JP2002503443A - 抗微生物活性を持つリゾチーム類似タンパク質とペプチド、それらの生産および使用 - Google Patents
抗微生物活性を持つリゾチーム類似タンパク質とペプチド、それらの生産および使用Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、抗微生物活性を持つリゾチーム類似タンパク質とペプチド、前記タンパク質とペプチドの生産および使用に関する。これらのタンパク質とペプチドは、ムラミダーゼ活性を除き、それらの主要な特性が保存される限りにおいてのみ、特にT4リゾチームの抗微生物特性が保存される限りにおいてのみ、組換え的に修飾されまたは変異により修飾される。本発明はまた、T4リゾチームの少なくともアミノ酸126〜141または143〜155を含有する組換えタンパク質に関する。本発明はさらに、それらをコードする遺伝子からの前記タンパク質とペプチドの生産に関し、前記生産は、原核生物および真核生物においてそれらの生合成を行う工程ならびに化学的に合成されたタンパク質またはペプチドを使用する工程を含む。最後に本発明は、医用薬効剤としての、食品添加物および飼料添加物としてのまたは他のインビボおよびインビトロ抗微生物防護材としてのまたはトランスジェニック生物における外因性のタンパク質としての、これらのタンパク質とペプチドの使用に関する。
Description
【0001】 本発明は抗微生物および抗ウイルス作用を持つリゾチーム類似タンパク質とペ
プチドに関し、具体的には抗微生物作用を持つT4リゾチーム類似タンパク質と
ペプチド、それらの生産および使用に関する。本発明の応用分野は医学および獣
医学から植物での耐性栽培と食品での殺細菌および殺真菌添加物の予防的使用に
及ぶ。
プチドに関し、具体的には抗微生物作用を持つT4リゾチーム類似タンパク質と
ペプチド、それらの生産および使用に関する。本発明の応用分野は医学および獣
医学から植物での耐性栽培と食品での殺細菌および殺真菌添加物の予防的使用に
及ぶ。
【0002】 T4リゾチームは、バクテリオファージT4が、その細菌宿主細胞での増殖後
に、その細菌宿主細胞を開き、自身を環境に入らせるために作るタンパク質であ
る。今日まで、T4リゾチームの酵素活性(ムラミダーゼ)がその細菌の破壊を
引き起こすのだと思われてきた(Tsugita,A.(1971)「ファージ
リゾチームと他の溶菌酵素(Phage lysozyme and othe
r lytic enzymes)」Boyer,P.D.編「The Enz
ymes,Vol.V」(ニューヨーク・Academic Press社)の
344〜411頁)。そのためには、T4リゾチームの基質となるムレイン層へ
の、細菌細胞膜を通した輸送が必要である。T4リゾチームの既に知られている
酵素活性はムラミン酸基のC−1とアセチルグルコサミンのC−4との間の特異
的切断をもたらす。これにより、細菌のムラミンネットワークが開裂し、細胞壁
が不安定化される。現在まで、内側の細胞膜を通してムラミン層に至るT4リゾ
チームの輸送経路を説明することはできていない。ムラミン層の開裂の結果とし
て、細菌は不安定化を起こして破裂し、そのようにして破壊されるのだと思われ
てきた。
に、その細菌宿主細胞を開き、自身を環境に入らせるために作るタンパク質であ
る。今日まで、T4リゾチームの酵素活性(ムラミダーゼ)がその細菌の破壊を
引き起こすのだと思われてきた(Tsugita,A.(1971)「ファージ
リゾチームと他の溶菌酵素(Phage lysozyme and othe
r lytic enzymes)」Boyer,P.D.編「The Enz
ymes,Vol.V」(ニューヨーク・Academic Press社)の
344〜411頁)。そのためには、T4リゾチームの基質となるムレイン層へ
の、細菌細胞膜を通した輸送が必要である。T4リゾチームの既に知られている
酵素活性はムラミン酸基のC−1とアセチルグルコサミンのC−4との間の特異
的切断をもたらす。これにより、細菌のムラミンネットワークが開裂し、細胞壁
が不安定化される。現在まで、内側の細胞膜を通してムラミン層に至るT4リゾ
チームの輸送経路を説明することはできていない。ムラミン層の開裂の結果とし
て、細菌は不安定化を起こして破裂し、そのようにして破壊されるのだと思われ
てきた。
【0003】 T4リゾチームのさらなる酵素的または他の生化学的機能(例えば膜親和性)
はこれまで記述されていない。
はこれまで記述されていない。
【0004】 真菌と有害動物への耐性を増加させるために、リゾチーム遺伝子を外因性の、
または追加のDNAとして植物に導入できることは、DE 39 26 390
からわかっている。リゾチーム遺伝子とは本発明では、好適な環境でのRNAへ
の転写とタンパク質への翻訳後に、リゾチームの既知の特性を持つ酵素の形成を
もたらす任意の核酸(DNA)であると解される。これらの酵素は形質転換植物
を植物病原性の真菌と有害動物から保護する。
または追加のDNAとして植物に導入できることは、DE 39 26 390
からわかっている。リゾチーム遺伝子とは本発明では、好適な環境でのRNAへ
の転写とタンパク質への翻訳後に、リゾチームの既知の特性を持つ酵素の形成を
もたらす任意の核酸(DNA)であると解される。これらの酵素は形質転換植物
を植物病原性の真菌と有害動物から保護する。
【0005】 トランスジェニック植物に伝達される遺伝子構築物は、植物中で活性なプロモ
ーター、大麦由来のα−アミラーゼのシグナルペプチドとバクテリオファージT
4のリゾチームとをコードするDNA配列を含有するT4リゾチームのキメラ遺
伝子、およびポリアデニル化シグナルを含むことが好ましい。T4リゾチームの
アミノ酸配列はファージT4から得られる。アミノ酸140〜142に存在する
N結合型グリコシル化のコンセンサス配列(Asn−X−Ser/Thr)によ
り、グリコシル化された形のT4リゾチームタンパク質が植物中で産生される(
During,K.;Porsch,P.;Fladung,M.;Lorz,
