JP2002517233A - Ｃ末端修飾ペプチドの製造方法 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【化１】
式Ｉの非ペプチド分子を使用して、ペプチド構造を模倣し、ペプチドリガンドと天然で結合するタンパク質とを結合する。該式において、Ｃ’は置換または非置換の炭素原子であり、Ｘは各炭素原子が置換または非置換であり得るＣ1−Ｃ4鎖であり、Ｒ1およびＲ2は天然または非天然のアミノ酸の側鎖を模擬する基である。この分子は、そのままで、またはポリペプチドなどのより大きい分子に組込んで、使用できる。いずれの場合も、タンパク質の活性を変えるために、治療剤として用い得る。さらに、この分子を用いて、タンパク質を検定し得、またはその精製における親和性リガンドとして作用せしめ得る。本発明の分子を取り込んだポリペプチドを製造する方法も記載する。
Description
【０００１】 本発明は、ペプチドおよびペプチド類似体の製造に関する。 多くの酵素基質および受容体リガンドはポリペプチドよりなる。かかる酵素お
よび受容体と相互作用して、その作用を治療的に好都合なように修飾する新規物
質についての研究において、当然のことながら、天然の基質またはリガンドと構
造的および配座的にある程度の類似性を有する分子に焦点が当てられてきた。天
然の基質またはリガンドは非常にしばしば同定されていないが、多くの場合、ポ
リペプチドの関与が推測されている。したがって、天然に生じるペプチド構造に
基づく様々な範囲の化合物を製造し得ることが望ましい。このような化合物は、
所望の酵素や受容体との相互作用における効力についてスクリーンできる。
よび受容体と相互作用して、その作用を治療的に好都合なように修飾する新規物
質についての研究において、当然のことながら、天然の基質またはリガンドと構
造的および配座的にある程度の類似性を有する分子に焦点が当てられてきた。天
然の基質またはリガンドは非常にしばしば同定されていないが、多くの場合、ポ
リペプチドの関与が推測されている。したがって、天然に生じるペプチド構造に
基づく様々な範囲の化合物を製造し得ることが望ましい。このような化合物は、
所望の酵素や受容体との相互作用における効力についてスクリーンできる。
【０００２】 タンパク質の相互作用が細胞機能の重要な態様を制御することが知られている
。例えば、これには細胞の分割を起こす情報伝達過程を制御するタンパク質−タ
ンパク質の相互作用があり、作用の機能悪化が癌などの増殖性疾患をもたらすこ
とがある。以前に報告されているところによると、天然のタンパク質の活性部分
と同じ配列を有する単離ペプチドを、天然タンパク質との結合相手に結合せしめ
て、同じ生物的応答を生じせしめるために、使用することができる。この形態の
プロセスは、例えば、WO 97/11174、WO 96/14339、WO 96/35715、WO 97/42222に
記載されている。
。例えば、これには細胞の分割を起こす情報伝達過程を制御するタンパク質−タ
ンパク質の相互作用があり、作用の機能悪化が癌などの増殖性疾患をもたらすこ
とがある。以前に報告されているところによると、天然のタンパク質の活性部分
と同じ配列を有する単離ペプチドを、天然タンパク質との結合相手に結合せしめ
て、同じ生物的応答を生じせしめるために、使用することができる。この形態の
プロセスは、例えば、WO 97/11174、WO 96/14339、WO 96/35715、WO 97/42222に
記載されている。
【０００３】 出願人の今回の発見によると、ある範囲の非ペプチド分子を用いて、天然にタ
ンパク質リガンドと結合する様々なタンパク質の天然ポリペプチド結合相手中の
特異的なペプチドの構造を模倣して、これらのタンパク質と相互作用せしめ得る
。この分子は、そのままで、あるいはポリペプチドなどのより大きい分子に組込
んで、使用でき、次の一般式を有する。
ンパク質リガンドと結合する様々なタンパク質の天然ポリペプチド結合相手中の
特異的なペプチドの構造を模倣して、これらのタンパク質と相互作用せしめ得る
。この分子は、そのままで、あるいはポリペプチドなどのより大きい分子に組込
んで、使用でき、次の一般式を有する。
【０００４】
【化５】 式中、Ｘ＝(ＣＨ2)n（ｎ＝１、２、３、４）または(ＣＨ2)x−Ｃ−(ＣＨ2)y（ｘ
およびｙは各々０、１、２、３、およびｘ＋ｙ＜３）である。
およびｙは各々０、１、２、３、およびｘ＋ｙ＜３）である。
【０００５】 環構造中に残存する炭素原子も所望により置換されていることがあり、さらに
一般的に表される下記の式を有する。
