JP2002504364A - ジイソプロピル−フルオロホスファターゼ、ならびにその使用および製造 - Google Patents

ジイソプロピル−フルオロホスファターゼ、ならびにその使用および製造

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、Loligo vulgarisからのジイソプロピルフルオロホスファターゼ（酵素分類EC 3.1.8.2.）および該酵素をコードする塩基配列に関する。また本発明はさらに、本発明のDNAを含むベクターおよび本発明の塩基配列により形質転換された細胞に関する。さらに、本発明は、本発明の形質転換細胞を使用するジイソプロピルフルオロホスファターゼの製造方法に関する。本発明はさらに、DFPアーゼの種々の使用および用途の分野、特に汚染環境の汚染除去における使用および用途、ヒトまたは動物を治療もしくは解毒するための医薬品の製造、衣類の浸漬、および分析化学における使用に関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、Loligo vulgarisからのジイソプロピル-フルオロホスファターゼ（
酵素分類EC 3.1.8.2.、以下「DFPアーゼ」という。）、該酵素をコードする塩基
配列、該酵素の使用、および形質転換細胞におけるその製造方法に関する。
【０００２】 用語「DFPアーゼ」は、ジイソプロピルフルオロホスフェート（DFP）およびそ
の他の同様の構造を有する有機リン化合物を加水分解することができる酵素の一
群を示す広い範囲の意味を有する。これらの有機リン化合物のグループは、以下
の基本構造の化合物ということができる。
【０００３】
【化６】 上記式中、Zは酸素または硫黄を表し、Yは、H-Y化合物としたときに酸性の性 質を有し得る基を表す。これは特に、無水物基（脱プロトン化された酸基）（特
にFまたはCN基）またはエステル基、例えばチオエステル、エノールエステルま たはp-ニトロフェニルエステル基である。X1およびX2は1〜15個の炭素原子を有 する直鎖、分岐鎖もしくは環状アルコキシ、アルキル、アリール、アルキルアミ
ノまたはジアルキルアミノ基であり得る。多数のそのような化合物が殺虫剤とし
て使用されており、あるいは使用されていた。その他の化合物は、いわゆる神経
ガスの用語に含まれるものである。この群の化合物の神経ガスとしては、特にDF
P、タブン、ソマン、サリン、エチルサリンおよびシクロサリンが挙げられる。
【０００４】 これらの非常に有毒な化合物の世界中のストックを減らすことは拡大しつつあ
る問題である。さらに環境のすでに汚染された地域の汚染を除去するための環境
的に許容される方法を見出すことが必要である。
【０００５】 大量のこれらの物質を破壊するためのこれまで最も重要な方法としては高温で
の焼却がある。
【０００６】 さらに、例えば米国特許第4,666,696号は溶融アルミニウムでの還元による神 経ガスおよびその他のコリンエステラーゼ阻害剤の破壊を扱っている。
【０００７】 この問題を解決する別の方法として、例えば物理的な方法が挙げられる。すな
わち、例えば米国特許第5,550,311号は水流中での毒性化合物（神経ガス）の熱 分解を記載している。別の方法が米国特許第5,648,591号に記載されており、こ れは、例えばサリンのような化学兵器を機械的ミルでの活性化により分解するも
のである。これらの方法はいずれも経済的効率およびその用途の限られた範囲に
関する重大な欠点を有する。すなわち、例えばこれらのいずれの方法においても
適当な有毒物質を特別な装置に供給する必要があり、これは例えばこの分野での
使用を不可能ではないにしても困難にしている。
【０００８】 大量に生産できる微生物または酵素による化学兵器のストックの生物学的処理
および汚染除去は、これらの問題の解決の簡略化あるいはそのためのより効果的
な方法を提供する可能性がある。
【０００９】 従って本発明は、上記の汚染除去方法と対照をなし、Aldrigeによる1953年と いうかなり以前の知見の上になされたものである。Aldridgeは種々の生物からの
様々な組織がコリンエステラーゼ阻害剤であるパラオクソンを加水分解する酵素
を含んでいることを見出した。その後の1966年の研究においてHoskinおよび共同
研究者はイカLoligo pealiiがDFP分解酵素を含むことを示した。多くの観察がこ
の領域で今日まで続いてなされたが、組換タンパク質を配列決定することあるい
は単離することさえ可能となっていない。Hoskinが調査した酵素はその分子量に
