JP2002223781A - 腫瘍壊死因子−γ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒトＴＮＦ−γポリペプチド、およびそのよ
うなポリペプチドをコードするＤＮＡ(ＲＮＡ)、および
そのようなポリペプチドを組換え技術により製造する方
法を開示する。 【解決手段】 そのようなポリペプチドを、腫瘍または
癌における細胞増殖を阻害するために、創傷治癒を促進
するために、感染に対する耐性を与えるために、炎症活
性を誘起するために、またある細胞の種類の増殖を刺激
して、疾患、例えば、再狭窄を治療するために利用する
方法もまた開示する。ＴＮＦ−γの核酸配列における変
異、またはＴＮＦ−γポリペプチドの過剰発現を検出す
るための診断方法もまた開示する。そのようなポリペプ
チドに対するアンタゴニスト、および悪液質、敗血症性
ショック、大脳マラリア、炎症、関節炎、および移植片
拒絶を治療するための治療物質としてのそれらの使用も
また開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、新たに同定されたポリヌクレオ
チド、そのようなポリヌクレオチドによりコードされる
ポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドの使用、さらにはまた、そのようなポリヌクレ
オチドおよびポリペプチドの製造に関する。とりわけ、
本発明のポリペプチドは、腫瘍壊死因子ファミリーの新
たなメンバーとして同定され、以下で「ＴＮＦ−γ」と
呼ぶ。本発明はまた、そのようなポリペプチドの作用を
阻害することにも関する。

【０００２】ヒト腫瘍壊死因子α(ＴＮＦ−α)およびβ
(ＴＮＦ−βまたはリンフォトキシン)は、サイトカイン
と総称される、インターフェロン、インターロイキンお
よび増殖因子が含まれる、ポリペプチドメディエーター
の広範にわたるクラスの関係するメンバーである(Ｂeut
ler,Ｂ.およびＣerami,Ａ.、Ａnnu.Ｒev.Ｉmmunol.、
７：６２５−６５５（１９８９）)。

【０００３】腫瘍壊死因子(ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−
β)は、元来、その抗腫瘍活性の結果として発見された
が、今や、免疫調節および炎症において重要な役割を担
う多面的サイトカインとして認められている。現在ま
で、ＴＮＦ関連サイトカインファミリーの８つの既知の
メンバー、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β(リンフォトキシン
−α)、ＬＴ−β、並びにＦas、ＣＤ３０、ＣＤ２７、
ＣＤ４０および４−１ＢＢ受容体に対するリガンドがあ
る。これらのタンパク質は、ＴＮＦ−βを除き、膜アン
カーとして使用されることの多い、保存されたＣ末端配
列、および可変性のＮ末端配列を有する。ＴＮＦ−αお
よびＴＮＦ−βは両方とも、それらがＴＮＦ受容体に結
合する場合、ホモトリマーとして機能する。ＴＮＦは、
単球、線維芽細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー(ＮＫ)細
胞を含め、多くの細胞の種類により、また主として活性
化マクロファージにより産生される。ＴＮＦ−αは、腫
瘍の急速な壊死、免疫刺激、自己免疫疾患、移植片拒
絶、寄生生物に対する耐性、抗ウイルス応答を引き起こ
すこと、敗血症性ショック、増殖調節、血管内皮効果お
よび代謝効果において役割を有することが報告されてい
る。ＴＮＦ−αはまた、ＰＡＩ−１、ＩＬ−１、ＧＭ−
ＣＳＦおよびＩＬ−６を含め、様々な因子を分泌するよ
う、内皮細胞を誘発して、細胞増殖を促進する。さら
に、ＴＮＦ−αは、Ｅ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１およ
びＶＣＡＭ−１といったような、様々な細胞接着分子を
上方調節する。ＴＮＦ−αおよびＦasリガンドはまた、
プログラムされた細胞死を誘起することも示されてい
る。

【０００４】ＴＮＦまたはＬＴにより媒介される様々な
細胞応答の誘起における第一段階は、それらが特異的な
細胞表面受容体に結合することである。約５５ＫＤa(Ｔ
ＮＦ−Ｒ１)および７５ＫＤa(ＴＮＦ−Ｒ２)の２つの異
なったＴＮＦ受容体が同定されており(Ｈohman,Ｈ.Ｐ.
ら、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.、２６４：１４９２７−１４９３
４（１９８９）)、また両方の受容体型に対応するヒト
およびマウスcＤＮＡが単離されて特徴付けられている
(Ｌoetscher,Ｈ.ら、Ｃell、６１：３５１（１９９
０）)。両方のＴＮＦ−Ｒとも、細胞外、膜貫通および
細胞内領域を含め、典型的な細胞表面受容体構造を共有
する。

【０００５】本発明のポリペプチドは、構造上の、アミ
ノ酸配列の相同性、および機能上の類似性に基づいて、
ＴＮＦファミリーの新規メンバーとして同定されてお
り、例えば、ＴＮＦ−γは、炎症前タンパク質である。

【０００６】本発明の一態様により、ＴＮＦ−γである
新規成熟ポリペプチド、さらにはまた、生物学的に活性
であって、診断上または治療上有用な、そのフラグメン
ト、アナログおよび誘導体を提供する。本発明のポリペ
プチドは、ヒト起源である。

【０００７】本発明の別の態様により、mＲＮＡ、ＤＮ
Ａ、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含め、ヒトＴＮＦ−γを
コードする、単離された核酸分子、さらにはまた、アナ
ログ、並びに生物学的に活性であって、診断上または治
療上有用な、そのフラグメントおよび誘導体を提供す
る。

【０００８】本発明のまたさらなる態様により、そのよ
うなポリペプチドを組換え技術により製造する方法であ
って、当該タンパク質の発現、およびその後の当該タン
パク質の回収を促進する条件下、ヒトＴＮＦ−γの核酸
配列を含む組換え原核および／または真核宿主細胞を培
養することを含んでなる方法を提供する。

【０００９】本発明のまたさらなる態様により、そのよ
うなポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドを、アゴニストおよびアンタ
ゴニストに関してスクリーニングするために、また治療
目的に、例えば、創傷治癒に、腫瘍増殖を阻害するため
に、寄生生物、細菌およびウイルスに対する耐性を与え
るために、炎症活性を誘起するために、内皮細胞および
ある造血細胞の増殖を誘起するために、再狭窄を治療す
るために、またある自己免疫疾患を予防するために利用
する方法を提供する。

【００１０】本発明のまたさらなる態様により、ヒトＴ
ＮＦ−γ配列へ特異的にハイブリダイズするのに十分な
長さの核酸分子を含んでなる核酸プローブもまた提供す
る。

【００１１】本発明の別の態様により、ＴＮＦ−γによ
く似ており、またＴＮＦ−γ受容体に結合して、ＴＮＦ
−γ型の応答を誘発する、ＴＮＦ−γアゴニストを提供
する。

【００１２】本発明のまた別の態様により、そのような
ポリペプチドの作用を阻害するために、例えば、敗血症
性ショック、炎症、大脳マラリア、ＨＩＶウイルスの活
性化、移植片拒絶、骨吸収および悪液質を予防するため
に使用することができる、そのようなポリペプチドに対
するアンタゴニストを提供する。

【００１３】本発明のさらに別の態様により、ＴＮＦ−
γポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコー
ドする核酸配列の発現不足および過剰発現に関係のある
疾患を検出するための診断アッセイを提供する。本発明
のこれらの態様および他の態様は、本明細書中の教示か
ら当業者に明らかであろう。

【００１４】以下の図面は、本発明の態様を説明するも
のであって、請求の範囲により包含される本発明の範囲
を限定しようとするものではない。第１〜２図は、本発
明のポリペプチドのcＤＮＡおよび対応する推定アミノ
酸配列を説明する。最初の２５個のアミノ酸(下線部)
は、推定されるリーダー配列である。アミノ酸に関する
標準的な１文字略号を使用する。第３〜５図は、ＴＮＦ
−γとＴＮＦファミリーの他のメンバーとの間のアミノ
酸配列のアラインメント(alignment)を説明する。ＴＮ
Ｆ−γは、陰影をつけた範囲によって示されるように、
ＴＮＦファミリーの保存されたアミノ酸残基を含む。第
６図は、ＴＮＦ−γが発現されるヒト組織を示す、ＲＮ
Ａブロット分析である。示した組織から得られたＲＮＡ
を、標識化ＴＮＦ−γ cＤＮＡでプローブした。ＴＮＦ
−γ mＲＮＡは、第６図が異なったバンドを示すことか
ら、主として腎臓に存在する。他のレーンは、強いハイ
ブリダイゼーションを示すようであるが、実際には、非
特異的なスミア(smear)がある。第７図は、ＴＮＦ−γ
が、主として、レーン９であるＨＵＶＥＣ細胞(ヒト臍
静脈内皮細胞)において発現されることを示す、ＲＮＡ
ブロット分析である。レーン６およびレーン８は、非特
異的なスミアである。示した細胞系から得られたＲＮＡ
を、標識化ＴＮＦ−γ cＤＮＡでプローブした。レーン
１は、ＣＡＭＡ１(乳癌)であり；レーン２は、ＡＮ３Ｃ
Ａ(子宮癌)であり；レーン３は、ＳＫ.ＵＴ.１(子宮癌)
であり；レーン４は、ＭＧ６３(骨芽細胞腫)であり；レ
ーン５は、ＨＯＳ(骨芽細胞腫)であり；レーン６は、Ｍ
ＣＦ７(乳癌)であり；レーン７は、ＯＶＣＡＲ−３(卵
巣癌)であり；レーン８は、ＣＡＯＶ−３(卵巣癌)であ
り；レーン９は、ＨＵＶＥＣであり；レーン１０は、Ａ
ＯＳＭＩＣ(平滑筋)であり；レーン１１は、包皮線維芽
細胞である。第８図は、細菌発現および精製により産生
されたＴＮＦ−γを電気泳動した後のゲルの写真であ
る。第９図は、ＴＮＦ−γのバキュロウイルス発現後の
ゲルの写真である。第１０〜１３図は、未処理のＷＥＨ
Ｉ １６４細胞(左上)、並びにＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β
およびＴＮＦ−γにさらした後のＷＥＨＩ １６４細胞
の写真である。伸長された、丸くない形態学を有する細
胞が溶菌している。加えたＴＮＦは、約０.５μg／mlで
あった。ＴＮＦを加えてから７２時間後に写真を撮っ
た。第１４〜１６図は、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βと
比較して、ＴＮＦ−γがＷＥＨＩ １６４細胞増殖を阻
害する能力を説明する。第１７図は、組換えＴＮＦ−
γ、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βがＷＥＨＩ １６４細
胞死を誘起する能力を説明する。第１８〜２１図は、組
換えＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βおよびＴＮＦ−γがＬ９２
９細胞において形態学的変化を誘起する能力を説明す
る。その形態学的変化は、黒く丸い細胞により示され
る。細胞を、Ｅ.Ｃoliが産生する組換えＴＮＦを用い
て、約０.５μg／mlの割合で処理した。ＴＮＦを加えて
から７２時間後に写真を撮った。その形態学的変化は、
細胞が殺されていることを示す。第２２〜２４図は、静
脈内皮細胞に対する、ＴＮＦ−γ、ＴＮＦ−αおよびＴ
ＮＦ−βの効果のグラフ説明である。静脈内皮細胞を市
販のＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βおよびＥ.Ｃoliが産生
するＴＮＦ−γで処理した後の細胞増殖を、ＭＴＳアッ
セイを利用して定量した。第２５〜２７図は、ＨＬ６０
細胞がばらばらに広がっていることを示す対照と共に、
ＨＬ６０細胞の写真である；ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−
γは、細胞接着を誘起して、細胞と細胞が、右下で一緒
に接着している細胞によって説明されるように接触す
る。第２８図は、ＴＮＦ−γが、２つの既知の可溶性Ｔ
ＮＦ受容体、すなわちsＴＮＦ ＲＩ(p５５)およびsＴＮ
Ｆ ＲII(p７５)へ有意に結合しないことを説明する。

