JP2002199880A - 大豆加工食品中に含まれるダイズｄｎａの抽出方法 - Google Patents
大豆加工食品中に含まれるダイズｄｎａの抽出方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、従来困難とされてきたＤＮＡ量が
少ない、味噌、醤油、納豆、大豆油、大豆蛋白を使用し
た２次加工品などの大豆加工食品から、ＰＣＲ法に用い
るのに十分な量の大豆ＤＮＡを、簡便で且つ効率に抽出
する方法を提供することを目的とする。 【解決手段】本発明は、大豆加工食品中に含まれる大豆
ＤＮＡを抽出する方法において、試料からＤＮＡを抽出
する工程における溶液のｐＨを、６．５〜９．５程度に
調整する、抽出方法を提供する。
少ない、味噌、醤油、納豆、大豆油、大豆蛋白を使用し
た２次加工品などの大豆加工食品から、ＰＣＲ法に用い
るのに十分な量の大豆ＤＮＡを、簡便で且つ効率に抽出
する方法を提供することを目的とする。 【解決手段】本発明は、大豆加工食品中に含まれる大豆
ＤＮＡを抽出する方法において、試料からＤＮＡを抽出
する工程における溶液のｐＨを、６．５〜９．５程度に
調整する、抽出方法を提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する分野】本発明は、味噌などの加工度が高
い食品からの大豆ＤＮＡの抽出を、効率よく行う方法な
らびに該方法に用いるＤＮＡを抽出精製するための試薬
に関する。
い食品からの大豆ＤＮＡの抽出を、効率よく行う方法な
らびに該方法に用いるＤＮＡを抽出精製するための試薬
に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年遺伝子組換え農作物を食品に使用す
ることについて消費者が不安を抱いており、非遺伝子組
換え食品に対する消費者のニーズが高まってきている。
農林水産省等においても遺伝子組換え農作物を使用した
食品について表示を義務化する方向で進んでいる。現在
非遺伝子組換え食品に使われる原料は、原料段階での遺
伝子組換え農作物の分別流通が行われ、分別管理によっ
て非遺伝子組換え農作物を使用したという証明書を持っ
ていれば遺伝子組換え原料を使用した旨の表示を行わな
くてもよいことになっている。しかしながら現実には流
通段階での遺伝子組換え原料のコンタミネーションの起
こる可能性があり、組換え体の混入を検証する方法が必
要になってくる。
ることについて消費者が不安を抱いており、非遺伝子組
換え食品に対する消費者のニーズが高まってきている。
農林水産省等においても遺伝子組換え農作物を使用した
食品について表示を義務化する方向で進んでいる。現在
非遺伝子組換え食品に使われる原料は、原料段階での遺
伝子組換え農作物の分別流通が行われ、分別管理によっ
て非遺伝子組換え農作物を使用したという証明書を持っ
ていれば遺伝子組換え原料を使用した旨の表示を行わな
くてもよいことになっている。しかしながら現実には流
通段階での遺伝子組換え原料のコンタミネーションの起
こる可能性があり、組換え体の混入を検証する方法が必
要になってくる。
【０００３】現在組換え体の検出には主に、組換え遺伝
子そのものを検出する方法と、その遺伝子産物を検出す
る方法の2種類が考えられているが、その内遺伝子産物
(蛋白質)検出法については熱がかけられたものは蛋白質
が変性してしまい測定が出来ないなどの問題があり、加
工食品の検査は不可能である。一方の組換え遺伝子の検
出には、その特定の遺伝子配列を特異的に増幅させるＰ
ＣＲ法が一般に用いられている。ＰＣＲ法の利点として
は非常に高感度な測定法であり、僅かな目的ＤＮＡがあ
れば検出できる点である。従って加工食品の場合でも加
工度が低く、損傷のないＤＮＡが僅かに含まれていれば
組換え体の検出が可能である。
子そのものを検出する方法と、その遺伝子産物を検出す
る方法の2種類が考えられているが、その内遺伝子産物
(蛋白質)検出法については熱がかけられたものは蛋白質
が変性してしまい測定が出来ないなどの問題があり、加
工食品の検査は不可能である。一方の組換え遺伝子の検
出には、その特定の遺伝子配列を特異的に増幅させるＰ
ＣＲ法が一般に用いられている。ＰＣＲ法の利点として
は非常に高感度な測定法であり、僅かな目的ＤＮＡがあ
れば検出できる点である。従って加工食品の場合でも加
工度が低く、損傷のないＤＮＡが僅かに含まれていれば
組換え体の検出が可能である。
【０００４】一般に植物材料からのＤＮＡの抽出精製方
法にはCTAB(セチルトリメチルアンモニウムブロミド)法
[1980. Nucl. Acids Res. 8:4321-4325] 及びその改変
法がよく用いられており、これまでにCTAB法によって大
豆粒及び豆腐から原料大豆中の組換え体を検出したとい
う報告はいくつかあるが [1999. 農林水産消費技術セン
ター調査研究報告 23:9-16、1999. 食衛誌40:149-157]
、味噌、醤油、納豆など発酵過程の含まれる加工度の
高い食品については、一般にＰＣＲ法による組換え体の
検出は不可能であるとされている。例えば、「食品と開
発、VOL.35, NO.2, p4-6」の表１において、ダイズにお
ける検査可能品目として、豆腐、油揚げ等は検査可能で
あるが、「味噌、醤油、納豆、大豆油、大豆蛋白を使用
した２次加工品」は検査不能品目として例示されてい
る。
法にはCTAB(セチルトリメチルアンモニウムブロミド)法
[1980. Nucl. Acids Res. 8:4321-4325] 及びその改変
法がよく用いられており、これまでにCTAB法によって大
豆粒及び豆腐から原料大豆中の組換え体を検出したとい
う報告はいくつかあるが [1999. 農林水産消費技術セン
ター調査研究報告 23:9-16、1999. 食衛誌40:149-157]
、味噌、醤油、納豆など発酵過程の含まれる加工度の
高い食品については、一般にＰＣＲ法による組換え体の
検出は不可能であるとされている。例えば、「食品と開
発、VOL.35, NO.2, p4-6」の表１において、ダイズにお
ける検査可能品目として、豆腐、油揚げ等は検査可能で
あるが、「味噌、醤油、納豆、大豆油、大豆蛋白を使用
した２次加工品」は検査不能品目として例示されてい
る。
【０００５】しかしながら、これら品目を検査すること
は、２００１年４月からの遺伝子組換え作物使用食品の
表示義務化に対応する上で、遺伝子組換え大豆の混入の
有無を検証することは非常に重要であり、業界において
も検査方法が望まれている。
は、２００１年４月からの遺伝子組換え作物使用食品の
表示義務化に対応する上で、遺伝子組換え大豆の混入の
有無を検証することは非常に重要であり、業界において
も検査方法が望まれている。
【０００６】
【発明が解決使用とする課題】本発明は、従来困難とさ
れてきた味噌、醤油、納豆、大豆油、大豆蛋白を使用し
た２次加工品などの加工度が高くＤＮＡ量が少ない大豆
加工食品から、ＰＣＲ法に用いるのに十分な量の大豆Ｄ
ＮＡを、簡便で且つ効率的に抽出する方法を提供するこ
とを目的とする。
れてきた味噌、醤油、納豆、大豆油、大豆蛋白を使用し
た２次加工品などの加工度が高くＤＮＡ量が少ない大豆
加工食品から、ＰＣＲ法に用いるのに十分な量の大豆Ｄ
ＮＡを、簡便で且つ効率的に抽出する方法を提供するこ
とを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、ＤＮＡ抽出には、塩濃度とｐＨが重要で
あることを発見し、本発明を完成した。
を重ねた結果、ＤＮＡ抽出には、塩濃度とｐＨが重要で
あることを発見し、本発明を完成した。
