JP2002521048A - 前立腺由来ｅｔｓ因子 - Google Patents

前立腺由来ｅｔｓ因子

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JP2002521048A JP2000562386A JP2000562386A JP2002521048A JP 2002521048 A JP2002521048 A JP 2002521048A JP 2000562386 A JP2000562386 A JP 2000562386A JP 2000562386 A JP2000562386 A JP 2000562386A JP 2002521048 A JP2002521048 A JP 2002521048A
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polypeptide
cells
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polynucleotide
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トウア アロン リバーマン，
ジョルグ ピーター オエトゲン，
チャールズ エイ． クンシュ，
グレゴリー エイ． エンドレス，
クレイグ エイ． ローゼン，
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Beth lsrael Deaconess Medical Center
Human Genome Sciences Inc
Original Assignee
Beth lsrael Deaconess Medical Center
Human Genome Sciences Inc
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、前立腺由来Ｅｔｓ因子と呼ばれる新規なヒトタンパク質、およびこのタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。このヒトタンパク質を産生するためのベクター、宿主細胞、抗体および組換え方法も提供される。本発明はさらに、この新規ヒトタンパク質に関連する障害の診断および処置に有用な診断方法および治療方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、Ｅｔｓファミリーのメンバーであるポリペプチドをコードする新規
なヒト遺伝子に関する。より詳細には、本発明は、前立腺由来Ｅｔｓ因子すなわ
ち「ＰＤＥＦ」と命名される新規なヒトポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドに関する。本発明はまた、ＰＤＥＦポリペプチド、ならびにベクター、宿主
細胞、ＰＤＥＦポリペプチドに対する抗体、およびＰＤＥＦポリペプチドを産生
するための組換え方法に関する。生殖系に関連する障害を検出するための診断方
法、およびこのような障害を処置するための治療方法もまた、提供される。本発
明はさらに、ＰＤＥＦ活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するための
スクリーニング方法に関する。
【０００２】 （発明の背景） 上皮細胞の分化は、成長因子、サイトカイン、細胞間相互作用、および遺伝子
の調節領域に結合することによって、発生段階特異的および系統特異的な遺伝子
発現を調節および協調する異なるセットの転写因子の、組み合わせの作用によっ
て調節される。
【０００３】 上皮細胞特異的遺伝子の調節領域の分析は、転写因子の結合部位として機能す
る反復ＤＮＡモチーフの存在を明らかにする。例えば、多くの上皮細胞特異的遺
伝子は、転写因子（例えば、Ｅｔｓ因子、ＳＰ１、ＴＴＦ−１、ＬＥＦ−１、レ
チノイン酸レセプター、ＡＰ−１、ＡＰ−２、ＬＦＢ３，ＫＤＦ−１、Ｏｃｔ−
６、およびｓｋｎ−１ａ）に結合するモチーフを含む。しかし、これらの転写因
子のうち、上皮細胞において単独で発現されるものはほとんどなく、このことは
、これらの異なる転写因子は、互いに強調し、特定の上皮遺伝子の選択的な段階
特異的および細胞特異的発現を生じるか、未知の上皮特異的転写因子がこれらの
因子と相互作用して、上皮特異的遺伝子の発現を起こすことのいずれかを示唆す
る。
【０００４】 Ｅｔｓ転写因子遺伝子ファミリーは、２０を超えるメンバーを含み、これらの
メンバーは、異常に発現された場合に細胞を形質転換することが示されている。
全てのＥｔｓ因子は、高度に保存されたＤＮＡ結合ドメインであるＥｔｓドメイ
ンを共有し、これは、Ｅｔｓ刺激された遺伝子のプロモーター領域内の配列「Ａ
／ＧＧＡＡ／Ｔ」である、コア結合モチーフを認識する。このモチーフの保存に
も関わらず、わずかな可変性が隣接ヌクレオチドの位置内に存在する。Ｅｔｓ因
子は、Ｅｔｓファミリーの特定のメンバーに対するユニークなさらなる相同性ド
メインに基づくサブクラスにグループ化され得るが、ＤＮＡ結合ドメインの外側
では、Ｅｔｓファミリーメンバー間に相同性はほとんど存在しない。
【０００５】 Ｅｔｓ因子は、転写エンハンサーまたは転写リプレッサーとして作用して、厳
密に調節される遺伝子（例えば、組織発生、分化、血管形成、細胞周期制御、お
よび細胞分化に関与する）の転写制御において重要な役割を果たす。しかし、上
皮細胞におけるＥｔｓ因子の役割については、比較的知られていない。
【０００６】 従って、このような調節の妨害が、癌（特に生殖系の）を含む、過剰増殖性障
害に関与し得るために、上皮細胞特異的遺伝子発現を調節するポリペプチドの必
要性が存在する。さらに、このような障害の検出、予防、および／または矯正に
おいて役割を果たし得る、このようなヒトポリペプチドを同定および特徴付けす
る必要性が存在する。
【０００７】 （発明の要旨） 本発明は、ＰＤＥＦの新規ポリヌクレオチドおよびそのコードされるポリヌク
レオチドに関する。さらに、本発明は、このポリペプチドおよびポリヌクレオチ
ドを生成するための、ベクター、宿主細胞、抗体、および組換え方法に関する。
このポリペプチドに関連する障害を検出するための診断方法、このような障害を
処置するための治療方法もまた、提供される。本発明はさらに、ＰＤＥＦの結合
パートナーを同定するためのスクリーニング方法に関する。
【０００８】 （詳細な説明） （定義） 以下の定義は、本明細書全体を通して使用される特定の用語の理解を容易にす
るために提供される。
【０００９】 本発明において、「単離された」とは、その元の環境（例えば、それが天然に
存在する場合は天然の環境）から取り出された物質をいい、したがって、その天
然の状態から「人間の手によって」変更されている。例えば、単離されたポリヌ
クレオチドは、ベクターまたは物質の組成物の一部であり得るか、あるいは細胞
内に含まれ得、そしてなお「単離され」ている。なぜなら、ベクター、物質の組
成物、または特定の細胞は、ポリヌクレオチドの元の環境ではないからである。
【００１０】 本明細書で使用される場合、ＰＤＥＦ「ポリヌクレオチド」とは、配列番号１
に含まれる核酸配列を有する分子、またはＡＴＣＣに寄託されたクローン内に含
まれるｃＤＮＡをいう。例えば、ＰＤＥＦポリヌクレオチドは、５’および３’
非翻訳配列、コード領域、領域を含む全長ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列、な
らびにこの核酸配列のフラグメント、エピトープ、ドメイン、および改変体を含
み得る。さらに、本明細書で使用される場合、ＰＤＥＦ「ポリペプチド」とは、
広く定義される場合、ポリヌクレオチドから生じた翻訳されたアミノ酸配列を有
する分子をいう。
【００１１】 本発明では、配列番号１として同定された全長ＰＤＥＦ配列は、公知のＥｔｓ
メンバー（ＨＧＳクローンＩＤ：ＨＢＺＳＤ４３ＲＡ（サブトラクトされた前立
腺ライブラリーＢＰＨ、ＬＩＢ２由来））に相同な配列についてのヒトＥＳＴ（
発現配列タグ）ｃＤＮＡデータベースを検索することによって生成された。ヌク
レオチド配列同一性を有するいくつかのＥＳＴは、新規なＥｔｓ様タンパク質を
コードすると予測された。これらのＥＳＴは、ヒト前立腺癌ｃＤＮＡライブラリ
ーから調製されたｃＤＮＡクローンから生じた。配列番号１についての配列の全
てまたはほとんどを含む代表的ｃＤＮＡクローンを、１９９８年７月２７日にア
メリカンタイプカルチャーコレクション（「ＡＴＣＣ」）に寄託し、ＡＴＣＣ寄
託番号２０３０７２を与えられた。ＡＴＣＣは、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１
１０−２２０９， ＵＳＡに位置する。ＡＴＣＣ寄託は、特許手続の目的のため
の微生物の寄託の国際承認に係るブダペスト条約の条項によって行われた。
【００１２】 ＰＤＥＦ「ポリヌクレオチド」はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼー
ション条件下で、配列番号１に含まれる配列、その相補体、または寄託されたク
ローン内に含まれるｃＤＮＡにハイブリダイズし得るポリヌクレオチドを含む。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、５０％ホルムアミド
、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム）、５０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキスト
ラン、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での４２℃で
の一晩インキュベーション、次いで０．１×ＳＳＣ中で約６５℃にてフィルター
を洗浄することをいう。
【００１３】 より低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件でＰＤＥＦポリヌ
クレオチドにハイブリダイズする核酸分子もまた意図される。ハイブリダイゼー
ションのストリンジェンシーおよびシグナル検出の変化は、主として、ホルムア
ミド濃度（より低い百分率のホルムアミドが、低下したストリンジェンシーを生
じる）；塩条件、または温度の操作によって行われる。例えば、より低いストリ
ンジェンシー条件は、６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３Ｍ ＮａＣｌ；０．２
Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4；０．０２Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％ ＳＤＳ、
３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌサケ精子ブロッキングＤＮＡを含む溶液
中、３７℃で一晩のインキュベーション；次いで１×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤ
Ｓを用いた５０℃での洗浄を含む。さらに、さらにより低いストリンジェンシー
を達成するために、ストリンジェントなハイブリダイゼーション後に行われる洗
浄は、より高い塩濃度（例えば、５×ＳＳＣ）で行われ得る。
【００１４】 上記の条件における変化が、ハイブリダイゼーション実験においてバックグラ
ウンドを抑制するために使用される代替的なブロッキング試薬の包含および／ま
たは置換によって達成され得ることに留意すること。代表的なブロッキング試薬
としては、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、お
よび市販の製品処方物が挙げられる。特異的ブロッキング試薬の包含は、適合性
の問題に起因して、上記のハイブリダイゼーション条件の改変を必要とし得る。
【００１５】 もちろん、ポリＡ＋配列（例えば、配列表に示されるｃＤＮＡの任意の３’末
端ポリＡ＋領域（ｔｒａｃｔ））に、またはＴ（もしくはＵ）残基の相補的スト
レッチにのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、このようなポリヌクレオ
チドが、ポリ（Ａ）ストレッチまたはその相補体（例えば、事実上任意の二本鎖
ｃＤＮＡクローン）を含む任意の核酸分子にハイブリダイズするので、「ポリヌ
クレオチド」の定義に包含されない。
【００１６】 ＰＤＥＦポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキ
シリボヌクレオチドから構成され得、これは、非改変ＲＮＡもしくは非改変ＤＮ
Ａまたは改変ＲＮＡもしくは改変ＤＮＡであり得る。例えば、ＰＤＥＦポリヌク
レオチドは、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であ
るＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合
物であるＲＮＡ、一本鎖、またはより代表的には二本鎖もしくは一本鎖および二
本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子から構
成され得る。さらに、ＰＤＥＦポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまた
はＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域から構成され得る。ＰＤＥＦポリ
ヌクレオチドはまた、安定性のために、または他の理由のために改変された１つ
以上の改変された塩基またはＤＮＡもしくはＲＮＡ骨格を含み得る。「改変され
た」塩基としては、例えば、トリチル化された塩基およびイノシンのような普通
でない塩基が挙げられる。種々の改変が、ＤＮＡおよびＲＮＡに対して行われ得
；したがって、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、または代謝的に改変
された形態を含む。
【００１７】 ＰＤＥＦポリペプチドは、ペプチド結合または改変されたペプチド結合、すな
わち、ペプチドアイソスター（ｉｓｏｓｔｅｒｅ）によって互いに連結したアミ
ノ酸から構成され得、そして遺伝子がコードする２０個のアミノ酸以外のアミノ
酸を含み得る。ＰＤＥＦポリペプチドは、翻訳後プロセシングのような天然のプ
ロセスによって、または当該技術分野で周知の化学的改変技術によってのいずれ
かで、改変され得る。このような改変は、基本テキスト、およびより詳細な研究
論文、ならびに多くの研究文献に十分記載される。改変は、ペプチド骨格、アミ
ノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含むＰＤＥＦポリペプチ
ドのどこでも生じ得る。同じ型の改変が、所定のＰＤＥＦポリペプチド中のいく
つかの部位で同じまたは種々の程度で存在し得ることが理解される。また、所定
のＰＤＥＦポリペプチドは多くの型の改変を含み得る。ＰＤＥＦポリペプチドは
、例えば、ユビキチン化の結果として分枝状であり得、そしてポリペプチドは、
分枝を含むかまたは含まない、環状であり得る。環状、分枝状および分枝した環
状ＰＤＥＦポリペプチドは、天然の翻訳後プロセスから生じ得るか、または合成
方法によって作製され得る。改変としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リ
ボシル化、アミデート化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオ
チドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、
ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、
脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成
、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸
化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏ
ｎ）、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノ
イル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸のトランスファ
ーＲＮＡ媒介付加、およびユビキチン化が挙げられる。（例えば、ＰＲＯＴＥＩ
ＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥ
Ｓ， 第２版， Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ
ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９３）；ＰＯＳＴＴＲ
ＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ
ＰＲＯＴＥＩＮＳ， Ｂ．Ｃ． Ｊｏｈｎｓｏｎ編， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １−１２頁 （１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ
ら， Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １８２：６２６−６４６ （１９９０）；Ｒ
ａｔｔａｎら， Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ６６３：４８−６２ （１
９９２）を参照のこと）。
【００１８】 「配列番号１」とは、ＰＤＥＦポリヌクレオチド配列をいうが、「配列番号２
」とは、ＰＤＥＦポリペプチド配列をいう。
【００１９】 「生物学的活性を有する」ＰＤＥＦポリペプチドとは、特定の生物学的アッセ
イで測定した場合、用量依存性を伴うかまたは伴わずに、ＰＤＥＦポリペプチド
の活性と類似であるが、必ずしも同一ではない活性を示すポリペプチドをいう。
用量依存性が存在する場合、ＰＤＥＦポリペプチドの用量依存性と同一である必
要はないが、むしろＰＤＥＦポリペプチドと比較した場合に、所定の活性におけ
る用量依存性に実質的に類似する（すなわち、候補ポリペプチドは、ＰＤＥＦポ
リペプチドと比較して、より大きな活性を示すか、または約１／２５以上、そし
て好ましくは約１／１０以上の活性、そして最も好ましくは約１／３以上の活性
を示す）。
【００２０】 （ＰＤＥＦポリヌクレオチドおよびＰＤＥＦポリペプチド） 全長ＰＤＥＦは、ヒト前立腺ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）から単離された。
このクローンは、配列番号２として同定される全体のコード領域を含む。寄託さ
れたクローンは、全１８９４ヌクレオチドを有するｃＤＮＡを含み、これは、３
３５アミノ酸残基の推定オープンリーディングフレームをコードする（図１を参
照のこと）。このオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド４１６位に位
置するＮ末端メチオニンで始まり、そしてヌクレオチド１４２０位のすぐ後の終
止コドンで終結する。ＰＤＥＦタンパク質の推定分子量は、３７．５ｋＤａであ
るはずである。
【００２１】 引き続くノーザン分析もまた、前立腺上皮、およびより少ない程度で、唾液腺
、気管、卵巣および乳房組織において、生殖系特異的発現と一致するパターンで
の、ＰＤＥＦ発現を示した。発現は、前立腺上皮細胞においける富化された発現
と一致するアンドロゲン感受性に関与する組織において最大である。約２．０ｋ
ｂの単一の主な転写物が観察される。この主要な２．０ｋｂ転写物の発現は、前
立腺上皮において最大であり、そして卵巣、気管および胃組織においてより少な
い程度である（実施例３を参照のこと）。
【００２２】 ＢＬＡＳＴ分析を使用して、配列番号２は、Ｅｔｓファミリーのメンバーに相
同であることが見出された。特に、配列番号２は、ＥＴＳ−４（図２）（配列番
号３）（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号ｇｉ｜１５７１９６）に対するＤｒｏｓｏｐ
ｈｉｌａ ｍｅｌａｎｇａｓｔｏｒ ｍＲＮＡの転写産物に相同なドメインを含
む。これらのドメインとしては、以下の保存されたドメインを含む：（ａ）配列
番号２のおよそアミノ酸１４２〜２１１に位置する推定指示ドメイン；および（
ｂ）配列番号２のおよそアミノ酸２４８〜３３１に位置する推定Ｅｔｓドメイン
。ＰＤＥＦのこれらのポリペプチドフラグメントを含むポリヌクレオチドは、特
に本発明に意図される。ＥＴＳ−４は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｇａ
ｓｔｏｒの生殖系列の発生において、転写因子として重要であると考えられるた
め、ＥＴＳ−４とＰＤＥＦとの間の相同性は、ＰＤＥＦがまた、上皮特異的遺伝
子発現を調節し得ることを示唆する。この指示ドメインは、Ｅｔｓファミリーの
いくつかのメンバーで見出されている。
【００２３】 さらに、このドメインの機能は明らかではないが、ＨＬＨドメインに対するそ
の弱い相同性は、このドメインが二量体化において役割を果たし得ることを示唆
する。他の報告は、遺伝子のトランス活性化におけるこの特定のドメインの掛か
り合いを示した。
【００２４】 最近、Ｅｔｓ関連タンパク質であるＥｔｓ因子ｔｅｌが、実際にこの特定のド
メインを介して二量体化し得ることを示されている（Ｇｏｌｕｂ，Ｔ．Ｒ．、Ｂ
ａｒｋｅｒ，Ｇ．Ｆ．、Ｌｏｖｅｔｔ，Ｍ．およびＧｉｌｌｉａｎｄ，Ｄ．Ｇ．
、Ｃｅｌｌ ７７：３０７〜３１６（１９９４）。このｔｅｌ特定のドメインが
種々の白血球の異なるタイプにおける種々の染色体転座に関係していることは、
形質転換におけるこの特定のドメインの役割を示唆する。従って、ＰＤＥＦにお
いて同定されるこの特定のドメインは、二量体化および遺伝子のトランス活性化
において役割を果たしそうである。
【００２５】 配列番号１として同定されるＰＤＥＦヌクレオチド配列は、寄託されたクロー
ンから得られる部分的に相同な（「重複する」）配列から、そしてさらなる関連
するＤＮＡクローンから得られた部分的に相同な（「重複する」）配列から、ア
センブルされた。重複する配列はアセンブルされて、高く縮重している単一の連
続する配列（通常各ヌクレオチド位置で３〜５重複する配列）となり、配列番号
１として同定される最終的配列を生じる。
【００２６】 従って、配列番号１および翻訳された配列番号２は十分に正確であり、そして
他に、当該分野で周知であり、そして以下にさらに記載される種々の用途に適切
である。例えば、配列番号１は、配列番号１または寄託されたクローンに含まれ
るｃＤＮＡに含まれる核酸配列を検出する核酸ハイブリダイゼーションプローブ
を設計するのに有用である。これらのプローブはまた、生物学的サンプル中の核
酸分子にもハイブリダイズし、それにより本発明の種々の法医学的方法および診
断方法を可能にする。同様に、配列番号２から同定されるポリペプチドは、ＰＤ
ＥＦに特異的に結合する抗体を生成するために使用され得る。
【００２７】 それにも関わらず、配列決定反応により生成されるＤＮＡ配列は、配列決定エ
ラーを含み得る。このエラーは、誤同定されたヌクレオチドまたは生成されたＤ
ＮＡ配列中のヌクレオチドの挿入もしくは欠失として存在する。誤って挿入また
は欠失されたヌクレオチドは、推定アミノ酸配列の読み取り枠においてフレーム
シフトを生じる。これらの場合において、生成されるＤＮＡ配列は実際のＤＮＡ
配列に対して９９．９％を超えて同一であり得る（例えば、１０００塩基を超え
るオープンリーディングフレームにおいて１つの挿入または欠失）としても、こ
の推定アミノ酸配列は、実際のアミノ酸配列と異なる。
【００２８】 従って、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列において正確さを必要とする適
用のために、本発明は、配列番号１として同定される生成されるヌクレオチド配
列および配列番号２として同定される推定された翻訳されるアミノ酸配列だけで
なく、ＡＴＣＣに寄託されたＰＤＥＦのヒトｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡの
サンプルもまた提供する。寄託されたＰＤＥＦクローンのヌクレオチド配列は、
公知の方法に従って寄託されたクローンを配列決定することにより、容易に決定
され得る。次いで、推定されたＰＤＥＦアミノ酸配列は、このような寄託物から
確認され得る。さらに、この寄託されたクローンによりコードされるタンパク質
のアミノ酸配列もまた、ペプチド配列決定か、または寄託されたヒトＰＤＥＦ
ｃＤＮＡを含む適切な宿主細胞においてそのタンパク質を発現させ、そのタンパ
ク質を収集し、そしてその配列を決定することにより、直接決定され得る。
【００２９】 本発明はまた、配列番号１、配列番号２、または寄託されたクローンに対応す
るＰＤＥＦ遺伝子に関する。ＰＤＥＦ遺伝子は、公知の方法に従って、本明細書
中に開示される配列情報を使用して単離され得る。このような方法は、開示され
た配列からプローブまたはプライマーを調製する工程、およびゲノム材料の適切
な供給源からＰＤＥＦ遺伝子を同定または増幅する工程を包含する。
【００３０】 また、本発明において、ＰＤＥＦの種ホモログも提供される。種ホモログは、
本明細書中に提供される配列から適切なプローブまたはプライマーを作製するこ
と、ならびに所望のホモログについて適切な核酸供給源をスクリーニングするこ
とによって、単離および同定され得る。
【００３１】 ＰＤＥＦポリペプチドは、任意の適切な様式で調製され得る。このようなポリ
ペプチドは、単離された天然に存在するポリペプチド、組換え生成されたポリペ
プチド、合成生成されたポリペプチド、またはこれらの方法の組合せにより生成
されたポリペプチドを含む。このようなポリペプチドを調製するための手段は、
当該分野で十分理解されている。
【００３２】 ＰＤＥＦポリペプチドは、好ましくは、単離された形態で提供され、そして好
ましくは実質的に精製される。組換え生成されたバージョンのＰＤＥＦポリペプ
チド（分泌されたポリペプチドを含む）は、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、
Ｇｅｎｅ６７：３１〜４０（１９９８）に記載される１工程方法によって、実質
的に精製され得る。ＰＤＥＦポリペプチドまた、天然の供給源または組換え供給
源から、当該分野で周知の方法においてＰＤＥＦタンパク質に対して惹起された
本発明の抗体を使用して精製され得る。
【００３３】 （ポリヌクレオチド改変体およびポリぺプチド改変体） 「改変体」とは、ＰＤＥＦポリヌクレオチドまたはＰＤＥＦポリぺプチドとは
異なるが、それらの本質的な特性を保持するポリヌクレオチドまたはポリぺプチ
ドをいう。一般に、改変体は、全体的に密接に類似し、そして、多くの領域にお
いて、ＰＤＥＦポリヌクレオチドまたはＰＤＥＦポリぺプチドに同一である。
【００３４】 本発明の参照ヌクレオチド配列に、少なくとも、例えば、９５％「同一」であ
るヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、このポリヌクレオチド
のヌクレオチド配列が、このポリヌクレオチド配列がＰＤＥＦポリぺプチドをコ
ードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つまでの点変異
を含み得ることを除いて、参照配列に対して同一であることを意図する。換言す
れば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列
を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列のヌクレオチドの５％までが
欠失され得るかまたは別のヌクレオチドで置換され得るか、あるいは参照配列中
の総ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドが参照配列中に挿入され得る。
照会（ｑｕｅｒｙ）配列は、配列番号１に示される配列全体、ＯＲＦ（オープン
リーディングフレーム）、または本明細書中で記載されるように特定される任意
のフラグメントであり得る。
【００３５】 実際問題として、任意の特定の核酸分子またはポリぺプチドが、本発明のヌク
レオチド配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、ま
たは９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラムを使用して従
来のように決定され得る。照会配列（本発明の配列）と対象配列との間の最も良
好な全体的な適合性（全体的な配列整列とも呼ばれる）を決定するための好まし
い方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．（１９９０）
６：２３７−２４５）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープロ
グラムを使用して決定され得る。配列整列において、照会配列および対象配列は
、両方ともにＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵをＴに変換することによって
比較され得る。この全体的な配列整列の結果は、同一性パーセントで示される。
同一性パーセントを算定するためにＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用
される好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌ
ｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌ
ｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃ
ｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ
Ｐｅｎａｌｔｙ ０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象ヌク
レオチド配列の長さ（どちらかより短い方）である。
【００３６】 対象配列が、５’欠失または３’欠失のために（内部欠失のためではなく）照
会配列より短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならない。これ
は、同一性パーセントを計算する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象配列の
５’短縮および３’短縮を考慮しないからである。５’末端または３’末端で短
縮された対象配列について、照会配列に対して、同一性パーセントは、一致／整
列されない対象配列の５’および３’である照会配列の塩基の数を照会配列の総
塩基のパーセントとして計算することによって補正される。ヌクレオチドが一致
／整列されるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次い
で、このパーセントは、特定のパラメーターを用いて上記のＦＡＳＴＤＢプログ
ラムによって算定された同一性パーセントから差し引かれ、最終的な同一性パー
セントのスコアに到達する。この補正されたスコアが、本発明の目的に使用され
るものである。ＦＡＳＴＤＢ整列によって示される場合、照会配列と一致／整列
されていない、対象配列の５’塩基および３’塩基の外側の塩基のみが、同一性
パーセントのスコアを手動で調整する目的で算定される。
【００３７】 例えば、９０塩基の対象配列が、同一性パーセントを決定するために１００塩
基の照会配列に対して整列される。欠失は、対象配列の５’末端で生じ、従って
、ＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０塩基の一致／整列を示さない。こ
の１０個の不対塩基は、この配列の１０％（（一致しない５’末端および３’末
端の塩基数）／（照会配列中の全塩基数））を提示し、その結果１０％が、ＦＡ
ＳＴＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントスコアから減算される
。残りの９０塩基が、完全に一致した場合、最終的な同一性パーセントは、９０
％である。別の例において、９０塩基の対象配列が、１００塩基の照会配列と比
較される。この時、欠失は内部欠失であり、その結果照会配列と一致／整列され
ない対象配列の５’および３’上の塩基は存在しない。この場合において、ＦＡ
ＳＴＤＢによって計算される同一性パーセントは、手動補正されない。再度、照
会配列と一致／整列されない対象配列の５’および３’の塩基のみが、手動補正
される。他の手動補正は、本発明の目的のためになされない。
【００３８】 本発明の照会アミノ酸配列に、少なくとも、例えば、９５％「同一」であるア
ミノ酸配列を有するポリぺプチドにより、対象ポリペプチドのアミノ酸配列は、
対象ポリペプチドのアミノ酸配列が、照会アミノ酸配列の各１００個のアミノ酸
あたり５つまでのアミノ酸の変更を含み得ることを除いて、照会配列に同一であ
ることが意図される。換言すれば、照会アミノ酸配列に少なくとも９５％同一で
あるアミノ酸配列を有するポリぺプチドを得るために、対象配列におけるアミノ
酸残基の５％までが、挿入、欠失（ｉｎｄｅｌ）され得るかまたは別のアミノ酸
で置換され得る。参照配列のこれらの変更は、参照アミノ酸配列のアミノ末端も
しくはカルボキシ末端部位で生じ得るか、またはそれらの末端部位の間のどこに
でも生じ得、参照配列中の残基間で個々にか、または参照配列内の１つ以上の連
続する群でのいずれかで、散在する。
【００３９】 実際問題として、任意の特定のポリぺプチドが、例えば、配列番号２に示され
るアミノ酸配列に対して、または寄託されたＤＮＡクローンによってコードされ
るアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％
、または９９％同一であるか否かは、従来のように、公知のコンピュータープロ
グラムを使用して決定され得る。照会配列（本発明の配列）と対象配列との間で
の最良の全体的な一致（全体的配列整列とも呼ばれる）を決定するための好まし
い方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．（１９９０）
６：２３７−２４５）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープロ
グラムを使用して決定され得る。配列整列において、照会配列および対象配列は
、両方ともヌクレオチド配列であるかまたは両方ともアミノ酸配列であるかのい
ずれかである。上記の全体的配列整列の結果は、同一性パーセントで示される。
ＦＡＳＴＤＢアミノ酸整列に用いられる好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ
＝ＰＡＭ ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、
Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏ
ｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉ
ｚｅ＝配列の長さ、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａ
ｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象アミノ酸配列の
長さ（どちらかより短い方）である。
【００４０】 対象配列が、Ｎ末端欠失またはＣ末端欠失により（内部の欠失のためではなく
）照会配列よりも短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならない
。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体的な同一性パーセントを算定する場
合に、対象配列のＮ末端短縮およびＣ末端短縮を考慮しないからである。Ｎ末端
およびＣ末端で短縮された対象配列について、照会配列に対して、同一性パーセ
ントが、対応する対象残基と一致／整列しない対象配列のＮ末端およびＣ末端で
ある照会配列の残基の数を照会配列の総塩基のパーセントとして計算することに
よって補正される。残基が一致／整列されているか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整
列の結果によって決定される。次いで、このパーセントが、上記のＦＡＳＴＤＢ
プログラムによって特定のパラメーターを使用して計算された同一性パーセント
から差し引かれ、最終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この最終的な
同一性パーセントのスコアが、本発明の目的で使用されるものである。照会配列
と一致／整列していない対象配列のＮ末端およびＣ末端側の残基のみが、同一性
パーセントのスコアを手動で調整する目的で考慮される。すなわち、対象配列の
最も遠いＮ末端残基およびＣ末端残基の外側の照会残基位置のみである。
【００４１】 例えば、９０アミノ酸残基の対象配列が、同一性パーセントを決定するために
１００残基の照会配列と整列される。欠失が対象配列のＮ末端で生じ、そしてそ
れゆえＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端の最初の１０残基の一致／整列を示さない。
１０個の不対合残基は、配列の１０％（（一致していないＮ末端およびＣ末端の
残基の数）／（照会配列中の残基の総数））を表し、その結果ＦＡＳＴＤＢプロ
グラムによって計算される同一性パーセントのスコアから１０％が差し引かれる
。残りの９０残基が完全に一致した場合、最終的な同一性パーセントは９０％で
ある。別の例において、９０残基の対象配列が、１００残基の照会配列と比較さ
れる。この時、欠失は、内部欠失であり、そのため照会配列と一致／整列しない
対象配列のＮ末端またはＣ末端の残基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢに
よって算定される同一性パーセントは、手動で補正されない。再び、ＦＡＳＴＤ
Ｂ整列において示される場合、照会配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端お
よびＣ末端の外側の残基位置のみが手動で補正される。他の手動の補正は、本発
明の目的のためにはなされない。
【００４２】 ＰＤＥＦ改変体は、コード領域、非コード領域、またはその両方における変更
を含み得る。特に好ましいものは、サイレントな置換、付加、または欠失を生成
するが、コードされるポリぺプチドの特性または活性を変更しない変更を含むポ
リヌクレオチド改変体である。遺伝コードの縮重に起因するサイレントな置換に
よって生成されるヌクレオチド改変体が、好ましい。さらに、任意の組合せにお
いて５〜１０、１〜５、もしくは１〜２アミノ酸が置換、欠失、または付加され
る改変体もまた、好ましい。ＰＤＥＦポリヌクレオチド改変体は、多様な理由（
例えば、特定の宿主についてのコドン発現を至適化する（ヒトｍＲＮＡにおける
コドンを、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌宿主によって好ましいコドンに変化する）
）ために、生成され得る。
【００４３】 天然に存在するＰＤＥＦ改変体は、「対立遺伝子改変体」と呼ばれ、そして生
物の染色体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代替の形態のうち
の１つをいう。（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらの対立遺伝子改変体
は、ポリヌクレオチドレベルおよび／またはポリぺプチドレベルのいずれかで変
化し得る。あるいは、天然に存在しない改変体は、変異誘発技術によってかまた
は直接的な合成によって生成され得る。
【００４４】 タンパク質工学および組換えＤＮＡ技術の公知の方法を使用して、改変体は、
ＰＤＥＦポリぺプチドの特徴を改善または変化するために作製され得る。例えば
、１つ以上のアミノ酸は、生物学的機能の実質的な欠損を伴わずに、タンパク質
のＮ末端またはＣ末端から欠失され得る。Ｒｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６８：２９８４−２９８８（１９９３）の著者らは、３個、８個、または２７
個のアミノ末端のアミノ酸残基を欠失した後であってさえもヘパリン結合活性を
有する改変体ＫＧＦタンパク質を報告した。同様に、インターフェロンγは、こ
のタンパク質のカルボキシ末端から８〜１０個のアミノ酸残基を欠失した後、１
０倍までのより高い活性を示している（Ｄｏｂｅｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ ７：１９９−２１６（１９８８））。
【００４５】 さらに、豊富な証拠は、改変体が、天然に存在するタンパク質の生物学的活性
に類似する活性をしばしば保持することを実証する。例えば、Ｇａｙｌｅおよび
共同研究者ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８：２２１０５−２２１１１（
１９９３））は、ヒトサイトカインＩＬ−１ａの広範囲にわたる変異分析を行っ
た。彼らは、ランダムな変異誘発を使用して、分子の全長にわたって改変体当た
り平均２．５アミノ酸の変化になる、３，５００個を超える個々のＩＬ−１ａ変
異体を作製した。複数の変異が、全ての可能なアミノ酸の位置で試験された。こ
の研究者らは、「分子の大部分は、結合活性または生物学的活性のいずれかに対
してほとんど影響を伴わないで変更され得る」ことを見出した。（要約を参照の
こと）。実際、試験された３，５００個を超えるヌクレオチド配列のうち、わず
か２３個の独特なアミノ酸配列が、野生型と活性が有意に異なるタンパク質を生
成した。
【００４６】 さらに、ポリぺプチドのＮ末端またはＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失
が、１つ以上の生物学的機能の改変または欠失を生じたとしても、他の生物学的
活性はなお保持され得る。例えば、そのタンパク質を認識する抗体を誘導および
／または結合する欠失改変体の能力は、そのタンパク質の残基の過半数未満が、
Ｎ末端またはＣ末端から除去される場合に保持されるようである。タンパク質の
Ｎ末端またはＣ末端残基を欠損する特定のポリぺプチドが、このような免疫原性
活性を保持するか否かは、本明細書中に記載され、そしてそうでなければ当該分
野において公知の慣用の方法によって容易に決定され得る。
【００４７】 従って、本発明はさらに、実質的な生物学的活性を示すＰＤＥＦポリぺプチド
改変体を含む。このような改変体としては、活性に対する効果をほとんど有さな
いように、当該分野において公知の一般的な法則に従って選択される、欠失、挿
