JP2002512618A - 悪性腫瘍の治療方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 腫瘍の治療方法における、化学療法、および非ＭＨＣ限定細胞傷害活性を特徴とする安定な細胞系の細胞を用いる細胞療法の相乗的組み合わせ剤の使用。本発明の方法は低減された量の化学療法剤が投与されることを可能にし、それにしばしば伴う副作用の低減をもたらす。

Description

【発明の詳細な説明】 悪性腫瘍の治療方法 発明の分野 本発明は、概括的には癌の治療に、そしてより具体的には薬物耐性癌の治療に 関する。 発明の背景 腫瘍性疾患を治療するための化学療法と共同しての養子移入療法の使用は養子 化学免疫療法の基礎を形成する。マウスモデルにおいて、いくつかの化学療法剤 の投与とともにのＴ細胞の養子移入は、かなりの数の腫瘍を担持する宿主を成功 裏に治療した［グリーンバーグ(P．Greenberg)ら、J．Exp．Med.、161:1122-113 4(1985)；ブックマン(M．Bookman)ら、J．Immunol.、139:3166-3170(1987)；お よびフォルネル(F．Fornelle)ら、Int．J．Cancer、42:952-957(1988)］。これ まで実施されたいくつかの臨床試験からの結果は、アドリアマイシン、マイトマ イシンもしくはシクロホスファミド治療と一緒になったＴＩＬ／ＩＬ−２療法が 、転移性もしくは原発性の肝腫瘍および黒色腫の患者における有望な治療のアプ ローチを代表することを立証した［カワタ(A．Kawata)ら、Am．J．Clin．Oncol. 、18:257-262(1995)；ローゼンバーグ(S．Rosenberg)ら、N．Engl．J．Med.、31 9:1676-1680(1988)；およびゴールド(J．Gold)ら、Eur．J．Cancer、31A:698-70 8(1995)］。併用レジメン(combined regimen)で得られる向上された抗腫瘍効果 の根底にある機構は完全には解明されていない。しかしながら、いくつかの化学 療法剤により表わされる免疫調節活性は、単剤治療に対する化学免疫療法の優位 の決定で重要な役割を演じるようである［アワド(A．Awwad)ら、Immunology、 65:87-92(1988)およびノース(R．North)、J．Exp．Med.、155:1063-1074(1982) ］。これらの臨床結果にもかかわらず、ＬＡＫもしくはＴＩＬ／ＩＬ−２療法に 伴う毒性［マルゴリン(K．Margolin)ら、J．Clin．Oncol.、7:486(1989)］、な らびにＴＩＬの調製および拡大(expansion)のための腫瘍試料の希少性［トパリ アン(S．Topalian)ら、J．Immunol．Meth.、102:127-141(1987)］は、他のアプ ローチとともにの細胞療法の使用に対する重要な制限因子である。 それが効能のためにＩＬ−２のような外因性の毒性のサイトカインの付随する投 与を必要としないため、ＬＡＫおよびＴＩＬ療法の限界を克服しうる、癌に対す る新たな養子移入戦略が開発された。このアプローチは、致死的に照射されたヒ トＴ細胞系（ＴＡＬＬ−１０４）、（ＣＤ３／ＴＣＲαβ⁺ＣＤ８⁺ＣＤ１６^-） の使用を基礎とし［セサノ(A．Cesano)ら、In Vitro Cell．Dev．Biol.、28A:64 8(1992)；セサノ(A．Cesano)ら、J．Immunol.、151:2943-2957(1993)；およびセ サノ(A．Cesano)ら、Cancer Immunol．Immunoth.、40:139(1995)］、これは、正 常組織からの細胞を助命しつつ、いくつかの種を横断する幅広い範囲の腫瘍に対 するＭＨＣに限定されない(MHC non-restricted)キラー活性を賦与される。可移 植性腫瘍をもつ免疫不全および免疫適格のマウスモデル、ならびに自発的に生じ る癌をもつイヌでの研究は、臨床設定における抗腫瘍剤としてのこの細胞系の潜 在能力を示唆する［セサノ(A．Cesano)ら、J．Clin．Invest．、94:1076(1994) ；セサノ(A．Cesano)ら、Cancer Res.、55:96(1995)；セサノ(A．Cesano)ら、Ca ncer Res.、56:3021(1996)；およびセサノ(A．Cesano)ら、Cancer Res.、56:444 4-4452(1996)］。 しかしながら、多様な形態の血液学的および非血液学的悪性腫瘍（すなわち充 実性腫瘍）の管理において近年になされた進歩にもかかわらず、外科手術、化学 療法、放射線療法および生物学的療法のような単一の治療アプローチが、腫瘍負 荷量を根絶もしくは激烈に低下させることにおいてしばしば有効でないことが明 らかになった。再発性腫瘍に至適の療法は複数の併用アプローチ(combination a pproaches)を必要とする。 当該分野において、単一形態の治療に抵抗性であり、そしてとりわけ化学療法 に抵抗性である癌の治療方法に対する要求が存在する。加えて、それ以外は有効 な抗癌化学療法レジメンの毒性の低減方法が必要とされる。 