JP2002153284A - 末端標識プローブアレイの製造方法、並びにそれを用いた標的物質量の評価方法 - Google Patents
末端標識プローブアレイの製造方法、並びにそれを用いた標的物質量の評価方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 プローブアレイの逐次的な合成における合
成収率の低さに起因する、標的物質を検出する際の感度
の低下、信頼性の低下を克服し、高感度で信頼性の高い
検出が可能な合成方法と検出方法を提供する。 【解決手段】 逐次合成の最終段階において、それま
での各段階の合成によって伸長されたプローブの末端に
標識化合物を結合することによって作製された末端標識
プローブアレイとその合成方法。さらに、それぞれのマ
トリクスの標識物質量を測定する、最終段階まで逐次合
成された各マトリクスのプローブの量の評価方法。
成収率の低さに起因する、標的物質を検出する際の感度
の低下、信頼性の低下を克服し、高感度で信頼性の高い
検出が可能な合成方法と検出方法を提供する。 【解決手段】 逐次合成の最終段階において、それま
での各段階の合成によって伸長されたプローブの末端に
標識化合物を結合することによって作製された末端標識
プローブアレイとその合成方法。さらに、それぞれのマ
トリクスの標識物質量を測定する、最終段階まで逐次合
成された各マトリクスのプローブの量の評価方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、標識プローブアレ
イ、該標識プローブアレイの作製方法、及び、該標識プ
ローブアレイを用いた標的物質量の評価方法に関する。
イ、該標識プローブアレイの作製方法、及び、該標識プ
ローブアレイを用いた標的物質量の評価方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、複数のプローブを基板方面にアレ
イ状に配置した、いわゆるプローブアレイを用いて標的
物質を精密に評価する方法が精力的に検討されている。
その代表的な例としてＤＮＡプローブアレイをあげるこ
とができる。ＤＮＡプローブアレイを用いることによ
り、例えば、複数の標的遺伝子の存在を塩基配列レベル
で、また、塩基配列そのものとして解析することが可能
となる。
イ状に配置した、いわゆるプローブアレイを用いて標的
物質を精密に評価する方法が精力的に検討されている。
その代表的な例としてＤＮＡプローブアレイをあげるこ
とができる。ＤＮＡプローブアレイを用いることによ
り、例えば、複数の標的遺伝子の存在を塩基配列レベル
で、また、塩基配列そのものとして解析することが可能
となる。
【０００３】プローブアレイの作製方法は大きくわける
と二つの方法がある。
と二つの方法がある。
【０００４】第一の方法は、プローブがＤＮＡ、オリゴ
ヌクレオチド、ペプチド核酸(ＰＮＡ)、蛋白質、オリゴ
ペプチドのように、ヌクレチオドやアミノ酸の配列が重
要な意味を持ち、かつ、化学的に伸長合成な物質である
場合、これらを固相アレイ基板上に逐次的に合成してい
く方法である。
ヌクレオチド、ペプチド核酸(ＰＮＡ)、蛋白質、オリゴ
ペプチドのように、ヌクレチオドやアミノ酸の配列が重
要な意味を持ち、かつ、化学的に伸長合成な物質である
場合、これらを固相アレイ基板上に逐次的に合成してい
く方法である。
【０００５】このような方法の一例として米国特許公報
５,４４５,９６６には、光分解性の保護基とフォトリソ
グラフィー法を用いた基板上でのＤＮＡプローブアレイ
の合成方法が示されている。また、他の例として米国特
許公報５,４７４,７９６にはヌクレオチドモノマーをイ
ンクジェット法により供給する方法も示されている。
５,４４５,９６６には、光分解性の保護基とフォトリソ
グラフィー法を用いた基板上でのＤＮＡプローブアレイ
の合成方法が示されている。また、他の例として米国特
許公報５,４７４,７９６にはヌクレオチドモノマーをイ
ンクジェット法により供給する方法も示されている。
【０００６】第二の方法は上述の物質の他に、化学的に
合成できない物質にも適用できるもので、予め合成、ま
たは、調製された物質をプローブアレイ基板の各マトリ
クス部位に、マイクロディスペンサー法、ピントランス
ファー法、インクジェット法等により供給する方法であ
る。
合成できない物質にも適用できるもので、予め合成、ま
たは、調製された物質をプローブアレイ基板の各マトリ
クス部位に、マイクロディスペンサー法、ピントランス
ファー法、インクジェット法等により供給する方法であ
る。
【０００７】第二の方法によれば予め精製し、量的にコ
ントロール可能なプローブを用いるので、プローブの純
度は十分確保でき、また、基板表面と反応させる濃度も
自由に決めることができる。結果として基板表面に存在
することになる各プローブ量をある程度正確に見積もる
ことができ、プローブアレイを用いる標的物質の検出の
信頼性が向上する。一方で第二の方法によればプローブ
アレイに必要な種類のプローブを全て、予め合成する必
要と、それをプローブアレイ基板へ供給、反応させる必
要がある。プローブアレイに必要なプローブの種類は、
場合により数十万種になることもあり、これらを全て、
予め合成し、基板へ供給、反応させるにはかなりの困難
をともなう。
ントロール可能なプローブを用いるので、プローブの純
度は十分確保でき、また、基板表面と反応させる濃度も
自由に決めることができる。結果として基板表面に存在
することになる各プローブ量をある程度正確に見積もる
ことができ、プローブアレイを用いる標的物質の検出の
信頼性が向上する。一方で第二の方法によればプローブ
アレイに必要な種類のプローブを全て、予め合成する必
要と、それをプローブアレイ基板へ供給、反応させる必
要がある。プローブアレイに必要なプローブの種類は、
場合により数十万種になることもあり、これらを全て、
予め合成し、基板へ供給、反応させるにはかなりの困難
をともなう。
【０００８】他方、第一の方法によれば、必要な種類の
プローブを基板上で合成し、それを標的物質との反応に
用いることができ、予め合成または調製したプローブを
基板上に固定する操作を省略できる。
プローブを基板上で合成し、それを標的物質との反応に
用いることができ、予め合成または調製したプローブを
基板上に固定する操作を省略できる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】ところが、上述した第
一の方法における検出感度や信頼性を更に向上させよう
とするには、以下のような問題がある。
一の方法における検出感度や信頼性を更に向上させよう
とするには、以下のような問題がある。
【００１０】(１)逐次合成の各段階での合成収率は 100
％ではないので、最終的な合成収率は場合によっては５
％程度になる場合がある。これは標的物質を検出する際
の感度の低下に直結する。
％ではないので、最終的な合成収率は場合によっては５
％程度になる場合がある。これは標的物質を検出する際
の感度の低下に直結する。
【００１１】(２)同様の理由で、プローブアレイの各マ
トリクスには最終的に望まれる長さのプローブの他に、
短い長さの物質が含まれることになり、これは、標的物
質の検出時の信頼性の低下の原因となる。
トリクスには最終的に望まれる長さのプローブの他に、
短い長さの物質が含まれることになり、これは、標的物
質の検出時の信頼性の低下の原因となる。
【００１２】(３)基板上で合成した結果、各マトリクス
のプローブの量を測定することができない。これも標的
物質の検出時の信頼性の低下の原因となる。
のプローブの量を測定することができない。これも標的
物質の検出時の信頼性の低下の原因となる。
【００１３】(４)上述のように、逐次合成の各段階での
合成収率は 100％ではなく、また、各段階で、また、各
マトリクス部位でばらつくので、最終的に得られる各プ
ローブの量は広い範囲でばらつくことになる。これも標
的物質の検出時の信頼性の低下の原因となる。
合成収率は 100％ではなく、また、各段階で、また、各
マトリクス部位でばらつくので、最終的に得られる各プ
ローブの量は広い範囲でばらつくことになる。これも標
的物質の検出時の信頼性の低下の原因となる。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記従来技術
の課題を解決するためになされたものである。
の課題を解決するためになされたものである。
【００１５】すなわち、プローブアレイ基板表面の複数
のマトリクス部位に、標的物質を捕捉するためのプロー
ブをその一部を固定して逐次合成する際に、該逐次合成
の最終段階において、それまでの各段階の合成によって
所望の鎖長まで伸長されたプローブの末端に標識化合物
を結合することを特徴とする末端標識プローブアレイの
合成方法についてのものである。
のマトリクス部位に、標的物質を捕捉するためのプロー
ブをその一部を固定して逐次合成する際に、該逐次合成
の最終段階において、それまでの各段階の合成によって
所望の鎖長まで伸長されたプローブの末端に標識化合物
を結合することを特徴とする末端標識プローブアレイの
合成方法についてのものである。
【００１６】また、プローブアレイ基板表面の複数のマ
トリクス部位に、標的物質を捕捉するための、それぞれ
異なるプローブが逐次合成され、逐次合成の最終段階に
おいて、それまでの各段階の合成によって所望の鎖長ま
で伸長されたプローブの末端に標識化合物が結合されて
いることを特徴とする、とりわけ前記記載の方法によっ
て作製された末端標識プローブアレイである。
トリクス部位に、標的物質を捕捉するための、それぞれ
異なるプローブが逐次合成され、逐次合成の最終段階に
おいて、それまでの各段階の合成によって所望の鎖長ま
で伸長されたプローブの末端に標識化合物が結合されて
いることを特徴とする、とりわけ前記記載の方法によっ
て作製された末端標識プローブアレイである。
【００１７】さらに、前記記載の末端標識プローブアレ
イの、それぞれのマトリクスの標識物質量を測定する、
最終段階まで逐次合成された各マトリクスのプローブの
量の評価方法である。
イの、それぞれのマトリクスの標識物質量を測定する、
最終段階まで逐次合成された各マトリクスのプローブの
量の評価方法である。
【００１８】
【発明の実施の形態】本発明では逐次合成の最終工程に
おいて、量的に測定可能な標識物質を導入することを特
徴とする。
おいて、量的に測定可能な標識物質を導入することを特
徴とする。
