JP2002515858A

JP2002515858A - 角膜移植に起因する疾患を処置するための殺菌／浸透性増強（ｂｐｉ）タンパク質

Info

Publication number: JP2002515858A
Application number: JP51912597A
Authority: JP
Inventors: スキャノン，パトリック，ジェイ．
Original assignee: ゾーマコーポレイション
Priority date: 1995-11-14
Filing date: 1996-11-12
Publication date: 2002-05-28
Also published as: CA2235625C; CA2235625A1; AU730303B2; EP0861087A1; AU7736196A; US5686414A; WO1997017989A1

Abstract

(57)【要約】本願発明は、殺菌／浸透性増強(BPI)タンパク質産物を含む好適な眼用製剤の局所的投与によって、角膜移植に関連または起因する障害、合併症あるいは疾患を患った患者を処置する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】角膜移植に起因する疾患を処置するための殺菌／浸透性増強(BPI)タンパク質発明の背景本願発明は、一般に、殺菌／浸透性増強(BPI)タンパク質産物の局所的投与によって、角膜移植に関連または起因する障害、合併症あるいは疾患を患った患者を処置するための方法に関する。角膜形成とも呼ばれている、角膜移植手術あるいは角膜移植法とは、不正常な患者の組織を健康な提供者の角膜組織と取り換える外科的処置である。移植片は、（層状の）角膜の一部厚みや、角膜（を貫通する）の全厚みを用いる。光学的改善、構造的改善、治療目的そして美容目的などの適応症に応じて、処置が施される。光学的改善とは、主に、混濁した角膜組織を澄明な提供者の組織に取り換えることによる、視覚改善を指す場合が多い。共通する症例として、様々なタイプの角膜炎や外傷によって引き起こされる、偽性水晶体水疱性角膜形成、円錐角膜、角膜ジストロフィー、角膜変性および瘢痕などがある。構造的改善には、固有質の薄化やデスメ瘤のような構造的変化が認められる眼の角膜組織の修復や保護処置がある。治療目的の処置には、従来の抗菌または抗ウイルス治療に対して感受性が小さくなった眼の膨張した角膜組織の除去がある。美容目的の処置には、眼の外観を改善するための処置が含まれる。角膜移植は、臓器移植の中でも最も普及している移植方法である。移植後に、術部に深い傷が残ったり、極端に歪んだり、あるいは角膜深層部に生じたジストロフィーの影響を受けている患者の処置が残される。米国での角膜移植の実施数は、米国アイバンク協会によれば、1980年の 14,400例から、1985年の28,926例、そして、1990年の40,631例へと劇的に増大しており、1994年には43,743例に達している。1994年12月31日現在で、7,000人近くの患者が角膜の提供を待ち続けている。角膜移植後に残る障害には、顕著な固有質の血管新生、角膜の感覚の欠如、移植片接合部組織の極端な薄化、そして角膜の炎症などがある。移植手術後に澄明な移植片が得られる予後を減少させうる因子として、自生的な緑内障、虹彩前癒着、ぶどう膜炎や、酒さ性座瘡および眼球瘢痕性天疱瘡のような反回性または進行性の結膜炎などがある。一般に、最も良好の予後は、局在化した角膜瘢痕、円錐角膜および角膜ジストロフィーに触発して応答する移植片において認められる。他の組織移植において認められるように、免疫拒絶反応が時として移植処置の実施を制限することになる。一般に、角膜は「適当」な移植部位とされており、また、患者の角膜が無血管である限りにおいては、提供者の組織が長期間にわたって患者の角膜部位に定着することが動物実験でも実証されている。手術後に患者の角膜に血管新生（「新血管新生」）が認められないことは、移植した角膜の長期定着に向けた第一の指標とされている。一般に、正常な角膜が無血管状態であるにもかかわらず、移植した角膜は相当の率で拒絶反応を起こし、新たな治療を要することになる。概して、移植拒絶反応とは、免疫学的反応によって生じた移植片の機能停止として定義されている。移植拒絶反応の態様は、様々な因子の中でも、患者の角膜の病理学的状態または疾患、外部からの物理的刺激、または物理的刺激に伴う感染症による眼の炎症、などによって変化する。角膜移植拒絶反応の発生率は、良好な予後の症例（ほとんどが無血管角膜）において、12〜13％の数値が報告されている。他の報告によれば、患者の角膜が無血管の場合で、2.3〜35％の割合で拒絶反応が起こるとされている。しかしながら、患者の角膜の血管新生の進行が著しい場合には、症例の65％までに拒絶反応が認められ、その約50％の移植が最終的に失敗に終わっているとの報告もされている。角膜中の血管の形成が、通常、毛細リンパ管の形成を伴うことが実験的に示されている。血管とリンパ管の組み合わせは、別の方法で免疫的に保護された角膜からの抗原の放出と、免疫適格細胞の移植角膜への到達を手助けすることになる。よって、免疫移植反応は、患者の角膜(例えば、瘢痕、血管新生、炎症、前移植片や他の因子)、患者の免疫学的状態、そして、移植拒絶反応を惹起および促進する角膜以外の病気（例えば、乾き目、瞼不整合、緑内障など）の条件によっても影響を受ける。これら条件は、特に、術後の初期段階において、重大な役割を果たすものと考えられ、また、初期拒絶反応の程度を知る手がかりにもなる。患者の状態に加えて、外科的手法、そして縫合と傷の回復に伴う問題が、角膜移植後の障害または拒絶反応の発生を招く場合がある。角膜の場合、移植拒絶反応は、他の外傷や眼病が認められない中で移植した角膜の混濁が進行することが特徴であり、混濁の症状が表れる以前の移植角膜が澄明であった場合には、角膜移植拒絶反応の臨床診断を行うことになる。拒絶反応は、角膜を構成する単一の層もしくはすべての層が同時に関与することが知られている。