発明の要約 本発明は、哺乳動物の腫瘍の治療、および哺乳動物に対する化学療法剤の毒性 の低減の方法を提供する。 一局面において、本発明は哺乳動物の癌の治療方法を提供する。当該方法は、 哺乳動物に、化学療法剤を用いる１クールの(a course of)療法、および、非Ｍ ＨＣ限定細胞傷害活性を特徴とする細胞（好ましくはサイトカインで刺激される もしくはサイトカインで活性化される細胞）を用いる１クールの療法を共投与す ることを必要とする。驚くべきことに、発明者は、この共投与が、化学療法およ び細胞療法単独の相加的抗腫瘍効果を越える抗腫瘍効果を有することを見出した 。 別の局面において、本発明は、薬物抵抗性の癌、およびとりわけ哺乳動物の薬 物抵抗性の腫瘍の治療方法を提供する。当該方法は、哺乳動物に、化学療法剤を 用いる１クールの療法、および、非ＭＨＣ限定（non−ＭＨＣ restricted）に制 限されない細胞傷害活性を特徴とする細胞 （サイトカインに刺激される）を用いる１クールの療法を共投与することを必要 とする。望ましくは、当該細胞系は化学療法剤を用いる１クールの治療の間に投 与される。 さらに別の局面において、本発明は、哺乳動物に対する化学療法剤の毒性の低 減方法を提供する。当該方法は、哺乳動物に、化学療法剤を用いる１クールの療 法、および、非ＭＨＣ限定細胞傷害活性を特徴とするサイトカインに刺激される 細胞を用いる１クールの療法を共投与することを含む。有利には、当該細胞系お よび化学療法剤の併用効果が、当該細胞系の非存在下で必要とされるよりも少な い用量の化学療法剤が有効であることを可能にする。 本発明の他の局面および利点は、その好ましい態様の以下の詳細な記述にさら に記述される。 図面の簡単な説明 図１Ａは、それぞれ18時間の⁵¹Ｃｒ放出および18時間の³ＨＴｄＲ取り込み阻 害アッセイにおける、ＭＧＣ＃１腫瘍細胞に対するγ照射されたＴＡＬＬ−１０ ４細胞の細胞傷害および細胞増殖抑制活性を具体的に説明する。＜2.0のＳＤ値 は示されない。 図１Ｂは、ＭＧＣ＃１腫瘍細胞のインビトロの成長に対する（多様な用量の） 多様な化学療法薬物の効果を具体的に説明する。実施された３回のうち１回の代 表的実験の結果が示される。 図２は、ＰＢＳ、アドリアマイシンおよび／もしくはＴＡＬＬ−１０４細胞の ｉ．ｐ．注入を受領するＳＣＩＤマウスでのヒトＭＧＣ＃１腫瘍移植片の成長曲 線である。 発明の詳細な記述 本発明は充実性腫瘍の治療のための方法および組成物を提供する。驚くべきこ とに、発明者は、ある態様において、下に詳細に記述されるような化学療法およ び細胞療法の共投与が、相乗効果、すなわち、化学療法もしくは細胞療法単独の 相加的抗癌効果、またはそれらの相加的効果を越える抗癌効果を提供することを 見出した。他の態様においては、この共投与は、化学療法もしくは細胞療法単独 の投与を越える抗癌効果を提供する。さらに、本発明の方法は、宿主免疫系と独 立の機構により単一治療薬に対する癌の抵抗性を克服することにおいて有用であ る。本発明のなお別の利点は、それが、より低用量の化学療法剤が所望の場合は 使用されること、例えばそれに伴う所望されない副作用を低減することを可能に することである。 本発明によれば、化学療法剤を用いる１クールの化学療法が、ヒトもしくは家 畜の患者に細胞療法とともに投与される。これらの療法のそれぞれは下により詳 細に論考される。本発明の方法は、同時投与、連続投与、もしくは併用投与を提 供する。これらの投与手段は本明細書で共投与と称される。 本発明の方法は癌の治療で有用な他の療法と組み合わせられうる。本治療が疾 患のためにすでに免疫抑制されている哺乳動物に投与されうることもまた予期さ れている。ヒトもしくは家畜の患者の免疫状態の評価は当業者により容易に決定 されうる。 化学療法 化学療法剤は当業者に公知である。こうした化学療法剤の例は、アルキル化剤 、抗生物質、代謝拮抗剤、植物由来の作用物質およびホルモンを包含する。適す るアルキル化剤は、シクロホスファミド、アジリジン、 アルキルアルコンスルホネート、ニトロソ尿素のようなナイトロジェンマスター ド、ダカルバジンのような非古典的アルキル化剤、ならびにカルボプラチナおよ びシスプラチナのような白金化合物である。適する抗生物質は、ダクチノマイシ ン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、プリカマイシン、ならびにドキソルビ シン（アドリアマイシンとしてもまた知られる）およびミトキサントロンのよう なアントラサイクリンである。適する代謝拮抗剤は、メトトレキセートのような アンチフォール(antifol)、プリン類似物、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ） およびシタラビンのようなピリミジン類似物、アスパラギナーゼのような酵素、 ならびにヒドロキシ尿素のような合成剤である。適する植物由来の作用物質は、 ビンクリスチンおよびビンブラスチンのようなビンカアルカロイド、タキサン、 エトポシドのようなエピポドフィロトキシン、ならびにカンプトテカンである。 適するホルモンはステロイドである。