【００１９】本発明の逐次合成方法とは、数個から百個
程度のユニット(例えばＤＮＡであればヌクレオチド、
タンパク質であればアミノ酸残基)からなる鎖状のオリ
ゴマーを、所望のユニットを逐次的に結合合成していく
方法であって、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、
ＰＮＡそれぞれに関してすでに一般的に用いられている
手法をそのまま用いることができる。例えばＤＮＡ(オ
リゴヌクレオチド)の合成を例に挙げると、現在自動合
成機で最も一般的に用いられている方法はフォスフォロ
アミダイト法であり、以下の合成ステップよりなる。 (１)固相担体(ガラス基板等)表面にリンカーを介して結
合されている水酸基の保護基を除去する工程。 (２)所望の塩基を有する第一番目のヌクレオチドを形成
すべきアミダイトモノマーの３'側で(１)の水酸基と結
合する工程。 (３)(１)の水酸基のうち(２)の工程で未反応なものをキ
ャッピングする工程。 (４)(２)で結合したアミダイトをフォスファイトからフ
ォスフェイトへ酸化する工程。 (５)(２)で結合したアミダイトの５'側に結合した水酸
基の保護基を除去する工程。 (６)(２)から(４)の工程を所望の塩基長、塩基配列に対
して３'→５'方向へ繰り返す工程。 (７)核酸塩基の保護基を除去する工程。
程度のユニット(例えばＤＮＡであればヌクレオチド、
タンパク質であればアミノ酸残基)からなる鎖状のオリ
ゴマーを、所望のユニットを逐次的に結合合成していく
方法であって、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、
ＰＮＡそれぞれに関してすでに一般的に用いられている
手法をそのまま用いることができる。例えばＤＮＡ(オ
リゴヌクレオチド)の合成を例に挙げると、現在自動合
成機で最も一般的に用いられている方法はフォスフォロ
アミダイト法であり、以下の合成ステップよりなる。 (１)固相担体(ガラス基板等)表面にリンカーを介して結
合されている水酸基の保護基を除去する工程。 (２)所望の塩基を有する第一番目のヌクレオチドを形成
すべきアミダイトモノマーの３'側で(１)の水酸基と結
合する工程。 (３)(１)の水酸基のうち(２)の工程で未反応なものをキ
ャッピングする工程。 (４)(２)で結合したアミダイトをフォスファイトからフ
ォスフェイトへ酸化する工程。 (５)(２)で結合したアミダイトの５'側に結合した水酸
基の保護基を除去する工程。 (６)(２)から(４)の工程を所望の塩基長、塩基配列に対
して３'→５'方向へ繰り返す工程。 (７)核酸塩基の保護基を除去する工程。
【００２０】プローブに関しては特に限定されることは
ないが、核酸、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ペプチド
核酸(ＰＮＡ)、蛋白質、オリゴペプチドなどを例にあげ
ることができる。
ないが、核酸、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ペプチド
核酸(ＰＮＡ)、蛋白質、オリゴペプチドなどを例にあげ
ることができる。
【００２１】また、プローブアレイを用いる標的物質の
検出においては、標的物質を蛍光色素で標識するのが一
般的な手段として用いられているので、そのような場合
にはプローブの標識物質にも蛍光色素を用いれば、同じ
測定器を用いて検出することができ都合がよい。
検出においては、標的物質を蛍光色素で標識するのが一
般的な手段として用いられているので、そのような場合
にはプローブの標識物質にも蛍光色素を用いれば、同じ
測定器を用いて検出することができ都合がよい。
【００２２】その他の標識物質も用いることができる
が、標的物質の検出の際の妨げにならないようにその種
類を適宜選択する必要があり、そういう意味からも標的
物質に結合させた標識物質とプローブに結合させた標識
物質は異なるものであることが望ましい。
が、標的物質の検出の際の妨げにならないようにその種
類を適宜選択する必要があり、そういう意味からも標的
物質に結合させた標識物質とプローブに結合させた標識
物質は異なるものであることが望ましい。
【００２３】標識物質が共に蛍光色素である場合には、
それぞれの励起波長と、蛍光波長が異なることが望まし
く、例えば、片方がＦIＴＣで他方がローダミン、片方
がＣＹ３(アマシャムファルマシアバイオテク(株))で他
方がＣＹ５(アマシャムファルマシアバイオテク(株))な
どの例をあげることができる。
それぞれの励起波長と、蛍光波長が異なることが望まし
く、例えば、片方がＦIＴＣで他方がローダミン、片方
がＣＹ３(アマシャムファルマシアバイオテク(株))で他
方がＣＹ５(アマシャムファルマシアバイオテク(株))な
どの例をあげることができる。
【００２４】プローブの固相での逐次合成の際には、一
段伸長反応を行った後に、伸長せずに未反応のまま残っ
た反応サイト(官能基)を反応性のないものに替える処理
(キャッピング)をする。例えばＤＮＡの固相合成では反
応サイトの水酸基がアセチル化されることにより反応性
を失う。
段伸長反応を行った後に、伸長せずに未反応のまま残っ
た反応サイト(官能基)を反応性のないものに替える処理
(キャッピング)をする。例えばＤＮＡの固相合成では反
応サイトの水酸基がアセチル化されることにより反応性
を失う。
【００２５】従って本発明において標識物質が導入され
るのは最終段階（所望の鎖長）まで伸長されたプローブ
のみということになり、結果として、それぞれのマトリ
クスのプローブの標識物質の量を測定することにより、
各マトリクスのプローブの量を評価することが可能とな
る。
るのは最終段階（所望の鎖長）まで伸長されたプローブ
のみということになり、結果として、それぞれのマトリ
クスのプローブの標識物質の量を測定することにより、
各マトリクスのプローブの量を評価することが可能とな
る。
【００２６】この量的に評価されたプローブの量と、こ
れらプローブに捕捉された標的物質の標識物質の量を比
較することにより標的物質の量の測定における各プロー
ブ間の相対的補正を行うことができる。
れらプローブに捕捉された標的物質の標識物質の量を比
較することにより標的物質の量の測定における各プロー
ブ間の相対的補正を行うことができる。
【００２７】また、絶対的な標的物質の量の評価方法と
して、本発明では、逐次合成の第一段階において基板表
面の所定の位置に結合され、その後の伸長反応を行わな
いマトリクス部位の標識物質の量と、伸長反応を行なう
各マトリクス部位での最終段階において伸長合成された
プローブに結合された標識物質の量を比較し、第一段階
の反応前に形成した基板表面の官能基の量に対する各マ
トリクスのプローブ量を評価し、この量的に評価された
プローブ量と、これらプローブに捕捉された標的物質の
標識物質の量を比較することにより標的物質の量の測定
における絶対量の把握と、各プローブ間の相対的補正を
同時に行うことができる。
して、本発明では、逐次合成の第一段階において基板表
面の所定の位置に結合され、その後の伸長反応を行わな
いマトリクス部位の標識物質の量と、伸長反応を行なう
各マトリクス部位での最終段階において伸長合成された
プローブに結合された標識物質の量を比較し、第一段階
の反応前に形成した基板表面の官能基の量に対する各マ
トリクスのプローブ量を評価し、この量的に評価された
プローブ量と、これらプローブに捕捉された標的物質の
標識物質の量を比較することにより標的物質の量の測定
における絶対量の把握と、各プローブ間の相対的補正を
同時に行うことができる。
【００２８】本発明における末端標識プローブアレイを
作製する際の各操作には前記の米国特許公報のいずれに
記載の方法でもよく、他にも従来の技術を用いることが
可能である。
作製する際の各操作には前記の米国特許公報のいずれに
記載の方法でもよく、他にも従来の技術を用いることが
可能である。
【００２９】
【実施例】以下に実施例をあげて本発明を具体的に説明
する。
する。
【００３０】(実施例１) 末端標識ＤＮＡプローブアレ
イの作製 (１)合成石英基板(25.4ｍｍ×25.5ｍｍ 厚さ0.5ｍｍ)
を、超音波洗浄専用洗剤ＧＰ-II(ブランソン社製)の１
０％水溶液で２０分間超音波洗浄した。超純水で適宜洗
浄した後、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液(８０℃)に浸漬
し、同様に超純水で洗浄、乾燥し、ついで、ＵＶオゾン
処理を行い、表面を清浄化した。
イの作製 (１)合成石英基板(25.4ｍｍ×25.5ｍｍ 厚さ0.5ｍｍ)
を、超音波洗浄専用洗剤ＧＰ-II(ブランソン社製)の１
０％水溶液で２０分間超音波洗浄した。超純水で適宜洗
浄した後、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液(８０℃)に浸漬
し、同様に超純水で洗浄、乾燥し、ついで、ＵＶオゾン
処理を行い、表面を清浄化した。
【００３１】(２)次に、カーボンブラックを含有したＤ
ＥＥＰ-ＵＶレジスト(新日鉄化学株式会社 ブラックマ
トリクス用ネガ型レジスト ＢＫ-739Ｐ)を、スピンコー
ターで膜厚５μｍになるように塗布した。この基板をホ
ットプレートで８０℃で５分間加熱し硬化させた。この
レジスト膜にＤＥＥＰ-ＵＶ露光装置を使用し、１cｍ×
１cｍの領域に、100μｍ間隔で、100μｍ×100μｍの正
方形のマトリクス部位が図１のように等間隔で配置され
るパターンに対応する所定のパターンマスクを用いてプ
ロキシミティー露光し、ついで、無機アルカリ水溶液の
現像液で、スピン現像機を用いて現像し、さらに、超純
水でリンス処理し、現像液を完全に除去し、その後、ス
ピン乾燥機を用いて簡単に乾燥した後、クリーンオープ
ン中で、180℃、３０分加熱し、レジストを本硬化さ
せ、所定のレジスト膜で囲まれた基板表面からなるマト
リクス部位を 2500 個形成した。なお、本実施例で形成
した各マトリクス部位の容積は５０pLと計算される。
ＥＥＰ-ＵＶレジスト(新日鉄化学株式会社 ブラックマ
トリクス用ネガ型レジスト ＢＫ-739Ｐ)を、スピンコー
ターで膜厚５μｍになるように塗布した。この基板をホ
ットプレートで８０℃で５分間加熱し硬化させた。この
レジスト膜にＤＥＥＰ-ＵＶ露光装置を使用し、１cｍ×
１cｍの領域に、100μｍ間隔で、100μｍ×100μｍの正
方形のマトリクス部位が図１のように等間隔で配置され
るパターンに対応する所定のパターンマスクを用いてプ
