JP2002308897A - 精子の運動不能性を引き起こす、インドのミミズの体腔液由来のタンパク質 - Google Patents
精子の運動不能性を引き起こす、インドのミミズの体腔液由来のタンパク質Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ミミズ由来の精子運動不能性タンパク質、これ
を用いた避妊薬を提供する。 【解決手段】本発明は、環形動物門に属するミミズ（Ｐ
ｈｅｒｅｔｉｍａ ｐｏｓｔｈｕｍａ）の体腔液から単
離された、新規な精子運動不能性タンパク質であり、避
妊薬として有用である。成熟した環形動物門に属するミ
ミズ（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ ｐｏｓｔｈｕｍａ）体腔液
（ＣＦ）中から活性因子の単離のための方法、精子運動
不能性試験の方法を提供する。本発明の精子運動不能性
タンパク質は、精子の運動不能性を引き起こす強力な効
果を有し、そして同時に、完全に非毒性である。
を用いた避妊薬を提供する。 【解決手段】本発明は、環形動物門に属するミミズ（Ｐ
ｈｅｒｅｔｉｍａ ｐｏｓｔｈｕｍａ）の体腔液から単
離された、新規な精子運動不能性タンパク質であり、避
妊薬として有用である。成熟した環形動物門に属するミ
ミズ（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ ｐｏｓｔｈｕｍａ）体腔液
（ＣＦ）中から活性因子の単離のための方法、精子運動
不能性試験の方法を提供する。本発明の精子運動不能性
タンパク質は、精子の運動不能性を引き起こす強力な効
果を有し、そして同時に、完全に非毒性である。
Description
【０００１】（発明の分野）本発明は、環形動物門に属
するミミズ（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ ｐｏｓｔｈｕｍａ）
から単離された、避妊薬として有用な新規な精子運動不
能タンパク質に関する。本発明はまた、環形動物門に属
するミミズ（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ ｐｏｓｔｈｕｍａ）
の、一般に入手可能な成熟した試料の体腔液（ＣＦ）中
の、避妊薬として有用な活性因子の単離のための方法を
提供する。
するミミズ（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ ｐｏｓｔｈｕｍａ）
から単離された、避妊薬として有用な新規な精子運動不
能タンパク質に関する。本発明はまた、環形動物門に属
するミミズ（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ ｐｏｓｔｈｕｍａ）
の、一般に入手可能な成熟した試料の体腔液（ＣＦ）中
の、避妊薬として有用な活性因子の単離のための方法を
提供する。
【０００２】（発明の背景）人口爆発のコントロール
は、インドおよび中国などのあらゆる後進国の発展に関
する、非常に重要な問題である。いくつかの避妊具およ
び避妊薬が市場にあり、これらは、疑いもなく受精能力
を調節するのに役立ち、従って人口コントロールに役立
つが、それらのほとんどは、完全な成功に関する問題、
またはステロイドを含有する経口避妊薬の場合のような
毒性の副作用に関する問題のいずれかを引き起こす。従
って、完全な成功を確実にするのみならず、有害な副作
用を生じない、非常に成功する器具または生成物が現実
に必要とされている。
は、インドおよび中国などのあらゆる後進国の発展に関
する、非常に重要な問題である。いくつかの避妊具およ
び避妊薬が市場にあり、これらは、疑いもなく受精能力
を調節するのに役立ち、従って人口コントロールに役立
つが、それらのほとんどは、完全な成功に関する問題、
またはステロイドを含有する経口避妊薬の場合のような
毒性の副作用に関する問題のいずれかを引き起こす。従
って、完全な成功を確実にするのみならず、有害な副作
用を生じない、非常に成功する器具または生成物が現実
に必要とされている。
【０００３】従って、様々な国による試みがこのような
生成物を利用するために向けられ、そして今日までのと
ころ、完全な成功は達成されていない。日本において興
味深い話がある。東京大学の前名誉教授と研究員のグル
ープは、Ｅｉｓｅｎｉａ ｆｏｅｔｉｄａの体腔液由来
の避妊薬の有効性についての調査プログラムを開始し
た。日本のミミズの体腔液由来の因子に加えて、Ｅｉｓ
ｅｎｉａ ｆｏｅｔｉｄａは、人間を含む多数の脊椎動
物の精子の運動を直ちに止めた。このグループは非常に
興奮し、タンパク質であるこの因子の精製を続け、そし
てそれは４１ｋＤａの単量体タンパク質であることを見
出した。後に、彼らがこのタンパク質の遺伝子をまさに
クローニングしたとき、彼らはこのタンパク質の高い毒
性を突然発見した（Ｓｅｋｉｚａｗａら、１９９６，Ｂ
ｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．，１７（３）、１９７−２０３；
Ｓｅｋｉｚａｗａら、１９９７，Ｇｅｎｅ，１９１，９
７−１０２；Ｙａｍａｊｉら、１９９８，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３（９），５３００−５３０６；
Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、２０００，Ｊ．Ｅｘｐｌ．Ｚｏ
ｏｌ．，２８６，５３８−５４９）。このタンパク質の
血液への注射により、ラットおよびマウスが直ちに死亡
した。このタンパク質のＲＢＣ調製物への添加は、細胞
を即座に溶解した。この出来事は、彼らの目的を台無し
にしたが、彼らはこのタンパク質の別の重要な局面（す
なわち、そのスフィンゴミエリン（大多数の脊椎動物の
細胞膜においていつも存在する脂質）に結合する特異
性）を観察し得た。細胞が溶解するのはこの結合によ
る。しかし、彼らは、非常に特異的なスフィンゴミエリ
ン結合タンパク質を発見し、そしてこのようなタンパク
質はまだ入手可能ではないので、このタンパク質は例外
的に重要なタンパク質である。それはｌｙｓｅｎｉｎと
名前が付けられ、そのスフィンゴミエリンに結合する性
質のため、高価で市販される。彼らはまた、ｌｙｓｅｎ
ｉｎについての多数の論文を発行した。
生成物を利用するために向けられ、そして今日までのと
ころ、完全な成功は達成されていない。日本において興
味深い話がある。東京大学の前名誉教授と研究員のグル
ープは、Ｅｉｓｅｎｉａ ｆｏｅｔｉｄａの体腔液由来
の避妊薬の有効性についての調査プログラムを開始し
た。日本のミミズの体腔液由来の因子に加えて、Ｅｉｓ
ｅｎｉａ ｆｏｅｔｉｄａは、人間を含む多数の脊椎動
物の精子の運動を直ちに止めた。このグループは非常に
興奮し、タンパク質であるこの因子の精製を続け、そし
てそれは４１ｋＤａの単量体タンパク質であることを見
出した。後に、彼らがこのタンパク質の遺伝子をまさに
クローニングしたとき、彼らはこのタンパク質の高い毒
性を突然発見した（Ｓｅｋｉｚａｗａら、１９９６，Ｂ
ｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．，１７（３）、１９７−２０３；
Ｓｅｋｉｚａｗａら、１９９７，Ｇｅｎｅ，１９１，９
７−１０２；Ｙａｍａｊｉら、１９９８，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３（９），５３００−５３０６；
Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、２０００，Ｊ．Ｅｘｐｌ．Ｚｏ
ｏｌ．，２８６，５３８−５４９）。このタンパク質の
血液への注射により、ラットおよびマウスが直ちに死亡
した。このタンパク質のＲＢＣ調製物への添加は、細胞
を即座に溶解した。この出来事は、彼らの目的を台無し
にしたが、彼らはこのタンパク質の別の重要な局面（す
なわち、そのスフィンゴミエリン（大多数の脊椎動物の
細胞膜においていつも存在する脂質）に結合する特異
性）を観察し得た。細胞が溶解するのはこの結合によ
る。しかし、彼らは、非常に特異的なスフィンゴミエリ
ン結合タンパク質を発見し、そしてこのようなタンパク
質はまだ入手可能ではないので、このタンパク質は例外
的に重要なタンパク質である。それはｌｙｓｅｎｉｎと
名前が付けられ、そのスフィンゴミエリンに結合する性
質のため、高価で市販される。彼らはまた、ｌｙｓｅｎ
ｉｎについての多数の論文を発行した。
【０００４】明らかに、彼らの主な目的（すなわち、そ
の避妊薬としての使用）は失敗であったが、商業的価値
はそれ以上である。
の避妊薬としての使用）は失敗であったが、商業的価値
はそれ以上である。
【０００５】（発明の目的）本発明の主な目的は、精子
の即時の運動不能を引き起こし、そして避妊薬として使
用され得る、ミミズの体腔液（ＣＦ）由来の因子を同定
することである。
の即時の運動不能を引き起こし、そして避妊薬として使
用され得る、ミミズの体腔液（ＣＦ）由来の因子を同定
することである。
【０００６】本発明の別の目的は、重篤な副作用を示
す、今日市販されている他の避妊薬と比較した場合、完
全に非毒性の化合物としてその因子を提案することであ
る。
す、今日市販されている他の避妊薬と比較した場合、完
全に非毒性の化合物としてその因子を提案することであ
る。
【０００７】（発明の要旨）本発明は、以下を提供す
る： １．以下の特徴： ａ．アニオン性タンパク質、 ｂ．２０ｋＤａの分子量、 ｃ．非毒性であり、そしていかなる溶血活性もなく、そ
して ｄ．２分以内に１００％精子運動不能性を引き起こす、
を有する、ミミズ（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ ｐｏｓｔｈｕ
ｍａ）から単離された新規な精子運動不能性タンパク
質。
る： １．以下の特徴： ａ．アニオン性タンパク質、 ｂ．２０ｋＤａの分子量、 ｃ．非毒性であり、そしていかなる溶血活性もなく、そ
して ｄ．２分以内に１００％精子運動不能性を引き起こす、
を有する、ミミズ（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ ｐｏｓｔｈｕ
ｍａ）から単離された新規な精子運動不能性タンパク
質。
【０００８】２．１０〜１５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用
量がラットおよびマウスに１ヶ月間投与される場合、い
かなる有害な効果も有さない、請求項１に記載のタンパ
ク質。
量がラットおよびマウスに１ヶ月間投与される場合、い
かなる有害な効果も有さない、請求項１に記載のタンパ
ク質。
【０００９】３．ヒトを含む哺乳動物の身体に内服用お
よび外用のために使用され得る、請求項１に記載のタン
パク質。
よび外用のために使用され得る、請求項１に記載のタン
パク質。
【００１０】４．環形動物門に属するミミズ（Ｐｈｅｒ
ｅｔｉｍａ ｐｏｓｔｈｕｍａ）から得られた体腔液抽
出物を含む、避妊薬としても有用な、新規な精子運動不
能性薬剤。
ｅｔｉｍａ ｐｏｓｔｈｕｍａ）から得られた体腔液抽
出物を含む、避妊薬としても有用な、新規な精子運動不
能性薬剤。
【００１１】５．従来の薬学的に受容可能な添加物をさ
らに含む、請求項４に記載の新規な精子運動不能性薬
剤。
らに含む、請求項４に記載の新規な精子運動不能性薬
剤。
【００１２】６．ゲル、粉末、カプセル、溶液、錠剤、
クリームの形態の、請求項５に記載の新規な精子運動不
能性薬剤。
クリームの形態の、請求項５に記載の新規な精子運動不
能性薬剤。
【００１３】７．非毒性であり、そして哺乳動物に注射
された場合にいかなる溶血効果も示さない、請求項４に
記載の新規な精子運動不能性薬剤。
された場合にいかなる溶血効果も示さない、請求項４に
記載の新規な精子運動不能性薬剤。
【００１４】８．２分以内に１００％精子運動不能性を
示す、請求項４および５に記載の新規な精子運動不能性
薬剤。
示す、請求項４および５に記載の新規な精子運動不能性
薬剤。
【００１５】９．非ステロイドであり、そして外用的に
使用され得る、請求項４に記載の新規な精子運動不能性
薬剤。
使用され得る、請求項４に記載の新規な精子運動不能性
薬剤。
【００１６】１０．一般的に利用可能な成熟した試料で
あるミミズ（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａｐｏｓｔｈｕｍａ）の
ＣＦ（体腔液）中の活性因子の単離のための方法であっ
て、該方法は以下の工程： ａ．一般的に利用可能な成熟した試料である該ミミズ
（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａｐｏｓｔｈｕｍａ）由来の体腔液
（ＣＦ）を提供し、そして該ＣＦを、超音波処理、続い
て遠心分離に供する工程、 ｂ．ＣＦの粗抽出物として上清を得る工程、 ｃ．ＣＦの該粗抽出物を、ゲル濾過クロマトグラフィー
に供する工程、 ｄ．２８０ｎｍでタンパク質フラクションをモニターす
る工程、 ｅ．３つのタンパク質ピークを得、そして各ピークの活
性をアッセイする工程、 ｆ．活性ピークＩＩＩを収集し、凍結乾燥し、透析し、
そしてそれをさらなる精製のためにＤＥＡＥカラムでＨ
ＰＬＣに供する工程 ｇ．非結合タンパク質および結合タンパク質を溶出する
工程、 ｈ．２８０ｎｍで各タンパク質ピークの吸光度を調べる
工程、 ｉ．各ピークをプールし、凍結乾燥し、そして透析し、
そしてこれらの精子運動性に対する活性をチェックする
工程、および ｊ．精子運動不能性効果を示す１番目の結合ピークを同
定し、そしてそれをその純度および分子量を決定するた
めにＳＤＳ−ＰＡＧＥに供する工程、を包含する、方
法。
あるミミズ（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａｐｏｓｔｈｕｍａ）の
ＣＦ（体腔液）中の活性因子の単離のための方法であっ
て、該方法は以下の工程： ａ．一般的に利用可能な成熟した試料である該ミミズ
（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａｐｏｓｔｈｕｍａ）由来の体腔液
（ＣＦ）を提供し、そして該ＣＦを、超音波処理、続い
て遠心分離に供する工程、 ｂ．ＣＦの粗抽出物として上清を得る工程、 ｃ．ＣＦの該粗抽出物を、ゲル濾過クロマトグラフィー
に供する工程、 ｄ．２８０ｎｍでタンパク質フラクションをモニターす
る工程、 ｅ．３つのタンパク質ピークを得、そして各ピークの活
性をアッセイする工程、 ｆ．活性ピークＩＩＩを収集し、凍結乾燥し、透析し、
そしてそれをさらなる精製のためにＤＥＡＥカラムでＨ
ＰＬＣに供する工程 ｇ．非結合タンパク質および結合タンパク質を溶出する
工程、 ｈ．２８０ｎｍで各タンパク質ピークの吸光度を調べる
工程、 ｉ．各ピークをプールし、凍結乾燥し、そして透析し、