H.「植物病原性細菌Erwina carotovoraに耐性な遺伝子導入
ジャガイモ(Transgenetic potato plants res
istant to the phytopathogenic bacter
ia Erwina carotovora)」The Plant Jour
nal 3,587〜598(1993))。植物体内(in planta)
で起こるグリコシル化は特許DE 39 26 390には記述されていないが
、これは、まだ詳細に議論されたことのない酵素特性または酵素機能の変化の原
因でありうる。例えば酵素の変換率が有意に低下する可能性がある。特許DE
39 26 390には、リゾチームコードDNA配列を含有するトランスジェ
ニック植物の真菌と有害動物に対する耐性を増加させるためにリゾチームを利用
することしか記述されていない。これは、上述の特性によって特定される遺伝子
構築物を使って行なわれる。これらの遺伝子構築物は、トランスジェニック植物
中でその系の効率を低下させうる、可能な影響因子を考慮していない。医学また
は獣医学での医薬として、または保存添加物としてT4リゾチームを精製し使用
するためのバイオリアクターとしてのトランスジェニック植物におけるT4リゾ
チームの生産は考慮されていない。
ーター、大麦由来のα−アミラーゼのシグナルペプチドとバクテリオファージT
4のリゾチームとをコードするDNA配列を含有するT4リゾチームのキメラ遺
伝子、およびポリアデニル化シグナルを含むことが好ましい。T4リゾチームの
アミノ酸配列はファージT4から得られる。アミノ酸140〜142に存在する
N結合型グリコシル化のコンセンサス配列(Asn−X−Ser/Thr)によ
り、グリコシル化された形のT4リゾチームタンパク質が植物中で産生される(
During,K.;Porsch,P.;Fladung,M.;Lorz,
H.「植物病原性細菌Erwina carotovoraに耐性な遺伝子導入
ジャガイモ(Transgenetic potato plants res
istant to the phytopathogenic bacter
ia Erwina carotovora)」The Plant Jour
nal 3,587〜598(1993))。植物体内(in planta)
で起こるグリコシル化は特許DE 39 26 390には記述されていないが
、これは、まだ詳細に議論されたことのない酵素特性または酵素機能の変化の原
因でありうる。例えば酵素の変換率が有意に低下する可能性がある。特許DE
39 26 390には、リゾチームコードDNA配列を含有するトランスジェ
ニック植物の真菌と有害動物に対する耐性を増加させるためにリゾチームを利用
することしか記述されていない。これは、上述の特性によって特定される遺伝子
構築物を使って行なわれる。これらの遺伝子構築物は、トランスジェニック植物
中でその系の効率を低下させうる、可能な影響因子を考慮していない。医学また
は獣医学での医薬として、または保存添加物としてT4リゾチームを精製し使用
するためのバイオリアクターとしてのトランスジェニック植物におけるT4リゾ
チームの生産は考慮されていない。
【0006】 ちなみに、真菌と有害動物に対するT4リゾチームの作用様式(特許DE 3
9 26 390の登録時には、そのムラミナダーゼ活性のみが知られていた)
は今なお解明されていない。特許DE 39 26 390で下されたリゾチー
ム遺伝子の定義はリゾチームの既知の特性を有するタンパク質への翻訳に関する
ものに過ぎない。
9 26 390の登録時には、そのムラミナダーゼ活性のみが知られていた)
は今なお解明されていない。特許DE 39 26 390で下されたリゾチー
ム遺伝子の定義はリゾチームの既知の特性を有するタンパク質への翻訳に関する
ものに過ぎない。
【0007】 本発明の目的は広範な用途を持つ新しいタイプのタンパク質とペプチドの調製
、そして好ましくは微生物からの防護へのそれらの使用である。
、そして好ましくは微生物からの防護へのそれらの使用である。
【0008】 驚くべきことに、T4リゾチーム分子の構造機能分析により、T4リゾチーム
の抗微生物作用が酵素的ムラミダーゼ活性とは無関係であることが見出された。
変性したT4リゾチームを加熱すると、それはもはや何の酵素活性も持たないが
、それでもなお完全な抗微生物作用を示すことが見出された。
の抗微生物作用が酵素的ムラミダーゼ活性とは無関係であることが見出された。
変性したT4リゾチームを加熱すると、それはもはや何の酵素活性も持たないが
、それでもなお完全な抗微生物作用を示すことが見出された。
【0009】 さらに、両親媒性αヘリックスがT4リゾチームのC末端部分に同定されたが
、これは驚くべきことにそれだけで抗微生物作用を発揮するのに十分である。し
かし、このペプチド配列(T4リゾチーム中のアミノ酸143〜155)は酵素
活性を持たない。このようにリゾチームの抗微生物作用にとっては膜相互作用機
能が必須であり、それは例えば両親媒性αヘリックス143〜155によって発
揮されうる。
、これは驚くべきことにそれだけで抗微生物作用を発揮するのに十分である。し
かし、このペプチド配列(T4リゾチーム中のアミノ酸143〜155)は酵素
活性を持たない。このようにリゾチームの抗微生物作用にとっては膜相互作用機
能が必須であり、それは例えば両親媒性αヘリックス143〜155によって発
揮されうる。
【0010】 これまで知られていたT4リゾチームの特性に反して、抗微生物作用を発揮す
るのに酵素的に活性なタンパク質は必要でない。
るのに酵素的に活性なタンパク質は必要でない。
【0011】 本発明に従い、リゾチーム(具体的にはT4リゾチーム)に由来するが、もや
はリゾチーム機能「ムラミダーゼ活性」を含まないタンパク質とペプチドが調製
された。
はリゾチーム機能「ムラミダーゼ活性」を含まないタンパク質とペプチドが調製
された。
【0012】 本発明の好ましい変化体(Variante)では、それらは以下の配列I:
