JP2002515974A

JP2002515974A - 新生児感染に対する迅速アッセイ

Info

Publication number: JP2002515974A
Application number: JP53838997A
Authority: JP
Inventors: ウェイリッチ，エリカ，イー．; レビン，ロナルド，エル．; マルドナド，イヴォンヌ; ヘルツェンバーグ，レオノア，エー．; ヘルツェンバーグ，レオナルド，エー．; ベニッツ，ウィリアム，イー．
Original assignee: ザボードオブトラスティーズオブザレランドスタンフォードジュニアユニバーシティ
Priority date: 1996-05-07
Filing date: 1997-05-07
Publication date: 2002-05-28
Also published as: EP0912756A4; EP0912756A1; AU3119197A; WO1997042341A1; US6077665A; CA2250911A1

Abstract

(57)【要約】新生児(新生乳児)のような免疫不全患者または免疫無防備患者(例えばHIVまたは移植患者)における感染に対する迅速アッセイが初期評価時の診断に用いられ、その結果、非感染患者に対して抗生物質治療及び集中看護室の病床につけること等が避けられる。このアッセイは、血流、脳脊髄液(CSF)、または尿路の細菌、ウイルス、またはカビのコロニーを検出するために使用できる。この方法は、敗血症の診断に対し特に好適である。多形核白血球(PMN、好中球)CD11b(Mac-1、CR3)レベルが、低容量(0.1ml)全血サンプルでフローサイトメトリーまたはレーザー走査顕微鏡により測定される。二重レーザーFACSは、FITCでコンジュゲートした抗CD15蛍光抗体により好中球を同定し、PEでコンジュゲートした抗CD11b抗体でマークした表面好中球CD11ｂを同定する。CD11bの自然上方調節は、4℃でサンプルを取り扱うか或いは抗CD14抗体またはアデノシンの様な安定化化合物をサンプルに添加することにより予防される。キットは、診断敷居値により分析に対し使用された装置を検定するためのCD11bでコートした微小球のような検定マーカーを、蛍光抗CD11b及び抗CD15抗体と同様に含む。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称：新生児感染に対する迅速アッセイ本発明は、厚生省のグラント番号MO1-RR00070及び健康保険局(NIH)のグラント番号CA42509及びAI34762の下に米国政府の支援により行われたものである。米国政府はこの発明に関して所定の権利を有する。関連出願データ本出願は、1996年5月7日に出願され、レファレンスとしてここに取り込まれる米国仮特許出願番号60/017、030の優先権を求めるものである。本出願は、1997 年4月8日に出願された、Weirichらによる"新生児感染に対する迅速アッセイ"と題する米国特許出願に関連する。発明の分野本発明は、感染の診断と治療の分野に関し、特に、感染が疑われる新生児及び他の免疫不全患者を検査するための迅速かつ信頼できるアッセイ法に関するものである。発明の背景毎年、米国では300,000の新生児が＄800ミリオン以上の費用で感染症に対する治療を受けている。新生児において重症の細菌性感染症の例数は低いが(生存出産1000当たり1から10程度である)、致死率は高く(20から75％)、最近10年間の強力な抗生物質の開発にもかかわらず低下していない。特に、血流感染症(敗血症) は非常に迅速に進行し、新生児が病原体にさらされた後数時間内にしばしば致命的となる。従って、治療は、非特異的臨床兆候または母体のリスクファクターにより、しばしば経験的に開始され、真に感染している乳児一人当たり、平均17人の乳児が治療を受ける。敗血症を含む新生児感染に関する一般情報に関しては、例えば参考文献[1-6]を参照できる。 IgA,IgM及び幾つかのIgGサブクラス等のレベルが低いこと、成人に比べて好中球の貯蔵量がより少ないこと(生誕時、成人レベルの10％)、及び好中球を循環させる機能の不全等のような新生児における多免疫障害が、病原体にさらされたとき、新生児に重篤な感染症の危険を与える。この様に臨床診療は、一連のリスクファクターを規定して、その存在が新生児感染の予防または予測治療を目的とする臨床的決定を必要とするようになる。新生児の免疫系不全に関する情報に関しては参考文献[7-13]を、新生児感染リスクファクターとそれらの臨床決定との関係に関する情報に対しては参考文献[14-15]を参照できる。以下の三つの主要な予防的且つ治療的経路が普通行われる：1）垂直伝播感染することに対しリスクのある母体(例えば、グループB連鎖球菌の既知のコロニー、膜の未熟な破裂、母体の発熱、予定日前の自然分娩開始等を持つ母体)は分娩前後に抗生物質で治療されてもよい；2）単一母体リスクファクターを有するかまたは中程度に未熟な乳児は、24時間にわたって、中程度のまたは高度の介護育児室でモニターされてもよい；3）多リスク因子及び/または感染症の臨床兆候を有する乳児は、血液及びCSF培養、CBC及び胸部X線等を含む完全なる診断検査を受けてもよい。広いスペクトラムの抗生物質による治療が通常開始され、乳児は感染が除外されるまで病院に残る。抗生物質を使用する新生児の感染症治療に関する情報に関しては、文献[4-6、16]を参照できる。現在、ある臨床医達は、感染症にかかる恐れのある新生児をその診断から除くために、血しょうC反応性蛋白質(CRP)を使用している。CRPは、急性期応答の成分として肝細胞により分泌され、組織障害に応答して血しょう中で1000倍近くまで増加する。血しょうCRPの上昇は、IL-6及びTNF-αの生産と、CRPが生産される肝臓へのそれらの輸送に依存する。臨床的に感染の兆候がないときは、3日間連続的にCRP測定値が陰性のとき乳児が非感染であるという確かな証明を提供する。