JP2002159291A

JP2002159291A - 非平衡反応場における核酸分子の重合方法

Info

Publication number: JP2002159291A
Application number: JP2000360362A
Authority: JP
Inventors: Koichiro Matsuno; 孝一郎松野
Original assignee: Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2000-11-27
Filing date: 2000-11-27
Publication date: 2002-06-04

Abstract

(57)【要約】【課題】非平衡反応場において、重合、分解を制御し
て、核酸分子の重合を可能とする。【解決手段】核酸分子の溶液を、高温・高圧状態から
低温・高圧状態に急速移行させる非平衡反応場において
重合させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この出願の発明は、非平衡反
応場における核酸分子の重合方法に関するものである。
さらに詳しくは、この出願の発明は、医薬、診断薬、そ
れらの前駆体等として有用な核酸の重合物を、所要の重
合度に制御容易として、低分子の核酸分子より重合する
ことのできる新しい技術としての非平衡反応場におる核
酸分子の重合方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術とその課題】従来より、一般の化学重合反
応では、重合性反応基を持つ有機分子を、重合触媒の存
在下やエネルギー線の照射下にて、許容された強度や圧
力という反応場においてその重合度を制御するようにし
ている。

【０００３】しかしながら、従来のいずれの場合におい
ても、この重合度を制御し、分子量分布を所定の狭い範
囲とすることは大変に難しいのが実情である。

【０００４】一方、自然界においては、深海底の熱水鉱
床のように、アミノ酸等の低分子有機化合物から生命体
を構成する重合体の生成までを可能とする、高度に制御
された反応場が形成されていることがわかる。

【０００５】そこで近年では、この熱水鉱床のような自
然界の反応場に着目した研究が進められてきてもいる。

【０００６】しかしながら、このような自然界の模倣に
よる反応場の形成は容易ではなく、実際的に、新しい技
術としての発展の可能性を有している研究はほとんど見
出せない状況にある。

【０００７】そこで、この出願の発明者らは、自然界の
知恵をより実際的に人為的に再構成するとの観点から検
討を進めてきた。そして、アミノ酸等の低分子有機化合
物を、より高度に制御された重合体へと変換することの
できる新しい技術手段を提供することを課題としてき
た。

【０００８】このような背景から、この出願の発明者
は、前記のとおりの課題を解決するものとして、高温・
高圧部と低温・高圧部とをこの両部の循環路とともに備
えた液相重合反応用のフローリアクターであって、重合
させるべき有機反応分子を含む反応液を高温・高圧部か
ら低温・高圧部に循環路を介して噴出させ、高温・高圧
部で生成された重合物の分解を低温・高圧部において抑
え、重合物を循環路を介して再度高温・高圧部に送り込
み、さらに重合を生じさせるという循環を繰り返すこと
からなる非平衡開放型フローリアクターを提案した（特
開２０００−２２５３３０）。

【０００９】そしてまた、この出願の発明者は、この非
平衡開放型フローリアクターについて、循環路には、低
温・高圧部の下流側に低温・低圧部が配置されているも
のとすること、循環路には、低温・高圧部の下流側に、
低温・低圧部と低温・高圧部とが順次に配置されている
ものとすること、低温・低圧部には、重合物の取出し路
が設けられているものとすること、低温・低圧部には、
重合させるべき有機反応分子の供給路が設けられている
ものとすること、さらに、高温・高圧部と低温・高圧部
とを接続する循環路は、その径の大きさが可変とされ
て、低温・高圧部での冷却速度が制御可能とされている
ものとすること等をその態様として提案した。

【００１０】すなわち、以上のとおりの提案は、定常的
に温度勾配が実現されている非平衡条件下で、エネルギ
ーの注入（高温側）とエネルギーの放出（低温側）が同
時に外部に開かれてなされているという開放系の反応場
を実現するものである。このような非平衡開放系の反応
場を構成することによって、重合物の生成と、生成した
重合物の分解とを制御容易として、アミノ酸等の有機分
子の所定の重合物を効果的に生成させるための展望を拓
くものである。

【００１１】だが、発明者にとっては、全く新しい非平
衡反応場での合成反応方法として画期的であるものの、
その適用可能とされる有機分子とその重合物についての
検討には多くの課題があった。特に、この出願の発明者
にとっては、生体を構成し、かつ医薬等として生体に深
く関係する核酸分子については、前記の非平衡反応場で
の重合が可能であるかどうか、その反応はどのように制
御され得るのかは極めて大きな課題であった。