【０００８】即ち、本発明は以下の発明を提供するもの
である。
である。
【０００９】項１． 大豆加工食品中に含まれる大豆Ｄ
ＮＡを抽出する方法において、試料からＤＮＡを抽出す
る工程における溶液のｐＨを、６．５〜９．５程度に調
整する、抽出方法。
ＮＡを抽出する方法において、試料からＤＮＡを抽出す
る工程における溶液のｐＨを、６．５〜９．５程度に調
整する、抽出方法。
【００１０】項２． 大豆加工食品中に含まれる大豆Ｄ
ＮＡを抽出する方法において、試料からＤＮＡを抽出す
る工程における溶液のｐＨを６．５〜９．５程度に調整
し、且つ、該溶液の塩濃度を０．５〜１．０Ｍ程度に調
整する、抽出方法。
ＮＡを抽出する方法において、試料からＤＮＡを抽出す
る工程における溶液のｐＨを６．５〜９．５程度に調整
し、且つ、該溶液の塩濃度を０．５〜１．０Ｍ程度に調
整する、抽出方法。
【００１１】項３． 下記工程 (a)大豆ＤＮＡを含む試料に、界面活性剤を含む溶媒を
添加、混合し、混合液のｐＨを、６．５〜９．５程度に
調整して、試料から大豆ＤＮＡを抽出する工程、(b)混
合液からＤＮＡ以外の不純物を除去する工程、(c)ＤＮ
Ａを沈殿させる工程を含むことを特徴とする大豆加工食
品中に含まれるダイズＤＮＡの抽出方法。
添加、混合し、混合液のｐＨを、６．５〜９．５程度に
調整して、試料から大豆ＤＮＡを抽出する工程、(b)混
合液からＤＮＡ以外の不純物を除去する工程、(c)ＤＮ
Ａを沈殿させる工程を含むことを特徴とする大豆加工食
品中に含まれるダイズＤＮＡの抽出方法。
【００１２】項４． 下記工程 (a)大豆ＤＮＡを含む試料に、界面活性剤を含む溶媒を
添加、混合し、混合液の塩濃度を０．５〜１．０Ｍ程度
に調整及び該混合液のｐＨを、６．５〜９．５程度に調
整して、試料から大豆ＤＮＡを抽出する工程、(b)混合
液からＤＮＡ以外の不純物を除去する工程、(c)ＤＮＡ
を沈殿させる工程を含むことを特徴とする大豆加工食品
中に含まれるダイズＤＮＡの抽出方法。
添加、混合し、混合液の塩濃度を０．５〜１．０Ｍ程度
に調整及び該混合液のｐＨを、６．５〜９．５程度に調
整して、試料から大豆ＤＮＡを抽出する工程、(b)混合
液からＤＮＡ以外の不純物を除去する工程、(c)ＤＮＡ
を沈殿させる工程を含むことを特徴とする大豆加工食品
中に含まれるダイズＤＮＡの抽出方法。
【００１３】項５． 大豆加工食品が、味噌又は醤油で
ある、項１〜４のいずれかに記載の抽出方法。
ある、項１〜４のいずれかに記載の抽出方法。
【００１４】項６． 項１〜５のいずれかに記載の抽出
方法によって得られたＤＮＡをＰＣＲを用いて遺伝子組
換え体を含有するか否かを検出する方法。
方法によって得られたＤＮＡをＰＣＲを用いて遺伝子組
換え体を含有するか否かを検出する方法。
【００１５】項７． (1)界面活性剤を含むＤＮＡ抽出
用バッファー、(2)ｐＨ調整液、(3)ＤＮＡ沈殿用溶液を
含む大豆加工食品中に含まれる大豆ＤＮＡ抽出用キッ
ト。
用バッファー、(2)ｐＨ調整液、(3)ＤＮＡ沈殿用溶液を
含む大豆加工食品中に含まれる大豆ＤＮＡ抽出用キッ
ト。
【００１６】項８． (1)界面活性剤を含むＤＮＡ抽出
用バッファーが、ＮａＣｌフリーである項７に記載のキ
ット。
用バッファーが、ＮａＣｌフリーである項７に記載のキ
ット。
【００１７】
【発明の実施の形態】本発明は、大豆加工食品の試料か
らＤＮＡを抽出する工程において、混合液中のｐＨ、更
には塩濃度を調整することを特徴とするものである。
らＤＮＡを抽出する工程において、混合液中のｐＨ、更
には塩濃度を調整することを特徴とするものである。
【００１８】本発明において「塩濃度」とは、塩化ナト
リウムの濃度を意味するものである。
リウムの濃度を意味するものである。
【００１９】本発明によるＤＮＡの抽出方法は、(a)抽
出を行う加工食品（試料）を、界面活性剤を含む溶媒
（抽出用バッファー）にて溶解する工程、(b)有機溶媒
を加えて蛋白質類、多糖類などを除去する工程、(c)溶
液中のＤＮＡを沈殿させる工程に大きく分けられる。
出を行う加工食品（試料）を、界面活性剤を含む溶媒
（抽出用バッファー）にて溶解する工程、(b)有機溶媒
を加えて蛋白質類、多糖類などを除去する工程、(c)溶
液中のＤＮＡを沈殿させる工程に大きく分けられる。
【００２０】また、更に精製するために、(d)得られた
ＤＮＡを精製する工程を加えても良い。
ＤＮＡを精製する工程を加えても良い。
【００２１】試料としては、大豆ＤＮＡを含む試料、具
体的には、大豆加工食品、より具体的には、味噌、醤
油、納豆、大豆油又は大豆蛋白を使用した２次加工品が
例示できる。大豆蛋白を使用した２次加工品としては、
粉末スープ全般に含まれる賦形剤、具材に使われるミン
チ肉のつなぎ、大豆蛋白を用いた油揚げ、麺や具材（肉
やエビなど）の着味に使用する着味液やガーリックパウ
ダーの原料等が挙げられる。
体的には、大豆加工食品、より具体的には、味噌、醤
油、納豆、大豆油又は大豆蛋白を使用した２次加工品が
例示できる。大豆蛋白を使用した２次加工品としては、
粉末スープ全般に含まれる賦形剤、具材に使われるミン
チ肉のつなぎ、大豆蛋白を用いた油揚げ、麺や具材（肉
やエビなど）の着味に使用する着味液やガーリックパウ
ダーの原料等が挙げられる。
【００２２】味噌の具体例としては、赤味噌、麦味噌、
白味噌、八丁味噌、粉末味噌等があげられる。また、醤
油の具体例としては、濃口醤油、薄口醤油、たまり醤
油、粉末醤油などがあげられる。
白味噌、八丁味噌、粉末味噌等があげられる。また、醤
油の具体例としては、濃口醤油、薄口醤油、たまり醤
油、粉末醤油などがあげられる。
【００２３】本発明の方法は、好ましくは、味噌、醤油
に適用でき、特に、味噌に適用される。
に適用でき、特に、味噌に適用される。
【００２４】以下、本発明の抽出方法についてより具体
的に述べる。 (a) 試料からのＤＮＡ抽出工程 まず、大豆加工食品の大豆ＤＮＡを含む試料に、界面活
性剤を含む溶媒（抽出用バッファー）を添加、混合す
る。抽出が容易となるように、大豆ＤＮＡを含む試料を
予め粉砕しておくのが好ましい。より具体的には、粉末
状のものはそのまま、固形のものは凍結乾燥もしくは適
当な方法で乾燥後、乳鉢、乳棒などを用いて粉砕を行
い、また液状のものも同様に凍結乾燥等を用いて乾燥、
粉砕したものを用いるか、液状のまま抽出に用いる。ま
た、生味噌はそのまま用いることができる。
的に述べる。 (a) 試料からのＤＮＡ抽出工程 まず、大豆加工食品の大豆ＤＮＡを含む試料に、界面活
性剤を含む溶媒（抽出用バッファー）を添加、混合す
る。抽出が容易となるように、大豆ＤＮＡを含む試料を
予め粉砕しておくのが好ましい。より具体的には、粉末
状のものはそのまま、固形のものは凍結乾燥もしくは適
当な方法で乾燥後、乳鉢、乳棒などを用いて粉砕を行
い、また液状のものも同様に凍結乾燥等を用いて乾燥、
粉砕したものを用いるか、液状のまま抽出に用いる。ま
た、生味噌はそのまま用いることができる。
【００２５】溶媒（抽出用バッファー）としては、界面
活性剤を含み、試料と混合した後に、ｐＨ、更には、塩
濃度を所定の範囲に調整できるものであれば特に限定さ
れないが、緩衝剤を含むことが好ましい。界面活性剤と
して、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、非イ
オン界面活性剤、両性界面活性剤が挙げられる。特に、
陽イオン界面活性剤が好ましく、CTAB（セチルトリメチ
ルアンモニウムブロミド）を使用することが好ましい。
これら界面活性剤は、単独で又は２種以上併用しても良