現在のところ、好ましい薬物はアドリアマ イシンもしくはシスプラチナである。しかしながら、上で同定された作用物質群 内の付加的作用物質を包含する他の適する化学療法剤が、治療されている充実性 腫瘍の型、ヒトもしくは家畜の患者の状態などに依存して、当業者により容易に 決定されうる。 選択された化学療法剤に適する投薬量は当業者に既知である。例えば、作用物 質がアドリアマイシンである場合、適する投薬量は、１週間間隔で２回静脈内に 投与される30mg/m²を包含しうる。しかしながら、当業者は、必要とされるよう に、投与経路、受領される投与の数、投与の時機、および投薬量を容易に調節し 得る。さらに、本発明の方法の細胞系との化学療法の共投与は高められた結果を 提供するため、当業者は、そ れに関連するいずれかの毒性の副作用を低減するように投与される化学療法剤の 用量を低減することが望ましいと知ることができる。 上の考慮を心に留めれば、一般には、本発明の方法により投与される場合に所 定の化学療法剤に適する用量は、0.01μg/mLないし約１mg/mLの間、そしてより 好ましくは0.01μg/mLないし約１μg/mLの間である。選択された特定の薬物もし くは作用物質に依存して容易に調節されうるこうした用量は、例えば、静脈内で 、皮内で、直接部位注入により、腹腔内で、鼻内で、などを包含するいずれかの 適する経路により投与されうる。投与は必要とされるように反復されうる。 細胞療法 本発明によれば、細胞療法は、ヒトもしくは家畜の患者への細胞の投与を必要 とする。本発明の方法で有用な細胞は、正常組織からの細胞を助命しつつ、いく つかの種を横断する幅広い範囲の腫瘍に対する非ＭＨＣ限定キラー活性を有する 。望ましくは、これらの細胞は安定な細胞系由来であり、そして、Ｔ細胞刺激性 サイトカインの１種もしくは組み合わせにより刺激される。 適する細胞系の例は、例えばＴＡＬＬ−１０４、ＴＡＬＬ−１０３／２、ＴＡ ＬＬ−１０７、ＹＴ、およびＮＫ−９２のようなナチュラルキラー細胞系を包含 する。しかしながら、当業者は、上述されたような非ＭＨＣ限定キラー活性を特 徴とする他の適切な細胞系を容易に選択し得る。こうした細胞系は、アメリカン タイプ カルチャー コレクション(American Type Culture Collection)（Ａ ＴＣＣ）、10801 ユニバーシティ ブールバード、バージニア州マナサス(1080 1 University Boulevard，Manassas，Virginia)20110-2209、ならびに多様な学 術的お よび商業的供給源から入手可能である。例えば、ＴＡＬＬ−１０４細胞系は受託 番号ＣＲＬ １１３８６でＡＴＣＣから入手可能である。ＴＡＬＬ−１０３／２ およびＴＡＬＬ−１０７細胞系は、ウィスター・インステチュート・オブ・アナ トミー アンド バイオロジー(Wister Institute of Anatomy and Biology)、 ペンシルヴァニア州フィラデルフィア、の実験室で維持されている。本発明で有 用な他の細胞系の供給源は当業者により容易に決定され得る。 望ましくは、本発明の方法での使用に先立ち、選択された細胞系の１種もしく はそれ以上から得られた細胞は、細胞増殖を不可逆的に停止させるがしかしその 細胞の細胞傷害活性を妨害しない様式で処理されることができる。現在のところ 、好ましい処理方法は、照射、およびとりわけγ照射を必要とする。γ照射は一 例として使用されるとは言え、マイトマイシンＣのようなＤＮＡ合成に影響を及 ぼす化学薬品での処理のような他の方法が細胞の成長を停止させるのに使用され 得ることが予期される。当業者は、成長を停止させるのに適切な方法を容易に選 択し得る。 現在のところ、好ましい細胞はＴＡＬＬ−１０４細胞系由来であり、この細胞 はＴ細胞刺激性サイトカインの１種もしくは組み合わせにより刺激されている。 ＴＡＬＬ−１０４細胞は、それらに腫瘍およびウイルスに感染した標的に対する 増大された細胞傷害性を提供するような様式で改変され(modified)うる。こうし た改変法は、1994年11月24日に刊行されたＷＯ ９４／２６２８４（引用により 本明細書に組み込まれる）に詳細に記述された。例えば、一改変段階は、１種の 選択されたサイトカインもしくはＴ細胞刺激性サイトカインの組み合わせでのＴ ＡＬＬ−１０４細胞のインビトロ処理を包含する。例えば、２種のインターロイ キン、すなわち組換えヒト（ｒｔ）インターロイキン（ＩＬ）ＩＬ−２およびｒ ｈＩＬ−２は、細胞系を処理するのに独立に使用される場合にその細胞系の細胞 傷害活性を誘導する。これらのサイトカインが細胞系を改変するのに一緒に使用 される場合は、改変された細胞系は相加的なもしくは増大された細胞傷害性の効 果を表わす。これは、最終的に＜0.1：1のＥ：Ｔ比で腫瘍標的の100％排除につ ながる、細胞傷害活性および再循環能力の有意の増大をもたらす[セサノ(Cesano )ら、J．Immunol.、151:2943(1993)]。 本発明の別の至適の改変段階は、インビトロおよびインビボ双方での細胞傷害 活性の完全な保持を伴う成長能力の不可逆的喪失を与える致死的照射へのＴＡＬ Ｌ−１０４細胞系の曝露を必要とする。