関して正確に特性化され得なかった。Hoskinは26,600 Daの分子量を推定したが 、その他の研究グループ、例えばKopec-Smythら(1993)は、おそらく26.6 kDaタ ンパク質は非常に不安定な42 kDaタンパク質の断片にすぎないとした。このDFP アーゼのペプチド断片の短いアミノ酸配列は1993年にWardおよびDeschampsによ って発表された。それに記載される配列部分は本発明の特許請求されるアミノ酸
配列には見られず、これによりLoligo pealiiからのDFPアーゼは明確に本発明の
DFPアーゼとは異なると推定されるべきである。
【００１０】 類似したタンパク質がLoligo pealii以外の多様な生物で同定されている。す なわち、それらは特に好熱菌あるいは好塩菌、E. coli、Proteus vulgaris、Sac
charomyces cerevisiae、Pseudomonas diminuta、Flavobacteriumおよび真核単 細胞生物Tetrahymena thermophilia、ならびに昆虫および無脊椎動物において見
出されている。マウス、ラット、ウサギ、ブタおよびヒトのような哺乳類におい
ても検出可能である。本発明のLoligo vulgarisからのDFPアーゼにその特異性に
おいて類似している酵素に関する多くの研究グループの努力にもかかわらず、い
ずれのグループも本発明に対応する酵素のアミノ酸配列およびその基礎となる塩
基配列を不完全に解明することにも成功しておらず、ベクターを使用して対応す
る塩基配列を宿主細胞に形質転換し、それにより優れた純度での工業的な生産を
可能とすることにおいても成功していない。Dierl（1995, 論文、Johann Wolfga
ng Goethe University, Frankfurt/Main）はその研究活動においてLoligo vulga
risからのDFPアーゼの部分配列を解明したが、この研究においてはアミノ酸配列
および塩基配列についての詳細は見られない。Dierlにより与えられた部分的な 情報は不完全なものであり、そこに示された結果を再現することは、単にその研
究が基づいたcDNA遺伝子バンクは公衆がアクセスできないものであり、公衆が利
用できないという理由により不可能である。
【００１１】 本発明の1つの目的は、Loligo vulgarisからの完全で機能するDFP-開裂酵素お
よび該酵素をコードする塩基配列を提供し、遺伝子工学的なものを工業的に製造
することを可能とすることである。別の目的は、分画硫酸アンモニウム沈殿によ
り安定性を損なうことなく工業的規模で単離することができ、約7.5の中性のpH および室温(約25℃)でその至適活性を有するDFPアーゼを提供することである。 これにより、特に神経ガスと殺虫剤の環境にやさしい、エネルギー節減型の処理
という目的を達成することを意図するものである。達成されるべきさらに別の目
的は、貯蔵安定性および溶媒安定性を有するDFPアーゼを提供することである。 すなわち、例えば濃縮溶液が4℃で活性の無視できる程度の損失のみで長期間に わたり安定であることを意図するものである。また、種々の溶媒または溶媒含有
水性媒体（例えば10%強度の水性エタノール溶液）が酵素の活性に影響しないこ とを意図するものである。達成されるべきさらに別の目的は、多様なバッファー
系において活性であるDFPアーゼを提供することである。該DFPアーゼを提供する
ことにより、DFPアーゼの基質となるアセチルコリンエステラーゼ阻害剤の汚染 を除去し、脱毒し、さらには検出することを可能とすることを意図するものであ
る。そのような酵素の提供は、適当な神経ガスまたは殺虫剤の工業的な分解を可
能とするばかりではなく、汚染された環境(土壌、水路等)の汚染を除去する可能
性を提供することも意図するものである。これにより植物におけるクローニング
も可能である。また、ヒトまたは動物の解毒あるいは治療のための医薬品を製造
するために酵素を使用することも考えられる。これは例えばスキンクリームの形
態で局所的に、溶液、点滴もしくは吸入剤の形態で非経口的に、または経口的に
前記酵素を使用することを含み得る。
【００１２】 前記目的は下記のアミノ酸配列のDFPアーゼを提供することによって達成され ている。
【００１３】
【化７】 本発明のジイソプロピル-フルオロホスファターゼは、この点において、DFPア
ーゼ活性が保持される限り、上記の配列から1以上のアミノ酸の欠失、挿入およ び／または置換によって得ることができるアミノ配列も包含する。いうまでもな