い。これらの使用濃度は、抽出用バッファーにおいて
０．１〜１０w/v％、好ましくは０．１〜５w/v％程度と
なるのが好ましい。
活性剤を含み、試料と混合した後に、ｐＨ、更には、塩
濃度を所定の範囲に調整できるものであれば特に限定さ
れないが、緩衝剤を含むことが好ましい。界面活性剤と
して、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、非イ
オン界面活性剤、両性界面活性剤が挙げられる。特に、
陽イオン界面活性剤が好ましく、CTAB（セチルトリメチ
ルアンモニウムブロミド）を使用することが好ましい。
これら界面活性剤は、単独で又は２種以上併用しても良
い。これらの使用濃度は、抽出用バッファーにおいて
０．１〜１０w/v％、好ましくは０．１〜５w/v％程度と
なるのが好ましい。
【００２６】また、更にEDTA（使用濃度としては、抽出
用バッファーにおいて１〜１００mM、好ましくは５〜５
０mM程度）を含むことがより好ましい。
用バッファーにおいて１〜１００mM、好ましくは５〜５
０mM程度）を含むことがより好ましい。
【００２７】緩衝剤としては、一般に使用されるもので
あれば、特に限定されないが、中性〜弱アルカリ（ｐＨ
としては、７〜９程度）において緩衝能を有するものを
使用するのが好ましい。例えば、トリス−塩酸、四ホウ
酸ナトリウム−塩酸、リン酸二水素カリウム−四ホウ酸
ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム−水酸化ナトリウ
ム等が挙げられ、その使用濃度としては、抽出用バッフ
ァーにおいて１０〜５００mM、好ましくは１０〜１００
mM程度、ｐＨは７〜９、好ましくは、７．５〜８．５程
度が好適である。
あれば、特に限定されないが、中性〜弱アルカリ（ｐＨ
としては、７〜９程度）において緩衝能を有するものを
使用するのが好ましい。例えば、トリス−塩酸、四ホウ
酸ナトリウム−塩酸、リン酸二水素カリウム−四ホウ酸
ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム−水酸化ナトリウ
ム等が挙げられ、その使用濃度としては、抽出用バッフ
ァーにおいて１０〜５００mM、好ましくは１０〜１００
mM程度、ｐＨは７〜９、好ましくは、７．５〜８．５程
度が好適である。
【００２８】また、メルカプトエタノール（使用濃度と
しては、抽出用バッファーにおいて０．１〜２w/v％程
度）を加えてもよい。
しては、抽出用バッファーにおいて０．１〜２w/v％程
度）を加えてもよい。
【００２９】抽出用バッファーは、更にNaCl等の塩を含
有していても良い。例えば、試料の塩濃度を予め測定
し、以下の条件に適合するような塩濃度となるように、
塩含有抽出バッファーを添加、混合しても良い。塩濃度
としては、特に限定されないが、例えば、０．１〜０．
６Ｍ程度、好ましくは０．１〜０．４Ｍ程度である。
有していても良い。例えば、試料の塩濃度を予め測定
し、以下の条件に適合するような塩濃度となるように、
塩含有抽出バッファーを添加、混合しても良い。塩濃度
としては、特に限定されないが、例えば、０．１〜０．
６Ｍ程度、好ましくは０．１〜０．４Ｍ程度である。
【００３０】但し、試料が微量の場合、まず、試料に塩
を含有しない抽出用バッファーを添加混合後、混合液の
塩濃度を測定し、塩濃度を調整するほうがよい。
を含有しない抽出用バッファーを添加混合後、混合液の
塩濃度を測定し、塩濃度を調整するほうがよい。
【００３１】より具体的な抽出用バッファーとしては、
０．５〜２w/v％ CTAB、５〜２０mMEDTA、１０〜１００
mMトリス−塩酸（ｐＨ７．５〜９）が例示できる。更
に、２−メルカプトエタノールを０．１〜２w/v％ の濃
度で含んでいてもよい。
０．５〜２w/v％ CTAB、５〜２０mMEDTA、１０〜１００
mMトリス−塩酸（ｐＨ７．５〜９）が例示できる。更
に、２−メルカプトエタノールを０．１〜２w/v％ の濃
度で含んでいてもよい。
【００３２】また、その使用量としては、通常、試料１
ｇ当たり、１〜２０ml程度、好ましくは、１〜５ml程度
がよい。
ｇ当たり、１〜２０ml程度、好ましくは、１〜５ml程度
がよい。
【００３３】(i)上記の割合で混合した混合液のｐＨを
ｐＨ調整液を用いて６．５〜９．５程度、好ましくは７
〜９程度、より好ましくは７．５〜９程度に調整する。
味噌等の大豆加工食品は、酸性であるため、１〜１０Ｎ
のNaOHを添加して、ｐＨを調整することができる。
ｐＨ調整液を用いて６．５〜９．５程度、好ましくは７
〜９程度、より好ましくは７．５〜９程度に調整する。
味噌等の大豆加工食品は、酸性であるため、１〜１０Ｎ
のNaOHを添加して、ｐＨを調整することができる。
【００３４】(ii)更に、上記の割合で混合した混合液の
塩濃度を、０．５〜１．０Ｍ程度になるように調整して
もよい。好ましくは、０．６〜０．８Ｍ程度がよい。上
述したように、事前に試料中の塩濃度を測定し、抽出用
バッファー中に適当な塩濃度を含有させてもよいし、混
合後の混合液の塩濃度を測定し、高濃度の塩溶液を添加
することで上記濃度に調整してもよい。該塩溶液として
は、１〜５ＭのNaCl水溶液、飽和ＮａＣｌ水溶液等が例
示でき、或いは直接塩化ナトリウム結晶を添加してもよ
い。
塩濃度を、０．５〜１．０Ｍ程度になるように調整して
もよい。好ましくは、０．６〜０．８Ｍ程度がよい。上
述したように、事前に試料中の塩濃度を測定し、抽出用
バッファー中に適当な塩濃度を含有させてもよいし、混
合後の混合液の塩濃度を測定し、高濃度の塩溶液を添加
することで上記濃度に調整してもよい。該塩溶液として
は、１〜５ＭのNaCl水溶液、飽和ＮａＣｌ水溶液等が例
示でき、或いは直接塩化ナトリウム結晶を添加してもよ
い。
【００３５】好ましくは、(i)及び(ii)の調整を共に行
うことが好ましい。
うことが好ましい。
【００３６】本発明は、また、以下に示す大豆ＤＮＡの
抽出方法を提供する。 ・味噌中に含まれる大豆ＤＮＡを抽出する方法におい
て、味噌１重量部あたり、０．５〜３重量部のＮａＣｌ
フリーの抽出用バッファーを添加する抽出方法。 ・醤油中に含まれる大豆ＤＮＡを抽出する方法におい
て、醤油１重量部あたり、１〜５重量部のＮａＣｌフリ
ーの抽出用バッファーを添加する抽出方法。 ・大豆蛋白を使用した２次加工品中に含まれる大豆ＤＮ
Ａを抽出する方法において、加工品１重量部あたり、
０．５〜１０重量部のＮａＣｌフリーの抽出用バッファ
ーを添加する抽出方法。
抽出方法を提供する。 ・味噌中に含まれる大豆ＤＮＡを抽出する方法におい
て、味噌１重量部あたり、０．５〜３重量部のＮａＣｌ
フリーの抽出用バッファーを添加する抽出方法。 ・醤油中に含まれる大豆ＤＮＡを抽出する方法におい
て、醤油１重量部あたり、１〜５重量部のＮａＣｌフリ
ーの抽出用バッファーを添加する抽出方法。 ・大豆蛋白を使用した２次加工品中に含まれる大豆ＤＮ
Ａを抽出する方法において、加工品１重量部あたり、
０．５〜１０重量部のＮａＣｌフリーの抽出用バッファ
ーを添加する抽出方法。
【００３７】該方法において「ＮａＣｌフリーの抽出用
バッファー」とは、上記記載の抽出用バッファーであっ
て、NaClを添加していないものをいう。従って、例え
ば、EDTA Na塩のNaは含まれていてもよい。
バッファー」とは、上記記載の抽出用バッファーであっ
て、NaClを添加していないものをいう。従って、例え
ば、EDTA Na塩のNaは含まれていてもよい。
【００３８】上記添加後、ｐＨを６．５〜９．５に調整
することが好ましい。
することが好ましい。