【００１５】本発明の一態様により、第１〜２図の推定
アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチド、または１９９
４年１０月２６日にＡＴＣＣ寄託番号第７５９２７号と
して寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされる
成熟ポリペプチドをコードする、単離された核酸(ポリ
ヌクレオチド)を提供する。

【００１６】本発明のポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドは、ヒト腎臓および臍静脈内皮細胞から得る
ことができる。本発明のポリヌクレオチドは、ヒト臍静
脈内皮細胞から得られたcＤＮＡライブラリー中で発見
された。それは、構造上、ＴＮＦファミリーに関係があ
る。それは、１７４個のアミノ酸残基のタンパク質をコ
ードするオープンリーディングフレームを含み、このう
ち、最初の約２５個のアミノ酸残基は推定されるリーダ
ー配列であることから、成熟タンパク質は１４９個のア
ミノ酸を含んでなる。そのタンパク質は、ウサギＴＮＦ
−αに対し、１１１個のアミノ酸範囲にわたり、３８％
の同一性および５８％の類似性をもって、最も高い程度
の相同性をＣ末端で示す。ＴＮＦファミリーのメンバー
全てに保存された配列はまた、ＴＮＦ−γにおいても保
存されている(第３〜５図参照)。肉太の文字は、保存さ
れたアミノ酸残基を示す。ＴＮＦ−γ mＲＮＡは、第７
図のＲＮＡブロット分析で示されるように、ヒト臍静脈
内皮細胞において特異的に発現される。

【００１７】本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形
で、またはＤＮＡの形であり得、このＤＮＡには、cＤ
ＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。該
ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得、また一本鎖で
あるなら、コード鎖または非コード(アンチ−センス)鎖
であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列
は、第１〜２図に示すコード配列または寄託されたクロ
ーンのコード配列と同じであってよく、あるいは遺伝コ
ードの重複または縮重の結果として、第１〜２図のＤＮ
Ａまたは寄託されたcＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドを
コードする異なったコード配列であってもよい。

【００１８】第１〜２図の成熟ポリペプチドまたは寄託
されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドには、これに限定されるも
のではないが、以下のものが含まれ得る：成熟ポリペプ
チドのコード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配
列、およびリーダーもしくは分泌配列またはプロタンパ
ク質配列といったような付加的コード配列；成熟ポリペ
プチドのコード配列(また場合により、付加的コード配
列)、および成熟ポリペプチドのコード配列のイントロ
ンまたは非コード配列５'および／または３'といったよ
うな非コード配列。

【００１９】従って、「ポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドのコード配
列のみが含まれるポリヌクレオチド、さらにはまた、付
加的コードおよび／または非コード配列が含まれるポリ
ヌクレオチドを包含する。

【００２０】本発明はさらに、第１〜２図の推定アミノ
酸配列を有するポリペプチドまたは寄託されたクローン
のcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメ
ント、アナログおよび誘導体をコードする、上記のポリ
ヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変
異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在するアレル変異
体またはポリヌクレオチドの天然には存在しない変異体
であり得る。

【００２１】従って、本発明には、第１〜２図に示すの
と同じ成熟ポリペプチドまたは寄託されたクローンのc
ＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド、さらにはまた、そのようなポ
リヌクレオチドの変異体が含まれ、これらの変異体は、
第１〜２図のポリペプチドまたは寄託されたクローンの
cＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメン
ト、誘導体またはアナログをコードする。そのようなヌ
クレオチド変異体には、欠失変異体、置換変異体並びに
付加および挿入変異体が含まれる。

【００２２】先に示したように、該ポリヌクレオチド
は、第１〜２図に示すコード配列の天然に存在するアレ
ル変異体または寄託されたクローンのコード配列の天然
に存在するアレル変異体であるコード配列を有し得る。
当業界で知られているように、アレル変異体は、１つま
たはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を
有し得る別の形のポリヌクレオチド配列であり、これ
は、コードされるポリペプチドの機能を実質的には変え
ない。

【００２３】本発明にはまた、成熟ポリペプチドのコー
ド配列が、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分
泌を助けるポリヌクレオチド配列、例えば、細胞からの
ポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機
能するリーダー配列に、同じ読み枠内で融合し得るポリ
ヌクレオチドも含まれる。リーダー配列を有するポリペ
プチドがプレタンパク質であり、また宿主細胞により切
断されて、成熟型のポリペプチドを形成したリーダー配
列を有することがある。該ポリヌクレオチドはまた、付
加的５'アミノ酸残基を加えた成熟タンパク質であるプ
ロタンパク質もコードし得る。プロ配列を有する成熟タ
ンパク質がプロタンパク質であり、また不活性型のタン
パク質である。プロ配列が一度切断されると、活性成熟
タンパク質が残る。

【００２４】従って、例えば、本発明のポリヌクレオチ
ドは、成熟タンパク質、またはプロ配列を有するタンパ
ク質、またはプロ配列およびプレ配列(リーダー配列)の
両方を有するタンパク質をコードし得る。

【００２５】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明
のポリペプチドの精製を可能とするマーカー配列に枠内
で融合したコード配列も有し得る。細菌宿主の場合に
は、そのマーカー配列は、マーカーに融合した成熟ポリ
ペプチドの精製を提供するための、pＱＥ−９ベクター
により与えられるヘキサ−ヒスチジンタグ(tag)であっ
てよく、または、例えば、哺乳動物宿主、例えば、ＣＯ
Ｓ−７細胞を使用する場合には、そのマーカー配列は、
赤血球凝集素(ＨＡ)タグであってよい。ＨＡタグは、イ
ンフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピ
トープに対応する(Ｗilson,Ｉ.ら、Ｃell、３７：７６
７（１９８４）)。

【００２６】本発明はさらに、配列間に少なくとも５０
％、また好ましくは７０％の同一性がある場合に、上記
の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関す
る。本発明は特に、ストリンジェント条件下、上記のポ
リヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド
に関する。本明細書中で使用する場合、「ストリンジェ
ント条件」という用語は、配列間に少なくとも９５％、
また好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合に
のみ、ハイブリダイゼーションが起こるであろうことを
意味する。好ましい態様では、上記のポリヌクレオチド
にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、第１〜２図
のcＤＮＡまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされる
成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を実質
的には保有するポリペプチドをコードする。

【００２７】本明細書中で言う寄託は、特許手続上の微
生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件の
下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に当業者
への便宜として与えられるものであって、寄託が３５
Ｕ.Ｓ.Ｃ. §１１２下に要求されることを承認するもの
ではない。寄託された物質中に含まれるポリヌクレオチ
ドの配列、さらにはまた、それによりコードされるポリ
ペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の一部を構成し
て、本明細書中の配列のいずれかの記載と矛盾する際は
いつでも照合している。寄託された物質を製造し、使用
し、または販売するには、実施許諾が要求され得、また
そのような実施許諾は、ここでは付与されない。

【００２８】本発明はさらに、第１〜２図の推定アミノ
酸配列を有する、または寄託されたcＤＮＡによりコー
ドされるアミノ酸配列を有するＴＮＦ−γポリペプチ
ド、さらにはまた、そのようなポリペプチドのフラグメ
ント、アナログおよび誘導体に関する。

【００２９】第１〜２図のポリペプチドまたは寄託され
たcＤＮＡによりコードされるポリペプチドを示す場
合、「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」
という用語は、そのようなポリペプチドと実質的に同じ
生物学的機能または活性を保有するポリペプチドを意味
する。従って、アナログには、プロプロテイン部分を切
断することにより活性化して、活性な成熟ポリペプチド
を製造することができるプロプロテインが含まれる。

【００３０】本発明のポリペプチドは、組換えポリペプ
チド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチド、好ま
しくは組換ポリペプチドであってよい。

【００３１】第１〜２図のポリペプチドまたは寄託され
たcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメ
ント、誘導体またはアナログは、（ｉ）１つまたはそれ
以上のアミノ酸残基が同型または非同型アミノ酸残基
(好ましくは、同型アミノ酸残基)で置換されており、ま
たそのような置換アミノ酸残基が遺伝コードによりコー
ドされるものであってもよく、またはコードされたもの
でなくてもよいもの、（ii）１つまたはそれ以上のアミ
ノ酸残基に置換基が含まれるもの、または（iii）成熟
ポリペプチドが、該ポリペプチドの半減期を増加させる
化合物(例えば、ポリエチレングリコール)のような、他
の化合物と融合しているもの、または（iv）リーダーも
しくは分泌配列、または成熟ポリペプチドの精製に使用
される配列、またはプロプロテイン配列といったよう
な、付加的アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合している
ものであり得る。そのようなフラグメント、誘導体およ
びアナログは、本明細書中の教示から当業者の範囲内で
あると思われる。

【００３２】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、単離された形で提供されるのが好ましく、好ま
しくは、均一となるまで精製される。

【００３３】「単離された」という用語は、物質がその
元の環境(例えば、それが天然に存在するなら、天然の
環境)から除去されていることを意味する。例えば、生
きている動物にある天然に存在するポリヌクレオチドま
たはポリペプチドは単離されていないが、天然の系にお
ける共存物質のいくつかまたは全てから分離された同じ
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されてい
る。そのようなポリヌクレオチドはベクターの部分とな
り得、および／またはそのようなポリヌクレオチドまた
はポリペプチドは組成物の部分となり得、またそのよう
なベクターまたは組成物はその天然の環境の部分ではな
いという点で、なお単離されている。

【００３４】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド
が含まれるベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作
された宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え
技術による製造にも関する。

【００３５】宿主細胞は、例えば、クローニングベクタ
ーまたは発現ベクターであり得る本発明のベクターで遺
伝的に操作される(トランスデュースされ、またはトラ
ンスフォームされ、またはトランスフェクトされる)。
該ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、フ
ァージ等の形であり得る。操作された宿主細胞は、プロ
モーターを活性化し、トランスフォーマントを選択し、
またはＴＮＦ−γ遺伝子を増幅するのに適するよう改変
された従来の栄養培地で培養することができる。温度、
pＨ等といったような培養条件は、発現用に選択された
宿主細胞で先に使用した培養条件であって、当業者に明
らかであろう。

【００３６】本発明のポリヌクレオチドは、ペプチドを
組換え技術により製造するのに使用することができる。
従って、例えば、該ポリヌクレオチドを、ポリペプチド
を発現するための様々な発現ベクターのいずれか１つに
含ませることができる。そのようなベクターには、染色
体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０
の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロ
ウイルス；酵母プラスミド；プラスミドとファージＤＮ
Ａとの組合せから得られるベクター；ワクシニア、アデ
ノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病といったような
ウイルスＤＮＡが含まれる。しかし、他のいずれのベク
ターも、それが宿主中で複製可能であって、生存可能で
ある限り、使用することができる。

【００３７】適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベク
ターに挿入することができる。一般には、ＤＮＡ配列を
当業界で既知の方法により適当な制限エンドヌクレアー
ゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方法は、
当業者の範囲内であると思われる。

【００３８】発現ベクターのＤＮＡ配列を、適当な発現
制御配列(プロモーター)に作動可能に結合し、mＲＮＡ
合成を行わせる。そのようなプロモーターの代表例とし
て、以下のものが挙げられる：ＬＴＲまたはＳＶ４０プ
ロモーター、Ｅ.coli. lacまたはtrp、ファージラムダ
Ｐ_Ｌプロモーター、および原核もしくは真核細胞または
それらのウイルスでの遺伝子の発現を制御することが知
られている他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻
訳開始のためのリボソーム結合部位および転写終結区も
含む。該ベクターはまた、発現を増幅するのに適当な配
列も含み得る。

【００３９】さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の
場合にはジヒドロフォレートレダクターゼまたはネオマ
イシン耐性といったような、またはＥ.coliではテトラ
サイクリンまたはアンピシリン耐性といったような、ト
ランスフォームされた宿主細胞の選択のための表現型特
性を与えるために、１つまたはそれ以上の選択可能なマ
ーカー遺伝子を含むのが好ましい。

【００４０】上記のような適当なＤＮＡ配列、さらには
また、適当なプロモーターまたは制御配列を含むベクタ
ーを、適当な宿主をトランスフォームするために使用し
て、その宿主がタンパク質を発現するのを可能にするこ
とができる。