これは、当該細胞系をそれらの使用直前 にγ照射にかけることにより達成される。好ましくは、細胞は¹³⁷Ｃｓ線源を使 用して4000ラドで照射される。 ＴＡＬＬ−１０４細胞の照射は、その増殖能力および従ってレシピエント生物 体中で無制限の様式で成長する可能性を喪失した、改変された細胞傷害性の細胞 系を提供する。事実、それらの照射されない対照物と異なり、ＳＣＩＤマウスに 移植された本発明の改変されたγ照射されたＴＡＬＬ−１０４細胞は白血病を引 き起こさない。 好ましくは、改変されたＴＡＬＬ−１０４細胞は以下のように調製される。Ｔ ＡＬＬ−１０４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １１３８６）が、組換えヒト（ｒｈ） ＩＬ−２の存在下で組織培養物中で指数的に成長される。所望の場合は、ＩＬ− １２が、当該細胞系の殺活性を高めるため約18時間添加され得る。サイトカイン 処理されたＴＡＬＬ−１０４細胞がその後、場合によっては、好ましくは約4,00 0ラドでγ照射される。照 射は、約30分のようなある選択された時間の間継続されうる。 望ましくは、本発明での使用のため選択された細胞の約10⁴ないし約10¹²、そ して好ましくは約10¹²個が、製薬学的に許容できる担体に懸濁され、そして、適 切な経路により所望の時間の長さの間連日投与される。１個のとりわけ望ましい 担体は生理的食塩水である。しかしながら、他の適する担体は当業者に公知であ り、そして容易に選択されうる。 上で検討されたとおり、細胞療法は化学療法と同時でありうるか、化学療法レ ジメンの終了後すぐに開始しうるか、もしくは単一の治療レジメンに組み合わせ られうる。あるいは、そして現在はより少なく望ましく、細胞療法の投与は化学 療法に先行する。現在のところ、好ましい態様は、化学療法のクールの間、そし てとりわけ化学療法剤での標的組織（すなわち腫瘍）の飽和後の細胞療法の投与 を必要とする。従って、細胞療法は、望ましくは、化学療法剤の投与１ないし約 ４日後に投与される。細胞療法の投与は必要とされるように反復される。 一例として、細胞（例えば、約２×10⁷個のサイトカイン刺激されたＴＡＬＬ −１０４細胞）が、化学療法と同時に２週間連日投与されうる。あるいは、細胞 が、化学療法の終了後すぐに開始して投与されうる。なお別の態様においては、 細胞療法は、異なる用量、（連日よりはむしろ）異なる間隔、またはより短いも しくはより長い時間の期間の間投与されうる。 細胞療法は、注入により、例えば静脈内に、もしくは上で検討された手段のい ずれかにより化学療法とともに投与されうる。時間も投与の様式も本発明に対す る制限でない。化学療法でのように、細胞療法レジメンは、当業者に既知の他の 考慮のなかで、選択された細胞系の細胞傷害 性、治療されている充実性腫瘍の型、疾患の段階および患者の状態のような因子 を考慮に入れて容易に調節されうる。 現在のところ好ましい一態様においては、本発明の方法は、サイトカイン刺激 されたＴＡＬＬ−１０４細胞およびアドリアマイシンおよびシスプラチナの共投 与を必要とする。下の実施例に具体的に説明されるとおり、これらの治療単独は 腫瘍の成長を阻害しなかったとは言え、相乗的抗腫瘍効果が、家畜もしくはヒト 患者の状態に従ってみられた。 製薬学的組成物 上述されたような化学療法および細胞療法の別々の投与に対する一代替として 、本発明の組成物は、併用された化学療法−細胞療法のアプローチを助長する。 別の局面において、本発明は、１種の所望の化学療法剤もしくは療法剤類、お よび本明細書に記述されるところの所望の細胞を含有する製薬学的組成物を提供 する。これらの組成物は製薬学的に許容できる担体をさらに含有しうる。適する 担体は、例えば、生理的食塩水、リン酸緩衝生理的食塩水、および５％ＨＳＡも しくはＰＰＦを含む生理的食塩水を包含する。他の適する担体は当業者に公知で あり、そして本発明に対する制限でない。同様に、当業者は、本発明の製薬学的 組成物中の包含に他の望ましい成分を容易に選択することができ、そしてこうし た成分は本発明の制限でない。本発明の現在のところ好ましい一組成物は、アド リアマイシンもしくはシスプラチナおよび本明細書で定義されるところの改変さ れたＴＡＬＬ−１０４細胞を含有する。 本発明の組成物は、化学療法および／もしくは細胞療法について上述された経 路によりかつレジメンに従って投与されうる。あるいは、他の 適する経路およびレジメンが当業者により容易に決定されうる。 下の実施例は、化学療法（アドリアマイシン）およびＭＨＣに制限されない（ ＭＨＣ−unrestricted）細胞傷害性Ｔ細胞系ＴＡＬＬ−１０４での養子免疫療法 の組み合わせが、ヒト胃腫瘍を移植されたＳＣＩＤマウス（ＭＧＣ＃１）の治療 の単一の形態に対する全抵抗性の克服で有効であったことを立証する。アドリア マイシン、およびサイトカイン刺激されたＴＡＬＬ−１０４細胞は、インビトロ でこれらの腫瘍細胞に対する強い細胞増殖抑制効果を表わしたとは言え、インビ ボ実験は、いずれの作用物質単独もＳＣＩＤマウスモデルで有意の抗腫瘍効果を 有しなかったことを示した。