MNIFEMLRID XRLRLKIYKD TEGYYTIGIG HLLTKSPSLN AAKSELDKAI 50 GRNCNGVITK DEAEKLFNQD VDAAVRGILR NAKLKPVYDS LDAVRRCALI 100 NMVFQMGETG VAGFTNSLRM LQQKRWDEAA VNLAKSRWYN QTPNRAKRVI 150 TTFRTGTWDA YKNL 164 を示す。ここで、Xはグルタミン酸以外の任意のアミノ酸を表わす。
MNIFEMLRID XRLRLKIYKD TEGYYTIGIG HLLTKSPSLN AAKSELDKAI 50 GRNCNGVITK DEAEKLFNQD VDAAVRGILR NAKLKPVYDS LDAVRRCALI 100 NMVFQMGETG VAGFTNSLRM LQQKRWDEAA VNLAKSRWYN QTPNRAKRVI 150 TTFRTGTWDA YKNL 164 を示す。ここで、Xはグルタミン酸以外の任意のアミノ酸を表わす。
【0013】 本発明はこのタンパク質、このタンパク質の一部、および変異または断片化に
よって配列Iから誘導されたタンパク質とペプチドを包含する。
よって配列Iから誘導されたタンパク質とペプチドを包含する。
【0014】 特に好ましい変化体の一つは、コンセンサス配列NQT(T4リゾチーム中の
アミノ酸140〜142)の任意の変異である。この変異により、トランスジェ
ニック真核生物への発現と共に(抗微生物能を低下させうる)N結合型グリコシ
ル化が起こらない状況を達成できる。
アミノ酸140〜142)の任意の変異である。この変異により、トランスジェ
ニック真核生物への発現と共に(抗微生物能を低下させうる)N結合型グリコシ
ル化が起こらない状況を達成できる。
【0015】 配列Iに由来する好ましいタンパク質はT4リゾチームのアミノ酸12〜16
4またはその一部を含む。
4またはその一部を含む。
【0016】 また本発明は、配列Iの短い一部分、好ましくはペプチドであって、アミノ酸
126〜141 WDEAAVNLAKSRWYNQ(140位/141位は変
異していてもよい)、143〜155 PNRAKRVIFTFRT、または少
なくともアミノ酸126〜141 WDEAAVNLAKSRWYNQ(140
位/141位が変異しているか、143〜155 PNRAKRVIFTFRT
を含有してもよい)に相当するものに関する。
126〜141 WDEAAVNLAKSRWYNQ(140位/141位は変
異していてもよい)、143〜155 PNRAKRVIFTFRT、または少
なくともアミノ酸126〜141 WDEAAVNLAKSRWYNQ(140
位/141位が変異しているか、143〜155 PNRAKRVIFTFRT
を含有してもよい)に相当するものに関する。
【0017】 さらに本発明は、少なくともT4リゾチームのアミノ酸126〜141または
143〜155(両親媒性ヘリックス)、またはさらにアミノ酸交換によって形
成された同じ機能性を持つ部分的に相同な配列を、他のアミノ酸配列に融合され
た成分として含有する組換えタンパク質をも包含する。
143〜155(両親媒性ヘリックス)、またはさらにアミノ酸交換によって形
成された同じ機能性を持つ部分的に相同な配列を、他のアミノ酸配列に融合され
た成分として含有する組換えタンパク質をも包含する。
【0018】 これらのタンパク質とペプチドの生産には様々な可能性が考えられる。
【0019】 変化体1: それらは、天然の供給源から抽出されたリゾチームの(好ましくはT4リゾチ
ームの11位での)アミノ酸交換によって得ることができる。このT4リゾチー
ム中に存在するアミノ酸であるグルタミン酸の他の任意のアミノ酸との交換は、
通常のタンパク質技術操作を使って行なわれる;それらには例えば細断片(su
bfragment)の新たなクローニング、天然の状態での、または修飾を同
時に導入しながらの、DNAの一定部分のポリメラーゼ連鎖反応による増幅と修
飾、もしくは部位特異的変異誘発によるものなどがある。
ームの11位での)アミノ酸交換によって得ることができる。このT4リゾチー
ム中に存在するアミノ酸であるグルタミン酸の他の任意のアミノ酸との交換は、
通常のタンパク質技術操作を使って行なわれる;それらには例えば細断片(su
bfragment)の新たなクローニング、天然の状態での、または修飾を同
時に導入しながらの、DNAの一定部分のポリメラーゼ連鎖反応による増幅と修
飾、もしくは部位特異的変異誘発によるものなどがある。
【0020】 変化体2: 断片は天然の供給源から抽出されたT4リゾチームの、プロテアーゼによる切
断によって生産されることが好ましい。
断によって生産されることが好ましい。
【0021】 変化体3: タンパク質とペプチドの生産のさらなる可能性としては、メリフィールド法な
どの実際によく知られている技術を用いた化学合成である。
どの実際によく知られている技術を用いた化学合成である。
【0022】 変化体4: 部分配列を生産するための、またはコードDNA配列に特異的変異またはラン
ダム変異を挿入するための、DNAの組換えを伴う方法は、とりわけ有利である
。この方法で得られる遺伝子は原核および真核トランスジェニック生物で、関連
タンパク質またはペプチドの発現に使用できる。この場合、T4リゾチームに起
因する主な生化学的特性、とりわけ殺細菌および殺真菌作用は、(ムラミダーゼ
活性を除いて)保持される。これら組換え遺伝子の発現は、コードされているタ
ンパク質またはペプチドを生産するために、またはインビボで直接的に抗微生物
作用を得る目的で、トランスジェニック生物において生じうる。
ダム変異を挿入するための、DNAの組換えを伴う方法は、とりわけ有利である
。この方法で得られる遺伝子は原核および真核トランスジェニック生物で、関連
タンパク質またはペプチドの発現に使用できる。この場合、T4リゾチームに起
因する主な生化学的特性、とりわけ殺細菌および殺真菌作用は、(ムラミダーゼ
活性を除いて)保持される。これら組換え遺伝子の発現は、コードされているタ
ンパク質またはペプチドを生産するために、またはインビボで直接的に抗微生物