くこれはアミノおよび／またはカルボキシ末端側の末端切断を包含するものであ
る。
【００１４】 本発明のこのアミノ酸配列はその基盤として、Loligo vulgarisからのDFPアー
ゼをコードし、好ましい実施形態においては下記の塩基配列を含むDNA配列を含 む本発明のDNA配列を有する。
【００１５】
【化８】 塩基配列を修飾することにより、例えば、酵素の基質特異性、溶解度および／
または安定性を対処すべき問題に適応させることができる。
【００１６】 本発明のさらに別の目的は、本発明のDNA配列の少なくとも1つのコピーを含む
ベクターを提供することである。このベクターは、本発明のDNA配列が存在する 任意の原核生物ベクターあるいは真核生物ベクターであってよく、好ましくは発
現シグナルの制御下にあるものである。発現シグナルとしては特に、プロモータ
ー、オペレーターおよびエンハンサーが挙げられる。プロモーターは、例えばT7
プロモーターまたはlac、tac、lacUV5もしくはPLプロモーターとすることができ
る。適当な原核生物ベクターとしては、例えば染色体ベクター、例えばバクテリ
オファージ(例えばバクテリオファージλ)、染色体外ベクター、例えばプラスミ
ドが挙げられ、この場合環状プラスミドベクターが好ましい。また一方で、本発
明のベクターは真核生物ベクター、例えば酵母ベクター、または高等生物細胞に
適するベクター、例えばプラスミドベクターもしくはウイルスベクターとするこ
とができる。示したタイプのベクターは分子生物学の分野の技術者にはよく知ら
れたものであり、これについてさらに詳細な説明は要しないであろう。好ましい
実施形態においては、DFPアーゼとシグナルペプチドとの融合タンパク質を発現 することを可能とするいわゆる分泌ベクターをそのようなベクターとして使用す
ることができる。シグナルペプチドはタンパク質が細胞を通過するのに必要であ
り、分泌時にDFPアーゼからシグナルペプチダーゼによって正確に切り離される 。適当なシグナルペプチドとしては、例えばpelB、αあるいはPH01シグナルペプ
チドが挙げられる。そのようなシグナルペプチドへのDFPアーゼの結合は、封入 小体、すなわち細胞内でのDFPアーゼの凝集の形成を防ぎ、細胞周辺腔または培 地にタンパク質をより多量に通過させるために有利である。
【００１７】 本発明はさらに、本発明のDNA配列または本発明のベクターによって形質転換 された細胞に関する。この細胞は例えば、原核細胞、好ましくはグラム陰性の原
核細胞、特に好ましくは真正細菌細胞である。ある実施形態においてはこの細胞
は大腸菌（E. coli）細胞である。外来核酸配列による原核細胞の形質転換は分 子生物学の分野の技術者によく知られている。しかし本発明の細胞は真核生物細
胞、例えば真菌細胞（例えば酵母）、動物または植物細胞であってもよい。好ま
しい真核生物発現系は、例えばPichia pastorisまたはSaccharomyces cerevisia
eである。外来核酸配列による真核細胞の形質転換またはトランスフェクション は分子生物学の分野の技術者によく知られており、従ってさらに説明することは
要しないであろう。
【００１８】 上記タンパク質、DNA配列、ベクターおよび形質転換細胞が提供されることに より、DFPアーゼ活性を有する酵素の工業的生産が可能となる。これは簡略で経 済的で環境に適合する方法で多量のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を分解す
ることを初めて可能としたものである。
【００１９】 このことは、DFPアーゼが、組換えDNA技術によって、例えば大腸菌中での発現
により、宿主生物抽出物の１成分としてまたは単離され精製された形態で得られ
ることを意味する。本発明によるそのようなDFPアーゼの使用は、P-F結合または
前記基本式に対応しP-Y結合を含むアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を分解す ることを含む。この目的のために、例えば、酵素反応器中でのP-Y結合を含むア セチルコリンエステラーゼ阻害剤(基本式に対応する)の工業的な分解のために精
製され単離されたDFPアーゼを使用することが可能であり好ましい。そのような 反応器における酵素の固定は当業者によく知られており、ここで詳述する必要は
ないであろう。特にDFPアーゼをポリウレタンフォームのような発泡体(foam)に 重合することが考えられる。前記使用の別の実施形態は、例えば天然のままの微