一般的に表される下記の式を有する。
【化６】 式中、Ｃ’は置換または非置換の炭素原子であり、Ｘは各炭素原子が置換または
非置換であり得るＣ1−Ｃ4鎖であり、Ｒ1およびＲ2は天然または非天然のアミノ
酸の側鎖を模擬する基である。
非置換であり得るＣ1−Ｃ4鎖であり、Ｒ1およびＲ2は天然または非天然のアミノ
酸の側鎖を模擬する基である。
【０００６】 従って、主要な態様において、本発明は、ある種のタンパク質と、そのタンパ
ク質の天然結合相手の少なくとも一部分に類似の構造を有する分子との複合体を
つくる方法を提供する。この分子は式Ｉの基からなるか、またはこの基を含有し
ている。
ク質の天然結合相手の少なくとも一部分に類似の構造を有する分子との複合体を
つくる方法を提供する。この分子は式Ｉの基からなるか、またはこの基を含有し
ている。
【０００７】 この型の分子の一つの重要な使用は、結合タンパク質の活性に阻害または促進
のいずれかの影響を与え得る医薬として、あるいはそのような医薬の設計におけ
る鋳型としてである。別の重要な利用は、アッセイでの使用も含み、精製におけ
る親和性リガンドとして、あるいは天然結合相手についての診断上の分子として
である。
のいずれかの影響を与え得る医薬として、あるいはそのような医薬の設計におけ
る鋳型としてである。別の重要な利用は、アッセイでの使用も含み、精製におけ
る親和性リガンドとして、あるいは天然結合相手についての診断上の分子として
である。
【０００８】 式Ｉの構造において、カルボニル基および隣接のメチレンやＣＲ1Ｒ2基はアミ
ノ酸の構造に類似している(アミノ基は別にして)。基Ｒ1およびＲ2、さらになん
らかの置換基は非常に様々であり得る。例えば、これらの基は、アルキル、アリ
ール、ヘテロ環、アルカノール、カルボキシル、アミノ、イミノ、イミド、エー
テル、エステル、チオールおよびチオエーテルから選択できる。天然アミノ酸を
模倣して、例えば、Ｒ1およびＲ2を下記から選択できる。
ノ酸の構造に類似している(アミノ基は別にして)。基Ｒ1およびＲ2、さらになん
らかの置換基は非常に様々であり得る。例えば、これらの基は、アルキル、アリ
ール、ヘテロ環、アルカノール、カルボキシル、アミノ、イミノ、イミド、エー
テル、エステル、チオールおよびチオエーテルから選択できる。天然アミノ酸を
模倣して、例えば、Ｒ1およびＲ2を下記から選択できる。
【表１】
【０００９】 広範な種々のアミノ酸模倣分子をつくるために、基Ｒ1およびＲ2として別のも
のも選択できる。
のも選択できる。
【００１０】 式Ｉの環構造の一つの重要な特徴は、高度の配座制限を付与することである。
この制限は、得た分子の利用性の自由度を規制するものであり、リガンド結合を
強めて活性化合物を同定する機会を増す。環中の原子の好ましい数は、４から７
である。３員環は緊張しすぎており、７を越える環は一般に弛緩しすぎている。
好ましくは、５員または６員環を使用する。
この制限は、得た分子の利用性の自由度を規制するものであり、リガンド結合を
強めて活性化合物を同定する機会を増す。環中の原子の好ましい数は、４から７
である。３員環は緊張しすぎており、７を越える環は一般に弛緩しすぎている。
好ましくは、５員または６員環を使用する。
【００１１】 環構造の一つの特に好ましい基は、環状１,３−ジオン類から提供されるもの
であり、特に下記式の６員環を有する：
であり、特に下記式の６員環を有する：
【化７】
【００１２】 アミノ酸残基を模倣する基の能力は、ジメドンとバリンとの下記の比較から評
価できる。
価できる。
【００１３】
【化８】 この式の化合物(本明細書では「シクロジオン」と呼ぶ。出願人の命名である
）は、既知の技術により容易につくることができ、多くの異なる反応を起こして
広範な誘導体を生成する。例えば、求電子付加がＣ−２位で起き、求核付加がＣ
−３位で起き得る。求電子および求核の両者を含有する２重機能試薬の付加によ
って、配座柔軟度に好都合な一層の制限を有する２環産物ができる。２つのカル
ボニル基も水素結合に理想的な部位を提供する。
）は、既知の技術により容易につくることができ、多くの異なる反応を起こして
広範な誘導体を生成する。例えば、求電子付加がＣ−２位で起き、求核付加がＣ
−３位で起き得る。求電子および求核の両者を含有する２重機能試薬の付加によ
って、配座柔軟度に好都合な一層の制限を有する２環産物ができる。２つのカル
ボニル基も水素結合に理想的な部位を提供する。
【００１４】 本発明の環基を包含するポリペプチド分子をつくるために、出願人は、固相「
逆ペプチド」合成(すなわち、通常のペプチド合成と逆に進む合成)についての新