角膜の各層の写真は、診断に供するに十分なほど特徴的である。上皮、固有質あるいは内皮での拒絶反応の実験的研究において、拒絶反応の進行におけるリンパ球の一様な関与が報告されている。拒絶反応とその関連疾患または合併症を予防または処置するための現在の治療方法は、免疫抑制剤コルチコステロイドの投与に限られている。実際のところ、コルチコステロイドの局所的使用が、ヒトでの角膜移植拒絶反応の予防および処置のための治療の主流であり、また、その処置も通常は角膜移植手術後に直ちに開始されている。術後のコルチコステロイド処置の実施態様は、非常に多岐にわたっている。時としてステロイド処置は抜糸の時まで継続されるし、また、臨床医によっては、小用量のステロイドで１年以上（場合によっては無期限）局所的に治療を行う。「軽い」拒絶反応については、３時間毎にステロイドを局所的に投与し、その効果を２日おきに確認すれば十分である。このような症例の場合、移植片が水腫性であると確定する以前の少なくとも３週間にわたって投与を行う。あるいは、拒絶反応の初期段階にて、コルチコステロイド処置を集中的に行う。この処置は、通常、ステロイドの経時的投与や、デポー剤の眼周囲への注射によって行う。ところが、ステロイド治療にあっては、複雑で危険性を伴う問題点がある。特に、コルチコステロイドの眼に対する毒性と局部的な副作用は、深刻な問題を招くことになる。例えば、局所的なコルチコステロイドの使用は、眼の高血圧や白内障を引き起こし、免疫抑制が一部に作用するために眼の表面での細菌、真菌またはウィルスによる二次感染を助長し、あるいは術後の経過および上皮と固有質の欠陥の双方に関して、角膜の上皮と固有質の回復を阻害してしまう。特に、コルチコステロイドが移植片への微生物感染を容易にし、または、これら感染の臨床経過を感化することが報告されている。ある研究によれば、移植片に微生物性角膜炎を患った患者の68〜100％が、感染した時にコルチコステロイドの点眼を受けていたと報告されている。コルチコステロイドを点眼することで、感染を許容する宿主防御機構に作用することが知られている。また、感染した移植片のコルチコステロイド治療を徐々にやめるか、治療を打ち切ると、往々にして炎症反応が増強されることになる。術後のステロイド治療に関連する感染の場合、抗生物質を局所的に長期にわたって投与すると、術後の微生物性角膜炎の発症および進行に関与する微生物に耐性を付与することになる。ある研究によれば、移植片に微生物性角膜炎を発症する微生物の95％が、患者が常用している抗生物質に対して耐性があると報告している。よって、角膜移植での微生物感染は、合併症に至りかねず、これは移植専門家の悩みの種ともなっている。米国における、角膜形成後の微生物性角膜炎の発症率は、1.8〜4.9％と報告されている。この合併症による視覚障害は、重い症状を伴う。ある研究によれば、移植片の感染を患った眼の46％に視力の低下が認められている。他の研究によれば、感染患者のわずか14％だけが、20/200以上の視力を有していたことを報告している。３つ目の研究は、澄明な移植片を移植した症例の内、微生物感染処置後でもなお澄明さを保っていた症例は40％に過ぎないことを報告している。術後のいかなる時点でも感染合併症の発症は認められるが、術後１年以内の移植片の感染が、ある研究では55％、他の研究では88％の割合で発生すると報告している。ステロイドおよび／または長期にわたる抗生物質の利用を伴わない移植拒絶反応の予防手段が、これまでに研究されているが、その実用化にほど遠いのが現状である。抗リンパ球血清やアザチオプリンのような薬剤が実験的に使用されているが、一般的に、臨床現場での使用には危険すぎると考えられている。患者と提供者の組織の免疫学的操作が、角膜移植においてある程度の成功を収めている一方で、外科処置技術の改良、提供者の内皮の検査方法の改良、および角膜組織の長期保存法の改良を含めた非免疫学的方法が目下のところ研究されている。 BPIは、微生物による侵入に対する防御に必須の血液細胞である哺乳動物の多形核白血球(PMNまたは好中球)の顆粒から単離されたタンパク質である。ヒトBPI タンパク質は、イオン交換クロマトグラフィー［E1sbachら、J．Biol．Chem.，2 54:11000頁、(1979)］または大腸菌アフィニティークロマトグラフィー［Weiss ら、Blood，69:652頁、(1987)］のいずれかと、酸抽出とを併用して、PMNから単離されている。このようにして得られたBPIを本明細書では天然型BPIと称するが、これは、広範なグラム陰性細菌に対する強力な殺菌活性を有することが示されている。ヒトBPIの分子量はおよそ55,000ダルトン(55kD)である。ヒトBPIタンパク質全体のアミノ酸配列、及び該タンパク質をコードするDNAの核酸配列は、Gla yら、J．Biol．Chem.，264:9505頁、(1989)の図１に報告されており、かかる文献を引用することにより、それら配列を本明細書に含むものとする。Grayらのアミノ酸配列は、本明細書において、配列番号：１に示した。 BPIは、強い陽イオン性を有するタンパク質である。BPIのＮ末端半分は、高い実効電荷の原因となり、一方、分子のＣ末端半分は、-3の実効電荷を有する。[E lsbachおよびWeiss(1981)、前出]。約25kDの分子量を有するBPIのタンパク質分解によるＮ末端断片は、疎水性領域と親水性領域とを交互に含み、両親媒性の特徴を有する。ヒトBPIのこのＮ末端断片は、天然に由来する55kDのヒトBPIホロタンパク質の抗細菌効果を保有している。[Ooiら、J．Biol．Chem.，262:14891〜14894頁、(1987)]。Ｎ末端部分とは対照的に、単離されたヒトBPIタンパク質のＣ末端領域は、グラム陰性生物に対してほんのわずかに検出可能な抗細菌活性を呈するに過ぎない。[Ooiら、Ｊ．Exp ．Med.，174巻、649頁、(1991)]。「rBPI₂₃」と称される、およそ23kDのN末端BP I断片が、組換え法により製造されており、これもグラム陰性生物に対して抗細菌活性を保持するものである。