生物中におけるDFPアーゼの使用であり、これは例えば屋外土壌の汚染除去に使 用することができ、この場合、形質転換された土壌菌を好ましく使用することが
できる。本発明の別の使用は、本発明のDFPアーゼを発泡体中で使用することを 含み、この場合、発泡体が担体および／または湿潤材料として作用する。このタ
イプの発泡体は表面活性発泡体(surfactant foam)とすることができ、これは特 に土壌、表面、高価な装置等の汚染除去に使用することができる。ある場合にお
いては、単なる噴霧、すなわちエアロゾルとして適用するだけでも十分である。
その場合、発泡体の形態で使用することは必ずしも必須ではない。静置した状態
で操業する方法および例えば反応器を使用する方法においてDFPアーゼを使用す ること、設備あるいは屋外の広い領域の汚染除去のために移動可能な方法におい
てDFPアーゼを使用することも考えられる。従って、DFPアーゼの使用の本発明の
別の実施形態は、汚染された水路または飲料水の解毒も含み得る。反応器におけ
る静止相として使用することによる酵素の固定は、例えば酵素を固体担体に共有
結合させることにより行うことができる。
【００２０】 コードcDNAは結合した「Hisタグ」を有するものとし得、これにより修飾DFPア
ーゼを製造することが可能となる。この修飾DFPアーゼは、ニッケルNTAで修飾さ
れた担体材料に結合することができる。ニッケルNTAで修飾された担体材料を分 離カラムの充填材料とすれば、この方法をDFPアーゼを精製するために使用する ことができる。
【００２１】 さらに共有結合または非共有結合性の結合によって織物に前記酵素を含浸させ
、保護布とすることができる。
【００２２】 本発明による1つの使用は、新しい検出方法、例えばバイオセンサーを使用す るものとすることもできる。この場合、DFPアーゼは変換器上に固定された受容 体として作用する。検出されるべき分析対象物、すなわち上記の基質がDFPアー ゼにより切断されると、生物学的信号が対応する測定可能な電気シグナルに変換
され、これは電子装置により増幅される。最終的なシグナルは一般的には分析対
象物の量および／または性質に関連する。DFPアーゼはこの場合、受容体として 純粋な単離された形態で、またはそれを発現する細胞中に存在し得る。適当な変
換器は、バイオセンサーの分野の技術者に公知の変圧器装置である。
【００２３】 本発明のさらに別の使用は、活性成分としてのDFPアーゼを含み、従ってP-Y結
合を含むアセチルコリンエステラーゼ阻害剤に被毒したヒトまたは動物を解毒し
あるいは治療するのに貢献し得る医薬製品を提供することである。局所投与以外
に非経口あるいは経口投与もこれに適している。
【００２４】 本発明はさらに、DFPアーゼの製造方法であって、DFPアーゼが本発明の細胞に
より生成される方法に関する。すなわちこの方法はDFPアーゼの完全な化学的合 成とは異なるものである。形質転換細胞による本発明のDFPアーゼの製造方法に おいては、発現ベクターによる形質転換は以下のステップにより行う。 (1) Loligo vulgarisの頭部神経節からのmRNAの単離。神経節は屠殺の直後に摘 出し液体窒素で直ちに急速冷凍しなければならない。 (2) オリゴ-(dR)-セルロースカラム上でのアフィニティクロマトグラフィーによ
る前記mRNAの精製。 (3) 前記mRNAのcDNAへの翻訳。 (4) λファージへの前記cDNAのクローニング。 (5) ポリメラーゼ連鎖反応を使用した縮重プローブによるDFPアーゼの遺伝情報 を含むλファージの探索。 (6) ポリメラーゼ連鎖反応による前記遺伝情報の増幅。 (7) 前記遺伝情報の発現ベクターへの導入。
【００２５】 この方法においては、遺伝子工学の分野の技術者が利用可能な標準的な技術に
よっては解決できない種々の困難を克服する必要があった。すなわち、例えば、
Loligo vulgarisの頭部神経節からのmRNAは屠殺したばかりの動物から単離する ことは必須であり、頭部神経節はその摘出の後直ちに液体窒素中で保存する必要
があるが、このことは自明ではなかった。この手順を使用しないとDFPアーゼの 完全長mRNAを単離することは実質的に不可能である。さらにDFPアーゼをコード するmRNAが少数であるために、PCR法を使用することが絶対に必要である。cDNA バンクにおいて遺伝情報を見出すために、さらにLoligo vulgarisからのcDNAと 長い領域において一致しなければならない高度に特異的なプローブを開発する必