【００３９】上記調整後、ＤＮＡをより効率的に試料か
ら抽出するために、３５〜７０℃、好ましくは５０〜６
０℃で、１０分〜２時間、好ましくは３０分〜１時間程
度時々攪拌しながら混合するのが好ましい。
ら抽出するために、３５〜７０℃、好ましくは５０〜６
０℃で、１０分〜２時間、好ましくは３０分〜１時間程
度時々攪拌しながら混合するのが好ましい。
【００４０】この工程によって、試料中のＤＮＡが抽出
用バッファーに溶解するが、塩濃度が上記範囲であるた
め、沈殿することなく溶解した状態で存在する。
用バッファーに溶解するが、塩濃度が上記範囲であるた
め、沈殿することなく溶解した状態で存在する。
【００４１】(b)混合液からＤＮＡ以外の不純物を除去
する工程、 (b-1)(a)の工程終了後、混合液に有機溶媒を加え、蛋白
質や糖質を有機溶媒層に移行させ、水層を回収すること
によって不純物を除去する。有機溶媒としては、水と混
和しない有機溶媒であれば特に限定されないが、例え
ば、クロロホルム、緩衝液飽和フェノール（ＴＥバッフ
ァー（ｐＨ６〜９程度）等の緩衝液が飽和状態で溶解し
ているフェノール）、ｎ−ブタノール等が挙げられる。
また、攪拌時の泡立ちを防ぎ、有機層と水層の分離を促
進するために、有機溶媒にイソアミルアルコールを適当
量混和してもよい。その混合割合としては、容積比とし
て有機溶媒：イソアミルアルコール＝２４：１〜４８：
１程度である。
する工程、 (b-1)(a)の工程終了後、混合液に有機溶媒を加え、蛋白
質や糖質を有機溶媒層に移行させ、水層を回収すること
によって不純物を除去する。有機溶媒としては、水と混
和しない有機溶媒であれば特に限定されないが、例え
ば、クロロホルム、緩衝液飽和フェノール（ＴＥバッフ
ァー（ｐＨ６〜９程度）等の緩衝液が飽和状態で溶解し
ているフェノール）、ｎ−ブタノール等が挙げられる。
また、攪拌時の泡立ちを防ぎ、有機層と水層の分離を促
進するために、有機溶媒にイソアミルアルコールを適当
量混和してもよい。その混合割合としては、容積比とし
て有機溶媒：イソアミルアルコール＝２４：１〜４８：
１程度である。
【００４２】これら有機溶媒は混合物１重量部あたり、
０．５〜２重量部、好ましくは、１〜２重量部程度の割
合で混合後、遠心することによって有機溶媒層と水層を
分離し、水層を回収する。混合温度は、１５〜２５℃程
度の室温で行うことができ、混合時間は、１０〜３０分
程度、遠心分離の条件は、3000〜5000rpmで１０〜３０
分間程度である。
０．５〜２重量部、好ましくは、１〜２重量部程度の割
合で混合後、遠心することによって有機溶媒層と水層を
分離し、水層を回収する。混合温度は、１５〜２５℃程
度の室温で行うことができ、混合時間は、１０〜３０分
程度、遠心分離の条件は、3000〜5000rpmで１０〜３０
分間程度である。
【００４３】(b-2)また、更に、有機溶媒層に残存する
ＤＮＡを回収するために、０．５〜１．０ＭのNaClを含
む抽出用バッファーを、有機溶媒１重量部当たり、０．
１〜０．５重量部程度加え、上記のように、混合後、遠
心することによって、水層を回収してもよい。
ＤＮＡを回収するために、０．５〜１．０ＭのNaClを含
む抽出用バッファーを、有機溶媒１重量部当たり、０．
１〜０．５重量部程度加え、上記のように、混合後、遠
心することによって、水層を回収してもよい。
【００４４】次の工程には、これら水層を併せて用いれ
ばよい。
ばよい。
【００４５】(b-3)また、上記水層に対して１重量部当
たり、０．０５〜０．２重量部程度の割合で、界面活性
剤及び０．５〜１．０Ｍの塩を含む補助溶液を加えて、
溶け残っている蛋白質等を更に除去してもよい。該補助
溶液は、水層の液量を増大させないようにするために、
界面活性剤の濃度は、混合してもその後の界面活性剤の
濃度が変化しないように、高濃度のもの（５〜１０w/v
%）を使用するのが好ましい。その後、上記(b-1)と同様
に有機溶媒を混合後、遠心することによって水層を洗浄
してもよい。
たり、０．０５〜０．２重量部程度の割合で、界面活性
剤及び０．５〜１．０Ｍの塩を含む補助溶液を加えて、
溶け残っている蛋白質等を更に除去してもよい。該補助
溶液は、水層の液量を増大させないようにするために、
界面活性剤の濃度は、混合してもその後の界面活性剤の
濃度が変化しないように、高濃度のもの（５〜１０w/v
%）を使用するのが好ましい。その後、上記(b-1)と同様
に有機溶媒を混合後、遠心することによって水層を洗浄
してもよい。
【００４６】(c)ＤＮＡを沈殿させる工程 上記(b)工程によって得られた水層に、ＤＮＡ沈殿用溶
液を加えてＤＮＡを沈殿させる。該ＤＮＡ沈殿用溶液と
しては、水層との混合後、混合液の塩濃度が０．４Ｍ以
下となるようなものであればよい。また、ｐＨも７〜９
程度がよい。
液を加えてＤＮＡを沈殿させる。該ＤＮＡ沈殿用溶液と
しては、水層との混合後、混合液の塩濃度が０．４Ｍ以
下となるようなものであればよい。また、ｐＨも７〜９
程度がよい。
【００４７】従って、該ＤＮＡ沈殿用溶液としては、塩
を含有しない、例えば、０．５〜２w/v％ 界面活性剤、
５〜２０mM EDTA、１０〜１００mM緩衝剤（ｐＨ７．５
〜８．５）が例示できる。
を含有しない、例えば、０．５〜２w/v％ 界面活性剤、
５〜２０mM EDTA、１０〜１００mM緩衝剤（ｐＨ７．５
〜８．５）が例示できる。
【００４８】界面活性剤及び緩衝剤とも、上記(a)工程
で記載したものが記載でき、界面活性剤としては、CTA
B、緩衝剤としてはトリス−塩酸が好ましい。
で記載したものが記載でき、界面活性剤としては、CTA
B、緩衝剤としてはトリス−塩酸が好ましい。
【００４９】水層に上記沈殿用溶液を添加、混合後、
０．５時間〜終夜程度、室温で静置し、3000〜5000 rpm
で５〜２０分間遠心し、抽出ＤＮＡを含む沈殿を得るこ
とができる。
０．５時間〜終夜程度、室温で静置し、3000〜5000 rpm
で５〜２０分間遠心し、抽出ＤＮＡを含む沈殿を得るこ
とができる。
【００５０】このように、本発明の方法は、大豆加工食
品からのＤＮＡの抽出に、例えば、塩化ナトリウムを除
いたCTABのような界面活性剤含有抽出バッファーを添
加、混合し、混合液を水酸化ナトリウム溶液等のアルカ
リｐＨ調整剤を用いて混合液のpHを中性及び弱アルカリ
性にさせ（ｐＨ６．５〜９．５）（又は更に、塩濃度を
調整し、）、ＤＮＡを溶解させた後、該液に有機溶媒を
加えて混合させた後、水層と有機溶媒層を分離し洗浄
後、得られた水層に、この溶液中の塩濃度を下げるため
のCTAB等の界面活性剤含有沈殿用バッファーを加えてＤ
ＮＡを沈殿させる。
品からのＤＮＡの抽出に、例えば、塩化ナトリウムを除
いたCTABのような界面活性剤含有抽出バッファーを添
加、混合し、混合液を水酸化ナトリウム溶液等のアルカ
リｐＨ調整剤を用いて混合液のpHを中性及び弱アルカリ
性にさせ（ｐＨ６．５〜９．５）（又は更に、塩濃度を
調整し、）、ＤＮＡを溶解させた後、該液に有機溶媒を
加えて混合させた後、水層と有機溶媒層を分離し洗浄
後、得られた水層に、この溶液中の塩濃度を下げるため
のCTAB等の界面活性剤含有沈殿用バッファーを加えてＤ
ＮＡを沈殿させる。
【００５１】(d)得られた抽出ＤＮＡを含む沈殿を、よ
り純度を高めるため精製してもよい。例えば、イオン交
換カラムの使用、もしくはエタノール、イソプロパノー
ル沈殿、密度勾配法などの精製工程、及びこれらを組み
合わせた工程を経て、純度の高いＤＮＡを得ることがで
きる。
り純度を高めるため精製してもよい。例えば、イオン交
換カラムの使用、もしくはエタノール、イソプロパノー