【００４１】適当な宿主の代表例として、以下のものが
挙げられる：Ｅ.coli、Ｓtreptomyces、Ｓalmonella ty
phimuriumといったような細菌細胞；酵母のような真菌
細胞；Ｄrosophila Ｓ２およびＳf９といったような昆
虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢowesメラノーマといっ
たような動物細胞；アデノウイルス；植物細胞等。適当
な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内
であると思われる。

【００４２】とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載
した配列を１つまたはそれ以上含んでなる組換え構築物
も含まれる。その構築物は、本発明の配列が順または逆
方向で挿入されている、プラスミドまたはウイルスベク
ターといったようなベクターを含んでなる。この実施態
様の好ましい態様では、該構築物はさらに、例えば、該
配列に作動可能に結合したプロモーターを含め、制御配
列を含んでなる。適当なベクターおよびプロモーターが
多数、当業者に知られていて、市販されている。以下の
ベクターを例として挙げる。細菌用: pＱＥ７０、pＱＥ
６０、pＱＥ−９(Ｑiagen)、pＢＳ、pＤ１０、ファージ
スクリプト(phagescript)、psiＸ１７４、pbluescript
ＳＫ、pbsks、pＮＨ８Ａ、pＮＨ１６a、pＮＨ１８Ａ、p
ＮＨ４６Ａ(Ｓtratagene)；ptrc９９a、pＫＫ２２３−
３、pＫＫ２３３−３、pＤＲ５４０、pＲＩＴ５(Ｐharm
acia)。真核生物用: pＷＬＮＥＯ、pＳＶ２ＣＡＴ、pＯ
Ｇ４４、pＸＴ１、pＳＧ(Ｓtratagene)、pＳＶＫ３、p
ＢＰＶ、pＭＳＧ、pＳＶＬ(Ｐharmacia)。しかし、他の
いずれのプラスミドまたはベクターも、それらが宿主中
で複製可能であって、生存可能である限り、使用するこ
とができる。

【００４３】プロモーター領域は、ＣＡＴ(クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ)ベクターまたは選択マ
ーカーを有する他のベクターを用いて、いずれかの所望
の遺伝子から選択することができる。２つの適当なベク
ターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。個々
に名付けられた細菌プロモーターには、lacＩ、lacＺ、
Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰ_Ｒ、Ｐ_Ｌおよびtrpが含まれ
る。真核プロモーターには、ＣＭＶ即時初期(immediate
early)、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期Ｓ
Ｖ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスの
メタロチオネイン−Ｉが含まれる。適当なベクターおよ
びプロモーターの選択は、十分、当業者のレベルの範囲
内である。

【００４４】さらなる態様では、本発明は、上記の構築
物を含む宿主細胞に関する。その宿主細胞は、哺乳動物
細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような低等真核
細胞であり得、または該宿主細胞は、細菌細胞のような
原核細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リ
ン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキ
ストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポ
レーションにより行うことができる。(Ｄavis,Ｌ.、Ｄi
bner,Ｍ.、Ｂattey,Ｌ.、Ｂasic Ｍethods inＭolecula
r Ｂiology（１９８６）)。

【００４５】宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用し
て、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を製造す
ることができる。あるいはまた、本発明のポリペプチド
は、従来のペプチド合成装置により合成的に製造するこ
とができる。

【００４６】成熟タンパク質は、適当なプロモーターの
制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中
で発現させることができる。そのようなタンパク質を、
本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造
するために、無細胞翻訳系もまた使用することができ
る。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニ
ングおよび発現ベクターは、Ｓambrookら、Ｍolecular
Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍanual, 第２版、Ｃold Ｓ
pring Ｈarbor、ニューヨーク、（１９８９)により記載
されており、この開示は、本明細書の一部を構成する。

【００４７】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベク
ターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、
プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常、
約１０〜３００bpの、ＤＮＡのシス作用性要素である。
例には、bp １００〜２７０の、複製開始点の後期側に
あるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期
プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にある
ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハ
ンサーが含まれる。

【００４８】通例、組換え発現ベクターには、複製開始
点、および宿主細胞のトランスフォーメーションを可能
にする選択可能なマーカー、例えば、Ｅ.coliのアンピ
シリン耐性遺伝子およびＳ.cerevisiae ＴＲＰ１遺伝
子、並びに下流の構造配列の転写を行わせるために高度
に発現される遺伝子から得られるプロモーターが含まれ
るであろう。そのようなプロモーターは、とりわけ、３
−ホスホグリセリン酸キナーゼ(ＰＧＫ)のような解糖系
酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショック
タンパク質をコードするオペロンから得ることができ
る。ヘテロロガス構造配列は、翻訳開始および終結配
列、また好ましくは、翻訳されたタンパク質の細胞周辺
腔または細胞外媒体への分泌を行わせることができるリ
ーダー配列と共に、適当な相(phase)で構築される。場
合により、そのヘテロロガス配列は、所望の特性、例え
ば、発現された組換え生成物の安定化または精製の簡易
化を与えるＮ−末端同定ペプチドが含まれる融合タンパ
ク質をコードすることができる。

【００４９】細菌で使用するのに有用な発現ベクター
は、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、
適当な翻訳開始および終結シグナルと共に、機能的なプ
ロモーターを有する作動可能なリーディング相に挿入す
ることにより構築される。そのベクターは、ベクターの
維持を確実なものとするために、また所望により、宿主
内での増幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表現
型の選択可能なマーカーおよび複製開始点を含んでなる
であろう。トランスフォーメーションに適当な原核宿主
には、Ｅ.coli、Ｂacillus subtilis、Ｓalmonella typ
himurium、並びにＰseudomonas属、Ｓtreptomyces属、
およびＳtaphylococcus属の範囲内の様々な種が含まれ
るが、他のものもまた、選択物質として使用することが
できる。

【００５０】代表的であるが、非限定的な例として、細
菌で使用するのに有用なベクターは、周知のクローニン
グベクター pＢＲ３２２(ＡＴＣＣ ３７０１７)の遺伝
要素を含んでなる市販のプラスミドから得られる、選択
可能なマーカーおよび細菌の複製開始点を含んでなり得
る。そのような市販のベクターには、例えば、pＫＫ２
２３−３(Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals、Ｕppsala、ス
ウェーデン)およびＧＥＭ１(Ｐromega Ｂiotec、Ｍadis
on、ＷＩ、米国)が含まれる。これらのpＢＲ３２２「骨
核」部分を適当なプロモーターおよび発現されるべき構
造配列と組み合わせる。

【００５１】適当な宿主株をトランスフォーメーション
して、その宿主株を適当な細胞密度まで増殖させた後、
選択されたプロモーターを適当な方法(例えば、温度シ
フトまたは化学誘導)により誘導して、細胞をさらなる
期間培養する。

【００５２】細胞を、一般的には、遠心分離により収集
し、物理的または化学的方法により破壊して、その結果
得られた粗製の抽出物を更なる精製のために保有する。

【００５３】タンパク質の発現に使用される微生物細胞
は、凍結−解凍サイクル、音波処理、機械的破壊、また
は細胞溶解剤の使用を含め、いずれの従来法によっても
破壊でき、そのような方法は、当業者に周知である。

【００５４】組換えタンパク質を発現させるために、様
々な哺乳動物細胞培養系もまた使用することができる。
哺乳動物発現系の例には、Ｇluzman、Ｃell、２３：１
７５（１９８１）により記載されている、サルの腎臓線
維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合可能なベクターを
発現させることができる他の細胞系、例えば、Ｃ１２
７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨeＬaおよびＢＨＫ細胞系が含ま
れる。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当なプ
ロモーターおよびエンハンサー、またいずれかの必要な
リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス
ドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および
５'に隣接する非転写配列もまた含んでなるであろう。
ＳＶ４０のスプライシングから得られるＤＮＡ配列、お
よびポリアデニル化部位を使用して、必要とされる非転
写遺伝要素を与えることができる。

【００５５】ＴＮＦ−γポリペプチドは、硫酸アンモニ
ウムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽
イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロ
マトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、
アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパ
タイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグ
ラフィーが含まれる方法により、組換え細胞培養物から
回収して、精製することができる。必要に応じて、タン
パク質の再生工程を、成熟タンパク質の立体配置を完成
するのに使用することができる。最後に、高性能液体ク
ロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)を最終精製工程に使用する
ことができる。

【００５６】本発明のポリペプチドは、天然に精製され
た産物、もしくは化学合成法の産物であり得るか、また
は原核もしくは真核宿主から(例えば、培養物中の細
菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によっ
て)組換え技術により製造することができる。組換え製
造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチド
は、グリコシル化され得るか、またはグルコシル化され
得ない。本発明のポリペプチドにはまた、最初のメチオ
ニンアミノ酸残基が含まれ得る。

【００５７】本発明のＴＮＦ−γポリペプチドは、腫瘍
細胞増殖または新形成を阻害するために使用することが
できる。該ＴＮＦ−γポリペプチドは、膜ブレビン(ble
bbin)(ゼイオシス(zeiosis))、細胞質の圧縮、および内
因性エンドヌクレアーゼの活性化により特徴付けられ
る、アポプトシスによる腫瘍破壊の原因となり得る(第
１７図)。表１に示されるように、ＴＮＦ−γは、異常
な細胞増殖および調節を有する、試験した細胞系、例え
ば、線維肉腫および癌細胞系に対して、強い細胞毒活性
を有する。このことはまた、第１０〜１３図、第１４〜
１６図および第１８〜２１図でも説明されており、ここ
では、ＴＮＦ−γが、細胞毒活性によってＬ９２９およ
びＷＥＨＩ １６４細胞増殖を阻害する能力を有するこ
とが示されている。ＷＥＨＩ １６４細胞は、マウス線
維肉腫細胞である。ＴＮＦ−γを投与する好ましい方法
は、腫瘍内への直接注射による。

【００５８】ＴＮＦ−γの細胞接着活性は、創傷治癒に
利用することができる。表１および第９図に示されるよ
うに、ＴＮＦ−γは強い内皮細胞増殖効果を有し、この
ことは、ＴＮＦ−γが創傷治癒において役割を担うこと
の指標である。ＴＮＦ−γの細胞接着効果はまた、創傷
治癒においての役割も担い得る。

【００５９】ＴＮＦ−γはまた、増殖促進活性を必要と
する疾患、例えば、再狭窄を治療するのに使用すること
もできる。上述のように、ＴＮＦ−γは、内皮細胞増殖
に対して強い増殖効果を有することが示されている。従
って、ＴＮＦ−γはまた、造血および内皮細胞の発達を
調節するのに使用することもできる。

【００６０】該ＴＮＦ−γポリペプチドは、そのＴ細胞
の活性化を刺激する能力により、免疫応答の重要なメデ
ィエーターである。従って、このポリペプチドは、様々
な寄生生物、細菌およびウイルス感染に対する免疫応答
を刺激するのに使用することができる。ＴＮＦ−γは、
ウイルス感染細胞を溶菌することから、ＨＩＶ感染細胞
を停止するのに使用することができる。

【００６１】該ＴＮＦ−γポリペプチドはまた、Ｔ細胞
増殖応答を高めることにより、Ｉ型糖尿病のような自己
免疫疾患を治療するのに使用することもできる。

【００６２】

【表１】

【００６３】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、ヒト疾患に対する治療および診断の発見のため
の、研究試薬および物質として使用することができる。

【００６４】本発明は、ＴＮＦ−γに対する受容体の同
定方法を提供する。該受容体をコードする遺伝子は、当
業者に知られている多数の方法、例えば、リガンドパニ
ング(panning)およびＦＡＣＳソーティングにより同定
することができる(Ｃoliganら、Ｃurrent Ｐrotocols i
n Ｉmmun.、１（２）、第５章（１９９１）)。好ましく
は、発現クローニングを利用し、ここでは、ポリアデニ
ル化ＲＮＡをＴＮＦ−γに応答する細胞から調製して、
このＲＮＡから作られるcＤＮＡライブラリーをプール
に分けて、ＣＯＳ細胞またはＴＮＦ−γに応答しない他
の細胞をトランスフェクトするために使用する。ガラス
スライド上で増殖させた、トランスフェクトされた細胞
を、標識化ＴＮＦ−γにさらす。ＴＮＦ−γは、ヨウ素
化または部位特異的プロテインキナーゼに対する認識部
位の包含を含め、様々な方法により標識化することがで
きる。固定およびインキュベーションに続いて、そのス
ライドをオートラジオグラフ分析にかける。陽性のプー
ルを同定して、サブプールを調製し、反復サブプーリン
グおよび再スクリーニング方法を利用して、再びトラン
スフェクトし、最終的には、推定される受容体をコード
する単一クローンを得る。