そしてこれらの精子運動性に対する活性をチェックする
工程、および ｊ．精子運動不能性効果を示す１番目の結合ピークを同
定し、そしてそれをその純度および分子量を決定するた
めにＳＤＳ−ＰＡＧＥに供する工程、を包含する、方
法。
【００１７】１１．前記ＣＦが、１０〜１５ｍｇ／ｋｇ
体重の範囲の用量でそれをラットおよびマウスに注射す
ることによる、運動不能性試験に供され、そして該注射
の１ヶ月後でさえも死亡率を示さない、請求項１０に記
載の方法。
体重の範囲の用量でそれをラットおよびマウスに注射す
ることによる、運動不能性試験に供され、そして該注射
の１ヶ月後でさえも死亡率を示さない、請求項１０に記
載の方法。
【００１８】１２．１０μｌの用量の前記粗抽出物を、
２５０μｌのＲＢＣ調製物に加えることによる、ラット
ＲＢＣを用いる溶血試験を行い、３０分間のインキュベ
ーションの後でさえ、いかなる溶血活性も有さないタン
パク質を表すインタクトなＲＢＣを示す、請求項１０に
記載の方法。
２５０μｌのＲＢＣ調製物に加えることによる、ラット
ＲＢＣを用いる溶血試験を行い、３０分間のインキュベ
ーションの後でさえ、いかなる溶血活性も有さないタン
パク質を表すインタクトなＲＢＣを示す、請求項１０に
記載の方法。
【００１９】１３．バイオアッセイに使用するための、
オスのラットおよびマウス由来の精子懸濁液を調製する
方法であって、該方法は以下の工程： ａ．繁殖性のオスのラットおよびマウスから精液を集
め、そしてＢＷＷ培地で希釈し、ＣＯ2インキュベータ
ー中で、空気中で５％のＣＯ2の存在下、３７℃で、オ
イルカバー下で平衡化する工程、 ｂ．該精子懸濁液を再びインキュベートし、精子が活発
に泳ぐのを可能にする工程、 ｃ．少なくとも７０％の前進運動性を有する、高運動性
の精子懸濁液を収集する工程、および ｄ．該精子懸濁液を約５〜１０分間遠心分離し、ペレッ
ト化した精子を希釈して、４０〜５０μｌの必要な濃度
（２．０×１０5〜２．５×１０5の精子）に到達させる
工程、を包含する、方法。
オスのラットおよびマウス由来の精子懸濁液を調製する
方法であって、該方法は以下の工程： ａ．繁殖性のオスのラットおよびマウスから精液を集
め、そしてＢＷＷ培地で希釈し、ＣＯ2インキュベータ
ー中で、空気中で５％のＣＯ2の存在下、３７℃で、オ
イルカバー下で平衡化する工程、 ｂ．該精子懸濁液を再びインキュベートし、精子が活発
に泳ぐのを可能にする工程、 ｃ．少なくとも７０％の前進運動性を有する、高運動性
の精子懸濁液を収集する工程、および ｄ．該精子懸濁液を約５〜１０分間遠心分離し、ペレッ
ト化した精子を希釈して、４０〜５０μｌの必要な濃度
（２．０×１０5〜２．５×１０5の精子）に到達させる
工程、を包含する、方法。
【００２０】１４．環形動物門に属するミミズ（Ｐｈｅ
ｒｅｔｉｍａ ｐｏｓｔｈｕｍａ）から得られた、哺乳
動物において外的または内的に使用され得る、避妊用化
合物。
ｒｅｔｉｍａ ｐｏｓｔｈｕｍａ）から得られた、哺乳
動物において外的または内的に使用され得る、避妊用化
合物。
【００２１】本出願人らは、インドのミミズ（Ｐｈｅｒ
ｅｔｉｍａ ｐｏｓｔｈｕｍａ）を用いる研究を開始
し、体腔液を抽出し、精子の運動性についてそれらを試
験し、そしてそれもまた、ｌｙｓｅｎｉｎと同じくらい
効果的に精子の運動を直ちに止めることを見出した。し
かし、明白な違いが存在する。インドのミミズ由来の抽
出物は、ラット、マウスまたはウサギのいかなる死亡率
も生じなかった。この毒性についての徹底的な試験は、
肝臓機能または他の組織の機能への有害な効果を示さな
かった。さらに、ＲＢＣ調製物へのその添加は、ｌｙｓ
ｅｎｉｎに関して観察されたような、細胞のいかなる溶
解も生じなかった。従って、この抽出物は、有害な副作
用なしで精子の即時の運動不能性を引き起こすための特
性を有する。これは、真の長所であり、そして受精率の
コントロールのために有利に使用され得る。この因子は
また、タンパク質である。本出願人らはまた、分子排除
クロマトグラフィー（ＳＧ−１００）、続いてＨＰＬＣ
アニオンクロマトグラフィーを通してそれを精製した。
従って、これはインドのミミズ供給源由来の新規な生成
物であり保護を必要とする。
ｅｔｉｍａ ｐｏｓｔｈｕｍａ）を用いる研究を開始
し、体腔液を抽出し、精子の運動性についてそれらを試
験し、そしてそれもまた、ｌｙｓｅｎｉｎと同じくらい
効果的に精子の運動を直ちに止めることを見出した。し
かし、明白な違いが存在する。インドのミミズ由来の抽
出物は、ラット、マウスまたはウサギのいかなる死亡率
も生じなかった。この毒性についての徹底的な試験は、
肝臓機能または他の組織の機能への有害な効果を示さな
かった。さらに、ＲＢＣ調製物へのその添加は、ｌｙｓ
ｅｎｉｎに関して観察されたような、細胞のいかなる溶
解も生じなかった。従って、この抽出物は、有害な副作
用なしで精子の即時の運動不能性を引き起こすための特
性を有する。これは、真の長所であり、そして受精率の
コントロールのために有利に使用され得る。この因子は
また、タンパク質である。本出願人らはまた、分子排除
クロマトグラフィー（ＳＧ−１００）、続いてＨＰＬＣ
アニオンクロマトグラフィーを通してそれを精製した。
従って、これはインドのミミズ供給源由来の新規な生成
物であり保護を必要とする。
【００２２】（表の簡単な説明） 表１：各タンパク質ピークの運動不能性をチェックする
ための、精子懸濁液へのそれらの添加のデータ。１５μ
ｇの各タンパク質ピークを精子懸濁液に加え、そして運
動不能性を引き起こすそれらの効果を、３０秒、２分、
５分および１０分でモニターした。ＰＩＩＩのみが１０
０％運動不能性を引き起こし、一方ＰＩおよびＰＩＩは
効果を有さなかった。
ための、精子懸濁液へのそれらの添加のデータ。１５μ
ｇの各タンパク質ピークを精子懸濁液に加え、そして運
動不能性を引き起こすそれらの効果を、３０秒、２分、
５分および１０分でモニターした。ＰＩＩＩのみが１０
０％運動不能性を引き起こし、一方ＰＩおよびＰＩＩは
効果を有さなかった。
【００２３】表２：各タンパク質ピークの運動不能性を
チェックするための、精子懸濁液へのそれらの添加のデ
ータ。５μｇの各タンパク質ピークを精子懸濁液に加
え、そして運動不能性を引き起こすそれらの効果を、３
０秒、２分、５分および１０分でモニターした。精子の
１００％運動不能性が、１番目の結合ピークのタンパク
質により引き起こされ、これはこのフラクション中の活
性因子の存在を示す。
チェックするための、精子懸濁液へのそれらの添加のデ
ータ。５μｇの各タンパク質ピークを精子懸濁液に加
え、そして運動不能性を引き起こすそれらの効果を、３
０秒、２分、５分および１０分でモニターした。精子の
１００％運動不能性が、１番目の結合ピークのタンパク
質により引き起こされ、これはこのフラクション中の活
性因子の存在を示す。
【００２４】（発明の詳細な説明）従って、本発明は、
以下の特徴： （ａ）アニオン性タンパク質、（ｂ）２０ｋＤａの分子
量、（ｃ）非毒性であり、そしていかなる溶血活性もな
く、そして（ｄ）２分以内に１００％精子運動不能性を
引き起こすを有する、ミミズ（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ ｐ
ｏｓｔｈｕｍａ）より単離された、新規な精子運動不能
性タンパク質を提供する。
以下の特徴： （ａ）アニオン性タンパク質、（ｂ）２０ｋＤａの分子
量、（ｃ）非毒性であり、そしていかなる溶血活性もな
く、そして（ｄ）２分以内に１００％精子運動不能性を