[Gazzano-Santoroら、Infect．Immun．60巻、475 4〜4761頁(1992)]。当該技術分野にあっては、正常症例および危険率の高い（例えば、血管新生した角膜の）症例での角膜移植患者の術前および術後処置での治療法、および、副作用、毒性、コルチコステロイド治療による複雑で危険性を伴う問題点を伴わずして、角膜移植拒絶反応、術後の新血管新生および角膜の混濁化を効果的に予防または処置するための治療法が求められている。このような治療法は、たいていの場合、角膜組織に浸透できる薬剤を用いて、全身的よりもむしろ局所的に処置することが好ましく、また、治療剤は、提供者の組織に移植前に適用することが好ましい。加えて、理想的には、微生物から保護された状態で（その薬剤単独あるいは抗生物質のような抗菌剤を用いた処置のための補助剤を併用して）治療を行う。発明の要旨本発明は、移植拒絶反応、または、角膜の新血管新生および／または角膜の混濁化を抑制するに十分な量の殺菌／浸透性増強(BPI)タンパク質産物の患者の角膜への局所的投与によって、角膜移植患者を処置するための新規の方法を提供する。目下のところ、本発明の実施において好ましいBPIタンパク質産物には、BPIホロタンパク質の生物学的に活性なアミノ末端断片、rBPI₂₁やrBPI₄₂のような組換えタンパク質、および以下に詳述する組換えもしくは化学的に合成したBPI-誘導ペプチドがある。本発明の方法は、コルチコステロイドのような抗炎症剤、ならびに／または、シプロフロキサシン、ゲンタマイシンおよびオフロキサシンのような抗菌剤を含む抗微生物剤を含んでもよい、あるいはこれらを同時に投与する、眼科学的に許容される製剤の形態でのBPIタンパク質産物の投与を意図している。また、本発明は、術前および術後の患者の眼へのBPIタンパク質産物の適用ならびに患者の眼に移植される角膜組織への術前適用による、角膜移植拒絶反応、角膜の新血管新生および／または角膜の混濁化の抑制も意図している。本発明の実施により、特徴的な上皮および内皮の拒絶反応帯あるいは拒絶反応線の形成、眩しがり症、充血、結膜水腫、虹彩炎、眼内圧の変化(IOP)、視力低下および眼痛などの、角膜移植患者に共通して認められる障害や症状の一つ以上の予防または緩和を通じて、その軽減が期待できる。本発明の実施により、細菌感染を防げ、移植箇所の治癒の促進が図れる。本発明の無数の態様と利点は、好ましい実施態様に関する以下の説明を考慮すれば、明らかになるであろう。発明の詳細な説明「角膜損傷に関連する病態を処置するための方法」という名称の国際出願No． PCT/US96/18632に対応する、出願人の共同所有に係る、係属中の、同時に特許出願した米国特許出願No.08/557,289の開示を、参考までに本明細書に組み込んでいる。本発明は、移植拒絶反応、角膜の新血管新生または角膜の混濁化の症状（例えば、頻度または程度）を抑制するに十分な量の殺菌／浸透性増強(BPI)タンパク質産物が、角膜移植患者に局所的投与できるという驚くべき発見に関する。本発明の方法は、移植拒絶反応、角膜の新血管新生および／または角膜の混濁化を含む角膜移植に関連した、あるいは角膜移植に起因した障害、合併症あるいは疾患を患った患者の処置に有用であり、また、かような疾患を予防または処置する方法を提供する。角膜組織の貫通が治療効果のために必要であるが十分な工程ではない場合には、角膜組織の毒性が無く、局所的に投与したBPIタンパク質産物の効果が発揮されることが特に望ましい。本発明によって、BPIタンパク質産物が、角膜移植拒絶反応、感染症、潰瘍や損傷などの角膜移植に関連する疾患を予防または軽減することが、例えば、移植拒絶反応、感染症、潰瘍や損傷などの病状を記録するスリットランプ式生体顕微鏡法を用いた検査によって実証されている。本発明の一態様によれば、単一治療効果を得るに十分な量のBPIタンパク質産物だけの眼用製剤が、角膜移植患者に投与される。BPIタンパク質産物だけを投与する場合、「単一治療効果を得るに十分な量」の用語が意味するところは、単一療法として投与した場合に、抗脈管形成および／または抗微生物効果を含めた所望の効果を呈する量のBPIタンパク質産物を含有した眼用製剤にある。本発明では、天然BPIタンパク質単離物、組換えBPIタンパク質、BPI断片、BPI類似体、 BPI変異体、およびBPI誘導ペプチドなどの当該技術分野で公知の多様なBPIタンパク質産物のいずれでも利用できる。本発明の他の態様によれば、角膜移植患者は、併用治療効果を得るに十分な量のBPIタンパク質産物を含有した眼用製剤と、併用治療効果を得るに十分な量の一つ以上の免疫抑制薬コルチコステロイドを共に（同時に、あるいは相前後して）投与して処置される。本発明のこの態様は、 BPIタンパク質産物を、プレドニゾロンおよびデクサメタゾーンを含むコルチコステロイドあるいはコルチコステロイド類の組み合わせと共に投与すること、そして、コルチコステロイド治療が必要な場合の、投薬量の低減および／または治療期間の短縮を意図するものである。本発明の他の態様によれば、角膜移植患者は、併用治療効果を得るに十分な量のBPIタンパク質産物を含有した眼用製剤と、併用治療効果を得るに十分な量の一つ以上の抗菌薬を共に投与して処置される。本発明のこの態様は、BPIタンパク質産物を、眼に局所的に使用される抗菌剤またはこれらの組み合わせと共に投与することを意図しており、この抗菌剤には、ゲンタマイシン、トブラマイシン、バシトラシン、クロラムフェニコール、シプロフロキサン、オフロキサシン、ノルフロキサシン、エリスロマイシン、バシトラシン／ネオマイシン／ポリミキシンＢ、バンコマイシン、クリンダマイシン、ティカルシリン、ペニシリン、オキサシリン、セファゾリンなどの抗菌剤；アムフォテリシンＢ、ナイスタティン、ナタマイシン(ピマリシン)、ミコナゾール、ケトカノゾール、フルカノゾールなどの抗真菌剤；イドクスリジン、ヴィダラビン、トリフルリディンなどの抗ウィルス剤；およびプロパミジン、ネオマイシン、クロトリマゾール、ミコナゾール、イルタコナゾール、ポリヘキサメチレンビグアニドなどの抗原生動物剤などがある。