インビボ活性の欠如は、単に、腫瘍の体内移植と治 療の開始との間に経過された時間、もしくはアドリアマイシンおよびＴＡＬＬ− １０４細胞の投与のスケジュールおよび経路のような使用された実験条件により うる。これらの条件は、腫瘍部位に移動しかつそこで持続したエフェクター細胞 の数、ならびにアドリアマイシンの吸収に負に影響を及ぼしてこの薬物の低いse ric濃度をもたらしたかも知れない。 化学療法および細胞療法が（同一の用量、スケジュールおよび投与経路で）組み 合わせで使用された場合は、ＭＧＣ＃１腫瘍移植片に対する劇的な抗腫瘍効果が 観察された。すなわち、とりわけ、動物の１／３が持続する完全応答（腫瘍塊の 壊死および脱落(fall out)）を有し、また、それらの２／３は、部分的かつ一過 性とは言え、同一実験において単一の治療により表わされた抗腫瘍効果の完全な 欠如と比較される場合に有意であった臨床応答を経験した。併用療法実験で使用 されたマウスの比較的少数（ｎ＝６）にもかかわらず、これらの結果は高度に有 意と考えられた。なぜなら、皮下腫瘍の自発的な壊死および退縮が観察されたこ とはなく、そして、他方、多数の体内移植されたマウスでの腫瘍の成長の高い再 現性が観察されたからである。さらに、併用療法群では、多様な時間点での平均 腫瘍体積の標準偏差は常に非常に小さかった（図２）。 いくつかの結論が、本発明の化学免疫療法プロトコルの抗腫瘍効果から引き出 され得る。同系腫瘍を担持する免疫適格マウスでの研究は、養子的に移入された Ｔ細胞およびいくつかの化学療法剤（とりわけシクロホスファミド）の組み合わ せが、有意の数の動物を成功裏に治療し得、また、腫瘍の退縮が主としてＴ細胞 に媒介されたことを示した［グリーンバーグ(P．Greenberg)ら、J．Exp．Med.、 161:1122-1134(1985)；ブックマン(M．Bookman)ら、J．Immunol.、139:3166-317 0(1987)；およびフォルネル(F．Fornelle)ら、Int．J．Cancer、42:952-957(198 8)］。これらのデータを擁護して、他の研究は、直接の腫瘍の細胞傷害性に加え 、いくつかの化学療法薬物が宿主の免疫応答性を調節し得ることを示した［アワ ド(A．Awwad)ら、Immunology、65:87-92(1988)およびノース(R．North)、J．Exp ．Med.、155:1063-1074(1982)］。本研究でマウスモデルとして使用されたＳＣ ＩＤマウスは事実上機能的なＴおよびＢ細胞を欠く［ボスマ(G．Bosma)ら、Natu re、301:527(1983)］ため、化学免疫療法の間およびその後に観察された抗腫瘍 効果は宿主の免疫応答と独立であり、そして従って上で報告されたもの［グリー ンバーグ(P．Greenberg)ら、J．Exp．Med.、161:1122-1134(1985)；ブックマン( M．Bookman)ら、J．Immunol.、139:3166-3170(1987)；およびフォルネル(F．For nelle)ら、Int．J．Cancer、42:952-957(1988)］と異なる。この点において、ア ドリアマイシン−ＴＡＬＬ−１０４細胞療法の抗腫瘍効果を探求するための免疫 無防備状態の動物の本研究での使用は、併用 された化学免疫療法のアプローチに応答して宿主免疫系により演じられる役割を 排除する。他方、ヒトの新生物の大多数が非免疫原性であり、そして従って自所 性宿主で有意のＴ細胞応答を導き出すことが不可能であることを考えれば、ヒト 腫瘍を担持するＳＣＩＤマウスモデルは、新しい治療様式の直接の殺腫瘍作用を 試験するのに非常に有用かつ適切な実験系を代表する。 インビトロ実験は、低用量のアドリアマイシンおよびＴＡＬＬ−１０４細胞の ＭＧＣ＃１腫瘍細胞に対する相加的抗増殖効果を示した。この知見は、最善の水 準に次ぐ(sub-optimal)濃度のエフェクター細胞および／もしくは薬物が治療の 間の異なる時点で腫瘍部位で存在するようであるというインビボのシナリオでの 向上された抗腫瘍効果に解釈できると考えられる。この点において、ＭＧＣ＃１ 腫瘍を担持するＳＣＩＤマウスでの⁵¹Ｃｒ標識されたサイトカイン刺激されたＴ ＡＬＬ−１０４細胞を使用する転送(trafficking)実験は、ｉ．ｐ．移入された エフェクターのわずかのみが腫瘍組織中に蓄積された（腫瘍組織１グラムあたり 投与された細胞の総数の約４％）ことを示した。腫瘍塊内のエフェクター細胞浸 潤は成功する養子療法にとって重要な特徴であるため、アドリアマイシンおよび ＴＡＬＬ−１０４細胞の相乗的抗腫瘍効果は、少なくとも部分的に、腫瘍部位で の増大されたＴＡＬＬ−１０４細胞蓄積の結果でありうる。この仮説は、おそら く、順にリンパ球浸潤に味方することができる腫瘍の血管新生の薬物誘導性の増 大の結果として起こるアドリアマイシン注入後のマウス腫瘍中へのＬＡＫ細胞の ２倍の蓄積を示す、カワタ(Kawata)ら、Mol．Biother.、2:221-227(1990)の結果 により支持される。他の系［ゴールド(J．Gold)ら、J．Surg．Oncol.