【００１２】

【課題を解決するための手段】この出願の発明は、以上
の経緯よりなされたものであって、第１には、核酸分子
の溶液を、高温・高圧状態から低温・高圧状態に急速移
行させる非平衡反応場において重合させることを特徴と
する非平衡反応場における核酸分子の重合方法を提供す
る。

【００１３】そして、第２には、高温・高圧状態での温
度を１００℃以上１２０℃未満とすることを特徴とする
非平衡反応場における核酸分子の重合方法を提供する。

【００１４】さらに、この出願の発明は、第３には、前
記のとおりのこの出願の発明者がすでに提案している非
平衡型フローリアクターを用いて非平衡反応場とする方
法を提供する。

【００１５】

【発明の実施の形態】この出願の発明は、以上の特徴を
もつものであるが、次にその実施の形態について説明す
る。

【００１６】この発明の非平衡反応場における核酸の重
合方法は、低分子量の核酸分子の溶液を、高温・高圧状
態から低温・高圧状態に急速移行させることにより実現
されることになる。

【００１７】対象とする核酸分子については、いわゆる
「核酸」としての生体高分子を構成する基本単位として
のヌクレオチド、あるいはその誘導体としての低分子量
の各種の分子である。

【００１８】この発明では、核酸分子は溶液に溶解され
て高温・高圧状態から低温・高圧状態に急速に移行され
るが、溶液のための溶媒としては、水、あるいは水性溶
媒が好ましいものとして挙げられる。

【００１９】核酸分子の重合では、高温・高圧状態での
温度については、圧力条件との関係が考慮されるが、高
温・高圧状態並びに低温・高圧状態のいずれの場合も圧
力を５ＭＰａ以上、さらには１０ＭＰａ以上３０ＭＰａ
以下とする場合には、高温状態での温度は、１００℃以
上１２０℃未満とするのが好ましい。低温・高圧状態で
の温度は、室温以下、つまり、２５℃以下とすることが
考慮される。

【００２０】この出願の発明では、圧力条件を一定ない
しほぼ一定とすることで、高温状態と低温状態の温度差
だけで、重合反応における分子重合の切断と接合が制御
できるという大きな特徴を有している。

【００２１】高温・高圧状態から低温・高圧状態への急
速移行は各種の手段として実現されてよく、たとえば、
高温・高圧反応部から区分された低温・高圧反応部に核
酸分子の溶液を噴出させることによっても実現される。

【００２２】この出願の発明者がすでに提案している非
平衡開放型フローリアクターはこのような方法のための
代表的な手段として有用である。

【００２３】すなわち、この非平衡開放型のフローリア
クターの構成をたとえば図１に示した側に沿って説明す
ると、高温・高圧部（Ａ）と低温・高圧部（Ｂ）とを、
この両部の循環路（Ｃ）とともに備えている。

【００２４】この構成において、重合させるべき核酸分
子を含む反応液を高温・高圧部（Ａ）から低温・高圧部
（Ｂ）に循環路（Ｃ）を介して噴出させる。高温・高圧
部（Ａ）で生成された重合物の分解を低温・高圧部
（Ｂ）において抑え、重合物を循環路（Ｃ２）を介して
再度高温・高圧部（Ａ）に送り込み、さらに重合を生じ
させるという循環を繰り返すことができるようにしてい
る。高温・高圧部（Ａ）と低温・高圧部（Ｂ）とによっ
て、定常的な温度勾配が実現されて非平衡な状態場とな
る。

【００２５】そして、この図１の例においては、高温・
高圧部（Ａ）のチャンバーは、電気炉（Ｅ）等の加熱手
段によって加熱され、また、低温・高圧上張り層（Ｂ）
のチャンバーは、たとえば冷却槽（Ｆ）中において冷却
水により冷却されるようになっている。熱エネルギーの
注入（高温側）とエネルギーの放出（低温側）が同時に
進行し、外部の高温熱源としての電気炉（Ｅ）と低温熱
浴としての冷却槽（Ｆ）に接していること、つまり外部
に対して開かれていることで開放系が実現されている。
また、前記の循環炉（Ｃ２）には、たとえば減圧ニード
ルチューブ（Ｃ２１）介して、低温・高圧部（Ｂ）の下
流側に、低温・低圧部（Ｄ）が連結配置され、この低温
・低圧部（Ｄ）には、重合物の取出し路（Ｇ）が接続さ
れている。