本発明のこの態様は、例えば、抗菌活性と共に抗血管形成活性を発現し、また、感染微生物の抗菌剤感受性を高めることで、抗菌剤治療に要する費用の低減、および／または、抗菌剤に対する毒性応答の危険性の低減などの利点をもたらす、BPIタンパク質産物を含有した眼用製剤と抗菌剤による改善された治療効果に基づくものである。BPIタンパク質産物は、24時間時点での、微生物のin vitro成長を阻害するに必要な抗菌剤の最少濃度を低減する。BPIタンパク質産物が24時間時点での微生物成長に影響を与えない場合でも、０〜７時間での抗菌剤のin vitro初期殺菌効果を強化する。このBPIタンパク質産物は、BPIタンパク質産物単独による殺菌性や成長阻止効果に対して感受的でない微生物に対しても、これら効果を発現する。本発明のこの態様は、BPIタンパク質産物と抗菌剤の投与による微生物の抗菌剤耐性の有効な反転に関係している。BPIタンパク質産物は、臨床上の耐性領域内のレベルから臨床上の感受性領域内のレベルの間で、抗菌剤の最少阻止濃度を低減する。よって、BPIタンパク質産物は、正常では抗菌剤耐性の微生物を抗菌剤感受性の微生物に変換する。本発明のこれら態様によれば、BPIタンパク質産物の好適な眼用製剤と、コルチコステロイドおよび／または抗生物質が、併用治療効果を得るに十分な量で同時に投与される。コルチコステロイドとBPIタンパク質産物の好適な眼用製剤を投与する場合、BPIタンパク質産物に関する「併用治療効果を得るに十分な量」の用語は、少なくとも、新血管新生を抑制または最少にし、および／または、移植片を活性化または活発化するに十分な量を意味し、また、コルチコステロイドに関する「併用治療効果を得るに十分な量」の用語は、BPIタンパク質産物の所定量と共に投与した時に、少なくとも、炎症を抑制または最少にし、および／または、移植片を活性化または活発化するに十分な量を意味する。BPIタンパク質産物あるいはコルチコステロイド、または双方は、角膜移植に関連する、あるいは角膜移植に起因する障害に対する単一治療効果を得るに必要なレベル以下の量が投与される。抗菌剤とBPIタンパク質産物の好適な眼用製剤を投与する場合、BPIタンパク質産物に関する「併用治療効果を得るに十分な量」の用語は、少なくとも、新血管新生を抑制し、および／または、抗菌剤に対する微生物の感受性を高めるに十分な量を意味し、また、抗菌剤に関する「併用治療効果を得るに十分な量」の用語は、BPIタンパク質産物の所定量と共に投与した時に、少なくとも、殺菌効果または成長阻止効果を引き出す抗菌剤の量のを意味する。BPIタンパク質産物もしくは抗菌剤、または双方は、角膜移植に関連する、あるいは角膜移植に起因する障害に対する単一治療効果を得るに必要なレベル以下の量が投与される。 BPIタンパク質産物は、通常の治療に付け加えるようにして投与され、また、好ましくは、角膜移植患者の初期治療から使用される。BPIタンパク質産物は、好ましくは、予防措置的に患者に投与するか、あるいは、移植後に直ちに投与する。BPIタンパク質産物を用いた治療は、各患者の臨床状態に基づいて医学的見地から決定した用量（例えば、約１〜約２mg/mlのBPIタンパク質産物の約10〜約 200μｌの溶液の滴下投与）を、好ましくは、１〜30日間、そして、必要であればさらに長期間継続する。BPIタンパク質産物による治療は、例えば、移植前に血管形成した角膜を移植した患者や、角膜移植後に重度または中度の角膜感染、潰瘍形成、損傷などを発症した患者に対して特に有効であり、また、角膜拒絶反応、感染症、潰瘍形成、損傷などが認められる患者の容体を改善する。患者の容体の回復の程度は、角膜移植患者に共通して認められる障害や症状の進行の遅れや退行を観察することで判定できる。また、本発明では、特に、移植を予定している患者の移植前処置の一部に眼用製剤の適用が含まれる場合に、移植に先駆けて提供者の移植用角膜組織にBPIタンパク質産物を適用することをも意図している。 BPIタンパク質産物の好適な眼用製剤は、ヘパリンを中和し、また、ヘパリン依存性脈管形成を阻害するので好ましい。BPIの抗脈管形成の特性は、参考までに共に本明細書に取り込んだ、Littleらの共同所有に係る、係属中の米国特許出願No.08/435,855と共同所有に係る米国特許No.5,348,942に開示されている。また、BPIタンパク質産物の好適な眼用製剤は、グラム陰性細菌および／または角膜の感染症／潰瘍を患った患者を抗生物質処置して放出された内毒素に関連する内毒素を中和するので好ましい。さらに、BPIタンパク質産物の好適な眼用製剤は、感受性細菌および真菌に対する抗菌活性を有し、そして、抗生物質と抗真菌剤の治療効果を高めるので好ましい。例えば、参考までに共に本明細書に取り込んだ、グラム陽性細菌に関するBPIタンパク質産物の活性について述べている、1994年７月11日に出願された米国特許出願No.08/274,229の一部継続出願である、Horwitzらの共同所有に係る、係属中の、1995年１月13日に出願された米国特許出願No.08/372,783；および、参考までに共に本明細書に取り込んだ、真菌に関するBPIタンパク質産物の活性について述べている、1994年７月11日に出願された米国特許出願No.08/273,540の一部継続出願である、Littleらの共同所有に係る、係属中の、1995年１月13日に出願された米国特許出願No.08/372,105 を参照。本明細書で述べた眼への使用にあっては、好ましくは、BPIタンパク質産物を局所的に角膜表面に投与する。局所的経路には、好ましくは、点眼、軟膏、ゲル、膏薬などの投与経路がある。他の局所的経路として、（例えば、傷の洗浄のための）灌注液を利用した経路がある。当業者であれば、眼用製剤に用いるBPIタンパク質産物の用量や投与形態を容易に決定できる。