要があった。そのようなプローブの合成は、本発明の時点においては、高度に特
異的なプローブを合成することを可能とするLoligo vulgarisからのDFPアーゼの
比較的長いタンパク質配列は知られていなかったという事実により妨げられた。
分子生物学の分野における技術者であれば、本発明により提供される配列情報の
みに基づいて簡単な方法でそのようなプローブを合成できる。
【００２６】 以下の実施例は本発明を例示することを意図するものである。
【００２７】実施例 Loligo vulgarisからの頭部神経節の単離およびその後の大腸菌中での組換えタ ンパク質の発現 (1) 頭部神経節を単離するため、イカの頭部を内臓嚢から切り離し、触手を除去
する。口腔から頭部裏側まで切開するため表皮を少し持ち上げる。頭部皮膜およ
び眼球を露出する。全ての神経索を除去した後、脳組織を取り出す。単離の直後
に脳組織を液体窒素中に移し、RNAを調製するまで-196℃で保存する。 全てのガラス器具は250℃で4時間乾燥させる。全ての溶液は可能な限りピロ炭
酸ジエチルで処理する。脳組織を液体窒素を入れた乳鉢に入れ、均一なペースト
にすりつぶす。その後組織をチオシアン酸グアニジニウム、β-メルカプトエタ ノールおよびN-ラウロイルサルコシンを含むクエン酸バッファー中に移す。ガラ
ス製Potterホモジナイザーを使用して、得られた細胞溶解物に依然として存在す
る小細胞断片を破壊する。超遠心分離を行う前に、依然として存在する組織粒子
を遠心分離によってホモジネートから除去する。塩化セシウム勾配による超遠心
分離を行い、その他の細胞成分からRNAを取り出す。遠心分離で得られたペレッ トをエタノールで洗浄し、水に溶解した後フェノール/クロロホルムで数回抽出 する。通常の試験を行ってRNAの質と量をチェックする。
【００２８】 (2) mRNAをオリゴ-(dT)-セルロース上のアフィニティクロマトグラフィーにより
濃縮する。この目的のために、アフィニティークロマトグラフィーカラムを準備
した後、完全なRNAを加熱し、その後氷浴で冷却する。二次構造を破壊した後、 完全なRNAを高塩濃度のオリゴ-(dT)-セルロースカラムに負荷する。このことは 、ポリ-(A+) RNAが担体材料に特異的に結合することを意味する。mRNAの収量を 増やすために、溶出液を回収し、再度変性し、再度負荷することが有利である。
ポリ-(A+) RNAが結合したカラムを負荷バッファーおよび洗浄バッファーで洗浄 する。低塩濃度の溶液により負荷されたオリゴ-(dT)-セルロースからポリ-(A+)
RNAを溶出させ、適当な分画を分光光度法によって決定する。
【００２９】 (3) 第1のcDNA鎖は、結合に必要なポリ-(dT)配列の他にXhoI切断部位と「GAGA」
配列を含むオリゴ(dT)プライマーを使用して合成する。ハイブリッドの形成の後
、mRNAに相補的なDNA鎖を逆転写酵素によって合成する。この反応に使用される 逆転写酵素はモロニーマウス白血病ウィルス（M-MuL VRT）からのものであり、 これは比較的低いRNアーゼH活性、高プロセシビティ、ポリ-(A-) RNAによる阻害
の低い可能性を有することによるものである。合成において制限酵素消化から保
護するため、dATP、dGTP、dTTPおよび5-メチル-dCTPの混合物を第1の鎖に使用す
る。合成の後、遺伝的マーカーmcrA-およびmcrB-を担持する大腸菌株PKL-F’を 使用して最初の回の複製を行う。 第1のcDNA鎖の合成に続いて、第2の鎖はGublerおよびHoffmanの方法によって 合成する。最初に、エンドリボヌクレアーゼであるRNアーゼHを使用してRNA：DN
A二本鎖のRNAを切断する。これにより5’-リン酸末端および3’-ヒドロキシ末端
を有するオリゴリボヌクレオチドが得られ、これらはDNAポリメラーゼIにより認
識され、DNA合成のための出発物質として使用される。 得られたDNA二本鎖を適当なベクター中にクローニングすることができるよう にするために、最初のステップでDNA鎖の突出端をT4 DNAポリメラーゼによる処 理で充填する。その後T4 DNAリガーゼを使用してcDNA末端にEcoRIアダプターを 付与する。これは、リン酸化9量体および脱リン酸化13量体オリゴデオキシリボ ヌクレオチドの混合物を使用することを必要とする。リガーゼを熱失活させた後
、突出5’末端をT4ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化し、その後DNA二本