CRP測定が一度陽性のときは、感染の可能性が示唆される。新生児感染の診断に対するCRPの使用に関する情報に対しては、参考文献[17-18]を参照できる。血しょうCRPアッセイは幾つかの短所を有する。細菌にさらされることと血しようCRPの上昇との間の時間的ずれは数時間から数日の範囲に渡るかもしれない。それ故に、CRPはレトロスペクチブに感染症を除外して抗生物質療法の中止を支持するの役立つ一方、CRPは乳児の抗生物質療法を省略しても安全かどうかを見極めるために用いることはできない。さらに、血しよう中のCRPレベルは、外傷や生理学的ストレスの他の形に見られるように、非特異的に上昇するかもしれない(参考文献[19-20]を参照されたい)。この様に、感染のインディケーターとしてCRPを用いることは、非感染新生児の不必要な治療につながる。さらに、血しょうCRPの上昇は細菌感染のみを示し、ウイルス感染の診断に使用することはできない。細菌の培養もまた新生児感染の診断に対して普通に使用される。細菌培養の結果は24から48時間得られない。このように、初期の検査時に感染症の可能性を除外するために細菌培養を利用することはできず、それは治療の決定をしなければいけない時期を過ぎている。また、細菌培養は、早い時点では偽陰性率が高い。新生児感染症診断に対する細菌培養の利用に関する情報に対しては、参考文献[5 7]を参照されたい。 CRPと血液培養を含む現在の新生児感染に対する良く確立された診断テストは、本質的に確証的なものであり、初期の検査時に治療決定をするために利用できない。新生児の敗血症は、抗原にさらされて数時間内にしばしば爆発的で致命的となるので、CRPと細菌培養試験は、試験結果が入手されるまでに危険因子を持つ新生児を治療して病床に付かせる必要性を除外はしない。ここに参考文献として取り込まれているDavisら[69]による論文は、白血球高親和性Fcリセプター(CD64)発現に対し定量的フローサイトメトリーアッセイを記述し、全身的急性炎症応答の診断のインディケーターとしてのその利用を提唱している。しかし、リセプターCD64は、インターフェロン-YまたはG-CSFにさらされた後、6時間まで増加するようには見えない。多分、CD64の上昇は蛋白合成の幾つかのレベルに依存している。従って、測定CD64レベルが抗原の存在をのみならず蛋白合成の特別なステージもまた反映しているとき、CD64の上昇は比較的遅く、早い時点に容易に解釈できない。抗原にさらされた後に続くCD64の上昇の長期の遅延は、患者の感染を迅速に除外するためのCD64レベルの使用を可能としないであろう。さらに、Davisらにより記述されたアッセイは、新生児から採血できる許容量よりはるかに多い100mlもの血液の使用が必要である。 Davisらはまた、白血球のCD11a、CD11b、CD16、CD18、CD23、CD32、及びHLA-D Rを含む多くの潜在的感染インディケーターの評価と、潜在的インディケーターの発現と感染の存在または他の実験的テストとの間には相関関係がない点等を報告している。 Gendrelら[67]は、新生児の感染の診断に対し、血しょうプロカルシトニンアッセイを提案している。しかし、プロカルシトニンは、新生児感染のインディケーターとしての使用に対し充分に信頼できるものか解っていない。プロカルシトニンは、ウイルス感染、細菌のコロニー、新生児不快感の乳児では僅かに上昇しているが、細菌性敗血症を持つ乳児では高く上昇している。本アッセイは初期評価時に感染が疑われている乳児の治療を除外するために使用できない。 IL-6、IL-2、血液学的な評価点システム、胃の吸引研究、細菌の抗原テスト及びその他等を含む、新生児感染の他の潜在的インディケーターは多くの研究者により提案されてきた(参考文献[4、5、17、58-66])。これらの分子または評価点システムのいずれも、予想的(確認的というよりもむしろ)スクリーニングテストにおける感染インディケーターとして使用するために、充分信頼できかつ迅速であると証明されていない。本発明の目的と長所上述のように、感染に対し新生児を迅速かつ信頼性よく試験する方法を提供するのが本発明の主たる目的である。試験方法は、早く高い陽性及び陰性予想値を有している。感染に対する初期評価で新生児の感染を排除可能とする試験方法を提供するのが別の目的である。抗生物質の治療の開始前に及び/または集中介護室に収容する前に、新生児の感染を排除可能とする試験方法を提供するのが別の目的である。非常に少量の血液サンプルを、特に、従来の血液採取からの廃棄物として得ることができる程充分に少量要求する方法を提供することである。抗原に対する主要な応答を測定し、抗原誘導の蛋白合成を要求しない試験方法を提供するのも別の目的である。細菌感染と同様にウイルス感染の早期の同定を可能とする方法を提供することもまた別の目的である。実施するのが比較的単純であり、技術者が要する時間またはトレーニングを殆ど要求しない試験方法を提供することも、さらなる目的である。本方法は、病院への平均滞在期間の減少と、感染が疑われる新生児に対し抗生物質の使用を可能とする。抗生物質の使用を減らすことは、抗生物質抵抗性微生物に対する淘汰圧を減らし、新生児集中治療介護室細菌相を改良して院内感染の頻度を減少する。本方法は、抗生物質治療の結果として、重度のカビ・コロニー化を発症する入院乳児の数を減らすことを可能とする。本方法は、新生児集中介護室に新生児が滞在する時間の短縮を可能とし、その結果、今度は、新生児とその両親の間のきずなのために利用できる時間を増やし、授乳確立の遅延を減少する。異なる装置間の測定評定を可能とするキットを提供するのも別の目的である。発明の要約本発明は、信頼できる新生児感染アッセイを提供する。このアッセイは、初期評価時に非感染の新生児に対し感染を除外するのに充分に迅速であり、その結果、非感染新生児を抗生物質により治療したり集中介護室の病床につけるのを避けることができる。好ましい実施形態では、好中球表面CD11bレベルが全血サンプルでフローサイトメトリーにより測定される。