であることが示唆された（Ｋａｒｓａｎ，Ａ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｃ
ａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．８：１９−２４（１９９８））。さらに、内皮細
胞アポトーシスは、抗脈管形成プロセスと脈管形成促進プロセスとの間の平衡に
関与する重要な機構であり得、そしてこの平衡が失われると、種々の疾患（例え
ば、固形腫瘍転移および網膜症）になる（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．およびＳｈｉｎ
ｇ，Ｊ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１０９３１−１０９３４（１９９２
）；Ｂｒｏｏｋｓ，Ｐ．Ｃ．ら，Ｃｅｌｌ ７９：１１５７−１１６４（１９９
４））。

【０４４６】 本発明の多数の改変および変形が、上記の教示を考慮すれば可能であり、それ
ゆえ、添付の特許請求の範囲の範囲内で、本発明は、特に記載された以外にも実
施され得る。

【０４４７】 本明細書中に引用される全ての刊行物（特許、特許出願、雑誌文献、研究マニ
ュアルまたは他の文書を含む）の全体的な開示は、本明細書中に参考として援用
される。

【０４４８】 さらに、コンピュータおよび紙の様式で本明細書とともに提出した配列表は、
その全体が本明細書中に参考として援用される。

【０４４９】

【表４】

【０４５０】

【表５】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

以下の図は、本発明の実施態様の例示であり、そして特許請求の範囲に包含さ
れる本発明の範囲を制限することを意味しない。

【図１】 図１は、本発明のＴＮＦ−γ−αのポリペプチドのｃＤＮＡ（配列番号１）お
よび対応する推定アミノ酸配列（配列番号２）を例示する。最初の２７アミノ酸
（下線を付している）は、推定のリーダー配列である。アミノ酸についての標準
的な一文字略語が、使用される。潜在的なアスパラギン連結グリコシル化部位は
、ＴＮＦ−γ−αアミノ酸配列中の太字のアスパラギン記号（Ｎ）およびＴＮＦ
−γ−αヌクレオチド配列中でアスパラギン残基をコードする最初のヌクレオチ
ド上の太字のポンド記号（ｐｏｕｎｄ ｓｉｇｎ）（＃）により、図１中に印付
けられる。潜在的なＮ連結グリコシル化配列は、ＴＮＦ−γ−αアミノ酸配列中
の以下の位置において見出される：Ｎ２９〜Ｎ−３２（Ｎ−２９、Ｙ−３０、Ｔ
−３１、Ｎ−３２）およびＮ−１２５〜Ｄ１２８（Ｎ−１２５、Ｖ−１２６、Ｓ
−１２７、Ｄ−１２８）。潜在的なプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）リン酸化部
位はまた、ＴＮＦ−γ−αアミノ酸配列中の太字のスレオニン記号（Ｔ）および
ＴＮＦ−γ−αヌクレオチド配列中のスレオニン残基をコードする最初のヌクレ
オチド上のアスタリスク（＊）により、図１中に印付けられる。潜在的なＰＫＣ
リン酸化配列は、ＴＮＦ−γ−αアミノ酸配列中の以下の位置において見出され
る：Ｔ−３２〜Ｋ−３４（Ｔ−３２、Ｎ−３３、Ｋ−３４）およびＴ−５０〜Ｒ
−５２（Ｔ−５０、Ｆ−５１、Ｒ−５２）。潜在的なカゼインキナーゼＩＩ（Ｃ
Ｋ２）リン酸化部位もまた、ＴＮＦ−γ−αアミノ酸配列中の太字のセリンまた
はスレオニン記号（ＳまたはＴ）およびＴＮＦ−γ−αヌクレオチド配列中の適
切なセリンまたはスレオニン残基をコードする第１のヌクレオチド上のアスタリ
スク（＊）により、図１中に印付けられる。潜在的なＣＫ２リン酸化配列は、Ｔ
ＮＦ−γ−αアミノ酸配列中の以下の位置において見出される：Ｓ−８３〜Ｅ−
８６（Ｓ−８３、Ｙ−８４、Ｐ−８５、Ｅ−８６）；Ｓ−９６〜Ｅ−９９（Ｓ−
９６、Ｖ−９７、Ｃ−９８、Ｅ−９９）；Ｓ−１１５〜Ｅ−１１８（Ｓ−１１５
、Ｌ−１１６、Ｑ−１１７、Ｅ−１１８）；Ｓ−１３０〜Ｄ−１３３（Ｓ−１３
０、Ｌ−１３１、Ｖ−１３２、Ｄ−１３３）；およびＴ−１３５〜Ｄ−１３８（
Ｔ−１３５、Ｋ−１３６、Ｅ−１３７、Ｄ−１３８）。潜在的なミリスチル化部
位はまた、ＴＮＦ−γ−αアミノ酸配列中の二重下線により、図１中に印付けら
れる。潜在的なミリスチル化配列は、ＴＮＦ−γ−αアミノ酸配列中の以下の位
置において見出される：Ｇ−２０〜Ｋ−２５（Ｇ−２０、Ｌ−２１、Ａ−２２、
Ｆ−２３、Ｔ−２４、Ｋ−２５）およびＧ−１１１〜Ｌ−１１６（Ｇ−１１１、
Ａ−１１２、Ｍ−１１３、Ｆ−１１４、Ｓ−１１５、Ｌ−１１６）。

