JP2002513291A

JP2002513291A - 神経上皮幹細胞及び系譜限定中間前駆体の産生、特性決定及び単離

Info

Publication number: JP2002513291A
Application number: JP54858198A
Authority: JP
Inventors: ラオ，マヘンドラ，エス．; メイヤー−プロッシェル，マーゴット; ムジタバ，ターミナ
Original assignee: ユニバーシティーオブユタリサーチファンデーション
Priority date: 1997-05-07
Filing date: 1998-05-07
Publication date: 2002-05-08
Also published as: AU7481198A; CA2289021A1; AU751581C; US20060199264A1; US6361996B1; US20020045251A1; IL132584A0; US20020142460A1; EP0983344A4; CA2289021C; US7595194B2; US7037720B2; AU751581B2; US6830927B2; WO1998050526A1; EP0983344A1; US20100015702A1

Abstract

(57)【要約】多能性神経上皮幹細胞及び系譜限定希突起膠細胞星状膠細胞前駆細胞を記載する。上記神経上皮幹細胞は自己再生することができ、そしてニューロン、星状膠細胞及び希突起膠細胞に分化することができる。該希突起膠細胞星状膠細胞前駆細胞は神経上皮幹細胞から誘導され、自己再生することができ、そして希突起膠細胞及び星状膠細胞には分化できるがニューロンには分化できない。このような神経上皮幹細胞を産生させ、単離しそして培養する方法及び希突起膠細胞星状膠細胞前駆細胞も開示する。神経冠幹細胞を産生する方法は神経上皮幹細胞をインビトロで神経冠幹細胞に分化するように誘導することに係わっている。分化は上記細胞をラミニン上に再播種し、マイトジェンを除去するか又は増殖培地に背方化剤を加えることによって誘導することができる。末梢神経系の誘導体は神経冠幹細胞をインビトロで分化するように誘導することによって産生させることができる。

Description

【発明の詳細な説明】神経上皮幹細胞及び系譜限定中間前駆体の産生、特性決定及び単離発明の背景本発明は多能性神経上皮幹細胞、系譜限定中間前駆細胞及びこれらの製造方法に関する。更に詳細には、本発明は自己再生能力並びにニューロン、星状膠細胞及び希突起膠細胞への分化能力を保持する神経上皮幹細胞に関する。更に、本発明は自己再生することができ、そして星状膠細胞や希突起膠細胞には分化できるがニューロンには分化できない希突起膠細胞星状膠細胞限定前駆細胞に関する。このような神経上皮幹細胞や希突起膠細胞星状膠細胞前駆細胞を産生させ、単離しそして培養する方法も記載する。更に尚、本発明は神経冠幹細胞、及び神経上皮幹細胞から得られる末梢神経系の誘導体を産生させ、単離しそして培養する方法に関する。幹細胞の特徴を有する多能性細胞は中枢神経系の幾つかの領域及び幾つかの発生段階で同定されている。エフ.エイチ．ゲイジ（F.H．Gage）等、ＣＮＳ(中枢神経系,Central Nerve System)から得られる幹細胞の単離、特徴決定及び用途、18 Ann．Rev．NeuroscI．159〜192(1995年);エム．マービン（M．Marvin）及びアール．マッケイ（R．McKay）、脊椎動物のＣＮＳにおける多能性幹細胞、3Sem in．Cell．Biol．401〜411(1992年);アール．ピー．スコフ（R．P．Skoff）、神経グリア細胞の系譜、2 The Neuroscientist 335〜344(1996年)。しばしば神経上皮幹細胞（ＮＥＰ細胞）と呼称される上記細胞は、自己再生を行いそしてニューロン、希突起膠細胞及び星状膠細胞に分化する能力を有しているので、多能性幹細胞を表している。エイ.エイ．デービス（A.A．Davis）及びエス．テンプル（S．Temple）、胚ラット大脳皮質における自己再生多能性幹細胞、362 Nature 363〜372(1994年);エイ.ジー．グリッチ（A.G．Gritti）等、成体マウス脳から得られる多能性幹細胞は塩基性線維芽細胞増殖因子に応答して増殖しそして自己再生する、16 J．Neurosci．1091〜1100(1996年);ビー.エイ．レイノルズ（B.A ．Reynolds）等、多能性ＥＧＦ応答性の線条体胚前駆細胞はニューロン及び星状膠細胞を産生する、12 J．Neurosci．4565〜4574(1992年);ビー.エイ．レイノルズ及びエス．ワイス（S．Weis）、クローン及び集団分析によってＥＧＦ応答性の咄乳類胚のＣＮＳ前駆体は幹細胞であることが証明される、175 Deve lopmental Biol．1〜13(1996年);ビィ.ピー．ウイリアムズ（B.P．Willlams）等、共通前駆細胞からのニューロン及び希突起膠細胞の産生、7 Neuron 685〜693( 1991年)。神経系はまた限定された分化能を有する前駆細胞も含んでいる。ティ.ジェイ．キルパトリック（T.J．Kilpatrick）及びピー.エフ．バートレット（P.F．Bar tlett）、マウス大脳から得られるクローン化した多能性前駆体はＦＧＦ-２を必要とし、一方グリア限定前駆体はＦＧＦ-２か又はＥＧＦのどちらかで刺激される、15 J．Neurosci．3653〜3661(1995年)；ジェイ．プライス（J．Price）等、レトロウイルス媒介遺伝子伝達による脊椎動物神経系の系譜分析、84 Developme ntal Biol．156〜160(1987年);ビー.エイ．レイノルズ等、上述;ビー.エイ．レイノルズ及びエス．ワイス、上述；ビー．ウイリアムズ、大脳皮質の胚領域における前駆細胞タイプ、17 BioEssays、391〜393(1995年)；ビー．ピィ．ウイリアムズ等、上述。多能性幹細胞と系譜限定前駆細胞間の関係は依然として不明である。原則的に、系譜限定細胞は多能性細胞から誘導され得るだろうが、これは神経系においては依然として仮説的な可能性であり、直接的な実験的証拠はない。発生中に、尾部神経管を構成する神経上皮細胞はニューロンとグリアに分化する。ニューロンは神経上皮前駆体から先ず生じ、そして最終的には、栄養要求、形態学及び機能によって特定される固有の表現型を発生する。運動ニューロンは発生する最初のニューロンの１つである。ヴィ．ハンバーガー（V．Hamburger）、ニワトリ胚の脊髄における有糸分裂パターン及び組織形成過程に対するこれらパターンの関係、88 J．Comp．Neurol．221〜284(1984年)；エイチ.オー．ノーンズ（H.O．Nornes）及びジー.ディ．ダス(G．D．Das)、ラット脊髄における神経発生の一時的パターン。1.神経芽細胞の起源と移動の時期及び部位並びに定着パターン、73 Brain Res．121〜138(1974年);ジェイ．アルトマン（J．Altman）及びエス．バイヤー（S．Bayer）、ラット脊髄の発生、85 Adv．Anat．Embryol ．Cell Biol．32〜46(1984年)；ピー．イー．フェルプス（P.E．Phelps）等、ラット頚部脊髄におけるコリン作動性ニューロンの４つのグループの産生パターン:三重水素化チミジンオートラジオグラフィー及びコリンアセチルトランスフェラーゼ免疫細胞化学の組合せ研究、273 J．Comp．Neurol．459〜472(1988 年)；ピー.イー．フェルプス等、ラット頚部脊髄におけるコリン作動性ニューロンの４つのサブセットの胚発生、291 J．Com．Neurol．9〜26（1990年）。運動ニューロンは、それらの位置と多数の特異的抗原の発現によって脊髄に存在する他のニューロンと識別することができる。イー.ダブリュ．チェン（E.W．Chen）及びエイ.ワイ．チュウ（A.Y．Chiu）、脊髄運動ニューロンの発生における初期段階、320 J．Comp．Neurol．291〜303（1992年）。Tag-1、ジェイ．ドッド（J ．Dodd）等、胚脊髄ニューロンのサブセットに関する軸索糖タンパク質発現の空間的調節、1 Neuron 105〜116（1988年）、islet-1、ジェイ．エリクソン（J．E rickson）等、ホメオボックス遺伝子Islet-1の発現によって明示される運動ニューロン分化の初期段階、256 Science 1555〜1559（1992年）、並びにｐ75、ダブリュ．カミュ（W．Camu）及びシー.イー．ヘンダーソン（C.E．Henderson）、低親和性ＮＧＦレセプターに対するモノクローナル抗体での選別による胚ラット運動ニューロンの精製、44 J．Neurosci．59〜70（1992年）はラット及びニワトリの運動ニューロンの発生の初期においてこれらに特異的に発現されるが、他の脊髄細胞では検出できないので、運動ニューロンを他の神経管細胞と識別するために使用することができる。グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）免疫反応性を特徴とする星状膠細胞は直後に現れる;ＧＦＡＰ染色は胚16日目（Ｅ16）に見られる。エム．ヒラノ（M．Hirano）及びジェイ.イー．ゴールドマン（J.E．Goldm an）、ラット脊髄におけるグリア発生：放射状前駆体から得られる星状膠細胞及び希突起膠細胞の起源に関する証拠、21 J．Neurosci．Res．155〜167（1988年）。星状膠細胞は増殖して脊髄の灰白質に定住し、そしてタイプ１及びタイプ２の星状膠細胞は共に脊髄で同定されている。ビー.シー．ワーフ（B.C．Warf）等、ラット脊髄における希突起膠細胞前駆体の腹側起源に関する証拠、11 J．Neur osci．2477〜2488（1991年）。希突起膠細胞は遅れて現れ、そして出生頃に初めて検出されるが、希突起膠細胞前駆体は血小板由来増殖因子アルファーレセプター（ＰＤＧＦＲＡ）発現及び培養アッセイに基づいてＥ14ほどの早期に存在している可能性がある。エヌ.ピー．プリングル（N.P．Pringle）及びダブリュ.ディ．リチャードソン（W.D．Richardson）、神経管の背腹側軸におけるＰＤＧＦアルファーレセプター発現の単一性によって希突起膠細胞系譜の起源が特定されると思われる、117 Development 525〜533(1993年)；ビー.シー．ワーフ等、上述。本明細書で示されるように、ＮＥＰ細胞はフィブロネクチンで増殖するので、培養中の未分化表現型を増殖させそして維持するためには線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）とニワトリ胚抽出物（ＣＥＥ）中に存在する未だ特徴未決定の成分を必要とする。ＮＥＰ細胞の増殖要件はＥ14.5皮質心室領域細胞から単離される神経球と異なっている。ビー.エイ．レイノルズ等、上述;ビー．エイ．レイノルズ及びエス．ワイス、上述;ＷＯ 9615226;ＷＯ9615224;ＷＯ 9609543;ＷＯ 9513364; ＷＯ 9416718;ＷＯ 9410292;ＷＯ 94O9119。神経球は懸濁培養で増殖し、そしてＣＥＥ又はＦＧＦを必要としないが、生存については上皮増殖因子に依存している。ＦＧＦは神経球の増殖を一時的に支持することができるが、これら神経球が長期間増殖するためにはＦＧＦ自体では十分でない。現在記載されているＮＥＰ細胞は接着培養で増殖し、ＦＧＦ依存性であり、検出可能な値のＥＧＦレセプターを発現せず、そして胚発生段階で単離されるが、この段階より前に神経球を単離することができる。かくして、ＮＥＰ細胞は脳幹と脊髄及び末梢神経系に特徴的な多能性前駆体に相当するように思われ、一方神経球は皮質に一層特徴的な幹細胞に相当すると思われる。ディ.ジェイ．アンダーソン（D.J．Anderson）及びディ.エル．ステンプル（D .L．Stemple）に付与された米国特許第5,589,376号は哺乳類神経冠幹細胞並びにこれら細胞の単離及びクローン増殖方法を開示しているが、培養ＮＥＰ細胞、培養系譜限定前駆細胞並びにこれら細胞の産生、単離及び培養方法は開示していない。神経冠細胞は末梢神経系（ＰＮＳ）のニューロン及びグリアに分化し、一方本発明の神経上皮幹細胞は中枢神経系（ＣＮＳ）のニューロン及びグリア並びに神経冠幹細胞及びＰＮＳのニューロン、グリア及び他の誘導体に分化する。この特許はまた、神経上皮幹細胞からの神経冠幹細胞の発生も開示していない。本発明は、多能性神経上皮幹細胞がどのようにして種々の神経上皮誘導体に限定されるようになるのかを理解するために必要である。特に、哺乳類幹細胞の発生の詳細が確認できるように、哺乳類神経上皮幹細胞の増殖及び自己再生を可能にする培養条件が望ましい。これは、神経上皮誘導体の多数の腫瘍が哺乳類、特にヒトに存在しているので、望ましい。それ故、ヒトにおけるこれらの疾患を理解するためには哺乳類神経上皮幹細胞の発生について知ることが必要である。更に、インビトロで哺乳類神経上皮幹細胞を単離しそして増殖できることによって、このような幹細胞を使用して哺乳類、特にヒトにおける神経学的疾患を治療することができることになる。更に、このような哺乳類神経上皮幹細胞はある種の疾病、例えばパーキンソン病を、例えばこのような細胞を苦しんでいるヒトに移植して治療する目的で治療的に使用することができる。その上、このような細胞は、ある種の疾病を治療するのに有用な遺伝子や医薬品を発見するために更に一層使用することができる。例えば、新規な遺伝子はディファレンシャルディスプレイ又は差引きハイブリダイゼーション或いは他のスクリーニング戦略によって同定することができる。更に尚、本発明による純粋なＮＥＰ幹細胞集団を使用して、これらの特異的細胞に特異的な抗体を産生させそしてスクリーニングすることができる。系譜限定ニューロン前駆体の単離に関して、1997年7月4日に出願された米国特許出願第08/909,435号は系譜限定前駆細胞及びこれらの製造方法に関するものである。特に、これらの細胞は胚又はＮＥＰ幹細胞から単離されたニューロン限定前駆体（NRPs）である。これらのニューロン限定前駆体は自己再生することができ、そしてニューロンには分化できるが中枢神経系のグリア(即ち、星状膠細胞及びデンドロサイト)には分化できない。この出願は本明細書に参照して組み入れる。中枢神経系から得られる系譜限定グリア前駆体に関して、1997年11月29日に出願された米国特許出願第08/980,850号は希突起膠細胞及び２つのタイプの星状膠細胞に分化することができるグリア限定前駆細胞（GRPs）に関するものである。これらのGRPsも胚又はＮＥＰ幹細胞から単離することができる。この出願も本明細書に参照して組み入れる。上記から見て、哺乳類神経上皮幹細胞及び系譜限定グリア前駆細胞の単離された集団並びにこのような細胞を産生させ、単離しそして培養する方法は当該技術分野における顕著な進歩となることが認められよう。神経冠幹細胞及び末梢神経系の細胞を産生させ、単離しそして培養する方法も当該技術分野で顕著な進歩であることが認められよう。発明の概要本発明の１つの目的は、哺乳類神経上皮幹細胞の単離された(純粋な)集団及びそれらの子孫を支持細胞非依存性接着培養で提供することである。本発明の更なる目的は、哺乳類系譜限定グリア前駆細胞の集団及びこれらの子孫を支持細胞非依存性接着培養で提供することである。本発明のもう１つの目的は、哺乳類神経上皮幹細胞及び系譜限定グリア前駆細胞並びにこれらの子孫を産生させ、単離しそして培養する方法を提供することである。本発明の更にもう１つの目的は、神経上皮幹細胞及び系譜限定グリア前駆細胞を支持細胞非依存性接着培養で増殖させそして再生させる方法を提供することである。本発明の尚もう１つの目的は神経上皮幹細胞から系譜限定グリア前駆細胞を産生させる方法を提供することである。本発明の更にもう１つの目的は、神経上皮幹細胞及び系譜限定グリア前駆細胞がら誘導される細胞の分化した純粋な集団を提供することである。本発明の尚もう１つの目的は、神経上皮幹細胞及び系譜限定グリア前駆細胞から誘導される分化した純粋な集団から得られるｃＤＮＡ及びｃＤＮＡライブラリーを提供することである。本発明の更にもう１つの目的は、ＮＥＰ細胞及び系譜限定グリア前駆細胞に特異的な抗体を提供することである。本発明の更に１つの目的は、神経冠幹細胞及びＮＥＰ細胞から得られる末梢神経系の細胞を産生させ、単離しそして培養する方法を提供することである。これらの目的や他の目的は、哺乳類ＣＮＳ神経上皮幹細胞の単離された純粋な集団を提供することによって達成することができ、その際該細胞は支持細胞非依存性接着培養培地中で自己再生しそして増殖することができ、そしてＣＮＳニューロン細胞又はグリア細胞に分化することができる。好ましくは、このような神経上皮幹細胞はネスチンを発現するが、ポリシアル化神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、スルファチド（Ｏ４）、ニューロフィラメント（ＮＦ）、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）、中間径フィラメント（β-IIIチューブリン）、ガングリオシド（モノクローナル抗体Ａ2Ｂ5）又はガラクトセレブロシド（Gal-C）免疫反応性を発現しない。このようなＣＮＳニューロン細胞が中間径フィラメント（β-IIIチューブリン）及びニューロフィラメント68（ＮＦ68）、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、ガングリオシド（モノクローナル抗体Ａ2Ｂ5）、スルファチド（Ｏ４）又はガラクトセレブロシド（Gal-C）免疫反応性を発現しないことも好ましい。神経上皮幹細胞は好ましくは更にグリア限定前駆細胞に分化することができる。このようなグリア限定前駆細胞は好ましくは支持細胞非依存性接着培養培地中で自己再生しそして増殖することができ、そしてＣＮＳグリア細胞には分化できるがＣＮＳニューロン細胞には分化できない。これらのグリア限定前駆細胞は好ましくは、ネスチン及びガングリオシド（モノクローナル抗体Ａ2Ｂ5）免疫反応性を発現するが、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、スルファチド（Ｏ４）又はガラクトセレブロシド（Gal-C）免疫反応性を発現しない。本発明の別の実例的な実施態様は哺乳類ＣＮＳグリア限定前駆細胞の単離された純粋な集団を含んでおり、その際上記グリア限定前駆細胞は支持細胞非依存性接着培養培地中で自己再生しそして増殖することができ、そしてＣＮＳグリア細胞には分化できるがＣＮＳニューロン細胞には分化できない。本発明の更にもう１つの実例的な実施態様は哺乳類ＣＮＳ神経上皮幹細胞の純粋な集団を単離する方法を含んでおり、その際上記細胞は支持細胞非依存性接着培養培地中で自己再生することができそしてＣＮＳニューロン又はグリア細胞に分化することができ、そして該方法は：（ａ）神経管の閉鎖後であるが神経管内で細胞が分化する前の胚発生段階で哺乳類の胚から神経管を取り出し；（ｂ）上記の哺乳類の胚から取り出した神経管を含んでいる細胞を分離し; （ｃ）基層上の、そして有効量の線維芽細胞増殖因子及びニワトリ胚抽出物を含んでいる神経上皮幹細胞の接着増殖を支持するために形成された培地中の支持細胞非依存性培養物中に上記の分離細胞を播種し；そして（ｄ）神経上皮幹細胞の増殖を誘導する温度及び雰囲気中で上記の播種細胞をィンキュベートする、段階を含んでいる。本発明の尚もう１つの実例的な実施態様は哺乳類ＣＮＳグリア限定前駆細胞の純粋な集団を単離する方法を含んでおり、その際上記細胞は支持細胞非依存性接着培養培地中で自己再生することができ、そしてＣＮＳグリア細胞には分化できるがＣＮＳニューロン細胞には分化できず、そして該方法は：（ａ）哺乳類ＣＮＳ神経上皮幹細胞の集団を単離し；（ｂ）有効量のニワトリ胚抽出物は欠いているが神経上皮幹細胞の増殖を支持するために形成された培地中で上記神経上皮幹細胞が分化を開始するのに十分な期間該細胞をインキュベートし；（ｃ）上記のインキュベートした細胞をグリア限定前駆細胞に特徴的な抗体を使用する特異的な抗体捕獲に付して捕獲細胞亜集団を生じさせ;そして（ｄ）細胞の増殖を支持するために形成され有効量の線維芽細胞増殖因子及び血小板由来増殖因子を含んでいる培地中で上記の捕獲された細胞亜集団をインキュベートする、段階を含んでいる。本発明の尚もう１つの実例的な実施態様は哺乳類運動ニューロンの集団を産生させる方法を含んでおり、該方法は：（ａ）哺乳類ＣＮＳ神経上皮幹細胞の集団を単離し；（ｂ）細胞の増殖及びニューロンの分化を促進する培地中で上記神経上皮幹細胞が分化を開始するのに十分な期間該細胞をインキュベートし；（ｃ）上記の分化中の細胞から運動ニューロンを単離する、段階を含んでいる。好ましい培地はラミニン被覆プレート及び有効量のニワトリ胚抽出物を欠いているＮＥＰ培地を使用することを含んでいる。哺乳類神経冠幹細胞を産生させる方法は、インビトロで神経上皮幹細胞を分化するように誘導し、そしてそれによって上記神経冠幹細胞を産生させることを含んでいる。ＮＥＰ細胞の分化誘導は、ラミニン被覆基質上に神経上皮幹細胞を再播種し、ＦＧＦ若しくはニワトリ胚抽出物のようなマイトジェンを除去するか又は背方化剤をこれら細胞に添加することによって実施することができる。好ましい背方化剤は骨形態形成タンパク質、例えばＢＭＰ-２、ＢＭＰ-４及びＢＭＰ- ７である。末梢神経系の細胞を産生させる方法は：（ａ）神経上皮幹細胞をインビトロで分化するように誘導し、そしてそれによって神経冠幹細胞を産生させ；（ｂ）上記神経冠幹細胞をインビトロで分化するように誘導し、そしてそれによって末梢神経系細胞を産生させる、段階を含んでいる。神経冠幹細胞は当該技術分野で周知の方法、例えば米国特許第5,589,376号（これは本明細書に参照して組み入れる）に記載されている方法に従って分化するように誘導することができる。図面の簡単な説明図１はＮＥＰ細胞とそれらの子孫の免疫反応性の概要を示す。図２は多能性ＮＥＰ幹細胞、ＮＥＰ細胞から生じるグリア限定Ａ2Ｂ5⁺細胞（希突起膠細胞星状膠細胞（Ｏ-Ａ）前駆体）並びにＯ-Ａ前駆体から生じる希突起膠細胞及び星状膠細胞の免疫反応性の概要を示す。