【００６５】受容体を同定するための他の方法として、
標識化ＴＮＦ−γを細胞膜と光親和性により結合させる
か、または受容体分子を発現する調製物を抽出すること
ができる。橋かけ(cross-linked)物質をＰＡＧＥにより
分けて、Ｘ線フィルムにさらす。ＴＮＦ−γ−受容体を
含む標識化複合体を切除し、ペプチドフラグメントに分
けて、タンパク質ミクロ配列決定にかけることができ
る。ミクロ配列決定から得られるアミノ酸配列を使用し
て、一組の変性オリゴヌクレオチドプローブを設計し、
cＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、推定され
る受容体をコードする遺伝子が同定されるであろう。

【００６６】ＴＮＦ−γは、２つの可溶性ＴＮＦ受容
体、sＴＮＦ−ＲＩ(p５５)およびsＴＮＦ−ＲII(p７５)
へ有意に結合しない。従って、ＴＮＦ−γは、既知のＴ
ＮＦタンパク質活性を含み、また既知のＴＮＦタンパク
質の活性以外の活性を有し得る(第２８図参照)。

【００６７】本発明はまた、化合物をスクリーニングし
て、ＴＮＦ−γによく似ている化合物(アゴニスト)を同
定する、またはＴＮＦ−γの効果を防ぐ方法にも関す
る。そのような方法の一例は、ＴＮＦ−γがコミトゲン
(comitogen) Ｃon Ａ.の存在下にヒト内皮細胞の増殖を
有意に刺激する能力を利用する。内皮細胞を得て、２μ
g／mlのＣon−Ａ(Ｃalbiochem、Ｌa Ｊolla、ＣＡ)の存
在下、１０％ 熱不活性化ウシ胎児血清(Ｈyclone Ｌab
s、Ｌogan、ＵＴ)、１％ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／m
l ペニシリン、１００μg／ml ストレプトマイシン、
０.１％ ゲンタマイシン(Ｇibco Ｌife Ｔechnologie
s、Ｇrand Ｉsland、ＮＹ)を補ったＲＰＭ１１６４０の
入った、９６ウェルの平底培養プレート(Ｃostar、Ｃam
bridge、ＭＡ)で培養する。Ｃon−Ａ、およびスクリー
ニングすべき化合物を、最終体積が０.２mlとなるまで
加える。３７℃で６０時間後、培養物を、１μＣiの[^３
Ｈ]チミジン(５Ｃi／mmol；１Ｃi＝３７ＢＧq；ＮＥＮ)
で１２−１８時間パルスして、ガラス繊維フィルター
(ＰhＤ；Ｃambridge Ｔechnology、Ｗatertown、ＭＡ)
上に収集する。３回行った培養の平均の[^３Ｈ]チミジン
の取込み(cpm)を、液体シンチレーションカウンター(Ｂ
eckman Ｉnstruments、Ｉrvine、ＣＡ)を使用して測定
する。有意な[^３Ｈ]チミジンの取込みは、内皮細胞増殖
の刺激を示す。あるいはまた、ＴＮＦ−γと受容体との
相互作用に続いて起こる、既知の第二メッセンジャーシ
ステムの応答は、該化合物の存在下または不存在下に測
定して比較されるであろう。そのような第二メッセンジ
ャーシステムには、これらに限定されるものではない
が、cＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャンネル
またはホスホイノシチド加水分解が含まれる。

【００６８】アンタゴニストに関してアッセイするに
は、上記アッセイを行うが、このアッセイでは、ＴＮＦ
−γを、スクリーニングすべき化合物と一緒に加え、ま
た該化合物がＴＮＦ−γの存在下に[^３Ｈ]チミジンの取
込みを阻害する能力は、該化合物がＴＮＦ−γに対する
アンタゴニストであることを示す。あるいはまた、ＴＮ
Ｆ−γアンタゴニストは、競合阻害アッセイに適当な条
件下、ＴＮＦ−γおよび可能性のあるアンタゴニスト
を、膜に結合したＴＮＦ−γ受容体と、または組換え受
容体と合わせることにより検出することができる。ＴＮ
Ｆ−γは、例えば、放射能より標識化することができる
ことから、該受容体に結合したＴＮＦ−γ分子の数によ
り、可能性のあるアンタゴニストの有効性を測定するこ
とができる。

【００６９】あるいはまた、該化合物の存在下、ＴＮＦ
−γ受容体を発現する哺乳動物の細胞または膜調製物
を、標識化ＴＮＦ−γと共にインキュベートする。次い
で、該化合物がこの相互作用を高める、またはブロック
する能力を測定することができるであろう。

【００７０】ＴＮＦ−γに特異的な抗体は、ＴＮＦ−γ
に結合して、ＴＮＦ−γがその受容体に結合できないよ
うにすることにより、アンタゴニストとして使用するこ
とができる。この試薬において、モノクローナル抗体が
特に有効である。該ＴＮＦ−γ受容体に特異的な抗体
は、しかし、その受容体との相互作用に対するＴＮＦ−
γの効果にアゴナイズ(agonize)傾向がある、異なった
細胞応答を媒介し得る。

【００７１】可能性のあるＴＮＦ−γアンタゴニストに
はまた、ＴＮＦ−γ受容体に結合して、該受容体をその
天然リガンドから有効にブロックするために第二メッセ
ンジャー応答を全く誘発しない、ＴＮＦ−γの変異体も
含まれる。具体的に設計されたオリゴヌクレオチドおよ
び小さな分子もまた、ＴＮＦ−γ受容体に結合して、Ｔ
ＮＦ−γ受容体をＴＮＦ−γからブロックすることがで
きる。小さな分子の例には、これらに限定されるもので
はないが、小さなペプチドまたはペプチド様分子が含ま
れる。

【００７２】別の可能性のあるＴＮＦ−γアンタゴニス
トは、ＴＮＦ−γに結合して、ＴＮＦ−γが膜に結合し
たＴＮＦ−γ受容体と相互作用できないようにする、可
溶性型のＴＮＦ−γ受容体である。この方法では、該受
容体が、ＴＮＦ−γにより刺激されない。

【００７３】別の可能性のあるＴＮＦ−γアンタゴニス
トは、アンチセンス技術を利用して調製されたアンチセ
ンス構築物である。アンチセンス技術を利用して、三重
らせん形成またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡに
よって遺伝子発現を制御することができ、この方法は両
方とも、ポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結
合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコー
ドする、ポリヌクレオチド配列の５'コード部分を使用
して、長さ約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオ
リゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチ
ドを、転写に関与する遺伝子領域に対して相補的である
よう設計し(三重らせん−Ｌeeら、Ｎucl.Ａcids Ｒe
s.、６：３０７３（１９７９）；Ｃooneyら、Ｓcienc
e、２４１：４５６（１９８８）；およびＤervanら、Ｓ
cience、２５１：１３６０（１９９１）を参照)、その
ことによって、転写およびＴＮＦ−γの産生を妨げる。
アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボに
おいてmＲＮＡにハイブリダイズして、mＲＮＡ分子のＴ
ＮＦ−γポリペプチドへの翻訳をブロックする(アンチ
センス−Ｏkano、Ｊ.Ｎeurochem.、５６：５６０（１９
９１）；Ｏligodeoxynucleotides as Ａntisense Ｉnhi
bitors of Ｇene Ｅxpression、ＣＲＣ Ｐress、Ｂoca
Ｒaton、ＦＬ（１９８８）)。上記のオリゴヌクレオチ
ドをまた、細胞に送り込むことから、アンチセンスＲＮ
ＡまたはＤＮＡをインビボにおいて発現させて、ＴＮＦ
−γの産生を阻害することができる。

【００７４】ＴＮＦ−γアンタゴニストはまた、ＴＮＦ
−γにより抑制されるリポタンパク質リパーゼの全身性
欠損から起こる脂質清澄化欠損症である、悪液質を治療
するのに使用することもできる。ＴＮＦ−γアンタゴニ
ストはまた、ＴＮＦ−γが病原的役割を担うらしい、大
脳マラリアを治療するのにも使用される。該アンタゴニ
ストはまた、滑液細胞において、ＩＬ−１のような炎症
性サイトカインの産生を誘起するＴＮＦ−γを阻害する
ことにより、慢性関節リウマチを治療するのに使用する
こともできる。関節炎を治療する場合、ＴＮＦ−γを関
節内に注射するのが好ましい。

【００７５】該ＴＮＦ−γアンタゴニストはまた、移植
片の存在下、ＴＮＦ−γによる免疫系の刺激を防ぐこと
により、移植片拒絶を防ぐのに使用することもできる。
該ＴＮＦ−γアンタゴニストはまた、ＴＮＦ−γが骨吸
収を誘起し得ることから、骨粗鬆症を治療するのに使用
することもできる。

【００７６】ＴＮＦ−γに対するアンタゴニストはま
た、ＴＮＦ−γが炎症応答の高まりを媒介することか
ら、抗炎症剤として使用することもできる。

【００７７】該アンタゴニストはまた、敗血症性ショッ
クとも呼ばれる内毒素性ショックを治療するのに使用す
ることもできる。この重篤な病態は、細菌または他の種
類の感染に対する応答の誇張から起こる。この応答は、
ショックおよび組織損傷の原因となるＴＮＦ−γレベル
の上昇をもたらす。

【００７８】該アンタゴニストは、以下に記載するよう
な薬学上許容され得る担体と共に、組成物中で使用する
ことができる。

【００７９】完全な長さのＴＮＦ−γ遺伝子のフラグメ
ントは、完全な長さの遺伝子を単離するために、また該
遺伝子に対する高い配列類似性、または類似の生物学的
活性を有する他の遺伝子を単離するために、cＤＮＡラ
イブラリーに対するハイブリダイゼーションプローブと
して使用することができる。この種類のプローブは、例
えば、２０〜２０００塩基であり得る。好ましくは、し
かし、該プローブは、３０〜５０塩基対を有する。該プ
ローブはまた、完全な長さの転写物、並びにゲノムクロ
ーン、または調節およびプロモーター領域、エキソン、
およびイントロンが含まれる、完全なＴＮＦ−γ遺伝子
を含むクローンに対応するcＤＮＡクローンを同定する
のに使用することもできる。スクリーニングの例として
は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するための既知
のＤＮＡ配列を使用することによって、ＴＮＦ−γ遺伝
子のコード領域を単離することを含んでなる。本発明の
遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識化オリゴヌク
レオチドを、ヒトcＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはmＲＮＡ
のライブラリーをスクリーニングするために使用して、
プローブがハイブリダイズするライブラリーのメンバー
を決定する。

【００８０】本発明のＴＮＦ−γポリペプチド並びにア
ゴニストおよびアンタゴニストは、適当な薬学的担体と
組み合わせて使用することができる。そのような組成物
は、治療上有効な量の該化合物、および薬学上許容され
得る担体または賦形剤を含んでなる。そのような担体に
は、これに限定されるものではないが、生理食塩水、緩
衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、
エタノール、およびそれらの組み合わせが含まれる。そ
の製剤は、投与方法に適合すべきである。

【００８１】本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分
を１つまたはそれ以上充填した、１つまたはそれ以上の
容器を含んでなる医薬品パックまたはキットも提供す
る。そのような容器に関連して、薬学的または生物学的
製品の製造、使用または販売を規制する政府当局により
規定された形の通知を付してもよく、この通知は、ヒト
への投与のための製造、使用または販売の、該当局によ
る承認を表わす。さらに、本発明の医薬組成物は、他の
治療化合物と共に使用することができる。