、58:212-2 21(1995)］により示唆される、（細胞傷害性細胞の前に投与される）アドリアマ イシンが腫瘍で表面の変化を誘導してそれによりＴＡＬＬ−１０４細胞溶解に対 するその感受性を増大させるという可能性は、多様な用量のアドリアマイシンで のＭＧＣ＃１腫瘍細胞のインビトロの前処理がこうした効果を有しなかった（示 されない）ため、ありそうにないように思われる。 これらの実施例は本発明の好ましい方法を具体的に説明する。より具体的には 、以下の実施例は、単一の形態の治療に完全に抵抗性であるヒト腫瘍サンプルを 移植されたＳＣＩＤマウスでのＴＡＬＬ−１０４細胞との化学療法（アドリアマ イシン）の併用効果を試験した実験を立証する。これらの実施例は具体的に説明 するのみであり、そして本発明の範囲を制限しない。 実施例１−細胞の調製 ＴＡＬＬ−１０４細胞系を、10％ＦＢＳ（シグマ ケミカル カンパニー(Sig ma Chemical Co.)、ミズーり州セントルイス）および100U/mlの組換えヒト（ｒ ｈ）ＩＬ−２（カイロン(Chiron)、カリフォルニア州エメリビル）で補充された ＩＭＤＭ（ギブコ−ＢＲL(Gibco-BRL)、ニューヨーク州グランドアイランド）中 、加湿された10％ＣＯ₂インキュベーター中37℃で維持した。細胞系を、商業的 ＰＣＲキット（ＡＴＣＣ、ヴァージニア州マナサス）を使用して、マイコプラズ マ(mycoplasma)汚染について反復して監視した。ＴＡＬＬ−１０４細胞は、場合 によっては、インビトロおよび養子療法での使用に先立ちγ照射（4000ラド）し た。 実施例２−腫瘍の体内移植 凍結された腫瘍断片を金属格子を通して切り刻み、そしてアキュプレップ［Ac cuPrep］（商標）リンパ球勾配（アキュレイト ケミカル(Accurate Chemical) 、ニュージャージー州ウェストベリー）上で遠心分離して死亡した細胞および赤 血球を除去した。界面で回収された胃腫瘍細胞を完全培地に再懸濁し、そして５ ％ＣＯ₂の加湿された雰囲気中37℃でインキュベーションした。 ５ないし６週齢のＣＢ−１７ ＳＣＩＤマウス（チャールズ リバー ラボラ トリーズ(Charles River Laboratories)、マサチューセッツ州ウィルミントン） を、ウィスター研究所動物施設(Wistar Institute Animal Facility)で病原体を 含まない環境中で飼育した。マウスに、胃癌（ＭＧＣ＃１）の患者由来の転移性 胸水（0.3×0.3cm断片）を皮下に（ｓ．ｃ．）移植した。 体内移植に際して、生検サンプルを局所腫瘍塊として成長させ、これをその後 収穫し、切断し、そして他のＳＣＩＤマウスで連続的に継代した。腫瘍の一部分 を、40％ＦＢＳおよび10％ＤＭＳＯ（シグマ(Sigma)）を含有するＩＭＤＭ中で 凍結した。元の患者でのこの腫瘍の高度に転移性の挙動にもかかわらず、移植さ れた腫瘍断片はマウスで転移性の特性を表わさなかった。 実施例３−ＴＡＬＬ−１０４細胞およびアドリアマイシンの細胞傷害／細胞増殖 抑制効果に対するＭＧＣ＃１細胞のインビトロ感受性 Ａ．細胞傷害性アッセイ ＴＡＬＬ−１０４細胞を、固定された数（10⁴個／ウェル）の⁵¹Ｃｒ標識され たＭＧＣ＃１細胞とともに４種の異なる濃度で18時間インキュベーションした。 特異的⁵¹Ｃｒ放出のパーセントを３回の反復実験の平 均から算出した[セサノ(A．Cesano)ら、Cancer Res.、56:3021(1996)]。 Ｂ．サイトカイン産生 ＴＡＬＬ−１０４細胞（２×10⁶個/ml）を、10：１のＥ：Ｔ比でＭＧＣ＃１細 胞とともに37℃で一夜インキュベーションした。細胞を含まない馴化培地を収穫 し、濾過し、そして商業的ＥＬＩＳＡキット（エンドゲン、Ｒ＆Ｄ(Endogen，R& D)、マサチューセッツ州ボストン）を使用して、記述されたとおり［セサノ(A． Cesano)ら、Cancer Res.、56:3021(1996)］、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ −βおよびＧＭ−ＣＳＦの存在について試験した。10日間単独でインキュベーシ ョンされたＭＧＣ＃１細胞培養物もまたサイトカイン産生について試験した。 Ｃ．増殖アッセイ ＭＧＣ＃１細胞（10⁴個／ウェル）に対する（４種の異なる濃度の）ＴＡＬＬ −１０４細胞の細胞増殖抑制効果を、記述されたとおり［セサノ(A．Cesano)ら 、Cancer Res.、56:4444-4452(1996)］、18時間の³ＨＴｄＲ取り込みアッセイで 試験した。アドリアマイシン（ファルマシア(Pharmacia)、ニュージャージー州 ピスカタウェイ）の効果を測定する実験では、ＭＧＣ＃１細胞（10⁴個／ウェル ）を、³Ｈ−ＴｄＲを間歇的に投与されている(being pulsed)前に0.01から100μ g/mlまでの濃度のこの薬物の存在および非存在下で48時間培養した。 Ｄ．結果 患者の生検試料から回収された胃癌細胞は、18時間の⁵¹Ｃｒ放出アッセイで測 定されたとおり、照射されたＴＡＬＬ−１０４細胞による溶解に対し完全に抵抗 性であったが、しかし、それらの細胞増殖抑制活性に対して高度に感受性であっ た（図１Ａ）。照射されたＴＡＬＬ−１０４ 細胞のＭＧＣ＃１細胞とのインキュベーションは、有意のレベルのＩＦＮ−γ、 ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βおよびＧＭ−ＣＳＦの産生もまたもたらした（示されな い）。