ロキシミティー露光し、ついで、無機アルカリ水溶液の
現像液で、スピン現像機を用いて現像し、さらに、超純
水でリンス処理し、現像液を完全に除去し、その後、ス
ピン乾燥機を用いて簡単に乾燥した後、クリーンオープ
ン中で、180℃、３０分加熱し、レジストを本硬化さ
せ、所定のレジスト膜で囲まれた基板表面からなるマト
リクス部位を 2500 個形成した。なお、本実施例で形成
した各マトリクス部位の容積は５０pLと計算される。
【００３２】(３)エポキシ基を有するシランカップリン
グ剤(ＫＢＭ403:γ-グリシドキシプロピルトリメトキシ
シラン、信越化学工業株式会社)の１％水溶液を予め室
温で１時間攪拌し加水分解した。この溶液に前記マトリ
クス部位を形成した基板を１時間浸漬し、ついで、超純
水で適宜洗浄後、120℃で１時間加熱した。この処理に
より前記マトリクス部位にエポキシ基が結合した。この
基板をさらにヘキサエチレングリコールで処理すること
により、前記マトリクス部位にオリゴヌクレオチドを結
合するための水酸基を導入した基板を得た。
グ剤(ＫＢＭ403:γ-グリシドキシプロピルトリメトキシ
シラン、信越化学工業株式会社)の１％水溶液を予め室
温で１時間攪拌し加水分解した。この溶液に前記マトリ
クス部位を形成した基板を１時間浸漬し、ついで、超純
水で適宜洗浄後、120℃で１時間加熱した。この処理に
より前記マトリクス部位にエポキシ基が結合した。この
基板をさらにヘキサエチレングリコールで処理すること
により、前記マトリクス部位にオリゴヌクレオチドを結
合するための水酸基を導入した基板を得た。
【００３３】(４)基板上でのオリゴヌクレオチドの合成
は通常のフォスフォロアミダイト法によって行った。上
記基板を収納可能なポリプロピレン製のチャンバーを製
作し、ＤＮＡ合成機(ＡＢI社製 381Ａ)のカラム部分に
装着した。アミダイトモノマーとアクティベーター以外
の供給と、その後の洗浄、乾燥以外の合成工程は、この
自動合成機によって行った。アミダイトモノマーとアク
ティベーターの供給にはインクジェットに用いられるピ
エゾ素子を改造して用いた。インクの替わりにアミダイ
トモノマー４種とアクティベーターのアセトニトリル溶
液を用いて、装置をドライボックス(アルゴン)中で操作
して各溶液を上記基板のマトリクス部位に位置を制御し
て供給した。なお、ピエゾ素子から一度に供給される液
の量は平均的に２４pLである。
は通常のフォスフォロアミダイト法によって行った。上
記基板を収納可能なポリプロピレン製のチャンバーを製
作し、ＤＮＡ合成機(ＡＢI社製 381Ａ)のカラム部分に
装着した。アミダイトモノマーとアクティベーター以外
の供給と、その後の洗浄、乾燥以外の合成工程は、この
自動合成機によって行った。アミダイトモノマーとアク
ティベーターの供給にはインクジェットに用いられるピ
エゾ素子を改造して用いた。インクの替わりにアミダイ
トモノマー４種とアクティベーターのアセトニトリル溶
液を用いて、装置をドライボックス(アルゴン)中で操作
して各溶液を上記基板のマトリクス部位に位置を制御し
て供給した。なお、ピエゾ素子から一度に供給される液
の量は平均的に２４pLである。
【００３４】(５)基本的には 2500 すべてのマトリクス
部位に異なる配列オリゴヌクレオチドを合成することが
可能であるが、本実施例では発癌関連遺伝子p５３の二
つのアミノ酸残基のうちの計３個所の塩基の全ての組み
合わせを含む以下の６４種のオリゴヌクレオチド、すな
わちＤＮＡプローブ合成した。得られたＤＮＡプローブ
アレイ基板を30%アンモニア水に室温で１２時間浸漬
し、核酸塩基の脱保護を行った。 合成したＤＮＡプローブ(No.1〜No.64)の塩基配列 合成したＤＮＡプローブ(No.1〜No.64)の塩基配列 No.1. 5'-ＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＡＡＧＴＴＣＡＴ-3' No.2. 5'-ＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＡＧＧＴＴＣＡＴ-3' No.3. 5'-ＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＡＣＧＴＴＣＡＴ-3' No.4. 5'-ＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴ-3' No.5. 5'-ＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＧＡＧＴＴＣＡＴ-3' No.6. 5'-ＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＧＧＧＴＴＣＡＴ-3' No.7. 5'-ＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＧＣＧＴＴＣＡＴ-3' No.8. 5'-ＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＧＴＧＴＴＣＡＴ-3' No.9. 5'-ＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＣＡＧＴＴＣＡＴ-3' No.10．5'-ＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＣＧＧＴＴＣＡＴ-3' No.11．5'-ＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＣＣＧＴＴＣＡＴ-3' No.12．5'-ＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＣＴＧＴＴＣＡＴ-3' No.13．5'-ＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＴＡＧＴＴＣＡＴ-3' No.14．5'-ＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＴＣＡＴ-3' No.15．5'-ＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＴＣＧＴＴＣＡＴ-3' No.16．5'-ＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＴＴＧＴＴＣＡＴ-3' No.17．5'-ＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＡＡＧＴＴＣＡＴ-3' No.18．5'-ＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＡＧＧＴＴＣＡＴ-3' No.19．5'-ＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＡＴ-3' No.20．5'-ＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴ-3' No.21．5'-ＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＧＡＧＴＴＣＡＴ-3' No.22．5'-ＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＧＧＧＴＴＣＡＴ-3' No.23．5'-ＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＧＣＧＴＴＣＡＴ-3' No.24．5'-ＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＧＴＧＴＴＣＡＴ-3' No.25．5'-ＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＣＡＧＴＴＣＡＴ-3' No.26．5'-ＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＣＧＧＴＴＣＡＴ-3' No.27．5'-ＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＣＣＧＴＴＣＡＴ-3' No.28．5'-ＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＴＴＣＡＴ-3' No.29．5'-ＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＴＡＧＴＴＣＡＴ-3' No.30．5'-ＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＴＧＧＴＴＣＡＴ-3' No.31．5'-ＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＴＣＧＴＴＣＡＴ-3' No.32．5'-ＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＴＴＧＴＴＣＡＴ-3' No.33．5'-ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＡＡＧＴＴＣＡＴ-3' No.34．5'-ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＡＧＧＴＴＣＡＴ-3' No.35．5'-ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＡＣＧＴＴＣＡＴ-3' No.36．5'-ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴ-3' No.37．5'-ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＧＡＧＴＴＣＡＴ-3' No.38．5'-ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＧＧＧＴＴＣＡＴ-3' No.39．5'-ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＧＣＧＴＴＣＡＴ-3' No.40．5'-ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＧＴＧＴＴＣＡＴ-3' No.41．