【００８２】該医薬組成物は、局所、静脈内、腹腔内、
筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経路といったような、
便利な方法で投与することができる。該医薬組成物は、
具体的な徴候を治療および／または予防するのに有効な
量で投与される。一般に、それらは、少なくとも約１０
μg／kg(体重)の量で投与され、最も多くの場合、それ
らは、１日当り約８mg／kg(体重)を超えない量で投与さ
れるであろう。最も多くの場合、投与経路および症状等
を考慮に入れて、投薬量は、毎日約１０μg／kg〜約１m
g／kg(体重)である。

【００８３】該ＴＮＦ−γポリペプチド、並びにポリペ
プチドであるアゴニストおよびアンタゴニストはまた、
「遺伝子治療」と呼ばれることが多い、そのようなポリ
ペプチドのインビボにおける発現により、本発明に従っ
て使用することもできる。

【００８４】従って、例えば、患者由来の細胞を、エク
スビボにおいてポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)で操作した後、操作した細胞
を該ペプチドで処置すべき患者に与える。そのような方
法は、当業界で周知であって、本明細書中の教示から明
らかである。例えば、本発明のポリペプチドをコードす
るＲＮＡを含むレトロウイルス粒子の使用により、細胞
を操作することができる。

【００８５】同様に、例えば、当業界で既知の方法によ
り、ポリペプチドのインビボにおける発現のために、細
胞をインビボにおいて操作することができる。例えば、
細胞をインビボにおいて操作して、ポリペプチドをイン
ビボにおいて発現させるために、本発明のポリペプチド
をコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を製造す
るための産生細胞を患者に投与することができる。その
ような方法により本発明のポリペプチドを投与するため
のこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当
業者に明らかであろう。例えば、細胞を操作するための
発現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの、例えば、
適当な運搬ビヒクルと組み合わせた後、細胞をインビボ
において操作するために使用することができるアデノウ
イルスであってもよい。

【００８６】本発明はまた、疾患、または変異したＴＮ
Ｆ−γの存在に関係のある疾患に対する感受率を検出す
るための診断アッセイの一部としての、ＴＮＦ−γ遺伝
子の使用にも関する。そのような疾患、例えば、腫瘍お
よび癌といったような異常な細胞増殖は、ＴＮＦ−γの
発現不足と関係がある。

【００８７】ヒトＴＮＦ−γ遺伝子において変異が起こ
っている個体は、様々な技術により、ＤＮＡレベルで検
出することができる。診断用の核酸は、患者の細胞か
ら、例えば、血液、尿、唾液、組織生検および剖検材料
から得ることができる。ゲノムＤＮＡは、検出のために
直接使用することができ、または分析前にＰＣＲ(Ｓaik
iら、Ｎature、３２４：１６３−１６６（１９８６）)
を利用することにより、酵素的に増幅することができ
る。ＲＮＡまたはcＤＮＡもまた、同じ目的に使用する
ことができる。例としては、ＴＮＦ−γをコードする核
酸に相補的なＰＣＲプライマーを使用して、ＴＮＦ−γ
変異を同定して分析することができる。例えば、欠失お
よび挿入は、正常な遺伝子型と比較しての増幅産物のサ
イズにおける変化により検出することができる。点変異
は、増幅されたＤＮＡが、放射能標識化ＴＮＦ−γ Ｒ
ＮＡ、あるいはまた、放射能標識化ＴＮＦ−γ アンチ
センスＤＮＡ配列にハイブリダイズすることにより同定
することができる。完全に対合している配列は、ＲＮア
ーゼ Ａ 消化により、または融解温度の相違により、対
合していない複式物(duplexes)と区別することができ
る。

【００８８】ＤＮＡ配列の相違に基づいた遺伝試験は、
変性剤を含む、または含まないゲルでのＤＮＡフラグメ
ントの電気泳動移動度における変化の検出により成し遂
げることができる。小さな配列の欠失および挿入は、高
分解能ゲル電気泳動により視覚化することができる。Ｄ
ＮＡフラグメントの様々な配列は、ホルムアミジングラ
ジエントゲルを変性することで区別することができ、こ
こでは、様々なＤＮＡフラグメントの移動度が、それら
の特異的な融解または部分的な融解温度により、ゲルに
おける様々な位置で遅延される(例えば、Ｍyersら、Ｓc
ience、２３０：１２４２（１９８５）を参照)。

【００８９】特定の位置での配列変化もまた、ＲＮアー
ゼおよびＳ１保護といったようなヌクレアーゼ保護アッ
セイ、または化学切断法により示すことができる(例え
ば、Ｃottonら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９７−
４４０１（１９８５）)。従って、特異的なＤＮＡ配列
の検出は、ゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーション、Ｒ
Ｎアーゼ保護、化学切断、直接ＤＮＡ配列決定、または
制限酵素の使用(例えば、制限酵素断片長多型（ＲＦＬ
Ｐ）)、およびサザンブロッティングといったような方
法により成し遂げることができる。さらに従来的なゲル
電気泳動およびＤＮＡ配列決定に加えて、変異はまた、
insitu 分析により検出することもできる。

【００９０】本発明はまた、正常な対照の組織試料と比
較しての該タンパク質の過剰発現により、疾患、または
疾患に対する感受率、例えば、腫瘍および大脳マラリア
の存在を検出することができることから、様々な組織に
おけるＴＮＦ−γタンパク質レベルの変化を検出するた
めの診断アッセイにも関する。宿主から得られた試料中
のＴＮＦ−γタンパク質レベルを検出するために利用さ
れるアッセイは当業者に周知であって、ラジオイムノア
ッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット分析、
ＥＬＩＳＡアッセイ、および「サンドイッチ」アッセイ
が含まれる。ＥＬＩＳＡアッセイ(Ｃoliganら、Ｃurren
t Ｐrotocols in Ｉmmunology、１（２）、第６章、
（１９９１）)は、まず最初に、ＴＮＦ−γ抗原に特異
的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製するこ
とを含んでなる。さらに、リポーター抗体を、そのモノ
クローナル抗体に対して調製する。そのリポーター抗体
に、放射能、蛍光、また本実施例では、ワサビペルオキ
シダーゼ酵素といったような、検出可能な試薬を結合さ
せる。試料を直ちに宿主から取り除いて、試料中のタン
パク質を結合する固形保持体、例えば、ポリスチレン皿
の上でインキュベートする。次いで、ＢＳＡのような、
非特異的なタンパク質と共にインキュベートすることに
より、その皿の上の空いているタンパク質結合部位を全
て覆う。次に、モノクローナル抗体を皿においてインキ
ュベートするが、その間に、そのモノクローナル抗体
は、ポリスチレン皿に結合した全てのＴＮＦ−γタンパ
ク質に結合する。結合しなかったモノクローナル抗体を
全て、緩衝液で洗い流す。ワサビペルオキシダーゼに結
合したリポーター抗体を直ちに皿に置くと、リポーター
抗体の、ＴＮＦ−γに結合した全てのモノクローナル抗
体への結合が起こる。次いで、結合しなかったリポータ
ー抗体を洗い流す。次いで、ペルオキシダーゼ基質を皿
に加えて、一定時間に発生した色の量は、標準曲線に対
して比較する場合、患者の試料の一定体積中に存在する
ＴＮＦ−γタンパク質の量の測定値である。

【００９１】競合アッセイを利用することができ、ここ
では、ＴＮＦ−γに特異的な抗体を固形保持体に結合さ
せて、標識化ＴＮＦ−γおよび宿主から得られた試料を
固形保持体上に通過させて、例えば、液体シンチレーシ
ョンクロマトグラフィーにより検出される標識の量を、
試料中のＴＮＦ−γの量に関連づけることができる。

【００９２】「サンドイッチ」アッセイは、ＥＬＩＳＡ
アッセイに似ている。「サンドイッチ」アッセイでは、
ＴＮＦ−γを固形保持体上に通過させて、固形保持体に
結合した抗体に結合させる。次いで、第二抗体をＴＮＦ
−γに結合させる。標識化され、また第二抗体に特異的
な第三抗体を固形保持体上に通過させて、第二抗体に結
合させた後、量を定量することができる。

【００９３】本発明の配列はまた、染色体同定にも有益
である。その配列を個々のヒト染色体上の特定の位置に
対して具体的に標的化して、ハイブリダイズさせること
ができる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同
定する必要がある。実際の配列データ(反復多型性)に基
づいた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置をマ
ークするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤ
ＮＡの染色体へのマッピングは、それらの配列を病気と
関連する遺伝子と関係づける重要な第一段階である。

【００９４】簡単に言えば、cＤＮＡ由来のＰＣＲプラ
イマー(好ましくは、１５−２５bp)を調製することによ
り、配列を染色体にマップすることができる。配列の
３'の翻訳されていない領域のコンピューター分析を利
用して、ゲノムＤＮＡ中の１つ以上のエキソンをスパン
(span)しないプライマーを迅速に選択することから、増
幅過程を複雑なものとする。次いで、これらのプライマ
ーを、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰ
ＣＲスクリーニングに使用する。プライマーに対応する
ヒト遺伝子を含む、それらのハイブリッドのみが、増幅
されたフラグメントを与えるであろう。

【００９５】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰属させるための迅
速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを
用いての本発明を利用して、サブローカリゼーション
は、具体的な染色体または大きいゲノムクローンのプー
ル由来のフラグメントのパネルを用いる類似の方法で達
成することができる。その染色体へマップするのに同様
に利用することができる他のマッピング方法には、in s
itu ハイブリダイゼーション、標識化フロー−ソーティ
ッド(flow−sorted)染色体を用いてのプレスクリーニン
グ、および染色体特異的cＤＮＡライブラリーを構築す
るためのハイブリダイゼーションによるプレセレクショ
ンが含まれる。

【００９６】cＤＮＡクローンの、中期染色体スプレッ
ドへの蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(ＦＩＳ
Ｈ)を利用して、正確な染色体位置を一工程で与えるこ
とができる。この技術は、５００または６００塩基とい
う短いcＤＮＡで利用することができる；しかし、２,０
００bpより大きいクローンは、簡単な検出に十分なシグ
ナル強度を有する独自の染色体位置へ結合する可能性が
高い。ＦＩＳＨは、発現配列タグ(ＥＳＴ)が得られるク
ローンの使用を必要とし、また長ければ長いほどよい。
例えば、２,０００bpが良好であり、４,０００はより良
好であって、４,０００以上は、恐らく、良好な結果を
妥当な時間割合で得るのに必要ない。この技術の復習に
は、Ｖermaら、Ｈuman Ｃhromosomes：a Ｍanual of Ｂ
asic Ｔechniques、Ｐergamon Ｐress、ニューヨーク
（１９８８）を参照。

【００９７】ある配列が正確な染色体位置に一度マップ
されると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝マップデ
ータと関連付けることができる。そのようなデータは、
例えば、Ｖ.ＭcＫusick、Ｍendelian Ｉnheritance in
Ｍan(Ｊohns Ｈopkins Ｕniversity Ｗelch Ｍedical
Ｌibraryを介してオンラインで利用できる)に見い出さ
れる。次いで、同じ染色体領域にマップされている遺伝
子と疾患との間の関係を結合分析(物理的に隣接した遺
伝子の共遺伝(coinheritance))によって確認する。

【００９８】次に、病気に冒された個体と冒されていな
い個体との間のcＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定
する必要がある。変異が、冒された個体のいくつかまた
は全てにおいて認められるが、いずれの正常な個体にお
いても認められないなら、その変異は疾患の原因となる
ものであるらしい。

【００９９】現在、物理的マッピングおよび遺伝的マッ
ピングの分析から、疾患と関連する染色体領域に正確に
局在化したcＤＮＡは、５０〜５００の可能な原因とな
る遺伝子の１つとなり得るであろう。(これは、１メガ
ベースのマッピング分析および２０kb当り１つの遺伝子
を仮定する)。

【０１００】ポリペプチド、それらのフラグメントもし
くは他の誘導体、もしくはそれらのアナログ、またはそ
れらを発現する細胞を免疫源として使用して、それらに
対する抗体を製造することができる。これらの抗体は、
例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であ
り得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト化
抗体、さらにはまた、Ｆabフラグメント、またはＦab発
現ライブラリーの生成物も含まれる。当業界で既知の様
々な方法を、そのような抗体およびフラグメントの製造
に使用することができる。