ル沈殿、密度勾配法などの精製工程、及びこれらを組み
合わせた工程を経て、純度の高いＤＮＡを得ることがで
きる。
【００５２】このようにして得られたＤＮＡをＰＣＲを
行うことによって、遺伝子組換え体を含有するかどうか
検出することができる。このＰＣＲの方法は、常法に従
い、行うことができる（例えば、1999. 農林水産消費技
術センター調査研究報告 23:9-16、1999. 食衛誌40:149
-157）。
行うことによって、遺伝子組換え体を含有するかどうか
検出することができる。このＰＣＲの方法は、常法に従
い、行うことができる（例えば、1999. 農林水産消費技
術センター調査研究報告 23:9-16、1999. 食衛誌40:149
-157）。
【００５３】本発明は、上記抽出方法を行うためのキッ
トも提供するものである。具体的には、上記(a)工程で
開示した(1)界面活性剤を含むＤＮＡ抽出用バッファ
ー、(2)ｐＨ調整液、及び(c)工程で開示した(3)ＤＮＡ
沈殿用溶液を含むキットを提供する。また、(1)界面活
性剤を含むＤＮＡ抽出用バッファーが、NaClを含まない
NaClフリーのバッファーでもよい。
トも提供するものである。具体的には、上記(a)工程で
開示した(1)界面活性剤を含むＤＮＡ抽出用バッファ
ー、(2)ｐＨ調整液、及び(c)工程で開示した(3)ＤＮＡ
沈殿用溶液を含むキットを提供する。また、(1)界面活
性剤を含むＤＮＡ抽出用バッファーが、NaClを含まない
NaClフリーのバッファーでもよい。
【００５４】更に、本発明のキットは(a)工程で開示し
た塩調整液を含んでいてもよい。
た塩調整液を含んでいてもよい。
【００５５】
【発明の効果】本発明の方法によれば、従来困難とされ
てきたＤＮＡ量が少ない、味噌、醤油、納豆、大豆油、
大豆蛋白を使用した２次加工品などの大豆加工食品か
ら、ＰＣＲ法に用いるのに十分な量の大豆ＤＮＡを、簡
便で且つ効率に抽出できる。
てきたＤＮＡ量が少ない、味噌、醤油、納豆、大豆油、
大豆蛋白を使用した２次加工品などの大豆加工食品か
ら、ＰＣＲ法に用いるのに十分な量の大豆ＤＮＡを、簡
便で且つ効率に抽出できる。
【００５６】
【実施例】以下、実施例を用いて本発明を説明するが、
これらに限定されるものではない。
これらに限定されるものではない。
【００５７】実施例１及び比較例１（生みそを用いた試
験） ＤＮＡ抽出試料として市販の生みそを用いた。 ０．７Ｍ塩化ナトリウム含有ＤＮＡ抽出用バッファー
(1w/v% CTAB(セチルトリメチルアンモニウムブロミド),
0.7M 塩化ナトリウム, 10mM EDTA(pH8.0), 1 w/v% メ
ルカプトエタノール, 50mM トリス-塩酸緩衝液(pH8.0))
（比較例１）又は 塩化ナトリウムフリーＤＮＡ抽出用バッファー(1 w/v
% CTAB, 10mM EDTA(pH8.0), 1 w/v% メルカプトエタノ
ール, 50mM トリス-塩酸緩衝液(pH8.0))（実施例１）の
2種類のＤＮＡ抽出用バッファーを用いて、生みそから
大豆ＤＮＡの抽出を行った。
験） ＤＮＡ抽出試料として市販の生みそを用いた。 ０．７Ｍ塩化ナトリウム含有ＤＮＡ抽出用バッファー
(1w/v% CTAB(セチルトリメチルアンモニウムブロミド),
0.7M 塩化ナトリウム, 10mM EDTA(pH8.0), 1 w/v% メ
ルカプトエタノール, 50mM トリス-塩酸緩衝液(pH8.0))
（比較例１）又は 塩化ナトリウムフリーＤＮＡ抽出用バッファー(1 w/v
% CTAB, 10mM EDTA(pH8.0), 1 w/v% メルカプトエタノ
ール, 50mM トリス-塩酸緩衝液(pH8.0))（実施例１）の
2種類のＤＮＡ抽出用バッファーを用いて、生みそから
大豆ＤＮＡの抽出を行った。
【００５８】生みそ各40gを10gずつ50ml遠沈管4本に分
取し、各遠沈管毎に上記各バッファーを21ml加え、十分
溶解させた。pHメーターにて、pHが8.0になるように、1
0Ｎの水酸化ナトリウムを加えて調整した。このときの
塩濃度はそれぞれ1.19M（比較例１），0.74M（実施
例１）であった。これを55℃の湯浴で30分間加熱した。
取し、各遠沈管毎に上記各バッファーを21ml加え、十分
溶解させた。pHメーターにて、pHが8.0になるように、1
0Ｎの水酸化ナトリウムを加えて調整した。このときの
塩濃度はそれぞれ1.19M（比較例１），0.74M（実施
例１）であった。これを55℃の湯浴で30分間加熱した。
【００５９】加熱終了後、各遠沈管毎に、クロロホルム
溶液(クロロホルム：イソアミルアルコール=24:1)を21m
l加え、室温で15分間穏やかに混合した後、3000回転で2
0分間遠心分離を行い、水層を回収した。沈殿物とクロ
ロホルム層の残った遠沈管に、共に、１本あたり7m
lの０．７Ｍ塩化ナトリウム含有ＤＮＡ抽出用バッファ
ーを加え、再び室温で15分間穏やかに混合した後、3000
回転で20分間遠心分離を行い、水層を回収し、先ほど回
収した水層に合わせた。
溶液(クロロホルム：イソアミルアルコール=24:1)を21m
l加え、室温で15分間穏やかに混合した後、3000回転で2
0分間遠心分離を行い、水層を回収した。沈殿物とクロ
ロホルム層の残った遠沈管に、共に、１本あたり7m
lの０．７Ｍ塩化ナトリウム含有ＤＮＡ抽出用バッファ
ーを加え、再び室温で15分間穏やかに混合した後、3000
回転で20分間遠心分離を行い、水層を回収し、先ほど回
収した水層に合わせた。
【００６０】この水層を新たな50ml遠沈管に入れ、1/10
容のCTAB含有補助溶液(10% CTAB, 0.7M 塩化ナトリウ
ム)を加えて撹拌した。さらに等量のクロロホルム溶液
を加えて室温で15分間穏やかに混合した後、3000回転で
20分間遠心分離を行い、水層を回収した。
容のCTAB含有補助溶液(10% CTAB, 0.7M 塩化ナトリウ
ム)を加えて撹拌した。さらに等量のクロロホルム溶液
を加えて室温で15分間穏やかに混合した後、3000回転で
20分間遠心分離を行い、水層を回収した。
【００６１】次に、回収した水層を集め、新たな50ml遠
沈管に各々入れ、等容量のＤＮＡ沈殿用バッファー(1w/
v% CTAB, 10mM EDTA(pH8.0), 50mM トリス-塩酸緩衝液
(pH8.0))を加えた。30分室温で放置したあと、3000回転
で10分間遠心分離を行い、水層を捨て、抽出ＤＮＡを含
む白褐色の沈殿を得た。
沈管に各々入れ、等容量のＤＮＡ沈殿用バッファー(1w/
v% CTAB, 10mM EDTA(pH8.0), 50mM トリス-塩酸緩衝液
(pH8.0))を加えた。30分室温で放置したあと、3000回転
で10分間遠心分離を行い、水層を捨て、抽出ＤＮＡを含
む白褐色の沈殿を得た。
【００６２】この各沈殿をＤＮＡ精製キット(CLONTECH
NucleoSpin Plant Kit)に供し、精製ＤＮＡ溶液100μL
を得た。
NucleoSpin Plant Kit)に供し、精製ＤＮＡ溶液100μL
を得た。
【００６３】このＤＮＡ溶液を蒸留水にて50倍希釈を行
い、200-300nmの紫外吸収スペクトルを測定したとこ
ろ、ではＤＮＡに特有なスペクトルははっきりと見ら
れなかったのに対し（比較例１、図１）、では260nm
付近にピークを持つＤＮＡに特有なスペクトルを検出す
ることが出来た（実施例１、図２）。
い、200-300nmの紫外吸収スペクトルを測定したとこ
ろ、ではＤＮＡに特有なスペクトルははっきりと見ら
れなかったのに対し（比較例１、図１）、では260nm