本明細書で使用する「BPIタンパク質産物」とは、天然および組換え生成したB PIタンパク質；BPIタンパク質の天然、合成、および組換えの生物学的に活性なポリペプチド断片；ハイブリッド融合タンパク質および二量体を含む、BPIタンパク質の生物学的に活性なポリペプチド変異体あるいはその断片；システイン置換した類似体を含む、BPIタンパク質の生物学的に活性なポリペプチド類似体あるいはその断片あるいはその変異体；およびBPI-誘導ペプチドを包含する。本発明に従って投与されるBPIタンパク質産物は、当該技術分野いかなる手段によっても生成および／または単離される。本明細書に参考文献として取り入れた、米国特許第5,198,541号は、rBPI₅₀またはrBPI₅₅と称する組換えBPIホロタンパク質とBPIの組換え断片を含むBPIタンパク質の発現のための方法とそれをコードする組換え遺伝子を開示している。本明細書に参考文献として取り入れた、共同所有に係る、係属中の米国特許出願No.07/885,501とその一部継続出願、1993年５月1 9日出願の米国特許出願No.08/072,063と、1993年５月19日に出願された対応国際出願No.93/04752は、培地中の遺伝子的に形質転換した哺乳類宿主細胞にて発現し、そこから分泌した組換えBPIタンパク質産物の新規の精製方法、および安定で、均質な薬剤調製物への導入に好適な組換えBPI生成物の大量調製の方法を開示している。生物学的に活性なBPIの断片(BPI断片)は、断片分子が、ホロタンパク質のアミノ末端アミノ酸、内部アミノ酸、および／またはカルボキシ末端アミノ酸を欠いていることを除けば、天然ヒトBPIホロタンパク質と同じあるいは同様のアミノ酸配列を有する生物学的に活性な分子を含む。かような断片の例として、Ooi et al.，J．Exp．Med.，17 4:649(1991)に記載の約25kDの天然ヒトBPIのＮ末端断片、およびGazzano-Santor o et al.，Infect．Immun．60:4754-4761(1992)に記載の、rBPI₂₃と称する、天然ヒトBPIのＮ末端アミノ酸の１位から約193あるいは199位をコードするＤＮＡの組換え発現生成物がある。その文献にて、発現ベクターを、第151位のバリンがGTCではなくGTGでコードされ、そして、第185位が(AAGで特定された)リジンでなく(GAGで特定された)グルタミン酸であることを除けば、前出のGray et al., の図１に記載された成熟したヒトBPIのＮ末端の31残基のシグナル配列および最初の199個のアミノ酸を有する組換え発現生成物(rBPI₂₃)をコードするＤＮＡの源として使用している。組換えホロタンパク質は、rBPI₂₃に関して述べた例外点ならびに第417位が(GTTで特定された)バリンでなく(GCTで特定された)アラニンであることを除けば、前出のGray et al.,の図１に記載された配列(配列番号：１および２)を有する状態で生成する。他の例としては、本明細書に参考文献として取り入れた、共同所有に係る、係属中の米国特許出願No.5,447,913に記載されたBPI断片の二量体がある。好ましい二量体生成物には、単量体がBPIホロタンパク質の約１〜175あるいは約１〜199のＮ末端残基を有するアミノ末端BPI断片である二量体のBPIタンパク質産物がある。特に好ましい二量体生成物には、rBP T₄₂二量体と称する、１〜193位のＮ末端残基を有するBPI断片の二量体がある。 BPIの生物学的に活性な変異体(BPI変異体)は、BPIホロタンパク質あるいはその生物学的に活性な断片、および少なくとも一つの他のポリペプチドの一部を含む組換えハイブリッド融合タンパク質、ならびにBPI変異体の二量体を含むが、これらに限定されるものではない。かようなハイブリッド融合タンパク質および二量体の例は、本明細書に参考文献として取り入れた、セオファンらによる、共同所有に係る、係属中の米国特許出願No．07/885,911とその一部継続出願、1993年５月19日に出願された米国特許出願No．08/064,693、および1993年５月19日に出願された対応国際出願No ．US93/04754に記載されており、アミノ末端にBPIタンパク質あるいはその生物学的に活性な断片、そして、カルボキシ末端に少なくとも一つの免疫グロブリンＨ鎖とその対立変異体を含むハイブリッド融合タンパク質を含む。 BPIの生物学的に活性な類似体(BPI類似体)は、BPIタンパク質産物に限定するものではないが、一つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸で置換されたものを含む。例えば、本明細書に参考文献として取り入れた、共同所有に係る、米国特許 No．5,420,019および1994年２月２日に出願された対応国際出願No．US94/01235 は、システイン残基が異なるアミノ酸で置換されたBPIとBPI断片のポリペプチド類似体を開示している。この出願に記載されている好ましいBPIタンパク質産物は、BPIホロタンパク質のＮ末端アミノ酸の第１位から約193（特に好ましい）あるいは199位のアミノ酸であり、その第132位のシステイン残基がアラニンで置換され、rBPI₂₁ΔcysあるいはrBPI₂₁と称するアミノ酸をコードするＤＮＡの発現生成物である。他の例として、例えば、本明細書に参考文献として取り入れた、共同所有に係る、係属中の1994年３月11日に出願された米国特許出願No.08/212, 132および対応する1995年３月11日に出願された米国特許出願No.08/212,132に記載されたBPI類似体の二量体がある。本発明の方法において有用な他のBPIタンパク質産物は、組換えもしくは合成手段で生成したBPIから誘導したペプチド(BPI誘導ペプチド)または当該BPIに基づくペプチドであり、かようなペプチドとして、本明細書に参考文献として取り入れた、1994年９月15日に出願された米国特許出願No．08/306,473に対応する、共同所有に係る、係属中の1995年７月20日に出願された米国特許出願No．