【０１０１】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生成される抗体は、ポリペプチドを動物に直接注入
することにより、またはポリペプチドを動物、好ましく
はヒトでない動物に投与することにより得ることができ
る。次いで、そのようにして得られた抗体は、そのポリ
ペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポリ
ペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえも、
完全な天然のポリペプチドを結合する抗体を製造するの
に使用することができる。次いで、そのような抗体を使
用して、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプ
チドを単離することができる。

【０１０２】モノクローナル抗体を調製するには、連続
的な細胞系培養により産生される抗体を与える技術を全
て使用することができる。例には、ハイブリドーマ技術
(ＫohlerおよびＭilstein、１９７５、Ｎature、２５
６:４９５−４９７)、トリオーマ(trioma)技術、ヒトＢ
細胞ハイブリドーマ技術(Ｋozborら、１９８３、Ｉmmun
ology Ｔoday ４：７２)、およびヒトモノクローナル抗
体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Ｃole
ら、１９８５、Ｍonoclonal Ａntibodies and Ｃancer
Ｔherapy、Ａlan Ｒ.Ｌiss,Ｉnc.、７７−９６頁におい
て)が含まれる。

【０１０３】単鎖抗体の産生に関して記載されている技
術(米国特許第４,９４６,７７８号)は、本発明の免疫原
性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を製造するのに適
合し得る。また、トランスジェニックマウスを使用し
て、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト化
抗体を発現させることもできる。

【０１０４】本発明をさらに、以下の実施例に関して記
載する；しかし、本発明は、そのような実施例に限定さ
れないことを理解すべきである。部または量は全て、特
にことわらない限り、重量単位である。以下の実施例の
理解を容易にするために、幾つかの頻繁に出てくる方法
および／または用語を記載する。

【０１０５】「プラスミド」は、前置きする小文字のp
および／または続けて大文字および／または数字により
示す。本明細書中の出発プラスミドは、市販されてい
て、限定されない基盤の下に公に入手可能であるか、ま
たは公開された方法により入手可能なプラスミドから構
築できる。さらに、記載したプラスミドと同等のプラス
ミドは、当業界で既知であって、当業者に明らかであろ
う。

【０１０６】ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列に
のみ作用する制限酵素でＤＮＡを触媒切断することを示
す。本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されて
おり、それらの反応条件、補因子および他の必要条件
は、当業者に知られているように使用した。分析目的に
は、一般的に、緩衝溶液約２０μl中、１μgのプラスミ
ドまたはＤＮＡフラグメントを約２単位の酵素と共に使
用する。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを
単離する目的には、一般的に、より多量の体積中、ＤＮ
Ａ５〜５０μgを２０〜２５０単位の酵素で消化する。
特定の制限酵素に適当な緩衝液および基質量は、製造者
により指定されている。３７℃で約１時間のインキュベ
ーション時間が通常利用されるが、供給者の指示に従っ
て変えることができる。消化後、その反応物をポリアク
リルアミドゲルで直接電気泳動して、所望のフラグメン
トを単離する。

【０１０７】切断したフラグメントのサイズ分離は、Ｇ
oeddel,Ｄら、Ｎucleic Ａcids Ｒes.、８：４０５７
（１９８０）により記載されている８％ ポリアクリル
アミドゲルを用いて行う。

【０１０８】「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成
することができる、一本鎖ポリデオキシヌクレオチド、
または２つの相補的ポリヌクレオチド鎖を示す。そのよ
うな合成オリゴヌクレオチドは５'ホスフェートを有さ
ないことから、キナーゼの存在下、ＡＴＰでホスフェー
トを加えることなしには、別のオリゴヌクレオチドにラ
イゲートしないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、
脱リン酸化されていないフラグメントにライゲートする
であろう。

【０１０９】「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸
フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する過
程をいう(Ｍaniatis,Ｔ.ら、同上、１４６頁)。特にこ
とわらない限り、ライゲーションは、ライゲートさせる
べきＤＮＡフラグメントのほぼ等モル量の０.５μg当り
１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」)と共に、
既知の緩衝液および条件を用いて成し遂げることができ
る。

【０１１０】特にことわらない限り、トランスフォーメ
ーションは、Ｇraham,Ｆ.およびＶan der Ｅb,Ａ.、Ｖi
rology、５２：４５６−４５７（１９７３）の方法に記
載されているようにして行った。

【０１１１】

【実施例】実施例 １ ＴＮＦ−γの細菌発現および精製 最初に、ＴＮＦ−γをコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ
第７５９２７号を、ＴＮＦ−γタンパク質の５'配列、
およびＴＮＦ−γ遺伝子の３'側ベクター配列に対応す
るＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを利用して増幅
する。ＴＮＦ−γに対応する付加的ヌクレオチドを各
々、５'および３'配列に付加した。５'オリゴヌクレオ
チドプライマーは、配列： を有し、ＢamＨＩ制限酵素部位、続いて、プロセッシン
グされたタンパク質コドンの推定される末端アミノ酸か
ら始まる、ＴＮＦ−γコード配列の最初の２４ヌクレオ
チドを含む。３'配列： は、ＸbaＩ部位に対する相補的配列、続いて、ＴＮＦ−
γの２２ヌクレオチド、およびＴＮＦ−γ ＤＮＡ挿入
物の３'に位置するpＱＥ−９ベクター配列に対する相補
的配列を含む。その制限酵素部位は、細菌発現ベクター
pＱＥ−９(Ｑiagen)上の制限酵素部位に対応する。次
いで、pＱＥ−９をＢamＨＩおよびＸbaＩで消化した。
増幅された配列をpＱＥ−９にライゲートして、ヒスチ
ジンタグおよびＲＢＳをコードする配列と共に枠内に挿
入した。次いで、そのライゲーション混合物を使用し
て、Ｓambrook,Ｊ.ら、Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌabo
ratoryＭanual、Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress
（１９８９）に記載されている手順により、Ｑiagenか
ら商標 Ｍ１５／rep４で入手可能なＥ.coli.株をトラン
スフォームした。Ｍ１５／rep４はプラスミドpＲＥＰ４
の多重コピーを含み、これは、lacＩリプレッサーを発
現して、またカナマイシン耐性(Ｋan^ｒ)も与える。トラ
ンスフォーマントを、それらがＬＢプレートで増殖する
能力により同定して、アンピシリン／カナマイシン耐性
コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを単離して、制
限分析により確認した。所望の構築物を含むコロニー
を、Ａmp(１００ug／ml)とＫan(２５ug／ml)の両方を補
ったＬＢ培地中での液体培養で一晩増殖させた(Ｏ／
Ｎ)。そのＯ／Ｎ培養物を使用して、大きな培養物を
１：１００〜１：２５０の割合で播種した。細胞が、
０.４〜０.６の光学密度６００(Ｏ.Ｄ. ^６００)まで増殖
した。次いで、ＩＰＴＧ(「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チ
オガラクトピラノシド」)を、最終濃度が１mＭとなるま
で加えた。ＩＰＴＧは、lacＩリプレッサーを不活性化
し、Ｐ／Ｏをクリアリングし、遺伝子発現を増加させる
ことにより誘導する。細胞をさらに３〜４時間増殖させ
た。次いで、細胞を遠心分離により収集した。細胞ペレ
ットをカオトロピック剤である６モルのグアニジンＨＣ
l中で可溶化した。清澄後、この溶液から、６−ヒスチ
ジンタグを含むタンパク質による強固な結合を可能にす
る条件下、ニッケル−キレートカラムでのクロマトグラ
フィーにより、可溶化したＴＮＦ−γを精製した(Ｈoch
uli,Ｅ.ら、Ｊ.Ｃhromatography ４１１：１７７−１８
４（１９８４）)。ニッケル−キレートカラムでの２回
目の操作により、ＴＮＦ−γをさらに精製した。６モル
のグアニジンＨＣl(pＨ ５.０)中、ＴＮＦ−γ(純度 ９
０％)をカラムから溶出し、また再生を目的として、Ｐ
ＢＳ緩衝液中で透析した。その発現産物をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにより電気泳動し、またその結果は、第８図（ここ
で、Ｍは、分子量マーカーであり；レーン１は、誘導さ
れた細胞ライゼートであり；レーン２は、誘導されない
細胞ライゼートであり；レーン３は、２回のニッケル−
キレートカラム精製後のＴＮＦ−γタンパク質であり；
レーン４は、１回のカラム精製後のＴＮＦ−γタンパク
質である）に見ることができる。

【０１１２】実施例 ２ バキュロウイルス発現システムを用いての ＴＮＦ−γの
クローニングおよび発現 完全な長さのＴＮＦ−γタンパク質をコードするＤＮＡ
配列、ＡＴＣＣ第７５９２７号を、遺伝子の５'および
３'配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマ
ーを利用して増幅した。その５'プライマーは、配列： を有し、またＢamＨＩ制限酵素部位(肉太の活字)、続い
て、２４ヌクレオチドのＴＮＦ−γ遺伝子を含む(翻訳
開始コドン「ＡＴＧ」に下線を引く)。その３'プライマ
ーは、配列： を有し、また制限エンドヌクレアーゼ ＸbaＩの切断部
位、およびＴＮＦ−γ遺伝子の３'非翻訳配列に対して
相補的な２２ヌクレオチドを含む。増幅された配列を、
市販のキット(「Ｇeneclean」、ＢＩＯ １０１ Ｉnc.、
Ｌa Ｊolla、Ｃa.)を使用して、１％ アガロースゲルか
ら単離した。次いで、そのフラグメントをエンドヌクレ
アーゼ ＢamＨＩおよびＸbaＩで消化した後、１％ アガ
ロースゲル上で次に再度精製した。このフラグメントを
Ｆ２と名付ける。ベクター pＡ２(pＶＬ９４１ベクター
の修飾、以下に論ずる)を、バキュロウイルス発現シス
テムを用いてのＴＮＦ−γタンパク質の発現に使用した
(レビューには、Ｓummers,Ｍ.Ｄ.およびＳmith,Ｇ.Ｅ.
１９８７、Ａ manual of methods for baculovirus vec
tors and insect cell culture procedures、Ｔexas Ａ
gricultural Ｅxperimental Ｓtation Ｂulletin Ｎo.
１５５５を参照)。この発現ベクターは、オートグラフ
ァ(Ａutographa)カリフォルニアポリヘドロシスウイル
ス(ＡcＭＮＰＶ)の強力なポリヘドリンプロモーター、
続いて、制限エンドヌクレアーゼ ＢamＨＩおよびＸba
Ｉの認識部位を含む。シミアンウイルス(ＳＶ) ４０の
ポリアデニル化部位を、有効なポリアデニル化に使用す
る。組換えウイルスを容易に選択するため、Ｅ.coli由
来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、ポリヘドリン遺伝
子のポリアデニル化シグナルが続くポリヘドリンプロモ
ーターと同じ向きに挿入する。同時トランスフェクトし
た(cotransfected)野生型ウイルスＤＮＡの、細胞によ
り媒介される相同組換えのためのウイルス配列をポリヘ
ドリン配列の両側に隣接させる。多くの他のバキュロウ
イルスベクターを、例えば、pＲＧ１、pＡc３７３、pＶ
Ｌ９４１、およびpＡcＩＭ１を、pＡ２の代わりに使用
することができるであろう(Ｌuckow,Ｖ.Ａ.およびＳumm
ers,Ｍ.Ｄ.、Ｖirology、１７０：３１−３９)。

【０１１３】プラスミドを制限酵素ＢamＨＩおよびＸba
Ｉで消化した後、当業界で既知の方法により、仔ウシ腸
ホスファターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、市販
のキット(「Ｇeneclean」 ＢＩＯ １０１ Ｉnc.、Ｌa
Ｊolla、Ｃa.)を使用して、ＤＮＡを１％ アガロースゲ
ルから単離した。このベクター ＤＮＡをＶ２と名付け
る。

【０１１４】フラグメント Ｆ２および脱リン酸化プラ
スミド Ｖ２をＴ４ ＤＮＡリガーゼでライゲートさせ
た。次いで、Ｅ.coli ＸＬ１ ブルー細胞をトランスフ
ォームした。クローン化されたフラグメントの配列を、
ＤＮＡ配列決定により確認した。