図３は、ＢＭＰの存在下又は不存在下で分裂するＮＥＰ細胞のパーセントを表すグラフを示す。図４は、神経冠幹細胞及び末梢神経系の誘導体細胞を含めてＮＥＰ細胞とそれらの子孫の免疫反応性の概要を示す。詳細な説明本発明の神経上皮幹細胞、グリア限定前駆細胞及びこれらの製造方法並びに神経冠幹細胞及びＰＮＳ誘導体細胞の製造方法を開示しそして記載する前に、本明細書に開示された特別の形態、方法段階及び材料は幾分変更することができるので、本発明はこのような形態、方法段階及び材料に限定されるものではないことを理解すべきである。本発明の範囲は下記請求の範囲及びそれらの均等物だけによって限定されるので、本明細書で使用した用語は特別の実施態様を記載する目的のためだけに使用されておりそして本発明の限定を意図するものではないことも理解すべきである。本明細書及び下記請求の範囲で使用するとき、文脈で明確に異なって指示されない限り、単数形の「ａ」、「an」及び「the」には複数の対象が含まれることが認められなければならない。それ故、例えば、「１個の胚」の言及には２個又はそれより多くの胚への言及が含まれ、そして「１個のマイトジェン」の言及には２個又はそれより多くのマイトジェンの混合物への言及が含まれ、そして「１個の因子」の言及には２個又はそれより多くの因子の混合物への言及が含まれる。本発明の説明及び請求の範囲では、次の用語は以下に記載した定義に従って使用されよう。本明細書で使用するとき、「自己再生」とは神経上皮幹細胞が分裂して２個の娘細胞を産生でき、そしてこれらのうち少なくとも１個は多能性神経上皮幹細胞であることを言う。本明細書で使用するとき、「クローン密度」及びこれに類似する用語は、選択した培養皿に播種したとき、単一の非侵入細胞の単離を生じさせるのに十分なほど十分に低い密度を意味する。このようなクローン密度の実例的な例は約225個の細胞／100mmの培養皿である。本明細書で使用するとき、「支持細胞非依存性接着培養」又はこれに類似する用語は、一般的には最初に培養皿に播種され、続いてこれに問題の組織から得られる細胞が添加される異なる細胞層の不存在下でのインビトロ細胞増殖を意味する。支持細胞培養においては、支持細胞は問題の組織から得られる細胞が付着するための基層を提供し、そして加えて、マイトジェンや生存因子の供給源として役立つ。本明細書の支持細胞非依存性接着培養は化学的に特定される基層、例えばフィブロネクチンを使用し、そしてマイトジェン又は生存因子は精製された因子か又は他の細胞若しくは組織から得られる粗製抽出物を液体培養培地に補充して提供される。それ故、支持細胞非依存性培養では、培養皿の細胞は主として問題の組織から誘導される細胞であり、そして問題の組織から誘導される細胞の増殖を支持するのに必要な他の細胞型を含有していない。本明細書で使用するとき、「有効量」とは非毒性であるが所望の効果及び成果を提供するのに十分な増殖因子若しくは生存因子又は他の因子の量を意味する。例えば、本明細書で使用されるＥＧＦの有効量とは、他の必須栄養素、因子等と組み合わせて使用したときＮＥＰ細胞の自己再生及び増殖を支持するように選択される量を意味する。本発明はラットから単離される神経上皮幹細胞を使用して説明される。本発明は全ての哺乳類神経上皮幹細胞を包含し、そしてラットから得られる神経上皮幹細胞に限定されない。哺乳類神経上皮幹細胞はヒト及び非ヒト霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギ等から単離することができる。本発明はＮＥＰ細胞と称され、尾部神経上皮から誘導される胚脊髄幹細胞に関するものであり、そしてこの細胞は増殖しそして自己再生するために線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）及びニワトリ胚抽出物（ＣＥＥ）を必要とする。ＮＥＰ細胞は:（１）ネスチンの発現、（２）系譜マーカーの不存在、（３）培養中に未分化状態で維持できること、（４）自己再生できること、及び（５）クローン培養で増殖できること、を特徴としている。適当な環境条件下で、ＮＥＰ細胞はＣＮＳの３つの主要なタイプの細胞、ニューロン、星状膠細胞及び希突起膠細胞に分化する。図１は脊髄分化のモデルを提示している。このモデルは造血や神経冠の分化に関して提案されたモデルに類似している（D.J．Andersonによる総説、神経冠系譜の問題：神経発生とは？、3 Neuron 1〜12(1989年)参照）。このモデルによれば、ＮＥＰ細胞10はネスチンを発現する（ネスチン⁺）が他の系譜マーカーは発現しない（lin^-）尾部神経管内の均質細胞集団を意味する。これらの細胞は培養中に分裂しそして自己再生し、そして分化した表現型を産生する。以前のデータで一層限定された能力を有する中間分裂前駆体が示唆されている。アール .エイチ．ミラー（R.H．Miller）及びヴィ．スジゲティ（V．Szigeti）、下記; ビー.シー．ワーフ等、上述;エヌ.ピー．プリングル及びダブリュ.ディ．リチャードソン、上述;ジェイ．レイ（J．Ray）及びエフ．ゲイジ、脊髄神経芽細胞は塩基性線維芽細胞増殖因子に応答して増殖する、14 J．Neurosci．3548〜 3564(1994年)。このような前駆体には希突起膠細胞18とタイプ２の星状膠細胞22 を産生する前駆体14、即ち両能性の星状膠細胞及びニューロン前駆体（図１には示されていない）、並びに数種のニューロンを産生するニューロン前駆体（図１には示されていない）が含まれる。それ故、このモデルは多能性前駆体（ＮＥＰ細胞）が分化した細胞（即ち、希突起膠細胞18、タイプ２の星状膠細胞22、タイプ１の星状膠細胞24、ニューロン26及び運動ニューロン30）を中間前駆体から産生することを示唆している。本発明で提示した、限定された増殖能を有する細胞の存在を示しているこれらの結果はこのモデルと一致している。図１は共通ＮＥＰ前駆体から生じる運動ニューロンを示している。本明細書に記載した実験は低親和性のニュートロフィンレセプター（ｐ75）免疫反応性で、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）陽性の細胞が脊髄の他の細胞と一緒に混合培養で生じることを示している。ｐ75／ChAT免疫反応性細胞だけからなるクローンは同定されなかったので、クローンが分析された齢では運動ニューロンに拘束された前駆体が存在していなかったことが示された。運動ニューロンが共通ＮＥＰ前駆体から生じるという観察はニワトリ神経管実験で得られた結果と一致する。例えば、エム．ブロナー-フレイザー（M．Bronner-Fraser）及びエス. イー．フレイザー（S.E．Fraser）、Cell Lineage Analysis Slows Multipotent iality of Some Avian Neural Crest Cells，355 Nature 161〜164(1988年)。それ故、これらの結果は、以前の観察と一緒になって、運動ニューロンの分化には進行的拘束段階を受けている多能性前駆体が関与していることを示唆している。ＮＥＰ細胞は髄脳や終脳から得られる神経上皮培養物と或る点で類似しており、そしてやはりこのような培養物とは明らかに異なっている。エム．マーフィー（M．Murphy）等、線維芽細胞増殖因子はインビトロで神経前駆細胞の増殖及び分化を刺激する、25 J．Neurosci．Res．463〜475(1990年);ジェイ．ドラゴ（J ．Drago）等、中枢神経系前駆体の線維芽細胞増殖因子介在性増殖はインスリン様増殖因子１の内在産生に依存する、88 Proc．Nat'l Acad．Sci．USA 2199〜22 03 (1991年);ティ.ジェイ．キルパトリック及びビー.エフ．バートレット、多能性神経前駆体のクローニング及び増殖:増殖及び分化の要件、10 Neuron 255〜265( 1993年)。これらの細胞と同様に、ＮＥＰ細胞もＦＧＦ依存性であり、接着細胞として増殖し、そしてＣＥＥ及び／又は血清中に存在する特徴未決定の成分を必要とする。しかしながら、マーフィー等、ドラゴ等並びにキルパトリック及びバートレットによって単離された細胞は、神経球を形成しない点でＮＥＰ細胞とは異なっている。かくして、脳幹及び脊髄前駆細胞は皮質前駆体とは異なっているように思われる。脳幹神経上皮細胞は両能性であって、希突起膠細胞に分化することは示されていない。更に、脊髄ＮＥＰ細胞は血清の存在下で星状膠細胞に急速に分化する。対照的に、脳幹ＮＥＰ細胞は血清の存在下で未分化状態のまま留まっている。ＮＥＰ細胞は、形態学と抗原性プロフィールにおいて神経冠細胞と異なっている。神経冠細胞はより一層線維芽細胞的であり、移動しがちでありそして細胞接触を回避する。エス．ボイッソウ（S．Boisseau）等、神経冠細胞からの神経節発生を研究するための哺乳類インビトロモデル、85 J．Physiol.，Paris 117〜1 22(1991年);ピー.ジー．バナーマン（P.G．Bannerman）及びディ．プレジュア(D ．Pleasure)、ラット神経冠細胞のタンパク質増殖因子要求、36 J．Neurosci．R es．46〜57（1993年）。ＮＥＰ細胞は一層平板化し且つ上皮様に見え、そして密に充填された単層として増殖する傾向がある。ラット神経冠細胞とは異なって、ＮＥＰ細胞は低親和性ニュートロフィンレセプターに対する免疫反応性を発現しない（ｐ75;実施例４）。その上、ＮＥＰ細胞の子孫は、ＮＥＰ細胞はＣＮＳとＰＮＳの両方の細胞に分化でき、一方神経冠はＰＮＳ細胞だけに分化するので、神経冠細胞誘導体と異なっている。例えば、ＮＥＰ培養物から得られるＧＦＡＰ免疫反応性細胞は検出可能なネスチン及びｐ75免疫反応性を発現しない（実施例６）。対照的に、ＰＮＳのグリア細胞でありそして神経冠から分化するシュワン細胞は培養物中で高い値のｐ75とＧＡＦＰの両方を発現する。ディ.エル．ステンプル及びディ.ジェイ．アンダースン、哺乳類神経冠からニューロン及びグリア用の幹細胞の単離、71 Cell 973〜978(1992年)。シュワン細胞もＯ4及びＰ0のようなミエリンマーカーを発現する、ディ.エル．ステンプル及びディ．ジェイ．アンダースン、上述；エム.エス．ラオ（M.S．Rao）及びディ.ジェイ．アンダースン、神経冠幹細胞の固定化、ＡＳＣＢ 2098(1994年)、これはＮＥＰ培養物から誘導されるＣＮＳのＧＦＡＰ免疫反応性細胞では発現されない（例えば、実施例４）。ＮＥＰ培養物はＡ2Ｂ5免疫反応性細胞を有しており、そしてこれはその後Ｏ4、GalC及びＯ1免疫反応性を発現する。抗原発現のこのパターンを有する細胞は神経冠の誘導体とは見なされない。更に、神経冠誘導副交感神経ニューロンはインビボでＣｈＡＴ免疫反応性を発現するが、このようなニューロンは神経冠培養物からは記載されたことがない。ディ.ジェイ．アンダースン、上述。しかしながら、ＮＥＰ細胞は直ちに分化してｐ75とChATを同時に発現する多数のニューロンを産生する。かくして、ＮＥＰ細胞と神経冠幹細胞は形態学的に且つ抗原的に異なっており、表現型として異なる分化した子孫を産生するので、異なる幹細胞に該当する。それ故、発生中の脊髄から得られ本明細書で特徴付けられるＮＥＰ幹細胞は他の神経系幹細胞と共通する幾つかの特性を有しているが、それらとは明らかに異なっている。ＮＥＰ細胞は、自己再生を行いそして培養中に全ての主要なＣＮＳ表現型並びに神経冠幹細胞及びそれらの誘導体に分化する。ＮＥＰ細胞は以前に同定された全ての幹細胞と培養条件や増殖能において異なっている。ＮＥＰ細胞培養物は分化した細胞タイプを取得するために選別できる一時的な細胞の大きな供給源を提供する。本明細書に記載した実験に使用される基本培地（ＮＥＰ培地）は100μg/mlのトランスフェリン（Calbiochem、カリフォルニア州サンジエゴ）、５μg/mlのインスリン（Sigma Chemical Co.、ミズーリ州セントルイス）、16μg/mlのプトレシン（Sigma）、20nMのプロゲステロン（Sigma）、30nMの亜セレン酸（Sigma）、１mg/mlのウシ血清アルブミン（GIBCO/BRL、メリーランド州ガイサースバーグ）に、Ｂ27添加物（GIBCO/BRL）、25ng/mlの線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、及び10％ニワトリ胚抽出物（ＣＥＥ）を加えたものを補充したＤＭＥＭ-Ｆ12（GIB CO/BRL）を含んでいる。一般的に、これらの添加物は100倍濃縮物として−20℃ で使用時まで貯蔵した。通常、200mlのＮＥＰ培地は、ＣＥＥを除く全ての添加物を用いて調製して、調製後２週間以内に使用した。ＣＥＥは培養細胞に供給する時点でＮＥＰ培地に加えた。ＦＧＦ及びＣＥＥはディ.エル．ステンプル及びディ.ジェイ．アンダースン、上述；エム.エス．ラオ及びディ.ジェイ．アンダースン、上述;エル．ソマーズ（L．Sommers）等、哺乳類の神経発生におけるｂＨＬＨ転写因子ＭＡＳＨ１の細胞的機能、15 Neuron 1245〜1258（1995年）(これは本明細書に参照して組み入れる)に記載されているようにして調製した。ＦＧＦは市販でも入手可能である（UBI）。簡単に述べると、ＣＥＥは以下のようにして調製した。鶏卵を加湿雰囲気中38 ℃で11日間インキュベートした。卵を洗浄して胚を取り出し、そして４℃の無菌最少必須培地（グルタミン及びアールの塩を有するＭＥＭ）（GIBCO/BRL）を含有するペトリ皿に播いた。約10個の胚をそれぞれ30mlのシリンジを通過させて50 mlの試験管中に解離させた。この方法によって典型的には約25mlの培地が製造された。各25mlに25mlのＭＥＭを加えた。試験管は４℃で１時間振とうした。無菌ヒアルロニダーゼ（１mg/胚25g）（Sigma）を加え、そしてこの混合物を30,000g で６時間遠心した。上清液を集め、0.45μmフィルター、次いで0.22μmフィルターを通過させ、そして使用するときまで−80℃で貯蔵した。フィブロネクチン（New York Blood Center、ニューヨーク州ニューヨーク、又はSigma）はＤ-ＰＢＳ（GIBCO/BRL）中で250μg/mlの濃度に希釈した。フィブロネクチン溶液を組織培養皿に適用しそして直ちに除去した。コラーゲン（Biom edical Technologles，Inc.、マサチューセッツ州スタウトン）及びポリ-Ｌ-リシン（Sigma）はそれぞれ20μg/mlの濃度で皿に適用した。ラミニン（GIBCO/BRL 又はSigma）は50〜250μg/mlの濃度で使用して皿を一夜被覆した。或る場合には、皿はｐＤＬ（30〜7OkDa）（Biomedical Technologles，Inc.）で予め被覆した。ｐＤＬを蒸留水に溶解して組織培養プレートに１時間適用し、そしてその後過剰のｐＤＬを除去してプレートを風乾した。プレートを水ですすぎ、そしてその後再度乾燥した。次いで、ｐＤＬ被覆プレートを上記したようにしてラミニンで被覆した。ＮＥＰ細胞を分離させて被覆した皿に播き、そして数種の異なる条件下でこれらの発生をモニターした。フィブロネクチンは、ＮＥＰ細胞がコラーゲン又はポリ-Ｌ-リシンには接着せずそしてラミニンには僅かに接着したので、増殖基質として選択した。それ故、培養中にＮＥＰ細胞を維持するその後の実験は全てフィブロネクチン被覆皿で実施した。しかしながら、ＮＥＰ幹細胞の分化を促進するためにラミニン被覆皿を時々使用した。実施例１神経管は、ラットにおいて、胚の10日齢で、閉鎖を受け（Hamburger、前出）、そして最も早い分化が１日後に生じる（Hamburger、前出；Nornes & Das、前出；Altman & Bayer、前出）。それゆえ、胚日齢10.5（E10.5）は、多数の未分化のＮＥＰ細胞が容易に単離され得る最も早い時点を示す。Sprague Dawleyラット胚を、E10.5（13〜22体節）で回収し、そしてCa/Mg非含有Hanks平衡化塩溶液（ＨＢＳＳ、GIBCO/BRL）を含有するペトリディッシュに置いた。胚（少なくとも10体節）の幹セグメントをタングステン針を使用して切開し、リンスし、次いで、新鮮なＨＢＳＳに移した。幹セグメントを、10〜12分間、１%トリプシン溶液（GIBCO/BRL）中で、４℃にてインキュベートした。トリプシン溶液を、10%胎児ウシ血清（ＦＢＳ、GTBCO/BRL）を含有する新鮮なＨＢＳＳで置換えた。セグメントを、パスツールピペットで穏やかに、磨砕し、周囲の体節および結合組織から遊離する神経管を放出した。単離された神経管を、0.05%トリプシン/EDTA溶液（GIBCO/BRL）に、さらに10分間、移した。細胞を、磨砕によって解離し、そしてフィブロネクチンでコートされた35mmディッシュにおいて、ＮＥＰ培地中に高濃度でプレートした。細胞を、５% CO₂/95%空気において、37℃で維持した。プレートした１〜３日後に、細胞を、低濃度、すなわち、35mmプレートあたり50 00個以下の細胞で再プレートした。次いで、いくつかのディッシュからの細胞を、トリプシン処理（0.05%トリプシン/EDTA溶液、２分間）によって採集した。次いで、細胞をペレット化し、小容量中に再懸濁し、そして計数した。約5000個の細胞を35mmディッシュ（CorningまたはNunc）に置いた。クローン分析について、トリプシン処理によって採集した細胞を、35mmディッシュあたり50〜100個の細胞の密度でプレートした。個々の細胞を、グリースペンシルで位置を作製することによって、同定および位置づけした。細胞を、上記のように付加物を含有するＤＭＥＭ/F12中で、10〜15日間に及ぶ期間、増殖した。実施例２細胞を、低密度でプレートし、そして酸性ＦＧＦ（ａＦＧＦ；25ng/ml）、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ；25ng/ml）、もしく表皮増殖因子（ＥＧＦ;50ng/ml）を含有するか、または添加される因子を含有しないかのいずれかのＮＥＦ培地中で、48時間、インキュベートした以外は、実施例１に記載される手順に従ってE10. 5ラット神経管を切開した。培養した細胞を、当該分野において周知の方法に従って、固定し、そして位相差顕微鏡によって実験した。ａＦＧＦまたはｂＦＧＦ中で増殖された細胞は、生存し、そして密度を増加した。対照的に、ＦＧＦを含有しないか、または50ng/ml ＥＧＦを含有して増殖された培養物において、生存する細胞は見られなかった。従って、ＮＥＰ細胞は、生存のためにＦＧＦを必要とし、およびＥＧＦは、接着培養においてＮＦＰ細胞の増殖を支持しない。実施例３この実施例において、E10.5ラット神経管細胞を、実施例１の手順に従って解離し、そして等しい数の細胞を、35mmディッシュにおいて低密度でプレートし、そして10%ＣＥＥを含有するか、またはＣＥＥを含有しない、ｂＦＧＦ（25ng/ml ）を含むＮＥＰ培地中で、５日間、インキュベートした。次いで、培養した細胞を、当該分野において周知の方法に従って、固定し、そして位相差顕微鏡によって実験した。ＣＥＥの不在下で、細胞増殖は遅延され、およびいくつかの細胞は球状でありおよび明相であるようであった。10% ＣＥＥの存在下で増殖された細胞は、より均一であるようであり、そして増殖してコンフルエントな単層を形成した。従って、ＣＥＥは、未分化の状態にＮＥＰを維持するために必要であった。しかし、ＣＥＥは、それ自身、生存因子でなく、およびＮＥＰ細胞は、外因的に添加されるＦＧＦの不在下でＣＥＥを補充した培地において、生存しなかった。従って、ＣＥＥは、ＦＧＦと協力して、培養において未分化の状態にＮＥＰを維持するＥＧＦとは異なる成分を含む。実施例４この実施例において、２日目に、同じ細胞に対して5-ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ、１μM濃度、Sigma）を添加した以外は、実施例３の手順に従って、５日間、フィブロネクチンでコートされたプレートにおいて、ＦＧＦおよびＣＥＥ中で培養したＮＥＰ細胞を、多様な抗原マーカーを使用して、細胞分裂および分化について、免疫細胞化学によって試験した。ネスチン（nestin）は、未分化の幹細胞についてのマーカーである。U．Lendahlら、ＣＮＳ幹細胞は新規なクラスの中間フィラメントタンパク質を発現する、60 Cell 585-95（1990）。ＢｒｄＵ取込みは、分裂する細胞の数を決定するためのマーカーである。使用された抗血清およびそれらの濃度を、表１にまとめる。全ての二次抗体は、Jackson Immu nologicals（Westgrove、PA）から得、そして製造業者の指示に従って使用した。染色手順を、D.L．Stemple & D.J．Anderson、前出に記載されるように行った。細胞表面抗原についての染色を、生存細胞の培養物において行った。神経線維タンパク質の、ＧＦＡＰおよびβ-IIIチューブリンについて、細胞を酸−エタノールで固定した。他の細胞内抗原について、培養物を、４%ホルムアルデヒド中で、15分間固定した。ＢｒｄＵ免疫細胞化学について、細胞をさらに、S.P．Men berg & A.K．Ha1L分裂するニューロン前駆体は、ニューロン特異的チューブリンを発現する、27 Neuroblol．26-43（1995）（本明細書中に参考として援用される）の手順によって浸透化した。細胞培養物を、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、１mg/mlウシ血清アルブミン（BSA）、0.5%トリトンX-100、１%ヤギ血清）中で、１時間、選択した一次抗体とともにインキュベートし、ＰＢＳでリンスし、そしてブロッキング緩衝液中で、さらに１時間、種特異的二次抗体（Jackson Immuno logicals、Westgrove、PA）とともにインキユベートした。培養物を、ＰＢＳの３回の交換を伴ってリンスした。二重標識化実験および三重標識化実験を、一次抗体の適切な組合せにおいて細胞を同時にインキュベートし、次いで、非交差反応性の二次抗体でインキュベートすることによって、行った。培養の５日後、全ての細胞は、ネスチンを発現し続けたが、試験した任意の他のマーカーを発現しなかった。さらに、３日間にわたって、大部分の細胞は分裂し、そしてＢｒｄＵを取込んだ。これらの結果は、細胞が分裂し、そして未分化幹細胞であったことを示す。