鎖を制限酵素XhoIにより切断する。適当なベクターへのクローニングは、cDNA末
端の2つの異なる制限酵素切断部位を使用することにより行うことができる。
【００３０】 (4) 得られたcDNAをバクテリオファージλのベクターアームにクローン化する。
先に調製したファージ頭部へのin vitroパッケージングおよびファージ変異体の
種々の細胞抽出物とのインキュベーションにより、生育可能なバクテリオファー
ジが得られる。異なる数の組換えベクター分子を含む2つのcDNAバンクを構築し 、以降の研究の出発点とする。
【００３１】 (5) ジイソプロピル-フルオロホスファターゼの遺伝情報について2つのcDNAバン
クをスクリーニングするために、該タンパク質のアミノ酸配列についてのこれま
でに解明されている部分的な情報とその他の技術を使用し、該タンパク質のcDNA
配列と可能な最大限の一致を示すようにしたオリゴデオキシリボヌクレオチドを
設計する。非常にストリンジェントな条件下での、配列5’-TTC-CAA-TTC-CCI-AA
T-GGI-ATT-GCT-GT-3’を有する配列特異的オリゴデオキシリボヌクレオチドを使
用するポリメラーゼ連鎖反応により、生成物を作製することができる。2つのオ リゴデオキシリボヌクレオチドをPCR実験において使用して、Loligo vulgarisか
らのジイソプロピル-フルオロホスファターゼを同定する。第1のオリゴデオキシ
リボヌクレオチドは、クローン化されたcDNA配列に結合されたバクテリオファー
ジλの配列からなる。第2のオリゴデオキシリボヌクレオチドは、いずれかの位 置にイノシンを含み、解明されたタンパク質配列から得られたものであり、従っ
てLoligo vulgarisからのジイソプロピル-フルオロホスファターゼに特異的なも
のである。 cDNAバンクにおいて550 bp長の生成物を検出することができる。ポリメラーゼ
チェーンリアションの生成物を単離精製した後、配列決定により含まれるDNA情 報を解読することができる。cDNA挿入物の両方のDNA鎖は、既に公知のDNA配列か
ら得られたオリゴデオキシリボヌクレオチドを使用して配列決定することができ
る。DNA配列決定から決定されたリーディングフレームをこれまでに決定されて いるタンパク質配列と比較することにより、調べた550 bp断片が所望のLoligo v
ulgarisからのジイソプロピル-フルオロホスファターゼの部分配列であることが
示される。 前記酵素のこの部分配列から出発して、1210 bpの全長を有するジイソプロピ ル-フルオロホスファターゼの完全なcDNA配列を解明することができる。このDNA
配列は、約210 bp長の領域を有し、5’末端にコードDNA配列を含まないことを特
徴とする。オープンリーディングフレームは942 bpからなり、314アミノ酸を有 し約35 kDaの分子量を有するタンパク質をコードする。
【００３２】 (6) 発現系を組み立てるために、前記酵素のオープンリーディングフレームを隣
接オリゴデオキシリボヌクレオチド配列を使用したポリメラーゼ連鎖反応により
増幅する。このオリゴデオキシリボヌクレオチドは前記タンパク質配列特異的情
報に加えて発現系へのクローン化を容易にする制限酵素切断部位を含む。Nco I 切断部位を情報の5’側に導入し、Hind III切断部位をDNAの3’側に挿入する。 ポリメラーゼ連鎖反応の生成物をPfu Tapポリメラーゼを使用して「平滑末端化 」し、アガロースゲル上で精製し、単離し、開環ベクターpCR-Script SK(+)中に
形質転換する。
【００３３】 (7) 所望の遺伝情報を含むプラスミドを選択した後、これをNco I/Hind IIIで切
り出し、trcプロモーター系を有する発現ベクター中に形質転換する。この系で の発現により、培地1リットルあたり150〜200 mgの生物学的に活性な組換えジイ
ソプロピル-フルオロホスファターゼを得ることができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０２Ｆ 1/00 Ｃ１２Ｐ 9/00 ４Ｄ００４ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/54 9/16 Ｂ０９Ｂ 3/00 Ｅ Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 BA11 CA01 CA04 CA11 CA12 DA06 EA04 FA02 GA11 GA19 4B050 CC03 DD11 LL01 LL10 4B064 AG01 CA02 CA19 CC24 DA01 DA16 4B065 AA26X AA90Y AB01 BA02 CA31 CA44 CA56 4C084 AA01 BA22 CA01 CA25 CA53 DC50 MA52 MA55 MA63 NA14 ZC372 4D004 AA41 AB05 CA20 CC07 CC20