入、逆位、反復、および置換が挙げられる。例えば、表現型的にサイレントなア
ミノ酸置換を作製する方法に関する指針は、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）において提供され、ここで、
その著者らは、変化に対するアミノ酸配列の許容性を研究するための２つの主要
なストラテジーがあることを指摘する。
【００４８】 第１のストラテジーは、進化の過程の間の天然の選別によるアミノ酸置換の許
容性を利用する。異なる種におけるアミノ酸配列を比較することによって、保存
されるアミノ酸が同定され得る。これらの保存されるアミノ酸は、タンパク質の
機能について重要であるようである。対照的に、置換が天然の選別によって許容
されたアミノ酸の位置は、これらの位置がタンパク質の機能に重要ではないこと
を示す。従って、アミノ酸置換を寛容する位置は改変され得るが、タンパク質の
生物学的活性をなおも維持する。
【００４９】 第２のストラテジーは、タンパク質機能に重要な領域を同定するために、クロ
ーン化された遺伝子の特定の位置でアミノ酸変化を導入するように遺伝子工学を
使用する。例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発（
分子中の各残基で１つずつのアラニン変異の導入）が、使用され得る。（Ｃｕｎ
ｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８
５（１９８９））。次いで、得られた変異体分子は生物学的活性について試験さ
れ得る。
【００５０】 その著者らが言及するように、これらの２つのストラテジーは、タンパク質が
アミノ酸置換に驚くほど許容性であることを明らかにした。この著者らはさらに
、どのアミノ酸変化が、タンパク質中の特定のアミノ酸位置で許容されるようで
あるかを示す。例えば、最も埋もれている（タンパク質の三次構造内の）アミノ
酸残基は、非極性側鎖を必要とするが、表面側鎖の特徴は、一般にほとんど保存
されない。さらに、許容される保存的なアミノ酸置換は、脂肪族または疎水性ア
ミノ酸のＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの置換；ヒドロキシル残基のＳ
ｅｒおよびＴｈｒの置換；酸性残基のＡｓｐおよびＧｌｕの置換；アミド残基の
ＡｓｎおよびＧｌｎの置換、塩基性残基のＬｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓの置換
；芳香族残基のＰｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐの置換、ならびに小さなサイズの
アミノ酸のＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、およびＧｌｙの置換を含む。
【００５１】 保存的なアミノ酸置換以外に、ＰＤＥＦ改変体は、（ｉ）１つ以上の非保存的
なアミノ酸残基での置換（ここでは置換されるアミノ酸残基は、遺伝コードによ
ってコードされるアミノ酸残基であってもよく、もしくはそうでなくてもよい）
、または（ｉｉ）置換基を有する１つ以上のアミノ酸残基での置換、または（ｉ
ｉｉ）別の化合物（例えば、そのポリぺプチドの安定性および／もしくは可溶性
を増加するための化合物（例えば、ポリエチレングリコール））との成熟ポリぺ
プチドの融合、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ融合領
域ペプチド、またはリーダー配列もしくは分泌配列、または精製を容易にする配
列）とのそのポリぺプチドへの融合を含む。このような改変体ポリぺプチドは、
本明細書中の教示から、当業者の範囲内であるとが考えられる。
【００５２】 例えば、他の荷電されたアミノ酸または中性のアミノ酸を用いての荷電された
アミノ酸のアミノ酸置換を含むＰＤＥＦポリぺプチド改変体は、改善された特徴
（例えば、より少ない凝集性）を有するタンパク質を生成し得る。薬学的処方物
の凝集は、凝集体の免疫原性活性に起因して、活性を減少し、かつクリアランス
を増加する。（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：
３３１−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６：８
３８−８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ
ｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０：３０７−３
７７（１９９３））。
【００５３】 （ポリヌクレオチドフラグメントおよびポリぺプチドフラグメント） 本発明において、「ポリヌクレオチドフラグメント」とは、寄託されたクロー
ンに含まれるかまたは配列番号１において示される、核酸配列を有する短いポリ
ヌクレオチドをいう。この短いヌクレオチドフラグメントは、好ましくは、少な
くとも約１５ヌクレオチド、およびより好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチ
ド、なおより好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチド、およびさらにより好ま
しくは少なくとも約４０ヌクレオチドの長さである。「少なくとも２０ヌクレオ
チドの長さ」のフラグメントは、例えば、寄託されたクローンに含まれるｃＤＮ
Ａ配列または配列番号１において示されるヌクレオチド配列からの、２０個以上
連続した塩基を含むことが意図される。これらのヌクレオチドフラグメントは、
本明細書中で考察されるように、診断プローブおよびプライマーとして有用であ
る。もちろん、より大きなフラグメント（例えば、５０、１５０、５００、６０
０、２０００ヌクレオチド）は好ましい。
【００５４】 さらに、ＰＤＥＦポリヌクレオチドフラグメントの代表的な例は、例えば、配
列番号１または寄託されたクローンにおいて含まれるｃＤＮＡの、ヌクレオチド
番号の約１〜５０、５１〜１００、１０１〜１５０、１５１〜２００、２０１〜
２５０、２５１〜３００、３０１〜３５０、３５１〜４００、４０１〜４５０、
４５１〜５００、５０１〜５５０、５５１〜６００、６５１〜７００、７０１〜
７５０、７５１〜８００、８００〜８５０、８５１〜９００、９０１〜９５０、
９５１〜１０００、１００１〜１０５０、１０５１〜１１００、１１０１〜１１
５０、１１５１〜１２００、１２０１〜１２５０、１２５１〜１３００、１３０
１〜１３５０、１３５１〜１４００、１４０１〜１４５０、１４５１〜１５００
、１５０１〜１５５０、１５５１〜１６００、１６０１〜１６５０、１６５１〜
１７００、１７０１〜１７５０、１７５１〜１８００、１８０１〜１８５０また
は１８５１〜１８９４からの配列を有するフラグメントを含む。この状況におい
て、「約」は、具体的に列挙される範囲、いずれかの末端もしくは両方の末端で
、いくつか（５、４、３、２、もしくは１個）のヌクレオチドだけより大きなま
たはより小さな範囲を含む。好ましくは、これらのフラグメントは、生物学的活
性を有するポリぺプチドをコードする。より好ましくは、これらのポリヌクレオ
チドは、本明細書において考察されるようにプローブまたはプライマーとして使
用され得る。
【００５５】 本発明において、「ポリぺプチドフラグメント」とは、配列番号２に含まれる
かまたは寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡによってコードされる、短いア
ミノ酸配列をいう。タンパク質フラグメントは、「自立構造（ｆｒｅｅ−ｓｔａ
ｎｄｉｎｇ）」であり得るか、またはそのフラグメントが部分または領域を形成
するより大きなポリぺプチド内に、最も好ましくは単一の連続領域として、含ま
れ得る。本発明のポリぺプチドフラグメントの代表的な例は、例えば、コード領
域のアミノ酸番号の約１〜２０、２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜
１００、１０２〜１２０、１２１〜１４０、１４１〜１６０、１６１〜１８０、
１８１〜２００、２０１〜２２０、２２１〜２４０、２４１〜２６０、２６１〜
２８０、２８１〜３００、３０１〜３２０、または３２１〜３３６から最後のフ
ラグメントを含む。さらに、ポリぺプチドフラグメントは、約２０、３０、４０
、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、
または１５０アミノ酸の長さであり得る。この状況において、「約」は、具体的
に列挙される範囲、いずれかの末端または両方の末端で、いくつかの（５、４、
３、２、または１個）アミノ酸だけより大きなまたはより小さな範囲を含む。
【００５６】 好ましいポリぺプチドフラグメントは、アミノ末端もしくはカルボキシ末端、
またはその両方から、連続した一連の欠失された残基を有する、ＰＤＥＦタンパ
ク質を含む。例えば、１〜６０個の範囲の任意の数のアミノ酸が、ＰＤＥＦポリ
ペプチドのアミノ末端から欠失され得る。同様に、１〜３０個の範囲の任意数の
アミノ酸が、ＰＤＥＦタンパク質のカルボキシ末端から欠失され得る。さらに、
上述のアミノ末端およびカルボキシ末端の欠失の任意の組み合わせが好ましい。
同様に、これらのＰＤＥＦポリぺプチドフラグメントをコードするポリヌクレオ
チドフラグメントもまた、好ましい。
【００５７】 特に、ＰＤＥＦポリペプチドのＮ末端欠失は、一般式ｍ−３３５によって記載
され得る。ここで、ｍは２〜３２１の整数であり、ｍは配列番号２において同定
されるアミノ酸残基の位置に対応する。好ましくは、配列番号２として示される
本発明のＰＤＥＦポリペプチドのＮ末端欠失は、配列番号２の以下の残基のアミ
ノ酸配列を含むポリペプチドを含む：
【００５８】
【化１】
【００５９】 さらに、ＰＤＥＦポリペプチドのＣ末端欠失もまた、一般式１−ｎによって記
載され得る。ここで、ｎは１５〜３３５の整数であり、ｎは配列番号２において
同定されるアミノ酸残基の位置に対応する。好ましくは、配列番号２として示さ
れる本発明のＰＤＥＦポリペプチドのＣ末端欠失は、配列番号２の以下の残基の
アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む：
【００６０】
【化２】 。
【００６１】 本発明はまた、アミノ末端およびカルボキシ末端の両方から欠失された１つ以
上のアミノ酸を有するポリペプチドを提供する。これは、一般的に配列番号２の
ｍ〜ｎ残基（ここでｎおよびｍは上記で記載された整数である）を有することが
記載され得る。例えば、上記に列挙された任意のＮ末端欠失またはＣ末端欠失は
、Ｎ末端またはＣ末端欠失されたＰＤＥＦポリペプチドを産生するために組み合
わせられ得る。
【００６２】 また、構造的なまたは機能的なドメインにより特徴付けられるＰＤＥＦのポリ
ペプチドおよびポリヌクレオチドフラグメントが好ましい。本発明の好ましい実
施態様は、αヘリックス領域およびαヘリックス形成領域（「α領域」）、βシ
ート領域およびβシート形成領域（「β領域」）、ターン領域およびターン形成
領域（「ターン領域」）、コイル領域およびコイル形成領域（「コイル領域」）
、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可撓性領域、表
面形成領域、基質結合領域および高抗原性指標領域を含むフラグメントを含む。
図において示すように、このような好ましい領域は、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓ
ｏｎのα領域、β領域、ターン領域およびコイル領域、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ
のα領域、β領域、およびターン領域、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの親水性
領域、および疎水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇのα両親媒性領域およびβ両親媒
性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ可撓性領域、Ｅｍｉｎｉ表面形成領域な
らびにＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ高抗原性指標領域を含む。保存されたドメイン
にはいる配列番号２のポリペプチドフラグメントは、本発明により特に意図され
、図に示される。さらに、これらのドメインをコードするポリヌクレオチドフラ
グメントもまた、意図される。
【００６３】 他の好ましいフラグメントは、生物学的に活性なＰＤＥＦフラグメントである
。生物学的に活性なフラグメントは、同じ活性を表すが、ＰＤＥＦポリペプチド
の活性と同一である必要はないフラグメントである。このフラグメントの生物学
的な活性は、所望の活性の改善、または望ましくない活性の低下を含み得る。
【００６４】 しかし、ＥＳＴ配列のような多数のポリヌクレオチド配列は、公的に入手可能
であり、そして配列データベースを通じてアクセス可能である。これらの配列の
いくつかは、配列番号１に関し、そして本発明の構想の前に公的に利用可能であ
ったかもしれない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本発
明の範囲から特に除外される。あらゆる関連する配列を列挙することは煩わしい
。従って、好ましくは、一般式ａ〜ｂにより記載されたヌクレオチド配列を含む
１つ以上のポリヌクレオチドが本発明から除外される。ここでａは、配列番号１
の１〜１８７８の間の任意の整数であり、ｂは、１５〜１８９４の整数であり、
ａおよびｂの両方は、配列番号１に示されるヌクレオチド残基の位置と対応し、
そしてｂは、＋１４以上である。
【００６５】 （エピトープおよび抗体） 本発明において、「エピトープ」とは、動物、特にヒトにおいて抗原性活性ま
たは免疫原性活性を有するＰＤＥＦポリペプチドフラグメントをいう。本発明の
好ましい実施態様は、エピトープおよびこのフラグメントをコードするポリヌク
レオチドを含むＰＤＥＦポリペプチドフラグメントに関する。抗体が結合し得る
タンパク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」として定義される。対照的に、
「免疫原性エピトープ」は、抗体応答を誘発するタンパク質の一部分として定義
される。（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２（１９８３）を参照のこと）。
【００６６】 エピトープとして機能するフラグメントは、任意の従来の手段により作製され
得る。（例えば、米国特許番号第４，６３１，２１１号にさらに記載されるＨｏ
ｕｇｈｔｅｎ、Ｒ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
２：５１３１〜５１３５（１９８５）を参照のこと）。
【００６７】 本発明において、抗原性エピトープは、好ましくは、少なくとも７個、より好
ましくは少なくとも９個、そして最も好ましくは約１５〜約３０個の間のアミノ
酸の配列を含む。抗原性エピトープは、このエピトープに特異的に結合する抗体
（モノクローナル抗体を含む）を惹起するために有用である（例えば、Ｗｉｌｓ
ｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７７８（１９８４）；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，
Ｊ．Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−６６６（１９８３）を参照のこ
と。）。
【００６８】 同様に、免疫原性エピトープは、当該分野で周知の方法に従って抗体を誘導す
るために用いられ得る。（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら（前出）；Ｗｉｌｓｏ
ｎら（前出）；Ｃｈｏｗ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．
Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと）。好ましい
免疫原性エピトープは、可溶性タンパク質を含む。免疫原性エピトープは、キャ
リアタンパク質（例えば、アルブミン）とともに動物系（例えば、ウサギまたは
マウス）に対して、あるいは十分に長い場合では（少なくとも約２５アミノ酸）
、キャリアを用いずに提示され得る。しかし、８〜１０程度のわずかなアミノ酸
を含む免疫原性エピトープが、変性されたポリペプチドの直鎖エピトープに（非
常に少なくとも）結合し得る抗体を惹起するのに十分であることが示された（例
えば、ウエスタンブロッティングにおいて）。
【００６９】 ＤＮＡｓｔａｒ分析を用いて、配列番号２は、以下のアミノ酸で抗原性を見出
された：Ａｓｐ２１〜Ｇｌｕ２９、Ｌｅｕ３８〜Ｓｅｒ４６、Ｓｅｒ４６〜Ｇｌ
ｙ５４、Ｌｅｕ６６〜Ａｌａ７４、Ａｌａ７５〜Ａｒｇ８３、Ｇｌｕ８４〜Ｇｌ
ｎ９２、Ｖａｌ１３０〜Ｃｙｓ１３８、Ａｓｐ１４６〜Ａｓｎ１５４、Ｇｌｎ１
６５〜Ｌｙｓ１７３、Ｌｅｕ１７８〜Ｍｅｔ１８６、Ａｒｇ１９２〜Ａｓｐ２０
０、Ｍｅｔ２１５〜Ｇｌｙ２２２、Ｓｅｒ２２９〜Ａｓｐ２３７、Ｇｌｕ２３９
〜Ｇｌｎ２４７、Ｓｅｒ２３４〜Ｓｅｒ２４２、Ｌｅｕ２７２〜Ｌｙｓ２８０、
Ｐｈｅ２７９〜Ｖａｌ２８７、Ｇｌｙ２９２〜Ｍｅｔ３００、Ａｓｎ３０１〜Ｉ
ｌｅ３０９、Ｉｌｅ３１７〜Ｇｌｎ３２５。従って、これらの領域は、配列番号
１によってコードされるタンパク質に対する抗体を産生するためのエピトープと
して用いられ得る。
【００７０】 本明細書中で使用される場合、用語「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル
抗体」（Ｍａｂ）は、インタクトな分子ならびにタンパク質に特異的に結合し得
る抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を含
むことを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、インタクトな
抗体のＦｃフラグメントを欠落し、循環からより迅速に除去され、そしてインタ
クトな抗体より少ない非特異的な組織への結合を有し得る（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎ
ｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３））。従って、これらのフラ
グメント、および、ＦＡＢの産物または他の免疫グロブリン発現ライブラリーが
、好ましい。さらに、本発明の抗体は、キメラ抗体、単鎖抗体、およびヒト化抗
体を含む。
【００７１】 （融合タンパク質） 任意のＰＤＥＦポリペプチドは、融合タンパク質を生成するために使用され得
る。例えば、ＰＤＥＦポリペプチドは、第２のタンパク質に融合される場合、抗
原性タグとして使用され得る。ＰＤＥＦポリペプチドに対して惹起される抗体は
、ＰＤＥＦに結合することによって、この第２のタンパク質を間接的に検出する
ために使用され得る。さらに、分泌されるタンパク質は、細胞位置を輸送シグナ
ルに基づいて標的化するので、ＰＤＥＦポリペプチドは、他のタンパク質に一旦
融合されると標的化分子として使用され得る。
【００７２】 ＰＤＥＦポリペプチドと融合され得るドメインの例は、異種シグナル配列のみ
ならず、また他の異種機能性領域をも含む。その融合は、必ずしも直接的である
必要はないが、リンカー配列を介して起こり得る。
【００７３】 さらに、融合タンパク質はまた、ＰＤＥＦポリペプチドの特徴を改良するため
に操作され得る。例えば、さらなるアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域が、宿主
細胞からの精製または続く取り扱いおよび貯蔵の間の安定性および持続性を改良
するためにＰＤＥＦポリペプチドのＮ末端に付加され得る。また、ペプチド部分
は、精製を容易にするためにＰＤＥＦポリペプチドに付加され得る。このような
領域は、ＰＤＥＦポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。ポリペプチドの
取り扱いを容易にするためのペプチド部分の付加は、当該分野でよく知られ、そ
して慣用技術である。
【００７４】 さらに、ＰＤＥＦポリペプチド（フラグメント、そして特にエピトープを含む
）は、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常ドメインの一部と組み合わせられ得、キ
メラポリぺプチドを生じる。これらの融合タンパク質は精製を容易にし、そして
インビボにおいて増加した半減期を示す。１つの報告された例は、ヒトＣＤ４ポ
リペプチドの最初の２つのドメイン、および哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖ま
たは軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載している
（ＥＰ Ａ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１
：８４〜８６（１９８８））。ジスルフィド連結二量体構造（ＩｇＧに起因する
）を有する融合タンパク質はまた、単量体分泌タンパク質またはタンパク質フラ
グメント単独よりも、他の分子を結合しそして中和するのに、より効率的であり
得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８〜
３９６４（１９９５））。
【００７５】 同様に、ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６４ ５３３（カナダ国対応特許第２０４５８６９
号）は、別のヒトタンパク質またはその部分とともに免疫グロブリン分子の定常
領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク
質のＦｃ部分は、治療および診断において有益であり、従って、例えば、改良さ
れた薬物動態学的な特性を生じ得る（ＥＰ−Ａ ０２３２ ２６２）。あるいは
、融合タンパク質が発現され、検出され、そして精製された後に、Ｆｃ部分を欠
失させることが望ましい。例えば、融合タンパク質が免疫化のための抗原として
使用される場合、Ｆｃ部分は、治療および診断を妨害し得る。例えば、薬物の発
見において、ｈＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニス
トを同定するための高処理能力スクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分
と融合されてきた（Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏ
ｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２〜５８（１９９５）；Ｋ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９〜９４７１（１９９５）を参照のこと）
。
【００７６】 さらに、ＰＤＥＦポリペプチドは、マーカー配列（例えば、ＰＤＥＦの精製を
容易にするペプチド）に融合され得る。好ましい実施態様において、マーカーア
ミノ酸配列は、とりわけヘキサヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（
ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏ
ｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）において提供されるタグ）であり、これらの多くの
マーカーアミノ酸配列が市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１〜８２４（１９８９）に記載
されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の都合の良い精製を提供す
る。精製のために有用な別のペプチドタグである「ＨＡ」タグは、インフルエン
ザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅ
ｌｌ ３７：７６７（１９８４））。
【００７７】 従って、任意のこれら上記の融合物は、ＰＤＥＦポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドを使用して操作され得る。
【００７８】 （ベクター、宿主細胞、およびタンパク質産生） 本発明はまた、ＰＤＥＦポリヌクレオチドを含むベクター、宿主細胞、および
組換え技術によるポリペプチドの産生に関する。例えば、このベクターは、ファ
ージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、またはレトロウイルス
ベクターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製コンピテント、または複
製欠損であり得る。後者の場合、一般的にウイルス増殖は、相補性（ｃｏｍｐｌ
ｅｍｅｎｔｉｎｇ）宿主細胞にのみ生じる。
【００７９】 ＰＤＥＦポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために選択マーカーを含む
ベクターに連結され得る。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈
澱物のような沈澱物、または荷電脂質との複合体において導入される。ベクター
がウイルスである場合、ウィルスベクターは、適切なパッケージング細胞株を使
用してインビトロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る
。
【００８０】 ＰＤＥＦポリヌクレオチド挿入物は、適切なプロモーター（いくつか挙げれば
、例えば、ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃプロモーター、
ｔｒｐプロモーター、ｐｈｏＡプロモーターおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４
０初期プロモーターおよびＳＶ４０後期プロモーター、ならびにレトロウイルス
ＬＴＲのプロモーター）に作動可能に連結されるべきである。他の適切なプロモ
ーターは当業者に公知である。発現構築物はさらに、転写開始、転写終結のため
の部位、および転写領域において、翻訳のためのリボソーム結合部位を含む。構
築物によって発現される転写物のコード部分は、好ましくは、始めに翻訳開始コ
ドン、および翻訳されるポリペプチドの末端に適切に配置される終結コドン（Ｕ
ＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含む。
【００８１】 示されるように、発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカー
を含む。このようなマーカーは、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクター
ゼ、Ｇ４１８、またはネオマイシン耐性、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌
において培養するためのテトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子
またはアンピシリン耐性遺伝子を含む。適切な宿主の代表的な例は、細菌細胞（
例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；酵母細胞のような真菌細胞；Ｄｒｏｓｏｐｈ
ｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞；ＣＨ
Ｏ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞のような動
物細胞；ならびに植物細胞を含むが、これらに限定されない。上記の宿主細胞に
ついての適切な培養培地および条件は、当該分野で公知である。
【００８２】 細菌における使用のために好ましいベクターの中には、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６
０およびｐＱＥ−９（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６
ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ならびにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２
３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能）を含む。好ましい真核生物ベクターの
中には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ（
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳ
ＧおよびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）がある。他の適切なベク
ターは当業者に容易に明らかである。
【００８３】 宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法によっ
てもたらされ得る。このような方法は、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８６）のような多く
の標準的な研究室マニュアルに記載される。ＰＤＥＦポリペプチドは、実際、組
換えベクターを欠損する宿主細胞によって発現され得ることが特に意図される。
【００８４】 ＰＤＥＦポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール沈澱、酸抽
出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマ
トグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマト
グラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され得、そして
精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）
が精製のために使用される。
【００８５】 ＰＤＥＦポリペプチドはまた、以下から回収され得る：直接単離されるかまた
は培養されるかにかかわらず、体液、組織および細胞を含む天然の供給源から精
製される産物；化学的合成手順の産物；ならびに、例えば、細菌細胞、酵母細胞
、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む、原核生物宿主または真
核生物宿主から組換え技術によって産生された産物。組換え産生手順において使
用される宿主に依存して、ＰＤＥＦポリペプチドは、グリコシル化されてもよく
、またはグリコシル化されていなくてもよい。さらに、ＰＤＥＦポリペプチドは
また、宿主媒介プロセスの結果として、いくつかの場合において、最初の改変さ
れたメチオニン残基を含み得る。従って、一般に、翻訳開始コドンによってコー
ドされるＮ末端メチオニンが、すべての真核生物細胞における翻訳後の任意のタ
ンパク質から高い効率で除去されることが、当該分野において周知である。ほと
んどのタンパク質においてＮ末端メチオニンはまた、ほとんどの原核生物におい
て効率的に除去されるが、いくつかのタンパク質については、この原核生物除去
プロセスは、非効率的であり、Ｎ末端メチオニンが共有結合するアミノ酸の性質
に依存する。
【００８６】 （ＰＤＥＦポリヌクレオチドの使用） 本明細書中で同定されるＰＤＥＦポリヌクレオチドは、多数の方法において試
薬として使用され得る。以下の説明は例示的であるとみなされるべきであり、そ
して公知の技術を利用する。
【００８７】 実際の配列データ（反復多型性）に基づく染色体マーキング試薬が現在ほとん
ど利用可能ではないため、新しい染色体マーカーを同定する必要性が存在するま
まである。この遺伝子は６ｐ２１．３にマッピングされる。従って、ＰＤＥＦポ
リペプチドは、染色体６ｐ２１．３についてのマーカーとして、連鎖分析におい
て使用され得る。
【００８８】 簡単に言うと、配列は、配列番号１に示される配列からＰＣＲプライマー（好
ましくは１５〜２５ｂｐ）を調製することによって染色体にマッピングされ得る
。プライマーが、ゲノムＤＮＡ中の１つより多くの予測されたエキソンにまたが
らないように、プライマーは、コンピューター分析を使用して選択され得る。次
いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰ
ＣＲスクリーニングに使用される。配列番号１に対応するヒトＰＤＥＦ遺伝子を
含むハイブリッドのみが、増幅したフラグメントを産生する。
【００８９】 同様に、体細胞ハイブリッドは、特定の染色体に対してポリヌクレオチドをＰ
ＣＲマッピングする迅速な方法を提供する。単一のサーマルサイクラーを使用し
て、１日あたり３つ以上のクローンが割り当てられ得る。さらに、ＰＤＥＦポリ
ヌクレオチドの下位局在化（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、特定の染色
体フラグメントのパネルで達成され得る。使用され得る他の遺伝子マッピングス
トラテジーは、インサイチュハイブリダイゼーション、標識フローソート（ｌａ
ｂｅｌｅｄ ｆｌｏｗ ｓｏｒｔｅｄ）染色体でのプレスクリーニング、および
染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションに
よる前選択を含む。
【００９０】 ＰＤＥＦポリヌクレオチドの正確な染色体位置はまた、中期染色体スプレッド
の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用して達成され得
る。この技術は、５００または６００塩基ほどの短さのポリヌクレオチドを使用
する；しかし２，０００〜４，０００ｂｐのポリヌクレオチドが好ましい。この
技術の総説としては、Ｖｅｒｍａら、「Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：
ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，Ｐｅｒｇａｍ
ｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと。
【００９１】 染色体マッピングについては、ＰＤＥＦポリヌクレオチドは、個々に（単一染
色体またはその染色体上の単一部位をマークするために）またはパネルで（複数
部位および／または複数染色体をマークするために）使用され得る。好ましいポ
リヌクレオチドは、ｃＤＮＡの非コード領域に対応する。なぜなら、コード配列
は、遺伝子ファミリー内で保存される傾向がより高く、従って、染色体マッピン
グの間に交差ハイブリダイゼーションの機会が増加するからである。
【００９２】 一旦、ポリヌクレオチドが正確な染色体位置にマップされると、ポリヌクレオ
チドの物理的位置は、連鎖分析において使用され得る。連鎖分析は、染色体位置
と特定の疾患の提示との間の同時遺伝（ｃｏｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ）を確立す
る（疾患マッピングデータは、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉ
ａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙを通して
オンラインで利用可能である）において見出される）。１メガベースマッピング
解像度および２０ｋｂあたり１遺伝子と仮定すると、疾患と関連する染色体領域
に正確に位置決めされるｃＤＮＡは、５０〜５００の潜在的な原因遺伝子の１つ
であり得る。
【００９３】 従って、一旦、同時遺伝が確立されると、罹患個体と非罹患個体との間でのＰ
ＤＥＦポリヌクレオチドおよび対応する遺伝子における差異が試験され得る。ま
ず、染色体中の可視的構造変化（例えば、欠失または転座）は染色体スプレッド
において、またはＰＣＲによって試験される。構造的変化が存在しない場合、点
変異の存在が確認される。何人かのまたは全ての罹患された個体で観察されたが
、正常な個体では観察されなかった変異は、この変異がこの疾患を引き起こし得
ることを示す。しかし、いくつかの正常な個体由来のＰＤＥＦポリペプチドおよ
び対応する遺伝子の完全な配列決定は、変異を多型性と区別するために要求され
る。新しい多型性が同定される場合、この多型ポリペプチドはさらなる連鎖分析
のために使用され得る。
【００９４】 さらに、非罹患個体と比較した罹患個体の遺伝子の増加または減少した発現が
、ＰＤＥＦポリヌクレオチドを使用して評価され得る。任意のこれらの変化（変
化した発現、染色体再配置、または変異）は、診断マーカーまたは予後マーカー
として使用され得る。
【００９５】 前記に加えて、ＰＤＥＦポリヌクレオチドは、三重らせん形成またはアンチセ
ンスＤＮＡもしくはＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するために使用され得る。
両方の方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に依存する。こ
れらの技術に関して、好ましいポリヌクレオチドは通常、２０〜４０塩基長であ
り、そして転写に関与する遺伝子領域（三重らせん−Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５
１：１３６０（１９９１）を参照のこと）またはｍＲＮＡ自体（アンチセンス−
Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏ
ｄｅｏｘｙ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂ
ｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂ
ｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８））のいずれかに相補的である。三重らせ
ん形成は、最適にはＤＮＡからのＲＮＡ転写の遮断を生じるが、アンチセンスＲ
ＮＡハイブリダイゼーションは、ポリペプチドへのｍＲＮＡ分子の翻訳を阻止す
る。両方の技術は、モデル系において効果的であり、そして本明細書に開示され
る情報は、疾患を処置するための試みにおいて、アンチセンスまたは三重らせん
ポリヌクレオチドを設計するために使用され得る。
【００９６】 ＰＤＥＦポリヌクレオチドはまた、遺伝子治療において有用である。遺伝子治
療の１つの目標は、遺伝子欠損を修正する試みにおいて、欠損遺伝子を有する生
物へ正常遺伝子を挿入することである。ＰＤＥＦは、高度に正確な様式でこのよ
うな遺伝子欠損を標的とする手段を提供する。別の目標は、宿主ゲノム中には存
在しなかった新しい遺伝子を挿入することであり、それによって宿主細胞中に新
しい形質を生成する。なお別の目標は、ＰＤＥＦのドミナントネガティブ変異体
を作製し、疾患におけるＰＤＥＦ機能を阻害することである。
【００９７】 ＰＤＥＦポリヌクレオチドはまた、微小な生物学的サンプルから個体を同定す
るために有用である。例えば、米国軍は、その職員を同定するために制限フラグ
メント長多型（ＲＦＬＰ）の使用を考慮している。この技術において、個体のゲ
ノムＤＮＡは１つ以上の制限酵素で消化され、そして職員を同定するための独特
なバンドを生じるためのサザンブロットについてプローブされる。この方法は、
「認識票（Ｄｏｇ ｔａｇ）」（これは、失われたり、交換されたり、または盗
まれたりすることにより、ポジティブな同定を困難にし得る）の現在の限界を受
けない。ＰＤＥＦポリヌクレオチドは、ＲＦＬＰのためのさらなるＤＮＡマーカ
ーとして使用され得る。
【００９８】 ＰＤＥＦポリヌクレオチドはまた、個体のゲノムの選択された部分の実際の塩
基ごとのＤＮＡ配列を決定することによって、ＲＦＬＰの代替として使用され得
る。これらの配列は、このような選択されたＤＮＡ（これは、次いで配列決定さ
れ得る）を増幅しそして単離するためのＰＣＲプライマーを調製するために使用
され得る。各々の個体が独特のＤＮＡ配列のセットを有するので、この技術を使
用して、個体が同定され得る。一旦、独特のＩＤデータベースが個体に対して確
立されると、個体が生存していようとまたは死亡していようと、その個体のポジ
ティブ同定が、極めて小さな組織サンプルから行われ得る。
【００９９】 法医学生物学もまた、本明細書に開示されるようなＤＮＡに基づく同定技術を
使用することから利益を得る。組織（例えば、髪または皮膚）、または体液（例
えば、血液、唾液、精液など）のような非常にわずかな生物学的サンプルから採
取されたＤＮＡ配列は、ＰＣＲを使用して増幅され得る。ある先行技術において
、ＤＱａクラスＩＩ ＨＬＡ遺伝子のような多型遺伝子座から増幅された遺伝子
配列は、個体を同定するために法医学生物学において使用される。（Ｅｒｌｉｃ
ｈ， Ｈ．，ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．
（１９９２））。一旦、これらの特異的多型遺伝子座が増幅されると、これらは
１つ以上の制限酵素で消化される。これは、ＤＱａクラスＩＩ ＨＬＡ遺伝子に
対応するＤＮＡでプローブされたサザンブロットについてのバンドのセットの同
定を生じる。同様に、ＰＤＥＦポリヌクレオチドは、法医学的目的のための多型
マーカーとして使用され得る。
【０１００】 また、特定の組織の供給源を同定し得る試薬についての必要性が存在する。例
えば、未知の起源の組織が提示される場合、法医学においてこのような必要性が
生じる。適切な試薬は、例えば、ＰＤＥＦ配列から調製される特定の組織に特異
的なＤＮＡプローブまたはプライマーを含み得る。このような試薬のパネルは、
種および／または器官型によって組織を同定し得る。同様の様式で、これらの試
薬は、夾雑物について組織培養物をスクリーニングするために使用され得る。
【０１０１】 ＰＤＥＦは、前立腺上皮で、そしてより低い程度では、唾液腺、気管、卵巣、
および乳房において発現されることが見出されるので、ＰＤＥＦポリヌクレオチ
ドは、生物学的サンプル中に存在する組織または細胞型の差示的同定のためのハ
イブリダイゼーションプローブとして有用である。同様に、ポリペプチドおよび
ＰＤＥＦポリペプチドに対する抗体は、組織または細胞型の差示的同定のための
免疫学的プローブを提供するために有用である。さらに、上記の組織または細胞
、特に生殖系の多くの障害について、「標準的」なＰＤＥＦ遺伝子の発現レベル
（すなわち、生殖系障害を有さない個体由来の健常組織におけるＰＤＥＦの発現