作用を得る目的で、トランスジェニック生物において生じうる。
【0023】 本発明のタンパク質の好ましい使用は、配列Iについては、基本タンパク質骨
格として、他の抗微生物活性ペプチド、好ましくは両親媒性ヘリックスの「担体
タンパク質」としても役立つことである。このようにして、現実の有効配列(短
いペプチド)を安定化できる。したがって、本発明によれば、ペプチド配列14
3〜155 PNRAKRVIFTFRTを別の天然ペプチド配列または合理的
設計によって開発したもので置換できる。
格として、他の抗微生物活性ペプチド、好ましくは両親媒性ヘリックスの「担体
タンパク質」としても役立つことである。このようにして、現実の有効配列(短
いペプチド)を安定化できる。したがって、本発明によれば、ペプチド配列14
3〜155 PNRAKRVIFTFRTを別の天然ペプチド配列または合理的
設計によって開発したもので置換できる。
【0024】 本発明に従って生産されるタンパク質とペプチドは抗微生物特性を有し、少な
くともT4リゾチームと同等であって、それをいくらか超える効果を持つ。一例
として、これを大腸菌細胞の生存率を用いて次に示す。
くともT4リゾチームと同等であって、それをいくらか超える効果を持つ。一例
として、これを大腸菌細胞の生存率を用いて次に示す。
【0025】
【表1】
【0026】 この表は、T4リゾチームと熱変性T4リゾチームの殺細菌活性に有意差がな
いことを示している;ここでは熱変性T4リゾチームが選ばれた条件下でさえ、
もはや100%は溶解しないことを考慮すべきである。しかし熱変性T4リゾチ
ームはもはや何の酵素活性(ムラミダーゼ)も示さない。6番目のアミノ酸(メ
チオニン)がリジンで置換されている変異体M6Kは、疎水性アミノ酸が極性ア
ミノ酸で置換されているので、既に、より高い殺細菌活性を示している。(配列
Iの)T4リゾチームのアミノ酸143〜155を含むペプチドA4も酵素的ム
ラミダーゼ活性を示さないが、有意に高い殺細菌活性を持つ。
いことを示している;ここでは熱変性T4リゾチームが選ばれた条件下でさえ、
もはや100%は溶解しないことを考慮すべきである。しかし熱変性T4リゾチ
ームはもはや何の酵素活性(ムラミダーゼ)も示さない。6番目のアミノ酸(メ
チオニン)がリジンで置換されている変異体M6Kは、疎水性アミノ酸が極性ア
ミノ酸で置換されているので、既に、より高い殺細菌活性を示している。(配列
Iの)T4リゾチームのアミノ酸143〜155を含むペプチドA4も酵素的ム
ラミダーゼ活性を示さないが、有意に高い殺細菌活性を持つ。
【0027】 実例として挙げたこれらの物質は、同じ方法により、Phytophthor
a nicotianaeの胚芽遊走子に対して殺真菌作用を示す。
a nicotianaeの胚芽遊走子に対して殺真菌作用を示す。
【0028】
【表2】
【0029】
【表3】
【0030】 本発明のタンパク質とペプチドまたはトランスジェニック生物の無加工材料は
、例えば食品または飼料への添加物、もしくは他の物質用の添加物として、それ
らにおける微生物の増殖を抑制するために使用できる。さらに、これらのタンパ
ク質とペプチドは医療において感染性疾患にも使用できる。さらなる応用分野は
癌治療である。というのは、癌細胞は健康な真核細胞の膜とは違い著しく異なる
構造をもつ細菌細胞に似た細胞膜構造を持つからである。
、例えば食品または飼料への添加物、もしくは他の物質用の添加物として、それ
らにおける微生物の増殖を抑制するために使用できる。さらに、これらのタンパ
ク質とペプチドは医療において感染性疾患にも使用できる。さらなる応用分野は
癌治療である。というのは、癌細胞は健康な真核細胞の膜とは違い著しく異なる
構造をもつ細菌細胞に似た細胞膜構造を持つからである。
【0031】 微生物によって引き起こされる疾患はいたるところで発生するので、本発明の
応用分野は非常に多い。それらはヒトの医学および獣医学から植物での耐性栽培
および食品での殺細菌および殺真菌添加物の予防的使用に及ぶ。さらに、本発明
が包含するタンパク質とペプチドの特性は、微生物による感染症とは関係しない
、例えば癌治療などの他の応用分野での使用にも適している。
応用分野は非常に多い。それらはヒトの医学および獣医学から植物での耐性栽培
および食品での殺細菌および殺真菌添加物の予防的使用に及ぶ。さらに、本発明
が包含するタンパク質とペプチドの特性は、微生物による感染症とは関係しない
、例えば癌治療などの他の応用分野での使用にも適している。
【0032】 特に、より小さい部分配列(好ましくはT4リゾチームのC末端部分から誘導
されるもの)の使用は、例えば組織への透過性の向上、サイズが小さいことによ
るアレルゲン性の低下、抗微生物活性の増加などといった特定の利点を有しうる
。
されるもの)の使用は、例えば組織への透過性の向上、サイズが小さいことによ
るアレルゲン性の低下、抗微生物活性の増加などといった特定の利点を有しうる
。
【0033】 下記の実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。
【0034】 1.T4リゾチームの修飾によるペプチドとタンパク質の生産 精製T4リゾチームから出発して、適当なプロテアーゼ(例えばクロストリパ
イン、ペプシン、トリプシンなど)を用いた消化によってペプチド断片の混合物
を生成し、次にそれをクロマトグラフィー法(C18カラムによる逆相HPLC
)で個々の断片に分離する。大腸菌もしくは他のグラム陰性型細菌(例えばEr
winia carotovora、Agrobacterium tumef
aciens、Pseudomonas fluorescens)またはグラ
ム陽性型細菌(例えばMicrococcus lysodeikticus、
Clavibacter michiganensisなど)と共に1時間イン
キュベート(1×107 個の細菌細胞量に対して1〜10μgのタンパク質また
はペプチドを使用)した後、その懸濁液の連続希釈液を平板に撒き、生存細菌数
を数えることによって、個々の断片の殺細菌作用を決定する。個々の断片の殺真