図面の説明図1は、包括及び除外基準を要約し、StanfordのLucile Salter Packard Chidr en's Hospitalでの"Rule Out Infection"と題するワークアップを導く重大なコースをハイライトするフローチャートである。図2は、本発明によるCD11bの好中球表面発現に関する時間と温度の効果をLPS 刺激ある場合とない場合を、図示したものである。図3-Aは、本発明により、非感染乳児における好中球CD11b発現を図解するFACS スキャンを示す。図3-Bは、本発明による、グループB Streptococcusに感染した乳児における好中球CD11b発現を図解するFACSスキャンを示す。図4は、本発明により、3臨床結果グループに対し好中球CD11bの分布を示す。図5は、培養により確認された感染を持つ新生児に対し、入院時のCRPレベルとピーク時のCRPレベルを示す。図6は、本発明による、感染症に対し評価された乳児における、好中球CD11bと最も高く測定された血しようCRPとの間の相関関係を図解する。詳細な説明 “感染”という用語は、患者の血流、脳脊髄液または尿路の細菌性、ウイルス性またはかびのコロニー化に関連していると理解されている。“敗血症”という用語は、血流感染に関係していると理解されている。感染インディケーターは、患者が感染しているかどうかを示し、さらに患者が感染症状及び/または感染インディケーターレベルの測定後に行われる感染確認テストで陽性の結果を示すかどうかを予期する、分子レベルに関連していると理解される。迅速な感染のインディケーターは、その検出が充分に迅速であり、患者を治療及び／または集中介護室の病床につけるために初期の決定をするときにその使用できる感染インディケーターに関連していると理解される。実際の問題として、迅速な感染インディケーターのレベルは、新生児の初期の評価の4時間以内に、好ましくは2時間以内に、さらに理想的には数分以内にまたは30分以内に治療の決定をするために、使用できる。本発明は、新生児の感染に対し迅速かつ信頼できるテスト方法を提供する。この方法は、感染に対し新生児を治療するかどうかを決定するために、新生児における迅速な感染インディケーターのレベルを測定することを含む。集団の新生児に対し、その集団における迅速な感染インディケーターのレベルを測定することは、測定したレベルにより、集団から治療群と治療除去群を同定するのを可能とする。治療群は感染に対し治療され、一方、治療除去群は感染治療から除外される。評価した集団は、好ましくは、母体のリスクファクター及び／または新生児の症状により感染に対してリスクがあると考えられる新生児からなる。好ましくは、感染した新生児は、後で細菌、ウイルスまたはかびの培養により感染していることが確認される新生児か、または後で感染症状が持続するかまたはCRPテストのような信頼できる確認テストでの陽性結果等により感染していることが疑われる新生児である。同様に、非感染新生児は、持続感染症状がないことにより、及び／または培養テストが陰性かつ信頼できる確認テストで陰性であることにより、後に非感染であることが決定される新生児である。感染新生児の誤診断の厳しい結果のために、治療群は本質的に集団におけるすべての感染(敗血症を含む)新生児を含むことが特に望まれる。同等に、治療除外群は本質的に非感染新生児からなる。本発明の新生児感染テストは非常に低い偽陰性率を有することは重要である。このテストが高い陰性予想値(陰性結果が正しい確率)と感度(実際の感染患者の数の分数としてテストにより検出された感染患者の数)を持つことが重要である。このテストの陰性予想値と感度とは、感染乳児の同定に対し90％よりも高いか好ましくは本質的に100％であるので、陰性のテスト結果を持つ感染乳児の数は最小である。高い陰性予想値と感度は、テストした乳児の集団におけるすべての感染乳児を本質的に同定することを可能とする。非感染新生児の誤診断の健康的結果は、本質的に感染新生児の誤診断よりも厳しくはない。しかしながら、テストが低い偽陽性率を持ち、その結果、誤診断の非感染新生児の数が最小となるのが好ましい。この様に、このテストが高い陽性予想値(陽性結果が正しいという確率)と特異性(実際の非感染患者の数の分数としてテストにより同定された非感染患者の数)を持つことが好ましい。特に、本発明のテストの陽性予想値と特異性は80％よりも高いか、好ましくは90％よりも高い。本発明の感染インディケーターは、好ましくは、高い陽性予想値と特異性を可能とする。新生児の敗血症は、患者が抗原にさらされて数時間内にしばしば致命的となるので、感染に対しリスクがあると認められる新生児を治療する決定は、迅速に、典型的には新生児の初期の評価時になされなければならない。新生児における感染を除外するための予想(確認よりむしろ)テストは、この様に、乳児を抗生物質で治療したり、または乳児を観察及び／または治療のために新生児集中介護室の病床につけることを決定する前に、テスト結果が迅速に手に入る必要がある。本発明の迅速なテストは、乳児に対するリスクを最小にして、テスト結果が入手されるまで治療決定を遅延することを可能とする。本発明の感染インディケーターのレベルは、新生児が抗原にさらされて数時間内に信頼できる感染のインディケーターである。感染インディケーターのレベルは、新生児の初期評価時点で感染に対し新生児を治療するかどうかを決定できる。抗原に応答する感染インディケーターの上方調節は迅速に起こり、抗原によって誘導された蛋白合成に対し好ましくは独立している。感染インディケーターは、好ましくは、ウイルス、細菌及びかび感染のインディケーターである。そのレベルは、新生児がウイルス、細菌及び／またはかび感染を有するかどうかを示す。感染インディケーターは、好ましくは分子である。テスト結果の変動性を減少するために、感染インディケーターのレベルは、好ましくは、全血サンプルの感染インディケーターの平均レベルに対応するというよりもむしろ、全血サンプルの特異的部分に対応する。