５日目毎に１：３希釈で、接着培養として継代培養したＮＥＰ細胞は、少なくとも３継代培養にわたって、分化した細胞に特徴的なマーカーを全く発現しないネプシン免疫反応性の細胞として維持され得た。その後の３ヶ月にわたる継代培養は、ネプシン免疫反応性の、系統ネガティブな細胞を維持したが、さらに、小さなパーセントのＧＦＡＰ-免疫反応性の細胞（１〜５%）が検出され得た。従って、ネプシン免疫反応性を発現し、およびニューロンおよびグリア亜系統についての全ての系統特異的マーカーを欠損する、単離されたＮＥＰ細胞は、継代培養され得、およびそれらの数は、非分化条件下で増殖された場合、増幅され得た。実施例５ＣＮＳは、３つの主要な表現型の、ニューロン、グリア、および星状膠細胞からなり、これらの全ては、特徴的な抗原マーカーを発現する。未分化の、培養されたＮＥＰ細胞がＣＮＳニューロンおよびグリアに分化し得たか否かを決定するために、実施例１の手順に従って、５日間、ＮＥＰ培地中のフィブロネクチン上で増殖したＮＥＰ細胞を、トリプシン処理によって採集し、そしてラミニンでコートされたプレートにおいて、ＣＥＥの添加を伴わない神経上皮培養培地中に再プレートした。ＣＥＥの省略を、分化を促進するために採用した。ラミニンは、増殖およびニューロンの分化を促進することが示されているので、ラミニンを、フィブロネクチンの代わりの基質として使用した。J．DRAgoら、前出。ラミニンでコートされたプレートにおいて、ＣＥＥ非含有のＮＥＰ培地中で５日後、実施例４の手順に従って、細胞を固定し、そしてβ-IIIチューブリン、神経線維160 （ＮＦ１６０）、低親和性のニューロトロフィンレセプター（ｐ75）、およびコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）に対する免疫反応性を決定するためにプロセスした。これらの条件下で、形態学および系統特異的抗原マーカーの発現の変化によって特徴付けられるように、ＮＥＰ細胞は迅速に分化した。小さな突起を伴う小さな明相細胞が、ＣＥＥの不在下のラミニンでコートされたプレート上に再プレートした48時間程後に、見られ得た。この形態学を伴う細胞は、β-IIIチューブリン免疫反応性を発現し、そしてβ-III免疫反応性の細胞のサブセットはまた、神経線維１６０（ＮＦ１６０）免疫反応性を発現した。β -IIIチューブリン免疫反応性の、ＮＦ１６０ネガティブ細胞がまた、観察され、そしてこれらの細胞は、未成熟なニューロンを示すようである。S.P.Menberg & A.K．Hall、前出。β-IIIチューブリン免疫反応性の細胞の数は、５日間にわたる培養において増殖し、５日目に、これらは細胞の総数の20%±４%を示した。小さな明相の、β-IIIチューブリン免疫反応性細胞に加えて、より大きな神経細胞体およびより精巧な突起を伴う細胞がまた見られた。これらの細胞は、ｐ75 、ＮＦ６０、およびＣｈＡＴ免疫反応性であり、および単一の細胞として、および塊としての両方で観察された。神経管の発生において、ｐ75およびＣｈＡＴ免疫反応性は、運動ニューロンの特徴である。W.Camu & C.E．Henderson、低親和性のＮＧＦレセプターに対するモノクローナル抗体におけるパンニングによる胚ラット運動ニューロンの精製、44 J．Neurosci．Meth．59-70（1992）。ｐ7 5、ＣｈＡＴ免疫反応性の細胞（本明細書中以後、「運動ニューロン」）は、細胞の総数の小さな割合（４%±２%）を示した。実施例６この実施例において、実施例１の手順に従って、５日間、ＮＥＰ培地中のフィブロネクチン上で増殖したＮＥＰ細胞を、トリプシン処理によって採集し、そしてフィブロネクチンでコートされたプレートにおいて、ＣＥＥを含有しないが、 10% ＦＢＳの添加を伴うＮＥＰ培地中で、５日間、再プレートした。ＣＥＥの省略を、分化を促進するために採用した。次いで、実施例４に記載の手順に従って、細胞を固定し、そしてＧＦＡＰ、ｐ75、ネプシン、β-IIIチューブリン、およびＡ２Ｂ５免疫反応性についてプロセスした。これらの条件下で、ＮＥＰ細胞は迅速に分化され、そして最も大きな割合の分化された細胞は、グリア原線維酸タンパク質（ＧＦＡＰ）免疫反応性を発現した。培養の５日後、GEAF免疫反応性の細胞は、存在する細胞の総数の73%±６%を構成した。２つの特徴的な形態学が同定され得、小さな突起を伴うまたは突起のない平らなパンケーキ状の細胞、および長い、精巧な突起を伴うより小さな、より多くの線維芽細胞が、同定され得た。これらの２つの形態学が異なる細胞のいずれも、Ａ２Ｂ５、ｐ75、およびβ-I IIチューブリン反応性のいずれも発現せず、このことは、これらの細胞が１型星状膠細胞である可能性が最も高いことを示す。Ａ２Ｂ５およびＧＦＡＰの同時発現によって規定されるような（M．Raff、ラット視覚神経におけるグリア細胞分化、243 Science 1450-55（1989）；L.E．LillIen & M.C．Raff、インビトロで２型星状膠細胞発生を制御する細胞一細胞相互作用の分析、4 Neuron 525-34（1 990））、２型星状膠細胞は、同定されなかったが、このような２型星状膠細胞は、他の培養条件（例えば、実施例８および12）におけるＮＥＰ細胞から生成された。実施例７この実施例において、実施例１の手順に従って、５日問、ＮＥＰ培地中のフィブロネクチンに上で増殖したＮＥＰ細胞を、トリプシン処理によって採集し、そしてラミニンでコートされたプレートにおいて、ＣＥＥの添加を伴わない神経上皮培養（ＮＥＰ）培地中で、５〜10日間、再プレートした。次いで、実施例４の手順に従って、ＮＥＰ細胞を、希突起膠細胞およびそれらの前駆体において発現するとして以前に同定されたマーカー：Ａ２Ｂ５、ＧａｌＣ、O1、およびO4で標識した。ＮＥＰ細胞を再プレートした３日後、細胞のサブセットは、Ａ２Ｂ５免疫反応性を発現し始めた。Ａ２Ｂ５免疫反応性の細胞は、初めは、検出可能なレベルのＧａｌＣ、O4、およびO1免疫反応性を発現しなかった。しかし、さらなる３日間の培養後、ＧａｌＣ免疫反応性の細胞が見られ得、この細胞はまた、Ａ２Ｂ５免疫反応性を発現した。このような細胞は、平らであるようであったが、希突起膠細胞−２型−星状膠細胞（O-2A）前駆体または成熟な希突起膠細胞の特徴的な形態学を有しなかった。しかしより長期間の培養は、小さな体および伸長した突起を伴うより成熟したみかけの希突起膠細胞が発生することを許容した。これらの細胞は、01およびＧａｌＣ免疫反応性、分化された希突起膠細胞の特徴的なマーカー、を発現した。従って、ＮＥＰ細胞は、10日間の培養にわたって成熟する希突起膠細胞を作製し得る。抗原発現のパターンはさらに、より加齢した胚からの脊髄培養物から記載されているように、続いて希突起膠細胞を生成する分裂する希突起膠細胞前駆体の存在を示唆する。B.C.Warfら、前出；R.H．Miller & V．Szigeti、新生児脊髄培養物における星状膠細胞多様性のクローン分析、11 5 Development 133-42（1991）。それゆえ、実施例５〜７において示されるように、培養において増殖したＮＥＰ細胞は、ＣＥＥの不在下でラミニンにおいて再プレートされた場合、ニューロン、グリア、および希突起膠細胞を生成した。この培養条件は、任意の特定の表現型について最適以下であるが、分化された子孫を生成するのに十分であり、およびその後の実験において分化を評価するために使用された。実施例８培養において増殖したＮＥＰ細胞は、細胞の均質な集団であり得る（ここでは、各細胞が全ての表現型に分化し得る）か、または多様な分化可能性を伴う細胞の不均質な集団であり得るかのいずれかであり得た。これらの可能性を区別するために、培養したＮＥＰ細胞を、クローン密度で増殖し、個々の細胞を回転(cir cled)し、そしてそれらの発生を、15日間、追跡した。クローンを、GEAP、β-II Iチューブリン、およびＡ２Ｂ５を星状膠細胞、ニューロン、および希突起膠細胞前駆体についてのマーカーとして使用する三重標識によって、分化について分析した。神経上皮細胞のクローン培養の調製のために、実施例１の手順に従って調製したＮＥＰ細胞を、トリプシン処理し、そしてフィブロネクチンでコートした35mm ディッシュにおいて、約50細胞／ディッシュの希釈でプレートした。しかし、いくつかの実験において、細胞を、約10細胞／ディッシュでプレートした。細胞を、４時間の期間、静置させ、次いで、単細胞を回転(circled)し、そしてそれらの発生を培養において追跡した。大部分の実験において、クローン培養、12日後に終結した。希突起膠細胞発生を実証するための実験において、クローンを、18 〜21日間、観察した。個々のクローンの再プレートについて、ガラスクローニング環（Fisher Scien tific、Pittsburg、PA）を各クローンの周囲に置き、そして細胞を、100μlのトリプシン/EDTA溶液で、１〜２分間、トルプシン処理することによって単離した。細胞を、新鮮な培地中に再懸濁し、そして細胞のアリコート（50〜100細胞）を、フィブロネクチンでコートした培養ディッシュ上に再プレートした。単一の細胞を同定し、そしてグリースペンシルで回転(circled)(circled)し、そして上記のようにそれらの発生を追跡した。一次クローン培養プレート、および再プレート化クローン培養プレートは、通常、細胞表面抗原で三重標識し、そして適切な二次抗体を、実施例４に記載される手順に従って生存細胞培養物において使用した。次いで、クローンを、４%パラホルムアルデヒド中で、10分間、固定し、そして他の抗原について、連続して、プロセスした。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化二次抗体に対する、ジアミノベンジン（ＤＡＢ、Sigma）反応を、いくつかの抗原との減少された染色が、クローンがＤＡＢ組識化学について先ずプロセスされる場合に観察されたので、全ての他の染色の後に行った。少なくともいくつかのクローンは、全ての３つのマーカーによって染色され、従って、細胞の全ての３つの表現型を含んだ。従って、少なくともいくつかのＮＥＰ細胞は、ニューロン、星状膠細胞、および希突起膠細胞を生成し得る。Ａ２Ｂ５免疫反応性の細胞が、希突起膠細胞を示すことを確認するために、いくつかのクローンを、01またはＧａｌＣで再染色した。表２においてまとめられる結果は、３回の独立したクローンアッセイからの256個のコロニーを示す。分析した全てのクローンは、１つ以上の表現型を含んだ。ニューロンおよび希突起膠細胞クローン、ならびにニューロンおよび星状膠細胞クローンが、同定された。ＮＥＰ細胞の有意な割合が、細胞の全ての３つの表現型を含むコロニーを生成した。全ての場合において、クローンを注意深く研究した場合、試験したマーカーを全く発現しない細胞を同定することが可能であり、このことは、前駆体細胞がなお存在したことを示唆する。さらに、１つのみの細胞型を含むクローンは同定され得ず、このことは、この段階で、拘束された細胞は培養物において存在しなかったことを示唆する。実施例９多能性幹細胞が、自己再生を経験したか否かを決定するために、実施例１の手順に従って調製したＮＥＰ細胞を、低密度でプレートし、そして実施例８に記載の手順に従って、単一の細胞を、10日間、観察した。この段階でのクローンは、約100から数千細胞に大きさを変化した。最も大きなクローンを同定し、トリプシン処理によって採集し、そして細胞のサブセットを、フィブロネクチンでコートされたプレートにおいて、ＮＥＰ培地中に再プレートした。各親クローンからの個々の細胞を、回転(circled)し、そして培養において観察した。再プレートの15日後、クローンを、O1、β-IIIチューブリン、およびＧＦＡＦ発現について三重標識した。全ての３つのマーカーを発現した娘クローンの数を、表３において示し、表３は、３つの独立したＮＥＰ細胞調製物からのプールされた結果を含む。追跡した15クローンのうちの、それぞれは、１〜15個の娘クローンを含み（再プレートされた細胞の３〜50%）、これはニューロン、星状膠細胞、および希突起膠細胞に分化した。従って、観察されたクローンの全てが、多能性の娘細胞を生成した。それゆえ、個々のＮＥＰ細胞は、自己再生し得る。実施例10 自己再生を経験し、および複数の表現型に分化するそれらの能力を保持する幹細胞は、以前に記載されている。B.A．Reynoldsら、多能性のＥＧＦ応答性の線状体胚前駆体細胞は、ニューロン、星状膠細胞を生成する、12 J.Neurosci．456 5-4574（1992）；B.A．Reynoldsら、ＥＧＦ反応性の哺乳動物胚ＣＮＳ前駆体が、幹細胞であることを実証するクローンおよび集団分析、175 Develop．Biol．1 -13（1996）；A.L．Vescoviら、ｂＧＦＧは、単能性（ニューロン）および両能性（ニューロン／星状グリア）のＥＦＧ−-生成されたCNF前駆体細胞の増殖運命を調節する、11 Neuron 951-66（1993）；T.J．Kilpatrick & B.F．Bartlett、前出；T.J．Kilpatrick & B.F．Bartlett、マウス大脳からクローン化された多能性の前駆体はＦＧＦ-2を必要とするのに対して、グリア拘束化前駆体は、ＦＧＦ-2またはＥＧＦのいずれかによって刺激される、15 J.Neurosci．3653-61（19 95）；A.A．Davis & S．Temple、胚ラット大脳皮質における自己再生する多能性幹細胞、372 Nature 263-66（1994）；S．Temple & A.Davis、単離されたラット皮質前駆体細胞は、膜関連性の因子によってインビトロで分裂が維持される、12 0 Development 999-1008（1994）。１つのこのような幹細胞は、皮質室帯域から単離された神経球であり、これは、ＥＧＦの存在下での規定された培地における複数の継代培養にわたって、未分化の状態に維持され得る。B.A．Reynoldsら（1 992）、前出；B.A．Reynoldsら（1996）、前出；A.L．Vescoviら、前出。ＮＥＰ細胞が、神経球として増殖され得るか否かを決定するために、実施例１の手順に従う接着培養において増殖された細胞を、トリプシン処理し、ペレット化し、そして100〜300細胞の密度での懸濁培養として、細菌プレートにおいて（すなわち、コロニー濃度で非接着培養において）増殖した。培地は、ＮＥＰ培地を使用した。大部分の細胞は、再プレートを生存しなかったが、平均、2.5±1.0細胞（1.2%）が神経球を形成した。細胞が、ＥＧＦ（50ng/m l）がＦＧＦ（20ng/ml）を代用したＮＥＰ培地において増殖された場合、神経球は得られなかった。ＦＧＦを含有する培地において生成された神経球を、フィブロネクチンでコートされたディッシュ上で非分化培地中に、またはラミニンでコートされたプレート上で分化培地（ＣＥＥを含有しないＮＥＰ培地）中に、のいずれかに再プレートした。フィブロネクチン上で増殖した球を、ＢｒｄＵおよびネスチンで標識し、これは、大多数の細胞が、未分化のネスチン免疫反応性の、分裂細胞から構成されることを示した。このような未分化の細胞は、神経管切開から生成されたＮＥＰ細胞に形態学が類似するようであり、ならびに継代培養され得、およびさらなる神経球を生成するために使用され得た。ラミニンにおいて増殖される球を、 O1、β-IIIチューブリン、およびＧＦＡＰ発現について、三重標識し、これは、神経球が、ニューロン、星状膠細胞、および希突起膠細胞に分化し得ることを示した。従って、ＮＥＰ細胞およびＦＧＦ依存性の神経球は、接着または非接着培養条件下で増殖される同一の細胞を示すが、より加齢した胚から作製されるＥＧＦ依存性の神経球とは異なる。実施例11 運動ニューロンは、尾側の神経上皮から分化する最も初期の細胞型である。例えば、Hamburger、前出。ＮＣＡＭ（神経細胞接着分子）およびｐ75免疫反応性のニューロンは、神経管が単離されおよびＮＥＰ細胞が培養におかれる時間の12 時間以内にインビボおよびインビトロで見られる。E.W．Chen & A.Y．Chiu、前出；W．Camu & C.E．Henderson、前出。それゆえ、拘束された運動ニューロン前駆体は、ＮＥＰ細胞が培養に置かれる時点で、すでに存在していた可能性がある。このような前駆体が存在するか否かを決定するために、ＮＥＰクローン培養を、運動ニューロンおよび他の系統特異的マーカーで分析した。E10.5ＮＥＰ細胞を、実施例８の手順に従って、単離し、そしてフィブロネクチンでコートされたディッシュにおいて培養し、トリプシン処理によって採集し、そしてフィブロネクチンでコートされた35mmディッシュ上で、ＣＥＥを含有するＮＥＰ培地中に、クローン密度で、再プレートした。単一の単離された細胞を回転(circled)( circled)し、そして10〜21日の期間、観察した。次いで、クローンを、実施例４の手順に従って、（ａ）ＣｈＡＴと、β-IIIチューブリン、ＧＦＡＰ、もしくはＡ２Ｂ５のいずれかとについて二重標識するか、または（ｂ）ＣｈＡＴ、β-III チューブリン、およびＡ２Ｂ５発現について、三重標識するかのいずれかを行った。次いで、クローンを、それらが発現したマーカーについてスコアした。これらの結果を表４においてまとめる。表４は、87クローンからのデータを示し、および二重標識した場合に両方のマーカーを発現するクローンの数を示す。ＣｈＡＴ免疫反応性の細胞のみを含むクローンは観察されず、従って運動ニューロン単独を含有するクローンは、観察されなかった。運動ニューロンを含有するクローンはまた、星状膠細胞、他のニューロン、および／または希突起膠細胞を含んだ。それゆえ、これらの結果は、運動ニューロンおよび他の脊髄細胞を生成し得る共通の前駆体が存在するという証拠である。ＮＥＰ幹細胞に由来するグリア拘束化前駆体多能性のＮＥＰ幹細胞は、その後のグリア分化に拘束される自己再生前駆体細胞を生成するように誘導され得る。自己再生する前駆体集団は、モノクローナル抗体Ａ２Ｂ５を使用する免疫パンニングによって単離され得、および血小板由来の増殖因子（ＰＤＧＦ）およびｂＦＧＦにおいて増殖される場合、複数の分裂にわたって、未分化の状態に維持され得る。Ａ２Ｂ５⁺細胞は、抗原表現型および分化可能性において、親ＮＥＰ細胞とは異なる。Ａ２Ｂ５⁺細胞は、ＮＥＰ細胞におけるニューロン分化を促進する条件下で、ニューロンに分化する能力を欠損する。しかし、Ａ２Ｂ５⁺細胞は、グリア細胞および星状膠細胞に分化する能力を保持し、従って、多能性のグリア拘束化前駆体として同定される。図２は、ＮＥＰ細胞分化のモデルを示し、ここでは多能性のＮＥＰ細胞50は、希突起膠細胞−星状体（O-A）前駆体54（これは、自己再生し得、およびまた希突起膠細胞58、１型星状膠細胞62、および２型星状膠細胞66にさらに分化する能力を保持する）に分化し得る能力を有する。図２はまた、ＮＥＰ細胞が、ニューロン70に分化し得るが、O-A前駆体細胞は分化し得ないことを説明しする。証拠のいくつかの列は、Ａ２Ｂ５免疫反応性のグリア拘束化前駆体が、多能性のＮＥＰ細胞から生じることを示す。第１に、ＮＥＰ細胞は、均質な、ネプシンポジティブな、Ａ２Ｂ５ネガティブな、細胞の集団である（実施例４）。第２に、ＮＥＰ細胞のクローン化分析は、グリア細胞のみを生じるクローンがないことを示す（実施例８）。第３に、Ａ２Ｂ５⁺細胞は、常に、Ａ２Ｂ５^-ニューロンおよび星状膠細胞を含むクローンにおいて生じる（実施例８）。従って、ＮＥＰ細胞が、拘束されるＡ２Ｂ５^-、Ｏ２Ａ前駆体を含むという証拠はない。むしろ、分化のプロセスは、ＮＥＰ細胞がより拘束された細胞型に移行する場合に生じる。ＮＥＰ細胞に由来するＡ２Ｂ５⁺集団は、均質であるようであり、および均一に、ニューロンを生成する能力を欠損する。これらのＡ２Ｂ５⁺細胞は、ＣＮＳにおいて同定された他のグリア拘束化前駆体と、いくつかの類似性を共有するが、またこれとは異なる。F．Aloisiら、ヒト胚脊髄のグリア細胞の発生的な出現、抗原プロフィール、および増殖：解離された培養細胞を使用する免疫細胞化学的研究、5 Glia 181-81（1992）；H.M．Blau & S.M．Hughes、脊椎動物発生における細胞系統、2 Curr．Biol．981-85（1990）；R.S．Cameron & P．Rakic、大脳皮質におけるグリア細胞系統：概説および合成、4 Glia 124-37（1991）；C.L ．Chanら、新生児および成体ラット視覚神経からの、希突起膠細胞−２型星状膠細胞（O-2A）前駆体細胞は、血小板由来の増殖因子に対するそれらの応答において異なる、55 Brain Res．Dev．Brain Res．275-82（1990）；P．Cochard & M.C ．Gis、[希突起膠細胞系統]、189 C R Seances Soc．Biol．Fil．263-69（1995 ）；A.A．Davis & S．Temple、前出；G.A．Elderら、ヒツジ中枢神経系の培養物におけるグリア亜集団の特徴づけ、1 Glia 317-27（1988）；J．Fock-Seang & R .H．Miller、ラット脊髄を発生するにおけるＡ２Ｂ５^-グリア前駆体の分布および分化、37 J．Neurosci．Res．219-35（1994）；B.P．Fultonら、キスカル酸刺激されたコバルト取込みによる成体ラット視覚神経における、Ｏ２Ａ前駆体細胞の可視化、12 J．Nuroscl．4816-33（1992）；D.S．Galileoら、トリ視盤における共有の前駆体から生じるニューロンおよびグリア：２つのレトロウイルスおよび細胞型特異的抗体での実証、87 Proc．Nat'l Acad．Sci．USA 458-62（1990）；A.L．Gardら、シグナル伝達因子LIFRβを使用する、表面表現型（O4＋ＧａｌＣ-）およびサイトカインに対する応答によって、Ｏ２Ａグリア前駆体から区別される希突起膠細胞、167 Dev．Biol．596-608（1995）；R．Hardy & R．Reynol d、インビトロおよびインビボの両方におけるラット前脳希突起膠前駆体の可能性の増殖および分化可能性、111 Develoment 1061-80（1991）；R.J．Hardy & V .L．Friedrich、Jr.、希突起膠細胞前駆体は、胚マウス脳全体に生成されたが、拘束された増殖巣は異なる、122 Develoment 2059-69（1996）；P.E．