菌作用は、Phytophthora nicotianae、または他のタイ
プの真菌の胞子と共に20時間インキュベートした後、平板に撒いて真菌菌糸の
成長長さの減少を測定することによって決定される。活性は標品としての精製T
4リゾチームとの関連で決定される。
イン、ペプシン、トリプシンなど)を用いた消化によってペプチド断片の混合物
を生成し、次にそれをクロマトグラフィー法(C18カラムによる逆相HPLC
)で個々の断片に分離する。大腸菌もしくは他のグラム陰性型細菌(例えばEr
winia carotovora、Agrobacterium tumef
aciens、Pseudomonas fluorescens)またはグラ
ム陽性型細菌(例えばMicrococcus lysodeikticus、
Clavibacter michiganensisなど)と共に1時間イン
キュベート(1×107 個の細菌細胞量に対して1〜10μgのタンパク質また
はペプチドを使用)した後、その懸濁液の連続希釈液を平板に撒き、生存細菌数
を数えることによって、個々の断片の殺細菌作用を決定する。個々の断片の殺真
菌作用は、Phytophthora nicotianae、または他のタイ
プの真菌の胞子と共に20時間インキュベートした後、平板に撒いて真菌菌糸の
成長長さの減少を測定することによって決定される。活性は標品としての精製T
4リゾチームとの関連で決定される。
【0035】 2.化学合成によるペプチドとタンパク質の生産 T4リゾチームに由来する確定したタンパク質またはペプチド部分配列、例え
ば両親媒性αヘリックス143〜155などは、化学的に合成することもできる
。殺細菌作用と殺真菌作用の決定は上述のように行なわれる。
ば両親媒性αヘリックス143〜155などは、化学的に合成することもできる
。殺細菌作用と殺真菌作用の決定は上述のように行なわれる。
【0036】 3.遺伝子工学ルートによるペプチドまたはタンパク質の生産 T4リゾチームまたはその一部をコードするDNA配列から出発して、そのD
NAの一定部分を、天然の状態で、または修飾を同時に導入しながら、組換えD
NAの生産方法(Sambrookら「Molecular Cloning,
A Laboratory Manual」(ニューヨーク・Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press,1989)を参照
されたい)を使用して(例えば細断片の新たなクローニング、ポリメラーゼ連鎖
反応による増幅と修飾、または部位特異的変異誘発によって)生産することがで
きる。本発明のタンパク質とペプチドをコードする新しいDNA配列は化学合成
によっても作成できる。この方法で作成されたDNA配列の正しさは、DNA配
列決定によって確認される。このようにして、T4リゾチームのC末端側の半分
、アミノ酸74からアミノ酸164までをコードするDNA配列を細断片として
クローニングするか、アミノ酸143〜155の両親媒性αヘリックスをコード
するDNA断片 をPCR増幅によって単離し、クローニングする。部位特異的
変異誘発により、Nグリコシル化のコンセンサス配列をN結合型グリコシル化が
もやは起こらないように変異させうる(例えばThr142→Ala142)。
NAの一定部分を、天然の状態で、または修飾を同時に導入しながら、組換えD
NAの生産方法(Sambrookら「Molecular Cloning,
A Laboratory Manual」(ニューヨーク・Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press,1989)を参照
されたい)を使用して(例えば細断片の新たなクローニング、ポリメラーゼ連鎖
反応による増幅と修飾、または部位特異的変異誘発によって)生産することがで
きる。本発明のタンパク質とペプチドをコードする新しいDNA配列は化学合成
によっても作成できる。この方法で作成されたDNA配列の正しさは、DNA配
列決定によって確認される。このようにして、T4リゾチームのC末端側の半分
、アミノ酸74からアミノ酸164までをコードするDNA配列を細断片として
クローニングするか、アミノ酸143〜155の両親媒性αヘリックスをコード
するDNA断片 をPCR増幅によって単離し、クローニングする。部位特異的
変異誘発により、Nグリコシル化のコンセンサス配列をN結合型グリコシル化が
もやは起こらないように変異させうる(例えばThr142→Ala142)。
【0037】 作成された組換え遺伝子は、特定のトランスジェニック原核または真核生物で
の発現が可能なように、適当なプロモーターの制御下にクローニングされる。こ
の工程を2つの例を用いて以下に説明する。
の発現が可能なように、適当なプロモーターの制御下にクローニングされる。こ
の工程を2つの例を用いて以下に説明する。
【0038】 4.細菌での生産(続いて単離を行なうもの) 本発明のタンパク質またはペプチドを細菌で発現させるには、作成した組換え
遺伝子を細菌発現ベクター(例えばQiagen社のpQEシリーズ由来)にク
ローニングする。精製を簡単にするために、例えば6×HISタグや、c−my
cタグまたはstrep−タグなどのいわゆるタグペプチド配列を融合できる。
誘導性プロモーター(例えばTacプロモーター)の制御下では、本発明のタン
パク質とペプチドの正確な生合成を、制御された条件で行なうことができる。本
発明のタンパク質またはペプチドは、6×HISタグを利用してニッケルキレー
トカラムでのアフィニティークロマトグラフィーで一回単離、精製することによ
り、高純度生成物を与える。他の原核生物への伝達とそこでの本発明タンパク質
およびペプチドの生合成は同様に行なわれる。
遺伝子を細菌発現ベクター(例えばQiagen社のpQEシリーズ由来)にク
ローニングする。精製を簡単にするために、例えば6×HISタグや、c−my
cタグまたはstrep−タグなどのいわゆるタグペプチド配列を融合できる。
誘導性プロモーター(例えばTacプロモーター)の制御下では、本発明のタン