付近にピークを持つＤＮＡに特有なスペクトルを検出す
ることが出来た（実施例１、図２）。
【００６４】実施例２〜４及び比較例２（粉末みそを用
いた試験） ＤＮＡ抽出試料として、スナック麺に使用するスープの
原料となる粉末味噌を用いた。実施例２〜４及び比較例
２において、各々粉末みそ10gを5gずつ50ml遠沈管2本に
分取し、各遠沈管毎に ０．７Ｍ塩化ナトリウム含有ＤＮＡ抽出用バッファー
(1w/v% CTAB(セチルトリメチルアンモニウムブロミド),
0.7M 塩化ナトリウム, 10mM EDTA(pH8.0), 1w/v% メル
カプトエタノール, 50mM トリス-塩酸緩衝液(pH8.0))21
ml（比較例２）、 塩化ナトリウムフリーＤＮＡ抽出用バッファー(1w/v%
CTAB, 10mM EDTA(pH8.0), 1w/v% メルカプトエタノー
ル, 50mM トリス-塩酸緩衝液(pH8.0))21mlに塩化ナトリ
ウム0．39gを加えたもの（実施例２）、 、塩化ナトリウムフリーＤＮＡ抽出用バッファー21
ml（各々実施例３及び４）をそれぞれ加え、よく溶解さ
せた。
いた試験） ＤＮＡ抽出試料として、スナック麺に使用するスープの
原料となる粉末味噌を用いた。実施例２〜４及び比較例
２において、各々粉末みそ10gを5gずつ50ml遠沈管2本に
分取し、各遠沈管毎に ０．７Ｍ塩化ナトリウム含有ＤＮＡ抽出用バッファー
(1w/v% CTAB(セチルトリメチルアンモニウムブロミド),
0.7M 塩化ナトリウム, 10mM EDTA(pH8.0), 1w/v% メル
カプトエタノール, 50mM トリス-塩酸緩衝液(pH8.0))21
ml（比較例２）、 塩化ナトリウムフリーＤＮＡ抽出用バッファー(1w/v%
CTAB, 10mM EDTA(pH8.0), 1w/v% メルカプトエタノー
ル, 50mM トリス-塩酸緩衝液(pH8.0))21mlに塩化ナトリ
ウム0．39gを加えたもの（実施例２）、 、塩化ナトリウムフリーＤＮＡ抽出用バッファー21
ml（各々実施例３及び４）をそれぞれ加え、よく溶解さ
せた。
【００６５】pHメーターにてpHが8.0になるように10Ｎ
の水酸化ナトリウムを加えて調整した。このときの塩濃
度はそれぞれ 1.4M、 1.0M、 及び0.7Mであった。これを55℃の湯浴で30分間加熱
した。
の水酸化ナトリウムを加えて調整した。このときの塩濃
度はそれぞれ 1.4M、 1.0M、 及び0.7Mであった。これを55℃の湯浴で30分間加熱
した。
【００６６】加熱終了後、各遠沈管毎に、クロロホルム
溶液(クロロホルム：イソアミルアルコール=24:1)を21m
l加え、室温で15分間穏やかに混合した後、3000回転で2
0分間遠心分離を行い、水層を回収した。沈殿物とクロ
ロホルム層の残った遠沈管に、〜共に１本あたり7m
lの０．７Ｍ塩化ナトリウム含有ＤＮＡ抽出用バッファ
ーを加え、再び室温で15分間穏やかに混合した後、3000
回転で20分間遠心分離を行い、水層を回収し、先ほど回
収した水層に合わせた。
溶液(クロロホルム：イソアミルアルコール=24:1)を21m
l加え、室温で15分間穏やかに混合した後、3000回転で2
0分間遠心分離を行い、水層を回収した。沈殿物とクロ
ロホルム層の残った遠沈管に、〜共に１本あたり7m
lの０．７Ｍ塩化ナトリウム含有ＤＮＡ抽出用バッファ
ーを加え、再び室温で15分間穏やかに混合した後、3000
回転で20分間遠心分離を行い、水層を回収し、先ほど回
収した水層に合わせた。
【００６７】この水層を新たな50ml遠沈管に入れ、1/10
容のCTAB含有補助溶液(10w/v% CTAB, 0.7M 塩化ナトリ
ウム)を加えて撹拌した。さらに等量のクロロホルム溶
液を加えて室温で15分間穏やかに混合した後，3000回転
で20分間遠心分離を行い、水層を回収した。
容のCTAB含有補助溶液(10w/v% CTAB, 0.7M 塩化ナトリ
ウム)を加えて撹拌した。さらに等量のクロロホルム溶
液を加えて室温で15分間穏やかに混合した後，3000回転
で20分間遠心分離を行い、水層を回収した。
【００６８】次に、回収した水層を新たな50ml遠沈管に
入れ、〜は等量のＤＮＡ沈殿用バッファー(1w/v% C
TAB, 10mM EDTA(pH8.0), 50mM トリス-塩酸緩衝液(pH8.
0))を、は3倍量のＤＮＡ沈殿用バッファーを加えた。
30分室温で放置したあと、3000回転で10分間遠心分離を
行い、水層を捨て、抽出ＤＮＡを含む白褐色の沈殿を得
た。
入れ、〜は等量のＤＮＡ沈殿用バッファー(1w/v% C
TAB, 10mM EDTA(pH8.0), 50mM トリス-塩酸緩衝液(pH8.
0))を、は3倍量のＤＮＡ沈殿用バッファーを加えた。
30分室温で放置したあと、3000回転で10分間遠心分離を
行い、水層を捨て、抽出ＤＮＡを含む白褐色の沈殿を得
た。
【００６９】この各沈殿をＤＮＡ精製キット(CLONTECH
NucleoSpin Plant Kit)に供し、精製ＤＮＡ溶液100μl
を得た。この溶液中のＤＮＡ濃度を260nmの吸光度を元
にして計算したところ、が0.75μg/100μl、が2.0
μg/100μl、が2.0μg/100μl、が9.0μg/100μlと
なり、〜、特にで多くのＤＮＡを回収することが
出来た。
NucleoSpin Plant Kit)に供し、精製ＤＮＡ溶液100μl
を得た。この溶液中のＤＮＡ濃度を260nmの吸光度を元
にして計算したところ、が0.75μg/100μl、が2.0
μg/100μl、が2.0μg/100μl、が9.0μg/100μlと
なり、〜、特にで多くのＤＮＡを回収することが
出来た。
【００７０】また溶液各1μlを、大豆由来遺伝子大豆ア
クチンを増幅するプライマーセットを用いてポリメラー
ゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を行い、電気泳動にて確認したとこ
ろ、と比較し、〜でははっきりと増幅バンドを確
認することが出来た。
クチンを増幅するプライマーセットを用いてポリメラー
ゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を行い、電気泳動にて確認したとこ
ろ、と比較し、〜でははっきりと増幅バンドを確
認することが出来た。
【００７１】即ち、大豆アクチン及び遺伝子組換え大豆
に含まれるアグロバクテリウム由来の組換え遺伝子CP4
EPSPS(5-enol-pyruvylshikimate-3-phosphate synthas
e)を標的としてポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を行い、
実施例２〜４及び比較例２にて得られたＤＮＡ溶液中の
組換え体由来ＤＮＡの検出を試みた。分析にはＰＣＲSc
reening Kit for GM Soybean Ver.2.0(宝酒造社製)を使
用した。プライマーはキットに含まれる、大豆アクチン
内の225bp及びCP4 EPSPS内の570bpを増幅するように設
計されたものを用いた。また鋳型として上記ＤＮＡ溶液
各1μLを用いた。反応は全量を50μLとし、94℃、2分間
の処理を行った後、94℃、30秒間、60℃、30秒間、72
℃、1分間を40サイクル実施し、増幅を行った。なおＰ
ＣＲはGeneAmp ＰＣＲ System 9700(PE Biosystems社
製)で実施した。
に含まれるアグロバクテリウム由来の組換え遺伝子CP4
EPSPS(5-enol-pyruvylshikimate-3-phosphate synthas