【図２Ａ】 図２Ａ〜Ｃは、ＴＮＦ−γ−α（配列番号２）と、ヒトＴＮＦαを誘導するＴ
ＦＮファミリーの他のメンバー（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｚ１５０２６；配列番
号３）、ヒトＴＮＦ−β（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｚ１５０２６；配列番号４）
、ヒトリンホトキシンβ（ＬＴβ；ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｌ１１０１６；配列
番号５）、およびヒトＦａｓリガンド（ＦＡＳＬ；ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｕ１
１８２１；配列番号６）との間のアミノ酸配列アラインメントを例示する。ＴＮ
Ｆ−γは、四角で囲まれ、そして影を付けられた領域によって示されるようにＴ
ＮＦファミリーの保存されたアミノ酸残基を含む。整列された分子は、図２Ａ、
図２Ｂ、および図２Ｃ全体において提示される。

【図２Ｂ】 図２Ａ〜Ｃは、ＴＮＦ−γ−α（配列番号２）と、ヒトＴＮＦαを誘導するＴ
ＦＮファミリーの他のメンバー（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｚ１５０２６；配列番
号３）、ヒトＴＮＦ−β（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｚ１５０２６；配列番号４）
、ヒトリンホトキシンβ（ＬＴβ；ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｌ１１０１６；配列
番号５）、およびヒトＦａｓリガンド（ＦＡＳＬ；ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｕ１
１８２１；配列番号６）との間のアミノ酸配列アラインメントを例示する。ＴＮ
Ｆ−γは、四角で囲まれ、そして影を付けられた領域によって示されるようにＴ
ＮＦファミリーの保存されたアミノ酸残基を含む。整列された分子は、図２Ａ、
図２Ｂ、および図２Ｃ全体において提示される。

【図２Ｃ】 図２Ａ〜Ｃは、ＴＮＦ−γ−α（配列番号２）と、ヒトＴＮＦαを誘導するＴ
ＦＮファミリーの他のメンバー（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｚ１５０２６；配列番
号３）、ヒトＴＮＦ−β（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｚ１５０２６；配列番号４）
、ヒトリンホトキシンβ（ＬＴβ；ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｌ１１０１６；配列
番号５）、およびヒトＦａｓリガンド（ＦＡＳＬ；ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｕ１
１８２１；配列番号６）との間のアミノ酸配列アラインメントを例示する。ＴＮ
Ｆ−γは、四角で囲まれ、そして影を付けられた領域によって示されるようにＴ
ＮＦファミリーの保存されたアミノ酸残基を含む。整列された分子は、図２Ａ、
図２Ｂ、および図２Ｃ全体において提示される。

【図３】 図３Ａは、ＴＮＦ−γが発現されるヒト組織を示すＲＮＡブロット分析である
。示される組織由来のＲＮＡを、標識化ＴＮＦ−γ ｃＤＮＡでプローブした。
図３Ａは別個のバンドを示すので、ＴＮＦ−γ−α ｍＲＮＡは主に腎臓に存在
する。他のレーンは強力なハイブリダイゼーションを示すが、これらは、実際に
非特異的スミアである。 図３Ｂは、ＴＮＦ−γが主にＨＵＶＥＣ細胞（ヒト臍静脈内皮細胞；レーン９
）において発現されることを示すＲＮＡブロット分析である。レーン６およびレ
ーン８は、非特異的スミアである。示された細胞株由来のＲＮＡを、標識化ＴＮ
Ｆ−γ−α ｃＤＮＡでプローブした。レーン１はＣＡＭＡ１（乳癌）；レーン
２はＡＮ３ＣＡ（子宮癌）；レーン３はＳＫ．ＵＴ．１（子宮癌）；レーン４は
ＭＧ６３（骨芽細胞腫）；レーン５はＨＯＳ（骨芽細胞腫）；レーン６はＭＣＦ
７（乳癌）；レーン７はＯＶＣＡＲ−３（卵巣癌）；レーン８はＣＡＯＶ−３（
卵巣癌）；レーン９はＨＵＶＥＣ；レーン１０はＡＯＳＭＩＣ（平滑筋）；レー
ン１１は包皮線維芽細胞である。

【図４】 図４は、増殖性内皮細胞または休止内皮細胞におけるＴＮＦ−γの相対的な発
現を例示する。培養されたＨＵＶＥＣ細胞におけるＴＮＦ−γ ｍＲＮＡレベル
を、ノーザンブロッティング分析によって決定した。同じ量の総ＲＮＡ（１５μ
ｇ）を、βアクチンの強度によって示されるように、各レーン上に負荷した。Ｔ
ＮＦ−γに対応するシグナルは、「ＶＥＧＩ」と示される。総ＲＮＡを、示され
た時点（接種後の日）において調製した。各培養フラスコにおける細胞の数を、
同時に決定した。実験を、二連で実施した。細胞を、フラスコあたり１２５，０
００個の細胞で接種した（Ｔ−２５）。

【図５】 図５は、ＴＮＦ−γタンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動分析の写真
である。ＴＮＦ−γを、細菌性発現によって産生し、そして実施例１に記載され
るように精製した。

【図６】 図６は、バキュロウイルスで発現されたＴＮＦ−γの相対的純度および移動度
を示すゲルの写真である。バキュロウイルス系を使用するＴＮＦ−γの発現およ
び精製は、実施例２に記載される。

【図７Ａ】 図７Ａは、未処理（図７Ａａ）、ならびにＴＮＦ−α（図７Ａｂ）、ＴＮＦ−
γ（図７Ａｃ）およびＴＮＦ−β（図７Ａｄ）に曝露後の、ＷＥＨＩ１６４細胞
の写真からなる。伸長された非球状形態を有する細胞が、溶解された。種々のＴ
ＮＦ分子を，約０．５μｇ／ｍｌの濃度で添加した。写真を、種々のＴＮＦ分子
の添加の７２時間後に撮った。