パク質とペプチドの正確な生合成を、制御された条件で行なうことができる。本
発明のタンパク質またはペプチドは、6×HISタグを利用してニッケルキレー
トカラムでのアフィニティークロマトグラフィーで一回単離、精製することによ
り、高純度生成物を与える。他の原核生物への伝達とそこでの本発明タンパク質
およびペプチドの生合成は同様に行なわれる。
【0039】 5.トランスジェニック植物の作出(単離を伴わないもの) トランスジェニック真核生物への発現に関して、トランスジェニック双子葉植
物の例を選択した。本発明のタンパク質またはペプチドをコードする組換え遺伝
子を植物中で構成的なプロモーターまたは調節可能な活性プロモーター(例えば
カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター、Agrobacteriu
m tumefaciensマンノピンシンターゼプロモーター、トウモロコシ
GapC4プロモーター、ジャガイモユビキチンプロモーターなど)の制御下に
クローニングする。さらに、転写されたmRNAの安定化を達成するために、タ
ーミネーター配列(例えばカリフラワーモザイクウイルス35Sターミネーター
、Agrobacterium tumefaciensノパリンシンターゼタ
ーミネーター、Agrobacterium tumefaciensオクトピ
ンシンターゼターミネーターなど)をその遺伝子の3’末端に融合する。この発
現カセットを、Agrobacterium tumefaciensを用いる
遺伝子導入に適したバイナリーベクター(例えばpBIN19、pPCV701
、pSR8−30、pSR8−35/1など)に移入する。遺伝子操作によって
改変されたこれらアグロバクテリアによる植物外植片の感染により、遺伝子をそ
の植物に移入する。植物の形質転換は、Agrobacterium tume
faciensを用いる方法以外に、他の適当な方法(例えばパーティクルガン
によるものなど)のいずれでも行いうる。外因性遺伝子のトランスジェニック植
物への導入は、単離したゲノムDNAの適当な制限消化とそれに続くサザンハイ
ブリダイゼーションによって、またはポリメラーゼ連鎖反応を利用した外因性D
NA配列の増幅に よって検出できる。遺伝子のmRNAへの転写はノーザンブ
ロットか他の適当な方法で検出できる。コードされているタンパク質への遺伝子
の翻訳はウェスタンブロット法、様々な構成のELISA試験または他の適当な
方法で検査、決定できる。この方法で本発明のタンパク質またはペプチドの存在
を証明できる。それらの生物学的活性は、先に記述した方法で決定される。さら
に耐性栽培法の場合は、その生物学的効率をトランスジェニック植物に対する耐
性テストによって決定できる。また本発明のタンパク質とペプチドは、生産のた
めにトランスジェニック植物中で過剰発現させうる。他の真核生物への伝達とそ
こでの本発明タンパク質とペプチドの生合成は同様に行なわれる。
物の例を選択した。本発明のタンパク質またはペプチドをコードする組換え遺伝
子を植物中で構成的なプロモーターまたは調節可能な活性プロモーター(例えば
カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター、Agrobacteriu
m tumefaciensマンノピンシンターゼプロモーター、トウモロコシ
GapC4プロモーター、ジャガイモユビキチンプロモーターなど)の制御下に
クローニングする。さらに、転写されたmRNAの安定化を達成するために、タ
ーミネーター配列(例えばカリフラワーモザイクウイルス35Sターミネーター
、Agrobacterium tumefaciensノパリンシンターゼタ
ーミネーター、Agrobacterium tumefaciensオクトピ
ンシンターゼターミネーターなど)をその遺伝子の3’末端に融合する。この発
現カセットを、Agrobacterium tumefaciensを用いる
遺伝子導入に適したバイナリーベクター(例えばpBIN19、pPCV701
、pSR8−30、pSR8−35/1など)に移入する。遺伝子操作によって
改変されたこれらアグロバクテリアによる植物外植片の感染により、遺伝子をそ
の植物に移入する。植物の形質転換は、Agrobacterium tume
faciensを用いる方法以外に、他の適当な方法(例えばパーティクルガン
によるものなど)のいずれでも行いうる。外因性遺伝子のトランスジェニック植
物への導入は、単離したゲノムDNAの適当な制限消化とそれに続くサザンハイ
ブリダイゼーションによって、またはポリメラーゼ連鎖反応を利用した外因性D
NA配列の増幅に よって検出できる。遺伝子のmRNAへの転写はノーザンブ
ロットか他の適当な方法で検出できる。コードされているタンパク質への遺伝子
の翻訳はウェスタンブロット法、様々な構成のELISA試験または他の適当な
方法で検査、決定できる。この方法で本発明のタンパク質またはペプチドの存在
を証明できる。それらの生物学的活性は、先に記述した方法で決定される。さら
に耐性栽培法の場合は、その生物学的効率をトランスジェニック植物に対する耐
性テストによって決定できる。また本発明のタンパク質とペプチドは、生産のた
めにトランスジェニック植物中で過剰発現させうる。他の真核生物への伝達とそ
こでの本発明タンパク質とペプチドの生合成は同様に行なわれる。
【0040】 個々の真核生物で各遺伝子を最適に発現させるには、使用するコドンをそこで
好まれるコドンに適合させ、またmRNAとそのタンパク質の安定性に影響する
他の因子を適合させる必要があるかもしれない。
好まれるコドンに適合させ、またmRNAとそのタンパク質の安定性に影響する
他の因子を適合させる必要があるかもしれない。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61P 31/00 A61K 37/02 C12N 9/36 37/54 Fターム(参考) 4B021 MC01 MK07 4B024 AA01 BA12 CA03 EA04 4B050 CC04 DD20 LL01 4C084 AA01 AA02 AA06 AA07 BA01 BA08 BA22 BA23 CA01 DA42 NA14 ZB262 ZB331 ZB332 ZB351 ZB352 4H011 AA01 AA02 AA03 BB19 DH11
