JP2002520292A - ヒト成長因子と組み合わせた血管形成剤としてのコンパウンドｂの使用 - Google Patents

ヒト成長因子と組み合わせた血管形成剤としてのコンパウンドｂの使用

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト成長因子と組み合わせた血管形成剤としてのコンパウンドＢの使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の属する技術分野 本発明は、ヒト成長因子と組み合わせた血管形成剤としてのコンポーネントＢ
の使用に関する。 従来技術の状態 コンポーネントＢ（以後ＣＢと示す）は最初にヒトの尿から単離された８１ア
ミノ酸の蛋白質である。該蛋白質を発現するヒト遺伝子はクローン化されて組換
えヒトコンポーネントＢとしてＣＨＯ細胞中で発現されて、該蛋白質は約８．９
ｋＤの分子量であり、そして、製造法およびそのアミノ酸配列に関しても、引用
されるＷＯ９４／１４２５９において完全に記載されている。
【０００２】 ＷＯ９７／３９７６５においては、瘢痕形成剤としてのＣＢの使用が記載され
た。 例えば塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）または血管内皮成長因子（ＶＥ
ＧＦ）としての成長因子が血管形成活性を有することも公知である。発明の詳細な説明 ＣＢと成長因子の同時の存在が何れか個々の因子により引き出される血管形成
性応答を増加させること、言い変えれば、ＣＢは組織中の新生血管成長を促進す
ること、おそらくは毛細血管から内皮細胞を流動させるのに必要ないくつかの初
期の事象を促進することにおいて成長因子と相乗作用可能なことが、今、驚いた
ことに発見された。
【０００３】 よって、本発明の主な目的は、体内の何れかの組織に対する創傷、潰瘍および
他の外傷性損傷の治療のために有用な薬剤組成物の製造のための成長因子との組
み合わせたＣＢの使用である。
【０００４】 発明の他の目的は、上記のとおりに製造された薬剤組成物である。 この発明のさらなる目的は、体内の何れかの組織に対する創傷、潰瘍および他
の外傷性損傷の治療方法であって、おそらくは薬学上受容可能な賦形剤と共に、
有効量のＣＢおよび成長因子を投与することからなる。
【０００５】 活性成分の投与経路は、経口、静脈内、筋肉内、皮下または局所であってよい
。各活性成分の所望の血液レベルを確立するかもしれない他の投与経路は、本発
明により含まれる。
【０００６】 該２つの活性化合物の投与はそれら両方を含む単一の薬剤調製物によるか、ま
たは好ましくは２つの成分の一方を別々に各々が含む２つの薬剤調製物により実
施することができる。本発明によりＣＢと組み合わせて使用されるための好まし
い成長因子は、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）または血管内皮成長因子
（ＶＥＧＦ）である。
【０００７】 血管形成はアルビノウサギの角膜において研究されたが、これが、炎症反応お
よび成長する毛細血管を容易に監視でき、且つ変化が実体顕微鏡検査により定量
できる、無血管の透明な組織だからである（Ｚｉｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９８
２）。この方法は、プロセスの直接且つ非外傷性の観察による血管成長の時間の
延長された期間にわたる監視を可能にする。さらに、同じ動物において、効果の
定量を公知の薬剤のそれと比較できる。
【０００８】 ウサギの角膜アッセイにおいて研究されたインビボ血管形成におけるコンポー
ネントＢ（ＣＢ）の役割の調査は、 ａ）無血管の角膜のストロマ中に置かれた場合に血管成長を起こさせる上記分
子の能力を試験すること； ｂ）血管形成因子である塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）または血管内
皮成長因子（ＶＥＧＦ）により引き出された新生血管形成を上記分子が好むかま
たは抑圧する能力を試験すること により実施された。方法 試験化合物のスローリリース製造のためのプロトコル 成長因子またはペプチドをスローリリースペレットとして製造した。