インビトロでのＭＧＣ＃１細胞に対する抗増殖活性について試験された全 部の化学療法薬物のなかで、アドリアマイシンが最も強力であり、0.1および１ μg/mlの用量で腫瘍細胞の増殖をそれぞれ75％および100％阻害することが可能 であった（図１Ｂ）。 実施例４−ＴＡＬＬ−１０４細胞の機能に対する化学療法薬物の効果 ＴＡＬＬ−１０４細胞に対する多様な化学療法剤の効果を研究した。細胞傷害 性、リンホカイン産生および増殖を、下の表１に列挙される薬物0.01ないし100 μg/mLを使用して、上の実施例３に記述されたとおりアッセイした。 下の表１に提供される結果からみられ得るとおり、ダカルバジン（非古典的ア ルキル化剤）は細胞傷害性もしくはリンホカイン産生に影響を及ぼさなかった。 アドリアマイシン（抗生物質）、ステロイド（ホルモン）、およびシスプラチナ （アルキル化剤）は細胞傷害性に対する影響を有さず、また、治療的濃度でリン ホカイン産生にわずかにのみ影響を及ぼした。実施例５−ＳＣＩＤマウスにおけるＴＡＬＬ−１０４細胞の抗腫瘍効果 Ａ．治療プロトコル 全部の治療を、腫瘍断片の体内移植３週間後（別の方法で明記される場合を除 く）、腫瘍の有意の巨視的成長が容易に評価できた場合に開始した。各治療群は ４〜６匹のマウスから成った。第一の実験では、サイトカイン刺激された場合に よってはγ照射されたＴＡＬＬ−１０４細胞（500μlＰＢＳ中２×10⁷個／マウ ス）もしくはＰＢＳ単独を連日２週間ｉ．ｐ．投与し；第二の実験では、100μl のＰＢＳ中10⁷個の細胞／マウスもしくはＰＢＳ単独を１日おきに全体で６注入 、病巣内に注入した。第三の実験では、マウスは原発性の(primary)腫瘍塊の外 科的除去、次いで連日２週間の照射されたＴＡＬＬ−１０４細胞（２×10⁷個／ マウス）もしくはＰＢＳ単独のいずれかのｉ．ｐ．注入を受けた。 治療群間の差異を、対にされない(unpaired)データについてスチューデント(S tudent)のｔ検定により有意性について検定した。Ｐ＜0.05を有意とみなした。 Ｂ．結果 最初の組の実験では、ＴＡＬＬ−１０４細胞を、３週間前にＭＧＣ＃１腫瘍断 片を移植されたＳＣＩＤマウスに２週間毎日ｉ．ｐ．注入した。治療の完了４週 間後に、全部の対照（ＰＢＳ注入された）および実験マウスを殺した。治療され たマウスの腫瘍と対照マウスのものとの間の重量の有意の差異は検出されなかっ た（表２）。 第二の組の実験では、ＭＧＣ＃１移植片を担持するマウスに、１日おきに全部 で６注入、ＴＡＬＬ−１０４細胞（もしくはＰＢＳ）を病巣内に注入した。全マ ウスを最後の注入１ヶ月後に殺し、そして腫瘍塊を除 去しかつ重量測定した。この設定でもまた、治療されたマウスの腫瘍と対照のも のとの間の重量の有意の差異は検出されなかった（表２）。 ＴＡＬＬ−１０４細胞の抗腫瘍有効性をその後、癌患者での最小限の残余の疾 患のものに類似の臨床設定を創製するため、最初の腫瘍の外科的除去の後に評価 した。高度に可動性かつ皮膚にも腹壁にも非付着性のようであった３週齢(3-wee k-old)のＭＧＣ＃１移植片を担持するマウスが、腫瘍の外科的摘出、次いで、第 一の実験で使用されたプロトコルに従ってＴＡＬＬ−１０４細胞療法（もしくは ＰＢＳ注入）を受けた。外科手術で、腫瘍の重量は0.781±0.112gであった。最 後の細胞注入１ヶ月後に全マウスを殺しそして剖検した。表２に示されるとおり 、ＴＡＬＬ−１０４細胞治療はマウスの腫瘍細胞の局所再生に対する有意の阻害 効果を有さず；これらのインビボのデータは、インビトロでＭＧＣ＃１細胞に対 しＴＡＬＬ−１０４細胞により表わされた観察された抗増殖効果（図１Ａ）と対 照的である。 実施例６−化学療法 ＭＧＣ＃１腫瘍細胞がアドリアマイシンの細胞傷害性効果に対し高度に感受性 であったというインビトロの観察結果（図１Ｂ）を基礎として、この薬物をイン ビボ研究に選んだ。ＭＧＣ＃１腫瘍移植片を担持する２群のマウス（ｎ＝６）を 、アドリアマイシン（１週間隔で30mg/m²）もしくはＰＢＳの２回のｉ．ｐ．注 入で治療した。最後の注入の１ヶ月後に実施された剖検は、対照とアドリアマイ シンで治療されたマウスとの間の腫瘍重量の有意の差異を示すことに失敗した（ 表２）。 実施例７−化学免疫療法 化学療法もしくは養子療法のいずれかでの治療に対するＭＧＣ＃１腫瘍移植片 により示される高抵抗性を克服する試みにおいて、アドリアマイシン、次いでＴ ＡＬＬ−１０４細胞の２周期の連続投与を基礎とした併用レジメンを、ＭＧＣ＃ １腫瘍移植片を担持するＳＣＩＤマウス（ｎ＝６）で治療的有効性について試験 した。最後の実験で、マウスはアドリアマイシン（第１および７日）、ならびに 、第２から６日までおよび第８から14日までの、サイトカイン刺激された場合に よってはγ照射されたＴＡＬＬ−１０４細胞（２×10⁷個／マウス）の２回のｉ ．ｐ．投与を受領した。対照群（ｎ＝４）は、ＰＢＳ、アドリアマイシンもしく はＴＡＬＬ−１０４細胞の単独を受領した。腫瘍塊を、治療前、そしてその後、 １週間隔で全体で５週の追跡期間の間、（ミリメートル副尺付きノギスを使用し て）測定した。