特異的部分は、血しょう、特別な細胞タイプの表面、及び特別な細胞タイプの細胞質等を含む。細胞タイプは、白血球、単球、好中球、その他を含む。好ましい実施形態では、感染インディケーターの測定レベルが好中球の表面の感染インディケーターのレベルである。好ましい実施形態では、好中球表面のCD11b(Mac-1、CR3)のレベルは、迅速な感染インディケーターとして使用される。好中球表面のCD11bが新生児感染の迅速かつ信頼できるインディケーターであることがわかった。CD11bは、好中球の接着、血管外遊出及び食作用に関与するβ-インテグリン接着分子である。構造を含むCD11bに関する一般情報に関しては、参考文献[21]を参照できる。この蛋白質は、例えば、参考文献[22、24、34]に記述されているように、非刺激好中球及びある別の白血球内の第1次及び第2次細胞内顆粒に貯蔵される。それは、補体カスケードの成分である、C3biに対するリセプターである。CD11bと補体との間の関係についての情報に関しては参考文献[32-33]を参照できる。 CD11bは、単球及び好中球を含む、種々の細胞に発現されている。これは、普通好中球上に非常に低レベルで発現され、好中球が病原体またはその生産物と遭遇すると迅速に上昇する。CD11bは、参考文献[23-24]に例証されているように、インビトロでエンドトキシン(リポポリサッカライド、LPS)の様な細菌生産物にさらされたとき、5分以内に好中球の表面上で増加し、表面上の発現は30分以内にピークとなる。LPSで刺激を受けた場合、好中球のCD11bの上方調節は、LPSが好中球表面のCD14に結合することにより開始される複雑ではあるが迅速なイベントのカスケードに依存していることが示されてきた。抗原に応答して、CD11bは細胞内顆粒から好中球表面に輸送される。好中球表面のCD11b発現の上方調節は、抗原誘導の蛋白合成には依存していない。LPSに応答する好中球のCD11bの上方調節の機構に関するさらに別の情報に対しては、参考文献[41-50]を参照できる。また、好中球は、恐らくCD-14とは無関係な機構により、アナフィラトキシンC 5a、細菌の生産物であるＦ-Ｍｅｔ-Ｌｅｕ-Ｐｈｅ及び炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子-α(ＴＮＦ-α)のような他の因子による刺激を受けて、インビトロ及びインビボでCD11bの発現を増加させることも知られている。その様な因子による刺激の際の好中球のCD11bの上方調節に関する情報に対しては、参考文献[ 46、51-53]を参照できる。ウイルス及び酵母による感染の間、好中球表面のCD11 b の増加は、参考文献[54.56]の内容を含む、幾つかのインビボ及びインビトロでの研究により報告されている。 CD11bは、インビボで感染状態にある場で、成人好中球上で増加する。病原体にさらされた後に続き好中球上でのCD11bの迅速な上方調節から、好中球表面のC D11bが成人における早期の感染の指標として有用であるかもしれないという示唆が得られた(参考文献[23-24、32-33、35-40]参照)。Wakefieldら[25]による研究は、免疫的に正常な成人の敗血症の早期の術後のインディケーターとしてCD11b の使用を記述している。しかし、新生児や免疫無防備状態患者のような免疫不全患者におけるCD11bの利用は、部分的には成人からの好中球よりも新生児の好中球のほうが一般的にはより少ない細胞内CD11bを含むという理由のために研究されてこなかった。Bruceら[26]及びMcEvoyら[27]は、好中球CD11bは新生児の好中球で減少しているために、このマーカーは新生児感染のインディケーターとして有用で有りそうもないことを示唆した。しかし、驚くべき事に、感染新生児における好中球表面CD11bの上方調節は抗原にさらした後数分内で容易に検出できる。表面CD11bは抗原にさらされた後5分以内に高度に上昇し、30分以内に最大に上昇する。その比較的に低い新生児のレベルにもかかわらず、好中球表面のCD11bは、新生児感染の迅速で感度が良く、特異的なインディケーターである。本発明のテストは、新生児の全血サンプルを用いる。新生児の採血許容量は、新生児の体重に依存していて、典型的には数ミリリッターより多くない。新生児の採血許容量は、種々のテストのために用いられ、それぞれ全血の最小量を必要とする。本発明のテストはできるだけ少ない全血を要求することが、この様に好まれている。感染テストに対し、必要とされる全血の容量は、好ましくは、0.1m lのオーダー、理想的には0.2mlより少ない。大量の血液を要求する分析ステップは、それ故に、本発明の新生児感染テストでは望ましくない。大量の血液を要求する分析ステップは、典型的な細胞の溶解と細胞部分の分離(例えば遠心)ステップとを含む。全血サンプルは、好中球表面CD11bの自然上方調節を阻害する条件下で常に取り扱われる。ひとつの実施形態では、サンプルは4℃で取り扱われる。別の実施形態では、アデノシンまたは抗CD-14抗体のような安定化化合物の好適な量が、サンプルに加えられる。好中球表面CD11bアッセイはサンプル取り扱い条件に対し極端に過敏であるので、分析サンプルの取り扱いには特別な注意を払うべきである。アッセイ条件についての不適当な制御の結果は、Davisら[69]による研究により例証されている。この報告は、CD11bを含む白血球の多くのマーカーのレベルと成人における感染の存在との間に相関関係がないことを報告している。Da visらの研究における方法の解析は、CD11bの自然上方調節が防げなかったことを示す；サンプルは採取後最高24時間に解析され、温度制御または安定化剤の添加により安定化されなかった。CD11bの自然上方調節を防ぐための注意深い温度コントロールまたは試薬の添加が、好中球表面CD11bの一定した結果をえるために要求される。好ましくは、好中級は、好中球の同定マーカーにより全血サンプルのフローサイトメトリーにより同定される。好ましい実施形態では、好中球同定マーカーは蛍光抗-CD15抗体のようなCD15マーカーを含む。