レベル）に比較して、有意により高いかまたはより低いレベルのＰＤＥＦ遺伝子
の発現、または、ＰＤＥＦを通常発現しない組織における異常なＰＤＥＦ発現が
、このような障害を有する個体から採取された特定の組織（例えば、癌性組織お
よび創傷組織）または体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液または髄液）中で、
検出され得る。
【０１０２】 従って、本発明は、障害の診断方法を提供し、この方法は、（ａ）個体の細胞
または体液中のＰＤＥＦ遺伝子の発現レベルをアッセイする工程；（ｂ）このＰ
ＤＥＦ遺伝子の発現レベルを標準的なＰＤＥＦ遺伝子の発現レベルと比較する工
程、を包含し、これによって、標準的な発現レベルと比較して、アッセイされた
ＰＤＥＦ遺伝子の発現レベルの増加または減少が、生殖系または他の組織におけ
る障害を示す。
【０１０３】 少なくとも、ＰＤＥＦポリヌクレオチドは、サザンゲルでの分子量マーカーと
して、特定の細胞型における特定のｍＲＮＡの存在に関する診断用プローブとし
て、新規なポリヌクレオチドを発見するプロセスでの公知の配列を「差し引き」
するためのプローブとして、「遺伝子チップ」または他の支持体に付着させるた
めのオリゴマーを選択および作製するため、ＤＮＡ免疫技術を用いて抗ＤＮＡ抗
体を惹起させるため、ならびに免疫応答を誘発する抗原として、使用され得る。
【０１０４】 （ＰＤＥＦポリペプチドの使用） ＰＤＥＦポリペプチドは、多くの方法に使用され得る。以下の記載は、例示と
してみなされるべきであり、そして公知の技術を利用する。
【０１０５】 ＰＤＥＦポリペプチドは、抗体に基づいた技術を使用して生物学的サンプル中
のタンパク質レベルをアッセイするために使用され得る。例えば、組織における
タンパク質発現は、古典的な免疫組織学的方法を用いて研究され得る（Ｊａｌｋ
ａｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８
５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７
−３０９６（１９８７））。タンパク質遺伝子発現を検出するのに有用である、
抗体に基づいた他の方法には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）のような免疫アッセイが含まれる。適切な抗体
アッセイの標識は、当該分野で公知であり、そして例えば、グルコースオキシダ
ーゼのような酵素標識、ならびにヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ
）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、および
テクネチウム（９９ｍＴｃ）のような放射性同位体、ならびにフルオレセインお
よびローダミンのような蛍光標識、ならびにビオチンが挙げられる。
【０１０６】 生物学的サンプル中のタンパク質レベルをアッセイすることに加えて、タンパ
ク質はまた、画像化によりインビボで検出され得る。タンパク質をインビボで画
像化するための抗体の標識またはマーカーとしては、Ｘ線ラジオグラフィー、Ｎ
ＭＲまたはＥＳＲにより検出可能なものが挙げられる。Ｘ線ラジオグラフィーに
ついては、適切な標識は、検出可能な放射線を発するが、被験体に対して明白に
は有害ではない、バリウムまたはセシウムのような放射性同位体を含む。ＮＭＲ
およびＥＳＲに適切なマーカーには、例えば重水素のような検出可能な特徴的な
スピンを有するものが含まれ、これは、関連するハイブリドーマのための栄養素
を標識することにより抗体に取り込まれ得る。
【０１０７】 放射性同位体（例えば、１３１Ｉ、１１２Ｉｎ、９９ｍＴｃ）、放射線不透過
性物質、または核磁気共鳴により検出可能な材料のような適切な検出可能な画像
化部分で標識された、タンパク質特異的抗体または抗体フラグメントは、哺乳動
物に（例えば、非経口的、皮下、または腹腔内に）導入される。被験体のサイズ
および用いられる画像化システムは、診断画像を生成するために必要な画像化部
分の量を決定することが当該分野で理解される。放射性同位体部分の場合には、
ヒト被験体について、注射される放射能の量は、通常、９９ｍＴｃの約５〜２０
ミリキュリーの範囲である。次いで、標識された抗体または抗体フラグメントは
、特定のタンパク質を含む細胞の位置に優先的に蓄積される。インビボ腫瘍画像
化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅ
ｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ
Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．」（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ
Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒの第１
３章、Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２））に記載される。
【０１０８】 従って、本発明は、障害の診断方法を提供し、この方法は、（ａ）個体の細胞
または体液中のＰＤＥＦポリペプチドの発現をアッセイする工程；（ｂ）この遺
伝子発現レベルを標準的な遺伝子発現レベルと比較する工程を包含し、これによ
って、標準的な発現レベルと比較して、アッセイされたＰＤＥＦポリペプチドの
遺伝子発現レベルの増加または減少が、障害を示す。
【０１０９】 さらに、ＰＤＥＦポリペプチドを用いて疾患を処置し得る。例えば、患者は、
ＰＤＥＦポリペプチド（例えば、インスリン）の非存在またはレベルの減少を元
に戻すこと、異なるポリペプチド（例えば、ヘモグロビンＢに対するヘモグロビ
ンＳ）の非存在またはレベルの減少を補充すること、ポリペプチド（例えば、ガ
ン遺伝子）の活性を阻害すること、ポリペプチドの活性を（例えば、レセプター
に結合することによって）活性化すること、遊離リガンド（例えば、炎症を低減
させる際に用いられる可溶性ＴＮＦレセプター）について膜結合レセプターと競
合させることによって膜結合レセプターの活性を減少させること、または所望の
応答（例えば、血管の増殖）をもたらすことに取り組む際に、ＰＤＥＦポリペプ
チドが投与され得る。さらに、ＰＤＥＦ遺伝子のプロモーターおよび／またはエ
ンハンサーエレメントは、前立腺特異的障害、特に前立腺癌または腫瘍を処置す
るための遺伝子治療の適用において使用され得る。
【０１１０】 同様に、ＰＤＥＦポリペプチドを指向する抗体もまた使用されて疾患を処置し
得る。例えば、ＰＤＥＦポリペプチドを指向する抗体の投与は、このポリペプチ
ドに結合し、そしてポリペプチドの過剰産生を低減し得る。同様に、抗体の投与
は、例えば、膜に結合したポリペプチド（レセプター）へ結合することにより、
ポリペプチドを活性化し得る。
【０１１１】 少なくとも、ＰＤＥＦポリペプチドは、当業者に周知の方法を用いるＳＤＳ−
ＰＡＧＥゲルまたは分子ふるいゲル濾過カラムの分子量マーカーとして使用され
得る。ＰＤＥＦポリペプチドはまた、抗体を惹起するために使用され得、次いで
、この抗体を使用して、宿主細胞の形質転換を評価する方法として、組換え細胞
からのタンパク質発現を測定する。さらに、ＰＤＥＦポリペプチドを使用して、
以下の生物学的活性を試験し得る。
【０１１２】 （ＰＤＥＦの生物学的活性） ＰＤＥＦポリヌクレオチドおよびポリペプチドをアッセイに用いて、１つ以上
の生物学的活性について試験し得る。ＰＤＥＦポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドが、特定のアッセイにおいて活性を示す場合、ＰＤＥＦは、生物学的活性に
関連した疾患に関与し得るようである。従って、ＰＤＥＦを用いて、その関連す
る疾患を処置し得る。
【０１１３】 例えば、前立腺組織の発達および維持に関与するメカニズムは、ほとんど理解
されていない。二次性徴表現型の成体における正常な発達および継続する発現は
、アンドロゲン依存性であることは理解されてきたが、アンドロゲンが作用する
遺伝子または分化した組織の発達をもたらす下流の経路については、比較的ほと
んど知られていない。前立腺の発達に関して、前立腺癌の根底にある基本的なメ
カニズムもまた、不明瞭なままである。しかし、アンドロゲン調節およびその損
失は、決定的な役割を果たすことが知られている。発達している前立腺および成
熟した前立腺の両方において、前立腺特異的細胞機能の維持は、アンドロゲンに
よる連続的な刺激を必要とする；前立腺特異的癌組織において、この細胞分化の
相互作用的損失（これは、疾患の進行の間に起こる）は、大部分、前立腺細胞に
よるアンドロゲン応答性の損失と同時に起こる。これらの大部分の対立するプロ
セスのいずれかに関与する遺伝子を同定することは、関与する基本的なメカニズ
ムのより深い理解をもたらすようである。
【０１１４】 ＰＤＥＦポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、他のＥｔｓ因子でないもの
を除き、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）プロモーター転写を直接増強することによっ
て、ＰＳＡ遺伝子を活性化することが示されている。ＰＳＡ遺伝子は、前立腺癌
の臨床的マーカーとして、重要な診断の有用性を有する、分泌されたタンパク質
をコードする。対照的に、他のＥｔｓ因子はいずれも、ＰＳＡプロモーターをさ
ほど活性化しないことが示されている。従って、ＰＳＡ遺伝子がＰＤＥＦによっ
て活性化され得るという事実は、ＰＳＡ遺伝子転写の正の調節因子としてのＰＤ
ＥＦの有用性を実証し、そしてＰＳＡが実際に、ＰＤＥＦの関連する前立腺特異
的標的となり得ることを示唆する。
【０１１５】 さらに、全てのＥｔｓ因子に特有の特徴は、それらが他の転写因子と相互作用
する能力である。この論法に従えば、ＰＤＥＦは、ＰＳＡプロモーター内の調節
エレメントに結合する因子と相互作用し得、このことは、転写制御の重要な機構
であり得る。さらに、ＰＤＥＦは、アンドロゲンレセプターのＤＮＡ結合ドメイ
ンに特異的に結合し、そしてＰＳＡプロモーターの活性化において、アンドロゲ
ンと協同する。このような協同性は、ＰＤＥＦとアンドロゲンレセプターとの直
接的な物理的相互作用により駆動されることが、示されている。
【０１１６】 上皮細胞特異性の強力な証拠は、個々の細胞型のＲＴ／ＰＣＲ分析ならびにイ
ンサイチュハイブリダイゼーションの両方により、提供される。ＰＤＥＦは、主
として前立腺の上皮細胞で、そしてより低い程度に、いくつかのさらなるホルモ
ンにより調節される腺組織で、発現される。前立腺においては、ＰＤＥＦ発現は
、管腔の上皮細胞（これは、前立腺癌マーカーＰＳＡを分泌する正確な細胞であ
る）に限定される。ＰＳＡ遺伝子がＰＤＥＦの明白な標的であること、およびＰ
ＤＥＦがアンドロゲンレセプターと相互作用し、そして共力して、アンドロゲン
の存在下でＰＳＡ遺伝子転写を誘導することが、実証されている。インサイチュ
ハイブリダイゼーション結果の矯正において（本発明の実施例３）、ＰＤＥＦ発
現は、刺激されていない前立腺癌細胞においてはより低く、そしてアンドロゲン
（これもまた、ＰＳＡをアップレギュレートする）によって誘導されるようにな
る。ＰＤＥＦの発現パターンは、ＰＤＥＦが、前立腺特異遺伝子の別個の群を調
節することを示唆する。上皮特異遺伝子の数種のみが、Ｅｔｓ因子により調節さ
れ、そして上皮特異的遺伝子のいずれも、前立腺特異的ではないことが、以前に
示されている。
【０１１７】 従って、ＰＤＥＦポリペプチドまたはポリヌクレオチドの新規な活性に起因し
て、ＰＤＥＦは、前立腺癌の診断のための前立腺特異腫瘍マーカーとして使用さ
れ得る。ＰＤＥＦとアンドロゲンレセプターとの物理的相互作用を考慮すると、
ＰＤＥＦはまた、前立腺癌の潜在的に重要な治療剤として作用し得る。
【０１１８】 （免疫活性） ＰＤＥＦポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、免疫細胞の増殖、分化、ま
たは動員（走化性）を活性化または阻害することによって、免疫系の不全または
障害を処置する際に有用であり得る。免疫細胞は、多能性幹細胞から骨髄性細胞
（血小板、赤血球、好中球、およびマクロファージ）およびリンパ系細胞（Ｂリ
ンパ球およびＴリンパ球）を産生する、造血と呼ばれるプロセスを介して発生す
る。これらの免疫不全または障害の病因は、遺伝性、体細胞性（例えば、癌また
はいくつかの自己免疫障害）、後天性（例えば、化学療法または毒素による）、
または感染性であり得る。さらに、ＰＤＥＦポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ドは、特定の免疫系疾患または障害のマーカーまたは検出因子として使用され得
る。
【０１１９】 ＰＤＥＦポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、造血細胞の不全または障害
を処置または検出する際に有用であり得る。ＰＤＥＦポリペプチドまたはポリヌ
クレオチドは、特定の（または多くの）型の造血細胞の減少に関連する障害を処
置する試みにおいて、多能性幹細胞を含む造血細胞の分化および増殖を増加させ
るために使用され得る。免疫学的不全症候群の例には以下が挙げられるが、それ
らに限定されない：血液タンパク質障害（例えば、無ガンマグロブリン血症、低
ガンマグロブリン血症）、毛細血管拡張性運動失調、分類不能型免疫不全、ディ
ジョージ症候群、ＨＩＶ感染、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ感染、白血球接着不全症候群、
リンパ球減少症、食細胞殺菌機能不全、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）、ヴィ
スコット‐オールドリッチ障害、貧血、血小板減少症、または血色素尿症。
【０１２０】 さらに、ＰＤＥＦポリペプチドまたはポリヌクレオチドはまた、止血活性（出
血の停止）または血栓崩壊活性（血餅形成）を調節するために使用され得る。例
えば、止血活性または血栓崩壊活性を増加させることによって、ＰＤＥＦポリヌ
クレオチドまたはポリペプチドは、血液凝固障害（例えば、無線維素原血症、因
子不全（ｆａｃｔｏｒ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ））、血小板障害（例えば、血小
板減少症）、または外傷、手術、もしくは他の原因から生じる創傷を処置するた
めに使用され得る。あるいは、止血活性または血栓崩壊活性を低減し得るＰＤＥ
Ｆポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、心臓発作（梗塞）、発作、または瘢
痕の処置において重要な、凝固を阻害または溶解するために使用され得る。
【０１２１】 ＰＤＥＦポリヌクレオチドまたはポリペプチドはまた、自己免疫障害を処置ま
たは検出する際に有用であり得る。多くの自己免疫障害は、免疫細胞による、自
己の外来物質としての不適切な認識から生じる。この不適切な認識は、宿主組織
の崩壊を導く免疫応答を生じる。従って、免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化、
または走化性を阻害し得るＰＤＥＦポリペプチドまたはポリヌクレオチドの投与
は、自己免疫障害を予防する際の有効な治療であり得る。
【０１２２】 ＰＤＥＦによって処置または検出され得る自己免疫障害の例には、以下が挙げ
られるがそれらに限定されない：アディソン病、溶血性貧血、抗リン脂質症候群
、慢性関節リウマチ、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、糸球体腎炎、グッドパス
チャー症候群、グレーヴズ病、多発性硬化症、重症筋無力症、神経炎、眼炎、水
疱性類天疱瘡、天疱瘡、多発性内分泌腺症、紫斑、ライター病、前立腺癌、ステ
ィッフマン症候群、自己免疫性甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性
肺炎、ギヤン‐バレー症候群、インスリン依存性糖尿病、および自己免疫炎症眼
病。
【０１２３】 同様に、喘息（特に、アレルギー性喘息）または他の呼吸器問題のようなアレ
ルギー反応および状態はまた、ＰＤＥＦポリペプチドまたはポリヌクレオチドに
よって処置され得る。さらに、ＰＤＥＦは、アナフィラキシー、抗原性分子に対
する過敏症、または血液型群不適合を処置するために使用され得る。
【０１２４】 ＰＤＥＦポリヌクレオチドまたはポリペプチドはまた、器官拒絶または対宿主
性移植片病（ＧＶＨＤ）を処置および／または予防するために使用され得る。器
官拒絶は、免疫応答を介する移植された組織の宿主免疫細胞崩壊によって生じる
。同様に、免疫応答はまたＧＶＨＤに関与するが、この場合において外来の移植
された免疫細胞は、宿主組織を崩壊する。免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化、
または走化性を阻害するＰＤＥＦポリペプチドまたはポリヌクレオチドの投与は
、器官拒絶またはＧＶＨＤを予防する際に有効な治療であり得る。
【０１２５】 同様に、ＰＤＥＦポリペプチドまたはポリヌクレオチドはまた、炎症を調節す
るために使用され得る。例えば、ＰＤＥＦポリペプチドまたはポリヌクレオチド
は、炎症応答に関与する細胞の増殖および分化を阻害し得る。これらの分子は、
以下を含む炎症状態（慢性状態および急性状態の両方）を処置するために使用さ
れ得る：感染と関連する炎症（例えば、敗血症性ショック、敗血症、または全身
性炎症応答症候群（ＳＩＲＳ））、虚血性再灌流傷害、内毒素致死、関節炎、補
体媒介超急性拒絶、腎炎、サイトカインまたはケモカイン誘導肺傷害、炎症性腸
疾患、クローン病、またはサイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＬ−１）の過
剰産生から生じる状態。
【０１２６】 （過剰増殖性障害） ＰＤＥＦポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、新生物を含む過剰増殖性障
害を処置または検出するために使用され得る。ＰＤＥＦポリペプチドまたはポリ
ヌクレオチドは、直接的相互作用または間接的相互作用を介して、障害の増殖を
阻害し得る。あるいは、ＰＤＥＦポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、過剰
増殖性障害を阻害し得る他の細胞を増殖し得る。
【０１２７】 例えば、免疫応答を増加させること、特に過剰増殖性障害の抗原性質を増加さ
せることによって、またはＴ細胞を増殖、分化、もしくは動員させることによっ
て、過剰増殖性障害を処置し得る。この免疫応答は、存在する免疫応答を増強さ
せることによって、または新しい免疫応答を開始させることによってのいずれか
で増加され得る。あるいは、免疫応答を低減させることもまた、化学療法剤のよ
うな過剰増殖性障害を処置する方法であり得る。
【０１２８】 ＰＤＥＦポリヌクレオチドまたはポリペプチドによって処置または検出され得
る過剰増殖性障害の例には、以下に位置する新生物が挙げられるがそれらに限定
されない：腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副
甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭部および頸部、神経（中
枢神経および末梢神経）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、泌尿器
、および前立腺。さらに、ＰＤＥＦにより処置または検出され得る、特定の型の
癌には、以下が挙げられる：非ホジキンリンパ腫、小胞中心（ｆｏｌｌｉｃｌｅ
ｃｅｎｔｅｒ）リンパ腫、卵巣癌、多発性骨髄腫、頚部癌、急性Ｔ−リンパ芽
球性白血病、子宮内膜癌、生殖細胞腫瘍、グリオーム、急性白血病、ＣＭＬ、お
よび黒色腫。
【０１２９】 同様に、他の過剰増殖性障害はまた、ＰＤＥＦポリヌクレオチドまたはポリペ
プチドによって処置または検出され得る。そのような過剰増殖性障害の例には、
以下が挙げられるがそれらに限定されない：高ガンマグロブリン血症、リンパ増
殖性（ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）障害、パラプロテイン血症、
紫斑、サルコイドーシス、セザリー症候群、Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｎマクログロ
ブリン血症、ゴシェ病、組織球増殖症、および上記で列挙した器官系に位置され
る新形成以外の任意の他の過剰増殖性疾患。
【０１３０】 （感染性疾患） ＰＤＥＦポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、感染性因子を処置または検
出するために使用され得る。例えば、免疫応答を増加させることによって、特に
Ｂ細胞および／またはＴ細胞の増殖および分化を増加させることによって、感染
性疾患を処置し得る。免疫応答は、存在する免疫応答を増強することによって、
または新しい免疫応答を開始させることによってのいずれかで増加され得る。あ
るいは、ＰＤＥＦポリペプチドまたはポリヌクレオチドはまた、免疫応答を必ず
しも誘発させることなく、感染性因子を直接的に阻害し得る。
【０１３１】 ウイルスは、ＰＤＥＦポリヌクレオチドまたはポリペプチドによって処置また
は検出され得る疾患または症状を生じ得る感染性因子のうちの１つの例である。
ウイルスの例には、以下のＤＮＡウイルス科およびＲＮＡウイルス科が挙げられ
るがそれらに限定されない：アルボウイルス科、アデノウイルス科、アレナウイ
ルス科、アルテリウイルス科、ビルナウイルス科、ブンヤウイルス科、カルシウ
イルス科、コルチコウイルス科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス
科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科（肝炎）、ヘルペスウイルス科（例
えば、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス、帯状ヘルペス）、モノネガウイル
ス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒｕｓ）（例えば、パラミクソウイルス科、麻疹ウイ
ルス、ラブドウイルス科）、オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザ
）、パポバウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイ
ルス科（例えば、天然痘またはワクシニア）、レオウイルス科（例えば、ロタウ
イルス）、レトロウイルス科（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レンチウイルス
）、およびトガウイルス科（例えば、ルビウイルス）。これらの科に入るウイル
スは、以下を含むがそれらに限定されない種々の疾患または症状を生じ得る：関
節炎、気管支炎（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｌｉｔｉｓ）、脳炎、眼感染（例えば、結
膜炎、角膜炎）、慢性疲労症候群、肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、慢性活動性、δ）、
髄膜炎、日和見感染（例えば、ＡＩＤＳ）、肺炎、バーキットリンパ腫、水痘、
出血熱、麻疹、おたふくかぜ、パラインフルエンザ、狂犬病、感冒、ポリオ、白
血病、風疹、性感染病、皮膚病（例えば、カポージいぼ）、およびウイルス血症
。ＰＤＥＦポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、これらの症状または疾患の
うちのいずれかを処置または検出するために使用され得る。
【０１３２】 同様に、疾患または症状を生じ得、そしてＰＤＥＦポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドによって処置または検出され得る細菌性因子または真菌性因子には、
以下のグラム陰性およびグラム陽性の細菌科および真菌が含まれるがそれらに限
定されない：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）、Ａｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｏｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ（例えば、Ａｎｔｈｒａｘ、Ｃｌｏ
ｓｔｒｉｄｉｕｍ）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｏｓ
ｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ、Ｃ
ａｎｄｉｄｉａｓｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｏ
ｍｙｃｏｓｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ、Ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅ
ｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍ
ｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔ
ｈｒｉｘ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌｏｓｉｓ、Ｌｅｐｔ
ｏｓｐｉｒｏｓｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ、Ｎ
ｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ（例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｏｎｏｒ
ｒｈｅａ、Ｍｅｎｉｇｏｃｏｃｃａｌ）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａ感染（
例えば、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐａｓｔｅ
ｕｒｅｌｌａ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ、Ｃ
ｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ、Ｓｙｐｈｉｌｉｓ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃａｌ。これらの細菌科または真菌科は、以下を含むがそれらに限定されない疾
患または症状を生じ得る：菌血症、心内膜炎、眼感染（結膜炎、結核症、ブドウ
膜炎）、歯肉炎、日和見感染（例えば、ＡＩＤＳ関連感染）、爪周囲炎、人工器
官関連感染、ライター病、気道感染（例えば、百日咳または蓄膿症）、敗血症、
ライム病、ネコ引っ掻き病、赤痢、パラチフス熱、食中毒、腸チフス、肺炎、淋
病、髄膜炎、クラミジア、梅毒、ジフテリア、らい病、パラ結核、結核、狼瘡、
ボツリヌス中毒、壊疽、破傷風、膿痂疹、リウマチ熱、猩紅熱、性感染病、皮膚
病（例えば、蜂巣炎、皮膚嚢腫（ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ））、毒血症、
尿路感染症、創傷感染。ＰＤＥＦポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、これ
らの症状または疾患のうちのいずれかを処置または検出するために使用され得る
。
【０１３３】 さらに、ＰＤＥＦポリヌクレオチドまたはポリペプチドによって処置または検
出され得る疾患または症状を生じる寄生虫性因子は、以下の科を含むがそれらに
限定されない：Ａｍｅｂｉａｓｉｓ、Ｂａｂｅｓｉｏｓｉｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏ
ｓｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｏｓｉｓ、Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂｉａｓｉ
ｓ、Ｄｏｕｒｉｎｅ、Ｅｃｔｏｐａｒａｓｉｔｉｃ、Ｇｉａｒｄｉａｓｉｓ、Ｈ
ｅｌｍｉｎｔｈｉａｓｉｓ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｓｉｓ、Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ
ｓｉｓ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｉａｓｉｓ、およ
びＴｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ。これらの寄生虫は、以下を含むがそれらに限定され
ない種々の疾患または症状を生じ得る：疥癬、ツツガムシ病、眼感染、腸疾患（
例えば、赤痢、ジアルジア鞭毛虫症）、肝臓疾患、肺疾患、日和見感染（例えば
、ＡＩＤＳ関連）、マラリア、妊娠合併症、およびトキソプラスマ症。ＰＤＥＦ
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、任意のそれらの症状または疾患を処置
または検出するために使用され得る。
【０１３４】 好ましくは、ＰＤＥＦポリペプチドまたはポリヌクレオチドを使用する処置は
、有効量のＰＤＥＦポリペプチドを患者へ投与することによって、または患者か
ら細胞を取り出し、この細胞にＰＤＥＦポリヌクレオチドを供給し、そしてこの
操作した細胞をこの患者に戻すこと（エキソビボ治療）によってのいずれかであ
り得る。さらに、ＰＤＥＦポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、ワクチン中
の抗原として使用され、感染性疾患に対する免疫応答を惹起し得る。
【０１３５】 （再生） ＰＤＥＦポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、細胞を分化、増殖、および
誘引し、組織の再生を導く遺伝子の発現を改変するために使用され得る。（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２７６：５９〜８７（１９９７）を参照のこと）。組織の再生は、
先天性欠陥、外傷（創傷、熱傷、切開、または潰瘍）、年齢、疾患（例えば、骨
粗鬆症、変形性関節症（ｏｓｔｅｏｃａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、歯周疾患、肝不全
）、手術（美容形成外科手術を含む）、線維症、再灌流傷害、または全身性サイ
トカイン損傷によって損傷を受けた組織を修復、置換、または保護するために使
用され得る。
【０１３６】 本発明を用いて再生され得る組織には、器官（例えば、膵臓、肝臓、腸、腎臓
、皮膚、内皮）、筋肉（平滑筋、骨格筋、または心筋）、脈管系（脈管内皮を含
む）、神経、造血組織、および骨格組織（骨、軟骨、腱、および靱帯）が挙げら
れる。好ましくは、再生は、瘢痕がないか、または瘢痕が減少して生じる。再生
にはまた、新脈管形成が挙げられ得る。
【０１３７】 さらにＰＤＥＦポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、治癒するのが困難な
組織の再生を増加させ得る。例えば、増加した腱／靭帯の再生は、損傷後の回復
時間を早める。本発明のＰＤＥＦポリヌクレオチドまたはポリペプチドはまた、
損傷を回避する努力において予防的に使用され得る。処置され得る特定の疾患に
は、腱炎、手根管症候群、および他の腱欠損または靭帯欠損が挙げられる。非治
癒創傷の組織再生のさらなる例には、圧迫潰瘍（ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｕｌｃｅｒ
）、血管不全と関連する潰瘍、外科的創傷、および外傷性創傷が挙げられる。
【０１３８】 同様に、神経および脳組織はまた、神経細胞を増殖および分化させるためにＰ
ＤＥＦポリヌクレオチドまたはポリペプチドを使用することによって再生され得
る。この方法を用いて処置され得る疾患には、中枢神経系疾患および末梢神経系
疾患、ニューロパシー、または機械的障害および外傷性障害（例えば、脊髄障害
、頭部外傷、脳血管疾患、および発作（ｓｔｏｋｅ））が挙げられる。特に、末
梢神経傷害と関連する疾患、末梢性ニューロパシー（例えば、化学療法または他
の医学的療法から生じる）、局在化されたニューロパシー、および中枢神経系疾
患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン病、筋萎縮
性側索硬化症、およびシャイ−ドレーガー症候群）はすべて、ＰＤＥＦポリヌク
レオチドまたはポリペプチドを用いて処置され得る。
【０１３９】 （走化性） ＰＤＥＦポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、走化性活性を有する遺伝子
の発現を変化させ得る。走化性分子は、身体中の特定の部位（例えば、炎症、感
染、または過剰増殖性の部位）に、細胞（例えば、単球、線維芽細胞、好中球、
Ｔ細胞、マスト細胞、好酸球、上皮細胞、および／または内皮細胞）を誘引また
は動員させる。次いで、動員された細胞は、特定の外傷または異常を撃退および
／または治癒し得る。
【０１４０】 ＰＤＥＦポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、特定の細胞の走化性活性を
増大し得る。次いで、これらの走化性分子は、身体中の特定の位置に標的化され
る細胞の数を増加させることによって、炎症、感染、過剰増殖性障害、または任
意の免疫系障害を処置するために使用され得る。例えば、走化性分子は、免疫細
胞を傷害を受けた位置に誘引することによって、組織に対する創傷および他の外
傷を処置するために使用され得る。走化性分子として、ＰＤＥＦはまた、創傷を
処置するために使用され得る線維芽細胞を誘引し得る。
【０１４１】 ＰＤＥＦポリヌクレオチドまたはポリペプチドは走化性活性を阻害し得ること
もまた意図される。これらの分子はまた、障害を処置するために使用され得る。
従って、ＰＤＥＦポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、走化性のインヒビタ
ーとして使用され得る。
【０１４２】 （結合活性） ＰＤＥＦポリペプチドは、ＰＤＥＦに結合するタンパク質、またはＰＤＥＦが
結合するタンパク質をスクリーニングするために使用され得る。ＰＤＥＦと分子
との結合は、結合したＰＤＥＦまたは分子の活性を活性化（アゴニスト）、増大
、阻害（アンタゴニスト）、または減少させ得る。そのような分子の例は、抗体
、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば、レセプター）、または低分子を含
む。
【０１４３】 好ましくは、分子は、ＰＤＥＦの天然のリガンド（例えば、リガンドのフラグ
メント）、または天然の基質、リガンド、構造的模倣物、もしくは機能的模倣物
に密接に関連する（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）： 第５章（１９９１）を参照のこと）
。同様に、分子は、ＰＤＥＦが結合する天然のレセプター、または少なくともＰ
ＤＥＦによって結合され得るレセプターのフラグメント（例えば、活性部位）に
密接に関連し得る。いずれの場合においても、分子は、公知の技術を用いて合理
的に設計され得る。
【０１４４】 好ましくは、これらの分子についてのスクリーニングは、ＰＤＥＦを、分泌タ
ンパク質としてまたは細胞膜上でのいずれかで発現する適切な細胞を産生する工
程を包含する。好ましい細胞は、哺乳動物、酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、また
はＥ．ｃｏｌｉ由来の細胞を含む。次いで、ＰＤＥＦを発現する細胞（または、
発現されたポリペプチドを含む細胞膜）は、好ましくは、ＰＤＥＦまたは分子の
いずれかの結合、刺激、または活性の阻害を観察するための分子を潜在的に含む
試験化合物と接触される。
【０１４５】 アッセイは、ＰＤＥＦへの候補化合物の結合を簡単に試験し得、ここで結合は
、標識によって、または標識された競合物との競合に関するアッセイにおいて検
出される。さらに、アッセイは、候補化合物がＰＤＥＦへの結合によって生成さ
れるシグナルを生じるか否かを試験し得る。
【０１４６】 あるいは、アッセイは、細胞を含まない調製物、固体支持体に固定されたポリ
ペプチド／分子、化学ライブラリー、または天然産物の混合物を用いて実施され
得る。アッセイはまた、ＰＤＥＦを含む溶液を候補化合物と混合する工程、ＰＤ
ＥＦ／分子の活性または結合を測定する工程、およびＰＤＥＦ／分子の活性また
は結合を、標準と比較する工程を簡単に包含し得る。
【０１４７】 好ましくは、ＥＬＩＳＡアッセイは、モノクローナル抗体またはポリクローナ
ル抗体を用いて、サンプル（例えば、生物学的サンプル）におけるＰＤＥＦのレ
ベルまたは活性を測定し得る。抗体は、ＰＤＥＦへの直接的もしくは間接的な結
合のいずれか、またはＰＤＥＦとの基質についての競合によって、ＰＤＥＦのレ
ベルまたは活性を測定し得る。
【０１４８】 これらの上記のアッセイのすべては、診断マーカーまたは予後マーカーとして
使用され得る。これらのアッセイを用いて発見される分子は、ＰＤＥＦ／分子を
活性化または阻害することによって、疾患を処置するか、または患者における特
定の結果（例えば、血管増殖）をもたらすために使用され得る。さらに、アッセ
イは、適切に操作された細胞または組織からのＰＤＥＦの産生を阻害または増強
し得る因子を発見し得る。
【０１４９】 従って、本発明は、以下の工程を含むＰＤＥＦに結合する化合物を同定する方
法を包含する：（ａ）候補結合化合物をＰＤＥＦとともにインキュベートする工
程；および（ｂ）結合が生じたか否かを決定する工程。さらに、本発明は、以下
の工程を含むアゴニスト／アンタゴニストを同定する方法を包含する：（ａ）候
補化合物をＰＤＥＦとともにインキュベートする工程、（ｂ）生物学的活性をア
ッセイする工程、および（ｂ）ＰＤＥＦの生物学的活性が改変されているか否か
を決定する工程。
【０１５０】 （他の活性） ＰＤＥＦポリペプチドまたはポリヌクレオチドはまた、上記で議論したように
、造血系統以外の胚幹細胞の分化または増殖を増加または低減させる遺伝子の発
現を変化させ得る。
【０１５１】 ＰＤＥＦポリペプチドまたはポリヌクレオチドはまた、身長、体重、髪の色、
眼の色、皮膚、脂肪組織の割合、色素沈着、サイズ、および形のような哺乳動物
の特徴を調節するため（例えば、美容手術）に使用され得る。同様に、ＰＤＥＦ
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、異化作用、同化作用、プロセシング、
利用、およびエネルギー貯蔵に影響を及ぼす哺乳動物代謝を調節するために使用
され得る。
【０１５２】 ＰＤＥＦポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、バイオリズム、概日リズム
（ｃａｒｉｃａｄｉｃ ｒｈｙｔｈｍ）、うつ病（抑うつ性障害を含む）、暴力
の傾向、痛みに対する耐性、生殖能力（好ましくは、アクチビン様活性またはイ
ンヒビン様活性による）、ホルモンレベルまたは内分泌レベル、食欲、性欲、記
憶、ストレス、または他の認識の質に影響を及ぼすことによって、哺乳動物の精
神状態または身体的状態を変化させるために使用され得る。
【０１５３】 ＰＤＥＦポリペプチドまたはポリヌクレオチドはまた、例えば、貯蔵能力、脂
肪含量、脂質、タンパク質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、補因子、または他
の栄養成分を増加または低減するための、食物添加剤または保存剤として使用さ
れ得る。
【０１５４】 ＰＤＥＦポリペプチドまたはポリヌクレオチドを使用して、ｃＤＮＡアレイ転
写プロフィーリングによって、新規な標的遺伝子を同定し得る。
【０１５５】 ＰＤＥＦポリペプチドまたはポリヌクレオチドを使用して、ＰＤＥＦを標的と
するＤＮＡ配列を同定し得る。
【０１５６】 ＰＤＥＦポリペプチドまたはポリヌクレオチドを使用して、前立腺特異プロモ
ーターを、前立腺特異遺伝子治療のための道具として、同定し得る。例えば、Ｐ
ＤＥＦのプロモーターを、コード配列と融合させると、そのコード配列の前立腺
特異発現を与え得る。
【０１５７】 本発明を一般的に記載したが、本発明は、以下の実施例を参照してより容易に
理解される。この実施例は、例示の目的で提供され、そして限定を意図されない
。
【０１５８】 （実施例） （実施例１：ＰＤＥＦ ｃＤＮＡクローンの寄託されたサンプルからの単離
） ＰＤＥＦについてのｃＤＮＡを、ｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ．）のＥｃｏＲＩマ
ルチクローニング部位に挿入する。ｐＣＩはアンピシリン耐性遺伝子を含み、そ
してＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能であるＥ．ｃｏｌｉ Ｄ
Ｈ１０Ｂ株に形質転換し得る。（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ，Ｃ．Ｅ．ら、Ｆｏｃｕ
ｓ １５：５９−（１９９３）を参照のこと）。
【０１５９】 寄託されたサンプルからＰＤＥＦを単離するために２つのアプローチが使用さ
れ得る。第一に、３０〜４０ヌクレオチドを有する配列番号１の特定のポリヌク
レオチドを、報告されている配列に従って、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓのＤＮＡ合成装置を使用して合成する。オリゴヌクレオチドを、例えば、32 Ｐ−γ−ＡＴＰで、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて標識し、そして慣用
の方法に従って精製する。（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ、ＮＹ（１９８
２））。プラスミド混合物を、当業者に公知の技術（例えば、ベクター供給業者
によって提供される技術または関連の刊行物もしくは特許において提供される技
術）を用いて、適切な宿主（例えば、ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ））に形質転換する。形質転換体を１．５％寒天プレート（適切な選択薬剤、
例えば、アンピシリンを含む）に、１プレートあたり約１５０の形質転換体（コ
ロニー）の密度でプレートする。これらのプレートを、細菌コロニースクリーニ
