JP2002500234A

JP2002500234A - インシュリン関連疾患の治療および診断の方法および組成物

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Publication number: JP2002500234A
Application number: JP2000527564A
Authority: JP
Inventors: クリフォードダックワース、ウィリアム; ジー．ハメル、フレデリック
Original assignee: クリフォードダックワース、ウィリアム; ジー．ハメル、フレデリック
Priority date: 1998-01-08
Filing date: 1999-01-08
Publication date: 2002-01-08
Also published as: BR9906833A; WO1999035169A9; CN1292798A; WO1999035169A2; EP1045860A2; WO1999035169A3; AU2313899A; CA2317674A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、絶対的または相対的インシュリン欠乏症、重度のインシュリン抵抗、脂質蓄積または過度の脂質合成、またはタンパク質異化作用または分解の疾患の症状を治療または軽減するための方法および組成物に関する。本発明はまた、このような疾患の治療の検出および評価方法を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景細胞のタンパク質分解は、複雑な一組の相互作用の過程である。タンパク質異
化作用は、大きな臨床的関わり合いを有している。多くの病理状態が、タンパク
質分解の増加に係わっており、これは、しばしば患者に害を及ぼす。過度のタン
パク質および／または筋肉分解は、制御されていない糖尿病（たとえば、糖尿病
患者における筋肉質量の減少）、重度のストレス（たとえば、外傷、火傷、敗血
症）、急性心筋梗塞、慢性消耗病（たとえば、エイズ、癌）ならびに他の状態お
よび病気で発生する。

【０００２】リソソームのタンパク質加水分解が、細胞のタンパク質分解の主な部位である
と従来考えらていたが、最近の研究は、細胞のタンパク質分解における標的タン
パク質の分解および短期変質（すなわちインシュリンによる阻害）のような、特
に選択的なタンパク質加水分解経路における細胞質ゾルのタンパク質加水分解過
程が重要な役割を有することを示している。プロテアソーム(proteasome)および
リソソームが主な２つの細胞下タンパク質区画である。これらの区画はいずれも
インシュリンに影響される。極端な状況（全くインシュリンがない場合）では、
リソソ−ムの自己食作用が活性化するが、ほとんどの生理的および病態生理状況
下（たとえば、ストレス）では、プロテアソームがインシュリンの主な標的にな
る場合がある（たとえば、食後のタンパク質加水分解の減少）。プロソームは、あらゆる生物の本質的にすべての細胞型の細胞質ゾルに存在する
偏在性円筒形細胞小器官であり、全細胞タンパク質の１〜２％を占める。プロソ
ームは、高分子量多触媒性プロテイナーゼ（ＭＣＰ）と同一であることがわかっ
たとき、その名がプロテアソームに変えられた。多触媒性プロテイナーゼは、多
数の明確な触媒部位(５箇所にもわたる）および２０〜３５ｋＤａ範囲の多数の帯からなるＳＤＳゲル上の特徴的な縞模様を有する。多触媒プロテイナーゼおよ
びその成分は異なる分子形態（１５Ｓ，２０Ｓおよび２６Ｓ）および異なる経路
（ＡＴＰ依存、ユビキチンおよび非ＡＴＰ依存）を含む複雑なタンパク質加水分
解システムの一部である。

【０００３】このシステムに対する強い関心が発達し、急速に拡大している。細胞質ゾルの
タンパク質分解複合体であるプロテアソームは、細胞タンパク質代謝回転におけ
る中心的な成分であることが最近の証拠により裏付けられている。プロテアソー
ム活性は、ユビキチン媒介タンパク質加水分解、インシュリン変質タンパク質加
水分解、抗原プロセシング、アポプトーシス、細胞増殖および自律分化ならびに
他の多くのタンパク質加水分解依存細胞機能にとって重要である。多触媒性プロ
テイナーゼは、ほとんどすべての細胞分解機能に係わってきたが、その制御につ
いては比較的ほとんど知られていない。

【０００４】インシュリン分解酵素（ＩＤＥ）インシュリナーゼは、インシュリン分解での
比較的高い特異性によって初めて同定された。インシュリンはこの酵素に対して
最も高い親和性を有しているが、その後、インシュリン分解酵素の他の基質が認
識されている。この酵素について、分子量、タンパク質加水分解活性および至適
ｐＨのような基本的な特性についての様々な報告があり、この酵素の特徴付けは
困難であった。特に、不安定さおよび手法によって変化する特性のために、この
タンパク質の精製は困難であった。同質性を得るまでの精製およびその後のｃＤ
ＮＡの単離によりそれらの問題のいくつかが解明した。インシュリン分解酵素は
、古典的なプロテイナーゼ類と同族でなくむしろＺｎ²⁺の必要条件を有するが典
型的なＺｎ²⁺の結合部位を有していない金属プロテイナーゼ類の提案された新し
い上綱の第１の代表物である。インシュリン分解酵素の分子量は、約１１０，０
００ダルトンである。

【０００５】インシュリン分解酵素は、インシュリンの細胞プロセシングおよび分解にとっ
て重要である。細胞のインシュリン分解の一般的な特徴は、この酵素の特性と一
致しており、インシュリン分解酵素は、インシュリン分解が始まるエンドソーム
に存在する。インシュリンの細胞分解生成物は、インシュリン分解酵素の公知の
切断部位と一致している。しかし、インシュリン分解酵素の一次細胞位置は細胞
質ゾルであり、この酵素は、インシュリンと結合および内化しない細胞を含むす
べての検査された細胞型に存在する。これは、インシュリン分解酵素は、単なる
インシュリン分解以上のより広い機能を有していることを示唆している。この考
え方は、大腸菌からヒトまでの生物でのインシュリン分解酵素の存在およびその
進化的保存によって裏付けられている。インシュリン分解酵素はまた、その発達
が調節されていることが示されており、細胞の分別および増殖に関わり合いがあ
る。インシュリン分解酵素は、多触媒性プロテイナーゼまたはプロテアソームの
活性を調節できることが示されている。インシュリン分解酵素および多触媒性プ
ロテイナーゼは複合体として細胞質ゾルから単離することができる。これらの酵
素の会合体を維持する条件下において、インシュリンは、この多触媒性酵素の基
質の全部ではなく、そのうちのいくつかの多触媒性プロテイナーゼ分解を阻害す
る。インシュリン分解酵素および多触媒性プロテイナーゼの精製による分離の後
、インシュリンの効果は消失する。インシュリン分解酵素、多触媒性プロテイナ
ーゼおよびそれらの複合体は、タンパク質の異化作用と関わり合いがある。しかし、インシュリンの細胞内作用は一般的に受け入れられておらず、このよう
な活性についての研究もなかった。インシュリンの細胞内効果をもたらす公知の
メカニズムがなかったので、これらの問題を解決する方法が制限されていた。細
胞のタンパク質加水分解の媒介でのプロテアソームが果たす重要な役割を考慮す
ると、プロテアソーム活性を変性したり、その変性を評価するシステムは、糖尿
病、ストレス、エイズ、癌などの、タンパク質の異化作用の変化に付随する状態
において重要な臨床的関わり合いを有し得、このようなシステムの必要性が依然
として存在する。

【０００６】発明の要旨本発明は、絶対的または相対的インシュリン欠乏症（たとえば、肥満患者にお
ける２型糖尿病）、重度のインシュリン抵抗、脂質蓄積または過度の脂質合成（
たとえば、肥満および／または糖尿病患者における体脂肪または脂質合成の増加
）、またはタンパク質異化作用または分解（たとえば、糖尿病または消耗症患者
における筋肉質量の減少）といった疾患の症状の治療または軽減方法およびこの
ような方法において用いることができるペプチドに関する。その必要性がある患
者におけるこのような疾患の症状の治療および軽減の好ましい方法は、患者にイ
ンシュリンのインシュリン分解酵素切断部位に隣接する配列を含むポリペプチド
を患者に投与することを含む。このようなペプチドは、インシュリン分解酵素と
多触媒性プロテイナーゼとの複合体の１つ以上の活性を阻害することが好ましい
。１つの実施形態では、症状の治療および軽減方法は、インシュリン分解酵素と
多触媒性プロテイナーゼとの複合体の活性を阻害するペプチドを投与することを
含む。

【０００７】本発明はまた、絶対的または相対的インシュリン欠乏症（たとえば、肥満患者
における２型糖尿病）、重度のインシュリン抵抗、脂質蓄積または過度の脂質合
成（たとえば、肥満および／または糖尿病患者における体脂肪または脂質合成の
増加）、またはタンパク質異化作用または分解（たとえば、糖尿病または消耗症
患者における筋肉質量の減少）といった疾患の検出方法に関する。このような検
出方法は、患者からの生体試料を用いて、インシュリン分解酵素と多触媒性プロ
テイナーゼとの複合体の活性を測定することを含む。好ましい検出方法では、こ
の活性レベルを適切な対照グループのレベルと比較する。１つの実施形態におい
て、この方法は、インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体の
活性に与える阻害剤の効果を測定することを含むことができる。

【０００８】本発明の他の実施形態では、患者からの生体試料を用いてのインシュリン分解
酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体の活性の測定は、絶対的または相対的
インシュリン欠乏症（たとえば、肥満患者における２型糖尿病）、重度のインシ
ュリン抵抗、脂質蓄積または過度の脂質合成（たとえば、肥満および／または糖
尿病患者における体脂肪または脂質合成の増加）、またはタンパク質異化作用ま
たは分解（たとえば、糖尿病または消耗症患者における筋肉質量の減少）といっ
た疾患の治療効果を評価するのに用いることができる。この方法において、この
活性レベルを適切な対照と比較し、患者のレベルが典型的な範囲に戻ったか、ま
たは入ったかどうかを決定する。

【０００９】インシュリン分解酵素インシュリン分解酵素は、Ｚｎ⁺⁺およびおそらくＭｎ⁺⁺も含有する金属酵素で
あり、その分解活性は１つ以上の二価のカチオンを必要とする。Ｚｎ⁺⁺およびＭ
ｎ⁺⁺の他に、Ｃａ⁺⁺もまた、生体外および無傷細胞内でのインシュリン分解酵素
の分解活性に影響を及ぼすことが示されている。インシュリン分解酵素は、Ｂ鎖
における残基９と１０との間、残基１０と１１との間、残基１６と１７との間、
残基２４と２５との間、残基２５と２６との間を含む部位でインシュリンを切断
する。インシュリンが最大の親和性を有する基質であるが、インシュリン分解酵
素は、他のペプチドおよびタンパク質とも作用する。一般的に、この酵素が認識
する基質は、インシュリンと構造上の同族関係を有する（プロインシュリン、プ
ロインシュリン中間体、表皮成長因子[ＥＧＦ]、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、リ
ラキシンおよび心房性ナトリウム利尿ペプチド[ＡＮＰ]）。この発見により、こ
の酵素はこれらのタンパク質の構造上の特徴を認識するという結論に到達した。

【００１０】インシュリン分解酵素は、無傷細胞または生体において精製、単離および研究
することができる。この酵素は、インシュリン分解酵素として、多触媒性プロテ
イナーゼとの複合体の一部として、または他の細胞内システムの成分として存在
することができる。インシュリン分解酵素の活性は、当業者に公知の種々のアッ
セイを用いて測定することができる。放射性同位体で標識されたタンパク質基質
を用いる典型的なアッセイでは、トリクロロ酢酸を用いて基質を沈殿させ、生成
物は溶けた状態にする。インシュリン分解酵素の活性測定法として、ＨＰＬＣを
ベースにしたアッセイも当該分野において公知である。公知のアッセイを用いて
、生体外または無傷細胞もしくは生体でのインシュリン分解酵素の活性をモニタ
ーすることができる。

【００１１】多触媒性プロテイナーゼプロテアソームとしても知られている多触媒性プロテイナーゼ（ＭＣＰ）は、
キモトリプシン様、トリプシン様およびペプチジル−グルタミル−分解活性など
を含む多数の触媒部位を有する。これらの触媒部位は、生体外および生体内アッ
セイに有用なタンパク質およびペプチドを含む種々の基質を分解する。多触媒性
プロテイナーゼは、無傷細胞または生体において精製、単離および研究すること
ができる。多触媒性プロテイナーゼの種々の活性は、当業者に公知の種々のアッ
セイを用いて測定することができる。放射性同位体で標識されたタンパク質基質
を用いる典型的なアッセイでは、トリクロロ酢酸を用いて基質を沈殿させ、生成
物は溶けた状態にする。また、多触媒性プロテイナーゼまたはインシュリン分解
酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体による切断時のペプチドからの発色ま
たは蛍光発光性化合物の放出を用いるペプチドをベースにしたアッセイもある。
公知のアッセイを用いて、生体外または無傷細胞もしくは生体での多触媒性プロ
テイナーゼまたはその複合体の活性をモニタすることができる。

【００１２】単離したプロテアソームへ添加したインシュリンは、キモトリプシン様および
トリプシン様活性を非拮抗的に阻害する。この阻害を用いて、単独またはインシ
ュリン分解酵素との複合体の一部としての多触媒性プロテイナーゼの活性に与え
るタンパク質の効果を調べることができる。プロテアソーム活性の修飾要因の効
果を直接評価することができる生体外システムが存在する。インシュリンおよび
関連タンパク質は、このシステムに直接の効果を有する。これは基本的研究に重
要な意味を有しているが、このシステムは、タンパク質加水分解に対する効果に
無関係の物質のスクリーニングに用いることができることが、一般的および臨床
的に、より大きな重要性を有する。たとえば、無傷細胞内のプロテアソーム活性
は、膜浸透可能基質を用いて検定することができる。臨床的アッセイとして、患
者の血清または他の組織に対して、プロテアソーム活性に対する効果に関するス
クリーニングを行ない、さらに、重要なことに、プロテアソーム活性に対する処
置の効果を評価することができる。プロテアソーム活性の低下をもたらす治療は
、タンパク質異化作用に全く有益である（たとえば、糖尿病または消耗症患者で
の筋肉重量の維持または筋肉分解の低下）。同様に、プロテアソーム活性の低下
は、ある病理状態に起こり、活性増加への効果的な手法の評価方法は、臨床的重
要性を有する。

【００１３】疾患の検出および治療の評価方法インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体の１つ以上の活性
レベルの測定は、絶対的または相対的インシュリン欠乏症（たとえば、肥満患者
における２型糖尿病）、重度のインシュリン抵抗、脂質蓄積または過度の脂質合
成（たとえば、肥満および／または糖尿病患者における体脂肪または脂質合成の
増加）、あるいはタンパク質異化作用または分解（たとえば、糖尿病または消耗
症患者における筋肉質量の減少）といった疾患を検出あるいはこのようは疾患の
治療の効能（たとえば、糖尿病または消耗症患者での筋肉重量の維持または筋肉
分解の低下）を評価する方法に用いることができる。インシュリン分解酵素と多
触媒性プロテイナーゼとの複合体の幾つかの活性の測定方法は、本明細書中に記
載され、当業者に公知である。