全血サンプルから好中球を同定することは、一般的に該分野で知られており、ここでは詳細には議論されないであろう。表面CD11bレベルは、蛍光抗-CD11b抗体のようなCD11bマーカーにより各同定された好中球に対して決定される。CD11bマーカーは、好中球同定マーカーからスペクトル的に区別できる。その結果、2個のマーカーは2レーザーフローサイトメトリーで同時に解析できる。蛍光抗-CD15及び抗-CD11b抗体が該分野で知られている。上述のフローサイトメトリーテストは迅速で実施が容易であり、非常に少量の全血を必要とする。検定マーカーのレベルは、感染インディケーターに対し感染診断の敷居値を決定するために測定される。新生児における診断の敷居値と感染インディケーターのレベルとの間の関係は、患者を感染に対し治療するかどうかを決定するために用いられる。感染の診断敷居値は、目的とするテストの感度と特異性値により選ばれる。診断の敷居値は、好ましくは感染患者の誤診断を避けるように選ばれる。ある実施形態では、診断の敷居値は感染及び非感染患者の間の鋭いカットオフに対応する。カットオフ値は、感染患者と非感染患者を少なくとも99％の陰性予想値で分離するように選ばれる。別の実施形態では、多くの(例えば2)の診断敷居値が、感染及び非感染サブ集団を同定するために、さらに評価を必要とするサブ集団と同様に、用いられる。最初の診断の敷居値は、非感染患者と評価を必要とする患者を分離し、一方、2番めの敷居値は評価を必要とする患者と感染患者を分離する。細胞表面の感染インディケーターに対し、検定マーカーは、好ましくは、感染インディケーターでコートした微粒子を含む。微粒子上の感染インディケーターのレベルは、好ましくは、敗血症の診断敷居値に対応する。異なる検定マーカーが各診断敷居値に対し必要とされる。好ましい実施形態では、検定マーカーは直径1μｍのオーダーのCD11bでコートしたラテックス微粒子を含む。特別な分子でコートした微粒子を生産するための技術は、該分野でよく知られている。その様な技術の一つでは、微粒子が、マウス抗ヒトCD11b抗体にコンジュゲートしたマウス抗ラテックス抗体でコートされる。コートした微粒子は、次に、CD11bにさらされる。微粒子上のCD11bのレベルは、関連診断敷居値に対応する好中球上の表面CD11bレベルに本質的に等しくなるように選ばれる。検定に対しては、CD11bでコートした微粒子が、アッセイで新生児好中球を染色するために使用される抗CD11b蛍光抗体の量で染色される。染色した微粒子は、装置の読み取りを検定するために、新生児サンプルを解析するために使用される装置上で解析される。例えば、従来のフローサイトメーターに対しては、光電子増倍管装置が、検定微粒子上の抗CD11b抗体の蛍光が予定のレベルに対応するように好ましくは調節される。検定マーカーは、好ましくは、新生児の感染に対しテストするためのキットの部分として提供される。このキットは、新生児の診断敷居値を決定するための検定マーカー、感染インディケーターに対するマーカー、好中球同定マーカー及び安定剤を含む。好ましい実施形態では、このキットはCD11bでコートした微粒子、蛍光抗CD11b抗体、スペクトル的に抗CD11b抗体と区別できる蛍光好中球特異抗体、及び抗CD14抗体を含む。このキットの成分の濃度は、与えられたアッセイプロトコールに対し、分析に対し使用される装置で、好適な(中間領域)感染インディケーターシグナルを生み出すように選ばれる。本発明は、さらに免疫不全患者の感染を診断する方法を提供する。免疫不全患者は、未成熟な免疫機構を有する患者(例えば、新生児)かつ免疫無防備状態の患者を含む。免疫無防備状態の患者は、HIV患者、及び免疫抑制剤を投与されている移植患者を含む。感染診断テストは、正常な免疫機構を持つ患者におけるよりも症状診断がはるかに難しい免疫不全患者に特に有用である。異なるクラスの免疫不全患者は、一般的に、異なる好適な診断敷居値を有する。その結果、免疫不全患者のクラスに対する診断の敷居値及びキットは、好ましくは、そのクラスに対する感染アッセイの性質に対し適合させられる。以下の実施例は、本発明の特別な局面を例証するためのものであり、本発明を限定するものと解釈すべきでない。実施例1 本発明の方法が、1994年8月から1995年1月までの間、Lucile Salter Packard Children's Hospitalの新生児集中治療室にその誕生日に入院した懐胎期間28週以上の新生児を評価するために使用された。図1は、包含及び除外基準を要約し、StanfordのLucile Salter Packard Children's Hospitalでの"Rule Out Infec tion"ワークアップを手引きする重要なコースをハイライトする。CRPまたは血液学的採点システム(HSS)試験に関する陽性の結果により、治療の開始が始まる。その様な測定は、しかしながら、新生児の評価での感染の除外を可能にしないので、早い時点で感染インディケーターとして使用できない。後の時点や持続的な臨床兆候の無い時に、CRPは、確認的感染インディケーターとして使用するのに充分信頼できるようになる。被験者は、NICUへの入院の理由が、母体の分娩時のリスクファクターまたは乳児の症状のいずれかにより感染のリスクがあると考えられたときは、登録された。NICUへの入院と感染に対するリスクの決定は、図1に示されるNICUの重要な経路と一致して、この研究と提携関係のない参加小児科医によりなされた。感染の疑いがあるグループで症状がある乳児の誤分類を避けるために、症状を説明する確信的診断を持つものは、感染の疑いがあるグループには含められなかった。この研究は、Stanford大学Human Subjects Committeeにより承認された。サンプルが臨床的に示された採取血液からの廃棄物としてのみ得られたので、インフォームドコンセントに対する要求は差し控えられ、この研究は乳児の治療または結果には影響を与えなかった。 