【図７Ｂ】 図７Ｂは、ＴＮＦ−γ（図７Ｂｃ）がＷＥＨＩ１６４細胞増殖を阻害する能力
を、ＴＮＦ−α（図７Ｂａ）およびＴＮＦ−β（図７Ｂｂ）と比較して例示する
。

【図８】 図８は、未処理Ｌ９２９細胞（図８Ａ）に対して、組換えＴＮＦ−α（図８Ｂ
）、ＴＮＦ−β（図８Ｄ）、およびＴＮＦ−γ（図８Ｃ）のＬ９２９細胞におけ
る形態学的変化を誘導する能力を例示する。形態学的変化は、球状の暗細胞によ
って示される。細胞を、約０．５μｇ／ｍｌで種々の組換えＴＮＦ分子（Ｅ．ｃ
ｏｌｉ中に産生される）で処理した。写真を、種々のＴＮＦ分子の添加の７２時
間後に撮った。形態学的変化は、細胞が殺傷されたことを示す。

【図９】 図９は、血管内皮細胞に対するＴＮＦ−γ（図９Ｃ）、ＴＮＦ−α（図９Ａ）
、およびＴＮＦ−β（図９Ｂ）の効果のグラフ図である。血管内皮細胞が市販の
ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βならびにＥ．ｃｏｌｉに産生されたＴＮＦ−γで処
理された後の細胞増殖を、ＭＴＳアッセイを使用して定量した。

【図１０】 図１０は、内皮細胞および乳癌細胞の増殖に対するＴＮＦ−γの効果を示す。
細胞の数は、示されるようにＴＮＦ−γ濃度に対してプロットされる（ＴＮＦ−
γは、この図において「ＶＥＧＩ」と示される）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（
黒三角）またはＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞（白丸）の増殖ではなく、成体ウシ大
動脈内皮（ＡＢＡＥ）細胞（黒丸）の増殖の阻害が、示される。細胞を、２４ウ
ェルプレート中に３組で、２×１０³細胞／ウェルで接種した。ＡＢＡＥ細胞培
養培地は、１０％ ＦＣＳおよび（１ｎｇ／ｍｌ）ＦＧＦ−２を補充したＩＭＥ
Ｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍ
Ｄ）を含んだ。この培養物を、６日間、３７℃、５％ ＣＯ₂で維持した。次い
で、細胞をトリプシン処理し、そして細胞の数をＣｏｕｌｔｅｒカウンターを使
用することによって決定した。回収したＡＢＡＥ細胞の総数の１／５が、ＭＤＡ
−ＭＢ−２３１細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞との比較を標準化するため
に示される。

【図１１】 図１１は、離れて拡散しているＨＬ６０細胞を示すコントロール（図１１Ａ）
を有する、ＨＬ６０細胞の写真である；ＴＮＦ−α（図１１Ｂ）およびＴＮＦ−
γ（図１１Ｃ）は、右下において共に接着している細胞によって例示されるよう
な細胞接着および細胞間接触を誘導する。

【図１２】 図１２は、組換ＴＮＦ−γ（四角によって示される）、ＴＮＦ−α（丸によっ
て示される）、およびＴＮＦ−β（三角によって示される）がＷＥＨＩ １６４
細胞死を誘導する能力を例示する。細胞死は、４９０ｎｍの吸光度に対する４０
５ｎｍの吸光度の比に反比例する。

【図１３】 図１３は、ＴＮＦ−γが２つの既知の可溶性ＴＮＦレセプター（すなわち、ｓ
ＴＮＦ ＲＩ（ｐ５５；黒棒）およびｓＴＮＦ ＲＩＩ（ｐ７５；陰影を付され
た棒））に有意に結合しないことを例示する。

【図１４】 図１４は、ＡＢＡＥ細胞がコラーゲンゲル上で毛細管様管を形成する能力に対
するＴＮＦ−γの効果を実証する。組換えＴＮＦ−γ（配列番号２中に示される
ような残基１２〜１４７、およびこの図において「ＶＥＧＩ」と示される）がＡ
ＢＡＥ細胞による毛細管様管の形成を阻害する能力を示す。カラムの上に与えら
れたｐ値（ｔ検定）は、ＴＮＦ−γが培養培地を含まない場合に対して、示され
るように、種々の濃度のＴＮＦ−γの存在下でＡＢＡＥ細胞による毛細管様管形
成の程度を比較することによって獲得される。

【図１５】 図１５は、ＴＮＦ−γによるニワトリ胚絨毛尿膜（ＣＡＭ）上に配置されたコ
ラーゲンゲルにおける新脈管形成の阻害を示す。ＣＡＭ上に配置されたコラーゲ
ンゲルペレットへの新たな毛細管の増殖を、ＦＧＦ−２（１００ｎｇ）またはＶ
ＥＧＦ（２５０ｎｇ）のいずれかによって誘導した。このゲルにおける新脈管形
成の程度を、ＣＡＭ循環へ注射したＦＩＴＣ−デキストランの蛍光強度の上昇に
よって決定した。１００より低い値によって示されるような組換えＴＮＦ−γ（
この図において「ＶＥＧＩ」と示される）による毛細管増殖の阻害が、示される
。この実験を三連で実施した。