【００１４】このような活性は、絶対的または相対的インシュリン欠乏症（たとえば、肥満
患者における２型糖尿病）、重度のインシュリン抵抗、脂質蓄積または過度の脂
質合成（たとえば、肥満および／または糖尿病患者における体脂肪または脂質合
成の増加）、あるいははタンパク質異化作用または分解（たとえば、糖尿病また
は消耗症患者における筋肉質量の減少）といった疾患の治療の検出または評価の
ための適切な生物試料で測定することができる。適切な生物試料は、血液、血漿
、膵臓、筋肉、脂肪、肝臓、尿などを含む。次いで、測定されたレベルを、活性
の対照レベルと比較することができる。適切な対照は、異なる時間での同一患者
、当該疾患を有する患者の履歴個体群、予想レベルなどを含む。比較により、患
者がその疾患を患っているかどうか、その疾患がどの程度まで進行しているか、
または治療がうまくいっているかなどの要因を決定する。このようなアッセイは
また、タンパク質異化作用に対する実際の治療薬または治療薬候補の効果を評価
するのに用いることができる。

【００１５】インシュリン本明細書で用いる「インシュリン」という語は、配列および構造が公知である
ウシ、ブタおよびヒトのインシュリンなどの哺乳類のインシュリンのことである
。ウシ、ブタおよびヒトのインシュリンが好ましい哺乳類のインシュリンであり
、ヒトのインシュリンがより好ましい。ヒトインシュリンのアミノ酸配列および
空間構造は周知である。ヒトインシュリンは、ジスルフィド結合によって架橋さ
れている２１個のアミノ酸Ａ鎖および３０個のアミノ酸Ｂ鎖からなっている。適
切に架橋されたヒトインシュリンは、３つのジスルフィド架橋を含む。すなわち
、Ａ鎖の７位とＢ鎖の７位との間に１つ、Ａ鎖の２０位とＢ鎖の１９位との間に
２つ目、Ａ鎖の６位と１１位との間に３つ目がある。

【００１６】「インシュリン類似体」という語は、それぞれ、ヒトインシュリンのＡ鎖およ
びＢ鎖と実質的に同じアミノ酸配列を有するが、インシュリン類似体のインシュ
リン活性を破壊しない程度の１つ以上のアミノ酸欠失、１つ以上のアミノ酸置換
、１つ以上のアミノ酸付加および／または１つ以上の側鎖変質を有するという点
においてヒトインシュリンのＡ鎖およびＢ鎖とは異なるＡ鎖およびＢ鎖を有する
タンパク質を意味する。

【００１７】インシュリン類似体の１つのタイプである「モノマー性インシュリン類似体」
が当該分野においてよく知られている。このようなヒトインシュリンの類似体は
、たとえば、Ｂ２８位のＰｒｏがＡｓｐ、Ｌｙｓ，Ｌｅｕ，ＶａｌまたはＡｌａ
と置換されており、Ｂ２９位のＬｙｓがＬｙｓであるかまたはＰｒｏで置換され
ているヒトインシュリン、また、ＡｌａＢ２６−ヒトインシュリン、脱（ｄｅｓ
）（Ｂ２８−Ｂ３０）ヒトインシュリンおよび脱（ｄｅｓ）（Ｂ２７）ヒトイン
シュリンを含む。モノマーのインシュリン類似体は、チャンス(Chance)らの１９
９６年５月７日発行米国特許第５，５１４，６４６号、ブレム(Brems)らのタンパク質工学(Protein Engineering)、６：５２７−５３３（１９９２）、ブランジ(Brange)らのＥＰＯ公報第２１４，８２６（１９８７年３月１８日公開）およ
びブランジ(Brange)ら構造生物学における現代の意見(Current Opinion in Stru
ctural Biology)、１：９３４−９４０（１９９１）に開示されている。これらの開示は、モノマー性インシュリン類似体の記載に関し参照により本明細書中に
明示的に組み込まれる。本発明の製薬で用いるモノマー性インシュリン類似体は
、ヒトインシュリンと同じ位置で適切に架橋されている。

【００１８】インシュリン類似体は、またアミド化されたアミノ酸に代えて酸性形態を有す
ることがある。たとえば、Ａｓｎは、ＡｓｐまたはＧｌｕと置換してもよい。同
様に、Ｇｌｎは、ＡｓｐまたはＧｌｕと置換してもよい。特に、ＡｓｎＡ１８、
ＡｓｎＡ２１、またはＡｓｐＢ３またはこれらの残基のどんな組み合わせも、Ａ
ｓｐまたはＧｌｕに置換されてもよい。また、ＧｌｎＡ１５またはＧｌｎＢ４あ
るいは両者は、ＡｓｐまたはＧｌｕのいずれかに置換されてもよい。代替インシ
ュリン類似体は、Ｂ２１でのＡｓｐもしくはＢ３でのＡｓｐまたは両方の置換、
ならびに他の置換または欠失を有するものであってもよい。

【００１９】インシュリン由来阻害剤絶対的または相対的インシュリン欠乏症（たとえば、肥満患者における２型糖
尿病）、重度のインシュリン抵抗、脂質蓄積または過度の脂質合成（たとえば、
肥満および／または糖尿病患者における体脂肪または脂質合成の増加）、あるい
はタンパク質異化作用または分解（たとえば、糖尿病または消耗症患者における
筋肉質量の減少）の状態または疾患におけるＩＤＥおよびＭＣＰの複合体の１つ
以上の活性のインシュリン由来の阻害剤の投与は、この状態または疾患の症状ま
たは影響を軽減するための効果的な方法である。このような状態は、（これらに
限らないが）糖尿病、重度のストレス（外傷、火傷、飢餓）、急性心筋梗塞、慢
性消耗病（たとえば、エイズ、癌）を含む。このようなペプチドは、グルコース
代謝または細胞増殖および有糸分裂誘発に対して直接の効果を有すると考えられ
ていない。というのは、これらのプロセスに対するインシュリンの効果は、異な
るメカニズムによるからである。間接的で潜在的に有益な効果（グルコースの低
下、有糸分裂誘発の低下）は、可能である。

【００２０】インシュリンは、インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体
のある特定の活性を阻害する。インシュリン由来のポリペプチドもまた、この複
合体のこれらの活性を阻害する。たとえば、インシュリン分解酵素によるインシ
ュリン切断からのポリペプチド生成物は、この複合体を阻害する。もっと完全に
分解したインシュリン、たとえば、トリクロロ酢酸に可溶の物質を主に含むイン
シュリン分解産物は、この複合体の阻害における効果は少ない。これは、インシ
ュリン分解酵素の切断部位に隣接するアミノ酸配列を含むインシュリン由来のポ
リペプチドが、この複合体の効果的な阻害剤であるということを示している。本
明細書に用いられている切断部位に隣接する（flanking the cleavage site ）とは、切断部位に隣接し（adjacent）、酵素による結合切断を受けるアミノ酸
のうちの１つを含む配列を有するポリペプチドのことである。

【００２１】切断部位に隣接するアミノ酸配列を含む阻害剤ポリペプチドは、約４〜１５個
という少ないアミノ酸、好ましくは約５〜約８個のアミノ酸であり得る。このよ
うな好ましいポリペプチドは、ＨＬＶＥＡＬＹ（配列番号：１）およびＬＶＥＡ
ＬＹ（配列番号：２）を含む。これらの好ましいポリペプチドは、それぞれイン
シュリンＢ鎖由来のアミノ酸１０−１６および１１−１６を表す。インシュリン
分解酵素は、Ｂ鎖における残基９と１０との間、残基１０と１１との間、残基１
６と１７との間、残基２４と２５との間、残基２５と２６との間を含む部位でイ
ンシュリンを切断する。したがって、ペプチドＨＬＶＥＡＬＹおよびＬＶＥＡＬ
Ｙはそれぞれ、２つの切断部位に隣接する。これらの切断部位に隣接するさらな
るペプチドは、たとえば、インシュリンＢ鎖の残基１−９、５−９、１−１０、
７−１０、９−２４、９−２５、１０−２４、１０−２５、１６−２１、１６−
２５、１６−２６、１７−２４、１７−２５、１７−３０、２４−３０および２
５−３０を表すペプチドなどを含む。

【００２２】本発明のポリペプチド、タンパク質およびペプチドは、合成または組換え技術
によって生成することができる。約１５〜２０個のアミノ酸より小さなポリペプ
チドは、自動固体相ペプチド合成のようなペプチド合成の公知の方法によってう
まく作ることができる。このようなポリペプチドはまた、組換え方法によっても
作ることができる。たとえば、このようなポリペプチドは、融合タンパク質の一
部として作ることができ、所望の配列の繰り返しを長い鎖状ポリマーの多数の単
位として発現させることができる。約２０〜９０個のアミノ酸より長いポリペプ
チドは、多数の公知の組換え方法によってうまく調製することができる。

【００２３】インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体の適切な阻害剤は
、上記のインシュリン内のアミノ酸配列と実質的に対応するポリペプチドを含む
。本発明の目的のための、上記のインシュリン内のアミノ酸配列と実質的に対応
するポリペプチドの定義は、インシュリンの対立遺伝子の異形体または変異体内
のアミノ酸配列と対応するペプチドを含む。前記異形体および変異体は、未変性
配列と高い相同性を有する（たとえば、置換、欠失または付加変異体）。インシ
ュリンのアミノ酸配列と実質的に対応するポリペプチドは、典型的に、少なくと
も約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％の配列が、未変性配列と相同性
を有する。インシュリンのアミノ酸配列と実質的に対応するポリペプチドは、少
なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％の配列が未変性配列と同
一であることが好ましい。

【００２４】インシュリン内のアミノ酸配列と実質的に対応することに加えて、本発明のポ
リペプチドは、インシュリンまたはインシュリンの阻害フラグメントの望ましい
特性を維持する。本発明のポリペプチドは、インシュリン分解酵素と多触媒性プ
ロテイナーゼとの複合体に結合および／または阻害するというインシュリンの機
能的活性を維持する。さらに、本発明のポリペプチドは、インシュリン分解酵素
および／またはインシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体の生
成物または基質であってもよい。また別の望ましい特性（たとえば、分解に対す
る抵抗または膜透過性の向上）を有するそれらのペプチドの類似体または誘導体
も本発明に含まれる。上記の生体外および他のアッセイシステムを用いて、潜在
的に有用な化合物をスクリーニングすることができる。

【００２５】本発明のインシュリン由来ポリペプチドの異形体は、欠失または同類アミノ酸
置換によって変形される。典型的に、このような同類アミノ酸置換は、「タンパ
ク質の配列および構造の地図書」（Atlas of Protein Sequence and Structure)
５、（１９７８）にデイホフ（Dayhoff)およびＥＭＢＯＪ．８、７７９（１９８
９）にアルゴス(Argos)によって記載されたような置換を含み、これらの開示は、本明細書に参照により組み込まれる。たとえば、次のクラスのうちの１つクラ
ス内でのアミノ酸の交換が同類置換である。クラスI：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＰｒｏ（小さな脂肪族側鎖および水酸基側鎖を表している）；ク
ラスII：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＴｙｒ（−ＯＨまたは−ＳＨ基を含んで
いる側鎖）；クラスIII：Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＡｓｎおよびＧｌｎ（側鎖を含んでいるカルボキシル基を表している）：クラスIV：Ｈｉｓ、ＡｒｇおよびＬｙｓ（
塩基側鎖を表している）；クラスV：Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＰｈｅおよびＭｅｔ（疎水性側鎖を表している）；クラスVI：Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＨ
ｉｓ（芳香族側鎖を表している）；およびクラスVII：Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｓｎおよびＧｌｎである。これらのクラスはまた、クラスＩでは３Ｈｙｐお
よび４Ｈｙｐ；クラスIIではホモシステイン；クラスIIIでは２−アミノアジピン酸、２−アミノピメリン酸、ｇ−カルボキシグルタミン酸、ｂ−カルボキシア
スパラギン酸、および対応するアミノ酸アミド；クラスIVではオルニチン、ホモ
アルギニン、Ｎ−メチルリジン、ジメチルリジン、トリメチルリジン、２，３−
ジアミノプロピオン酸、２，４−ジアミノ酪酸、ホモアルギニン、サルコシンお
よびヒロドキシリジン；クラスVでは置換フェニルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、２−アミノオクタン酸、２−アミノヘプタン酸、スタチン（statine ）およびｂ−バリン；ならびにクラスVIではナフチルアラニン、置換フェニルア
ラニン、テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸およびハロゲン化チロシン
のような関連のアミノ酸も含む。

【００２６】関連のアミノ酸およびアミノ酸誘導体のさらなる例は、当業者に公知の種々の
公報に見つけることができる（たとえば、Bachem Biosciences,Inc.（King of P
russia, PA)のカタログ）。さらに、L-アミノ酸が、置換に典型的に好ましいが、上記クラスにLおよびD立体異性体の両者を含んでもよい。本明細書中に用いら
れる、「同類アミノ酸置換」もまた、グリスコフ(Gribskov)ら、核酸研究(Nucl. Acid Rres. )、１４（１６）、６７４５（１９８６）によって頻繁に発生する同
類アミノ酸置換とされた多数の他のアミノ酸置換を含み、この開示は、参照によ
り本明細書中に組み込まれる。このような同類アミノ酸置換には、AlaとCys、As
pまたはGluとの交換；GlyまたはHisとAsp,GluまたはGlnとの交換；SerとAsn、Ph
eまたはTrpとの交換；LeuとTyrまたはTrpとの交換およびProとGlu、GlnまたはAr
gとの交換が含まれる。アミノ酸誘導体はまた、リン酸化アミノ酸、ガンマ−グルタミルアミノ酸または別の天然発生のアミノ酸誘導体であってもよい。アミノ
酸誘導体は、インシュリンまたはインシュリン分解産物に天然発生するものであ
ることが好ましい。

【００２７】付加的ポリペプチド阻害剤ある特定の他のタンパク質もまた、インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイ
ナーゼとの複合体の１つ以上の活性を阻害する。これらのタンパク質は、心房性
ナトリウム利尿ペプチド、リラキシン、TGFα、またはインシュリン様成長因子ＩＩ,およびこれらのタンパク質由来のある特定のポリペプチドを含む。たとえば、インシュリン分解酵素による心房性ナトリウム利尿ペプチド、リラキシンま
たはインシュリン様成長因子ＩＩの切断からのポリペプチド生成物は、この複合
体を阻害する。これは、これらのタンパク質由来であって、かつインシュリン分
解酵素の切断部位に隣接するアミノ配列を含んでいるポリペプチドが、この複合
体の効果的な阻害剤であることを示している。切断部位に隣接するアミノ配列を
含んでいる阻害剤ポリペプチドは、約４〜約１５個、好ましくは約５〜８個とい
う少ないアミノ酸であってもよい。インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナ
ーゼとの複合体の適切な阻害剤は、上記のタンパク質および上記のタンパク質の
誘導体のアミノ酸配列と実質的に対応する配列を有するポリペプチドを含む。心
房性ナトリウム利尿ペプチド、リラキシン、TGFα、またはインシュリン様成長因子ＩＩ,およびこれらのタンパク質由来のある特定のポリペプチドに実質的対応するポリペプチドは、インシュリンと対応する配列の上で述べた特徴と似た特
徴を有する。

【００２８】ポリペプチドの製薬組成物本発明のインシュリン由来および他のポリペプチドは、糖尿病、重度のストレ
ス（外傷、火傷、飢餓）、急性心筋梗塞および慢性消耗病（エイズ、癌など）の
ような疾患、絶対的または相対的インシュリン欠乏症（たとえば、肥満患者にお
ける２型糖尿病）、あるいは重度のインシュリン抵抗、脂質蓄積または過度の脂
質合成（たとえば、肥満および／または糖尿病患者における体脂肪または脂質合
成の増加）を含む他の疾患、ならびに／またはタンパク質分解もしくは異化作用
の破壊（たとえば、糖尿病または消耗症患者における筋肉質量の減少）の症状の
治療または軽減のための製薬組成物に用いることができる。