【０００９】 スローリリースペレット（１ｘ１ｘ０．５ｍｍ）は、１０％塩化メチレン（１
０μｌ／ドロプレット）中、エチニル−ビニルコポリマー（Ｅｌｖａｘ−４０，
デュポン、ウイルミントン、デラウエア）の注入成型溶液中に試験物質を取り込
む滅菌条件にて製造した（Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｆｏｌｋｍａｎ，１９７６；
Ｚｉｃｈｅ ｅｔ ａｌ．１９８２）。外科手術の手法 血管形成活性はウサギ角膜アッセイを使用してインビボにおいてアッセイした
。ペントタールナトリウム（３０ｍｇ／ｋｇ）により麻酔した、ニュージーラン
ド白ウサギ（チャールズリバー、カルコ（Ｃａｌｃｏ）、レッコ（Ｌｅｃｃｏ）
、イタリア）の目の下半分において、柔軟性の虹彩のスパチュラ１．５ｍｍ幅を
使用してマイクロポケット（１．５ｘ３ｍｍ）を外科手術により生成した。該ペ
レットを透明な無血管の角膜ストロマ内に位置させたマイクロポケット中に移植
した。 角膜の血管形成の定量 のちの移植物の毎日の観察は麻酔なしでスリットランプ実体顕微鏡により実施
した。縁の（ｌｉｍｂａｌ）叢からの血管の出芽が３−４日後に起こり、そして
以前に報告された（Ｚｉｃｈｅ ｅｔ ａｌ．１９８９）スキムに従い移植され
たペレットに到達するように毛細血管が進行した場合に、血管形成応答をスコア
した。血管形成活性は研究された全移植物にわたり新生血管形成を提示する移植
物の数として表す。新たに形成された血管の数およびそれらの成長速度により能
力をスコアする。データは血管形成スコアとして表現し、縁から遠方の血管密度
ｘとしてｍｍにて計算する。密度の値１は角膜あたり０から２５の血管に相当し
、２は２５から３０、３は５０から７５、４は７５から１００そして５は１００
の血管より上に相当する（Ｚｉｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。 実験デザイン 以下の２つの手法を使用してコンポーネントＢの効果を試験した： Ａ）３つの異なる濃度の分子を、各用量において少なくとも４匹の別のウサギの
角膜中で試験することにより、上記化合物の潜在的血管形成活性を定義した。コ
ンポーネントＢの効果を、５０および１００ｎａｇ／ペレットの成長因子ｂＦＧ
Ｆにより引き出された効果と比較した。この実験プロトコルにおいて、ウサギは
３週間監視した。 Ｂ）血管形成を変調することにおけるコンポーネントＢの潜在的役割を評価する
ために、この薬剤の効果を、定義された血管形成因子、即ちｂＦＧＦの存在下に
おいて試験した。この目的のため、同じ角膜中に２つの隣接するポケットを外科
手術により作成して、一方は血管形成トリガーとし他方はコンポーネントＢとし
た。同じペレットに取り込まれた両物質を試験する実験も実施した（図１）。
【００１０】 この最後の実験プロトコルは我々のグループにより特別にセットアップされた
ものであり、 １）ｂＦＧＦにより引き出された血管形成性の「共刺激剤」としての薬剤の効果
または２）成長因子により引き出された血管形成性を阻害する薬剤の能力を定義
する（Ｚｉｃｈｅ ｅｔ ａｌ，１９９２および１９９４）。
【００１１】 この実験プロトコルにおいて、ウサギは４−５週間監視した。同じプロトコル
を用いて、ＶＦＧＦにより誘導される血管形成性の「共刺激剤」としてのＣＢの
効果を試験した。 組織学分析 ＣＢおよび／またはｂＦＧＦを含む角膜ポケットを有するウサギの角膜を術後
２、６、１５日後にサンプルし、そしてペレット除去後にホルマリン中に固定化
した。
【００１２】 日常的な組織病理学のプロセスを実施した：切片５μｍ厚を各ペレットが置か
れた場所のそばで切り出し；切片をヘマトキシリン−エオシンにより染色した。
少なくとも４０の切片を各角膜あたりで試験した。 統計分析 結果は（ｎ）移植物に関する平均で表す。血管形成スコアのデータは陽性およ
び陰性の両方の結果を含んだ。一方向のＡＮＯＶＡにより複数の比較を実施し、
そして個々の差異はＡＮＯＶＡによる顕著なグループ間の差異の証明後にフィッ
シャー試験により試験した。Ｐ値＜０．０５は顕著であったと解釈した（さらな
る統計評価に関する付録も参照されたい）。結果 ａ）ＣＢの血管形成活性 ポリマーＥｌｖａｘ−４０のスローリリースペレット中の化合物の濃度を増加