CD11b測定に対するサンプルは、病院の診断施設によるルーティンの細菌培養、血液測定及びCRP測定に対する血液採取と同時に、入院時に得られた。懐胎時の年齢と体重もまたこの時点で記録された。ウイルス培養は、臨床的に指示されたようにのみ実施された。血しょうCRP並びに血液、尿及びCSFの培養の結果は、少なくとも7日後に集められた。感染の臨床的兆候は、本研究と提携していないN ICUの看護スタッフにより、乳児のチャートに記録された。リスクファクター、抗生物質による母体の前治療、排泄物の診断、感染の臨床兆候(乳児のチャートに記されているような)は、CRPとCD11bの結果を知らされない一団により記録された。実施例2 好中球表面CD11bレベルのサンプル貯蔵時間、温度、LPSの存在等への依存性は、インビトロで調べられ、図2に示される。好中球CD11bは、サンプルが最高8 時間4℃で維持されるとき、好中球表面上に認められるほど増加しない。8時間後、LPS刺激及び非刺激細胞では僅かの増加が認められる。好中球表面のCD11bは、 2時間以上室温で貯蔵した細胞で増加している。38℃で貯蔵した細胞では殆ど即時に増加している。室温及び38℃においてLPSで刺激された細胞では、好中球表面のCD11b発現の最大量の増加が見られた。実施例3 末梢血好中球のCD11b発現は、全血サンプルのフローサイトメトリーにより測定された。血液(0.1ml)がNICUに入院したリスクファクターのある乳児から得られ、CD11b及びCD15を検出する抗体で染められ、採取8時間以内に冷却され解析された。培養、血液測定及びC-反応性蛋白質(CRP)決定に対する血液が同時に得られた。CD11b解析に対して用いられるサンプルは、CD11bが室温で末梢血サンプル中の好中球を自然に上方調節するので、4℃で取り扱われた。臨床的に指示された診断研究に対する血液採取の間、0.1mlの全血が各被験者から得られ、2.5mlの冷い染色メジウムで希釈された。染色メジウムは、不完全ＲＰＭI1640メジウム(Applied Scientific、Irvine、CA)、1％牛胎児血清(Gemin i Bioproduct、Calabasas、CA)、1％HEPES、pH7.2(Sigma、St.Louis、MO)を含んでいた。10％のアジ化ナトリウムのストック溶液が、0.02％の濃度になるように加えられた。貯蔵される場合は、最高8時間まで4℃に維持された。サンプルは一度染色メジウムで洗われ、0.5mlの染色メジウムに再サスペンドされFITCでコンジュゲートしたCD15(好中球を同定するために)及びPEでコンジュゲートしたCD11 bマウスの抗ヒトモノクローナル抗体(Becton-Dickinson、Milpitas、CA)で15分間染色された。サンプルは次に3回洗浄され、1％パラ-フォルムアルデヒド/染色メジウムに再サスペンドされた。染色に先立ち、HTCでコンジュゲートした抗CD1 5が、好中球CD15染色を蛍光活性化Cell Sorter(FACS)(FACScan、Becton Dickins on)で中間領域にもたらすために、コンジユゲートしていない抗CD-15抗体で希釈された。この装置は、各蛍光チャンネルにおける標準ビーズ(3.2μmSphero Rain bow蛍光粒子、Sphertech社、Libertyville、IL)の蛍光が各運転に対し正確に同じであるように調節された。サンプルが、好中球に対する正しい領域のCD15蛍光を持つ細胞のみがイベントとして受け入れられるように、FACScan上で敷居値のセットを用いて解析された。この敷居値は、赤血球及び他のすべての白血球を除外する。好中球CD11bの平均蛍光が、各サンプルに対し30,000カウント細胞当たり及び1から475蛍光単位( 任意の単位)の領域でCD11bの蛍光分布に基づいて測定された。低レベルのCD11b及びCD15を発現している、培養U-937細胞(ATCC、Rockville、 MD)が染色され、染色手順が正しい事を確かめるために患者のサンプルと同時に解析された。この研究期間の間、U-937細胞は100回解析され、CD11bの蛍光に対し、平均SDは2.00 0.11であった。U-937細胞におけるCD11b発現に関する情報に対しては、参考文献[31]を参照できる。実施例4 血しょうCRPレベルが、StanfordのLucile Packard Children's Hospitalの標準アッセイプロトコールを用いて、すべての新生児に対し測定された。測定した血しょうCRPレベルは、＜0.4-8.0の範囲であった。病院の診断施設により実施されたCRPアッセイは、低い方の感度限界が0.4mg/dlである。この敷居値より低いC RPレベルは、定量的というよりむしろ分類別に(“＜0.4mg/dl”)報告される。1 より大きいレベルは、StanfordのLucile Packard Children's Hospitalの臨床プロトコールに従い異常値として規定された。実施例5 図3-A及び3-Bは、それぞれ非感染及びグループB連鎖球菌感染乳児に対するサンプルのFACSプロットを示す。各等高線は、30,000個の細胞のサンプルの5％を表す。蛍光スケールが対数表示であることに留意を要する。非感染乳児は低いCD 11b発現を持ち(中央蛍光値＝1.62)、一方感染乳児は上昇したCD11b(中央蛍光値＝245.00)を示した。サンプルのCD11b蛍光はしっかりと分布しており、非特異的結合による干渉を殆ど示していない。好中球のみがイベントとしてカウントされるようにFACScan上で硬質ゲートがセットされたけれども、各サンプルが一個の集団の細胞のみをあらわしているので、さらに別の分析ゲートは必要ではなかった。実施例6 すべての確認テストの結果を入手した後、被験者は、感染(細菌またはウイルス培養で陽性、CRPまたはWBCカウントの上昇、または感染の強くて持続的な臨床症状)及び非感染(培養結果陰性、3日以上の正常CRP、感染の臨床兆候がないこと )のグループに分類された。