ングについての慣用の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、（１９
８９）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒ
ｅｓｓ、１．９３〜１．１０４頁）または当業者に公知の他の技術に従って、ナ
イロンメンブレンを使用してスクリーニングする。
【０１６０】 あるいは、配列番号１の両端（すなわち、クローンの５’ＮＴおよび３’ＮＴ
によって囲まれる配列番号１の領域内）に由来する、１７〜２０ヌクレオチドの
２つのプライマーを合成し、そしてこれらを使用して、寄託されたｃＤＮＡプラ
スミドを鋳型として用いて、ＰＤＥＦ ｃＤＮＡを増幅する。ポリメラーゼ連鎖
反応を、慣用の条件下で、例えば、０．５μｇの上記ｃＤＮＡ鋳型との反応混合
物の２５μｌ中で実施する。簡便な反応混合物は、１．５〜５ｍＭ ＭｇＣｌ2
、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、それぞれ２０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＧＴＰ、ｄＴＴＰ、２５ｐｍｏｌの各プライマーおよび０．２５ユニットのＴａ
ｑポリメラーゼである。３５サイクルのＰＣＲ（９４℃での変性を１分間；５５
℃でのアニーリングを１分間；７２℃での伸長を１分間）を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ
ｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ自動化サーマルサイクラーを用いて実施する。増幅産物を
アガロースゲル電気泳動により分析し、そして予想される分子量のＤＮＡバンド
を切り出し、そして精製する。ＰＣＲ産物を、ＤＮＡ産物をサブクローニングお
よび配列決定することによって選択された配列であることを確認する。
【０１６１】 寄託されたクローンに存在しないかもしれないＰＤＥＦ遺伝子の５’非コード
部分または３’非コード部分の同定のために、いくつかの方法が利用可能である
。これらの方法は、以下を含むがこれらに限定されない：フィルタープロービン
グ、特異的プローブを使用するクローン富化、および当該分野で周知である５’
および３’「ＲＡＣＥ」プロトコルと類似するかまたは同一のプロトコル。例え
ば、５’ＲＡＣＥに類似する方法は、所望の全長転写物の５’末端の欠失を生成
するために利用可能である（Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１（７）：１６８３−１６８４（１９９３））。
【０１６２】 簡潔には、特定のＲＮＡオリゴヌクレオチドを、全長遺伝子ＲＮＡ転写物をお
そらく含むＲＮＡの集団の５’末端に連結する。連結されたＲＮＡオリゴヌクレ
オチドに特異的なプライマーおよび目的のＰＤＥＦ遺伝子の既知の配列に特異的
なプライマーを含むプライマーセットを使用して、ＰＤＥＦの全長遺伝子の５’
部分をＰＣＲ増幅する。次いで、この増幅した産物を配列決定し得、そしてこれ
を使用して全長遺伝子を生成し得る。
【０１６３】 この上記の方法は、ポリＡ＋ＲＮＡを使用し得るが、所望の供給源から単離さ
れた総ＲＮＡを用いて開始する。次いで、ＲＮＡ調製物を、必要ならばホスファ
ターゼで処理して、後のＲＮＡリガーゼ工程を妨害し得る分解または損傷ＲＮＡ
の５’リン酸基を排除し得る。次いで、ホスファターゼを不活化するべきであり
、そしてＲＮＡをメッセンジャーＲＮＡの５’末端に存在するキャップ構造を除
去するために、タバコ酸ピロホスファターゼを用いて処理するべきである。この
反応は、次いでＴ４ ＲＮＡリガーゼを用いてＲＮＡオリゴヌクレオチドに連結
され得る、キャップ切断ＲＮＡの５’末端に５’リン酸基を残す。
【０１６４】 この改変型ＲＮＡ調製物を、遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドを用いる、第
一鎖ｃＤＮＡ合成のための鋳型として使用する。第一鎖合成反応物を、連結され
たＲＮＡオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子の既知の
配列に特異的なプライマーを用いる、所望の５’末端のＰＣＲ増幅のための鋳型
として使用する。次いで、得られた生成物を配列決定し、そして分析して５’末
端配列がＰＤＥＦ遺伝子に属することを確認する。
【０１６５】 （実施例２：ＰＤＥＦゲノムクローンの単離） ヒトゲノムＰ１ライブラリー（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）
を、実施例１に記載される方法に従って、配列番号１に対応するｃＤＮＡ配列に
ついて選択されたプライマーを用いるＰＣＲによってスクリーニングする（Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋもまた参照のこと）。
【０１６６】 （実施例３：ＰＤＥＦポリペプチドの組織分布） ＰＤＥＦのｍＲＮＡ発現の組織分布を、とりわけ、Ｓａｍｂｒｏｏｋらによっ
て記載されるノーザンブロット分析についてのプロトコルを用いて決定する。例
えば、実施例１に記載される方法によって生成されるＰＤＥＦプローブを、Ｒｅ
ｄｉＰｒｉｍｅTM ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、製造者の指示に従って、Ｐ32で標識
する。標識後、プローブを、ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−１００TMカラム（Ｃｌｏ
ｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用して、製造者のプロ
トコル番号ＰＴ１２００−１に従って精製する。次いで、精製した標識プローブ
を使用して、種々のヒト組織をｍＲＮＡ発現について試験する。
【０１６７】 種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（ＩＭ）を含む多重組織ノーザン
（ＭＴＮ）ブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂTMハイブリ
ダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、製造者のプロトコル番号Ｐ
Ｔ１１９０−１に従って、標識化プローブで試験する。ハイブリダイゼーション
および洗浄後、ブロットをマウントして、そして−７０℃で一晩フィルムに曝露
し、そしてフィルムを標準的な手順に従って現像する。
【０１６８】 例えば、種々のヒト組織由来のポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡを、プローブとしてＰＤ
ＥＦ ｃＤＮＡを使用するノーザンブロットハイブリダイゼーションおよびドッ
トブロットハイブリダイゼーションによって分析した（図４を参照のこと）。ノ
ーザンブロットを、ＧＡＰＤＨプローブを用いて再びハイブリダイズして、ＲＮ
Ａの定性および定量について制御した。ハイブリダイゼーションについての条件
は、以下を含んだ：異なるヒト組織由来のポリ（Ａ）＋選択されたｍＲＮＡを含
むノーザンブロットおよびドットブロット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を、Ｑｕｉｃ
ｋＨｙｂ溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中でランダムプライム標識化ＰＤＥＦ、
ＥＳＥ−１、およびＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡを用いてハイブリダイズし、そして０
．２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて５０℃で洗浄した。
【０１６９】 この結果は、約２．０ｋｂの１つの顕著なＰＤＥＦ転写物の存在を示す。ＰＤ
ＥＦは、Ｅｔｓファミリーのいずれかのメンバーと著しく異なる発現パターンで
、前立腺において高度にかつほとんど独占的に発現される。ヒト胎児組織におい
て，ノーザンブロットハイブリダイゼーションによって、いずれの組織において
も発現は検出されなかった。成体組織において、前立腺は、最高レベルのＰＤＥ
Ｆを発現した。低レベルのＰＤＥＦ転写物を、卵巣、気管、および胃においての
み見出したが、他の全ての組織においては発現を検出しなかった。
【０１７０】 これらの結果は、ＰＤＥＦが非常に制限されたセットの組織において発現され
、従って非常に特定の機能を有することを示唆する。ＰＤＥＦの発現を別のＥｔ
ｓ因子の発現と比較するために、ノーザンブロットを、ＥＳＥ−１のためのｃＤ
ＮＡプローブを用いて再びハイブリダイズした。胎児組織において、ＥＳＥ−１
を、肺、肝臓および腎臓において発現した。成体組織において、最高レベルのＥ
ＳＥ−１を、小腸、前立腺、結腸、膵臓、腎臓、肝臓、および胎盤において見出
した。従って、ＥＳＥ−１の発現パターンは、胃腸系、胎児肺、およびいくつか
の他の上皮細胞組織における特に高いＥＳＥ−１発現を有するＰＤＥＦと著しく
異なる。
【０１７１】 さらに、ヒトＲＮＡの全パネルのドットブロット分析は、ＰＤＥＦの非常に制
限された発現パターンを確認し、このことは、ＰＤＥＦが前立腺において高度に
発現され、より低い程度で唾液腺および気管において発現され、そして乳腺、胃
、および肺において弱く発現されることを実証した（図５を参照のこと）。ＲＮ
Ａブロット（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ）を、ＱｕｉｃｋＨｙｂ溶液（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ）中でハイブリダイズし、そして０．２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用い
て５０℃で洗浄した。
【０１７２】 さらに、インサイチュハイブリダイゼーションを、ＰＤＥＦ発現が上皮細胞に
対して制限されるという仮説をさらに試験するために、ヒト前立腺の凍結切片に
対して実施した（図６を参照のこと）。インサイチュハイブリダイゼーション（
ＩＳＨ）を、以下の手順で実施した：組織を、リン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ７
．４（ＰＢＳ）中で、２〜４時間、４℃にて４％パラホルムアルデヒドで固定し
、次いで、４℃で一晩、ＰＢＳ中で３０％スクロースに移し、ＯＣＴ化合物（Ｍ
ｉｌｅｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ）中で凍結し、そし
て−７０℃で保存した。ＩＳＨを、６μｍの凍結切片に対して実施した。スライ
ドを、キシレンおよび格付けされたアルコール；０．２Ｍ ＨＣｌ；３ｍｃｇ／
ｍｌプロテイナーゼＫを有するＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ；０．２％グリシン；ＰＢＳ
中の４％パラホルムアルデヒド；１／２００（容量／容量）酢酸無水物を含有す
る０．１Ｍ トリエタノールアミン；および２×ＳＳＣに通した。スライドを、
以下の混合物中で、３５Ｓ−標識化リボプローブを用いて５０℃で一晩ハイブリ
ダイズした：０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．６、５ｍＭ
ＥＤＴＡ、５０％ホルムアミド、１０％ 硫酸デキストラン、０．１ｍｇ／ｍ
ｌ 酵母ｔＲＮＡ、および０．０１Ｍ ジチオトレイトール。ハイブリダイゼー
ション後、以下を含んで洗浄した：５０℃で、２×ＳＳＣ／５０％ホルムアミド
／１０ｍＭ ジチオトレイトール；３７℃で、２０ｍｃｇ／ｍｌリボヌクレアー
ゼを有する４×ＳＳＣ／１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／１ｍＭ ＥＤＴＡ；および６５℃
で、２×ＳＳＣ／５０％ホルムアミド／１０ｍＭ ジチオトレイトールならびに
２×ＳＳＣ。次いで、スライドを、０．３Ｍ 酢酸アンモニウムを含有する、格
付けされたアルコールによって脱水し、乾燥し、Ｋｏｄａｋ ＮＴＢ ２エマル
ジョンで被覆し、そして４℃で２週間、暗室で保存した。このエマルジョンを、
Ｋｏｄａｋ Ｄ １９発色剤を用いて発色させ、そしてスライドを、ヘマトキシ
リンを用いて対比染色した（Ｆｒｅｎｃｈ，Ｃ．Ｃ．、Ｖａｎ ｄｅ Ｗａｔｅ
ｒ，Ｌ．、Ｄｖｏｒａｋ，Ｈ．Ｆ．およびＨｙｎｅｓ，Ｒ．Ｏ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．１０９：９０３〜９１４（１９８９））。
【０１７３】 広範性の強力な発現は、前立腺の管腔上皮においてのみ留意されたが、他の細
胞型においては留意されなかった。シグナルはセンスコントロールプローブで検
出されなかった。これらの結果は、ＰＤＥＦが上皮細胞において独占的に発現さ
れ、前立腺における特に強力に発現するというデータをさらに支持する。
【０１７４】 異なる細胞型からのＰＤＥＦの発現を、初代細胞および癌由来の細胞株の両方
を使用する、異なる細胞型由来のｍＲＮＡを用いるＲＴ／ＰＣＲによって決定し
た。ＲＴ−ＰＣＲを、以下のプロトコルによって実施した：ｃＤＮＡを、デオキ
シリボヌクレアーゼ Ｉ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）処理したサンプル中で、オリゴ
ｄＴ１２〜１８プライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｇｒａ
ｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）およびＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ
ＢＲＬ）を使用して異なる細胞または組織から単離された１ｍｇのｍＲＮＡか
ら生成した。各ＰＣＲは、最終容量２５μｌに対して、等量（０．１ｎｇ）のｃ
ＤＮＡ、４ｎｇ／μｌの各プライマー、０．２５ユニットのＴａｑポリメラーゼ
（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）、１５０μＭの各ｄＮＴＰ
、３ｍＭのＭｇＣｌ2、反応緩衝液および水を使用し、そして鉱油で覆った。Ｇ
ＡＰＤＨに対するプライマーの配列は、以下：センス：５’−ＣＡＡＡＧＴＴＧ
ＴＣＡＴＧＧＡＴＧＡＣＣ−３’（配列番号１４を参照のこと）、アンチセンス
：５’ＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴＧＧＧＧ−３’（配列番号１５を参照のこ
と）であり、２００ｂｐの増幅産物を予測した。ＲＴ／ＰＣＲ増幅を、Ｐｅｒｋ
ｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓサーマルサイクラー４８０を使用して、以下のよ
うに実施した：９４℃で１分、５６℃で１分および７２℃で１分を２０〜３０サ
イクル、続いて７２℃で１５分。より少ないサイクル数を使用して、増幅シグナ
ルの線形性を確認した。この増幅産物を、２％アガロースゲル上で分析した。
【０１７５】 前立腺上皮癌由来の唯一の細胞であるＬＮＣａＰは、高レベルのＰＤＥＦ ｍ
ＲＮＡを発現したが、他の上皮細胞および非上皮細胞は、完全にＰＤＥＦ ｍＲ
ＮＡを欠いた。驚くべきことに、ヒト大動脈内皮細胞（臍静脈内皮細胞ではない
）もまた、低レベルのＰＤＥＦを発現した。従って、ＰＤＥＦは、別々かつ独特
の発現パターンを表し、主に前立腺上皮細胞に対して制限された。ＬＮＣａＰ細
胞を、Ｔ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｆｏｒｍｕｌａ Ｎｏ．９７−０２９５Ｄ
Ｊ）、１０％ ＦＣＳ、ＰＥＮ／ＳＴＲＥＰ中で増殖し、そしてこの細胞は、Ｄ
ｒ．Ｚ．Ｊ．Ｓｕｎ，Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｓｕｒｇｅｒｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ Ｓｔａｎｄｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅ
ｄｉｃｉｎｅによって提供された。
【０１７６】 （実施例４：ＰＤＥＦの染色体マッピング） オリゴヌクレオチドプライマーのセットを、配列番号１の５’末端の配列に従
って設計する。このプライマーは、好ましくは約１００ヌクレオチドにわたる。
次いで、このプライマーセットを、以下のセットの条件下でポリメラーゼ連鎖反
応に使用する：９５℃で３０秒；５６℃で１分；７０℃で１分。このサイクルを
３２回反復し、次いで１回、７０℃で５分間のサイクルを行う。個々の染色体ま
たは染色体フラグメントを含む体細胞ハイブリッドパネル（Ｂｉｏｓ，Ｉｎｃ）
に加えて、ヒト、マウス、およびハムスターのＤＮＡを鋳型として使用する。反
応物を、８％ポリアクリルアミドゲルまたは３．５％アガロースゲルのいずれか
で分析する。染色体マッピングを、特定の体細胞ハイブリッドにおける約１００
ｂｐのＰＣＲフラグメントの存在によって決定する。
【０１７７】 ＰＤＥＦは、種々のヒト癌におけるヘテロ接合の損失および染色体転座に関連
しているヒト第６染色体の領域に局在化した。ＰＤＥＦ遺伝子の正確な染色体位
置を、ヒト染色体中期スプレッドに対するシグナル−遺伝子蛍光インサイチュハ
イブリダイゼーションによって決定した。ディジテル化した画像を分析し、その
ほとんどは、第６染色体のホモログの両方に対する真のハイブリダイゼーション
のダブレットシグナルの特徴を有した。個々の染色体の詳細な分析は、ＰＤＥＦ
遺伝子が６ｐ２１バンド内に位置し、シグナルの大部分が６ｐ２１．３バンドに
クラスター化ことを示した。
【０１７８】 Ｅｔｓ因子は、腫瘍形成に直接関連している。このファミリーの異なるメンバ
ーは、遺伝子発現を活性化するかまたは抑制するかのいずれかなので、Ｅｔｓフ
ァミリーのいくつかのメンバーは、オンコジーンとして作用するようであるが、
その他のものは、腫瘍サプレッサーとして作用するようである。正常な対応物が
ＰＤＥＦを発現しない、癌細胞におけるＰＤＥＦの異常な発現が観察されている
。染色体６ｐ２１．３は、種々の型の癌に対して特に興味深い。染色体６ｐ２１
の非ランダムな構造異常性は、しばしば、ヒト腫瘍において観察され、そして非
ホジキンリンパ腫、小胞中心リンパ腫（ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｃｅｎｔｅｒ ｌｙ
ｍｐｈｏｍａ）、卵巣癌、多発性骨髄腫、頚部の癌、急性Ｔリンパ芽球性白血病
、子宮内膜癌、生殖細胞の腫瘍、神経膠腫、急性白血病、ＣＭＬ、および黒色腫
を含む多くのヒト癌に関連している。他のＥｔｓ因子が種々の型の腫瘍において
転座していることが示されているので、ＰＤＥＦはまた、ヒト癌における染色体
の異常性に関与し得る可能性がある。
【０１７９】 （実施例５：ＰＤＥＦの細菌性発現） 本発明のＰＤＥＦポリペプチドをコードするＰＤＥＦポリヌクレオチドを、実
施例１に概説するように、ＤＮＡ配列の５’および３’末端に対応するＰＣＲオ
リゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅し、挿入フラグメントを合成する。
ｃＤＮＡ挿入物を増幅するために使用されるプライマーは、発現ベクターに増幅
産物をクローン化するために、好ましくはプライマーの５’末端にＢａｍＨＩお
よびＸｂａＩのような制限部位を含むべきである。例えば、ＢａｍＨＩおよびＸ
ｂａＩは、細菌性発現ベクターｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔ
ｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）の制限酵素部位に対応する。このプラスミドベクターは、
抗生物質耐性（Ａｍｐr）、細菌の複製起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧで調節可能な
プロモーター／オペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６−
ヒスチジンタグ（６−Ｈｉｓ）、および制限酵素クローニング部位をコードする
。
【０１８０】 詳細には、細菌性ベクターにＰＤＥＦタンパク質をクローン化するために、配
列番号１におけるＰＤＥＦ配列の末端領域に特異的な配列の５’プライマーおよ
び３’ プライマーの両方を設計する。当然のことながら、５’プライマーが開
始するタンパク質コード配列中の点が、全長タンパク質よりも短いまたは長い完
全なＰＤＥＦタンパク質の任意の所望の部分をコードするＤＮＡセグメントを増
幅するために変更され得ることは、当業者に明らかである。さらに、記載のプラ
イマーは、次いで、ＰＣＲ方法論−細菌性ベクター内に存在する制限部位の利点
の利用によって、対応するｃＤＮＡ ＰＤＥＦクローン（配列番号１）を増幅す
るために使用され得、そして対応するＰＤＥＦ特異的プライマーの末端に付加さ
れる。
【０１８１】 例えば、ｐＱＥ−９ベクターをＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、そして、
増幅されたフラグメントを細菌性ＲＢＳにおいて開始されるリーディングフレー
ムを維持してｐＱＥ−９ベクターに連結する。次いで、連結混合物を、ｌａｃＩ
リプレッサーを発現し、またカナマイシン耐性（Ｋａｎr）を与えるプラスミド
ｐＲＥＰ４の多重コピーを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４（Ｑｉａｇｅ
ｎ，Ｉｎｃ．）を形質転換するために使用する。形質転換体を、それらがＬＢプ
レート上で生育する能力によって同定し、そしてアンピシリン／カナマイシン耐
性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、そして制限分析によって確
認する。
【０１８２】 所望の構築物を含むクローンを、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）およびＫａｎ（
２５μｇ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地における液体培養で一晩（Ｏ／Ｎ）
増殖させる。Ｏ／Ｎ培養物を、１：１００〜１：２５０の比で大量培養に接種す
るために使用する。細胞を、０．４〜０．６の間の光学密度６００（Ｏ．Ｄ．60 0 ）まで増殖させる。次いで、ＩＰＴＧ（イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクト
ピラノシド）を最終濃度１ｍＭになるように加える。ＩＰＴＧは、ｌａｃＩリプ
レッサーを不活化し、Ｐ／Ｏを一掃して、遺伝子発現の増加を導く。
【０１８３】 細胞を、さらに３〜４時間増殖させる。次いで、細胞を遠心分離（６０００×
ｇで２０分間）によって収集する。細胞ペレットを、カオトロピック剤である６
ＭグアニジンＨＣｌ中に、４℃で３〜４時間攪拌することによって可溶化させる
。細胞細片を遠心分離によって取り除き、そしてポリペプチドを含む上清を、ニ
ッケル−ニトリロ−三酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニティー樹脂カラムにロ
ードする（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．（前出）より入手可能）。６×Ｈｉｓタグを
有するタンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に高い親和性で結合し、そして単純な１
工程手順で精製され得る（詳細には、Ｔｈｅ ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓ
ｔ（１９９５）ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，（前出）を参照のこと）。
【０１８４】 手短に言えば、上清を、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ ８のカラムにロード
し、カラムを、最初に１０容量の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ ８で洗浄し、
次いで１０容量の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ ６で洗浄し、最後にポリペプ
チドを、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ ５で溶出する。
【０１８５】 次いで、精製したＰＤＥＦタンパク質を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）
または５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ ６の緩衝液および２００ｍＭ ＮａＣ
ｌに対して透析することにより再生させる。あるいは、ＰＤＥＦタンパク質はＮ
ｉ−ＮＴＡカラムに固定化している間に、首尾よく再折り畳みされ得る。推奨条
件は以下の通りである：プロテアーゼインヒビターを含む、５００ｍＭ ＮａＣ
ｌ、２０％ グリセロール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ ７．４中の６
Ｍ〜１Ｍ尿素の直線勾配を使用する再生。再生は、１．５時間以上の時間にわた
って行われるべきである。再生後、タンパク質を２５０ｍＭイミダゾールの添加
によって溶出する。イミダゾールを、ＰＢＳまたは５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、
ｐＨ ６の緩衝液および２００ｍＭ ＮａＣｌに対する最終の透析工程によって
除去する。精製したＰＤＥＦタンパク質を、４℃で保存するか、または−８０℃
で凍結する。
【０１８６】 上記の発現ベクターに加えて、本発明はさらに、ＰＤＥＦポリヌクレオチドに
作動可能に連結されたファージオペレーターおよびプロモーターエレメントを含
み、ｐＨＥ４ａと呼ばれる発現ベクターを含む（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４５
、１９９８年２月２５日に寄託）。このベクターは以下を含む：１）選択マーカ
ーとしてのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、２）Ｅ．ｃｏｌｉ複
製起点、３）Ｔ５ファージプロモーター配列、４）２つのｌａｃオペレーター配
列、５）シャイン−ダルガーノ配列、および６）ラクトースオペロンリプレッサ
ー遺伝子（ｌａｑＩｑ）。複製起点（ｏｒｉＣ）は、ｐＵＣ１９（ＬＴＩ，Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に由来する。プロモーター配列およびオペレータ
ー配列を合成的に作製する。
【０１８７】 ＮｄｅＩおよびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、またはＡｓｐ７１８によっ
てベクターを制限処理し、制限生成物をゲルで泳動し、そしてより大きなフラグ
メント（スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）フラグメントは約３１０塩基対である
べきである）を単離することによって、ＤＮＡをｐＨＥａに挿入し得る。ＤＮＡ
挿入物を、ＮｄｅＩ（５’プライマー）およびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ
、またはＡｓｐ７１８（３’プライマー）に対する制限部位を有するＰＣＲプラ
イマーを使用して、実施例１に記載されるＰＣＲプロトコルに従って生成する。
ＰＣＲ挿入物を、ゲル精製し、そして適合する酵素で制限処理する。挿入物およ
びベクターを、標準的なプロトコールに従って連結する。
【０１８８】 操作されたベクターは、上記のプロトコールにおいて、細菌系でタンパク質を
発現させるために容易に置換され得る。
【０１８９】 （実施例６：封入体からのＰＤＥＦポリペプチドの精製） 以下の別の方法は、ＰＤＥＦポリペプチドが封入体の形態で存在する場合に、
Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現されたＰＤＥＦポリペプチドを精製するために使用され得
る。他に指定されない場合には、以下のすべての工程は４〜１０℃で行われる。
【０１９０】 Ｅ．ｃｏｌｉ発酵の生産期の完了後、細胞培養物を４〜１０℃に冷却し、そし
て１５，０００ｒｐｍの連続遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｓｅｐａｔｅｃｈ）に
よって細胞を収集する。細胞ペーストの単位重量あたりのタンパク質の予想され
る収量および必要とされる精製タンパク質の量に基づいて、細胞ペーストの適切
な量（重量による）を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．
４を含む緩衝溶液中に懸濁する。細胞を、高剪断ミキサーを使用して均質な懸濁
液に分散させる。
【０１９１】 次いで、細胞をマイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（
Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｃｏｒｐ．またはＡＰＶ Ｇａｕｌｉｎ，Ｉｎｃ
．）に２回、４０００〜６０００ｐｓｉで溶液を通すことによって溶解させる。
次いでホモジネートを、最終濃度０．５Ｍ ＮａＣｌになるようにＮａＣｌ溶液
と混合し、続いて７０００×ｇで１５分間遠心分離を行う。得られたペレットを
、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．
４を使用して再度洗浄する。
【０１９２】 得られた洗浄した封入体を、１．５Ｍ 塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）で２〜
４時間可溶化する。７０００×ｇで１５分間の遠心分離の後、ペレットを廃棄し
、そしてポリペプチドを含む上清を４℃で一晩インキュベートしてさらなるＧｕ
ＨＣｌ抽出を可能にする。
【０１９３】 不溶性粒子を除去するための高速遠心分離（３０，０００×ｇ）に続き、Ｇｕ
ＨＣｌ可溶化タンパク質を、ＧｕＨＣｌ抽出物と、５０ｍＭ ナトリウム、ｐＨ
４．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０容量の緩衝液とを
、激しい攪拌で迅速に混合することによって、再折畳みさせる。再折畳みした希
釈タンパク質溶液を、さらなる精製工程の前の１２時間、混合しないで４℃で保
つ。
【０１９４】 再折畳みされたポリペプチド溶液を清澄化するために、予め準備した、４０ｍ
Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０で平衡化した適切な表面積を有する０．１６μｍ
メンブレンフィルターを備える接触濾過ユニット（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｉ
ｌｔｒａｔｉｏｎ ｕｎｉｔ）（例えば、Ｆｉｌｔｒｏｎ）を、使用する。濾過
したサンプルを、カチオン交換樹脂（例えば、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ−５０，Ｐｅｒ
ｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上にロードする。カラムを４０ｍＭ
酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０で洗浄し、そして同じ緩衝液中の２５０ｍＭ、５０
０ｍＭ、１０００ｍＭ、および１５００ｍＭ ＮａＣｌを用いて、段階的な様式
で溶出する。溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度を継続的にモニターする。画分
を収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによってさらに分析する。
【０１９５】 次いでＰＤＥＦポリペプチドを含む画分をプールし、そして４容量の水と混合
する。次いで希釈されたサンプルを、あらかじめ準備した強アニオン（Ｐｏｒｏ
ｓ ＨＱ−５０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および弱アニ
オン（Ｐｏｒｏｓ ＣＭ−２０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
）交換樹脂の直列カラムのセットにロードする。カラムを４０ｍＭ 酢酸ナトリ
ウム、ｐＨ６．０で平衡化する。両方のカラムを、４０ｍＭ 酢酸ナトリウム、
ｐＨ６．０、２００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄する。次いでＣＭ−２０カラムを１０
カラム容量の直線的勾配（０．２Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐ
Ｈ６．０から１．０Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６．５の範
囲）を用いて溶出させる。画分を、溶出液の定常Ａ280モニタリング下で収集す
る。次いで、（例えば、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した）ポリペプチ
ドを含む画分をプールする。
【０１９６】 得られたＰＤＥＦポリペプチドは、上記の再折畳み工程および精製工程の後に
９５％より高い純度を示すべきである。５μｇの精製タンパク質がロードされる
場合、いかなる主たる夾雑バンドも、クマシーブルー染色した１６％ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥゲルから観察されるべきではない。精製ＰＤＥＦタンパク質はまた、エン
ドトキシン／ＬＰＳ夾雑物について試験され得、そして代表的には、ＬＰＳ含量
はＬＡＬアッセイに従って、０．１ｎｇ／ｍｌ未満である。
【０１９７】 （実施例７：バキュロウイルス発現系におけるＰＤＥＦのクローニングおよび
発現） この実施例では、ＰＤＥＦを発現するために、プラスミドシャトルベクターｐ
Ａ２を使用してＰＤＥＦポリヌクレオチドをバキュロウイルスに挿入する。この
発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多核体病ウ
イルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、続いてＢａｍＨＩ
、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８のような便利な制限部位を含む。シミアンウイ
ルス４０（「ＳＶ４０」）のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化の
ために使用する。組換えウイルスの容易な選択のために、プラスミドは、同方向
にある弱いＤｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモーターの制御下でＥ．ｃｏｌｉ由来のβ
−ガラクトシダーゼ遺伝子、続いてポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナ
ルを含む。挿入された遺伝子は両方の側で、クローン化したＰＤＥＦポリヌクレ
オチドを発現する生存可能なウイルスを生成するために、野生型ウイルスＤＮＡ
との細胞媒介性の相同組換えのためのウイルス配列と隣接する。
【０１９８】 他の多くのバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１
、およびｐＡｃＩＭ１）は、当業者が容易に理解するように、構築物が転写、翻
訳、分泌など（必要とされる場合、シグナルペプチドおよびインフレームなＡＵ
Ｇを含む）のために適切に配置されたシグナルを提供する限りにおいて、上記の
ベクターの代わりに使用され得る。このようなベクターは、例えば、Ｌｕｃｋｏ
ｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９（１９８９）に記載される。
【０１９９】 具体的には、寄託されたクローンに含まれるＰＤＥＦ ｃＤＮＡ配列（これは
、ＡＵＧ開始コドンを含む）を、実施例１に記載されるＰＣＲプロトコルを使用
して増幅させる。あるいは、ベクターは、Ｓｕｍｍｅｒｓら（「Ａ Ｍａｎｕａ
ｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ
ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ」
、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａ
ｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７））に記載される標準
的な方法を用いて、バキュロウイルスリーダー配列を含むように改変され得る（
ｐＡ２ ＧＰ）。
【０２００】 より詳細には，ＡＵＧ開始コドンを含む寄託されたクローンにおいて全長ＰＤ
ＥＦタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号１に示される）は、その遺
伝子の５’配列または３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー
を使用して増幅される。
【０２０１】 増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ
１０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）を使用して、１％アガロースゲル
から単離する。次いでフラグメントを適切な制限酵素で消化し、そして再び１％
アガロースゲルで精製する。
【０２０２】 プラスミドを対応する制限酵素で消化し、そして必要に応じて、当該分野で公
知の慣用の手順を用いて、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化し得る。
次いでＤＮＡを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０１ Ｉｎ
ｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）を使用して、１％アガロースゲルから単離する
。
【０２０３】 フラグメントおよび脱リン酸化したプラスミドを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用
いて互いに連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１または他の適切なＥ．ｃｏｌｉ
宿主（例えば、ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ））細胞を、連結混合液で形質転換し
、そして培養プレート上に拡げる。プラスミドを含む細菌を、個々のコロニー由
来のＤＮＡを消化し、そして消化産物をゲル電気泳動によって分析することによ
り同定する。クローン化したフラグメントの配列をＤＮＡ配列決定によって確認
する。
【０２０４】 このポリヌクレオチドを含む５μｇのプラスミドを、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７（１９
８７）によって記載されたリポフェクション法を使用して、１．０μｇの市販の
線状化バキュロウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTM ｂａｃｕｌｏｖｉ
ｒｕｓ ＤＮＡ」，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と共に
同時トランスフェクトする。１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTMウイルスＤＮＡお
よび５μｇのプラスミドを、５０μｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含むマイ
クロタイタープレートの滅菌したウェル中で混合する。その後、１０μｌのリポ
フェクチンおよび９０μｌグレース培地を加え、混合し、そして室温で１５分間
インキュベートする。次いで、トランスフェクション混合液を、無血清グレース
培地１ｍｌを加えた３５ｍｍ組織培養プレートに播種したＳｆ９昆虫細胞（ＡＴ
ＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下して加える。次いで、プレートを２７℃で５時
間インキュベートする。次いで、トランスフェクション溶液をプレートから除去
し、そして１０％ウシ胎仔血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加する
。次いで培養を２７℃で４日間継続する。
【０２０５】 ４日後上清を収集し、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）によって記載
されたようにプラークアッセイを行う。「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を含むアガロー
スゲルを、ｇａｌ発現クローン（青色に着色したプラークを生ずる）の容易な同
定および単離を可能にするために使用する（この型の「プラークアッセイ」の詳
細な説明はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈ
ｅｒｓｂｕｒｇ，（９−１０頁）によって配布される、昆虫細胞培養およびバキ
ュロウイルス学のための使用者ガイドの中に見出され得る）。適切なインキュベ
ーションの後、青色に着色したプラークをマイクロピペッター（例えば、Ｅｐｐ
ｅｎｄｏｒｆ）のチップで拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、２００
μｌのグレース培地を含む微小遠心分離チューブ中で再懸濁させ、そして組換え
バキュロウイルスを含む懸濁液を、３５ｍｍディッシュに播種したＳｆ９細胞に
感染させるために使用する。４日後、これらの培養ディッシュの上清を収集し、
次いで４℃で貯蔵する。
【０２０６】 ポリペプチドの発現を確認するために、１０％熱非働化ＦＢＳを補充したグレ
ース培地中でＳｆ９細胞を増殖させる。細胞を、約２の感染多重度（「ＭＯＩ」
）でポリヌクレオチドを含む組換えバキュロウイルスに感染させる。放射性標識
したタンパク質を所望する場合には、６時間後に培地を除去し、そしてメチオニ
ンおよびシステインを含まないＳＦ９００ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手可能）に置き換え