させて取り込んだ後に、ＣＢの血管形成活性を試験した。試験された用量は、０
．２、０．５、２および４μｇ／ペレットであった。ＣＢの効果を塩基性繊維芽
細胞成長因子（ｂＦＧＦ）により生産されたものと比較した。
【００１３】 ＣＢは用量依存性の血管形成効果を引き出し、その能力はｂＦＧＦにより引き
出されたよりも弱いらしかった。図２Ａにおいては、以前の実験およびＣＢと平
行に走らせた実験から得たｂＦＧＦの血管形成活性のデータを報告する。図２Ｂ
においては、ＣＢ含有ペレットを移植したウサギ角膜の毎日の観察からのデータ
を血管形成スコアとして報告する。ＣＢを用いて得られたもっとも高い血管形成
スコアは３−３．５（２−４μｇ／ペレット）（Ｐ＜０．０５対媒体ペレットの
み）に平均化されたのに対してｂＦＧＦにより生産されたのは７−８であった（
０．２μｇ／ペレット）（Ｐ＜０．０５対媒体ペレットのみ）。０．２μｇ／ペ
レットの濃度においてはＣＢは血管形成性でなかった。表１に示すとおり、０．
５μｇ／ペレットのＣＢは、実施した５つのうち１移植物において陽性の血管形
成応答を誘導した。２および４μｇ／ペレットはもっとも高い用量であった。こ
れらの用量は同様な血管形成活性を誘導して、実施した５つのうち２の陽性移植
物を生じた。
【００１４】 ＣＢは、試験されたいかなる濃度においても実験を通してすべて角膜の透明性
の維持により明らかにされるとおり、あらゆるマクロスコープな炎症活性を欠い
た。
【００１５】 ＣＢの血管形成効果の特異性を評価するため、上記化合物を２０分間ボイルす
ることにより熱不活性化（ｈ．ｉ．）した。２μｇの用量を次に試験した。熱不
活性化のあと、ＣＢは完全に血管形成活性を喪失した（図３）（Ｐ＜０．０５対
ＣＢ ２μｇ）。 ｂ）ｂＦＧＦにより誘導された血管形成性に対するＣＢの効果 公知の血管形成エフェクターの効果を変調することにおけるＣＢの潜在的役割
を評価するため、角膜ストロマに同時放出された両物質の最適以下の濃度（５０
０ｎｇのＣＢおよび１００ｎｇのｂＦＧＦ）を試験する実験を実施した。同じペ
レット中に取り込まれた両物質を試験する実験を実施した（図１Ａ）。さらに、
これらの化合物は同じ濃度において上記のとおり実施したが、但し２つの別個の
ペレットにおいて別々にストロマ中に放出した（図１Ｂ）。
【００１６】 角膜内へのＣＢおよびｂＦＧＦの共存は何れか個々の薬剤により引き出された
血管形成応答を増加させた（図４ＡおよびＢ、表２）。 血管形成は初期に起こり、そしてより迅速に進行して、新たに形成された血管
の数の顕著な増加を生じた（Ｐ＜０．０５対ＣＢおよびｂＦＧＦのみ）。この効
果は両方の実験条件において明らかであった。
【００１７】 しかしながら、ＣＢとｂＦＧＦが２つの別個のペレットにより個別に放出され
た場合には、効果が高かった。毛細血管はＣＢよりもｂＦＧＦに向かって成長し
たことから、ＣＢがｂＦＧＦ活性を増強するのに貢献したことを示唆する。７日
後、新生血管の成長が抑圧され始めた。
【００１８】 追加の実験を増加濃度のＣＢにより（０．２，０．５および２μｇ／ペレット
）ｂＦＧＦ（１００ｎｇ）の一定濃度により引き出された血管形成性に対して実
施した。２つの分子間の共働作用を観察することができた（図５）。興味を引く
のは、ＣＢとｂＦＧＦの間の相乗効果のもっとも効果的な条件が２つの別々のペ
レットにおいて試験された２００ｎｇのＣＢ（Ｐ＜０．０５対ＣＢおよびｂＦＧ
Ｆのみ）により観察された。 ｃ）ＶＥＧＦにより誘導された血管形成性に対するＣＢの効果 表３において、ＶＥＧＦにより誘導された血管形成性に対するコンポーネント
Ｂの相乗効果を報告する。
【００１９】 ＣＢとＶＥＧＦの間の共働作用を、２つの別々のペレットにおいて試験された
因子を用いて評価した。１０日目に得られた結果を表３に報告する。データは、
実施した全ての移植物にわたり、６に等しいかまたは６を超える血管形成スコア
を伴う新生血管形成を示した移植物の数として表現する。
【００２０】 より保守的な分析を使用して試験化合物間の可能な実在の相互作用を確認する
ために、さらに統計分析を実施した（付録中の図１１を参照されたい）。 主要な因子（全時間を通した（ｏｖｅｒ ｔｉｍｅ）「試験化合物」と「血管
形成スコア」）をマルチファクター分析に従い分析した。結果は、全時間にわた