Knapp、拘束される希突起膠細胞についての初期マーカーを使用する、グリア系統の研究およびインビトロ増殖、30 J．Nurosci．Res．336-45（1991）；M.B．Luskinら、ラット大脳皮質のニューロン、星状膠細胞、および希突起膠細胞は、別々の前駆体細胞に由来する：クローンが関連する細胞の超微細構造的な分析、13 J．Nuro sci．1730-50（1993）；R.H．Miller、希突起膠細胞起源、19 TINS 92-96（1996 ）；K．Onoら、胚ニワトリ脊髄における希突起膠細胞前駆体の初期の発生および分散、121 Development 1743-54（1995）；M.C．Raffら、培養培地に依存して、インビトロで希突起膠細胞に発生するグリア前駆体、303 Nature 390-96（1983 ）；M.J．Rivkinら、ヒト胎児大脳における希突起膠細胞の発生、38 Ann．Neuro l．92-101（1995）；P.M．Wood & A.K．Williams、共通の前駆体細胞からのニューロンおよび希突起膠細胞の生成、7 Neuron 685-93（1984）。ＮＥＰ由来のＡ２Ｂ５⁺細胞は、視覚神経由来のＯ２Ａ前駆体細胞と、いくつかの特徴を共有し、形態学、遊走性の性質、ＰＤＧＦおよびｂＦＧＦに対する応答、ならびに希突起膠細胞および２型星状膠細胞を生成する能力を含む。しかし、生後のＯ２Ａ前駆体細胞と対照的に、ＮＥＰ由来のＡ２Ｂ５⁺細胞はまた、１型星状膠細胞を生じ得る。従って、ＮＥＰから精製されたＡ２Ｂ５⁺細胞は、このように広範囲に研究されてきたＡ２Ｂ５⁺Ｏ２Ａ前駆体細胞よりも、グリア前駆体細胞発生の初期の段階を示すようである。それゆえ、本発明は、多能性の前駆体細胞集団と、系統拘束された前駆体細胞集団との間の系統の関係についての直接的な証拠を提供し、およびこの２つの集団間を区別するための形態学依存性の、抗原依存性の、サイトカイン依存性のデータを同定する。さらに、単離された前駆体細胞の発生を追跡するための、ならびに分化プロセスを調節する細胞性および分子性の事象を研究するための、利用可能な培養系を確立する。実施例12 ニューロン、希突起膠細胞、および星状膠細胞は、多様な系統特異的なマーカーを使用して同定され得る。G.S．Eisenbarthら、ニューロンの血漿膜抗原に対するモノクローナル抗体、76 Proc．Nat'l、Acad．USA 4913-17（1979）；E.E． Geisert & A．Frankfurter、ラットにおけるクラスβチューブリンの免疫染色によって可視化されるような、創傷に対するニューロン応答、102 Neurosci．Lett ．137-41（1989）；I．Sommer & M．Schachner、希突起膠細胞細胞表面に対するモノクローナル抗体（01〜O4）：中枢神経系における免疫細胞学的な研究、83 D ev．Biol．311-27（1981）；P.A．Trimmerら、組織培養物中の同定されたＣＮＳニューロンおよびグリアにおけるメッセンジャーRNAを検出するためのIn Situハイブリダイゼーションと免疫細胞化学との組合せ、39 J．Histochem．Cytochem ．891-98（1991）。表５は、本実施例において使用された系統特異的なマーカーを示す。分化された細胞を規定することに加えて、いくつかの前駆体細胞はまた、特異的な抗体によって認識され得る。２つのこのようなマーカー、ネスチンおよびＡ２Ｂ５を、本実施例で使用した。ネスチンは、ＣＮＳにおいて多様な未分化の細胞によって発現される。例えば、U．Landahlら、前出。Ａ２Ｂ５抗体は、Ｏ２Ａ前駆体細胞を標識する。この実施例において、実施例１の手順に従って、E10.5ラット神経管細胞から調製したＮＥＰ細胞を、ＣＥＥおよびｂＦＧＦの存在下で３日間増殖し、次いで、さらなる５日間、ＣＥＥを欠損するＮＥＰ培地中で、5000細胞／カバーガラスで再プレートした。細胞を、実施例４の手順に従って、24時間、ＢｒｄＵとともにインキュベートし、そして抗ＢｒｄＵで染色した。平衡培養物を、７日後に、表５において記載される抗体の選択された組合せとともに二重染色した。ＣＥＥの不在下で３日間培養したＮＥＰ細胞細胞の70%が、Ａ２Ｂ５免疫反応性を示した。これらのＡ２Ｂ５⁺細胞は、平らな形態学を有し、およびｂＦＧＦの存在下で分裂し得た。ＣＥＥの不在下での４日間の培養後、Ａ２Ｂ５⁺ＮＥＰ由来の細胞の81%±７%が、抗ＢｒｄＵ免疫反応性によって決定されるように、細胞分裂に従事した。抗体α-ネスチン、α-ＧａｌＣ、α-ＧＦＡＰ、α-β-IIIチューブリン、およびα-ｐ75(星状膠細胞のサブセットを認識する低親和性ＮＧＦレセプターに対する抗体）でのＮＥＰ由来のＡ２Ｂ５⁺細胞の二重標識は、系統マーカーのいずれも、Ａ２Ｂ５⁺細胞において同時発現されなかったことを示した。しかし、Ａ２Ｂ５⁺細胞の実質的なサブセットは、α-ネスチンを発現した。α- ネスチンおよびＡ２Ｂ５のこの同時発現は、Ｏ２Ａ前駆体細胞において以前に記載された。従って、ＮＥＰ由来のＡ２Ｂ５ポジティブ細胞は、Ｏ２Ａ前駆体細胞に抗原的に類似する。さらなる２日間の培養後、Ａ２Ｂ５⁺細胞は、グリア特異的マーカーを発現し始めた。細胞の亜集団は、その時間までに明らかにＧａｌＣ⁺であった。細胞が、希突起膠細胞に連続的に分化することを確認するために、培養物を、O4および α−ＧａｌＣで染色した。予測されるように、O4⁺細胞の30%が、α−ＧａｌＣを同時発現し、未成熟の希突起膠細胞を類似する。Ａ２Ｂ５およびαＧＦＡＰでの二重標識化は、Ａ２Ｂ５⁺細胞の10%がまた、ＧＦＡＰ⁺であり、２型星状膠細胞の抗原特徴を類似したことを示した。Ａ２Ｂ５⁺細胞のサブセットにおいて、後期の時点で同時発現された全てのマーカーは、Ｏ２Ａ系統に属する細胞の特徴である。これらの結果は、少なくともＡ２Ｂ５⁺細胞のサブセットが、グリア前駆体細胞を示し、およびＡ２Ｂ５は、より詳細に細胞のこの亜集団を規定するための有用なマーカーであったことを示唆した。実施例13 Ａ２Ｂ５⁺細胞が、多能性の細胞から生じるのか、またはＡ２Ｂ５⁺細胞が、Ａ２Ｂ５ＮＥＰ細胞の既に拘束された亜集団から生じるのかを決定するために、ＮＥＰ細胞を、実施例８の手順に従ってクローン密度でプレートし、そして培養におけるそれらの発生を、10日問、追跡した。次いで、細胞を、Ａ２Ｂ５/α-β-I IIチューブリンまたはＡ２Ｂ５/α-ＧＦＡＰの抗体の組合せで二重染色した。13 2個のクローンの分析の結果を、表６においてまとめる。 132個のクローンのほとんど全てが、Ａ２Ｂ５⁺、ＧＦＡＰ⁺、およびβ-IIIチューブリンｆ⁺物からなった。クローンの91%の細胞が、Ａ２Ｂ５⁺またはＧＦＡＰ⁺のいずれかである細胞を含んだが、93%のクローンは、Ａ２Ｂ５⁺またはβ-II Iチューブリン⁺であった。分析したクローンのいずれも、Ａ２Ｂ５⁺であった細胞のみからならなかった。この初期の段階で、クローンのいずれもＧａｌＣ⁺細胞を含まなかったが、希突起膠細胞は、クローン培養物において、およびより後の段階で（ＣＥＥを欠損する培地におけるプレート化の12〜15日後）、大量培養において同定され得たことは、注目に値する。これらのクローン分析は、Ａ２Ｂ５⁺集団が、共有の多能性のＡ２Ｂ５前駆体細胞から生じたことを示唆する。実施例14 ＮＥＰ由来のＡ２Ｂ５⁺細胞が、グリア細胞のみを生じ得るか否かを直接的に決定するために、Ａ２Ｂ５⁺集団を、特異的な抗体捕獲アッセイ（免疫パンニング）によって精製した。L.J．Wysocko & V.L．Sato、リンパ球についてのパンニング：細胞選択のための方法、75 Proc．Nat'l Acad．Sci．2844-48（1978）；M ．Mayerら、毛様体の神経栄養性因子および白血球阻害因子は、希突起膠細胞の生成、成熟、および生存を促進する、120 Development 142-53（1994）（本明細書中に参考として援用される）。簡潔には、実施例１に従って調製した細胞を、トリプシン処理し、そして懸濁物を、Ａ２Ｂ５抗体でコートされたディッシュに置き、全てのＡ２Ｂ５⁺細胞をプレートに結合させた。上清を除去し、そしてプレートを、J.E．Bottenstein & G.H．Sato、血清非含有の補充された培地におけるラット神経芽腫細胞株の増殖、76 Proc．Nat'l Acad．Sci．USA 514-17（1979 ）（本明細書中に参考として援用される）によって記載される付加物を補充したＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ-BS）で洗浄した。結合する細胞を擦り取り、そしてフィブロネクチン／ラミニンでコートされたガラスカバーガラスにおいて、300μl ＤＭＥＭ-BS±増殖因子中に、5000細胞/ウェルで、プレートした。最終の培養において、混入するＡ２Ｂ５細胞は、全細胞の10%未満を示した。プレートをコート化するためにＡ２Ｂ５抗体を、５μg/mlタンパク質の濃度で使用した。細胞を、 20〜30分間、37℃のインキュベーターにおいて、プレートに結合させた。増殖因子を、10ng/mlの濃度で１日おき毎に添加した。組換えヒトＰＤＧＦ-AAを、Ch iron Corporationから得た。組換えラット毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）を、 Precision Research Biochemicalsから得た。組換えｂＦＧＦを、PeroTechInc. から購入し、およびレチノール酸（ＲＡ）を、Sigmaから購入した。ＣＥＥの不在下におけるＮＥＰ細胞の培養の５日後、細胞を免疫精製し、フィブロネクチン／ラミニンでコートされたディッシュにプレートし、そして希突起膠細胞、星状膠細胞、またはニューロンへの前駆体の分化と以前に関連されたサイトカインに曝露した。Ａ２Ｂ５パンニングした集団は、パンニングの１時間後に染色した場合、Ａ２Ｂ５⁺細胞について98%を超えてポジティブであった。パンニングの24時間後の染色は、パンニングした集団の全ての細胞がＡ２Ｂ５⁺であり、および試験した他の系統マーカーを全く発現しなかった。ｂＦＧＦの存在下で他の増殖因子を含まずに、５日間、パンニングした培養物は、１%の希突起膠細胞、50%のＧＦＡＰ⁺星状膠細胞、および49%のＡ２Ｂ５⁺細胞からなった。分化された細胞の集団は、ｂＦＧＦを含有する培地が、ＰＤＧＦのみで補充された培地と、３日後に置きかえられた場合、有意にシフトされた。これらの条件下、培養物は、30%の希突起膠細胞、50%の星状膠細胞、および20% のＡ２Ｂ５⁺細胞からなった。ｂＦＧＦ単独の存在下での増殖は、親集団において、ニューロンへのＮＥＰ細胞の分化を許容するのに十分であったが、ｂＦＧＦの存在下で培養された、Ａ２Ｂ５⁺パニング化集団において、ニューロンは検出されなかった。ニューロン分化の可能性を増強するために、親ＮＥＰ細胞集団において、ニューロン分化を有意に増加したレチノール酸で培地をさらに補充した。このニューロン促進環境においてさえ、免疫精製されたＡ２Ｂ５⁺細胞はβ-IIIチューブリン⁺細胞を含まなかった。どの時点においてもパンニングされた大量培養物において、有意な細胞死が観察されなかったので、ニューロン集団は、選択的な細胞死を介して喪失されないようであり、このことは、ニューロンは、迅速に出現せず、および死亡しなかったことを示す。さらに、β-IIIチューブリン⁺ゴーストの証拠は検出されなかった。これらの結果は、ニューロンの生成を担う前駆体細胞は、免疫精製されたＡ２Ｂ５⁺集団の部分ではなかったことを示唆する。Ａ２Ｂ５パンニング化細胞は、星状膠細胞および希突起膠細胞を生じたが、ニューロンを生じなかったので、Ａ２Ｂ５⁺集団は、グリア系統に拘束された前駆体細胞を含んだようであった。実施例15 大量培養実験は、実施例14に従って調製されたＡ２Ｂ５パンニング化細胞が、グリア系統に拘束される異なる可能性を有する細胞を含んだことを示唆した。しかし、この実験は、星状膠細胞および希突起膠細胞が、Ａ２Ｂ５⁺集団に存在する、拘束された単能性の細胞から生成されたのか、または単一の細胞が、両能性であり、ならびに星状膠細胞および希突起膠細胞の両方を生成し得たのかを示さない。この問題に取り組むために、クローン実験を行い、ここでは、Ａ２Ｂ５パンニング化集団を、パンニングの１日後にＡ２Ｂ５で染色し、そして細胞を、96 ウェルプレートに、限界希釈でプレートした。ウェルを免疫蛍光でスコアし、そして１つのＡ２Ｂ５⁺染色された細胞を有するウェルを記録し、そしてＰＤＧＦ/ ｂＦＧＦ中で、７日間、培養した。この手順は、クローンの増殖を許容し、およびまた単一の細胞が、分化条件下に直接的に置かれる場合に生じる細胞死の量を最小化する。７日後、増殖されたクローンは、50〜200個の細胞を含み、および均一にＡ２Ｂ５⁺であった。大多数のクローン（51個）を、先ず、ｂＦＧＦ非含有のＤＭＥＭ-BSで洗浄し、次いで、ＰＤＧＦを補充した培地（大量培養実験において示されるように、希突起膠細胞生成を誘導するために有効な培養条件）に切り替えた。全てのクローンは、希突起膠細胞、ＧＦＡＰ⁺星状膠細胞、およびＡ２Ｂ５⁺細胞を含んだが、いずれのクローンもβ-IIIチューブリン⁺細胞を含まず、このことは、単一のＡ２Ｂ５⁺細胞が、少なくとも両能性であり、およびまたグリア細胞系統に拘束されたことを示唆する（表７）。ｂＦＧＦおよびＣＮＴＦで補充した培養培地におけるＡ２Ｂ５⁺細胞の分化可能性をまた試験した。パンニングした大量培養実験から、ｂＦＧＦ単独は、ＧＦＡＰ⁺星状膠細胞の数の増加、および希突起膠細胞の数の減少を導くことが明らかであるようであった。培養条件に依存して、ＣＮＴＦは、希突起膠細胞生成を促進すること（M．Mayer、前出）、またはＧＦＡＰ⁺でありおよび一過的にＡ２Ｂ５を発現する２型星状膠細胞の生成を導くことが示されている。L.E．Lillien & M.C．Raff、ＣＮＳにおける分化シグナル：モデル系としてのインビトロでの２型星状膠細胞発生、5 Neuron 5896-6273（1990）。ＰＤＧＦ／ｂＦＧＦ中で拡張し、次いで、ｂＦＧＦ／ＣＮＴＦに切り替えた、６つのクローンを分析した。驚くべきことに、全ての６つのクローンは、Ａ２Ｂ５⁺/ＧＦＡＰ⁺である細胞を含み、２型星状膠細胞表現型を類似する。唯一のクローンは、CalC⁺希突起膠細胞を含み、いずれのクローンも、β-IIIチューブリン⁺細胞を含まなかった。この結果は、ＣＮＴＦおよびｂＦＧＦの存在下で、Ａ２Ｂ５⁺細胞が、２型星状膠細胞表現型を有する細胞に優先的に分化することを示唆する。５つのＡ２Ｂ５⁺クローンを、異なるニューロン促進条件において分析し、そして以前のように、ニューロンを生成し得なかった。５つの、ＰＤＧＦ/ｂＦＧＦで拡張されたクローンをトリプシン処理し、２つの部分に分け、そしてｂＦＧＦ単独、またはレチノール酸を補充したｂＦＧＦのいずれかに再プレートした。クローンを、抗体Ａ２Ｂ５、α-ＧＦＡＰ、α-ＧａｌＣ、およびα-β-III1チューブリンで染色した（表８）。クローンのいずれも、細胞がｂＦＧＦ単独またはｂＦＧＦ/ＲＡにおいて増殖されたにもかかわらず、β-IIIチューブリン免疫活性を含まなかった。対照的に、全ての５つのクローンは、Ａ２Ｂ５⁺またはＧＦＡＰ⁺のいずれかであるが、両方ではない細胞の混合物からなった。ｂＦＧＦ単独において増殖された唯一の細胞が、ＧａｌＣ免疫反応性の希突起膠細胞を含んだのに対し、ｂＦＧＦ/ＲＡにおいて、ＧａｌＣ⁺希突起膠細胞は見出されなかった。これらのデータは、誘導されたＮＥＰ細胞培養物から単離されたＡ２Ｂ５⁺細胞が、多能性であり、およびそれらの分化可能性において、グリア系統の細胞に拘束された、最初の観察を支持する。実施例16 真の中間前駆体の基準を満たすために、細胞は、１より多くの特異的な細胞型に分化する能力を喪失することなく、拡張される自己再生能を有することを必要とする。個々のＡ２Ｂ５⁺細胞の自己再生能力を試験するために、ＰＤＧＦ/ｂＦＧＦ中で７日間、拡張した２つのクローンを、長期の培養および継代培養について選択した。２つのクローンを、１日おき毎に、ＰＤＧＦ/ｂＦＧＦで再栄養補給し、そして４回の連続継代培養を伴って、合計３ヶ月間、維持した。サイトカインのこの組合せが明らかに分化を阻害し、そして分裂を促進するので、クローンをＰＤＧＦ/ｂＦＧＦ中で、増殖させた。細胞を、各継代培養の前および後に染色し、ならびに全ての時点で、Ａ２Ｂ５⁺以外は、試験した全ての分化マーカーについてネガティブであった。長期間のクローンの分化可能性を決定するために、各継代培養の間に、単一のクローンを再プレートし、50〜200個の細胞に再拡張し、そしてＰＤＧＦ単独に切り替えて、分化を促進した。これらの二次培養において、希突起膠細胞および星状膠細胞は、８〜10日後に、一貫して出現した。希突起膠細胞および星状膠細胞に分化する能力は、継代培養の増加とともに有意に変化せず、このことはこれらの長期間増殖された細胞がなお多能性であったことを示唆する。これらの結果は、多能性のＮＥＰから分化するＡ２Ｂ５⁺細胞が、前駆体細胞として拡張および増殖され得ることを示す。継代培養された個々のＡ２Ｂ５⁺細胞は、自己再生し、および希突起膠細胞、Ａ２Ｂ５⁺およびＡ２Ｂ５⁺星状膠細胞を生成し得たが、ニューロンは生成し得なかった。従って、ＮＥＰ由来のＡ２Ｂ５⁺細胞は、グリア系統に制限される、多能性の中間前駆体細胞に該当する。ＮＥＰ幹細胞に由来する神経冠幹細胞神経冠幹細胞（ＮＣＳＣ）は、神経管閉鎖時にまたはその付近で生じる細胞の一過的な集団であり、広範囲の移動を経験し、および莫大な数の表現型を生成する。N.M．Le Douarin、神経冠（Cambridge Univ．Press、1992）；M．Bronner-F raster、神経冠の起源および発生潜在性、218 Exp．Cell Res．405-417（1995）；M．Bronner-Fraster、トリ神経冠の起源、13 Stem Cells（Dayt）、640-646（ 1995）。分化は、発生運命における一連の増殖性の拘束を介して生じるようである。D.J．Anderson、神経冠系統問題；神経形成？、３ Neuron 1-12（1989）；D .J．Anderson、神経冠細胞系統多様化の、細胞および分子生物学、３ Curr．Opi n．Neuroblol．8-13（1993）。神経球およびＮＥＰ細胞のように、ＮＳＣＳは、多能性であり、および少なくとも制限された自己再生能力を示す。それゆえ、ＮＣＳＣは、抹消神経系についての幹細胞に相当する。ＮＣＳＣは、それらの形態学、低親和性の神経増殖因子（ＮＧＦ）レセプターの発現（げっ歯類の冠において）によって、それらが生成する子孫によって、およびそれらが上記のようなＣＮＳ誘導体を生成し得ないことによって、ＣＮＳ幹細胞から区別される。ＮＳＣＳは、シュワン細胞、感覚ニューロン、交換ニューロン、および腸ニューロン、ならびに非ニューロン性の誘導体（例えば、軟骨、骨、メラニン細胞、および平滑筋（ＣＮＳ幹細胞から報告されていない誘導体）に分化する。成熟した、ＮＣＳＣ由来の細胞は、ＣＮＳにおける関連の細胞から区別するために使用され得る表現型マーカーを発現する。例えば、シュワン細胞は、ＧＦＡＰおよび有髄化抗原（例えば、ＧａｌＣ、PO、O4など）の同時発現によって、星状膠細胞および希突起膠細胞から区別され得る。ペリフェリンおよびチロシンヒドロキシレート（ＴＨ）発現は、ＰＮＳの交換ニューロンの特徴であるが、ＣＮＳ誘導体の制限された集団において、一般に見られる。ＮＣＳＣ誘導体に特徴的なマーカーを発現する細胞は、ＮＥＰ細胞のいずれの神経球からも生じることは示されていない。さらに、ＮＣＳＣは、ＰＮＳの多能性の幹細胞であるが、それらは、ＣＮＳ誘導体を生成し得ないようであり、ならびにＣＮＳへの一次冠細胞および細胞系統の移植は、シュワン細胞の分化を生じる。従って、ＣＮＳ幹細胞およびＮＣＳＣは、２つの異なる種類の幹細胞に相当する。ＣＮＳ幹細胞とＮＣＳＣとの間の系統関係は、これまで、げっ歯類において密接に分析されていなかった。２つの独立した系統が、神経管閉鎖時に分離されたか、または２つの集団が系統的に関連するかのいずれかである。両方の可能性を示唆する証拠が、トリ冠発生を分析する実験に存在する。いくつかの研究は、冠細胞が神経管閉鎖の前に分離されたことを示すだけでなく、冠集団が既に、制限された分化可能性を有する亜類型に分離されていたことを示す。例えば、初期および後期に移動する冠細胞は、メラニン細胞および感覚ニューロンを生成するそれらの能力が異なることが記載されている。J.A．Weston、神経冠系統における発生的に拘束される中間細胞集団の連続的な分離および運命、25 Currtopics De v．Biol．133-153（1991）；P．Henion & J．Weston、神経冠系統における細胞運命の拘束の時機およびパターン、124 Developmen T 435l-4359（1997）。他の実験、J.D．Moury & A.G．Jacobson、アホロートルにおいて神経板と表皮との間で新規に作成される境界での神経摺形成、133 Dev．Blol．243-253（1989）；M. A．Selleck & Bronner-Fraser、トリ神経冠の起源：神経板−表皮相互作用の役割、121 Development 525-538（1995）は、少なくともいくつかの神経冠細胞が、神経管を形成する神経板細胞からではなく、神経摺を伴う近位における外胚葉から生じることを示した。発生における後期の段階で行われた神経管回転実験、J.A．Weston、ニワトリにおける体躯神経冠の移動および局在化の放射線グラフ分析、6 Dev．Biol．279-310（1963）；C.D．Sternら、ニワトリ胚における神経冠細胞の移動および分化に影響する組織相互作用、113 Development 207-216 （1991）は、腹側の神経管が背側に置かれる場合、これは、神経冠を生成しないことを示す。むしろ、神経冠は、回転された背側管から腹側に生じ、このことは、細胞が、15期にはＣＮＳまたはＰＮＳ運命に拘束され始めたことを示唆する。ニワトリおよびウズラにおいて冠発生を分析する他の実験は、分離が絶対でないことを示唆した。単一の細胞標識化実験は、その子孫がＣＮＳおよび抹消の両方を占有した前駆体を同定した。J.R．