08/504 ,841に対応する1995年７月20日に出願された国際出願No．US95/09262、1994年９月15日に出願された米国特許出願No．08/306,473に対応する1994年９月15日に出願された国際出願No．US94/10427、および、1993年３月12日に出願された米国特許出願No．08/030,644の一部継続出願である、（1994年３月11日に出願された国際出願No．US94/02401に対応する）1993年７月15日に出願された米国特許出願No ．08/093,202の一部継続出願である、1994年１月14日に出願された米国特許出願 No．08/183,222の一部継続出願である、1994年３月11日に出願された米国特許出願No．08/209,762に対応する1994年３月11日に出願された国際出願No．US94/024 65に記載されたものがある。 BPIタンパク質産物のヒトへの全身投与に関する安全性は、健康なヴォランティアで実証されており、また、von der Mohlenら、Blood，85(12):3437-3443(19 95)およびvon der Mohlenら、J．Infect．Dis.，172:144-151(1995)の文献に掲載されたヒトの内毒素血症の実験モデルでも実証されている。目下のところ好ましいBPIタンパク質産物には、組換え的に生成したBPIのＮ末端断片、特に、rBPI₂₃あるいはrBPI₂₁のような約21〜25kDの分子量を有するもの、あるいはこれらＮ末端断片の二量体（例えば、rBPI₄₂二量体）がある。さらに、BPIタンパク質産物として、rBPI₅₅およびBPI-誘導ペプチドがある。目下のところ最も好ましいタンパク質は、プルロニックP123(ポロキサマー403 )(BASF Wyandotte、パルシパニー、ニュージャージー州)のような抗菌活性を高めるポロキサマー界面活性剤を用いて調製したrBPI₂₁タンパク質産物である。 BPIタンパク質産物の投与は、好ましくは、BPIタンパク質産物、および薬学的に許容される希釈剤、賦形剤あるいは担体を含む薬学的組成物として投与される。BPIタンパク質産物は、BPIタンパク質産物単独、あるいは公知の界面活性剤、他の化学療法薬、あるいは他の公知の抗微生物薬剤と組み合わせて投与される。 BPIタンパク質産物を含む薬学的組成物は、５mMクエン酸塩、150mM塩化ナトリウム、0.2％プルロニックP123(ポロキサマー403)または0.2％プルロニックP103(ポロキサマー333)および0.002％のポリソルベート80中での２mg/mlの濃度のrBPI₂₁ タンパク質産物を含む。BPIタンパク質産物および抗菌活性を高めるポロキサマー界面活性剤の組成物は、本明細書に参考文献として取り入れた、共同所有に係る、係属中の1995年９月19日に出願された米国特許出願No.08/530,599および199 5年１月13日に出願された米国特許出願No.08/372,104に記載されている。rBPI₂₁ のようなBPIタンパク質産物を含む他の薬学的組成物は、５mMクエン酸塩、150mM 塩化ナトリウム、0.2％プルロニックF68(ポロキサマー188)および0.002％のポリソルベート80中での２mg/mlの濃度のBPIタンパク質産物を含む。BPIタンパク質産物(例えば、rBPI₅₅、rBPI₄₂、rBPI₂₃)を含むさらに他の薬学的組成物では、ポロキサマー188(プルロニックF-68、BASF Wyandotte、パルシパニー、ニュージャージー州）と0.002重量％のポリソルベート80(Tween80、ICI Americas社、ウィルミントン、デラウェア州)を含んだリン酸塩で緩衝化した生理食塩水(５または 20mMクエン酸塩、150mM塩化ナトリウム、pH5.0)中に１mg/mlの濃度のBPIタンパク質産物を含む。このような組み合わせは、本明細書に参考文献として取り入れた、1994年２月２日に出願された米国特許出願No.08/190,869と1993年２月２日に出願された米国特許出願N o．08/012,360に対応する、共同所有に係る、係属中の、1994年２月２日に出願された国際出願No．US94/01239に記載されている。本発明の他の態様と利点は、以下の実施例の開示を考慮すればさらに理解が深まるであろう。実施例１は、BPIタンパク質産物の単独投与またはコルチコステロイドおよび／または抗生物質との同時投与による、同種移植片を角膜移植したウサギモデルでのBPIタンパク質産物の効果について述べている。実施例２は、B PIタンパク質産物の単独投与またはコルチコステロイドおよび／または抗生物質との併用による、異種移植片を角膜移植したウサギモデルでのBPIタンパク質産物の効果について述べている。実施例１同種移植片を角膜移植したウサギモデルでのBPIタンパク質産物の投与効果同種移植拒絶反応に関するBPIタンパク質産物の投与効果を、BPIタンパク質産物の単独投与またはコルチコステロイドおよび／または抗生物質との同時投与によって、同種移植片を角膜移植したウサギモデルで評価する。これら実験のために、ニュージーランド白ウサギ(Pine Acres Rabbitry、ウエストブラットレボロ、バーモント州)を準備し、また、実験動物の利用に関するS ERIガイドラインとARVO Resolutionに厳格に従う。任意に選択した一方の眼に、角膜移植を行う。2.0〜3.0kgの体重のウサギに、0.5〜0.7ml/kgの齧歯動物用カクテル剤(100mg/mlケタミン、20mg/mlキシラジンおよび10mg/mlアセプロザミン)の筋内注射で麻酔をかける。プロパラカイン塩酸塩(0.5％オフタイン、Bristol-Myer s Squibb社)の点眼液を、瞳孔の拡張を最大ならしめるために、シクロペントレート（１％、Cyclogyl(登録商標)、Alcon社、フォートワース、テキサス州）とフェニルエフリン（10.0％、CibaVision、ダルチ、ジョージア州）の点眼液と共に一滴ずつ動物の眼に滴下する。