る。４２時間後、５μＣｉの35Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉの35Ｓ−システイ
ン（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）を添加する。細胞をさらに１６時間インキ
ュベートし、次いで遠心分離によって採集する。上清中のタンパク質および細胞
内タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで（放射性標識した場合）オートラジ
オグラフィーによって分析する。
【０２０７】 精製タンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列の微量配列決定法を使用して、産
生されたＰＤＥＦタンパク質のアミノ末端配列を決定し得る。
【０２０８】 （実施例８：哺乳動物細胞におけるＰＤＥＦの発現） ＰＤＥＦポリペプチドを、哺乳動物細胞中で発現させ得る。代表的な哺乳動物
発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を仲介するプロモーターエレメント、タ
ンパク質コード配列、および転写の終結および転写物のポリアデニル化に必要な
シグナルを含む。さらなるエレメントは、エンハンサー、コザック配列、および
、ＲＮＡスプライシングのドナーおよびアクセプター部位に隣接する介在配列を
含む。非常に効率的な転写は、ＳＶ４０由来の初期および後期プロモーター、レ
トロウイルス（例えばＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩ）由来の長末端反復（ＬＴ
Ｒ）、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターを用いて達成
される。しかし、細胞内エレメント（例えば、ヒトアクチンプロモーター）もま
た、使用され得る。
【０２０９】 本発明を実施する際の使用に適切な発現ベクターは、例えば、ｐＳＶＬおよび
ｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃ
ａｔ（ＡＴＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、
ｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ２．０、ならび
にｐＣＭＶＳｐｏｒｔ３．０のようなベクターを含む。使用され得る哺乳動物宿
主細胞は、ヒトＨｅｌａ細胞、２９３細胞、Ｈ９細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞、
マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ１細胞、Ｃｏｓ７細胞およ
びＣＶ１細胞、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞、ならびにチャイニーズハ
ムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む。
【０２１０】 あるいは、ＰＤＥＦポリペプチドは、染色体に組み込まれたＰＤＥＦポリヌク
レオチドを含む、安定な細胞株中で発現され得る。ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ネオマイ
シン、ハイグロマイシンのような選択マーカーを用いる同時トランスフェクショ
ンは、トランスフェクトされた細胞の同定および単離を可能にする。
【０２１１】 トランスフェクトされたＰＤＥＦ遺伝子はまた、大量のコードされたタンパク
質を発現するために増幅され得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マー
カーは、目的の遺伝子の数百または数千ものコピーを有する細胞株の開発に有用
である（例えば、Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３
５７−１３７０（１９７８）；Ｈａｍｌｉｎ，Ｊ．Ｌ．およびＭａ，Ｃ．、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１０９７：１０７−１４３（１
９９０）：Ｐａｇｅ，Ｍ．Ｊ．およびＳｙｎｄｅｎｈａｍ，Ｍ．Ａ．、Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：６４−６８（１９９１）を参照のこと）。別の有用な
選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（Ｍｕｒｐｈｙら、
Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２２７：２７７−２７９（１９９１）；Ｂｅｂｂｉｎｇｔ
ｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９−１７５（１９９２））
。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地中で増殖させ、そして
最も高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は、染色体に組み込まれ
た、増幅された遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およ
びＮＳＯ細胞は、タンパク質の産生のためにしばしば使用される。
【０２１２】 プラスミドｐＳＶ２−ＤＨＦＲ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘導体であ
る、発現ベクターｐＣ４（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４６）およびｐＣ６（ＡＴ
ＣＣ受託番号２０９６４７）は、ラウス肉腫ウイルス（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４３８−４４７（
１９８５年３月））の強力なプロモーター（ＬＴＲ）およびＣＭＶエンハンサー
（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０（１９８５））のフラグ
メントを含む。例えば、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＡｓｐ７１８の制限酵素切
断部位を有するマルチクローニングサイトは、ＰＤＥＦのクローニングを容易に
する。ベクターはまた、３’イントロン、ラットプレプロインシュリン遺伝子の
ポリアデニル化および終結シグナル、ならびにＳＶ４０初期プロモーターの制御
下にあるマウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。
【０２１３】 具体的には、プラスミドｐＣ６を、適切な制限酵素によって消化し、次いで当
該分野で公知の手順よって、仔ウシ腸ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を
使用して脱リン酸化する。次いで、ベクターを１％アガロースゲルから単離する
。
【０２１４】 ＰＤＥＦポリヌクレオチドは、実施例１に概説するプロトコルに従って増幅さ
れる。ＰＤＥＦは天然に分泌されないので、ベクターはシグナルペプチドを必要
としない。あるいは、天然に存在するシグナル配列が使用されない場合には、ベ
クターは異種シグナル配列を含むように改変され得る（例えば、ＷＯ９６／３４
８９１を参照のこと）。
【０２１５】 増幅フラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ １０
１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を使用して１％アガロースゲルから
単離する。次いで、フラグメントを適切な制限酵素で消化し、そして再び１％ア
ガロースゲル上で精製する。
【０２１６】 次いで、増幅フラグメントを同じ制限酵素で消化し、そして１％アガロースゲ
ルで精製する。次いで、単離されたフラグメントおよび脱リン酸化したベクター
を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１また
はＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、そしてプラスミドｐＣ６に挿入された
フラグメントを含む細菌を、例えば、制限酵素分析を用いて同定する。
【０２１７】 活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠失するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トラン
スフェクションに使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ６を、リポフェクチン
を用いて、０．５μｇのプラスミドｐＳＶｎｅｏと共に同時トランスフェクトす
る（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは、優性選択マー
カーである、Ｇ４１８を含む抗生物質の群に対する耐性を付与する酵素をコード
するＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子を含む。細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充
したαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、細胞をトリプシン処理し、そして１
０、２５、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートおよび１ｍｇ／ｍｌのＧ４
１８を補充したαマイナスＭＥＭ中のハイブリドーマクローニングプレート（Ｇ
ｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に播種する。約１０〜１４日後、単一のクロ
ーンをトリプシン処理し、次いでメトトレキサートの異なる濃度（５０ｎＭ、１
００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を使用して、６ウェルのペト
リ皿または１０ｍｌのフラスコに播種する。次いで、メトトレキサートの最高濃
度で増殖するクローンを、さらに高い濃度（１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０ｍＭ
、２０ｍＭ）のメトトレキサートを含む新たな６ウェルプレートに移す。同じ手
順を、１００〜２００μＭの濃度で増殖するクローンが得られるまで繰り返す。
ＰＤＥＦの発現を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによっ
て、または逆相ＨＰＬＣ分析によって分析する。
【０２１８】 （実施例９：Ｎ末端および／またはＣ末端欠失変異体の構築） 以下の一般的な方法を使用して、Ｎ末端またはＣ末端欠失ＰＤＥＦ欠失変異体
をクローン化し得る。一般に、約１５〜２５ヌクレオチドの２つのオリゴヌクレ
オチドプライマーは、配列番号１のポリヌクレオチドの所望の５’および３’位
置に由来する。プライマーの５’および３’の位置を、所望のＰＤＥＦポリヌク
レオチドフラグメントに基づいて決定する。開始コドンおよび終止コドンを、必
要ならば、ポリヌクレオチドフラグメントによってコードされるＰＤＥＦポリぺ
プチドフラグメントを発現するように、５’および３’プライマーにそれぞれ加
える。好ましいＰＤＥＦポリヌクレオチドフラグメントは、本明細書中の「ポリ
ヌクレオチドフラグメントおよびポリぺプチドフラグメント」の節において上記
に開示される、Ｎ末端およびＣ末端の欠失変異体をコードするフラグメントであ
る。
【０２１９】 所望のベクター中でＰＤＥＦポリヌクレオチドフラグメントのクローニングを
容易にするための制限部位を含む、さらなるヌクレオチドもまた、５’および３
’プライマー配列に加え得る。ＰＤＥＦポリヌクレオチドフラグメントを、適切
なＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーならびに本明細書中で議論される条件も
しくは当該分野に公知の条件を使用して、ゲノムＤＮＡからまたは寄託されたｃ
ＤＮＡクローンから増幅する。本発明のＰＤＥＦポリヌクレオチドフラグメント
によってコードされるＰＤＥＦポリペプチドフラグメントは、同様の一般的な様
式で、完全長のポリぺプチドとして発現され得、そして精製され得るが、特定の
フラグメントと完全長のポリぺプチドとの間の化学的特徴および物理的特徴の相
違に起因して、慣用的な改変が必要とされ得る。
【０２２０】 本発明を限定しない例示的な手段としては、ＰＤＥＦポリペプチドフラグメン
ト（Ｐ−２４８〜Ｖ−３３２）をコードするポリヌクレオチドを、以下のように
増幅し、そしてクローン化する：配列番号２中のアミノ酸２４８を表すＰの開始
コドンで始まるポリぺプチドフラグメントのＮ末端部分をコードするポリヌクレ
オチド配列を用いて、インフレームで制限部位に続いて開始コドンを含む５’プ
ライマーを生成する。配列番号２中のアミノ酸３３２を示すＶで終了するＰＤＥ
ＦポリぺプチドフラグメントのＣ末端部分をコードするポリヌクレオチド配列を
用いて、インフレームで制限酵素部位に続いて終止コドンを含む相補的な３’プ
ライマーを生成する。
【０２２１】 増幅したポリヌクレオチドフラグメントおよび発現ベクターを、プライマー中
の部位を認識する制限酵素で消化する。次いで、消化したポリヌクレオチドを共
に連結する。ＰＤＥＦポリヌクレオチドフラグメントを、好ましくは、プロモー
ターから下流に、ＰＤＥＦポリペプチドフラグメントコード領域を配置する様式
で、制限処理された発現ベクターに挿入する。連結混合物を、標準的な手順を用
いて、および本明細書の実施例に記載されるようにコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細
胞中に形質転換する。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離し、そしてクロ
ーン化されたＤＮＡの同一性を制限分析、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定によって
確認する。
【０２２２】 （実施例１０：ＰＤＥＦのタンパク質融合） ＰＤＥＦポリぺプチドは、好ましくは、他のタンパク質に融合される。これら
の融合タンパク質は、種々の適用のために使用され得る。例えば、ＰＤＥＦポリ
ぺプチドの、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、プロテインＡ、ＩｇＧドメイン、およびマ
ルトース結合タンパク質への融合は、精製を容易にする（実施例５を参照のこと
；ＥＰ Ａ ３９４，８２７もまた参照のこと；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａ
ｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８））。同様に、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−
３、およびアルブミンへの融合は、インビボでの半減期を延長させる。ＰＤＥＦ
ポリぺプチドに融合した核局在化シグナルは、タンパク質を特定の細胞局在に標
的化し得る。一方、共有結合ヘテロダイマーまたはホモダイマーは、融合タンパ
ク質の活性を増大または減少させ得る。融合タンパク質はまた、１つより多い機
能を有するキメラ分子を作製し得る。最後に、融合タンパク質は、非融合タンパ
ク質と比較して、融合タンパク質の可溶性および／または安定性を増大させ得る
。上記の融合タンパク質の全ての型は、ポリぺプチドのＩｇＧ分子への融合を概
説する以下のプロトコール、または実施例５に記載されるプロトコールを改変す
ることによって作製され得る。
【０２２３】 手短に言えば、ＩｇＧ分子のヒトＦｃ部分は、以下に記載の配列の５’および
３’末端にわたるプライマーを使用してＰＣＲ増幅され得る。これらのプライマ
ーはまた、発現ベクター（好ましくは、哺乳動物発現ベクター）へのクローニン
グを容易にする都合の良い制限酵素部位を有するべきである。
【０２２４】 例えば、ｐＣ４（受託番号第２０９６４６号）が使用される場合、ヒトＦｃ部
分は、ＢａｍＨＩクローニング部位に連結され得る。３’ＢａｍＨＩ部位が破壊
されるべきであることに注意のこと。次に、ヒトＦｃ部分を含有するベクターが
、ＢａｍＨＩによって再び制限され、ベクターを線状化し、そして実施例１に記
載するＰＣＲプロトコールによって単離されたＰＤＥＦのポリヌクレオチドが、
このＢａｍＨＩ部位に連結される。このポリヌクレオチドは、終止コドンなしに
クローン化されるか、そうでなければ、融合タンパク質は産生されないことに注
意すること。
【０２２５】 分泌タンパク質が作製されるべき場合、このベクターは、異種シグナル配列を
含むように改変され得る（例えば、ＷＯ ９６／３４８９１を参照のこと）。 ヒト ＩｇＧのＦｃ領域：
【０２２６】
【化３】 （実施例１１：抗体の産生） 本発明の抗体は、種々の方法によって調製され得る。（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ，第２章を参照のこと。）例えば、ＰＤＥＦを発現する細胞は、
ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導するために動物に投与される。好ま
しい方法で、ＰＤＥＦタンパク質の調製物が調製され、そして精製されて、天然
の夾雑物を実質的に含まないようにする。次いで、このような調製物は、動物に
導入されて、より大きな比活性のポリクローナル抗血清を生成する。
【０２２７】 最も好ましい方法において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体（または、
そのタンパク質結合フラグメント）である。このようなモノクローナル抗体は、
ハイブリドーマ技術を使用して調製され得る（Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ
２５６：４９５（１９７５）；Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．６：５１１（１９７６）；Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．６：２９２（１９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓ
ｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．、５６３−６８１頁（１９８１））。一般に、このような
手順は、動物（好ましくは、マウス）をＰＤＥＦポリぺプチドで免疫すること、
またはより好ましくは、分泌ＰＤＥＦポリぺプチド発現細胞で免疫することを含
む。このような細胞は、任意の適切な組織培養培地において培養され得る；しか
し、１０％ウシ胎仔血清（約５６℃で非働化した）を補充し、そして約１０ｇ／
ｌの非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および約１００μｇ
／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＥａｒｌｅ改変Ｅａｇｌｅ培地において
細胞を培養することが好ましい。
【０２２８】 このようなマウスの脾細胞は抽出され、そして適切なミエローマ細胞株と融合
される。任意の適切なミエローマ細胞株は、本発明に従って用いられ得る；しか
し、ＡＴＣＣから入手可能な親ミエローマ細胞株（ＳＰ２Ｏ）を用いることが好
ましい。融合後、得られるハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地において選択的に
維持し、次いでＷａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２
５−２３２（１９８１））に記載されるように限界希釈によってクローニングす
る。次いで、このような選択によって得られるハイブリドーマ細胞は、ＰＤＥＦ
ポリぺプチドに結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイさ
れる。
【０２２９】 あるいは、ＰＤＥＦポリぺプチドに結合し得るさらなる抗体を、抗イディオタ
イプ抗体を使用して２段階工程の手順において生成し得る。このような方法は、
抗体それ自体が抗原であり、従って第二の抗体に結合する抗体を得ることが可能
であるという事実を利用する。この方法に従って、タンパク質特異的抗体を使用
して、動物（好ましくは、マウス）を免疫する。次いで、このような動物の脾細
胞を使用して、ハイブリドーマ細胞を産生する。そして、ハイブリドーマ細胞は
、ＰＤＥＦタンパク質特異的抗体に結合する能力がＰＤＥＦによってブロックさ
れ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニングされる。このよ
うな抗体は、ＰＤＥＦタンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含
み、そして動物を免疫してさらなるＰＤＥＦタンパク質特異的抗体の形成を誘導
するために使用され得る。
【０２３０】 ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに本発明の抗体の他のフラグメントは、本
明細書中で開示される方法に従って使用され得ることが理解される。このような
フラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生するため）
またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生するため）のような酵素を
使用して、タンパク質分解性切断によって産生される。あるいは、分泌されたＰ
ＤＥＦタンパク質結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用により、または
合成化学により産生され得る。
【０２３１】 ヒトにおける抗体のインビボ使用のために、「ヒト化」キメラモノクローナル
抗体を使用することが好ましくあり得る。このような抗体は、上記のモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝的構築物を使用すること
によって産生され得る。キメラ抗体を産生するための方法は当該分野で公知であ
る（総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（
１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；
Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、
ＥＰ １７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒ
ｇｅｒら、ＷＯ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ ８７０２６７１
；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕ
ｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと）。
【０２３２】 （実施例１２：高処理能力スクリーニングアッセイのためのＰＤＥＦタンパク
質の産生） 以下のプロトコルは、試験されるべきＰＤＥＦポリぺプチド、または遺伝子プ
ロモーターへのＰＤＥＦの結合により産生されるタンパク質を含有する上清を産
生する。次いで、この上清は、実施例１４〜２１に記載されるスクリーニングア
ッセイにおいて使用され得る。
【０２３３】 第一に、ポリ−Ｄ−リジン（６４４ ５８７ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ）ストック溶液（ＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍｌ）を、ＰＢＳ（カルシウム
もマグネシウムも含まない１７−５１６Ｆ Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で１
：２０に希釈して、作業溶液５０μｇ／ｍｌにする。２００μｌのこの溶液を、
各ウェル（２４ウェルプレート）に添加し、そして室温で２０分間インキュベー
トする。溶液を各ウェルにわたって分配させることを確実にする（注：１２チャ
ンネルピペッターは、１つおきのチャンネルにチップをつけて使用され得る）。
ポリ−Ｄ−リジン溶液を吸引除去し、そして１ｍｌ ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理
食塩水）でリンスする。ＰＢＳは、細胞をプレートする直前までウェル中に残す
べきであり、そしてプレートは２週間前までに予めポリリジンでコーティングし
得る。
【０２３４】 ２９３Ｔ細胞（Ｐ＋２０を過ぎて細胞を保有しない）を、２×１０5細胞／ウ
ェルで、０．５ｍｌのＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地）（４．
５Ｇ／ＬのグルコースおよびＬ−グルタミン（１２−６０４Ｆ Ｂｉｏｗｈｉｔ
ｔａｋｅｒ）を含む）／１０％熱非働化ＦＢＳ（１４−５０３Ｆ Ｂｉｏｗｈｉ
ｔｔａｋｅｒ）／１×Ｐｅｎｓｔｒｅｐ（１７−６０２Ｅ Ｂｉｏｗｈｉｔｔａ
ｋｅｒ）中にプレートする。細胞を一晩増殖させる。
【０２３５】 翌日、滅菌溶液容器（ｂａｓｉｎ）中で、３００μｌリポフェクトアミン（１
８３２４−０１２ Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）および５ｍｌ Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ（
３１９８５０７０ Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）／９６ウェルプレートを、一緒に混合
する。小容量のマルチチャンネルピペッターを用いて、実施例８〜１０に記載す
る方法によって産生されたポリヌクレオチド挿入物を含有する約２μｇの発現ベ
クターを、適切に標識された９６ウェルの丸底プレート中にアリコートする。マ
ルチチャンネルピペッターを用いて、５０μｌのリポフェクトアミン／Ｏｐｔｉ
ｍｅｍ Ｉ混合物を各ウェルに添加する。ピペットで緩やかに吸い上げたり下げ
たりして混合する。室温で１５〜４５分間インキュベートする。約２０分後、マ
ルチチャンネルピペッターを使用して１５０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ Ｉを各ウェ
ルに添加する。コントロールとして、挿入物を欠失するベクターＤＮＡの１つの
プレートは、トランスフェクションの各セットでトランスフェクトされるべきで
ある。
【０２３６】 好ましくは、トランスフェクションは、以下の作業をタッグチームを組んで（
ｔａｇ−ｔｅａｍｉｎｇ）行うべきである。タッグチームを組むことによって、
作業時間は半減され、そして細胞にはＰＢＳ上であまり多くの時間を過ごさせな
い。まず、Ａさんは、培地を細胞の４つの２４ウェルプレートから吸引除去し、
次いでＢさんが０．５〜１ｍｌのＰＢＳで各ウェルをリンスする。次いで、Ａさ
んは、ＰＢＳリンスを吸引除去し、そしてＢさんは、チャンネル１つおきにチッ
プのついた１２チャンネルピペッターを使用して、２００μｌのＤＮＡ／リポフ
ェクトアミン／Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ複合体を、まず奇数のウェルに、次いで偶数
のウェルにと、２４ウェルプレート上の各列に添加する。３７℃で６時間インキ
ュベートする。
【０２３７】 細胞をインキュベートする間に、１×ペンストレップ（ｐｅｎｓｔｒｅｐ）を
有するＤＭＥＭ中の１％ＢＳＡか、または２ｍＭグルタミンおよび１×ペンスト
レップを含むＨＧＳ ＣＨＯ−５培地（１１６．６ｍｇ／ＬのＣａＣｌ2（無水
物）；０．００１３０ｍｇ／Ｌ ＣｕＳＯ4−５Ｈ2Ｏ；０．０５０ｍｇ／ＬのＦ
ｅ（ＮＯ3）3−９Ｈ2Ｏ；０．４１７ｍｇ／ＬのＦｅＳＯ4−７Ｈ2Ｏ；３１１．
８０ｍｇ／ＬのＫＣｌ；２８．６４ｍｇ／ＬのＭｇＣｌ2；４８．８４ｍｇ／Ｌ
のＭｇＳＯ4；６９９５．５０ｍｇ／ＬのＮａＣｌ；２４００．０ｍｇ／ＬのＮ
ａＨＣＯ3；６２．５０ｍｇ／ＬのＮａＨ2ＰＯ4−Ｈ2Ｏ；７１．０２ｍｇ／Ｌの
Ｎａ2ＨＰＯ4；０．４３２０ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ4−７Ｈ2Ｏ；０．００２ｍｇ／
Ｌのアラキドン酸；１．０２２ｍｇ／Ｌのコレステロール；０．０７０ｍｇ／Ｌ
のＤＬ−α−酢酸トコフェロール；０．０５２０ｍｇ／Ｌのリノール酸；０．０
１０ｍｇ／Ｌのリノレン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのミリスチン酸；０．０１０ｍ
ｇ／Ｌのオレイン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのパルミトオレイン酸（ｐａｌｍｉｔ
ｒｉｃ ａｃｉｄ）；０．０１０ｍｇ／Ｌのパルミチン酸；１００ｍｇ／ＬのＰ
ｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８；０．０１０ｍｇ／Ｌのステアリン酸；２．２０ｍｇ
／ＬのＴｗｅｅｎ８０；４５５１ｍｇ／ＬのＤ−グルコース；１３０．８５ｍｇ
／ｍｌのＬ−アラニン；１４７．５０ｍｇ／ｍｌのＬ−アルギニン−ＨＣｌ；７
．５０ｍｇ／ｍｌのＬ−アスパラギン−Ｈ2Ｏ；６．６５ｍｇ／ｍｌのＬ−アス
パラギン酸；２９．５６ｍｇ／ｍｌのＬ−シスチン２ＨＣｌ−Ｈ2Ｏ；３１．２
９ｍｇ／ｍｌのＬ−シスチン−２ＨＣｌ；７．３５ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミン
酸；３６５．０ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミン；１８．７５ｍｇ／ｍｌのグリシン
；５２．４８ｍｇ／ｍｌのＬ−ヒスチジン−ＨＣｌ−Ｈ2Ｏ；１０６．９７ｍｇ
／ｍｌのＬ−イソロイシン；１１１．４５ｍｇ／ｍｌのＬ−ロイシン；１６３．
７５ｍｇ／ｍｌのＬ−リジンＨＣｌ；３２．３４ｍｇ／ｍｌのＬ−メチオニン；
６８．４８ｍｇ／ｍｌのＬ−フェニルアラニン；４０．０ｍｇ／ｍｌのＬ−プロ
リン；２６．２５ｍｇ／ｍｌのＬ−セリン；１０１．０５ｍｇ／ｍｌのＬ−スレ
オニン；１９．２２ｍｇ／ｍｌのＬ−トリプトファン；９１．７９ｍｇ／ｍｌの
Ｌ−チロシン（Ｔｒｙｒｏｓｉｎｅ）−２Ｎａ−２Ｈ2Ｏ；９９．６５ｍｇ／ｍ
ｌのＬ−バリン；０．００３５ｍｇ／Ｌのビオチン；３．２４ｍｇ／ＬのＤ−Ｃ
ａパントテン酸；１１．７８ｍｇ／Ｌの塩化コリン；４．６５ｍｇ／Ｌの葉酸；
１５．６０ｍｇ／Ｌのｉ−イノシトール；３．０２ｍｇ／Ｌのナイアシンアミド
；３．００ｍｇ／ＬのピリドキサールＨＣｌ；０．０３１ｍｇ／Ｌのピリドキシ
ンＨＣｌ；０．３１９ｍｇ／Ｌのリボフラビン；３．１７ｍｇ／ＬのチアミンＨ
Ｃｌ；０．３６５ｍｇ／Ｌのチミジン；および０．６８０ｍｇ／ＬのビタミンＢ 12 ；２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤；２．３９ｍｇ／ＬのＮａヒポキサンチン；０
．１０５ｍｇ／Ｌのリポ酸；０．０８１ｍｇ／Ｌのプトレシンナトリウム−２Ｈ
Ｃｌ；５５．０ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム；０．００６７ｍｇ／Ｌの亜セ
レン酸ナトリウム；２０μＭのエタノールアミン；０．１２２ｍｇ／Ｌのクエン
酸第二鉄；４１．７０ｍｇ／Ｌのリノール酸と複合体化したメチル−Ｂ−シクロ
デキストリン；３３．３３ｍｇ／Ｌのオレイン酸と複合体化したメチル−Ｂ−シ
クロデキストリン；ならびに１０ｍｇ／Ｌのレチナールと複合体化したメチル−
Ｂ−シクロデキストリン、浸透圧を３２７ｍＯｓｍに調製する）のいずれかの適
切な培地を調製する。（１０％ＢＳＡストック溶液のために、１Ｌ ＤＭＥＭ中
にＢＳＡ（８１−０６８−３ Ｂａｙｅｒ）１００ｇを溶解した）。培地を濾過
し、そして５０μｌを内毒素アッセイのために１５ｍｌポリスチレンコニカル中
に収集する。
【０２３８】 トランスフェクション反応を、好ましくはタッグチームを組んでインキュベー
ション時間の終わりに終結させる。Ａさんは、トランスフェクション培地を吸引
除去し、その間Ｂさんは、１．５ｍｌの適切な培地を各ウェルに添加する。使用
された培地に依存して４５時間または７２時間、３７℃でインキュベートする：
１％ＢＳＡは４５時間、またはＣＨＯ−５は７２時間。
【０２３９】 ４日目に、３００μｌのマルチチャンネルピペッターを使用して、６００μｌ
を１ｍｌの深底ウェルプレート１枚にアリコートし、そして残りの上清を２ｍｌ
の深底ウェルにアリコートする。次いで、各ウェルからの上清を実施例１４〜２
１に記載するアッセイにおいて使用し得る。
【０２４０】 活性が、上清を使用して以下に記載する任意のアッセイにおいて得られる場合
、この活性は、ＰＤＥＦポリぺプチドから直接に（例えば、分泌タンパク質およ
び／または可溶性タンパク質として）か、または他のタンパク質の発現を誘導す
るＰＤＥＦによって（このタンパク質は、次いで上清中に分泌される）のいずれ
かに由来することが特に理解される。従って、本発明はさらに、特定のアッセイ
における活性によって特徴づけられる上清中のタンパク質を同定する方法を提供
する。
【０２４１】 （実施例１３：ＧＡＳレポーター構築物の構築） 細胞の分化および増殖に関与する１つのシグナル伝達経路は、Ｊａｋ−ＳＴＡ
Ｔ経路と呼ばれる。Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路において活性化されたタンパク質は、
多くの遺伝子のプロモーターに位置する、γ活性化部位「ＧＡＳ」エレメントま
たはインターフェロン感受性応答エレメント（「ＩＳＲＥ」）に結合する。これ
らのエレメントに対するタンパク質の結合は、関連する遺伝子の発現を変化させ
る。
【０２４２】 ＧＡＳエレメントおよびＩＳＲＥエレメントは、転写のシグナルトランスデュ
ーサーおよびアクチベーター、すなわち「ＳＴＡＴ」と呼ばれるクラスの転写因
子によって認識される。ＳＴＡＴファミリーには６つのメンバーが存在する。Ｓ
ｔａｔ１およびＳｔａｔ３は、Ｓｔａｔ２と同様に（ＩＦＮαに対する応答が広
範であるように）、多くの細胞型において存在する。Ｓｔａｔ４は、より限定さ
れており、そして多くの細胞型には存在しないが、ＩＬ−１２での処理後のＴヘ
ルパークラスＩ細胞に見出されている。Ｓｔａｔ５は、元々は乳房成長因子と呼
ばれたが、骨髄細胞を含む他の細胞においてより高い濃度で見出されている。そ
れは、多くのサイトカインによって組織培養細胞において活性化され得る。
【０２４３】 ＳＴＡＴは活性化されて、Ｊａｎｕｓ Ｋｉｎａｓｅ（「Ｊａｋ」）ファミリ
ーとして知られる１セットのキナーゼによるチロシンリン酸化に際して細胞質か
ら核へ移動する。Ｊａｋは、可溶性のチロシンキナーゼの独特のファミリーの代
表であり、そしてＴｙｋ２、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、およびＪａｋ３を含む。これ
らのキナーゼは、有意な配列類似性を示し、そして一般には休止細胞において触
媒的に不活性である。
【０２４４】 Ｊａｋｓは、以下の表によって要約されるように広範なレセプターによって活
性化される。（ＳｃｈｉｄｌｅｒおよびＤａｒｎｅｌｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．６４：６２１−５１（１９９５）による総説から改変）。Ｊａｋを
活性化し得るサイトカインレセプターファミリーは、２つの群に分けられる：（
ａ）クラス１は、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−
９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、Ｅｐｏ、ＰＲＬ、ＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ
、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、およびトロンボポエチンに対するレセプタ
ーを含み；そして（ｂ）クラス２は、ＩＦＮ−ａ（α）、ＩＦＮ−ｇ（γ）、お
よびＩＬ−１０を含む。クラス１レセプターは、保存されたシステインモチーフ
（４つの保存されたシステインおよび１つのトリプトファンのセット）、および
ＷＳＸＷＳモチーフ（Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘｘｘ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（配列番号５）
をコードする膜近接領域）を共有する。
【０２４５】 従って、リガンドのレセプターへの結合の際に、Ｊａｋは活性化され、これは
次いでＳＴＡＴを活性化し、次いで、これは、移動し、そしてＧＡＳエレメント
に結合する。この全プロセスは、Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路に包含され
る。
【０２４６】 従って、ＧＡＳまたはＩＳＲＥエレメントの結合によって反映されるＪａｋｓ
−ＳＴＡＴ経路の活性化は、細胞の増殖および分化に関与するタンパク質を示す
ために使用され得る。例えば、増殖因子・成長因子およびサイトカインは、Ｊａ
ｋ−ＳＴＡＴ経路を活性化することが知られている。（以下の表を参照のこと）
。従って、レポーター分子に連結したＧＡＳエレメントを使用することにより、
Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路のアクチベーターが同定され得る。
【０２４７】
【化４】 実施例１４〜１５に記載される生物学的アッセイにおいて使用されるプロモー
ターエレメントを含む合成ＧＡＳを構築するために、ＰＣＲに基づいたストラテ
ジーを用いてＧＡＳ−ＳＶ４０プロモーター配列を生成する。５’プライマーは
、ＩＲＦ１プロモーターにおいて見出され、そして一定の範囲のサイトカインで
の誘導の際にＳＴＡＴに結合することが以前に実証されたＧＡＳ結合部位の４つ
の直列のコピーを含むが（Ｒｏｔｈｍａｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：４５７−
４６８（１９９４））、他のＧＡＳエレメントまたはＩＳＲＥエレメントを代わ
りに使用し得る。５’プライマーはまた、ＳＶ４０初期プロモーター配列に対し
て相補的な１８ｂｐの配列も含み、そしてＸｈｏＩ部位に隣接する。５’プライ
マーの配列は以下である：
【０２４８】
【化５】 下流プライマーはＳＶ４０プロモーターに対して相補的であり、そしてＨｉｎ
ｄ ＩＩＩ部位に隣接する：５’：ＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧ
ＣＣＴＡＧＧＣ：３’（配列番号７）。
【０２４９】 ＰＣＲ増幅を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したβ−ｇａｌ：プロモータープラ
スミド中に存在するＳＶ４０プロモーターのテンプレートを用いて実施する。得
られたＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩを用いて消化し、そし
てＢＬＳＫ２−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングする。正方向およ
び逆方向のプライマーを用いる配列決定により、挿入物が以下の配列を含むこと
を確認する：
【０２５０】
【化６】 このＧＡＳプロモーターエレメントがＳＶ４０プロモーターに結合されると、
次に、ＧＡＳ：ＳＥＡＰ２レポーター構築物を操作する。ここで、レポーター分
子は、分泌アルカリホスファターゼ、すなわち「ＳＥＡＰ」である。しかし、明
らかに、この実施例または他の実施例のいずれにおいても、任意のレポーター分
子が、ＳＥＡＰの代わりとなり得る。ＳＥＡＰの代わりに使用され得る周知のレ
ポーター分子としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃ
ＡＴ）、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グ
リーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または抗体により検出可能な任意のタンパク
質が挙げられる。
【０２５１】 上記の配列により確認された合成ＧＡＳ−ＳＶ４０プロモーターエレメントを
、ＧＡＳ−ＳＥＡＰベクターを作製するために、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ
を用いて、増幅したＧＡＳ：ＳＶ４０プロモーターエレメントでＳＶ４０プロモ
ーターを有効に置換し、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したｐＳＥＡＰ−プロモータ
ーベクターにサブクローニングする。しかし、このベクターはネオマイシン耐性
遺伝子を含まず、それゆえ、哺乳動物の発現系には好ましくない。
【０２５２】 従って、ＧＡＳ−ＳＥＡＰレポーターを発現する哺乳動物の安定な細胞株を作
製するために、ＧＡＳ−ＳＥＡＰカセットを、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを用いて
ＧＡＳ−ＳＥＡＰベクターから取り出し、そしてＧＡＳ−ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベク
ターを作製するために、マルチクローニング部位におけるこれらの制限部位を用
いて、ネオマイシン耐性遺伝子を含む骨格（バックボーン）ベクター（例えば、
ｐＧＦＰ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））に挿入する。一旦、このベクターを哺乳動
物細胞にトランスフェクトすれば、次いでこのベクターは、実施例１４〜１５に
記載されるようにＧＡＳ結合についてのレポーター分子として使用され得る。
【０２５３】 他の構築物を、上記の記載を使用し、そしてＧＡＳを異なるプロモーター配列
で置換して、作製し得る。例えば、ＮＦＫ−ＢおよびＥＧＲプロモーター配列を
含むレポーター分子の構築を、実施例１６および１７に記載する。しかし、多く
の他のプロモーターをこれらの実施例に記載のプロトコルを使用して置換し得る
。例えば、ＳＲＥ、ＩＬ−２、ＮＦＡＴ、またはオステオカルシンのプロモータ
ーを単独で、または組み合わせて（例えば、ＧＡＳ／ＮＦ−ＫＢ／ＥＧＲ、ＧＡ