感染グループは、次に確信的感染グループ(細菌またはウイルス培養陽性)及び疑いのある感染(培養結果は陰性であるが、CRPまたはW BCカウントが上昇しているか或いは強くて持続的な感染の臨床兆候がある)グループに細分化された。すべての転帰(outcome)グループへの割り当ては、CD11bの結果を知らされていない一団により行われた。疑いのある感染グループに分類される臨床兆候としては、チャートに記載されている以下の条件の1以上の8時間以上か、または2以上の条件の4時間以上が挙げられる：発熱、低体温、皮疹または呼吸困難。乳児は、非感染の病因が臨床兆候を説明するために同定される事が出来なかったときのみ、このグループに含められた。この様な非感染の病因としては、先天性奇形、投薬中止、トリソミー18及び21を含む染色体以上等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。表1は106の被験者に対して得られたデータを要約する。統計的解析がJMPソフトウエア(SAS Institute、Cary、NC)のヴァージョン3.1.を用いて実施された。転帰グループにおける差は、このデータに対し適当なものとして、2x3及び2x2相関表に対し独立のGテストを用いて評価された。106人の被験者の中で、7人が細菌またはウイルスの培養陽性結果(“培養により確認された感染”)を持ち、17人が臨床的感染兆候と陰性の培養結果(“疑いのある感染”)を持ち、82人が陰性の培養結果と臨床兆候を持たなかった(“非感染”)。好中球CD11bは、細菌に対してテストされた106人の被験者の中で陽性の細菌培養結果を持つすべての乳児において高く（グループB連鎖球菌が3症例、グループD連鎖球菌が1症例、腸球菌(Enterococcu s Faecalis)が1症例）、ウイルス(単純ヘルペスウイルス及びコクサッキーBウイルス)に対しテストされた11人の被験者の中で陽性のウイルス培養結果を持つ2人の被験者で上昇していた。陽性のウイルス培養結果を持つ両方の乳児が上昇した CD11bを持ったが、CRPレベルは正常限界内であった。表2は、陽性培養結果を持つ7人の乳児に対するCD11b及びCRPレベルを示す。CR Pは陽性の細菌培養結果を有する乳児においては3日目までに上昇したが、ウイルス陽性培養結果を持つ乳児では上昇してはいなかった。106人の乳児の内82人(77 ％)において、感染が、陰性の培養結果により及び感染の臨床兆候がない事により除外された。これらの乳児で高いCD11bを示したものはいなかった。図4は、各転帰グループに対し好中球CD11bレベルの分布を示す。好中級CD11b は、培養で確認された感染を持つすべての乳児で、疑われた感染の94％で上昇していたが、非感染ではだれも上昇していなかった。診断敷居値は、各転帰グループに対し蛍光値の分布に基づいて、60蛍光単位に定義された。CD11bは、"確認された感染"グループにおけるすべての被験者で100中央蛍光値よりも大きく、"非感染"グループでは60中央蛍光値よりも低かった。"疑われた感染"グループでは、好中球CD11bは、1被験者を除くすべての被験者で、60中央蛍光値よりも大きかった。この被験者の感染は、持続的低温症により疑われた。CRPレベルはこの乳児では同様に低かった。表3は、以下のグループの乳児に対し感染を検出するとき、CD11bアッセイの感度、特異性、陽性及び陰性の予想値を示す：1）感染新生児(疑われたまたは確認された感染)(ｎ＝17、96％の感度及び100％の特異性)；2）確認された細菌またはウイルス感染(ｎ＝7、グループ1のサブセット、100％の感度と83％の特異性) ；3）確認された細菌感染(ｎ＝5、グループ1及び2のサブセット、100％の感度と 81％の特異性)。G統計値に基づいて、これらの値はすべて有意であった(p＜10^-4 )。安全なテストが感染していそうなすべての新生児を同定すべきであるので、感染新生児のグループ分けはもっとも重要である。陰性及び陽性の予想値、感度、及び特異性は、初期評価時の新生児感染の診断に対し、それぞれ100％、99％、96％及び100％であった。疑われた或いは確認された感染を同定するための好中球CD11bの陰性予想値は99％であり、96.4から100％の95％信頼区間であった。図5は、入院した日のCRPの分布と陽性の細菌培養結果を持つ新生児のピークCR Pを示す。確認された感染グループにおけるすべての患者は、入院1日目に高い好中球CD11bを示した。しかしながら、このグループにおける5人の乳児の内3人が、少なくとも入院2日目までに血清CRPを上昇しなかった。血液培養は入院1日目に送られ、最初のCRP測定時とCD11b測定時に存在する感染を反映している。CD11 bの上昇は、細菌の血液培養がその後に陽性となった60％の新生児においてCRPの上昇に先行した。確認された感染グループでは、2人の被験者が陽性のウイルス培養結果を示した。これらの被験者は、低いCRPと高いCD11bを示した。図6は、好中球上の上昇したCD11bが0.4より大きいCRP値に対しピークCRP(r²＝ 0.76、p＜0.0001)と相関関係にあることを実証している。相関関係は標準線型回帰を用いて評価された。この図に含まれるCRP値は、3日間の間に得られた最も高い値であり、一方CD11b値は入院時に得られた。0.4より低いCRPを持つ被験者は、CRPアッセイが感度0.4の限界を持っているので、この線型回帰から省かれた。線型回帰から省略されたデータは、CRP＝0.3の個所で誤差バーを持つ平均として示されている。CD11bとピークCRPレベルとの間の相関関係は、組み合わせた分類別の且つ連続的データに対し、分類データ(“CRP＜0.4”)の包含を可能とするSp earman Rho関連測定を用いて評価された。ｎ＝26の観察に対し、Spearman-Rhoテストはr²＝0.54、p＜0.0001をもたらした。 CBC(例えば、卵割した好中球、バンヅ(未成熟好中球)、白血球)により測定された白血球サブセットにおける上昇または減少と、個体ベースあるいは回帰グループによる陽性血液培養結果または感染の臨床兆候との間には有意な相関関係は認められなかった。