Sanes、組換えレトロウイルスでの細胞系統の分析、12 TINS 21-28（1989）；S.M．Leberら、トリ脊髄におけるコロニー関連性の運動ニューロンの系統、配置、および死、10 J．Neurosci．2451-2462 （1990）；M．Bronner-Fraster & S.E．Fraser−355 Nature 161-164（1988）、前出；M．Bronner-Fraster & S.E．Fraster、トリ体躯神経冠細胞のIn Situでの発生可能性、3 Neuron 755-766（1989）；K.B．Artingerら、背側および腹側のタイプが、共通の神経管前駆体から生じ得る、172 Dev．Biol．591-601（1995）。形態学的分析は、細胞がまた、適切なＰＮＳ運命を採用したことを示した。これらの実験は、共通のＣＮＳ−ＰＮＳ前駆体がインビボに存在することを強力に示唆した。神経管切除実験はまた、神経管を発生するにおいて存在する神経上皮細胞が、ＰＮＳ誘導体を生成し得るそれらの能力を喪失しなかったことを示唆した。神経管が、通常の冠移動後６時間までに切除される場合、通常、神経冠を生成しない腹側の神経管細胞が、適切なＰＮＳグリアを占有する移動細胞を容易に生成する。T．Schersonら、神経冠を形成するための頭側神経管の調節的な能力、118 Development 1049-1062（1993）。これらの研究は、上述で引用した研究と対照的に、共通の前駆体が、発生におけるいくらか初期の段階で（神経管閉鎖後であっても）、存在すること、およびこの前駆体は、インビボでＣＮＳおよびＰＮＳ誘導体の両方を生成することを示唆する。共通のＣＮＳ−ＰＮＳ前駆体を実証する対応する実験は、げっ歯類において行われておらず、およびこのような共通の前駆体が存在するか否かの問題は、保留されたままである。さらに、トリ胚からの結果のほとんどは、共通のＣＮＳ-FNS 前駆体が存在する場合、その増殖可能性は、冠が移動した直ぐ後に、迅速に喪失されることを示唆し、このことは、げっ歯類から単離されたＣＮＳ幹細胞が、冠様の細胞を生成する能力を有しないかもしれないことを示唆する。実際、発生するげっ歯類神経管が、げっ歯類において神経管閉鎖後に神経冠を生成し得ることを示す証拠は、ほとんど存在しない。実際、E10.5（正常な冠が成長する時期）で単離され、そして培養に置かれた神経管においてでさえ、神経冠の成長は、背側表面からのみ生じる。これは、神経冠およびＣＮＳ幹細胞系統が、E11で既に分離していた可能性を生じる。しかし、代替の説明（例えば、外植培養物における適切なシグナルの欠損など）が、排除され得ない。ＣＮＳとＰＮＳとの問の系統関係を試験するために、ＮＥＰ幹細胞の分化特性を実験した。個々のＮＥＰ細胞が、大量培養およびクローン培養の両方において、ＰＮＳ誘導体を生成し得るという証拠が、本明細書中に示されている。ＰＮＳ誘導体への分化は、神経冠幹細胞の生成を含むようであることが示される。これらのデータは、ある幹細胞から、より拘束された発生潜在性の別の幹細胞への移行を示唆する。実施例17ＮＥＰ細胞は、シュワン細胞および平滑筋を生成するＮＥＰ細胞が、神経冠由来のＰＮＳ細胞に分化し得るか否かを決定するために、２つの型の細胞誘導体、シュワン細胞および平滑筋細胞を試験した。シュワン細胞は、ＧＦＡＰ、低親和性のＮＧＦレセプター、ならびに有髄化抗原のそれらの同時発現によって、星状膠細胞から区別され得る。D.L．Stemple & D.J．Ande rson、71 Cell 973-985（1992）、前出；N.M．Shahら、ＴＧＦβスーパーファミリーメンバーによって、代替の神経冠細胞運命は、有益に促進される、85 Cell 331-343（1996）；N.M．Shah & D.J．Anderson、神経冠幹細胞による複数の指導的な役割の取込みは、相対的な増殖因子応答における細胞内部偏向を示す、94 P roc．Nat'l Acad．Sci．USA 11369-11374（1997）；R．Mirskyら、シュワン細胞の発生および分化、152 Rev.Neurol.（Paris）308-313（1996）。平滑筋は、平滑筋特異的なアクチン（ＳＭＡ）の発現、およびデスミンの同時発現によって同定され得る。N.M．Shahら、前出；N.M．Shah & D.J．Anderson、前出。実施例１の手順に従って調製したE10-5 ＮＥＰ細胞を、フィブロネクチンにおいて、５日間、増殖し、次いで、トリプシン処理によって採集し、そしてフィブロネクチンでコートされた35mmディッシュにおいて、ＣＥＥを含有する神経冠培地中に再プレートした。D.L．Stemple & D.J．Anderson、71 Cell 973-985（199 2）、前出。簡潔には、神経冠培地を、J.E．Bottenstein & G.H．Sato、76Proc ．Nat'l Acad．Sci．USA 514-17（1979）、前出によって記載される付加物（10% ＣＥＥ、50ng/ml ＮＧＦ（UBI）、10ng/ml ＦＧＦ（UBI）、および100ng/ml ＥＧＦ（UBI）で、ＤＭＥＭ/F12培地を補充することによって調製した。免疫組識化学を、実施例４の手順に従って行った。表１に記載されない抗体を、Iowa大学のDevelopmental Studies Hybridoma Bankから得た。１つのディッシュを、ネスチンおよびｐ75で、プレートした１日後に染色し、これは、解離されたＮＥＰ細胞が、ｐ75（低親和性のニューロトロフィンレセプター）免疫反応性を発現しないことを示した。ｐ75免疫反応性は、検出されなかった。Ｐ75免疫反応性のＮＥＰ細胞を、分化条件（ＣＥＥを含有する神経冠培地）中で増殖して、冠細胞分化を促進し、次いで、神経冠培地中に10〜15日間維持し、そして平滑筋細胞およびシュワン細胞の存在を、免疫組識化学によって分析した。細胞を、５日間または10日間、分化させた。５日間培養した細胞を、ＤＡＰＩ／ｐ75について染色し、一方、10日間培養した細胞を、ＳＭＡおよびネスチン、またはｐ75およびＧＦＡＰについて、二重標識した。シュワン細胞（ｐ75⁺、ＧＦＡＰ⁺）および平滑筋細胞（ｐ75⁺、ＳＭＡ⁺）の有意な数が存在し、このことは、これらのＰＮＳ誘導体の両方が、ｐ75免疫ネガティブなＮＥＰ細胞から生成され得たことを示す。実施例18培養において、ＮＥＰ細胞は神経冠細胞を生成するこの例において、５日間フィブロネクチン上で増殖したＮＥＰ細胞を、トリプシン処理によって採集し、そしてフィブロネクチンでコートされた35mmディッシュ上で、ＣＥＥを含有する神経冠培地中に再プレートした。細胞を、５日間分化させ、次いで、ｐ75およびネプシンの発現、Ｅ−ＮＣＡＭ、Ａ２Ｂ５、およびＧＦＡＰについて、二重標識した。シュワン細胞および平滑筋細胞を、この手順に従って生成した。これらのＰＮＳ誘導体は、ｐ75-免疫反応性の細胞の存在によって、一定不変に先行された。２つの異なる型のｐ75免疫反応性の細胞が、区別され得た。第１に、明相であり、ならびに大きな細胞体および長い突起を有する、神経細胞様の細胞が観察された。二重標識が、大部分のｐ75免疫反応性のニューロン細胞が、コリン−アセチルートランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）免疫反応性を同時発現したことを示したので、これらの細胞は、運動ニューロンであるようであった。第２に、より平らな、繊維芽細胞様の細胞が存在した。これらの細胞は、塊で生じた。これらの細胞の二重標識は、これらはネスチン免疫反応性であったこと、ＧＦＡＰおよびＥ−ＮＣＡＭのような系統マーカーを発現しなかったこと、ならびにＡ２Ｂ５モノクローナル抗体で標識されなかったことを示した。系統マーカーの不在およびｐ75およびネスチンの同時発現は、げっ歯類における神経冠の特徴と考慮された。D.L．Stemple & D.J．Anderson、前出。従って、ｐ 75免疫反応性のＮＥＰ細胞は、ｐ75免疫反応性の冠様の細胞、およびＮＣＳＣ誘導体を生成し得た。実施例19ＮＥＰ由来のｐ75免疫反応性の細胞は、大量培養において神経冠由来の細胞を生成するＮＥＦ由来のＰ75免疫反応性の細胞が、ＮＣＳＣ誘導体に分化する能力を有するか否かをさらに決定するために、ＮＥＰ細胞を、ラミニンでコートされたディッシュ上に再プレートし、およびＣＥＥを取り除くことによって、培養において分化させた。抗ｐ75抗体を、細胞を選択するために使用し、そして神経冠分化培地中にプレートした以外は、実施例14の手順に従って、ｐ75ポジティブ細胞を、免疫パンニングによって選択した。簡潔には、免疫パンニングは、細胞をトリプシン処理し、および得られる懸濁液を、ｐ75抗体でコートされたディッシュにプレートして、全てのｐ75⁺細胞をプレートに結合させることによっておこなった。ｐ75⁺ディッシュは、連続的に、未標識の抗マウスＩｇＧ抗体で培養ディッシュをコートし、ディッシュをＤＰＢＳでリンスし、そしてｐ75抗体（ＩｇＧ192、Developmental Studies Hybrido ma Bank、Iowa大学）で、１時間、室温でコートすることによって、調製した。細胞を、１時聞、室温で結合させた。未結合の細胞を除去し、そしてプレートを、Bottenstein & Sato、前出によって記載される付加物で補充したＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ-ＢＳ）で洗浄した。結合した細胞を、擦り取り、そしてフィブロネクチン／ラミニンでコートされたディッシュにおいて、１mlのＤＭＥＭ−ＢＳ±増殖因子中に、大量培養（5000細胞/ディッシュ）またはクローン培養（100細胞/ディッシュ）のいずれかでプレートした。増殖因子を、一日おき毎に添加した。全ての場合において、細胞のアリコートを、次の日に分析して、免疫パンニングの効率を決定した。一般に、90%を超える結合した細胞が、検出可能なｐ75免疫反応性を発現した。シュワン細胞の成熟を促進するために、分化された、免疫パンニングによって得られたｐ75免疫反応性の細胞を、ジブチルcAMP（５μM、Sigma）の添加を伴う神経冠培地において、さらに７日間、増殖した。平滑筋分化を促進するために、冠細胞を、10%胎児ウシ血清（Hyclone Labs、Logan、Utah）で補充した神経冠培地において増殖した。７または15日後、分化マーカーの発現を、アッセイした。ｐ75ポジティブな細胞は、β-IIIチューブリンおよびＧＦＡＰ−免疫反応性の細胞に分化した。ＧＦＡＰ免疫反応性の細胞は、ｐ75を発現し、および細胞のサブセットは、O4、有髄化特異的抗原を発現した。抗原発現のこのパターンは、シュワン細胞の特徴である。D.L．Stemple & D.J．Anderson、前出；M．Rao & D.J． Anderson、神経冠幹細胞の不死化、７Ｊ．Neurobio．722-46（1996）；R．Mirsl yら、前出、分化したニューロンは、ペリフェリンを発現し、ならびに細胞のサブセットは、ＴＨおよびＭＡＳＨ、交換ニューロンおよび腸ニューロンの特徴的なマーカーを発現した。ペリフェリン免疫反応性のニューロンへの分化のこのパターンは、同一の培養条件下での神経冠未分化に類似する。L．Sommers ら、前出；M．Rao & D.J．Anderson、前出。従って、ＮＥＰ細胞から単離されるｐ75免疫反応性の細胞は、神経冠に形態学および表現型が同一であり、ならびに類似の様式において培養物において応答した。ｐ75免疫反応性の細胞は、試験した全ての培養条件において、ＧａｌＣおよびO4免疫反応性によって特徴付けられるように、希突起膠細胞を生成しなかった。対照的に、ＮＥＰ前駆体細胞は、上記のように、培養物において希突起膠細胞に容易に分化された。従って、ＮＥＰ由来のｐ75免疫反応性の細胞は、ＰＮＳ誘導体（抹消ニューロン、平滑筋、およびシュワン細胞）を生成したが、ＣＮＳ誘導体を生成しなかった。実施例20ＮＥＰ由来のｐ75細胞は、クローン培養において増殖して、ニューロン、平滑筋、およびシュワン細胞を生成した個々のＮＥＰ由来の、ｐ75免疫反応性の細胞が多能性であるか否かを決定するために、クローン培養において増殖したこのような細胞の分化可能性を試験した。従って、E10.5胚からのＮＥＰ細胞を単離し、ＲＡの添加、およびＦＧＦの排除、および5ng/mlのＢＭＰ−２の添加によって分化するように誘導した。ｐ75免疫反応性の細胞を、免疫パンニングによって単離し、そしてクローン培養においてプレートし、そして個々のクローンの分化を、抗原マーカーの発現によって追跡した。ＮＥＰ由来のＰ75⁺細胞を、神経冠培地中で増殖した。自発的に分化する、Ｐ75免疫反応性の細胞およびＢＭＰ−２誘導性のｐ75免疫反応性の細胞の両方を、試験し、同一の結果を得た。ＢＭＰ誘導性のｐ75免疫反応性の細胞を、クローン密度でプレートし、そしてコロニーを、10日間の培養後に評価した。クローン合成は、ｐ75免疫反応性の細胞に由来する大部分のクローン（14/17）が、多能性であること、およびクローンの有意な割合が、１種類よりも多くの分化された細胞を含んだことを示した。ニューロンおよび平滑筋の両方を含有するクローン、ならびにグリアおよび平滑筋の両方を含有するクローンが、同定され得た。３分化能のクローンは、まれであった（２/17）。唯一の単能性のクローンが同定され、これは主に平滑筋細胞からなっていた。従って、大部分のＮＥＰ由来の（またはＢＭＰ−２誘導性の）ｐ75ポジティブ細胞は、少なくとも両能性であり、ならびに神経誘導体および非神経誘導体に分化し得る。実施例21Ａ２Ｂ５およびｐ75免疫反応性の細胞を含有するコロニーからのＮＥＰ細胞以上に示される結果は、ＮＥＰ細胞が、ＣＮＳ誘導体およびＰＮＳ誘導体の両方を生成し得ることを示唆する。しかし、ＮＥＰ培養物が、利用可能な抗原によって区別可能でない２つの異なる細胞の集団（その一方は、ＣＮＳ細胞を生成し、他方は、ＰＮＳを生成する）を含んでいる可能性があった。これらの可能性を区別するために、個々のＮＥＰ細胞が、ＣＮＳおよびＰＮＳ前駆体細胞を生成する能力を試験した。ｐ75を、神経冠についてのマーカーとして、Ａ２Ｂ５を、希突起膠細胞前駆体についてのマーカーとして選択した。冠細胞によって発現されるので、ｐ75を使用し、ならびにニューロンマーカーでの二重標識化によって、このマーカーを発現し得る他の集団（例えば、運動ニューロン）が排除され得た。Ａ２Ｂ５が、ラット神経上皮細胞培養物においてグリア前駆体を認識することが以前に示されたので、Ａ２Ｂ５を、グリアマーカーとして使用した。米国特許出願第08/980,850号；M.Raoら、新規な三能性のグリア前駆体細胞が発生する脊髄に存在する、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（印刷中）；M．Rao & M．Mayer-Pr oschel、胚脊髄からの神経上皮細胞は、グリア前駆体を生じ得る、188 Dev．Bio l．48-63（1997）。それゆえ、ｐ75とＡ２Ｂ５とのこの組合せは、複数の抗体の使用を必要とせずに、ＣＮＳおよびＰＮＳ誘導体の両方の検出を許容する。５日間、フィブロネクチン上で増殖したE10.5 ＮＥＰ細胞を、トリプシン処理によって採集し、そしてフィブロネクチンでコートされた35mmディッシュにおいて、クローン密度（50〜100細胞/35mnlディッシュ）で、ＮＥＰ培地中に再プレートした。単一の単離した細胞を回転(circled)し、そして15日間、追跡した。クローン分析は、個々のＮＥＰが、Ａ２Ｂ５およびｐ75の両方の免疫反応性の細胞を生成し得たことを示した。二重標識は、ｐ75およびＡ２Ｂ５が、細胞の重複しない集団において発現されたこと、ならびにクローンにおけるｐ75免疫反応性の細胞のパーセントが、５〜50%に変化したことを示した。ｐ75免疫反応性の細胞のみからなるクローン、およびＡ２Ｂ５免疫反応性の細胞のみからなるクローンは、見られなかった。表９において示されるように、全ての細胞において、未標識の細胞がまた存在した。実施例22ＮＥＰ細胞はＣＮＳおよびＰＮＳ誘導体の両方を含有するコロニーを形成する同じクローンにおける、ＣＮＳおよびＰＮＳ誘導体の両方の存在をさらに確認するために、ＮＥＰクローンのサブセットを、さらに成熟させ、およびＳＭＡと、Ａ２Ｂ５およびβ-IIIチューブリンとの同時発現を、分析した。Ａ２Ｂ５免疫反応性がＣＮＳグリア前駆体を同定することが以前に実証されたので、Ａ２Ｂ５を選択した。M．Rao & M．Mayer-Proschel、前出。従って、E10.5 ＮＥＰ細胞を、５日間、フィブロネクチン上で増殖し、トリプシン処理によって採集し、そしてフィブロネクチンでコートされたディッシュ上に、クローン密度で（50〜100 細胞/35mmディッシュ）、ＣＥＥを含有するＮＥＰ培地中に再プレートした。単一の単離された細胞を、回転(circled)し、そして15日間、追跡した。Ａ２Ｂ５およびＳＭＡ免疫反応性の細胞を含有するクローン、ならびにβ-III チューブリンおよびＳＭＡを含有するクローンが存在した。約40%のクローンが、Ａ２Ｂ５およびＳＭＡ免疫反応性の両方の存在を示し、このことは、ＣＡＮおよびＰＮＳ誘導体の両方が、同じ培養物中に存在することを示唆した。実施例23 ＢＭＰ−２は、培養物に存在するｐ75免疫反応性の細胞の数を調製する背方化シグナル(Dorsalizing signals)が、ＣＮＳまたはＰＮＳ幹細胞への、前駆体細胞の分化を調節し得ることが、以前に示唆された。M.E．Dickinsonら、非神経外胚葉による神経管の背方化(Dorsallzation)、121 Development 2099-21 06（1995）；K.F.Liem、Jr．ら、表皮外胚葉からのＢＭＰ媒介性のシグナルによって誘導される神経板細胞の背側分化、82 Cell 969-979（1995）。ＢＭＰのような背方化シグナルが、ｐ75免疫反応性の冠細胞へのＮＥＰ細胞の分化を促進し得るか否かを決定するために、ＢＭＰ−２の効果を試験した。 E10.5 ＮＥＰ細胞を、５日間、フィブロネクチン上で増殖し、トリプシン処理によって採集し、そしてフィブロネクチンでコートされた35mmディッシュ上に、ＣＥＥを含有し、および10ng/mlのＢＭＰ−２または100ng/mlのshhのいずれかを含有する神経冠培地中に再プレートした。細胞を、さらに２日間、分化させ、次いで、ＤＡＰＩ免疫組識化学についてまたはｐ75免疫反応性について、二重標識した。 10ng/mlのＢＭＰ−２は、ｐ75免疫反応性の細胞の数における、およびｐ75免疫反応性の強度における大きな増加（４倍）を引き起こした。ニューロン性のおよび非ニューロン性のｐ75免疫反応性細胞の両方が、検出可能であった。形態学においてニューロンでないようであり、および検出可能なβ-IIIチューブリン（ニューロンマーカー）を発現しなかったｐ75免疫反応性の細胞、ならびにＡ２Ｂ５またはＧＦＡＰ免疫反応性の細胞は、神経冠細胞であることが考慮された。冠細胞の同一性は、免疫パンニングされた細胞の特異的な可能性を分析することによって、確認した。実施例24ＢＭＰ−２は、神経冠未分化を調節する指導的な分子として作用するＢＭＰが、増殖を増加することによって冠分化を促進するか否がを決定するために、ＮＥＰ細胞有糸分裂に対するＢＭＰの効果を、ＢＲＤＵ取込みによって試験した。フィブロネクチンに対して、５日間、増殖したE10.5 ＮＥＰ細胞を、トリプシン処理によって採集し、そして10ng/mlのＢＭＰ−２の添加を伴うかまたは伴わないフィブロネクチンでコートされた35mmディッシュ上に再プレートした。細胞を、さらに２日間分化させ、次いでＢＲＤＵおよびＤＡＰＩ免疫組識化学について二重標識した。ＢＭＰは、全体の有糸分裂を阻害するようであった。ＢＭＰは、ｐ75免疫反応性の細胞の有糸分裂を選択的に促進しないようであり、このことは、細胞が、表現型を決定するための細胞分裂を経験する必要がなかったことを示唆する。これは、ＮＥＰ細胞を、低密度でプレートし、そしてｐ75免疫反応性が細胞分裂を経験することなく獲得され得るか否かを決定することによって、直接的に評価された。従って、ＢＭＰは、ｐ75免疫反応性の冠様細胞に分化するように細胞を導くための指導的な分子として作用し得、このことは、ＣＮＳ幹細胞またはＮＣＳＣになる選択が、外部シグナルによって調節され得ることを示す。図３に、２つの独立した実験からのランダムな分野(random fields)を計数した結果をまとめる。差異は、スチューデントT検定を使用して、95%の信頼度で、統計学的に有意である。これらの結果は、ＣＮＳのニューロン、星状膠細胞、および希突起膠細胞を生成するに加えて、大量培養およびクローン培養においてシュワン細胞および平滑筋をまた生成し得る、共通のＣＮＳ−ＰＮＳ前駆体の存在を実証する。平滑筋およびシュワン細胞への分化は、以前に特徴付けられたＮＣＳＣに形態学および表現型が同一であるｐ75免疫反応性の細胞の生成によって先行される。ＮＥＰ由来のＮＣＳＣは、ニューロン性誘導体および非ニューロン性誘導体の両方を生成し得る自己再生する多能性の細胞である。これらの結果は、ＣＮＳまたはＰＮＳ幹細胞への分化の選択が、インビボで、ＢＭＰ−２によって調節され得ること、およびＢＭＰ−２が、有糸分裂の刺激を伴わずに冠分化を生成することを示す。個々の細胞は、細胞分裂を伴わずに、ＮＥＰから冠に分化し得、このことは、ＢＭＰが、指導的な分子として作用することを示唆する。これらの結果は、いくつかの理由のために、ＮＥＰ細胞培養物に存在したｐ75 免疫反応性の冠細胞の、混入する集団の存在によって説明することができない。ＮＥＰ細胞を、48時間培養し、そしてｐ75免疫反応性について染色し、そしてｐ 75免疫反応性の細胞を有しない培養物のみ（培養物の100%）を分析した。ｐ 75免疫反応性の細胞は、ｐ75免疫反応性の細胞を誘導した混合されたクローンを容易に生成し、このことは、ｐ75ネガティブな細胞が、ｐ75⁺細胞様の細胞を生成し得たことを示す。ｐ75免疫反応性の細胞は、ＢＭＰ処置の２日間内で、培養された細胞の80％を構成し、ＢＭＰがＮＥＰ細胞に対しても、神経冠細胞に対しての有糸分裂効果を有しなかったので、この大きな増加は、冠細胞の増殖に起因しなかった。合わせると、これらのデータは、ＮＥＰ細胞が、神経冠およびその誘導体を生成し得ることを強力に示唆する。