e)を標的としてポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を行い、
実施例２〜４及び比較例２にて得られたＤＮＡ溶液中の
組換え体由来ＤＮＡの検出を試みた。分析にはＰＣＲSc
reening Kit for GM Soybean Ver.2.0(宝酒造社製)を使
用した。プライマーはキットに含まれる、大豆アクチン
内の225bp及びCP4 EPSPS内の570bpを増幅するように設
計されたものを用いた。また鋳型として上記ＤＮＡ溶液
各1μLを用いた。反応は全量を50μLとし、94℃、2分間
の処理を行った後、94℃、30秒間、60℃、30秒間、72
℃、1分間を40サイクル実施し、増幅を行った。なおＰ
ＣＲはGeneAmp ＰＣＲ System 9700(PE Biosystems社
製)で実施した。
【００７２】反応液のうち8μLをアガロースゲル電気泳
動に供し、エチジウムブロミド染色後、写真撮影した結
果を図３に示す。図中、レーン1、8はバクテリオファー
ジφX174am3ＤＮＡのHincII消化物からなる分子量マー
カー、レーン2は遺伝子組換え大豆から抽出精製したＤ
ＮＡの225bp及び570bpのＰＣＲ増幅産物の泳動パター
ン、レーン3は非遺伝子組換え大豆から抽出精製したＤ
ＮＡの225bpのＰＣＲ増幅産物の泳動パターン、レーン4
はの抽出用バッファーを用いて粉末みそから抽出精製
したＤＮＡのＰＣＲ増幅産物の泳動パターン(比較例
２)、レーン5、6はそれぞれ、のように混合液中の
塩濃度を1.0M、0.7Mに調整した抽出用バッファーを用い
て粉末みそから抽出精製したＤＮＡのＰＣＲ増幅産物の
泳動パターン(実施例２及び３)、レーン7は混合液中の
塩濃度を0.7Mに調整した抽出バッファーを用い、ＤＮＡ
沈殿時の塩濃度を0.175Mに調整した、ＤＮＡのＰＣＲ増
幅産物の泳動パターン(実施例４)を示す。比較例２に対
して実施例２〜４でははっきりと増幅バンドを確認する
ことが出来た。
動に供し、エチジウムブロミド染色後、写真撮影した結
果を図３に示す。図中、レーン1、8はバクテリオファー
ジφX174am3ＤＮＡのHincII消化物からなる分子量マー
カー、レーン2は遺伝子組換え大豆から抽出精製したＤ
ＮＡの225bp及び570bpのＰＣＲ増幅産物の泳動パター
ン、レーン3は非遺伝子組換え大豆から抽出精製したＤ
ＮＡの225bpのＰＣＲ増幅産物の泳動パターン、レーン4
はの抽出用バッファーを用いて粉末みそから抽出精製
したＤＮＡのＰＣＲ増幅産物の泳動パターン(比較例
２)、レーン5、6はそれぞれ、のように混合液中の
塩濃度を1.0M、0.7Mに調整した抽出用バッファーを用い
て粉末みそから抽出精製したＤＮＡのＰＣＲ増幅産物の
泳動パターン(実施例２及び３)、レーン7は混合液中の
塩濃度を0.7Mに調整した抽出バッファーを用い、ＤＮＡ
沈殿時の塩濃度を0.175Mに調整した、ＤＮＡのＰＣＲ増
幅産物の泳動パターン(実施例４)を示す。比較例２に対
して実施例２〜４でははっきりと増幅バンドを確認する
ことが出来た。
【００７３】実施例５〜７及び比較例３（粉末みそを用
いた試験） ＤＮＡ抽出試料としてスナック麺に使用するスープの原
料となる粉末味噌を用いた。実施例５〜７及び比較例３
について、各々粉末みそ10gを5gずつ50ml遠沈管2本に分
取したものを4組用意し、各遠沈管毎に塩化ナトリウム
フリーＤＮＡ抽出用バッファー(1w/v% CTAB, 10mM EDTA
(pH8.0), 1w/v% メルカプトエタノール,50mM トリス-塩
酸緩衝液(pH8.0))21mlをそれぞれ加え、よく溶解させ
た。
いた試験） ＤＮＡ抽出試料としてスナック麺に使用するスープの原
料となる粉末味噌を用いた。実施例５〜７及び比較例３
について、各々粉末みそ10gを5gずつ50ml遠沈管2本に分
取したものを4組用意し、各遠沈管毎に塩化ナトリウム
フリーＤＮＡ抽出用バッファー(1w/v% CTAB, 10mM EDTA
(pH8.0), 1w/v% メルカプトエタノール,50mM トリス-塩
酸緩衝液(pH8.0))21mlをそれぞれ加え、よく溶解させ
た。
【００７４】溶解後、pH未調整のもの（比較例３）、
及びpHメーターにてpHがそれぞれ7.0（実施例５）、
8.0（実施例６）、9.0（実施例７）になるように10
Ｎの水酸化ナトリウムを加えて調整したものを使用し
た。これを55℃の湯浴で30分間加熱した。
及びpHメーターにてpHがそれぞれ7.0（実施例５）、
8.0（実施例６）、9.0（実施例７）になるように10
Ｎの水酸化ナトリウムを加えて調整したものを使用し
た。これを55℃の湯浴で30分間加熱した。
【００７５】加熱終了後、各遠沈管毎にクロロホルム溶
液(クロロホルム：イソアミルアルコール=24:1)を21ml
加え室温で15分間穏やかに混合した後、3000回転で20分
間遠心分離を行い、水層を回収した。沈殿物とクロロホ
ルム層の残った遠沈管に、〜共に１本あたり7mlの
比較例１で使用した０．７Ｍ塩化ナトリウム含有ＤＮＡ
抽出用バッファーを加え、再び室温で15分間穏やかに混
合した後、3000回転で20分間遠心分離を行い、水層を回
収し、先ほど回収した水層に合わせた。この水層を新た
な50ml遠沈管に入れ、1/10容のCTAB含有補助溶液(10w/v
% CTAB, 0.7M塩化ナトリウム)を加えて撹拌した。さら
に等量のクロロホルム溶液を加えて室温で15分間穏やか
に混合した後、3000回転で20分間遠心分離を行い、水層
を回収した。
液(クロロホルム：イソアミルアルコール=24:1)を21ml
加え室温で15分間穏やかに混合した後、3000回転で20分
間遠心分離を行い、水層を回収した。沈殿物とクロロホ
ルム層の残った遠沈管に、〜共に１本あたり7mlの
比較例１で使用した０．７Ｍ塩化ナトリウム含有ＤＮＡ
抽出用バッファーを加え、再び室温で15分間穏やかに混
合した後、3000回転で20分間遠心分離を行い、水層を回
収し、先ほど回収した水層に合わせた。この水層を新た
な50ml遠沈管に入れ、1/10容のCTAB含有補助溶液(10w/v
% CTAB, 0.7M塩化ナトリウム)を加えて撹拌した。さら
に等量のクロロホルム溶液を加えて室温で15分間穏やか
に混合した後、3000回転で20分間遠心分離を行い、水層
を回収した。
【００７６】次に、回収した水層を新たな50ml遠沈管に
入れ、等量のＤＮＡ沈殿用バッファー(1% CTAB, 10mM E
DTA(pH8.0), 50mM トリス-塩酸緩衝液(pH8.0))を加え
た。30分室温で放置したあと、3000回転で10分間遠心分
離を行い、水層を捨て、抽出ＤＮＡを含む白褐色の沈殿
を得た。
入れ、等量のＤＮＡ沈殿用バッファー(1% CTAB, 10mM E
DTA(pH8.0), 50mM トリス-塩酸緩衝液(pH8.0))を加え
た。30分室温で放置したあと、3000回転で10分間遠心分
離を行い、水層を捨て、抽出ＤＮＡを含む白褐色の沈殿
を得た。
【００７７】この各沈殿をＤＮＡ精製キット(CLONTECH
NucleoSpin Plant Kit)に供し、精製ＤＮＡ溶液100μl
を得た。この溶液中のＤＮＡ濃度を260nmの吸光度を元
にして計算したところ、が測定限界以下、、が1.
3μg/100μl、が1.0μg/100μlとなり、〜で多く
のＤＮＡを回収することが出来た。
NucleoSpin Plant Kit)に供し、精製ＤＮＡ溶液100μl
を得た。この溶液中のＤＮＡ濃度を260nmの吸光度を元
にして計算したところ、が測定限界以下、、が1.