5'-ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＣＡＧＴＴＣＡＴ-3' No.42．5'-ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＡＴ-3' No.43．5'-ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＴＣＡＴ-3' No.44．5'-ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＣＴＧＴＴＣＡＴ-3' No.45．5'-ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＴＡＧＴＴＣＡＴ-3' No.46．5'-ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＴＧＧＴＴＣＡＴ-3' No.47．5'-ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＴＣＧＴＴＣＡＴ-3' No.48．5'-ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＴＴＧＴＴＣＡＴ-3' No.49．5'-ＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＡＡＧＴＴＣＡＴ-3' No.50．5'-ＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＧＴＴＣＡＴ-3' No.51．5'-ＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＡＣＧＴＴＣＡＴ-3' No.52．5'-ＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴ-3' No.53．5'-ＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＴＣＡＴ-3' No.54．5'-ＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＧＧＧＴＴＣＡＴ-3' No.55．5'-ＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＧＣＧＴＴＣＡＴ-3' No.56．5'-ＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＧＴＧＴＴＣＡＴ-3' No.57．5'-ＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＣＡＧＴＴＣＡＴ-3' No.58．5'-ＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＣＧＧＴＴＣＡＴ-3' No.59．5'-ＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＣＣＧＴＴＣＡＴ-3' No.60．5'-ＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＡＴ-3' No.61．5'-ＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＴＡＧＴＴＣＡＴ-3' No.62．5'-ＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＴＧＧＴＴＣＡＴ-3' No.63．5'-ＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＴＣＧＴＴＣＡＴ-3' No.64．5'-ＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＴＴＧＴＴＣＡＴ-3' 図１は作製したＤＮＡアレイ基板上のＤＮＡプローブの
塩基配列とその配置、および、後にハイブリダイゼーシ
ョンに用いるテトラメチルローダミン標識モデル標的Ｄ
ＮＡの塩基配列を示したものである。配列Ｎo.６５は標
的ＤＮＡの塩基配列、他の配列は配列Ｎo.６５に対して
相補的であるが、下線部の３塩基については、ＡＧＣＴ
すべての組み合わせをもったもの、すなわち、４3＝６
４とおりの配列である。なお、上記プローブの３塩基
は、配列Ｎo.６５の下線部に対応している。また、各配
列のＮの部分はそれぞれ四角で形どられた部分の上部に
書かれた塩基に対応している。結果として、基板上の各
ＤＮＡプローブは図１に示したように、標的ＤＮＡ配列
に対して、完全に相補的(Ｎo.４２)、あるいは、１塩基
ミスマッチ、２塩基ミスマッチ、３塩基ミスマッチを有
するものとなる。
部位に異なる配列オリゴヌクレオチドを合成することが
可能であるが、本実施例では発癌関連遺伝子p５３の二
つのアミノ酸残基のうちの計３個所の塩基の全ての組み
合わせを含む以下の６４種のオリゴヌクレオチド、すな
わちＤＮＡプローブ合成した。得られたＤＮＡプローブ
アレイ基板を30%アンモニア水に室温で１２時間浸漬
し、核酸塩基の脱保護を行った。 合成したＤＮＡプローブ(No.1〜No.64)の塩基配列 合成したＤＮＡプローブ(No.1〜No.64)の塩基配列 No.1. 5'-ＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＡＡＧＴＴＣＡＴ-3' No.2. 5'-ＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＡＧＧＴＴＣＡＴ-3' No.3. 5'-ＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＡＣＧＴＴＣＡＴ-3' No.4. 5'-ＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴ-3' No.5. 5'-ＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＧＡＧＴＴＣＡＴ-3' No.6. 5'-ＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＧＧＧＴＴＣＡＴ-3' No.7. 5'-ＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＧＣＧＴＴＣＡＴ-3' No.8. 5'-ＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＧＴＧＴＴＣＡＴ-3' No.9. 5'-ＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＣＡＧＴＴＣＡＴ-3' No.10．5'-ＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＣＧＧＴＴＣＡＴ-3' No.11．5'-ＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＣＣＧＴＴＣＡＴ-3' No.12．5'-ＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＣＴＧＴＴＣＡＴ-3' No.13．5'-ＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＴＡＧＴＴＣＡＴ-3' No.14．5'-ＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＴＣＡＴ-3' No.15．5'-ＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＴＣＧＴＴＣＡＴ-3' No.16．5'-ＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＴＴＧＴＴＣＡＴ-3' No.17．5'-ＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＡＡＧＴＴＣＡＴ-3' No.18．5'-ＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＡＧＧＴＴＣＡＴ-3' No.19．5'-ＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＡＴ-3' No.20．5'-ＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴ-3' No.21．5'-ＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＧＡＧＴＴＣＡＴ-3' No.22．5'-ＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＧＧＧＴＴＣＡＴ-3' No.23．5'-ＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＧＣＧＴＴＣＡＴ-3' No.24．5'-ＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＧＴＧＴＴＣＡＴ-3' No.25．5'-ＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＣＡＧＴＴＣＡＴ-3' No.26．5'-ＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＣＧＧＴＴＣＡＴ-3' No.27．5'-ＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＣＣＧＴＴＣＡＴ-3' No.28．5'-ＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＴＴＣＡＴ-3' No.29．5'-ＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＴＡＧＴＴＣＡＴ-3' No.30．5'-ＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＴＧＧＴＴＣＡＴ-3' No.31．