米国特許出願第08/852,744号は、ＮＥＰ細胞分化（図１）を提唱し、ここでは、神経冠未分化について示唆されたように、ＮＥＰ細胞分化が、発生運命における増殖の拘束を介して生じることが議論された。D.J.Anderson、3 Neuron１〜12 、前出。ＮＥＰ細胞は、ＮＲＰおよびＧＲＰと呼ばれる中間の、より拘束される前駆体ＣＮＳ誘導体を介して生成されることが示唆された。続いて、このような前駆体の存在が実証され、そしてＮＲＰおよびＧＲＰ細胞が、特徴的なマーカーの発現によって、ＮＥＰ細胞から区別され得ることが示された。米国特許出願第 08/909,435号；米国特許出願第08/980,850号。ＮＣＳＣは、これらが、ＮＥＰ細胞から生成され得、およびＣＮＳ誘導体に分化する能力を喪失したので、他の中間前駆体に類似すると考えられ得る。それゆえ、ＮＥＰ細胞分化についてのモデルは、神経冠への分化を含むように拡張された（図４）。これらの結果は、ｐ75免疫反応性の細胞は、ＣＮＳ誘導体に分化しないが、脊髄由来のＮＥＰ細胞についての分化可能性における類似の制限は、生じなかったことを示唆する。発生の後期の段階で単離された皮質幹細胞でさえまた、神経冠誘導体を生成し得た。E14.5（頭側神経冠が移動した十分に後の時点）で採集された皮質幹細胞は、神経冠様の細胞を生成し、このことは、神経冠を生成する能力が、以前に提案されたよりもはるかに長く存在し得ることを示す。報告された幹細胞の両方が、ＦＧＦにおいて維持されたことに注目されるべきである。ＥＧＦ-依存性の神経球幹細胞および成体神経球幹細胞は、大部分の特徴において、胚神経球に類似するようであり、神経冠を生成することは示されなかった。これらの結果は、トリ胚においてE5の背側脊髄から出現するとして記載される後期に出現する神経冠集団についての潜在的な起源を提供する。Z．KoRAde & E．FRAnk、神経冠経路に移植された発生する脊髄細胞の細胞運命における拘束、16 J．Neurosci．7638-7648（1995）；G.S．Sohalら、dil標識化およびホメオボックス遺伝子島(Islet)-1発現は、トリ三叉神経ガングリオンの形成に対する腹側神経管細胞の寄与を示す、14 Int．J．Dev．Neuroscl．419-427（1996）。これらの結果は、神経管閉鎖後、いくつかの脊髄細胞が、末梢誘導体を生成し得、およびこれらの誘導体が正常な発生に重要な成分であることを示す。本発明の結果と合わせると、これらの実験は、マウスおよびラットの神経冠分化は、トリ冠発生に類似し得ることを示唆する。冠細胞の後期に出現する集団は、幹細胞の分離された集団を示さないことをさらに示唆する。むしろ、これらは、適切な環境シグナル下で、ＣＮＳ幹細胞の正常な分化可能性を示す。本発明の実験は、ＢＭＰ−２は、ＮＣＳＣへのＮＥＰ細胞の分化を調節するにおいて重要であり得ることを示唆する。ＢＭＰ−２は、培養物に存在するｐ75免疫反応性のＮＣＳＣの数を有意に増加した。ＢＭＰ−２は、抗有糸分裂因子であるようであり、および存在する分裂細胞の数が有意に減少されるようであったので、冠細胞数の増加は、増殖の増加に起因しなかった。むしろ、ＢＭＰ−２は、細胞分裂を伴わずに、冠未分化を促進する指導的な分子として作用するようであった。類似の効果が、ＢＭＰ-4およびＢＭＰ-7で、示された。Hazelら、Soc．Of Neurosci．要訳131.9（1997）を参照のこと。トリ神経管での外植実験、Dickin sonら、前出；Liemら、前出；K.F.Liem、Jr.ら、背側脊髄中でのニューロンパターン化における上衣板およびその常在性ＴＧＦβ関連タンパク質についての役割、91 Cell 127-138（1997）、ならびにアフリカツメガエル胚における冠分化を研究する実験はまた、神経冠分化を促進するにおける外胚葉およびＴＧＦ-βスーパーファミリーのメンバーを強く示唆した。P.A．Wilson & A．Hemmati-Briva nlou、ＢＭＰ-4による外胚葉の誘導および神経運命の阻害、376 Nature 331-333 （1995）；R．Mayorら、神経冠誘導におけるＦＧＦおよびnogginの役割、189 De v．Biol．1-12（1997）;A．Mancilla & R．Mayor、アフリカツメガエル胚葉における神経冠の形成：Xslug誘導の機構、177 Dev．Biol．580-589（1996）。従って、利用可能なデータは、背側管または重層する外胚葉のいずれがに存在するＴＧＦ-βスーパーファミリーのメンバーが、冠誘導を調節する重要な指導的な分子であり得ることを示唆する。ファミリーのいくつかのメンバーは、dorsalinを誘導し（K．Basterら、神経管における細胞パターンの制御：dorsalin-1、新規なＴＧＦ-βファミリーメンバーによる細胞分化の調節、73 Cell 687-702（1993））、ＴＧＦ-β（Liemら（1997）、前出）は、インビボで適切な時間で発現され、それゆえ、これらは有力な候補である。nogginおよびslugのような他の分子もまた、役割を果たし得る。本発明のＮＥＰ細胞―冠細胞培養アッセイは、このような分子が迅速に試験され得る単純なアッセイを示す。ＮＥＰ幹細胞の有意な集団が、神経冠を生成し得ること、およびこの数が、ＢＭＰによって調節され得ることの実証が、分析のための多数の冠細胞についての潜在的な供給源を提供する。歴史的に、神経冠細胞を採集および分析することは、これらが初期の胚発生において一時的にのみ存在するので、困難であった。さらに、単一のE10.5ラット神経管からの冠細胞の平均の収量は、わずか100〜150 神経冠細胞である。対照的に、同じ段階で採集される各神経管は、約100,000細胞を産生し、そのうちの60%が潜在的に幹細胞である。さらに、ＣＮＳ幹細胞は、複数の継代培養にわたって維持され得、利用可能な幹細胞の数をさらに増幅する。培養ＣＮＳ幹細胞から神経冠細胞を生成することは、非常に多数のＰＮＳ誘導体を得る新規な方法を示す。まとめると、これらの結果は、ＣＮＳ幹細胞（ＮＥＰ細胞）とＰＮＳ幹細胞（ＮＣＳＣ）との間の系統関係を確立する。一方の幹細胞から他方への分化が実証され、そしてこの分化は、外部シグナル（例えば、ＢＭＰ−２）によって調節される。これらの結果はさらに、前駆体細胞の発生潜在性における連続的な拘束のさらなる理解であり、そして胚神経幹細胞からのＮＣＳＣの分化の基礎をなす分子事象を分析するためのモデルを提供する。ＮＥＰ幹細胞分化の間のＥＧＦレセプターおよびＦＧＦレセプターイソ型の発現脊髄の分化した細胞は、より制限された分化可能性を伴う系統拘束化前駆体の生成を介して、最初は多能性のＮＥＰ細胞から生じる。２つの拘束化前駆体、ニューロンの複数の種類を生成し得るニューロン拘束化前駆体（ＮＲＰ；米国特許出願第08/909,435号、本明細書中に参考として援用される）、ならびに希突起膠細胞および星状膠細胞を生成し得るグリア拘束化前駆体（ＧＲＰ；米国特許出願第08/980,850号、本明細書中に参考として援用される）が、記載された。ＮＥＰ細胞、ＧＲＰ、およびＮＥＰは全て、培養におけるそれらの生存または分化のために、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を必要とする。ＮＥＰ細胞の成長および増殖についてのＦＧＦの絶対的な要求性は、他の脳領域からの多能性の神経幹細胞（神経球）の要求性に対して、はっきりと対照的である。Reynoldsら、前出；Re ynolds & Weiss、前出；Vescoviら、前出。有糸分裂を促進するために、ＦＧＦは、ＥＧＦと相乗的に作用し得るが、神経球幹細胞は、インビボおよびインビトロのいずれかのそれらの生存または増殖のために、ＦＧＦを必要としないが、表皮増殖因子（ＥＧＦ）を必要とする。Grittiら、前出；Vescoviら、前出。他方、ＮＥＰ幹細胞は、ＦＧＦ依存性であり、ＥＧＦの効果は発見されていない。ＮＥＰ細胞が、ＥＧＦに応答できないことは、存在しないかまたは低レベルのＥＧＦレセプター（ＥＧＦ-Ｒ）を反映し得るが、ＮＥＰ細胞におけるＥＧＦ-Ｒの存在または不在は、決定されていないままである。ＥＧＦは、ＮＥＰ細胞に対して作用しないかもしれないが、ＥＧＦおよびＦＧＦの両方は、ＣＮＳ神経分化プロセスにおいて複数の段階で、作用するようであり、ならびにそれらの効果は段階特異的および用量依存性であり得る。低用量で、ＦＧＦは、幹細胞についての生存因子であるが、高用量で、ＦＧＦは、分裂促進因子であるようである。さらに、低用量で、ＦＧＦは、ニューロンに対する分化を誘導するが、より高い用量で、星状膠細胞分化を促進する。X．Qianら、ＦＧＦ2濃度は、多能性皮質幹細胞からのニューロンおよびグリアの生成を調節する、18 Neuron 81-93（1997）。高用量のＦＧＦはまた、希突起膠細胞分化を阻害し、（R．Bansal & S.E．Pfeiffer、ＦＧＦ-2は、成熟希突起膠細胞を、新規な表現型に変換する、50 J．Neurosci．RES．215-228（1997））、およびＦＧＦの優勢ネガティブな形態の発現は、希突起膠細胞有糸分裂を妨げ、および有髄化を変化させる（D．Harariら、ＦＧＦは、インビボで希突起膠細胞維持においてわずかな役割を果たす、J．Neurosci．Res．404-415（1997）；D.J．Osterhout ら、ドミナントネガティブなＦＧＦレセプターを発現する移植された希突起膠細胞前駆体細胞は、インビボで移動できない、17 J．Neurosci．Res．9122-9132（1997 ））ようである。同様に、ＥＧＦは、拘束化Ｏ２Ａ前駆体の分化を阻害し得（H. Z．Shengら、表皮増殖因子は希突起膠細胞におけるミエリン塩基性タンパク質の発現を阻害する、23 J．Neurosci．Res．425-432（1989））、ならびにＥＧＦ− Ｒの過剰発現は、星状膠細胞運命に前駆体細胞を誘導し得る（R.C．Burrowsら、前駆体細胞成熟の応答多様性および時機は、皮質におけるＥＧＦＲ発現の発生的な変化によって調節される、19 Neuron 251-267（1997）；L．Lillien、ＥＧＦレセプターの過剰発現によって誘導される網膜細胞運命の変化、377 Nature158- 162（1995））。ＥＧＦおよびＦＧＦはまた、有糸分裂後のニューロンについての生存因子として作用する。D．Casperら、ＥＧＦは、ラット胚中脳の一次細胞培養においてドーパミンニューロンの生存を増強する、30 J．Neuroscl．RES．3 72-381(1991)。従って、ＦＧＦおよびＥＧＦの効果は、適用される濃度、およびこれが提示される細胞分化の段階に依存する。ＥＧＦの効果は、ＥＧＦ−Ｒと命名される170kDaレセプターチロシンキナーゼによって媒介される。構造的に関連するポリペプチドのＴＧＦ-αは、ＥＧＦと類似の分子量を有するＥＧＦ−Ｒを結合し得、そして活性化し得る。ＥＧＦ−Ｒは、出生後および後期胚発生においての両方で、胚帯域に局在化された。M.R．K aserら、成体ラット脳の領域における表皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、およびＥＧＦレセプターのレベルの比較、16 BRAin RES．Mol．BRAin Res ．316-322（1992）；H.I．Kornblumら、ラット脳における表皮増殖因子レセプターおよびそのリガンド、トランスフォーミング増殖因子αの出生前の発ガン性、 380 J．Comp．Neurol．243-261（1997）；K.B．Seroogyら、出生後のラット脳の増殖帯域は、表皮増殖因子レセプターｍＲＮＡを発現する、670 BRain Res．157 -164（1995）。ＦＧＦの発現は、ＦＧＦレセプター（ＦＧＦ−Ｒ）ファミリーの異なるメンバーの活性化を介して媒介される。D.M．Ornitzら、線維芽細胞増殖因子ファミリーのレセプター特異性、271 J．Biol．Chem．15292-15297（1996）。４つの別々のＦＧＦレセプター（ＦＧＦ-Ｒ−１〜４）および多様なスプライス改変体が、同定された。D．Glvol．& A．Yayon、ＦＧＦレセプターの複雑性：構造多様性および機能的特異性についての遺伝子基準、6 FASEB J．3362-3369（1992）；D.E．Johnson & L.T．Williams、ＦＧＦレセプター多重遺伝子ファミリーにおける構造的および機能的多様性、60 Adv．CANcer R es．1-41（1993）。ＦＧＦ−Ｒ１〜４は、互いに強力な相同性を有するが、親和性の程度が異なり、異なるＦＧＦを結合する。Ornitzら、前出。選択的なｍＲＮＡスプライシング事象は、独特のリガンド結合特性を有するＦＧＦ−Ｒのイソ型を生成する。T．Mikiら、選択的スプライシングによるリガンド結合特異性の決定：単一の遺伝子によってコードされる２つの異なる増殖因子レセプター、89 Proc．Nat'l．Acad．Sci．USA 246-250（1992）；W.Wernerら、線維芽細胞増殖因子レセプター１の細胞外領域における異なるスプライシングは、異なるリガンド結合特異性を有するレセプター改変体を生成する、12 Mol．Cell．Biol．82-8 8（1992）。細胞外アミノ末端領域をコードするエキソンの排除から生じる１つのスプライシング事象は、レセプターの「短い」形態（これは、その細胞外領域に２つのIg様ドメインを含む）、または「長い」形態（これは、３つのIg様ドメインを含む）のいずれかを生成する。別のスプライシング事象は、第３のIg様ドメインのＣ末端領域についての２つの代替のエキソンの使用を含み、およびFGR １、２、または３において、このドメイン（IIIa、IIIb、またはIIIc）の３つの異なるバージョンを生じる。ＦＧＦＲ４は、この領域において選択的にスプライスされることが知られていない。異なるイソ形態は、異なるリガンド親和性を示し、および異なる二次メッセンジャー経路を異なって活性化し得る。従って、スプライス改変体が、特定の細胞によって発現されることを知ることは、神経前駆体細胞に対する異なるＦＧＦの作用についての予測を可能にし得る。 In Situハイブリダイゼーション分析および免疫組識化学は、ＦＧＦおよびＦＧＦファミリーの多くの異なるメンバーの両方が、ＣＮＳの胚発生の間に存在することを明らかに示した。L.M．Lazar & M．Blum、定量的なヌクレアーゼ保護アッセイによる、マウス脳における表皮増殖因子およびトランスフォーミング増殖因子-αｍＲＮＡの領域分布および発生的な発現、12 J．Neuroscl．1688-1697（ 1992）；R.P.Schaudiesら、ラット脳における表皮増殖因子免疫反応性の物質：複数の種の局在化および同定、250 J．Biol．Chem．10447-10450（1989）；J.H ．Fallonら、中枢神経系における表皮増殖因子免疫反応性の物質：位置および発生、224 Science 1107-1109（1984）；K．Kuzisら、ラット中枢神経系の異なる細胞集団における、酸性および塩基性線維芽細胞増殖因子の発現の、発生の時間過程、358 J．Comp．Neurol．142-153（1995）。ＥＧＦ発現は、発生する脳において、および成体において、検出された。さらに、ＥＧＦ−Ｒノックアウトは、皮質発生異常、ニューロン転位、および減少された数の星状膠細胞を伴って、皮質表現型を示した。D.W．T Hereadgillら、マウスＥＧＦレセプターの標的化破壊：変異体表現型に対する遺伝子バックグラウンドの効果、269 Science 230-23 4（1995）。星状膠細胞およびニューロンは両方とも、ＥＧＦを合成するが、初期の胚段階でＥＧＦを合成する細胞はまだ決定されていない。複数のＦＧＦがまた、ＣＮＳにおいて存在する。少なくとも10個の異なるＦＧＦが同定されており、およびいくつかのＦＧＦ（ＦＧＦ１、２、４、５、および８を含む）は、発生の異なる段階で存在し得、および異なる役割を果たし得る。M．Heikinheimoら、原腸形成後のマウスにおけるＦＧＦ-8発現は、顔、肢、および中枢神経系の発生における役割を示唆する、48 Mech．Dev．129-138（1994）；Kuzisら、前出；A ．Orr-Urtregerら、線維芽細胞増殖因子レセプター2（ＦＧＦＲ−２）のスプライス代替物の発生的な局在、158 Dev．Biol．475-486（1993）。酸性および塩基性ＦＧＦ（それぞれ、ＦＧＦ1およびＦＧＦ2）は、初期のＣＮＳ発生において非常に重要であるようである。これらのＦＧＦの両方は、発生する脊髄に存在するが、酸性および塩基性ＦＧＦを合成する細胞は同定されていない。塩基性ＦＧＦ発現は、E1〜５で検出され、酸性ＦＧＦは、いくらか後の段階で検出される。M. D．Fordら、胚マウス脳におけるＦＧＦ-2および新規な硫酸ヘパリンプロテオグリカンの同時局在化、5 Neuroreport 565-568（1994）。ＦＧＦに対する中和化抗体は、神経形成をブロックし（Y.Taoら、インビボ神経形成は、塩基性線維芽細胞増殖因子に対する中和化抗体によって阻害される、33 J．Neuroblol．289-2 96（1997））、このことは、発生する神経系において合成されるＦＧＦが、正常な発生のために重要であることを示唆する。神経幹細胞およびそれらの分化された子孫に対する、ＥＧＦおよびＦＧＦ複数の作用を理解するために、神経前駆体細胞に存在するＥＧＦおよびＦＧＦレセプター亜類型の特徴づけを始めた。ＮＥＰ細胞は、ＦＧＦ−Ｒのサブセットを発現するが、ＥＧＦに対して応答せず、ＥＧＦ−Ｒを発現しないことが、本明細書中で示される。ＮＥＰ細胞に対するＦＧＦ−Ｒの発現のパターンは、ＮＲＰ、ＧＲＰ、希突起膠細胞、および星状膠細胞に対する発現のパターンとは異なる。ＮＥＰ細胞が、酸性ＦＧＦおよび塩基性ＦＧＦの両方を合成すること、そして自己分泌ループが、外因的に添加されるＦＧＦに依存せずに、細胞の生存を許容することが見出された。実施例25ＦＧＦはＮＥＰ細胞培養において分裂促進因子として作用するが、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、およびＮＧＦは作用しない E10.5神経管から単離されたＮＥＰ細胞が、ニューロン、星状膠細胞、および希突起膠細胞に分化し得る多能性の細胞であること、ならびにＮＥＰ細胞は、培養において未分化および増殖を保持するために、ＦＧＦおよびＣＥＥを必要とすることは、本明細書中で、以前に示された。他のサイトカインが、ＣＥＥまたはＦＧＦを置換え得るか否かを決定するために、発生のこの段階で発現することが知られる多様な因子の有糸分裂効果を実験した。実施例１に従って調製したＮＥＰ細胞を、ＮＥＰ培地中で増殖し、そしてＢＲＤＵを、４時間加えた。細胞を、ホルムアルデヒド（４％）で固定し、HClで透過し、ホウ酸ナトリウムで中和化し、そして抗ＢＲＤＵ標識化抗体と反応して、上記のように標識された細胞を同定した。分裂する細胞を、各35mmディッシュからの５つのランダムな分野を計数することによって評価した。各試験から重複したディッシュを試験し、各実験を３回反復した。試験した全ての因子のうち、ＦＧＦのみが、分裂促進因子として作用した。ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、またはＮＧＦのいずれも、試験した任意の用量で、効果を全く有しなかった。しかし、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）は、0.10ng/mlの用量で、ＢＲＤＵ取込みによって評価されるように、分裂促進性であり、最大の効果は、10ng/mlで見られた。酸性ＦＧＦ（ａＦＧＦ）は等しい効果であった。ＦＧＦを用いるその後の実験は、他で言及しない限り、20ng/mlで行った。実施例26ＮＥＰ細胞培養における分裂促進因子としてのＦＧＦＥＧＦの、単独での効果、またはＦＧＦとの相乗的な効果のいずれも見られなかったことは（実施例25）、ＥＧＦ依存性の幹細胞がＦＧＦによって支持され得、またその逆も成り立ったという以前の結果を考慮すると、驚くべきことであった。それゆえ、逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）および免疫細胞化学によって、ＥＧＦ−ＲのＮＥＰによる発現を実験した。全RNAを、グアニジンイソチオシアネート-フェノール-クロロホルム抽出法（T RIZOL；GIBCO/BRL）の改変によって、細胞から単離した。次いで、肖該分野において周知の方法に従って、ｃＤＮＡを、20μlの反応容量において１〜５μgの全 RNAを使用して、合成した。SUPERSCRIPT II（GIBCO/BRL）、改変されたモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、およびオリゴ（dT）12〜18プライマーを使用し、ならびにGIBCO/BRLプロトコルに従った。ＰＣＲについて、ｃＤＮＡのアリコート（上述のｃＤＮＡ合成反応物の1/20に等しい）を、50μl反応容量において使用した。ELONGASEポリメラーゼ（GIBCO/BRL）を使用して、レセプターｍＲＮＡのＰＣＲ増幅を行った。レセプターｍＲＮＡのＰＣＲ増殖について使用したプライマー配列を、表10において示す。反応を35サイクル行い、そして72℃での10分間のインキュベーションを、完全な伸長を確実にするために最後に加えた。ＰＣＲ産物を、ADVANTAGE ＰＣＲ-PUR E KIT（Clontech、Palo Alto、California）を使用して生成し、そして配列解析、制限エンドヌクレアーゼ消化反応、サブクローニング、およびスロットブロット実験（以下）のために使用した。急性に解離された細胞を、上記のように、尾側の神経管からのE10.5細胞の酵素学的消化および磨砕後に得た。個々のＮＥＰ細胞を同定し、そして視覚的な制御下、２μlの逆転写酵素溶液[50mM KCl、10mM Tris-HCl、5mM MgCl₂、１mMの各 dNTP、50ngオリゴ-dTプライマー、RNaseインヒビター、逆転写酵素（SUPERSCRIP T II、GIBCO/BRL）］を含有するピペット中に注意深く吸引した。次いで、ピペットの成分を20μlの逆転写酵素溶液を含有するチューブに移し、そして42℃で１時間、インキュベートした。