【００２９】本発明の薬学的組成物は、効果的単位投与量形態でのインシュリン由来ポリペ
プチドおよび製薬的に許容可能なキャリアを含む。本明細書中に用いる語「効果
的単位投与量」または「効果的単位投与」とは、絶対的もしくは相対的インシュ
リン欠乏症（たとえば、肥満患者における２型糖尿病）または重度のインシュリ
ン抵抗を含む疾患、脂質蓄積または過度の脂質合成（たとえば、肥満および／ま
たは糖尿病患者における体脂肪または脂質合成の増加）、あるいはタンパク質分
解または異化作用の破壊（たとえば、糖尿病または消耗症患者における筋肉質量
の減少）を含む疾患の症状の治療または軽減に効果的であるのに十分な所定の量
を意味する。製薬的に許容可能なキャリアは、医薬の投与目的に有用な物質であ
り、好ましくは無害であり、固形、液体、気体の物質であってもよく、不活性で
医薬的に許容可能であり、活性成分と相溶性がある。

【００３０】水、生理食塩水、水性デキストローズおよびグリコールが好ましい液体キャリ
アであり、これらは、特に（等張のとき）注射可能な溶液に好ましい。キャリアは、石油、動物、植物または合成源の、たとえば、ピーナッツ油、大豆油、鉱
物油、ゴマ油などを含む各種油から選択することができる。適切な製薬賦形剤は
、スターチ、セルロース、タルク、グルコース、ラクトーズ、ショ糖、ゲラチン
、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリ
ン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、乾燥スキム
ミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどを含む。組
成物は、殺菌などの従来の製薬手段に供することができ、防腐剤、安定剤、湿潤
剤、または乳化剤などの従来の製薬添加剤、浸透圧調整のための塩、緩衝剤など
含むことができる。適切な製薬キャリアおよびその組成は、マーチン（Martin) 、「レミングトンの製薬科学」（Remington's Pharmaceutical Sciences)、第１
５版；マック出版社(Mack Publishing Co.)、イーストン(Easton)(1975)（たとえば、1405-1412頁および1461-1487頁を参照）に記載されている。このような組
成物は、一般的に、宿主への適切な投与のための適切な投与形態が調製されるよ
うに、適切な量のキャリアとともに効果的な量の活性化合物を含む。

【００３１】これらの製薬組成物は、調製薬を用いるのが、体内の疾患であるか体外部の疾
患であるかによって、注射を含む非経口に、経口的に、パッチにより、イオン泳
動ありまたはイオン泳動なしで、座剤または膣座剤として用いる、軟膏、クリー
ム、噴霧剤、粉末としての局所施用する、または点眼剤または点鼻剤として与え
るなどして投与することができる。

【００３２】組成物は、０．１％〜９９％の活性物質を含むことができる。たとえば、局所
投与には、一般的に組成物は０．０１％から２０％、より好ましくは０．５％か
ら５％の活性物質を含む。

【００３３】本発明はまた、糖尿病、重度のストレス（外傷、火傷、飢餓）、急性心筋梗塞
および慢性消耗病（エイズ、癌など）のような疾患、絶対的もしくは相対的イン
シュリン欠乏症（たとえば、肥満患者における２型糖尿病）または重度のインシ
ュリン抵抗、脂質蓄積もしくは過度の脂質合成（たとえば、肥満および／または
糖尿病患者における体脂肪または脂質合成の増加）を含む他の疾患、あるいはタ
ンパク質分解もしくは異化作用の破壊（たとえば、糖尿病または消耗症患者にお
ける筋肉質量の減少）を含む他の疾患の症状の軽減方法に関する。典型的に、こ
の組成物は、それを必要としている患者（ヒト、これに限らないが、ネコ、ウマ
、ブタ、ヒツジ、イヌおよびウシなどの哺乳動物ならびに鳥類を含む他の動物）
に対し、疾患の症状を治療または軽減するのに効果的な量を投与する。本発明の
組成物は、経口投与、静脈投与、筋肉投与または局所投与することができる。

【００３４】経口投与用として、微粉または顆粒は、希釈剤、分散剤および／または表面活
性剤を含むことができ、頓服水剤、水またはシロップ、乾燥状態または懸濁剤を
含むことができる非水性もしくは懸濁液でのカプセルまたはサックネット(sacne
t)、結合剤および潤滑剤を含むことができるタブレットまたは腸溶コーティング
ピル、または水またはシロップでの懸濁液という形態で提供することができる。
望ましいまたは必要な場合、調味剤、保存剤、懸濁剤、増粘剤または乳化剤を含
むことができる。

【００３５】口腔投与用として、組成物は、従来の方法で製造されたタブレットまたはトロ
ーチ剤の形態をとることができる。

【００３６】非経口投与または目の病気などのように滴剤としての投与のために、組成物は
、約０．１から１０％、好ましくは０．５から２．０％、最も好ましくは１．２
％ｗ／ｖの濃度の水溶液という形態で提供することができる。この溶液は、酸化
防止剤、緩衝剤などを含むことができる。

【００３７】本発明による組成物はまた、注射用に製造することもでき、添加の防腐剤とと
もにアンプルまたは多投与容器での単位投与形態で提供することができる。この
組成物は、油性もしくは水性ビークルでの懸濁液、溶液または乳濁液などの形態
をとることができ、懸濁剤、安定剤および／または分散剤のような調製上の薬剤
を含むことができる。あるいは、活性成分は使用前は粉末形態であり、適切なビ
ークル、たとえば無菌の発熱性物質を含有しない緩衝生理食塩水との構成物を形
成するようにしてもよい。本発明の組成物はまた、カプセル化されたリポソーム
の形態であってもよい。

【００３８】本発明の組成物は、局所的な軟膏またはクリームとして患者の体に塗布するこ
ともできる。組成物は、約０．１から１０％、好ましくは０．５から２．０％、
最も好ましくは１．２％ｗ／ｖの濃度で、たとえば水溶性軟膏基剤とともに軟膏
という形態で、またはたとえば、水中油クリーム基剤とともにクリームという形
態で提供することができる。局所投与の場合、ヒトの大人の治療に用いる毎日の
投与量は、０．１ｍｇから１０００ｍｇ、好ましくは０．５ｍｇから１０ｍｇの
範囲である。しかし、重症の場合は、より多くの投与量の使用を必要とする場合
がある。

【００３９】本発明の組成物はまた、スプレーまたは滴剤の形態で鼻、口腔および耳のよう
な体の開口部に適用することができる。たとえば、本発明の組成物は、座薬また
はクリームという形態で直腸および膣のような体の開口部に適用することができ
る。

【００４０】全身投与の場合、ヒトの大人の治療に用いる毎日の投与量は、活性成分が５ｍ
ｇから５０００ｍｇ、好ましくは５０ｍｇから２０００ｍｇの範囲であり、たと
えば、投与の方法および患者の状態によって、１日１から５回投与することがで
きる。組成物が、投与単位を含んでいる場合、各単位は、活性成分が２ｍｇから
２０００ｍｇ、たとえば５０ｍｇから５００ｍｇを含むのが好ましい。重症の場
合は、化合物は、たとえば、０．０１から１０ｍｇ／ｋｇ／時の活性成分を用い
て静脈注射により投与することができる。

【００４１】本発明はまた、本発明の製薬組成物を含み、本発明の方法で用いるキットを包
含する。本発明のキットは、本発明のインシュリン由来ポリペプチドおよび乾燥
または液体形態のいずれかでの適切なキャリアを含むバイアルを含む。本発明の
キットは、バイアル上のラベルの形態および／またはバイアルが包装された箱に
含まれた挿入物という形態で使用説明書をさらに含む。この使用説明書はまた、
バイアルが包装された箱に印刷することもできる。使用説明書は、当該分野での
作業者が薬剤を投与することができるように、十分な投与量および投与情報など
の情報を含む。当該分野での作業者とは、薬剤を投与する可能性のあるいかなる
医者、看護婦または技術者を含んでいると考えられる。

【００４２】本発明はまた、インシュリン由来ポリペプチドを含んでいる、本明細書中に記
載の目的および使用のための投与に適切な製剤組成物に関する。本発明によると
、インシュリン由来ポリペプチドは、非経口または経口投与に適切な組成物また
は医薬の製造に用いることができる。本発明はまた、非経口または経口投与に適
切な形態のインシュリン由来ポリペプチドを含む組成物の製造方法に関する。た
とえば、非経口または経口調剤は従来の技術を用いて幾つかの方法で製造するこ
とができる。液体調剤は、緩衝剤または他の賦形剤を含んでいる、適切なｐＨの
水などの適切な溶媒にインシュリン由来ポリペプチドを溶解することによって製
造することができる。

【００４３】本発明は、以下の実施例を参照することにより、より理解することができる。
これらの実施例は、本発明の具体的な実施形態の代表的なものであり、本発明の
範囲を制限するものではない。

【００４４】

【実施例】

（実施例１）インシュリンおよび他のＩＤＥ基質が、インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体の活性を阻害する。

【００４５】インシュリン分解酵素は、インシュリンならびに付加的なペプチドおよびタン
パク質と作用、結合およびそれを切断する。一般的に、この酵素により認識され
る基質は、インシュリンと構造上の同族関係を有している。このような基質は、
たとえば、プロインシュリン、プロインシュリン中間体、表皮成長因子（ＥＧＦ
）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、リラキシンおよび心房性ナトリウム利尿ペプチ
ド（ＡＮＰ）などである。これらの基質のうち、プロインシュリン、ＥＧＦおよ
びＩＧＦ−Ｉを含む幾つかは、結合するが、切断される速度は遅く、ＩＧＦ−Ｉ
ＩおよびＡＮＰなどは急速に分解する。これらの基質ポリペプチドのうちいずれ
が、インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体の活性を阻害す
るかを決定することに関心があった。

【００４６】研究設計および方法Ｔｙｒ^A14またはＴｙｒ^B26と特定して標識化される[¹²⁵Ｉ]ヨードインシュリンは、イーライリリー研究所のブルースフランク(Bruce Frank)博士によって提
供され、当該技術分野において公知な方法によって作られた。結晶性ブタのイン
シュリン、グルカゴン、ヒトのプロインシュリン、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−Ｉ
Ｉは、イーライリリー研究所のドナルドチャンス(Ronald Chance)博士によって
提供された。酵素等級の硫酸アンモニウムは、ＩＣＮバイオメディカルズ（Irvi
ne, CA)から購入した。スクシニル-leu-leu-val-tyr-７-アミド-４-メチルクマリン[LLVY]、ＣＢＺ-leu-leu-gul β-ナフチル-アミド[LLE]およびboc-leu-ser-
thr-arg-7アミド-4-メチルクマリン[LSTR]は、シグマ(Sigma)から購入した。DEA
E-セファセル（Sephacel）、フェニル−セファロース、セファデックス G-50お
よびモノ-Qは、ファルマシア(Pharmacia)から購入した。バイオ−ゲル(Bio-Gel
)Ｐ−２００はバイオ−ラッド(Bio-Rad)から購入した。他のすべての化学物質は
試薬等級以上であった。

【００４７】酵素試料の調製インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体は、ラットの筋肉
から調製し、当該技術分野に公知の方法により超遠心分離および硫酸アンモニウ
ム沈降により精製した。いくつかの実験では、複合体は、DEAE-セファセルでさらに精製した。精製された多触媒性プロテイナーゼは上記のように調製し、次い
で、当該技術分野の公知の方法によりフェニル−セファロース、バイオ−ゲルＰ
−２００およびモノ-Qに対しクロマトグラフィを行なった。

【００４８】分解活性の測定 A14[¹²⁵Ｉ]ヨードインシュリンまたは他の標識化されたインシュリンを用いて
インシュリン分解の測定をトリクロロ酢酸沈降により行ない、３７℃での１５分
間のインキュベーションごとに可溶パーセントとして表した。

【００４９】蛍光発生ペプチドの分解を当該技術分野の公知の方法により行ない、励起およ
び発光波長が３９０と４４０ｎｍ（LLVYおよびLSTR)または３３５と４１０ｎｍ（LLE)の蛍光発光によって測定した。ＬＬＶＹの分解は、代謝性シェーカーで３
７℃、６０分間、ｐＨ７．５の０．１Ｍトリス緩衝剤（アッセイ容量１ｍｌ）で
１３μｍのＬＬＶＹを用いて酵素試料をインキュベートすることにより測定した
。氷上のエタノールを０．２ｍｌ添加することにより反応を止めた。遊離したＡ
ＭＣによる蛍光発光の増加を、それぞれ、３９０および４４０ｎｍの励起および
発光波長について、セコイア−ターナー(Sequoia-Turner)蛍光計で測定した。デ
ータは、カラムプロフィルとして、６０分当たりに遊離したＡＭＣのナノモルま
たは６０分当たりの蛍光発光単位で表している。

【００５０】励起波長３８０ｎｍ（スリット幅、１５ｎｍ）、発光波長４４０ｎｍ（スリッ
ト幅、５ｎｍ）、３７℃でＬＬＶＹ分解を連続的にモニターを行なった。硫酸ア
ンモニウム分画（１００μｌの１：１０の希釈液）をトリス（２ｍｌの１００ｍ
Ｍ全アッセイ量、ｐＨ７．５）で１３μｍＬＬＶＹとともにインキュベートし、
ＡＭＣの遊離による蛍光発光を率が直線になるまでモニターした。１０^-5Ｍ（２
２０μｌの１０^-4Ｍ）のインシュリンをキュベットに入れ、遊離したＡＭＣの量
の変化を同容量の緩衝剤を入れたものと比較した。あるいは、１０^-6Ｍのインシ
ュリン（２２０μｌの１０^-4Ｍ）の反復投与量入れ、その率を同容量の緩衝剤を
添加したものと比較した。

【００５１】蛍光発生基質分解に対するペプチドホルモンの効果酵素複合体または完全に精製された多触媒性プロテイナーゼを種々の濃度のイ
ンシュリン、ＡＮＰ、リラキシン、ＩＧＦ−ＩＩ、プロインシュリン、グルカゴ
ン、ＥＧＦまたはＩＧＦ−Ｉの存在下および不存在下においてインキュベートを
行ない、ＬＬＶＹ，ＬＳＴＲおよびＬＬＥの分解を測定した。ペプチドホルモン
のインシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体による分解の量に
与える効果と、精製多触媒性プロテイナーゼによる分解に与える効果とを比較し
た。さらにインシュリンＣ−ペプチド、セクレチン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ
）、成長ホルモン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、腫瘍壊死因子、α２マクロ
グロブリン、カルモジュリン、ブラジキニン、ウシ膵臓ポリペプチド（ＢＰＰ）
、ユビキチン、血管作動性小腸ペプチド（ＶＩＰ）およびコレシストキニン（Ｃ
ＣＫ）を含む種々のペプチドおよびタンパク質の効果を測定し、ビークルだけの
場合と比較した。