5'-ＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＴＣＧＴＴＣＡＴ-3' No.32．5'-ＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＴＴＧＴＴＣＡＴ-3' No.33．5'-ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＡＡＧＴＴＣＡＴ-3' No.34．5'-ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＡＧＧＴＴＣＡＴ-3' No.35．5'-ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＡＣＧＴＴＣＡＴ-3' No.36．5'-ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴ-3' No.37．5'-ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＧＡＧＴＴＣＡＴ-3' No.38．5'-ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＧＧＧＴＴＣＡＴ-3' No.39．5'-ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＧＣＧＴＴＣＡＴ-3' No.40．5'-ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＧＴＧＴＴＣＡＴ-3' No.41．5'-ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＣＡＧＴＴＣＡＴ-3' No.42．5'-ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＡＴ-3' No.43．5'-ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＴＣＡＴ-3' No.44．5'-ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＣＴＧＴＴＣＡＴ-3' No.45．5'-ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＴＡＧＴＴＣＡＴ-3' No.46．5'-ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＴＧＧＴＴＣＡＴ-3' No.47．5'-ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＴＣＧＴＴＣＡＴ-3' No.48．5'-ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＴＴＧＴＴＣＡＴ-3' No.49．5'-ＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＡＡＧＴＴＣＡＴ-3' No.50．5'-ＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＧＴＴＣＡＴ-3' No.51．5'-ＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＡＣＧＴＴＣＡＴ-3' No.52．5'-ＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴ-3' No.53．5'-ＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＴＣＡＴ-3' No.54．5'-ＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＧＧＧＴＴＣＡＴ-3' No.55．5'-ＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＧＣＧＴＴＣＡＴ-3' No.56．5'-ＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＧＴＧＴＴＣＡＴ-3' No.57．5'-ＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＣＡＧＴＴＣＡＴ-3' No.58．5'-ＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＣＧＧＴＴＣＡＴ-3' No.59．5'-ＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＣＣＧＴＴＣＡＴ-3' No.60．5'-ＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＡＴ-3' No.61．5'-ＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＴＡＧＴＴＣＡＴ-3' No.62．5'-ＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＴＧＧＴＴＣＡＴ-3' No.63．5'-ＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＴＣＧＴＴＣＡＴ-3' No.64．5'-ＧＡＴＧＧＧＴＣＴＣＴＴＧＴＴＣＡＴ-3' 図１は作製したＤＮＡアレイ基板上のＤＮＡプローブの
塩基配列とその配置、および、後にハイブリダイゼーシ
ョンに用いるテトラメチルローダミン標識モデル標的Ｄ
ＮＡの塩基配列を示したものである。配列Ｎo.６５は標
的ＤＮＡの塩基配列、他の配列は配列Ｎo.６５に対して
相補的であるが、下線部の３塩基については、ＡＧＣＴ
すべての組み合わせをもったもの、すなわち、４3＝６
４とおりの配列である。なお、上記プローブの３塩基
は、配列Ｎo.６５の下線部に対応している。また、各配
列のＮの部分はそれぞれ四角で形どられた部分の上部に
書かれた塩基に対応している。結果として、基板上の各
ＤＮＡプローブは図１に示したように、標的ＤＮＡ配列
に対して、完全に相補的(Ｎo.４２)、あるいは、１塩基
ミスマッチ、２塩基ミスマッチ、３塩基ミスマッチを有
するものとなる。
【００３５】(６)合成した全てのＤＮＡプローブの５'
末端にはフルオロセインフォスフォロアミダイト(グレ
ンリサーチ社)をもちいて蛍光色素であるフルオロセイ
ンを結合した。また、他の１個所のマトリクス部位には
直接、上記アミダイトを用いてフルオロセインを結合し
た。すなわち第一段階の所望の塩基を有するアミダイト
の代わりにフルオロセインフォスフォロアミダイトを用
いてフルオロセインを結合した。なお、このものには原
理的に次段階以降の伸長反応は進行しない。
末端にはフルオロセインフォスフォロアミダイト(グレ
ンリサーチ社)をもちいて蛍光色素であるフルオロセイ
ンを結合した。また、他の１個所のマトリクス部位には
直接、上記アミダイトを用いてフルオロセインを結合し
た。すなわち第一段階の所望の塩基を有するアミダイト
の代わりにフルオロセインフォスフォロアミダイトを用
いてフルオロセインを結合した。なお、このものには原
理的に次段階以降の伸長反応は進行しない。
【００３６】(実施例２) 実施例１で合成したＤＮＡプ
ローブアレイの蛍光定量。
ローブアレイの蛍光定量。
【００３７】各マトリクス部位からのフルオロセイン由
来の蛍光は蛍光顕微鏡ＥＣＬIＰＳＥ800(株式会社ニコ
ン、対物レンズ ＣＦIＰlanＡpo 20×)とイメージイン
テンシファイヤー付きＣＣＤカメラＣ2400-87(浜松ホト
ニクス株式会社)で取り込み、画像処理装置 Ａrgu50(浜
松ホトニクス株式会社)を用いて定量した。なお、イメ
ージインテンシファイヤーの増幅度はＨＶ＝2.0とし、
積算回数は６４回、蛍光顕微鏡のフィルターブロックは
フルオロセイン測定用のＢ-２Ｅ/Ｃを使用した。また、
蛍光の測定は基板をスライドガラス上に置き、50ｍｍol
/L リン酸緩衝撃(pＨ＝7.0、100ｍｍol/L ＮaＣlを含
む)を適宜滴下した後、カバーガラスで覆った状態で行
った。
来の蛍光は蛍光顕微鏡ＥＣＬIＰＳＥ800(株式会社ニコ
ン、対物レンズ ＣＦIＰlanＡpo 20×)とイメージイン
テンシファイヤー付きＣＣＤカメラＣ2400-87(浜松ホト
ニクス株式会社)で取り込み、画像処理装置 Ａrgu50(浜
松ホトニクス株式会社)を用いて定量した。なお、イメ
ージインテンシファイヤーの増幅度はＨＶ＝2.0とし、
積算回数は６４回、蛍光顕微鏡のフィルターブロックは
フルオロセイン測定用のＢ-２Ｅ/Ｃを使用した。また、
蛍光の測定は基板をスライドガラス上に置き、50ｍｍol
/L リン酸緩衝撃(pＨ＝7.0、100ｍｍol/L ＮaＣlを含
む)を適宜滴下した後、カバーガラスで覆った状態で行
った。
【００３８】図２に蛍光の測定値を示した。図２の四角
形の外部の蛍光値(11330)はフルオロセインを直接結合
したマトリクス部位からのものである。図２から最終的
に結合されたオリゴヌクレオチドからの蛍光値は 2940
から 10350 の範囲に渡ることがわかる。これは各オリ
ゴヌクレオチドプローブの量の指標に用いることがで
き、ハイブリダイゼーションの結果をこれらの蛍光値で
補正すれば良いことになる。また、複数のＤＮＡアレイ
を用いる場合には、各アレイの直接結合されフルオロセ
インからの蛍光値によりマトリクス部位間の補正を行う
ことが可能である。
形の外部の蛍光値(11330)はフルオロセインを直接結合
したマトリクス部位からのものである。図２から最終的
に結合されたオリゴヌクレオチドからの蛍光値は 2940
から 10350 の範囲に渡ることがわかる。これは各オリ
ゴヌクレオチドプローブの量の指標に用いることがで
き、ハイブリダイゼーションの結果をこれらの蛍光値で
補正すれば良いことになる。また、複数のＤＮＡアレイ
を用いる場合には、各アレイの直接結合されフルオロセ
インからの蛍光値によりマトリクス部位間の補正を行う
ことが可能である。
【００３９】(実施例３) 実施例１で合成したＤＮＡプ
ローブアレイによる標的ＤＮＡの定量。
ローブアレイによる標的ＤＮＡの定量。
【００４０】図３にハイブリダイゼーションに用いたテ
トラメチルローダミン標識モデル標的ＤＮＡの構造を示
す。前述のようにこの標的ＤＮＡの塩基配列は配列Ｎo.