Ｓ／ＮＦ−ＫＢ、Ｉｌ−２／ＮＦＡＴ、またはＮＦ−ＫＢ／ＧＡＳ）置換し得る
。同様に、他の細胞株（例えば、ＨＥＬＡ（上皮細胞）、ＨＵＶＥＣ（内皮細胞
）、Ｒｅｈ（Ｂ細胞）、Ｓａｏｓ−２（骨芽細胞）、ＨＵＶＡＣ（大動脈細胞）
、または心筋細胞）を、レポーター構築物の活性を試験するために使用し得る。
【０２５４】 （実施例１４：Ｔ細胞の活性についての高処理能力スクリーニングアッセイ） 以下のプロトコルを、ＰＤＥＦ上清がＴ細胞を増殖させるか、および／または
分化させるか否かを同定することによりＴ細胞の活性を評価するために使用する
。Ｔ細胞の活性を、実施例１３で作製したＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を用
いて評価する。従って、ＳＥＡＰ活性を増加させる因子は、Ｊａｋ−ＳＴＡＴシ
グナル伝達経路を活性化する能力を示す。このアッセイに使用したＴ細胞は、Ｊ
ｕｒｋａｔ Ｔ細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＴＩＢ−１５２）であるが、Ｍｏｌｔ−
３細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５５２）およびＭｏｌｔ−４細胞（ＡＴＣ
Ｃ受託番号ＣＲＬ−１５８２）細胞もまた使用し得る。
【０２５５】 Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、リンパ芽球性ＣＤ４＋ Ｔｈ１ヘルパー細胞である
。安定な細胞株を作製するために、およそ２００万のＪｕｒｋａｔ細胞をＤＭＲ
ＩＥ−Ｃ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＧＡＳ−ＳＥＡＰ
／ｎｅｏベクターでトランスフェクト（以下に記載のトランスフェクション手順
）する。トランスフェクトした細胞を、およそ２０，０００細胞／ウェルの密度
で播種し、そして１ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（ｇｅｎｔｉｃｉｎ）に対して
耐性であるトランスフェクト体を選択する。耐性コロニーを増殖させ、次いで、
漸増する濃度のインターフェロンγに対するそれらの応答について試験する。選
択したクローンの用量応答を示す。
【０２５６】 詳細には、以下のプロトコルにより、２００μｌの細胞を含む７５のウェルに
ついて十分な細胞を得る。従って、複数の９６ウェルプレートについて十分な細
胞を産生するために、これをスケールアップするか、または複数で実施するかの
いずれかを行う。Ｊｕｒｋａｔ細胞をＲＰＭＩ＋１０％血清および１％のＰｅｎ
−Ｓｔｒｅｐ中で維持する。Ｔ２５フラスコ中で２．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ
（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と１０μｇのプラスミドＤＮＡとを組
み合わせる。５０μｌのＤＭＲＩＥ−Ｃを含む２．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭを
添加し、そして、室温で１５〜４５分間インキュベートする。
【０２５７】 インキュベート時間の間、細胞濃度をカウントし、必要な細胞数（トランスフ
ェクションあたり１０7個）をスピンダウンし、そして最終濃度が１０7細胞／ｍ
ｌとなるようにＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で再懸濁する。次いで、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ中
の１×１０7個の細胞１ｍｌをＴ２５フラスコに加え、そして３７℃で６時間イ
ンキュベートする。インキュベーションの後、１０ｍｌのＲＰＭＩ＋１５％の血
清を添加する。
【０２５８】 Ｊｕｒｋａｔ：ＧＡＳ−ＳＥＡＰ安定レポーター株をＲＰＭＩ＋１０％血清、
１ｍｇ／ｍｌジェネティシン、および１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ中で維持する。
これらの細胞を実施例１２に記載されるプロトコルにより産生されるようなＰＤ
ＥＦポリペプチドまたはＰＤＥＦ誘導ポリペプチドを含む上清で処理する。
【０２５９】 上清での処理日に細胞を洗浄すべきであり、そして１ｍｌあたり５００，００
０個の密度となるように新鮮なＲＰＭＩ＋１０％血清中に再懸濁するべきである
。必要な細胞の正確な数は、スクリーニングされる上清の数に依存する。１枚の
９６ウェルプレートについて、およそ１０００万個の細胞（１０枚のプレートに
ついて１億個の細胞）を必要とする。
【０２６０】 細胞を、９６ウェルのディッシュに分与するために、１２チャンネルのピペッ
トを用いて、三角のリザーバーボートに細胞を移す。２００μｌの細胞を、１２
チャンネルのピペットを用いて、それぞれのウェルに移す（従って、ウェル当た
り１００，０００個の細胞を添加する）。
【０２６１】 全てのプレートに播種した後、５０μｌの上清を、１２チャンネルピペットを
用いて、上清を含む９６ウェルプレートから各ウェルに直接的に移す。さらに、
外来性のインターフェロンγの用量（０．１、１．０、１０ｎｇ）を、ウェルＨ
９、ウェルＨ１０、およびウェルＨ１１に添加し、アッセイについてのさらなる
陽性コントロールとして供する。
【０２６２】 上清で処理したＪｕｒｋａｔ細胞を含む９６ウェルディッシュをインキュベー
ターに４８時間置く（注：この時間は４８〜７２時間の間で変更可能である）。
次いで、各ウェルから３５μｌのサンプルを１２チャンネルのピペットを用いて
、不透明な９６ウェルプレートに移す。不透明なプレートを（セロファンのカバ
ーを用いて）覆うべきであり、そして実施例１８に従うＳＥＡＰアッセイを行う
まで、−２０℃で保存するべきである。残存する処理した細胞を含むプレートを
４℃に置き、そして、所望するならば、特定のウェル上でのアッセイを繰り返す
ための物質の供給源として使用する。
【０２６３】 陽性コントロールとして、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を活性化することが公知であ
る１００ユニット／ｍｌのインターフェロンγを使用し得る。代表的には、３０
倍を超える誘導が、陽性コントロールのウェルにおいて観察される。
【０２６４】 （実施例１５：骨髄性の活性を同定する高処理能力スクリーニングアッセイ） 以下のプロトコルを、ＰＤＥＦが、骨髄性細胞を増殖および／または分化させ
るか否かを同定することによりＰＤＥＦの骨髄性の活性を評価するために使用す
る。骨髄性細胞の活性を実施例１３において産生されたＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅ
ｏ構築物を用いて評価する。従って、ＳＥＡＰ活性を増加させる因子は、Ｊａｋ
−ＳＴＡＴシグナル伝達経路を活性化させる能力を示す。このアッセイに使用し
た骨髄性細胞は、Ｕ９３７（前単球（ｐｒｅ−ｍｏｎｏｃｙｔｅ）細胞株である
）が、ＴＦ−１、ＨＬ６０、またはＫＧ１も使用し得る。
【０２６５】 Ｕ９３７細胞を、実施例１３において産生されたＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構
築物で、一過性にトランスフェクトするために、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法（
Ｋｈａｒｂａｎｄａら、１９９４，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒ
ｅｎｔｉａｔｉｏｎ，５：２５９−２６５）を用いる。最初に、２×１０ｅ7個
のＵ９３７細胞を回収し、そしてＰＢＳで洗浄する。Ｕ９３７細胞を、通常、１
００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補
充した１０％熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地中
で増殖させる。
【０２６６】 次に、０．５ｍｇ／ｍｌ ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ、８μｇのＧＡＳ−ＳＥ
ＡＰ２プラスミドＤＮＡ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、３７５μＭ
Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、および６７５μＭ ＣａＣｌ2
を含む１ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）緩衝液に細胞を懸
濁する。３７℃で４５分間インキュベートする。
【０２６７】 １０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地で細胞を洗浄し、次いで、１０
ｍｌの完全培地に再懸濁し、そして３７℃で３６時間インキュベートする。
【０２６８】 ＧＡＳ−ＳＥＡＰ／Ｕ９３７安定細胞を、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で細
胞を増殖させることにより得る。Ｇ４１８を含まない培地を使用して、慣用的に
増殖させるが、１〜２ヶ月毎に細胞を二継代の間、４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８
中で再増殖させるべきである。
【０２６９】 これらの細胞を１×１０8個の細胞（これは１０枚の９６ウェルプレートアッ
セイのために十分である）を回収することにより試験し、そしてＰＢＳで洗浄す
る。上記の２００ｍｌの増殖培地中に、５×１０5細胞／ｍｌの最終密度で細胞
を懸濁する。９６ウェルプレートにおいてウェルあたり２００μｌの細胞（すな
わち、１×１０5細胞／ウェル）をプレートする。
【０２７０】 実施例１２に記載されるプロトコルにより調製された上清を５０μｌ添加する
。３７℃で４８〜７２時間インキュベートする。陽性コントロールとして、Ｕ９
３７細胞を活性化させることが公知である、１００単位／ｍｌのインターフェロ
ンγを使用し得る。代表的には、３０倍を超える誘導が、陽性コントロールウェ
ルにおいて観察される。実施例１８に記載のプロトコルに従って上清をＳＥＡＰ
アッセイする。
【０２７１】 （実施例１６：ニューロン活性を同定する高処理能力スクリーニングアッセイ
） 細胞が分化および増殖を経る場合、一群の遺伝子が多くの異なるシグナル伝達
経路を介して活性化される。これらの遺伝子の１つであるＥＧＲ１（初期増殖応
答遺伝子１）は、活性化時に種々の組織および細胞型において誘導される。ＥＧ
Ｒ１のプロモーターはこのような誘導を担う。レポーター分子に結合したＥＧＲ
１プロモーターを使用して、ＰＤＥＦによる細胞の活性化を評価し得る。
【０２７２】 詳細には、以下のプロトコルをＰＣ１２細胞株におけるニューロン活性を評価
するために使用する。ＰＣ１２細胞（ラット褐色細胞腫（ｐｈｅｎｏｃｈｒｏｍ
ｏｃｙｔｏｍａ））は、多くのマイトジェン（例えば、ＴＰＡ（テトラデカノイ
ルホルボールアセテート）、ＮＧＦ（神経成長因子）、およびＥＧＦ（上皮増殖
因子））での活性化により増殖および／または分化することが公知である。この
処理の間にＥＧＲ１遺伝子発現を活性化する。従って、ＳＥＡＰレポーターに結
合したＥＧＲプロモーターを含む構築物でＰＣ１２細胞を安定にトランスフェク
トすることにより、ＰＤＥＦによるＰＣ１２細胞の活性化を評価し得る。
【０２７３】 ＥＧＲ／ＳＥＡＰレポーター構築物を以下のプロトコルにより組み立て得る。
ＥＧＲ−１プロモーター配列（−６３３〜＋１）（Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｋら、Ｏ
ｎｃｏｇｅｎｅ ６：８６７−８７１（１９９１））を以下のプライマーを用い
て、ヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し得る：
【０２７４】
【化７】 次いで、実施例１３において作製したＧＡＳ：ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを使
用して、ＥＧＲ１増幅産物をこのベクターに挿入し得る。制限酵素ＸｈｏＩ／Ｈ
ｉｎｄＩＩＩを使用してＧＡＳ：ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを直線化し、ＧＡＳ
／ＳＶ４０スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）を取り除く。これらと同じ酵素を用
いて、ＥＧＲ１増幅産物を制限処理する。ベクターとＥＧＲ１プロモーターとを
連結する。
【０２７５】 細胞培養のための９６ウェルプレートを調製するために、コーティング溶液（
コラーゲンＩ型（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ． カタログ番号０
８−１１５）の、３０％エタノール（滅菌濾過）での１：３０希釈）を、１つの
１０ｃｍプレートあたり２ｍｌ、または９６ウェルプレートの１ウェルあたり５
０ｍｌ添加し、そして２時間風乾させる。
【０２７６】 ＰＣＩ２細胞を、予めコートした１０ｃｍ組織培養ディッシュ上で、ペニシリ
ン（１００ユニット／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を
補充した、１０％ウマ血清（ＪＲＨ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ、カタログ番号１
２４４９−７８Ｐ）、５％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ−１
６４０培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で慣用的に増殖させる。１つから
４つへの分割を３〜４日毎に行う。細胞を掻き取ることによりプレートから取り
出し、そして１５回より多く上下にピペッティングして再懸濁する。
【０２７７】 ＥＧＲ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を、実施例１２に記載のリポフェクタミン（
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）プロトコルを使用して、ＰＣＩ２にトランスフェ
クトする。ＥＧＲ−ＳＥＡＰ／ＰＣＩ２の安定な細胞を、３００μｇ／ｍｌのＧ
４１８中で細胞を増殖させることにより得る。Ｇ４１８を含まない培地を慣用的
増殖のために使用するが、１〜２ヶ月毎に、細胞を２継代の間、３００μｇ／ｍ
ｌのＧ４１８中で再増殖させるべきである。
【０２７８】 ニューロン活性をアッセイするために、およそ７０〜８０％コンフルエントで
ある細胞を有する１０ｃｍプレートを、古い培地を除去することによりスクリー
ニングする。細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）を用いて１回洗浄する。
次いで、細胞を低血清培地（抗生物質とともに１％ウマ血清および０．５％ Ｆ
ＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０）中で一晩、飢餓させる。
【０２７９】 翌朝、培地を除去し、そしてＰＢＳで細胞を洗浄する。プレートから細胞を掻
き取り、細胞を２ｍｌの低血清培地中でよく懸濁する。細胞数をカウントし、そ
してより低血清の培地に添加し、５×１０5細胞／ｍｌの最終細胞密度に到達さ
せる。
【０２８０】 ２００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに添加する（１×１
０5細胞／ウェルに等しい）。実施例１２により産生された５０μｌの上清を、
３７℃で４８〜７２時間加える。陽性コントロールとして、ＥＧＲを通してＰＣ
Ｉ２細胞を活性化することが公知の増殖因子（例えば、５０ｎｇ／μｌの神経増
殖因子（ＮＧＦ））を使用し得る。代表的には、５０倍を超えるＳＥＡＰ誘導が
陽性コントロールウェルにおいて見られる。ＳＥＡＰは実施例１８に従って、上
清をアッセイする。
【０２８１】 （実施例１７：Ｔ細胞の活性についての高処理能力スクリーニングアッセイ） ＮＦ−κＢ（核因子κＢ）は、広範な種々の薬剤（炎症性サイトカインである
ＩＬ−１およびＴＮＦ、ＣＤ３０およびＣＤ４０、リンホトキシン−αおよびリ
ンホトキシン−βを含む）により、ＬＰＳまたはトロンビンへの曝露により、な
らびに特定のウイルス遺伝子産物の発現により活性化される転写因子である。転
写因子として、ＮＦ−κＢは免疫細胞の活性化に関与する遺伝子の発現、アポト
ーシスの制御（ＮＦ−κＢは、アポトーシスから細胞を保護すると思われる）、
Ｂ細胞およびＴ細胞の発生、抗ウイルス応答および抗菌応答、ならびに複数のス
トレス応答を調節する。
【０２８２】 刺激されない条件において、ＮＦ−κＢは、Ｉ−κＢ（インヒビターκＢ）を
有する細胞質に保持される。しかし、刺激の際に、Ｉ−κＢはリン酸化され、そ
して分解（ｄｅｇｒａｄｅ）され、ＮＦ−κＢの核への往復（ｓｈｕｔｔｌｅ）
を引き起こし、これにより標的遺伝子の転写を活性化する。ＮＦ−κＢにより活
性化される標的遺伝子としては、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣＡＭ
−１およびクラス１ＭＨＣが挙げられる。
【０２８３】 その中心的な役割および一定の範囲の刺激に応答する能力に起因して、ＮＦ−
κＢプロモーターエレメントを利用するレポーター構築物を、実施例１２におい
て産生された上清をスクリーニングするために使用する。ＮＦ−κＢのアクチベ
ーターまたはインヒビターは、疾患の処置の際に有用である。例えば、ＮＦ−κ
Ｂのインヒビターを、急性または慢性的なＮＦ−κＢの活性化に関連するこれら
の疾患（例えば、慢性関節リウマチ）を処置するために使用し得る。
【０２８４】 ＮＦ−κＢプロモーターエレメントを含むベクターを構築するために、ＰＣＲ
に基づいたストラテジーを用いる。上流のプライマーは、ＮＦ−κＢ結合部位（
ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣ）（配列番号１１）の４つの直列コピー、ＳＶ４０初
期プロモーター配列の５’末端に対して相補的な１８ｂｐの配列を含み、そして
ＸｈｏＩ部位に隣接する：
【０２８５】
【化８】 下流プライマーは、ＳＶ４０プロモーターの３’末端に対して相補的であり、
そしてＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接する： ５’：ＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＣＴＡＧＧＣ：３’（配列
番号７）。
【０２８６】 ＰＣＲ増幅を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したｐＢ−ｇａｌ：プロモータープ
ラスミドに存在するＳＶ４０プロモーターのテンプレートを使用して実行する。
得られたＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして
ＢＬＳＫ２−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングする。Ｔ７プライマ
ーおよびＴ３プライマーを用いる配列決定により、挿入物が以下の配列を含むこ
とを確認する：
【０２８７】
【化９】 次に、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを使用して、ｐＳＥＡＰ２−プロモータ
ープラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に存在するＳＶ４０最小プロモーターエレメ
ントをこのＮＦ−κＢ／ＳＶ４０フラグメントと置換する。しかし、このベクタ
ーはネオマイシン耐性遺伝子を含まず、従って哺乳動物の発現系には好ましくな
い。
【０２８８】 安定な哺乳動物細胞株を作製するために、ＮＦ−κＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰカ
セットを制限酵素ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを使用して上記のＮＦ−κＢ／ＳＥＡ
Ｐベクターから取り出し、そしてネオマイシン耐性を含むベクターに挿入する。
特に、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩでｐＧＦＰ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を制限処理
した後に、ＮＦ−κＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰカセットをｐＧＦＰ−１に挿入し、
ＧＦＰ遺伝子を置換した。
【０２８９】 一旦、ＮＦ−κＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを作製した後は、実
施例１４に記載のプロトコルに従って、安定なＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を作製し、
そして維持する。同様に、これらの安定なＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を含む上清をア
ッセイするための方法がまた、実施例１４に記載される。陽性コントロールとし
て、外因性のＴＮＦα（０．１、１、１０ｎｇ）をウェルＨ９、Ｈ１０、および
Ｈ１１に添加し、代表的には、５〜１０倍の活性化が観察される。
【０２９０】 （実施例１８：ＳＥＡＰ活性についてのアッセイ） 実施例１４〜１７に記載されるアッセイのためのレポーター分子として、ＳＥ
ＡＰ活性を、以下の一般的な手順に従ってＴｒｏｐｉｘ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｌｉ
ｇｈｔ Ｋｉｔ（カタログ番号ＢＰ−４００）を用いてアッセイする。Ｔｒｏｐ
ｉｘ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｌｉｇｈｔ Ｋｉｔは、以下で使用される希釈緩衝液、
アッセイ緩衝液、および反応緩衝液を供給する。
【０２９１】 ディスペンサーに２．５×希釈緩衝液を満たし、そして１５μｌの２．５×希
釈緩衝液を３５μｌの上清を含むオプティプレート（Ｏｐｔｉｐｌａｔｅ）に分
与する。プラスチックシーラーでプレートをシールし、そして６５℃で３０分間
インキュベートする。一様でない加温を避けるためにオプティプレートを離して
おく。
【０２９２】 サンプルを室温まで１５分間冷却する。ディスペンサーを空にし、そしてアッ
セイ緩衝液で満たす。５０μｌのアッセイ緩衝液を添加し、そして室温で５分間
インキュベートする。ディスペンサーを空にし、そして反応緩衝液で満たす（以
下の表を参照のこと）。５０μｌの反応緩衝液を添加し、そして室温で２０分間
インキュベートする。化学発光シグナルの強度は時間依存的であり、そしてルミ
ノメーターで５つのプレートを読み取るために約１０分間を費やすので、各回で
５つのプレートを処理し、そして１０分後に２つ目のセットを開始するべきであ
る。
【０２９３】 ルミノメーターにおける相対的な光の単位（ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ）を読み取
る。ブランクとしてＨ１２をセットし、そして結果を印字する。化学発光の増加
は、レポーター活性を示す。
【０２９４】
【化１０】 （実施例１９：低分子の濃度および膜透過性における変化を同定する高処理能
力スクリーニングアッセイ） レセプターへのリガンドの結合が、カルシウム、カリウム、ナトリウムのよう
な低分子およびｐＨの細胞内レベルを変化させ、ならびに膜電位を変化させるこ
とは公知である。これらの変化を特定細胞のレセプターに結合する上清の同定を
行うアッセイで測定し得る。以下のプロトコルは、カルシウムについてのアッセ
イを記載するが、このプロトコルは、カリウム、ナトリウム、ｐＨ、膜電位、ま
たは蛍光プローブにより検出可能な任意の他の低分子における変化を検出するよ
うに容易に改変され得る。
【０２９５】 以下のアッセイは、蛍光定量画像化プレートリーダー（「ＦＬＩＰＲ」）を使
用して低分子と結合する蛍光分子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）におけ
る変化を測定する。明らかに、低分子を検出する任意の蛍光分子が、本明細書で
用いられるカルシウム蛍光分子であるｆｌｕｏ−３の代わりに使用され得る。
【０２９６】 接着細胞については、細胞を１０，０００〜２０，０００細胞／ウェルで、底
が清澄なＣｏ−ｓｔａｒ黒色９６ウェルプレートに播種する。プレートをＣＯ2
インキュベーター内で２０時間インキュベートする。接着細胞をＢｉｏｔｅｋ洗
浄器内で２００μｌのＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩類溶液）で二回洗浄し、最後の
洗浄後、１００μｌの緩衝液を残す。
【０２９７】 １ｍｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−３のストック溶液を１０％プルロン酸（ｐｌｕｒｏ
ｎｉｃ ａｃｉｄ）ＤＭＳＯ中に作製する。細胞にｆｌｕｏ−３をロードするた
め、１２μｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−３（５０μｌ）を各ウェルに添加する。このプ
レートをＣＯ2インキュベーター中、３７℃で６０分間インキュベートする。プ
レートをＢｉｏｔｅｋ洗浄器で、ＨＢＳＳを用いて４回洗浄し、１００μｌの緩
衝液を残す。
【０２９８】 非接着細胞については、細胞を培養培地からスピンダウンする。細胞を、５０
ｍｌの円錐チューブ内でＨＢＳＳを用いて２〜５×１０6細胞／ｍｌに再懸濁す
る。細胞懸濁液１ｍｌにつき、１０％プルロン酸ＤＭＳＯ中の１ｍｇ／ｍｌのｆ
ｌｕｏ−３溶液４μｌを加える。次いで、チューブを３７℃の水浴中に３０〜６
０分間置く。細胞をＨＢＳＳで二回洗浄し、１×１０6細胞／ｍｌに再懸濁し、
そしてマイクロプレートに１００μｌ／ウェルずつ分配する。プレートを１００
０ｒｐｍで５分間遠心分離する。次いで、プレートをＤｅｎｌｅｙ Ｃｅｌｌ
Ｗａｓｈ中で２００μｌで一回洗浄した後、吸引工程により最終容量を１００μ
ｌにする。
【０２９９】 非細胞ベースのアッセイについては、各ウェルは、ｆｌｕｏ−３のような蛍光
分子を含有する。上清をウェルに添加し、そして蛍光変化を検出する。
【０３００】 細胞内カルシウムの蛍光を測定するため、ＦＬＩＰＲを以下のパラメーターに
ついて設定する：（１）システムゲインは、３００〜８００ｍＷ；（２）曝露時
間は、０．４秒間；（３）カメラＦ／ストップは、Ｆ／２；（４）励起は４８８
ｎｍ；（５）放射は５３０ｎｍ；および（６）サンプル添加は５０μｌ。５３０
ｎｍにおける放射の増加は、細胞内Ｃａ++濃度の増加を生じる、分子（ＰＤＥＦ
またはＰＤＥＦによって誘導される分子のいずれか）によって生じる細胞外シグ
ナル伝達事象を示す。 （実施例２０：チロシンキナーゼ活性を同定する高処理能力スクリーニングアッ
セイ） プロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）は、多様な群の膜貫通キナーゼおよび
細胞質キナーゼを表す。レセプタープロテインチロシンキナーゼ（ＲＰＴＫ）群
内に、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＨＧＦおよびインスリンレセプター
サブファミリーを含む、一定の範囲のマイトジェン因子および代謝性増殖因子の
レセプターがある。さらに、対応するリガンドが未知である大きなＲＰＴＫファ
ミリーが存在する。ＲＰＴＫのリガンドは、主として分泌される低分子量タンパ
ク質を含むが、膜結合型タンパク質および細胞外マトリックスタンパク質も含む
。
【０３０１】 リガンドによるＲＰＴＫの活性化は、リガンド媒介レセプター二量体化に関与
し、レセプターサブユニットのリン酸基転移および細胞質チロシンキナーゼの活
性化を生じる。細胞質チロシンキナーゼとしては、ｓｒｃファミリー（例えば、
ｓｒｃ、ｙｅｓ、ｌｃｋ、ｌｙｎ、ｆｙｎ）のレセプター関連チロシンキナーゼ
、ならびにＪａｋファミリーのような非レセプター結合型および細胞質ゾルプロ
テインチロシンキナーゼが挙げられる。これらのメンバーは、サイトカインスー
パーファミリー（例えば、インターロイキン、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ
およびレプチン）のレセプターによって誘発されるシグナル伝達を媒介する。
【０３０２】 チロシンキナーゼ活性を刺激し得る公知の因子は広範であるため、ＰＤＥＦま
たはＰＤＥＦによって誘導される分子が、チロシンキナーゼシグナル伝達経路を
活性化し得るか否かの同定は興味深い。従って、以下のプロトコルを設計して、
チロシンキナーゼシグナル伝達経路を活性化し得るそのような分子を同定する。
【０３０３】 標的細胞（例えば、初代ケラチノサイト）を約２５，０００細胞／ウェルの密
度で、Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ（Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）から購入した９６
ウェルＬｏｐｒｏｄｙｎｅ Ｓｉｌｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌａｔｅに播種す
る。プレートを１００％エタノールで２回、３０分間リンスして滅菌し、水でリ
ンスし、そして一晩乾燥させる。いくつかのプレートを、１００ｍｌの細胞培養
グレードＩ型コラーゲン（５０ｍｇ／ｍｌ）、ゼラチン（２％）またはポリリジ
ン（５０ｍｇ／ｍｌ）（これらは全て、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ
．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し得る）で、またはＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎ
ｓｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入した１０％マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇ
ｅｌ）、あるいは仔ウシ血清で２時間コーティングし、ＰＢＳでリンスし、そし
て４℃で保存する。増殖培地に５，０００細胞／ウェルを播種し、製造業者のＡ
ｌａｍａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ
）が記載するように、ａｌａｍａｒＢｌｕｅを使用して４８時間後に細胞数を間
接的に定量することにより、これらのプレート上の細胞増殖をアッセイする。Ｂ
ｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）のＦａｌｃｏｎプレ
ートカバー＃３０７１を使用し、Ｌｏｐｒｏｄｙｎｅ Ｓｉｌｅｎｔ Ｓｃｒｅ
ｅｎ Ｐｌａｔｅを被覆する。Ｆａｌｃｏｎ Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ ＩＩＩ細胞
培養プレートはまた、いくつかの増殖実験において使用され得る。
【０３０４】 抽出物を調製するため、Ａ４３１細胞をＬｏｐｒｏｄｙｎｅプレートのナイロ
ン膜上に播種し（２０，０００／２００ｍｌ／ウェル）、そして完全培地内で一
晩培養する。細胞を無血清基本培地中で２４時間インキュベートして静止させる
。ＥＧＦ（６０ｎｇ／ｍｌ）または実施例１２で生成した上清５０μｌで５〜２
０分間処理した後、培地を除去し、１００ｍｌの抽出緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰ
ＥＳ ｐＨ７．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０
．１％ＳＤＳ、２ｍＭ Ｎａ3ＶＯ4、２ｍＭ Ｎａ4Ｐ2Ｏ7およびＢｏｅｈｅｒ
ｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から入手し
たプロテアーゼインヒビターの混合物（＃１８３６１７０））を各ウェルに添加
し、そしてプレートを回転振盪器上にて４℃で５分間振盪する。次いで、プレー
トを真空トランスファーマニホルド（ｖａｃｕｕｍ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍａｎ
ｉｆｏｌｄ）に置き、そしてハウスバキュームを使用して抽出物を各ウェルの底
の０．４５ｍｍ膜を通して濾過する。抽出物をバキュームマニホルドの底の９６
ウェル捕獲／アッセイプレートに回収し、そして直ちに氷上に置く。遠心分離に
より明澄化した抽出物を得るため、界面活性剤で５分間可溶化した後、各ウェル
の含有物を取り出し、そして４℃、１６，０００×ｇで１５分間遠心分離する。
【０３０５】 濾過抽出物をチロシンキナーゼ活性のレベルについて試験する。チロシンキナ
ーゼ活性を検出する多数の方法が公知であるが、本明細書においては１つの方法
を記載する。
【０３０６】 一般的に、特定の基質（ビオチン化ペプチド）上のチロシン残基をリン酸化す
る能力を決定することにより、上清のチロシンキナーゼ活性を評価する。この目
的に使用され得るビオチン化ペプチドとしては、ＰＳＫ１（細胞分裂キナーゼｃ
ｄｃ２−ｐ３４のアミノ酸６〜２０に対応）およびＰＳＫ２（ガストリンのアミ
ノ酸１〜１７に対応）が挙げられる。両ペプチドは、一連のチロシンキナーゼの
基質であり、そしてＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手可能であ
る。
【０３０７】 以下の成分を順に添加することにより、チロシンキナーゼ反応を設定する。ま
ず、５μＭビオチン化ペプチド１０μｌを添加し、次いでＡＴＰ／Ｍｇ2+（５ｍ
Ｍ ＡＴＰ／５０ｍＭ ＭｇＣｌ2）１０μｌ、次いで５×アッセイ緩衝液（４
０ｍＭ塩酸イミダゾール、ｐＨ７．３、４０ｍＭ β−グリセロリン酸塩、１ｍ
Ｍ ＥＧＴＡ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＭｎＣｌ2、０．５ｍｇ／ｍｌ
ＢＳＡ）１０μｌ、次いでバナジン酸ナトリウム（１ｍＭ）５μｌ、最後に水
５μｌを加える。成分を穏やかに混合し、そして反応混合物を３０℃で２分間プ
レインキュベートする。コントロール酵素または濾過上清１０μｌを加えること
によって反応を開始させる。
【０３０８】 次いで、１２０ｍＭ ＥＤＴＡ１０μｌを添加することによりチロシンキナー
ゼアッセイ反応を停止させ、反応物を氷上に置く。
【０３０９】 反応混合物の５０μｌのアリコートをマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）モ
ジュールに移し、３７℃で２０分間インキュベートすることにより、チロシンキ
ナーゼ活性を決定する。これにより、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖａ
ｄｉｎ）コーティング９６ウェルプレートをビオチン化ペプチドと会合させる。
ＭＴＰモジュールを３００μｌ／ウェルのＰＢＳで４回洗浄する。次に、西洋ワ
サビペルオキシダーゼに結合した抗ホスホチロシン（ｐｈｏｓｐｏｔｙｒｏｓｉ
ｎｅ）抗体（抗Ｐ−Ｔｙｒ−ＰＯＤ（０．５ｕ／ｍｌ））７５μｌを、各ウェル
に添加し、そして３７℃で１時間インキュベートする。ウェルを上記のように洗
浄する。
【０３１０】 次に、ペルオキシダーゼ基質溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ
）１００μｌを加え、室温で少なくとも５分間（最長３０分間）インキュベート
する。ＥＬＩＳＡリーダーを使用することにより、４０５ｎｍでのサンプルの吸
光度を測定する。結合したペルオキシダーゼ活性のレベルを、ＥＬＩＳＡリーダ
ーを使用して定量し、これはチロシンキナーゼ活性のレベルを反映する。
【０３１１】 （実施例２１：リン酸化活性を同定する高処理能力スクリーニングアッセイ） 実施例２０に記載のプロテインチロシンキナーゼ活性のアッセイに可能性のあ
る代替物および／または補完物（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）として、主要な細胞内
シグナル伝達中間体の活性化（リン酸化）を検出するアッセイもまた使用し得る
。例えば、下記のように、一つの特定のアッセイは、Ｅｒｋ−１およびＥｒｋ−
２キナーゼのチロシンリン酸化を検出し得る。しかし、Ｒａｆ、ＪＮＫ、ｐ３８
ＭＡＰ、Ｍａｐキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）、ＭＥＫキナーゼ、Ｓｒｃ、筋肉
特異的キナーゼ（ＭｕＳＫ）、ＩＲＡＫ、ＴｅｃおよびＪａｎｕｓのような他の
分子、ならびに他の任意のホスホセリン、ホスホチロシンまたはホスホトレオニ
ン分子のリン酸化を、以下のアッセイにおいてこれらの分子をＥｒｋ−１または
Ｅｒｋ−２について置換することにより検出し得る。
【０３１２】 詳細には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルをプロテインＧ（１μｇ／
ｍｌ）０．１ｍｌにより室温（ＲＴ）で２時間コーティングしてアッセイプレー
トを作製する。次いでプレートをＰＢＳでリンスし、そして３％ＢＳＡ／ＰＢＳ
によりＲＴで１時間ブロックする。次いでプロテインＧプレートをＥｒｋ−１お
よびＥｒｋ−２に対する２つの市販のモノクローナル抗体（１００ｎｇ／ウェル
）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で処理（ＲＴで１時
間）する。（他の分子を検出するために、上記の任意の分子を検出するモノクロ
ーナル抗体を置換することにより、この工程を容易に改変し得る）。ＰＢＳで３
〜５回リンスした後、使用時まで、プレートを４℃で保存する。
【０３１３】 Ａ４３１細胞を２０，０００／ウェルで９６ウェルＬｏｐｒｏｄｙｎｅフィル
タープレートに播種し、そして増殖培地中で一晩培養する。次いで、細胞を基本
培地（ＤＭＥＭ）中で４８時間飢餓させた後、次いでＥＧＦ（６ｎｇ／ウェル）
または実施例１２で得た上清５０μｌで５〜２０分間処理する。次いで、細胞を
可溶化し、そして抽出物をアッセイプレート内に直接濾過する。
【０３１４】 抽出物を用いてＲＴで１時間インキュベートした後、ウェルを再度リンスする
。陽性コントロールとして、市販のＭＡＰキナーゼ調製物（１０ｎｇ／ウェル）
をＡ４３１抽出物の代わりに使用する。次いで、プレートを、Ｅｒｋ−１および
Ｅｒｋ−２キナーゼのリン酸化エピトープを特異的に認識する市販のポリクロー
ナル（ウサギ）抗体（１μｇ／ｍｌ）で処理する（ＲＴで１時間）。この抗体を
標準的な手順によりビオチン化する。次いで、結合したポリクローナル抗体をＷ
ａｌｌａｃ ＤＥＬＦＩＡ装置内でユーロピウムストレプトアビジンおよびユー
ロピウム蛍光増強剤と共に連続的にインキュベートする（時間分解性蛍光）こと
によって定量する。バックグラウンドを超える蛍光シグナルの増加は、ＰＤＥＦ
またはＰＤＥＦによって誘導される分子によるリン酸化を示す。
【０３１５】 （実施例２２：ＰＤＥＦ遺伝子における変化の決定方法） 目的の表現型（例えば、疾患）を提示する家族全員または個々の患者から単離
されたＲＮＡを単離する。次いでｃＤＮＡをこれらのＲＮＡサンプルから当該分
野で公知のプロトコルを使用して生成する（Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと）。
次いでこのｃＤＮＡを、配列番号１における目的の領域を取り囲むプライマーを
用いるＰＣＲのテンプレートとして使用する。示唆されるＰＣＲ条件は、Ｓｉｄ
ｒａｎｓｋｙ，Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：７０６（１９９１）に記載の
緩衝溶液を使用し、９５℃で３０秒間；５２〜５８℃で６０〜１２０秒間；およ
び７０℃で６０〜１２０秒間の３５サイクルからなる。
【０３１６】 次いで、ＰＣＲ産物を、ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｅｐ
ｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、５’末端にＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼで標識したプライマーを使用して配列決定する。ＰＤＥＦの
選択したエキソンのイントロン−エキソン境界をまた決定し、そしてゲノムＰＣ
Ｒ産物を分析してその結果を確認する。次いでＰＤＥＦについて疑わしい変異を
有するＰＣＲ産物をクローン化および配列決定し、直接配列決定の結果を確認す
る。
【０３１７】 ＰＤＥＦのＰＣＲ産物を、Ｈｏｌｔｏｎ，Ｔ．Ａ．およびＧｒａｈａｍ，Ｍ．
Ｗ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：１１５６（１９
９１）に記載のようにＴテール（Ｔ−ｔａｉｌｅｄ）ベクターにクローン化し、
そしてＴ７ポリメラーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌ）で配列決定する。罹患個体を、非罹患個体には存在しないＰＤＥＦにおける
変異により同定する。
【０３１８】 ゲノム再配置もまた、ＰＤＥＦ遺伝子における改変を決定する方法として観察
する。実施例２に従って単離したゲノムクローンを、ジゴキシゲニンデオキシ−
ウリジン５’−三リン酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ）を用いてニ
ックトランスレーションし、そしてＪｏｈｎｓｏｎ，Ｃｇ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３５：７３−９９（１９９１）に記載のようにＦＩＳ
Ｈを行う。ＰＤＥＦのゲノムの遺伝子座への特異的ハイブリダイゼーションのた
めに、大過剰のヒトｃｏｔ−１ ＤＮＡを用いて標識プローブとのハイブリダイ
ゼーションを行う。
【０３１９】 染色体を、４，６−ジアミノ−２−フェニリドール（ｐｈｅｎｙｌｉｄｏｌｅ
）およびヨウ化プロピジウムで対比染色し、ＣバンドおよびＲバンドの組み合わ
せを生成する。正確なマッピングのための整列イメージを、三重バンドフィルタ
ーセット（Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，Ｖ
Ｔ）と冷却電荷結合素子カメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，Ａ
Ｚ）および可変励起波長フィルター（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃｖ．ら、Ｇｅｎｅｔ．
Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．，８：７５（１９９１））とを組み合わせて用
いて得る。ＩＳｅｅ Ｇｒａｐｈｉｃａｌ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｓｙｓｔｅｍ （
Ｉｎｏｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ．）を使用
して、画像収集、分析および染色体部分長測定を行う。ＰＤＥＦ（プローブによ
りハイブリダイズされた）のゲノム領域の染色体変化を、挿入、欠失および転座
として同定する。これらＰＤＥＦの変化を関連疾患の診断マーカーとして使用す
る。
【０３２０】 （実施例２３：生物学的サンプル中のＰＤＥＦの異常レベルを検出する方法） ＰＤＥＦのポリペプチドは生物学的サンプル中で検出され得、そしてＰＤＥＦ
レベルの上昇または低下が検出される場合、このポリペプチドは、特定表現型の
マーカーである。検出方法は数多くあり、従って当業者は以下のアッセイをそれ
らの特定の必要性に適合するように改変し得ることが理解される。
【０３２１】 例えば、抗体サンドイッチＥＬＩＳＡを使用し、サンプル中、好ましくは、生
物学的サンプル中のＰＤＥＦを検出する。マイクロタイタープレートのウェルを
、ＰＤＥＦに対する特異的抗体を最終濃度０．２〜１０μｇ／ｍｌで用いてコー
ティングする。この抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかで
あって、実施例１１に記載の方法により産生される。ウェルに対するＰＤＥＦの
非特異的結合が減少するように、このウェルをブロックする。
【０３２２】 次に、コーティングしたウェルを、ＰＤＥＦ含有サンプルと共にＲＴで２時間
を超えてインキュベートする。好ましくは、サンプルの系列希釈を使用して結果
を確認すべきである。次に、プレートを脱イオン水または蒸留水で三回洗浄し、
非結合ＰＤＥＦを除去する。
【０３２３】 次に、特異的抗体−アルカリホスファターゼ結合体５０μｌを２５〜４００ｎ
ｇの濃度で加え、室温で２時間インキュベートする。プレートを再び脱イオン水
または蒸留水で三回洗浄し、未結合の結合体を除去する。
【０３２４】 ４−メチルウンベリフェリルリン酸（ＭＵＰ）またはｐ−ニトロフェニルリン
酸（ＮＰＰ）基質溶液７５μｌを各ウェルに添加し、そして室温で１時間インキ
ュベートする。反応物をマイクロタイタープレートリーダーにより測定する。コ
ントロールサンプルの系列希釈を使用して標準曲線を作成し、そしてＸ軸（対数
スケール）にＰＤＥＦポリペプチド濃度を、そしてＹ軸（直線スケール）に蛍光
または吸光度をプロットする。標準曲線を用いてサンプル中のＰＤＥＦ濃度を補
間する。
【０３２５】 （実施例２４：ポリペプチドの処方） ＰＤＥＦ組成物を、個々の患者の臨床状態（特に、ＰＤＥＦポリペプチド単独
処置の副作用）、送達部位、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の因子
を考慮に入れ、医療実施基準（ｇｏｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）
を遵守する方式で処方および投薬する。従って、本明細書において目的とする「
有効量」は、このような考慮を行って決定される。
【０３２６】 一般的提案として、用量当り、非経口的に投与されるＰＤＥＦの総薬学的有効
量は、患者体重の、約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあるが、
上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。さらに好ましくは、このホルモン
について、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくはヒ
トに対して約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日と約１ｍｇ／ｋｇ／日との間である。連続
投与する場合、代表的には、ＰＤＥＦを約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋ
ｇ／時間の投薬速度で１日に１〜４回の注射かまたは連続皮下注入（例えばミニ
ポンプを用いる）のいずれかにより投与する。静脈内用バッグ溶液もまた使用し
得る。変化を観察するために必要な処置期間および応答が生じる処置後の間隔は
、所望の効果に応じて変化するようである。
【０３２７】 ＰＤＥＦを含む薬学的組成物を、経口的、直腸内、非経口的、槽内（ｉｎｔｒ
ａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤
、または経皮パッチによるなど）、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして
投与する。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体または
液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の製剤補助剤をいう。本明細書で
用いる用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関
節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
【０３２８】 ＰＤＥＦはまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性組成物の適
切な例は、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの成形品の形態の半透過性
ポリマーマトリックスを包含する。徐放性マトリックスとしては、ポリラクチド
（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸お
よびγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ， Ｕ．ら、Ｂ
ｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒド
ロキシエチルメタクリレート）（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａ
ｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）、およびＲ．Ｌａｎｇｅｒ
，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））、エチレンビニルア
セテート（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸
（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。徐放性組成物はまた、リポソームに封入
されたＰＤＥＦポリペプチドを包含する。ＰＤＥＦを含有するリポソームは、そ
れ自体が公知である方法により調製される：ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔ
ｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８−
３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３
６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日
本国特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および
第４，５４４，５４５号ならびにＥＰ第１０２，３２４号。通常、リポソームは
、小さな（約２００〜８００Å）ユニラメラ型であり、そこでは、脂質含有量は
、約３０モル％コレステロールよりも多く、選択された割合が、最適分泌ポリペ
プチド治療のために調整される。
【０３２９】 非経口投与のために、１つの実施態様において、一般に、ＰＤＥＦは、それを
所望の程度の純度で、薬学的に受容可能なキャリア、すなわち用いる投薬量およ
び濃度でレシピエントに対して毒性がなく、かつ処方物の他の成分と適合するも
のと、単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で混合するこ
とにより処方される。例えば、この処方物は、好ましくは、酸化剤、およびポリ
ペプチドに対して有害であることが知られている他の化合物を含まない。
【０３３０】 一般に、ＰＤＥＦを液体キャリアまたは微細分割固体キャリアあるいはその両
方と均一および緊密に接触させて処方物を調製する。次に、必要であれば、生成
物を所望の処方物に成形する。好ましくは、キャリアは、非経口的キャリア、よ
り好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャリア
ビヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶
液が挙げられる。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような非水性ビヒクルも
また、リポソームと同様に本明細書において有用である。
【０３３１】 キャリアは、等張性および化学安定性を高める物質のような微量の添加剤を適
切に含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対
して毒性がなく、そしてこのような物質としては、リン酸塩、クエン酸塩、コハ
ク酸塩、酢酸および他の有機酸またはその塩類のような緩衝剤；アスコルビン酸
のような抗酸化剤；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド（例えば、
ポリアルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グ
ロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；
グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸；
セルロースまたはその誘導体、ブドウ糖、マンノースまたはデキストリンを含む
、単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニ
トールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン
；および／またはポリソルベート、ポロキサマーもしくはＰＥＧのような非イオ
ン性界面活性剤が挙げられる。
【０３３２】 ＰＤＥＦは、代表的には約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは
１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３〜８のｐＨで、このようなビヒクル中に処方
される。前記の特定の賦形剤、キャリアまたは安定化剤を使用することにより、
ポリペプチド塩が形成されることが理解される。
【０３３３】 治療的投与に用いられるＰＤＥＦは無菌状態であり得る。滅菌濾過膜（例えば
０．２ミクロンメンブレン）で濾過することにより無菌状態は容易に達成される
。一般に、治療用ポリペプチド組成物は、滅菌アクセスポートを有する容器、例
えば、皮下用注射針で穿刺可能なストッパー付の静脈内用溶液バッグまたはバイ
アルに配置される。
【０３３４】 ＰＤＥＦポリペプチドは、通常、単位用量または複数用量容器、例えば、密封
アンプルまたはバイアルに、水溶液または再構成するための凍結乾燥処方物とし
て貯蔵される。凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌのバイアルに、滅菌濾過し
た１％（ｗ／ｖ）ＰＤＥＦポリペプチド水溶液５ｍｌを充填し、そして得られる
混合物を凍結乾燥する。凍結乾燥したＰＤＥＦポリペプチドを注射用静菌水を用
いて再構成して注入溶液を調製する。
【０３３５】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分を満たした一つ以上の
容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品
の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような
容器に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関
する政府機関による承認を表す。さらに、ＰＤＥＦを他の治療用化合物と組み合
わせて使用し得る。
【０３３６】 （実施例２５：ＰＤＥＦのレベル低下を処置する方法） 本発明は、身体におけるＰＤＥＦ活性のレベル低下を必要とした個体を処置す
るための方法に関し、この方法は、そのような個体に治療学的有効量のＰＤＥＦ
アンタゴニストを含む組成物を投与する工程を包含する。本発明における使用の
ための好ましいアンタゴニストは、ＰＤＥＦ特異的抗体である。
【０３３７】 さらに、個体におけるＰＤＥＦの標準または正常発現レベルの低下により引き
起こされる状態は、ＰＤＥＦ（好ましくは可溶性（ｓｏｌｕａｂｌｅ）形態の）
を投与することにより処置し得ることが理解される。従って、本発明はまた、Ｐ
ＤＥＦポリペプチドのレベルの増加が必要な個体の処置方法を提供する。この方
法は、このような個体に、このような個体でＰＤＥＦの活性レベルを増加させる
量のＰＤＥＦを含む薬学的組成物を投与する工程を包含する。
【０３３８】 例えば、ＰＤＥＦポリペプチドのレベルが低下した患者は、ポリペプチドを、
１日用量０．１〜１００μｇ／ｋｇで６日続けて服用する。好ましくは、ポリペ
プチドは可溶性（ｓｏｌｕａｂｌｅ）形態である。投与および処方に基づく投薬
計画の正確な詳細は、実施例２４に提供されている。
【０３３９】 （実施例２６：ＰＤＥＦのレベル上昇を処置する方法） 本発明はまた、身体におけるＰＤＥＦ活性のレベル増加を必要とした個体を処
置するための方法に関し、この方法は、そのような個体に治療学的有効量のＰＤ
ＥＦまたはそのアゴニストを含む組成物を投与する工程を包含する。
【０３４０】 アンチセンス技術を使用してＰＤＥＦの産生を阻害する。この技術は、ガンの
ような様々な病因に起因するＰＤＥＦポリペプチド（好ましくは可溶性（ｓｏｌ
ｕａｂｌｅ）形態の）のレべルを低下させる方法の１つの例である。
【０３４１】 例えば、ＰＤＥＦのレベルが異常に上昇したと診断された患者に、アンチセン
スポリヌクレオチドを、０．５、１．０、１．５、２．０および３．０ｍｇ／ｋ
ｇ／日で静脈内に２１日間投与する。この処置に対して十分な耐性があれば、７
日間の休薬期間後に、この処置を繰り返す。アンチセンスポリヌクレオチド処方
は、実施例２４に提供されている。
【０３４２】 （実施例２７：遺伝子治療を使用する処置方法−エキソビボ） 遺伝子治療の１つの方法は、ＰＤＥＦポリペプチドを発現し得る線維芽細胞を
患者に移植する方法である。一般に、線維芽細胞は、皮膚生検により被験者から
得られる。得られた組織を組織培養培地中に配置し、そして小片に分割する。組
織の小塊を組織培養フラスコの湿潤表面に置き、ほぼ１０片を各フラスコに置く
。このフラスコを倒置し、しっかりと閉めた後、室温で一晩放置する。室温で２
４時間後、フラスコを反転させ、組織塊をフラスコの底に固定させたままにし、
そして新鮮培地（例えば、１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシン
を含有するＨａｍのＦ１２培地）を添加する。次に、フラスコを３７℃で約１週
間インキュベートする。
【０３４３】 この時点で、新鮮培地を添加し、次いで数日ごとに取り換える。さらに二週間
培養した後に単層の線維芽細胞が出現する。単層をトリプシン処理し、そしてさ
らに大きなフラスコにスケールアップする。
【０３４４】 Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルスの長末端反復が隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉ
ｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７：２１９−２５（１９８８））を
ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、仔ウシ腸ホスファターゼで処理
する。線状ベクターをアガロースゲルで分画し、そしてガラスビーズを使用して
精製する。
【０３４５】 ＰＤＥＦをコードするｃＤＮＡを、実施例１に記載のそれぞれ５’および３’
末端配列に対応するＰＣＲプライマーを使用して増幅し得る。好ましくは、５’
プライマーはＥｃｏＲＩ部位を含み、そして３’プライマーはＨｉｎｄＩＩＩ部
位を含む。等量の、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルス線状骨格および増幅した
ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在
下で一緒に加える。得られた混合物を二つのフラグメントを連結するのに適した
条件下で維持する。次に、連結混合物を使用し、細菌ＨＢ１０１を形質転換する
。次に、ベクターが正確に挿入されたＰＤＥＦを含むことを確認するために、そ
れを、カナマイシンを含む寒天上にプレーティングする。
【０３４６】 アンフォトロピックｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を、
１０％仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＤｕｌ
ｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅｓ培地（ＤＭＥＭ）中、組織培養でコンフルエントな
密度まで増殖させる。次に、ＰＤＥＦ遺伝子を含むＭＳＶベクターを培地に加え
、そしてパッケージング細胞にベクターを形質導入する。このとき、パッケージ
ング細胞はＰＤＥＦ遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（ここで、パッ
ケージング細胞をプロデューサー細胞という）。
【０３４７】 形質導入されたプロデューサー細胞に新鮮培地を添加し、次いで培地を１０ｃ
ｍプレートのコンフルエントなプロデューサー細胞から採取する。感染性ウイル
ス粒子を含む使用済み培地をミリポアーフィルターを通して濾過し、はがれたプ
ロデューサー細胞を除去した後、この培地を使用して、線維芽細胞を感染させる
。線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから培地を除去し、そしてプロデ
ューサー細胞からの培地で速やかに置き換える。この培地を除去し、そして新鮮
培地と置き換える。ウイルスの力価が高ければ、実質的にすべての線維芽細胞が
感染され、選択は必要ではない。力価が非常に低ければ、ｎｅｏまたはｈｉｓの
ような選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用することが必要であ
る。一旦、線維芽細胞が効率的に感染したなら、線維芽細胞を分析し、ＰＤＥＦ
タンパク質が産生されているか否かを決定する。
【０３４８】 次に、操作された線維芽細胞を、単独で、またはサイトデックス３マイクロキ
ャリアビーズ上でコンフルエントに増殖させた後のいずれかで宿主に移植する。
【０３４９】 （実施例２８：遺伝子治療を使用する処置方法−インビボ） 本発明の別の局面は、障害、疾患、および状態を処置するためにインビボ遺伝
子治療方法を使用することである。遺伝子治療法は、ＰＤＥＦポリペプチドの発
現を増大または減少させるために、裸の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびアンチセ
ンスＤＮＡまたはＲＮＡ）ＰＤＥＦ配列の動物への導入に関する。このＰＤＥＦ
ポリヌクレオチドは、プロモーターまたは標的組織によるＰＤＥＦポリペプチド
の発現に必要な任意の他の遺伝子エレメントに作動可能に連結され得る。このよ
うな遺伝子治療および送達の技術および方法は、当該分野で公知であり、例えば
、ＷＯ９０／１１０９２、ＷＯ９８／１１７７９；米国特許第５，６９３，６２
２号、同第５，７０５，１５１号、同第５，５８０，８５９号；Ｔａｂａｔａ
Ｈら、（１９９７） Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｒｅｓ． ３５（３）：４７０
−４７９， Ｃｈａｏ Ｊら、（１９９７） Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｓ．
３５（６）：５１７−５２２， Ｗｏｌｆｆ Ｊ．Ａ．（１９９７） Ｎｅｕ
ｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．７（５）：３１４−３１８， Ｓｃｈｗａｒ
ｔｚ Ｂ．ら（１９９６） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ３（５）：４０５−４１１
， Ｔｓｕｒｕｍｉ Ｙ．ら、（１９９６）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９４（１
２）：３２８１−３２９０（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと
。
【０３５０】 ＰＤＥＦポリヌクレオチド構築物は、注射可能な物質を動物の細胞に送達する
任意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓、腸など）の間隙空間
への注射）によって送達され得る。ＰＤＥＦポリヌクレオチド構築物は、薬学的
に受容可能な液体または水性キャリア中で送達され得る。
【０３５１】 用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、またはＲＮＡは、細胞への侵入を補
助、促進または容易にするように作用するいかなる送達ビヒクル（ウイルス配列
、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、または沈澱剤などを含む
）も含まない配列をいう。しかし、ＰＤＥＦポリヌクレオチドはまた、当業者に
周知の方法によって調製され得るリポソーム処方物（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ
Ｐ．Ｌ．ら （１９９５） Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７７２：
１２６−１３９およびＡｂｄａｌｌａｈ Ｂら、（１９９５）Ｂｉｏｌ． Ｃｅ
ｌｌ ８５（１）：１−７で教示されたもの）中で送達され得る。
【０３５２】 遺伝子治療方法において使用されたＰＤＥＦポリヌクレオチドベクター構築物
は、好ましくは、宿主ゲノムに組み込まれず、複製を可能にする配列を含まない
構築物である。当業者に公知の任意の強力なプロモーターは、ＤＮＡの発現を駆
動するために用いられ得る。他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸配列を標
的細胞に導入する１つの主要な利点は、細胞におけるポリヌクレオチド合成の一
過性の性質である。研究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入されて、６ヶ
月までの間の期間、所望のポリペプチドの産生を提供し得ることが示された。
【０３５３】 ＰＤＥＦポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉、皮膚、脳、肺、肝
臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃
、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を包含する）
の間隙空間に送達され得る。組織の間隙空間は、細胞間液、器官組織の細網線維
間のムコ多糖マトリクス、血管もしくは室の壁における弾性線維、線維性組織の
コラーゲン線維、または筋肉細胞を覆う結合組織もしくは骨の裂孔中の同じマト
リクスを包含する。これは、同様に、循環の血漿およびリンパチャンネルのリン
パ液により占められた空間である。筋肉組織の間隙空間への送達は、以下に記載
の理由のために好ましい。それらは、これらの細胞を含む組織への注射によって
、好都合に送達され得る。それらは、好ましくは、分化した持続性の非分裂細胞
に送達され、その細胞において発現されるが、送達および発現は、非分化細胞ま
たは完全には分化していない細胞（例えば、血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞
）において達成され得る。インビボ筋肉細胞は、ポリヌクレオチドを取り込み、
そして発現する能力において、特に適格である。
【０３５４】 裸のＰＤＥＦポリヌクレオチド注射のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投薬
量は、約０．０５ｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。好まし
くは、投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇであり、そして
より好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇである。もちろん、
当業者が認識するように、この投薬量は、注射の組織部位に従って変化する。核
酸配列の適切かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得、そして処
置される状態および投与経路に依存し得る。好ましい投与経路は、組織の間隙空
間への非経口注射経路によってである。しかし、他の非経口経路もまた用いられ
得、これには、例えば、特に肺または気管支組織、咽喉または鼻の粘膜への送達
のためのエアロゾル処方物の吸入が挙げられる。さらに、裸のＰＤＥＦポリヌク
レオチド構築物が、血管形成術の間にこの手順において用いられるカテーテルに
よって動脈に送達され得る。
【０３５５】 インビボでの筋肉における注入ＰＤＥＦポリヌクレオチドの用量応答効果を、
以下のようにして決定する。ＰＤＥＦポリペプチドをコードするｍＲＮＡの生成
のための適切なＰＤＥＦ鋳型ＤＮＡを、標準的な組換えＤＮＡ方法論に従って調
製する。鋳型ＤＮＡ（これは環状または直鎖状のいずれかであり得る）を裸のＤ
ＮＡとして使用するか、またはリポソームと複合体化するかのいずれかである。
次いで、マウスの四頭筋に、多様な量の鋳型ＤＮＡを注射する。
【０３５６】 ５〜６週齢の雌および雄のＢａｌｂ／Ｃマウスに、０．３ｍｌの２．５％Ａｖ
ｅｒｔｉｎを腹腔内注射することにより麻酔する。１．５ｃｍの切開を大腿前部
で行い、そして四頭筋を直接可視化する。ＰＤＥＦ鋳型ＤＮＡを、０．１ｍｌの
キャリアに入れて、１ｃｃ注射器で２７ゲージ針を通して１分間にわたって、筋
肉の遠位挿入部位から膝に約０．５ｃｍで、そして約０．２ｃｍの深さで注射す
る。縫合を、将来的な局在化のための注射部位にわたって行い、そして皮膚をス
テンレス鋼クリップで閉じる。
【０３５７】 適切なインキュベーション時間（例えば、７日）後、筋肉抽出物を、四頭全体
を切り出すことによって調製する。個々の四頭筋の５枚毎の１５μｍ切片を、Ｐ
ＤＥＦタンパク質発現について組織化学的に染色する。ＰＤＥＦタンパク質発現
についての時間経過は、異なるマウスからの四頭筋を異なる時間で採取すること
以外は、同様な様式で行い得る。注射後の筋肉中のＰＤＥＦ ＤＮＡの持続性を
、注射マウスおよびコントロールマウスからの全細胞性ＤＮＡおよびＨＩＲＴ上
清を調製した後、サザンブロット分析によって決定し得る。マウスにおける上記
実験の結果は、裸のＰＤＥＦ ＤＮＡを用いて、ヒトおよび他の動物において適
切な投薬量および他の処置パラメーターを推定するために使用され得る。
【０３５８】 （実施例２９：アンドロゲン刺激の間のＰＤＥＦ発現） アンドロゲン刺激に対する前立腺上皮細胞の感受性をを考慮すると、前立腺上
皮細胞におけるＰＤＥＦの高い発現に加えて、ＰＤＥＦがアンドロゲン応答に関
与し得るかどうかを知ることは興味深い。ヒト前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ）を、
アンドロゲン刺激の前に任意のステロイドを欠く特殊な増殖培地において飢餓さ
せた。アンドロゲンの添加は、異なる前立腺マーカー遺伝子（例えば、ＰＳＡ）
の、アップレギュレーションおよびダウンレギュレーションの種々の段階を通し
て２４時間よりも長い期間にわたって進行する遺伝子発現のプログラムを開始し
た。
【０３５９】 ＬＮＣａＰ細胞のアンドロゲン誘導の間、ＰＤＥＦ発現を評価するために、飢
餓させたＬＮＣａＰ細胞由来のｍＲＮＡおよびアンドロゲンでの誘導後の異なる
時点でのＬＮＣａＰ細胞由来のｍＲＮＡを用いて、ＲＴ／ＰＣＲを行なった。Ｒ
ＮＡの質を評価するため、および相対的な発現レベルを大まかに比較するために
、各ＲＮＡサンプルを、ＧＡＰＤＨ発現についてＲＴ／ＰＣＲにより分析した。
ＲＴ／ＰＣＲについての条件は、以下を含む：ｃＤＮＡを、デオキシリボヌクレ
アーゼＩ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で処理したサンプルにおいて、オリゴｄＴ１２
−１８プライミング（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ．
ＵＳＡ）およびＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて、異なる
細胞または組織から単離された１μｇのｍＲＮＡから生成した。各ＰＣＲは、等
量の（０．１ｎｇ）のｃＤＮＡ、４ｎｇ／μｌの各プライマー、０．２５ユニッ
トのＴａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ．ＵＳＡ）、
１５０μＭの各ｄＮＴＰ、３ｍＭのＭｇＣｌ2、反応緩衝液、および水を使用し
（終容積２５μｌ）、そしてミネラルオイルを用いてカバーした。ＧＡＰＤＨに
ついてのプライマーの配列は、以下であり：センス：５’−ＣＡＡＡＧＴＴＧＴ
ＣＡＴＧＧＡＴＧＡＣＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、アンチセンス：
５’−ＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴＧＧＧＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
５）、２００ｂｐの推定増幅産物を生じた。ＲＴ／ＰＣＲ増幅を、Ｐｅｒｋｉｎ
−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓサーマルサイクラー４８０を用いて、以下のように行
なった：９４℃にて１分間、５６℃にて１分間、および７２℃にて１分間の２０
〜３０サイクル、次いで、７２℃にて１５分間。より少ない数のサイクルを使用
して、増幅シグナルの直線性を確かめた。増幅産物を、２％のアガロースゲル上
で分析した。
【０３６０】 ＰＣＲ増幅の各時点からの等量のｃＤＮＡを用いて、非常に類似したレベルの
ＧＡＰＤＨ増幅産物が、異なる数の増幅サイクルを使用した場合でさえ、全ての
サンプルについて得られた。ＰＤＥＦ発現を、刺激していないＬＮＣａＰ細胞に
おいて、既に検出した。しかし、刺激の１２時間後、増強されたＰＤＥＦの発現
が明瞭であった。これらの結果は、ＰＤＥＦの発現が、刺激の１２時間後の前立
腺癌細胞のアンドロゲン刺激の間に上方調節されることを示唆する。
【０３６１】 別のＥｔｓ因子ＥＳＥ−１の発現が、同様に誘導され得るかどうかを決定する
ために、ＥＳＥ−１特異的プライマーを用いるＲＴ／ＰＣＲを行なった。ＰＤＥ
Ｆと対照的に、ＥＳＥ−１の発現は、アンドロゲン刺激の間、有意に変化しなか
った。このことは、ＰＤＥＦが、アンドロゲン刺激の間、特異的に上方調節され
ることを示す。
【０３６２】 （実施例３０：他のＥｔｓ因子と異なり、ＰＤＥＦはＰＳＡ遺伝子の転写を特
異的に増強する） ＰＤＥＦが、転写のリプレッサーとして作用するのか、またはエンハンサーと
して作用するのかの評価において、そして前立腺に特異的な前立腺特異的抗原（
ＰＳＡ）遺伝子がＰＤＥＦについての標的である可能性を評価するために、真核
生物発現ベクター中に挿入した全長ＰＤＥＦ（ｐＣＩ／ＰＤＥＦ）を、ＰＤＥＦ
ネガティブＣＶ−１細胞中に、ＰＳＡプロモーターの制御下のルシフェラーゼ遺
伝子を含むｐＧＬ２レポーター遺伝子構築物とともに同時トランスフェクトした
。ＰＳＡは、ヒト前立腺癌についての診断マーカーとしてのその使用のための有
意な臨床的に価値のある分泌タンパク質をコードする。さらに、種々の他のＥｔ
ｓ因子をコードする発現ベクターを、ＰＤＥＦに対するそれらの活性と比較する
ために同時トランスフェクトした。
【０３６３】 ３×１０5のＣＶ−１細胞の同時トランスフェクションを、２μｇのレポータ
ー遺伝子構築物ＤＮＡおよび３μｇの発現ベクターＤＮＡとともに、上記のよう
に１２．５μｌのリポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いて行なった。
細胞を、トランスフェクションの１６時間後に回収するか、またはチャコールス
トリップ（ｃｈａｒｃｏａｌ ｓｔｒｉｐｐｅｄ）ＦＣＳを含むアンドロゲンを
含まない培地において２４時間飢餓させ、次いで、２４時間アンドロゲンととも
にインキュベートし、そしてルシフェラーゼ活性についてアッセイした。各構築
物について、トランスフェクションを別個に２連で行ない、そして２つの異なる
プラスミド調製物を用いて３〜４回反復し同様の結果を得た。トランスフェクシ
ョン効率の決定のための第二のプラスミドの同時トランスフェクションは、省略
した。なぜなら、この技術を用いる潜在的な人工産物が報告されており、そして
多くの通常使用されるウイルスプロモーターは、Ｅｔｓ因子の潜在的結合部位を
含むからである。
【０３６４】 ｐＣＩ／ＰＤＥＦを用いる同時トランスフェクションは、親のｐＣＩベクター
と比較して、約７倍のＰＳＡプロモーターの転写刺激を生じた（図７を参照のこ
と）。対照的に、他のＥｔｓ因子は、ＰＳＡプロモーター活性に対して有意な効
果を全く有さず、ＥＳＥ−１のようなＥｔｓ因子は、ＰＳＡプロモーターを増強
するよりもむしろ抑制するようであった。従って、ＰＳＡ遺伝子は、ＰＤＥＦに
より活性化され得、このことは、転写のポジティブなレギュレーターとしてのＰ
ＤＥＦの有用性を実証し、ＰＳＡが、確かに、ＰＤＥＦに関連する前立腺特異的
な標的であり得ることを意味する。同時トランスフェクションについての条件は
また以下を含む：３×１０5のＣＶ−１細胞の同時トランスフェクションを、３
μｇのレポーター遺伝子構築物ＤＮＡおよび１μｇの発現ベクターＤＮＡを用い
て、１２．５μｌのリポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を使用して実施し
た。細胞を、無血清ＤＭＥＭを用いて洗浄した。１．６ｍｌの無血清ＤＭＥＭを
ウェルごとに加えた。リポソームを、室温にて１５分間、２００μｌの無血清Ｄ
ＭＥＭ中で、ＤＮＡとともにインキュベートし、次いで４時間３７℃にて細胞と
ともにインキュベートした。２０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有する２ｍｌ
のＤＭＥＭを添加し、トランスフェクションの１６時間後に細胞を採取し、そし
て上記のようにルシフェラーゼ活性についてアッセイした。各構築物についての
トランスフェクションを別個に２連で実施し、そして少なくとも２つの異なるプ
ラスミド調製物を用いて２〜５回反復し同様の結果を得た（Ｏｅｔｔｇｅｎ，Ｐ
、Ａｋｂａｒａｌｉ，Ｙ、Ｂｏｌｔａｘ，Ｊ、Ｂｅｓｔ，Ｊ、Ｋｕｎｓｃｈ，Ｃ
およびＬｉｂｅｒｍａｎｎ，Ｔａ（１９９６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１
６：５０９１−５１０６）。
【０３６５】 （実施例３１：ＰＤＥＦはアンドロゲンレセプターと相互作用し、そしてＰＳ
Ａ遺伝子の転写を相乗的に増強する） Ｅｔｓ部位に加えて、種々の他の調節エレメントが、ＰＳＡ遺伝子のアンドロ
ゲン誘導性に重要であることが見出されているアンドロゲンレセプター結合部位
を含むＰＳＡプロモーターに存在する。全てのＥｔｓ因子の特徴的な機能は、他
の転写因子と相互作用するそれらの能力であり、これは、ＰＳＡプロモーター内
の調節エレメントに結合する因子とＰＤＥＦの相互作用が、転写制御の重要な機
構であり得ることを示唆する。
【０３６６】 ＰＤＥＦがアンドロゲンレセプターと相互作用する可能性を調査するために、
ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）低下（ｐｕｌｌ ｄｏｗｎ）
実験を行なった。全長ＰＤＥＦ遺伝子の異なるドメインを、ＧＳＴコード領域に
融合し、そして融合タンパク質として細菌において発現させた（図８参照のこと
）。ＰＤＥＦをインビトロにおいて転写し、そして網状赤血球溶解物におけるタ
ンパク質に翻訳し、予想された分子量のタンパク質が主要な産物として明らかに
された（図９を参照のこと）。微量のさらなるより速い移動度（低分子量）のタ
ンパク質が、部分的タンパク質分解、内部翻訳開始、または早発性翻訳終結のい
ずれかに起因して存在した。インビトロ翻訳のためのプラスミド構築物は、ＴＡ
クローニングベクター（ｐＣＲ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中のＴ７プロモー
ターの下流に完全なオープンリーディングフレームをコードする全長ＰＤＥＦ
ｃＤＮＡの挿入により構築した。組み合わせたインビトロ転写／インビトロ翻訳
反応を行なった（Ｐｒｏｍｅｇａ）。アフィニティー精製したＧＳＴ−アンドロ
ゲンレセプターフラグメントをインビトロ翻訳した３５Ｓ−メチオニン標識した
ＰＤＥＦとともにインキュベートし、洗浄し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｓｏｄ
ｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ−Ｓｕｌｆａｔｅ Ｐｏｌｙ−Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ
Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）により分析した（図１０参照のこと
）。
【０３６７】 インビトロ翻訳のための条件を以下に挙げる：完全なオープンリーディングフ
レームをコードする全長ＰＤＥＦ ｃＤＮＡを、開始メチオニンの上流のＴ７プ
ロモーターを含むＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し
た。組み合わせたインビトロ転写／インビトロ翻訳反応を、（35Ｓ）−メチオニ
ン（ＮＥＮ）または非標識メチオニンのいずれかの存在下で、製造者により推奨
される通りに、ＴＮＴ網状赤血球溶解キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびＴ７ＲＮ
Ａポリメラーゼを、１μｇのプラスミドとともに使用して行なった。標識された
インビトロ翻訳産物の一部を、１０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上にて分析した。
【０３６８】 ＰＤＥＦは、ＤＮＡ結合ドメインを含む任意のＧＳＴ−アンドロゲンレセプタ
ー融合タンパク質により特異的に減少されたが、ＧＳＴ単独または他のアンドロ
ゲンレセプターのドメインによって減少されなかった。
【０３６９】 ＰＤＥＦとアンドロゲンレセプターとの間の物理的相互作用が、機能的な相互
作用と相関するか否かを評価するために、ＰＤＥＦおよびアンドロゲンレセプタ
ー発現ベクターを、ＰＳＡプロモータールシフェラーゼ構築物とともに同時トラ
ンスフェクトし、そして細胞をアンドロゲンＤＨＴ（ジヒドロ−テストステロン
）の非存在下または存在下のいずれかで培養した。トランスフェクションの条件
は以下を含む：３×１０5のＣＶ−１細胞のトランスフェクションを、３μｇの
レポーター遺伝子構築物ＤＮＡおよび１μｇの発現ベクターＤＮＡを記載のよう
に１２．５ｍｌのリポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いて行なった。
細胞を、トランスフェクションの１６時間後に回収するか、または１０％チャコ
ールストリップＦＣＳを含むアンドロゲンを含まない培地において２４時間飢餓
させ、次いで、２４時間アンドロゲンとともにインキュベートし、そしてルシフ
ェラーゼ活性についてアッセイした。各構築物について、トランスフェクション
を別個に２連で行ない、そして２つの異なるプラスミド調製物を用いて３〜４回
反復し同様の結果を得た。トランスフェクション効率の決定のための第二のプラ
スミドの同時トランスフェクションは、省略した。なぜなら、この技術を用いる
潜在的な人工産物が報告されており、そして多くの通常使用されるウイルスプロ
モーターは、Ｅｔｓ因子の潜在的な結合部位を含むからである。ＰＳＡ／ルシフ
ェラーゼ構築物（ｐＧＬ２／ＰＳＡ−６２８）を、ルシフェラーゼｐＧＬ２ベク
ター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて融合タンパク質として構築した（Ｓｕｎ，Ｚ，
Ｐａｎ，Ｊ，およびＢａｌｋ，Ｓ．Ｐ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：
３３１８−３３２５（１９９７））（図１１を参照のこと）。
【０３７０】 アンドロゲンの非存在下でのＰＤＥＦは、ＰＳＡプロモーター活性を約４倍増
強した。同様に、アンドロゲンの存在下でのアンドロゲンレセプターは、ＰＳＡ
プロモーターを約５倍増強した。ＰＤＥＦ、アンドロゲンレセプターおよびアン
ドロゲンの存在下において、ＰＳＡプロモーターのトランス活性化の相乗効果が
観察され、このことは、ＰＤＥＦおよびアンドロゲンレセプターが、ＰＳＡプロ
モーターの調節において協力することを示す。
【０３７１】 （実施例３２：ヒト腫瘍におけるＰＤＥＦの差示的発現） ヒト癌細胞株および原発性癌組織におけるＰＤＥＦの発現レベルを評価するた
めに、癌細胞株および原発性癌組織由来のｍＲＮＡを単離した。ＲＴ／ＰＣＲ分
析は、上皮起源の種々の癌におけるＰＤＥＦの高い差示的発現パターンを明らか
にした。同様の量のｃＤＮＡを各反応に使用したことを確認するために、ＧＡＰ
ＤＨ特異的プライマーでのＲＴ／ＰＣＲを、本発明の実施例３に記載の方法に従
って行なった。７つの肺癌細胞株の３つがＰＤＥＦを発現したが、頸部癌細胞株
の間ではＡ−４３１のみＰＤＥＦを発現したが、ＨｅＬａ細胞またはＣ−３３Ａ
細胞はＰＤＥＦを発現しなかった。
【０３７２】 原発性腫瘍の間で、同様の結果の差示的発現が観察された。３つの結腸癌の１