引き起こすを有する、ミミズ（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ ｐ
ｏｓｔｈｕｍａ）より単離された、新規な精子運動不能
性タンパク質を提供する。
【００２５】本発明の実施形態においては、１０〜１５
ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量のこのタンパク質がラット
およびマウスに１ヶ月間投与される場合、このタンパク
質はいかなる有害な効果も有さない。
ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量のこのタンパク質がラット
およびマウスに１ヶ月間投与される場合、このタンパク
質はいかなる有害な効果も有さない。
【００２６】別の本発明の実施形態においては、このタ
ンパク質は、ヒトを含む哺乳動物の身体に内服用および
外用のために使用され得る。
ンパク質は、ヒトを含む哺乳動物の身体に内服用および
外用のために使用され得る。
【００２７】さらに別の本発明の実施形態においては、
避妊薬としてもまた有用なこの精子運動不能性薬剤は、
環形動物門に属するミミズ（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ ｐｏ
ｓｔｈｕｍａ）から得られた体腔液抽出物を含む。
避妊薬としてもまた有用なこの精子運動不能性薬剤は、
環形動物門に属するミミズ（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ ｐｏ
ｓｔｈｕｍａ）から得られた体腔液抽出物を含む。
【００２８】さらに別の実施形態においては、この新規
な精子運動不能性薬剤は、従来の薬学的に受容可能な添
加物をさらに含む。
な精子運動不能性薬剤は、従来の薬学的に受容可能な添
加物をさらに含む。
【００２９】なお別の本発明の実施形態においては、こ
の新規な精子運動不能性薬剤は、溶液、ゲル、粉末、カ
プセル、錠剤およびクリームの形態である。
の新規な精子運動不能性薬剤は、溶液、ゲル、粉末、カ
プセル、錠剤およびクリームの形態である。
【００３０】なお別の本発明の実施形態においては、こ
の新規な精子運動不能性薬剤は、哺乳動物に注射される
場合、非毒性であり、そしていかなる溶血活性も示さな
い。
の新規な精子運動不能性薬剤は、哺乳動物に注射される
場合、非毒性であり、そしていかなる溶血活性も示さな
い。
【００３１】なお別の本発明の実施形態においては、こ
の新規な精子運動不能性薬剤は、２分以内に１００％精
子運動不能性を示す。
の新規な精子運動不能性薬剤は、２分以内に１００％精
子運動不能性を示す。
【００３２】なお別の本発明の実施形態においては、こ
の新規な精子運動不能性薬剤は、非ステロイドであり、
そして外的に使用され得る。
の新規な精子運動不能性薬剤は、非ステロイドであり、
そして外的に使用され得る。
【００３３】もう１つの本発明の実施形態は、一般的に
利用可能な成熟試料であるミミズ（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ
ｐｏｓｔｈｕｍａ）のＣＦ（体腔液）中の活性因子の
単離のための方法に関し、この方法は、以下の工程： ａ．一般的に利用可能な成熟試料であるミミズ（Ｐｈｅ
ｒｅｔｉｍａ ｐｏｓｔｈｕｍａ）由来の体腔液（Ｃ
Ｆ）を提供し、そしてこのＣＦを、超音波処理、続いて
遠心分離に供する工程、 ｂ．ＣＦの粗抽出物として上清を得る工程、 ｃ．このＣＦの粗抽出物を、ゲル濾過クロマトグラフィ
ーに供する工程、 ｄ．２８０ｎｍでタンパク質フラクションをモニターす
る工程、 ｅ．３つのタンパク質ピークを得、そして各ピークの活
性をアッセイする工程、 ｆ．活性ピークＩＩＩを収集し、凍結乾燥し、透析し、
そしてそれをさらなる精製のためにＤＥＡＥカラムでＨ
ＰＬＣに供する工程、 ｇ．非結合タンパク質および結合タンパク質を溶出する
工程、 ｈ．２８０ｎｍで各タンパク質ピークの吸光度を調べる
工程、 ｉ．各ピークをプールし、凍結乾燥し、そして透析し、
そしてこれらの精子運動性に対する活性をチェックする
工程、および ｊ．精子運動不能性効果を示す１番目の結合ピークを同
定し、そしてそれをその純度および分子量を決定するた
めにＳＤＳ−ＰＡＧＥに供する工程、を包含する。
利用可能な成熟試料であるミミズ（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ
ｐｏｓｔｈｕｍａ）のＣＦ（体腔液）中の活性因子の
単離のための方法に関し、この方法は、以下の工程： ａ．一般的に利用可能な成熟試料であるミミズ（Ｐｈｅ
ｒｅｔｉｍａ ｐｏｓｔｈｕｍａ）由来の体腔液（Ｃ
Ｆ）を提供し、そしてこのＣＦを、超音波処理、続いて
遠心分離に供する工程、 ｂ．ＣＦの粗抽出物として上清を得る工程、 ｃ．このＣＦの粗抽出物を、ゲル濾過クロマトグラフィ
ーに供する工程、 ｄ．２８０ｎｍでタンパク質フラクションをモニターす
る工程、 ｅ．３つのタンパク質ピークを得、そして各ピークの活
性をアッセイする工程、 ｆ．活性ピークＩＩＩを収集し、凍結乾燥し、透析し、
そしてそれをさらなる精製のためにＤＥＡＥカラムでＨ
ＰＬＣに供する工程、 ｇ．非結合タンパク質および結合タンパク質を溶出する
工程、 ｈ．２８０ｎｍで各タンパク質ピークの吸光度を調べる
工程、 ｉ．各ピークをプールし、凍結乾燥し、そして透析し、
そしてこれらの精子運動性に対する活性をチェックする
工程、および ｊ．精子運動不能性効果を示す１番目の結合ピークを同
定し、そしてそれをその純度および分子量を決定するた
めにＳＤＳ−ＰＡＧＥに供する工程、を包含する。
【００３４】別の本発明の実施形態においては、このＣ
Ｆを、１０〜１５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量でそれを
ラットおよびマウスに注射することによる、運動不能性
試験に供し、これはこのような注射の１ヶ月後でさえも
死亡率を示さない。
Ｆを、１０〜１５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量でそれを
ラットおよびマウスに注射することによる、運動不能性
試験に供し、これはこのような注射の１ヶ月後でさえも
死亡率を示さない。
【００３５】さらに別の本発明の実施形態においては、
１０μｌの用量の粗抽出物を２５０μｌのＲＢＣ調製物
に加えることによる、ラットＲＢＣを用いる溶血試験を
行う方法に関し、これは、３０分間のインキュベーショ
ンの後でさえインタクトなＲＢＣが、いかなる溶血活性
も有さないタンパク質を表すことを示す。
１０μｌの用量の粗抽出物を２５０μｌのＲＢＣ調製物
に加えることによる、ラットＲＢＣを用いる溶血試験を
行う方法に関し、これは、３０分間のインキュベーショ
ンの後でさえインタクトなＲＢＣが、いかなる溶血活性
も有さないタンパク質を表すことを示す。
【００３６】なお別の実施形態においては、オスのラッ
トおよびマウス由来の精子懸濁液を調製し、バイオアッ
セイに使用する方法を提供し、この方法は以下の工程： ａ．繁殖性のオスのラットおよびマウスから精液を集
め、そしてＢＷＷ培地で希釈し、ＣＯ2インキュベータ
ー中で、空気中で５％のＣＯ2の存在下、３７℃で、オ
イルカバー（ｃａｖｅｒａｇｅ）下で平衡化する工程、 ｂ．精子懸濁液を再びインキュベートし、精子が活発に
泳ぐのを可能にする工程、 ｃ．少なくとも７０％の前進運動性を有する、高運動性