【００５２】反応速度実験種々の基質およびインシュリン濃度での複合体（硫酸アンモニウム分画）によ
るＬＬＶＹおよびＬＳＴＲの分解を測定した。ＬＬＶＹまたはＬＳＴＲの濃度は
、３から６７ｍｍｏｌ／ｌまで変化させ、インシュリン濃度は、１．０ｍｍｏｌ
／ｌ、１０ｍｍｏｌ／ｌ、５０ｍｍｏｌ／ｌ、０．１μｍｏｌ／ｌ、０．５μｍ
ｏｌ／ｌまたは１．０μｍｏｌ／ｌに設定した。データについてディクソン変換
を行なった。すべての濃度で酵素の不存在下でのバックグラウンド蛍光発光を引
いた。同様の実験をカゼインで行なった。α−カゼインの濃度（０、２．１、８
．５および２１ｍｍｏｌ／ｌ）を変化させて、ＬＬＶＹ分解を上記のように測定
した。ＬＬＶＹ濃度は、１０、５０、および１００ｍｍｏｌ／ｌであった。

【００５３】結果インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体を単離し、ＬＬＶ
Ｙの分解を測定すると、インシュリンが、複合体の多触媒性プロテイナーゼのキ
モトリプシン様活性を阻害することが観察できた。表１は、インシュリン分解酵
素の基質であるインシュリンおよび多触媒性プロテイナーゼの基質であるＬＬＶ
Ｙは、複合体からの分離後、他の精製された酵素に直接効果を与えないことを示
している。これらのデータは、ＬＬＶＹ分解へのインシュリンの効果はインシュ
リン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの相互作用を必要とする。（表１）インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体ならびに精製され
たインシュリン分解酵素および多触媒性プロテイナーゼの活性に与えるインシュ
リンとＬＬＶＹの効果インシュリン分解活性ＬＬＶＹ分解活性インシュリン分解酵素と多触媒性フ゜ロテイナーセ゛との複合体２１±４１６６±９インシュリン添加ＮＤ９２±５ＬＬＶＹ添加２０±３ＮＤ精製ＩＤＥ２２±１０ＬＬＶＹ添加２１±１ＮＤ精製ＭＣＰ０１４７±６インシュリン添加ＮＤ１４１±３ＬＬＶＹ分解に対する１ｍｍｏｌ／ｌインシュリンの効果およびインシュリン
分解に対する４０ｍｍｏｌ／ｌＬＬＶＹの効果を測定した。上記の方法の項で述
べたような方法で、インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体
によるか、または精製インシュリン分解酵素または多触媒性プロテイナーゼのい
ずれかによって分解が行なわれた。インシュリン分解活性は、１５分当たりのイ
ンシュリンからのＴＣＡ可溶カウントの百分率として表す。ＬＬＶＹ分解活性は
、６０分当たりの遊離した蛍光発光（任意の単位）として表す。データは、２つ
の独立実験の平均値±ＳＥである。ＮＤは、決定できずの意。

【００５４】インシュリンが、インシュリン分解酵素の好ましい基質であるが、他のペプチ
ドもこの酵素と結合し、基質または阻害剤として作用することができる。これら
の多くはＩＤＥ−ＭＣＰ複合体に添加し、精製した多触媒性プロテイナーゼに別
に添加し、ＬＬＶＹ分解を測定した。インシュリン分解酵素と作用すると知られ
ているペプチドのすべてが、複合体によるＬＬＶＹ分解を阻害したが、インシュ
リンが最も効果的であった（図１）。インシュリンと構造上同族関係を有するイ
ンシュリン分解酵素基質ＡＮＰおよびＩＧＦ−ＩＩならびにリラキシンがこの複
合体を阻害した。インシュリン分解酵素と結合およびそれに分解されるグルカゴ
ンおよび結合するが貧基質であるＥＧＦは、複合体と同様に精製多触媒性プロテ
イナーゼに直接の効果を有した。しかし、グルカゴンは、精製多触媒性プロテイ
ナーゼへの効果より複合体への効果のほうが大きかった。それ自体分解し難いイ
ンシュリン分解の競合阻害剤であるプロインシュリンは、部分的な効果を有した
。これらのデータは、インシュリン分解酵素結合および分解と多触媒性プロテイ
ナーゼの調節との複雑な相互作用を裏付けている。

【００５５】多触媒性プロテイナーゼは、多触媒性タンパク質の多数の活性部位に起因する
他の基質に対するタンパク質加水分解活性を有する。インシュリンは、活性に対
し異なる効果を有しており、キモトリプシン様およびトリプシン様活性（それぞ
れ、ＬＬＶＹおよびＬＳＴＲ分解）は、ペプチジル−グルタミル加水分解活性（
ＬＬＥ分解）より大きく影響を受けることが当該技術分野において知られている
。図２および図３は、インシュリン分解酵素と作用するペプチドが、ＩＤＥ−Ｍ
ＣＰ複合体によるＬＳＴＲ分解についてはＬＬＶＹ分解と同様の効果を有するが
、ＬＬＥ分解については同様でないことを示している。これらのデータは、イン
シュリン効果の特異性およびＩＤＥとＭＣＰとの相互作用の特異性を裏付けてい
る。これらのデータはまた、グルカゴンは、多触媒性プロテイナーゼに対する直
接効果とは別の複合体に対する効果を有していることを示している。というのは
、そのホルモンが、複合体によるＬＳＴＲ分解を低下させているが、精製多触媒
性プロテイナーゼによる分解を低下させていないからである。インシュリンは、
小さいが有意のＬＬＥ分解の阻害を有することもまた興味深い。これらのデータ
は、多触媒性プロテイナーゼ活性のインシュリン分解酵素調節という役割および
インシュリンの異なる効果を裏付けている。

【００５６】インシュリン分解酵素と相互作用しないことがわかっている他の多くのペプチ
ドを本発明のシステムで調べた。これらのペプチドは、インシュリンＣ−ペプチ
ド、セクレチン、ＦＳＨ、成長ホルモン、ＢＳＡ、ＴＮＦ、Ｉ２マクログロブリ
ン、カルモジュリン、ブラジキニン、ＢＰＰ、ユビキチン、ＶＩＰおよびＣＣＫ
を含む。これらのペプチドは、インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼ
との複合体のタンパク質加水分解活性を大きく変えなかった（データは示さず）
。これらのデータは、インシュリン分解酵素基質の特異性を示し、阻害は、バル
クペプチドまたはビークル効果によるのではないことを示している。

【００５７】インシュリン、グルカゴンおよびプロインシュリンの他に、最も特徴づけられ
ているインシュリン分解酵素基質は、ＩＧＦ−Ｉ、およびＩＧＦ−ＩＩである。
ＩＧＦ−Ｉは、インシュリン分解酵素に比較的高い親和性を有して結合するが、
分解は遅い。これは、プロインシュリンと同様であり、一方、ＩＧＦ−ＩＩは、
急速に分解しインシュリンと似ている。

【００５８】結論ＩＤＥ−インシュリン−相互作用は、公知のインシュリンの生物学的作用のと
おり、細胞質タンパク質である多触媒性プロテイナーゼの機能を変化させる。こ
れらの生物学的作用は、細胞グルココルチコイド作用の低下および細胞タンパク
質分解の阻害を含む。

【００５９】（実施例２）活性インシュリン分解酵素は、インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体のインシュリン媒介阻害に必要とされる。

【００６０】インシュリン分解酵素は、多触媒性プロテイナーゼの関連の活性に影響を与え
ない濃度でのある公知のプロテイナーゼ阻害剤によって阻害される。これらの阻
害剤を用いて、活性インシュリン分解酵素が、インシュリン分解酵素と多触媒性
プロテイナーゼとの複合体に対する観察されたインシュリンの効果に必要である
かどうかを調べた。

【００６１】材料および方法方法と試薬は、以下の例外を除いて実施例１に記載されたものと同様である。
使用した酵素調製剤は、当該技術分野に公知の手順によって硫酸アンモニウム分
画法によって部分的に精製した。酵素は、少なくとも２０ボリュームの酢酸ナト
リウム、ｐＨ６．２に対して、添加なし、１ｍＭのＥＤＴＡまたは１ｍＭのＥＧ
ＴＡのいずれかの３つの変化で一晩透析した。２価のカチオンの酢酸塩を示され
た濃度で添加した。

【００６２】結果インシュリン分解酵素によるインシュリン分解は、ＥＤＴＡでの処置によって
減少する。インシュリン分解酵素の調節機能もまたＥＤＴＡによって影響される
。インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体のＥＤＴＡ処置に
より、ＬＬＶＹの分解の低下に反映されているように、多触媒性プロテイナーゼ
のキモトリプシン様が低下した。インシュリンとインシュリン分解酵素は、キモ
トリプシン様（ＬＬＶＹ分解）活性と同様にトリプシン様（ＬＳＴＲ分解）を調
節する。ＥＤＴＡ処置により、ＬＳＴＲ分解は大きく減少し、インシュリン効果
を消滅させる。

【００６３】インシュリン分解酵素の多触媒性プロテイナーゼの制御における調節機能をさ
らに調べるために、選択された阻害剤を調べた（表２）。金属プロテイナーゼ阻
害剤であるフェナントロリンは、インシュリン分解酵素を阻害し、ＥＤＴＡと同
様、ＬＬＶＹ分解へのインシュリン効果を廃絶した。公知のインシュリン分解酵
素の阻害剤であるＮＥＭおよびバシトラシンもまた、インシュリン効果を阻止し
た。低濃度でのＰＭＳＦは、大きな効果を示さなかった。

【００６４】（表２）各種阻害剤のインシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体に与
える効果添加濃度ＩＤＥＬＬＶＹ分解（％） −インシュリン＋インシュリンなし１００１００５１．３ 1,10フェナントロリン０．１ｍＭ４４．４７３．１７６．２１．０ｍＭ０．２３０．６３０．６ＰＭＳＦ０．１ｍＭ９３．７１１１．２６８．０１．０ｍＭ８５．３１１６．１６２．７ＮＥＭ０．０１ｍＭ５６．０６３．４６６．００．１ｍＭ１３．４２４．７１８．６バシトラシン１０μｇ／ｍｌ５９．９７１．３５２．０１００μｇ／ｍｌ２４．５３９．２３５．４ＰＣＭＢ０．０５ｍＭ５．１＊＊０．５ｍＭ６．４＊＊ＥＤＴＡ１．０ｍＭ５２．４３３．７２８．８１０ｍＭ７．９３２．８３０．１ＥＧＴＡ１．０ｍＭ５０．０４４．０４４．０１０ｍＭ５．７３１．０２９．６＊ＬＬＶＹ分解なしＩＤＥ−ＭＣＰ調製剤は、「材料および方法」の項において記載のように調製
した。インシュリンおよびＬＬＶＹ分解は、示された濃度の阻害剤またはビーク
ルの存在下で測定した。ＬＬＶＹの分解は、１．０μＭのインシュリンまたはビ
ークルのみの存在下で決定した。数値は、ビークルのみの存在下での分解活性を
％で表したものである。データは、４つの独立した実験の平均値である。

【００６５】表３は、インシュリン分解酵素の阻害剤の効果について、インシュリン分解酵
素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体のタンパク質加水分解活性に対する効果
と精製多触媒性プロテイナーゼの対応する活性に対する効果とを比較している。
フェナントロリン、ＮＥＭおよびバシトラシンは、多触媒性プロテイナーゼがイ
ンシュリン分解酵素と複合しているときＬＬＶＹ分解を阻害するが、これらの薬
剤は、精製多触媒性プロテイナーゼには効果がない。これらの発見は、インシュ
リン分解酵素の多触媒性プロテイナーゼ活性に対する調節効果を裏付けている。

【００６６】（表３）ＭＣＰ活性ＬＬＶＹ分解活性に対するＩＤＥの阻害剤の効果（制御の％）添加ＩＤＥ−ＭＣＰ精製ＭＣＰなし１００％１００％フェナントロリン２１％９５％ＮＥＭ３％１００％バシトラシン１０％８５％結論インシュリン分解酵素活性は、インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナー
ゼとの複合体に対するインシュリンの観察された効果に必要である。

【００６７】（実施例３）インシュリンフラグメントは、インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体を阻害する。

【００６８】実施例２で報告された結果は、活性インシュリン分解酵素は、インシュリン分
解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体の複合体に対するインシュリン効果
に必要であることを示している。これは、インシュリン分解酵素によるインシュ
リン分解の生成物が、複合体でのインシュリン効果に寄与しているかもしれない
ことを示唆している。

【００６９】材料および方法方法および試薬は、以下の例外を除いて実施例１および２に記載のものである
。インシュリンフラグメントの効果を調べるために、インシュリンをインシュリ
ン分解酵素とともにインキュベートし、生成物をセファデックスＧ−５０カラム
で分離した。無傷のインシュリン（インシュリンフラグメントの異種混合）の後
、溶出した生成物をプールとし、インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナー
ゼとの複合体に戻し添加した。未加工の（精製した硫酸アンモニウム）と精製し
た複合体の両方によるＬＬＶＹ分解の阻害を調べた。

【００７０】結果表４に示すように、インシュリン分解生成物は、１０^-7ｍｏｌ／ｌのインシュ
リンよりも効果的にＬＬＶＹ分解を阻害した。

【００７１】（表４）インシュリンおよびインシュリン分解生成物の多触媒性プロテイナーゼ活性に
対する効果酵素試料添加なしインシュリン添加生成物添加未加工複合体１００６６．２４４．２精製複合体１００６３．２３７．５精製ＭＣＰ１００９３．９１０４．５データは％。数値は、添加なしのＭＣＰ活性で正規化している。精製の種々の
段階でのＬＬＶＹ−ＭＣＰの分解をインシュリン（０．１μｍｏｌ／ｌ）または
インシュリン分解酵素により生成され、次いでセファデックスＧ−５０クロマト
グラフィで精製されたインシュリン分解生成物（濃度不明）の存在下で測定した
。

【００７２】先の実験は、高いが濃度不明のインシュリン分解生成物を用いたため、またイ
ンシュリンフラグメントのいくつかは、インシュリン分解酵素基質であるため、
表５に報告された実験は、これをより慎重に調べた。非常に高く精製されたイン
シュリン分解酵素を微量のＢ２６ヨードインシュリンを含む５×１０^-8ｍｏｌ／
ｌインシュリンとともに時間を変化させてインキュベートした。インシュリン分
解は、ＴＣＡ沈降によって評価した。示された時間において、インシュリン分解
酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体（硫酸アンモニウム調製剤）をＬＬＶ
ＹまたはＬＳＴＲのいずれかとともに添加した。さらに６０分後これらの基質の
分解を検定した（表５）。

【００７３】（表５）インシュリン分解生成物の生成および多触媒性プロテイナーゼ活性に対するイ
ンキュベーション時間の影響フ゜レインキュヘ゛ーション LLVY分解 LSTR分解Ｂ−２６ヨート゛インシュリン時間のTCA溶解度インシュリンなし（０）１６０１４２ −−− ０１１７１０００．２５１１０１１８３．０１５１３０１２３１２．３３０１３４１１７２２．１数値は、１時間当たり生成される蛍光発光（ＬＬＶＹおよびＬＳＴＲ分解）ま
たはＴＣＡ溶解度の百分率ある。示された時間の間、精製インシュリン分解酵素
でインシュリン（５０ｎｍｏｌ／ｌ）を予め分解することによって種々のサイズ
および濃度のインシュリン分解生成物を生成した。次いでＩＤＥ−ＭＣＰを含む
酵素複合体を添加し、ＬＬＶＹ分解に対する予め分解されたインシュリンの効果
を測定した。プレインキュベーションで分解されたインシュリンの程度はＴＣＡ
溶解度によって概算された。