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記アミノ酸配列： 【化１】 または1以上のアミノ酸の削除、挿入および／もしくは置換によって得ることが できる配列を特徴とするジイソプロピル-フルオロホスファターゼ。
  2. 【請求項２】 DFPアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA配列を
    含むDNAであって、コードされるポリペプチドが下記アミノ酸配列： 【化２】 または1以上のアミノ酸の削除、挿入および／もしくは置換によって得ることが できる配列を有する前記DNA。
  3. 【請求項３】 下記塩基配列： 【化３】 を含むかまたは有する請求項２に記載のDNA。
  4. 【請求項４】 請求項２または３に記載のDNAの少なくとも1のコピーを含む
    ことを特徴とするベクター。
  5. 【請求項５】 請求項２もしくは３に記載のDNAまたは請求項4に記載のベク
    ターにより形質転換されたものであることを特徴とする細胞。
  6. 【請求項６】 形質転換大腸菌細胞である請求項５に記載の細胞。
  7. 【請求項７】 土壌菌または真核生物細胞系である請求項５に記載の細胞。
  8. 【請求項８】 請求項１に記載のDFPアーゼを製造する方法であって、DFPア
    ーゼを請求項５、６または７に記載の細胞により製造する前記方法。
  9. 【請求項９】 P-Y結合を有し、下記の基本構造： 【化４】 （上記中、Zは酸素または硫黄を表し、Yは無水物基（脱プロトン化された酸基）
    、特にFまたはCN基を表し、またはエステル基、特にチオエステル、エノールエ ステルもしくはp-ニトロフェニルエステル基を表し、X1およびX2は1〜15個の炭 素原子を有する直鎖、分岐鎖もしくは環状アルコキシ、アルキル、アリール、ア
    ルキルアミノまたはジアルキルアミノ基を表し、X1およびX2は同一であってもよ
    く異なっていてもよい）を有するアセチルコリンエステラーゼ阻害剤の分解のた
    めの請求項１に記載のDFPアーゼの使用。
  10. 【請求項１０】 DFPアーゼが担体材料上または担体材料中に固定されてい る請求項９に記載の使用。
  11. 【請求項１１】 DFPアーゼを酵素反応器中で使用する請求項９または１０ に記載の使用。
  12. 【請求項１２】 DFPアーゼが、そのままあるいはDFPアーゼを生産する固定
    された形質転換微生物中に存在しており、DFPアーゼがバイオセンサーアセンブ リーの受容体として作用する請求項１０に記載の使用。
  13. 【請求項１３】 DFPアーゼが、汚染除去用のエアロゾル形成スプレー液体 の形態で使用される請求項９に記載の使用。
  14. 【請求項１４】 DFPアーゼが、汚染除去用の表面活性発泡体中に使用され る請求項９に記載の使用。
  15. 【請求項１５】 土壌または設備を汚染除去する請求項１３または１４に記
    載の使用。
  16. 【請求項１６】 飲料水または水路を汚染除去する請求項９に記載の使用。
  17. 【請求項１７】 P-Y結合を含み、下記の基本構造： 【化５】 （上記中、Zは酸素または硫黄を表し、Yは無水物基（脱プロトン化された酸基）
    、特にFまたはCN基を表し、またはエステル基、特にチオエステル、エノールエ ステルもしくはp-ニトロフェニルエステル基を表し、X1およびX2は1〜15個の炭 素原子を有する直鎖、分岐鎖もしくは環状アルコキシ、アルキル、アリール、ア
    ルキルアミノまたはジアルキルアミノ基を表し、X1およびX2は同一であってもよ
    く異なっていてもよい）を有するアセチルコリンエステラーゼ阻害剤による被毒
    に対処するための医薬品を製造するための請求項９に記載の使用。
  18. 【請求項１８】 医薬品が局所、非経口または経口投与に適している請求項
    １７に記載の使用。
  19. 【請求項１９】 担体材料が織物材料である請求項９に記載の使用。
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