この実験の結果を図２に要約する。治療の第１週の後には、統計 学的に有意の差異は異なるマウスの群の平均の腫瘍の大きさの間で見出されなか った。しかしながら、注目すべきことに、併用療法を受領した２匹のマウスが治 療の第１週の終了時に巨視的に顕著な腫瘍壊死を提示し；壊死は腫瘍塊が双方の マウスで脱落するまで進行して、追跡の第２週の間に壊死瘢痕をあとに残した。 この理由から、これら２匹のマウスの腫瘍測定に関する値は図２で現われず、ま た、第２追跡週の後になされたいかなる統計学的算出にも包含され得なかった。 治療の第２週の終了時に、４匹の残存するアドリアマイシン／ＴＡＬＬ−１０４ 細胞で治療された動物の腫瘍は、ＰＢＳもしくはアドリアマイシンで治療された マウスに存在するものに比較して有意により小さかった（それぞれｐ＜0.05およ びｐ＜0.002）。対照的に、統計学的に有意の差異は、この時点で、アドリアマ イシン／ＴＡＬＬ−１０４ 細胞で治療されたマウスとＴＡＬＬ−１０４細胞単独を受領していたマウスの群 との間で観察されなかった。事実、双方の群では、腫瘍の大きさのはっきり区別 されている収縮（それぞれ36％および20％）が示された。腫瘍の縮小は第１週の 終了時にすでに検出可能であった（しかし統計学的に有意でなかった）。第３週 の終了（全部の治療が停止された後１週間）から開始して、腫瘍の収縮は併用療 法を受領していたマウスの群で安定した（約36％）一方、腫瘍の成長は、ＴＡＬ Ｌ−１０４細胞単独を受領したものを包含する全部の他のマウスの群で進行した 。結果として、アドリアマイシン／ＴＡＬＬ−１０４細胞で治療された動物と、 ＰＢＳ、アドリアマイシンもしくはＴＡＬＬ−１０４細胞のいずれかの単独を受 領するものとの間の腫瘍体積の差異は統計学的に有意であった（それぞれ、ｐ＜ 0.02、ｐ＜0.001およびｐ＜0.05）。類似の結果が第４週の終了時に観察された 。第５週の終了までに、ＴＡＬＬ−１０４細胞単独で治療されたマウスの腫瘍体 積は、それがＰＢＳもしくはアドリアマイシンで治療されたマウスでみられたも のに非常に近くなった点まで増大した。これらのデータは、ＴＡＬＬ−１０４細 胞は独力で治療の最初の２週間の間にＭＧＣ＃１腫瘍の成長に対する抗腫瘍活性 を有したとは言え、これらの効果は一過性であり、そして腫瘍は細胞注入が停止 されるや否や迅速に発達したことを示した。３種の対照群は高腫瘍負荷量（併用 レジメンで治療されたマウスでみられた腫瘍の体積の約３倍）のために第５週の 終了時に殺した。アドリアマイシン／ＴＡＬＬ−１０４細胞で治療されたマウス はさらに４週間追跡した。すなわち、この時間の間、腫瘍はゆっくりとしかし漸 進的に成長して、第９週の終了時に、ＴＡＬＬ−１０４細胞単独で治療されたマ ウスの群により第５週に表わ された腫瘍の大きさに達した。この実験はこの時点で終了させた。 本発明の多数の改変および変形が上で同定された明細に包含され、そして当業 者に明らかであることが期待される。本発明の組成物および方法に対するこうし た改変および変更は、これに付属として付けられる請求の範囲の範囲に包含され ると考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １２１ Ａ６１Ｐ 43/00 １２１ Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (72)発明者 セサノ，アレツサンドラ アメリカ合衆国ペンシルベニア州19146フ イラデルフイア・ベークマンプレイス・ロ ンバードストリート1720・アパートメント 305

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．哺乳動物の癌を治療するための医薬の製造における、非ＭＨＣ限定細胞傷害 活性を特徴とする安定な細胞系のサイトカインに刺激される細胞の使用であって 、前記治療が、 哺乳動物に、化学療法剤を用いる１クールの療法および前記細胞を用いる１ク ールの療法を共投与すること、 の段階を含んで成り、 これにより、前記共投与が前記化学療法および前記細胞療法の相加的抗癌効果 を越える抗癌効果を有する使用。 ２．細胞療法が、化学療法剤を用いるクールの治療の間に投与される、請求の範 囲１に記載の使用。 ３．細胞療法が、化学療法剤を用いるクールの治療の後に投与される、請求の範 囲１に記載の使用。 ４．化学療法剤が、アルキル化剤、抗生物質、代謝拮抗剤、植物由来の作用物質 およびホルモンから成る群から選択される、請求の範囲１に記載の使用。 ５．化学療法剤がアドリアマイシンである、請求の範囲４に記載の使用。 ６．化学療法剤がシスプラチナである、請求の範囲４に記載の使用。 ７．細胞が、ＴＡＬＬ−１０４、ＴＡＬＬ−１０３／２、ＴＡＬＬ−１０７、Ｙ ＴおよびＮＫ−９２から成る群から選択される安定な細胞系由来である、請求の 範囲１に記載の使用。 ８．前記癌が哺乳動物の耐性腫瘍である、請求の範囲１に記載の使用。 ９．細胞療法および化学療法剤の併用効果が、細胞療法の非存在下で必要とされ るよりも少ない用量の化学療法剤が有効であることを可能にす る、請求の範囲１に記載の使用。