【００２６】さらにまた、循環路（Ｃ２）には、たとえ
ば低温・高圧部（Ｈ）としての無脈流ポンプ（Ｐ）と安
全装置付圧力計（Ｉ）等が配置されてもいる。

【００２７】たとえば以上のとおりの図１の例のリアク
ターにおいては、図示することは省略しているが、初期
の核酸分子、つまり原料物質としての、あるいは合成中
間体としての低分子の核酸分子もしくはその誘導体等の
分子を、低温・低圧部（Ｄ）に供給する。この場合、こ
れらの核酸分子は、前記のとおり液状のものとして、溶
媒に溶解したものとして供給する。次いで、供給された
核酸分子を含む反応液は、加圧のためのポンプ（Ｐ）を
経由させるために低温・高圧部に送り込む。加圧された
反応液は、たとえば予備加熱部（Ｊ）を経由して高温・
高圧部（Ａ）へと導くことができる。

【００２８】高温・高圧部（Ａ）では、有機分子の重合
と分解の反応が同時に進行するが、反応液がそこに滞在
する時間を制御することにより、高温部での分解をある
範囲、もしくは程度にあらかじめ制御することができ
る。

【００２９】反応によって生成した核酸分子重合物を含
有する反応液は、前記の循環路（Ｃ１）を介して、低温
・高圧部（Ｂ）に噴出させることになる。この際に、噴
出された生成重合物は、その周囲環境が冷却による低温
であるため、生成重合物の熱分解が抑制され、この抑制
を受けた重合物が、この低温・高圧部（Ｂ）に保持され
る。

【００３０】高温・高圧部（Ａ）から低温・高圧部
（Ｂ）への噴出は、循環路（Ｃ１）を介して行われる
が、この場合、循環路（Ｃ１）は径の細いノズル形状、
もしくはノズル構造として考慮することができる。そし
て、このノズル形状、もしくはノズル構造の循環路（Ｃ
１）においては、その径を可変とすることによって、低
温・高圧部での冷却速度を制御することが可能となる。
径を小さくすればするほど、冷却速度を増大させること
ができる。このような冷却速度の制御のために、高温・
高圧部（Ａ）の出口近傍には、測温部（Ｋ）を配置して
おいてもよい。

【００３１】たとえば以上のような循環路（Ｃ１）の構
成により、高温において分解速度の大きな重合物を目的
物として得ようとする場合には、低温・高圧部（Ｂ）で
の冷却速度をこの分解速度により大きくなるように設定
すればよい。

【００３２】生成した核酸分子の重合物を含んだ反応液
は、以上の低温・高圧部から、たとえば減圧ニードルチ
ューブ（Ｃ２１）等の減圧手段を介して減圧されて低温
・低圧部（Ｄ）に送られる。重合物の一部もしくは全部
は、この低温・低圧部（Ｄ）から取出し路（Ｇ）を介し
て外部へ取出すことができる。

【００３３】残余の生成重合物は、反応液とともに前記
のとおりの低温・高圧部（Ｈ）を経由して再度高温・高
圧部（Ａ）へと循環される。ここで、生成重合物は、さ
らに反応物としての別の重合物に転化される。このよう
にして、熱エネルギーを受けることによってさらなる重
合反応が継続して進行する。このような循環を、所要回
数繰り返すことにより、生成重合の重合度が順次増大し
て行くことになる。

【００３４】もちろん、図１はこの発明の方法における
反応装置例の一つであって、これに限定されることはな
い。

【００３５】以上の説明においては、「低温」「高
温」、そして「低圧」「高圧」についてそのレベル数値
を示していないが、これらは重合させる核酸分子の種類
と、目的とする重合物の重合度、さらには循環日数等に
応じて設定されることになる。たとえば「低圧」は常圧
条件であってよい。

【００３６】たとえば、以上のような反応装置を用いて
のこの出願の発明の核酸分子の重合方法においては、従
来核酸分子の非生物学的重合において必要とされていた
化学活性化のためイミダゾールのような活性化物質を使
用することは必須ではない。このこともこの出願の発明
の特徴である。

【００３７】ただ必要に応じてイミダゾール等の化学活
性化物質を使用してもよいし、あるいは、ヌクレチオド
結合の促進のための触媒として金属塩、たとえば亜鉛や
鉛のハロゲン化物等を溶液に添加してもよい。