り試験化合物の間で統計上の顕著な差異（ｐ＜０．０００１）が存在することを
示した。
【００２１】 試験化合物間の相互作用に関して、ツーキーの試験（Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｔｅｓ
ｔ）の結果が以下の考察を可能にする（以下の図１２を参照されたい）： ＣＢ ５００ｎｇ ＋ ｂＦＧＦ １００ｎｇ（１ペレット） 両化合物各々は統計上対照と異ならない。２つの化合物の組み合わせは対照お
よび単独の薬剤の何れとも統計上異なる応答を与える。その応答は期待された付
加物の効果の付近である。 ＣＢ ２００ｎｇ ＋ ｂＦＧＦ １００ｎｇ（２ペレット） 両化合物各々は統計上対照と異ならない。２つの化合物の組み合わせは対照お
よび単独の薬剤の何れとも統計上異なる応答を与える。さらに、組み合わされた
処理の応答は明らかに期待された付加物の効果を超えることは注目すべきである
。上記は２つの薬剤の間の相乗効果の存在を確証するらしい。 ＣＢ ５００ｎｇ ＋ ｂＦＧＦ １００ｎｇ（２ペレット） 両化合物は統計上対照と異ならない。２つの化合物の組み合わせは対照および
単独の薬剤の何れとも統計上異なる応答を与える。その応答は期待された付加物
の効果の付近である。さらに、ＣＢの５００ｎｇ＋ｂＦＧＦの１００ｎｇ（１ペ
レット）対ＣＢの５００ｎｇ＋ｂＦＧＦの１００ｎｇ（２ペレット）の比較にお
いて差異は見いだされなかった。 ＣＢ ２μｇ ＋ ｂＦＧＦ １００ｎｇ（２ペレット） 両化合物は統計上対照と異ならない。２つの化合物の組み合わせは、対照と統
計上異なる応答を与えるが、単独化合物との異なる応答は与えない。その応答は
期待された付加物の効果の付近である。 組織学分析 最大の効果の濃度（４μｇ）および最適以下の濃度（５００ｎｇ）においてｂ
ＦＧＦ（１００ｎｇ）の存在下および不在下にてＣＢの効果を試験した。細胞の
浸潤の範囲における差異はあらゆる組み合わせにおいてＣＢとｂＦＧＦの間に差
異が無かった（図７、８、９）。移植から２日以内に、角膜の上皮側の縁の領域
の近接において新たに形成された毛細血管の密性ネットワークを、白血球の浸潤
物が取り囲んだ（図１０）。６日目、白血球の浸潤物の範囲内の一致する減少が
明らかであったのに対し、毛細血管は何れかの分子に応答して数および口径を増
加させた（図１１）。１５日目、白血球の浸潤物の範囲は無視できるほどでであ
ったのに対し、毛細血管は形態学上未修飾のままらしかった。 結論 コンポーネントＢはマイクログラムの濃度範囲において明確であって熱不活性
化により失われる血管形成活性を所有する。殆どの血管形成因子は２０−４０倍
低い濃度において血管形成性である。血管形成性を引き出すのに必要な高い濃度
と共に、２つの側面がＣＢの効果において関係するらしい： １）移植物から最初の３−４日内で毛細血管の出芽を引き出す能力であって、マ
トリックス結合性血管形成因子ｂＦＧＦよりも分泌された血管形成因子ＶＥＧＦ
を模倣する； ２）新生血管成長の効率の時間にわたる平坦化であって、試験された移植物のほ
んの３０−４０％が１０−１４日後に完全に血管化されることを導く。
【００２２】 我々の結果は、ＣＢがインビボにおいて血管形成を誘導してウサギの角膜にお
いて新生血管成長を促進することにおいてｂＦＧＦと共働作用する能力を有する
ことを示す。
【００２３】 ｂＦＧＦ存在下における血管形成応答の潜在化の特徴を一緒にしたこれらの考
察は、ＣＢがその血管形成能力をインビボにおいて完全に発現させるためには、
追加の成長因子の存在を必要とすることを暗示する。
【００２４】 様々な時間間隔でサンプルされた角膜切片の組織学の実験を実施することによ
り、ＣＢにより引き出された血管形成プロセスが炎症性細胞浸潤物を含んだか否
かを評価した。ＣＢの効果をｂＦＧＦの角膜移植物により生産された効果と比較
した。日常的な組織学の実験において、我々は、ＣＢ，ｂＦＧＦまたは２つの組
み合わせを受け取った角膜において、白血球の浸潤物の範囲および種類における
主要な差異は見いださなかった。即ち、我々の結果から、我々は、ＣＢにより誘
導された角膜の新生血管化が全体の炎症性反応産物により媒介されないらしいと
結論することができるが、角膜の不透明の兆候が明らかでなかったからである。