【０１１５】リポフェクション法を利用して、プラスミ
ド pＢac ＴＮＦ−γ ５μgを市販の線形化バキュロウ
イルス(「ＢaculoＧold^ＴＭ バキュロウイルス ＤＮ
Ａ」、Ｐharmingen、Ｓan Ｄiego、ＣＡ)１.０μgと共
に同時トランスフェクトした(Ｆelgnerら、Ｐroc.Ｎat
l.Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ、８４：７４１３−７４１７（１
９８７）)。

【０１１６】ＢaculoＧold^ＴＭ ウイルス ＤＮＡ １μg
およびプラスミド pＢac ＴＮＦ−γ ５μgを、無血清
グレイス(Ｇrace's)培地(Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.、
Ｇaithersburg、ＭＤ)５０μlを含むマイクロタイター
プレートの無菌ウェル中で混合した。その後、リポフェ
クチン(Ｌipofectin)１０μlとグレイス培地９０μlを
加え、混合して、室温で１５分間インキュベートした。
次いで、トランスフェクション混合物を、無血清グレイ
ス培地１mlを含む、３５mmの組織培養プレートに播種し
たＳf９昆虫細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１)に滴加し
た。そのプレートを前後に揺り動かして、新たに加えた
溶液を混合した。次いで、そのプレートを２７℃で５時
間インキュベートした。５時間後、そのトランスフェク
ション溶液をプレートから除去して、１０％ ウシ胎児
血清を補ったグレイス昆虫培地１mlを加えた。そのプレ
ートをインキュベーターに戻して、２７℃で４日間培養
し続けた。

【０１１７】４日後、上清を集めて、ＳummersおよびＳ
mith(上記)により記載されたようにして、プラークアッ
セイを行った。変法として、「Ｂlue Ｇal」(Ｌife Ｔe
chnologies Ｉnc.、Ｇaithersburg)を含むアガロースゲ
ルを使用したが、このことにより、青色に染色されたプ
ラークを容易に単離することが可能となる。(「プラー
クアッセイ」の詳細な記述はまた、昆虫細胞培養に関す
る利用者のガイド、およびＬife Ｔechnologies Ｉn
c.、Ｇaithersburgにより配布されたバキュロウイルス
学、９−１０頁にも見い出すことができる)。

【０１１８】連続希釈の４日後に、ウイルスを細胞に加
えて、青色に染色されたプラークをエッペンドルフピペ
ットの先端で採取した。次いで、組換えウイルスを含む
寒天を、グレイス培地２００μlを含むエッペンドルフ
管内で再び懸濁させた。その寒天を短時間の遠心分離に
より除去して、組換えバキュロウイルスを含む上清を、
３５mmの皿に播種したＳf９細胞を感染させるのに使用
した。４日後、これらの培養皿の上清を収集した後、４
℃で保存した。

【０１１９】Ｓf９細胞を、１０％ 熱不活性化ＦＢＳを
補ったグレイス培地で増殖させた。その細胞に、感染多
重度(ＭＯＩ) ２で組換えバキュロウイルス Ｖ−ＴＮＦ
−γを感染させた。６時間後、その培地を除去して、メ
チオニンおよびシステインを含まないＳＦ９００ II 培
地(Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.、Ｇaithersburg)に替え
た。４２時間後、５μＣiの^３５Ｓ−メチオニンおよび
５μＣiの^３５Ｓ システイン５μＣi(Ａmersham)を加え
た。その細胞をさらに１６時間インキュベートした後、
それらを遠心分離により収集して、標識化タンパク質
を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーに
より視覚化した。第９図は、ゲルを説明する（ここで、
レーン１およびレーン３は、ＴＮＦ−γおよび対照の培
地であり；レーン２および４は、ＴＮＦ−γおよび対照
の細胞ライゼートである）。

【０１２０】実施例 ３ ＣＯＳ細胞における組換えＴＮＦ−γの発現 プラスミド、ＴＮＦ−γ ＨＡの発現は、１）ＳＶ４０
複製開始点、２）アンピリシン耐性遺伝子、３）Ｅ.col
i 複製開始点、４）ポリリンカー領域、ＳＶ４０ イン
トロンおよびポリアデニル化部位が続くＣＭＶプロモー
ターを含む、ベクター pcＤＮＡＩ／Ａmp(Ｉnvitrogen)
から得られる。完全なＴＮＦ−γ前駆体およびその３'
末端に枠内で融合したＨＡタグ(tag)をコードするＤＮ
Ａフラグメントを、そのベクターのポリリンカー領域に
クローン化したことから、組換えタンパク質発現は、Ｃ
ＭＶプロモーターの下に指示される。ＨＡタグは、前記
のようなインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得
られるエピトープに対応する(Ｉ.Ｗilson、Ｈ.Ｎiman、
Ｒ.Ｈeighten、Ａ.Ｃherenson、Ｍ.Ｃonnolly、および
Ｒ.Ｌerner、１９８４、Ｃell ３７、７６７)。ＨＡタ
グを我々の標的タンパク質へ融合させることにより、組
換えタンパク質を、ＨＡエピトープを認識する抗体で容
易に検出することが可能となる。

【０１２１】プラスミド構築方法を以下に記載する：Ｔ
ＮＦ−γをコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ第７５９２
７号を、２つのプライマーを用いてクローン化した、も
とのＥＳＴでのＰＣＲにより構築した：５'プライマー
(バキュラ(bacula)の実施例に関するものと同じ)は、Ｂ
amＨＩ部位、続いて、開始コドンから始まる２４ヌクレ
オチドのＴＮＦ−γコード配列を含む； ３'配列 は、ＸbaＩ部位に対する相補的配列、翻訳終止コドン、
ＨＡタグ、およびＴＮＦ−γコード配列の最後の１８ヌ
クレオチド(終止コドンは含まれていない)を含む。従っ
て、ＰＣＲ産物は、ＢamＨＩ部位、ＴＮＦ−γコード配
列、続いて、枠内で融合したＨＡタグ、そのＨＡタグの
隣の翻訳終了終止コドン、およびＸbaＩ部位を含む。Ｐ
ＣＲにより増幅されたＤＮＡフラグメントおよびベクタ
ー、pcＤＮＡＩ／Ａmpを、ＢamＨＩおよびＸbaＩ制限酵
素で消化して、ライゲートさせた。そのライゲーション
混合物をＥ.coli株 ＳＵＲＥ(Ｓtratagene Ｃloning Ｓ
ystems、１１０９９ Ｎorth Ｔorrey Ｐines Ｒoad、Ｌ
a Ｊolla、ＣＡ ９２０３７から入手可能である)にトラ
ンスフォームし、そのトランスフォームされた培養物を
アンピシリン培地プレート上に置いて、耐性コロニーを
選択した。プラスミド ＤＮＡをトランスフォーマント
から単離して、正しいフラグメントの存在に関して制限
分析により試験した。組換えＴＮＦ−γの発現には、Ｄ
ＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮ方法により、ＣＯＳ細胞を発現
ベクターでトランスフェクトした(Ｊ.Ｓambrook、Ｅ.Ｆ
ritsch、Ｔ.Ｍaniatis、Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌab
oratory Ｍanual、Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐres
s、（１９８９）)。ＴＮＦ−γＨＡタンパク質の発現
を、放射能標識および免疫沈降法により検出した。(Ｅ.
Ｈarlow、Ｄ.Ｌane、Ａntibodies：Ａ Ｌaboratory Ｍa
nual、Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress、（１９８
８）)。トランスフェクションから２日後、細胞を^{３ ５}
Ｓ−システインで８時間標識化した。次いで、細胞培地
を集めて、細胞を界面活性剤(ＲＩＰＡ緩衝液(１５０m
Ｍ ＮaＣl、１％ ＮＰ−４０、０.１％ ＳＤＳ、１％
ＮＰ−４０、０.５％ ＤＯＣ、５０mＭ トリス、pＨ
７.５))で溶菌した。(Ｗilson,Ｉ.ら、同上 ３７：７６
７（１９８４）)。細胞溶菌液および培養培地は両方と
も、ＨＡに特異的なモノクローナル抗体で沈降した。沈
降したタンパク質を１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で
分析した。

【０１２２】実施例 ４ ヒト組織におけるＴＮＦ−γの発現パターン ＲＮＡブロット分析を行って、ヒト組織におけるＴＮＦ
−γの発現レベルを調べた。全体の細胞ＲＮＡ試料をＲ
ＮＡzol^ＴＭ Ｂ システム(Ｂiotecx Ｌaboratories,Ｉn
c. ６０２３ Ｓouth Ｌoop Ｅast、Ｈouston、ＴＸ ７
７０３３)で単離した。指定された各々のヒト組織から
単離された総ＲＮＡ約２μg(第３Ａ図のＲＮＡブロット
に関して)を１％ アガロース−ホルムアルデヒドゲルで
分離して、ナイロンフィルター上にブロットした(Ｓamb
rook、Ｆritsch、およびＭaniatis、Ｍolecular Ｃloni
ng、Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｐress、（１９８９）)。
Ｓtratagene Ｐrime−Ｉt キットにより、標識化反応を
ＴＮＦ−γ cＤＮＡ５０ngで行っって、^３２Ｐ−標識化
ＴＮＦ−γ cＤＮＡを産生した。標識化ＤＮＡをＳelec
t−Ｇ−５０カラム(５ Ｐrime−３ Ｐrime,Ｉnc. ５６
０３ Ａrapahoe Ｒoad、Ｂoulder、ＣＯ ８０３０３)で
精製した。次いで、０.５Ｍ ＮaＰＯ_４(pＨ ７.４)およ
び７％ ＳＤＳ中、フィルターを、１,０００,０００cpm
／mlの、完全な長さの放射能標識化ＴＮＦ−γ遺伝子
と、６５℃で一晩ハイブリダイズした。０.５×ＳＳ
Ｃ、０.１％ ＳＤＳを用いて、室温で２回および６０℃
で２回洗浄した後、そのフィルターを増感紙に−７０℃
で一晩さらした。ＴＮＦ−γのメッセージＲＮＡは、腎
臓に豊富である(第６図)。示した組織から得られたポリ
Ａ ＲＮＡ１０μgを使用することだけを変えて、同じ反
応を第７図に示す結果に関して行った。ＴＮＦ−γのメ
ッセージＲＮＡは、ＨＵＶＥＣ細胞において主に発現す
る(第７図)。

【０１２３】実施例 ５ 組換えＴＮＦ−γがＷＥＨＩ １６４およびＬ９２９細
胞増殖を阻害し、 ＨＬ−６０細胞における細胞接着を誘
起して、内皮細胞増殖を促進する能力 ＰＢＳ中でのトリプシン処理により、接着性標的細胞を
集密的(confluent)培養から調製し、非接着性標的細胞
を静置培養から収集して、培養液で１回洗浄した。標的
細胞を、１０％ ＦＣＳを含む培養液中に３×１０^５細
胞／mlの割合で懸濁させた。０.１mlのアリコートを、
細胞(ＷＥＨＩ １６４およびＬ９２９)の連続的に希釈
した試験試料０.１mlを含む９６ウェルの平底マイクロ
タイタープレートへと分配した。７０時間インキュベー
ションし続けた。ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βおよびＴＮＦ
−γを０.５μg／mlの濃度で加えた。ＭＴＳおよびメト
硫酸フェナジン(ＰＭＳ)溶液２０μlを各々のウェルに
加えることにより行われるＭＴＳアッセイを利用して、
細胞毒性および増殖活性を定量した。３時間インキュベ
ーションした後、４９２nmでのＯＤをＥＬＩＳＡプレー
ト読み取り装置により測定した。ＯＤ_４９２は、ウェル
中の生存可能な細胞の数に比例する。細胞毒性のパーセ
ントを以下のように計算した： 細胞毒性（％）＝（１００−測定したＯＤ／対照のＯ
Ｄ）×１００。 ７２時間後に写真をとった。第１０〜１３図および第１
８〜２１図で示すように、ＴＮＦ−γは、殺された黒く
丸い細胞として現れるという、形態学的変化を誘起し
た。