しい方法を開発した。この方法では、周知の「ワング・リンカー(Wang linker)
」などのリンカーを使用する。保護されていないアミノ酸が、このリンカーにア
ミノ基を介して結合し、次の反応のためにカルボキシル基を自由にしておく。こ
の方法の最大の利点は、広範な種々のペプチド分子をつくるために、ペプチドの
Ｃ末端を容易に修飾できることである。他の利点は、保護されていないアミノ酸
を用いるので、保護されたアミノ酸が必須である従来の合成法に比べて非常に簡
略化されていることである。
逆ペプチド」合成(すなわち、通常のペプチド合成と逆に進む合成)についての新
しい方法を開発した。この方法では、周知の「ワング・リンカー(Wang linker)
」などのリンカーを使用する。保護されていないアミノ酸が、このリンカーにア
ミノ基を介して結合し、次の反応のためにカルボキシル基を自由にしておく。こ
の方法の最大の利点は、広範な種々のペプチド分子をつくるために、ペプチドの
Ｃ末端を容易に修飾できることである。他の利点は、保護されていないアミノ酸
を用いるので、保護されたアミノ酸が必須である従来の合成法に比べて非常に簡
略化されていることである。
【００１５】 従って、本発明は、別の態様において、遊離カルボキシル基を有する分子と式
Ｉの化合物(上記に定義)との反応工程を含むペプチドまたはペプチド類似体の製
造方法を提供する。
Ｉの化合物(上記に定義)との反応工程を含むペプチドまたはペプチド類似体の製
造方法を提供する。
【００１６】 好都合に、樹脂結合リンカーの末端ヒドロキシル基と置換クロロフォルメート
とを反応さして遊離カルボキシル基を有する分子をつくることができ、カルボネ
ート結合を介して接着した活性基を有する樹脂結合分子を得る。次いでアミノ酸
を加え、活性基を置換してカルバメート結合をつくると、末端カルボキシ基を有
するアミノ酸残基で終了する樹脂結合分子を得る。この工程を下記する。例示で
は、クロロフォルメートはｐ−ニトロフェニルクロロフォルメートであり、アミ
ノ酸はバリンである。最初の樹脂結合リンカーをつくる適当な反応工程も示す。
これは既知技術である。
とを反応さして遊離カルボキシル基を有する分子をつくることができ、カルボネ
ート結合を介して接着した活性基を有する樹脂結合分子を得る。次いでアミノ酸
を加え、活性基を置換してカルバメート結合をつくると、末端カルボキシ基を有
するアミノ酸残基で終了する樹脂結合分子を得る。この工程を下記する。例示で
は、クロロフォルメートはｐ−ニトロフェニルクロロフォルメートであり、アミ
ノ酸はバリンである。最初の樹脂結合リンカーをつくる適当な反応工程も示す。
これは既知技術である。
【００１７】
【化９】 (i) OHCH2C6H4OCH2COOH / DIC / HOBt / DCM / DMF (ii) N2H4.H2O / DMF (iii)
P-ニトロフェニルクロロフォルメート / ピリジン / DCM (iv) L-バリン / BSA
/ DMAP / DMF
P-ニトロフェニルクロロフォルメート / ピリジン / DCM (iv) L-バリン / BSA
/ DMAP / DMF
【００１８】 この過程の産物(便宜的に用語「ポリペプチド前駆体」を当て得る）は本発明
のペプチド形成法における最重要の中間体である。「逆」法においてポリペプチ
ド分子をつくる多数の方法を使用でき、シクロジオンの包含は１例に過ぎない。
ポリペプチドをつくるために、さらに置換したクロロフォルメートと前駆体を反
応せしめ、混合のカルボン酸無水物(すなわち、−ＣＯ−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−結合を
有する分子)をつくる。この物も非常に重要な中間体であって、希望の別のアミ
ノ酸の段階的付加を可能にする。アミノ酸が付加されると、無水物結合の開裂、
ＣＯ2の発生、ペプチド結合の形成が起きる。末端のアミノ酸残基が遊離のカル
ボキシル基を残しているので、別のアミノ酸との反応を所望の回数繰返し得る。
この反応を下記する。例示では、フェニルアラニンを混合カルボン酸無水物に付
加する。
のペプチド形成法における最重要の中間体である。「逆」法においてポリペプチ
ド分子をつくる多数の方法を使用でき、シクロジオンの包含は１例に過ぎない。
ポリペプチドをつくるために、さらに置換したクロロフォルメートと前駆体を反
応せしめ、混合のカルボン酸無水物(すなわち、−ＣＯ−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−結合を
有する分子)をつくる。この物も非常に重要な中間体であって、希望の別のアミ