3μg/100μl、が1.0μg/100μlとなり、〜で多く
のＤＮＡを回収することが出来た。
【００７８】また溶液各1μlを、大豆由来遺伝子大豆ア
クチンを増幅するプライマーセットを用いてポリメラー
ゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を行い、電気泳動にて確認したとこ
ろ、と比較し、〜でははっきりと増幅バンドを確
認することが出来た。
クチンを増幅するプライマーセットを用いてポリメラー
ゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を行い、電気泳動にて確認したとこ
ろ、と比較し、〜でははっきりと増幅バンドを確
認することが出来た。
【００７９】即ち、大豆アクチン及び遺伝子組換え大豆
に含まれるアグロバクテリウム由来の組換え遺伝子CP4
EPSPS(5-enol-pyruvylshikimate-3-phosphate synthas
e)を標的としてポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を行い、
実施例５〜７及び比較例３にて得られたＤＮＡ溶液中の
組換え体由来ＤＮＡの検出を試みた。分析にはＰＣＲSc
reening Kit for GM Soybean Ver.2.0(宝酒造社製)を使
用した。プライマーはキットに含まれる、大豆アクチン
内の225bp及びCP4 EPSPS内の570bpを増幅するように設
計されたものを用いた。また鋳型として上記ＤＮＡ溶液
各1μLを用いた。反応は全量を50μLとし、94℃、2分間
の処理を行った後、94℃、30秒間、60℃、30秒間、72
℃、1分間を40サイクル実施し、増幅を行った。なおＰ
ＣＲはGeneAmp ＰＣＲ System 9700(PE Biosystems社
製)で実施した。反応液のうち8μLをアガロースゲル電
気泳動に供し、エチジウムブロミド染色後、写真撮影し
た結果を図４に示す。図中、レーン1、8はバクテリオフ
ァージφX174am3ＤＮＡのHincII消化物からなる分子量
マーカー、レーン2は遺伝子組換え大豆から抽出精製し
たＤＮＡの225bp及び570bpのＰＣＲ増幅産物の泳動パタ
ーン、レーン3は非遺伝子組換え大豆から抽出精製した
ＤＮＡの225bpのＰＣＲ増幅産物の泳動パターン、レー
ン4は溶液中のpH非調整（）にて粉末みそから抽出精
製したＤＮＡのＰＣＲ増幅産物の泳動パターン(比較例
３)、レーン5〜7はそれぞれ溶液中のpHを7.0、8.0、9.0
に調整(上記〜)を行った粉末みそから抽出精製した
ＤＮＡのＰＣＲ増幅産物の泳動パターン（実施例５、
６、７）を示す。特に、においてはっきりとした増
幅バンドを確認することが出来た。
に含まれるアグロバクテリウム由来の組換え遺伝子CP4
EPSPS(5-enol-pyruvylshikimate-3-phosphate synthas
e)を標的としてポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を行い、
実施例５〜７及び比較例３にて得られたＤＮＡ溶液中の
組換え体由来ＤＮＡの検出を試みた。分析にはＰＣＲSc
reening Kit for GM Soybean Ver.2.0(宝酒造社製)を使
用した。プライマーはキットに含まれる、大豆アクチン
内の225bp及びCP4 EPSPS内の570bpを増幅するように設
計されたものを用いた。また鋳型として上記ＤＮＡ溶液
各1μLを用いた。反応は全量を50μLとし、94℃、2分間
の処理を行った後、94℃、30秒間、60℃、30秒間、72
℃、1分間を40サイクル実施し、増幅を行った。なおＰ
ＣＲはGeneAmp ＰＣＲ System 9700(PE Biosystems社
製)で実施した。反応液のうち8μLをアガロースゲル電
気泳動に供し、エチジウムブロミド染色後、写真撮影し
た結果を図４に示す。図中、レーン1、8はバクテリオフ
ァージφX174am3ＤＮＡのHincII消化物からなる分子量
マーカー、レーン2は遺伝子組換え大豆から抽出精製し
たＤＮＡの225bp及び570bpのＰＣＲ増幅産物の泳動パタ
ーン、レーン3は非遺伝子組換え大豆から抽出精製した
ＤＮＡの225bpのＰＣＲ増幅産物の泳動パターン、レー
ン4は溶液中のpH非調整（）にて粉末みそから抽出精
製したＤＮＡのＰＣＲ増幅産物の泳動パターン(比較例
３)、レーン5〜7はそれぞれ溶液中のpHを7.0、8.0、9.0
に調整(上記〜)を行った粉末みそから抽出精製した
ＤＮＡのＰＣＲ増幅産物の泳動パターン（実施例５、
６、７）を示す。特に、においてはっきりとした増
幅バンドを確認することが出来た。
【図１】比較例１の方法によって生みそから抽出したＤ
ＮＡの 200-300nmの紫外吸収スペクトルを示す。
ＮＡの 200-300nmの紫外吸収スペクトルを示す。
【図２】実施例１の方法によって生みそから抽出したＤ
ＮＡの 200-300nmの紫外吸収スペクトルを示す。
ＮＡの 200-300nmの紫外吸収スペクトルを示す。
【図３】実施例２〜４及び比較例２により、粉末みそか
ら抽出されたＤＮＡを、大豆アクチン内の225bp及びCP4
EPSPS内の570bpを増幅するプライマーセットを用いて
行ったＰＣＲ増幅産物のアガロースゲル電気泳動パター
ンを示す写真である。
ら抽出されたＤＮＡを、大豆アクチン内の225bp及びCP4
EPSPS内の570bpを増幅するプライマーセットを用いて
行ったＰＣＲ増幅産物のアガロースゲル電気泳動パター
ンを示す写真である。
【図４】実施例５〜７及び比較例３により、粉末みそか
ら抽出されたＤＮＡを、大豆由来遺伝子大豆アクチンを
増幅するプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反
応(ＰＣＲ)を行ったＰＣＲ増幅産物のアガロースゲル電
気泳動パターンを示す写真である。
ら抽出されたＤＮＡを、大豆由来遺伝子大豆アクチンを
増幅するプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反
応(ＰＣＲ)を行ったＰＣＲ増幅産物のアガロースゲル電
気泳動パターンを示す写真である。
フロントページの続き (72)発明者 米田 幸生 大阪府大阪市淀川区西中島４丁目１番１号 日清食品株式会社内 (72)発明者 仲野 茂 大阪府大阪市淀川区西中島４丁目１番１号 日清食品株式会社内 (72)発明者 奥島 実 大阪府大阪市淀川区西中島４丁目１番１号 日清食品株式会社内 (72)発明者 山田 敏広 大阪府大阪市淀川区西中島４丁目１番１号 日清食品株式会社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA05 AA11 CA20 HA11 4B039 LB01 LG01 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ16 QQ42 QR62 QS25
Claims (8)
- 【請求項１】 大豆加工食品中に含まれる大豆ＤＮＡを
抽出する方法において、試料からＤＮＡを抽出する工程
における溶液のｐＨを、６．５〜９．５に調整する、抽
出方法。 - 【請求項２】 大豆加工食品中に含まれる大豆ＤＮＡを
抽出する方法において、試料からＤＮＡを抽出する工程
における溶液のｐＨを６．５〜９．５に調整し、且つ、
該溶液の塩濃度を０．５〜１．０Ｍに調整する、抽出方
法。 - 【請求項３】 下記工程 (a)大豆ＤＮＡを含む試料に、界面活性剤を含む溶媒を
添加、混合し、混合液のｐＨを、６．５〜９．５に調整
して、試料から大豆ＤＮＡを抽出する工程、(b)混合液
からＤＮＡ以外の不純物を除去する工程、(c)ＤＮＡを
沈殿させる工程を含むことを特徴とする大豆加工食品中
に含まれるダイズＤＮＡの抽出方法。 - 【請求項４】 下記工程 (a)大豆ＤＮＡを含む試料に、界面活性剤を含む溶媒を
添加、混合し、混合液の塩濃度を０．５〜１．０Ｍに調
整及び該混合液のｐＨを、６．５〜９．５に調整して、
試料から大豆ＤＮＡを抽出する工程、(b)混合液からＤ
ＮＡ以外の不純物を除去する工程、(c)ＤＮＡを沈殿さ
せる工程を含むことを特徴とする大豆加工食品中に含ま
れるダイズＤＮＡの抽出方法。 - 【請求項５】 大豆加工食品が、味噌又は醤油である、
請求項１〜４のいずれかに記載の抽出方法。 - 【請求項６】 請求項１〜５のいずれかに記載の抽出方
法によって得られたＤＮＡをＰＣＲを用いて遺伝子組換
え体を含有するか否かを検出する方法。 - 【請求項７】 (1)界面活性剤を含むＤＮＡ抽出用バッ
ファー、(2)ｐＨ調整液、(3)ＤＮＡ沈殿用溶液を含む大
豆加工食品中に含まれる大豆ＤＮＡ抽出用キット。 - 【請求項８】 (1)界面活性剤を含むＤＮＡ抽出用バッ
ファーが、ＮａＣｌフリーである請求項７に記載のキッ
ト。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000401323A JP2002199880A (ja) | 2000-12-28 | 2000-12-28 | 大豆加工食品中に含まれるダイズｄｎａの抽出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000401323A JP2002199880A (ja) | 2000-12-28 | 2000-12-28 | 大豆加工食品中に含まれるダイズｄｎａの抽出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002199880A true JP2002199880A (ja) | 2002-07-16 |
Family
ID=18865775
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000401323A Pending JP2002199880A (ja) | 2000-12-28 | 2000-12-28 | 大豆加工食品中に含まれるダイズｄｎａの抽出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002199880A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102242114A (zh) * | 2011-02-23 | 2011-11-16 | 中国检验检疫科学研究院 | 酱油中总dna的提取方法及应用 |
| CN115161312A (zh) * | 2021-04-06 | 2022-10-11 | 欧陆食品检测服务(大连)有限公司 | 一种食用油脂dna提取方法 |
-
2000
- 2000-12-28 JP JP2000401323A patent/JP2002199880A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102242114A (zh) * | 2011-02-23 | 2011-11-16 | 中国检验检疫科学研究院 | 酱油中总dna的提取方法及应用 |
| CN115161312A (zh) * | 2021-04-06 | 2022-10-11 | 欧陆食品检测服务(大连)有限公司 | 一种食用油脂dna提取方法 |
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