【０１２４】第６Ｂ図のグラフでは、アッセイを上記の
ように行ったが、ＴＮＦの量を次第に増加させて加え
た。その結果は、ＴＮＦ−γがＷＥＨＩ １６４細胞の
インヒビターであることを示す。ＴＮＦ−γの接着能力
を試験するために、ＨＬ−６０細胞を使用し、細胞接着
および細胞と細胞の接触を顕微鏡で観察することにより
測定して、２人の別々の研究者により個人的に記録し
た。第２５〜２７図は、細胞接着を誘起するＴＮＦ−γ
の能力を説明する。ＴＮＦ−γが内皮細胞増殖を促進す
る能力を試験するためのアッセイでは、増殖指数(ＰＩ)
を以下のように計算した： ＰＩ＝測定したＯＤ／対照のＯＤ。 第１８〜２１図は、ＴＮＦ−γが内皮細胞増殖のプロモ
ーターであることを説明する。

【０１２５】実施例 ６ ＴＮＦ−γのアポプトシス能力の測定 第一インキュベーション段階では、抗ヒストン抗体をマ
イクロタイタープレートモジュールの壁に吸着固定させ
る。その後、壁の上の非特異的な結合部位をインキュベ
ーション緩衝液(例えば、ブロッキング溶液)で処理する
ことにより飽和する。第二インキュベーション段階の間
に、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βまたはＴＮＦ−γで処理し
たＷＥＨＩ １６４細胞試料中に含まれるヌクレオソー
ムが、それらのヒストン成分によって、固定化された抗
ヒストン抗体に結合する。第三インキュベーション段階
では、抗−ＤＮＡ−ペルオキシダーゼ(ＰＯＤ)をヌクレ
オソームのＤＮＡ部分と反応させる。結合しなかったペ
ルオキシダーゼ複合体を洗浄工程により全て取り除いた
後、ＡＢＴＳ(２,２'−アジノ−ジ−[３−エチルベンズ
チアゾリン スルホネート])を基質として用い、免疫複
合体中に保有されるペルオキシダーゼの量を吸光光度法
により測定する。抗ヒストン抗体は、試料から得られた
ヒストンＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４と反応
する。抗−ＤＮＡ ＰＯＤ抗体を一本鎖および二本鎖Ｄ
ＮＡに結合させる。従って、ＥＬＩＳＡは、モノ−およ
びオリゴヌクレオソームの検出を可能とし、またアポプ
トシス的な(apoptotic)細胞死を測定するのに適用する
ことができる。細胞死のレベルは、吸光度 Ａ４０５nm
／Ａ４９０として示される、細胞質ヒストンが結合した
ＤＮＡフラグメントの量により測定される(Ｂoehringer
mannheim カタログ、０９９０ Ｃ ９３ ２ １５４１１
７０を参照)(第１７図を参照)。

【０１２６】実施例 ７ ＴＮＦ−γを用いての受容体結合アッセイ ６−Ｈisタグを用いて、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−γを
Ｎi−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー精製
し、１μg／ウェルをニッケルキレートで覆われた９６
ウェルのプレート(Ｘenopore Ｃorp.)に加えて、２時間
インキュベートした。３回洗浄した後、ヒト可溶性ＴＮ
Ｆ受容体、sＴＮＦ ＲＩまたはsＴＮＦ ＲII １００ng
を各々のウェルに加えて、２時間インキュベートした。
そのプレートを３回洗浄して、sＴＮＦ ＲＩまたはsＴ
ＮＦ ＲII(２００μl)に対する、アルカリ性ホスファタ
ーゼで標識化したポリクローナル抗体を加えた。基質溶
液２００μlを各々のウェルに加えて、そのプレートを
２時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡ読み取り装置
(試験波長４５０nm、補正波長５９０nm)を用いて、ＯＤ
を測定した。第２８図に示す結果は、ＴＮＦ−γがsＴ
ＮＦ受容体に有意に結合しないことを説明する。先の教
示から見て、本発明の多数の変更および変化が可能であ
ることから、後記する請求の範囲内で、特に記載した以
外の方法で、本発明を行うことができる。

【０１２７】

【配列表】

（１） 一般的情報 ： （i） 特許出願人 ： ユー等 （ii） 発明の名称 ： ヒト腫瘍壊死因子−γ （iii） 配列の数 ： ２ （iv） 連絡先 ： （Ａ） 住所 ： カレラ，バーン，ベーン，ギルフィラ
ン，セッチ，ステュアート・アンド・オルステイン （Ｂ） 通り ： ベッカー・ファーム・ロード６番 （Ｃ） 市 ： ローズランド （Ｄ） 州 ： ニュージャージー （Ｅ） 国 ： アメリカ合衆国 （Ｆ） ＺＩＰ ： ０７０６８ （v） コンピューター解読書式 ： （Ａ） 媒体型 ： ３.５インチ ディスケット （Ｂ） コンピューター ： ＩＢＭ ＰＳ／２ （Ｃ） オペレーティング・システム ： ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ） ソフトウエア ： ワードパーフェクト ５.１ （vi） 本出願のデータ ： （Ａ） 出願番号 ： （Ｂ） 出願日 ： 同日 （Ｃ） 分類 ： （vii） 先行技術データ ： （Ａ） 出願番号 ： （Ｂ） 出願日 ： （viii） 弁理士／代理人情報 ： （Ａ） 氏名 ： フェルラロ，グレゴリー・ディ （Ｂ） 登録番号 ： ３６,１３４ （Ｃ） 参照／整理番号 ： ３２５８００−２５６ （ix） 電話連絡先情報 ： （Ａ） 電話番号 ： ２０１−９９４−１７００ （Ｂ） ファックス番号 ： ２０１−９９４−１７４４ （２） 配列番号１の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ２４４２塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： cＤＮＡ （xi） 配列の記述 ： 配列番号１ ： （２） 配列番号２の情報 ： （i） 配列の特徴 ： （Ａ） 長さ ： １７４アミノ酸 （Ｂ） 型 ： アミノ酸 （Ｃ） 鎖の数 ： （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 配列の種類 ： タンパク質 （xi） 配列の記述 ： 配列番号２ ：

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明のポリペプチドのcＤＮＡおよび対応
する推定アミノ酸配列を説明する。最初の２５個のアミ
ノ酸(下線部)は、推定されるリーダー配列である。アミ
ノ酸に関する標準的な１文字略号を使用する。

【図２】 本発明のポリペプチドのcＤＮＡおよび対応
する推定アミノ酸配列を説明する。

【図３】 ＴＮＦ−γとＴＮＦファミリーの他のメンバ
ーとの間のアミノ酸配列のアラインメント(alignment)
を説明する。ＴＮＦ−γは、陰影をつけた範囲によって
示されるように、ＴＮＦファミリーの保存されたアミノ
酸残基を含む。

【図４】 ＴＮＦ−γとＴＮＦファミリーの他のメンバ
ーとの間のアミノ酸配列のアラインメント(alignment)
を説明する。

【図５】 ＴＮＦ−γとＴＮＦファミリーの他のメンバ
ーとの間のアミノ酸配列のアラインメント(alignment)
を説明する。

【図６】 ＴＮＦ−γが発現されるヒト組織を示す、Ｒ
ＮＡブロット分析である。

【図７】 ＴＮＦ−γが、主として、レーン９であるＨ
ＵＶＥＣ細胞(ヒト臍静脈内皮細胞)において発現される
ことを示す、ＲＮＡブロット分析である。

【図８】 細菌発現および精製により産生されたＴＮＦ
−γを電気泳動した後のゲルの写真である。

【図９】 ＴＮＦ−γのバキュロウイルス発現後のゲル
の写真である。

【図１０】 未処理のＷＥＨＩ １６４細胞(左上)、並
びにＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βおよびＴＮＦ−γにさらし
た後のＷＥＨＩ １６４細胞の写真である。

【図１１】 未処理のＷＥＨＩ １６４細胞(左上)、並
びにＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βおよびＴＮＦ−γにさらし
た後のＷＥＨＩ １６４細胞の写真である。

【図１２】 未処理のＷＥＨＩ １６４細胞(左上)、並
びにＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βおよびＴＮＦ−γにさらし
た後のＷＥＨＩ １６４細胞の写真である

【図１３】 未処理のＷＥＨＩ １６４細胞(左上)、並
びにＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βおよびＴＮＦ−γにさらし
た後のＷＥＨＩ １６４細胞の写真である。

【図１４】 ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βと比較して、
ＴＮＦ−γがＷＥＨＩ １６４細胞増殖を阻害する能力
を説明する。

【図１５】 ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βと比較して、
ＴＮＦ−γがＷＥＨＩ １６４細胞増殖を阻害する能力
を説明する。

【図１６】 ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βと比較して、
ＴＮＦ−γがＷＥＨＩ １６４細胞増殖を阻害する能力
を説明する。

【図１７】 組換えＴＮＦ−γ、ＴＮＦ−αおよびＴＮ
Ｆ−βがＷＥＨＩ１６４細胞死を誘起する能力を説明す
る。

【図１８】 組換えＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βおよびＴＮ
Ｆ−γがＬ９２９細胞において形態学的変化を誘起する
能力を説明する。

【図１９】 組換えＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βおよびＴＮ
Ｆ−γがＬ９２９細胞において形態学的変化を誘起する
能力を説明する。

【図２０】 組換えＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βおよびＴＮ
Ｆ−γがＬ９２９細胞において形態学的変化を誘起する
能力を説明する

【図２１】 組換えＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βおよびＴＮ
Ｆ−γがＬ９２９細胞において形態学的変化を誘起する
能力を説明する

【図２２】 静脈内皮細胞に対する、ＴＮＦ−γ、ＴＮ
Ｆ−αおよびＴＮＦ−βの効果のグラフ説明である。

【図２３】 静脈内皮細胞に対する、ＴＮＦ−γ、ＴＮ
Ｆ−αおよびＴＮＦ−βの効果のグラフ説明である。

【図２４】 静脈内皮細胞に対する、ＴＮＦ−γ、ＴＮ
Ｆ−αおよびＴＮＦ−βの効果のグラフ説明である。

【図２５】 ＨＬ６０細胞がばらばらに広がっているこ
とを示す対照と共に、ＨＬ６０細胞の写真である。

【図２６】 ＨＬ６０細胞がばらばらに広がっているこ
とを示す対照と共に、ＨＬ６０細胞の写真である。

【図２７】 ＨＬ６０細胞がばらばらに広がっているこ
とを示す対照と共に、ＨＬ６０細胞の写真である。

【図２８】 ＴＮＦ−γが、２つの既知の可溶性ＴＮＦ
受容体、すなわちsＴＮＦ ＲＩ(p５５)およびsＴＮＦ
ＲII(p７５)へ有意に結合しないことを説明する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 29/00 Ａ６１Ｐ 31/12 ４Ｃ０８４ 31/04 33/00 ４Ｈ０４５ 31/12 35/00 33/00 37/02 35/00 43/00 １０７ 37/02 Ｃ０７Ｋ 14/525 43/00 １０７ 16/24 Ｃ０７Ｋ 14/525 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/24 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 21/08 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 1/68 Ａ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/53 5/00 Ａ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 グオ−リャン・ユー アメリカ合衆国20878メリーランド州ダー ネスタウン、ストロー・ベイル・レイン 13524番 (72)発明者 チーアン・ニー アメリカ合衆国20853メリーランド州ロッ クビル、マナーフィールド・ロード5502番 (72)発明者 クレイグ・エイ・ローゼン アメリカ合衆国20882メリーランド州レイ トンズビル、ローリング・ヒル・ロード 22400番 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA28 BA41 CA04 DA02 DA06 EA02 EA04 FA02 GA11 HA01 HA14 4B063 QA01 QA19 QQ08 QQ43 QR32 QR55 QR62 QS25 QS34 4B064 AG07 CA02 CA10 CA19 CC24 DA05 DA14 4B065 AA26X AA90X AA99Y AB01 AC14 BA02 BA05 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA01 BA44 DA25 ZA512 ZA542 ZA552 ZA892 ZB112 ZB212 ZB262 ZB332 ZB352 ZB372 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA14 DA76 EA28 EA51 FA74

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 本明細書に記載されたいずれかの発明。