ノ酸の段階的付加を可能にする。アミノ酸が付加されると、無水物結合の開裂、
ＣＯ2の発生、ペプチド結合の形成が起きる。末端のアミノ酸残基が遊離のカル
ボキシル基を残しているので、別のアミノ酸との反応を所望の回数繰返し得る。
この反応を下記する。例示では、フェニルアラニンを混合カルボン酸無水物に付
加する。
【００１９】
【化１０】 (v) P-ニトロフェニルクロロフォルメート / ピリジン / DCM (iv) L-フェニル
アラニン 得たポリペプチドを式ＩまたはIIの基と適当なカップリング剤(ＤＣＣ／ＤＭ
ＡＰなど)の存在下に直接反応せしめ得る。この反応を下記に示す。
アラニン 得たポリペプチドを式ＩまたはIIの基と適当なカップリング剤(ＤＣＣ／ＤＭ
ＡＰなど)の存在下に直接反応せしめ得る。この反応を下記に示す。
【化１１】
【００２０】 ポリペプチド分子の基本的特徴が、式Ｉおよび式IIの基との反応性の観点から
して、末端のカルボニル基にあることが分かるであろう。式Ｉおよび式IIの基は
、ポリペプチド前駆体に等しくよく直接的に反応し得る。
して、末端のカルボニル基にあることが分かるであろう。式Ｉおよび式IIの基は
、ポリペプチド前駆体に等しくよく直接的に反応し得る。
【００２１】 一般的方法の変形として、末端アミノ酸残基をカップリング剤で処理して環化
しオキサゾロンをつくることができる。オキサゾロンはそれ自体ペプチドおよび
ペプチド模倣分子の合成における有意の中間体である。例えば、オキサゾロンを
Ｃ４位で容易にアルキル化して、α,α−ジアルキル化アミノ酸をつくり得る。
このものは２次構造のある種の要素を誘導することが知られている基である。あ
るいは、オキサゾロンを別の(遊離の)オキサゾロンと反応せしめて、「ルグハイ
マー(Ruegheimer)二量体」をつくり得る。両反応を下記に示す。
しオキサゾロンをつくることができる。オキサゾロンはそれ自体ペプチドおよび
ペプチド模倣分子の合成における有意の中間体である。例えば、オキサゾロンを
Ｃ４位で容易にアルキル化して、α,α−ジアルキル化アミノ酸をつくり得る。
このものは２次構造のある種の要素を誘導することが知られている基である。あ
るいは、オキサゾロンを別の(遊離の)オキサゾロンと反応せしめて、「ルグハイ
マー(Ruegheimer)二量体」をつくり得る。両反応を下記に示す。
【化１２】
【００２２】 変法の態様において、本発明は、次の最初の工程を含むペプチドまたはポリペ
プチドの製造方法を提供する：（ａ）遊離カルボキシル基を有する末端アミノ酸
残基との樹脂結合ペプチド分子を形成すること；（ｂ）ペプチド結合のカルボニ
ルと末端アミノ酸残基の遊離カルボキシル基との縮合反応を行い、末端のオキサ
ゾロン基を形成すること。
プチドの製造方法を提供する：（ａ）遊離カルボキシル基を有する末端アミノ酸
残基との樹脂結合ペプチド分子を形成すること；（ｂ）ペプチド結合のカルボニ
ルと末端アミノ酸残基の遊離カルボキシル基との縮合反応を行い、末端のオキサ
ゾロン基を形成すること。
【００２３】 下記のように、本発明は、非常に実質的な範囲の異なるペプチドおよびペプチ
ド模倣分子を創生する。これらの化合物は順次、治療的使用の可能性のある大き
い化合物「ライブラリィ」を提供する。
ド模倣分子を創生する。これらの化合物は順次、治療的使用の可能性のある大き
い化合物「ライブラリィ」を提供する。
【００２４】 本発明により提供されるポリペプチド模倣分子の利点は、シクロジオンとシク
ロフィリンとの反応に関する下記の例から分かるであろう。シクロフィリンは,
多くの異なる疾患領域で有望な薬剤標的である。疾患には、免疫抑制障害、寄生
虫感染1、リウマチ性関節炎2、ＡＩＤＳ3,4がある。最近、唯一の既知シクロフ
ィリン結合薬剤であるシクロスポリンＡ、免疫抑制ウンデカペプチド薬剤が臓器
移植手術後の拒絶反応を防ぐのに使用されている5,6,7。
ロフィリンとの反応に関する下記の例から分かるであろう。シクロフィリンは,
多くの異なる疾患領域で有望な薬剤標的である。疾患には、免疫抑制障害、寄生
虫感染1、リウマチ性関節炎2、ＡＩＤＳ3,4がある。最近、唯一の既知シクロフ
ィリン結合薬剤であるシクロスポリンＡ、免疫抑制ウンデカペプチド薬剤が臓器
移植手術後の拒絶反応を防ぐのに使用されている5,6,7。
【００２５】 われわれが明かにしたところによると、シクロジオンのペプチド模倣は、親ジ
メドンとタンパク質ヒトシクロフィリンＡとの結晶性複合体の形成でなし得る。
タンパク質Ｘ線構造解析の分解能０.２ｎｍは、シクロフィリンＡ活性部位中の
ジメドンの存在を示す。ジメドン基のジメチル基の位置は、シクロスポリンＡ阻