Claims (12)
- 【請求項1】 タンパク質とペプチドが、T4リゾチーム由来であり、かつ
T4リゾチームの以下のアミノ酸: アミノ酸140〜142が変異され得る、アミノ酸12〜164、 アミノ酸140および/または141が変異され得る、アミノ酸126〜14 1、 アミノ酸143〜155、 アミノ酸140〜142が変異され得る、アミノ酸74〜164、 アミノ酸140〜142が変異され得る、アミノ酸114〜164、 アミノ酸124〜164、 を示すものより選ばれるものである、ムラミダーゼ活性を持たない、リゾチーム
類似タンパク質とペプチド。 - 【請求項2】 タンパク質またはペプチドが天然の供給源由来のT4リゾチ
ームのプロテアーゼによる切断により得られるものであることを特徴とする請求
項1記載のタンパク質またはペプチドの生産方法。 - 【請求項3】 タンパク質またはペプチドが実際によく知られている化学合
成法により得られるものであることを特徴とする請求項1記載のタンパク質また
はペプチドの生産方法。 - 【請求項4】 タンパク質またはペプチドが実際によく知られている技術を
用いて遺伝子工学ルートにより得られるものであることを特徴とする請求項1記
載のタンパク質またはペプチドの生産方法。 - 【請求項5】 タンパク質とペプチドが部分配列を生産するためのまたはコ
ードDNA配列に変異を挿入するためのDNAの組換え法により得られることを
特徴とし、得られた遺伝子は原核トランスジェニック生物および真核トランスジ
ェニック生物にて発現し、これらの組換え遺伝子の発現が、コードされるタンパ
ク質またはペプチドを生産するために、またはインビボでの直接的な抗微生物活
性の目的のためにトランスジェニック生物において生じ得るものである、請求項
4記載の方法。 - 【請求項6】 ヒトの医学および獣医学における医用薬効剤としての、植物
での耐性栽培のための抗微生物物質としての、食品添加物および飼料添加物にお
ける殺細菌添加物および殺真菌添加物としてのまたはインビボおよびインビトロ
での他の抗微生物防護物質としての予防的使用のための、トランスジェニック生
物ならびに癌治療における外因性のタンパク質としての、または抗ウイルス剤の
成分としての、ムラミダーゼ活性を含まない、リゾチーム類似タンパク質とペプ
チドの使用。 - 【請求項7】 タンパク質とペプチドがT4リゾチームに由来し、かつ天然
T4リゾチーム配列の11位のグルタミン酸残基が任意のアミノ酸残基により置
換されたものである請求項6記載の使用。 - 【請求項8】 タンパク質とペプチドが、アミノ酸配列 MNIFEMLRID XRLRLKIYKD TEGYYTIGIG HLLTKSPSLN AAKSELDKAI 50 GRNCNGVITK DEAEKLFNQD VDAAVRGILR NAKLKPVYDS LDAVRRCALI 100 NMVFQMGETG VAGFTNSLRM LQQKRWDEAA VNLAKSRWYN QTPNRAKRVI 150 TTFRTGTWDA YKNL 164 、ここで、Xはグルタミン酸以外の任意のアミノ酸を表わす、 ならびにこの配列の断片、変化体および変異体であることを特徴とする、請求項
5または6記載の使用。 - 【請求項9】 リゾチーム類似タンパク質とペプチドが請求項1記載のもの
である請求項6または7記載の使用。 - 【請求項10】 基本タンパク質骨格としてのまたは他の抗微生物活性ペプ
チド、好ましくは両親媒性ヘリックスの「担体タンパク質」としての、ムラミダ
ーゼ活性を含まない、リゾチーム類似タンパク質とペプチドの使用。 - 【請求項11】 タンパク質とペプチドがT4リゾチームに由来し、かつ天
然T4リゾチーム配列の11位のグルタミン酸残基が任意のアミノ酸残基により
置換されたものである、請求項10記載の使用。 - 【請求項12】 タンパク質とペプチドが、アミノ酸配列 MNIFEMLRID XRLRLKIYKD TEGYYTIGIG HLLTKSPSLN AAKSELDKAI 50 GRNCNGVITK DEAEKLFNQD VDAAVRGILR NAKLKPVYDS LDAVRRCALI 100 NMVFQMGETG VAGFTNSLRM LQQKRWDEAA VNLAKSRWYN QTPNRAKRVI 150 TTFRTGTWDA YKNL 164 、ここで、Xはグルタミン酸以外の任意のアミノ酸を表わす、 ならびにこの配列の断片、変化体および変異体であることを特徴とする、請求項
10または11記載の使用。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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DE19749973.2 | 1997-11-05 | ||
PCT/DE1998/003287 WO1999024589A2 (de) | 1997-11-05 | 1998-10-31 | Lysozym-analoge proteine und peptide mit antimikrobieller wirkung, ihre herstellung und ihre verwendung |
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Publication Number | Publication Date |
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ID=7848391
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000520583A Pending JP2002503443A (ja) | 1997-11-05 | 1998-10-31 | 抗微生物活性を持つリゾチーム類似タンパク質とペプチド、それらの生産および使用 |