【００７４】表からわかるように、プレインキュベーションなしの５×１０^-8ｍｏｌ／ｌの
インシュリンは、ＬＬＶＹ分解を２７％、ＬＳＴＲ分解を３０％抑制した。精製
インシュリン分解酵素に５分間曝した後のインシュリンのＴＣＡ溶解度は３％で
あり、１５分後および３０分後はそれぞれ１２．３％および２２．１％にまで上
昇した。当該技術分野に示されているように、部分的に分解したインシュリンは
、かなりＴＣＡの状態を保持するので、ＴＣＡ溶解度は、実際の分解より低い数
値になっている。高性能液体クロマトグラフィ研究に基づくと、無傷インシュリ
ンの実際の消失は、ＴＣＡ可溶性フラグメントの生成より３〜４倍大きい。した
がって、分解インシュリンは、５、１５および３０分でそれぞれ、〜１０、４０
および８０％の当該物質を含んでいた。これにもかかわらず、すべての時間点に
おいて、ＬＬＶＹおよびＬＳＴＲ分解の阻害を示し、インシュリンの分解生成物
もまた多触媒性プロテイナーゼの活性に影響を与えていることを示している。イ
ンシュリンおよびその生成物による阻害の減少は、ＴＣＡ可溶性放射活性の生成
によって概算される。これは、インシュリン分解酵素に結合しない低分子量生成
物は効果がないことを示唆している。

【００７５】結論インシュリン分解酵素によるインシュリン分解の生成物は、インシュリン分解
酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体を阻害する。

【００７６】（実施例４）インシュリン由来ペプチドは、インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体を阻害する。

【００７７】インシュリンフラグメントのインシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼ
との複合体を阻害する能力を、インシュリンフラグメントの配列を有する合成ペ
プチドを用いてさらに調べた。

【００７８】材料と方法方法および試薬は、以下の例外を除いて実施例１および２に記載のものを用い
た。インシュリンＢ鎖のアミノ酸１０〜１６およびアミノ酸１１〜１６の配列を
有するペプチドを、固体相ペプチド合成の標準的な方法を用いて合成した。これ
らのペプチドは、それぞれ配列ＨＬＶＥＡＬＹおよびＬＶＥＡＬＹを有する。

【００７９】結果インシュリン、インシュリン類似体およびインシュリン由来ペプチドの効果を
インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体のキモトリプシン様
、トリプシン様、グルタミル−トランスフェラーゼおよびタンパク質分解活性に
関するアッセイを用いて測定した。インシュリンおよびlys-proインシュリンは、キモトリプシン様およびトリプシン様活性の両方の阻害において最も高いレベ
ルを示した（図４Ａおよび図４Ｂ）。ペプチドＨＬＶＥＡＬＹおよびＬＶＥＡＬ
Ｙは、１０^-6と１０^-5モルとの間で阻害した（図５Ａおよび図５Ｂ）。インシュ
リン、インシュリン類似体および各ペプチドは、インシュリン分解酵素と多触媒
性プロテイナーゼとの複合体グルタミル−グルタミル−トランスフェラーゼ活性
において大きな阻害を示さなかった。インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイ
ナーゼとの複合体による¹²⁵Ｉ−インシュリン加水分解の分解を測定すると、インシュリンとその全長類似体は、最も強い阻害を示した（図７）。ここでも、ペ
プチドは１０^-6〜１０^-5モルの範囲で阻害を示した。

【００８０】結論幾つかのインシュリン類似体およびインシュリン由来ペプチドＨＬＶＥＡＬＹ
およびＬＶＥＡＬＹはそれぞれ、インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナー
ゼとの複合体のキモトリプシン様、トリプシン様、および一般のタンパク質分解
活性を阻害する。

【００８１】インシュリン分解酵素は、残基Ｂ９−１０、残基Ｂ１０−１１および残基Ｂ１
６−１７でインシュリンを切断する。Ｂ１０−１６（ＨＬＶＥＡＬＹ）ペプチド
は、インシュリンと同様の効果を有する。Ｂ１１−１６（ＬＶＥＡＬＹ）ペプチ
ドは、高濃度において効果を有する。Ｂ１０（Ｂ１０ＡＳＰ）で置換されたイン
シュリン類似体は、インシュリンほど効果がない。Ｂ１６−Ｂ１７（ＥＱＦ）で
置換されたインシュリ類似体は、全く効果がない。（実施例５）無傷細胞において、インシュリンは、インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体を阻害する。

【００８２】本実施例の研究は、細胞タンパク質分解に対するインシュリンの主な効果はプ
ロテアソーム活性に対する効果によるという証拠を提供する。

【００８３】材料および方法方法および試薬は、以下の例外を除いて実施例１および２に記載のものを用い
た。ＨｅｐＧ２細胞系は、ＯｍａｈａＶＡＭＣのＤ．クレメンス（D. Clemens）
からのものであった。ダルベッコ（Dulbecco）のモディファイドイーグルズ (M
odified Eagle's)培地（ＤＭＥＭ）は、ライフテクノロジー(Life Technologies
) (Grand Island, NY)からのものであった。ウシ胎児の血清は、インタージェン
社(Intergen Co.)(Purchase, NY)からのものであった。蛍光発生基質メトキシサ
クシニル-phe-leu-phe-7-アミド−4-トリフルオロメチルクマリン（ＦＬＦ）は
、酵素システムプロダクツ(Zenzyme Systems Products)(Dublin, CA)からのもの
であった。カルパイン阻害剤であるＮ−アセチル−leu-leu- ノルロイシナル(no
rleucinal)(カルパイン阻害剤Ｉ、ＡＬＬＮ)およびＮ−アセチル−leu-leu- メチオニナル(methioninal)(カルパイン阻害剤IＩ、ＡＬＬＭ)は、シグマ（セント
ルイス、ＭＯ）からのものであった。

【００８４】部分的に精製された多触媒性プロテイナーゼによるペプチド分解当該技術分野に公知の方法で、ラットの骨格筋細胞質ゾルから多触媒性プロテ
イナーゼ（プロテアソーム）を部分的に精製した。示された濃度のインシュリン
で３７℃、６０分間、ＦＬＦ（最終１３μＭ）を用いてトリス緩衝剤（０．１Ｍ
、ｐＨ７．５）でこの酵素をインキュベートした。氷のように冷たいエタノール
で反応を止め、７−アミド−４−トリフルオロメチルクマリンの遊離による蛍光発光は、それぞれ、３９０ｎｍと５１５ｎｍの励起および発光波長で測定した
。

【００８５】無傷細胞における細胞培養およびペプチド分解５％のＣＯ₂／９５％の空気環境で１０％ウシ胎児血清で補足したＤＭＥＭにヒト肝細胞癌（ＨｅｐＧ２）細胞を保持した。ペプチド分解アッセイのために、
処置に先立ち、一晩（１８時間）で亜密集培養を血清除去した。先に公開した方
法の変形により膜透過性基質（ＦＬＦ）でペプチド分解を評価した。ホルモンお
よび／または阻害剤処置の後、ＦＬＦを最終濃度が１３μＭになるまで細胞に添
加し、１時間インキュベートした。ＦＬＦの添加からのＤＭＳＯ濃度は０．０４
％を超えなかった。次いで、超音波処理により細胞を破壊し、生じた細胞培地／
溶解物を上記の蛍光計で測定した。

【００８６】細胞ペプチド分解に関する阻害研究プロテアーゼ阻害剤のＨｅｐＧ２細胞によるＦＬＦ分解に対する効果を、上記
のようなインシュリンおよび／またはＦＬＦ添加に先立ち、阻害剤による２時間
の細胞処置によって調べた。カルパイン阻害剤ＩおよびＩＩ（それぞれＡＬＬＮ
およびＡＬＬＭ）を、ＤＭＳＯで原液から調製した。阻害剤添加からのＤＭＳＯ
濃度は０．１５％を超えなかった。

【００８７】結果インシュリンは、投与量依存でＦＬＦ分解を阻害した。計算されたＥＣ₅₀＝１
．１×１０^-6Ｍであった。従って、ＦＬＦは、生体外でプロテアソームのキモト
リプリン様基質としてＬＬＶＹのように振る舞うようである。ＦＬＦの細胞内分
解は、ヒトの肝細胞癌（ＨｅｐＧ２）細胞で調べた。プロテアソーム基質として
のＦＬＦの特異性を決定するために、プロテアーゼ阻害剤を用いた。カルパイン
阻害剤であるＡＬＬＮおよびＡＬＬＭは、同様の力価で、ナノモル濃度において
カルパインおよびカテプシンを阻害する。ＡＬＬＮとＡＬＬＭは両者ともプロテ
アソームに対しても阻害的であるが、これは、マイクロモルの濃度においてであ
り、力価は大きく異なる。多触媒性プロテイナーゼにより触媒されたＦＬＦ加水
分解の場合と同様に、ＡＬＬＮは、マイクロモル濃度範囲でＦＬＦ分解を阻害し
たが、ＡＬＬＭの効果はずっと少なかった。これらの結果により、ＨｅｐＧ２細
胞におけるＦＬＦ分解の大部分はプロテアソームによることが確認された。無傷細胞でのプロテアソーム活性に対するインシュリンの効果を調べた。図７に
示すように、インシュリンは、肝細胞癌細胞における全タンパク質分解に対する
インシュリンの濃度依存の効果と同様に、投与量依存でＦＬＦ分解を阻害した。
計算されたＥＣ₅₀（〜１０^-13Ｍ）は生理学的に重要である。最大阻害は１９％であり、他の研究でのタンパク質加水分解の抑制へのインシュリン効果と同様で
ある。カルパイン阻害剤での追加の対照は、観察されたインシュリンの効果は多
触媒性プロテイナーゼ活性に対するものであることを示している。

【００８８】結論本実施例の研究は、無傷の細胞におけるプロテアソーム活性に対するインシュ
リンの潜在的効果を調べることが目的であった。インシュリンは、単離されたプ
ロテアソームおよび無傷細胞のいずれによってもＦＬＦ分解を阻害した。細胞阻
害は、インシュリンに対して非常に感応性が高い形質転換された肝細胞を用いた
先の研究と匹敵するぐらいの濃度が必要とされる濃度依存であった。阻害の規模
は、タンパク質分解の阻害に対するインシュリンの公知の作用と一致している。
この研究は、無傷細胞におけるプロテアソーム活性のインシュリン制御の役割を
裏付けている。

【００８９】（実施例６）無傷細胞において、インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体のインシュリン媒介阻害に活性ＩＤＥが必要である。

【００９０】この研究は、活性インシュリン分解酵素が、この酵素を阻害する抗体を用いる
ことによる無傷細胞でのタンパク質分解のインシュリン阻害に必要であるかどう
かを決定する。

【００９１】材料と方法方法および試薬は、以下の例外を除いて実施例１、２および５に記載されたも
のを用いた。プロテアソーム阻害剤であるラクタシスチン(lactacystin)は、Ｅ．Ｊ．コーレイ(Corey)（ハーバード大学）からのものであった。

【００９２】細胞タンパク質分解：スプラーグ−ドーレー(Sprague-Dawley)雄ラットを一晩
絶食させ、テリス(Terris)＆スタイナー(Steiner)の方法の変形で肝細胞を単離した。細胞緩衝剤において約１０⁶個／ｍｌの密度で細胞を再懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞の生存度は約９０％であった。細胞タンパク
質分解は、³Ｈ−ロイシンおよび５Ｘ規定血清濃度の非標識アミノ酸（ロイシンを除く）を含む緩衝剤で６０分間細胞を標識化することによって測定し、次いで
２ｍＭ非標識ロイシンで洗浄およびチェイスした。細胞は３つの部分に分割し、
３０μｇ／ｍｌの抗ＩＤＥ抗体Ｃ２０−３．１ａ（３）非特異性マウスＩｇＧ（
３０μｇ／ｍｌ）またはＰＢＳ緩衝剤のいずれかを添加した。これらのシステム
のそれぞれに対し、以下のものを添加した。すなわち、５Ｘアミノ酸、１０ｎＭ
ブタインシュリンまたは添加なしである。アミノ酸の規定血清濃度の５倍を正の
対照として用い、インシュリン調節システムとは独立した質量作用によるタンパ
ク質分解の阻害を示した。３７℃で細胞をインキュベートし、０および１２０分
時点で０．５ｍｌのアリクオットを取り、カウントした。細胞分解は、０および
１２０分での溶解度（１２．５％のＴＣＡでの）の違いにより決定した。

【００９３】生体外プロテアソーム活性：多触媒性プロテイナーゼと複合体を形成する部
分的に精製したインシュリン分解酵素を、ラットの骨格筋から当該技術分野に公
知の方法により得た。抗ＩＤＥ抗体Ｃ２０−３．１Ａの量を増加させながら５分間ＩＤＥ−プロテイナーゼ複合体をプレインキュベートした。Ａ１４位で¹²⁵ Ｉ−標識化されたインシュリンの分解をトリクロロ酢酸可溶カウントの生成によ
り測定した。プロテアソーム活性をＬＬＶＹおよびＬＳＴＲで測定し、それぞれ
、キモトリプシン様およびトリプシン様活性を決定した。

【００９４】抗体研究：ＨｅｐＧ２細胞の亜密集培養を一晩血清除去し、次いでオカダお
よびレシュタイナー(Rechsteiner)の方法により、阻害抗ＩＤＥモノクローナル抗体Ｃ２０−３．１Ａ（５０μｇ／ｍｌ）で浸透充填した。蛍光発生プロテアソ
ーム基質ＦＬＦを添加し、１時間細胞をインキュベートした。ＦＬＦの分解によ
る蛍光発光を上記のように測定した。

【００９５】結果表６に報告された結果は、全細胞タンパク質分解に与える細胞内インシュリン
ＩＤＥ効果を示している。タンパク質分解は、インシュリンまたは過度のアミノ
酸とのインキュベートにより減少した。予め標識化された細胞もまた、インシュ
リン分解酵素活性を阻害するモノクローナル抗体とインキュベートを行った。抗
体で処置された細胞は、タンパク質分解を減少させることによってインシュリン
にもはや反応せず、インシュリンとは独立した質量作用によって働く５倍余分の
アミノ酸の添加に反応した。これらのデータは、タンパク質分解の阻害のインシ
ュリンへの細胞反応におけるインシュリン分解酵素の選択的機能を示している。（表６）抗ＩＤＥ抗体は、単離されたラットの肝細胞でのタンパク質分解の阻害を排除
する。

【００９６】抗体なし抗ＩＤＥ非特異性ＩｇＧ対照１００１００１００５Ｘアミノ酸７８．８±４．６８５．０±２．４７８．４±６．５インシュリン８３．５±６．４９９．７±２．５７８．２±６．２放射性同位体で標識されたアミノ酸の放出により測定された細胞タンパク質分
解は、緩衝剤または非特異性ＩｇＧでのインシュリンと過度のアミノ酸によって
阻害される。しかし、抗ＩＤＥ抗体の存在下では、インシュリンは、タンパク質
分解を阻害しない。データはインシュリンまたは過度のアミノ酸不存在下でイン
キュベートされた細胞のものに正規化された、放出された可溶標識の百分率で表
している。