害剤中にあるバリン側鎖の位置を模倣している。下記に実験での詳細を示す。
メドンとタンパク質ヒトシクロフィリンＡとの結晶性複合体の形成でなし得る。
タンパク質Ｘ線構造解析の分解能０.２ｎｍは、シクロフィリンＡ活性部位中の
ジメドンの存在を示す。ジメドン基のジメチル基の位置は、シクロスポリンＡ阻
害剤中にあるバリン側鎖の位置を模倣している。下記に実験での詳細を示す。
【００２６】 組換えヒトシクロフィリン(ｈＣｙｐＡ)は、ノバルティス社から提供を受け、
Ｈｅｐｅｓ２０ｍＭ、ＮａＣｌ１００ｍＭ、ＮａＮ3０.０２％(ｗ／ｖ)中で１４
ｍｇ／ｍｌに濃縮した。ｈＣｙｐＡ結晶の成長は、ハンギング・ドロップ法によ
り１７℃での蒸気拡散で行った。ウエル中の沈澱用溶液は１００ｍＭトリスＨＣ
ｌ(ｐＨ８.０)、２２％(ｗ／ｖ)ＰＥＧ８０００、５％(ｖ／ｖ)ＤＭＳＯ、０.０
２％ＮａＮ3からなる。最初の８μｌ滴は５０ｍＭトリスＨＣｌ(ｐＨ８.０)、１
１％(ｗ／ｖ)ＰＥＧ８０００、２.５％(ｖ／ｖ)ＤＭＳＯ、０.０２％ＮａＮ3、
０.４ｍＭのｈＣｙｐＡからなる。
Ｈｅｐｅｓ２０ｍＭ、ＮａＣｌ１００ｍＭ、ＮａＮ3０.０２％(ｗ／ｖ)中で１４
ｍｇ／ｍｌに濃縮した。ｈＣｙｐＡ結晶の成長は、ハンギング・ドロップ法によ
り１７℃での蒸気拡散で行った。ウエル中の沈澱用溶液は１００ｍＭトリスＨＣ
ｌ(ｐＨ８.０)、２２％(ｗ／ｖ)ＰＥＧ８０００、５％(ｖ／ｖ)ＤＭＳＯ、０.０
２％ＮａＮ3からなる。最初の８μｌ滴は５０ｍＭトリスＨＣｌ(ｐＨ８.０)、１
１％(ｗ／ｖ)ＰＥＧ８０００、２.５％(ｖ／ｖ)ＤＭＳＯ、０.０２％ＮａＮ3、
０.４ｍＭのｈＣｙｐＡからなる。
【００２７】 ジメドン・リガンドの結晶(０.２ｍｍｘ０.１ｍｍｘ０.０２５ｍｍ)への導入
に、ＤＭＳＯ濃度を徐々に減じ、リガンド濃度を徐々に上げる段階浸漬法を使用
した。この方法で結晶の損傷を防ぎ、また活性部位でのＤＭＳＯ競合を防ぐ。第
１工程で、ｈＣｙｐＡの単一結晶を、３０ｍＭエチル−１‐ピペリジングリオキ
シレートおよび減じた濃度(４％)のＤＭＳＯを含む沈澱用溶液に浸した。１時間
後、３０ｍＭリガンドと３％ＤＭＳＯを含有する新鮮な浸漬溶液に、結晶を移し
た。結晶の移行を６時間で計６回行った。最後の浸漬には、３０ｍＭジメドンを
含有するＤＭＳＯなしの溶液中で２.５時間をかけた。
に、ＤＭＳＯ濃度を徐々に減じ、リガンド濃度を徐々に上げる段階浸漬法を使用
した。この方法で結晶の損傷を防ぎ、また活性部位でのＤＭＳＯ競合を防ぐ。第
１工程で、ｈＣｙｐＡの単一結晶を、３０ｍＭエチル−１‐ピペリジングリオキ
シレートおよび減じた濃度(４％)のＤＭＳＯを含む沈澱用溶液に浸した。１時間
後、３０ｍＭリガンドと３％ＤＭＳＯを含有する新鮮な浸漬溶液に、結晶を移し
た。結晶の移行を６時間で計６回行った。最後の浸漬には、３０ｍＭジメドンを
含有するＤＭＳＯなしの溶液中で２.５時間をかけた。
【００２８】 １００ｍＭトリスＨＣｌ(ｐＨ８.０)、２２％(ｗ／ｖ)ＰＥＧ８０００、０.０
２％ＮａＮ3、３０ｍＭリガンド３０％グリセロールからなる寒冷保護溶液中で
の浸漬の後に、液体窒素中で結晶のフラッシュ冷凍を行った。Ｘ線データをＭＡ
Ｒイメージプレート(直径３０ｃｍ)検出器に収集した。ＣｕＫａ(λ＝１.５４１
２Å)照射は回転陽極Ｘ線発生器からである。データ整備はコンピューター・プロ
グラムＤＥＮＺＯで行い、ＳＣＡＬＥＰＡＣＫで計量した。
２％ＮａＮ3、３０ｍＭリガンド３０％グリセロールからなる寒冷保護溶液中で
の浸漬の後に、液体窒素中で結晶のフラッシュ冷凍を行った。Ｘ線データをＭＡ
Ｒイメージプレート(直径３０ｃｍ)検出器に収集した。ＣｕＫａ(λ＝１.５４１
２Å)照射は回転陽極Ｘ線発生器からである。データ整備はコンピューター・プロ
グラムＤＥＮＺＯで行い、ＳＣＡＬＥＰＡＣＫで計量した。
【００２９】 ｈＣｙｐＡ／シクロスポリンＡ複合体のＸ線構造からのｈＣｙｐＡの精製構造
を出発モデルとして用いた。ＡＭＯＲＥ使用の回転および翻訳の検査によって、
分子を位置付け、よい出発モデルを得た。続く剛体の精製および個々の原子の等
方温度因子の精製で、１５と１.７Åとの間におけるデータでＲ因子が２１％で
あった。この段階で計算した示差フリエ・マップは、結合リガンドについての明
白な電子密度を示した。構造はＷＩＴＮＯＴＰソフトウエアーを用いてつくった
。
を出発モデルとして用いた。ＡＭＯＲＥ使用の回転および翻訳の検査によって、
分子を位置付け、よい出発モデルを得た。続く剛体の精製および個々の原子の等
方温度因子の精製で、１５と１.７Åとの間におけるデータでＲ因子が２１％で