白血球サブセットと上昇したCD11bまたは上昇したCRPとの間に相関関係は見出されなかった。ウイルス陽性培養結果を持つ2個体では、白血球のカウントは細菌陽性培養結果を持つ被験者と比べて有意な差はなかった。Ap garスコア、誕生時の体重、または懐胎年齢とCD11b、CRP、陽性細菌培養結果または臨床回帰グループとの間には、相関関係は見られなかった。上述の実施形態が本発明の範囲をはずれずに多くの方法で変更しても良いことは、当該分野の熟練者には明瞭であろう。例えば、蛍光抗体以外の多くのマーカーが本発明の方法で使用するのに好適である。その様なマーカーとしては、中でも、酵素、ポリヌクレオチド及び砂糖が挙げられる。蛍光活性化細胞ソーティング以外の多くの分析技術が本発明の方法で好適であり、その例としては、走査顕微鏡及び光屈折技術等が挙げられる。さらに、特異的な血液部分または細胞タイプの分析を含まないアッセイ技術が、本発明の使用には好適である。その様な技術の例としては、感染インディケーターに対するマーカーでのみ全血染色し、次に全血サンプルのフローサイトメトリーまたはレーザー走査顕微鏡分析を行うこと等が挙げられる。感染及び悲感染患者を区別するために、種々の臨床技術が入手できる。診断敷居値を含むテストパラメーターが、特殊な臨床用途と要求される陽性及び陰性予想値によって選ばれる。従って、本発明の範囲は、以下のクレームとその法的に同等なものにより決定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者レビン，ロナルド，エル. アメリカ合衆国，メリーランド州 20850, ロックビル，ダンディーロード 1946 (72)発明者マルドナド，イヴォンヌアメリカ合衆国，カリフォルニア州 94061，レッドウッドシティ，ベレスフォードアヴェニュー 463 (72)発明者ヘルツェンバーグ，レオノア，エー. アメリカ合衆国，カリフォルニア州 94305，スタンフォード，セドロウェイ 876 (72)発明者ヘルツェンバーグ，レオナルド，エー. アメリカ合衆国，カリフォルニア州 94305，スタンフォード，セドロウェイ 876 (72)発明者ベニッツ，ウィリアム，イー. アメリカ合衆国，カリフォルニア州 94306，パロアルト，ラパラアベニュー 896

Claims

【特許請求の範囲】１．新生児の感染をテストする方法であって、前記新生児に対し感染を治療するか否かを決定するために前記新生児に迅速感染インディケーターのレベルを測定するステップを含む方法。２．前記感染インディケーターの前記レベルは、感染を引き起こす抗原に前記新生児がさらされて4時間以内に前記新生児において感染兆候の信頼できる予報をするものである、請求項1に記載の方法。３．感染に対する前記感染インディケーターの応答の検出が、本質的に抗原により誘導される蛋白合成に対して独立している、請求項1に記載の方法。４．フローサイトメトリーにより前記感染インディケーターの前記レベルの前記測定を含む、請求項1に記載の方法。５．前記新生児の全血サンプルの前記感染インディケーターの前記レベルの前記測定を含み、前記サンプルの容量が0.2mlより小さい、請求項1に記載の方法。６．前記感染インディケーターの前記レベルの自然上方調節を阻害する条件に前記新生児のサンプルをさらすステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。７．前記感染が血液流感染を含む、請求項1に記載の方法。８．感染に対し前記新生児を治療するかどうかを決めるために、前記新生児のCD 11ｂのレベルを測定するステップを含む、感染に対する新生児のテスト方法。９．前記新生児の初期評価時に感染に対して前記新生児を治療するかどうかを決定するために、前記新生児の迅速感染インディケーターのレベルを測定するステップを含む、感染に対する新生児のテスト方法。１０．以下のステップを含む、感染に対し新生児をテストする方法。ａ）好中球同定マーカーによる前記新生児の全血サンプルから好中球を同定するステップ；ｂ）感染に対し前記新生児を治療するかどうかを決定するために、前記好中球の表面上のCD11bのレベルを測定するステップ；１１．感染に対し新生児の集団をテストする方法であって、複数のレベルによって前記集団から治療グループと治療除外グループを同定するために、前記集団において迅速感染インディケーターの前記複数のレベルを測定するステップを含む方法。１２．前記治療グループが前記集団においてすべての感染新生児を本質的に含む、請求項11に記載の方法。１３．前記方法の感度が本質的に100％である、請求項12に記載の方法。１４．前記方法の特異性が90％より高い、請求項13に記載の方法。１５．感染に対し免疫不全患者をテストする方法であって、感染に対し前記患者を治療するかどうかを決定するために前記免疫不全患者において迅速感染インディケーターのレベルを測定するステップを含む方法。１６．感染に対し新生児をテストするためのキットであって、前記新生児において前記診断敷居値と前記感染インディケーターのレベルとの間の関係により感染に対し前記新生児を治療するかどうかを決定するために、前記迅速感染インディケーターに対する診断敷居値を決定するための検定マーカーを含むキット。１７．感染に対し新生児をテストするためのキットであって、前記新生児における前記感染インディケーターのレベルにより感染に対して前記新生児を治療するかどうかを決定するために、迅速感染インディケーターに対するマーカー含むキット。１８．前記感染インディケーターがCD11bを含む、請求項17に記載のキット。１９．前記新生児の血液サンプルから好中球を同定するために好中球同定マーカーをさらに含み、前記感染インディケーターの前記レベルは前記好中球に対応する、請求項18に記載のキット。２０．前記感染インディケーターの前記レベルの、自然上方調節を阻害するために、安定化化合物をさらに含む、請求項19に記載のキット。