後者の薬液の凝固を防ぐために、各動物の静脈に１mlのヘパリン(5000単位/ml)を投与する。すべての外科処置を顕微鏡下で行う。これらの実験のために、2.0〜3.0kgの体重のオランダウサギから移植用角膜を得る。ペントバルビタールナトリウム（６g/ml、somlethol社，J.A．Webster、スターリン、マサチューセッツ州）の致死量を静脈から投与してウサギを屠殺する。24時間以内に眼球を摘出し、４℃で、改良組織用培地にて保存する。角膜移植の直前に、滅菌したはさみで角膜を切り出し、改良組織用培地で洗浄する。場合によっては、角膜移植に先駆けて移植用組織の前処置として、改良組織用培地にBPIタンパク質産物を補充する。穿孔術によって6.25mmの大きさの移植片を取り出す。移植処置に向けて、まず、4-0の縫合糸で眼を２つの直筋に固定し、そして、６mmの穿孔器を用いて、各動物の角膜の上部側方の四分円に偏心的に位置する部分厚の角膜形成を行う。次に、患者の角膜の端部の１〜２mmが、移植片が周縁部に最も近接する箇所に認められるように移植片を位置せしめる。後房に穿孔器を導いた後に、角膜用はさみで切開を行う。そして、角膜の交換を行い、まず、術後に抜糸される４つの10-0単繊維ナイロン製縫合糸で固定する。血管新生を助長し、また、縫合糸の結び目が隠れないようにすべく、10-0単繊維ナイロン製縫合糸を用いて、周縁に最も近接する移植片の側面に位置する結び目で移植片を固定する。処置の終わりに、クロラムフェニコール軟膏を処置した眼に適用する。あるいは、クロラムフェニコールの補助剤として、BPIタンパク質産物の眼用薬液を、移植を受ける側の眼に術前および／または術後に適用する。同じ動物に一旦切り出した角膜を縫合すること以外は、同一の方法に従った自己移植も行う。手術後、角膜の抜糸が行われる14日目まで、すべての動物に、毎日、アトロピン点眼液（１％、硫酸アトロピン、Bauch & Lomb社、タンパ、フロリダ州）とクロラムフェニコール軟膏(1.0％、Bauch & Lomb社、タンパ、フロリダ州)を投与する。手術後１日目に、移植角膜と患者の角膜の澄明度、後房の深さと反応性、角膜／虹彩の癒着の程度、そして水晶体の損傷の痕跡を記録するためにスリットランプ試験を行う。移植片の澄明化率、血管新生の進行度、およびぶどう膜炎または同種移植拒絶反応を評価するために、以後毎日、スリットランプ試験を行う。一方法として、同種移植片を角膜移植したウサギを以下の４つのグループに分けて処置する。(a)少なくとも１ヶ月間、毎日、BPIタンパク質産物を５回投与した５羽のウサギ、(b)少なくとも１ヶ月間、毎日、対照の賦形剤を５回投与した５羽のウサギ、(c)少なくとも１ヶ月間、毎日、プレドニソロン（１％、Predfor te(登録商標)、Allergan、イルビン、カリフォルニア州）を５回投与した５羽のウサギ、および(d)少なくとも１ヶ月間、毎日、BPIタンパク質産物と１％プレドニソロンを５回投与した５羽のウサギ。並行して行った実験では、移植に先駆けて、BPIタンパク質産物眼用液剤で移植片組織を前処置する。さらに、BPIタンパク質産物単独またはクロラムフェニコールなどの抗菌剤の補助剤としてのBP Iタンパク質産物眼用液剤で術後直ちに眼周ポケットと手術した眼球を洗浄する。以下の兆候の一つ以上の出現を、同種移植拒絶反応の現れを示す指標とする。 (1)当初澄明であった移植片の角膜固有質の一部または全部の混濁化、(2)上皮拒絶反応線の出現、(3)内皮拒絶反応線の出現、または(4)角膜経線に関して表れた新血管新生。手術を行った日から上掲した兆候のいずれかが初めて表れる日まで、移植片の状態を記録する。診断内容を確定するために動物を屠殺する前に、同種移植拒絶反応の進行を数日間にわたって観察する。ペントバルビタールナトリウム（６ｇ/ml、somlethol（ソムレソル）、J.A．Webster社、スターリン、マサチューセッツ州）の致死量を投与してウサギを屠殺する。眼球を摘出して、半分の濃度に希釈したカルノフスキーの定着液で固定する。細胞の浸潤を決定するために、ヘマトキシリンとエオシンで切片を染色する。移植拒絶反応スコアを、マン−ウィットニーＵ試験法を用いて解析し、Statview SE+グラフィックソフトウェア(Abicus Concepts、バークレイ、カリフォルニア州)を用いて統計処理する。 BPIタンパク質産物単独およびコルチコステロイドとの併用投与により、同種移植反応または拒絶反応の兆候の出現の遅延化または予防、角膜血管新生および／または混濁化の発生の遅延化または予防において、臨床上の重要性が認めらる。これら臨床上の重要性は、特徴的な上皮または内皮の拒絶反応線の形成、視力低下、眩しがり症、充血、結膜水腫、虹彩炎、眼内圧の変化(IOP)および眼痛などの角膜移植患者に認められる障害や症状の一つ以上の予防または緩和を通じても認めることができる。実施例２異種移植片を角膜移植したウサギモデルでのBPIタンパク質産物の投与効果 BPIタンパク質産物の投与効果を、BPIタンパク質産物の単独投与または局所用コルチコステロイドおよび／または抗菌剤との併用によって、異種移植片を角膜移植したモデルで評価する。これら実験のために、ニュージーランド白ウサギ(Pine Acres Rabbitry、ウエストブラットレボロ、バーモント州)を準備し、また、実験動物の利用に関するS ERIガイドラインとARVO Resolutionに厳格に従う。任意に選択した一方の眼に、角膜移植を行う。2.0〜3.0kgの体重のウサギに、0.5〜0.7ml/kgの齧歯動物用カクテル剤(100mg/mlケタミン、20mg/mlキシラジンおよび10mg/mlアセプロザミン) の筋内注射で麻酔をかける。プロパラカイン塩酸塩(0.5％オフタイン、Bristol- Myers Squibb社)の点眼液を、瞳孔の拡張を最大ならしめるために、シクロペントレート（１％、Cyclogyl(登録商標)、Alcon社、フォートワース、テキサス州）とフェニルエフリン（10.0％、Ciba Vision、ダルチ、ジョージア州）の点眼液と共に一滴ずつ動物の眼に滴下する。