の精子懸濁液を収集する工程、および ｄ．この精子懸濁液を約５〜１０分間遠心分離し、ペレ
ット化した精子を希釈して、４０〜５０μｌの必要な濃
度（２．０×１０5〜２．５×１０5の精子）に到達させ
る工程、を包含する。
トおよびマウス由来の精子懸濁液を調製し、バイオアッ
セイに使用する方法を提供し、この方法は以下の工程： ａ．繁殖性のオスのラットおよびマウスから精液を集
め、そしてＢＷＷ培地で希釈し、ＣＯ2インキュベータ
ー中で、空気中で５％のＣＯ2の存在下、３７℃で、オ
イルカバー（ｃａｖｅｒａｇｅ）下で平衡化する工程、 ｂ．精子懸濁液を再びインキュベートし、精子が活発に
泳ぐのを可能にする工程、 ｃ．少なくとも７０％の前進運動性を有する、高運動性
の精子懸濁液を収集する工程、および ｄ．この精子懸濁液を約５〜１０分間遠心分離し、ペレ
ット化した精子を希釈して、４０〜５０μｌの必要な濃
度（２．０×１０5〜２．５×１０5の精子）に到達させ
る工程、を包含する。
【００３７】なお別の実施形態においては、環形動物門
に属するミミズ（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ ｐｏｓｔｈｕｍ
ａ）から得られたこの避妊用化合物は、哺乳動物におい
て外的または内的に使用され得る。
に属するミミズ（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ ｐｏｓｔｈｕｍ
ａ）から得られたこの避妊用化合物は、哺乳動物におい
て外的または内的に使用され得る。
【００３８】（Ｉ 有効成分のバイオアッセイ） （（ａ）精子の収集および精子懸濁液の調製）このアッ
セイのための精子を、繁殖性のオスのラットおよびマウ
スの精巣上体尾部（ｃａｕｄａ）から収集し、そしてＢ
ＷＷ培地（ＮａＣｌ ９４ｍＭ、ＫＣｌ ４．７ｍＭ、
ＣａＣｌ2 １．７ｍＭ、ＫＨ2ＰＯ4 １．２ｍＭ、Ｍ
ｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．２ｍＭ、ＮａＨＣＯ3 ２５ｍ
Ｍ、ピルビン酸Ｎａ ０．５ｍＭ、乳酸Ｎａ １９ｍ
Ｍ、グルコース ５ｍＭ、０．４％ＢＳＡ、０．１％抗
生物質溶液、ｐＨ７．２）で希釈し、そしてこれをＣＯ
2インキュベーター中で、空気中で５％のＣＯ2の存在
下、３７℃でオイルカバー下で平衡化した。この精子懸
濁液を再びインキュベートし、精子が活発に泳ぐのを可
能にした。１時間後、活発に泳ぐ精子を精子懸濁液の上
部から集めた。活発に泳ぐ精子の濃度をＭａｃｌａｒ’
ｓチャンバーで決定した。これらの精子の性質および運
動性もまたチェックした。少なくとも７０％の前進運動
性を有する、高運動性の精子懸濁液を実験のために考慮
に入れた。これらの活発に泳ぐ精子を精子懸濁液の上部
から集め；１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして
ペレット化した精子を希釈して必要な濃度に到達させ
た。５０μｌ（２．５×１０5の精子）の精子懸濁液
を、３５ｍｍ使い捨てペトリ皿に置き、そしてＣＯ2イ
ンキュベーター中で、５％ＣＯ2の空気中、終夜で、予
め平衡化した鉱油（Ｓｉｇｍａ）でカバーした。
セイのための精子を、繁殖性のオスのラットおよびマウ
スの精巣上体尾部（ｃａｕｄａ）から収集し、そしてＢ
ＷＷ培地（ＮａＣｌ ９４ｍＭ、ＫＣｌ ４．７ｍＭ、
ＣａＣｌ2 １．７ｍＭ、ＫＨ2ＰＯ4 １．２ｍＭ、Ｍ
ｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．２ｍＭ、ＮａＨＣＯ3 ２５ｍ
Ｍ、ピルビン酸Ｎａ ０．５ｍＭ、乳酸Ｎａ １９ｍ
Ｍ、グルコース ５ｍＭ、０．４％ＢＳＡ、０．１％抗
生物質溶液、ｐＨ７．２）で希釈し、そしてこれをＣＯ
2インキュベーター中で、空気中で５％のＣＯ2の存在
下、３７℃でオイルカバー下で平衡化した。この精子懸
濁液を再びインキュベートし、精子が活発に泳ぐのを可
能にした。１時間後、活発に泳ぐ精子を精子懸濁液の上
部から集めた。活発に泳ぐ精子の濃度をＭａｃｌａｒ’
ｓチャンバーで決定した。これらの精子の性質および運
動性もまたチェックした。少なくとも７０％の前進運動
性を有する、高運動性の精子懸濁液を実験のために考慮
に入れた。これらの活発に泳ぐ精子を精子懸濁液の上部
から集め；１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして
ペレット化した精子を希釈して必要な濃度に到達させ
た。５０μｌ（２．５×１０5の精子）の精子懸濁液
を、３５ｍｍ使い捨てペトリ皿に置き、そしてＣＯ2イ
ンキュベーター中で、５％ＣＯ2の空気中、終夜で、予
め平衡化した鉱油（Ｓｉｇｍａ）でカバーした。
【００３９】（（ｂ）種々のタンパク質フラクションの
精子運動性に対する効果）精子運動不能性についての試
験をするすべてのフラクションを、リン酸塩緩衝化生理
食塩水（ＰＢＳ）で希釈した。５０μｌの試験材料を精
子懸濁液小滴に加え；コントロール研究のために、同体
積のＰＢＳを試験溶液の代わりに加えた。精子運動性の
性質を、顕微鏡で、試験材料の添加後３０秒、２分、５
分および１０分の間隔で観察した。この段階の間、培養
皿をＣＯ2インキュベーター中に維持した。最後の観察
後、全ての試験小滴のｐＨを、試験懸濁液のｐＨの任意
の偏差を確認するために記録した。
精子運動性に対する効果）精子運動不能性についての試
験をするすべてのフラクションを、リン酸塩緩衝化生理
食塩水（ＰＢＳ）で希釈した。５０μｌの試験材料を精
子懸濁液小滴に加え；コントロール研究のために、同体
積のＰＢＳを試験溶液の代わりに加えた。精子運動性の
性質を、顕微鏡で、試験材料の添加後３０秒、２分、５
分および１０分の間隔で観察した。この段階の間、培養
皿をＣＯ2インキュベーター中に維持した。最後の観察
後、全ての試験小滴のｐＨを、試験懸濁液のｐＨの任意
の偏差を確認するために記録した。
【００４０】（ＩＩ．有効成分の抽出および精製）ミミ
ズの成熟した試料を滅菌針で刺した。約１００のこのよ
うなミミズをビーカーに取り、４５分間、超音波処理に
供した。１５ｍｌの体腔液（ＣＦ）をこの方法により得
た。これを１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し
た。上清を−２０℃で貯蔵し、ＣＦの粗抽出物として、
そしてまた有効成分のさらなる精製のために用いた。
ズの成熟した試料を滅菌針で刺した。約１００のこのよ
うなミミズをビーカーに取り、４５分間、超音波処理に
供した。１５ｍｌの体腔液（ＣＦ）をこの方法により得
た。これを１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し
た。上清を−２０℃で貯蔵し、ＣＦの粗抽出物として、
そしてまた有効成分のさらなる精製のために用いた。
【００４１】（ａ）分子排除クロマトグラフィー：ＣＦ
を、０．０５Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で予め平衡化し
たＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ １００カラム（１．５×８０
ｃｍ）によるゲル濾過クロマトグラフィーに供した。
０．５ｍｌのＣＦをカラムに載せた。このカラムを、同
じ緩衝液で２０ｍｌ／ｈの流速で溶出し、そして２．０
ｍｌのフラクションを収集した。これらのフラクション
の吸光度を２８０ｎｍでモニターした。３つのタンパク