あった。この段階で計算した示差フリエ・マップは、結合リガンドについての明
白な電子密度を示した。構造はＷＩＴＮＯＴＰソフトウエアーを用いてつくった
。
【００３０】 すべての水分子を含む完全精製を加えると、Ｒ＝１８.７％であった。 ジメドン・リガンドがプロリン結合ポケットを占拠していた。
【００３１】
【表２】 表１：ｈＣｙｐＡ／ジメドン複合体についての結晶学的データ
【００３２】 １．Ｒmerge＝(Σ｜Ｉ−＜Ｉ＞｜／Σ｜Ｉ｜）、式中、対称関連反射についてＩ
は観測強度、＜Ｉ＞は平均強度である。
は観測強度、＜Ｉ＞は平均強度である。
【００３３】 このＸ線構造は、下記に示すように、ジメドンがバリン残基を模倣し天然リガ
ンド・シクロスポリン中に存在し得ることを表す。
ンド・シクロスポリン中に存在し得ることを表す。
【化１３】
【００３４】 新規のシクロフィリン結合リガンドは、阻害性薬剤として医学に有用である可
能性が高い。シクロフィリンの阻害がそのＨＩＶタンパク質コートへのとりこみ
を防止するとの発見は、免疫抑制シクロスポリンに関連しない阻害剤ファミリー
が抗ＨＩＶ薬剤を提供し得る可能性を示している。種特異的シクロフィリン阻害
剤の開発は、新しい抗寄生虫薬剤への経路も提供する。
能性が高い。シクロフィリンの阻害がそのＨＩＶタンパク質コートへのとりこみ
を防止するとの発見は、免疫抑制シクロスポリンに関連しない阻害剤ファミリー
が抗ＨＩＶ薬剤を提供し得る可能性を示している。種特異的シクロフィリン阻害
剤の開発は、新しい抗寄生虫薬剤への経路も提供する。
【００３５】 参考文献 １．Page, A.P.; Kumar, S.; Carlow, C.K.S. 寄生虫シクロフィリンおよびシク
ロスポリンＡの抗寄生虫活性 Parasitology Today 11, (1995) 385-388
ロスポリンＡの抗寄生虫活性 Parasitology Today 11, (1995) 385-388
【００３６】 ２．Bellich, A.; Winkler, G.; Aschauer, H.; Rot, A.; Peichi, P. リウマチ
性関節炎患者の滑液におけるシクロフィリンＡの存在 J. Experimental Medicin
e 185 (1997) 975-980
性関節炎患者の滑液におけるシクロフィリンＡの存在 J. Experimental Medicin
e 185 (1997) 975-980
【００３７】 ３．Luban, J.; Bossolt, K.L.; Franke, E.K.; Kalpana, G.V.; Goff, S.P. ヒ
ト免疫不全ウイルス１型 gag タンパク質がシクロフィリンＡおよびシクロフィ
リンＢに結合する Cell 73, 1067-1078
ト免疫不全ウイルス１型 gag タンパク質がシクロフィリンＡおよびシクロフィ
リンＢに結合する Cell 73, 1067-1078
【００３８】 ４．Sherry, B.; Zybarth, G.; Alfano, M.; Dubrovsky, L.; Mitchell, R.; Ri
ch. D; Ulrich. P.; Bucala, R.; Cerami, A.; Bukrinsky, M. マクロファージ
およびＴ白血球によるＨＩＶ−１の取り込みにおけるシクロフィリンＡの役割 P
roceedings of the National Academy of Sciences of the United States of A
merica 95 (1998) 1758-1763
ch. D; Ulrich. P.; Bucala, R.; Cerami, A.; Bukrinsky, M. マクロファージ
およびＴ白血球によるＨＩＶ−１の取り込みにおけるシクロフィリンＡの役割 P
roceedings of the National Academy of Sciences of the United States of A
merica 95 (1998) 1758-1763
【００３９】 ５．Beveridge, T.; Calne, R.Y. 遺体腎臓の移植におけるシクロスポリン(sand
immun(r))−多施設センターの試みについての１０年間の追跡 Transplantation
59 (1995) 1568-1570
immun(r))−多施設センターの試みについての１０年間の追跡 Transplantation
59 (1995) 1568-1570
【００４０】 ６．Pflugl, G.; Kallen, J.; Schirmer, T.; Jansonius, J.N.; Zurini, M.G.M