【００９７】表６のデータは、インシュリン−ＩＤＥ効果の特定の部位を示していない。イ
ンシュリン−ＩＤＥ−プロテアソーム相互作用を示したので、単離されたプロテ
アソームをインシュリンの存在下または不存在下で抗ＩＤＥ抗体の量を変化させ
ながらインキュベートした。プロテアソームの２つの異なる触媒部位であるトリ
プシン様およびキモトリプシン様を人工的な基質を用いてアッセイした。先に示
したように、インシュリンは、ＬＬＶＹ（キモトリプシン様）およびＬＳＴＲ（
トリプシン様）分解を阻害した。抗ＩＤＥ抗体は、投与量依存でＬＬＶＹおよび
ＬＳＴＲ分解へのインシュリン効果を阻止した。（表７）モノクローナル抗体でのＩＤＥの阻害は、生体外プロテアソームのインシュリ
ン阻害を減少させる。抗体インシュリン分解（％）１μＭインシュリンによる阻害（％）（μg/ml）ＬＬＶＹＬＳＴＲ０１００６４．５±４．９６９．９±２．９２０９４．６±８．５４５．８±８．７５２．６±７．３４０８０．９±１０．７４５．２±４．６３８．８±１３．７６０６８．２±９．８３７．２±３．９４７．０±９．４抗ＩＤＥ抗体の量を増加させながらインシュリン分解を測定した。データは、
１５分間のインキュベーションごとの酸可溶カウント百分率で表している。１μ
Ｍのインシュリンの存在下または不存在下で同じ条件でプロテアソーム活性を測
定した。データは、インシュリンの不存在下でのものと比べたときのプロテアソ
ーム活性の阻害の百分率で表している。データは３つの独立した実験での平均値
±ＳＥＭである。

【００９８】我々はまた、培養された肝細胞癌細胞での多触媒性プロテイナーゼによる蛍光
発生基質（ＦＬＦ）の分解をモニターすることによって、インシュリンの生体内
効果もまた、インシュリン分解酵素による媒介に係わることを示した。これらの
細胞を、インシュリン分解酵素阻害モノクローナル抗体またはビークルのみで浸
透的に装填した。回収可能にするための一晩のインキュベーション後、アッセイ
した細胞およびＦＬＦ分解にインシュリンを添加した。ビークルのみを装填した
細胞において、インシュリンは、予想通り、投与量依存でプロテアソーム活性を
阻害した。阻害的抗体を含む細胞は、ホルモンへの反応が非常に制限された。

【００９９】結論この実施例において、インシュリン分解酵素の活性を阻害する抗体を用いて、
無傷細胞でのタンパク質分解のインシュリン阻害にインシュリン分解酵素が必要
であることを示した。抗ＩＤＥ抗体は、放射性アミノ酸で予め標識化されたタン
パク質の細胞の分解に対するインシュリン効果を阻止した。抗ＩＤＥ抗体はまた
、無傷細胞における特異性基質のプロテアソーム分解のインシュリン阻害を減少
させた。これらのデータは、インシュリンは、プロテアソームによるタンパク質
分解を阻害するために、インシュリン分解酵素を介して細胞内で働くことを示し
ている。

【０１００】（実施例７）無傷細胞において、インシュリン由来ペプチドは、インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体を阻害する。

【０１０１】インシュリン由来ペプチドＨＬＶＥＡＬＹおよびＬＶＥＡＬＹを調べて、一次
培養および肝臓培養細胞系、ＨｅｐＧ２での無傷の単離されたラットの肝細胞に
おけるインシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体の活性に対す
る効果を決定した。

【０１０２】材料および方法実施例１、２、５および６に記載の方法および試薬を用いた。

【０１０３】結果インシュリンおよびインシュリン由来ペプチドであるＨＬＶＥＡＬＹおよびＬ
ＶＥＡＬＹのいずれも、ＨｅｐＧ２細胞でのインシュリン分解酵素と多触媒性プ
ロテイナーゼ複合体ＦＬＦ分解を阻害する（図８Ａおよび８Ｂ）。インシュリン
による阻害は、細胞をそのタンパク質に曝したあと少なくとも１２０分後に観察
された。ペプチドの阻害効果は一過性のものであった。阻害は、ペプチドの添加
６０分後に観察されたが、ペプチドの添加１２０分後では観察されなかった。イ
ンシュリンのペプチドに対する効果もまた、単離された肝細胞で調べた（図９）
。インシュリンによる阻害は、最大約９０分間明らかであった。１０^-10モルでのペプチドＬＶＥＡＬＹによる阻害は、少なくとも１２０分間明らかであった（
図１０Ａ）。ペプチドＨＬＶＥＡＬＹによる阻害は一過性のものであり、ペプチ
ドの添加１２０分後に消滅した。

【０１０４】結論インシュリン由来ペプチドＨＬＶＥＡＬＹおよびＬＶＥＡＬＹは、無傷細胞に
おいてインシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体のプロテアー
ゼ活性を阻害する。

【０１０５】（実施例８）無傷細胞において、インシュリン、インシュリン類似体およびインシュリン由来ペプチドが全細胞タンパク質分解を阻害する。

【０１０６】全細胞タンパク質分解をインシュリン、インシュリン類似体およびインシュリ
ン由来ペプチドの存在下で測定し、インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナ
ーゼとの複合体のこれらのポリペプチドによる阻害が、細胞におけるタンパク質
の代謝回転効果を有するかどうかを決定した。

【０１０７】（実験１）材料および方法方法および試薬は、以下の例外を除いて実施例１、２、５および６に記載のも
のを用いた。肝細胞細胞系はＨ１４であり、これは、細胞系ＨｅｐＧ２の場合の
上記の実験研究に用いたものである。

【０１０８】結果図１１に示すような結果になった実験において、一晩細胞を標識化し、洗浄し
、次いで、様々な濃度のインシュリン、インシュリン類似体およびインシュリン
由来ペプチドの存在下で３時間タンパク質分解を進行させた。インシュリンは、
生理学的濃度が１０^-11〜１０^-9モルにおいてタンパク質分解を阻害した。１０位にＢ鎖のアミノ酸変化を有する変異インシュリンは、インシュリンより低い程
度で阻害した。ペプチドＬＶＥＡＬＹは、タンパク質分解に大きな阻害を示さな
かった。ペプチドＨＬＶＥＡＬＹは、１０^-9〜１０^-7モルの濃度でタンパク質分
解に対し大きな阻害を行った。

【０１０９】図１２に示すような結果となった別の実験において、一晩細胞を標識化し洗浄
し、３時間プレインキュベートした。次いで、阻害剤を添加し、４時間の期間の
終了時にタンパク質分解を評価した。インシュリンならびにインシュリン類似体
Ｂ１０およびＥＱＦはタンパク質分解を阻害した。ペプチドＬＶＥＡＬＹは、大
きな阻害を示さなかった。ペプチドＨＬＶＥＡＬＹは、１０^-10および１０^-9で阻害を示した。

【０１１０】結論インシュリン、インシュリン類似体およびインシュリン由来ペプチドは、無傷
肝細胞でのタンパク質分解を効果的に阻害した。

【０１１１】（実験２）インシュリンおよびインシュリン由来ペプチドの存在下で様々な標識化および
ペプチドへの暴露条件で全細胞タンパク質分解を測定し、これらの条件が、細胞
におけるタンパク質の代謝回転のこれらのペプチドによる阻害に影響を与えるか
どうかを決定した。

【０１１２】材料と方法この実験において、時間を変化させて[³H]ロイシンとともに培養した肝細胞（
Ｈ４細胞）をインキュベートした。次いで、取り込まれなかった標識を洗浄して
落とし、細胞を過度の未標識ロイシンとともに細胞をインキュベートした。様々
な濃度のインシュリンまたはインシュリン由来ペプチドで細胞を処置した。上記
のような酸可溶放射性の生成によってタンパク質分解を検定した。その他は、実
施例１、２、５および６に記載の方法および試薬を用いた。肝細胞細胞系はＨ４
であり、これは、細胞系ＨｅｐＧ２の場合に上記の実験研究に用いたものである
。

【０１１３】結果２つの異なる標識化条件でのインシュリンおよびペプチドのタンパク質分解に
与える効果を図３１および図３２に示す。図３１は、インシュリンの投与量依存
効果を示しており、標準条件（１８時間の標識化、３時間洗浄および４時間のイ
ンキュベーション）でのタンパク質分解が減少している。ＨＬＶＥＡＬＹは、単
離されたプロテアソームで見られたのと非常によく似た３相効果を有している（
上記実施例４、図５Ａおよび図５Ｂを参照）。ＬＶＥＡＬＹは、似ているが、顕
著さが少ない効果を有している。図３２は、異なる標識化および処置条件（洗浄
なし、Ｃａ⁺⁺不存在でアミノ酸存在のインキュベーション培地）でのインシュリ
ンおよびペプチド効果を示している。これらの条件下では、いずれのペプチドも
インシュリンより低い濃度でタンパク質分解が減少しているが、全体的な効果は
少ない。

【０１１４】結論いずれのペプチドも、いずれの条件においても培養肝細胞でのタンパク質分解
を減少させる。

【０１１５】（実施例９）動物において、インシュリン由来ペプチドが、全細胞タンパク質分解を阻害する。

【０１１６】ラットにおける絶対的または相対的インシュリン欠乏症疾患または重度のイン
シュリン抵抗疾患およびタンパク質異化作用疾患の症状に影響を与え得るかどう
かについて、インシュリン由来ペプチドを評価した。材料と方法糖尿病のスプラーグ−ドーレー(Sprague-Dawley)ラットを処置および対照グル
ープに分けた。移植された浸透ポンプから持続的に注入することによって、ビー
クルまたはインシュリン由来ペプチドのいずれかをラットに投与した。ペプチド
の投与量をμｇ／時で図１３〜図１６に示す。この動物の尿排泄および体組成に
ついて、当該技術分野で公知の方法で評価した。

【０１１７】結果第１の実験において、未処置の糖尿病ラット（ｎ＝１）をインシュリン処置（
ｎ＝２）およびＨＬＶＥＡＬＹペプチド処置（ｎ＝１）のラットと比較した。結
果を図１３および図１４に示す。投与量が０．５μｇ／時および１μｇ／時のＨ
ＬＶＥＡＬＹペプチドは、尿排出、体重量および種々の筋肉および器官の重量に
対して大きくかつ一貫した効果を示した。これらのデータは、ラットにおける絶
対的または相対的インシュリン欠乏症疾患または重度のインシュリン抵抗疾患お
よびタンパク質異化作用疾患の症状を軽減における明らかな生物学的効果を示し
ている。これらの研究において、ペプチドは実際、脂肪体および骨格筋のサイズ
を減少させた。ペプチドはグルコースレベルには効果がなかった。第２の実験において、インシュリン処置の糖尿病ラット（ｎ＝１）をインシュリ
ンとＨＬＶＥＡＬＹペプチドの両方で処置されたラット（ｎ＝１）と比較した。
結果を図１５および図１６に示す。ここでも、ＨＬＶＥＡＬＹペプチドが、尿容
量および体および器官の重量に対する効果が大きかった。５μｇ／時および８μ
ｇ／時の投与量で、ＨＬＶＥＡＬＹは、未処置およびインシュリン処置の糖尿病
対照に対して、脂肪体および骨格筋の重量を増加させた。ペプチドはグルコース
レベルには効果がなかった。

【０１１８】結論これらのデータは、関連動物モデルにおける絶対的または相対的インシュリン
欠乏症疾患または重度のインシュリン抵抗疾患およびタンパク質異化作用疾患の
症状に対するＨＬＶＥＡＬＹの生物学的効果を示している。（実施例１０）糖尿病動物において、インシュリン由来ペプチドが、脂肪貯蔵を犠牲にして筋肉質量を維持する。

【０１１９】ラットにおける絶対的または相対的インシュリン欠乏症疾患または重度のイン
シュリン抵抗疾患およびタンパク質異化作用の症状に影響を与え得るかどうかに
ついて、インシュリン由来ペプチドを評価した。

【０１２０】材料と方法ストレプトゾトシンでの処置によりラットを糖尿病にし、皮下浸透小ポンプを
移植した。小ポンプにより、緩衝剤、０．１〜０．８μｇ／時のＨＬＶＥＡＬＹ
、０．０５〜５．０μｇ／時のＬＶＥＡＬＹ、または各ペプチドが０．１〜２．
５μｇ／時のこれら２種類のペプチドを組み合わせたもののうちいずれかを投与
した。小ポンプ（通常のインシュリン、２．４Ｕ／ｄａ７）または皮下注射（１
日当たり１．５〜３．５ユニットのＰＺＩインシュリン）のいずれかによってイ
ンシュリンを投与した。

【０１２１】血液グルコースレベルおよび尿３−メチルヒシチジンレベルを毎日測定した。
６日後、この動物を殺し、器官重量を測定した、種々の代謝物のアッセイのため
の血液を得た。

【０１２２】結果図１７および図１８は、それぞれ最初と最後の血液グルコースレベルを示す。
インシュリン処置により、グルコースレベルが大きく減少した。ペプチドにより
、グルコースは、大きくないがわずかに減少した。

【０１２３】図１９は尿Ｎ−メチルヒスチジン排泄を示す。Ｎ−メチルヒスチジンレベルは
、筋肉分解のレベルと相関関係があることが当該技術分野で知られている。図１
９のこの測定は、筋肉分解が糖尿病で増加し、インシュリンにより減少すること
を示している。ＨＬＶＥＡＬＹは筋肉異化作用の減少においてインシュリン分解
酵素と同じくらい効果があった。ＬＶＥＡＬＹは、大きな効果がなかった。

【０１２４】図２０、図２１および図２２は、それぞれ、トリグリセリド、β−ヒドロキシ
酪酸塩および非エステル化脂肪酸の血清レベルを示す。それらはいずれも糖尿病
によって増加し、インシュリン処置により減少した。ＨＬＶＥＡＬＹは、トリブ
リセリドを非糖尿病レベルにまで回復させるが、β−ヒドロキシ酪酸塩および非
エステル化脂肪酸のレベルに対しては大きな効果がなかった。ＬＶＥＡＬＹは、
これらの物質のいずれのレベルに対しても大きな効果がなかった。

【０１２５】これらの短期間実験において、体または器官重量に対して大きな効果が見られ
なかった。５つの実験のうち４つ（動物の糖尿病の度合いが少ない１つの実験以
外）において、ＨＬＶＥＡＬＹは、筋肉重量の維持および体脂肪の減少をいくら
か示した（図２３〜図３０）。図２３は、対照動物およびインシュリン、ＨＬＶ
ＥＡＬＹおよびＬＶＥＡＬＹで処置されたラットにおける絶対滑車上部筋重量を
示す。図２４は、全体重の％として表わした対照および実験動物における滑車上
部筋重量に対する効果を示す。図２３および図２４の結果は、ＬＶＥＡＬＹが実
際にこの代謝活性筋肉の重量を減少させたが、ＨＬＶＥＡＬＹは、これを増加さ
せる傾向があった。しかし、副睾丸脂肪体については、未処置糖尿病動物よりＨ
ＬＶＥＡＬＹ処置動物の方がさらに低い傾向があった（図２５および図２６）。
同様の傾向が、全体の脚、ひらめ筋および滑車上部筋に対する膨らみ部分の割合
において実際見られる（図２７〜図２９）。ＨＬＶＥＡＬＹ処置動物の全体重は
、低い傾向にあった（図３０）。

【０１２６】結論ＨＬＶＥＡＬＹ処置は、糖尿病ラットにおける筋肉分解を減少させた。この処
置は、脂肪貯蔵を犠牲にして筋肉を保持する傾向があった。脂肪代謝回転への効
果は、ＨＬＶＥＡＬＹ処置ラットにおける血清トリグリセリドの減少により裏付
けられた。