質ピークを得（図１）、そして各ピークについて活性を
アッセイした（表１）。活性ピーク（ＰＩＩＩ）のフラ
クションをプールし、凍結乾燥し、透析し（０．００５
Ｍリン酸塩緩衝液に対して４℃で２４時間、緩衝液を２
回交換）、そしてＨＰＬＣ ＤＥＡＥカラムによるイオ
ン交換クロマトグラフィーに供した。
を、０．０５Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で予め平衡化し
たＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ １００カラム（１．５×８０
ｃｍ）によるゲル濾過クロマトグラフィーに供した。
０．５ｍｌのＣＦをカラムに載せた。このカラムを、同
じ緩衝液で２０ｍｌ／ｈの流速で溶出し、そして２．０
ｍｌのフラクションを収集した。これらのフラクション
の吸光度を２８０ｎｍでモニターした。３つのタンパク
質ピークを得（図１）、そして各ピークについて活性を
アッセイした（表１）。活性ピーク（ＰＩＩＩ）のフラ
クションをプールし、凍結乾燥し、透析し（０．００５
Ｍリン酸塩緩衝液に対して４℃で２４時間、緩衝液を２
回交換）、そしてＨＰＬＣ ＤＥＡＥカラムによるイオ
ン交換クロマトグラフィーに供した。
【００４２】（ｂ）イオン交換クロマトグラフィー：分
子交換クロマトグラフィー工程の活性フラクション（Ｐ
ＩＩＩ）を、緩衝液Ａ（０．００５Ｍリン酸塩緩衝液
（ｐＨ７．０））で平衡化したＨＰＬＣ ＤＥＡＥカラ
ム（７．５×７５０ｍｍ）により、さらに精製した。非
結合タンパク質を、同じ緩衝液で、０．８ｍｌ／ｍｉｎ
の流速でカラムを洗浄することにより溶出させた。結合
タンパク質を、緩衝液Ｂ（２．０Ｍ ＮａＣｌを加えた
緩衝液Ａ）で溶出させた。各タンパク質フラクションの
吸光度を２８０ｎｍでモニターした。１つの小さい非結
合ピークおよび３つの結合ピークを得た（図２）。各ピ
ークを別々にプールし、凍結乾燥し、そして透析し
（０．００５Ｍリン酸塩緩衝液に対して４℃で２４時
間、緩衝液を２回交換）、そしてそれらの精子運動性に
対する活性をチェックした（表２）。１番目の結合ピー
クは、精子運動不能性効果を示し、そしてそれを、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥに供した。
子交換クロマトグラフィー工程の活性フラクション（Ｐ
ＩＩＩ）を、緩衝液Ａ（０．００５Ｍリン酸塩緩衝液
（ｐＨ７．０））で平衡化したＨＰＬＣ ＤＥＡＥカラ
ム（７．５×７５０ｍｍ）により、さらに精製した。非
結合タンパク質を、同じ緩衝液で、０．８ｍｌ／ｍｉｎ
の流速でカラムを洗浄することにより溶出させた。結合
タンパク質を、緩衝液Ｂ（２．０Ｍ ＮａＣｌを加えた
緩衝液Ａ）で溶出させた。各タンパク質フラクションの
吸光度を２８０ｎｍでモニターした。１つの小さい非結
合ピークおよび３つの結合ピークを得た（図２）。各ピ
ークを別々にプールし、凍結乾燥し、そして透析し
（０．００５Ｍリン酸塩緩衝液に対して４℃で２４時
間、緩衝液を２回交換）、そしてそれらの精子運動性に
対する活性をチェックした（表２）。１番目の結合ピー
クは、精子運動不能性効果を示し、そしてそれを、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥに供した。
【００４３】（ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：イオン交換クロ
マトグラフィー工程の活性ピークを、１２％分離用ゲル
および３．５％濃縮用ゲルによるＳＤＳ−ＰＡＧＥに供
した。約３μｇのこのタンパク質を、０．０１Ｍトリ
ス、１０％ＳＤＳ、５％β−メルカプトエタノールおよ
び０．１％ブロモフェノールブルーを含むサンプル緩衝
液（ｐＨ６．８）２０μｌに溶解した。これを１００℃
で５分間加熱し、ゲルに載せ、５０Ｖで電気泳動した。
７μｌの予め染色したマーカー（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）
を、分子量の決定のために使用した。２０ｋＤａの単一
の単量体タンパク質を得た（図３）。
マトグラフィー工程の活性ピークを、１２％分離用ゲル
および３．５％濃縮用ゲルによるＳＤＳ−ＰＡＧＥに供
した。約３μｇのこのタンパク質を、０．０１Ｍトリ
ス、１０％ＳＤＳ、５％β−メルカプトエタノールおよ
び０．１％ブロモフェノールブルーを含むサンプル緩衝
液（ｐＨ６．８）２０μｌに溶解した。これを１００℃
で５分間加熱し、ゲルに載せ、５０Ｖで電気泳動した。
７μｌの予め染色したマーカー（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）
を、分子量の決定のために使用した。２０ｋＤａの単一
の単量体タンパク質を得た（図３）。
【００４４】ＩＩＩ．毒性試験： （ａ）死亡率試験：この体腔液がいくらかの毒性作用を
有しているか否かをチェックするため、粗抽出物を、１
５ｍｇ／ｋｇ体重の用量でラットおよびマウス（各５
匹）に注射した（ｉ．ｖおよびｉ．ｐ）。コントロール
動物に同体積の０．９％生理食塩水を注射した。注射の
１ヶ月後でさえも、どの動物の死亡率も存在しなかっ
た。
有しているか否かをチェックするため、粗抽出物を、１
５ｍｇ／ｋｇ体重の用量でラットおよびマウス（各５
匹）に注射した（ｉ．ｖおよびｉ．ｐ）。コントロール
動物に同体積の０．９％生理食塩水を注射した。注射の
１ヶ月後でさえも、どの動物の死亡率も存在しなかっ
た。
【００４５】（ｂ）溶血試験 ヘパリン処理した試験管中に血液を収集した後、直ちに
ラットＲＢＣを調製した。この血液を、等張生理食塩水
で３倍に希釈し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し
た。ペレット化したＲＢＣを、生理食塩水で５回洗浄
し、約２×１０5細胞／ｍｌに希釈した。１０μｌの粗
抽出物（０．１９ｍｇ）を、５０μｌのＲＢＣ調製物に
加え、顕微鏡で観察した。全てのＲＢＣは、３０分間の
インキュベーション後でさえもインタクトであり、これ
は、このタンパク質がいかなる溶血活性も有さないこと
を示す。
ラットＲＢＣを調製した。この血液を、等張生理食塩水
で３倍に希釈し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し
た。ペレット化したＲＢＣを、生理食塩水で５回洗浄
し、約２×１０5細胞／ｍｌに希釈した。１０μｌの粗
抽出物（０．１９ｍｇ）を、５０μｌのＲＢＣ調製物に
加え、顕微鏡で観察した。全てのＲＢＣは、３０分間の
インキュベーション後でさえもインタクトであり、これ
は、このタンパク質がいかなる溶血活性も有さないこと
を示す。
【００４６】すべてのインビトロ試験およびインビボ試
験を行い、本出願人らは、精子の運動不能性を引き起こ
す強力な効果を有し、そして同時に、完全に非毒性の、
Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ ｐｏｓｔｈｕｍａの体腔液中の因
子の同定を主張するに至った。この２０ｋＤａのタンパ
ク質は、強力な精子運動不能性薬剤であり、そしてプレ
ート中の精子の数が一定のままである場合、マウス、ラ
ットおよび人間において同様の濃度効果を有することが
見出された。従って、これは、今日市販されている多く
のステロイド含有避妊薬において見られるような副作用
を有さない避妊薬として、ヒトに使用される強い可能性
を有する。これは、市場に出る最初の非ステロイド性の