【００２５】 ＣＢによる無血管の角膜中において引き出された血管形成応答の特徴は、ＣＢ
が毛細血管から内皮細胞を流動させるのに必要な初期の事象のいくつかを促進さ
せるかもしれないことを暗示する。このプロセスが一度開始して内皮細胞が細胞
外マトリックスへの強固な結合から「ゆるめられた」なら、ｂＦＧＦがより効果
的にその有糸分裂効果を発現する。
【００２６】
【表１】
【００２７】
【表２】
【００２８】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ウサギの角膜内の、両活性化合物を負荷したペレット（１Ａ）または一つの活
性化合物を負荷されたそれぞれ２つのペレット（１Ｂ）の移植物を示す。
【図２】 ウサギ角膜内の血管形成性に対するｂＦＧＦとＣＢの効果を示す。
【図３】 ＣＢの血管形成活性に対する熱不活性化の効果を示す。
【図４】 ｂＦＧＦ−誘導血管形成性に対するＣＢの効果を示す。
【図５】 ｂＦＧＦの血管形成活性に対するＣＢの効果を示す。
【図６】 以下の図７−図１１において観察可能な主要構造を示すウサギ角膜の典型的な
組織学切片の描写を表す。
【図７】 術後６日目にサンプルされた１００ｎｇのｂＦＧＦを含む角膜ポケットを有す
るウサギ角膜切片（ｘ２００）であって、矢印は新たに形成された血管を示す。
（Ｅｐ＝上皮）
【図８】 術後２日目にサンプルされた５００ｎｇのＣＢを含む角膜ポケットを有するウ
サギ角膜切片（ｘ１００）であって、矢印は新たに形成された血管を示す。
【図９】 術後６日目にサンプルされた５００ｎｇのＣＢを含む角膜ポケットを有するウ
サギ角膜切片（ｘ２００）であって、矢印は新たに形成された血管を示す。
【図１０】 術後１５日目にサンプルされた４μｇのＣＢを含む角膜ポケットを有するウサ
ギ角膜切片（ｘ１００）であって、矢印は新たに形成された血管を示す。
【図１１】 術後１５日目にサンプルされた５００ｎｇのｂＦＧＦを含む角膜ポケットを有
するウサギ角膜切片（ｘ１００）であって、矢印は新たに形成された血管を示す
。
【図１２】 平均および９５．０％ツーキーＨＳＤインターバルである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 ドニーニ，シルヴィア イタリア国イ−00186 ローマ，ラルゴ・ デグリ・オスチ 22 (72)発明者 ボッレッリ，フランチェスコ イタリア国イ−00179 ローマ，ヴィア・ エルレ・デ・チェーザレ 119 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA19 BA20 BA44 CA18 CA39 DB52 DB54 DB57 MA02 MA36 MA52 MA58 MA65 NA05 NA14 ZA681 ZA891 ZB211 ZC752

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヒト成長因子と組み合わせた血管形成剤としてのコンポーネン
    トＢの使用。
  2. 【請求項２】 体内の何れかの組織に対する創傷、潰瘍および他の外傷性損傷
    の治療のための、請求項１記載の使用。
  3. 【請求項３】 コンポーネントＢおよびヒト成長因子を活性成分として薬学上
    受容可能な賦形剤と共に含む、瘢痕形成剤として有用な薬剤組成物。
  4. 【請求項４】 単一投与用量にて２つの活性成分が存在する、請求項３記載の
    薬剤組成物。
  5. 【請求項５】 別々の投与用量にて２つの活性成分が各々存在する、請求項３
    記載の薬剤組成物。
  6. 【請求項６】 ヒト成長因子がｂＦＧＦまたはＶＥＧＦである、請求項３乃至
    ５の何れか１項記載の薬剤組成物。
  7. 【請求項７】 有効量のコンポーネントＢと有効量のヒト成長因子を単一投与
    用量にて投与することからなる、体内の何れかの組織に対する創傷、潰瘍および
    他の外傷性損傷の治療方法。
  8. 【請求項８】 ２つの活性成分が別々の投与用量にて投与される、請求項７記
    載の方法。
  9. 【請求項９】 ヒト成長因子がｂＦＧＦまたはＶＥＧＦである、請求項８また
    は９記載の方法。
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