このｃＤＮＡの10分の１を、表10に列挙される特異的なプライマーを使用して、その後のＰＣＲ反応について使用した。ＥＧＲ−Ｒは、切片および解離された細胞において、ＰＣＲおよび免疫細胞化学のいずれによっても検出され得なかった。ＥＧＦ−Ｒが、星状膠細胞、ニューロン、および希突起膠細胞培養物において容易に検出されたので、ＥＧＲ−Ｒを検出できないことは、方法の感度に起因し得なかった。従って、ＮＥＰ細胞は、それらがＥＧＦ−Ｒ（erbB-1）を欠損するので、外因性のEGRに反応しない。実施例27E10.5 神経上皮は、複数のＦＧＦレセプター（ＦＧＦＲ）型を発現する実施例25および26の結果は、ＦＧＦは、ＮＥＰ幹細胞についての重要な分裂促進因子であったが、ＥＧＦまたは試験した任意の他の分裂促進因子は、そうではなかったことを示した。ＦＧＦレセプターは、ＦＧＦの効果を媒介することを決定するために、個々のＦＧＦＲの発現を、大量培養においておよび単一の細胞分析によっての両方で、評価した。４つの主要なＦＧＦレセプターの発現、ならびにそれらのスプライス改変体を、ＰＣＲおよびスプライス特異的制限消化によって試験した。ＰＣＲプライマーを設計して、ＦＧＦ−Ｒ−１およびＦＧＦ−Ｒ− ３がらのエキソンIIIの遠位半分を含む、各レセプターの領域を増幅した。ＦＧＦ−Ｒ−２について、個々のプライマーを設計して、beck（IIIcイソ形態）またはKGFR（IIIbイソ形態）のいずれかを、技術的理由のために特異的に増幅した。ＦＧＦ-Ｒ４がこの領域において選択的にスプライスされないので、プライマーの単一のセットを、ＦＧＦ-Ｒ４について使用した。プライマー配列を、表10において列挙する。これらの条件下で、ＰＣＲは、予測される大きさの産物を増幅し、そしてそれらの同一性を、配列分析によって確認した。配列分析を、当該分野において周知の方法に従って、ＰＣＲフラグメントをpBLUES SCRIPT KS+（Str atagene、La Jolla、California）をクローニングし、そしてジデオキシ法により配列決定することによって行った。ＦＧＦ−Ｒ−１、ＦＧＦ−Ｒ−３、およびＦＧＦ-Ｒ４、ならびにＦＧＦ−Ｒ−２のIIIcイソ形態が存在した。beckイソ型は、存在せず、およびさらなる増幅サイクル後であっても検出され得なかったが、beckイソ型は、同じ段階での、全胚から容易に検出された。ＦＧＦＲ−１およびＦＧＦＲ−３のIIIb形態とIIIc形態とを区別するために、制限消化反応を、両方のレセプターの各形態に特異的な酵素を使用して、ＰＣＲ産物に対して行った。IIIb特異的ＰＣＲ産物と、IIIc特異的ＰＣＲ産物とを区別するために、制限エンドヌクレアーゼ消化を、製造業者の指示に従って、ＦＧＦＲ−１についてVspI（GIBCO/BRL）およびAccI（GIBCO/BRL）、ならびにＦＧＦＲ −３についてBaII（GIBCO/BRL）およびBspMI（New England Biolabs）を用いて行った。VspIおよびBaIIエンドヌクレアーゼは、それぞれ、ＦＧＦＲ−１およびＦＧＦＲ−３のIIIb改変体からの増幅化産物を単独で切断し、ならびにAccIおよびBspMI酵素は、それぞれ、ＦＧＦＲ−１およびＦＧＦＲ−３のIIIc改変体からの増幅産物を単独で切断する。得られるフラグメントを、1.5%アガロースゲルにおいて分離し、エチジウムブロマイドで染色し、そしてUV照射のもとで写真撮影した。ＦＧＦＲ−１およびＦＧＦＲ−３のIIIc形態について特異的な酵素のみが、E1 0.5神経上皮から増幅される産物を消化する。IIIbイソ型のみが、E10.5神経管または培養したＮＥＰ細胞において、検出され得た。IIIbイソ型は、皮膚に存在し、このことは、アッセイの信頼性を実証する。従って、ＮＥＰ細胞は、ＦＧＦＲレセプターの拘束されたサブセットを発現し、ＦＧＦＲ−１（IIIc）、bek、ＦＧＦＲ−３（IIIc）、およびＦＧＦＲ４は全て発現されるが、ＦＧＦＲ−１、ＦＧＦＲ−２（KGFR）、およびＦＧＦＲ−３のIIIb形態は発現されない。実施例28E10.5 での個々のＮＥＰ細胞は、ＦＧＦレセプターの同じサブセットを発現するＮＥＰ細胞は、それらの形態学、分化可能性、および発現される抗原において均質であることが、本明細書中で以前に示された。ＮＥＰ細胞によって発現されるＦＧＦ−ＲについてのＲＴ−ＰＣＲの大量培養での結果は、複数のＦＧＦ−Ｒ細胞が、個々のＮＥＰ細胞によって発現されることを示唆した。しかし、個々のＮＥＰ細胞が、不均質であり、および大量培養において検出されるＦＧＦ−Ｒのサブセットを発現することが可能であった。単一のＮＥＰ細胞が、全ての４つのＦＧＦ−Ｒを発現するか否かを評価するために、ＮＥＰ細胞を低密度でプレートし、そして顕微鏡制御下で、吸引によって、単一の細胞を単離した。単一の細胞のｃＤＮＡを、標識化ヌクレオチドを使用して個々の細胞から調製し、そして標識化ｃＤＮＡを、当該分野において周知の方法に従って、ＦＧＦ−ＲｃＤＮＡ、アクチン、およびＧＦＡＰを含有するスロットブロットにハイブリダイズした。簡潔には、等モル量のラットＦＧＦ−Ｒ−１、２（bek）、３、および４、ならびにβ-アクチン（ポジティブコントロールのために）およびＧＦＡＰ（ネガティブコントロールのために）を、変性条件下で10分間インキュベーションした後に、ZETA-PROBEメンブレン（Biorad、Richmond、California）に対してブロットした。次いで、これらを、T7 RNAポリメラーゼを使用してＦＧＦ−Ｒプラスミドのそれぞれから転写した10⁶−10⁶cpmRNAプローブで、個々にプローブした。ハイブリダイゼーション混合液は、５×SSC、２×デンハルト溶液、50%ホルムアミド、および100μg/ml酵母ｔＲＮＡを含んだ。61℃での４時間のプレハイブリダイゼーションおよび一晩のハイブリダイゼーションの後、２×SSC/0.2% SDSの最終濃度でブロットを洗浄し、そしてオートラジオグラムフィルムに、12時間、増感スクリーンとともに露光した。ストリンジェンシーのこのレベルで、個々のプローブと、任意の他のＦＧＦ−Ｒとの交差ハイブリダイゼーションはほとんどまたは全くなかった。単一の細胞分析について、個々の細胞を同定し、そして上記のように、２μl の逆転写酵素混合物を含有するピペットに、注意深く吸引した。１本鎖ｃＤＮＡ合成後、第２鎖を、100mM KCl、20mM Tris-HCl、５mM MgCl₂、10mM硫酸アンモニウム、１mM ATP、５μg BSA、１ユニットのＴ４リガーゼ、１ユニットのRNase H 、および20ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ１を含有する溶液（最終容量80 μl）をＲＴ反応に添加することによって合成した。次いで、全混合物を、12℃ で１時間、次いで、22℃で１時間、インキュベートし、次いで、10ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよび10ユニットのＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントの添加を伴って、平滑末端化した。次いで、エタノール沈殿、フェノール−クロロホルム抽出、および滴定分析によって２本鎖ｃＤＮＡを精製した。ＲＮＡを、20μlの総容量中の４μlの転写緩衝液（GIBCO/BRL；200mM Tris-HCl、p H8.0、40mM MgCl2、10mMスペルミジン-(HCl)₃、125mM NaCl）、 10mM DTT、0.5mM各rNTP、20ユニットのRNaseインヒビター、５μl ｃＤＮＡ鋳型、2000ユニットのT7 RNAポリメラーゼ、および50mCiの32P-α-CTPを使用して合成した。次いで、反応物を、37℃で４時間インキュベートし、次いでエタノール沈殿した。次いで、以前に作製したスロットブロットに対して個々のＦＧＦレセプターを検出するためのプローブとして、このＲＮＡを使用した。単一の細胞からの標識化プローブは、ＦＧＦＲ−１、ＦＧＦＲ−２、ＦＧＦＲ −３、およびＦＧＦＲ４に特異的なハイブリダイゼーションを示したが、ＧＦＡＰに対して示さず、これはＮＥＰ細胞において検出可能でなくおよびネガティブコントロールとして作用した。分析した全ての単一の細胞（ｎ＝５）は、全ての４つのＦＧＦＲを発現し、このことは、大量培養の結果が、単一の細胞において見られるプロフィールを反映することを示した。ＦＧＦの結果が、密接に関連されるＦＧＦＲ配列に対する、標識化プローブの交差反応に起因することを除外するために、放射標識化プローブを調製し、そしてスロットブロットにおいてハイブリダイズした。個々のＦＧＦＲに対するプローブは、実験の条件下で有意な交差ハイブリダイゼーションを全く示さなかった。これらのコントロール実験の結果は、E10.5神経上皮の個々の細胞による、全ての４つのレセプターの発現を確認する。実施例29ＦＧＦＲ−１の長いイソ型のみを発現する神経上皮幹細胞 IIIbおよびTIIcイソ型に加えて、選択的スプライシングは、２または３つのIg 様ドメインを有するＦＧＦ−Ｒ−１分子（それぞれ、「短い」または「長い」形態と呼ばれる）を生成する。J．Houら、肝臓からの線維芽細胞増殖因子レセプターは、３つの構造ドメインにおいて異なる、251 Science 665-668（1991）；Joh nson & Williams、前出。これらのイソ型の特異的な発現の生物学的な重要性は、未だ明らかでないが、ＦＧＦ−Ｒ１の長いイソ型が、各周囲の場所に輸送されるが、短いイソ型は、輸送されない。I.A．Prodovskyら、細胞外線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）-1の核輸送は、ＦＧＦレセプター-1aイソ型の核周囲の会合と相関するが、ＦＧＦレセプター-1Bイソ型の核周囲の会合とは相関しない、 271 J．Biol．Chem．14198-14205（1995）。さらに、ガンのいくつかのタイプの実験は、ＦＧＦ−Ｒ−１の短い形態の優先的な発現を示し、悪性の程度は、発現される短いおよび長いイソ型の割合と相関した。F.Penault-Llorcaら、ヒト乳ガンにおけるＦＧＦおよびＦＧＦレセプターの発現、61 Int．J．Cancer-170-176 （1995）；これらの知見は、ＦＧＦ−Ｒ−１イソ型の特異的な発現が、それらが発現される細胞の増殖潜在性を調節するにおいて重要であることを示唆する。どのＦＧＦ−Ｒ−１の形態が、E10.5 ＮＥＰ細胞において発現されるのかを決定するために、第２および第３のIg様ドメインを含むＦＧＦ−Ｒ−１の細胞外ドメインを増幅するプライマーを設計した。1kb産物は、長い形態の発現を示したが、732bp産物は、短いイソ型の転写物から増殖された。星状膠細胞、および悪性グリア細胞は、長いおよび短いイソ型の両方、ならびに200bp欠失を伴う第３のイソ型を発現した。対照的に、ＮＥＰ細胞は、ＦＧＦ−Ｒ−１の長い形態のみを発現する。これらの結果は、これらの細胞における増殖のために重要であるのは、ＦＧＦ−Ｒ−１レセプターの短い形態ではないことを示唆する。実施例30ＮＥＰ細胞は、複数のＦＧＦレセプターを種々のレベルで発現するＦＧＦリガンドは、大部分のＦＧＦレセプターを活性化し得るが、胚発生の間のいくつかのＦＧＦＲの同時発現は、各レセプターによって媒介されるシグナルの異なる機能を示唆する。ＮＥＰ細胞におけるＦＧＦ−Ｒ発現の相対的なレベルを評価するために、単一のＰＣＲプライマー対を設計して、４つのＦＧＦ−Ｒのそれぞれのチロシンキナーゼドメインにおける保存されていた配列を増幅した。このドメインは、種にわたって（ラット、マウス、およびヒト）、ならびにレセプターにわたっての両方で、非常に保存された。単一のプライマー対を使用して、全ての発現されたレセプターの組合せの341bp産物を増幅した。次いで、制限消化分析を行い、４つのレセプターを区別した。使用した酵素および消化した産物の予測される大きさを、表11に列挙する。次いで、サンプルを、10%非変性1×TBEポリアクリルアミドゲルにおいて分離した。次いで、エチジウムブロマイドでゲルを染色し、そして画像を、Kodack Dlgital Science Cameraを使用して捕獲した。Kodack DSプログラムを使用して、各バンドの相対的な強度を計算した。ＮＥＰ細胞における各レセプターの相対的な発現レベルの予備的な研究において、ＦＧＦＲ４は、発現量が最も少ないレセプターである。実施例31ＦＧＦ−ＲおよびＥＧＦ−Ｒレセプター発現は、ＮＥＰ細胞の成熟の間に変化する本明細書中で示される結果は、ＥＧＦ−Ｒが、ＮＥＰ幹細胞によって発現されないことを示した。しかし、ＥＧＦ−Ｒは、発生において、後に複数の細胞型によって発現されることが示されている。それゆえ、ＮＥＰ細胞の分化された子孫を、ＥＧＦ発現について実験した。ＮＥＰ細胞およびＯ２Ａ前駆体細胞は、検出可能なレベルのＥＧＦ−Ｒを発現しなかった。対照的にＮＲＰ、ニューロン、および星状膠細胞は、ＥＧＦ−Ｒを発現した。従って、細胞は、分化の直ぐ後の培養において、ＥＧＦ−Ｒ発現を獲得し、これはインビボでのＥＧＦ−Ｒの発現の時機と一致する。ＮＥＰ細胞に対するＦＧＦ−Ｒ発現をまた、分化された子孫におけるＦＧＦ− Ｒのパターンと比較した。ＮＥＰ細胞、ＮＣＡＭ⁺神経芽細胞、星状膠細胞、および希突起膠細胞を、初期の発生の段階で採集し、そして精製した集団を、特異的な抗体選択によって得た。ＦＧＦ−Ｒ発現を、複数の独立したｃＤＮＡ調製物を用いて、上記のように試験した。ＮＥＰ細胞は、分析した全ての細胞の中で、ＦＧＦ−Ｒの最も広いスペクトルを有し、および各分化された表現型は、これらのレセプターのより小さなサブセットを発現した。実施例32高密度でプレートされる場合、ＮＥＰ細胞は、ＦＧＦを合成せず、および外因性ＦＧＦを必要としない酸性ＦＧＦおよび塩基性ＦＧＦの両方が、発生する神経管の細胞によって合成されることが、当該分野において知られる。本明細書中に示される結果は、この段階で、神経管が、ＮＥＰ幹細胞の均質な集団であることを示唆する。これは、ＮＥＰ細胞が、複数のＦＧＦ−Ｒを発現するのみでなく、これらがまた適切なリガンドを合成する可能性を生じる。この可能性を試験するために、ＮＥＰ細胞を、実施例１の手順に従って、E10.5神経管から単離し、そして実施例26の方法に従って、ＦＧＦ1およびＦＧＦ2発現について、ＲＴ−ＰＣＲによって試験した。ＦＧＦ1およびＦＧＦ2の両方が、ＮＥＰ細胞に存在した。ＰＣＲ産物の特異性を、制限消化によって、および増幅した産物の配列決定によって、確認し、In Sit uハイブリダイゼーションによって示されるＦＧＦ発現が、ＮＥＰ細胞における発現に起因することを確認した。合成されたＦＧＦが、ＦＧＦ−Ｒを活性化するのに利用可能であるか否か、およびＮＥＰ細胞増殖を維持するか否かを決定するために、ＮＥＰ細胞を、ＦＧＦの不在下で、異なる密度でプレートし、そしてＢＲＤＵ取込みを測定した。高密度でのプレート化は、細胞増殖に対するＦＧＦの効果を模倣し、そしてこのような高密度で、実質的に全ての細胞が、アッセイされた期間で分裂した。高密度の効果が、外因性ＦＧＦに起因するか否かを試験するために、ＢＲＤＵ取込みに対するＦＧＦの効果を、ｂＦＧＦに対する中和化抗体の存在下で評価した。ｂＦＧＦに対する中和化抗体は、50%まで（最大用量で）増殖を減少し、そしてこの効果は、過剰な酸性ＦＧＦの添加によって拮抗され得、このことは、増殖応答の少なくとも一部が、ＦＧＦに起因することを示した。酸性ＦＧＦおよび塩基性ＦＧＦの両方への中和化抗体の添加は、増殖速度をさらに減少せず、このことは、他の分裂促進因子が分泌されたか、またはＦＧＦがその有糸分裂効果のために放出される必要がなかったのかのいずれかを示唆する。L．Shermanら、初期のトリ胚におけるｂＦＧＦの複数の形態の発現、および神経冠細胞拘束におけるそれらの潜在的な役割、638 Ann．N.Y．Acad．Sci．4 70-473（1991）。ＦＧＦは、神経管誘導において、ならびに多様な細胞型の生存および増幅において、重要であることが示されている。T.M．Lamb & R.M．Harland、線維芽細胞増殖因子は、直接的な神経誘導因子であり、nogginと組合わされて、前側および後側神経パターンを生成する、121 Development 3627-3636（1995）；K．Launay ら、短縮されたＦＧＦレセプターは、外因性アフリカツメガエル誘導因子による神経誘導をブロックする、122 Development 869-880（1996）：M．Murphyら、線維芽細胞増殖因子は、神経前駆体細胞の増殖および分化を刺激する、25 J．Neur osci．RES．463-475（1990）；P．Walickeら、線維芽細胞増殖因子は、生存または解離された海馬ニューロンを促進し、および神経突起伸長を増強する、84 Pro c．Nat'l Acad Sci．USA 5459-5463（1986）。本明細書中に示される結果は、これらの観察を拡張し、およびＦＧＦが、幹細胞増殖および分化において重要であることを示す。ＮＥＰ細胞は、ＦＧＦ−Ｒのサブセットを発現したが、ＥＧＦ− ＲおよびＰＤＧＲ−Ｒを発現しない。ＮＥＰ細胞におけるＦＧＦ−Ｒの発現のパターンは、ＮＲＰ、ＧＲＰ、希突起膠細胞、および星状膠細胞における発現のパターンとは異なる。本発明の結果はさらに、ＮＥＰ細胞が、適切なレセプターの発現に加えて、酸性および塩基性ＦＧＦの両方を合成すること、ならびに自己分泌ループが、外因的に添加されるＦＧＦに依存しない細胞性生存を許容することを示す。本明細書中で示される重要な観察は、ＮＥＰ細胞が、ＥＧＦ−Ｒを発現しないことである。ＥＧＦ−Ｒ発現が、免疫細胞化学およびＰＣＲの両方によって、他の細胞型において容易に検出されたので、ＥＧＦ−Ｒを検出できなかったことは、使用した方法の感度に起因しなかった。ＮＥＰ細胞に対するＥＧＦ−Ｒ発現の不在は、これらの結果と一致する。ＥＧＦ単独は、胚脊髄幹細胞増殖または生存に対する効果を有しなかった。最近のIn Situハイブリダイゼーションデータはまた、ＥＧＦ−Ｒ発現が、発生の後期の段階においてのみ観察されることを示唆する。本発明の結果はまた、ＥＧＦ−Ｒノックアウトマウスからの結果（幹細胞増殖および生存において異常を全く示さないが、これは後期の発生段階での皮質発育異常を示す）と一致する。これらの結果は、皮質ＥＧＦ依存性の神経球細胞とＦＧＦ依存性のＮＥＰ幹細胞との区別を明らかに説明する。V．Tropepe & D．va n der Kooy、増殖におけるＥＧＦおよびＦＧＲ−２の特異的な役割は、別々の紙型幹細胞亜集団を反映し得る、23 Soc．Neurosci．要訳、131.3（1997）；A．Re presaら、脊髄におけるｂＦＧＦ応答性の幹細胞とＥＧＦ応答性の幹細胞との間に系統関係は存在するのか？、23 Soc．Neurosci.要訳131.14（1997）。これらの結果はまた、ＰＤＧＦＲαおよびβが、ＮＥＰ細胞に存在しないが、神経芽細胞およびグリア芽細胞は、発生の後期の段階で、これらのレセプターを発現することを示す。K.K．Joheら、単一の因子は、胎児および成体の中枢神経からの幹細胞の分化を指向する、10 Genes Dev．3129-3140（1996）；N.P．Prin gleら、ラットＣＮＳにおけるＰＤＧＦレセプター：後期神経形成の間に、ＰＤＧＦα-レセプター発現は、希突起膠細胞系統のグリア細胞に制限される（115 D evelopment 535-551（1992）；B.P．Williamsら、ＰＤＧＦ調節性の迅速な初期遺伝子応答は、腹側帯域前駆体細胞における神経分化を開始する、18 Neuron 55 3-562（1997））、およびＰＤＧＦがＮＥＰ細胞に対して効果を有しないという本発明の結果に一致する。ＰＤＧＦは、前駆体細胞分化をニューロンに誘導するための指導的な分子として、皮質幹細胞（おそらく、神経球細胞）に対して作用することが以前に示された。E.J．Williamら、ＦＧＦレセプターの活性化は、L1 、ＮＣＡＭ、およびN-Cadherinによって刺激される神経突起成長の基底をなす、 13 Neuron 583-5974（1994）。ＰＤＧＦ−Ｒの不在はさらに、ＮＥＰ細胞と皮質ＥＧＦ依存性の神経球との間の差異を説明する。本発明の結果は、ＥＧＦ依存性の神経球の栄養要求性における以前の結果と合わせて、２つの異なるクラスの幹細胞が、尾側神経管に存在するという証拠をさらに提供する。胚発生において初期に存在し、そして成体動物において少数で生存するＥＧＦ依存性のＥＧＦ−Ｒネガティブな幹細胞（J．Santa-Olalla & L．Covarrubias、表皮増殖因子（EF）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ-α）、および塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）は、マウス胚中脳の神経前駆細胞を異なって影響する、42 J．Nurosci．Res．172-183（1995））、および胚発生の後期に存在し、そしてまた、成体細胞において検出され得るＥＧＦ反応性の幹細胞。同じく重要なことは、本発明の結果は、ＥＧＦ−Ｒ免疫反応性が、幹細胞の異なる集団を選択するために使用され得ることを示唆することである。これらの結果が、皮質について一般化され得るか否かは、未だ決定されていないが、ＥＧＦ依存性幹細胞およびＦＧＦ依存性幹細胞の両方が、成体動物において記載されている。ＥＧＦは、ＮＥＰ細胞に対して効果を有さず、およびＮＥＰ細胞は、ＥＧＦ− Ｒを発現しないが、いくつかの異なるＦＧＦ−Ｒが検出可能である。ＦＧＦ−Ｒ −１〜３およびＦＧＦ−Ｒ４のIIIcイソ型は全て、ＮＥＰ細胞に存在する。ＦＧＦ−Ｒの相対的なレベルの分析はさらに、ＦＧＦ−Ｒ−２が最も豊富であることを示唆する。これらの結果は、マウスにおいてＦＧＦ−Ｒ−１およびＦＧＦ−Ｒ −２が、E8.5で発現される（ラットにおけるE10.5に等しい）ことを示すIn Situ 実験と一致する。ＦＧＦ−Ｒ−３はまた、発生する脊髄の腹側帯域（増幅するＮＥＰ細胞が存在する部位）において発現され、本発明の結果の独立した確認を提供する。ＦＧＦ-Ｒ４の発現は、発生する神経系において記載されていなかった。しかし、ＦＧＦ-Ｒ４についてのタンパク質およびメッセージの両方が、培養した神経上皮細胞において検出され得ることが本明細書中で示された。