.; Walkinshaw, M.D. １０量体シクロフィリン・シクロスポリン結晶性複合体の
Ｘ線構造 Nature 361 91-94
.; Walkinshaw, M.D. １０量体シクロフィリン・シクロスポリン結晶性複合体の
Ｘ線構造 Nature 361 91-94
【００４１】 ７．Mikol, V.; Kallen, J.; Pflugel, G.; Walkinshaw, M.D. ２センター・ド
ット−１オングストローム分解能での単量体シクロフィリンＡ・シクロスポリン
Ａ結晶複合体のＸ線構造 J. Molecular Biology 234 1119-1130
ット−１オングストローム分解能での単量体シクロフィリンＡ・シクロスポリン
Ａ結晶複合体のＸ線構造 J. Molecular Biology 234 1119-1130
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ０７Ｋ 19/00 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 ニコラス・ジョン・ターナー イギリス、イーエイチ３・６キューアー ル、エジンバラ、グレイト・キング・スト リート33番 (72)発明者 ザビーネ・ラーヤ・フリッチュ イギリス、イーエイチ３・６キューアー ル、エジンバラ、グレイト・キング・スト リート33番 Ｆターム(参考） 4B050 CC10 DD11 LL03 4C076 EE41 EE59 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 BA51 BA62 DA55 EA20 EA50 EA65 FA33 FA40
Claims (19)
- 【請求項１】 ある種のタンパク質と、そのタンパク質の天然結合相手の少
なくとも一部分に類似の構造を有する分子との複合体をつくる方法であって、こ
の分子が、下記式： 【化１】 （式中、Ｃ’は置換または非置換の炭素原子であり、Ｘは各炭素原子が置換また
は非置換であり得るＣ1−Ｃ4鎖であり、Ｒ1およびＲ2は天然または非天然のアミ
ノ酸の側鎖を模擬する基である）の基からなるか、または基を含む、方法。 - 【請求項２】 ＸがＣ2−Ｃ3鎖である、請求項１の方法。
- 【請求項３】 式Ｉの化合物が下記式II： 【化２】 （式中、環構造中の炭素原子が置換または非置換であり得る） を有する、請求項１または２の方法。
- 【請求項４】 環構造中の炭素原子上の置換基がアルキル、アリール、ヘテ
ロ環、アルカノール、カルボキシル、アミノ、イミノ、イミド、エーテル、エス
テル、チオールおよびチオエーテルから選択される、請求項１−３の方法。 - 【請求項５】 分子がジメドンであり、タンパク質がシクロフィリンである
、請求項３の方法。 - 【請求項６】 遊離のカルボキシル基を有する分子と、下記式Ｉ： 【化３】 （式中、Ｃ’は置換または非置換の炭素原子であり、Ｘは各炭素原子が置換また
は非置換であり得るＣ1−Ｃ4鎖であり、Ｒ1およびＲ2は天然または非天然のアミ
ノ酸の側鎖を模擬する基である）の化合物とを反応せしめる工程を含む、ペプチ
ドまたはペプチド類似体を製造する方法。 - 【請求項７】 ＸがＣ2−Ｃ3鎖である、請求項６の方法。
- 【請求項８】 式Ｉの化合物が下記式II： 【化４】 （式中、環構造中の炭素原子が置換または非置換であり得る） を有する、請求項６または７の方法。
- 【請求項９】 環構造中の炭素原子上の置換基がアルキル、アリール、ヘテ
ロ環、アルカノール、カルボキシル、アミノ、イミノ、イミド、エーテル、エス
テル、チオールおよびチオエーテルから選択される、請求項６−８の方法。 - 【請求項１０】 遊離のカルボキシ基を有する分子が樹脂結合ペプチドであ
る、請求項１−９の方法。 - 【請求項１１】 樹脂結合ペプチドが下記の工程： （ａ）樹脂結合リンカーの末端ヒドロキシル基と置換クロロフォルメートとを
反応せしめ、カルボネートを介して接着した活性基を有する樹脂結合分子をつく
り； （ｂ）該活性基をアミノ酸で置き換え、樹脂結合リンカーと該アミノ酸のアミ
ノ基とのカルボネート結合を形成せしめること； によりつくられる、請求項１０の方法。 - 【請求項１２】 １以上のさらなるアミノ酸を樹脂結合ペプチドに、下記の
工程： （ａ）末端アミノ酸残基の遊離カルボキシル基と置換クロロフォルメートとを
反応せしめ、混合カルボン酸無水物を形成せしめ； （ｂ）無水物結合をさらなるアミノ酸の添加により開裂し（二酸化炭素の発生