【００３８】そこで以下に実施例を示し、さらに詳しく
説明する。

【００３９】

【実施例】図１の構成において、高温・高圧部（Ａ）お
よび低温・高圧部（Ｂ）、並びに循環路（Ｃ）は全てス
テンレススチール製（ＳＵＳ３１６）とした。

【００４０】高温・高圧部（Ａ）のチャンバーは容積１
５ｍｌとし、このものに、径８００μｍの循環路（Ｃ
１）ノズルチューブを介して、容積７８．５ｍｌの低温
・高圧部（Ｂ）チャンバーを接続した。また、この低温
・高圧部（Ｂ）のチャンバーは、−２０℃の冷媒を循環
させる冷却パイプを備えた容積２０ｌの水浴中に浸漬し
た。水浴中では、循環出口部の温度が０℃となるように
した。

【００４１】反応液の流速は、４．６ｍｌ／ｍｉｎと
し、高温・高圧部（Ａ）並びに低温・高圧部（Ｂ）のチ
ャンバー内圧が一定（１３ＭＰａ）となるようにした。

【００４２】原料試料として、２０ｍＭアデノシンモノ
フォスフェート（ＡＭＰ）並びに１ｍＭＺｎＣｌ₂の
水溶液を調製し、ピロリン酸の添加によってｐＨ３．０
に調製した。

【００４３】この原料試料を用いて反応を行った。

【００４４】生成物の同定には、アニオン交換ＨＰＬＣ
カラム Shodex ＩＥＣＤＥＤＡ−４２０Ｎを用いた。

【００４５】図２は、反応１時間後の生成物についての
ＨＰＬＣプロファイルを例示した図である。生成物と溶
出液は、次のとおりである。

【００４６】Ａ：２′−５′結合アデニル酸トリマー２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌＯ₄（ｐＨ９．０）Ｂ：３′−５′結合アデニル酸トリマー２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌＯ₄／２０ｍＭＮａＣｌ
Ｏ₄ Ｃ：ダイマー２０ｍＭＮａＣｌＯ₄ 次に、ＡＭＰ２０ｍＭの水溶液をピロリン酸の添加によ
ってｐＨ２．０に調整したものを用いて、同様に反応さ
せた。その経時的な重合体の生成動向を例示したもの
が、図３である。

【００４７】高温・高圧部の温度を１１０℃近辺とする
時に、３′−５′トリマーの生成が、８０分経過後にピ
ーク状態に達することが確認された。一方、１２０℃以
上の温度では、生成量は減少することも別途に確認され
ている。

【００４８】また、生成重合体については、８量体成分
まで確認されている。

【００４９】

【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この出願の
発明によって、非平衡反応場において、核酸分子を、高
度に制御された重合度の生成重合体として生成させるこ
と等を可能とする新しい重合技術手段が提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】この発明のフローリアクターの構成を例示した
概要図である。

【図２】実施例としてのＨＰＬＣプロファイルを示した
図である。

【図３】オリゴヌクレオチドの生成量を経時的に示した
図である。

【符号の説明】Ａ高温・高圧部Ｂ低温・高圧部Ｃ，Ｃ１，Ｃ２循環路Ｃ２１減圧ニードルチューブＤ低温・低圧部Ｅ電気炉Ｆ冷却槽Ｇ重合物取出し路Ｈ低温・高圧部Ｉ圧力計Ｊ予備加熱部Ｋ測温部Ｐポンプ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】核酸分子の溶液を、高温・高圧状態から
低温・高圧状態に急速移行させる非平衡反応場において
重合させることを特徴とする非平衡反応場における核酸
分子の重合方法。
【請求項２】高温・高圧状態での温度を１００℃以上
１２０℃未満とすることを特徴とする非平衡反応場にお
ける核酸分子の重合方法。
【請求項３】非平衡反応場は、高温・高圧部と低温・
高圧部とをこの両部の循環路とともに備えた液相重合反
応用のフローリアクターであって、重合させるべき核酸
分子を含む反応液を高温・高圧部から低温・高圧部に噴
出させ、生成された重合物を循環路を介して再度高温・
高圧部に送り込むという循環を繰り返すことをできるよ
うにしたことを特徴とする非平衡反応場における核酸分
子の重合方法。