６５である。
トラメチルローダミン標識モデル標的ＤＮＡの構造を示
す。前述のようにこの標的ＤＮＡの塩基配列は配列Ｎo.
６５である。
【００４１】上記基板をＢＳＡ(牛血清アルブミン、シ
グマアルドリッチジャパン)を２％の濃度で含む 50ｍｍ
ol/Lリン酸緩衝液(pＨ＝7.0、100ｍｍol/L ＮaＣlを含
む)に１時間浸漬した後、上記緩衝液で適宜洗浄した後
のハイブリダイゼーションに用いた。
グマアルドリッチジャパン)を２％の濃度で含む 50ｍｍ
ol/Lリン酸緩衝液(pＨ＝7.0、100ｍｍol/L ＮaＣlを含
む)に１時間浸漬した後、上記緩衝液で適宜洗浄した後
のハイブリダイゼーションに用いた。
【００４２】ハイブリダイゼーションは上記の標的ＤＮ
Ａを 50nｍol/Lの濃度で含む 100ｍｍol/L ＮaＣl、50
ｍｍol/Lリン酸緩衝液(pＨ＝7.0)２ｍLとＤＮＡプロー
ブアレイ基板をハイブリダイゼーション用の樹脂パック
に封じ、７０℃に加熱した後、２０℃まで冷却し、その
後その状態で２４時間放置することによりおこなった。
Ａを 50nｍol/Lの濃度で含む 100ｍｍol/L ＮaＣl、50
ｍｍol/Lリン酸緩衝液(pＨ＝7.0)２ｍLとＤＮＡプロー
ブアレイ基板をハイブリダイゼーション用の樹脂パック
に封じ、７０℃に加熱した後、２０℃まで冷却し、その
後その状態で２４時間放置することによりおこなった。
【００４３】次に基板を上記緩衝液中で２０分間洗浄し
た後に標的ＤＮＡのテトラメチルローダミンからの蛍光
を実施例２と同様の方法で定量した。なお、蛍光フィル
ターブロックにはＹ-２Ｅ/Ｃを使用した。また、イメー
ジインテンシファイヤーの増幅度は 4.0 である。
た後に標的ＤＮＡのテトラメチルローダミンからの蛍光
を実施例２と同様の方法で定量した。なお、蛍光フィル
ターブロックにはＹ-２Ｅ/Ｃを使用した。また、イメー
ジインテンシファイヤーの増幅度は 4.0 である。
【００４４】結果を図４に示す。また、図４の定量値に
補正値(伸長反応を行なわないマトリクス部位に直接結
合したフルオロセインからの蛍光値:11330/伸長反応を
行なった各マトリクス部位のフルオロセインからの蛍光
値)を掛け合わせた値を図５に示した。これらの値を比
較例の値と比較する(後記)。
補正値(伸長反応を行なわないマトリクス部位に直接結
合したフルオロセインからの蛍光値:11330/伸長反応を
行なった各マトリクス部位のフルオロセインからの蛍光
値)を掛け合わせた値を図５に示した。これらの値を比
較例の値と比較する(後記)。
【００４５】(比較例１) インクジェット法による既合
成ＤＮＡプローブの基板への供給と結合、及び、ハイブ
リダイゼーション 実施例１と同様にガラス基板を洗浄した後、減圧蒸留し
て精製したアミノシランカップリング剤(ＫＢＭ-603 信
越化学工業株式会社)を１％の濃度で含む水溶液を室温
下、１時間攪拌し、メトキシ基部分を加水分解させた。
次に上記基板を洗浄後速やかに上記シランカップリング
剤水溶液に室温下、１時間浸漬し、流水(超純水)洗浄
後、窒素ガスを吹きつけて乾燥させ、次いで、120℃の
オーブン中で１時間加熱定着させた。
成ＤＮＡプローブの基板への供給と結合、及び、ハイブ
リダイゼーション 実施例１と同様にガラス基板を洗浄した後、減圧蒸留し
て精製したアミノシランカップリング剤(ＫＢＭ-603 信
越化学工業株式会社)を１％の濃度で含む水溶液を室温
下、１時間攪拌し、メトキシ基部分を加水分解させた。
次に上記基板を洗浄後速やかに上記シランカップリング
剤水溶液に室温下、１時間浸漬し、流水(超純水)洗浄
後、窒素ガスを吹きつけて乾燥させ、次いで、120℃の
オーブン中で１時間加熱定着させた。
【００４６】冷却後、Ｎ-(６-マレイミドカプロキシ)ス
クシイミド(ＥＭＣＳ,化合物I,同仁化学研究所)
クシイミド(ＥＭＣＳ,化合物I,同仁化学研究所)
【００４７】
【化１】
【００４８】の 0.3％溶液(エタノール;ジメチルスルホ
キシド＝１:１)に基板を室温下、２時間浸漬し、反応さ
せたのち、エタノール:ジメチルスルホキシド＝１:１で
１回、エタノールで３回洗浄し、窒素ガスを吹きつけて
乾燥させた。この処理によりガラス基板上のシランカッ
プリング剤のアミノ基とＥＭＣＳのスクシイミド基が結
合し、表面にマレイミド基が生成したことになる。この
マレイミド基とＤＮＡプローブのチオール基が結合する
(後記)。
キシド＝１:１)に基板を室温下、２時間浸漬し、反応さ
せたのち、エタノール:ジメチルスルホキシド＝１:１で
１回、エタノールで３回洗浄し、窒素ガスを吹きつけて
乾燥させた。この処理によりガラス基板上のシランカッ
プリング剤のアミノ基とＥＭＣＳのスクシイミド基が結
合し、表面にマレイミド基が生成したことになる。この
マレイミド基とＤＮＡプローブのチオール基が結合する
(後記)。
【００４９】実施例３と全く同様の塩基配列を有する６
４種のＤＮＡプローブをベックス株式会社より購入し
た。これらのＤＮＡには基板に結合するために５'末端
にチオールリンカーを担持させてある。チオールリンカ
ーを有するＤＮＡの例を化合物II
４種のＤＮＡプローブをベックス株式会社より購入し
た。これらのＤＮＡには基板に結合するために５'末端
にチオールリンカーを担持させてある。チオールリンカ
ーを有するＤＮＡの例を化合物II
【００５０】
【化２】
【００５１】としてあげた。ちなみに化合物IIはモデル
標的ＤＮＡに対して完全に相補的な塩基配列(Ｎo.４２)
を有するものである。
標的ＤＮＡに対して完全に相補的な塩基配列(Ｎo.４２)
を有するものである。
【００５２】これらのＤＮＡをサーマルジェットプリン
ターで吐出するための溶媒、すなわち、グリセリン 7.5
ｗt％、尿素 7.5ｗt％、チオジグリコール 7.5ｗt％、
一般式III
ターで吐出するための溶媒、すなわち、グリセリン 7.5
ｗt％、尿素 7.5ｗt％、チオジグリコール 7.5ｗt％、
一般式III
【００５３】
【化３】
【００５４】で示されるアセチレンアルコール(例え
ば、商品名:アセチレノールＥＨ 川研ファインケミカル
株式会社)１ｗt％を含む水溶液に、吸光度が 1.0 にな
るように溶解させ、0.4ｍLをサーマルジェットプリンタ
ー(キヤノン株式会社製のインクジェット用ヘッドを２
個搭載可能)のインク供給部を改良して充填し、上記の
基板上に吐出した。吐出のパターンは実施例１から３と
同様である(形状は異なる)。装置の仕様上からは、吐出
される液滴１滴の量は２４pLで、この条件では液滴１滴
のしめるドットの直径は 70〜100μｍである。吐出密度
は 120dpi(ドット/インチ)である。この基板を、湿度 1
00％の保湿チャンバー内に室温下で１時間反応させた
後、流水(超純水)中で約 30秒洗浄した。
ば、商品名:アセチレノールＥＨ 川研ファインケミカル
株式会社)１ｗt％を含む水溶液に、吸光度が 1.0 にな
るように溶解させ、0.4ｍLをサーマルジェットプリンタ
ー(キヤノン株式会社製のインクジェット用ヘッドを２
個搭載可能)のインク供給部を改良して充填し、上記の
基板上に吐出した。吐出のパターンは実施例１から３と
同様である(形状は異なる)。装置の仕様上からは、吐出
される液滴１滴の量は２４pLで、この条件では液滴１滴
のしめるドットの直径は 70〜100μｍである。吐出密度
は 120dpi(ドット/インチ)である。この基板を、湿度 1
00％の保湿チャンバー内に室温下で１時間反応させた
後、流水(超純水)中で約 30秒洗浄した。
【００５５】ＢＳＡによる処理、ハイブリダイゼーショ
ンの条件、及び、蛍光定量の条件は実施例３と同様であ
る。イメージインテンシファイヤーの増幅度は 2.0 で
ある。蛍光定量の結果を図６に示した。
ンの条件、及び、蛍光定量の条件は実施例３と同様であ
る。イメージインテンシファイヤーの増幅度は 2.0 で
ある。蛍光定量の結果を図６に示した。
【００５６】図７には図６の結果と図５の結果の比較を
示した。図５の各マトリクスの値をＡn、図６の各マト
リクスの値をＢn(n＝１〜６４)とすると、図７の各マト
リクスの値Ｃnは以下の(１)式で示される。 (１) Ｃn＝Ｂn×(ΣＡn/ΣＢn)/Ａn (ΣＡnはＡnの総和、ΣＢnはＢnの総和を示す。) 図７の結果は本発明による逐次合成のＤＮＡプローブア
レイによるハイブリダイゼーションの結果をプローブの
末端標識に用いた蛍光色素の蛍光値と、伸長反応を行な
わないマトリクス部位の蛍光値とで補正した値と、予め
合成、精製したＤＮＡプローブを結合したＤＮＡプロー
ブアレイを用いたハイブリダイゼーションの結果を比較
したものである。図７の数値は±約 20％、標準偏差は
約９％の範囲であり、本発明の補正方法が有効であるこ
とを示している。また、ＤＮＡプローブアレイ基板相互
の補正も伸長反応を行なわないマトリクス部位におい
て、直接基板に結合した蛍光色素(フルオロセイン)の値
により可能である。
示した。図５の各マトリクスの値をＡn、図６の各マト
リクスの値をＢn(n＝１〜６４)とすると、図７の各マト
リクスの値Ｃnは以下の(１)式で示される。 (１) Ｃn＝Ｂn×(ΣＡn/ΣＢn)/Ａn (ΣＡnはＡnの総和、ΣＢnはＢnの総和を示す。) 図７の結果は本発明による逐次合成のＤＮＡプローブア
レイによるハイブリダイゼーションの結果をプローブの
末端標識に用いた蛍光色素の蛍光値と、伸長反応を行な
わないマトリクス部位の蛍光値とで補正した値と、予め
合成、精製したＤＮＡプローブを結合したＤＮＡプロー
ブアレイを用いたハイブリダイゼーションの結果を比較
したものである。図７の数値は±約 20％、標準偏差は
約９％の範囲であり、本発明の補正方法が有効であるこ
とを示している。また、ＤＮＡプローブアレイ基板相互
の補正も伸長反応を行なわないマトリクス部位におい
て、直接基板に結合した蛍光色素(フルオロセイン)の値
により可能である。
【００５７】
【発明の効果】本発明の逐次合成におけるプローブアレ
イの合成において、末端に標識を施すことにより、各マ
トリクス間のプローブ量を把握することが可能となり、
また、各プローブ量を補正して標的物質を検出、定量す