外用剤（膣に挿入される）である。
験を行い、本出願人らは、精子の運動不能性を引き起こ
す強力な効果を有し、そして同時に、完全に非毒性の、
Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ ｐｏｓｔｈｕｍａの体腔液中の因
子の同定を主張するに至った。この２０ｋＤａのタンパ
ク質は、強力な精子運動不能性薬剤であり、そしてプレ
ート中の精子の数が一定のままである場合、マウス、ラ
ットおよび人間において同様の濃度効果を有することが
見出された。従って、これは、今日市販されている多く
のステロイド含有避妊薬において見られるような副作用
を有さない避妊薬として、ヒトに使用される強い可能性
を有する。これは、市場に出る最初の非ステロイド性の
外用剤（膣に挿入される）である。
【００４７】この予備実験は、外用剤としてのその見込
みを明らかに示した。
みを明らかに示した。
【００４８】（表１．ＳＧ１００溶出物の異なるピーク
の精子運動不能性効果）
の精子運動不能性効果）
【００４９】
【表１】 ５０μｌ（２．５×１０5の精子）を各試験に用い、そ
して１５μｇの各ピークのタンパク質を加えた。結果
は、５回の観察のデータから得られる。
して１５μｇの各ピークのタンパク質を加えた。結果
は、５回の観察のデータから得られる。
【００５０】（表２．ＨＰＬＣ ＤＥＡＥイオン交換ク
ロマトグラフィーの異なるピークの精子運動不能性効
果）
ロマトグラフィーの異なるピークの精子運動不能性効
果）
【００５１】
【表２】 ５０μｌ（２．５×１０5の精子）を各試験に用い、そ
して５μｇの各ピークのタンパク質を加えた。結果は、
５回の観察のデータから得られる。
して５μｇの各ピークのタンパク質を加えた。結果は、
５回の観察のデータから得られる。
【００５２】最後に、本発明は、避妊薬として有用な、
環形動物門に属するミミズ（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ ｐｏ
ｓｔｈｕｍａ）から単離された、新規な精子運動不能性
タンパク質、および避妊薬として有用な、環形動物門に
属するミミズ（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ ｐｏｓｔｈｕｍ
ａ）の一般に利用可能な成熟した試料の体腔液（ＣＦ）
中の、活性因子の単離のための方法に関する。
環形動物門に属するミミズ（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ ｐｏ
ｓｔｈｕｍａ）から単離された、新規な精子運動不能性
タンパク質、および避妊薬として有用な、環形動物門に
属するミミズ（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ ｐｏｓｔｈｕｍ
ａ）の一般に利用可能な成熟した試料の体腔液（ＣＦ）
中の、活性因子の単離のための方法に関する。
【図１】図１は、ＳＧ１００ゲル濾過カラムを通した体
腔液の溶出分布図であり、３つのピーク（ＰＩ、ＰＩ
Ｉ、ＰＩＩＩ）が得られた。各ピークのタンパク質を、
それらの精子の運動能に対する活性について試験した。
腔液の溶出分布図であり、３つのピーク（ＰＩ、ＰＩ
Ｉ、ＰＩＩＩ）が得られた。各ピークのタンパク質を、
それらの精子の運動能に対する活性について試験した。
【図２】図２は、ＨＰＬＣ ＤＥＡＥカラムを通したＰ
ＩＩＩ（ゲルクロマトグラフィーの活性なピーク）の溶
出分布図である。１つの小さな非結合ピーク（Ｄ１）お
よび３つの結合ピーク（ＤＩＩ、ＤＩＩＩおよびＤＩ
Ｖ）が得られ、各ピークのタンパク質を、それらの精子
の運動能に対する活性について試験した。
ＩＩＩ（ゲルクロマトグラフィーの活性なピーク）の溶
出分布図である。１つの小さな非結合ピーク（Ｄ１）お
よび３つの結合ピーク（ＤＩＩ、ＤＩＩＩおよびＤＩ
Ｖ）が得られ、各ピークのタンパク質を、それらの精子
の運動能に対する活性について試験した。
【図３】図３は、イオン交換クロマトグラフィー工程の
活性なフラクションの、１２％分離用ゲルおよび３．５
％濃縮用ゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥである。約３μｇの
タンパク質を、０．０１ＭのＴｒｉｓ、１０％ＳＤＳ、
５％β−メルカプトエタノールおよび０．１％ブロモフ
ェノールブルー（ｐＨ６．８）を含む２０μｌのサンプ
ル緩衝液に溶解した。それを１００℃で５分間加熱し、
ゲルに載せ、５０Ｖで電気泳動した。７μｌの予め染色
したマーカー（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を分子量の決定の
ために用いた。単一の２０ｋＤａの単量体タンパク質が
得られた（図３）。
活性なフラクションの、１２％分離用ゲルおよび３．５
％濃縮用ゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥである。約３μｇの
タンパク質を、０．０１ＭのＴｒｉｓ、１０％ＳＤＳ、
５％β−メルカプトエタノールおよび０．１％ブロモフ
ェノールブルー（ｐＨ６．８）を含む２０μｌのサンプ
ル緩衝液に溶解した。それを１００℃で５分間加熱し、
ゲルに載せ、５０Ｖで電気泳動した。７μｌの予め染色
したマーカー（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を分子量の決定の
ために用いた。単一の２０ｋＤａの単量体タンパク質が
得られた（図３）。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 35/56 Ａ６１Ｋ 35/56 ４Ｈ０４５ 38/00 Ａ６１Ｐ 15/16 Ａ６１Ｐ 15/16 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 30/88 Ｊ Ｇ０１Ｎ 30/88 33/48 Ａ // Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｃ１２Ｒ 1:91 (Ｃ１２Ｑ 1/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 モフア マカージー インド国， 700 032， カルカッタ， ジャダブプール， ラジャ エス．シー. ムリック ロード， ４， （カウンシ ル オブ サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ），インデ ィアン インスティテュート オブ ケミ カル バイオロジー (72)発明者 シャンパ ビスワズ インド国， 700 032， カルカッタ， ジャダブプール， ラジャ エス．シー. ムリック ロード， ４， （カウンシ ル オブ サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ），インデ ィアン インスティテュート オブ ケミ カル バイオロジー (72)発明者 マラビカ ダッタ インド国， 700 032， カルカッタ， ジャダブプール， ラジャ エス．シー. ムリック ロード， ４， （カウンシ ル オブ サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ），インデ ィアン インスティテュート オブ ケミ カル バイオロジー (72)発明者 サミール バッタチャーリャ インド国， 700 032， カルカッタ， ジャダブプール， ラジャ エス．