より最近の報告は、成体脳においておよびキンカチョウ胚の発生する神経系において、ＦＧＦ-Ｒ４の発現を報告した。B．Thisseら、新規なＦＧＦレセプター（Z−ＦＧＦＲ４）は、初期のキンカチョウ胚形成の間に、中胚葉および神経外胚葉において活発に発現される、203 Dev．Dynamics 377-391（1995）。ＥＳ細胞分化におけるＦＧＦ-Ｒ４発現の発現を試験する研究は、これらの観察と一致する。ＥＳ細胞株のニューロン分化は、ＦＧＦ-Ｒ４レセプターの増加されるレベルを生じる。ＮＥＰ細胞におけるＦＧＦ-Ｒ４の存在、および分化された子孫における不在は、幹細胞の精製した集団を単離するために使用され得るＮＥＰ細胞についての独特のマーカーを同定する。ＮＥＰ細胞および分化された子孫におけるＦＧＦレセプターの発現の比較は、ＮＥＰ細胞が、ＦＧＦ−Ｒイソ型の大きなサブセットを発現するが、各異なるサブタイプはこれらのレセプターのサブセットを発現することを示唆する。ＧＲＰに対するＦＧＦ−Ｒのスペクトルに対する本発明の結果は、Ｏ２Ａ前駆体に存在するＦＧＦ−Ｒに対して以前に報告された結果（Bansalら、希突起膠細胞系統におけるＦＧＦレセプターの調製、7 Mol.Cell Neurosci．263-275（1996））に類似する。ＦＧＦ−Ｒ−３発現は、発生の後期の段階で、ニューロンに局在化された。K．Petersら、マウス器官形成の間のＦＧＦレセプター3遺伝子の独特な発現パターン、155 Dev．Biol．423-430（1993）。本発明の結果は、これらの結果を拡張し、ニューロン前駆体がＦＧＦ−Ｒ−３をまた発現することを示す。レセプターのサブセットの段階特異的発現は、ＦＧＦに対する段階特異的応答が、異なるＦＧＦリガンドではなく発現されるレセプターの補足によって媒介され得るという可能性を生じる。推測であるが、細胞のこれらの集団を単離する能力は、この可能性に直接的に取り組むことを許容する。等しく重要に、発現されるＦＧＦ −Ｒのサブセットによって細胞を型分けする能力は、細胞型特定についてのさらなる独立したマーカーを提供する。実際、ＦＧＦ-3発現は、２型星状膠細胞から１型星状膠細胞を区別するために使用された。レセプターの種々のサブタイプの結合親和性が、直接的に比較された。Ormiz ら、前出。異なるＦＧＦレセプターイソ型の結合特性についてのいくつかの論議が存在するが（M.Mathieuら、マウス線維芽細胞増殖因子のレセプター結合および分裂促進的特性、3、270 J．Biol．Chem．24197-24203（1995）；Ornizら、前出；J．Partanenら、異なる発現パターンを有するＦＧＦＲ４、新規な酸性線維芽細胞増殖因子レセプター、10 EMBO J．1347-1354（1991））、ＮＥＰ細胞におけるＦＧＦ−Ｒ１、２、および３のIIIcイソ型の発現のパターンは、酸性および塩基性ＦＧＦが、ＮＥＰ細胞についての最も良好な分裂促進因子であることを示唆する。ＦＧＦ３およびＦＧＦ７は、IIIbイソ型に優先的に結合し、重要でないようである。実際、発現分析は、ＮＥＰ細胞に存在するレセプターのサブセットを優先的に活性化するＦＧＦのうちの２つが、発生の適切な時間で発現されることを示す。ＦＧＦ1およびＦＧＦ2発現の本発明の分析は、ＮＥＰ細胞が両方のリガンドを合成することを示す。リガンドの濃度は、外因的に添加されるＦＧＦに独立してＮＥＰ細胞増殖を維持するのに十分であり、またｂＦＧＦに対する抗体阻害は、細胞分裂を減少させる。従って、自己分泌ループは、前駆体細胞数を調節するためにインビボで存在するようである。ＦＧＦレセプターは、複数のシグナル経路の下流を活性化し、ならびに活性化される特定の下流のシグナルは、存在するリガンド、発現されるレセプターサブタイプに対する結合親和性、および細胞の分化の状態に依存する。本発明の結果は、ＦＧＦが、脊髄幹細胞の増殖および分化の重要な調節因子であることを示す。ＦＧＦの作用は、複数のＦＧＦ−Ｒによって媒介され、およびＦＧＦの作用の特異性は、特定の細胞型によって発現されるレセプターの特定のサブセットに起因するようである。まとめると、神経上皮幹細胞分化の調節におけるＥＧＦおよびＦＧＦの役割を特徴付けるために、ＮＥＰならびにそれらの誘導体によるＦＧＦ、ＥＧＦ、およびそれらのレセプターの発現、を実験した。精製された培養物または単一の細胞からのｃＤＮＡを用いる逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、未分化の神経上皮細胞が、ＦＧＦレセプターイソ型のサブセットを発現するが、ＥＧＦ-R（erb-1）を発現しないことが示された。分化されたニューロンおよびグリア細胞のＦＧＦレセプターの発現のパターンと、神経上皮細胞のＦＧＦレセプターの発現のパターンとの比較は、ＦＧＦ-Ｒ４が、神経上皮細胞において独特に発現されることを示唆する。ＦＧＦ-Ｒ−１は、神経上皮細胞によって発現され、およびその発現はニューロンによって維持されるが、ＦＧＦ−Ｒ −２はダウンレギュレートされる。分化したばかりの星状膠細胞、希突起膠細胞、およびＧＲＰ細胞におけるＦＧＦレセプターの発現のパターンは、神経上皮細胞およびニューロンのＦＧＦレセプターの発現のパターンとは異なる。ＮＥＰ細胞によるＦＧＦおよびＥＧＥの発現をまた実験した。ＮＥＰ細胞は、検出可能なレベルのＦＧＦ1およびＦＧＦ2の両方を発現するが、検出可能なレベルのＥＧＦを発現しない。ＦＧＦ-1およびＦＧＦ-2の発現は、高密度での細胞増殖が、それらの生存のためにＦＧＦを必要とせず、およびＦＧＦに対する中和化抗体の存在下での細胞増殖は、細胞生存および分裂の減少を示すので、生物学的に有意味である。従って、神経上皮細胞は、ＦＧＦを合成し、これに応答するが、ＥＧＦを合成せずまたこれに応答せず、ならびにＥＧＦ神経球とは異なる。ＦＧＦイソ型のそれらの発現のパターンは、それらのより分化された子孫からＮＥＰ細胞を区別するために作用し得る。本明細書中に引用され、および以前に明白に参考として援用されなかった参考文献の全ては、本明細書中に参考として援用される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年４月２日（１９９９．４．２）【補正内容】請求の範囲１．哺乳類神経上皮幹細胞の単離された純粋な集団であって、該細胞が接着支持細胞非依存性培養培地中で自己再生することができ、かつＣＮＳニューロン細胞又はＣＮＳグリア細胞、及び神経冠幹細胞に分化することができる、前記集団。２．神経上皮幹細胞がヒト並びに非ヒト霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ及びウサギからなる群から選択された１種の哺乳類から単離される、請求項１に記載の集団。３．神経上皮幹細胞がネスチンを発現するが、Ｎ-ＣＡＭ^-、ＧＦＡＰ^-、Ｏ4^- 、ＮＦ^-、ＣｈＡＴ^-、β-IIIチューブリンー、Ａ2Ｂ5^-、及びGalC^-である、請求項１に記載の集団。４．ＣＮＳニューロン細胞がβ-IIIチューブリン⁺及びＮＦ⁺である、請求項１に記載の集団。５．ＣＮＳニューロン細胞がＣｈＡＴ⁺である、請求項４に記載の集団。６．ＣＮＳグリア細胞がＧＦＡＰ⁺である、請求項１に記載の集団。７．ＣＮＳグリア細胞がＡ2Ｂ5⁺である、請求項６に記載の集団。８．ＣＮＳグリア細胞がＡ2Ｂ5⁺である、請求項１に記載の集団。９．ＣＮＳグリア細胞がＯ4⁺である、請求項８に記載の集団。１０．ＣＮＳグリア細胞がGalC⁺である、請求項８に記載の集団。１１．神経上皮幹細胞がグリア限定前駆細胞に更に分化することができる、請求項１に記載の集団。１２．グリア限定前駆細胞が接着支持細胞非依存性培養培地中で自己再生することができ、かつＣＮＳグリア細胞には分化できるがＣＮＳニューロン細胞には分化できない、請求項１１に記載の集団。１３．グリア限定前駆細胞がネスチンを発現しそしてＡ2Ｂ5⁺であり、かつＧＦＡＰ⁺、Ｏ4^-及びGalC^-である、請求項１２に記載の集団。１４．ＣＮＳグリア細胞がＡ2Ｂ5⁺及びＧＦＡＰ⁺である、請求項１２に記載の集団。１５．ＣＮＳグリア細胞がＧＦＡＰ⁺であり、かつＡ2Ｂ5⁺である、請求項１２に記載の集団。１６．ＣＮＳグリア細胞がGalC⁺であり、かつＡ2Ｂ5⁺である、請求項１２に記載の集団。１７．哺乳類ＣＮＳグリア限定前駆体細胞の単離された純粋な集団であって、該グリア限定前駆細胞が接着支持細胞非依存性培養培地中で自己再生することができ、かつＣＮＳグリア細胞には分化できるがＣＮＳニューロン細胞には分化できない、前記集団。１８．グリア限定前駆細胞がネスチンを発現し、Ａ2Ｂ5⁺であり、かつ、ＧＦＡＰ^-、Ｏ4^-及びGalC^-である、請求項１７に記載の集団。１９．ＣＮＳグリア細胞がＡ2Ｂ5⁺及びＧＦＡＰ⁺である、請求項１７に記載の集団。２０．ＣＮＳグリア細胞がＧＦＡＰ⁺であり、かつＡ2Ｂ5^-である、請求項１７に記載の集団。２１．ＣＮＳグリア細胞がGalC⁺であり、かつＡ2Ｂ5^-である、請求項１７に記載の集団。２２．哺乳類ＣＮＳ神経上皮幹細胞の純粋な集団を単離する方法であって、該細胞が支持細胞非依存性接着培養培地中で自己再生することができ、該ＣＮＳニューロン細胞又はＣＮＳグリア細胞に分化することができる、該方法において、（ａ）神経管の閉鎖後であるが神経管内で細胞が分化する前の胚発生段階で哺乳類の胚から神経管を取り出す工程；（ｂ）哺乳類の胚から取り出した神経管を含んでいる細胞を分離する工程; （ｃ）基層上であって、かつ有効量の線維芽細胞増殖因子及びニワトリ胚抽出物を含む、神経上皮幹細胞の接着増殖を支持すべく調製された培地中に分離した細胞を播種し、支持細胞非依存性培養する工程;及び（ｄ）神経上皮幹細胞の増殖を誘導する温度及び雰囲気中で上記の播種細胞をインキュベートする工程を含む、前記方法。２３．哺乳類の胚が霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ及びウサギからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。２４．基層がフィブロネクチンを含む、請求項２２に記載の方法。２５．温度が約３７℃であり、かつ、雰囲気が約５％のＣＯ₂と約95％の空気を含む、請求項２２に記載の方法。２６．培地がＮＥＰ培地を含む、請求項２２に記載の方法。２７．哺乳類ＣＮＳグリア限定前駆細胞の純粋な集団を単離する方法であって、該細胞が接着支持細胞非依存性培養培地中で自己再生することができ、かつ、ＣＮＳグリア細胞には分化できるがＣＮＳニューロン細胞には分化できない該方法において、（ａ）哺乳類ＣＮＳ神経上皮幹細胞の集団を単離する工程；（ｂ）神経上皮幹細胞が分化を開始するのに十分な期間、有効量のニワトリ胚抽出物を欠いている培地中で該細胞をインキュベートする工程；（ｃ）インキュベートした細胞をグリア限定前駆細胞に特徴的な抗体を使用する特異的な抗体捕獲に付して、捕獲された細胞亜集団を生じさせる工程;そして（ｄ）捕獲細胞亜集団を、有効量の線維芽細胞増殖因子及び血小板由来増殖因子を含み、該集団の接着増殖を支持すべく調製された培地中でインキュベートする工程を含む、前記方法。２８．ＣＮＳ神経上皮幹細胞集団の単離が：（１）神経管の閉鎖後であるが神経管内で細胞が分化する前の胚発生段階で哺乳類の胚から神経管を取り出す工程；（２）哺乳類の胚から取り出した神経管を含んでいる細胞を分離する工程; （３）基層上に、かつ有効量の線維芽細胞増殖因子及びニワトリ胚抽出物を含み、神経上皮幹細胞の接着増殖を支持すべく調製された培地中に分離した細胞を播種し、支持細胞非依存性培養する工程;そして（４）神経上皮幹細胞の増殖を誘導する温度及び雰囲気中で播種細胞をインキュベートする工程を含む、請求項２７に記載の方法。２９．哺乳類の胚が霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ及びウサギからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。３０．基層がフィブロネクチンを含む、請求項２８に記載の方法。３１．温度が約37℃であり、かつ、雰囲気が約５％のＣＯ₂と約95％の空気を含む、請求項２８に記載の方法。３２．哺乳類運動ニューロンの集団を産生させる方法であって、（ａ）哺乳類ＣＮＳ神経上皮幹細胞の集団を単離する工程;及び（ｂ）細胞が分化を開始するのに十分な期間、細胞の増殖及びニューロンの分化を促進する培地中で神経上皮幹細胞をインキュベートする工程、を含む、前記方法。３３．培地がラミニン被覆プレートと、有効量のニワトリ胚抽出物を欠いているＮＥＰ培地を含む、請求項３２に記載の方法。３４．神経上皮幹細胞をインビトロで分化するように誘導し、それによって哺乳類神経冠幹細胞を産生させる工程を含む、哺乳類神経冠幹細胞の産生方法。３５．誘導が神経上皮幹細胞をラミニン被覆基質上に再播種する工程を含む、請求項３４に記載の方法。３６．誘導がマイトジェンを除去する工程を更に含む、請求項３５に記載の方法。３７．マイトジェンがＦＧＦである、請求項３６に記載の方法。３８．誘導がニワトリ胚抽出物を除去する工程を更に含む、請求項３５に記載の方法。３９．誘導がマイトジェンを除去する工程を含む、請求項３４に記載の方法。４０．マイトジェンがＦＧＦである、請求項３９に記載の方法。４１．誘導がニワトリ胚抽出物を除去する工程を含む、請求項３４に記載の方法。４２．誘導が細胞に背方化剤を添加する工程を含む、請求項３４に記載の方法。４３．背方化剤が骨形態形成タンパク質からなる群から選択される１種のメンバーである、請求項４２に記載の方法。４４．背方化剤がＢＭＰ-２である、請求項４３に記載の方法。４５．背方化剤がＢＭＰ-４である、請求項４３に記載の方法。４６．背方化剤がＢＭＰ-７である、請求項４３に記載の方法。４７．末梢神経系の細胞を産生させる方法であって、（ａ）神経上皮幹細胞をインビトロで分化するように誘導し、それによって神経冠幹細胞を産生させる工程、及び（ｂ）神経冠幹細胞をインビトロで分化するように誘導し、それによって末梢神経系細胞を産生させる工程、を含む、前記方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者メイヤー−プロッシェル，マーゴットアメリカ合衆国ユタ州84092、サンディー、エス．ヒドゥンバレーロード 12169 (72)発明者ムジタバ，ターミナアメリカ合衆国ユタ州84070、サンディー、サウス 465 イースト 11205

Claims

【特許請求の範囲】１．哺乳類神経上皮幹細胞の単離された純粋な集団であって、該細胞が接着支持細胞非依存性培養培地中で自己再生することができ、かつＣＮＳニューロン細胞又はＣＮＳグリア細胞、及び神経冠幹細胞に分化することができる、前記集団。２．神経上皮幹細胞がヒト並びに非ヒト霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ及びウサギからなる群から選択された１種の哺乳類から単離される、請求項１に記載の集団。３．神経上皮幹細胞がネスチンを発現するが、Ｎ-ＣＡＭ^-、ＧＦＡＰ^-、Ｏ4^- 、ＮＦ^-、ChAT^-、β-IIIチューブリン^-、Ａ2Ｂ5^-、及びGalC^-である、請求項１に記載の集団。４．ＣＮＳニューロン細胞がβ-IIIチューブリン⁺及び及びＮＦ⁺である、請求項１に記載の集団。５．ＣＮＳニューロン細胞がChAT⁺である、請求項４に記載の集団。６．ＣＮＳグリア細胞がＧＦＡＰ⁺である、請求項１に記載の集団。７．ＣＮＳグリア細胞がＡ2Ｂ5⁺である、請求項６に記載の集団。８．ＣＮＳグリア細胞がＡ2Ｂ5⁺である、請求項１に記載の集団。９．ＣＮＳグリア細胞がＯ4⁺である、請求項８に記載の集団。１０．ＣＮＳグリア細胞がGalC⁺である、請求項８に記載の集団。１１．神経上皮幹細胞がグリア限定前駆細胞に更に分化することができる、請求項１に記載の集団。１２．グリア限定前駆細胞が接着支持細胞非依存性培養培地中で自己再生することができ、かつＣＮＳグリア細胞には分化できるがＣＮＳニューロン細胞には分化できない、請求項１１に記載の集団。１３．グリア限定前駆細胞がネスチンを発現しそしてＡ2Ｂ５⁺であり、かつＧＦＡＰ^-、Ｏ4^-及びGalC^-である、請求項１２に記載の集団。１４．ＣＮＳグリア細胞がＡ2Ｂ5⁺及びＧＦＡＰ⁺である、請求項１２に記載の集団。１５．ＣＮＳグリア細胞がＧＦＡＰ⁺であり、かつＡ2Ｂ5^-である、請求項１２に記載の集団。１６．ＣＮＳグリア細胞がGalC⁺であり、かつＡ2Ｂ5^-である、請求項１２に記載の集団。１７．哺乳類ＣＮＳグリア限定前駆体細胞の単離された純粋な集団であって、該グリア限定前駆細胞が接着支持細胞非依存性培養培地中で自己再生することができ、かつＣＮＳグリア細胞には分化できるがＣＮＳニューロン細胞には分化できない、前記集団。１８．グリア限定前駆細胞がネスチンを発現し、Ａ2Ｂ5⁺であり、かつ、ＧＦＡＰ^-、Ｏ4^-及びGalC^-である、請求項１７に記載の集団。１９．ＣＮＳグリア細胞がＡ2Ｂ5⁺及びＧＦＡＰ⁺である、請求項１７に記載の集団。２０．ＣＮＳグリア細胞がＧＦＡＰ⁺であり、かつＡ2Ｂ5^-である、請求項１７に記載の集団。２１．ＣＮＳグリア細胞がGalC⁺であり、かつＡ2Ｂ5^-である、請求項１７に記載の集団。２２．哺乳類ＣＮＳ神経上皮幹細胞の純粋な集団を単離する方法であって、該細胞が支持細胞非依存性接着培養培地中で自己再生することができ、該ＣＮＳニューロン細胞又はＣＮＳグリア細胞に分化することができる、該方法において、（ａ）神経管の閉鎖後であるが神経管内で細胞が分化する前の胚発生段階で哺乳類の胚から神経管を取り出す工程；（ｂ）哺乳類の胚から取り出した神経管を含んでいる細胞を分離する工程; （ｃ）基層上であって、かつ有効量の線維芽細胞増殖因子及びニワトリ胚抽出物を含む、神経上皮幹細胞の接着増殖を支持すべく調製された培地中に分離した細胞を播種し、支持細胞非依存性培養する工程;及び（ｄ）神経上皮幹細胞の増殖を誘導する温度及び雰囲気中で上記の播種細胞をインキュベートする工程を含む、前記方法。２３．哺乳類の胚が霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ及びウサギからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。２４．基層がフィブロネクチンを含む、請求項２２に記載の方法。２５．温度が約37℃であり、かつ、雰囲気が約５％のＣＯ₂と約95％の空気を含む、請求項２２に記載の方法。２６．培地がＮＥＰ培地を含む、請求項２２に記載の方法。２７．哺乳類ＣＮＳグリア限定前駆細胞の純粋な集団を単離する方法であって、該細胞が接着支持細胞非依存性培養培地中で自己再生することができ、かつ、ＣＮＳグリア細胞には分化できるがＣＮＳニューロン細胞には分化できない該方法において、（ａ）哺乳類ＣＮＳ神経上皮幹細胞の集団を単離する工程；（ｂ）神経上皮幹細胞が分化を開始するのに十分な期間、有効量のニワトリ胚抽出物を欠いている培地中で該細胞をインキュベートする工程；（ｃ）インキュベートした細胞をグリア限定前駆細胞に特徴的な抗体を使用する特異的な抗体捕獲に付して、捕獲された細胞亜集団を生じさせる工程;そして（ｄ）捕獲細胞亜集団を、有効量の線維芽細胞増殖因子及び血小板由来増殖因子を含み、該集団の接着増殖を支持すべく調製された培地中でインキュベートする工程を含む、前記方法。２８．ＣＮＳ神経上皮幹細胞集団の単離が：（１）神経管の閉鎖後であるが神経管内で細胞が分化する前の胚発生段階で哺乳類の胚から神経管を取り出す工程；（２）哺乳類の胚から取り出した神経管を含んでいる細胞を分離する工程; （３）基層上に、かつ有効量の線維芽細胞増殖因子及びニワトリ胚抽出物を含み、神経上皮幹細胞の接着増殖を支持すべく調製された培地中に分離した細胞を播種し、支持細胞非依存性培養する工程;そして（４）神経上皮幹細胞の増殖を誘導する温度及び雰囲気中で播種細胞をインキュベートする工程を含む、請求項２７に記載の方法。２９．哺乳類の胚が霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ及びウサギからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。３０．基層がフィブロネクチンを含む、請求項２８に記載の方法。３１．温度が約37℃であり、かつ、雰囲気が約５％のＣＯ₂と約95％の空気を含む、請求項２８に記載の方法。３２．哺乳類運動ニューロンの集団を産生させる方法であって、（ａ）哺乳類ＣＮＳ神経上皮幹細胞の集団を単離する工程;及び（ｂ）細胞が分化を開始するのに十分な期間、細胞の増殖及びニューロンの分化を促進する培地中で神経上皮幹細胞をインキュベートする工程、を含む、前記方法。３３．培地がラミニン被覆プレートと、有効量のニワトリ胚抽出物を欠いているＮＥＰ培地を含む、請求項３２に記載の方法。３４．神経上皮幹細胞をインビトロで分化するように誘導し、それによって哺乳類神経冠幹細胞を産生させる工程を含む、哺乳類神経冠幹細胞の産生方法。３５．誘導が神経上皮幹細胞をラミニン被覆基質上に再播種する工程を含む、請求項３４に記載の方法。３６．誘導がマイトジェンを除去する工程を更に含む、請求項３５に記載の方法。３７．マイトジェンがＦＧＦである、請求項３６に記載の方法。３８．誘導がニワトリ胚抽出物を除去する工程を更に含む、請求項３５に記載の方法。３９．誘導がマイトジェンを除去する工程を含む、請求項３４に記載の方法。４０．マイトジェンがＦＧＦである、請求項３９に記載の方法。４１．誘導がニワトリ胚抽出物を除去する工程を含む、請求項３４に記載の方法。４２．誘導が細胞に背方化剤を添加する工程を含む、請求項３４に記載の方法。４３．背方化剤が骨形態形成タンパク質からなる群から選択される１種のメンバーである、請求項４２に記載の方法。４４．背方化剤がＢＭＰ-２である、請求項４３に記載の方法。４５．背方化剤がＢＭＰ-４である、請求項４３に記載の方法。４６．背方化剤がＢＭＰ-７である、請求項４３に記載の方法。４７．末梢神経系の細胞を産生させる方法であって、（ａ）神経上皮幹細胞をインビトロで分化するように誘導し、それによって神経冠幹細胞を産生させる工程、及び（ｂ）神経冠幹細胞をインビトロで分化するように誘導し、それによって末梢神経系細胞を産生させる工程、を含む、前記方法。