【０１２７】これらのデータは、関連動物モデルにおける絶対的または相対的インシュリン
欠乏症疾患または重度のインシュリン抵抗疾患およびタンパク質異化作用の症状
に対するＨＬＶＥＡＬＹペプチドの生物学的効果を示している。

【０１２８】（実施例１１）無傷細胞において、インシュリンおよびインシュリン由来ペプチドは、タンパク質分解および脂質合成を減少させ、グルコース輸送、グルコース酸化およびＩＬ−８分泌を増加させるが、インシュリン由来ペプチドは、ＤＮＡ合成に影響を与えない。

【０１２９】細胞インシュリン反応の幾つかの特徴をインシュリンおよびインシュリン由来
ペプチドの存在下で測定して、これらのポリペプチドが、無傷細胞のタンパク質
分解、脂質合成、グルコース輸送または酸化、ＩＬ−８分泌およびＤＮＡ合成に
効果があるかどうかを決定した。

【０１３０】（実験１）上記のようなインシュリン作用の容認されたモデルは、脂肪堆積、代謝作用お
よびタンパク質の代謝回転におけるインシュリンプロセシングおよび分解の機能
を含む。この研究は、単離された脂肪細胞の代謝作用に対するインシュリンおよ
びペプチドの効果を調べる。

【０１３１】材料および方法以下に述べる方法および当該技術分野において通常の方法によって脂肪細胞を
得て培養した。その他は、実施例１、２、５および６に大体記載の試薬および方
法を用いた。当業者に公知の方法によりグルコース代謝作用を測定した。

【０１３２】結果および議論脂肪細胞における細胞内グルコース代謝作用に対するペプチドの効果を図３３
および図３４に示す。

【０１３３】インシュリンは、脂肪細胞のグルコース輸送を増加させることが知られている
。これは、インシュリンに曝すと急速に発生し、インシュリンのプロセシングに
よって変化することがないインシュリンの効果であり、したがって、本研究には
含まなかった。この後グルコースは脂肪として貯蔵され（中間効果）、または酸
化される。

【０１３４】無傷脂肪細胞において、ＨＬＶＥＡＬＹは、グルコースの脂質への組み込みを
減少させ（図３３）、グルコース酸化を増加させる（図３４）。

【０１３５】結論グルコースの脂質への組み込みを減少させ、グルコース酸化を増加させるとい
うインシュリン由来ペプチドの効果は、本明細書で報告された糖尿病ラットの研
究に基づき予想していたものである。これらの効果は、インシュリンの効果につ
いての本発明の知識と一貫している。

【０１３６】この効果は、インシュリン由来ペプチドが、脂肪貯蔵が第１の問題である肥満
、インシュリン抵抗２型糖尿病において顕著な臨床的利点を有することができる
。

【０１３７】（実験２）インシュリンは、多くの生理的な経路を調節し、これは、従来からインシュリ
ン感応性とされていない細胞のものであっても行う。これらの多くは、たとえば
上記のようなインシュリンへの中間反応を有する。内皮細胞は、インシュリンに
反応してサイトカイン分泌を変化させ、これが、一次刺激剤のモジュレータとし
て働く。

【０１３８】材料および方法当該技術分野において通常の方法によって内皮細胞を得て培養した。その他は
、実施例１、２５および６に大体記載の試薬および方法を用いた。当業者に公知
の方法によりＩＬ−８刺激を達成し、レベルを測定した。

【０１３９】結果デキサメタゾン、インシュリンおよびＴＮＦの間の相互作用ならびに呼吸内皮
細胞からのＩＬ８分泌作用に対するそれらの効果を図３５に示す。インシュリン
は、ＴＮＦ刺激された細胞のＩＬ８分泌作用を増加させた。ＬＶＥＡＬＹ（ペプ
チドＤ）は、ＴＮＦ刺激されたＩＬ−８分泌作用に大きな効果がある。ＨＬＶＥ
ＡＬＹ（ペプチドＢ）は、ＴＮＦ刺激されたＩＬ−８分泌作用へのインシュリン
効果より大きな効果がある。同様に、ＴＮＦとデキサメタゾンで処置された細胞
において、ＬＶＥＡＬＹは大きな効果がなく、ＨＬＶＥＡＬＹはインシュリンよ
り大きな効果を示す。

【０１４０】結論ここでも、インシュリンの細胞作用を真似ているインシュリン由来ペプチドの
選択的効果が明らかである。

【０１４１】（実験３）インシュリンプロセシングおよび分解に関係しないインシュリンの効果のなか
には、インシュリンＤＮＡ合成を刺激するという効果があった。インシュリン由
来ペプチドのＤＮＡ合成への効果を評価した。

【０１４２】材料および方法以下の例外を除いて実施例１、２、５および６に記載の方法および試薬を用い
た。肝細胞細胞系はＨ４であり、これは、細胞系ＨｅｐＧ２の場合の上に記載し
た実験研究に用いたものである。

【０１４３】結果図３６は、インシュリン由来ペプチドは、肝細胞においてＤＮＡ合成を刺激し
ないが、インシュリンはするということを示す結果を示す。

【０１４４】結論インシュリン由来ペプチドがＤＮＡ合成に対する効果がないということは、本
明細書に報告したこれらのペプチドの活性に基づくと予想される。これらの効果
は、インシュリンの効果の本発明の知識と一貫している。インシュリンのこの作
用は、インシュリンの分解に依存せず、分解したインシュリンを真似るペプチド
は、ＤＮＡ合成を刺激するはずがない。

【０１４５】（実施例１２）肥満２型糖尿病ラットにおいて、インシュリン由来ペプチドは、高血糖および筋肉分解を減少させる。

【０１４６】ラットにおける絶対的または相対的インシュリン欠乏症疾患または重度のイン
シュリン抵抗疾患およびタンパク質異化作用の症状に影響を与え得るかどうかに
ついて、インシュリン由来ペプチドを評価した。特に、糖尿病ラットの生体内デ
ータおよび生体外脂肪細胞研究により、肥満被験物の２型糖尿病の症状の軽減に
おけるインシュリン由来ペプチドの数値を示す。

【０１４７】（実験１）材料および方法概して、実施例１、２、５、６、９および１０に記載の材料および方法を用い
た。用いたラットは、ツッカー肥満糖尿病動物であった。他の手順および試薬は
当該技術分野で通常用いられるものである。

【０１４８】結果実験動物のうちたった２匹だけば、実験中に高血糖を発達させ始めた。３−メチルヒシチジン排泄のレベルを測定することによって、筋肉分解をモニタ
した。結果を図３７に示す。３−メチルヒシチジンレベルは、緩衝剤処置ラット
では徐々に増加したが、ＨＬＶＥＡＬＹ処置動物では最初の３日にかけて減少し
た。ＨＬＶＥＡＬＹは、インシュリン欠乏ラットの場合と同様に、２型動物モデ
ルでの筋肉分解を減少させた。

【０１４９】ＨＬＶＥＡＬＹ投与で達成されたパターン、すなわち、初期の３−メチルヒシ
チジンの減少、後の逸脱(escape)は、ペプチドの分解によるものかもしれない。

【０１５０】結論インシュリン由来ペプチドは、肥満２型糖尿病動物の筋肉分解および高血糖を
減少させた。

【０１５１】（実験２）材料および方法概して、実施例１、２、５、６、９および１０に記載の材料および方法を用い
た。用いたラットは、ツッカー肥満糖尿病動物であった。他の手順および試薬は
当該技術分野で通常用いられるものである。

【０１５２】脂肪細胞調製アルゼットモデル(Alzet Model) 2001小浸透ポンプを用いて、２μｇ／時で７
日間インシュリン由来ペプチドＨＬＶＥＡＬＹ存在（ｎ＝２）または不存在（ｎ
＝２）で、ツッカー糖尿病肥満動物（ＺＤＦ／Ｇｍｉ^tm−ｆａ／ｆａ）を処置し
た。副睾丸脂肪体を除去し、脂肪細胞をコラゲナーゼ消化により調製した。４％
のウシ血清アルブミンおよび０．５５ｍＭグルコースを含んでいるKrebs-Ringer
/HEPES緩衝剤、ｐＨ７．４をすべての単離およびインキュベーション工程で用い
た。この手順において、１ｇの切り刻まれた脂肪組織を、緩やかに振りながら３
７℃で４５分間、５ｇのコラゲナーゼを含む２ｍｌの緩衝剤でインキュベートし
た。次いで、緩衝剤で２回細胞を洗浄し、ポリエステルシルクで濾過した。次い
で、アッセイ用に細胞をマイクロフュージ(microfuge)チューブに等分した。

【０１５３】脂肪酸酸化アッセイ [9,10-³H]パルミチン酸塩から³H₂Oへの変換によって脂肪酸酸化を評価する。３７℃、５時間、１ｍＭのＫＣＮ存在下および不存在下で、２％ＢＳＡおよび０
．１ｍＭパルミチン酸塩（１μＣｉ／μｍｏｌ）と用いてＭＥＭにおいて新しく
単離された脂肪細胞（２×１０⁶／ｍｌ）をインキュベードした。ＫＣＮ（ミトコンドリア阻害剤）の存在下で起こる酸化は、もともとペルオキシゾーム性であ
ると考えた。５％トリクロロ酢酸による析出（２×）により、培地中の余分の[9
,10-³H]パルミチン酸塩を除去した。上澄み液をミイクロフュージチューブに移し、０．５ｍｌの非標識水とともにシンチレーションバイアルに入れ密閉し、５
０℃、１８時間インキュベートした。次いで、マイクロフュージチューブの外部
の水をシンチレーション液に追加し、ベータカウンターで測定した。別途、１０
μｌの³Ｈ₂Ｏをマイクロフュージチューブの４９０μｌの水に添加することによ
り、³Ｈ₂Ｏの平衡係数を決定し、上記のようにインキュベートした。次いで、こ
の平衡係数を用いて細胞によって生成された³Ｈ₂Ｏの総量を計算した。

【０１５４】結果図３８および図３９は本研究の結果を示す。図３８に示すように、処置された
動物からの細胞で全脂肪酸酸化は増加した。図３９は、この増加の多くが、ペル
オキシゾーム性脂肪酸酸化からの刺激によるということを示している。

【０１５５】結論これらの結果は、ＨＬＶＥＡＬＹ処置が、脂肪細胞による脂肪酸酸化を増加さ
せることを示す。したがって、インシュリン由来ペプチドが、肥満２型糖尿病動
物の別の症状を減少させた。これらの結果は、処置動物の副睾丸(epidymal)脂肪
体重量の減少を示した、本明細書中の上記のスプラーグ−ドーレー(Sprague-Daw
ley)ラットでの研究と合致する。種々の具体的な好ましい実施形態および技術を参照しながら本発明を説明した
。しかし、本発明の精神および範囲内で多くの変形および変更がなせることを理
解すべきである。

【０１５６】本明細書中のすべての公報および特許出願は、本発明が関する当業者のレベル
を示している。すべての公報および特許出願は、各個々の公報および特許出願が
参照により具体的および個々に示されているのと同じ程度まで参照により本明細
書中に組み込まれている。

【０１５７】

【配列表】

SEQUENCE LISTING <110> DUCKWORTH, William,Clifford HAMEL, Frederick,G. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING AND DIAGNOSING INSULIN RELATED DISORDERS <130> R4425 <140> PCT/US99/00471 <141> 1999-01-08 <150> US60/070,821 <151> 1998-01-08 <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> mammalian <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <400> 1 His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> mammalian <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(6) <400> 2 Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、インシュリン分解酵素の高親和性配位子であるペプチドがインシュリ
ン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体によるＬＬＶＹ分解を阻害する
ことを示している。酵素複合体（□）または精製された多触媒性プロテイナーゼ
（黒塗りの四角）を１μmol/lのペプチドホルモンの存在下および不存在下でインキュベートした。この複合体と精製された多触媒性プロテイナーゼについて、
それらによる分解に対するペプチドホルモンの効果を比較した（^*Ｐ＜０．０１）。ＬＬＶＹ分解をビークルだけの添加と比較して、６０分当たりの遊離した蛍
光発光（任意の単位）の百分率で表している。データは３つの独立した実験での
平均値±ＳＥで示されている。ＧＬＣ，グルカゴン；ＩＮＳ，インシュリン；Ｐ
ＲＯ，プロインシュリン；ＲＸＮ，リラキシン。

【図２】図２は、インシュリン分解酵素の高親和性配位子であるペプチドがインシュリ
ン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体によるＬＳＴＲ分解を阻害する
ことを示す結果を表している。酵素複合体（□）または精製された多触媒性プロ
テイナーゼ（黒塗りの四角）を１μmol/lのペプチドホルモンの存在下および不存在下でインキュベートした。この複合体と精製された多触媒性プロテイナーゼ
について、それらによる分解に対するペプチドホルモンの効果を比較した（^*Ｐ＜０．０５、^**Ｐ＜０．０１）。ＬＳＴＲ分解をビークルだけの添加と比較して
、６０分当たりの遊離した蛍光発光（任意の単位）の百分率で表している。デー
タは３つの独立した実験での平均値±ＳＥで示されている。用いられている短縮
形は、ＧＬＣ，グルカゴン；ＩＮＳ，インシュリン；ＰＲＯ，プロインシュリン
；ＲＸＮ，リラキシンである。

【図３】図３は、多触媒性プロテイナーゼによるＬＬＥ分解にほとんど効果のないペプ
チドを示している。酵素複合体（□）または精製された多触媒性プロテイナーゼ
（黒塗りの四角）を１μmol/lのペプチドホルモンの存在下および不存在下でインキュベートした。この複合体と精製された多触媒性プロテイナーゼについて、
それらによる分解に対するペプチドホルモンの効果を比較した（^*Ｐ＜０．０５）。ＬＬＥ分解をビークルだけの添加と比較して、６０分当たりの遊離した蛍光
発光（任意の単位）の百分率で表している。データは３つの独立した実験での平
均値±ＳＥで示されている。用いられている短縮形は、ＧＬＣ，グルコース；Ｉ
ＮＳ，インシュリン；ＰＲＯ，プロインシュリン；ＲＸＮ，リラキシンである。

【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの
複合体によるＬＬＶＹ分解（Ａ）およびＬＳＴＲ分解（Ｂ）に与えるインシュリ
ンおよび類似体の効果の投与量応答曲線を示している。インシュリンおよびｌｙ
ｓ−ｐｒｏインシュリンの効果はほぼ等しい。Ｂ１０−ａｓｐの阻害はそれより
少なく、ＥＱＦは大きな阻害を示していない。

【図５】図５Ａおよび図５Ｂは、ＬＬＹＹ分解（Ａ）およびＬＳＴＲ分解（Ｂ）の加水
分解により触媒されたＩＤＥ−ＭＣＰに対するインシュリンおよびペプチドの効
果の投与量応答曲線を示している。ＨＬＶＥＡＬＹは１０^-5Ｍで最大の阻害を有
する３相の効果を有する。ＬＶＥＡＬＹは１０^-5Ｍで阻害する。

【図６】図６は、ＭＣＰ−ＩＤＥ複合体によって触媒された¹²⁵Ｉインシュリンの分解の阻害の投与量応答効果を示している。インシュリン、インシュリン類似体およ
びインシュリン由来ペプチドを試験した。Ｂ１０−ａｓｐインシュリンと野生型
インシュリンは等しい。ＥＱＦインシュリンはより効果的である。ペプチドＨＬ
ＶＥＡＬＹおよびＬＶＥＡＬＹは、１０^-6〜１０^-5Ｍの範囲の濃度で阻害する。