つ、２つの乳癌、２つの前立腺癌、１つの子宮内膜癌および３つのウィルムス腫
瘍の２つが、ＰＤＥＦ転写物を発現したが、肝臓癌、膵臓癌、および卵巣癌は、
ＰＤＥＦ発現の証拠が見られなかった。これらの結果は、種々の腫瘍が、高レベ
ルのＰＤＥＦを発現するが、これらまたは他の腫瘍の特定の部分においてＰＤＥ
Ｆは発現されないことを示唆する。
【０３７３】 ＰＤＥＦ発現を評価するために使用した原発性腫瘍の型および細胞株は以下を
含む：ＳＣＣ−４（舌の扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）
）、ＳＣＣ−９（舌の扁平上皮癌）、ＳＣＣ−１３（表皮扁平上皮癌）、ＳＣＣ
−１５（舌の扁平上皮癌）、ＳＣＣ−４０（軟口蓋扁平上皮癌）、ＨａＣａＴ（
突発性不朽化（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ）皮膚
ケラチノサイト、ｐ５３変異体）、ＨｅＬａ（頸部癌）、Ａ４３１（外陰部癌）
、Ｃ−３３Ａ（頸部癌）、ＳＫ−ＭＥＳ−１（扁平上皮肺癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ
ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ））、ＣｈａＧｏ Ｋ−１（未分化の気管支原
生癌）、Ｃａｌｕ １（類表皮肺癌、グレードＩＩＩ）、Ｈ１５７（大細胞肺癌
）、Ｃａｌｕ６（肺腺癌）、Ａ５４９（肺腺癌）、Ｈ２４９（小細胞肺癌）、Ｉ
ＧＲ３（黒色腫）、Ｕ−３７３ Ｍｇ（星状細胞腫、グレードＩＩＩ）、３４０
（神経膠芽細胞腫）、Ｃｌ２２９（神経膠芽細胞腫）、Ａ１７２（神経膠芽細胞
腫）、Ｔ４７（神経膠腫）、Ｕ−７０６Ｔ（巨細胞神経膠芽細胞腫）、Ｕ−３４
３ Ｍｇ（神経膠芽細胞腫）、Ｕ−Ｃｌ２：６（神経膠芽細胞腫）、Ｕ−１２４
２ Ｍｇ（神経膠芽細胞腫）、およびＵ−５６３ Ｍｇ（神経膠芽細胞腫）。（
例えば、Ｌｉｂｅｒｍａｎｎ，Ｔ．Ａ．およびＤ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、「Ａ
Ｐｒｅ−Ｂ−Ｃｅｌｌ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｅｌｅｍｅｎｔ
ｉｎ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｈｅａｖｙ−Ｃｈａｉｎ Ｅ
ｎｈａｎｃｅｒ」Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３（１０）：５９５７−６９
（１９９３）；Ｌｉｂｅｒｍａｎｎ，Ｔ．Ａ．，Ｆｒｉｅｓｅｌ，Ｒ．，Ｊａｙ
ｅ，Ｍ．，Ｌｙａｌｌ，Ｒ．Ｍ．，Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ，Ｂ．，Ｄｒｏｈａｎ
，Ｗ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ａ．，Ｍａｃｉａｇ，Ｔ．およびＳｃｈｌｅｓｓｉｎ
ｇｅｒ，Ｊ．「Ａｎ Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ｉ
ｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｌｉｏｍａ Ｃｅｌｌｓ」Ｅｍ
ｂｏ Ｊ．、６：１６２７−１６３２（１９８７）；Ｏｅｔｔｇｅｎ，Ｐ．，Ａ
ｋｂａｒａｌｉ，Ｙ．，Ｂｏｌｔａｘ，Ｊ．，Ｂｅｓｔ，Ｊ．，Ｋｕｎｓｃｈ，
Ｃ．およびＬｉｂｅｒｍａｎｎ，Ｔ．Ａ．「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ ＮＥＲＦ，ａ Ｎｏｖｅｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏ
ｒ Ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ Ｅｔｓ Ｆａｃｔｏｒ ＥＬＦ−１」Ｍｏｌ．Ｃｅ
ｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１６：５０９１−５１０６（１９９６）；Ｒｈｅｉｎｗａｌ
ｄ，Ｊ．Ｇ．およびＭ．Ａ．Ｂｅｃｋｅｔｔ「Ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ Ｋｅｒ
ａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｌｉｎｅｓ Ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ Ａｎｃｈｏｒａｇｅ
ａｎｄ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｒｏｍ
Ｈｕｍａｎ Ｓｑｕａｍｏｕｓ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ」Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓ．、４１（５）：１６５７−６３（１９８１））。
【０３７４】 本発明は、前記の説明および実施例において詳細に記載される場合以外にも実
施され得ることは明らかである。本発明の多数の改変および変更が、上記の教示
を考慮して可能であり、従って添付の特許請求の範囲内である。
【０３７５】 発明の背景、詳細な説明および実施例において引用された各文書の全開示（特
許、特許出願、学術文献、要約、実験マニュアル、書籍または他の開示を含む）
は、これによって、本明細書中に参考として援用される。さらに、配列表は、本
明細書中で参考として援用される。
【０３７６】
【表１】
【０３７７】
【表２】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａ〜Ｂは、ＰＤＥＦのヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ
酸配列（配列番号２）を示す。指示ドメインおよびＥｔｓドメインに対する保存
領域を、それぞれ、一重下線および二重下線で示す。
【図２】 図２は、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡ Ｓｔａｒ ｓｕｉｔ ｏｆ ｐｒｏｇｒ
ａｍｓ）分析によって決定された、ＰＤＥＦタンパク質のアミノ酸配列とＤｒｏ
ｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｇａｓｔｏｒ ＥＴＳ−４（配列番号３）（Ｇｅｎ
ｅｂａｎｋ登録番号ｇｉ｜１５７１９６）の翻訳産物との間の同一性の領域を示
す。２つのポリペプチド間の同一アミノ酸に斜線を付けて示し、一方保存的アミ
ノ酸を四角で囲む。斜線および／または四角で囲まれたアミノ酸の領域を調べる
ことによって、当業者は、この２つのポリペプチド間の保存されたドメインを容
易に同定し得る。
【図３】 図３は、ＰＤＥＦアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターンおよびコイルの
領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指数および表面
可能性を示す。「抗原性指数またはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」グラフにおいて
、正のピークは、ＰＤＥＦタンパク質の高度に抗原性の領域（すなわち、本発明
のエピトープ保有ペプチドから得られ得る領域）の位置を示す。これらのグラフ
によって定義されたドメインは、本発明によって意図される。図３にグラフとし
て要約されたデータの表による提示は、１０３〜１０６頁に見出される。
【図４Ａ】 図４Ａ〜Ｃは、ノーザンハイブリダイゼーションによる異なるヒト胎児組織お
よび成体組織におけるＰＤＥＦ発現の組織分布を示す。ブロットは、示された組
織（本発明の実施例３を参照のこと）由来のポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡを使用して、
ストリンジェント条件下で、ＰＤＥＦ（上パネル）、ＥＳＥ−１（中パネル）お
よびＧＡＤＰＨ ｃＤＮＡ（下パネル）のプローブを用いて、連続的にプローブ
した。当業者は、ブロットに対するバンドの強度および位置を、各組織内のＰＤ
ＥＦ ｍＲＮＡの量および大きさの両方の指示として、容易に関連付ける。
【図４Ｂ】 図４Ａ〜Ｃは、ノーザンハイブリダイゼーションによる異なるヒト胎児組織お
よび成体組織におけるＰＤＥＦ発現の組織分布を示す。ブロットは、示された組
織（本発明の実施例３を参照のこと）由来のポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡを使用して、
ストリンジェント条件下で、ＰＤＥＦ（上パネル）、ＥＳＥ−１（中パネル）お
よびＧＡＤＰＨ ｃＤＮＡ（下パネル）のプローブを用いて、連続的にプローブ
した。当業者は、ブロットに対するバンドの強度および位置を、各組織内のＰＤ
ＥＦ ｍＲＮＡの量および大きさの両方の指示として、容易に関連付ける。
【図４Ｃ】 図４Ａ〜Ｃは、ノーザンハイブリダイゼーションによる異なるヒト胎児組織お
よび成体組織におけるＰＤＥＦ発現の組織分布を示す。ブロットは、示された組
織（本発明の実施例３を参照のこと）由来のポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡを使用して、
ストリンジェント条件下で、ＰＤＥＦ（上パネル）、ＥＳＥ−１（中パネル）お
よびＧＡＤＰＨ ｃＤＮＡ（下パネル）のプローブを用いて、連続的にプローブ
した。当業者は、ブロットに対するバンドの強度および位置を、各組織内のＰＤ
ＥＦ ｍＲＮＡの量および大きさの両方の指示として、容易に関連付ける。
【図５Ａ】 図５Ａ〜Ｂは、ドットプロットハイブリダイゼーションによる異なるヒト胎児
組織および成体組織由来のポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ内のＰＤＥＦ発現の組織分布を
示す。ブロットは、本発明の実施例３に記載の条件下でＰＤＥＦでプローブした
。当業者は、ドットの強度を、各組織内のＰＤＥＦ ｍＲＮＡの量の指示として
、容易に関連付ける。
【図５Ｂ】 図５Ａ〜Ｂは、ドットプロットハイブリダイゼーションによる異なるヒト胎児
組織および成体組織由来のポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ内のＰＤＥＦ発現の組織分布を
示す。ブロットは、本発明の実施例３に記載の条件下でＰＤＥＦでプローブした
。当業者は、ドットの強度を、各組織内のＰＤＥＦ ｍＲＮＡの量の指示として
、容易に関連付ける。
【図６】 図６Ａ〜Ｄは、インサイチュハイブリダイゼーション研究を示す。明視野（Ａ
，Ｃ）および対応する偏光蛍光（Ｂ，Ｄ）の顕微鏡写真を対にする。正常肺にお
ける前立腺上皮の強い標識化が、ＰＤＥＦ ｍＲＮＡに対するアンチセンスプロ
ーブを用いて見られる（Ａ，Ｂ）。コントロールのセンスプローブ（Ｃ，Ｄ）を
用いては、標識化は見られない。
【図７】 図７は、発現されたＰＤＥＦポリペプチドの存在下でのＰＳＡプロモーターの
転写誘導のレベルを示す。示されたデータは、１つの代表的なトランスフェクシ
ョンからの３連の測定の平均である。
【図８】 図８は、構築されたＧＳＴ／ＰＤＥＦ融合タンパク質を示す。
【図９】 図９は、全長ＰＤＥＦポリペプチドおよび短縮化（Δ１９４）ＰＤＥＦポリペ
プチドに加えて、プログラムされていない網状赤血球溶解物（「−」で示される
）のインビトロ翻訳産物を示す。翻訳産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し
、そしてオートラジオグラフィーによって可視化した。
【図１０】 図１０は、「ＧＳＴ−プルダウン」実験によって決定されたように、ＰＤＥＦ
がアンドロゲンレセプターと物理的に相互作用することを示す。
【図１１】 図１１は、ＰＤＥＦおよびアンドロゲンレセプターがＰＳＡプロモーター活性
化において協調することを示す。ＣＶ−１細胞を、ＰＤＥＦおよびアンドロゲン
レセプターの発現ベクターまたは親のｐＣＩ発現ベクター、ならびにＰＳＡプロ
モーターを含むルシフェラーゼ構築物で同時トランスフェクトした。溶解物中の
ルシフェラーゼ活性を、本発明の実施例において記載されたように、アンドロゲ
ン（ＤＨＴ）の存在下または非存在下で４８時間後に測定した。示されるデータ
は、１つの代表的なトランスフェクション由来の２連の測定の平均である。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年２月２２日（２００１．２．２２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３７５
【補正方法】変更
【補正内容】
【０３７５】 発明の背景、詳細な説明および実施例において引用された各文書の全開示（特
許、特許出願、学術文献、要約、実験マニュアル、書籍または他の開示を含む）
は、これによって、本明細書中に参考として援用される。さらに、配列表は、本
明細書中で参考として援用される。
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Libermann, Towia A. Oettgen, Joerg P. Kunsch, Charles A. Endress, Gregory A. Rosen, Craig A. <120> Prostate Derived Ets Factor <130> 1488.1090000 <140> 09/126,945 <141> 1998-07-31 <160> 15 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1894 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gtctgacttc ctcccagcac attcctgcac tctgccgtgt ccacactgcc ccacagaccc 60 agtcctccaa gcctgctgcc agctccctgc aagcccctca ggttgggcct tgccacggtg 120 ccagcaggca gccctgggct gggggtaggg gactccctac aggcacgcag ccctgagacc 180 tcagagggcc accccttgag ggtggccagg cccccagtgg ccaacctgag tgctgcctct 240 gccaccagcc ctgctggccc ctggttccgc tggcccccca gatgcctggc tgagacacgc 300 cagtggcctc agctgcccac acctcttccc ggcccctgaa gttggcactg cagcagacag 360 ctccctgggc accaggcagc taacagacac agccgccagc ccaaacagca gcggcatggg 420 cagcgccagc ccgggtctga gcagcgtatc ccccagccac ctcctgctgc cccccgacac 480 ggtgtcgcgg acaggcttgg agaaggcggc agcgggggca gtgggtctcg agagacggga 540 ctggagtccc agtccacccg ccacgcccga gcagggcctg tccgccttct acctctccta 600 ctttgacatg ctgtaccctg aggacagcag ctgggcagcc aaggcccctg gggccagcag 660 tcgggaggag ccacctgagg agcctgagca gtgcccggtc attgacagcc aagccccagc 720 gggcagcctg gacttggtgc ccggcgggct gaccttggag gagcactcgc tggagcaggt 780 gcagtccatg gtggtgggcg aagtgctcaa ggacatcgag acggcctgca agctgctcaa 840 catcaccgca gatcccatgg actggagccc cagcaatgtg cagaagtggc tcctgtggac 900 agagcaccaa taccggctgc cccccatggg caaggccttc caggagctgg cgggcaagga 960 gctgtgcgcc atgtcggagg agcagttccg ccagcgctcg cccctgggtg gggatgtgct 1020 gcacgcccac ctggacatct ggaagtcagc ggcctggatg aaagagcgga cttcacctgg 1080 ggcgattcac tactgtgcct cgaccagtga ggagagctgg accgacagcg aggtggactc 1140 atcatgctcc gggcagccca tccacctgtg gcagttcctc aaggagttgc tactcaagcc 1200 ccacagctat ggccgcttca ttaggtggct caacaaggag aagggcatct tcaaaattga 1260 ggactcagcc caggtggccc ggctgtgggg catccgcaag aaccgtcccg ccatgaacta 1320 cgacaagctg agccgctcca tccgccagta ttacaagaag ggcatcatcc ggaagccaga 1380 catctcccag cgcctcgtct accagttcgt gcaccccatc tgagtgcctg gcccagggcc 1440 tgaaacccgc cctcaggggc ctctctcctg cctgccctgc ctcagccagg ccctgagatg 1500 ggggaaaacg ggcagtctgc tctgctgctc tgaccttcca gagcccaagg tcagggaggg 1560 gcaaccaact gccccagggg gatatgggtc ctctggggcc ttcgggacca tggggcaggg 1620 gtgcttcctc ctcaggccca gctgctcccc tggaggacag agggagacag ggctgctccc 1680 caacacctgc ctctgacccc agcatttcca gagcagagcc tacagaaggg cagtgactcg 1740 acaaaggcca caggcagtcc aggcctctct ctgctccatc cccctgcctc ccattctgca 1800 ccacacctgg catggtgcag ggagacatct gcacccctga gttgggcagc caggagtgcc 1860 cccgggaatg gataataaag atactagaga actg 1894 <210> 2 <211> 335 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gly Ser Ala Ser Pro Gly Leu Ser Ser Val Ser Pro Ser His Leu 1 5 10 15 Leu Leu Pro Pro Asp Thr Val Ser Arg Thr Gly Leu Glu Lys Ala Ala 20 25 30 Ala Gly Ala Val Gly Leu Glu Arg Arg Asp Trp Ser Pro Ser Pro Pro 35 40 45 Ala Thr Pro Glu Gln Gly Leu Ser Ala Phe Tyr Leu Ser Tyr Phe Asp 50 55 60 Met Leu Tyr Pro Glu Asp Ser Ser Trp Ala Ala Lys Ala Pro Gly Ala 65 70 75 80 Ser Ser Arg Glu Glu Pro Pro Glu Glu Pro Glu Gln Cys Pro Val Ile 85 90 95 Asp Ser Gln Ala Pro Ala Gly Ser Leu Asp Leu Val Pro Gly Gly Leu 100 105 110 Thr Leu Glu Glu His Ser Leu Glu Gln Val Gln Ser Met Val Val Gly 115 120 125 Glu Val Leu Lys Asp Ile Glu Thr Ala Cys Lys Leu Leu Asn Ile Thr 130 135 140 Ala Asp Pro Met Asp Trp Ser Pro Ser Asn Val Gln Lys Trp Leu Leu 145 150 155 160 Trp Thr Glu His Gln Tyr Arg Leu Pro Pro Met Gly Lys Ala Phe Gln 165 170 175 Glu Leu Ala Gly Lys Glu Leu Cys Ala Met Ser Glu Glu Gln Phe Arg 180 185 190 Gln Arg Ser Pro Leu Gly Gly Asp Val Leu His Ala His Leu Asp Ile 195 200 205 Trp Lys Ser Ala Ala Trp Met Lys Glu Arg Thr Ser Pro Gly Ala Ile 210 215 220 His Tyr Cys Ala Ser Thr Ser Glu Glu Ser Trp Thr Asp Ser Glu Val 225 230 235 240 Asp Ser Ser Cys Ser Gly Gln Pro Ile His Leu Trp Gln Phe Leu Lys 245 250 255 Glu Leu Leu Leu Lys Pro His Ser Tyr Gly Arg Phe Ile Arg Trp Leu 260 265 270 Asn Lys Glu Lys Gly Ile Phe Lys Ile Glu Asp Ser Ala Gln Val Ala 275 280 285 Arg Leu Trp Gly Ile Arg Lys Asn Arg Pro Ala Met Asn Tyr Asp Lys 290 295 300 Leu Ser Arg Ser Ile Arg Gln Tyr Tyr Lys Lys Gly Ile Ile Arg Lys 305 310 315 320 Pro Asp Ile Ser Gln Arg Leu Val Tyr Gln Phe Val His Pro Ile 325 330 335 <210> 3 <211> 114 <212> PRT <213> Drosophila melanogaster <400> 3 Thr Asn Ala Ser Asn Gly Gly Thr Ala Thr Val Lys Arg Pro Asn Gly 1 5 10 15 Gly Arg Thr Gly Gly Gly Gly Ser His Ile His Leu Trp Gln Phe Leu 20 25 30 Lys Glu Leu Leu Ala Ser Pro Gln Val Asn Gly Thr Ala Ile Arg Trp 35 40 45 Ile Asp Arg Ser Lys Gly Ile Phe Lys Ile Glu Asp Ser Val Arg Val 50 55 60 Ala Lys Leu Trp Gly Arg Arg Lys Asn Arg Pro Ala Met Asn Tyr Asp 65 70 75 80 Lys Leu Ser Arg Ser Ile Arg Gln Tyr Tyr Lys Lys Gly Ile Met Lys 85 90 95 Lys Thr Glu Arg Ser Gln Arg Leu Val Tyr Gln Phe Cys His Pro Tyr 100 105 110 Ser Gln <210> 4 <211> 733 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gggatccgga gcccaaatct tctgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg 60 aattcgaggg tgcaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga 120 tctcccggac tcctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt aagccacgaa gaccctgagg 180 tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg 240 aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact 300 ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca acccccatcg 360 agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc 420 catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct 480 atccaagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga 540 ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg 600 acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc 660 acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatgagtg cgacggccgc 720 gactctagag gat 733 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> UNSURE <222> (3) <223> May be any amino acid <400> 5 Trp Ser Xaa Trp Ser 1 5 <210> 6 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: DNA primer <400> 6 gcgcctcgag atttccccga aatctagatt tccccgaaat gatttccccg aaatgatttc 60 cccgaaatat ctgccatctc aattag 86 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: DNA primer <400> 7 gcggcaagct ttttgcaaag cctaggc 27 <210> 8 <211> 271 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR fragment <400> 8 ctcgagattt ccccgaaatc tagatttccc cgaaatgatt tccccgaaat gatttccccg 60 aaatatctgc catctcaatt agtcagcaac catagtcccg cccctaactc cgcccatccc 120 gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat 180 ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt 240 ttttggaggc ctaggctttt gcaaaaagct t 271 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 gcgctcgagg gatgacagcg atagaacccc gg 32 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 gcgaagcttc gcgactcccc ggatccgcct c 31 <210> 11 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: DNA primer <400> 11 ggggactttc cc 12 <210> 12 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: DNA Primer <400> 12 gcggcctcga ggggactttc ccggggactt tccggggact ttccgggact ttccatcctg 60 ccatctcaat tag 73 <210> 13 <211> 256 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR fragment <400> 13 ctcgagggga ctttcccggg gactttccgg ggactttccg ggactttcca tctgccatct 60 caattagtca gcaaccatag tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc taactccgcc 120 cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga 180 ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg 240 cttttgcaaa aagctt 256 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: DNA Primer <400> 14 caaagttgtc atggatgacc 20 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: DNA Primer <400> 15 ccatggagaa ggctgggg 18
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/06 Ａ６１Ｐ 7/02 ４Ｈ０４５ 3/10 7/04 7/00 9/00 7/02 11/00 7/04 13/08 9/00 17/00 11/00 19/02 13/08 25/00 17/00 29/00 １０１ 19/02 31/00 25/00 31/04 29/00 １０１ 31/06 31/00 31/10 31/04 31/12 31/06 31/14 31/10 31/16 31/12 31/18 31/14 33/00 31/16 33/02 31/18 33/04 33/00 33/06 33/02 35/00 33/04 35/02 33/06 37/02 35/00 37/04 35/02 37/08 37/02 43/00 １０５ 37/04 Ｃ０７Ｋ 14/47 37/08 16/18 43/00 １０５ Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 14/47 1/19 16/18 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/19 21/08 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 5/10 33/50 Ｐ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｚ 21/08 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/68 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ａ６１Ｋ 37/24 33/53 37/02 33/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (71)出願人 9410 Ｋｅｙ Ｗｅｓｔ Ａｖｅｎｕｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎ ｄ 20850， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ ｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 リバーマン， トウア アロン アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02467， ニュートン， ビーコン スト リート 86 (72)発明者 オエトゲン， ジョルグ ピーター アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02146， ブルックリン， リンデン ス トリート 13 (72)発明者 クンシュ， チャールズ エイ． アメリカ合衆国 ジョージア 30092， ノークロス， スパルディング ホロウ 4083 (72)発明者 エンドレス， グレゴリー エイ． アメリカ合衆国 メリーランド 20850， ポトマック， クラゲット ファーム ドライブ 9729 (72)発明者 ローゼン， クレイグ エイ． アメリカ合衆国 メリーランド 20882， レイトンズビル， ローリング ヒル ロード 22400 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB20 BB60 CA17 CA25 CA26 CB01 CB02 CB03 CB09 CB17 CB26 DA12 DA13 DA14 DA20 DA36 DA80 FA19 FA29 FB01 FB02 FB03 FB05 FB06 FB09 FB16 4B024 AA01 AA11 BA44 CA01 HA04 HA17 4B064 AG01 AG27 CA10 CA19 DA01 DA13 4B065 AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 BA01 BA08 BA22 BA23 CA30 CA53 DB01 NA14 ZA01 ZA02 ZA33 ZA34 ZA36 ZA51 ZA61 ZA66 ZA81 ZA89 ZA96 ZB07 ZB08 ZB09 ZB11 ZB13 ZB15 ZB26 ZB27 ZB31 ZB33 ZB35 ZB37 ZB38 ZC03 ZC33 ZC35 ZC55 4H045 AA10 AA11 BA10 CA44 DA76 EA26 EA28 EA50 FA74

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 単離された核酸分子であって、以下： （ａ）配列番号１のポリヌクレオチドフラグメント、またはＡＴＣＣ寄託番号
    ２０３０７２に含まれるｃＤＮＡ配列のポリヌクレオチドフラグメント； （ｂ）配列番号２のポリペプチドフラグメントまたはＡＴＣＣ寄託番号２０３
    ０７２に含まれるｃＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドフラグメント
    をコードする、ポリヌクレオチドフラグメント； （ｃ）配列番号２のポリペプチドドメインまたはＡＴＣＣ寄託番号２０３０７
    ２に含まれるｃＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドドメインをコード
    する、ポリヌクレオチド； （ｄ）配列番号２のポリペプチドエピトープまたはＡＴＣＣ寄託番号２０３０
    ７２に含まれるｃＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドエピトープをコ
    ードする、ポリヌクレオチド； （ｅ）生物学的活性を有する、配列番号２のポリペプチドまたはＡＴＣＣ寄託
    番号２０３０７２に含まれるｃＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドを
    コードする、ポリヌクレオチド、； （ｆ）配列番号１の改変体であるポリヌクレオチド； （ｇ）配列番号１の対立遺伝子改変体であるポリヌクレオチド； （ｈ）配列番号２の種相同体をコードするポリヌクレオチド； （ｉ）（ａ）〜（ｈ）において特定されるポリヌクレオチドのいずれか１つに
    ストリンジェント条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであって、こ
    こで、該ポリヌクレオチドは、Ａ残基のみまたはＴ残基のみのヌクレオチド配列
    を有する核酸分子に、ストリンジェント条件下でハイブリダイズしない、ポリヌ
    クレオチド、 からなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有
    するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
  2. 【請求項２】 前記ポリヌクレオチドフラグメントが、タンパク質をコード
    するヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
  3. 【請求項３】 前記ポリヌクレオチドフラグメントが、配列番号２として同
    定される配列をコードするヌクレオチド配列、またはＡＴＣＣ寄託番号２０３０
    ７２に含まれるコード配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
  4. 【請求項４】 前記ポリヌクレオチドフラグメントが、配列番号１の全体の
    ヌクレオチド配列、またはＡＴＣＣ寄託番号２０３０７２に含まれるｃＤＮＡ配
    列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
  5. 【請求項５】 前記ヌクレオチド配列が、Ｃ末端またはＮ末端のいずれかか
    らの連続するヌクレオチド欠失を含む、請求項２に記載の単離された核酸分子。
  6. 【請求項６】前記ヌクレオチド配列が、Ｃ末端またはＮ末端のいずれかから
    の連続するヌクレオチド欠失を含む、請求項３に記載の単離された核酸分子。
  7. 【請求項７】 請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、組換えベクタ
    ー。
  8. 【請求項８】 請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、組換え宿主細
    胞を作製する方法。
  9. 【請求項９】 請求項８に記載の方法によって産生される、組換え宿主細胞
    。
  10. 【請求項１０】 ベクター配列を含む、請求項９に記載の組換え宿主細胞。
  11. 【請求項１１】 単離されたポリペプチドであって、以下： （ａ）配列番号２、またはＡＴＣＣ寄託番号２０３０７２に含まれるコードさ
    れた配列の、ポリペプチドフラグメント； （ｂ）生物学的活性を有する、配列番号２、またはＡＴＣＣ寄託番号２０３０
    ７２に含まれるコードされた配列の、ポリペプチドフラグメント； （ｃ）配列番号２、またはＡＴＣＣ寄託番号２０３０７２に含まれるコードさ
    れた配列の、ポリペプチドドメイン； （ｄ）配列番号２、またはＡＴＣＣ寄託番号２０３０７２に含まれるコードさ
    れた配列の、ポリペプチドエピトープ； （ｅ）分泌タンパク質の成熟形態； （ｆ）全長の分泌タンパク質； （ｇ）配列番号２の改変体； （ｈ）配列番号２の対立遺伝子改変体；あるいは （ｉ）配列番号２の種相同体、 からなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、
    単離されたポリペプチド。
  12. 【請求項１２】 前記全長タンパク質が、Ｃ末端またはＮ末端のいずれかか
    らの連続するアミノ酸欠失を含む、請求項１１に記載の単離されたポリペプチド
    。
  13. 【請求項１３】 請求項１１に記載の単離されたポリペプチドに特異的に結
    合する、単離された抗体。
  14. 【請求項１４】 請求項１１に記載の単離されたポリペプチドを発現する、
    組換え宿主細胞。
  15. 【請求項１５】 単離されたポリペプチドを作製する方法であって、以下： （ａ）該ポリペプチドが発現されるような条件下で、請求項１４に記載の組換
    え宿主細胞を培養する工程；および （ｂ）該ポリペプチドを回収する工程、 を包含する、方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１５に記載の方法によって産生される、ポリペプチ
    ド。
  17. 【請求項１７】 医学的状態を予防、処置、または緩和する方法であって、
    請求項１１に記載のポリペプチドまたは請求項１に記載のポリヌクレオチドの治
    療有効量を、哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、方法。
  18. 【請求項１８】 タンパク質の発現または活性に関連する被験体における病
    理学的状態、または病理学的状態に対する感受性を診断する方法であって、以下
    ： （ａ）請求項１に記載のポリヌクレオチドにおいて変異の存在または非存在を
    決定する工程；および （ｂ）該変異の存在または非存在に基づいて病理学的状態、または病理学的状
    態に対する感受性を診断する工程、 を包含する、方法。
  19. 【請求項１９】 タンパク質の発現または活性に関連する、被験体における
    病理学的状態または病理学的状態に対する感受性を診断する方法であって、以下
    ： （ａ）生物学的サンプルにおいて請求項１１に記載のポリペプチドの発現の存
    在または量を決定する工程、および （ｂ）該ポリペプチドの発現の存在または量に基づいて病理学的状態、または
    病理学的状態に対する感受性を診断する工程、 を包含する、方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１１に記載のポリペプチドに対する結合パートナー
    を同定する方法であって、以下： （ａ）請求項１１に記載のポリペプチドを結合パートナーと接触させる工程；
    および （ｂ）該結合パートナーが該ポリペプチドの活性をもたらすか否かを決定する
    工程、 を包含する、方法。
  21. 【請求項２１】 配列番号２のｃＤＮＡ配列に対応する、遺伝子。
  22. 【請求項２２】 生物学的アッセイにおいて活性を同定する方法であって、
    ここで該方法が、以下： （ａ）細胞において配列番号１を発現させる工程； （ｂ）その上清を単離する工程； （ｃ）生物学的アッセイにおいて活性を検出する工程；および （ｄ）該活性を有する該上清においてタンパク質を同定する工程、 を包含する、方法。
  23. 【請求項２３】 請求項２２に記載の方法によって産生される、産物。
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