ることが可能となった。また、各プローブ基板に直接標
識物質を結合することにより、各プローブアレイ間の補
正も可能となった。
イの合成において、末端に標識を施すことにより、各マ
トリクス間のプローブ量を把握することが可能となり、
また、各プローブ量を補正して標的物質を検出、定量す
ることが可能となった。また、各プローブ基板に直接標
識物質を結合することにより、各プローブアレイ間の補
正も可能となった。
【００５８】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Canon Inc. <120> Probe array. <130> 3906114 <160> 81 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 1 gatgggactc aagttcat 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 2 gatgggactc aggttcat 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 3 gatgggactc acgttcat 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 4 gatgggactc atgttcat 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 5 gatgggactc gagttcat 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 6 gatgggactc gggttcat 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 7 gatgggactc gcgttcat 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 8 gatgggactc gtgttcat 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 9 gatgggactc cagttcat 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 10 gatgggactc cggttcat 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 11 gatgggactc ccgttcat 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 12 gatgggactc ctgttcat 18 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 13 gatgggactc tagttcat 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 14 gatgggactc tggttcat 18 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 15 gatgggactc tcgttcat 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 16 gatgggactc ttgttcat 18 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 17 gatggggctc aagttcat 18 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 18 gatggggctc aggttcat 18 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 19 gatggggctc acgttcat 18 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 20 gatggggctc atgttcat 18 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 21 gatggggctc gagttcat 18 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 22 gatggggctc gggttcat 18 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 23 gatggggctc gcgttcat 18 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 24 gatggggctc gtgttcat 18 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 25 gatggggctc cagttcat 18 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 26 gatggggctc cggttcat 18 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 27 gatggggctc ccgttcat 18 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 28 gatggggctc ctgttcat 18 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 29 gatggggctc tagttcat 18 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 30 gatggggctc tggttcat 18 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 31 gatggggctc tcgttcat 18 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 32 gatggggctc ttgttcat 18 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 33 gatgggcctc aagttcat 18 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 34 gatgggcctc aggttcat 18 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 35 gatgggcctc acgttcat 18 <210> 36 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 36 gatgggcctc atgttcat 18 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 37 gatgggcctc gagttcat 18 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 38 gatgggcctc gggttcat 18 <210> 39 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 39 gatgggcctc gcgttcat 18 <210> 40 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 40 gatgggcctc gtgttcat 18 <210> 41 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 41 gatgggcctc cagttcat 18 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 42 gatgggcctc cggttcat 18 <210> 43 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 43 gatgggcctc ccgttcat 18 <210> 44 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 44 gatgggcctc ctgttcat 18 <210> 45 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 45 gatgggcctc tagttcat 18 <210> 46 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 46 gatgggcctc tggttcat 18 <210> 47 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 47 gatgggcctc tcgttcat 18 <210> 48 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 48 gatgggcctc ttgttcat 18 <210> 49 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 49 gatgggtctc aagttcat 18 <210> 50 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 50 gatgggtctc aggttcat 18 <210> 51 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 51 