【図１６Ａ】 図１６は、ＴＮＦ−γによる無胸腺症ヌードマウスにおけるヒト乳癌異種移植
片腫瘍の増殖の阻害を例示する。ＴＮＦ−γ過剰発現ＣＨＯ細胞またはベクター
をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞（５×１０⁶細胞／注射）およびヒト乳癌細
胞（１×１０⁶細胞／注射）の混合物を、ヌードマウスの乳房脂肪パッドへ注射
した。腫瘍サイズ（面積）を、注射の後にモニターした。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１
異種移植片腫瘍のサイズ（ｍｍ²）を、接種後の日の関数としてプロットした（
図１６Ａ）。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片腫瘍のサイズ（ｍｍ²）を、接種
後の日の関数としてプロットした（図１６Ｂ）。白丸は、ベクターをトランスフ
ェクトしたＣＨＯ細胞で同時接種した腫瘍の値を示す。それに対し、黒丸はＴＮ
Ｆ−γをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞で同時接種した腫瘍の値を示す。

【図１６Ｂ】 図１６は、ＴＮＦ−γによる無胸腺症ヌードマウスにおけるヒト乳癌異種移植
片腫瘍の増殖の阻害を例示する。ＴＮＦ−γ過剰発現ＣＨＯ細胞またはベクター
をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞（５×１０⁶細胞／注射）およびヒト乳癌細
胞（１×１０⁶細胞／注射）の混合物を、ヌードマウスの乳房脂肪パッドへ注射
した。腫瘍サイズ（面積）を、注射の後にモニターした。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１
異種移植片腫瘍のサイズ（ｍｍ²）を、接種後の日の関数としてプロットした（
図１６Ａ）。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片腫瘍のサイズ（ｍｍ²）を、接種
後の日の関数としてプロットした（図１６Ｂ）。白丸は、ベクターをトランスフ
ェクトしたＣＨＯ細胞で同時接種した腫瘍の値を示す。それに対し、黒丸はＴＮ
Ｆ−γをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞で同時接種した腫瘍の値を示す。

【図１７】 図１７は、ＴＮＦ−γ−αアミノ酸配列（配列番号２）の分析を示す。α、β
、ターンおよびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；
抗原性指標および表面確率が、示されたコンピュータープログラムのデフォルト
パラメーターを使用して予測されるように、示される。「Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏ
ｌｆの抗原性指標」グラフにおいて、正のピークは、ＴＮＦ−γタンパク質の高
度な抗原性領域（すなわち、本発明のエピトープ保有ペプチドが得られ得る領域
）の位置を示す。

【図１８Ａ】 図１８Ａ〜Ｄは、デフォルトパラメーターでコンピュータープログラムＢＥＳ
ＴＦＩＴセットを使用することによって構築されるＴＮＦ−γ−α（配列番号１
）およびＴＮＦ−γ−β（配列番号１９）のヌクレオチド配列のアラインメント
を示す。

【図１８Ｂ】 図１８Ａ〜Ｄは、デフォルトパラメーターでコンピュータープログラムＢＥＳ
ＴＦＩＴセットを使用することによって構築されるＴＮＦ−γ−α（配列番号１
）およびＴＮＦ−γ−β（配列番号１９）のヌクレオチド配列のアラインメント
を示す。

【図１８Ｃ】 図１８Ａ〜Ｄは、デフォルトパラメーターでコンピュータープログラムＢＥＳ
ＴＦＩＴセットを使用することによって構築されるＴＮＦ−γ−α（配列番号１
）およびＴＮＦ−γ−β（配列番号１９）のヌクレオチド配列のアラインメント
を示す。

【図１８Ｄ】 図１８Ａ〜Ｄは、デフォルトパラメーターでコンピュータープログラムＢＥＳ
ＴＦＩＴセットを使用することによって構築されるＴＮＦ−γ−α（配列番号１
）およびＴＮＦ−γ−β（配列番号１９）のヌクレオチド配列のアラインメント
を示す。

【図１９】 図１９は、コンピュータープログラムＢＥＳＴＦＩＴのデフォルトパラメータ
ーを使用して構築されるＴＮＦ−γ−α（配列番号２）およびＴＮＦ−γ−β（
配列番号２０）のアミノ酸配列のアラインメントを示す。