を伴う）、ペプチド結合を形成せしめ； （ｃ）工程（ａ）および（ｂ）を必要回数繰り返すこと； により添加する、請求項１１の方法。 - 【請求項１３】 最終工程として、樹脂結合リンカーをはずし、遊離のペプ
チドまたはポリペプチドの分子をつくる、請求項１１または１２の方法。 - 【請求項１４】 下記の最初の工程： （ａ）遊離カルボキシル基を有する末端アミノ酸残基のある樹脂結合ペプチド
分子を形成せしめ； （ｂ）ペプチド結合と末端アミノ酸残基の遊離カルボキシル基との環化縮合反
応を行い、末端オキサゾロン基を形成せしめること； を含む、ペプチドまたはポリペプチドを製造する方法。 - 【請求項１５】 オキサゾロン基をＣ−４位でアルキル化するさらなる工程
を含む、請求項１４の方法。 - 【請求項１６】 末端アミノ酸残基がアルキル側鎖であり、請求項７の工程
の産物がα,α−ジアルキル化アミノ酸残基である、請求項１５の方法。 - 【請求項１７】 末端オキサゾロン基とさらなるオキサゾロン分子とを反応
せしめ、ルグハイマー二量体を形成せしめる、請求項１４の方法。 - 【請求項１８】 遊離カルボキシル基を有する樹脂結合ペプチドが、下記の
工程： （ａ）樹脂結合リンカーの末端ヒドロキシル基と置換クロロフォルメートとを
反応せしめ、カルボネートを介して接着した活性基を有する樹脂結合分子をつく
り； （ｂ）該活性基をアミノ酸で置き換え、樹脂結合リンカーと該アミノ酸のアミ
ノ基とのカルボネート結合を形成せしめること； によりつくられる、請求項１４−１７の方法。 - 【請求項１９】 １以上のさらなるアミノ酸を樹脂結合ペプチドに、環化工
程の前に、下記： （ａ）末端アミノ酸残基の遊離カルボキシル基と置換クロロフォルメートとを
反応せしめ、混合カルボン酸無水物を形成せしめ； （ｂ）無水物結合をさらなるアミノ酸の添加により開裂し（二酸化炭素の発生
を伴う）、ペプチド結合を形成せしめ； （ｃ）工程（ａ）および（ｂ）を必要回数繰り返すこと； により添加する、請求項１８の方法。
Applications Claiming Priority (3)
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|---|---|---|---|
| GBGB9812675.8A GB9812675D0 (en) | 1998-06-11 | 1998-06-11 | Peptides |
| GB9812675.8 | 1998-06-11 | ||
| PCT/GB1999/001855 WO1999064574A1 (en) | 1998-06-11 | 1999-06-11 | Method to prepare c-terminal modified peptides |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002517233A true JP2002517233A (ja) | 2002-06-18 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000553564A Pending JP2002517233A (ja) | 1998-06-11 | 1999-06-11 | Ｃ末端修飾ペプチドの製造方法 |
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| JP (1) | JP2002517233A (ja) |
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| GB (1) | GB9812675D0 (ja) |
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-
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-
1999
- 1999-06-11 WO PCT/GB1999/001855 patent/WO1999064574A1/en not_active Application Discontinuation
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- 1999-06-11 AU AU42825/99A patent/AU4282599A/en not_active Abandoned
- 1999-06-11 JP JP2000553564A patent/JP2002517233A/ja active Pending
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