gatgggtctc acgttcat 18 <210> 52 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 52 gatgggtctc atgttcat 18 <210> 53 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 53 gatgggtctc gagttcat 18 <210> 54 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 54 gatgggtctc gggttcat 18 <210> 55 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description 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<223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 62 gatgggtctc tggttcat 18 <210> 63 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 63 gatgggtctc tcgttcat 18 <210> 64 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 64 gatgggtctc ttgttcat 18 <210> 65 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 65 atgaaccgga ggcccatc 18 <210> 66 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 66 gatgggactc angttcat 18 <210> 67 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 67 gatgggactc gngttcat 18 <210> 68 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 68 gatgggactc cngttcat 18 <210> 69 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 76 gatgggcctc cngttcat 18 <210> 77 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 77 gatgggcctc tngttcat 18 <210> 78 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 78 gatgggtctc angttcat 18 <210> 79 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 79 gatgggtctc gngttcat 18 <210> 80 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 80 gatgggtctc cngttcat 18 <210> 81 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized <400> 81 gatgggtctc tngttcat 18
【図面の簡単な説明】
【図１】標的ＤＮＡ塩基配列とプローブ塩基配列および
アレイ基板上での配置
アレイ基板上での配置
【図２】実施例２のＤＮＡプローブアレイのフルオロセ
イン由来の蛍光測定値
イン由来の蛍光測定値
【図３】標的ＤＮＡの構造
【図４】実施例３のハイブリダイゼーションの結果
【図５】実施例３のハイブリダイゼーションの結果の補
正値
正値
【図６】比較例のハイブリダイゼーションの結果
【図７】実施例３の補正値と比較例の結果の比較
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１３年１２月１４日（２００１．１２．
１４）
１４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の名称
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の名称】 末端標識プローブアレイの製造方法、
並びにそれを用いた標的物質量の評価方法
並びにそれを用いた標的物質量の評価方法
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、標識プローブアレ
イの製造方法、及び、該標識プローブアレイを用いた標
的物質量の評価方法に関する。
イの製造方法、及び、該標識プローブアレイを用いた標
的物質量の評価方法に関する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１５】すなわち、プローブアレイ基板表面の複数
のマトリクス部位に、標的物質を捕捉するためのプロー
ブをその一部を固定して逐次合成する際に、該逐次合成
の最終段階において、それまでの各段階の合成によって
所望の鎖長まで伸長されたプローブの末端に標識化合物
を結合することを特徴とする末端標識プローブアレイの
製造方法に関する。
のマトリクス部位に、標的物質を捕捉するためのプロー
ブをその一部を固定して逐次合成する際に、該逐次合成
の最終段階において、それまでの各段階の合成によって
所望の鎖長まで伸長されたプローブの末端に標識化合物
を結合することを特徴とする末端標識プローブアレイの
製造方法に関する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＦ (72)発明者 鈴木 智博 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キヤ ノン株式会社内 Ｆターム(参考） 2G042 AA01 BD19 FA11 4B024 AA11 AA19 CA01 HA12 HA19 4B063 QA01 QQ42 QR32 QR55 QR62 QS32
Claims (15)
- 【請求項１】 プローブアレイ基板表面の複数のマトリ
クス部位に、標的物質を捕捉するためのプローブをその
一部を固定して、該プローブを構成するためのユニット
を逐次的に結合していく、逐次合成の際に、該逐次合成
の最終段階において、それまでの各段階の合成によって
所望の鎖長まで伸長されたプローブの末端に標識化合物
を結合することを特徴とする末端標識プローブアレイの
合成方法。 - 【請求項２】 前記プローブが核酸である請求項１の末
端標識プローブアレイの合成方法。 - 【請求項３】 前記核酸がＤＮＡ、オリゴヌクレオチ
ド、ペプチド核酸である請求項２に記載の末端標識プロ
ーブアレイの合成方法。 - 【請求項４】 前記核酸がＤＮＡであり、前記逐次合成
が下記の合成ステップよりなるフォスフォロアミダイト
法である請求項３に記載の末端標識プローブアレイの合
成方法。 (１)固相担体(ガラス基板等)表面にリンカーを介して結
合されている水酸基の保護基を除去する工程。 (２)所望の塩基を有する第一番目のヌクレオチドを形成
すべきアミダイトモノマーの３'側で(１)の水酸基と結
合する工程。 (３)(１)の水酸基のうち(２)の工程で未反応なものをキ
ャッピングする工程。 (４)(２)で結合したアミダイトをフォスファイトからフ
ォスフェイトへ酸化する工程。 (５)(２)で結合したアミダイトの５'側に結合した水酸
基の保護基を除去する工程。 (６)(２)から(４)の工程を所望の塩基長、塩基配列に対
して３'→５'方向へ繰り返す工程。 - 【請求項５】 前記プローブが蛋白質である請求項１に
記載の末端標識プローブアレイの合成方法。 - 【請求項６】 前記プローブがオリゴペプチドである請
求項１に記載の末端標識プローブアレイの合成方法。 - 【請求項７】 前記プローブの末端に結合した標識物質
が蛍光物質である請求項１から６に記載の末端標識プロ
ーブアレイの合成方法。 - 【請求項８】 前記プローブの末端に結合した標識物質
が蛍光色素である請求項７に記載の末端標識プローブア
レイの合成方法。 - 【請求項９】 前記プローブの末端に結合した標識物質
が、標的物質に対する標識物質と異なる請求項１から８
に記載の末端標識プローブアレイの合成方法。 - 【請求項１０】 プローブアレイ基板表面の複数のマト
リクス部位に、標的物質を捕捉するための、それぞれ異
なるプローブが逐次合成され、逐次合成の最終段階にお
いて、それまでの各段階の合成によって所望の鎖長まで
伸長されたプローブの末端に標識化合物が結合されてい
ることを特徴とする末端標識プローブアレイ。 - 【請求項１１】 請求項１から９に記載の方法によって
作製された、請求項１０記載の末端標識プローブアレ
イ。 - 【請求項１２】 請求項１１記載の末端標識プローブア
レイの、それぞれのマトリクスの標識物質量を測定す
る、最終段階まで逐次合成された各マトリクスのプロー
ブの量の評価方法。 - 【請求項１３】 請求項１２に記載の量的に評価された
プローブの量と、該プローブに捕捉された標的物質の標
識物質の量を比較する標的化合物の量の評価方法。 - 【請求項１４】 逐次合成の第一段階において基板表面
の所定のマトリクスに結合され、その後の伸長反応を行
わない標識物質の量と、最終段階において結合された標
識物質の量を比較する請求項１２に記載のプローブの量
の評価方法。 - 【請求項１５】 請求項１１記載の末端標識プローブア
レイの所定の部位のマトリクスのプローブに捕捉された
標識標的化合物の標識化合物の量と、最終段階において
結合された標識物質の量と、逐次合成の第一段階におい
て基板表面に結合された標識物質の量とを比較する標的
化合物の量の評価方法。
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