【図２０】 図２０ＡおよびＢは、本発明のＴＮＦ−γ−βのポリペプチドのｃＤＮＡ（配
列番号１９）および対応する推定アミノ酸配列（配列番号２０）を示す。アミノ
酸についての標準的な一文字略語が、使用される。アミノ酸メチオニン−１〜ト
リプトファン−３５が、推定細胞内ドメインである。アミノ酸残基アラニン−３
６〜アラニン６１（下線を付している）は、推定の膜貫通配列である。アミノ酸
残基グルタミン−６２〜ロイシン−２５１（下線を付している）は、推定膜貫通
配列である。潜在的なアスパラギン連結グリコシル化部位は、ＴＮＦ−γ−βア
ミノ酸配列中の太字のアスパラギン記号（Ｎ）およびＴＮＦ−γ−αヌクレオチ
ド配列中でアスパラギン残基をコードする最初のヌクレオチド上の太字のポンド
記号（ｐｏｕｎｄ ｓｉｇｎ）（＃）により、図２０ＡおよびＢ中に印付けられ
る。潜在的なＮ連結グリコシル化配列は、ＴＮＦ−γ−βアミノ酸配列中の以下
の位置において見出される：Ｎ１３３〜Ｎ−１３６（Ｎ−１３３、Ｙ−１３４、
Ｔ−１３５、Ｎ−１３６）およびＮ−２２９〜Ｄ２３２（Ｎ−２２９、Ｖ−２３
０、Ｓ−２３１、Ｄ−２３２）。潜在的なプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）リン
酸化部位もまた、ＴＮＦ−γ−βアミノ酸配列中の太字のセリンまたはスレオニ
ン記号（ＳまたはＴ）およびＴＮＦ−γ−βヌクレオチド配列中のセリン残基を
コードする最初のヌクレオチド上のアスタリスク（＊）により、図２０Ａおよび
Ｂ中に印付けられる。潜在的なＰＫＣリン酸化配列は、ＴＮＦ−γ−βアミノ酸
配列中の以下の位置において見出される：Ｓ−２３〜Ｒ−２５（Ｓ−２３、Ｃ−
２４、Ｒ−２５）；Ｓ−３２〜Ｒ−３４（Ｓ−３２、Ａ−３３、Ｒ−３４）；Ｔ
−１３５〜Ｋ−１３７（Ｔ−１３５、Ｎ−１３６、Ｋ−１３７）；およびＴ−１
５４〜Ｒ−１５６（Ｔ−１５４、Ｆ−１５５、Ｒ−１５６）。潜在的なカゼイン
キナーゼＩＩ（ＣＫ２）リン酸化部位はまた、ＴＮＦ−γ−βアミノ酸配列中の
太字のセリンまたはスレオニン記号（ＳまたはＴ）およびＴＮＦ−γ−βヌクレ
オチド配列中の適切なセリンまたはスレオニン残基をコードする第１のヌクレオ
チド上のアスタリスク（＊）により、図２０ＡおよびＢ中に印付けられる。潜在
的なＣＫ２リン酸化配列は、ＴＮＦ−γ−βアミノ酸配列中の以下の位置におい
て見出される：Ｓ−８〜Ｅ−１１（Ｓ−８、Ｆ−９、Ｇ−１０、Ｅ−１１）；Ｓ
−１８７〜Ｅ−１９０（Ｓ−１８７、Ｙ−１８８、Ｐ−１８９、Ｅ−１９０）；
Ｓ−２００〜Ｅ−２０３（Ｓ−２００、Ｖ−２０１、Ｃ−２０２、Ｅ−２０３）
；Ｓ−２１９〜Ｅ−２２２（Ｓ−２１９、Ｌ−２２０、Ｑ−２２１、Ｅ−２２２
）；Ｓ−２３４〜Ｄ−２３７（Ｓ−２３４、Ｌ−２３５、Ｖ−２３６、Ｄ−２３
７）；およびＴ−２３９〜Ｄ−２４２（Ｔ−２３９、Ｋ−２４０、Ｅ−２４１、
Ｄ−２４２）。潜在的なミリスチル化部位はまた、ＴＮＦ−γ−βアミノ酸配列
中の二重下線により、図２０ＡおよびＢ中に印付けられる。潜在的なミリスチル
化配列は、ＴＮＦ−γ−βアミノ酸配列中の以下の位置において見出される：Ｇ
−６〜Ｅ−１１（Ｇ−６、Ｌ−７、Ｓ−８、Ｆ−９、Ｇ−１０、Ｅ−１１）；Ｇ
−１２４〜Ｇ−１２９（Ｇ−１２４、Ｌ−１２５、Ａ−１２６、Ｆ−１２７、Ｔ
−１２８、Ｋ−１２９）；およびＧ−２１５〜Ｌ−２２０（Ｇ−２１５、Ａ−２
１６、Ｍ−２１７、Ｆ−２１８、Ｓ−２１９、Ｌ−２２０）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 16/24 ４Ｈ０４５ Ｃ０７Ｋ 14/525 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/24 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｌ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 9410 Ｋｅｙ Ｗｅｓｔ Ａｖｅｎｕｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎ ｄ 20850， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ ｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 ニ， ジアン アメリカ合衆国 メリーランド 20853， ロックビル， マナーフィールド ロ− ド 5502 (72)発明者 ローゼン， クレイグ エイ． アメリカ合衆国 メリーランド 20882， レイトンズビル， ローリング ヒル ロード 22400 (72)発明者 チャン， ジュン アメリカ合衆国 メリーランド 20817， ベセスダ， クレストベリー ロード 10100 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA28 BA61 CA04 DA02 HA03 HA14 HA17 4B064 AG07 CA19 CC24 DA05 4B065 AB04 BA02 BA03 CA24 CA43 CA44 4C084 AA02 AA07 AA13 BA44 CA53 DA25 NA14 ZA962 ZB152 ZB262 4C086 AA02 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA96 ZB15 ZB26 4H045 AA10 AA20 AA30 CA40 DA14 EA22 FA74