【図７】図７は、無傷のＨｅｐＧ２細胞におけるインシュリンによるＦＬＦ分解の投与
量依存阻害を示している。ＨｅｐＧ２細胞の亜密集培養は一晩血清除去し、次い
で２時間示された濃度のインシュリンで処置し、次いで１時間基質（ＦＬＦ）を
添加した。データは、少なくとも４つの独立した実験のビークルだけでのＦＬＦ
分解％の平均値±ＳＥＭとして表している。ＥＣ₅₀は、１．５×１０^-13Ｍインシュリンであり、最大阻害率は１９．１％である。＊＊は、結果が、インシュリ
ンを全く添加しないときとは大きく異なることを示している（ｐ＜０．０１）。

【図８】図８Ａおよび図８Ｂは、ＨｅｐＧ２細胞におけるインシュリン分解酵素と多触
媒性プロテイナーゼとの複合体によるＦＬＦ分解のインシュリンおよびインシュ
リン由来のペプチドによる阻害を示している。インシュリンまたはペプチドの添
加６０分後（Ａ）および１２０分後（Ｂ）のインシュリン、ＨＬＶＥＡＬＹおよ
びＬＶＥＡＬＹの投与応答曲線を示す。

【図９】図９は、単離された肝細胞におけるインシュリン分解酵素と多触媒性プロテイ
ナーゼとの複合体によるＦＬＦ分解のインシュリンによる経時的な阻害を添加イ
ンシュリンの不存在下、ゼロ時間の％として示している。

【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、単離された肝細胞におけるインシュリン分解酵素と
多触媒性プロテイナーゼとの複合体によるＦＬＦ分解に対するＬＶＥＡＬＹ（Ａ
）およびＨＬＶＥＡＬＹ（Ｂ）の効果を時間０でペプチドを添加しないときの分
解の％として示している。

【図１１】図１１は、インシュリン、インシュリン類似体およびインシュリン由来ペプチ
ドによるＨ４細胞における全細胞タンパク質分解の阻害を示す。細胞を一晩標識
化し、次いで洗浄し、次いでインシュリン、類似体およびペプチドの効果を測定
した。

【図１２】図１２は、標識が不存在下での３時間のプレインキュベーション後のインシュ
リン、インシュリン類似体およびインシュリン由来ペプチドによるＨ４細胞にお
ける全細胞タンパク質分解の阻害を示す。細胞を一晩標識化し洗浄した。３時間
のプレインキュベーション後の４時間にわたるタンパク質分解を評価した。

【図１３】図１３は、対照およびＨＬＶＥＡＬＹ処置動物の尿排出を示す。

【図１４】図１４は、対照およびＨＬＶＥＡＬＹ処置動物の体重を示す。

【図１５】図１５は、対照およびＨＬＶＥＡＬＹ処置動物の尿排出を示す。

【図１６】図１６は、対照およびＨＬＶＥＡＬＹ処置動物の体重を示す。

【図１７】図１７は、インシュリンまたはインシュリン由来ペプチドで処置された糖尿病
動物における最初の血液グルコースレベルを示す。

【図１８】図１８は、インシュリンまたはインシュリン由来ペプチドで処置された糖尿病
動物における最終血液グルコースレベルを示す。

【図１９】図１９は、インシュリンまたはインシュリン由来ペプチドで処置された糖尿病
動物からの尿のＮ−メチルヒスチジン排泄を示す。

【図２０】図２０は、インシュリンまたはインシュリン由来ペプチドで処置された糖尿病
動物における血清トリグリセリドレベルを示す。

【図２１】図２１は、インシュリンまたはインシュリン由来ペプチドで処置された糖尿病
動物における血清β−ヒドロキシブチレートレベルを示す。

【図２２】図２２は、インシュリンまたはインシュリン由来ペプチドで処置された糖尿病
動物における血清非エステル化脂肪酸レベルを示す。

【図２３】図２３は、インシュリン、ＨＬＶＥＡＬＹおよびＬＶＥＡＬＹで処置された対
照動物およびラットにおける滑車上部筋の絶対重量を示す。

【図２４】図２４は、対照および実験動物における滑車上部筋に与える効果を全体重の％
として示す。

【図２５】図２５は、インシュリン、ＨＬＶＥＡＬＹおよびＬＶＥＡＬＹで処置された対
照動物およびラットにおける副睾丸の脂肪体の絶対重量を示す。

【図２６】図２６は、対照および実験動物における副睾丸の脂肪体に与える効果を全体重
の％として示す。

【図２７】図２７は、対照および実験動物における副睾丸の脂肪体に与える効果を全脚重
量の％として示す。

【図２８】図２８は、対照および実験動物における副睾丸の脂肪体に与える効果をヒラメ
筋重量の％として示す。

【図２９】図２９は、対照および実験動物における副睾丸の脂肪体に与える効果を滑車上
部筋重量の％として示す。

【図３０】図３０は、インシュリン、ＨＬＶＥＡＬＹおよびＬＶＥＡＬＹで処置された対
照動物およびラットにおける体重変化を示す。

【図３１】図３１は、標準的な条件下（１８時間の標識化、３時間の洗浄および４時間の
インキュベーション）で標識された無傷細胞におけるタンパク質分解の減少に与
えるインシュリンの投与依存効果を示す。

【図３２】図３２は、図３１で用いたものと異なる標識化および処置条件下（洗浄なし、
Ｃａ⁺⁺がなくアミノ酸を有するインキュベーション培地）で標識された無傷細胞
におけるタンパク質分解の減少に与えるインシュリンおよびペプチドの効果を示
す。

【図３３】図３３は、インシュリンおよびＨＬＶＥＡＬＹで処置された無傷の脂肪細胞で
のグルコースの脂質への取り込みを示す。

【図３４】図３４は、インシュリンおよびＨＬＶＥＡＬＹで処置された無傷の脂肪細胞で
のグルコース酸化を示す。

【図３５】図３５は、デクサメタゾーン、インシュリンおよびＴＮＦの相互作用ならびに
呼吸内皮細胞からのＩＬ８分泌に与えるそれらの効果を示す。

【図３６】図３６は、Ｈ４肝細胞におけるＤＮＡ合成に対するインシュリンおよびインシ
ュリン由来ペプチドの効果を示す。

【図３７】図３７は、肥満の２型糖尿病ラットによる尿３−メチルヒスチジン排泄に対す
るＨＬＶＥＡＬＹ処置の効果を示す。

【図３８】図３８は、肥満の２型糖尿病ラットの脂肪細胞における全脂肪酸酸化に対する
ＨＬＶＥＡＬＹ処置の効果を示す。

【図３９】図３９は、肥満の２型糖尿病ラットの脂肪細胞におけるペルオキシゾーム性脂
肪酸酸化に対するＨＬＶＥＡＬＹ処置の効果を示す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年２月１１日（２０００．２．１１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ハメル、フレデリックジー．アメリカ合衆国、68124 ネブラスカ州、オマハ、エス．102ンドストリート 3631 Ｆターム(参考） 2G045 DA36 FA26 FA27 FA29 FB01 FB03 FB07 FB08 FB12 GC15 4H045 AA10 BA13 BA14 BA15 BA16 BA17 CA40 DA56 EA20 EA27 FA34 FA74 HA02 HA03

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】インシュリン分解酵素の切断部位に隣接するインシュリン由来
の配列を含むポリペプチドであって、インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイ
ナーゼとの複合体の活性を阻害するポリペプチド。
【請求項２】前記ポリペプチドが、インシュリン分解酵素の切断部位に隣接
するインシュリン由来の配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】前記ポリペプチドが、インシュリンＢ鎖の残基９、１０、１１
、１６、１７またはそれらの組み合せを含む請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】前記ポリペプチドが、インシュリン残基Ｂ１１〜１６またはＢ
１０〜１６を含む請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】前記ポリペプチドが、配列ＨＬＶＥＡＬＹまたはＬＶＥＡＬＹ
を有する請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項６】前記ポリペプチドが、インシュリン分解酵素またはインシュリ
ン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体によるインシュリンの分解産物
の配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】前記インシュリンが、天然インシュリンまたはＡｓｐＢ１０イ
ンシュリンを含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】前記インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合
体の活性が、前記切断部位に隣接する配列ＬＬＶＹまたはＬＳＴＲを含んでいる
基質の加水分解を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９】前記ポリペプチドが、前記切断部位に隣接する配列ＬＬＶＹま
たはＬＳＴＲを含んでいる基質の加水分解を大きく阻害する濃度で、インシュリ
ン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体のＬＬＥ活性を大きくは阻害し
ない請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】前記ペプチドが、それを必要とする患者への投与により、絶
対的または相対的インシュリン欠乏症、重度のインシュリン抵抗、脂質蓄積また
は過度の脂質合成、あるいはタンパク質異化作用または分解の疾患の症状の軽減
に効果がある請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１１】前記疾患が、糖尿病、重度のストレス、心筋梗塞または慢性
消耗病を含む請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】前記重度のストレスは、外傷、火傷または飢餓を含む請求項
１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】前記慢性消耗病は、エイズまたはガンを含む請求項１１に記
載のポリペプチド。
【請求項１４】前記症状は、筋肉質量の減少、体脂肪の増加、脂質合成の増
加またはそれらの組み合せを含む請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１５】患者の絶対的または相対的インシュリン欠乏症または重度の
インシュリン抵抗疾患を検出する方法であって、前記患者から生物試料を採取する工程と、前記生物試料において、インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼと
の複合体の活性のレベルを測定する工程と、前記測定レベルを前記患者の特定の特徴を有する被験物の公知または予想対
照レベルあるいは対照グループの公知または予想レベルと相関させる工程とを含
む方法。
【請求項１６】患者のタンパク質分解または異化作用の疾患を検出する方法
であって、前記患者から生物試料を採取する工程と、前記生物試料において、インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼと
の複合体の活性のレベルを測定する工程と、前記測定レベルを前記患者の特定の特徴を有する被験物の公知または予想対
照レベルあるいは対照グループの公知または予想レベルと相関させる工程とを含
む方法。
【請求項１７】患者の脂質蓄積または過度の脂質合成の疾患を検出する方法
であって、前記患者から生物試料を採取する工程と、前記生物試料において、インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼと
の複合体の活性のレベルを測定する工程と、前記測定レベルを前記患者の特定の特徴を有する被験物の公知または予想対
照レベルあるいは対照グループの公知または予想レベルと相関させる工程とを含
む方法。
【請求項１８】絶対的もしくは相対的インシュリン欠乏症または重度のイン
シュリン抵抗の治療の効果を評価する方法であって、前記患者から生物試料を採取する工程と、前記生物試料において、インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼと
の複合体の活性のレベルを測定する工程と、前記測定レベルを前記患者からの対応する生物試料におけるインシュリン分
解酵素またはインシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体の活性
の以前のレベルと相関させる工程とを含む方法。
【請求項１９】タンパク質分解または異化作用の疾患の治療の効果を評価す
る方法であって、前記患者から生物試料を採取する工程と、前記生物試料において、インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼと
の複合体の活性のレベルを測定する工程と、前記測定レベルを前記患者からの対応する生物試料におけるインシュリン分
解酵素またはインシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体の活性
の以前のレベルと相関させる工程とを含む方法。
【請求項２０】脂質蓄積または過度の脂質合成の疾患の治療の効果を評価す
る方法であって、前記患者から生物試料を採取する工程と、前記生物試料において、インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼと
の複合体の活性のレベルを測定する工程と、前記測定レベルを前記患者からの対応する生物試料におけるインシュリン分
解酵素またはインシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体の活性
の以前のレベルと相関させる工程とを含む方法。
【請求項２１】それを必要とする患者での絶対的または相対的インシュリン
欠乏症、重度のインシュリン抵抗、脂質蓄積または過度の脂質合成、あるいはタ
ンパク質異化作用または分解の疾患の症状の軽減方法であって、絶対的または相対的インシュリン欠乏症、重度のインシュリン抵抗、脂質蓄
積または過度の脂質合成、あるいはタンパク質異化作用または分解の疾患の症状
の軽減の必要性を決定する工程と、インシュリンのインシュリン分解酵素の切断部位に隣接する配列を含むポリ
ペプチドを効果的な量患者に投与する工程と、前記投与の効能をモニターする工程とを含む方法。
【請求項２２】前記疾患が、糖尿病、重度のストレス、心筋梗塞または慢性
消耗病を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】前記重度のストレスは、外傷、火傷または飢餓を含む請求項
２２に記載の方法。
【請求項２４】前記慢性消耗病は、エイズまたはガンを含む請求項２２に記
載の方法。
【請求項２５】前記症状は、筋肉質量の減少、体脂肪の増加、脂質合成の増
加またはそれらの組み合せを含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】前記インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複
合体の活性のレベルを測定する工程をさらに含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】タンパク質異化作用のレベルを測定する工程をさらに含む請
求項２１に記載の方法。
【請求項２８】分解したタンパク質のレベルを測定する工程をさらに含む請
求項２７に記載の方法。
【請求項２９】前記ポリペプチドが、インシュリンのインシュリン分解酵素
切断部位に隣接するインシュリン由来の配列を含み、前記ポリペプチドが、イン
シュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体の活性を阻害する請求項
２１に記載の方法。
【請求項３０】前記ポリペプチドが、インシュリンＢ鎖の残基９、１０、１
１、１６、１７またはそれらの組み合せを含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】前記ポリペプチドが、インシュリン残基Ｂ１１〜１６または
Ｂ１０〜１６を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】前記ポリペプチドが、配列ＨＬＶＥＡＬＹまたはＬＶＥＡＬ
Ｙを有する請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】前記ポリペプチドが、インシュリン分解酵素によるインシュ
リンの分解産物を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】前記インシュリンが、天然インシュリンまたはＡｓｐＢ１０
インシュリンを含む請求項２１に記載の方法。
【請求項３５】前記インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複
合体の活性が、前記切断部位に隣接する配列ＬＬＶＹまたはＬＳＴＲを含んでい
る基質の加水分解を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項３６】前記ポリペプチドが、前記切断部位に隣接する配列ＬＬＶＹ
またはＬＳＴＲを含んでいる基質の加水分解を大きく阻害する濃度で、インシュ
リン分解酵素と多触媒性プロテイナーゼとの複合体のＬＬＥ活性を大きくは阻害
しない請求項３５に記載の方法
【請求項３７】それを必要とする絶対的または相対的インシュリン欠乏症、
重度のインシュリン抵抗、脂質蓄積または過度の脂質合成、あるいはタンパク質
異化作用または分解の疾患の症状の軽減方法であって、それを必要とする絶対的または相対的インシュリン欠乏症、重度のインシュ
リン抵抗、脂質蓄積または過度の脂質合成、あるいはタンパク質異化作用または
分解の疾患の症状の軽減の必要性を決定する工程と、心房性ナトリウム利尿ペプチド、リラキシン、またはインシュリン様成長因
子ＩＩ由来の配列を含んでいるポリペプチドを、効果的な量患者に投与する工程
であって、前記ポリペプチドが、インシュリン分解酵素と多触媒性プロテイナー
ゼとの複合体の活性を阻害する工程と、前記投与の効能をモニターする工程とを含む方法。