シー. ムリック ロード， ４， （カウンシ ル オブ サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ），インデ ィアン インスティテュート オブ ケミ カル バイオロジー (72)発明者 ランジャン バドラ インド国， 700 032， カルカッタ， ジャダブプール， ラジャ エス．シー. ムリック ロード， ４， （カウンシ ル オブ サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ），インデ ィアン インスティテュート オブ ケミ カル バイオロジー (72)発明者 アロク パル インド国， 700 032， カルカッタ， ジャダブプール， ラジャ エス．シー. ムリック ロード， ４， （カウンシ ル オブ サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ），インデ ィアン インスティテュート オブ ケミ カル バイオロジー Ｆターム(参考） 2G045 AA29 AA40 BA14 BA20 BB10 BB14 BB24 BB29 BB41 BB46 BB48 BB50 BB51 CB14 CB17 DA36 FA16 FA29 FB05 FB06 GC10 4B063 QA20 QQ08 QR41 QX10 4C076 AA06 AA29 AA36 AA53 CC30 FF68 4C084 AA02 AA03 AA06 AA07 BA44 DB01 MA28 MA35 MA37 MA41 MA43 NA10 ZC032 4C087 AA01 AA02 AA04 AA05 BB11 CA11 CA16 CA23 MA28 MA35 MA37 MA43 NA10 ZC10 4H045 AA10 AA30 CA50 EA20 EA50 FA71 GA10 GA15 GA22 HA05
Claims (14)
- 【請求項１】 以下の特徴： ａ．アニオン性タンパク質、 ｂ．２０ｋＤａの分子量、 ｃ．非毒性であり、そしていかなる溶血活性もなく、そ
して ｄ．２分以内に１００％精子運動不能性を引き起こす、 を有する、ミミズ（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ ｐｏｓｔｈｕ
ｍａ）から単離された新規な精子運動不能性タンパク
質。 - 【請求項２】 １０〜１５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量
がラットおよびマウスに１ヶ月間投与される場合、いか
なる有害な効果も有さない、請求項１に記載のタンパク
質。 - 【請求項３】 ヒトを含む哺乳動物の身体に内服用およ
び外用のために使用され得る、請求項１に記載のタンパ
ク質。 - 【請求項４】 環形動物門に属するミミズ（Ｐｈｅｒｅ
ｔｉｍａ ｐｏｓｔｈｕｍａ）から得られた体腔液抽出
物を含む、避妊薬としても有用な、新規な精子運動不能
性薬剤。 - 【請求項５】 従来の薬学的に受容可能な添加物をさら
に含む、請求項４に記載の新規な精子運動不能性薬剤。 - 【請求項６】 ゲル、粉末、カプセル、溶液、錠剤、ク
リームの形態の、請求項５に記載の新規な精子運動不能
性薬剤。 - 【請求項７】 非毒性であり、そして哺乳動物に注射さ
れた場合にいかなる溶血効果も示さない、請求項４に記
載の新規な精子運動不能性薬剤。 - 【請求項８】 ２分以内に１００％精子運動不能性を示
す、請求項４および５に記載の新規な精子運動不能性薬
剤。 - 【請求項９】 非ステロイドであり、そして外用的に使
用され得る、請求項４に記載の新規な精子運動不能性薬
剤。 - 【請求項１０】 一般的に利用可能な成熟した試料であ
るミミズ（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ ｐｏｓｔｈｕｍａ）の
ＣＦ（体腔液）中の活性因子の単離のための方法であっ
て、該方法は以下の工程： ａ．一般的に利用可能な成熟した試料である該ミミズ
（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａｐｏｓｔｈｕｍａ）由来の体腔液
（ＣＦ）を提供し、そして該ＣＦを、超音波処理、続い
て遠心分離に供する工程、 ｂ．ＣＦの粗抽出物として上清を得る工程、 ｃ．ＣＦの該粗抽出物を、ゲル濾過クロマトグラフィー
に供する工程、 ｄ．２８０ｎｍでタンパク質フラクションをモニターす
る工程、 ｅ．３つのタンパク質ピークを得、そして各ピークの活
性をアッセイする工程、 ｆ．活性ピークＩＩＩを収集し、凍結乾燥し、透析し、
そしてそれをさらなる精製のためにＤＥＡＥカラムでＨ
ＰＬＣに供する工程 ｇ．非結合タンパク質および結合タンパク質を溶出する
工程、 ｈ．２８０ｎｍで各タンパク質ピークの吸光度を調べる
工程、 ｉ．各ピークをプールし、凍結乾燥し、そして透析し、
そしてこれらの精子運動性に対する活性をチェックする
工程、および ｊ．精子運動不能性効果を示す１番目の結合ピークを同
定し、そしてそれをその純度および分子量を決定するた
めにＳＤＳ−ＰＡＧＥに供する工程、を包含する、方
法。 - 【請求項１１】 前記ＣＦが、１０〜１５ｍｇ／ｋｇ体
重の範囲の用量でそれをラットおよびマウスに注射する
ことによる、運動不能性試験に供され、そして該注射の
１ヶ月後でさえも死亡率を示さない、請求項１０に記載
の方法。 - 【請求項１２】 １０μｌの用量の前記粗抽出物を、２
５０μｌのＲＢＣ調製物に加えることによる、ラットＲ
ＢＣを用いる溶血試験を行い、３０分間のインキュベー
ションの後でさえ、いかなる溶血活性も有さないタンパ
ク質を表すインタクトなＲＢＣを示す、請求項１０に記
載の方法。 - 【請求項１３】 バイオアッセイに使用するための、オ
スのラットおよびマウス由来の精子懸濁液を調製する方
法であって、該方法は以下の工程： ａ．繁殖性のオスのラットおよびマウスから精液を集
め、そしてＢＷＷ培地で希釈し、ＣＯ2インキュベータ
ー中で、空気中で５％のＣＯ2の存在下、３７℃で、オ
イルカバー下で平衡化する工程、 ｂ．該精子懸濁液を再びインキュベートし、精子が活発
に泳ぐのを可能にする工程、 ｃ．少なくとも７０％の前進運動性を有する、高運動性
の精子懸濁液を収集する工程、および ｄ．該精子懸濁液を約５〜１０分間遠心分離し、ペレッ
ト化した精子を希釈して、４０〜５０μｌの必要な濃度
（２．０×１０5〜２．５×１０5の精子）に到達させる
工程、を包含する、方法。 - 【請求項１４】 環形動物門に属するミミズ（Ｐｈｅｒ
ｅｔｉｍａ ｐｏｓｔｈｕｍａ）から得られた、哺乳動
物において外的または内的に使用され得る、避妊用化合
物。
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| CNB011124350A CN100406470C (zh) | 2001-03-30 | 2001-03-30 | 从一种印度蚯蚓体腔液中得到的引起精子不能游动的蛋白 |
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| JP2006096673A (ja) * | 2004-09-28 | 2006-04-13 | Mihara Lr Kenkyusho:Kk | ミミズ製品の製造方法 |
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