Claims (41)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一
   のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子： （ａ）配列番号２の完全アミノ酸配列（すなわち、配列番号２の−２７〜１４
   ７位）を有するＴＮＦγポリペプチドをコードするヌクレオチド配列； （ｂ）配列番号２のＮ末端メチオニンを除く完全アミノ酸配列（すなわち、配
   列番号２の−２６〜１４７位）を有するＴＮＦγポリペプチドをコードするヌク
   レオチド配列； （ｃ）配列番号２の１〜１４７位として示される配列番号２のアミノ酸配列を
   有する成熟ＴＮＦγポリペプチドをコードするヌクレオチド配列； （ｄ）ＡＴＣＣ受託番号７５９２７に含まれるｃＤＮＡクローンによりコード
   される完全アミノ酸配列を有するＴＮＦγポリペプチドをコードするヌクレオチ
   ド配列； （ｅ）ＡＴＣＣ受託番号７５９２７に含まれるｃＤＮＡクローンによりコード
   される、Ｎ末端メチオニンを除く完全アミノ酸配列を有するＴＮＦγポリペプチ
   ドをコードするヌクレオチド配列； （ｆ）ＡＴＣＣ受託番号７５９２７に含まれるｃＤＮＡクローンによりコード
   されるアミノ酸配列を有する成熟ＴＮＦγポリペプチドをコードするヌクレオチ
   ド配列；および （ｇ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）における
   いずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列。
2. 【請求項２】 前記ポリヌクレオチドが、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）
   の全ヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の核酸分子。
3. 【請求項３】 前記ポリヌクレオチドが、図１Ａおよび１Ｂのヌクレオチド
   配列（配列番号１）を有し、該ヌクレオチドが配列番号２の−２７〜１４７位の
   アミノ酸配列を有するＴＮＦγポリペプチドをコードする、請求項１に記載の核
   酸分子。
4. 【請求項４】 前記ポリヌクレオチドが、図１Ａおよび１Ｂにおけるヌクレ
   オチド配列（配列番号１）を有し、該ヌクレオチド配列は、配列番号２の約１〜
   約１４７位のアミノ酸配列を有する成熟ＴＮＦγポリペプチドをコードする、請
   求項１に記載の核酸分子。
5. 【請求項５】 以下からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一
   のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子： （ａ）配列番号２の残基ｎ¹〜１４７のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコ
   ードするヌクレオチド配列であって、ここで、ｎ¹は−２７〜３５の範囲の整数
   である、ヌクレオチド配列； （ｂ）配列番号２の残基−２７〜ｍ¹のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコ
   ードするヌクレオチド配列であって、ここで、ｍ¹は１４６〜１４７の範囲の整
   数である、ヌクレオチド配列； （ｃ）配列番号２の残基ｎ¹〜ｍ¹からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド
   をコードするヌクレオチド配列であって、ここで、ｎおよびｍは、それぞれ、上
   記（ａ）および（ｂ）において規定される整数である、ヌクレオチド配列； （ｄ）ＡＴＣＣ受託番号７５９２７に含まれるｃＤＮＡクローンによってコー
   ドされる完全ＴＮＦγアミノ酸配列の一部からなるポリペプチドをコードするヌ
   クレオチド配列であって、ここで、該一部は、ＡＴＣＣ受託番号７５９２７に含
   まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる該完全アミノ酸配列のアミノ末端
   から約１〜約６２アミノ酸を除く、ヌクレオチド配列； （ｅ）ＡＴＣＣ受託番号７５９２７に含まれるｃＤＮＡクローンによってコー
   ドされる全ＴＮＦγアミノ酸配列の一部からなるポリペプチドをコードするヌク
   レオチド配列であって、ここで、該一部は、ＡＴＣＣ受託番号７５９２７に含ま
   れるｃＤＮＡクローンによってコードされる該完全アミノ酸配列のカルボキシ末
   端から１アミノ酸を除く、ヌクレオチド配列； （ｆ）ＡＴＣＣ受託番号７５９２７に含まれるｃＤＮＡクローンによってコー
   ドされる全ＴＮＦγアミノ酸配列の一部からなるポリペプチドをコードするヌク
   レオチド配列であって、ここで、該一部は、上記（ｄ）および（ｅ）のアミノ末
   端欠失およびカルボキシ末端欠失の任意の組み合わせを含む、ヌクレオチド配列
   。
6. 【請求項６】 前記ポリヌクレオチドが、ＡＴＣＣ受託番号７５９２７に含
   まれるｃＤＮＡクローンの全ヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の核酸
   分子。
7. 【請求項７】 前記ポリヌクレオチドは、ＴＮＦγポリペプチドをコードす
   るヌクレオチド配列を有し、該ポリペプチドは、ＡＴＣＣ受託番号７５９２７に
   含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列からＮ末端メチオニ
   ンを除く全アミノ酸配列を有する、請求項１に記載の核酸分子。
8. 【請求項８】 前記ポリヌクレオチドが、ＡＴＣＣ受託番号７５９２７に含
   まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する成熟ＴＮＦγ
   ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の核酸分
   子。
9. 【請求項９】 請求項１に記載の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）
   、（ｆ）、または（ｇ）におけるヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を
   有するポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下
   でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子であって、
   ここで該ハイブリダイズするポリヌクレオチドは、Ａ残基のみまたはＴ残基のみ
   からなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハ
   イブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしない、核酸分子。
10. 【請求項１０】 請求項１に記載の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ
    ）、または（ｆ）におけるアミノ酸配列を有するＴＮＦγポリペプチドのエピト
    ープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された
    核酸分子。
11. 【請求項１１】 ＴＮＦγポリペプチドのエピトープ保有部位をコードする
    、請求項１０に記載の単離された核酸分子であって、該アミノ酸配列の該部分は
    、配列番号２の以下からなる配列の群より選択される、単離された核酸分子：約
    Ｔｈｒ−２４〜約Ａｓｎ−３２；約Ｉｌｅ−３７〜Ｉｌｅ−４５；約Ｍｅｔ−５
    ４〜約Ａｒｇ−６２；約Ｇｌｎ−６３〜約Ａｓｐ−７１；約Ｇｌｕ−５７〜約Ｇ
    ｌｙ−６５；約Ｖａｌ−８０〜約Ｔｈｒ−８８；約Ｌｅｕ−１１６〜約Ｖａｌ−
    １２４；および約Ａｓｐ−１３３〜約Ｐｈｅ−１４１。
12. 【請求項１２】 請求項１に記載の単離された核酸分子をベクターに挿入す
    る工程を包含する、組換えベクターを作製するための方法。
13. 【請求項１３】 請求項１２に記載の方法によって生成される、組換えベク
    ター。
14. 【請求項１４】 請求項１３に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入する
    工程を包含する、組換え宿主細胞を作製するための方法。
15. 【請求項１５】 請求項１４に記載の方法によって産生される、組換え宿主
    細胞。
16. 【請求項１６】 ＴＮＦγポリペプチドを生成するための組換え方法であっ
    て、該ポリペプチドが発現されるような条件下で請求項１５に記載の組換え宿主
    細胞を培養する工程、および該ポリペプチドを回収する工程を包含する、方法。
17. 【請求項１７】 以下からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同
    一のアミノ酸配列を含む、単離されたＴＮＦγポリペプチド； （ａ）配列番号２に示される完全アミノ酸配列（すなわち、配列番号２の−２
    ７〜１４７位）を有する全長ＴＮＦγポリペプチドのアミノ酸配列； （ｂ）Ｎ末端メチオニンを除く、配列番号２に示される全アミノ酸配列（すな
    わち、配列番号２の−２６〜１４７位）を有する全長ＴＮＦγポリペプチドのア
    ミノ酸配列； （ｃ）配列番号２の１〜１４７位のアミノ酸配列を有する推定成熟ＴＮＦγポ
    リペプチドのアミノ酸配列； （ｄ）ＡＴＣＣ受託番号７５９２７に含まれるｃＤＮＡクローンによりコード
    される全アミノ酸配列； （ｅ）ＡＴＣＣ受託番号７５９２７に含まれるｃＤＮＡクローンによりコード
    される、Ｎ末端メチオニンを除く全アミノ酸配列；および （ｆ）ＡＴＣＣ受託番号７５９２７に含まれるｃＤＮＡクローンによりコード
    される推定成熟ＴＮＦγポリペプチドの全アミノ酸配列。
18. 【請求項１８】 請求項１７に記載のＴＮＦγポリペプチドに特異的に結合
    する、単離された抗体。
19. 【請求項１９】 患者の腫瘍を処置する方法であって、請求項１に記載の単
    離された核酸分子を該患者に投与する工程、を包含する、方法。
20. 【請求項２０】 患者の腫瘍を処置する方法であって、請求項１７のＴＮＦ
    −γポリペプチドの治療上有効な量を該患者に投与する工程、を包含する、方法
    。
21. 【請求項２１】 患者の慢性関節リウマチを処置する方法であって、請求項
    １７のＴＮＦ−γポリペプチドの治療上有効な量を該患者に投与する工程、を包
    含する、方法。
22. 【請求項２２】 以下からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同
    一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子： （ａ）配列番号２０の完全アミノ酸配列（すなわち、配列番号２０の１〜２５
    １位）を有するＴＮＦγ−βのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列； （ｂ）Ｎ末端メチオニンを除く配列番号２０の完全アミノ酸配列（すなわち、
    配列番号２０の２〜２５１位）を有するＴＮＦγ−βのポリペプチドをコードす
    るヌクレオチド配列； （ｃ）配列番号２０の６２〜２５１位として示される配列番号２０のアミノ酸
    配列を有するＴＮＦγ−βポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオ
    チド配列； （ｄ）ＡＴＣＣ受託番号２０３０５５に含まれるｃＤＮＡクローンによりコー
    ドされる完全アミノ酸配列を有するＴＮＦγ−βポリペプチドをコードするヌク
    レオチド配列； （ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２０３０５５に含まれるｃＤＮＡクローンによりコー
    ドされる、Ｎ末端メチオニンを除く完全アミノ酸配列を有するＴＮＦγ−βポリ
    ペプチドをコードするヌクレオチド配列； （ｆ）ＡＴＣＣ受託番号２０３０５５に含まれるｃＤＮＡクローンによりコー
    ドされるアミノ酸配列を有するＴＮＦγ−βポリペプチドの細胞外ドメインをコ
    ードするヌクレオチド配列；および （ｇ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）における
    いずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列。
23. 【請求項２３】 前記ポリヌクレオチドが、図２０Ａおよび２０Ｂ（配列番
    号１９）の完全ヌクレオチド配列を有する、請求項２２に記載の核酸分子。
24. 【請求項２４】 前記ポリヌクレオチドが、図２０Ａおよび２０Ｂのヌクレ
    オチド配列（配列番号１９）を有し、該ヌクレオチドが配列番号２０の１〜２５
    １位のアミノ酸配列を有するＴＮＦγポリペプチドをコードする、請求項２２に
    記載の核酸分子。
25. 【請求項２５】 前記ポリヌクレオチドが、図２０Ａおよび２０Ｂにおける
    ヌクレオチド配列（配列番号１９）を有し、該ヌクレオチド配列は、配列番号２
    ０の約６２〜約２５１位のアミノ酸配列を有するＴＮＦγポリペプチドの細胞外
    ドメインをコードする、請求項２２に記載の核酸分子。
26. 【請求項２６】 以下からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同
    一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子： （ａ）配列番号２０の残基ｎ⁴〜２５１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを
    コードするヌクレオチド配列であって、ここで、ｎ⁴は２〜２４６の範囲の整数
    である、ヌクレオチド配列； （ｂ）配列番号２０の残基１〜ｍ⁴のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコー
    ドするヌクレオチド配列であって、ここで、ｍ⁴は６〜２５０の範囲の整数であ
    る、ヌクレオチド配列； （ｃ）配列番号２０の残基ｎ⁴〜ｍ⁴からなるアミノ酸配列を有するポリペプチ
    ドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、ｎ⁴およびｍ⁴は、それぞれ
    、上記（ａ）および（ｂ）において規定される整数である、ヌクレオチド配列； （ｄ）ＡＴＣＣ受託番号２０３０５５に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
    ードされる全ＴＮＦγ−βアミノ酸配列の一部からなるポリペプチドをコードす
    るヌクレオチド配列であって、ここで、該一部は、ＡＴＣＣ受託番号２０３０５
    ５に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる該完全アミノ酸配列のアミ
    ノ末端から１〜約２４６アミノ酸を除く、ヌクレオチド配列； （ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２０３０５５に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
    ードされる全ＴＮＦγ−βアミノ酸配列の一部からなるポリペプチドをコードす
    るヌクレオチド配列であって、ここで、該一部は、該ＡＴＣＣ受託番号２０３０
    ５５に含まれるｃＤＮＡによってコードされる全アミノ酸配列のカルボキシ末端
    からほぼ１アミノ酸を欠く、ヌクレオチド配列； （ｆ）ＡＴＣＣ受託番号２０３０５５に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
    ードされる全ＴＮＦγ−βアミノ酸配列の一部からなるポリペプチドをコードす
    るヌクレオチド配列であって、ここで、該一部は、上記（ｄ）および（ｅ）のア
    ミノ末端欠失およびカルボキシ末端欠失の任意の組み合わせを含む、ヌクレオチ
    ド配列。
27. 【請求項２７】 前記ポリヌクレオチドが、ＡＴＣＣ受託番号２０３０５５
    に含まれるｃＤＮＡクローンの全ヌクレオチド配列を有する、請求項２２に記載
    の核酸分子。
28. 【請求項２８】 前記ポリヌクレオチドは、ＴＮＦγ−βポリペプチドをコ
    ードするヌクレオチド配列を有し、該ポリペプチドは、ＡＴＣＣ受託番号２０３
    ０５５に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされる、Ｎ末端メチオニンを欠
    く完全アミノ酸配列を有する、請求項２２に記載の核酸分子。
29. 【請求項２９】 前記ポリヌクレオチドが、ＴＮＦγ−βポリペプチドの細
    胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を有し、該ポリペプチドは、ＡＴＣ
    Ｃ受託番号２０３０５５に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ
    酸配列を有する、請求項２２に記載の核酸分子。
30. 【請求項３０】 請求項２２に記載の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（
    ｅ）、（ｆ）、または（ｇ）におけるヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配
    列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条
    件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子であっ
    て、ここで該ハイブリダイズするポリヌクレオチドは、Ａ残基のみまたはＴ残基
    のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェント
    なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしない、単離された核酸分子
    。
31. 【請求項３１】 請求項２２に記載の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（
    ｅ）、または（ｆ）におけるアミノ酸配列を有するＴＮＦγ−βポリペプチドの
    エピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、単離
    された核酸分子。
32. 【請求項３２】 請求項２２に記載の単離された核酸分子をベクターに挿入
    する工程を包含する、組換えベクターを作製するための方法。
33. 【請求項３３】 請求項３２に記載の方法によって生成される、組換えベク
    ター。
34. 【請求項３４】 請求項３３に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入する
    工程を包含する、組換え宿主細胞を作製する方法。
35. 【請求項３５】 請求項３４に記載の方法によって産生される、組換え宿主
    細胞。
36. 【請求項３６】 ＴＮＦγ−βポリペプチドを生成するための組換え方法で
    あって、該ポリペプチドが発現されるような条件下で請求項３５に記載の組換え
    宿主細胞を培養する工程、および該ポリペプチドを回収する工程を包含する、方
    法。
37. 【請求項３７】 以下からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同
    一のアミノ酸配列を含む、単離されたＴＮＦγ−βポリペプチド； （ａ）配列番号２０に示される完全アミノ酸配列（すなわち、配列番号２０の
    １〜２５１位）を有する全長ＴＮＦγ−βポリペプチドのアミノ酸配列； （ｂ）Ｎ末端メチオニンを除く、配列番号２０に示される完全アミノ酸配列（
    すなわち、配列番号２０の２〜２５１位）を有する全長ＴＮＦγ−βポリペプチ
    ドのアミノ酸配列； （ｃ）配列番号２０の６２〜２５１位のアミノ酸配列を有するＴＮＦγ−βポ
    リペプチドの推定細胞外ドメインのアミノ酸配列； （ｄ）ＡＴＣＣ受託番号２０３０５５に含まれるｃＤＮＡクローンによりコー
    ドされる全アミノ酸配列； （ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２０３０５５に含まれるｃＤＮＡクローンによりコー
    ドされる、Ｎ末端メチオニンを除く完全アミノ酸配列；および （ｆ）ＡＴＣＣ受託番号２０３０５５に含まれるｃＤＮＡクローンによりコー
    ドされるＴＮＦγ−βポリペプチドの推定細胞外ドメインの完全アミノ酸配列；
38. 【請求項３８】 請求項３７に記載のＴＮＦγポリペプチドに特異的に結合
    する、単離された抗体。
39. 【請求項３９】 患者の腫瘍を処置する方法であって、請求項２２に記載の
    単離された核酸分子を該患者に投与する工程、を包含する、方法。
40. 【請求項４０】 患者の腫瘍を処置する方法であって、請求項３７のＴＮＦ
    −γポリペプチドの治療上有効な量を該患者に投与する工程、を包含する、方法
    。
41. 【請求項４１】 患者の慢性関節リウマチを処置する方法であって、請求項
    ３７のＴＮＦ−γポリペプチドの治療上有効な量を該患者に投与する工程、を包
    含する、方法。