すべての外科処置を顕微鏡下で行う。これらの実験のために、約200〜300ｇの体重のFisherラット（Charles River Laboratory、ウィルミントン、マサチューセッツ州）から移植用角膜を得る。ラットを二酸化炭素ガスで窒息死させる。窒息死させた後、直ちに眼球を摘出し、４℃で、改良組織用培地にて保存する。異種角膜移植の直前に、滅菌したはさみで角膜を切り出し、改良組織用培地で洗浄する。場合によっては、角膜移植に先駆けて移植用組織の前処置として、改良組織用培地にBPIタンパク質産物を補充する。穿孔術によって約2.0mmの大きさの移植片を取り出す。移植処置に向けて、眼球の突出に続いて、角膜の上部周縁と平行でかつ上部周縁から約６mm以内の位置に、約４mmの長さにわたって切開する。切開部分の切開深さは、角膜の厚みの約半分である。毛様体解離術用スパチュラを用いてさらに器官質内切開によって、上部周縁から約２mm以内の位置を切開することで、異種移植片を収容するに十分な大きさの眼周ポケットが形成される。このポケットの位置は、移植片の異なる部位から派生する効果のバラツキを最小ならしめる位置に定める。そして、約40μlのゲンタマイシン硫酸塩の眼用液剤でこの眼周ポケットを洗浄し、その後、齧歯動物の角膜をそこに移植し、可能なかぎり均等に定着させる。術後直ちに、手術した眼に、別の約40μlのゲンタマイシン硫酸塩の眼用液剤を適用する。あるいは、ゲンタマイシンの補助剤として、BPIタンパク質産物の眼用薬液を、移植を受ける側の眼に術前および／または術後に適用する。手術後、角膜の抜糸が行われる７日目まで、すべての動物に、毎日、約40μl のゲンタマイシン硫酸塩の眼用液剤（３mg/ml）を投与する。手術後、毎日、移植角膜の澄明度、血管新生の進行度、およびぶどう膜炎または同種移植拒絶反応を評価するためにスリットランプ試験を行う。一方法として、異種移植片を角膜移植したウサギを以下の４つのグループに分けて処置する。(a)異種移植の日から少なくとも１ヶ月間、毎日、BPIタンパク質産物を５回投与した５羽のウサギ、(b)少なくとも１ヶ月間、毎日、対照の賦形剤を５回投与した５羽のウサギ、(c)少なくとも１ヶ月間、毎日、プレドニソロン（１％、Predforte(登録商標)、Allergan、イルビン、カリフォルニア州）を５回投与した５羽のウサギ、および(d)少なくとも１ヶ月間、毎日、BPIタンパク質産物と１％プレドニソロンそれぞれを５回投与した５羽のウサギ。並行して行った実験では、移植に先駆けて、BPIタンパク質産物眼用液剤で移植片組織を前処置する。さらに、BPIタンパク質産物単独またはゲンタマイシンなどの抗菌剤の補助剤としてのBPIタンパク質産物眼用液剤で術後直ちに眼周ポケットと手術した眼球を洗浄する。以下の兆候の一つ以上の出現を、同種移植拒絶反応の現れを示す指標とする。 (1)当初澄明であった移植片の角膜固有質の一部または全部の混濁化、(2)上皮拒絶反応線の出現、(3)内皮拒絶反応線の出現、または(4)角膜経線に関して表れた新血管新生。手術を行った日から上掲した兆候のいずれかが初めて表れる日まで、移植片の状態を記録する。診断内容を確定するために動物を屠殺する前に、異種移植拒絶反応の進行を数日間にわたって観察する。ソムレソルの致死量（６g/ ml）を投与してウサギを屠殺する。眼球を摘出して、半分の濃度に希釈したカルノフスキーの定着液で固定する。細胞の浸潤を決定するために、ヘマトキシリンとエオシンで切片を染色する。移植拒絶反応スコアを、マン−ウィットニーＵ試験法を用いて解析し、Statview SE+グラフィックソフトウェア(Abicus concepts 、バークレイ、カリフォルニア州)を用いて統計処理する。 BPIタンパク質産物単独およびコルチコステロイドとの併用投与により、同種移植反応または拒絶反応の兆候の出現の遅延化または予防、角膜血管新生および／または混濁化の発生の遅延化または予防において、臨床上の重要性が認められる。これら臨床上の重要性は、特徴的な上皮または内皮の拒絶反応線の形成、視力低下、眩しがり症、充血、結膜水腫、虹彩炎、眼内圧の変化(IOP) および眼痛などの角膜移植患者に認められる障害や症状の一つ以上の予防または緩和を通じても認めることができる。当業者からすれば、上記発明の無数の修正と変更を想到できるものと考えられる。よって、添付した請求の範囲に記載された制限のみが、本発明に対して課されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 27/02 Ａ６１Ｐ 27/02 37/06 37/06 43/00 43/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．角膜移植患者を処置するための方法であって、移植拒絶反応または角膜の新血管新生または角膜の不透明化の発生率を低減するために、殺菌／浸透性増強(B PI)タンパク質産物の有効量を患者の角膜に局所的に投与する工程を含む方法。２．前記BPIタンパク質産物が、BPIタンパク質のアミノ末端断片である請求の範囲第１項に記載の方法。３．前記BPIタンパク質産物が、rBPI₂₁である請求の範囲第１項に記載の方法。４．前記BPIタンパク質産物が、BPI-誘導ペプチドである請求の範囲第１項に記載の方法。５．前記BPIタンパク質産物が、rBPI₄₂である請求の範囲第１項に記載の方法。６．前記方法が、抗炎症剤または抗菌剤を投与する工程をさらに含む請求の範囲第１項に記載の方法。７．前記抗炎症剤が、コルチコステロイドである請求の範囲第６項に記載の方法。８．前記抗菌剤が、シプロフロキサシン、ゲンタマイシンおよびオフロキサシンからなるグループから選択された抗生物質である請求の範囲第６項に記載の方法。９．移植拒絶反応または角膜の新血管新生または角膜の不透明化の発生率を低減するための方法であって、移植に先駆けて、角膜移植組織に有効量のBPIタンパク質産物を適用することを含む方法。