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EP (1) | EP1029061A2 (ja) |
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AU (1) | AU751422B2 (ja) |
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DE19749973C1 (de) * | 1997-11-05 | 1998-10-22 | Klaus Dr Duering | Lysozym-analoge Proteine und Peptide mit antimikrobieller Wirkung, ihre Herstellung und ihre Verwendung |
JP5414972B2 (ja) * | 2003-12-23 | 2014-02-12 | バイオキット, エセ.アー. | 病原体感染の検出のための組成物および方法 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0155190A3 (en) * | 1984-03-16 | 1987-08-19 | Genentech, Inc. | Non-naturally occurring zymogens and methods and materials for their construction |
IT1190433B (it) * | 1985-12-11 | 1988-02-16 | Prodotti Antibiotici Spa | Peptidi correlati al lisozima |
AU2802989A (en) * | 1987-11-02 | 1989-06-01 | Louisiana State University Agricultural And Mechanical College | Plants genetically enhanced for disease resistance |
AU5433190A (en) * | 1989-04-10 | 1990-11-16 | Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Lytic peptides, use for growth, infection and cancer |
DE3926390A1 (de) * | 1989-08-10 | 1991-02-14 | Bayer Ag | Verwendung von lysozym genen in pflanzen zur resistenzerhoehung |
US5422108A (en) * | 1991-09-19 | 1995-06-06 | Smart Plants International Inc. | Protection of plants against plant pathogens |
US5607914A (en) * | 1993-01-13 | 1997-03-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Synthetic antimicrobial peptides |
DE19749973C1 (de) * | 1997-11-05 | 1998-10-22 | Klaus Dr Duering | Lysozym-analoge Proteine und Peptide mit antimikrobieller Wirkung, ihre Herstellung und ihre Verwendung |
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- 1997-11-05 DE DE19749973A patent/DE19749973C1/de not_active Expired - Fee Related
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- 1998-10-31 NZ NZ504368A patent/NZ504368A/xx unknown
- 1998-10-31 WO PCT/DE1998/003287 patent/WO1999024589A2/de not_active Application Discontinuation
- 1998-10-31 JP JP2000520583A patent/JP2002503443A/ja active Pending
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- 1998-10-31 AU AU18679/99A patent/AU751422B2/en not_active Ceased
- 1998-10-31 IL IL13598798A patent/IL135987A0/xx unknown
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- 2000-05-05 US US09/567,563 patent/US6515106B1/en not_active Expired - Fee Related
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Legal Events
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050616 |
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A02 | Decision of refusal |
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